BR112013028365B1 - Composição líquida compreendendo adi ligado covalentemente com polietilenoglicol para tratamento de câncer e uso - Google Patents

Composição líquida compreendendo adi ligado covalentemente com polietilenoglicol para tratamento de câncer e uso Download PDF

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Abstract

COMPOSIÇÃO LÍQUIDA COMPREENDENDO ADI, COMPOSTO COMPREENDENDO ADI LIGADA COVALENTEMENTE ATRAVÉS DE GRUPO DE LIGAÇÃO A POLIETILENOGLICOL E USO DE ADI NO PREPARO DE COMPOSIÇÃO PARA TRATAMENTO DE CÂNCER. A presente invenção refere-se, de uma maneira geral, aos métodos de tratamento de câncer com arginina deiminase e, em particular, com arginina deiminase peguilada.

Description

REFERÊNCIA CRUZADA AOS PEDIDOS DE PATENTE RELACIONADOS
[001] Este pedido de patente reivindica prioridade ao Pedido de Patente Provisório U.S. N ° 61/620.368, depositado em 4 de abril de 2012, o qual o pedido de patente é incorporado na presente invenção por meio de referência na sua totalidade.
DECLARAÇÃO SOBRE REGISTRO DA LISTAGEM DE SEQUÊNCIA
[002] A listagem de sequência associada a este pedido de patente é fornecida em formato de texto, em vez de uma cópia em papel, e fica incorporada por meio de referência no presente relatório descritivo. O nome do arquivo de texto contendo a listagem de sequência é POLA_001_01WO_ST25.txt. O arquivo de texto é de 8 KB, foi criado em 30 de maio de 2012, e está sendo submetido eletronicamente via EFS -Web.
ANTECEDENTE DA TÉCNICA Campo técnico
[003] A presente invenção refere-se, de uma maneira geral, aos métodos de tratamento de câncer com arginina deiminase (ADI), e, nomeadamente, o ADI peguilado (ADI- PEG).
Descrição da Técnica Relacionada
[004] A terapia de privação de aminoácidos pode ser um tratamento eficaz de algumas formas de câncer. Até à data, existe um exemplo clínico conhecido relevante a esta abordagem que utiliza asparaginase para baixar os níveis de asparagina circulantes e inibe a síntese de proteínas. Este tratamento é particularmente eficaz para leucemia linfoblástica aguda (Avramis 2005, Viera Pinheiro, 2004). As células de leucemia linfoblástica aguda requerem o aminoácido asparagina para o crescimento e para a proliferação. Em contraste, a maioria das células humanas normais são capazes de sintetizar asparagina e não são afetadas por meio da depleção de asparagina. Portanto, a diminuição de soro de asparagina com asparaginase pode matar seletivamente as células cancerosas sem danificar as células normais, tecidos e hospedeiro. A forma derivada de uma E. coli de asparaginase foi aprovada para uso humano. No entanto, asparaginase é encontrada apenas em microrganismos, o que faz com que seja altamente imunogênica em seres humanos e também tem uma curta semivida no soro a seguir à injeção (Avramis 2005). Para fazer com que asparaginase seja mais eficaz, estas desvantagens foram minimizadas por meio da formulação dos derivados de E. coli asparaginase com polietilenoglicol (PEG), para reduzir a antigenicidade desta enzima e das reações alérgicas associadas. Além disso, o PEG prolonga significativamente a semivida de circulação de asparaginase, o que reduz tanto a frequência de tratamento quanto ao custo total da terapia. PEG de asparaginase formulado está aprovado para uso e é comercializado sob o nome comercial Oncaspar ® (Oncaspar ® 2011, Avramis 2005, Viera Pinheiro 2004, Fu 2007, Zeidan 2008).
[005] A arginina é um outro aminoácido não essencial para os seres humanos e camundongos (para revisão vide Rogers, 1994). Nos seres humanos, a arginina pode ser sintetizada a partir de citrulina em duas etapas através de sintetase de argininossuccinato das enzimas do ciclo Krebs (ureia) (ASS, L- citrulina : L- aspartato-ligase [ AMP formadora ], EC 6.3.4.5) e liase de argininossuccinato (ASL argininossuccinato L- arginina- liase, EC 4.3.2.) (Haines 2011, Wu 2009, Morris 2006, Husson 2003, Tapiero 2002, Rogers 1994). ASS catalisa a conversão de citrulina e ácido aspártico para argininossuccinato, que é então convertido em ácido fumárico e arginina por meio de ASL (Figura 1). Uma dieta deficiente em arginina em seres humanos não evoca hiperamonemia, aciduria orótico, nem altera a síntese da taxa de óxido nítrico em todo o corpo (NO) em seres humanos adultos (Tapiero 2002, Castillo 1995, 1994 Rogers, Carey 1987, 1986 Barbul, Snyderman 1959, Rose 1949). Apesar de recém-nascidos prematuros parecem exigir arginina (Wu, 2004), os níveis de arginina não se correlacionam com a idade entre crianças, adolescentes e adultos jovens (Lucke 2007). Em 1992, Takaku e Sugimura relataram separadamente que os melanomas humanos e as linhagens de células de carcinoma hepatocelular (HCC) parecem exigir arginina para crescimento. Outros estudos mostraram que o ADI peguilado foi eficaz para o tratamento de melanomas e hepatomas, com poucos efeitos adversos.
[006] O câncer é principalmente tratado com um ou uma combinação de três tipos de terapias : cirurgia, radiação e quimioterapia. Para os cânceres que não podem ser tratados com as terapias locais, tais como cirurgia, radioterapia e embolização, as quimioterapias sistêmicas são a única opção de tratamento. No entanto, as quimioterapias tradicionais não conseguem distinguir entre as células normais e as cancerosas, que conduzem a uma toxicidade significativa e eficácia limitada. A nova geração de terapia sistêmica é alvo das terapias destinadas a matar as células cancerosas seletivamente por meio da exploração das diferenças entre as células normais e as cancerosas. A presente invenção proporciona esta e outras vantagens para o tratamento de cânceres.
[007] Referências : Avramis VI, Panosyan EH. 2005. Clin Farmacokinet 44: 367 a 393 ; Barbul A. 1986. J Nutr Parenteral Enteral 10: 227 a 238 ; Carey GP, et al. 1987. J Nutr 117: 1734 a 1739 ; Castillo L, et al. 1995. Am J Phisiol 268 (Endocrinol Metab 31) : E360 a 367 ; Fu CH, Sakamoto KM. 2007. Expert Opin Farmacother 8: 19771984 ; Haines RJ, et al. 2011. Int J Biochem Mol Biol 2: 8 a 23 ; Husson, A. et al. 2003. Eur J Biochem 270: 1887 a 1899 ; Lucke T, et al. 2007. Clin Chem Lab Med 45: 1525 a 1530 ; Morris SM Jr. 2006. Am J Clin Nutr 83 (Suppl) : 598S a 512S ; Rogers QR. 1994. Em Procedimentos a partir do Simpósio Honrando Willard J. Visek - a partir de amônia ao câncer e a expressão gênica. Publicação Especial 86 - abril de 1994, Estação Experimental de Agricultura da Universidade de Illinois, 211 Mumford Hall, Urbana, IL 61801, pp 9-21 ; Tapiero H, et al. 2002. Biomed Farmacother 56: 439 a 445, de 2002; Viera Pinheiro JP, Boos J. 2004. Br J Haematol 125 : 117 a 127 ; Wu L, et al. 2009. Aminoácidos 37: 153 a 168 ; Wu L, et al. 2004. J Nutr Biochem 15: 442 a 451 ; Zeidan, A. et al. 2008. Especialista Opin Biol Ther 9: 111 a 119.) BREVE SUMÁRIO
[008] Um aspecto da presente invenção proporciona um método de tratamento de leucemia em um paciente que compreende a administração ao paciente de um composto que compreende ADI ligado de uma maneira covalente através de um grupo de ligação a polietilenoglicol. Em uma modalidade, a leucemia é leucemia mieloide aguda ou leucemia mieloide aguda recidiva. Em uma outra modalidade, a leucemia não é a leucemia linfocítica crônica ou leucemia mieloide. No entanto, em outras modalidades, a leucemia pode incluir leucemia linfocítica ou leucemia mieloide crônica. Em uma outra modalidade, a arginina deiminase é ligada de uma maneira covalente a 5 ± 1,5 moléculas de PEG de cadeia linear e o composto é formulado em uma composição que compreende menos do que cerca de 0,5 % de ADI nativo, menos do que cerca de 5 % de PEG livre, ou ambos ; em que a arginina deiminase é administrada semanalmente em uma dose de cerca de 160 UI/m2 a cerca de 640 UI/m2m2, e em que a leucemia exibe a expressão reduzida de ASS.
[009] Outro aspecto da presente invenção proporciona um método de tratamento de um câncer em um paciente, que compreende a administração ao paciente de um inibidor autofagia e um composto que compreende ADI ligado de uma maneira covalente através de um grupo de ligação a polietilenoglicol, em que o câncer é o câncer do pâncreas ou o câncer do pulmão de células pequenas. A este respeito, um inibidor autofagia é selecionado a partir do grupo que consiste em cloroquina, 3- metiladenina, hidroxicloroquina, bafilamicina A1, 5- amino -4- imidazol carboxamida ribosídeo (AICAR), ácido ocadáico, N6- mercaptopurina ribosídeo, wortmanina, e vimblastina. Outros inibidores autofagia conhecidos na técnica estão contemplados para uso nos métodos descritos na presente invenção. Em certas modalidades, o ADI e o inibidor autofagia atua de uma formo Aditiva ou de uma forma sinérgica. Em uma outra modalidade, a arginina deiminase é ligada de uma maneira covalente a 5 ± 1,5 moléculas de PEG de cadeia linear e o composto é formulado em uma composição que compreende menos do que cerca de 0,5 % de ADI nativo, menos do que cerca de 5 % de PEG livre, ou ambos; em que a arginina deiminase é administrada semanalmente em uma dose de cerca de 160 UI/m2 a cerca de 640 UI/m2m2, e em que o câncer exibe a expressão reduzida de ASS.
[0010] Um aspecto da presente invenção proporciona um método de tratamento de um câncer em um paciente, que compreende a administração ao paciente de um composto que compreende ADI ligado de uma maneira covalente através de um grupo de ligação a polietilenoglicol, em que o câncer é selecionado a partir do grupo que consiste em câncer de mama, câncer do ovário, câncer colorretal, câncer gástrico, glioma, glioblastoma multiforme, o câncer de pulmão de não células pequenas (NSCLC), câncer de rim, câncer de bexiga, câncer de útero, câncer de esôfago, câncer de cérebro, cabeça e pescoço, câncer de colo do útero, câncer testicular, e câncer do estômago. Em uma modalidade, a arginina deiminase é ligada de uma maneira covalente a 5 ± 1,5 moléculas de PEG de cadeia linear e o composto é formulado em uma composição que compreende menos do que cerca de 0,5 % ADI nativo, menos do que cerca de 5 % de PEG livre, ou ambos; em que arginina deiminase é administrada semanalmente em uma dose de cerca de 160 UI/m2 a cerca de 640 UI/m2m2, e em que o câncer exibe expressão reduzida de ASS.
[0011] Um aspecto da presente invenção proporciona um método para o tratamento de melanoma em um paciente que compreende a administração ao paciente de um composto que compreende ADI ligado de uma maneira covalente através de um grupo de ligação a polietilenoglicol, em combinação com a cisplatina. Em uma modalidade, a arginina deiminase é ligada de uma maneira covalente a 5 ± 1,5 moléculas de PEG de cadeia linear e o composto é formulado em uma composição que compreende menos do que cerca de 0,5 % ADI nativo, menos do que cerca de 5 % de PEG livre, ou ambos; em que arginina deiminase é administrada semanalmente em uma dose de cerca de 160 UI/m2 a cerca de 640 UI/m2m2, e em que o melanoma exibe expressão reduzida de ASS.
[0012] Outro aspecto da presente invenção proporciona um método de tratamento de um câncer em um paciente, que compreende a administração ao paciente de um composto que compreende ADI ligado de uma maneira covalente através de um grupo de ligação a polietilenoglicol, em que o câncer não é o melanoma, o câncer do pâncreas, câncer da próstata, células pequenas câncer de pulmão, mesotelioma, leucemia linfocítica, leucemia mieloide crônica, linfoma, hepatoma, e sarcoma. Em uma modalidade, a arginina deiminase é ligada de uma maneira covalente a 5 ± 1,5 moléculas de PEG de cadeia linear e o composto é formulado em uma composição que compreende menos do que cerca de 0,5 % de ADI nativo, menos do que cerca de 5 % de PEG livre, ou ambos; em que arginina deiminase é administrada semanalmente em uma dose de cerca de 160 UI/m2 a cerca de 640 UI/m2m2, e em que o câncer exibe expressão reduzida de ASS.
[0013] Outro aspecto da presente invenção proporciona um método de tratamento de células não pequenas do câncer do pulmão, câncer da cabeça e do pescoço ou câncer da próstata em um paciente que compreende a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto que inclui arginina deiminase ligada de uma maneira covalente através de um grupo de ligação a polietilenoglicol, em combinação com o docetaxel. Em uma modalidade, a arginina deiminase é ligada de uma maneira covalente a 5 ± 1,5 moléculas de PEG de cadeia linear e o composto é formulado em uma composição que compreende menos do que cerca de 0,5 % ADI nativo, menos do que cerca de 5 % de PEG livre, ou ambos; em que arginina deiminase é administrado semanalmente na dose de cerca de m2m2160 UI /m2 a cerca de 640 UI/m2, e em que o câncer de células não pequenas do pulmão, cabeça e pescoço, câncer ou câncer de próstata apresenta expressão reduzida de ASS.
[0014] Outro aspecto da presente invenção proporciona um método de tratamento de carcinoma de células renais em um paciente que compreende a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto que inclui arginina deiminase ligada de uma maneira covalente através de um grupo de ligação a polietilenoglicol, em combinação com a rapamicina. Em uma modalidade, a arginina deiminase é ligada de uma maneira covalente a 5 ± 1,5 moléculas de PEG de cadeia linear e o composto é formulado em uma composição que compreende menos do que cerca de 0,5 % ADI nativo, menos do que cerca de 5 % de PEG livre, ou ambos; em que arginina deiminase é administrada semanalmente em uma dose de cerca de m2m2160 UI /m2 a cerca de 640 UI/m2, e em que o câncer exibe expressão reduzida de ASS.
[0015] Em certas modalidades da presente invenção, o ADI é ligado de uma maneira covalente a mais do que uma molécula de polietileno-glicol, ou de cerca de 9 a cerca de 12 moléculas de polietilenoglicol. Em uma outra modalidade da presente invenção, o polietileno-glicol tem um peso molecular médio total de cerca de 1.000 a cerca de 40.000, tem um peso molecular médio total de cerca de 10.000 a cerca de 30.000, e em certas modalidades, o polietileno glicol tem um peso molecular de 20.000.
[0016] Em certas modalidades da presente descrição o grupo de ligação é um grupo succinimida. Em certas modalidades, o grupo succinimida pode ser succinato de succinimidila, propionato de succinimidila, carboximetilato de succinimidila, succinamida de succinimidila, N-hidróxi succinimida ou a combinações dos mesmos. Em uma modalidade, o grupo succinimida é succinato de succinimidila, propionato de succinimidila ou as combinações dos mesmos.
[0017] Em certas modalidades da presente invenção o ADI não é isolado a partir de Mycoplasma arginini. Em outras modalidades, o ADI é isolado a partir de Mycoplasma hominis. Em uma modalidade particular, o ADI foi modificado para estar livre de, pelo menos, uma lisina na posição 112, 374, 405 ou 408 da SEQ ID NO: 1, e em uma outra modalidade, o ADI compreende a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 2. Em uma modalidade, a arginina deiminase é ligada de uma maneira covalente a 5 ± 1,5 moléculas de PEG, e em certas modalidades do PEG é o PEG de cadeia linear.
[0018] Em algumas modalidades dos métodos atuais, o ADI é administrado a partir de cerca de duas vezes por semana a cerca de uma vez a cada duas semanas, e em uma modalidade particular, o ADI é administrado semanalmente.
[0019] Em uma modalidade, o ADI é administrado a uma dose de entre cerca de 80 UI/m2 e cerca de 640 UI/m2m2, e em uma modalidade particular, é administrado a uma dose de cerca de 160 UI/m2. Em uma outra modalidade, o ADI é administrado semanalmente em uma dose de cerca de 160 UI/m2.
[0020] Em uma modalidade, o composto usado nos métodos descritos na presente invenção que compreende arginina deiminase ligada de uma maneira covalente através de um grupo de ligação a polietilenoglicol, é formulado em uma composição que compreende menos do que cerca de 0,5 % de ADI nativo, menos do que cerca de 5 % de PEG livre, ou ambos.
[0021] Outro aspecto da presente invenção proporciona um método de tratamento de GVHD em um paciente que compreende a administração ao paciente de um composto que compreende ADI ligado de uma maneira covalente através de um grupo de ligação a polietilenoglicol.
[0022] Um outro aspecto da presente invenção proporciona um método de tratamento de um câncer em um paciente, que compreende a administração ao paciente de um composto que compreende ADI ligado de uma maneira covalente através de um grupo de ligação a polietilenoglicol, em que o câncer exibe ASS. Em uma modalidade, o câncer é selecionado a partir do grupo que consiste em leucemia, leucemia mieloide aguda, leucemia mieloide aguda recidiva, câncer de mama, câncer do ovário, câncer colorretal, câncer gástrico, glioma, glioblastoma multiforme, câncer do pulmão de células não pequenas (NSCLC), câncer de rim, câncer de bexiga, câncer de útero, câncer de esôfago, câncer de cérebro, cabeça e pescoço, câncer de colo uterino, câncer testicular e câncer de estômago. Em uma outra modalidade, a expressão diminuída de rASS resulta na metilação do promotor de argininossuccinato sintetase. Em uma outra modalidade, a expressão reduzida de ASS resulta em uma mutação ou em uma deleção de DNA. Em uma modalidade particular, a expressão reduzida de ASS resulta na deleção ou na transposição do local 9q34 como parte do " cromossoma Filadélfia ". Em certas modalidades, o câncer exibe expressão reduzida de ASS.
[0023] Ainda um outro aspecto da presente invenção proporciona um método de tratamento de um câncer em um paciente, que compreende a administração ao paciente de um composto que compreende ADI ligado de uma maneira covalente através de um grupo de ligação a polietilenoglicol, em que o câncer exibe expressão reduzida de liase de argininossuccinato. Em uma modalidade, o câncer é selecionado a partir do grupo que consiste em leucemia, leucemia mieloide aguda, leucemia mieloide aguda recidiva, câncer de mama, câncer do ovário, câncer colorretal, câncer gástrico, glioma, glioblastoma multiforme, câncer do pulmão de células não pequenas (NSCLC), câncer de rim, câncer de bexiga, câncer de útero, câncer de esôfago, câncer de cérebro, cabeça e pescoço, câncer de colo uterino, câncer testicular e câncer de estômago. Em uma modalidade, a expressão reduzida de ASL resulta na metilação do promotor de liase de argininossuccinato. Em certas modalidades, a expressão reduzida de ASL resulta em uma mutação ou em uma deleção de DNA. Em uma modalidade particular, o câncer é ASL negativo.
[0024] Em certas modalidades da presente invenção, o tratamento com o ADI-PEG inibe a síntese de NO, inibe a angiogênese, induz a apoptose em células de tumor, ou uma combinação dos mesmos, in vivo. Em certas modalidades o tratamento resulta na doença estável. Em outras modalidades, o tratamento aumenta o tempo de sobrevivência livre de progressão no paciente. Ainda em uma outra modalidade, a arginina do plasma está esgotada durante pelo menos um mês, ou mais de 2 meses.
[0025] Em certas modalidades, os métodos descritos na presente invenção compreendem ainda a administração de um agente terapêutico, tal como um agente quimioterapêutico, incluindo, mas não limitado a, ciclofosfamida, gencitabina, cisplatina, sorafenib, sunitinib e everolimus. Em certas modalidades, o ADI e o agente quimioterapêutico atua de formo Aditiva ou de forma sinérgica.
BREVE DESCRIÇÃO DA LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS
[0026] SEQ ID NO: 1 é a sequência de aminoácidos de uma proteíno ADI M. hominis do tipo selvagem.
[0027] SEQ ID NO: 2 é a sequência de aminoácidos de uma proteíno ADI de M. hominis modificada.
[0028] SEQ ID NO: 3 e 4 são os iniciadores de PCR usados para amplificar a sintetase de cDNA argininossuccinato.
[0029] BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[0030] A Figura 1 é um diagrama do metabolismo arginina através do ciclo de Krebs (ureia).
[0031] A Figura 2 mostra a indução de apoptose dependente de caspases e autofagia de células de câncer do pâncreas por ADI in vitro. A Figura 2A é um gráfico de barras que mostra a percentagem de células que sofrem morte celular após a incubação com um inibidor da pan- caspase zVAD - fmk (" zVAD ") e/ ou ADI- PEG. A Figura 2B é um gráfico de barras que mostra a percentagem de células positivas para anexina V na sequência de uma incubação de 72 horas com o ADI-PEG em comparação com um controle de PBS.
[0032] A Figura 3 mostra os níveis de expressão de caspase 3 clivados, p62 e LC3B após a incubação de células de câncer pancreático humano com hidroxicloroquina (" CHQ ") e/ ou ADI- PEG.
[0033] As Figuras 4A e 4B mostram a porcentagem de células positivas para anexina V e células sub-G0/ G1 após a incubação de células de câncer de pâncreas humanos com CHQ e/ ou ADI- PEG.
[0034] A Figura 5 mostra o volume do tumor em camundongos após tratamento com cloroquina (CQ) e/ ou ADI- PEG. Os xenoenxertos Subcutâneos da linhagem celular do câncer de pâncreas humano MIA PaCa -2 foram estabelecidos em camundongos atímicos.
[0035] A Figura 6 mostra a histopatologia de MIA dos tumores PaCa - 2 após tratamento com cloroquina e/ ou ADI- PEG. A primeira coluna mostra coloração H & E, a segunda coluna mostra a coloração para caspase ativa 3, a terceira coluna mostra a coloração para a fragmentação do DNA através do ensaio de TUNEL, e a quarta coluna mostra a coloração para p62.
