CN103797025B - 用精氨酸脱亚氨酶治疗的方法 - Google Patents

用精氨酸脱亚氨酶治疗的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN103797025B
CN103797025B CN201280027431.6A CN201280027431A CN103797025B CN 103797025 B CN103797025 B CN 103797025B CN 201280027431 A CN201280027431 A CN 201280027431A CN 103797025 B CN103797025 B CN 103797025B
Authority
CN
China
Prior art keywords
adi
cancer
peg
peg20
purposes
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201280027431.6A
Other languages
English (en)
Other versions
CN103797025A (zh
Inventor
J.博马拉斯基
吴伯文
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Polaris Group Taiwan
Original Assignee
Polaris Group Taiwan
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Polaris Group Taiwan filed Critical Polaris Group Taiwan
Publication of CN103797025A publication Critical patent/CN103797025A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN103797025B publication Critical patent/CN103797025B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/96—Stabilising an enzyme by forming an adduct or a composition; Forming enzyme conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
    • A61K31/337—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having four-membered rings, e.g. taxol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/4353—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems
    • A61K31/436—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems the heterocyclic ring system containing a six-membered ring having oxygen as a ring hetero atom, e.g. rapamycin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K33/00—Medicinal preparations containing inorganic active ingredients
    • A61K33/24—Heavy metals; Compounds thereof
    • A61K33/243—Platinum; Compounds thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A61K38/50—Hydrolases (3) acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5), e.g. asparaginase
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/51—Lyases (4)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/66—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid the modifying agent being a pre-targeting system involving a peptide or protein for targeting specific cells
    • A61K47/67—Enzyme prodrug therapy, e.g. gene directed enzyme drug therapy [GDEPT] or VDEPT
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y305/00—Hydrolases acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5)
    • C12Y305/03—Hydrolases acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5) in linear amidines (3.5.3)
    • C12Y305/03006—Arginine deiminase (3.5.3.6)
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Abstract

