ES2828656T3 - Composición que comprende arginina desiminasa pegilada - Google Patents

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Abstract

Una composición líquida, que comprende arginina desiminasa (ADI) modificada covalentemente con polietilenglicol (ADI-PEG), comprendiendo además la composición histidina-HCl, que es de aproximadamente 0,0035 M de histidina- HCl a aproximadamente 0,35 M de histidina-HCl, en la que la composición tiene un pH de aproximadamente 6,5 a aproximadamente 7,5.

Description

DESCRIPCIÓN
Composición que comprende arginina desiminasa pegilada
Antecedentes
Campo técnico
La presente invención se refiere generalmente a arginina desiminasa (ADI), y en particular, a ADI pegilada (ADI-PEG) para su uso en métodos de tratamiento del cáncer.
Descripción de la técnica relacionada
La terapia de privación de aminoácidos puede ser un tratamiento eficaz de algunas formas de cáncer. Hasta ahora, existe un ejemplo clínico conocido relevante para este enfoque que utiliza asparaginasa para reducir los niveles en circulación de asparagina e inhibir la síntesis de proteínas. Este tratamiento es particularmente eficaz para la leucemia linfoblástica aguda (Avramis 2005, Viera Pinheiro 2004). Las células de leucemia linfoblástica aguda requieren el aminoácido asparagina para su crecimiento y proliferación. En cambio, la mayoría de las células humanas normales son capaces de sintetizar asparagina y no se ven afectadas por el agotamiento de asparagina. Por lo tanto, la disminución de asparagina sérica con asparaginasa puede destruir selectivamente las células cancerosas sin dañar las células normales, los tejidos y al huésped. Una forma de asparaginasa procedente de E. coli ha sido aprobada para uso humano. Sin embargo, la asparaginasa se encuentra solo en microbios; lo que la hace muy inmunogénica en seres humanos y también tiene una semivida corta en suero después de la inyección (Avramis 2005). Para hacer que la asparaginasa sea un fármaco más eficaz, estos inconvenientes se minimizaron formulando la asparaginasa procedente de E. coli con polietilenglicol (PEG) para reducir la antigenicidad de esta enzima y las reacciones alérgicas asociadas. Asimismo, el PEG prolonga en gran medida la semivida en circulación de la asparaginasa, lo que reduce tanto la frecuencia del tratamiento como el coste total de la terapia. La asparaginasa formulada con PEG está aprobada para su uso y se comercializa con el nombre comercial Oncaspar® (Oncaspar® 2011, Avramis 2005, Viera Pinheiro 2004, Fu 2007, Zeidan 2008).
La arginina es otro aminoácido no esencial para seres humanos y ratones (para revisión, véase Rogers 1994). En los seres humanos, se puede sintetizar arginina a partir de citrulina en dos etapas a través de las enzimas del ciclo de Krebs (urea) argininosuccinato sintetasa (ASS, L-citrulina: L-aspartato ligasa [formación de AMP], EC 6.3.4.5) y argininosuccinato liasa (ASL, L-argininosuccinato arginina-liasa, EC 4.3.2.) (Haines 2011, Wu 2009, Morris 2006, Husson 2003, Tapiero 2002, Rogers 1994). La ASS cataliza la conversión de citrulina y ácido aspártico en argininosuccinato, que después se convierte en arginina y ácido fumárico por ASL (figura 1). Una dieta deficiente en arginina en seres humanos no induce hiperamonemia, aciduria orótica, ni altera la tasa de síntesis de óxido nítrico (NO) en todo el cuerpo en seres humanos adultos (Tapiero 2002, Castillo 1995, Rogers 1994, Carey 1987, Barbul 1986, Snyderman 1959, Rose 1949). Aunque los recién nacidos prematuros parecen necesitar arginina (Wu 2004), los niveles de arginina no se correlacionan con la edad entre los bebés, niños y adultos jóvenes (Lucke 2007). En 1992, Takaku y Sugimura informaron por separado de que las líneas celulares de melanomas humanos y carcinoma hepatocelular (CHC) parecen necesitar arginina para su crecimiento. Otros estudios mostraron que la ADI pegilada fue eficaz para el tratamiento de melanomas y hepatomas con pocos efectos adversos. Feun, L. et al. (2006), Expert Opinion on Investigational Drugs 15(7):815-822 describen la arginina desiminasa pegilada.