[0036] A Figura 7 mostra a expressão de ASS em tumores de câncer de pulmão de células pequenas humanas e linhagens de células. O anticorpo anti -ASS 195-21-1 foi usado para detectar a expressão de proteína ASS na pele normal (Figura 7A), carcinoma do cólon (Figura 7B), e câncer do pulmão de células pequenas (Figura 7C). A Figura 7D mostra a expressão da proteína ASS em um painel de linhagens de pulmão de células pequenas cancerosas em comparação com controle SW1222 células cancerígenas do cólon positivos por western blot. A figura 7E mostra a correlação entre a expressão da proteína ASS como medido por Western blot com a expressão do mRNA determinado por qRT -PCR.
[0037] A Figura 8 mostra a inibição da proliferação in vitro de células cancerígenas das células pequenas do pulmão negativas ASS por ADI- PEG 20. As células aderentes (Figura 8A) e não aderentes (figura 8B) foram tratadas com ADI- PEG 20 durante 120 horas antes de proliferação ter sido ensaiada utilizando o ensaio de MTS para células aderentes ou o ensaio de proteína total de BCA para as células não aderentes.
[0038] A Figura 9 mostra que o ADI induz a apoptose em autofagia - 13 SK -LC de células cancerígenas das células pequenas do pulmão negativas ASS. Para células ativadas por meio da fluorescência da triagem de análise do teor de DNA sub -G1 demonstrando a apoptose, as células foram incubadas em meio de controle (Figura 9A), 25 nM de topotecano (Figura 9B), 1,0 ml de mUI -1 ADI- PEG 20 (Figura 9C), e 10 mL de mUI -1 ADI- PEG 20 (Figura 9D), durante 72 horas antes da coloração do DNA com iodeto de propídio (PI). A Figura 9E mostra o nível de proteína LC3 -I e LC3- II após 24 horas de incubação com ADI- PEG 20 ou cloroquina (" CQ ") de controle positivo. A Figura 9F mostra caspase 3 ativa detectada por meio de western blot em células SK -LC- 13 (Figura 9F).
[0039] A Figura 10 mostra o silenciamento da expressão ASS com siRNA. A Figura 10A mostra a expressão relativa da expressão do mRNA de ASS determinada por RT-PCR em células SW1222 tratadas com siRNA ASS. A Figura 10B mostra a expressão relativa de proteína ASS avaliada por meio de western blot em células SW1222 tratadas com siRNA ASS. A Figura 10C mostra a proliferação das células tratadas com 20 ADI- PEG como medido por meio do ensaio de proliferação de MTS.
[0040] A Figura 11 mostra a inibição do crescimento de tamanho moderado de xenoenxertos de câncer de pulmão de células pequenas SK -LC- 13 em camundongos BALB/ c nus por meio do ADI formulado com PEG de 20.000 MW (ADI- PEG 20). As curvas de crescimento de volumes tumorais de camundongos que receberam PBS veículo (círculo cheio), em um curso de 20 dias de curta duração (de dosagem a cada 5 dias) de ADI- PEG 20 (preenchimento do quadrado), ou em dosagem continua (cada 5 dias até o término do grupo) de ADI- PEG 20 (quadrado aberto), em doses de 1 UI por camundongo (Figura 11A), de 2 UI por camundongo (Figura 11B), e 5 UI por camundongo (Figura 11C) são mostradas. Os volumes dos tumores de terminação do grupo de controle no dia 33 são mostrados na Figura 11D. Os níveis séricos de ADI-PEG 20 (Figura 11E), arginina (Figura 11F), e citrulina (Figura 11G) são apresentados para os dias 0, 12 e 40 do estudo. Os valores são os mesmos em coortes de dosagem curtos e prolongados no dia 0 e 12, com a dosagem prolongada apenas sendo iniciada no dia 20.
[0041] A Figura 12 mostra a curva de crescimento dos volumes de tumor de ASS positivos pequenas NCI- H69 xenoenxertos de câncer do pulmão de células em camundongos BALB/ c nu crescimento. Os camundongos receberam PBS veículo ou 2 UI ADI- PEG 20 por rato (setas pretas).
[0042] A Figura 13 mostra a inibição de grandes de xenoenxertos de câncer de pulmão de células pequenas SK -LC- 13 em camundongos BALB/ c -nu. As curvas de crescimento de volumes tumorais de camundongos que receberam PBS veículo (círculo), um curso de curta duração 20 dias de ADI- PEG 20 (setas pretas) (quadrado), ou a dosagem contínua de ADI- PEG 20 (setas cinzentas) (triângulo) em doses de 1 UI por rato (Figura 13A), de 2 UI por rato (Figura 13B), e 5 UI por rato (Figura 13C) são mostradas. Os volumes dos tumores de terminação do grupo de controle no dia 32 são mostrados na Figura 13D.
[0043] A Figura 14 mostra a responsabilidade célula relativa em relação ao respectivo em tratamentos in vitro com ADI- PEG 20 e autofagia do inibidor cloroquina.
[0044] A Figura 15 mostra um gráfico dos dados de xenoenxerto que demonstra que a combinação de ADI- PEG 20 e cisplatina resulta em atividade antitumoral melhorada em células de melanoma deficientes de ASS.
[0045] A Figura 16 mostra um gráfico dos dados de xenoenxerto que demonstra que a combinação de ADI-PEG- 20 e os resultados de rapamicina em maior atividade antitumoral contra a linhagem celular de xenoenxertos de carcinoma de células renais Caki -1.
DESCRIÇÃO DETALHADA
[0046] A presente invenção refere-se, de uma maneira geral, aos métodos de tratamento de câncer com o ADI e, nomeadamente, o ADI-PEG.
[0047] As células normais não necessitam de arginina para o crescimento, uma vez que podem sintetizar a arginina a partir de citrulina em um processo em duas fases catalisadas por ASS e ASL (vide a Figura 1). Por outro lado, certos tipos de câncer não expressam ASS. Certos cânceres não expressam ASL, e outros tipos de câncer podem ter diminuído de expressão, ou podem não expressar ASS e/ ou o ASL. Portanto, esses cânceres são auxotróficos para arginina. Esta diferença metabólica pode ser capitalizada para desenvolver uma terapia segura e eficaz para tratar estas formas de câncer. ADI catalisa a conversão de arginina em citrulina pela via dihidrolase arginina, e pode assim ser usada para eliminar a arginina.
[0048] A prática da presente invenção irá empregar, a menos que seja especificamente indicado de uma outra maneira aos métodos convencionais de virologia, imunologia, microbiologia, biologia molecular e técnicas de DNA recombinante dentro da perícia na técnica, muitas das quais estão descritas abaixo para fins de ilustração. Tais técnicas são completamente explicadas na literatura. Vide, por exemplo, os Protocolos em Ciência da Proteína, Protocolos atuais em Biologia Molecular ou Protocolos Atuais em Imunologia, John Wiley & Sons, New York, NY (2009), Ausubel et al, Protocolos curtos em Biologia Molecular, 3 a ed, Wiley& Sons, 1995; Sambrook e Russell,Clonagem Molecular: Um Manual Laboratorial (3rd Edition, 2001), Maniatis et al. Clonagem Molecular: Um Manual Laboratorial (1982), Clonagem de DNA: Uma abordagem prática, vol. I & II (D. Glover, ed.), Síntese de Oligonucleotídeos (N. Gait, ed, 1984.), Hibridização de Ácidos Nucleicos (B. Hames & S. Higgins, eds, 1985.); Transcrição e tradução (B. Hames & S. Higgins, eds, 1984);. Cultura celular Animal (R. Freshney, ed, 1986);. Perbal, Um Guia Prático para Clonagem Molecular (1984) e outras referências similares.
[0049] Tal como é usado no presente relatório descritivo e nas reivindicações anexas, as formas singulares "um", "uma", "a" e "o" incluem as referências plurais a menos que o conteúdo dite claramente o contrário.
[0050] Ao longo deste presente relatório descritivo, a menos que o contexto exija o contrário, a palavra " compreendem", ou variações tais como " compreende " ou "que compreende", serão entendidas como implicando a inclusão de um referido elemento ou número inteiro ou grupo de elementos ou números inteiros, mas não a a exclusão de qualquer outro elemento ou número inteiro ou grupo de elementos ou números inteiros.
[0051] Cada modalidade no presente relatório descritivo, deve ser aplicada mutatis mutandis a qualquer outra modalidade, a menos que expressamente indicado em contrário.
[0052] As técnicas padrão podem ser usadas para o DNA recombinante, síntese de oligonucleotídeos, e cultura de tecidos e transformação (por exemplo, electroporação, lipofecção). As reações enzimáticas e as técnicas de purificação podem ser realizadas de acordo com as especificações do fabricante ou como realizadas normalmente na técnica ou como descrito na presente invenção. Estas e outros técnicas e procedimentos podem geralmente ser efetuadas de acordo com métodos convencionais bem conhecidos na técnica e tal como descrito em várias referências gerais e mais específicas que são citadas e discutidas ao longo do presente relatório descritivo. A menos que definições específicas sejam fornecidas, a nomenclatura usada em conexão com, e os procedimentos e as técnicas de laboratório, de biologia molecular, da química analítica, química orgânica sintética, e química medicinal e farmacêutica descritas na presente invenção são os bem conhecidos e vulgarmente usados na técnica. As técnicas padrão podem ser usadas para a tecnologia recombinante, biológica, microbiológica, sínteses moleculares químicas, análises químicas, a preparação farmacêutica, formulação e entrega e tratamento de pacientes.
[0053] O termo "Paciente" refere-se a um animal, em certas modalidades a um mamífero, e em uma modalidade específica, um ser humano.
[0054] O termo "Biocompatível" refere-se a materiais ou compostos que geralmente não são prejudiciais às funções biológicas e que não irão resultar em nenhum grau de toxicidade inaceitável, incluindo os estados alérgicos e patológicos.
[0055] Ao longo da presente invenção, podem ser usadas as seguintes abreviaturas: PEG, polietilenoglicol ; ADI, arginina deiminase ; SS, succinato de succinimidila; SSA, succinamida succinimidila, SPA, propionato de succinimidila; NHS, N-hidróxi - succinimida ; ASS1 ou ASS, argininossuccinato sintetase ; ASL, liase de argininossuccinato.
[0056] Na presente invenção, o gene ADI pode ser derivado, clonado ou produzido a partir de qualquer fonte, incluindo, por exemplo, microrganismos, biotecnologia recombinante ou qualquer combinação dos mesmos. Por exemplo, a arginina deiminase pode ser clonada a partir de microrganismos dos gêneros Mycoplasma, Clostridium, Bacillus, Borrelia, Enterococcus, Streptococcus, Lactobacillus, Giardia. Em certas modalidades, a arginina deiminase é clonada a partir de Mycoplasma pneumoniae, Mycoplasma hominis, Mycoplasma arginini, Streptococcus pyogenes, Streptococcus pneumoniae, Borrelia burgdorferi, Borrelia afzelii, Giardia intestinalis, Clostridium perfringens, Bacillus licheniformis, Enterococcus faecalis, Lactobacillus sake, ou qualquer combinação dos mesmos. Em particular, ADI usado na presente invenção pode compreender a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1 ou 2, ou uma variante deste possuindo atividade ADI (por exemplo, capaz de metabolizar a arginina em citrulina e amoníaco) ou um fragmento do mesmo tendo atividade ADI.
[0057] Em certas modalidades da presente invenção, o ADI é clonado a partir de microrganismos do gênero Mycoplasma. Em outras modalidades, o ADI é clonado a partir de Mycoplasma hominis, Mycoplasma arthritides ou qualquer combinação dos mesmos e não é derivado de Mycoplasma arginini. Em particular, o ADI usado na presente invenção pode ter a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 1 ou 2, ou uma variante do mesmo possuindo atividade ADI (por exemplo, capaz de metabolizar a arginina em citrulina e amoníaco) ou um fragmento do mesmo tendo atividade de ADI.
[0058] ADI nativo pode ser encontrado em microrganismos e é antigênico e rapidamente eliminado da circulação em um paciente. Estes problemas podem ser superados através da modificação ADI. Dessa maneira, a presente invenção fornece ADI modificado por meio de um agente de modificação, incluindo, mas não se limitando a polímeros de macromoléculas, peptídeos, proteínas, polissacarídeos, ou outros compostos. A arginina deiminase e o agente de modificação pode ser ligado, quer por ligação covalente ou interação não covalente para formar um conjugado estável ou uma composição estável para atingir o efeito desejado. Em certas modalidades, o ADI modificado retém a atividade biológica de ADI e tem uma longa semi- vida in vivo e menor antigenicidade do que o ADI não modificado. Em certas modalidades, o ADI modificado retém pelo menos 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou mais da atividade biológica do ADI não modificado.
[0059] Em uma modalidade, um agente de modificação pode ser um polímero ou uma proteína ou um fragmento do mesmo que é biocompatível e pode aumentar a meia vida do ADI no sangue. O agente de modificação pode ser quer quimicamente acoplado o ADI ou se for caso disso, ligado ao ADI através de expressão da proteína de fusão.
[0060] Os polímeros macromoleculares podem incluir um polímero macromolecular não peptídico, o que em certas modalidades, pode ter a sua própria bioatividade. Os polímeros adequados incluem, mas não estão limitados a, compostos polienol, compostos de poliéter, polivinilpirrolidona, poli- aminoácidos, copolímero de éter divinílico e anidrido maléico, N- (2-hidroxipropil) - metacrilamida, polissacarídeo, poliol polioxietilado, a heparina ou o fragmento do mesmo, poli -alquil- etileno -glicol e seus derivados, copolímeros de poli -alquil- etileno - glicol e seus derivados, poli (éter vinil etílico), a, P - poli [(2 -hidroxietil)- DL- aspartamida ], policarboxilatos, poli- oxietileno - oximetilenos, morfolinas poliacriloílas, copolímero de compostos amino e oxiolefina, ácido hialurônico, poli polioxiranos, copolímero de ácido malônico e ácido etanodióico, poli (1,3- dioxolano), copolímero de etileno e de hidrazida maléica, ácido poli- siálico, ciclodextrina, etc Em certas modalidades, o polímero é o polietilenoglicol.
[0061] Os compostos polienol tal como usados na presente invenção incluem, mas não estão limitados a, polietileno-glicol (incluindo o monometoxi- polietileno -glicol, polietileno-glicol monohidroxil), álcool polivinílico, álcool polialilico, polibutenol e similares, e os seus derivados, tais como lipídeos.
[0062] Os compostos de poliéter incluem, mas não estão limitados a poli- alquileno -glicol (HO ((CH2) xO) NH), polipropileno -glicol, polioxirehileno (HO ((CH2) 2O) nH), álcool polivinílico ((CH2CHOH)n).
[0063] Os poliaminoácidos sintéticos incluem, mas não estão limitados a, polímeros de um tipo de aminoácido ou copolímeros de dois ou mais tipos de aminoácidos, por exemplo, polialanina ou polilisina, ou copolímeros em bloco dos mesmos.
[0064] Os polissacarídeos incluem, mas não estão limitados a, glucosan e seus derivados, por exemplo, sulfato de dextrano, celulose e seus derivados (incluindo metil-celulose e carboximetil-celulose), amido e seus derivados, polissacarose, etc.
[0065] Em uma modalidade específica da presente invenção, o ADI é modificado por meio do acoplamento com proteínas ou peptídeos, em que uma ou mais proteínas ou peptídeos estão direta ou indiretamente ligadas o ADI. As proteínas podem ser proteínas naturalmente existentes ou os fragmentos dos mesmos, incluindo, mas não limitados a proteínas existentes naturalmente no soro humano ou os fragmentos dos mesmos, tais como proteína de ligação a tiroxina, a transtirretina, a1- glicoproteína ácida, a transferrina, o fibrinogênio, a imunoglobulina, Ig Fc reguis, albumina, e os fragmentos dos mesmos. Por "fragmento" entende-se qualquer porção de uma proteína que é menor do que toda a proteína, mas que retém a função desejada da proteína. ADI pode ser direta ou indiretamente ligado a uma proteína através de uma ligação covalente. A Ligação direta significa que um aminoácido de ADI está diretamente ligado a um aminoácido da proteína de modificação, através de uma ligação peptídica, ou uma ponte dissulfureto. A ligação Indireta refere-se à articulação entre ADI e uma proteína modificante, através de uma originalmente existente química entre os mesmos grupos ou grupos químicos específicos adicionados por meios químicos ou biológicos, ou a combinação das ligações mencionadas acima.
[0066] Em uma modalidade particular, o ADI é modificado por meio da ligação covalente com PEG. De uma maneira covalente ADI modificado com PEG (com ou sem um grupo de ligação) pode ser daqui por diante referido como " o ADI-PEG ". Quando comparado com ADI nativo, ADI- PEG retém a maior parte da sua atividade enzimática, é muito menos antigênico, tem uma circulação meia-vida muito prolongada, e é muito mais eficaz no tratamento de tumores.
[0067] O termo "polietileno glicol" ou "PEG" refere-se a mistura de polímeros de condensação de óxido de etileno e água, em uma cadeia ramificada ou linear, representada por meio da fórmula geral H (OCH2CH2) nOH em geral, em que n é pelo menos 4. "Polietileno glicol" ou "PEG" é usado em combinação com um sufixo numérico para indicar o peso molecular médio aproximado dos mesmos. Por exemplo, PEG 5,000 refere-se a PEG possuindo um peso molecular médio total de cerca de 5.000 ; PEG 12,000 refere-se a PEG possuindo um peso molecular médio total de cerca de 12.000, e PEG 20,000 refere-se a PEG possuindo um peso molecular médio total peso de cerca de 20.000.
[0068] Em uma modalidade da presente invenção, o PEG tem um peso molecular médio total de cerca de 1.000 a cerca de 50.000, em uma modalidade de cerca de 3.000 a cerca de 40.000, e em outra modalidade de cerca de 5.000 a cerca de 30.000, em certas modalidades de cerca de 8.000 a cerca de 30.000, em outras modalidades de cerca de 11.000 a cerca de 30.000, em modalidades adicionais, a partir de cerca de 12.000 a cerca de 28.000, em ainda outras modalidades, entre cerca de 16.000 a cerca de 24.000, e em outras modalidades, cerca de 18.000 a cerca de 22.000, em uma outra modalidade, a partir de cerca de 19.000 a 21.000, e em uma modalidade, o PEG tem um peso molecular médio total de cerca de 20.000. Geralmente, o PEG com um peso molecular de 30.000 ou mais é difícil de dissolver e os rendimentos do produto formulado são muito reduzidos. O PEG pode apresentar uma cadeia linear ou ramificada, ou, em certas modalidades, uma cadeia linear. Geralmente, o aumento do peso molecular do PEG diminui a imunogenicidade do ADI. O PEG tendo um peso molecular descrito nesta modalidade pode ser usado em conjunto com o ADI e, opcionalmente, um grupo de ligação biocompatível para tratar o câncer, incluindo, por exemplo, leucemia mieloide aguda, tal como uma recaída de leucemia mieloide aguda, câncer de mama, câncer de ovário, câncer colorretal, câncer gástrico, glioma, glioblastoma multiforme, o câncer de pulmão das células não pequenas (NSCLC), câncer de rim, câncer de bexiga, câncer de útero, câncer de esôfago, câncer de cérebro, cabeça e pescoço, câncer de colo do útero, câncer testicular, câncer de estômago e câncer de esôfago.
[0069] Em uma outra modalidade da presente invenção, o PEG tem um peso molecular médio total de cerca de 1.000 a cerca de 50.000, em certas modalidades de cerca de 3.000 a cerca de 30.000, em outras modalidades de cerca de 3.000 a cerca de 20.000, em uma modalidade de cerca de 4.000 a cerca de 12.000, em ainda outras modalidades de cerca de 4.000 a cerca de 10.000, em modalidades adicionais de cerca de 4.000 a cerca de 8.000 ; ainda outras modalidades de cerca de 4.000 a cerca de 6.000 e cerca de 5.000, em outra modalidade. O PEG pode ser uma cadeia ramificada ou linear, e em certas modalidades é uma cadeia linear. O PEG tendo um peso molecular descrito nesta modalidade pode ser usado em conjunto com o ADI e, opcionalmente, um grupo de ligação biocompatível para tratar enxerto versus doença do hospedeiro (GVHD), ou câncer.
[0070] Enquanto o ADI-PEG representa o ADI modificado ilustrativo descrito na presente invenção, como seria reconhecido pela pessoa que é versada na técnica, o ADI pode ser modificado com outros polímeros ou moléculas adequadas para o efeito desejado, nomeadamente a redução da imunogenicidade e o aumento da semivida sérica.
[0071] ADI pode ser ligado de forma covalente a um agente de modificação, tal como PEG, com ou sem um grupo de ligação, apesar de uma modalidade preferida utilizar um grupo de ligação.
[0072] O grupo de ligação usado para unir de uma maneira covalente ADI a um agente de modificação, por exemplo, PEG pode ser qualquer grupo de ligação biocompatível. Como discutido acima, "biocompatível" indica que o composto ou grupo não é tóxico e pode ser usado in vitro ou in vivo sem provocar lesão, enfermidade, doença ou morte. Um agente de modificação, tal como PEG, pode ser ligado ao grupo de ligação, por exemplo, através de uma ligação éter, uma ligação éster, uma ligação tiol ou uma ligação amida. Os grupos de ligação biocompatíveis adequados incluem, por exemplo, um grupo éster, um grupo amida, um grupo imida, um grupo carbamato, um grupo carboxila, um grupo hidroxila, um hidrato de carbono, um grupo succinimida (incluindo, por exemplo, succinato de succinimidila (SS), propionato de succinimidila (SPA), carboximetilato succinimidila (SCM), succinamida succinimidila (SSA) ou N -hidróxi-succinimida (NHS)), um grupo epóxido, um grupo oxicarbonilimidazol (incluindo, por exemplo, carbonildimidazol (CDI)), um grupo nitro, grupo fenila (incluindo, por exemplo, carbonato de nitrofenila (NPC) ou carbonato de triclorofenila (TPC)), um grupo trisilato, um grupo aldeído, um grupo isocianato, um grupo vinilsulfona, um grupo tirosina, um grupo cisteína, um grupo histidina ou uma primária amina. Em uma modalidade, o grupo de ligação biocompatível é um grupo éster e/ ou um grupo succinimida. Em uma outra modalidade, o grupo de ligação é SS, SPA, SCM, SSA ou NHS, em certas modalidades, SS, SPA ou NHS sendo os mais preferidos, e em outras modalidades, SS ou SPA sendo os mais preferidos.