本发明一般涉及用精氨酸脱亚氨酶，特别是聚乙二醇化的精氨酸脱亚氨酶来治疗癌症的方法。

Description

用精氨酸脱亚氨酶治疗的方法
对相关申请的交叉引用
本申请要求对2012年4月4日提交的美国临时申请No.61/620,368的优先权，该申请通过全文提述并入本文中。
关于序列表的声明
以文本形式代替纸件提供与本申请相关的序列表，且据此通过提述并入说明书中。含有序列表的文本文档的名称是POLA_001_01WO_ST25.txt。文本文档为8KB，在2012年5月30日创建，且经由EFS-Web电子提交。
发明背景
技术领域
本发明一般涉及用精氨酸脱亚氨酶(ADI)，特别是聚乙二醇化的ADI(ADI-PEG)来治疗癌症的方法。
背景技术
氨基酸消除(deprivation)疗法可能是对一些癌症形式的有效治疗。迄今为止，有一个已知的与此办法相关的临床例子，其利用天冬酰胺酶来降低天冬酰胺的循环水平并抑制蛋白质合成。此治疗对于急性淋巴母细胞性白血病尤为有效(Avramis2005,VieraPinheiro2004)。急性淋巴母细胞性白血病细胞需要氨基酸天冬酰胺用于生长和增殖。相比之下，大多数正常的人细胞能够合成天冬酰胺且不受天冬酰胺消耗影响。因此，用天冬酰胺酶降低血清天冬酰胺能选择性杀死癌症细胞而不损害正常细胞、组织和宿主。已批准将天冬酰胺酶的大肠杆菌衍生型用于人使用。然而，仅在微生物中发现天冬酰胺酶；这使得其在人中高度免疫原性并且在注射后也具有短血清半寿期(Avramis2005)。为了使天冬酰胺酶为更有效的药物，通过将大肠杆菌衍生的天冬酰胺酶与聚乙二醇(PEG)配制在一起来降低该酶的抗原性和相关的过敏反应而将这些缺点最小化。另外，PEG极大地延长了天冬酰胺酶的循环半寿期，这既降低了治疗频率也降低了治疗总成本。批准使用PEG配制的天冬酰胺酶且其在商标名下销售(2011,Avramis2005,Viera Pinheiro2004,Fu2007,Zeidan2008)。
精氨酸是人和小鼠的另一种非必需氨基酸(对于综述，参见Rogers1994)。在人中，可以从瓜氨酸以两步合成精氨酸，其经由Krebs(尿素)循环酶精氨基琥珀酸合成酶(ASS，L-瓜氨酸:L-天冬氨酸连接酶[形成AMP]，EC6.3.4.5)和精氨基琥珀酸裂合酶(ASL，L-精氨基琥珀酸精氨酸裂合酶，EC4.3.2.)(Haines2011,Wu2009,Morris2006,Husson2003,Tapiero2002,Rogers1994)。ASS催化瓜氨酸和天冬氨酸到精氨基琥珀酸的转化，然后通过ASL将精氨基琥珀酸转化成精氨酸和延胡索酸(图1)。人中的精氨酸缺陷性饮食不引起高氨血症、乳清酸尿症(orotic aciduria)，也不改变成人整个身体一氧化氮(NO)合成的速率(Tapiero2002,Castillo1995,Rogers1994,Carey1987,Barbul1986,Snyderman1959,Rose1949)。尽管早产儿似乎需要精氨酸(Wu2004)，但精氨酸水平在婴儿、儿童和青少年中与年龄不相关(Lücke2007)。1992年，Takaku和Sugimura分别报告了人黑色素瘤和肝细胞癌瘤(HCC)细胞系似乎需要精氨酸用于生长。其它研究显示聚乙二醇化的ADI对于黑色素瘤和肝细胞瘤的治疗是有效的，具有极少的不良作用。
癌症主要用以下3种类型疗法中的一种或其组合来治疗：外科手术、放射和化疗。对于不能用局部疗法如外科手术、放射和栓塞治疗的癌症，系统性化疗是唯一的治疗选择。然而，传统的化疗不区分正常细胞和癌细胞，其导致显著毒性和有限功效。新一代系统性疗法是靶向疗法，其设计为通过利用正常细胞和癌细胞之间的差异来选择性杀死癌细胞。本发明提供针对癌症治疗的这一优点和其它优点。
参考文献：Avramis VI,Panosyan EH.2005.Clin Pharmacokinet44:367-393;Barbul A.1986.J Parenteral Enteral Nutr10:227-238;Carey GP等1987.J Nutr117:1734-1739;Castillo L等1995.Am J Physiol268(Endocrinol Metab31):E360-367;FuCH,Sakamoto KM.2007.Expert Opin Pharmacother8:1977-1984;Haines RJ等2011.Int JBiochem Mol Biol2:8-23;Husson A等2003.Eur J Biochem270:1887-1899;Lücke T等2007.Clin Chem Lab Med45:1525-1530;Morris SM Jr.2006.Am J Clin Nutr83(Suppl):598S-512S;Rogers QR.1994.于Proceedings from a Symposium Honoring WillardJ.Visek-from Ammonia to Cancer and Gene Expression.Special Publication86-April,1994,Agriculture Experiment Station,University of Illinois,211MumfordHall,Urbana,IL61801,pp.9-21;Tapiero H等2002.Biomed Pharmacother56:439-445,2002;Viera Pinheiro JP,Boos J.2004.Br J Haematol125:117-127;Wu G等2009.AminoAcids37:153-168;Wu G等2004.J Nutr Biochem15:442-451;Zeidan A等2008.ExpertOpin Biol Ther9:111-119.)
发明概述
本发明的一个方面提供治疗患者中白血病的方法，包括对该患者施用包含经由连接基团共价键合至聚乙二醇的ADI的化合物。在一个实施方案中，白血病是急性髓细胞性白血病(acute myeloid leukemia)或复发的急性髓细胞性白血病。在一个别的实施方案中，白血病不是淋巴细胞性白血病或慢性髓细胞性白血病。然而，在别的实施方案中，白血病可包括淋巴细胞性白血病或慢性髓细胞性白血病。在另一个实施方案中，精氨酸脱亚氨酶共价键合至5±1.5个直链PEG分子，且所述化合物在包含低于约0.5%天然ADI、低于约5%游离PEG或两者皆是的组合物中配制；其中所述精氨酸脱亚氨酶以约160IU/m2至约640IU/m2的剂量每周施用；且其中白血病展现出降低的ASS表达。
本发明的另一个方面提供治疗患者中癌症的方法，包括对该患者施用自体吞噬抑制剂和包含经由连接基团共价键合至聚乙二醇的ADI的化合物，其中所述癌症是胰腺癌或小细胞肺癌。在这一方面，自体吞噬抑制剂选自下组：氯喹(chloroquine)、3-甲基腺嘌呤、羟基氯喹、巴夫洛霉素(bafilomycin)A1、5-氨基-4-咪唑羧酰胺核糖苷(AICAR)、冈田酸(okadaic acid)、N6-巯基嘌呤核糖苷、渥曼青霉素(wortmannin)和长春碱。涵盖本领域中已知的其它自体吞噬抑制剂以用于本文中的方法。在某些实施方案中，ADI和自体吞噬抑制剂加合或协同性地作用。在另一个实施方案中，所述精氨酸脱亚氨酶共价键合至5±1.5个直链PEG分子，且所述化合物配制在包含低于约0.5%天然ADI、低于约5%游离PEG或两者皆是的组合物中；其中所述精氨酸脱亚氨酶以约160IU/m2至约640IU/m2的剂量每周施用；且其中所述癌症展现出降低的ASS表达。
本发明的一个方面提供治疗患者中癌症的方法，其包括对该患者施用包含经由连接基团共价键合至聚乙二醇的ADI的化合物，其中所述癌症选自下组：乳腺癌、卵巢癌、结肠直肠癌、胃癌、胶质瘤、多形性胶质母细胞瘤、非小细胞肺癌(NSCLC)、肾癌、膀胱癌、子宫癌、食道癌、脑癌、头和颈癌、子宫颈癌、睾丸癌和胃癌。在一个实施方案中，所述精氨酸脱亚氨酶共价键合至5±1.5个直链PEG分子，且所述化合物配制在包含低于约0.5%天然ADI、低于约5%游离PEG或两者皆是的组合物中；其中所述精氨酸脱亚氨酶以约160IU/m2至约640IU/m2的剂量每周施用；且其中所述癌症展现出降低的ASS表达。
本发明的一个方面提供治疗患者中黑色素瘤的方法，包括对该患者施用包含经由连接基团共价键合至聚乙二醇的ADI的化合物与顺铂的组合。在一个实施方案中，所述精氨酸脱亚氨酶共价键合至5±1.5个直链PEG分子，且所述化合物配制在包含低于约0.5%天然ADI、低于约5%游离PEG或两者皆是的组合物中；其中以约160IU/m2至约640IU/m2的剂量每周施用精氨酸脱亚氨酶；且其中黑色素瘤展现出降低的ASS表达。
本发明的另一个方面提供治疗患者中癌症的方法，包括对该患者施用包含经由连接基团共价键合至聚乙二醇的ADI的化合物，其中所述癌症不是黑色素瘤、胰腺癌、前列腺癌、小细胞肺癌、间皮瘤、淋巴细胞性白血病、慢性髓细胞性白血病、淋巴瘤、肝细胞瘤和肉瘤。在一个实施方案中，所述精氨酸脱亚氨酶共价键合至5±1.5个直链PEG分子，且所述化合物配制在包含低于约0.5%天然ADI、低于约5%游离PEG或两者皆是的组合物中；其中所述精氨酸脱亚氨酶以约160IU/m2至约640IU/m2的剂量每周施用；且其中所述癌症展现出降低的ASS表达。
本公开的另一个方面提供在患者中治疗非小细胞肺癌、头和颈癌或前列腺癌的方法，包括施用治疗有效量的包含经由连接基团共价键合至聚乙二醇的精氨酸脱亚氨酶的化合物与多西他赛的组合。在一个实施方案中，所述精氨酸脱亚氨酶共价键合至5±1.5个直链PEG分子，且所述化合物配制在包含低于约0.5%天然ADI、低于约5%游离PEG或两者皆是的组合物中；其中所述精氨酸脱亚氨酶以约160IU/m2至约640IU/m2的剂量每周施用；且其中非小细胞肺癌、头和颈癌或前列腺癌展现出降低的ASS表达。
本公开的另一个方面提供在患者中治疗肾细胞癌瘤的方法，包括施用治疗有效量的包含经由连接基团共价键合至聚乙二醇的精氨酸脱亚氨酶的化合物与雷帕霉素(rapamycin)的组合。在一个实施方案中，所述精氨酸脱亚氨酶共价键合至5±1.5个直链PEG分子且所述化合物配制在包含低于约0.5%天然ADI、低于约5%游离PEG或两者皆是的组合物中；其中所述精氨酸脱亚氨酶以约160IU/m2至约640IU/m2的剂量每周施用；且其中所述癌症展现出降低的ASS表达。
在本发明的某些实施方案中，ADI共价键合至超过1个聚乙二醇分子，或约9至约12个聚乙二醇分子。在本发明的另一个实施方案中，聚乙二醇具有约1,000至约40,000的总重均分子量、具有约10,000至约30,000的总重均分子量，且在某些实施方案中，聚乙二醇具有20,000的分子量。
在本公开的某些实施方案中，所述连接基团是琥珀酰亚胺基团。在某些实施方案中，所述琥珀酰亚胺基团可以是琥珀酰亚氨基琥珀酸、琥珀酰亚氨基丙酸、琥珀酰亚氨基羧甲基化物、琥珀酰亚氨基琥珀酰胺、N-羟基琥珀酰亚胺或其组合。在一个实施方案中，所述琥珀酰亚胺基团是琥珀酰亚氨基琥珀酸、琥珀酰亚氨基丙酸或其组合。
在本公开的某些实施方案中，ADI不是从精氨酸枝原体(Mycoplasma arginini)分离的。在其它实施方案中，ADI是从人型枝原体(Mycoplasma hominis)分离的。在一个具体的实施方案中，ADI经过修饰以没有在SEQ ID NO:1的112、374、405或408位的至少一个赖氨酸，而在另一个实施方案中，ADI包含SEQ ID NO:2中列出的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述精氨酸脱亚氨酶共价键合至5±1.5个PEG分子，且在某些实施方案中，PEG是直链PEG。
在所述方法的一些实施方案中，以约每周两次至约每2周一次施用ADI，而在一个具体的实施方案中，每周施用ADI。
在一个实施方案中，以约80IU/m2至约640IU/m2的剂量施用ADI，且在一个具体的实施方案中，以约160IU/m2的剂量施用。在另一个实施方案中，以约160IU/m2的剂量每周施用ADI。
在一个实施方案中，本文描述的方法中使用的、包含经由连接基团共价键合至聚乙二醇的精氨酸脱亚氨酶的化合物配制在包含低于约0.5%天然ADI、低于约5%游离PEG或两者皆是的组合物中。
本发明的另一个方面提供治疗患者中GVHD的方法，包括对该患者施用包含经由连接基团共价键合至聚乙二醇的ADI的化合物。
本发明的又一个方面提供治疗患者中癌症的方法，包括对患者施用包含经由连接基团共价键合至聚乙二醇的ADI的化合物，其中所述癌症展现出ASS。在一个实施方案中，所述癌症选自下组：白血病、急性髓细胞性白血病、复发的急性髓细胞性白血病、乳腺癌、卵巢癌、结肠直肠癌、胃癌、胶质瘤、多形性胶质母细胞瘤、非小细胞肺癌(NSCLC)、肾癌、膀胱癌、子宫癌、食道癌、脑癌、头和颈癌、子宫颈癌、睾丸癌和胃癌。在一个别的实施方案中，降低的ASS表达起因于精氨基琥珀酸合成酶启动子的甲基化。在另一个实施方案中，降低的ASS表达起因于DNA突变或缺失。在一个具体的实施方案中，降低的ASS表达起因于作为“费城(Philadelphia)染色体”一部分的9q34基因座的缺失或转座。在某些实施方案中，所述癌症展现出降低的ASS表达。
本发明的再一个方面提供治疗患者中癌症的方法，包括对该患者施用包含经由连接基团共价键合至聚乙二醇的ADI的化合物，其中所述癌症展现出降低的精氨基琥珀酸裂合酶表达。在一个实施方案中，所述癌症选自下组：白血病、急性髓细胞性白血病、复发的急性髓细胞性白血病、乳腺癌、卵巢癌、结肠直肠癌、胃癌、胶质瘤、多形性胶质母细胞瘤、非小细胞肺癌(NSCLC)、肾癌、膀胱癌、子宫癌、食道癌、脑癌、头和颈癌、子宫颈癌、睾丸癌和胃癌。在一个实施方案中，降低的ASL表达起因于精氨基琥珀酸裂合酶启动子的甲基化。在某些实施方案中，降低的ASL表达起因于DNA突变或缺失。在一个具体的实施方案中，所述癌症是ASL阴性的。
在本发明的某些实施方案中，用ADI-PEG的治疗在体内抑制NO合成、抑制血管发生、诱导肿瘤细胞中的细胞凋亡、或其组合。在某些实施方案中，所述治疗导致稳定疾病(stable disease)。在其它实施方案中，所述治疗延长患者中的无进展存活时间(progression free survival time)。在又一个实施方案中，血浆精氨酸消耗达至少1个月或超过2个月。
在某些实施方案中，本文中描述的方法还包括施用治疗剂如化疗剂，其包括但不限于环磷酰胺、吉西他滨(gemcitabine)、顺铂、索拉非尼(sorafenib)、舒尼替尼(sunitinib)和依维莫司(everolimus)。在某些实施方案中，ADI和化疗剂加合或协同性地作用。
对序列的简要说明
SEQ ID NO:1是野生型人型枝原体ADI蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO:2是经修饰的人型枝原体ADI蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO:3和4是用于扩增精氨基琥珀酸合成酶cDNA的PCR引物。
附图简述
图1是经由Krebs(尿素)循环的精氨酸代谢的图。
图2显示在体外通过ADI对胰腺癌细胞的胱天蛋白酶依赖性细胞凋亡和自体吞噬的诱导。图2A是显示在与泛胱天蛋白酶抑制剂ZVAD-fmk(“Zvad”)和/或ADI-PEG温育后经历细胞死亡的细胞百分数的条形图。图2B是显示与ADI-PEG温育72小时后相比于PBS对照，膜联蛋白V(Annexin V)阳性细胞百分数的条形图。
图3显示在将人胰腺癌细胞与羟化氯喹(“ChQ”)和/或ADI-PEG温育后切割的胱天蛋白酶3、p62和LC3B的表达水平。
图4A和4B显示将人胰腺癌细胞与ChQ和/或ADI-PEG温育后膜联蛋白V阳性细胞和亚G0/G1细胞的百分数。
图5显示在用氯喹(CQ)和/或ADI-PEG治疗后小鼠中的肿瘤体积。在无胸腺小鼠中建立了人胰腺癌细胞系MIA PaCa-2的皮下异种移植物。
图6显示用氯喹和/或ADI-PEG治疗后MIA PaCa-2肿瘤的组织病理学。第一栏显示H&E染色，第二栏显示对活性胱天蛋白酶3的染色，第三栏显示经由TUNEL测定法对DNA片段化的染色，且第四栏显示对p62的染色。
图7显示在小细胞肺癌人肿瘤和细胞系中ASS的表达。抗ASS抗体195-21-1用于检测正常皮肤(图7A)、结肠癌瘤(图7B)和小细胞肺癌(图7C)中的ASS蛋白表达。图7D显示通过western印迹的一组小细胞肺癌细胞系相比于阳性对照SW1222结肠癌细胞的ASS蛋白表达。图7E显示通过western印迹测量的ASS蛋白表达与通过qRT-PCR测定的mRNA表达的相关性。
图8显示ADI-PEG20对ASS阴性小细胞肺癌细胞的体外增殖的抑制。将粘附(图8A)和非粘附(图8B)细胞用ADI-PEG20处理120小时，接着对于粘附细胞使用MTS测定法或对于非粘附细胞使用BCA总蛋白测定法测定增殖。
图9显示ADI在ASS阴性SK-LC-13小细胞肺癌细胞中诱导细胞凋亡和自体吞噬。对于显示细胞凋亡的亚G1DNA含量的荧光活化的细胞分选分析，将细胞在对照培养基(图9A)、25nM托泊替康(topotecan)(图9B)、1.0mIU ml-1ADI-PEG20(图9C)和10mIU ml-1ADI-PEG20(图9D)中温育72小时，接着用碘化丙啶(propidium iodide(PI))对DNA染色。图9E显示在与ADI-PEG20或氯喹(“CQ”)阳性对照温育24小时后的LC3-I和LC3-II蛋白水平。图9F显示通过western印迹在SK-LC-13细胞中检测的活性胱天蛋白酶3(图9F)。
图10显示使用siRNA对ASS表达的沉默。图10A显示在用ASS siRNA处理的SW1222细胞中通过RT-PCR确定的ASS mRNA表达的相对表达。图10B显示在用ASS siRNA处理的SW1222细胞中通过western印迹评估的ASS蛋白的相对表达。图10C显示通过MTS增殖测定法测量的用ADI-PEG20处理的细胞的增殖。
图11显示通过用具有20,000m.w.的PEG配制的ADI对BALB/c裸鼠中中等大小的SK-LC-13小细胞肺癌异种移植物生长的抑制。显示来自接受PBS媒介物(实心圆)、ADI-PEG20的短20天时程(每5天给药)(实心正方形)、或ADI-PEG20的持续给药(每5天直至组终止)(开放正方形)的小鼠(以每小鼠1IU(图11A)、2IU(图11B)和5IU(图11C)的剂量)的肿瘤体积的生长曲线。在第33天对照组终止时的肿瘤体积显示于图11D。显示对于研究的第0、12和40天ADI-PEG20(图11E)、精氨酸(图11F)和瓜氨酸(图11G)的血清水平。在第0和12天时短程给药和延长给药分组中的值相同，因为延长给药仅在第20天时启动。
图12显示BALB/c裸鼠中ASS阳性的NCI-H69小细胞肺癌异种移植物的肿瘤体积的生长曲线。小鼠接受PBS媒介物或每小鼠2IU ADI-PEG20(黑色箭头)。
图13显示对BALB/c裸鼠中大SK-LC-13小细胞肺癌异种移植物的抑制。显示来自接受PBS媒介物(圆)、ADI-PEG20的短20天时程(黑色箭头)(正方形)，或ADI-PEG20的持续给药(灰色箭头)(三角形)的小鼠(以每小鼠1IU(图13A)、2IU(图13B)和5IU(图13C)的剂量)的肿瘤体积的生长曲线。在第32天对照组终止时的肿瘤体积显示于图13D。
图14显示相对于分别的用ADI-PEG20和自体吞噬抑制剂氯喹体外处理的相对细胞易感性(liability)。
图15显示异种移植物数据的图，其显示ADI-PEG20与顺铂的组合导致ASS缺陷性黑色素瘤细胞中增强的抗肿瘤活性。
图16显示异种移植物数据的图，其显示ADI-PEG20与雷帕霉素的组合导致针对异种移植的Caki-1肾细胞癌细胞系中增强的抗肿瘤活性。
发明详述
本发明一般涉及用ADI，特别是ADI-PEG来治疗癌症的方法。
正常细胞不需要精氨酸来用于生长，因为它们能从瓜氨酸以通过ASS和ASL催化的两步过程合成精氨酸(见图1)。与之相对，某些癌症不表达ASS。某些癌症不表达ASL，而其他癌症可能具有降低的ASS和/或ASL表达，或者可能不表达ASS和/或ASL。因此，这些癌症对于精氨酸是营养缺陷型的。可利用此代谢差异来开发一种治疗这些癌症形式的安全且有效的疗法。ADI催化精氨酸经由精氨酸双水解酶途径到瓜氨酸的转化，如此可用于消除精氨酸。
除非特定地相反指示的，本发明的实践将采用本领域技术中的病毒学、免疫学、微生物学、分子生物学和重组DNA技术的常规方法，其中许多在下文描述以用于例示目的。这类技术在文献中有完全解释。参见，例如Current Protocols in Protein Science,Current Protocols in Molecular Biology或Current Protocols in Immunology,JohnWiley&Sons,New York,N.Y.(2009);Ausubel et al.,Short Protocols in MolecularBiology,3rd ed.,Wiley&Sons,1995;Sambrook和Russell,Molecular Cloning:ALaboratory Manual(3rd Edition,2001);Maniatis et al.Molecular Cloning:ALaboratory Manual(1982);DNA Cloning:A Practical Approach,vol.I&II(D.Glover,ed.);Oligonucleotide Synthesis(N.Gait,ed.,1984);Nucleic Acid Hybridization(B.Hames&S.Higgins,eds.,1985);Transcription and Translation(B.Hames&S.Higgins,eds.,1984);Animal Cell Culture(R.Freshney,ed.,1986);Perbal,APractical Guide to Molecular Cloning(1984)和其它类似的参考文献。
如本说明书和所附权利要求中使用的，除非内容清楚地另外指示，单数形式“一个”、“一种”和“该”均包括复数指代物。
贯穿本说明书中，除非上下文另外要求的，词语“包含/包括”将理解为暗示纳入所述要素或整数、或要素或整数的组，但不排除任何其它要素或整数、或要素或整数的组。
除非另外明确陈述，本说明书中的每个实施方案，加以必要的修改(mutatismutandis)，适用于每个其它的实施方案。
可将标准技术用于重组DNA、寡核苷酸合成以及组织培养和转化(例如，电穿孔、脂质转染(lipofection))。可依照制造商说明书或作为在本领域中普遍实现的或如本文中描述的来实施酶促反应和纯化技术。这些及相关技术和规程一般可依照本领域中公知的常规方法，以及如在贯穿本说明书引用和论述的各种一般性和更特定的参考文献中描述的来实施。除非提供特定定义，本文中描述的分子生物学、分析化学、合成有机化学、以及医学和药物化学相关使用的命名和本文中描述的分子生物学、分析化学、合成有机化学、以及医学和药物化学的实验室规程和技术是本领域中公知和普遍使用的那些。标准的技术可用于重组技术、分子生物学、微生物学、化学合成、化学分析、药物制备、配制和递送、以及患者治疗。
“患者”指动物，在某些实施方案中指哺乳动物，而在一个特定的实施方案中指人。
“生物相容性”指一般对生物学功能无害且不会导致任何程度的不可接受毒性(包括过敏和疾病状态)的材料或化合物。
贯穿本公开，可使用以下缩写：PEG，聚乙二醇；ADI，精氨酸脱亚氨酶；SS，琥珀酰亚氨基琥珀酸；SSA，琥珀酰亚氨基琥珀酰胺；SPA，琥珀酰亚氨基丙酸；NHS，N-羟基-琥珀酰亚胺；ASS1或ASS，精氨基琥珀酸合成酶；ASL，精氨基琥珀酸裂合酶。
在本发明中，ADI基因可自任何来源，包括例如微生物、重组生物技术或其任意组合来源、克隆或产生。例如，精氨酸脱亚氨酶可以自以下属的微生物克隆：枝原体属(Mycoplasma)、梭菌属(Clostridium)、芽孢杆菌属(Bacillus)、疏螺旋体属(Borrelia)、肠球菌属(Enterococcus)、链球菌属(Streptococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、贾第虫属(Giardia)。在某些实施方案中，精氨酸脱亚氨酶克隆自肺炎枝原体(Mycoplasmapneumoniae)、人型枝原体、精氨酸枝原体(Mycoplasma arginini)、酿脓链球菌(Steptococcus pyogenes)、肺炎链球菌(Steptococcus pneumoniae)、布氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)、阿氏疏螺旋体(Borrelia afzelii)、肠贾第虫(Giardiaintestinalis)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)、地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、清酒乳杆菌(Lactobacillussake)、或其任意组合。具体地，本发明中使用的ADI可包含SEQ ID NO:1或2的氨基酸序列，或其具有ADI活性的变体(例如，能够将精氨酸代谢成瓜氨酸和氨)或其具有ADI活性的片段。
在本发明的某些实施方案中，ADI克隆自枝原体属的微生物。在别的实施方案中，ADI克隆自人型枝原体、Mycoplasma arthritides、或其任意组合，且不自精氨酸枝原体来源。具体地，本发明中使用的ADI可具有SEQ ID NO:1或2中列出的氨基酸序列，或其具有ADI活性的变体(例如，能够将精氨酸代谢成瓜氨酸和氨)或其具有ADI活性的片段。
天然ADI可见于微生物，其为抗原性的且在患者中被快速从循环清除。这些问题可通过修饰ADI来克服。如此，本公开提供由修饰剂修饰的ADI，所述修饰剂包括但不限于大分子聚合物、蛋白质、肽、多糖或其它化合物。精氨酸脱亚氨酶和修饰剂可通过共价键或非共价相互作用连接以形成稳定的缀合物或稳定的组合物来实现期望的效果。在某些实施方案中，经修饰的ADI保留ADI的生物学活性且在体内具有比未经修饰的ADI更长的半寿期和更低的抗原性。在某些实施方案中，经修饰的ADI保留未经修饰的ADI的至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更多的生物学活性。