El cáncer se trata principalmente con una o una combinación de tres tipos de terapias: cirugía, radiación y quimioterapia. Para los cánceres que no se pueden tratar con terapias locales tales como cirugía, radiación y embolización, las quimioterapias sistémicas son la única opción de tratamiento. Sin embargo, las quimioterapias tradicionales no pueden distinguir entre células normales y cancerosas, lo que conduce a una toxicidad significativa y una eficacia limitada. La nueva generación de terapia sistémica son terapias dirigidas diseñadas para destruir células cancerosas de forma selectiva aprovechando las diferencias entre las células normales y las cancerosas. La presente invención proporciona esta y otras ventajas para el tratamiento de cánceres.
Referencias: Avramis VI, Panosyan EH. 2005. Clin Pharmacokinet 44:367-393; Barbul A. 1986. J Parenteral Enteral Nutr 10:227-238; Carey GP, et al. 1987. J Nutr 117:1734-1739; Castillo L, et al. 1995. Am J Physiol 268 (Endocrinol Metab 31):E360-367; Fu CH, Sakamoto KM. 2007. Expert Opin Pharmacother 8:1977-1984; Haines RJ, et al. 2011. Int J Biochem Mol Biol 2:8-23; Husson A, et al. 2003. Eur J Biochem 270:1887-1899; Lucke T, et al. 2007. Clin Chem Lab Med 45:1525-1530; Morris SM Jr. 2006. Am J Clin Nutr 83(Suppl):598S-512S; Rogers QR. 1994. En Proceedings from a Symposium Honoring Willard J. Visek - from Ammonia to Cancer and Gene Expression. Publicación especial 86 - abril de 1994, Estación Experimental de Agricultura, Universidad de Illinois, 211 Mumford Hall, Urbana, IL 61801, págs. 9-21; Tapiero H, et al. 2002. Biomed Pharmacother 56:439- 445, 2002; Viera Pinheiro JP, Boos J. 2004. Br J Haematol 125: 117-127; Wu G, et al. 2009. Amino Acids 37:153-168; Wu G, et al. 2004. J Nutr Biochem 15:442-451; Zeidan A, et al. 2008. Expert Opin Biol Ther 9:111-119.
Breve sumario
La invención se define en las reivindicaciones adjuntas. En particular, la invención se refiere a una composición líquida que comprende ADI modificada covalentemente con polietilenglicol (ADI-PEG), comprendiendo la composición histidina-HCl, que es de aproximadamente 0,0035 M de histidina-HCl a aproximadamente 0,35 M de histidina-HCl, en la que la composición tiene un pH de aproximadamente 6,5 a aproximadamente 7,5.
Cualquier materia objeto que se encuentre fuera del alcance de las reivindicaciones se proporciona solo con fines de información. Cualquier referencia en la descripción a métodos de tratamiento se refiere a los compuestos, composiciones farmacéuticas y medicamentos de la presente invención para su uso en un método para el tratamiento del cuerpo humano o animal mediante terapia.
Un aspecto de la presente divulgación proporciona un método para tratar la leucemia en un paciente que comprende administrar al paciente un compuesto que comprende ADI unida covalentemente mediante un grupo de unión a polietilenglicol. En un aspecto, la leucemia es leucemia mieloide aguda o leucemia mieloide aguda recidivante. En un aspecto adicional, la leucemia no es leucemia linfocítica o leucemia mielógena crónica. Sin embargo, en aspectos adicionales, la leucemia puede incluir leucemia linfocítica o leucemia mielógena crónica. En otro aspecto, la arginina desiminasa se une covalentemente a 5 ± 1,5 moléculas de PEG de cadena lineal y el compuesto se formula en una composición que comprende menos de aproximadamente el 0,5 % de ADI nativa, menos de aproximadamente el 5 % de PEG libre, o ambos; en la que la arginina desiminasa se administra semanalmente a una dosis de aproximadamente 160 UI/m2 a aproximadamente 640 UI/m2; y en la que la leucemia presenta una expresión reducida de ASS.