[0073] De uma maneira alternativa, o ADI pode ser acoplado diretamente a um agente modificador, tal como PEG (isto é, sem um grupo de ligação) através de um grupo amino, um grupo sulfhidral, um grupo hidroxila ou um grupo carboxila.
[0074] ADI pode ser ligado de forma covalente ao PEG atraves de um grupo de ligação biocompatível, utilizando os métodos conhecidos na técnica, como descrito, por exemplo, por Park et al, Anticancer Res, 1: 373 a 376 (1981),. E Zaplipsky e Lee, Química de polietileno Glicol: Aplicações Biotécnicas e aplicações biomédicas, JM Harris, Ed., Plenum Press, Nova Iorque, Capítulo 21 (1992), as descrições das quais são incorporadas na presente invenção por meio de referência na sua totalidade.
[0075] A ligação do PEG em ADI aumenta a semivida de circulação do ADI. Geralmente, PEG é ligado a uma amina primária do ADI. A seleção do local de ligação do PEG, ou de outro agente de modificação, no ADI é determinada pelo papel de cada um dos locaiss dentro do domínio ativo da proteína, tal como seria conhecido por meio da pessoa que é versada na técnica. PEG pode ser ligado às aminas primárias do ADI, sem perda substancial de atividade enzimática. Por exemplo, o ADI clonado de Mycoplasma arginini, Mycoplasma arthritides e Mycoplasma hominis possui cerca de 17 lisinas que podem ser modificadas por meio deste processo. Em outras palavras, as 17 lisinas são todas possíveis pontos em que o ADI pode ser anexado ao PEG através de um grupo de ligação biocompatível, tal como SS, SPA, SCM, SSA e/ ou NHS. PEG pode também ser ligado a outros locais no ADI, tal como seria aparente para uma pessoa que é versada na técnica à vista da presente invenção.
[0076] Desde 1 até cerca de 30 moléculas de PEG podem ser ligadas de uma maneira covalente ao ADI. Em certas modalidades, ADI é modificado com uma molécula de PEG. Em outras modalidades, ADI é modificado com mais de uma molécula de PEG. Em uma modalidade, ADI é modificado com cerca de 7 a cerca de 15 moléculas de PEG, em uma modalidade de cerca de 9 a cerca de 12 moléculas de PEG. Em uma outra modalidade, o ADI é modificado com 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, ou 12 moléculas de PEG. Em uma modalidade específica, o ADI é modificado com 4,5 a 5,5 moléculas de PEG por ADI. Em uma outra modalidade, o ADI é modificado com 5 ± 1,5 moléculas de PEG.
[0077] Em uma outra modalidade, cerca de 30 % a cerca de 70 % dos grupos amino primários em ADI são modificados com PEG, em uma modalidade de cerca de 40 % a cerca de 60 %, ou, em certas modalidades cerca de 45 % até cerca de 55 %, e em outras modalidades cerca de 50 % dos grupos amino primários em arginina deiminase são modificados com PEG. Quando o PEG é ligado de forma covalente ao terminal final do ADI, pode ser desejável ter uma única molécula de PEG usado. O aumento do número de unidades PEG em ADI aumenta a semivida de circulação da enzima. No entanto, aumentar o número de unidades PEG em ADI diminui a atividade específica da enzima. Deste modo, um equilíbrio deve ser alcançado entre os dois, como seria evidente para uma pessoa que é versada na técnica em vista da presente invenção.
[0078] Na presente invenção, uma característica comum dos grupos de ligação biocompatíveis é que os mesmos atribuem a uma amina primária da arginina deiminase por meio de um grupo maleimido. Uma vez acoplado com ADI, PEG-SS tem uma ligação éster ao lado do PEG, o que pode tornar este local sensível à esterase no soro, o que pode libertar o PEG do ADI no corpo. SPA- PEG e PEG2-NHS não tem uma ligação éster, então eles não são sensíveis ao soro esterase.
[0079] Na presente invenção, os grupos de ligação especiais não parecem influenciar a semivida de circulação de ADI-PEG ou a sua atividade enzimática específica. No entanto, em certas modalidades, um grupo de ligação biocompatível é usado na presente invenção. PEG que é ligado à proteína tanto pode ser de cadeia linear, tal como com a SS- PEG, SPA- PEG e SC -PEG, ou uma cadeia ramificada de PEG pode ser usada, como com PEG2 -NHS.
[0080] Em certas modalidades, o ADI da presente invenção pode ser modificado como descrito na Patente U.S. No. 6.635.462. Em particular, as alterações de um ou mais resíduos de aminoácidos de ADI que ocorrem naturalmente, em particular a partir de Mycoplasma hominis, pode proporcionar para uma enzima que é mais facilmente renaturada e formuladoa melhorando assim as técnicas existentes para a fabricação de ADI e as composições terapêuticas que compreende os mesmos. Em uma modalidade, o ADI da presente invenção é modificado para remover um ou mais resíduos de lisina (por exemplo, a lisina pode ser substituída por um outro aminoácido). Em particular, em uma modalidade, o ADI é modificado para se tornar livre da lisina na posição 112, 374, 405 ou 408 da SEQ ID NO: 1.
[0081] Em certas modalidades, os locais de peguilação associados com o ADI localizado no ou adjacente à região catalítica da enzima são modificados. Para os fins da presente invenção, a frase " local de peguilação " pode ser definida como qualquer local ou posição de ADI que pode ser de uma maneira covalente modificada com polietilenoglicol. Um "local de peguilação " pode ser considerado localizado na ou adjacente à região catalítica da enzima, onde a peguilação no local resulta em uma redução significativa na atividade catalítica da enzima. A peguilação de tais locais tradicionalmente resultou na inativação da enzima. Por exemplo, o ADI de Mycoplasma hominis possui uma lisina na posição 112, que pode ser considerado estar no ou adjacente à região catalítica da enzima. A ligação do PEG a esta lisina na posição 112 pode inativar a enzima. Além disso, o ADI de Mycoplasma hominis possui uma cisteína na posição 397, que pode ser considerado estar no ou adjacente à região catalítica da enzima. As substituições de aminoácidos para cisteína na posição 397 pode inativar a enzima. Em particular, a substituição de alanina, histidina, arginina, serina, lisina ou tirosina por cisteína na posição 397 pode resultar em uma perda de toda a atividade de enzima detectável. ADI de Mycoplasma hominis também tem três lisinas localizadas perto esta cisteína conservada, em particular Lis374, Lis405 e Lis408. A ligação do PEG a Lis374, Lis405, Lis408 ou as combinações dos mesmos pode inativar a enzima.
[0082] É para ser entendido que o ADI derivado a partir de outros organismos pode também ter locais de peguilação correspondentes a posição 112 do ADI de Mycoplasma hominis. Por exemplo, o ADI a partir de Streptococcus pyrogenes possui lisina na posição 104, o ADI de Mycoplasma pneumoniae possui lisina na posição 106, e ADI a partir de Giardia intestinalis possui lisina na posição 114. Além disso, o ADI de alguns organismos pode possuir lisinas correspondendo à mesma localização geral como a posição 112 de ADI a partir de Mycoplasma hominis. A localização de lisina no ADI a partir de tais organismos é conhecida das pessoas que é versada na técnica e está descrita na Patente U.S. No. 6.635.462.
[0083] Dessa maneira, em uma modalidade, a presente invenção proporciona certas substituições de aminoácidos na cadeia polipeptídica do ADI. Estas substituições de aminoácidos proporcionam ADI modificada que perde menos atividade modificada sobre um agente de modificação, por exemplo, mediante peguilação. Ao eliminar os locais de peguilação, ou outros locais de modificação conhecidos, no ou adjacente à região catalítica da enzima, a modificação ótima, por exemplo, a peguilação, pode ser alcançada sem a perda de atividade.
[0084] É para ser entendido que outras modalidades da presente invenção são baseadas no entendimento de que certas características estruturais da arginina deiminase podem impedir ou interferir com a renaturação correta e rápida da arginina deiminase, quando produzidas através de tecnologia recombinante. Em particular, estas características estruturais dificultam ou impedem a enzima de assumir uma conformação ativa durante a produção recombinante. Para os fins da presente invenção, a frase "conformação ativa" pode ser definida como uma estrutura tridimensional que permite a atividade enzimática não modificada ou modificada por meio da arginina deiminase. A conformação ativa pode, em particular, ser necessária para catalisar a conversão de arginina em citrulina. A expressão " característica estrutural " pode ser definida como qualquer característica, qualidade ou propriedade da cadeia de polipetídeo resultante de um aminoácido particular ou da combinação de aminoácidos. Por exemplo, a arginina deiminase pode conter um aminoácido, que resulta em uma curvatura ou torção na cadeia peptídica normal e, dessa maneira, impede a enzima de assumir uma conformação ativa durante a renaturação da enzima. Em particular, a arginina deiminase de Mycoplasma hominis possui uma prolina na posição 210, que pode resultar em uma curva ou torção da cadeia peptídica, o que torna mais difícil para renaturar a enzima durante a produção recombinante. É para ser entendido que a arginina deiminase derivada de outros organismos pode também ter pontos correspondentes à posição 210 da arginina deiminase de Mycoplasma hominis.
[0085] A presente invenção proporciona de novo, dessa maneira, para certas substituições de aminoácidos na cadeia polipeptídica de arginina deiminase. Tais substituições de aminoácidos podem eliminar as características estruturais problemáticos na cadeia peptídica da arginina deiminase. Tais substituições de aminoácidos podem proporcionar uma melhor renaturação da arginina deiminase modificada. Estas possíveis substituições de aminoácidos fazem rápidas renaturação de arginina deiminase modificada utilizando as quantidades reduzidas de tampão. Estas substituições de aminoácidos também podem fornecer o aumento do rendimento de deiminase arginina renaturada modificada. Em uma modalidade da presente invenção, a modificação da arginina deiminase possui uma única substituição de aminoácido na P210. Como mencionado acima, a arginina deiminase derivada de Mycoplasma hominis possui o aminoácido prolina localizado na posição 210. Embora não limitando a presente invenção, crê-se presentemente que a presença do aminoácido prolina na posição 210 resulta em uma curvatura ou torção na cadeia de polipeptídeo normal que aumenta a dificuldade de renaturação (isto é, redobragem) da arginina deiminase. As substituições para prolina na posição 210 possibilitam a rápido renaturalização de modificação arginina deiminase usando as quantidades reduzidas do tampão. As substituições para prolina na posição 210 também pode fornecer o aumento do rendimento de deiminase arginina renaturada modificada. Em uma modalidade preferida, a prolina na posição 210 é substituída por serina. É para ser entendido que, de acordo com este aspecto da presente invenção, outras substituições na posição 210 podem ser feitas. Exemplos de outras substituições incluem Pro210 a Thr210, Pro210 a Arg210, Pro210 a Asn210, Gln210 ou Pro210 Pro210 para a Met210. Ao eliminar estas características estruturais associadas com o aminoácido da posição 210 da arginina deiminase de tipo selvagem, a redobragem apropriada da enzima pode ser conseguida.
[0086] Os métodos da presente invenção podem envolver as aplicações quer in vitro ou in vivo. No caso das aplicações in vitro, incluindo as aplicações da cultura de células, os compostos descritos na presente invenção podem ser adicionados às células em culturas e depois incubados. Os compostos da presente invenção também podem ser usados para facilitar a produção de anticorpos monoclonais e/ ou policlonais utilizando as técnicas de produção de anticorpo bem conhecidas na técnica. Os anticorpos monoclonais e/ ou policlonais podem então ser usados em uma vasta variedade de aplicações de diagnóstico, tal como seria aparente para uma pessoa que é versada na técnica.
[0087] Os meios in vivo de administração dos compostos da presente invenção podem variar, dependendo da aplicação pretendida. A administração das composições de ADI descritas na presente invenção, em forma pura ou em uma composição farmacêutica apropriada, pode ser realizada através de qualquer um dos modos de administração aceitos dos agentes para servir as utilidades similares. As composições farmacêuticas podem ser preparadas através da combinação de ADI, por exemplo, ADI- PEG, ADI-PEG- 20, com um veículo, diluente ou excipiente fisiologicamente aceitável adequado , e podem ser formulados em preparações em formas sólidas, semi- sólidas, líquidas ou gasosas, tais como comprimidos, cápsulas, pós, grânulos, soluções, pomadas, supositórios, injeções, inaladores, gases, microesferas, e aerossóis. Além disso, outros ingredientes farmaceuticamente ativos (incluindo outros agentes anticâncer, tal como descritos na presente invenção em um outro local) e/ ou excipientes adequados tais como sais, tampões e estabilizadores podem, mas não necessita, estar presente na composição. A administração pode ser conseguida por meio de uma variedade de diferentes vias, incluindo oral, parentérica, nasal, intravenosa, intradérmica, subcutânea ou tópica. Os modos de administração dependerão da natureza da condição a ser tratada ou prevenida. Dessa maneira, o ADI-PEG, por exemplo, o ADI- PEG 20, pode ser administrado por via oral, intranasal, intraperitoneal, parentérica, intravenosa, intralinfática, intratumoralmente, intramuscularmente, intersticialmente, intra- arterialmente, subcutaneamente, intraocularmente, intrasinovialmente, transepitelialmente e transdermicamente. Uma quantidade que, após a administração, reduz, inibe, impede ou retarda a progressão e/ ou a metástase de um câncer é considerado eficaz. Em certas modalidades, as composições de ADI na presente invenção aumentam o tempo médio de sobrevivência dos pacientes de uma quantidade estatisticamente significante. Em uma modalidade, os tratamentos ADI descritos na presente invenção aumentam o tempo médio de sobrevivência de um paciente, por 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, sete semanas, oito semanas, 9 semanas, 10 semanas, 15 semanas, 20 semanas, 25 semanas, 30 semanas, 40 semanas, ou mais. Em certas modalidades, os tratamentos do ADI aumentam o tempo médio de sobrevivência de um paciente por 1 ano, 2 anos e 3 anos ou mais. Em uma modalidade, os tratamentos ADI descritos na presente invenção aumentam a sobrevida livre de progressão em 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, cinco semanas, 6 semanas, sete semanas, 8 semanas, 9 semanas, 10 semanas ou mais. Em certas modalidades, os tratamentos ADI descritos na presente invenção aumentam a sobrevida livre de progressão em 1 ano, 2 anos, 3 anos, ou mais.
[0088] Em certas modalidades, a quantidade administrada é suficiente para resultar em uma regressão do tumor, tal como indicado por meio de uma diminuição estatisticamente significativa no valor de tumor viável, por exemplo, pelo menos uma redução de 50 % na massa de tumor, ou por meio da alteração (por exemplo, diminuição com significância estatística) das dimensões de digitalização. Em certas modalidades, a quantidade administrada é suficiente para resultar em uma doença estável. Em outras modalidades, a quantidade administrada é suficiente para resultar em uma redução clinicamente relevante nos sintomas de uma doença de particular indicação conhecida pelo médico especialista.
[0089] Em certas modalidades a quantidade administrada é suficiente para inibir a síntese de NO, inibir a angiogênese, ou e é suficiente para induzir a apoptose em células tumorais ou qualquer combinação dos mesmos. A síntese de NO, a angiogênese e a apoptose podem ser medidas utilizando os métodos conhecidos na técnica, vide, por exemplo, Protocolos Atuais na Imunologia ou Protocolos atuais na Biologia molecular, John Wiley & Sons, Nova Iorque, NY, EUA (2009 e atualizações), Ausubel et al, Protocolos Curtos na Biologia Molecular , 3a ed, Wiley & Sons, 1995, e outras referências. Em uma modalidade particular, a quantidade administrada inibe a síntese e inibe o crescimento do melanoma e sinergiza com outras quimioterapias, tal como descrito na presente invenção, tais como a cisplatina. Por conseguinte, uma modalidade da presente invenção proporciona um método para o tratamento de melanoma através da administração de ADI- PEG 20, em combinação com a cisplatina, em que o tratamento esgota o óxido nítrico endógeno (NO).
[0090] A dosagem precisa e a duração do tratamento é uma função da doença a ser tratada e pode ser determinada empiricamente usando protocolos de teste conhecidos ou testando as composições em sistemas de modelo conhecidos na técnica e extrapolando a partir dos mesmos. Os ensaios clínicos controlados também podem ser realizados. As dosagens podem também variar com a gravidade da condição a ser aliviada. Uma composição farmacêutica é geralmente formulada e administrada para exercer um efeito terapêutico útil, minimizando os efeitos secundários indesejáveis. A composição pode ser administrada uma vez, ou pode ser dividida em um número de doses menores a serem administradas em intervalos de tempo. Para qualquer indivíduo em particular, os regimes de dosagem específicos podem ser ajustados ao longo do tempo de acordo com a necessidade individual.
[0091] As composições de ADI podem ser administradas sozinhas ou em combinação com outros tratamentos de câncer conhecidos, tais como terapia de radiação, quimioterapia, transplante, imunoterapia, terapia hormonal, terapia fotodinâmica, etc As composições podem também ser administradas em combinação com antibióticos.
[0092] As vias típicas de administração destas composições farmacêuticas e similares incluem Dessa maneira, sem limitação, administração oral, tópica, transdérmica, inalação, parentérica, sublingual, bucal, retal, vaginal e intranasal. O termo parenteral como usado na presente invenção inclui injeções subcutâneas, intravenosas, intramusculares, injeção intra-esternal ou técnicas de infusão. As composições farmacêuticas de acordo com certas modalidades da presente invenção são formuladas de modo a permitir que os ingredientes ativos contidos nelas venham a ser biodisponíveis por meio da administração da composição a um paciente. As composições que serão administradas a um indivíduo ou paciente pode tomar a forma de uma ou mais unidades de dosagem, em que, por exemplo, um comprimido pode ser uma única unidade de dosagem, e um recipiente de uma composição de ADI descrito na presente invenção na forma de aerossol pode conter uma pluralidade de unidades de dosagem. Os métodos atuais de preparação de tais formas de dosagem são conhecidos, ou serão evidentes, para as pessoas que são versadas na técnica, por exemplo, vide Remington : A Ciência e Prática da Farmácia, 20a Edição (Philadelphia College of Farmacy and Science, 2000). A composição a ser administrada irá, em qualquer caso, conter uma quantidade terapeuticamente eficaz de um ADI-PEG da presente invenção, como ADI- PEG 20, para o tratamento de uma doença ou condição de interesse de acordo com os ensinamentos desta presente invenção.
[0093] Uma composição farmacêutica pode estar sob a forma de um sólido ou líquido. Em uma modalidade, o (s) veículo (s) é (são) de partículas, de modo que as composições estão, por exemplo, em forma de comprimido ou pó. O (s) veículo (s) pode (m) ser líquidos, sendo as composições, por exemplo, óleo de anoral, líquido injetável ou de um aerossol, o que é útil, por exemplo, a administração por meio da inalação. Quando se destinam a administração oral, a composição farmacêutica é geralmente quer em forma sólida ou em forma líquida, onde as formas semi-sólida, semi- líquida, suspensão e gel estão incluídas dentro das formas consideradas na presente invenção como sólidos ou líquidos.
[0094] Como uma composição sólida para administração oral, a composição farmacêutica pode ser formulada na forma de um pó, grânulo, prensada em comprimidos, comprimido, cápsula, goma de mascar, pastilha ou similares. Essa composição sólida conterá tipicamente um ou mais diluentes inertes ou veículos comestíveis. Além disso, um ou mais dos seguintes podem estar presentes : aglutinantes, tais como carboximetilcelulose, acetato de celulose, celulose microcristalina, goma tragacanta ou gelatina; excipientes, tais como amido, lactose ou dextrinas, agentes de desintegração tais como ácido algínico, alginato de sódio, Primogel, amido de milho e similares, lubrificantes, tais como estearato de magnésio ou Sterotex, agentes de deslizamento, tais como dióxido de silício coloidal, agentes edulcorantes tais como sacarose ou sacarina, um agente aromatizante tal como hortelã-pimenta, salicilato de metila ou aromatizante de laranja e um agente corante. Quando a composição farmacêutica está na forma de uma cápsula, por exemplo, uma cápsula de gelatina, pode conter, para além dos materiais do tipo acima, um veículo líquido tal como polietileno glicol ou óleo.
[0095] A composição farmacêutica pode estar na forma de um líquido, por exemplo, um elixir, xarope, solução, emulsão ou suspensão. O líquido pode ser para administração oral ou para entrega através de injeção, como dois exemplos. Quando se destinam a administração oral, a composição preferida contém, para além dos compostos presentes, um ou mais de um agente adoçante, conservantes, corantes/ corante e intensificador de sabor. Em uma composição destinada a ser administrada por injeção, uma ou mais de um tensoativo, um conservante, um agente molhante, agente dispersante, agente de suspensão, tampão, estabilizador e agente isotônico pode ser incluído.
[0096] As composições farmacêuticas líquidas, quer sejam soluções, suspensões ou outras, como forma, podem incluir um ou mais dos seguintes adjuvantes: diluentes estéreis tais como água para injeção, solução salina, em certas modalidades, uma solução salina fisiológica, solução de Ringer, cloreto de sódio isotônico, óleos fixos, tais como mono ou diglicerídeos de síntese que podem servir como o meio dissolvente ou de suspensão, polietileno-glicóis, glicerina, propileno glicol ou outros solventes, agentes antibacterianos, tais como álcool benzílico ou metil-parabeno, antioxidantes tais como ácido ascórbico ou bissulfito de sódio; quelantes os agentes tais como o ácido etilenodiaminotetracético ; tampões tais como acetatos, citratos ou fosfatos e agentes para o ajustamento da tonicidade tais como cloreto de sódio ou dextrose. A preparação parentérica pode ser encerrada em ampolas, seringas descartáveis ou frascos de doses múltiplas feitas de vidro ou plástico. A solução salina fisiológica é um adjuvante preferido. Uma composição farmacêutica injectável é de preferência estéril.
[0097] Uma composição farmacêutica líquida destinada à administração parentérica ou oral deve conter uma quantidade de ADI como descrito na presente invenção, tal como ADI- PEG 20, tal que uma dosagem adequada será obtida. Tipicamente, esta quantidade é pelo menos 0,01 % de ADI na composição. Quando se destinam a administração oral, esta quantidade pode ser variada entre 0,1 e cerca de 70 % do peso da composição. Certas composições farmacêuticas orais contêm entre cerca de 4 % e cerca de 75 % de ADI-PEG. Em certas modalidades, as composições e as preparações farmacêuticas de acordo com a presente invenção são preparadas de modo que uma unidade de dosagem parenteral contenha entre 0,01 a 10 % em peso de ADI- PEG antes da diluição.