在一个实施方案中，修饰剂可以是生物相容的且能增加ADI在血液中半寿期的聚合物或蛋白质或其片段。修饰剂可以化学偶联至ADI，或当适用时经由融合蛋白表达连接于ADI。
大分子聚合物可包括非肽大分子聚合物，在某些实施方案中，其可具有其自身的生物活性。合适的聚合物包括但不限于，聚烯醇化合物、聚醚化合物、聚乙烯吡咯烷酮、聚氨基酸、二乙烯醚和马来酸酐的共聚物、N-(2-羟丙基)-甲基丙烯酰胺、多糖、聚氧乙烯多元醇(polyoxyethylated polyol)、肝素或其片段、聚-烃基-乙二醇及其衍生物、聚-烃基-乙二醇及其衍生物的共聚物、聚(乙烯基乙醚)、a,P-聚[(2-羟乙基)-DL-天冬酰胺]、聚羧酸酯、聚氧乙烯-甲醛(oxymethylene)、聚丙烯酰吗啉、氨基化合物和oxyolefin的共聚物、聚透明质酸、聚环氧乙烷(polyoxirane)、乙二酸和丙二酸的共聚物、聚(1,3-二氧戊环)、乙烯和马来酰肼共聚物、聚唾液酸、环糊精等。在某些实施方案中，所述聚合物是聚乙二醇。
如本文中使用的聚烯醇化合物包括但不限于，聚乙二醇(包括单甲氧基聚乙二醇、单羟基聚乙二醇)、聚乙烯醇、聚烯丙基醇、聚丁烯醇等、及其衍生物如脂质。
所述聚醚化合物包括但不限于聚亚烃基二醇(poly alkylene glycol)(HO((CH2)xO)nH)、聚丙二醇、polyoxyrehylene(HO((CH2)2O)nH)、聚乙烯醇((CH2CHOH)n)。
聚氨基酸包括但不限于，一种类型氨基酸的聚合物或两种或更多种类型氨基酸的共聚物，例如，聚丙氨酸或聚赖氨酸，或其嵌段共聚物。
多糖包括但不限于，葡聚糖及其衍生物，例如右旋糖酐硫酸盐、纤维素及其衍生物(包括甲基纤维素和羧甲基纤维素)、淀粉及其衍生物、聚蔗糖等。
在本发明的一个特定的实施方案中，通过与至蛋白质或肽偶联来修饰ADI，其中所述一种或多种蛋白质或肽直接或间接连接至ADI。蛋白质可以是天然存在的蛋白质或其片段，包括但不限于，天然存在的人血清蛋白质或其片段，如结合甲状腺素的蛋白质、甲状腺素转运蛋白(transthyretin)、a1酸糖蛋白、转铁蛋白、血纤蛋白原、免疫球蛋白、Ig Fcreguis、白蛋白、及其片段。“片段”意指蛋白质的任意部分，其小于全蛋白但保留该蛋白质的期望功能。ADI可以直接或间接地经由共价键连接至蛋白质。直接连接意为ADI的一个氨基酸经由肽键或二硫键直接连接至修饰蛋白质的一个氨基酸。间接连接指ADI与修饰蛋白之间的连接经由最初存在于其之间的化学基团或通过生物或化学手段添加的特定化学基团，或者是上述连接的组合。
在一个具体的实施方案中，ADI通过与PEG共价附接而修饰。与PEG共价附接的ADI(有或无连接基团)在下文中可称为"ADI-PEG"。在与天然ADI相比时，ADI-PEG保留其大多数酶活性，抗原性低得多，具有极大延长的循环半寿期，且在治疗肿瘤中远更有效。
“聚乙二醇”或“PEG”指支链或直链形式的环氧乙烷和水的缩聚物的混合物，其由通式H(OCH2CH2)nOH代表，其中n至少为4。“聚乙二醇”或“PEG”与数字下标组合指示其大概的重均分子量。例如，PEG5,000指具有总重均分子量约5,000的PEG；PEG12,000指具有总重均分子量约12,000的PEG；而PEG20,000指具有总重均分子量约20,000的PEG。
在本发明的一个实施方案中，PEG具有约1,000至约50,000的总重均分子量；在一个实施方案中从约3,000至约40,000，且在另一个实施方案中从约5,000至约30,000；在某些实施方案中，从约8,000至约30,000；在其它实施方案中从约11,000至约30,000；在另外的实施方案中，从约12,000至约28,000；在其它别的实施方案中，从约16,000至约24,000；而在其它实施方案中，从约18,000至约22,000；在另一个实施方案中，从19,000至约21,000，而在一个实施方案中，PEG具有约20,000的总重均分子量。一般而言，具有30,000或更高的分子量的PEG难以溶解，且配制产物的产量极大地降低。PEG可以是支链或直链的，或者在某些实施方案中，是直链。一般而言，增加PEG的分子量降低ADI的免疫原性。具有此实施方案中描述的分子量的PEG可与ADI，以及任选地生物相容性连接基团联合使用来治疗癌症，包括例如急性髓细胞性白血病如复发的急性髓细胞性白血病、乳腺癌、卵巢癌、结肠直肠癌、胃癌、胶质瘤、多形性胶质母细胞瘤、非小细胞肺癌(NSCLC)、肾癌、膀胱癌、子宫癌、食道癌、脑癌、头和颈癌、子宫颈癌、睾丸癌、胃癌和食道癌。
在本发明的另一个实施方案中，PEG具有约1,000至约50,000的总重均分子量；在某些实施方案中，约3,000至约30,000；在其它实施方案中，从约3,000至约20,000；在一个实施方案中，从约4,000至约12,000；还在其它实施方案中，从约4,000至约10,000；在另外的实施方案中，从约4,000至约8,000；仍在别的实施方案中，从约4,000至约6,000；且在另一个实施方案中为约5,000。PEG可以是支链或直链，且在某些实施方案中是直链。具有此实施方案中描述的分子量的PEG可与ADI，以及任选地生物相容性连接基团联合使用来治疗移植物抗宿主病(GVHD)或癌症。
虽然ADI-PEG是本文中描述的例示性的经修饰ADI，如会被技术人员认可的，ADI可用其它聚合物或适宜分子修饰用于期望的效果，特别是降低免疫原性并延长血清半寿期。
无论有或无连接基团，ADI可共价键合于修饰剂如PEG，尽管一个优选的实施方案利用连接基团。
用于将ADI共价附接至修饰剂例如PEG的连接基团，可以是任何生物相容性连接基团。如上文论述的，“生物相容性”指示该化合物或基团是无毒的，且可以用于体外或体内而不导致损伤、患病(sickness)、疾病(disease)或死亡。修饰剂如PEG，可以例如经由醚键、酯键、硫醇键或酰胺键键合至连接基团。合适的生物相容性连接基团包括，例如酯基团、酰胺基团、酰亚胺基团、氨基甲酸酯基团、羧基基团、羟基基团、糖、琥珀酰亚胺基团(包括，例如琥珀酰亚氨基琥珀酸(SS)、琥珀酰亚氨基丙酸(SPA)、琥珀酰亚氨基羧甲基化物(SCM)、琥珀酰亚氨基琥珀酰胺(SSA)或N-羟基琥珀酰亚胺(NHS))、环氧化物基团、氧羰基咪唑(oxycarbonylimidazole)基团(包括例如，羰基二咪唑(CDI))、硝基苯基基团(包括，例如硝基苯基碳酸酯(NPC)或三氯苯基碳酸酯(TPC))、trysylate基团、醛基团、异氰酸酯基团、乙烯砜(vinylsulfone)基团、酪氨酸基团、半胱氨酸基团、组氨酸基团或伯胺。在一个实施方案中，所述生物相容性连接基团是酯基和/或琥珀酰亚胺基团。在另一个实施方案中，所述连接基团是SS、SPA、SCM、SSA或NHS；在某些实施方案中，更优选SS、SPA或NHS，而在其它实施方案中，最优选SS或SPA。
或者，ADI可以经由氨基基团、巯基(sulfhydral)基团、羟基基团或羧基基团直接偶联至修饰剂，如PEG(即无连接基团)。
ADI可以使用本领域中已知的方法经由生物相容性连接基团共价键合至PEG，所述方法例如Park等,Anticancer Res.,1:373-376(1981)；以及Zaplipsky和Lee,Polyethylene Glycol Chemistry:Biotechnical and Biomedical Applications,J.M.Harris,ed.,Plenum Press,NY,Chapter21(1992)描述的，其公开通过全文提述并入本文。
PEG对ADI的附接增加ADI的循环半寿期。一般而言，PEG附接于ADI的伯胺。ADI上PEG或其它修饰剂的附接位点的选择由每个位点在该蛋白的活性域中的作用决定，如本领域技术人员会知晓的。PEG可以附接至ADI的伯胺，而实质上并不损失酶活性。例如，自精氨酸枝原体、Mycoplasma arthritides和人型枝原体克隆的ADI具有约17个可通过此规程修饰的赖氨酸。换言之，所述17个赖氨酸均为ADI可经由生物相容性连接基团(如SS、SPA、SCM、SSA和/或NHS)附接至PEG的可能位点。PEG可附接于ADI上的其它位点，如根据本公开对于本领域技术人员来说将是明显的。
1至约30个PEG分子可以共价键合至ADI。在某些实施方案中，ADI用一个PEG分子修饰。在其它实施方案中，ADI用超过一个PEG分子修饰。在一个实施方案中，ADI用约7至约15个PEG分子修饰，在一个实施方案中约9至约12个PEG分子修饰。在另一个实施方案中，ADI用2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个PEG分子修饰。在一个特定的实施方案中，ADI以每ADI4.5–5.5个PEG分子修饰。在另一个实施方案中，ADI用5±1.5个PEG分子修饰。
在另一个实施方案中，ADI中约30%至约70%的伯胺基团用PEG修饰，在一个实施方案中为约40%至约60%，或在某些实施方案中，约45%至约55%，而在其它实施方案中精氨酸脱亚氨酶中约50%的伯胺基团用PEG修饰。当PEG共价键合至ADI的末端时，可以期望仅利用1个PEG分子。增加ADI上PEG单元的数目延长该酶的循环半寿期。然而，增加ADI上PEG单元的数目降低该酶的比活。如此，需要在两者之间达到平衡，如根据本公开对于本领域技术人员来说将是明显的。
在本发明中，生物相容性连接基团的共同特征是它们经由马来酰亚胺基基团附接至精氨酸脱亚氨酶的伯胺。一旦与ADI偶联，SS-PEG就具有邻近PEG的酯连接，这可能使得该位点对从体内ADI释放PEG的血清酯酶敏感。SPA-PEG和PEG2-NHS不具有酯连接，因此它们对于血清酯酶不敏感。
在本发明中，特定的连接基团并不显示影响ADI-PEG的循环半寿期或其酶比活。然而，在某些实施方案中，生物相容性连接基团用于本发明中。附接于蛋白质的PEG可以是直链，如对于SS-PEG、SPA-PEG和SC-PEG的，或者可以使用支链PEG，如对于PEG2-NHS的。
在某些实施方案中，本公开的ADI可以如美国专利No.6,635,462中描述的进行修饰。具体地，对ADI(具体地来自人型枝原体)的一个或多个天然存在的氨基酸残基的修饰能提供更容易复性和配制的酶，并由此改进制备ADI和包含ADI的治疗性组合物的现有技术。在一个实施方案中，修饰本公开的ADI以除去一个或多个赖氨酸残基(例如，赖氨酸可用另一个氨基酸取代)。具体地，在一个实施方案中，将ADI修饰为在SEQ ID NO:1的第112、374、405或408位没有赖氨酸。
在某些实施方案中，修饰位于或邻近酶催化区的与ADI有关的聚乙二醇化位点。就本发明目的而言，短语“聚乙二醇化位点”可定义为可用聚乙二醇共价修饰的ADI的任何位点或位置。“聚乙二醇化位点”可视为位于或邻近于酶的催化区，其中位点的聚乙二醇化导致该酶催化活性的显著降低。这类位点的聚乙二醇化在传统上导致酶的失活。例如，来自人型枝原体的ADI在第112位具有赖氨酸，其可视为位于或邻近于酶的催化区。PEG对此第112位赖氨酸的附接能导致该酶失活。另外，来自人型枝原体的ADI在第397位具有半胱氨酸，其可视为位于或邻近于酶的催化区。对第397位半胱氨酸的氨基酸取代能使该酶失活。具体地，用丙氨酸、组氨酸、精氨酸、丝氨酸、赖氨酸或酪氨酸取代第397位半胱氨酸能导致所有可检测酶活性的丧失。来自人型枝原体的ADI还具有位于此保守半胱氨酸附近的3个赖氨酸，具体为Lys374、Lys405和Lys408。PEG对Lys374、Lys405、Lys408或其组合的附接能使该酶失活。
应理解自其它生物体来源的ADI也可以具有对应于来自人型枝原体的ADI第112位的聚乙二醇化位点。例如，来自酿脓链球菌的ADI在第104位具有赖氨酸，来自肺炎枝原体的ADI在第106位具有赖氨酸，且来自肠贾第虫的ADI在第114位具有赖氨酸。另外，来自一些生物体的ADI可具有对应于与来自人型枝原体的ADI第112位相同的一般位置的赖氨酸。来自这类生物体的ADI中赖氨酸的位置是本领域技术人员已知的且记载于美国专利No.6,635,462。
如此，在一个实施方案中，本发明在ADI的多肽链中提供特定的氨基酸取代。这些氨基酸取代提供经修饰的ADI，其在由修饰剂修饰例如聚乙二醇化时，失去较少活性。通过消除位于或邻近于酶催化区的聚乙二醇化位点或其它已知的修饰位点，可以实现最佳的修饰例如聚乙二醇化，而不损失活性。
应理解本发明的其它实施方案基于以下理解，即精氨酸脱亚氨酶的某些结构特征在经由重组技术产生时可以阻止或干扰精氨酸脱亚氨酶的适宜和快速的复性。具体地，这些结构属性阻碍或阻止该酶在重组产生期间表现活性构象。就本发明目的而言，短语“活性构象”可定义为允许通过未经修饰或经修饰的精氨酸脱亚氨酶的酶活性的3维结构。具体地，所述活性构象可以是催化精氨酸转化成瓜氨酸所必需的。短语“结构特征”可定义为起因于特定氨基酸或氨基酸组合的任何性状、品质或特性。例如，精氨酸脱亚氨酶可含有氨基酸，其导致正常肽链中的弯曲或弯折，如此阻碍该酶在酶复性期间表现活性构象。具体地，来自人型枝原体的精氨酸脱亚氨酶在第210位具有脯氨酸，其可能导致肽链中的弯曲或弯折，从而导致重组生产期间使该酶复性更困难。应理解，自其它生物体来源的精氨酸脱亚氨酶也可具有对应于来自人型枝原体的精氨酸脱亚氨酶第210位的位点。
如此，本发明再提供在精氨酸脱亚氨酶多肽链中的特定氨基酸取代。这类氨基酸取代能消除精氨酸脱亚氨酶肽链中有问题的结构特征。这类氨基酸取代提供对经修饰精氨酸脱亚氨酶的改进的复性。这些氨基酸取代使得使用降低量的缓冲液将经修饰的精氨酸脱亚氨酶快速复性成为可能。这些氨基酸取代还可以提供增加的复性的、经修饰的精氨酸脱亚氨酶产率。在本发明的一个实施方案中，所述经修饰的精氨酸脱亚氨酶在P210具有单个氨基酸取代。如上文提述的，自人型枝原体来源的精氨酸脱亚氨酶具有位于第210位的氨基酸脯氨酸。不限制本发明，目前认为在第210位的氨基酸脯氨酸的存在导致正常多肽链中的弯曲或弯折，其增加精氨酸脱亚氨酶复性(即重折叠)的难度。对第210位脯氨酸的取代使得使用降低量的缓冲液对经修饰的精氨酸脱亚氨酶快速复性成为可能。对第210位脯氨酸的取代还可提供增加的复性的、经修饰的精氨酸脱亚氨酶产率。在一个优选的实施方案中，将第210位脯氨酸用丝氨酸取代。应理解，依照本发明的这一方面，可以进行在第210位的其它取代。其它取代的例子包括Pro210至Thr210、Pro210至Arg210、Pro210至Asn210、Pro210至Gln210或Pro210至Met210。通过消除与野生型精氨酸脱亚氨酶第210位氨基酸有关的那些结构特征，可以实现该酶的适宜重折叠。
本发明的方法可牵涉体外或体内应用。在体外应用的情况下，包括细胞培养应用中，本文中描述的化合物能添加至培养物中的细胞然后温育。本发明的化合物还可用于帮助使用本领域中公知的抗体生产技术产生单克隆和/或多克隆抗体。然后，所述单克隆和/或多克隆抗体可用于很多种诊断性应用，如对于本领域技术人员来说明显的。
本发明化合物的体内施用手段将随着意图的应用而变化。本文中描述的ADI组合物的施用(以纯形式或在适宜药物组合物中)，可经由药剂的任一种用于类似效用的可接受施用模式来实施。所述药物组合物可通过将ADI例如ADI-PEG、ADI-PEG20与合适的生理学可接受的载体、稀释剂或赋形剂组合来配制，并且可以配制成固态、半固态、液态或气态形式的制备物，如片剂、胶囊、散剂(powder)、颗粒剂、软膏剂、溶液、栓剂、注射剂、吸入剂、凝胶、微球和气雾剂。另外，其它药学活性成分(包括其它抗癌剂，如本文中别处描述的)和/或合适的赋形剂如盐、缓冲剂和稳定剂，可以但非必需存在于组合物中。施用可通过多种不同途径实现，包括口服、胃肠外、鼻、静脉内、皮内、皮下或局部。施用模式取决于待治疗或预防的疾患的性质。如此，ADI-PEG例如ADI-PEG20可以口服、鼻内、腹膜内、胃肠外、静脉内、淋巴内、肿瘤内、肌内、间质(interstitially)、动脉内、皮下、眼内、滑液内、经上皮和经皮施用。在施用后，减小、抑制、预防或延迟癌症进展和/或转移的量被视为有效的。在某一实施方案中，本文中的ADI组合物以统计学显著量延长患者的中值存活时间。在一个实施方案中，本文中描述的ADI将患者的中值存活时间延长4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周、15周、20周、25周、30周、40周或更长。在某些实施方案中，ADI治疗将患者的中值存活时间延长1年、2年、3年或更长。在一个实施方案中，本文中描述的ADI将无进展存活延长2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周或更长。在某些实施方案中，本文中描述的ADI将无进展存活延长1年、2年、3年或更长。
在某些实施方案中，施用的量足以导致肿瘤消退(tumor regression)，如由活肿瘤的量的统计学显著的降低例如肿瘤质量中至少50%的降低，或由改变的(例如具有统计学显著性的降低)扫描尺寸所指示的。在某些实施方案中，施用的量足以导致稳定疾病。在其它实施方案中，施用的量足以导致熟练临床医师已知的特定疾病适应证的症状中临床相关的减轻。
在某些实施方案中，施用的量足以抑制NO合成、抑制血管发生、和/或足以诱导肿瘤细胞中的细胞凋亡、或其任意组合。可以使用本领域中已知的方法来测量NO合成、血管发生和细胞凋亡，参见例如，Current Protocols in Immunology或Current Protocols inMolecular Biology,John Wiley&Sons,New York,N.Y.(2009及其更新内容);Ausubel等.,Short Protocols in Molecular Biology,3rd ed.,Wiley&Sons,1995；和其它类似的参考文献。在一个具体的实施方案中，施用的量抑制NO合成且抑制黑色素瘤的生长，并与如本文中描述的其它化疗如顺铂协同作用。因此，本公开的一个实施方案提供了治疗黑色素瘤的方法，即与顺铂组合施用ADI-PEG20，其中该治疗消耗内源性一氧化氮(NO)。
治疗的准确剂量和持续时间是所治疗疾病的函数，并且可使用已知的测试方案或通过测试本领域中已知的模型系统中的组合物并从其外推来经验性测定。还可实施受控的临床试验。剂量也可以随着要减轻的疾患的严重性而变化。通常配制并施用药学组合物以施加治疗有用的效果并使得不想要的副作用最小化。所述组合物可施用一次，或可分成许多要以时间间隔施用的更小的剂量。对于任何具体的受试者，可依照个体需要来随时间调整特定剂量方案。
可以单独或与其它已知的癌症治疗如放疗、化疗、移植、免疫治疗、激素治疗、光力学治疗等组合来施用ADI组合物。还可以与抗生素组合来施用组合物。
如此，这些和相关药物组合物的通常施用途径包括但不限于，口服、局部、经皮、吸入、胃肠外、舌下、含服、直肠、阴道和鼻内。如本文中使用的术语胃肠外包括皮下注射、静脉内、肌内、胸骨内注射或输注技术。依照本发明某些实施方案的药物组合物配制为允许其中含有的活性成分在对患者施用该组合物时为生物可用的。将对受试者或患者施用的组合物将采用一个或多个剂量单位的形式，其中例如，片剂可以是单剂量单位，而本文中描述的气雾剂形式的ADI组合物的容器可容纳多个剂量单位。制备这类剂量形式的实际方法对于本领域中技术人员是已知的或会是明显的；例如，参见Remington:The Science andPractice of Pharmacy,20th Edition(Philadelphia College of Pharmacy andScience,2000)。要施用的组合物在任何事件中将含有治疗有效量的本公开的ADI-PEG，如ADI-PEG20，以用于依照本文中的教导来治疗感兴趣的疾病或疾患。
药物组合物可以以固体或液体的形式。在一个实施方案中，载体是颗粒，从而所述组合物为例如片剂或散剂形式。载体可以是液体，从而所述组合物为例如anoral油、可注射液体或气雾剂(可用于例如吸入施用)。当意图用于口服施用时，所述药物组合物一般是固体或液体形式，其中半固体、半液体、悬液和凝胶形式包含在本文中视为固体或液体的形式中。
作为用于口服施用的固体组合物，药物组合物可配制成散剂、颗粒、压缩的片剂、丸剂、胶囊剂、咀嚼胶、wafer等。这类固体组合物通常会含有一种或多种惰性稀释剂或可食用载体。另外，可存在一种或多种以下物质：粘合剂如羧甲基纤维素、乙基纤维素、微晶纤维素、西黄蓍胶(gum tragacanth)或明胶；赋形剂如淀粉、乳糖或糊精，崩解剂如海藻酸、海藻酸钠、Primogel、玉米淀粉等；润滑剂如硬脂酸镁或Sterotex；助流剂如胶体二氧化硅；增甜剂如蔗糖或糖精；芳香剂如胡椒薄荷、水杨酸甲酯或橙香精；和着色剂。当药物组合物以胶囊剂例如明胶胶囊剂的形式时，它在上述材料类型之外，还可以含有液体载体如聚乙二醇或油。
药物组合物可以以液体，例如酏剂、糖浆剂、溶液、乳剂或悬液的形式。试举两例，液体可以用于例如口服施用或用于通过注射递送。当意图用于口服施用时，优选的组合物除了所述化合物外还含有一种或多种增甜剂、防腐剂、染料/着色剂和增香剂。在意图通过注射施用的一种组合物中，可以纳入一种或多种表面活性剂、防腐剂、润湿剂、分散剂、悬浮剂、缓冲剂、稳定剂和等渗剂。
液体药物组合物，不管它们是溶液、悬液或其它类似形式，可以包含一种或多种以下佐剂：无菌稀释剂如注射用水、盐水溶液，且在某些实施方案中，生理学盐水、林格氏溶液(Ringer’s solution)、等渗氯化钠、不挥发油如合成的单甘油酯或二甘油酯(其可充当溶剂或悬浮介质)、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它溶剂；抗细菌剂如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯(methyl paraben)；抗氧化剂如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂如乙二胺四乙酸；缓冲剂如乙酸、柠檬酸或磷酸，和用于调节张度的试剂如氯化钠或右旋糖。胃肠外制备物可装入由玻璃或塑料制备的安瓿、一次性注射器或多剂量管形瓶(multiple dose vial)中。生理盐水是优选的佐剂。优选地，可注射药物组合物是无菌的。
意图胃肠外或口服施用的液体药物组合物应含有使得将获得合适剂量的如本文中公开的ADI如ADI-PEG20的量。通常地，此量为组合物中至少0.01%的ADI。当意图用于口服施用时，此量可在组合物重量的0.1至约70%变化。某些口服药物组合物含有约4%至约75%的ADI-PEG。在某些实施方案中，制备依照本发明的药物组合物和制备物从而胃肠外剂量单位在稀释前含有按重量计0.01至10%的ADI-PEG。
所述药物组合物可意图用于局部施用，在此情况下载体可适宜地包含溶液、乳液、软膏或凝胶基底。所述基底例如可包含以下一种或多种：矿脂(petrolatum)、羊毛脂(lanolin)、聚乙二醇、蜂蜡、矿物油、稀释剂如水和醇、以及乳化剂和稳定剂。增稠剂可存在于用于局部施用的药物组合物中。如果意图用于经皮施用，所述组合物可包含经皮贴剂(transdermal patch)或离子电渗装置。所述药物组合物可意图用于直肠施用，其为例如栓剂的形式，栓剂会在直肠中融化并释放药物。用于直肠施用的组合物可含有油质基底作为合适的无刺激性赋形剂。这类基底包括但不限于，羊毛脂、可可油(cocoa butter)和聚乙二醇。
所述药物组合物可包含各种材料，其改变固体或液体剂量单位的物理形式。例如，组合物可包含在活性成分周围形成涂料壳的材料。形成涂料壳的材料通常是惰性的，并且可以选自例如糖、紫胶(shellac)和其它肠包衣剂(coating agent)。或者，所述活性成分可装入明胶胶囊中。固体或液体形式的药物组合物可包含结合ADI-PEG的药剂并由此帮助化合物递送。可以此能力作用的合适药剂包括单克隆或多克隆抗体、一种或多种蛋白质或脂质体。药物组合物可基本由可作为气雾剂施用的剂量单位组成。术语气雾剂用于指多种系统，从那些具有胶体性质的系统到由加压包装组成的系统。递送可通过液化或加压气体，或通过分散活性成分的合适的泵系统进行。气雾剂可以以单相、双相或三相系统递送以递送活性成分。气雾剂的递送包括必要的容器、激活剂、阀、子容器等，其合起来可以形成试剂盒。本领域中的普通技术人员不用过度实验就可以确定优选的气雾剂。
药物组合物可通过药物领域中公知的方法学来制备。例如，意图通过注射施用的药物组合物可通过将包含如本文中描述的ADI-PEG的组合物和任选地一种或多种盐、缓冲剂和/或稳定剂，与无菌蒸馏水组合从而形成溶液来制备。可以添加表面活性剂来促进均一溶液或悬液的形成。表面活性剂是与ADI-PEG组合物非共价相互作用以协助ADI-PEG在水性递送系统中的溶解或均一悬浮的化合物。
所述组合物可以以治疗有效量施用，其将随着多个因素而变化，所述因素包括采用的特定化合物(例如，ADI-PEG)的活性；化合物的代谢稳定性和作用长度；患者的年龄、体重、一般健康、性别和饮食；施用模式和时间；排泄速率；药物组合；特定病症或疾患的严重性；和进行疗法的受试者。
本发明化合物之一的治疗有效量是有效抑制肿瘤生长的量。一般而言，用小剂量启动治疗，其可通过小增量增加直至达到该情况下的最佳效果。一般而言，本发明化合物的治疗剂量可从约1至约200mg/kg每周两次到约每两周一次。例如，剂量可以是以2ml静脉内注射约1mg/kg每周一次至约20mg/kg每3天一次。在一个别的实施方案中，剂量可以是从约50IU/m2至约700IU/m2，约每3天一次、约每周一次、约每周两次、或约每2周一次施用。在某些实施方案中，剂量可以是约50IU/m2、60IU/m2、70IU/m2、80IU/m2、90IU/m2、100IU/m2、110IU/m2、120IU/m2、130IU/m2、140IU/m2、150IU/m2、160IU/m2、170IU/m2、180IU/m2、190IU/m2、200IU/m2、210IU/m2、220IU/m2、230IU/m2、240IU/m2、250IU/m2、260IU/m2、270IU/m2、280IU/m2、290IU/m2、300IU/m2、310IU/m2、约320IU/m2、约330IU/m2、340IU/m2、约350IU/m2、360IU/m2、370IU/m2、380IU/m2、390IU/m2、400IU/m2、410IU/m2、420IU/m2、430IU/m2、440IU/m2、450IU/m2、500IU/m2、550IU/m2、600IU/m2、620IU/m2、630IU/m2、640IU/m2、650IU/m2、660IU/m2、670IU/m2、680IU/m2、690IU/m2、或约700IU/m2，约每3天一次、约每周一次、约每周两次或约每2周一次地施用。在某些受试者可能产生抗ADI免疫应答的实施方案中，可以如熟练临床医师期望的来修改剂量。