Otro aspecto de la presente divulgación proporciona un método para tratar un cáncer en un paciente que comprende administrar al paciente un inhibidor de la autofagia y un compuesto que comprende ADI unida covalentemente mediante un grupo de unión a polietilenglicol, en el que el cáncer es cáncer de páncreas o cáncer de pulmón microcítico. A este respecto, se selecciona un inhibidor de la autofagia del grupo que consiste en cloroquina, 3-metiladenina, hidroxicloroquina, bafilomicina A1, 5-amino-4-imidazol carboxamida ribósido (AICAR), ácido okadaico, N6-mercaptopurina ribósido, wortmanina y vinblastina. Se contemplan otros inhibidores de la autofagia conocidos en la técnica para su uso en los métodos del presente documento. En determinados aspectos, la ADI y el inhibidor de la autofagia actúan de forma aditiva o sinérgica. En otro aspecto, la arginina desiminasa se une covalentemente a 5 ± 1,5 moléculas de PEG de cadena lineal y el compuesto se formula en una composición que comprende menos de aproximadamente el 0,5 % de ADI nativa, menos de aproximadamente el 5 % de PEG libre, o ambos; en la que la arginina desiminasa se administra semanalmente a una dosis de aproximadamente 160 UI/m2 a aproximadamente 640 UI/m2; y en la que el cáncer presenta una expresión reducida de ASS.
Un aspecto de la presente divulgación proporciona un método para tratar un cáncer en un paciente que comprende administrar al paciente un compuesto que comprende ADI unida covalentemente mediante un grupo de unión a polietilenglicol, en el que el cáncer se selecciona del grupo que consiste en cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer colorrectal, cáncer gástrico, glioma, glioblastoma multiforme, cáncer de pulmón no microcítico (CPNM), cáncer de riñón, cáncer de vejiga, cáncer de útero, cáncer esofágico, cáncer cerebral, cánceres de cabeza y cuello, cáncer de cuello de útero, cáncer de testículo y cáncer de estómago. En un aspecto, la arginina desiminasa se une covalentemente a 5 ± 1,5 moléculas de PEG de cadena lineal y el compuesto se formula en una composición que comprende menos de aproximadamente el 0,5 % de ADI nativa, menos de aproximadamente el 5 % de PEG libre, o ambos; en la que la arginina desiminasa se administra semanalmente a una dosis de aproximadamente 160 UI/m2 a aproximadamente 640 UI/m2; y en la que el cáncer presenta una expresión reducida de ASS.
Un aspecto de la presente divulgación proporciona un método para tratar un melanoma en un paciente que comprende administrar al paciente un compuesto que comprende ADI unida covalentemente mediante un grupo de unión a polietilenglicol, en combinación con cisplatino. En un aspecto, la arginina desiminasa se une covalentemente a 5 ± 1,5 moléculas de PEG de cadena lineal y el compuesto se formula en una composición que comprende menos de aproximadamente el 0,5 % de ADI nativa, menos de aproximadamente el 5 % de PEG libre, o ambos; en la que la arginina desiminasa se administra semanalmente a una dosis de aproximadamente 160 UI/m2 a aproximadamente 640 UI/m2; y en la que el melanoma presenta una expresión reducida de ASS.
Otro aspecto de la presente divulgación proporciona un método para tratar un cáncer en un paciente que comprende administrar al paciente un compuesto que comprende ADI unida covalentemente mediante un grupo de unión a polietilenglicol, en el que el cáncer no es melanoma, cáncer de páncreas, cáncer de próstata, cáncer de pulmón microcítico, mesotelioma, leucemia linfocítica, leucemia mielógena crónica, linfoma, hepatoma, ni sarcoma. En un aspecto, la arginina desiminasa se une covalentemente a 5 ± 1,5 moléculas de PEG de cadena lineal y el compuesto se formula en una composición que comprende menos de aproximadamente el 0,5 % de ADI nativa, menos de aproximadamente el 5 % de PEG libre, o ambos; en la que la arginina desiminasa se administra semanalmente a una dosis de aproximadamente 160 UI/m2 a aproximadamente 640 UI/m2; y en la que el cáncer presenta una expresión reducida de ASS.
Otro aspecto de la presente divulgación proporciona un método para tratar cáncer de pulmón no microcítico, cáncer de cabeza y cuello o cáncer de próstata en un paciente que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto que comprende arginina desiminasa unida covalentemente mediante un grupo de unión a polietilenglicol, en combinación con docetaxel. En un aspecto, la arginina desiminasa se une covalentemente a 5 ± 1,5 moléculas de PEG de cadena lineal y el compuesto se formula en una composición que comprende menos de aproximadamente el 0,5 % de ADI nativa, menos de aproximadamente el 5 % de PEG libre, o ambos; en la que la arginina desiminasa se administra semanalmente a una dosis de aproximadamente 160 UI/m2 a aproximadamente 640 UI/m2; y en la que el cáncer de pulmón no microcítico, el cáncer de cabeza y cuello o el cáncer de próstata presentan una expresión reducida de ASS.