[0098] A composição farmacêutica pode ser destinada para administração tópica, caso em que o veículo pode compreender adequadamente uma solução, emulsão, pomada ou base de gel. A base, por exemplo, pode compreender um ou mais dos seguintes: vaselina, lanolina, polietilenoglicóis, cera de abelha, óleo minaral, diluentes, tais como água e álcool, e emulsionantes e estabilizantes. Os agentes de espessamento podem estar presentes em uma composição farmacêutica para administração tópica. Se se destinar a administração transdérmica, a composição pode incluir um adesivo transdérmico ou dispositivo de iontoforese. A composição farmacêutica pode ser destinada para administração retal, sob a forma, por exemplo, de um supositório, que fundirá no reto e libertará o fármaco. A composição para administração retal pode conter uma base oleaginosa como um excipiente não irritante adequado. Tais bases incluem, sem limitação, lanolina, manteiga de cacau e polietileno- glicol.
[0099] A composição farmacêutica pode incluir vários materiais que modificam a forma física da unidade de dosagem sólida ou líquida. Por exemplo, a composição pode incluir materiais que formam um invólucro de revestimento em torno dos ingredientes ativos. Os materiais que formam o invólucro de revestimento são normalmente inertes e podem ser selecionados de, por exemplo, açúcar, goma-laca, e outros agentes de revestimento entérico. De uma maneira alternativa, os ingredientes ativos podem ser incorporados em uma cápsula de gelatina. A composição farmacêutica em forma sólida ou líquida pode incluir um agente que se liga o ADI- PEG e, dessa maneira, auxilia na distribuição do composto. Os agentes apropriados que podem atuar nesta capacidade incluem os anticorpos monoclonais ou policlonais, uma ou mais proteínas ou um lipossoma. A composição farmacêutica pode consistir essencialmente em unidades de dosagem que podem ser administradas como um aerossol. O termo aerossol é usado para denotar uma variedade de sistemas que vão desde os de natureza coloidal até os sistemas constituídos por meio das embalagens pressurizadas. A entrega pode ser feita por meio de um gás liquefeito ou comprimido ou por um sistema de bomba adequado que dispensa os ingredientes ativos. Os aerossóis podem ser administrados em fase única, bifásico, ou sistema trifásico com a finalidade de liberar o (s) ingrediente (s) ativo (s) . A entrega do aerossol inclui o contentor necessário, ativadores, válvulas, sub- recipientes e similares, os quais em conjunto podem formar um kit. Uma pessoa que é versada na técnica, sem experimentação indevida pode determinar os aerossóis preferidos.
[00100] As composições farmacêuticas podem ser preparadas por meio da metodologia bem conhecida na técnica farmacêutica. Por exemplo, uma composição farmacêutica destinada a ser administrada por meio de injeção pode ser preparada por combinação de uma composição que compreende o ADI-PEG, como descrito na presente invenção e, opcionalmente, um ou mais dos sais, tampões e/ ou estabilizantes, com água destilada estéril, de modo a formar uma solução. Um tensoativo pode ser adicionado para facilitar a formação de uma solução homogênea ou uma suspensão. Os tensoativos são compostos de forma que não venham a interagir de uma maneira covalente com a composição de ADI- PEG, de modo a facilitar a dissolução ou a suspensão homogênea do ADI- PEG no sistema de entrega aquoso.
[00101] As composições podem ser administradas em uma quantidade terapeuticamente eficaz, que irá variar dependendo de uma variedade de factores incluindo a atividade do composto específico (por exemplo, o ADI-PEG) empregue, a estabilidade metabólica e duração da acção do composto, a idade, peso corporal, saúde geral, sexo e dieta do paciente, o modo e tempo de administração, da taxa de excreção, a combinação de fármacos, a gravidade da doença ou condição particular e do indivíduo submetido a terapia.
[00102] Uma quantidade terapeuticamente eficaz de um dos compostos da presente invenção é uma quantidade que é eficaz para inibir o crescimento do tumor. Geralmente, o tratamento é iniciado com pequenas dosagens que podem ser aumentadas por meio de pequenos incrementos até que o efeito ótimo nas circunstâncias seja alcançado. Geralmente, uma dosagem terapêutica de compostos da presente invenção pode ser de cerca de 1 a cerca de 200 mg/ kg, duas vezes por semana a cerca de uma vez a cada duas semanas. Por exemplo, a dosagem pode ser de cerca de 1 mg/ kg uma vez por semana como uma injeção intravenosa de 2 ml até cerca de 20 mg/ kg uma vez cada 3 dias. Em uma outra modalidade, a dose pode ser de cerca de 50 UI/m2 a cerca de 700 UI/m2m2, administrada uma vez a cada 3 dias, cerca de uma vez por semana, cerca de duas vezes por semana, ou cerca de uma vez a cada 2 semanas. Em certos enquadramentos, a dose pode ser de cerca de 50 UI/m2, 60 UI/m2, 70 UI/m2, 80 UI/m2, 90 UI/m2, UI/m2 100, 110 UI/m2, UI/m2 120, 130 UI/m2, 140 UI/m2, 150 UI/m2, 160 UI/m2, 170 UI/m2, 180 UI/m2, 190 UI/m2, 200 UI/m2, 210 UI/m2, 220 UI/m2, 230 UI/m2, 240 UI/m2, 250 UI/m2, 260 UI/m2, 270 UI/m2, 280 UI/m2, 290 UI/m2, 300 UI/m2, 310 UI/m2, cerca de 320 UI/m2, cerca de 330 UI/m2, 340 UI/m2 cerca de 350 UI/m2, 360 UI/m2, 370 UI/m2, 380 UI/m2, 390 UI/m2, 400 UI/m2, 410 UI/m2, 420 UI/m2, 430 UI/m2, 440 UI/m2, 450 UI/m2, 500 UI/m2, 550 UI/m2, 600 UI/m2, 620 UI/m2, 630 UI/m2, 640 UI/m2, 650 UI/m2, 660 UI/m2, 670 UI/m2, 680 UI/m2, 690 UI/m2, ou cerca de 700 UI/m2 administrada uma vez a cada 3 dias, cerca de uma vez por semana, cerca de duas vezes por semana, ou cerca de uma vez a cada duas semanas. Em certas modalidades em que um indivíduo pode montar uma resposta imune anti- ADI, a dose pode ser modificada como desejado por meio de uma pessoa que é versada na técnica.
[00103] A dosagem ótima com ADI- SS- PEG 5,000 pode ser de cerca de duas vezes por semana, enquanto que a dosagem ótima com ADI- SS- PEG 20,000 pode ser de cerca de uma vez por semana a cerca de uma vez a cada duas semanas. Em certos enquadramentos, a dosagem ótima com ADI- SS- PEG 20,000 pode ser de cerca de duas vezes por semana.
[00104] ADI-PEG pode ser misturado com uma solução salina tamponada com fosfato, ou com qualquer outra solução apropriada conhecida dos das pessoas que são versadas na técnica, antes da injeção. Em uma modalidade, uma composição líquida que compreende o ADI-PEG compreende cerca de 10 a cerca de 12 mg de ADI, de cerca de 20 a cerca de 40 mg de polietilenoglicol, 1,27 mg + 5 % de fosfato de sódio monobásico, USP, cerca de 3 mg + 5 % de sódio dibásico fosfato, USP; 7,6 mg + 5 % de cloreto de sódio, USP, com um pH de cerca de 6,6 a cerca de 7, em uma quantidade apropriada de água para injeção (por exemplo, cerca de 1 ml, ou cerca de 2 ml). Em uma modalidade, uma composição líquida que compreende o ADI-PEG compreende histidina - HCl, e em certas modalidades, a composição de tampão é de cerca de Histidina -HCl a 0.0035M a cerca de Histidina a HCl 0,35 M. Em uma modalidade particular, a composição é formulada num tampão contendo histidina a 0,035 M -HCl a pH 6,8 com cloreto de sódio a 0,13 M. Em uma outra modalidade, a composição é formulada num tampão que compreende tampão de fosfato de sódio a 0,02 M a pH 6,8 com cloreto de sódio a 0,13 M.
[00105] Em uma modalidade, uma composição que compreende ADI ou ADI- PEG tem um pH de cerca de 5 a cerca de 9, cerca de 6 a cerca de 8, ou cerca de 6,5 a cerca de 7,5. Em algumas modalidades, a composição compreende ADI tem um pH de cerca de 6,8 ± 1,0.
[00106] Em uma modalidade, o PEG livre em uma composição que compreende o ADI-PEG situa-se entre 1 a 10 %, e em uma outra modalidade, é inferior a 7 %, inferior a 6 %, inferior a 5 %, inferior a 4 %, inferior a 3 %, menos do que 2 % ou menos de 1 % do PEG total. Em certas modalidades, o ADI nativo em uma composição que compreende o ADI-PEG é inferior a cerca de 1 %, 0,9 %, 0,8 %, 0,7 %, 0,6 %, 0,5 %, 0,4 %, 0,3 %, 0,2 % ou menos do que 0,1 %. Geralmente, as composições que compreende o ADI-PEG tem um total de impurezas inferior a ou igual a cerca de 4 %, 3 %, 2 %, 1,5 %, 1 % ou 0,5 %.
[00107] Em uma modalidade, o grupo sulfidrila livre em uma composição que compreende ADI ou ADI- PEG é maior do que cerca de 90 %. Em algumas modalidades, o sulfidrila livre em uma composição que compreende ADI ou ADI- PEG é de cerca de 91 %, cerca de 92 %, cerca de 93 %, cerca de 94 % ou cerca de 95 %, cerca de 96 % cerca de 97 %, cerca de 98 % cerca de 99 % ou mais.
[00108] Em uma modalidade, o ADI ou ADI- PEG em uma composição tem uma Km de cerca de 0,5 uM a cerca de 15 uM, e em uma outra modalidade, é de cerca de 1 jiM a cerca de 12 pM, cerca de 1 uM até cerca de 10 uM, cerca de 1,5 uM a cerca de 9 mM, cerca de 1,5 uM a cerca de 8 mM ou cerca de 1,5 uM a cerca de 7 uM. Em certas modalidades, o ADI ou ADI- PEG em uma composição tem uma Km de cerca de 1,5 uM a cerca de 6,5 uM. Em alguns emdboiemtns, o ADI ou ADI- PEG em uma composição tem uma Km de cerca de 1,5 uM, cerca de 2 uM, cerca de 2,5 uM, cerca de 3 um, de cerca de 3,5 uM, cerca de 4 uM, cerca de 4,5 uM, cerca de 5 pM, cerca 5,5 mM, cerca de 6 mM, cerca de 6,5 uM, ou cerca de 7 uM.
[00109] Em uma modalidade, o ADI ou ADI- PEG em uma composição tem uma kcat de cerca de 0,5 s - 1 a cerca de 15 s -1, e em uma outra modalidade, é de cerca de 1 s - 1 a cerca de 12 s -1, cerca de 1 s - 1 a cerca de 10 s -1, de cerca de 1,5 s -1 a cerca de 9 s -1, a cerca de 2 s -1 para cerca de 8 s - 1, ou cerca de 2,5 s - 1 a cerca de 7 s -1. Em certas modalidades, o ADI ou ADI- PEG em uma composição tem uma kcat de cerca de 2,5 s -1 a cerca de 7,5 s -1. Em algumas modalidades, o ADI ou ADI- PEG em uma composição tem uma kcat de cerca de 2,5 s -1, cerca de 3 s -1, de cerca de 3,5 s -1, a cerca de 4 s -1, de cerca de 4,5 s -1, cerca de 5 s -1, cerca de 5,5 s -1, a cerca de 6 s -1, de cerca de 6,5 s -1, cerca de 7 s -1, de cerca de 7,5 s -1, ou cerca de 8 s -1.
[00110] Em uma modalidade, o ADI ou ADI- PEG em uma composição tem uma condutividade (igualmente referido na técnica como condutância específica) de cerca de 5 mS/ cm a cerca de 20 mS/ cm, e em outras modalidades, a partir de cerca de 5 mS/ cm até cerca de 15 mS/ cm, de cerca de 7 mS/ cm a cerca de 15 mS/ cm, a cerca de 9 mS/ cm a cerca de 15 mS/ cm ou de cerca de 10 mS/ cm a cerca de 15 mS/ cm. Em algumas modalidades, o ADI ou ADI- PEG em uma composição tem uma condutividade de cerca de 9 mS/ cm, a cerca de 10 mS/ cm, a cerca de 11 mS/ cm, a cerca de 12 mS/ cm ou de cerca de 13 mS/ cm, a cerca de 14 mS/ cm ou de cerca de 15 mS/ cm. Em certas modalidades, o ADI ou ADI- PEG em uma composição tem uma condutividade de aproximadamente 13 mS/ cm ± 1,0 mS/ cm.
[00111] Em uma modalidade, o ADI ou ADI- PEG em uma composição tem uma osmolaridade de cerca de 50 mOsm/ kg a cerca de 500 mOsm/ kg, cerca de 100 mOsm/ kg a cerca de 400 mOsm/ kg, cerca de 150 mOsm/ kg a cerca de 350 mOsm/ kg, cerca de 200 mOsm/ kg a cerca de 350 mOsm/ kg, ou cerca de 250 mOsm/ kg a cerca de 350 mOsm/ kg. Em certas modalidades, o ADI ou ADI- PEG em uma composição tem uma osmolaridade de cerca de 300 ± 30 mOsm/ kg.
[00112] As composições que compreendem o ADI-PEG da presente invenção podem também ser administradas em simultâneo com, antes de, ou após a administração de um ou mais outros agentes terapêuticos. Esta terapia de combinação pode incluir a administração de uma única dosagem de formulação farmacêutica que contém um composto da presente invenção e um ou mais agentes ativos adicionais, bem como a administração de composições que compreendem o ADI-PEG (por exemplo, o ADI-PEG- 20) da presente invenção e cada agente ativo na sua própria formulação separada de dosagem farmacêutica. Por exemplo, o ADI-PEG como descrito na presente invenção e o outro agente ativo podem ser administrados ao paciente em conjunto em uma única composição de dosagem por via oral tal como um comprimido ou cápsula, ou cada agente administrado em formulações de dosagem oral separadas. Do mesmo modo, o ADI- PEG como descrito na presente invenção e o outro agente ativo podem ser administrados ao paciente em conjunto em uma única composição de dosagem parentérica tais como uma solução salina ou outra solução fisiologicamente aceitável, ou cada agente administrado em formulações de dosagem parenterais separadas. Quando são usadas as formulações de dosagem separadas, as composições que compreende o ADI- PEG e um ou mais agentes ativos adicionais podem ser administrados essencialmente ao mesmo tempo, ou seja, simultaneamente, ou em tempos separadamente, isto é, sequencialmente e em qualquer ordem escalonada ; terapia de combinação é entendida como incluindo todos estes regimes.
[00113] Dessa maneira, em certas modalidades, é também contemplada a administração das composições de ADI da presente invenção, em combinação com um ou mais outros agentes terapêuticos. Estes agentes terapêuticos podem ser aceites na arte como um tratamento padrão para um estado de doença particular, tal como descrito na presente invenção, tal como um câncer em particular ou GVHD. Agentes terapêuticos exemplares contempladas incluem citocinas, fatores de crescimento, esteroides, anti-inflamatórios, DMARDs, anti -inflamatórios, quimioterápicos, radiotherapeutics, inibidores da autofagia, ou outros agentes ativos e auxiliares.
[00114] Em certas modalidades, as composições de ADI descritas na presente invenção podem ser administradas em conjunto com qualquer número de agentes quimioterapêuticos. Exemplos de agentes quimioterapêuticos incluem agentes alquilantes tais como tiotepa e ciclofosfamida (CYTOXANTM), sulfonatos de alquila tais como bussulfano, improssulfano e pipossulfano ; aziridinas tais como benzodopa, carboquona, meturedopa e uredopa ; etileniminas e metilamelaminas incluindo altretamina, trietilenomelamina, trietilenofosforamida, e trietilenotiofosfaoramida trimetilolomelamina ; mostardas de nitrogênio tais como clorambucil, clornafazina, colofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, cloridrato de óxido de mecloretamina, melfalano, novembichin, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostarda de uracila ; nitrosureias tais como carmustina, clorozotocin, fotemustina, lomustina, nimustina, ranimustina ; antibióticos tais como aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, caliqueamicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina, cromomicinas, dactinomicina, daunorrubicina, detorrubicina, 6 -diazo -5- oxo -L- norleucina, doxorrubicina, epirubicina, esorrubicina, idarrubicina, marcelomicina, mitomicinas, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorrubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorrubicina ; anti-metabolitos tais como metotrexato e 5- fluorouracil (5- FU) ; análogos de ácido fólico tais como denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato ; análogos de purina tais como fludarabina, 6- mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina ; análogos de pirimidina tais como ancitabina, azacitidina, 6- azauridina, carmofur, citarabina, didesoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina, 5- FU, androgênios tais como calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano, testolactona ; anti - supra-renais tais como aminoglutetimida, mitotano, trilastano ; repositor de ácido fólico tal como ácido frolínico ; aceglatona ; glicósido aldofosfamida ; aminolevulínico ; amsacrina ; bestrabucila ; bisantreno ; acetato eliptínio ; ; edatraxato ; defofamina ; demecolcina ; diaziquona ; elformitine etoglucid, nitrato de gálio ; hidroxiureia ; lentinan ; lonidamina ; mitoguazona ; mitoxantrona ; mopidamol ; nitracrine ; pentostatin ; fenamet ; pirarubicina ; ácido podofilínico ; 2 etilhidrazide ; procarbazina ; PSK. RTM ;. razoxano ; sizofirano ; espirogermânio ; tenuazônico ácido ; triaziquona, 2, 2 ', 2 "- triclorotrietilamina ; uretano; vindesina ; dacarbazina ; manomustina ; mitobronitol ; mitolactol ; pipobromano ; gacitosina ; arabinosídeo (" Ara- C "); ciclofosfamida ; tiotepa ; taxoides, por exemplo, paclitaxel (Taxol ®, Bristol -Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ) e docetaxel (Taxotere ®, Rhne - Poulenc, Antony, França.); chlorambucil ; gencitabina ; 6 tioguanina ; mercaptopurina ; metotrexato ; análogos de platina tais como cisplatina e carboplatina ; vimblastina ; platina, etoposido (VP- 16); ifosfamida, mitomicina C, mitoxantrona, vincristina, vinorelbina ; navelbina, novantrona ; teniposídeo ; daunomicina ; aminopterina ; ibandronato Xeloda; CPT- 11; topoisomerase inibidor RFS 2000; difluorometilomitina (DMFO); derivados do ácido retinóico, tais como Targretin ™ (bexaroteno), Panretin ™ (alitretinoína); Ontak ™ (Denileucina diftitox); esperamicinas ; capecitabina, e seus sais farmaceuticamente aceitáveis , os ácidos ou derivados de qualquer um dos acima. Também incluídos nesta definição estão os agentes anti- hormonais que atuam para regular ou inibir a ação do hormônio em tumores tais como anti -estrogênios incluindo por exemplo tamoxifeno, raloxifeno, inibição de aromatase 4 (5) - imidazoles, 4- hidroxitamoxifeno, trioxifeno, keoxifeno, LI117018, onapristona e toremifeno (Fareston) e anti-andrógenos, tais como flutamida, bicalutamida, nilutamida, leuprolide e goserelin ; outros agentes quimioterápicos incluem inibidores sorafenibe e outra proteína quinase como afatinib, axitinib, bevacizumab, cetuximab, crizotinib, dasatinib, erlotinib, fostamatinib, gefitinib, imatinib, lapatinib, lenvatinib, mubritinib, nilatinib, panitumumab, pazopanib, pegaptanib, ranibizumab, ruxolitinib, trastuzumab, vandetanib, vemurafenib, e sunitinib ;. sirolimus (rapamicina), everolimus e de outros inibidores de mTOR sais farmaceuticamente aceitáveis, ácidos ou derivados de qualquer um dos acima são também contemplados para o uso na presente invenção.
[00115] Em certas modalidades, as composições de ADI descritas na presente invenção podem ser administradas em conjunto com qualquer número de inibidores autofagia. Em algumas modalidades preferidas, o inibidor da autofagia é selecionado de entre o grupo que consiste em: cloroquina, 3- metiladenina, hidroxicloroquina (Plaquenil.TM.), ribosídeo carboxamida de Bafilamicina A1, 5-amino - 4- imidazol (AICAR), ácido ocadaico, autofagia - supressivos toxinas de algas que inibem proteínas fosfatases do tipo 2A ou tipo 1, análogos do cAMP, e os fármacos que elevam os níveis de acampamento, adenosina, ribosídeo N6 -mercaptopurina, wortmanina, e vimblastina. Em também podem ser usados, além disso, anti-sentido ou siRNA que inibe a expressão de proteínas essenciais para a autofagia, tais como, por exemplo Atg5 .
[00116] Em uma modalidade, a combinação de ADI- PEG com um ou mais agentes terapêuticos atua de formo Aditiva ou de forma sinérgica. A este respeito, os agentes de sinergia são descritos na presente invenção, que incluem um agente terapêutico (por exemplo, um agente quimioterapêutico, inibidor autofagia, inibidor de mTOR, ou qualquer outro agente terapêutico usado para o tratamento do câncer, GVHD, ou doença inflamatória do intestino, tal como descrito na presente invenção) que é capaz de atuar sinergicamente com o ADI- PEG, tal como fornecido na presente invenção, sempre que tal sinergia manifesta-se como um efeito detectável que é maior (ou seja, de uma forma estatisticamente significativa em relação a uma condição de controle apropriadoa) em magnitude do que o efeito que pode ser detectado quando o agente quimioterapêutico está presente, mas a composição ADI- PEG está ausente, e/ ou quando o ADI- PEG está presente, mas o agente quimioterapêutico está ausente. Os métodos para medir a sinergia são conhecidos na técnica (vide, por exemplo, Cancer Res. 15 de janeiro de 2010 70, 440).