ADI-SS-PEG5,000的最佳剂量可以是约每周两次，而ADI-SS-PEG20,000的最佳剂量可以从约每周一次到约每两周一次。在某些实施方案中，ADI-SS-PEG20,000的最佳剂量可以是约每周两次。
可以在注射前将ADI-PEG与磷酸盐缓冲盐水溶液或任何其它本领域技术人员已知的适宜溶液混合。在一个实施方案中，包含ADI-PEG的液体组合物包含约10至约12mg的ADI、约20至约40mg的聚乙二醇、1.27mg+5%磷酸二氢钠，USP；约3mg+5%磷酸氢二钠，USP；7.6mg+5%氯化钠，USP；pH为约6.6至约7；在合适量的注射用水中(例如，约1ml或约2ml)。在一个实施方案中，包含ADI-PEG的液体组合物包含组氨酸-HCl，且在某些实施方案中，组合物缓冲液为约0.0035M组氨酸-HCl至约0.35M组氨酸-HCl。在一个具体的实施方案中，将所述组合物配制到包含pH6.8的0.035M组氨酸-HCl与0.13M氯化钠的缓冲液中。在另一个实施方案中，将所述组合物配制到包含pH6.8的0.02M磷酸钠缓冲液与0.13M氯化钠的缓冲液中。
在一个实施方案中，包含ADI或ADI-PEG的组合物具有约5至约9、约6至约8、或约6.5至约7.5的pH。在一些实施方案中，包含ADI的组合物具有约6.8±1.0的pH。
在一个实施方案中，包含ADI-PEG的组合物中的游离PEG为1-10%，且在一个别的实施方案中，低于总PEG的7%、低于6%、低于5%、低于4%、低于3%、低于2%或低于1%。在某些实施方案中，包含ADI-PEG的组合物中的天然ADI为低于约1%、0.9%、0.8%、0.7%、0.6%、0.5%、0.4%、0.3%、0.2%或低于0.1%。一般而言，包含ADI-PEG的组合物具有低于或等于约4%、3%、2%、1.5%、1%或0.5%的总杂质。
在一个实施方案中，包含ADI或ADI-PEG的组合物中的游离巯基超过约90%。在一些实施方案中，包含ADI或ADI-PEG的组合物中的游离巯基为约91%、约92%、约93%、约94%或约95%、约96%、约97%、约98%、约99%或更多。
在一个实施方案中，组合物中的ADI或ADI-PEG具有约0.5μM至约15μM的Km，而在一个别的实施方案中，为约1μM至约12μM、约1μM至约10μM、约1.5μM至约9μM、约1.5μM至约8μM或约1.5μM至约7μM。在某些实施方案中，组合物中的ADI或ADI-PEG具有约1.5μM至约6.5μM的Km。在一些实施方案中，组合物中的ADI或ADI-PEG具有约1.5μM、约2μM、约2.5μM、约3μM、约3.5μM、约4μM、约4.5μM、约5μM、约5.5μM、约6μM、约6.5μM或约7μM的Km。
在一个实施方案中，组合物中的ADI或ADI-PEG具有约0.5秒-1至约15秒-1的Kcat，而在一个别的实施方案中，为约1秒-1至约12秒-1、约1秒-1至约10秒-1、约1.5秒-1至约9秒-1、约2秒-1至约8秒-1或约2.5秒-1至约7秒-1。在某些实施方案中，组合物中的ADI或ADI-PEG具有约2.5秒-1至约7.5秒-1的Kcat。在一些实施方案中，组合物中的ADI或ADI-PEG具有约2.5秒-1、约3秒-1、约3.5秒-1、约4秒-1、约4.5秒-1、约5秒-1、约5.5秒-1、约6秒-1、约6.5秒-1、约7秒-1、约7.5秒-1或约8秒-1的Kcat。
在一个实施方案中，组合物中的ADI或ADI-PEG具有约5mS/cm至约20mS/cm的电导率(在本领域中也称为比电导)，而在别的实施方案中，为约5mS/cm至约15mS/cm、约7mS/cm至约15mS/cm、约9mS/cm至约15mS/cm或约10mS/cm至约15mS/cm。在一些实施方案中，组合物中的ADI或ADI-PEG具有约9mS/cm、约10mS/cm、约11mS/cm、约12mS/cm或约13mS/cm、约14mS/cm或约15mS/cm的电导率。在某些实施方案中，组合物中的ADI或ADI-PEG具有约13mS/cm±1.0mS/cm的电导率。
在一个实施方案中，组合物中的ADI或ADI-PEG具有约50mOsm/kg至约500mOsm/kg、约100mOsm/kg至约400mOsm/kg、约150mOsm/kg至约350mOsm/kg、约200mOsm/kg至约350mOsm/kg或约250mOsm/kg至约350mOsm/kg的重量摩尔渗透压浓度(osmolality)。在某些实施方案中，组合物中的ADI或ADI-PEG具有约300±30mOsm/kg的重量摩尔渗透压浓度。
本公开的包含ADI-PEG的组合物还可与一种或多种其它治疗剂的施用同时、在前或在后施用。这类组合疗法可包括施用含有本发明的化合物和一种或多种另外的活性剂的单药物剂量制剂，以及施用在其自身分开的药物剂量制剂中的包含本发明的ADI-PEG(例如，ADI-PEG20)的组合物和每种活性剂。例如，如本文中描述的ADI-PEG和其它活性剂可以一起在单一口服剂量组合物(如片剂或胶囊)中对患者施用，或者每种药剂在分开的口服剂量制剂中施用。类似地，如本文中描述的ADI-PEG和其它活性剂可以一起在单一胃肠外剂量组合物如盐水溶液或其它生理学可接受溶液中对患者施用，或者每种药剂在分开的胃肠外剂量制剂中施用。当使用分开的剂量制剂时，可以基本同时即共同地，或在分别错开的时间即顺序地且以任何次序地施用包含ADI-PEG的组合物和一种或多种另外的活性剂；组合疗法理解为包含所有这些方案。
如此，在某些实施方案中，还涵盖将本公开ADI组合物与一种或其它治疗剂组合施用。这类治疗剂在本领域中可接受为针对如本文中描述的特定疾病状态，如特定癌症或GVHD的标准治疗。涵盖的例示性治疗剂包括细胞因子、生长因子、类固醇、NSAID、DMARD、抗炎剂、化疗、放疗、自体吞噬抑制剂、或其它活性剂和辅助剂。
在某些实施方案中，本文中公开的ADI组合物可联同任何数目的化疗剂一起施用。化疗剂的例子包括烷化剂类如塞替派(thiotepa)和环磷酰胺烷基磺酸酯类(alkyl sulfonates)，如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶类(aziridines)，如苯佐替派(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、美妥替派(meturedopa)和乌瑞替派(uredopa)；乙撑亚胺类(ethylenimines)和甲基蜜胺类(methylamelamines)，包括六甲蜜胺(altretamine)、三乙撑蜜胺(triethylenemelamine)、三乙撑磷酰胺(triethylenephosphoramide)、三乙撑硫代磷酰胺(triethylenethiophosphoramide)和三羟甲蜜胺(trimethylolomelamine)；氮芥类(nitrogen mustards)，如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、胆磷酰胺(cholophosphamide)、雌莫司汀(estramustine)、异环磷酰胺(ifosfamide)、双氯乙基甲胺(mechlorethamine)、盐酸氧氮芥(mechlorethamine oxide hydrochloride)、美法仑(melphalan)、新氮芥(novembichin)、苯芥胆甾醇(phenesterine)、泼尼莫司汀(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥(uracil mustard)；亚硝脲类(nitrosoureas)，如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)、雷莫司汀(ranimustine)；抗生素类，如阿克拉霉素(aclacinomycin)、放线菌素(actinomycin)、氨茴霉素(authramycin)、偶氮丝氨酸(azaserine)、博来霉素(bleomycin)、放线菌素C(cactinomycin)、加利车霉素(calicheamicin)、carabicin、洋红霉素(carminomycin)、嗜癌霉素(carzinophilin)、色霉素(chromomycin)、放线菌素D(dactinomycin)、柔红霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-二氮-5-氧-L-正亮氨酸、多柔比星(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊达比星(idarubicin)、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素类(mitomycins)、霉酚酸(mycophenolic acid)、诺拉霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycin)、培洛霉素(peplomycin)、泊非霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素(puromycin)、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑菌素(streptonigrin)、链佐星(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代谢物类，如甲氨喋呤(methotrexate)和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，如二甲叶酸(denopterin)、甲氨喋呤(methotrexate)、蝶酰三谷氨酸(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤类似物，诸如氟达拉滨(fludarabine)、6-巯基嘌呤(mercaptopurine)、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鸟嘌呤(thioguanine)；嘧啶类似物，如安西他滨(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮尿苷(azauridine)、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、双脱氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、依诺他滨(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)、5-FU；雄激素类，如卡鲁睾酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolone propionate)、表硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睾内酯(testolactone)；抗肾上腺类，如氨鲁米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充剂，诸如亚叶酸(folinic acid)；醋葡醛内酯(aceglatone)；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamideglycoside)；氨基乙酰丙酸(aminolevulinic acid)；安吖啶(amsacrine)；bestrabucil；比生群(bisantrene)；依达曲沙(edatraxate)；地磷酰胺(defosfamide)；地美可辛(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；elfornithine；依利醋铵(elliptinium acetate)；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓；羟脲(hydroxyurea)；香菇多糖(lentinan)；氯尼达明(lonidamine)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌达醇(mopidamol)；二胺硝吖啶(nitracrine)；喷司他丁(pentostatin)；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；鬼臼酸(podophyllinic acid)；2-乙基酰肼(ethylhydrazide)；丙卡巴肼(procarbazine)；PSK.RTM.；雷佐生(razoxane)；西佐喃(sizofiran)；螺旋锗(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亚胺醌(triaziquone)；2,2',2''-三氯三乙胺；乌拉坦(urethan)；长春地辛(vindesine)；达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露莫司汀(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；gacytosine；阿糖胞苷(arabinoside)(“Ara-C”)；环磷酰胺；塞替派；类紫杉醇类(taxoids)，例如帕利他塞(paclitaxel)(Bristol-Myers SquibbOncology，Princeton，N.J.)和多西他赛(doxetaxel)(Rhne-PoulencRorer，Antony，France)；苯丁酸氮芥(chlorambucil)；吉西他滨(gemcitabine)；6-硫鸟嘌呤(thioguanine)；巯基嘌呤(mercaptopurine)；甲氨喋呤(methotrexate)；铂类似物，如顺铂(cisplatin)和卡铂(carboplatin)；长春碱(vinblastine)；铂(platinum)；依托泊苷(etoposide)(VP-16)；异环磷酰胺(ifosfamide)；丝裂霉素C(mitomycin C)；米托蒽醌(mitoxantrone)；长春新碱(vincristine)；长春瑞滨(vinorelbine)；navelbine；能灭瘤(novantrone)；替尼泊苷(teniposide)；道诺霉素(daunomycin)；氨基蝶呤(aminopterin)；xeloda；伊本膦酸盐(ibandronate)；CPT-11；拓扑异构酶抑制剂RFS2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；视黄酸衍生物，如TargretinTM(贝沙罗汀(bexarotene))、PanretinTM(阿利维A酸(alitretinoin))；ONTAKTM(地尼白介素2(denileukin diftitox))；esperamicin；卡培他滨(capecitabine)；和上文中任一种的药学可接受的盐、酸或衍生物。还包含在此定义中的是作用于调节或抑制激素对肿瘤的作用的抗激素剂如抗雌激素类，包括例如，他莫昔芬(tamoxifen)、雷洛昔芬(raloxifene)、抑制芳香酶的4(5)-咪唑、4-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬(trioxifene)、那洛昔芬(keoxifene)、LY117018、奥那司酮(onapristone)和托瑞米芬(toremifene)(Fareston)；和抗雄激素类，如氟他米特(flutamide)、尼鲁米特(nilutamide)、比卡米特(bicalutamide)、亮丙瑞林(leuprolide)和戈舍瑞林(goserelin)；其他化疗剂包括索拉非尼(sorafenib)和其它蛋白激酶抑制剂如afatinib、axitinib、贝伐单抗(bevacizumab)、西妥昔单抗(cetuximab)、crizotinib、dasatinib、erlotinib、fostamatinib、gefitinib、伊马替尼(imatinib)、lapatinib、lenvatinib、mubritinib、nilotinib、panitumumab、pazopanib、pegaptanib、ranibizumab、ruxolitinib、曲妥单抗(trastuzumab)、vandetanib、vemurafenib、和舒尼替尼(sunitinib)；sirolimus(雷帕霉素)、依维莫司(everolimus)和其它mTOR抑制剂。还涵盖将上文中任一种的药学可接受的盐、酸或衍生物用于本文。
在某些实施方案中，本文中公开的ADI组合物可联同任意数目的自体吞噬抑制剂一起施用。在一些优选的实施方案中，所述自体吞噬抑制剂选自下组：氯喹、3-甲基腺嘌呤、羟基氯喹(Plaquenil.TM.)、巴夫洛霉素(bafilomycin)A1、5-氨基-4-咪唑羧酰胺核糖苷(AICAR)、冈田酸(okadaic acid)、抑制2A型或1型蛋白磷酸酶的自体吞噬抑制性藻毒素(autophagy-suppressive algal toxin)、cAMP类似物、和升高cAMP水平的药物、腺苷、N6-巯基嘌呤核糖苷、渥曼青霉素和长春碱。另外，还可以使用抑制自体吞噬所必需的蛋白质(如例如ATG5)表达的反义或siRNA。
在一个实施方案中，ADI-PEG与一种或多种治疗剂加合或协同性地作用。在此方面，在本文中描述了协同作用剂，其包括能与本文中提供的ADI-PEG协同作用的治疗剂(例如，化疗剂、自体吞噬抑制剂、mTOR抑制剂、或任何其它用于治疗如本文中描述的癌症、GVHD或炎性肠病的治疗剂)，其中这类协同展现为可检测效果，该效果的幅度大于(即，相对于合适的对照状况以统计学显著的方式)在存在化疗剂但不存在ADI-PEG组合物时，和/或在存在ADI-PEG但不存在化疗剂时所能检测到的效果。用于测量协同性的方法是本领域中已知的(参见例如，Cancer Res January15,201070;440)。
如本文中描述的包含ADI和任选地其它治疗剂的组合物可用于供治疗癌症的治疗性方法和用于预防癌症转移的方法。如此，本发明提供用于治疗多种不同癌症、减轻其症状或抑制其进展、或预防多种不同癌症的方法。在另一个实施方案中，本公开提供用于治疗GVHD、减轻其症状或抑制其进展的方法。具体地，本公开提供用于治疗患者中的癌症或GVHD、减轻其症状或抑制其进展的方法，包括对患者施用治疗有效量的如本文中描述的ADI组合物，由此治疗癌症或GVHD、减轻其症状或抑制其进展。如此，本文中描述的ADI组合物可对患有炎性肠病(例如，克罗恩病(Crohn's disease)；溃疡性结肠炎)、GVHD或癌症的个体施用，所述癌症包括但不限于白血病(例如急性髓细胞性白血病和复发的急性髓细胞性白血病)、黑色素瘤、肉瘤(包括但不限于转移性肉瘤、子宫平滑肌肉瘤)、胰腺癌、前列腺癌(如但不限于，激素难治性前列腺癌)、间皮瘤、淋巴性白血病、慢性髓细胞性白血病、淋巴瘤、小细胞肺癌、乳腺癌、卵巢癌、结肠直肠癌、胃癌(包括但不限于胃腺癌瘤)、胶质瘤、多形性胶质母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、神经母细胞瘤、非小细胞肺癌(NSCLC)、肾癌(包括但不限于肾细胞癌瘤)、膀胱癌、子宫癌、食道癌、脑癌、头和颈癌(包括但不限于头和颈的鳞状细胞癌瘤；舌癌)、子宫颈癌、睾丸癌、胆囊癌、胆管癌瘤(cholangiocarcinoma)和胃癌。
在一个实施方案中，本公开提供治疗髓细胞性白血病如但不限于急性髓细胞性白血病(AML)、减轻其症状或抑制其进展的方法，即施用治疗有效量的ADI-PEG20。在某些实施方案中，髓细胞性白血病如AML是ASS、ASL或两者皆缺陷性的。在另一个实施方案中，髓细胞性白血病(例如，AML)不包含易位t(15;17)。在一个别的实施方案中，本公开提供治疗AML的方法，包括约每3天一次、约每周一次、约每周两次、或约每2周一次地施用ADI-PEG20。在某些实施方案中，用于治疗AML所施用的ADI-PEG20剂量为约160IU/m2至约360IU/m2，且在其它实施方案中为约160IU/m2、约170IU/m2、180IU/m2、190IU/m2、200IU/m2、210IU/m2、220IU/m2、230IU/m2、240IU/m2、250IU/m2、260IU/m2、270IU/m2、280IU/m2、290IU/m2、300IU/m2、310IU/m2、约320IU/m2、约330IU/m2、340IU/m2、约350IU/m2、约360IU/m2、约370IU/m2、380IU/m2、390IU/m2、400IU/m2、410IU/m2、420IU/m2、430IU/m2、440IU/m2、450IU/m2、500IU/m2、550IU/m2、600IU/m2、640IU/m2或约700IU/m2。在某些实施方案中，其中用ADI-PEG治疗AML诱导针对ADI的免疫应答，本公开提供治疗AML的方法，其中ADI的剂量加倍并可增加至每周640IU/m2或更多。在一个具体的实施方案中，用于治疗AML的ADI修饰为每ADI3.5-6.5个PEG分子，或在一个实施方案中，每ADI4.5-5.5个PEG分子。在另一个实施方案中，本公开提供治疗AML的方法，即施用包含ADI-PEG20的组合物，其中所述组合物包含用5±1.5个PEG分子修饰的ADI，且在一个实施方案中，包含用5±1.5个直链PEG分子修饰的ADI，在某些实施方案中，所述组合物包含低于约0.5%的天然ADI(即未用PEG修饰)和/或低于约5%的游离PEG。在一个别的实施方案中，所述组合物包含组氨酸-HCL缓冲剂。
在一个实施方案中，本公开提供治疗肉瘤(包括但不限于转移性肉瘤)、减轻其症状或抑制其进展的方法，即施用治疗有效量的ADI-PEG20。在某些实施方案中，所述肉瘤是ASS、ASL或两者皆缺陷性的。在一个别的实施方案中，本公开提供治疗肉瘤的方法，包括约每3天一次、约每周一次、约每周两次、或约每2周一次地施用ADI-PEG20。在某些实施方案中，用于治疗AML施用的ADI-PEG20剂量为约160IU/m2至约360IU/m2，而在其它实施方案中为约160IU/m2、约170IU/m2、180IU/m2、190IU/m2、200IU/m2、210IU/m2、220IU/m2、230IU/m2、240IU/m2、250IU/m2、260IU/m2、270IU/m2、280IU/m2、290IU/m2、300IU/m2、310IU/m2、约320IU/m2、约330IU/m2、340IU/m2约350IU/m2、约360IU/m2、约370IU/m2、380IU/m2、390IU/m2、400IU/m2、410IU/m2、420IU/m2、430IU/m2、440IU/m2、450IU/m2、500IU/m2、550IU/m2、600IU/m2、640IU/m2、或约700IU/m2。在某些实施方案中，其中用ADI-PEG治疗肉瘤诱导针对ADI的免疫应答，本公开提供治疗肉瘤的方法，其中ADI的剂量加倍并可增加至每周640IU/m2或更多。在一个具体的实施方案中，用于治疗AML的ADI修饰为每ADI3.5-6.5个PEG分子，或在一个实施方案中，每ADI4.5-5.5个PEG分子。在另一个实施方案中，本公开提供治疗肉瘤包括转移性肉瘤的方法，即施用包含ADI-PEG20的组合物，其中所述组合物包含用5±1.5个PEG分子修饰的ADI，且在一个实施方案中，包含用5±1.5个直链PEG分子修饰的ADI，且在某些实施方案中，所述组合物包含低于约0.5%的天然ADI(即未用PEG修饰)和/或低于约5%的游离PEG。在一个别的实施方案中，所述组合物包含组氨酸-HCL缓冲剂。
在一个实施方案中，本公开提供治疗胰腺癌、减轻其症状或抑制其进展的方法，即施用治疗有效量的ADI-PEG20与自体吞噬抑制剂的组合，所述自体吞噬抑制剂如但不限于，氯喹、3-甲基腺嘌呤、羟基氯喹、巴夫洛霉素A1、5-氨基-4-咪唑羧酰胺核糖苷(AICAR)、冈田酸、N6-巯基嘌呤核糖苷、渥曼青霉素和长春碱。在某些实施方案中，胰腺癌是ASS、ASL或两者皆缺陷性的。在一个别的实施方案中，本公开提供治疗胰腺癌的方法，包括约每3天一次、约每周一次、约每周两次、或约每2周一次地施用ADI-PEG20；其与治疗有效量的自体吞噬抑制剂如氯喹组合。在此方面，治疗有效剂量的氯喹可以是约600mg碱(base)的起始剂量，接着是在两个连续日每日的额外300mg碱和单剂300mg碱。这代表3天中2.5g氯喹磷酸盐或1.5g碱的总剂量。在别的实施方案中，剂量可以是约300mg碱。氯喹、或其它自体吞噬抑制剂的剂量可以如需要的由熟练临床医师使用本领域中已知的剂量修改。如技术人员会理解的，自体吞噬抑制剂可在包含ADI-PEG20的组合物之前、同时或之后施用。在某些实施方案中，用于治疗胰腺癌施用的ADI-PEG20剂量为约160IU/m2至约360IU/m2，且在其它实施方案中为约160IU/m2、约170IU/m2、180IU/m2、190IU/m2、200IU/m2、210IU/m2、220IU/m2、230IU/m2、240IU/m2、250IU/m2、260IU/m2、270IU/m2、280IU/m2、290IU/m2、300IU/m2、310IU/m2、约320IU/m2、约330IU/m2、340IU/m2约350IU/m2、约360IU/m2、约370IU/m2、380IU/m2、390IU/m2、400IU/m2、410IU/m2、420IU/m2、430IU/m2、440IU/m2、450IU/m2、500IU/m2、550IU/m2、600IU/m2、640IU/m2、或约700IU/m2。在某些实施方案中，其中用ADI-PEG组合氯喹治疗胰腺癌诱导针对ADI的免疫应答，本公开提供治疗胰腺癌的方法，其中ADI的剂量加倍并可增加至每周640IU/m2或更多。在一个具体的实施方案中，用于治疗胰腺癌的ADI修饰为每ADI3.5-6.5个PEG分子，或在一个实施方案中，每ADI4.5-5.5个PEG分子。在另一个实施方案中，本公开提供治疗胰腺癌的方法，即施用氯喹或其它适宜的自体吞噬抑制剂与包含ADI-PEG20的组合物的组合，其中所述组合物包含用5±1.5个PEG分子修饰的ADI，且在一个实施方案中，包含用5±1.5个直链PEG分子修饰的ADI，且在某些实施方案中，所述组合物包含低于约0.5%的天然ADI(即未用PEG修饰)和/或低于约5%的游离PEG。在一个别的实施方案中，所述组合物包含组氨酸-HCL缓冲剂。