Otro aspecto de la presente divulgación proporciona un método para tratar el carcinoma de células renales en un paciente que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto que comprende arginina desiminasa unida covalentemente mediante un grupo de unión a polietilenglicol, en combinación con rapamicina. En un aspecto, la arginina desiminasa se une covalentemente a 5 ± 1,5 moléculas de PEG de cadena lineal y el compuesto se formula en una composición que comprende menos de aproximadamente el 0,5 % de ADI nativa, menos de aproximadamente el 5 % de PEG libre, o ambos; en la que la arginina desiminasa se administra semanalmente a una dosis de aproximadamente 160 UI/m2 a aproximadamente 640 UI/m2; y en la que el cáncer presenta una expresión reducida de ASS.
En determinadas realizaciones de la presente invención, la ADI está unida covalentemente a más de una molécula de polietilenglicol, o de aproximadamente 9 a aproximadamente 12 moléculas de polietilenglicol. En otra realización de la presente invención, el polietilenglicol tiene un peso molecular promedio en peso total de aproximadamente 1.000 a aproximadamente 40.000, tiene un peso molecular promedio en peso total de aproximadamente 10.000 a aproximadamente 30.000 y, en determinadas realizaciones, el polietilenglicol tiene un peso molecular de 20.000.
En determinadas realizaciones de la presente divulgación, el grupo de unión es un grupo succinimida. En determinadas realizaciones, el grupo succinimida puede ser succinato de succinimidilo, propionato de succinimidilo, carboximetilato de succinimidilo, succinimidil succinamida, N-hidroxisuccinimida, o combinaciones de los mismos. En una realización, el grupo succinimida es succinato de succinimidilo, propionato de succinimidilo, o combinaciones de los mismos.
En determinadas realizaciones de la presente divulgación, la IDA no se aísla de Mycoplasma arginini. En otras realizaciones, la ADI se aísla de Mycoplasma hominis. En una realización particular, la ADI se ha modificado para que esté libre de al menos una lisina en la posición 112, 374, 405 o 408 de la SEQ ID NO:1, y en otra realización, la ADI comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 2. En una realización, la arginina desiminasa está unida covalentemente a 5 ± 1,5 moléculas de PEG y, en determinadas realizaciones, el PEG es PEG de cadena lineal.
En algunos aspectos de los presentes métodos, la ADI se administra de aproximadamente dos veces por semana a aproximadamente una vez cada 2 semanas y, en un aspecto particular, la ADI se administra semanalmente.
En un aspecto, la IDA se administra a una dosis de entre aproximadamente 80 UI/m2 y aproximadamente 640 UI/m2, y en un aspecto particular, se administra a una dosis de aproximadamente 160 UI/m2. En otro aspecto, la IDA se administra semanalmente a una dosis de aproximadamente 160 UI/m2.
En un aspecto, el compuesto usado en los métodos descritos en el presente documento que comprende arginina desiminasa unida covalentemente mediante un grupo de unión a polietilenglicol, se formula en una composición que comprende menos de aproximadamente el 0,5 % de ADI nativa, menos de aproximadamente el 5 % de PEG libre, o ambos.
Otro aspecto de la presente divulgación proporciona un método para tratar la EICH en un paciente que comprende administrar al paciente un compuesto que comprende ADI unida covalentemente mediante un grupo de unión a polietilenglicol.
Un aspecto adicional de la presente divulgación proporciona un método para tratar un cáncer en un paciente que comprende administrar al paciente un compuesto que comprende ADI unida covalentemente mediante un grupo de unión a polietilenglicol, en el que el cáncer presenta ASS. En un aspecto, el cáncer se selecciona del grupo que consiste en leucemia, leucemia mieloide aguda, leucemia mieloide aguda recidivante, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer colorrectal, cáncer gástrico, glioma, glioblastoma multiforme, cáncer de pulmón no microcítico (CPNM), cáncer de riñón, cáncer de vejiga, cáncer de útero, cáncer esofágico, cáncer cerebral, cánceres de cabeza y cuello, cáncer de cuello de útero, cáncer de testículo y cáncer de estómago. En un aspecto adicional, la expresión reducida de ASS es resultado de la metilación del promotor de la argininosuccinato sintetasa. En otro aspecto, la expresión reducida de ASS es resultado de una mutación o supresión del ADN. En un aspecto particular, la expresión reducida de ASS es resultado de la supresión o transposición del locus 9q34 como parte del "cromosoma Filadelfia". En determinados aspectos, el cáncer presenta una expresión reducida de ASS.