[00117] As composições que compreendem ADI, e, opcionalmente, outros agentes terapêuticos, como descritos na presente invenção podem ser usados em métodos terapêuticos para o tratamento de câncer e métodos para prevenir a metástase de um câncer. Dessa maneira, a presente invenção proporciona os métodos para o tratamento, melhoria dos sintomas de, ou inibição da progressão de, ou prevenção de uma variedade de diferentes tipos de câncer. Em uma outra modalidade, a presente invenção fornece os métodos para o tratamento, melhoria dos sintomas de, ou inibição da progressão de GVHD. Em particular, a presente invenção fornece os métodos para o tratamento, melhoria dos sintomas de, ou inibição da progressão de um câncer ou GVHD em um paciente que compreende a administração ao paciente de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição de ADI tal como descrito na presente invenção, tratando deste modo, melhorando os sintomas de, ou inibindo a progressão do câncer ou GVHD. Dessa maneira, as composições de ADI descritas na presente invenção podem ser administradas a um indivíduo aflito com a doença inflamatória do intestino (por exemplo, doença de Crohn, colite ulcerativa), GVHD ou a um câncer, incluindo, mas não se limitando a leucemia (por exemplo, leucemia mieloide aguda e recaída de leucemia mieloide aguda), melanomas, sarcomas (incluindo, mas não limitado a, sarcomas uterinos metastáticos, leiomiossarcoma), câncer do pâncreas, câncer da próstata (tal como, mas não limitado a, câncer da próstata refratário hormonal), mesotelioma, leucemia linfática, leucemia mieloide crônica, linfoma, câncer de pulmão de células pequenas, câncer de mama, câncer de ovário, câncer colorretal, câncer gástrico (incluindo, mas não limitado a, adenocarcinoma gástrico), glioma, glioblastoma multiforme, retinoblastoma, neuroblastoma, câncer de pulmão não células pequenas (NSCLC), câncer renal (incluindo, mas não limitado a carcinoma de células renais), câncer de bexiga, câncer de útero, câncer de esôfago, câncer cerebral, cânceres de cabeça e pescoço (incluindo, mas não limitado a, carcinoma da cabeça e pescoço de células escamosas ; câncer de língua), câncer de colo do útero, câncer de testículo, vesícula biliar, colangiocarcinoma e câncer de estômago.
[00118] Em uma modalidade, a presente descrição proporciona um método para o tratamento, melhoria dos sintomas de, ou inibição da progressão de leucemia mieloide, tais como, mas não limitados a, leucemia mieloide aguda (AML), por meio da administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um ADI PEG - 20. Em certas modalidades, a leucemia mieloide, tais como AML, é deficiente em ASS, o ASL, ou ambos. Em uma outra modalidade, a leucemia mieloide, (por exemplo, AML) não compreende a translocação t (15, 17). Em uma outra modalidade, a presente invenção fornece um método de tratamento que compreende a administração de LMO ADI- PEG 20, cerca de uma vez a cada 3 dias, cerca de uma vez por semana, cerca de duas vezes por semana, ou cerca de uma vez a cada 2 semanas. Em certas modalidades, a dose de ADI- PEG 20 administrados para o tratamento de AML é entre cerca de 360 UI/m2 e cerca de 160IU/m2m2, e em outras modalidades é de cerca de 160 UI/m2, UI/m2 cerca de 170, 180 UI/m2, 190 UI/m2, 200 UI/m2, 210 UI/m2, 220 UI/m2, 230 UI/m2, 240 UI/m2, 250 UI/m2, 260 UI/m2, 270 UI/m2, 280 UI/m2, 290 UI/m2, 300 UI/m2, 310 UI/m2, cerca de 320 UI/m2, cerca de 330 UI/m2, 340 UI/m2 cerca de 350 UI/m2, cerca de 360 UI/m2, cerca de 370 UI/m2, 380 UI/m2, 390 UI/m2, 400 UI/m2, 410 UI/m2, 420 UI/m2, 430 UI/m2, 440 UI/m2, 450 UI/m2, 500 UI/m2, 550 UI/m2, 600 UI/m2, 640 UI/m2, ou cerca de 700 UI/m2. Em certas modalidades, em que o tratamento de AML com ADI- PEG induz uma resposta imune contra o ADI, a presente descrição proporciona um método de tratamento de AML, em que a dose de ADI é duplicada e pode ser aumentada para 640 UI/m2 por semana ou mais. Em uma modalidade particular, o ADI para o tratamento de AML é modificado com 3.5-6.5, ou em uma modalidade, 4,5-5,5 moléculas de PEG por ADI. Em uma outra modalidade, a presente descrição proporciona um método de tratamento de AML, por meio da administração de uma composição que compreende o ADI-PEG 20, em que a composição compreende um ADI modificado com 5 ± 1,5 moléculas de PEG, e em uma modalidade, 5 ± 1,5 moléculas de PEG de cadeia linear, e, em certas modalidades, a composição compreende menos do que cerca de 0,5 % de ADI nativo (isto é, não modificado com PEG) e/ ou menos do que cerca de 5 % de PEG livres. Em uma outra modalidade, a composição compreende uma histidina - HCl.
[00119] Em uma modalidade, a presente descrição proporciona um método para o tratamento, melhoria dos sintomas de, ou inibição da progressão de sarcomas, incluindo, mas não limitado a sarcomas metastáticas, por meio da administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um ADI- PEG 20. Em certas modalidades, o sarcoma é deficiente em ASS, o ASL, ou ambos. Em uma outra modalidade, a presente invenção fornece um método de tratamento que compreende a administração de um sarcoma de ADI- PEG 20, cerca de uma vez a cada 3 dias, uma vez por semana, duas vezes por semana, ou cerca de uma vez a cada 2 semanas. Em certas modalidades, a dose de ADI- PEG 20 administrados para o tratamento de AML é entre cerca de 360 UI/m2 e cerca de 160 IU/m2m2, e em outras modalidades é de cerca de 160 UI/m2, UI/m2 cerca de 170, 180 UI/m2, 190 UI/m2, 200 UI/m2, 210 UI/m2, 220 UI/m2, 230 UI/m2, 240 UI/m2, 250 UI/m2, 260 UI/m2, 270 UI/m2, 280 UI/m2, 290 UI/m2, 300 UI/m2, 310 UI/m2, cerca de 320 UI/m2, cerca de 330 UI/m2, 340 UI/m2 cerca de 350 UI/m2, cerca de 360 UI/m2, cerca de 370 UI/m2, 380 UI/m2, 390 UI/m2, 400 UI/m2, 410 UI/m2, 420 UI/m2, 430 UI/m2, 440 UI/m2, 450 UI/m2, 500 UI/m2, 550 UI/m2, 600 UI/m2, 640 UI/m2, ou cerca de 700 UI/m2. Em certas modalidades, em que o tratamento de um sarcoma com ADI- PEG induz uma resposta imune contra o ADI, a presente descrição proporciona um método de tratamento de sarcoma, em que a dose de ADI é duplicada e pode ser aumentada para 640 por semana ou UI/m2 mais. Em uma modalidade particular, o ADI para o tratamento de AML é modificado com 3,5 a 6,5, ou em uma modalidade, 4,5 a 5,5 moléculas de PEG por ADI. Em uma outra modalidade, a presente descrição proporciona um método de tratamento de um sarcoma, um sarcoma metastático incluindo, por meio da administração de uma composição que compreende o ADI- PEG 20, em que a composição compreende um ADI modificado com 5 ± 1,5 moléculas de PEG, e em uma modalidade, 5 ± 1,5 moléculas de PEG de cadeia linear, e, em certas modalidades, a composição compreende menos do que cerca de 0,5 % de ADI nativo (isto é, não modificado com PEG) e/ ou menos do que cerca de 5 % de PEG livres. Em uma outra modalidade, a composição compreende uma histidina - HCl.
[00120] Em uma modalidade, a presente descrição proporciona um método para o tratamento, melhoria dos sintomas de, ou inibição da progressão de câncer do pâncreas, por meio da administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de ADI- PEG 20, em combinação com um inibidor da autofagia, tais como, mas não se limitando à cloroquina, 3- metiladenina, hidroxicloroquina, bafilamicina A1, ribosídeo carboxamida 5-amino -4- imidazol (AICAR), ácido ocadaico, ribosídeo N6- mercaptopurina, wortmanina, e vimblastina. Em certas modalidades, o câncer do pâncreas é deficiente em ASS, o ASL, ou ambos. Em uma outra modalidade, a presente invenção fornece um método de tratamento do câncer do pâncreas, que compreende a administração do ADI- PEG 20 cerca de uma vez a cada 3 dias, cerca de uma vez por semana, cerca de duas vezes por semana, ou cerca de uma vez a cada duas semanas, em combinação com um terapeuticamente eficaz quantidade de um inibidor de autofagia, tais como a cloroquina. A este respeito, uma dose terapeuticamente eficaz de cloroquina pode ser uma dose inicial de cerca de 600 mg de base seguida por um adicional de 300 mg de base e uma dose única de 300 mg de base em cada um dos dois dias consecutivos. Isto representa uma dose total de 2,5 g de fosfato de cloroquina ou 1,5 g de base em três dias. Em outras modalidades, a dose pode ser de cerca de 300 mg de base. A dose de cloroquina, ou outro inibidor da autofagia, pode ser modificada conforme necessário por um médico especialista utilizando as dosagens conhecidas na técnica. Como seria compreendido por meio de uma pessoa que é versada na técnica, o inibidor autofagia pode ser administrado antes, ao mesmo tempo que, ou depois de uma composição que compreende o ADI-PEG 20. Em certas modalidades, a dose de ADI- PEG 20 administrada para o tratamento do câncer do pâncreas é entre cerca de 360 UI/m2 e cerca de 160 IU/m2m2, e em outras modalidades é de cerca de 160 UI/m2, UI/m2 cerca de 170, 180 UI/m2, 190 UI/m2, 200 UI/m2, 210 UI/m2, 220 UI/m2, 230 UI/m2, 240 UI/m2, 250 UI/m2, 260 UI/m2, 270 UI/m2, 280 UI/m2, 290 UI/m2, 300 UI/m2, 310 UI/m2, cerca de 320 UI/m2, cerca de 330 UI/m2, 340 UI/m2 cerca de 350 UI/m2, cerca de 360 UI/m2, cerca de 370 UI/m2, 380 UI/m2, 390 UI/m2, 400 UI/m2, 410 UI/m2, 420 UI/m2, 430 UI/m2, 440 UI/m2, 450 UI/m2, 500 UI/m2, 550 UI/m2, 600 UI/m2, 640 UI/m2, ou cerca de 700 UI/m2. Em certas modalidades, em que o tratamento do câncer do pâncreas com o ADI- PEG em combinação com cloroquina induz uma resposta imune contra o ADI, a presente descrição proporciona um método de tratamento de câncer do pâncreas, em que a dose de ADI é duplicada e pode ser aumentada para 640 UI/m2 por semana ou mais. Em uma modalidade particular, o ADI para o tratamento do câncer do pâncreas é modificado com 3,5 a 6,5, ou em uma modalidade, 4,5-5,5 moléculas de PEG por ADI. Em uma outra modalidade, a presente descrição proporciona um método de tratamento do câncer do pâncreas, por meio da administração de cloroquina, ou outro inibidor da autofagia apropriado, em combinação com uma composição que inclui ADI- PEG 20, em que a composição compreende um ADI modificado com 5 ± 1,5 moléculas de PEG, e em Em uma modalidade, 5 ± 1,5 moléculas de PEG de cadeia linear, e, em certas modalidades, a composição compreende menos do que cerca de 0,5 % de ADI nativo (ou seja, não modificado com PEG) e/ ou menos do que cerca de 5 % de PEG livres. Em uma outra modalidade, a composição compreende uma histidina - HCl.
[00121] Em uma modalidade, a presente descrição proporciona um método para o tratamento, melhoria dos sintomas de, ou inibição da progressão de câncer do pulmão de células pequenas de câncer através da administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de ADI- PEG 20, em combinação com um inibidor da autofagia. Em certas modalidades, o câncer do pulmão de células pequenas é deficiente em ASS, o ASL, ou ambos. Em uma outra modalidade, a presente invenção fornece um método de tratamento de câncer do pulmão de células pequenas, que compreende a administração o ADI- PEG 20 cerca de uma vez a cada 3 dias, cerca de uma vez por semana, cerca de duas vezes por semana, ou cerca de uma vez a cada duas semanas, em combinação com um quantidade terapeuticamente eficaz de um inibidor autofagia, tais como a cloroquina. A este respeito, uma dose terapeuticamente eficaz de cloroquina pode ser uma dose inicial de cerca de 600 mg de base seguida por um adicional de 300 mg de base e uma dose única de 300 mg de base em cada um dos dois dias consecutivos. Isto representa uma dose total de 2,5 g de fosfato de cloroquina ou 1,5 g de base em três dias. Em outras modalidades, a dose pode ser de cerca de 300 mg de base. A dose de cloroquina pode ser modificado conforme necessário por um médico especialista utilizando dosagens conhecidos na técnica. Como seria compreendido por meio de uma pessoa que é versada na técnica, o inibidor autofagia pode ser administrado antes, ao mesmo tempo que, ou depois de uma composição que compreende o ADI-PEG 20. Em certas modalidades, a dose de ADI- PEG 20 administrados para o tratamento do câncer do pulmão de células pequenas é entre cerca de 360 UI/m2 e cerca de 160 IU/m2m2, e em outras modalidades é de cerca de 160 UI/m2, cerca de 170 UI/m2, 180 UI/m2, 190 UI/m2, 200 UI/m2, 210 UI/m2, 220 UI/m2, 230 UI/m2, 240 UI/m2, 250 UI/m2, 260 UI/m2, 270 UI/m2, 280 UI/m2, 290 UI/m2, 300 UI/m2, 310 UI/m2, cerca de 320 UI/m2, cerca de 330 UI/m2, 340 UI/m2 cerca de 350 UI/m2, cerca de 360 UI/m2, cerca de 370 UI/m2, 380 UI/m2, 390 UI/m2, 400 UI/m2, 410 UI/m2, 420 UI/m2, 430 UI/m2, 440 UI/m2, 450 UI/m2, 500 UI/m2, 550 UI/m2, 600 UI/m2, 640 UI/m2, ou cerca de 700 UI/m2. Em certas modalidades, em que o tratamento do câncer do pulmão de células pequenas com o ADI-PEG em combinação com cloroquina induz uma resposta imune contra o ADI, a presente descrição proporciona um método de tratamento de câncer do pulmão de células pequenas, em que a dose de ADI é duplicada e pode ser aumentada para 640 UI/m2 por semana ou mais. Em uma modalidade particular, o ADI para o tratamento do câncer do pulmão de células pequenas é modificado com 3.5-6.5, ou em uma modalidade, 4,5-5,5 moléculas de PEG por ADI. Em uma outra modalidade, a presente descrição proporciona um método de tratamento de câncer do pulmão de células pequenas com a administração de cloroquina em combinação com uma composição que compreende o ADI-PEG 20, em que a composição compreende um ADI modificado com 5 ± 1,5 moléculas de PEG, e em uma modalidade, 5 ± 1,5 moléculas de PEG de cadeia linear, e, em certas modalidades, a composição compreende menos do que cerca de 0,5 % de ADI nativo (ou seja, não modificado com PEG) e/ ou menos do que cerca de 5 % de PEG livres. Em uma outra modalidade, a composição compreende uma histidina - HCl.
[00122] Em uma modalidade, a presente descrição proporciona um método para o tratamento, melhoria dos sintomas de, ou inibição da progressão dos sarcomas (incluindo, mas não limitado a, sarcomas metastático) pela administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de ADI- PEG 20, em combinação com um autofagia inibidor. Em certos enquadramentos, o sarcoma é deficiente em ASS, o ASL, ou ambos. Em uma outra modalidade, a presente invenção fornece um método de tratamento que compreende a administração de sarcomo ADI- PEG 20, cerca de uma vez a cada 3 dias, cerca de uma vez por semana, cerca de duas vezes por semana, ou cerca de uma vez a cada duas semanas, em combinação com uma quantidade terapeuticamente eficaz de um inibidor de autofagia, tais como a cloroquina. A este respeito, uma dose terapeuticamente eficaz de cloroquina pode ser uma dose inicial de cerca de 600 mg de base seguida por um adicional de 300 mg de base e uma dose única de 300 mg de base em cada um dos dois dias consecutivos. Isto representa uma dose total de 2,5 g de fosfato de cloroquina ou 1,5 g de base em três dias. Em outras modalidades, a dose pode ser de cerca de 300 mg de base. A dose de cloroquina pode ser modificado conforme necessário por um médico especialista utilizando dosagens conhecidos na técnica. Como seria compreendido por meio de uma pessoa que é versada na técnica, o inibidor autofagia pode ser administrado antes, ao mesmo tempo que, ou depois de uma composição que compreende o ADI-PEG 20. Em certas modalidades, a dose de ADI- PEG 20 administradas para o tratamento de sarcoma é entre cerca de 360 UI/m2 e cerca de 160 IU/m2m2, e em outras modalidades é de cerca de 160 UI/m2, UI/m2 cerca de 170, 180 UI/m2, 190 UI/m2, 200 UI/m2, 210 UI/m2, 220 UI/m2, 230 UI/m2, 240 UI/m2, 250 UI/m2, 260 UI/m2, 270 UI/m2, 280 UI/m2, 290 UI/m2, 300 UI/m2, 310 UI/m2, cerca de 320 UI/m2, cerca de 330 UI/m2, 340 UI/m2 cerca de 350 UI/m2, cerca de 360 UI/m2, cerca de 370 UI/m2, 380 UI/m2, 390 UI/m2, 400 UI/m2, 410 UI/m2, 420 UI/m2, 430 UI/m2, 440 UI/m2, 450 UI/m2, 500 UI/m2, 550 UI/m2, 600 UI/m2, 640 UI/m2, ou cerca de 700 UI/m2. Em certas modalidades, em que o tratamento do sarcoma com ADI- PEG em combinação com cloroquina induz uma resposta imune contra o ADI, a presente descrição proporciona um método de tratamento de sarcoma, em que a dose de ADI é duplicada e pode ser aumentada para 640 UI/m2 por semana ou mais. Em uma modalidade particular, o ADI para o tratamento do sarcoma é modificado com 3.5 a 6.5, ou em uma modalidade, 4,5-5,5 moléculas de PEG por ADI. Em uma outra modalidade, a presente descrição proporciona um método de tratamento de sarcoma, por meio da administração de cloroquina em combinação com uma composição que compreende ADI- PEG 20, em que a composição compreende um ADI modificado com 5 ± 1,5 moléculas de PEG, e em uma modalidade, 5 ± 1,5 cadeia linear moléculas de PEG, e, em certas modalidades, a composição compreende menos do que cerca de 0,5 % de ADI nativo (ou seja, não modificado com PEG) e/ ou menos do que cerca de 5 % de PEG livres. Em uma outra modalidade, a composição compreende uma histidina - HCl.
[00123] Em uma modalidade, a presente descrição proporciona um método para o tratamento, melhoria dos sintomas de, ou inibição da progressão de melanoma através da administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de ADI- PEG 20, em combinação com o docetaxel. Em certos enquadramentos, o melanoma é deficiente em ASS, o ASL, ou ambos. Em uma outra modalidade, a presente invenção fornece um método de tratamento de melanoma, que compreende a administração o ADI- PEG 20 cerca de uma vez a cada 3 dias, cerca de uma vez por semana, cerca de duas vezes por semana, ou cerca de uma vez a cada duas semanas, em combinação com uma quantidade terapeuticamente eficaz de docetaxel. A este respeito, uma dose terapeuticamente eficaz de docetaxel pode compreender 75mg/m2 ou 100 mg/m2, administrada por via intravenosa ao longo de 30 minutos a uma hora aproximadamente a cada 3 semanas. Como seria entendido por meio de uma pessoa que é versada na técnica, a dose de docetaxel pode ser modificado dependendo de indicação de doença e/ ou os tratamentos anteriores, e o docetaxel pode ser administrado antes, ao mesmo tempo que, ou depois de uma composição que compreende o ADI-PEG 20. Em certas modalidades, a dose de ADI- PEG 20 administrada para o tratamento de melanoma é entre cerca de 360 UI/m2 e cerca de 160 IU/m2m2, e em outras modalidades é de cerca de 160 UI/m2, UI/m2 cerca de 170, 180 UI/m2, 190 UI/m2, 200 UI/m2, 210 UI/m2, 220 UI/m2, 230 UI/m2, 240 UI/m2, 250 UI/m2, 260 UI/m2, 270 UI/m2, 280 UI/m2, 290 UI/m2, 300 UI/m2, 310 UI/m2, cerca de 320 UI/m2, cerca de 330 UI/m2, 340 UI/m2 cerca de 350 UI/m2, cerca de 360 UI/m2, cerca de 370 UI/m2, 380 UI/m2, 390 UI/m2, 400 UI/m2, 410 UI/m2, 420 UI/m2, 430 UI/m2, 440 UI/m2, 450 UI/m2, 500 UI/m2, 550 UI/m2, 600 UI/m2, 640 UI/m2, ou cerca de 700 UI/m2. Em certas modalidades, em que o tratamento de melanoma com ADI- PEG em combinação com docetaxel induz uma resposta imune contra o ADI, a presente invenção fornece um método para tratar o melanoma, em que a dose de ADI é duplicada e pode ser aumentada para 640 UI/m2 por semana ou mais. Em uma modalidade particular, o ADI para o tratamento de melanoma é modificado com 3.5-6.5, ou em uma modalidade, 4,5-5,5, as moléculas de PEG por ADI. Em uma outra modalidade, a presente descrição proporciona um método para o tratamento de melanoma através da administração de docetaxel em combinação com uma composição que compreende o ADI-PEG 20, em que a composição compreende um ADI modificado com 5 ± 1,5 moléculas de PEG, e em uma modalidade, 5 ± 1,5 cadeia linear moléculas de PEG, e, em certas modalidades, a composição compreende menos do que cerca de 0,5 % de ADI nativo (ou seja, não modificado com PEG) e/ ou menos do que cerca de 5 % de PEG livres. Em uma outra modalidade, a composição compreende uma histidina - HCl.