在一个实施方案中，本公开提供治疗小细胞肺癌、减轻其症状或抑制其进展的方法，即施用治疗有效量的ADI-PEG20与自体吞噬抑制剂的组合。在某些实施方案中，小细胞肺癌是ASS、ASL或两者皆缺陷性的。在一个别的实施方案中，本公开提供治疗小细胞肺癌的方法，包括约每3天一次、约每周一次、约每周两次、或约每2周一次地施用ADI-PEG20；其与治疗有效量的自体吞噬抑制剂如氯喹组合。在此方面，治疗有效剂量的氯喹可以是约600mg碱的起始剂量，接着是在两个连续日每日的额外300mg碱和单剂300mg碱。这代表3天中2.5g氯喹磷酸盐或1.5g碱的总剂量。在别的实施方案中，剂量可以是约300mg碱。氯喹的剂量可以如需要的由熟练临床医师使用本领域中已知的剂量修改。如技术人员会理解的，自体吞噬抑制剂可在包含ADI-PEG20的组合物之前、同时或之后施用。在某些实施方案中，用于治疗小细胞肺癌施用的ADI-PEG20剂量为约160IU/m2至约360IU/m2，而在其它实施方案中为约160IU/m2、约170IU/m2、180IU/m2、190IU/m2、200IU/m2、210IU/m2、220IU/m2、230IU/m2、240IU/m2、250IU/m2、260IU/m2、270IU/m2、280IU/m2、290IU/m2、300IU/m2、310IU/m2、约320IU/m2、约330IU/m2、340IU/m2、约350IU/m2、约360IU/m2、约370IU/m2、380IU/m2、390IU/m2、400IU/m2、410IU/m2、420IU/m2、430IU/m2、440IU/m2、450IU/m2、500IU/m2、550IU/m2、600IU/m2、640IU/m2、或约700IU/m2。在某些实施方案中，其中用ADI-PEG组合氯喹治疗小细胞肺癌诱导针对ADI的免疫应答，本公开提供治疗小细胞肺癌的方法，其中ADI的剂量加倍并可增加至每周640IU/m2或更多。在一个具体的实施方案中，用于治疗小细胞肺癌的ADI修饰为每ADI3.5-6.5个PEG分子，或在一个实施方案中，每ADI4.5-5.5个PEG分子。在另一个实施方案中，本公开提供治疗小细胞肺癌的方法，即施用氯喹与包含ADI-PEG20的组合物的组合，其中所述组合物包含用5±1.5个PEG分子修饰的ADI，且在一个实施方案中，包含用5±1.5个直链PEG分子修饰的ADI，且在某些实施方案中，所述组合物包含低于约0.5%的天然ADI(即未用PEG修饰)和/或低于约5%的游离PEG。在一个别的实施方案中，所述组合物包含组氨酸-HCL缓冲剂。
在一个实施方案中，本公开提供治疗肉瘤(包括但不限于，转移性肉瘤)、减轻其症状或抑制其进展的方法，即施用治疗有效量的ADI-PEG20与自体吞噬抑制剂的组合。在某些实施方案中，肉瘤是ASS、ASL或两者皆缺陷性的。在一个别的实施方案中，本公开提供治疗肉瘤的方法，包括约每3天一次、约每周一次、约每周两次、或约每2周一次地施用ADI-PEG20；其与治疗有效量的自体吞噬抑制剂如氯喹组合。在此方面，治疗有效剂量的氯喹可以是约600mg碱的起始剂量，接着是在两个连续日每日的额外的300mg碱和单剂300mg碱。这代表3天中2.5g氯喹磷酸盐或1.5g碱的总剂量。在别的实施方案中，剂量可以是约300mg碱。氯喹的剂量可以如需要的由熟练临床医师使用本领域中已知的剂量修改。如技术人员会理解的，自体吞噬抑制剂可在包含ADI-PEG20的组合物之前、同时或之后施用。在某些实施方案中，用于治疗肉瘤施用的ADI-PEG20剂量为约160IU/m2至约360IU/m2，而在其它实施方案中为约160IU/m2、约170IU/m2、180IU/m2、190IU/m2、200IU/m2、210IU/m2、220IU/m2、230IU/m2、240IU/m2、250IU/m2、260IU/m2、270IU/m2、280IU/m2、290IU/m2、300IU/m2、310IU/m2、约320IU/m2、约330IU/m2、340IU/m2约350IU/m2、约360IU/m2、约370IU/m2、380IU/m2、390IU/m2、400IU/m2、410IU/m2、420IU/m2、430IU/m2、440IU/m2、450IU/m2、500IU/m2、550IU/m2、600IU/m2、640IU/m2、或约700IU/m2。在某些实施方案中，其中用ADI-PEG组合氯喹治疗肉瘤诱导针对ADI的免疫应答，本公开提供治疗肉瘤的方法，其中ADI的剂量加倍并可增加至每周640IU/m2或更多。在一个具体的实施方案中，用于治疗肉瘤的ADI修饰为每ADI3.5-6.5个PEG分子，或在一个实施方案中，每ADI4.5-5.5个PEG分子。在另一个实施方案中，本公开提供治疗肉瘤的方法，即施用氯喹与包含ADI-PEG20的组合物的组合，其中所述组合物包含用5±1.5个PEG分子修饰的ADI，且在一个实施方案中，包含用5±1.5个直链PEG分子修饰的ADI，且在某些实施方案中，所述组合物包含低于约0.5%的天然ADI(即未用PEG修饰)和/或低于约5%的游离PEG。在一个别的实施方案中，所述组合物包含组氨酸-HCL缓冲剂。
在一个实施方案中，本公开提供治疗黑色素瘤、减轻其症状或抑制其进展的方法，即施用治疗有效量的ADI-PEG20与多西他赛的组合。在某些实施方案中，黑色素瘤是ASS、ASL或两者皆缺陷性的。在一个别的实施方案中，本公开提供治疗黑色素瘤的方法，包括约每3天一次、约每周一次、约每周两次、或约每2周一次地施用ADI-PEG20；其与治疗有效量的多西他赛组合。在此方面，治疗有效剂量的多西他赛可包含约每3周在30分钟至1小时内静脉内施用75mg/m2或100mg/m2。如熟练临床医师会理解的，多西他赛的剂量可根据疾病适应证和/或先前治疗来修改，且多西他赛可在包含ADI-PEG20的组合物之前、同时或之后施用。在某些实施方案中，用于治疗黑色素瘤施用的ADI-PEG20剂量为约160IU/m2至约360IU/m2，而在其它实施方案中为约160IU/m2、约170IU/m2、180IU/m2、190IU/m2、200IU/m2、210IU/m2、220IU/m2、230IU/m2、240IU/m2、250IU/m2、260IU/m2、270IU/m2、280IU/m2、290IU/m2、300IU/m2、310IU/m2、约320IU/m2、约330IU/m2、340IU/m2约350IU/m2、约360IU/m2、约370IU/m2、380IU/m2、390IU/m2、400IU/m2、410IU/m2、420IU/m2、430IU/m2、440IU/m2、450IU/m2、500IU/m2、550IU/m2、600IU/m2、640IU/m2、或约700IU/m2。在某些实施方案中，其中用ADI-PEG组合多西他赛治疗黑色素瘤诱导针对ADI的免疫应答，本公开提供治疗黑色素瘤的方法，其中ADI的剂量加倍并可增加至每周640IU/m2或更多。在一个具体的实施方案中，用于治疗黑色素瘤的ADI修饰为每ADI3.5-6.5个PEG分子，或在一个实施方案中，每ADI4.5-5.5个PEG分子。在另一个实施方案中，本公开提供治疗黑色素瘤的方法，即施用多西他赛与包含ADI-PEG20的组合物的组合，其中所述组合物包含用5±1.5个PEG分子修饰的ADI，且在一个实施方案中，包含用5±1.5个直链PEG分子修饰的ADI，且在某些实施方案中，所述组合物包含低于约0.5%的天然ADI(即未用PEG修饰)和/或低于约5%的游离PEG。在一个别的实施方案中，所述组合物包含组氨酸-HCL缓冲剂。
在一个实施方案中，本公开提供治疗黑色素瘤、减轻其症状或抑制其进展的方法，即施用治疗有效量的ADI-PEG20与顺铂的组合。在某些实施方案中，黑色素瘤是ASS、ASL或两者皆缺陷性的。在一个别的实施方案中，本公开提供治疗黑色素瘤的方法，包括约每3天一次、约每周一次、约每周两次、或约每2周一次地施用ADI-PEG20；其与治疗有效量的顺铂组合。在此方面，治疗有效剂量的顺铂可包含以50-100mg/m2每周期(每3-4周)一次的施用，或每天施用达5天总计每周期为100mg/m2。如熟练临床医师会理解的，顺铂的剂量可根据疾病适应证、个体患者和/或先前治疗来修改，且顺铂可在包含ADI-PEG20的组合物之前、同时或之后施用。在某些实施方案中，用于治疗黑色素瘤施用的ADI-PEG20剂量为约160IU/m2至约360IU/m2，而在其它实施方案中为约160IU/m2、约170IU/m2、180IU/m2、190IU/m2、200IU/m2、210IU/m2、220IU/m2、230IU/m2、240IU/m2、250IU/m2、260IU/m2、270IU/m2、280IU/m2、290IU/m2、300IU/m2、310IU/m2、约320IU/m2、约330IU/m2、340IU/m2约350IU/m2、约360IU/m2、约370IU/m2、380IU/m2、390IU/m2、400IU/m2、410IU/m2、420IU/m2、430IU/m2、440IU/m2、450IU/m2、500IU/m2、550IU/m2、600IU/m2、640IU/m2、或约700IU/m2。在某些实施方案中，其中用ADI-PEG组合顺铂治疗黑色素瘤诱导针对ADI的免疫应答，本公开提供治疗黑色素瘤的方法，其中ADI的剂量加倍并可增加至每周640IU/m2或更多。在一个具体的实施方案中，用于治疗黑色素瘤的ADI修饰为每ADI3.5-6.5个PEG分子，或在一个实施方案中，每ADI4.5-5.5个PEG分子。在另一个实施方案中，本公开提供治疗黑色素瘤的方法，即施用顺铂与包含ADI-PEG20的组合物的组合，其中所述组合物包含用5±1.5个PEG分子修饰的ADI，且在一个实施方案中，包含用5±1.5个直链PEG分子修饰的ADI，且在某些实施方案中，所述组合物包含低于约0.5%的天然ADI(即未用PEG修饰)和/或低于约5%的游离PEG。在一个别的实施方案中，所述组合物包含组氨酸-HCL缓冲剂。
在一个实施方案中，本公开提供治疗肾细胞癌瘤、减轻其症状或抑制其进展的方法，即施用治疗有效量的ADI-PEG20与mTOR抑制剂的组合，所述mTOR抑制剂如但不限于雷帕霉素、替西罗莫司(temsirolimus)、依维莫司(everolimus)和ridaforolimus。在某些实施方案中，肾细胞癌瘤是ASS、ASL或两者皆缺陷性的。在一个别的实施方案中，本公开提供治疗肾细胞癌瘤的方法，包括约每3天一次、约每周一次、约每周两次、或约每2周一次地施用ADI-PEG20；其与治疗有效量的mTOR抑制剂如雷帕霉素组合。雷帕霉素或其它mTOR抑制剂的剂量可如需要的由熟练临床医师使用本领域中已知的剂量确定。如技术人员会理解的，mTOR抑制剂可在包含ADI-PEG20的组合物之前、同时或之后施用。在某些实施方案中，用于治疗肾细胞癌瘤施用的ADI-PEG20剂量为约160IU/m2至约360IU/m2，而在其它实施方案中为约160IU/m2、约170IU/m2、180IU/m2、190IU/m2、200IU/m2、210IU/m2、220IU/m2、230IU/m2、240IU/m2、250IU/m2、260IU/m2、270IU/m2、280IU/m2、290IU/m2、300IU/m2、310IU/m2、约320IU/m2、约330IU/m2、340IU/m2约350IU/m2、约360IU/m2、约370IU/m2、380IU/m2、390IU/m2、400IU/m2、410IU/m2、420IU/m2、430IU/m2、440IU/m2、450IU/m2、500IU/m2、550IU/m2、600IU/m2、640IU/m2、或约700IU/m2。在某些实施方案中，其中用ADI-PEG组合氯喹治疗肾细胞癌瘤诱导针对ADI的免疫应答，本公开提供治疗肾细胞癌瘤的方法，其中ADI的剂量加倍并可增加至每周640IU/m2或更多。在一个具体的实施方案中，用于治疗肾细胞癌瘤的ADI修饰为每ADI3.5-6.5个PEG分子，或在一个实施方案中，每ADI4.5-5.5个PEG分子。在另一个实施方案中，本公开提供治疗肾细胞癌瘤的方法，即施用雷帕霉素或其它适宜的mTOR抑制剂，与包含ADI-PEG20的组合物的组合，其中所述组合物包含用5±1.5个PEG分子修饰的ADI，且在一个实施方案中，包含用5±1.5个直链PEG分子修饰的ADI，且在某些实施方案中，所述组合物包含低于约0.5%的天然ADI(即未用PEG修饰)和/或低于约5%的游离PEG。在一个别的实施方案中，所述组合物包含组氨酸-HCL缓冲剂。
在某些实施方案中，本公开提供治疗患者中癌症、减轻其症状或抑制其进展的方法，其包括对该患者施用如本文中描述的包含ADI的组合物，其中所述癌症不是黑色素瘤、胰腺癌、前列腺癌、小细胞肺癌、间皮瘤、淋巴性白血病、慢性髓细胞性白血病、淋巴瘤、肝细胞瘤或肉瘤。
本公开还提供治疗患者中炎性病症、减轻其症状或抑制其进展的方法，包括单独地或与一种或多种其它治疗剂组合地，对该患者施用如本文中描述的包含ADI(例如ADI-PEG，特别是ADI-PEG20)的组合物。在一个实施方案中，本公开还提供治疗患者中炎性肠病、减轻其症状或抑制其进展的方法，包括单独地或与一种或多种其它治疗剂组合地，对该患者施用如本文中描述的包含ADI(例如ADI-PEG，特别是ADI-PEG20)的组合物。在此方面，本公开提供治疗患者中克罗恩病或溃疡性结肠炎、减轻其症状或抑制其进展的方法，包括单独地或与一种或多种其它治疗剂组合地，对该患者施用如本文中描述的包含ADI(例如ADI-PEG，特别是ADI-PEG20)的组合物。
在另一个实施方案中，本公开提供治疗患者中癌症、减轻其症状或抑制其进展的方法，其包括对该患者施用包含ADI的组合物和任选地一种或多种如本文中描述的其它治疗剂，其中所述癌症是ASS、ASL或两者皆缺陷性的。在此方面，ASS或ASL缺陷性可以是表达中的降低，如通过mRNA表达或蛋白质表达测量的，或者可以是蛋白质活性中的降低，且一般包括表达或活性中统计学显著的降低，如由技术人员确定的。降低的ASS或ASL表达或活性可以是表达或活性约5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%或更多的降低，如相比于已知无癌症的适宜对照样品中的表达或活性。在某些实施方案中，ASS或ASL表达或活性相比于无癌症对照样品中的表达或活性降低了至少两倍。
在某些实施方案中，ASS或ASL的降低的表达或活性起因于ASS或ASL启动子的甲基化。在另一个实施方案中，ASS或ASL表达或活性中的降低起因于DNA突变(例如，一个或多个点突变、小缺失、插入等)或导致基因缺失的染色体异常。在一个实施方案中，癌症是ASS或ASL阴性的，意味着未观察到表达或活性。
ASS或ASL表达或活性中的降低可使用本领域中已知的任意方法来测量，所述方法如但不限于，定量PCR、免疫组织化学、酶活性测定法(例如，测量瓜氨酸到精氨基琥珀酸的转化或精氨基琥珀酸到精氨酸和延胡索酸的转化的测定法；例如，见图1)等。
如此，本发明提供治疗患者中癌症、减轻其症状或抑制其进展的方法，其包括对该患者施用如本文中描述的包含ADI的组合物，其中所述癌症展现出ASS或ASL、或两者皆降低的表达或活性，其中所述癌症包括但不限于白血病(例如急性髓细胞性白血病和复发的急性髓细胞性白血病)、黑色素瘤、肉瘤(包括但不限于转移性肉瘤、子宫平滑肌肉瘤)、胰腺癌、前列腺癌(如但不限于，激素难治性前列腺癌)、间皮瘤、淋巴性白血病、慢性髓细胞性白血病、淋巴瘤、小细胞肺癌、乳腺癌、卵巢癌、结肠直肠癌、胃癌(包括但不限于胃腺癌)、胶质瘤、多形性胶质母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、神经母细胞瘤、非小细胞肺癌(NSCLC)、肾癌(包括但不限于肾细胞癌瘤)、膀胱癌、子宫癌、食道癌、脑癌、头和颈癌(包括但不限于头和颈的鳞状细胞癌；舌癌)、子宫颈癌、睾丸癌、胆囊癌、胆管癌瘤和胃癌。
各种文献中的研究已显示ASS在以下肿瘤中是缺陷性的：
表1：ASS缺陷性肿瘤
因此，本文中特定地涵盖了对这些ASS缺陷性癌症的治疗，其使用单独的ADI-PEG20或与其它治疗组合。
本发明还提供治疗患者中癌症、减轻其症状或抑制其进展的方法，包括对该患者施用如本文中描述的包含ADI(例如ADI-PEG，特别是ADI-PEG20)的组合物与自体吞噬抑制剂的组合。在一个实施方案中，本发明提供用于治疗患者中癌症的方法，包括对该患者施用治疗有效量的如本文中描述的包含ADI的组合物与自体吞噬抑制剂的组合，其中所述癌症是胰腺癌或小细胞肺癌。
在某些实施方案中，本发明提供治疗方法，其中如本文中描述的包含ADI的组合物的施用消耗血浆中的精氨酸达至少1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月或更长。
实施例
实施例1
精氨酸脱亚氨酶降低精氨基琥珀酸合酶缺陷性急性髓细胞性白血病细胞的生存力(VIABILITY)
急性髓细胞性白血病(AML)是成人中最常见的白血病和儿童中第二常见的白血病，其消耗显著份额的医疗保健成本，每年仅在US就有1万例诊断。以天冬酰胺酶形式的基于酶的疗法已将急性淋巴母细胞性白血病的治疗革命化，且在利用AML中类似的、易处理的代谢缺陷中的兴趣不断增加。由于针对精氨酸生成的限速酶精氨基琥珀酸合成酶(ASS)的缺陷，精氨酸营养缺陷型肿瘤易受降解精氨酸的酶的影响。
在本实施例中，使用AML细胞系和原发性AML样品确定了ASS阴性是否预测聚乙二醇化的精氨酸脱亚氨酶(ADI-PEG20)的功效。ASS蛋白的缺乏在7种白血病细胞系中的3种(K562、Kasumi和KG-1)和来自患有细胞遗传学正常和异常核型AML患者的所有9份样品中得到鉴定。ASS启动子的甲基化与ASS mRNA的降低水平和ASS表达的缺乏相关。来自患有AML患者的骨髓环钻(trephine)通过免疫组织化学揭示了87%(46/53)样品中ASS蛋白的缺乏，其指示可将ASS表达用作体内对ADI-PEG20应答的生物标志物。在具有易位t(15;17)的急性早幼粒细胞白血病中注意到升高水平的ASS mRNA和可检测的ASS蛋白表达。
显著地，ADI-PEG20降低ASS阴性AML系的生存力，而ASS阳性对照系Fujioka和U937对于药物诱导的精氨酸消除为抗性的。已鉴定NOD/SCID小鼠中良好嫁接的原发性ASS阴性AML样品，并且已开始了使用此原发性AML异种移植模型对ADI-PEG20功效的研究。基于本文中描述的结果和精氨酸消除在人中的具有低毒性的潜在功效，已在患有复发AML的患者中计划ADI-PEG20的II期试验。
实施例2
对自体吞噬的抑制增加精氨酸脱亚氨酶诱导的精氨基琥珀酸合酶缺陷性胰腺腺癌细胞的细胞死亡
自体吞噬的作用及其对细胞死亡的贡献是有争议的。据假设，自体吞噬在精氨酸消除背景中是保护性的，且通过羟基氯喹(ChQ)对自体吞噬的抑制将增加细胞死亡。
在体外和体内单独地或在ChQ存在下用聚乙二醇化的精氨酸脱亚氨酶(ADI-PEG)处理人胰腺癌细胞系MIA-PaCa2。细胞死亡由确定亚G1DNA含量的碘化丙啶(PI)-FACS测量，且细胞凋亡由膜联蛋白V-PI流式细胞术评估。对胱天蛋白酶3的切割由western印迹和ELISA评估。通过由western印迹和ELISA评估LC3和核孔蛋白(nucleoporin)p62(p62)的表达水平来测量自体吞噬。
进行体内实验，即在无胸腺小鼠中生成皮下异种移植物，接着腹膜内注射PBS、ADI-PEG、ChQ或ADI-PEG与ChQ的组合。在杀死后，取出肿瘤用于分析。通过western印迹分析肿瘤裂解物中的胱天蛋白酶3和p62。还实施针对激活的胱天蛋白酶3和DNA片段化(TUNEL)的免疫组织化学染色测定法。
为了确定ADI是否以胱天蛋白酶依赖性方式诱导细胞凋亡和自体吞噬，将细胞与ADI-PEG或ADI-PEG与ZVAD-fmk(一种泛胱天蛋白酶抑制剂)的组合温育。如图2A中显示的，与ADI-PEG温育增加亚G0/G1中的细胞数，且此效应是用与泛胱天蛋白酶抑制剂ZVAD-fmk共温育可逆转的。在体外将胰腺癌细胞与ADI-PEG(0.3μg/mL)温育72小时诱导膜联蛋白V去极化(另一种细胞凋亡指示物)(图2B)。进一步显示在72小时时ADI以剂量依赖性方式诱导胱天蛋白酶切割和LC3B与PE缀合。这些结果指示ADI在体外诱导胱天蛋白酶依赖性细胞凋亡和自体吞噬。
为了确定对自体吞噬的抑制是否增强ADI诱导的细胞凋亡，有或无ChQ(5μM)地，将细胞与ADI-PEG(0.3μg/mL)一起培养72小时。Western印迹分析揭示通过ADI对细胞凋亡的诱导，如由胱天蛋白酶3切割测量的(图3)。p62、LC3B-I和LC3B-II的水平由western印迹分析测量以检查自体吞噬通量。ChQ的添加减小自体吞噬通量，如由p62水平中的增加以及LC3B-I和LC3B-II两者积累的增加所显示的(图3)。这些结果表明ChQ在体外增强了ADI诱导的细胞凋亡和抑制自体吞噬通量。
为了检查ChQ在与ADI组合使用时是否改变凋亡或非凋亡性细胞死亡的量，将细胞与单独的ADI-PEG或ADI-PEG与ChQ的组合温育。向细胞培养物添加ChQ导致亚G0/G1中细胞百分数的增加(图4B)。相比之下，与ADI-PEG以及与ADI-PEG和ChQ温育的培养物显示类似的膜联蛋白V阳性细胞百分数(图4A)。因此，这些结果指示ChQ增强体外非凋亡性细胞死亡。
为了评估ChQ对ADI依赖性肿瘤生长抑制的影响，在无胸腺小鼠中建立MIA PaCa-2的皮下异种移植物。然后，将小鼠用PBS、ADI-PEG、ChQ或ADI-PEG+ChQ处理达7周。每周测量肿瘤体积两次。如图5中显示的，用ADI-PEG+ChQ处理的小鼠相比于仅用ADI-PEG处理的小鼠具有显著更小的肿瘤体积。在处死后，将肿瘤保存在10%福尔马林中并针对细胞凋亡标志物包括活性胱天蛋白酶3、增加的p62和DNA切割染色(图6)。这些结果证明，ADI-PEG与ChQ的组合展现出对肿瘤生长的协同性抑制。
总之，精氨酸消除诱导ASS缺陷性细胞系中的自体吞噬和细胞死亡。显示对于胰腺腺癌瘤细胞，自体吞噬在精氨酸消除中起着保护性作用，且通过羟基氯喹使自体吞噬失活在体内导致增强的肿瘤抑制。
实施例3
精氨酸脱亚氨酶抑制精氨基琥珀酸合酶缺陷性小细胞肺癌肿瘤生长
小细胞肺癌(SCLC)的特征在于对化疗的较强起始应答，尽管大多数患者继续复发(Dowell,Am J med Sci339(1):68-76,2010;Rodriguez和Lilenbaum,Curr Oncol Rep12(5):327-334,2010)。在一线化疗失败的那些患者中，对二线治疗应答的可能性剩有约10%，且这些患者中的总体存活仅为3-4个月。另外，目前的治疗缺乏肿瘤特异性且导致大量毒性，因此可能将治疗物的施用限制在最大有效剂量之下(Demedts等,Eur Respir J35(1):202-215,2010;Dowell,Am J med Sci339(1):68-76,2010;Rodriguez和Lilenbaum,CurrOncol Rep12(5):327-334,2010)。这一情况凸显了对继续开发出具有高治疗指标的有效抗癌剂的需要。
本实施例描述了SCLC中精氨酸营养缺陷的程度和ADI-PEG20精氨酸疗法在此疾病中的有效性。
细胞系、抗体和化学剂
从Ludwig Institute for Cancer Research,New York Branch在MemorialSloan-Kettering Cancer Center(MSKCC)的细胞库中获得一组10份SCLC。细胞或者在MSKCC建立，或者购自美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)(ATCC;Manassas,VA,USA)。将细胞在补充有10%v/v胎牛血清、5%w/v青霉素/链霉素(青霉素G5000单位ml-1每链霉素硫酸盐5000mgml-1)和1%L-谷氨酰胺的RPMI-1640培养基中生长。通过western印迹使用抗ASS抗体(Clone25,BD Biosciences,San Jose,CA,USA)来评估精氨基琥珀酸合成酶(ASS)的细胞表达。依照制造商用法说明书使用LC3B(Cell Signaling,Danvers,MA,USA)、活性胱天蛋白酶3(Cell Signaling)、总胱天蛋白酶3(Invitrogen LifeTechnologies,Carlsbad,CA,USA)和肌动蛋白(GeneTex,Irvine,CA,USA)。盐酸拓扑替康(Topotecan hydrochloride)自Axxora(San Diego,CA,USA)获得且氯喹自Sigma-Aldrich(St Louis,MO,USA)获得。
免疫组织化学
使用抗ASS抗体195-21-1(LICR,New York,NY,USA)将肿瘤和正常组织染色，如Jungbluth等(Mod Pathol23(Suppl1):387A,2010)中详述的。
Western印迹分析
在RIPA裂解缓冲液(Tris-HCl50mM,0.05%SDS,0.5%脱氧胆酸钠,NaCl150mM,EDTA5mM)加上蛋白酶抑制剂混合物缓冲液(Roche Applied Science,Indianapolis,IN,USA)中制备SCLC细胞系的全细胞裂解物。使用Pierce BCA蛋白测定法(Thermo FisherScientific,Rockford,IL,USA)确定蛋白量，并通过SDS-PAGE使用4-12%凝胶(NuPAGE,Invitrogen Life Technologies)解析相等量的蛋白质。将蛋白质转移至PVDF膜(Millipore,Billerica,MA,USA)，用5%BSA封闭并用适宜抗体在4℃过夜探测。在清洗后，将膜用适宜的二抗探测，接着使用ECL试剂(Perkin-Elmer,Fremont CA,USA)使蛋白质最终显影。
定量实时PCR