Aún un aspecto adicional de la presente divulgación proporciona un método para tratar un cáncer en un paciente que comprende administrar al paciente un compuesto que comprende ADI unida covalentemente mediante un grupo de unión a polietilenglicol, en el que el cáncer presenta una expresión reducida de argininosuccinato liasa. En un aspecto, el cáncer se selecciona del grupo que consiste en leucemia, leucemia mieloide aguda, leucemia mieloide aguda recidivante, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer colorrectal, cáncer gástrico, glioma, glioblastoma multiforme, cáncer de pulmón no microcítico (CPNM), cáncer de riñón, cáncer de vejiga, cáncer de útero, cáncer esofágico, cáncer cerebral, cánceres de cabeza y cuello, cáncer de cuello de útero, cáncer de testículo y cáncer de estómago. En un aspecto, la expresión reducida de ASL es resultado de la metilación del promotor de la argininosuccinato liasa. En determinados aspectos, la expresión reducida de ASL es resultado de una mutación o supresión del ADN. En un aspecto particular, el cáncer es negativo para ASL.
En determinadas realizaciones de la presente invención, el tratamiento con ADI-PEG inhibe la síntesis de NO, inhibe la angiogénesis, induce la apoptosis en células tumorales, o una combinación de las mismas, in vivo. En determinadas realizaciones, el tratamiento da como resultado una enfermedad estable. En otras realizaciones, el tratamiento aumenta el tiempo de supervivencia sin progresión en el paciente. Aún en otra realización, la arginina plasmática se agota durante al menos un mes o durante más de 2 meses.
En determinadas realizaciones, los métodos descritos en el presente documento comprenden además la administración de un agente terapéutico, tal como un agente quimioterapéutico, incluyendo, pero sin limitación, ciclofosfamida, gemcitabina, cisplatino, sorafenib, sunitinib y everolimus. En determinadas realizaciones, la ADI y el agente quimioterapéutico actúan de forma aditiva o sinérgica.
Breve descripción de las secuencias
La SEQ ID NO:1 es la secuencia de aminoácidos de la proteína ADI de M. hominis de tipo silvestre.
La SEQ ID NO:2 es la secuencia de aminoácidos de la proteína ADI de M. hominis modificada.
Las SEQ ID NO:3 y 4 son cebadores de PCR usados para amplificar el ADNc de la argininosuccinato sintetasa.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1 es un diagrama del metabolismo de la arginina a través del ciclo de Krebs (urea).
La figura 2 muestra la inducción de la apoptosis dependiente de caspasa y la autofagia de células de cáncer de páncreas por ADI in vitro. La figura 2A es un gráfico de barras que muestra el porcentaje de células que experimentan la muerte celular tras la incubación con un inhibidor de pan-caspasa ZVAD-fmk ("Zvad") y/o ADI-PEG. La figura 2B es un gráfico de barras que muestra el porcentaje de células positivas para Anexina V después de una incubación de 72 horas con ADI-PEG en comparación con un control de PBS.
La figura 3 muestra los niveles de expresión de caspasa 3, p62 y LC3B escindidas después de la incubación de células de cáncer de páncreas humano con hidroxicloroquina ("ChQ") y/o ADI-PEG.
Las figuras 4A y 4B muestran el porcentaje de células positivas para Anexina V y células sub-G0/G1 después de la incubación de células de cáncer de páncreas humano con ChQ y/o ADI-PEG.
La figura 5 muestra el volumen tumoral en ratones después del tratamiento con cloroquina (CQ) y/o ADI-PEG. Se establecieron xenoinjertos subcutáneos de la línea celular de cáncer de páncreas humano MIA PaCa-2 en ratones atímicos.