[00124] Em uma modalidade, a presente descrição proporciona um método para o tratamento, melhoria dos sintomas de, ou inibição da progressão de melanoma através da administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de ADI- PEG 20, em combinação com a cisplatina. Em certos enquadramentos, o melanoma é deficiente em ASS, o ASL, ou ambos. Em uma outra modalidade, a presente invenção fornece um método de tratamento de melanoma, que compreende a administração o ADI- PEG 20 cerca de uma vez a cada 3 dias, cerca de uma vez por semana, cerca de duas vezes por semana, ou cerca de uma vez a cada duas semanas, em combinação com uma quantidade terapeuticamente eficaz de cisplatina. A este respeito, uma dose terapeuticamente eficaz de cisplatina pode compreender a administração quer uma vez por ciclo (cada 3 a 4 semanas) a 50-100 mg/m2, ou diariamente, durante 5 dias, num total de 100 mg/m2 por ciclo. Como seria entendido por meio de uma pessoa que é versada na técnica, a dose de cisplatina pode ser modificado dependendo de indicação de doença, paciente individual, e/ ou os tratamentos anteriores, e a cisplatina pode ser administrada antes, ao mesmo tempo que, ou depois de uma composição que compreende o ADI-PEG 20. Em certas modalidades, a dose de ADI- PEG 20 administrados para o tratamento de melanoma é entre cerca de 360 UI/m2 e cerca de 160IU/m2m2, e em outras modalidades é de cerca de 160 UI/m2, UI/m2 cerca de 170, 180 UI/m2, 190 UI/m2, 200 UI/m2, 210 UI/m2, 220 UI/m2, 230 UI/m2, 240 UI/m2, 250 UI/m2, 260 UI/m2, 270 UI/m2, 280 UI/m2, 290 UI/m2, 300 UI/m2, 310 UI/m2, cerca de 320 UI/m2, cerca de 330 UI/m2, 340 UI/m2 cerca de 350 UI/m2, cerca de 360 UI/m2, cerca de 370 UI/m2, 380 UI/m2, 390 UI/m2, 400 UI/m2, 410 UI/m2, 420 UI/m2, 430 UI/m2, 440 UI/m2, 450 UI/m2, 500 UI/m2, 550 UI/m2, 600 UI/m2, 640 UI/m2, ou cerca de 700 UI/m2. Em certas modalidades, em que o tratamento de melanoma com ADI- PEG em combinação com a cisplatina induz uma resposta imune contra o ADI, a presente invenção fornece um método para tratar o melanoma, em que a dose de ADI é duplicada e pode ser aumentada para 640 UI/m2 por semana ou mais. Em uma modalidade particular, o ADI para o tratamento de melanoma é modificado com 3,5-6,5, ou em uma modalidade, 4,5-5,5, as moléculas de PEG por ADI. Em uma outra modalidade, a presente descrição proporciona um método para o tratamento de melanoma através da administração de cisplatina em combinação com uma composição que compreende o ADI-PEG 20, em que a composição compreende um ADI modificado com 5 ± 1,5 moléculas de PEG, e em uma modalidade, 5 ± 1,5 cadeia linear moléculas de PEG, e, em certas modalidades, a composição compreende menos do que cerca de 0,5 % de ADI nativo (ou seja, não modificado com PEG) e/ ou menos do que cerca de 5 % de PEG livres. Em uma outra modalidade, a composição compreende uma histidina - HCl.
[00125] Em uma modalidade, a presente descrição proporciona um método para o tratamento, melhoria dos sintomas de, ou inibição da progressão do carcinoma de célula renal, por meio da administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de ADI- PEG 20, em combinação com um inibidor de mTOR, tais como, mas não limitados a rapamicina, temsirolimus, everolimus, e ridaforolimus. Em certos enquadramentos, o carcinoma de células renais é deficiente em ASS, o ASL, ou ambos. Em uma outra modalidade, a presente invenção fornece um método de tratamento de carcinoma de célula renal que compreende a administração o ADI-PEG 20, cerca de uma vez a cada 3 dias, cerca de uma vez por semana, cerca de duas vezes por semana, ou cerca de uma vez a cada duas semanas, em combinação com um terapeuticamente quantidade eficaz de um inibidor de mTOR, tais como rapamicina. A dose de rapamicina, ou de outro inibidor de mTOR, pode ser determinada conforme necessário por um médico especialista utilizando dosagens conhecidos na técnica. Como seria compreendido por meio de uma pessoa que é versada na técnica, o inibidor de mTOR pode ser administrado antes, ao mesmo tempo que, ou depois de uma composição que compreende o ADI-PEG 20. Em certas modalidades, a dose de ADI- PEG 20 administrados para o tratamento de carcinoma de células renais, está entre cerca de 360 UI/m2 e cerca de 160IU/m2m2, e em outras modalidades é de cerca de 160 UI/m2, UI/m2 cerca de 170, 180 UI/m2, 190 UI/m2, 200 UI/m2, 210 UI/m2, 220 UI/m2, 230 UI/m2, 240 UI/m2, 250 UI/m2, 260 UI/m2, 270 UI/m2, 280 UI/m2, 290 UI/m2, 300 UI/m2, 310 UI/m2, cerca de 320 UI/m2, cerca de 330 UI/m2, 340 UI/m2 cerca de 350 UI/m2, cerca de 360 UI/m2, cerca de 370 UI/m2, 380 UI/m2, 390 UI/m2, 400 UI/m2, 410 UI/m2, 420 UI/m2, 430 UI/m2, 440 UI/m2, 450 UI/m2, 500 UI/m2, 550 UI/m2, 600 UI/m2, 640 UI/m2, ou cerca de 700 UI/m2. Em certas modalidades, em que o tratamento de carcinoma de células renais com ADI- PEG em combinação com cloroquina induz uma resposta imune contra o ADI, a presente descrição proporciona um método de tratamento de carcinoma de células renais, em que a dose de ADI é duplicada e pode ser aumentada para 640 UI/m2 por semana ou mais. Em uma modalidade particular, o ADI para o tratamento de carcinoma de células renais é modificado com 3.5-6.5, ou em uma modalidade, 4,5-5,5 moléculas de PEG por ADI. Em uma outra modalidade, a presente descrição proporciona um método de tratamento de carcinoma de células renais por meio da administração de rapamicina, ou de outro inibidor de mTOR apropriado, em combinação com uma composição que inclui ADI- PEG 20, em que a composição compreende um ADI modificado com 5 ± 1,5 moléculas de PEG, e em uma modalidade, 5 ± 1,5 moléculas de PEG de cadeia linear, e, em certas modalidades, a composição compreende menos do que cerca de 0,5 % ADI nativo (ou seja, não modificado com PEG) e/ ou menos do que cerca de 5 % de PEG livres. Em uma outra modalidade, a composição compreende uma histidina - HCl.
[00126] Em certas modalidades, a presente descrição proporciona um método para o tratamento, melhoria dos sintomas de, ou inibição da progressão de um câncer em um paciente, que compreende a administração ao paciente de uma composição que compreende ADI, tal como descrito na presente invenção, em que o câncer não é o melanoma, o câncer do pâncreas, câncer de próstata, câncer de pulmão de células pequenas, mesotelioma, leucemia linfática, leucemia mieloide crônica, linfoma, hepatoma, ou sarcoma.
[00127] A presente invenção também proporciona os métodos de tratamento, melhoria dos sintomas de, ou inibição da progressão de uma doença inflamatória em um paciente que compreende a administração ao paciente de uma composição que compreende ADI (por exemplo, o ADI-PEG, em particular ADI- PEG 20), com os descritos na presente invenção, isoladamente ou em combinação com um ou mais outros agentes terapêuticos. Em uma modalidade, a presente invenção também proporciona os métodos para o tratamento, melhoria dos sintomas de, ou inibição da progressão de uma doença inflamatória intestinal em um paciente que compreende a administração ao paciente de uma composição que compreende ADI (por exemplo, o ADI-PEG, em particular ADI- PEG 20), tal como descrito na presente invenção, sozinho ou em combinação com um ou mais outros agentes terapêuticos. A este respeito, a presente invenção proporciona os métodos de tratamento, melhoria dos sintomas de, ou inibição da progressão da doença de Crohn ou colite ulcerativa em um paciente, que compreende a administração ao paciente de uma composição que compreende ADI (por exemplo, o ADI-PEG, em particular, o ADI- PEG 20), tal como descrito na presente invenção, sozinho ou em combinação com um ou mais outros agentes terapêuticos.
[00128] Em uma outra modalidade, a presente descrição proporciona um método para o tratamento, melhoria dos sintomas de, ou inibição da progressão de um câncer em um paciente, que compreende a administração ao paciente de uma composição que compreende ADI, e opcionalmente um ou mais outros agentes terapêuticos, tal como descrito na presente invenção, em que o câncer é deficiente em ASS, o ASL, ou ambos. A este respeito, ASS ou deficiência da ASL pode haver uma redução na expressão como medido por meio da expressão de mRNA ou a expressão da proteína, ou pode ser uma redução na atividade da proteína, e compreende geralmente uma redução estatisticamente significativa na expressão ou atividade como determinado por meio de uma pessoa versada na técnica. A expressão ou atividade Reduzida de ASS ou de ASL pode haver uma redução na expressão ou atividade de cerca de 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, ou mais, em comparação com a expressão ou atividade de uma amostra de controle adequada conhecida por ser livre de câncer. Em certas modalidades, a expressão ou atividade ASS ou ASL é reduzida em pelo menos duplo dobramento, em comparação com a expressão ou atividade de uma amostra de controle não câncer.
[00129] Em certas modalidades, a expressão ou atividade reduzida de ASS ou ASL resulta na metilação do promotor ASS ou ASL. Em uma outra modalidade a redução na expressão ou atividade de ASS ou ASL resulta em uma mutação do DNA (por exemplo, uma ou mais mutações pontuais, pequenas supressões, inserções, e similares) ou de uma anomalia cromossômica, resultando em deleção do gene. Em uma modalidade, o câncer é ASS ou ASL negativo, ou seja, nenhuma expressão ou atividade é observada.
[00130] A redução da expressão ou atividade de ASL o ASS pode ser medida utilizando quaisquer métodos conhecidos na técnica, tais como, mas não limitados a, PCR quantitativa, imuno-histoquímica, os ensaios de atividade da enzima (por exemplo, ensaio para medir a conversão de citrulina em argininossuccinato ou conversão de argininossuccinato em e fumarato de arginina, por exemplo, vide a Figura 1), e similares.
[00131] Dessa maneira, a presente invenção proporciona os métodos para o tratamento, melhoria dos sintomas de, ou inibição da progressão de um câncer em um paciente, que compreende a administração ao paciente de uma composição que compreende ADI, tal como descrito na presente invenção, em que o câncer apresenta a expressão ou atividade de ASS ou ASL reduzida, ou a ambos, em que o câncer inclui, mas não está limitado a leucemia (por exemplo, leucemia mieloide aguda, leucemia mieloide aguda recidiva), melanomas, sarcomas (incluindo, mas não limitado a, sarcomas uterinos metastáticas, leiomiossarcoma), câncer do pâncreas, câncer da próstata (tal como, mas não se limitando a, hormona de câncer da próstata refractário), mesotelioma, leucemia linfática, leucemia mieloide crônica, linfoma, câncer do pulmão de células pequenas, câncer de mama, câncer do ovário, câncer colorretal, câncer gástrico (incluindo, mas não limitado a, adenocarcinoma gástrico), glioma, glioblastoma multiforme, retinoblastoma, neuroblastoma, câncer de pulmão não células pequenas (NSCLC), câncer renal (incluindo, mas não limitado a carcinoma de células renais), câncer de bexiga, câncer de útero, câncer de esôfago, câncer de cérebro, cânceres da cabeça e pescoço (incluindo, mas não limitados a, carcinoma da cabeça e do pescoço de células escamosas, carcinoma da língua), câncer cervical, câncer dos testículos, da vesícula biliar, colangiocarcinoma, e câncer do estômago.
[00132] Vários estudos na literatura têm mostrado que ASS é deficiente nas seguintes tumores : Tabela 1: Tumores deficientes de ASS
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[00133] Dessa maneira, o tratamento destes cânceres deficientes de ASS é especificamente contemplado na presente invenção, o ADI- PEG 20, sozinho ou em combinação com outros tratamentos.
[00134] A presente invenção proporciona ainda os métodos para o tratamento, melhoria dos sintomas de, ou inibição da progressão do câncer em um paciente, que compreende a administração ao paciente de uma composição que compreende ADI, tal como descrito na presente invenção (por exemplo, o ADI- PEG e em particular o ADI- PEG- 20), em combinação com um inibidor da autofagia. Em uma modalidade, a presente invenção proporciona os métodos para o tratamento do câncer em um paciente, que compreende a administração ao paciente de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição que compreende ADI, tal como descrito na presente invenção em combinação com inibidor de autofagia em que o câncer é o câncer do pâncreas ou o câncer do pulmão de células pequenas.
[00135] Em certas modalidades, a presente invenção proporciona os métodos de tratamento em que a administração das composições compreendem ADI descritas na presente invenção esgotada de arginina no plasma durante pelo menos um mês, 2 meses, 3 meses, 4 meses, 5 meses, 6 meses ou mais.
EXEMPLOS EXEMPLO 1 ARGININA DEIMINASE REDUZ A VIABILIDADE DAS CÉLULAS DE LEUCEMIA MIELOIDE AGUDA DEFICIENTES EM SINTASE DE ARGININOSSUCCINATO
[00136] A leucemia mieloide aguda (AML) é a leucemia mais comum em adultos e a segunda leucemia mais comum em crianças, sendo responsável por uma parcela significativa dos custos de cuidados de saúde com dez mil casos diagnosticados por ano em somente nos Estados Unidos. TA terapia à base de enzimas sob a forma de asparaginase revolucionou o tratamento da leucemia linfoblástica aguda e existe um interesse crescente em explorar os defeitos metabólicos tratáveis análogos em AML. Os tumores auxotróficos de Arginina devido à deficiência da enzima limitante da proporção para a produção de arginina, argininossuccinato sintetase (ASS), são susceptíveis a enzimas que degradam a arginina.
[00137] Neste exemplo, foi determinado se a negatividade de ASS seria de prever para a eficácia da arginina deiminase peguilada (ADI- PEG- 20), utilizando as linhagens de células de AML e as amostras de AML primária. A falta de proteína ASS foi identificada em três das sete linhagens de células de leucemia (K562, Kasumi e KG - 1), e em todas os nove amostras de pacientes com karotipo AML citogeneticamente normal e anormal. A metilação do promotor de ASS correlacionou-se com os níveis reduzidos de mRNA de ASS e a ausência de expressão de ASS. As trefinas de medula óssea dos pacientes com leucemia mieloide aguda revelaram a ausência de proteína ASS em 87 % (46/ 53) das amostras por meio da imuno-histoquímica, indicando que a expressão de ASS pode ser usada como um biomarcador da resposta ao ADI- PEG 20 in vivo. Os níveis aumentados de mRNA de ASS e a expressão da proteína detectável de ASS foram notados na leucemia promielocítica aguda, com a translocação t (15, 17).
[00138] Significativamente, o ADI- PEG 20 reduziu a viabilidade das linhagens de AML negativas de ASS, enquanto que as linhagens de controle de ASS positivos, Fujioka e U937, foram resistentes ao fármaco induzido por meio da privação de arginina. As amostras de AML de ASS negativos primário com bom enxerto em NOD/ SCID foram identificadas e os estudos da eficácia de ADI- PEG 20, utilizando este modelo de xenoenxerto de AML primária começaram. Com base nos resultados descritos na presente invenção e a eficácia potencial com baixa toxicidade de privação de arginina em seres humanos, um estudo de fase II do ADI- PEG 20 foi planejado em pacientes com AML recaída.
EXEMPLO 2 INIBIÇÃO DA AUTOFAGIA AUMENTA A MORTE DE CÉLULAS INDUZIDAS DE ARGININA DEIMINASE DE CÉLULAS ADENOCARCINOMA PANCREÁTICAS DEFICIENTES DE SINTETASE DE ARGININOSSUCCINATO
[00139] O papel da autofagia e a sua contribuição para a morte celular é controverso. Postula-se que a autofagia é protetora em configuração de privação de arginina e que a inibição da autofagia por meio da hidroxicloroquina (CHQ) iria aumentar a morte celular.
[00140] A linhagem celular de câncer pancreático humano MIA- PaCa2 foi tratada in vitro e in vivo com peguilado arginina deiminase (ADI- PEG) sozinho ou na presença de CHQ. A morte celular foi medida por meio de iodeto de propídio (PI)- FACS para determinar o teor de DNA sub -G1, e a apoptose foi avaliada por meio da citometria de fluxo de anexina V-PI. A clivagem de caspase-3 foi avaliada por Western blot e ELISA. A autofagia foi medida através da avaliação dos níveis de expressão de LC3 e nucleoporin p62 (p62) por meio de Western blots e ELISA.
[00141] Os experimentos in vivo foram conduzidos através da geração de xenoenxertos subcutâneos em camundongos atímicos, seguido por meio das injeções intraperitoneais de PBS, o ADI-PEG, CHQ ou uma combinação de PEG e ADI- CHQ. No momento do sacrifício, os tumores foram removidos para análise. Os lisados de tumor foram analisados por Western blot para a caspase-3 e p62. Os ensaios de coloração imuno-histoquímica para caspase 3 ativada e fragmentação do DNA (TUNEL) também foram realizados.
[00142] A fim de determinar se o ADI induz a apoptose e a autofagia de uma forma dependente das caspases, as células foram incubadas ou com ADI- PEG ou uma combinação de ADI-PEG e zVAD - fmk, um inibidor da pan- caspase. Como mostrado na Figura 2A, a incubação com o ADI-PEG aumentou o número de células em sub-G0/ G1, e este efeito foi reversível com a co -incubação do inibidor da pancaspase zVAD - fmk. A incubação de células de câncer do pâncreas in vitro com ADI- PEG (0,3 ug/ ml) durante 72 horas a despolarização induzida anexina V, um outro indicador de apoptose (Figura 2B). Foi ainda demonstrado que o ADI induz a clivagem de caspase e a conjugação com a EP LC3B às 72 horas de um modo dependente da dose. Estes resultados indicaram que o ADI induz apoptose dependente da caspase e autofagia in vitro.
[00143] A fim de determinar se a inibição da autofagia intensifica a apoptose induzida por ADI, as células foram cultivadas com o ADI- PEG (0,3 ug/ mL) com ou sem CHQ (5 uM), durante 72 horas. A análise Western blot revelou a indução de apoptose por ADI como medido por clivagem de caspase-3 (Figura 3). Os níveis de p62, LC3B -I e -II LC3B foram medidos por análise de Western blot, a fim de examinar o fluxo autofagic. O ADIção de CHQ diminuída fluxo autofagic como mostrado por um aumento no nível de p62 e um aumento na acumulação de ambos LC3B LC3B -I e -II (Figura 3). Estes resultados demonstram que CHQ reforçado ADI induziu apoptose e inibiu autofagic fluxo in vitro.
[00144] A fim de analisar se CHQ altera a quantidade de morte celular por apoptose ou não apoptótica quando usado em combinação com ADI, as células foram incubadas o ADI-PEG sozinho ou uma combinação de PEG com ADI- CHQ. A adição de CHQ à cultura de células levou a um aumento na percentagem de células em sub-G0/ G1 (Figura 4B). Em contraste, as culturas incubadas com ADI- PEG e ADI- PEG com CHQ mostrou uma percentagem semelhante de células positivas para Anexina V (Figura 4A). Deste modo, estes resultados indicam que a morte celular aumenta CHQ não apopotótica in vitro.
[00145] A fim de avaliar o efeito de CHQ na supressão do crescimento do tumor dependente de ADI, os xenoenxertos subcutâneos de MIA PaCa -2 foram estabelecidos em camundongos atímicos. Os camundongos foram então tratados com PBS, o ADI- PEG, CHQ ou ADI- PEG + CHQ durante até sete semanas. Os volumes dos tumores foram medidos duas vezes semanalmente. Como mostrado na Figura 5, os camundongos tratados com ADI- PEG + CHQ tinha um volume de tumor significativamente menor em comparação com os camundongos tratados com ADI- PEG sozinho. Após a eutanásia, os tumores foram conservados em formol a 10 % e corados para marcadores de apoptose, incluindo a caspase ativa 3, o aumento da p62, e a clivagem do DNA (Figura 6). Estes resultados demonstram que uma combinação de ADI- PEG e CHQ exibiu uma sinergia na supressão do crescimento do tumor.
[00146] Em suma, a privação de arginina induziu a autofagia e a morte celular em linhagens de células deficientes em ASS. Foi mostrado que a autofagia desempenhou um papel protetor na privação arginina por meio das células de adenocarcinoma do pâncreas, e inativação de autofagia por meio da hidroxicloroquina resultou no aumento da supressão do tumor in vivo.
EXEMPLO 3 ARGININA DEIMINASE INIBE O CRESCIMENTO TUMORAL DO CÂNCER DO PULMÃO DE CÉLULAS PEQUENAS DEFICIENTES DE SINTASE DE ARGININOSSUCCINATO
[00147] O câncer do pulmão de células pequenas (SCLC) é caracterizado por uma forte resposta inicial à quimioterapia, embora a maioria dos pacientes passam por uma recaída (Dowell, Am J Med Sci 339 (1) : 68 a 76, 2010; Rodriguez e Lilenbaum, Curr Oncol Rep 12 (5) : 327 a 334, 2010). Naqueles pacientes para os quais a primeira linha de quimioterapia falha, a possibilidade de resposta a tratamentos secundários permanece cerca de 10 %, e a sobrevivência global nestes pacientes é de apenas 3 a 4 meses. Além disso, o tratamento atual carece de especificidade do tumor e resulta em vários efeitos tóxicos, e podem, consequentemente, limitar a administração da terapêutica para um valor inferior à dose máxima eficaz (Demedts et al, Eur Respir J 35 (1) : 202 a 215, 2010; Dowell, Am J Med Sci 339 (1) : 68 a 76, 2010; Rodriguez e Lilenbaum, Curr Oncol Rep 12 (5) : 327 a 334, 2010). Esta situação evidencia a necessidade do desenvolvimento contínuo de agentes anticâncer eficazes com índices terapêuticos elevados.
[00148] Este exemplo descreve a extensão de auxotrofia de arginina em SCLC e a eficácia de terapia de arginina ADI- PEG 20 nesta doença.