对于RNA提取，将细胞沉淀溶解于600μl TRI试剂溶液(Ambion,Austin,TX,USA)中，然后添加60μl溴氯丙烷(bromochloropane)。接着向管添加约两滴最佳切割温度化合物(Miles Inc.,Elkhart,IN,USA)，并涡旋该混合物，然后在RT留置2min。在14,000r.p.m.离心10min后，将上清液移至新管，其中添加等体积的100%异丙醇以沉淀RNA。在14,000r.p.m.离心后，将RNA沉淀在75%乙醇中清洗并在重悬于50μl温水之前再次离心。RNA浓度使用纳米分光光度计(nanophotometer)(Implen Inc.,Westlake Village,CA,USA)测定。
对于cDNA的扩增，将1.5μg RNA添加至cDNA反应混合物，其包含总体积20μl中10X反应缓冲液(Qiagen,Valencia,CA,USA)、5mM dNTP酶(Qiagen)、Oligo DT(Qiagen)、逆转录酶(Invitrogen Life Technologies)和RNAse Out(Invitrogen)。对于定量实时(qRT)-PCR反应，将1.5μl cDNA与反应混合物混合，该反应混合物含有5μl SYBRGreen(Invitrogen)、0.02μl Rox、0.2μl引物和水达总反应体积10μl。对于ASS，引物为F：5’-TTTAAGCAGACTAAGGGG-3’(SEQ ID NO:3)和R：5’-CCAT CCCAGGTTATAAGCACA-3’(SEQ ID NO:4)。使用7500Fast Real-Time PCR系统(Applied Biosystems,Carlsbad,CA,USA)实施qRT-PCR分析，其中将GAPDH用于表达的标准化。使用等式2(-△△CT)测定基因表达的相对定量(靶RNA的相对量)。
增殖测定法
为了评估ADI-PEG20对粘附细胞的抗增殖效果，将细胞以每孔2x103个细胞的密度在组织培养96微孔板中铺板并允许过夜粘附。次日，将细胞用0至10mIU ml-1范围的ADI-PEG20(DesigneRx Pharmaceuticals,Vacaville,CA,USA,Polaris Group,San Diego,CA,USA的子公司)处理。在温育120h后，使用(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧基甲氧基苯基)-2-(4-磺苯基)-2H-四唑盐)(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium)(MTS,CellTiter96AQueousOne Solution,Promega,Madison,WI,USA)依照制造商方案确定细胞生存力。将20微升的MTS试剂添加至合适对照和测定孔，接着将板在37℃温育2小时，并读出490nm处的吸光度。通过减去背景MTS吸光度确定每一处理的绝对吸光度，并计算均值和标准偏差。使用MTS测定评估自体吞噬抑制剂氯喹(Sigma)对细胞增殖的影响。
为了评估ADI-PEG20在非粘附细胞中的活性，将细胞以每孔1x105个细胞的密度在组织培养24孔板中铺板。然后加入含有ADI-PEG20至终浓度范围为0-10mIU ml-1的另外培养基。为了测量与ADI-PEG20温育120h后增殖中的变化，将细胞收集、清洗并裂解于RIPA缓冲液。然后使用BSA蛋白测定法作为总细胞数的量度来确定每一处理的总蛋白。所有处理均一式三份地实施。
用于亚G1染色的碘化丙啶染色
通过FACS测量用碘化丙啶染色细胞的细胞凋亡，如由Riccardi等(Riccardi和Nicoletti,Nat Protoc1(3):1458-1461,2006)详述的。将细胞铺板于24孔板中并用ADI-PEG20处理120h。然后将细胞收获，清洗并固定于70%乙醇。接着使用含10μgml-1无DNAse的RNAse A(Sigma-Aldrich)的20μg ml-1碘化丙啶对DNA染色。然后在BD FACSCalibur(BDBiosciences)上读取细胞并使用Flow Jo Software(Tree Star,Ashland,OR,USA)分析。
对ASS的小干扰RNA下调
为了进一步评估应答ADI-PEG20处理的细胞ASS表达的重要性，通过使用ASS特异性siRNA将ASS的表达沉默。针对ASS编码区的小干扰RNA构建体自Integrated DNAtechnologies(IDT,Coralville,IA,USA)获得。仅选择没有任何其它转录本匹配的siRNA构建体用于进一步实验。
将精氨基琥珀酸合成酶阳性SW1222以每个皿6x105个细胞的密度在8ml培养基中铺板于100mm组织培养皿，并允许过夜粘附。对于转染，将10μl10μM ASS siRNA添加至990μlOpti-MEM培养基，并将20μl Lipofectamine2000试剂稀释于980μl Opti-MEM培养基(Invitrogen Life Technologies)。将这些混合物在RT温育5分钟，接着混合并再在RT温育20分钟。然后，将该转染混合物添加至细胞，并在37℃温育24小时。此时，将经转染细胞的制备物从培养皿提起，并铺板于96孔板以评估ADI-PEG20对经转染细胞生长的影响。将另外的细胞再温育72h，接着处理用于PCR和western印迹分析。
精氨酸脱亚氨酶-PEG20体内功效研究
发现ASS阴性的SCLC SK-LC-13为致肿瘤性的，并在随后将其用于测定ADI-PEG20的体内功效。还在携带ASS阳性的NCI-H69SCLC异种移植物的小鼠中评估ADI-PEG20的活性。小细胞肺癌异种移植物建立于雌性BALB/c裸鼠，3-4周龄，称重为～20g(Charles RiverLabs,Wilmington,MA,USA)。为了建立肿瘤，将培养基中10x106个细胞以1:1与MatrigelHigh Concentration(BD Biosciences)混合，并在小鼠的腹部区域皮下注射。定期测量肿瘤生长，并使用公式(TV=(长x宽2)/2)计算肿瘤体积。所有的动物研究均由MSKCCInstitutional Animal Care and Use Committee批准。当肿瘤达到约1,000mm3的体积时，将小鼠处死。
在携带中等或较大SK-LC-13SCLC异种移植物的小鼠中同时评估ADI-PEG20的抗肿瘤功效。在第一项研究中，一旦肿瘤达到125mm3的平均大小就启动治疗。在较大异种移植物研究中，一旦肿瘤达到500mm3的平均大小就启动治疗。精氨酸脱亚氨酶-PEG20以每只动物1、2和5IU的剂量每5天施用一次达20天(5剂)。为了评估持续给药的效果，在所有剂量水平的其它组(n=5)接受每5天ADI-PEG20的持续施用直至肿瘤进展到1,000mm3大小限制。另外，在携带ASS阳性NCI-H69异种移植物的小鼠中评估ADI-PEG的功效。这里，一旦肿瘤达到150mm3的平均大小，小鼠就接受5剂2IU ADI-PEG20达20天。在所有研究中通过腹膜内注射施用精氨酸脱亚氨酶-PEG20。在这些研究中使用的ADI-PEG20的比活性为9IU mg-1蛋白。如此，1IU ADI-PEG20每20g小鼠等同于160IU m-2。
血清精氨酸和瓜氨酸的测量
为了确定ADI-PEG20治疗对系统性精氨酸水平的影响，使用高效液相层析(HPLC)分析小鼠血清。L-精氨酸和L-瓜氨酸用在39℃反应温度的Pickering LaboratoriesPCX5200柱后衍生化仪器(post-column derivatization instrument)(PickeringLaboratories,Mountain View,CA,USA)和荧光检测器解析。所有试剂，包括缓冲液和柱，均如Pickering Laboratories建议的使用。总ADI-PEG20水平通过ELISA测量，如先前描述的(Holtsberg等,J Control Release80(1-3):259-271,2002)。
统计学分析
通过比较对照和治疗组的均值来评估ADI-PEG20治疗在体内的功效，即在对照组终止时使用GraphPad Prism(Version5.0,GraphPad Software Inc.,La Jolla,CA,USA)进行不配对双尾t检验。使用95%置信水平，如果P<0.05则均值肿瘤体积称为显著不同的。
结果
SCLC经常缺乏ASS表达
由于ASS表达的缺乏通常与对ADI的敏感性有关，在人SCLC肿瘤中评估其表达。如图7C中显示的，对人SCLC肿瘤的初始免疫组化(IHC)分析揭示，一些SCLC具有几乎全部的ASS表达缺乏。此初始分析中约45%(16中有7)的肿瘤显示极小或没有ASS表达。相反，ASS的鲁棒(robust)表达在正常组织如皮肤(图7A)和其它癌症如结肠癌瘤中(图7B；Jungbluth等,Mod Pathol23(Suppl1):387A,2010)是明显的。
由于初始免疫组化分析已显示SCLC人肿瘤中丧失损失ASS表达，评估一组SCLC细胞系中ASS的表达状态。Western印迹分析揭示，测试的SCLC细胞系中10个有5个(50%)在蛋白质水平缺乏ASS的显著表达(图7D)。使用Clone25和195-21-1抗ASS抗体通过western免疫印迹检测的ASS的细胞表达是类似的(数据未显示)。使用qRT-PCR对mRNA水平的分析显示ASS mRNA与蛋白质表达水平之间的普遍相关(图7E)。
精氨酸脱亚氨酶-PEG20抑制ASS阴性SCLC细胞系的体外增殖
在ASS阳性SCLC细胞和那些缺乏该酶表达的细胞中评估ADI-PEG20对体外细胞增殖的影响。这些实验包括具有粘附和非粘附生长组织培养特征的细胞。在粘附性ASS阴性SCLC细胞系SK-LC-13和SW1271中发现增殖中明显的剂量依赖性降低。在粘附性ASS阳性结肠癌瘤细胞系SW1222的增长上没有明显影响(图8A)。对于非粘附性细胞，ASS阳性细胞显示出对ADI-PEG20的抗增殖作用的几乎全部抗性，而在ASS缺陷性细胞中在ADI-PEG20处理后再次观察到增殖中的相对降低(图8B)。由于ADI-PEG20敏感性细胞系SK-LC-13确定为致肿瘤性的，因此将其选定为体外和体内后期实验的模式细胞系。
精氨酸脱亚氨酶-PEG20诱导自体吞噬和胱天蛋白酶非依赖性细胞凋亡
与更通常的营养饥饿类似，观察到ADI对细胞内精氨酸的消耗诱导代谢应激和随后的细胞自体吞噬(Kim等,Cancer Res69(2):700-708,2009;Savaraj等,Curr Mol Med10(4):405-412,2010)。针对自体吞噬相关蛋白LC3-II形成的测定法评估了用ADI-PEG20处理是否能诱导SCLC中的细胞自体吞噬。尽管在SK-LC-13中观察到LC3-II表达的一些基底表达，但用ADI-PEG20处理导致蛋白质可检测细胞水平的明显升高(图9E)。已知氯喹是破坏正常溶酶体功能，且如此导致LC3-II细胞水平的升高的自体吞噬的抑制剂。随后，作为阳性对照用氯喹处理的细胞显示非常鲁棒的LC3-II表达。将细胞用ADI-PEG20和氯喹组合处理导致生存力相对于单独处理的较小但显著(P=0.008)的降低，这表明对自体吞噬的抑制可以增强ADI-PEG20的功效(图14)。
为了确定ADI-PEG20抗增殖效果的可能机制，实施通过亚G1DNA含量对细胞凋亡的FACS分析。在实施分析前将细胞处理72小时。在未经处理的细胞中几乎检测不到细胞凋亡，而观察到用作阳性对照的25nM拓扑替康导致约45%的SK-LC-13细胞中的凋亡(图9A和B)。尽管不如拓扑替康有效，但与1.0和10mIU ml-1ADI-PEG20温育导致分别在～6%和16%的细胞中诱导细胞凋亡(图9C和D)。尽管细胞凋亡通过亚-G1DNA含量是明显的，但在用ADI-PEG20处理细胞后与用拓扑替康处理的细胞相对未观察到胱天蛋白酶激活(图9F)。
ASS表达的沉默诱导对ADI-PEG20的敏感性
在用ASS特异性siRNA转染后，用Real Time PCR评估ASS阳性细胞系中ASS的相对表达。如图10A显示的，用ASS siRNA转染在72h温育后将ASS mRNA水平降低～90%。同时的western印迹分析显示在用ASS特异性siRNA处理的细胞中ASS蛋白表达水平中的鲁棒的降低(图10B)。然而，一些ASS仍在这些条件下表达。使用MTS测定法对细胞生存力的检查显示，用ASS siRNA处理的ASS阳性细胞变为对ADI-PEG20诱导的精氨酸消除敏感的，从而导致降低的细胞生存力，而在对照或用混杂siRNA处理的细胞中未观察到生存力中的降低(图10C)。
精氨酸脱亚氨酶-PEG20抑制SCLC异种移植物的生长
在携带人SCLC异种移植物的BALB/c裸鼠中评估体内用ADI-PEG20系统性处理的抗肿瘤功效。在具有约125mm3的已建立肿瘤的小鼠和在治疗开始时携带更大(～500mm3)肿瘤的小鼠中实施分别的研究。在携带中等大小SK-LC-13异种移植物(124.6±37.1mm3)的小鼠中，相对于对照小鼠，ADI-PEG20在肿瘤生长中产生显著的且剂量依赖性的降低(图11A-C)。由于过大的肿瘤体积，在第33天将对照小鼠处死，彼时对照小鼠的均值肿瘤体积显著大于在用ADI-PEG20处理的小鼠组中的，而与剂量或治疗方案无关(对于所有治疗组P>0.0001；图11D)。在研究完成时，每5天用5IU ADI-PEG20的持续给药处理的肿瘤显著小于每5天给药仅达20天的那些肿瘤(P=0.0063)。然而，该效果未在1和2IU剂量水平观察到，因为肿瘤生长在接受短程给药和持续给药的组中以相当的速率进展。随后，接受短程和持续ADI-PEG20给药的小鼠的均值肿瘤体积在相应的短程给药组终止时由于过大肿瘤体积而没有显著差异(1IU:P=0.251;2IU:P=0.084)。用ADI-PEG20处理ASS阳性的NCI-H69SCLC异种移植物未对肿瘤生长产生任何影响(图12)。
对在ADI-PEG20的初始给药之前(第0天)、期间(第12天)和之后(第40天)来自这些小鼠的血清的分析揭示，ADI-PEG20血清水平是剂量依赖性的(图11E)。在仅施用ADI-PEG20至第20天的小鼠中，到第40天时观察到酶的血清水平回到基线水平，这与ADI-PEG20在小鼠中的～7天半寿期是一致的(Ensor等,Cancer Res62(19):5443-5450,2002;Holtsberg等,JControl Release80(1-3):259-271,2002)。而且，此治疗的短时程如预期地暂时消耗血清精氨酸，其在无另外ADI-PEG20给药时在最后一次给药后20天(第40天)回复到正常水平(图11F)。瓜氨酸水平以对精氨酸剂量依赖性关系升高，ADI-PEG20的短时程与瓜氨酸水平回到基线相关(图11G)。瓜氨酸水平随着在1IU水平的延长给药升高，这与系统性精氨酸剩余且代谢为瓜氨酸一致，尽管精氨酸血清水平低于检测限。对于在2和5IU剂量水平的持续给药在瓜氨酸水平几乎观察不到增加。
在ADI-PEG20的体内第二项研究中，当肿瘤生长至473.4±161.0mm3的相对较大尺寸时开始治疗。再次观察到对肿瘤生长的剂量依赖性抑制(图13A-C)，尽管其没有在携带更小异种移植物的动物中观察到的显著。在此研究第32天对照分组终止时比较肿瘤体积(图13D)。用1IU ADI-PEG20持续治疗能显著降低相对于对照小鼠的肿瘤体积(P=0.007)，而短时程治疗不导致对肿瘤大小的统计学显著降低(P=0.07)。而且，观察到持续给药相对于短时程治疗导致在肿瘤体积中的中等显著(P=0.26)降低，如在第39天短治疗组终止时评估的。在更高剂量的ADI-PEG20，在2IU水平的短程(P=0.004)和持续(P=0.0007)施用两者，而且在5IU剂量水平的短程(P=0.0003)和持续(P=0.0001)方案两者中相对于未经处理的对照观察到肿瘤体积的显著降低。然而，持续给药并未显著改进在这些剂量处相对于短时程治疗的应答。
总之，本实施例证明较大比例的SCLC缺乏ASS的表达，并且ASS阴性SCLC对于精氨酸消除疗法是敏感的。尽管ASS缺陷的频率不等于如在黑色素瘤中报告的表达的几乎全部缺乏，但美国每年报告的SCLC近30,000个新病例有50%可能易受精氨酸消除疗法影响。
使用粘附和非粘附ASS缺陷性SCLC细胞系的体外研究证明，ADI-PEG20导致剂量依赖性抗增殖功效。本文中描述的结果指示，ASS蛋白的丧失在其它方面相同的细胞中与ADI-PEG20的抗增殖效果有关，并进一步验证了在具不同ASS表达的SCLC癌症中观察到的相对敏感性。由于对细胞保护性自体吞噬的抑制可以加强ADI-PEG20的抗增殖效果，在体外评估ADI-PEG20与25mM自体吞噬抑制剂氯喹组合的抗增殖效果(Kim等,Cancer Res69(2):700-708,2009)。然而，该组合仅诱导SCLC细胞中ADI-PEG20的抗增殖作用的中等(尽管显著(P=0.008))的增加(图14)。用ADI-PEG20处理SCLC导致用碘化丙啶染色后亚-G1峰中细胞群体的增加，表明这些细胞经历细胞凋亡。Western印迹分析揭示，ADI-PEG20不导致SK-LC-13SCLC细胞中的胱天蛋白酶激活。不希望受理论束缚的，由ADI-PEG20在SCLC细胞中诱导的对精氨酸消除的总体细胞应答似乎经由一种复杂机制操作，该机制牵涉在自体吞噬的诱导中看到的初始代谢应答，随后是独立于胱天蛋白酶的细胞死亡。
小鼠中的体内研究揭示，SK-LC-13异种移植物的生长被ADI-PEG20以剂量依赖性方式消除。在每动物给药1、2和5IU剂量观察到显著的抗肿瘤活性。重要地，尽管在携带更小(～120mm3)已建立肿瘤的小鼠中观察到更有力的对肿瘤生长的抑制，但ADI-PEG20在携带较大(～500mm3)异种移植物的小鼠中也显示显著的抗肿瘤功效。尽管难以与其它肿瘤类型直接比较，但对ADI-PEG20在SCLC异种移植物中所观察到的抗肿瘤功效是相似的且可能优于使用相等剂量的ADI-PEG20在不同的肿瘤类型(包括肾癌和前列腺癌异种移植物)中所观察到的。
实施例4
精氨酸脱亚氨酶抑制ASS缺陷性转移性肉瘤的生长
肉瘤是一类罕见的肿瘤，其对目前临床方案的不良应答代表了在肿瘤学中的一项重要的未满足需求。对肉瘤生长的生物学和代谢的更好的治疗理解是开发新的治疗学以治疗患有该类肿瘤的患者所必需的。精氨基琥珀酸合酶(ASS)是将瓜氨酸转化成精氨酸中的限速酶。当不表达ASS时，精氨酸变成必须从饮食递送到癌症细胞的必需氨基酸。
对代表肉瘤45个亚型的701份患者标本的免疫组化分析显示，ASS在超过85%的肉瘤(701份患者样品中有619)中不表达。这表明肉瘤对于使用聚乙二醇化的精氨酸脱亚氨酶(ADI-PEG20)的精氨酸消除疗法是敏感的。
用ADI-PEG20治疗一组平滑肌肉瘤、骨肉瘤、泡状软组织肉瘤(alveolar softpart sarcoma)、恶性外周神经鞘肿瘤(peripheral nerve sheath tumor)和尤因(Ewing’s)肉瘤细胞系在ASS表达较低时导致细胞周期停滞而不是细胞凋亡，而在ASS较高时骨肉瘤细胞系MG63继续分裂。在肉瘤细胞系中的应答依赖于ASS表达，如骨肉瘤、软组织肉瘤、复杂细胞遗传肉瘤和易位依赖性肉瘤在用ADI-PEG20处理时均展现出细胞周期抑制。用ADI-PEG20处理的细胞系的IC50在具有较低ASS表达的敏感细胞系中的范围为0.02-0.1μg/mL。
用ADI-PEG20对缺乏ASS的肉瘤的处理导致自体吞噬。通过ADI-PEG20在ASS缺陷性肉瘤中对精氨酸的消耗在与氯喹(一种自体吞噬抑制剂)组合时导致细胞死亡，如通过膜联蛋白V测量的。
将ASS低表达骨肉瘤细胞系MNNG异种移植到裸鼠中，接着用ADI-PEG20处理展现出相比于用PBS处理的对照的显著变缓的肿瘤生长速率。
对于上文实施例，应当注意在肾细胞癌瘤异种移植模型中，观察到ADI-PEG20加上自体吞噬抑制剂(羟基氯喹)不产生加合效应。因此，ADI-PEG20加上自体吞噬抑制剂在任何特定癌症中的效果是不可预测的，进一步凸显了本公开的令人惊讶的效果。
实施例6
与顺铂组合的ADI-PEG20显著增强体内抗肿瘤活性
还进行异种移植测试来评估ADI-PEG20与顺铂组合的体内功效。在对裸鼠中两种不同的人黑色素瘤异种移植模型的治疗中，作为单剂或与顺铂组合地，体内评估ADI-PEG20的治疗功效。顺铂剂量为6mg/kg或18mg/m2(Km=3)，每6天腹膜内(IP)给药，一共3剂。此相同剂量外推至人将是40mg/m2(Km=40)，或3周内总剂量120mg/m2。ADI-PEG20每6天以53.3IU/kgIM给药，一共4剂。此相同ADI-PEG20剂量外推至人将是160IU/m2或18mg/m2。如图15中显示的，用ADI-PEG20和顺铂组合治疗显示相比于任一单剂显著增强的活性。如此，异种移植数据显示ADI-PEG20与顺铂的组合导致ASS缺陷性黑色素瘤细胞中增强的肿瘤活性，即使在有限时间段内施用顺铂的情况下。
实施例7
与多西他赛组合的ADI-PEG20的I期人研究
启动一项单中心的开放标签的I期剂量扩大研究(single-center,open-label,phase I dose escalation study)来确定每3周对患有晚期实体肿瘤的患者静脉内(IV)施用的多西他赛组合的ADI-PEG20的最大可耐受剂量和剂量限制毒性(MTD和DLT)。患者以扩大剂量每周肌内(IM)接受ADI-PEG20，继之以1小时后(第1天)的多西他赛75mg/m2IV。周期长为21天。由始至终持续ADI-PEG20作为每周IM注射。剂量扩大使用标准3+3设计进行。当最后一位受试者进入先前分组后21天，进入每个新剂量水平分组。18mg/m2约等同于160IU/m2。
给药方案汇总于下表2。
表2：多西他赛+ADI-PEG20给药方案
剂量水平 多西他赛(mg/m2) ADI-PEG20(mg/m2)
-1 75 2.2
1 75 4.5
2 75 9
3 75 18
4 75 36
*试验将在水平1开始且如果观察到DLT将降低至水平-1。
治疗方案汇总于下表3。
表3：治疗方案
1：1个周期等于21天
2：多西他赛IV施用于每周期的第1天(30分钟内输注)
3：ADI-PEG20每周一次肌内给药
来自此研究的初始结果汇总于下表4。具体地，治疗至今的可获得信息的8位受试者中，客观临床益处结果如下：
表4：对研究结果的汇总
肿瘤 最佳应答 治疗上持续时间
肺-非小细胞 稳定疾病 33周
肺-非小细胞 稳定疾病 12周
舌(头和颈) 稳定疾病 12周
舌(头和颈) 部分应答(待确认) 12周
肿瘤 最佳应答 治疗上持续时间
前列腺 稳定疾病 8周
如此，迄今招募的患者8位中有6位(75%)具有临床益处(稳定疾病+部分应答+完全应答)。
本研究中使用的剂量是低剂量，如已在3期肝细胞癌瘤研究中使用的18mg/m2，和已在黑色素瘤中显示有效性的36mg/m2。因此，鉴于甚至在此低剂量的阳性应答，此早期数据是相当令人鼓舞的，并且表明ADI-PEG20与多西他赛组合是一种有效的癌症治疗。具体地，多西他赛在美国被批准用于治疗乳腺癌、非小细胞肺癌、激素难治性前列腺癌、胃腺癌瘤以及头和颈癌的鳞状细胞癌瘤中的肿瘤。此外，其已用于治疗肉瘤，特别是子宫平滑肌肉瘤和变种癌(over variant cancer)。如此，用多西他赛与ADI-PEG20的组合来治疗这些癌症特定地涵盖在本文中。
实施例8
ADI-PEG20加雷帕霉素在肾细胞癌瘤的体内异种移植模型中显示协同效应
使用小鼠异种移植模型来研究单独的和与雷帕霉素组合的ADI-PEG20对治疗肾细胞癌瘤的效果。
在携带Caki-1(ATCC No.HTB-46TM)异种移植物的小鼠中评估ADI-PEG20活性。肾细胞癌瘤Caki-1异种移植物建立于雌性BALB/c裸鼠，3–4周龄，体重为20g(SLAC,Shanghai,China)。为了建立该肿瘤，将培养基中5×106个细胞以1:1与Matrigel HighConcentration(BD Biosciences)混合，并在小鼠的腹部区域皮下注射。定期测量肿瘤生长，并使用公式(TV=(长x宽2)/2)计算肿瘤体积。当肿瘤达到约125mm3的体积时，将ADI-PEG20以160、320和640IU/m2的剂量水平每周一次通过肌内注射施用达4周。每个研究组具有9只小鼠。当肿瘤达到约1,100mm3的体积时，将小鼠处死。结果指示ADI-PEG20以剂量依赖性方式抑制肿瘤生长。当使用640IU/m2时，实现超过80%的肿瘤抑制。
在一项另外的实验中，在携带Caki-1异种移植物的小鼠中评估作为单剂或与雷帕霉素组合的ADI-PEG20的活性。肾细胞癌瘤异种移植物建立于雌性BALB/c裸鼠，3–4周龄，体重为20g(SLAC,Shanghai,China)。为了建立该肿瘤，将培养基中5×106个细胞以1:1与Matrigel High Concentration(BD Biosciences)混合，并在小鼠的腹部区域皮下注射。定期测量肿瘤生长，并使用公式(TV=(长x宽2)/2)计算肿瘤体积。当Caki-1异种移植物达到约125mm3的体积时，将小鼠随机分成6组，每组8只动物，并依照以下方案启动治疗：组1接受每周一次地通过肌内注射40μL PBS达4周，组2接受每周一次地通过肌内注射ADI-PEG20(320IU/m2)达4剂，组3接受每日一次地通过i.p.注射雷帕霉素(0.5mg/kg)达21天，组4接受每日一次地通过i.p.注射雷帕霉素(0.2mg/kg)达21天，组5接受每周一次ADI-PEG20(320IU/m2)达4周与每日一次雷帕霉素(0.5mg/kg)达21天的组合，组6接受每周一次ADI-PEG20(320IU/m2)达4周与每日一次雷帕霉素(0.2mg/kg)达21天的组合。当肿瘤达到约2500mm3的体积时，将小鼠处死。
如图16中显示的，结果指示ADI-PEG20和雷帕霉素组合与单独的ADI-PEG20或雷帕霉素相比协同性增强肿瘤抑制。
对于不同癌症类型，文献中的数据关于ADI-PEG20与自体吞噬抑制剂或与mTOR抑制剂如雷帕霉素组合的效果是不一致的。因此，不可能预测ADI-PEG20与雷帕霉素组合会在抑制肾细胞癌瘤肿瘤中协同性作用。这些结果表明技术人员不能预测与ADI-PEG20的任何特定组合对于治疗癌症(特别是对于肾细胞癌瘤)将是有效的。
上文描述的各个实施方案可以组合以提供别的实施方案。本说明书中陈述的和/或在申请数据表中列出的所有美国专利、美国专利申请公开、美国专利申请、外国专利、外国专利申请和非专利公开通过全文提述并入本文中。如果需要采用各专利、申请和公开的概念以提供别的实施方案，可以修改所述实施方案的方面。
可以根据上文详述的说明对实施方案进行这些和其它变化。一般而言，在所附权利要求中，使用的术语不应解释为将权利要求限定到本说明书和权利要求中披露的特定实施方案，而应理解为包括所有可能的实施方案联同此类权利要求享有权利的全部等同范围。因此，权利要求不受本公开限制。