As linhagens de células, anticorpos e produtos químicos
[00149] Um painel de 10 SCLC foi obtido a partir do banco de células do Instituto Ludwig para Pesquisa do Câncer, New York Branch no Memorial Sloan -Kettering Cancer Center (MSKCC). As células estavam estabelecidas em MSKCC ou compradas a partir da American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, EUA). As células foram cultivadas em meio RPMI - 1640 suplementadas com 10 % de soro fetal de vitelo v/ v, 5 % p/ v de penicilina/ estreptomicina (5000 unidades de penicilina G mL - 1 por 5000 mg de sulfato de estreptomicina mL -1) e 1 % de L-glutamina. A expressão celular de argininossuccinato sintetase (ASS) por meio de western blot foi avaliada usando um anticorpo anti -ASS (Clone 25, BD Biosciences, San Jose, CA, EUA). LC3B (Cell Signaling, Danvers, MA, EUA), ativa a caspase- 3 (sinalização celular), no total foram usados caspase-3 (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA, EUA) e actina (GeneTex, Irvine, CA, EUA), de acordo com as instruções do fabricante. Topotecano cloridrato foi obtido a partir de Axxora (San Diego, CA, EUA) e cloroquina foi obtida a partir da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EUA).
Imuno-histoquímica
[00150] Os tumores e tecidos normais foram corados com anticorpo anti -ASS 195-21-1 (LICR, Nova Iorque, NY, EUA), como detalhado no Jungbluth et al (Mod Pathol 23 (Suppl 1): 387A, 2010).
A análise de Western blot
[00151] Os lisados de células inteiras de linhagens de células de SCLC foram preparados em tampão de lise RIPA (50 mM Tris-HCl, 0,05 % de SDS, 0,5 % Na- desoxicolato, NaCl a 150 mM, EDTA a 5mM mais tampão de coquetel de inibidores de protease (Roche Applied Science, Indianapolis, IN, EUA). As quantidades de proteína foram determinadas usando o ensaio de proteínas Pierce BCA (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, EUA) e as quantidades iguais de proteínas foram resolvidas por SDS-PAGE, utilizando de 4 a 12 % de géis (NuPAGE, Invitrogen Life Technologies), as proteínas foram transferidas para membranas de PVDF (Millipore, Billerica, MA, EUA), bloqueadas com BSA a 5 % e sondadas com anticorpos apropriados durante a noite a 4 ° C. Após a lavagem, as membranas foram então sondadas com o anticorpo secundário adequado antes de, finalmente, as proteínas terem sido visualizadas utilizando ECL reagente (Perkin - Elmer, Fremont CA, EUA).
PCR quantitativo em tempo real
[00152] Para extração de RNA, os péletes de células foram dissolvidos em 600 ul de solução de Reagente TRI (Ambion, Austin, TX, EUA), e 60 ul de bromocloropano foi então adicionado. Aproximadamente duas gotas do composto de temperatura de corte ótimo (Miles Inc., Elkhart, IN, EUA) foi em seguido adicionado ao tubo e a mistura foi agitada em vórtex e deixada repousar à temperatura ambiente durante 2 min. Após centrifugação a 14000 r.p.m. durante 10 min, o sobrenadante foi removido para um novo tubo, onde um volume igual de 100 % de isopropanol foi adicionado para precipitar o RNA. Após centrifugação a 14.000 rpm, o sedimento de ARN foi lavado em etanol a 75 % e novamente centrifugado, antes de re- suspensão em 50 ul de água quente. A concentração de RNA foi determinada utilizando um nanofotômetro (Implen Inc., Westlake Village, CA, EUA).
[00153] Para a amplificação de cDNA, 1,5 μg de ARN foi adicionado a uma mistura de reação que compreende cDNA de tampão de reação 10X (Qiagen, Valencia, CA, EUA), dNTPase a 5mM (Qiagen), Oligo DT (Qiagen), transcriptase reversa (Invitrogen Life Technologies) e RNAse Fora (Invitrogen) em um volume total de 20 ul. Para quantitativa em tempo - real (qRT)- PCR, as reações de 1,5 μl de cDNA foram misturadas com uma mistura de reação contendo 5 ul SYBRGreen (Invitrogen), 0,02 μl Rox, 0,2 μl de iniciadores, e água para um volume total de reação de 10 ul. Para ASS, os iniciadores foram F : 5'- TTTAAGCAGACTAAGGGG -3 '(SEQ ID NO: 3) e R : 5'- CCAT CCCAGGTTATAAGCACA -3 ' (SEQ ID NO: 4). A análise de qRT- PCR foi realizada utilizando um sistema rápido DE PCR em tempo real 7500 (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, EUA), com a GAPDH usado para normalização da expressão. A quantificação relativa da expressão do gene (quantidade relativa de ARN alvo) foi determinada utilizando a equação 2 (- ΔΔCT).
Os ensaios de proliferação
[00154] Para avaliar o efeito anti -proliferativo de ADI- PEG 20 em células aderentes, as células foram plaqueadas em uma densidade de 2 x 103 células por cavidade em uma placa de cultura de tecidos de 96 micropoços e deixadas aderir durante a noite. No dia seguinte, as células foram tratadas com ADI- PEG 20 (DesigneRx Farmaceuticals, Vacaville, CA, EUA, uma subsidiária da Polaris Group, San Diego, CA, EUA) variando de 0 a 10 MUI ml -1. Após incubação durante 120 horas, a viabilidade celular foi determinada utilizando (3 - (4,5- dimetiltiazol -2- il) -5 - (3- carboximetoxifenil) -2 - (4- sulfofenil)- 2H- tetrazólio) (MTS, Uma solução de titulação de célula 96aquosa, Promega, Madison, WI, EUA), de acordo com o protocolo do fabricante. Vinte microlitros do reagente de MTS foram adicionados ao controle apropriado e as cavidades de ensaio antes da placa foram incubadas durante 2 h a 37 ° C e a absorvância lida a 490 nm. A absorvância absoluta de cada tratamento foi determinada por meio da subtração do fundo MTS absorvência, e a média e o desvio padrão foi calculado. O efeito do inibidor de autofagia cloroquina (Sigma) sobre a proliferação celular foi avaliada utilizando o ensaio de MTS.
[00155] Para avaliar a atividade de ADI- PEG 20 nas células não aderentes, as células foram plaqueadas a uma densidade de 1 x 105 células por cavidade em uma placa de cultura de tecidos de 24 cavidades. Os meios de comunicação adicionais, em seguida, foram adicionados contendo ADI-PEG 20 para as concentrações finais que variam de 0-10 mUI ml -1. Para medir as variações na proliferação após a incubação com o ADI-PEG 20, durante 120 horas, as células foram recolhidas, lavadas e lisadas em tampão RIPA. A proteína total, para cada tratamento foi então determinada utilizando o ensaio de proteína de BSA, como uma medida do número de células total. Todos os tratamentos foram realizados pelo menos em triplicado.
Coloração com iodeto de propídio para a coloração de sub-G1
[00156] A apoptose foi medida por meio de FACS de células coradas de iodeto de propídio como detalhado por Riccardi et al (Riccardi e Nicoletti, Nat. protocolo 1 (3) : 1458 a 1461, 2006). As células foram plaqueadas em placas de 24 cavidades e tratadas com ADI- PEG 20 durante 120 horas. As células foram então colhidas, lavadas e fixadas em etanol a 70 %. O DNA foi, em seguida, corado utilizando 20 μg ml- 1 de iodeto de propídio contendo 10 μgml -1 de DNAse livre de RNAse A (Sigma- Aldrich). As células foram então continuadas a ler um FACSCalibur BD (BD Biosciences) e analisadas utilizando Fluxo Jo Software (Árvore Star, Ashland, OR, EUA).
Baixa regulação de pequeno interferente de RNA de ASS
[00157] Para avaliar ainda mais a importância da expressão ASS celular em resposta ao tratamento com ADI- PEG 20, a expressão de ASS foi silenciada através do uso específico de siRNA - ASS. Pequenos constructos interferentes de RNA foram obtidos a partir de tecnologias Integradas de DNA (IDT, Coralville, IA, EUA) contra a região ASS codificante. Somente os constructos siRNA sem quaisquer outros jogos de transcrição foram selecionados para novos experimentos.
[00158] Argininossuccinato sintetase de SW1222 positivo foi plaqueada a uma densidade de 6 x 105 células por placa em 8 ml de meio em placas de cultura de 100 mm de tecido e deixadas aderir durante a noite. Para a transfecção, 10 ul de 10 mM de ASS siRNA foram adicionados para 990 ul meios Opti- MEM e 20 ul de reagente Lipofectamina 2000 foi diluído em 980 ul de meio Opti- MEM (Invitrogen Life Technologies). Estas misturas foram incubadas durante 5 min à temperatura ambiente antes de serem misturadas e incubadas durante mais 20 min à temperatura ambiente. A mistura de transfecção foi então adicionada às células e incubadas durante 24 h a 37 ° C. Neste momento, as preparações das células transfectadas foram retiradas da placa de cultura, e plaqueadas em placas de 96 cavidades a fim de avaliar o efeito de ADI-PEG 20, sobre o crescimento das células transfectadas. Outras células incubadas durante mais 72 h antes do processamento para a PCR e análise de Western blot.
Estudo de eficácia in vivo de Arginina deiminase PEG20
[00159] SCLC SK -LC- 13 de ASS negativo foi encontrado para ser tumorigênico e foi subsequentemente usado para determinar a eficácia de ADI- PEG 20 in vivo. A atividade do ADI- PEG 20 também foi avaliada em camundongos com xenoenxertos SCLC NCI- H69 ASS positivos. Xenoenxertos de câncer de células pequenas do pulmão foram estabelecidos em camundongos fêmea BALB/ c - nu, de 3 a 4 semanas de idade, pesando ~ 20 g (Charles River Labs, Wilmington, MA, EUA). Para estabelecer os tumores, 10 x 106 células em meio foram misturadas a 1: 1 com Alta Concentração de Matrigel (BD Biosciences) e injetadas por via subcutânea na região abdominal dos camundongos. O crescimento do tumor foi medido periodicamente e o volume do tumor calculado utilizando a fórmula (TV = (comprimento x largura 2)/ 2). Todos os estudos com animais foram aprovados pelo MSKCC Animal Care Institucional e Use Committee. Os camundongos foram sacrificados quando os tumores atingiram um volume de aproximadamente 1000 mm3.
[00160] A eficácia antitumoral do ADI-PEG- 20 foi avaliado em camundongos portadores simultaneamente de xenoenxertos SK -LC- 13 SCLC tanto moderados quanto grandes. No primeiro estudo, o tratamento foi iniciado quando os tumores tinham atingido um tamanho médio de 125 mm3. No estudo de xenoenxerto grande, o tratamento foi iniciado quando os tumores tinham atingido um tamanho médio de 500 mm3. A arginina deiminase - PEG20 foi administrada em doses de 1, 2 e 5 UI por animal, uma vez a cada 5 dias para 20 dias (cinco doses). Para avaliar o efeito de dosagem sustentada, outros grupos (n = 5) em todos os níveis de dose receberam a administração continuada de ADI- PEG 20, a cada 5 dias até os tumores terem progredido para o limite de tamanho de 1000 mm3. Adicionalmente, a eficácia de ADI-PEG- 20 foi avaliada em camundongos portadores de xenoenxertos NCI - H69 ASS positivos. Aqui, os camundongos receberam cinco doses de 2 UI ADI- PEG 20, durante 20 dias, uma vez que o tumor atingiu um tamanho médio de 150 mm3. Arginina deiminase - PEG20 foi administrado por injeção intraperitoneal em todos os estudos. A atividade específica do ADI- PEG 20 usado nestes estudos é 9 UI mg -1 de proteína. Dessa maneira, 1 UI de ADI- PEG 20 por 20 g de rato é equivalente a 160 UI m-2.
Medição de soro de arginina e citrulina
[00161] A fim de determinar o efeito de ADI-PEG 20, os níveis de arginina no tratamento sistémicos, os soros de camundongo foram analisados por meio da cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC). L-arginina e L- citrulina foram resolvidos com um instrumento de derivatização pós-coluna de Laboratories Pickering PCX 5200 (Pickering Laboratories, Mountain View, CA, EUA) a 39 ° C, temperatura de reação e um detector de fluorescência. Todos os reagentes, incluindo o tampão de coluna, foram usados tal como sugerido pelo Pickering Laboratories. O total de 20 níveis de ADI-PEG foi determinado por meio de ELISA, como descrito anteriormente (Holtsberg et al, J Release Control 80 (1 a 3) : 259 a 271, 2002).
A análise estatística
[00162] A eficácia do tratamento ADI- PEG 20 in vivo foi avaliada comparando os meio de grupos de controle e tratamento usando t- testes bilaterais desemparelhados na terminação de grupos de controle utilizando GraphPad Prism (versão 5.0, GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, EUA). Um nível de confiança de 95 % foi usado, com volume médio tumor declarado significativamente diferente se P < 0,05.
RESULTADOS SCLC frequentemente carece da expressão de ASS
[00163] À medida que a falta de expressão de ASS é geralmente associada à sensibilidade ADI, a sua expressão foi avaliada em tumores de SCLC humanas. Tal como mostrado na Figura 7C, uma análise imuno-histoquímica inicial (IHQ) de tumores SCLC humanas revelou que alguns SCLC tiveram uma quase total falta de expressão de ASS. Cerca de 45 % (7 de 16) dos tumores nesta análise inicial demonstrou pouca ou nenhuma expressão ASS. Pelo contrário, a expressão robusta de ASS foi evidente em tecidos normais, tais como a pele (Figura 7A) e de outros cânceres, tais como carcinoma do cólon (Figura 7B ; Jungbluth et al, Mod Pathol 23 (Suppl 1): 387A, 2010).
[00164] Como a análise imuno-histoquímica inicial mostrou uma perda frequente de expressão de ASS em tumores humanos SCLC, o status de expressão de ASS em um painel de linhagens de células de SCLC foi avaliado. A análise por meio de Western blot revelou que 5 dos 10 (50 %) das linhagens de células SCLC testadas careceram da expressão significativa de ASS ao nível da proteína (Figura 7D). A expressão celular de ASS, como detectada por meio de immunblotting ocidental foi semelhante usando tanto o clone 195-21-1 25 quanto os anticorpos anti-ASS (dados não mostrados). A análise dos níveis de mRNA utilizando qRT-PCR demonstrou uma correlação geral entre o mRNA ASS e os níveis de expressão de proteína (Figura 7E).
A arginina deiminase - PEG20 inibe a proliferação das linhagens de células SCLC ASS negativas in vitro
[00165] O efeito de ADI- PEG 20 sobre a proliferação celular in vitro foi avaliada em ambas as células SCLC de ASS positivo e aquelas que não possuem a expressão da enzima. As células com características de crescimento de cultura de tecidos tanto aderentes quanto as não aderentes foram incluídas nestas experiências. Uma diminuição dependente da dose na proliferação clara foi encontrada nas linhagens de células de SCLC de ASS negativo aderentes a SK -LC- 13 e SW1271. Nenhum efeito foi evidente no crescimento da linhagen de célula do carcinoma do cólon da aderente de SW1222 de ASS positivo (Figura 8A). Como para as células não aderentes, as células de ASS positivo demonstraram resistência quase total para os efeitos anti- proliferativos do ADI- PEG 20, ao passo que uma diminuição relativa da proliferação foi observada novamente nas células deficientes de ASS seguindo o tratamento ADI- PEG 20 (Figura 8B). À medida que a linhagem de células sensíveis a ADI- PEG 20 de SK -LC- 13 foi determinada ser tumorigênica, foi escolhida para ser uma linhagem de células de modelo para posteriores experiências in vitro e in vivo.
A arginina deiminase - PEG20 induz a apoptose independente de autofagia e caspase
[00166] Tal como acontece de uma forma mais geral no que diz respeito à fome de nutritivo, o esgotamento da arginina intracelular por ADI tem sido observado para induzir stress metabólico e autofagia celular subsequente (Kim et al, Câncer Res. 69 (2) : 700 a 708, 2009; Savaraj et al, Curr Med Mol 10 (4) : 405 a 412, 2010). Um ensaio para a formação da proteína relacionada com a autofagia LC3 -II avaliou se o tratamento com o ADI-PEG- 20 foi capaz de induzir a autofagia celular em CPPC. Embora alguma expressão basal de expressão LC3 -II foi observada em SK -LC -13, o tratamento com ADI- PEG 20 resultou em um claro aumento no nível celular detectável da proteína (Figura 9E). A cloroquina é um inibidor conhecido da autofagia lisossomal que interrompe as funções normais e, dessa maneira, resulta em um aumento no nível celular de LC3 -II. Posteriormente, as células tratadas com cloroquina como um controle positivo demonstrou expressão muito robusta de LC3 -II. O tratamento combinado de células com ADI- PEG 20 e cloroquina resultou em um pequeno decréscimo, mas significativo (P = 0,008), em relação à viabilidade dos tratamentos individuais, sugerindo que a inibição da autofagia pode aumentar a eficácia de ADI- PEG 20 (Figura 14).
[00167] De modo a determinar o possível mecanismo dos efeitos antiproliferativos de ADI- PEG 20 uma análise FACS da apoptose por meio do teor sub -G1 de DNA foi realizado. As células foram tratadas durante 72 h antes da análise ter sido realizada. Pouco apoptose foi detectável em células não tratadas, enquanto 25 nM de topotecano, usado como um controle positivo, foi observado que causa apoptose em aproximadamente 45 % das células SK -LC- 13 (Figuras 9A e B). Apesar de não ser tão eficaz como o topotecano, a incubação com 1,0 ml e 10 mUI -1 de ADI- PEG 20, resultou na indução de apoptose em cerca de 6 % e 16 % de células, respectivamente (Figuras 9C e D). Embora a apoptose foi aparente pelo teor sub -G1 de DNA, qualquer ativação das caspases foram observadas após o tratamento de células com ADI- PEG 20, em contraste com as células tratadas com topotecano (Figura 9F). Silenciamento de expressão ASS induz sensibilidade à ADI- PEG 20
[00168] Após a transfecção com siRNA especifico de ASS, a expressão relativa de ASS em linhagens de células ASS positivas foi avaliada por PCR em Tempo Real. Como mostrado na Figura 10A, a transfecção com ASS de siRNA reduzu os níveis de mRNA ASS por ~ 90 % após 72 h de incubação. Western blot demonstrou uma redução simultânea robusta na expressão dos níveis de proteína nas células tratadas com siRNA especifico de ASS (Figura 10B). No entanto, alguma expressão de ASS permaneceu sob estas condições. O exame da viabilidade celular utilizando o ensaio de MTS demonstrou que as células ASS positivas tratadas com siRNA de ASS tornou-se sensível à privação de arginina induzida por ADI- PEG 20, resultando na redução da viabilidade das células, enquanto nenhuma diminuição na viabilidade foi observada no controle ou tratada com as células tratadas com siRNA (Figura 10C).
A arginina deiminase - PEG20 inibe o crescimento de xenoenxertos de SCLC
[00169] A eficácia antitumoral do tratamento sistêmico com ADI- PEG 20 in vivo foi avaliada em camundongos BALB/ c -nu com xenoenxertos SCLC humanos. Estudos independentes foram realizados em camundongos com tumores estabelecidos cerca de 125 mm3, e em camundongos portadores de tumores maiores (~ 500 mm3) no início do tratamento. Nos camundongos portadores de xenoenxertos SK -LC- 13 de tamanho moderado (124,6 ± 37,1 mm3), ADI- PEG 20 causou uma redução significativa e dependente da dose do crescimento do tumor em relação aos camundongos de controle (Figuras 11A- C). Os camundongos de controle foram sacrificados no dia 33, devido ao volume excessivo de tumor, altura em que o volume do tumor médio do controle de camundongos foi significativamente maior do que nos grupos de camundongos tratados com ADI- PEG 20, independentemente da posologia ou do tratamento (P> 0,0001 para todos os grupos de tratamento, Figura 11D). Na conclusão do estudo, os tumores tratados com uma dose contínua de 5 UI de ADI- PEG 20, a cada 5 dias foram significativamente menores do que aquelas doses a cada 5 dias para apenas 20 dias (P = 0,0063). No entanto, este efeito não foi observado nas doses de 1 e 2 UI, uma vez que o crescimento do tumor continuou a uma taxa comparável nos grupos que receberam a dosagem curta e contínua. Subsequentemente, os volumes tumorais médios de camundongos que receberam dosagens curtas ou contínuas de ADI- PEG 20 não foram significativamente diferentes na terminação dos respectivos grupos de dosagem curto, devido ao volume excessivo do tumor (1 UI : P = 0,251 ; 2UI : P = 0,084). O tratamento de xenoenxertos SCLC NCI - H69 de ASS positivo com ADI- PEG 20 não produziu qualquer efeito sobre o crescimento do tumor (Figura 12).
[00170] Análise do soro destes camundongos antes (dia 0), durante (dia 12) e após (dia 40), a dosagem inicial do ADI- PEG 20 revela que os níveis séricos ADI-PEG 20 foram dependentes da dose (Figura 11E). Nos camundongos em que o ADI-PEG 20 só foi administrado até 20 dias, foram observados níveis séricos da enzima para voltar aos níveis da linha de base no dia 40, de acordo com o ~ 7 dias de semivida de ADI- PEG 20 nos camundongos (Ensor et al, Cancer Res. 62 (19) : 5443 a 5450, 2002; Holtsberg et al, J Release Control 80 (1 a 3) : 259 a 271, 2002). Além disso, este pequeno curso de tratamento apenas temporariamente empobrecido de arginina no soro, tal como esperado, o que posteriormente voltou aos níveis normais de 20 dias após a última dose (dia 40) sem qualquer outra dosagem de ADI- PEG 20 (Figura 11F). Os níveis de citrulina subiram em uma relação dose- dependente de arginina, com um curso mais curto do ADI- PEG 20 correlacionando-se com o retorno dos níveis de citrulina à linha de base (Figura 11G). Os níveis de citrulina aumentou com a dosagem prolongado no nível 1 UI, de acordo com arginina sistêmica restante e foi metabolizado em citrulina, apesar de os níveis de arginina no soro serem abaixo dos limites de detecção. Pouco aumento nos níveis de citrulina foi observado com a administração contínua os níveis de doses de 2 e 5 UI.
[00171] No segundo estudo de ADI- PEG 20, in vivo, o tratamento foi iniciado quando os tumores tinham atingido um tamanho relativamente grande de 473,4 ± 161,0 mm3. A inibição dependente da dose do crescimento do tumor foi novamente observada (Figuras 13A- C), embora esta não foi tão significativa como a observada em animais com xenoenxertos menores. Os volumes tumorais foram comparados no término do grupo de controle no dia 32 deste estudo (Figura 13D). O tratamento continuado com um UI ADI- PEG 20 foi capaz de reduzir significativamente o volume do tumor em relação a camundongos de controle (P = 0,007), enquanto que um tratamento de curta duração, não resultou em uma redução estatisticamente significativa no tamanho do tumor (P = 0,07). Além disso, a dosagem contínua foi observada para causar uma redução moderada significativa (P = 0,26) no volume do tumor em relação ao tratamento de curta duração, tal como avaliado no fim do grupo de curto tratamento no dia 39. Em doses mais elevadas de ADI- PEG 20, foi observada uma redução significativa do volume do tumor em relação aos controles não tratados com o nível curto (P = 0,004) e contínuo (P = 0,0007) ao nível de administração UI 2, e também, tanto ao nível curto (P = 0,0003) e contínuo (P = 0,0001) no nível de dose de 5 UI. No entanto, a administração contínua não melhorou significativamente as respostas a estas doses em relação ao tratamento de curta duração.
[00172] Em suma, este exemplo demonstra que uma grande proporção de SCLCS falta noq ue diz respeito à expressão de ASS, e que SCLC de ASS negativo são sensíveis à terapia de privação de arginina. Embora a frequência de deficiência de ASS não seja igual a quase total ausência de expressão como relatado em melanoma, permanece o fato que 50 % dos cerca de 30.000 novos casos de SCLC relatados nos Estados Unidos a cada ano podem ser suscetíveis a terapia de privação de arginina.
[00173] Em estudos in vitro utilizando as linhagens de células SCLC deficientes de ASS tanto aderentes quanto as não aderentes demonstraram que o ADI-PEG 20 causou a eficácia antiproliferativa dependente da dose. Os resultados descritos na presente invenção indicam que a perda de proteína ASS está associada com os efeitos antiproliferativos do ADI- PEG 20 em células idênticas e valida ainda as sensibilidades relativas observadas em cânceres SCLC de diferentes expresses de ASS. A inibição da autofagia cito-protetora pode potenciar os efeitos antiproliferativos do ADI- PEG 20, a combinação de ADI- PEG 20 com 25 mM do inibidor de autofagia cloroquina foi avaliada in vitro (Kim et al, Cancer Res. 69 (2): 700 a 708, 2009). No entanto, a combinação induziu somente um moderado, mas significativo (P = 0,008), aumento do efeito antiproliferativo de ADI-PEG- 20 nas células de SCLC (Figura 14). O tratamento de SCLC com ADI- PEG 20 causou um aumento moderado na população de células, em pico sub -G1 após coloração com iodeto de propídio, o que sugere que estas células tinham sofrido apoptose. A análise por Western blot revelou que o ADI- PEG 20 não causou a ativação da caspase em células SCLC SK -LC- 13. Sem querer estar limitado pela teoria, a resposta celular global à privação de arginina induzida por ADI-PEG- 20 nas células de SCLC parece operar através de um mecanismo complexo que envolve uma resposta metabólica inicial vista na indução de autofagia, seguida por morte celular independente de caspase.
[00174] Estudos in vivo em camundongos revelaram que o crescimento de xenoenxertos SK -LC- 13 foi abolido por ADI- PEG 20 em uma forma de dose -dependente. A atividade antitumoral significativa foi observada na dose de 1, 2 e 5 UI por doses de animais. É importante notar, embora a inibição mais forte do crescimento do tumor tenha sido observada em camundongos portadores de tumores menores (~ 120 mm3 ) tumores estabelecidos, ADI- PEG 20 também demonstrou a sua eficácia antitumor significativa em camundongos portadores de xenoenxertos grandes (~ 500 mm3). Embora a comparação direta com outros tipos de tumores seja difícil, a eficácia antitumoral observada com o ADI-PEG 20 em xenoenxertos de SCLC é semelhante e, possivelmente, superior àquela observada utilizando as doses equivalentes de ADI- PEG 20, em diferentes tipos de tumores, incluindo os xenoenxertos de câncer da próstata e renal .
EXEMPLO 4 ARGININA DEIMINASE INIBE O CRESCIMENTO DE SARCOMAS METASTÁTICOS DEFICIENTES DE ASS
[00175] Enquanto sarcomas são um grupo raro de tumores, a má resposta aos regimes clínicos atuais representa uma importante necessidade insatisfeita em oncologia. Uma melhor compreensão da biologia terapêutica e do metabolismo do crescimento do sarcoma é necessária em relação ao desenvolvimento de novas terapias para o tratamento de pacientes com este grupo de tumores. Sintetase de argininossuccinato (ASS) é a enzima limitante para a conversão de arginina para citrulina. Quando ASS não é expressa, arginina torna-se um aminoácido essencial para uma célula de câncer que deve ser entregue a partir da dieta.
[00176] A análise imuno-histoquímica de 701 amostras de pacientes que representam 45 subtipos de sarcoma demonstrou que ASS não é expressa em mais de 85 % dos sarcomas (619 de 701 amostras de pacientes). Isto sugeriu que os sarcomas são sensíveis à terapia de privação de arginina usando arginina deiminase peguilada (ADI- PEG 20).
[00177] O tratamento de um painel de leiomiossarcoma, osteossarcoma, sarcoma alveolar de partes moles, tumor maligno do nervo periférico maligno e as linhagens de células de sarcoma de Ewing com ADI- PEG 20 resultou em paragem do ciclo celular, mas não apoptose, quando a expressão ASS era baixa, enquanto que a linhagem de células de osteossarcoma MG63 de alta ASS continuou a dividir-se. A resposta nas linhagens de células de sarcoma foi dependente da expressão de ASS, como sarcomas ósseos, sarcomas dos tecidos moles, complexos de sarcomas citogenéticos e translocação de sarcomas dependentes todos demonstraram a inibição de ciclo celular após tratamento com ADI- PEG 20. A CI50 para as linhagens de células tratadas com ADI- PEG 20 variaram de 0,02-0,1 ug/ ml em linhagens de células sensíveis com baixa expressão de ASS.
[00178] O tratamento de sarcomas que carecem de ASS com ADI- PEG 20 induziu a autofagia. O esgotamento da arginina por ADI- PEG 20 em sarcomas deficientes de ASS quando combinado com cloroquina, um inibidor da autofagia, induziu a morte celular como medido por meio de anexina V.
[00179] O xenoenxerto da linhagem de cálula MNNG de orteossarcoma expressando baixo ASS nos camundongos nus, seguido por tratamento com ADI- PEG 20 mostrou uma taxa de crescimento do tumor significativamente mais lenta em comparação com os controles tratados com PBS.
[00180] No que diz respeito aos exemplos acima, deve notar-se que, em um modelo de xenoenxerto de carcinoma de células renais, foi observado que o ADI-PEG 20 mais o inibidor autofagia, hidroxicloroquina, não resultou em um efeito aditivo. Por conseguinte, o efeito de ADI-PEG 20 mais inibidores autofagia em qualquer tipo de câncer em particular não é previsível, destacando ainda mais os efeitos surpreendentes da presente invenção.
EXEMPLO 6 ADI- PEG 20 COMBINADO COM CISPLATINA AUMENTA SIGNIFICATIVAMENTE A ATIVIDADE ANTITUMORAL IN VIVO
[00181] O ensaio de xenoenxerto também foi realizado para avaliar a eficácia in vivo de ADI- PEG 20, em combinação com a cisplatina. ADI- PEG 20 foi avaliada in vivo para eficácia terapêutica, quer como um agente único ou em combinação com cisplatina, no tratamento de dois modelos diferentes de xenoenxerto de melanoma humano em camundongos nus. A dose de cisplatina foi de 6 mg/ kg ou 18 mg/m2 (Km = 3) por via intraperitoneal (IP) administrado a cada 6 dias x 3 doses. Esta mesma dose, extrapolada para seres humanos, seria de 40 mg/m2 (Km = 40), ou uma dose total de 120 mg/m2 ao longo de 3 semanas. ADI- PEG 20 foi dada em 53,3 UI/ kg a cada 6 dias IM x 4 doses. Esta mesma dose de 20 ADI- PEG, extrapolada para seres humanos, seria de 160 UI/m2 ou 18 mg/m2. Como mostrado na Figura 15, o tratamento com o ADI-PEG 20 e a combinação de cisplatina mostraram atividade significativamente melhorada em comparação com qualquer um dos agentes isolados. Dessa maneira, os dados de xenoenxerto mostraram que a combinação de ADI- PEG 20 e a cisplatina resulta na atividade melhorada das células de tumor de melanoma deficientes ASS, mesmo quando a cisplatina foi administrada ao longo de um período de tempo limitado.
EXEMPLO 7 ESTUDO DE FASE HUMANA I DE ADI- PEG 20 ASSOCIADA COM DOCETAXEL
[00182] Um estudo de dose escalada de único centro, aberto, de fase I foi iniciado para determinar a dose máxima tolerável e toxicidade limitante dose (MTD e DLT) do ADI- PEG 20, em combinação com docetaxel administrado por via intravenosa (IV) a cada três semanas para os pacientes com tumores sólidos avançados. Os pacientes receberam o ADI- PEG 20 por via intramuscular (IM), em doses crescentes semanal seguido uma hora mais tarde (no dia 1), através de docetaxel 75 mg/m2 IV. A duração do ciclo é de 21 dias. ADI- PEG 20 foi mantida como uma injeção IM semanalmente por toda parte. O aumento da dose ocorreu através de um projeto padrão de 3 +3. Cada novo grupo de dose foi retomado 21 dias após o último paciente ter sido inscrito no grupo anterior. 18 mg/m2 é aproximadamente equivalente a 160 UI/m2.
[00183] O regime de dosagem é resumido na Tabela 2 abaixo. Tabela 2: Regime de dosagem Docetaxel + ADI- PEG 20
Figure img0003
*O ensaio sera iniciado no nível 1 e sera desescalado ao nível -1 se DLT foi observado.
[00184] O esquema de tratamento é resumido na Tabela 3 abaixo. Tabela 3: Esquema de tratamento
Figure img0004
1: ciclo 1 é igual a 21 dias 2: A administração de docetaxel IV no primeiro dia de cada ciclo (em perfusão durante 30 min.)
3: ADI-PEG-20 é administrada por via intramuscular uma vez por semana
[00185] Os primeiros resultados deste estudo estão resumidos na Tabela 4 abaixo. Em particular, 8 dos pacientes tratados até à data com a informação disponível, os resultados de benefícios clínicos objetivos são os seguintes: Tabela 4: Sumário dos resultados do estudo
Figure img0005
[00186] Assim 6 de 8 (75%) dos pacientes inscritos até à data têm benefício clínico (doença estável + resposta parcial + resposta completa).
[00187] As doses a serem usadas neste estudo são doses baixas, como 18 mg/m2, tem sido usadas em estudos da fase 3 do carcinoma hepatocelular, e 36 mg/m2 demonstrou eficácia em pacientes com melanoma. Por conseguinte, este dado precoce é muito encorajador tendo em conta a resposta positiva, mesmo nesta dose baixa, e sugere que a combinação de ADI- PEG 20 com docetaxel é um tratamento eficaz do câncer. Em particular, o docetaxel é aprovado nos Estados Unidos para o tratamento de tumores do câncer de mama, câncer de pulmão de células não pequenas, câncer de próstata de hormônio refratário, adenocarcinoma gástrico e carcinoma de células escamosas da cabeça e pescoço. Além disso, tem sido usado no tratamento de sarcoma, leiomiossarcoma especialmente uterino, e sobre o câncer da variante. Como tal, o tratamento destes cânceres com docetaxel em combinação com ADI- PEG 20 está aqui especificamente contemplado.
EXEMPLO 8 ADI- PEG 20 MAIS RAPAMICINA DEMONSTRA EFEITO SINÉRGICO NO MODELO DE XENOENXERTO IN VIVO DE CARCINOMA DE CÉLULA RENAL
[00188] Um modelo de xenoenxerto de camundongo foi usado para estudar os efeitos de ADI- PEG 20 sozinho e, em combinação com a rapamicina para o tratamento de carcinoma de células renais.
[00189] A atividade do ADI- PEG 20 foi avaliada em camundongos com xenoenxertos Caki -1 (ATCC HTB- 46TM). O carcinoma de Células Renais dos xenoenxertos Caki - 1 foi estabelecido em camundongos BALB/ c- nus fêmeas, de 3 a 4 semanas de idade, com um peso de 20 g (SLAC, Shanghai, China). Para estabelecer os tumores, as células 5 x 106 em meios foram misturadas 1: 1 com alta concentração de Matrigel (BD Biosciences) e injetadas por via subcutânea na região abdominal dos camundongos. O crescimento do tumor foi medido periodicamente e o volume do tumor calculado utilizou a fórmula (TV = (comprimento x largura 2)/ 2). Quando os tumores atingiram um volume aproximado de 125mm3, ADI- PEG20 foi administrado ao nível de 160, 320 e 640 UI/m2 uma vez por semana durante quatro semanas por meio das doses por via intramuscular. Cada grupo de estudo teve nove camundongos. Os camundongos foram sacrificados quando os tumores atingiram um volume aproximado de 1100mm3. Os resultados indicaram que ADI- PEG 20 inibiu o crescimento do tumor de um modo dependente da dose. Mais do que 80 % da inibição do tumor foi alcançada quando 640IU/m2 foi usada.
[00190] Em uma experiêncio adicional, a atividade de ADI- PEG 20, quer como um agente único ou em combinação com a rapamicina foi avaliada em camundongos portadores do xenoenxerto Caki -1. Os xenoenxertos de carcinoma de células renais foram estabelecidos em camundongos BALB/ c- nus fêmeas, de 3 a 4 semanas de idade, pesando cerca de 20 g (SLAC, Shanghai, China). Para estabelecer os tumores, as células 5 x 106 em meios foram misturadas 1: 1 com alta concentração de Matrigel (BD Biosciences) e injetadas por via subcutânea na região abdominal dos camundongos. O crescimento do tumor foi medido periodicamente e o volume do tumor calculado utilizando a fórmula (TV = (comprimento x largura2)/ 2). Quando os xenoenxertos Caki - 1 atingiram um volume aproximado de 125mm3, os camundongos foram aleatoriamente divididos em seis grupos de oito animais por grupo, e os tratamentos foram iniciados de acordo com o protocolo seguinte : Grupo 1 recebeu 40 ul de PBS, uma vez por semana durante quatro semanas através de injeções intramusculares, o grupo 2 recebeu ADI-PEG 20 (320IU/m2) uma vez por semana, durante quatro doses por via de injeções intramusculares, o grupo 3 recebeu rapamicina (0,5 mg) uma vez por dia durante 21 dias pela injeção ip, grupo 4 recebeu rapamicina (0,2mg/ kg) uma vez por dia durante 21 dias pela injeção ip, o grupo 5 recebeu uma combinação de ADI- PEG20 (320 IU/m2) uma vez a cada semana, durante quatro semanas e rapamicina (0,5 mg) uma vez por dia durante 21 dias, o grupo 6 recebeu ADI- PEG20 (320 IU/m2) uma vez em cada semana durante quatro semanas e rapamicina (0,2mg/ kg) uma vez por dia durante 21 dias. Os camundongos foram sacrificados quando os tumores atingiram um volume aproximado de 2500 mm3.
[00191] Como mostrado na Figura 16, os resultados indicaram que o ADI-PEG 20 e a inibição tumoral de rapamicina sinergicamente aumentou, quando comparada com a combinação de tanto ADI- PEG 20 quanto rapamicina sozinho.
[00192] Os dados da literatura não são consistentes para os diferentes tipos de câncer no que respeita ao efeito da combinação de ADI- PEG 20 com inibidores autofagia ou com inibidores de mTOR, tais como rapamicina. Portanto, não podia ter sido previsto que o ADI- PEG 20, em combinação com a rapamicina seria atuar sinergicamente em tumores de carcinoma de células renais inibidores. Estes resultados indicam que o versado na técnica não pode prever se qualquer combinação particular com ADI- PEG 20 será eficaz para o tratamento de câncer, em particular para o carcinoma de células renais.
[00193] As várias modalidades descritas acima podem ser combinadas para fornecer outras modalidades. Todas as patentes U.S., as publicações de pedido de patente U.S., Pedido de Patente U.S., patentes estrangeiras, o pedido de patente estrangeira e as publicações de patentes não referidas na presente memória descritiva e/ ou listada no Pedido de Patente das folhas de dados são incorporadas na presente invenção por meio da referência, na sua totalidade. Os aspectos das modalidades podem ser modificados, se necessário, para utilizar os conceitos das várias patentes, aplicações e publicações para fornecer ainda outras modalidades.
[00194] Estas e outras alterações podem ser feitas para as modalidades, à luz da descrição acima detalhada. Em geral, nas reivindicações que se seguem, os termos usados não devem ser interpretados como limitativos das reivindicações às modalidades específicas descritas no relatório descritivo e nas reivindicações, mas deve ser interpretado de forma a incluir todas as possíveis modalidades, juntamente com o escopo completo de equivalentes aos quais tais reivindicações têm direito. Consequentemente, as reivindicações não estão limitadas por meio da presente invenção.

Claims (15)

1. Composição líquida, caracterizada pelo fato de que compreende ADI covalentemente modificado com polietileno glicol (ADI-PEG), a composição compreendendo histidina-HCl, que é de 0,0035M Histidina-HCl a 0,35M Histidina-HCl, em que a composição tem um pH de 6,5 a 7,5.
2. Composição líquida de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que compreende 0035M Histidina-HCl a pH de 6,8 com 0,13M de cloreto de sódio.
3. Composição líquida de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que a arginina deiminase é ligada de uma maneira covalente a: (a) mais do que uma molécula de polietilenoglicol; (b) de 9 a 12 moléculas de polietilenoglicol; ou (c) 5 ± 1,5 moléculas de PEG.
4. Composição líquida de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que: (a) o polietilenoglicol tem um peso molecular médio de peso total de 1.000 a 40.000; (b) o polietilenoglicol tem um peso molecular médio de peso total de 10.000 a 30.000; ou (c) o polietilenoglicol tem um peso molecular de 20.000.
5. Composição líquida de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que o polietilenoglicol é polietilenoglicol de cadeia linear.
6. Composição líquida de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada pelo fato de que a arginina deiminase é ligada de uma maneira covalente ao PEG com um grupo ligante e opcionalmente em que o grupo de ligação é um grupo succinimida, opcionalmente selecionado a partir do grupo consistindo de succinato de succinimidila, propionato de succinimidila, carboximetilato de succinimidila, succinamida de succinimidila, succinimida de N-hidróxi ou as combinações dos mesmos.
7. Composição líquida de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada pelo fato de que a arginina deiminase não é isolada a partir de Mycoplasma arginini.
8. Composição líquida de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada pelo fato de que a arginina deiminase é isolada a partir de Mycoplasma hominis.
9. Composição líquida de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de que a arginina deiminase foi modificada para estar livre de pelo menos uma lisina na posição 112, 374, 405 ou 408 da SEQ ID NO: 1, ou em que a arginina deiminase compreende a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 2.
10. Composição líquida de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizada pelo fato de ser para uso no tratamento de um câncer em um paciente, em que o câncer exibe expressão reduzida de argininossuccinato liase, em que o câncer é selecionado a partir do grupo que consiste em melanoma, sarcomas, câncer pancreático, câncer de pulmão de células pequenas, mesotelioma, câncer da próstata, leucemia linfática, leucemia mieloide crônica, linfoma, retinoblastoma, neuroblastoma, colangiocarcinoma, leucemia mieloide aguda, leucemia mieloide aguda recidiva, câncer de mama, câncer do ovário, câncer colorretal, câncer gástrico, glioma, glioblastoma multiforme, câncer do pulmão de células não pequenas (NSCLC), câncer de rim, câncer de bexiga, câncer de útero, câncer de esôfago, câncer de cérebro, câncer da cabeça e do pescoço, câncer de colo do útero, câncer testicular e câncer de estômago.
11. Uso de ADI-PEG e histidina-HCl, que é de 0,0035M Histidina-HCl a 0,35M Histidina-HCl, em que a composição tem um pH de 6,5 a 7,5, caracterizado pelo fato de que é para preparação de uma composição líquida como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9, em combinação com um ou mais agentes terapêuticos, em que o um ou mais agentes terapêuticos são selecionados do grupo consistindo em ciclofosfamida, gencitabina, cisplatina, sorafenib, sunitinib, everolimus, rapamicina, docetaxel e inibidores de autofagia, em que os inibidores de autofagia são selecionados a partir do grupo que consiste em cloroquina, 3- metiladenina, hidroxicloroquina, bafilamicina A1, ribosídeo de 5-amino- 4-imidazol carboxamida (AICAR), ácido ocadaico, ribosídeo N6- mercaptopurina, wortmanina, e vimblastina, para o tratamento do câncer, em que o câncer exibe expressão reduzida de argininossuccinato liase, em que o câncer é selecionado a partir do grupo que consiste em melanoma, sarcomas, câncer pancreático, câncer de pulmão de células pequenas, mesotelioma, câncer da próstata, leucemia linfática, leucemia mieloide crônica, linfoma, retinoblastoma, neuroblastoma, colangiocarcinoma, leucemia mieloide aguda, leucemia mieloide aguda recidiva, câncer de mama, câncer do ovário, câncer colorretal, câncer gástrico, glioma, glioblastoma multiforme, câncer do pulmão de células não pequenas (NSCLC), câncer de rim, câncer de bexiga, câncer de útero, câncer de esôfago, câncer de cérebro, câncer da cabeça e do pescoço, câncer de colo do útero, câncer testicular e câncer de estômago.
12. Uso de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que a composição líquida é administrada em combinação com um inibidor de autofagia e o câncer é câncer pancreático ou câncer de pulmão de células pequenas.
13. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 12, caracterizado pelo fato de que o tratamento: (a) inibe a síntese de NO, inibe a angiogênese, induz a apoptose em células de tumor, ou uma combinação dos mesmos, in vivo. (b) resulta na doença estável ou aumenta o tempo de sobrevivência livre de progressão no paciente; ou (c) aumenta a progressão tempo de sobrevivência livre no paciente.
14. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 13, caracterizado pelo fato de que a arginina no plasma é: (a) empobrecida durante pelo menos um mês; ou (b) empobrecida por mais de 2 meses.
15. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 14, caracterizada pelo fato de que ainda compreende a administração de um agente quimioterapêutico, em que o agente quimioterapêutico é selecionado do grupo que consiste em ciclofosfamida, gencitabina, cisplatina, sorafenib, sunitinib e everolimus.
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