Claims (20)

1.液体药物组合物在制备用于治疗患者中癌症的药物中的用途，所述癌症展现出降低的精氨基琥珀酸合成酶表达，所述液体药物组合物包含聚乙二醇化的精氨酸脱亚氨酶ADI-PEG，其中所述液体药物组合物是无菌的并且pH为6.6至7.0，所述组合物包含0.0035M组氨酸-HCl至0.35M组氨酸-HCl的组氨酸-HCl，其中所述ADI-PEG是ADI-PEG20，其为用5±1.5个PEG分子修饰的ADI。
2.权利要求1的用途，其中所述组合物包含pH 6.8的0.035M组氨酸-HCl与0.13M氯化钠。
3.权利要求1或2的用途，其中所述药物用于治疗：
(a)胰腺癌、小细胞肺癌(SCLC)、间皮瘤或肝细胞瘤；
(b)组合施用自体吞噬抑制剂的患者，其中所述癌症是胰腺癌、肉瘤或小细胞肺癌；
(c)组合施用顺铂的患者中的黑色素瘤；
(d)组合施用多西他赛的患者中的非小细胞肺癌、头和颈癌或前列腺癌；
(e)组合施用雷帕霉素对患者中的肾细胞癌瘤；或
(f)选自下组的癌症：急性髓细胞性白血病、复发的急性髓细胞性白血病、乳腺癌、卵巢癌、结肠直肠癌、胃癌、胶质瘤、多形性胶质母细胞瘤、非小细胞肺癌(NSCLC)、肾癌、膀胱癌、子宫癌、食道癌、脑癌、头和颈癌、子宫颈癌、睾丸癌和胃癌。
4.权利要求1-3中任一项的用途，其中以每周两次至每2周一次施用所述液体药物组合物。
5.权利要求1-3中任一项的用途，其中每周施用所述液体药物组合物。
6.权利要求1-3中任一项的用途，其中以80IU/m2至650IU/m2的剂量施用所述精氨酸脱亚氨酶。
7.权利要求1-3中任一项的用途，其中以160IU/m2的剂量施用所述精氨酸脱亚氨酶。
8.权利要求1-3中任一项的用途，其中以160IU/m2的剂量施用所述精氨酸脱亚氨酶。
9.权利要求1-3中任一项的用途，其中以160IU/m2至640IU/m2的剂量每周施用精氨酸脱亚氨酶。
10.权利要求1-9中任一项的用途，其中所述降低的精氨基琥珀酸合成酶表达起因于该精氨基琥珀酸合成酶启动子的甲基化或DNA突变或缺失。
11.权利要求10的用途，其中所述癌症是精氨基琥珀酸合成酶阴性的。
12.权利要求1-11中任一项的用途，其中所述治疗在体内抑制NO合成、抑制血管发生、诱导肿瘤细胞的细胞凋亡、或其组合。
13.权利要求1-11中任一项的用途，其中所述治疗导致稳定疾病。
14.权利要求1-11中任一项的用途，其中所述治疗延长所述患者中的无进展存活时间。
15.权利要求1-14中任一项的用途，其中血浆精氨酸消耗至少1个月。
16.权利要求1-14中任一项的用途，其中血浆精氨酸消耗超过2个月。
17.权利要求1-16中任一项的用途，其中所述药物与进一步的化疗剂组合施用。
18.权利要求17的用途，其中所述化疗剂选自下组：环磷酰胺、吉西他滨、顺铂、索拉非尼(sorafenib)、舒尼替尼(sunitinib)和依维莫司(everolimus)。
19.权利要求3的用途，其中所述自体吞噬抑制剂选自下组：氯喹、3-甲基腺嘌呤、羟基氯喹、巴夫洛霉素(bafilomycin)A1、5-氨基-4-咪唑羧酰胺核糖苷(AICAR)、冈田酸(okadaic acid)、N6-巯基嘌呤核糖苷、渥曼青霉素(wortmannin)和长春碱。
20.权利要求3的用途，其中所述精氨酸脱亚氨酶和所述自体吞噬抑制剂协同作用。
CN201280027431.6A 2012-04-04 2012-05-30 用精氨酸脱亚氨酶治疗的方法 Active CN103797025B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201261620368P 2012-04-04 2012-04-04
US61/620,368 2012-04-04
PCT/US2012/039979 WO2013151568A1 (en) 2012-04-04 2012-05-30 Methods of treatment with arginine deiminase

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN103797025A CN103797025A (zh) 2014-05-14
CN103797025B true CN103797025B (zh) 2018-03-23

Family

ID=49300886

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201280027431.6A Active CN103797025B (zh) 2012-04-04 2012-05-30 用精氨酸脱亚氨酶治疗的方法

Country Status (13)

Country Link
US (3) US9731028B2 (zh)
EP (2) EP3782653A1 (zh)
JP (4) JP2014521602A (zh)
KR (1) KR101638226B1 (zh)
CN (1) CN103797025B (zh)
AU (1) AU2012330497B2 (zh)
BR (1) BR112013028365B1 (zh)
CA (1) CA2834083C (zh)
ES (1) ES2828656T3 (zh)
HK (2) HK1197251A1 (zh)
SG (1) SG194641A1 (zh)
TW (3) TW201735943A (zh)
WO (1) WO2013151568A1 (zh)

Families Citing this family (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013022801A1 (en) 2011-08-05 2013-02-14 Forsight Vision4, Inc. Small molecule delivery with implantable therapeutic device
EP2640360A2 (en) 2010-11-19 2013-09-25 Forsight Vision4, Inc. Therapeutic agent formulations for implanted devices
TW201735943A (zh) 2012-04-04 2017-10-16 普拉瑞斯集團 利用精胺酸去亞胺酶之治療方法
EP2968113B8 (en) 2013-03-14 2020-10-28 Forsight Vision4, Inc. Systems for sustained intraocular delivery of low solubility compounds from a port delivery system implant
WO2014151982A2 (en) 2013-03-15 2014-09-25 Polaris Group Arginine deiminase with reduced cross-reactivity toward adi – peg 20 antibodies for cancer treatment
EP3052116B1 (en) * 2013-10-04 2021-05-05 Ann, David K. Arginase i, arginase ii, or adi in combiantion with doxorubicin for use in a treatmnt of a breast cancer
WO2015143006A1 (en) 2014-03-18 2015-09-24 Tdw Group Engineered chimeric pegylated adi and methods of use
CN114106186A (zh) 2014-07-08 2022-03-01 瑞华药业集团 精氨基琥珀酸合成酶的抗体和相关方法
US9474756B2 (en) * 2014-08-08 2016-10-25 Forsight Vision4, Inc. Stable and soluble formulations of receptor tyrosine kinase inhibitors, and methods of preparation thereof
CN114522225A (zh) 2014-09-16 2022-05-24 瑞华药业集团 用于癌症治疗的对adi-peg20抗体具有降低的交叉反应性的精氨酸脱亚氨酶
KR20180127632A (ko) * 2015-12-03 2018-11-29 란자테크 뉴질랜드 리미티드 가스 발효 아세토젠에서의 효율을 개선하기 위한 아르기닌 보충
TW201825122A (zh) * 2016-07-05 2018-07-16 開曼群島商北極星藥業集團股份有限公司 用精胺酸耗盡劑進行之組合癌症免疫療法
TW202308683A (zh) * 2016-11-02 2023-03-01 開曼群島商北極星藥業集團股份有限公司 聚乙二醇化精胺酸脫亞胺酶之調配物
CN108324951B (zh) * 2018-04-16 2021-05-25 薛剑峰 一种精氨酸脱亚胺酶注射剂及其制备方法
CN110694076B (zh) * 2019-09-09 2021-02-09 浙江大学 一种羟基氯喹两亲性聚合物药物前体、制备方法及其应用
EP4069280A4 (en) * 2019-12-02 2024-01-03 Univ Hong Kong Polytechnic METHODS FOR INDUCING INTERMITTENT FASTING AND MODULATING AUTOPHAGY
WO2022000151A1 (en) * 2020-06-29 2022-01-06 Vision Global Holdings Limited Method of treating aml subtypes using arginine-depleting agents

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6635462B1 (en) * 1997-05-12 2003-10-21 Phoenix Pharmacologies, Inc. Mutated form of arginine deiminase
US7323167B2 (en) * 1997-05-12 2008-01-29 Polaris Group Method of treatment with modified arginine deiminase

Family Cites Families (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IT1298918B1 (it) 1998-02-20 2000-02-07 Mendes Srl Uso di batteri dotati di arginina deiminasi per indurre apoptosi e/o ridurre una reazione infiammatoria e composizioni farmaceutiche
WO2002009741A1 (en) 2000-07-27 2002-02-07 Angiolab, Inc. The pharmaceutical composition comprising arginine deiminase for inhibiting angiogenesis
EP1337630A2 (en) * 2000-11-28 2003-08-27 Phoenix Pharmacologics, Inc. Modified arginine deiminase
AU2003282883B2 (en) 2002-11-18 2008-12-04 Polaris Group Methods for inhibiting viral replication in vivo
AU2004235382A1 (en) * 2003-04-29 2004-11-11 Wyeth Methods for diagnosing AML and MDS differential gene expression
PT1778723E (pt) 2004-08-17 2013-01-25 Regeneron Pharma Formulações de antagonista de il-1
CN101002945B (zh) 2006-01-20 2012-09-05 清华大学 一种用于肿瘤治疗的新型复合物
US8546329B2 (en) * 2006-03-22 2013-10-01 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Erythropoietin solution preparation
EP2068923A4 (en) * 2007-03-30 2010-11-24 Medimmune Llc ANTIBODIES HAVING REDUCED DEAMIDATION PROFILES
US20100197944A1 (en) 2007-07-04 2010-08-05 Dr. Reddy's Laboratories Limited Docetaxel process and polymorphs
US20090238813A1 (en) 2007-12-28 2009-09-24 Board Of Regents, The University Of Texas System Compositions And Methods For Engineered Human Arginine Deiminases
WO2010083312A2 (en) * 2009-01-14 2010-07-22 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Micro-rna biomarker in cancer
WO2011053871A2 (en) 2009-10-30 2011-05-05 Life Technologies Corporation Multi-primer assay for mycoplasma detection
AR080428A1 (es) 2010-01-20 2012-04-11 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Formulaciones liquidas estabilizadas contentivas de anticuerpos
AU2011260016B2 (en) 2010-06-02 2013-08-22 Fresenius Kabi Oncology Ltd. Stable pharmaceutical compositions of Rapamycin esters
US8663967B2 (en) 2011-08-22 2014-03-04 Jiangsu T-Mab Biopharma Co., Ltd. Arginine deiminase mutant and preparation and application thereof
TW201735943A (zh) 2012-04-04 2017-10-16 普拉瑞斯集團 利用精胺酸去亞胺酶之治療方法
WO2014151982A2 (en) 2013-03-15 2014-09-25 Polaris Group Arginine deiminase with reduced cross-reactivity toward adi – peg 20 antibodies for cancer treatment

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6635462B1 (en) * 1997-05-12 2003-10-21 Phoenix Pharmacologies, Inc. Mutated form of arginine deiminase
US7323167B2 (en) * 1997-05-12 2008-01-29 Polaris Group Method of treatment with modified arginine deiminase

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Arginine deiminase inhibits proliferation of human leukemia cells more potently than asparaginase by inducing cell cycle arrest and apoptosis.;H Gong et al.;《Leukemia》;20001231;826-829 *
Pegylated Arginine Deiminase (ADI-SS PEG20,000 mw) Inhibits Human Melanomas and Hepatocellular Carcinomas in Vitro and in Vivo.;Charles Mark Ensor et al.;《CANCER RESEARCH》;20021001;5443-5450 *

Also Published As

Publication number Publication date
AU2012330497A1 (en) 2013-10-24
HK1205150A1 (zh) 2015-12-11
EP3782653A1 (en) 2021-02-24
US9333268B2 (en) 2016-05-10
TW201611843A (en) 2016-04-01
US10525142B2 (en) 2020-01-07
TWI577386B (zh) 2017-04-11
EP2834262B1 (en) 2020-09-02
HK1197251A1 (zh) 2015-01-09
US20150132278A1 (en) 2015-05-14
TW201735943A (zh) 2017-10-16
WO2013151568A1 (en) 2013-10-10
US9731028B2 (en) 2017-08-15
ES2828656T3 (es) 2021-05-27
JP2015172083A (ja) 2015-10-01
CN103797025A (zh) 2014-05-14
US20180154008A1 (en) 2018-06-07
TW201340979A (zh) 2013-10-16
AU2012330497B2 (en) 2016-08-04
US20150231272A1 (en) 2015-08-20
CA2834083A1 (en) 2013-10-10
KR20150035350A (ko) 2015-04-06
BR112013028365A2 (pt) 2016-11-29
SG194641A1 (en) 2013-12-30
EP2834262A1 (en) 2015-02-11
CA2834083C (en) 2018-05-22
JP6534205B2 (ja) 2019-06-26
KR101638226B1 (ko) 2016-07-08
BR112013028365B1 (pt) 2022-04-05
JP2017008115A (ja) 2017-01-12
JP2018104470A (ja) 2018-07-05
JP2014521602A (ja) 2014-08-28
EP2834262A4 (en) 2015-11-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN103797025B (zh) 用精氨酸脱亚氨酶治疗的方法
CN105188739B (zh) 用于癌症治疗的具有减弱的对adi‑peg 20抗体的交叉反应性的精氨酸脱亚胺酶
US9789170B2 (en) Arginine deiminase with reduced cross-reactivity toward ADI-PEG 20 antibodies for cancer treatment
TWI676683B (zh) 用於癌症治療之對ａｄｉ－ｐｅｇ２０抗體交叉反應性降低之精胺酸去亞胺酶
TW201408321A (zh) 治療癌症之協同組合

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: DE

Ref document number: 1197251

Country of ref document: HK

GR01 Patent grant
GR01 Patent grant