La figura 6 muestra la histopatología de los tumores MIA PaCa-2 después del tratamiento con cloroquina y/o ADI-PEG. La primera columna muestra la tinción H&E, la segunda columna muestra la tinción para caspasa 3 activa, la tercera columna muestra la tinción para fragmentación del ADN a través del ensayo TUNEL, y la cuarta columna muestra la tinción para p62.
La figura 7 muestra la expresión de ASS en líneas celulares y tumores humanos de cáncer de pulmón microcítico. Se utilizó el anticuerpo anti-ASS 195-21-1 para detectar la expresión de la proteína ASS en piel normal (figura 7A), carcinoma de colon (figura 7B) y cáncer de pulmón de células pequeñas (figura 7C). La figura 7D muestra la expresión de la proteína ASS en un panel de líneas celulares de cáncer de pulmón microcítico en comparación con las células de cáncer de colon SW1222 de control positivo mediante transferencia de Western. La figura 7E muestra la correlación de la expresión de la proteína a Ss medida por transferencia de Western con la expresión de ARNm determinada por qRT-PCR.
La figura 8 muestra la inhibición de la proliferación in vitro de células de cáncer de pulmón microcítico negativas para ASS por ADI-PEG 20. Las células adherentes (figura 8A) y no adherentes (figura 8B) se trataron con ADI-PEG 20 durante 120 horas antes de ensayar la proliferación usando el ensayo MTS para células adherentes o el ensayo de proteína total BCA para células no adherentes.
La figura 9 muestra que ADI induce la apoptosis y la autofagia en células de cáncer de pulmón microcítico SK-LC-13 negativas para a Ss . Para el análisis de clasificación de células activadas por fluorescencia del contenido de ADN sub-Gi que demuestra la apoptosis, las células se incubaron en medio de control (figura 9A), topotecán 25 nM (figura 9B), 1,0 mUI mM de ADI-PEG 20 (figura 9C), y 10 mUI mM de ADI-PEG 20 (figura 9D) durante 72 horas antes de la tinción del ADN con yoduro de propidio (PI). La figura 9E muestra el nivel de proteína LC3-I y LC3-II después de una incubación de 24 horas con ADI-PEG 20 o cloroquina ("CQ") - control positivo. La figura 9F muestra la caspasa 3 activa detectada por transferencia de Western en células SK-LC-13 (figura 9F).
La figura 10 muestra el silenciamiento de la expresión de ASS con ARNip. La figura 10A muestra la expresión relativa de la expresión de ARNm de ASS determinada por RT-PCR en células SW1222 tratadas con ARNip de ASS. La figura 10B muestra la expresión relativa de la proteína ASS evaluada por transferencia de Western en células SW1222 tratadas con ARNip de ASS. La figura 10C muestra la proliferación de células tratadas con ADI-PEG 20 según se mide por el ensayo de proliferación con MTS.
La figura 11 muestra la inhibición del crecimiento de xenoinjertos de cáncer de pulmón microcítico SK-LC-13 de tamaño moderado en ratones desnudos BALB/c mediante ADI formulada con PEG de 20.000 p.m. (ADI-PEG 20). Se muestran curvas de crecimiento de los volúmenes tumorales de ratones que recibieron vehículo de PBS (círculo de color negro), un ciclo corto de 20 días (dosificación cada 5 días) de ADI-PEG 20 (cuadrado de color negro), o dosificación continua (cada 5 días hasta la terminación del grupo) de ADI-PEG 20 (cuadrado de color blanco) a dosis de 1 UI por ratón (figura 11A), 2 UI por ratón (figura 11B) y 5 UI por ratón (figura 11C). Los volúmenes tumorales a la terminación del grupo de control el día 33 se muestran en la figura 11D. Se muestran los niveles séricos de ADI-PEG 20 (figura 11E), arginina (figura 11F) y citrulina (figura 11G) para los días 0, 12 y 40 del estudio. Los valores son los mismos en las cohortes de dosificación corta y prolongada los días 0 y 12, ya que la dosificación prolongada solo se inició el día 20.
La figura 12 muestra la curva de crecimiento de los volúmenes tumorales de xenoinjertos de cáncer de pulmón microcítico NCI-H69 positivos para ASS en ratones desnudos BALB/c. Los ratones recibieron vehículo de PBS o 2 UI de ADI-PEG 20 por ratón (flechas de color negro).
La figura 13 muestra la inhibición de grandes xenoinjertos de cáncer de pulmón microcítico SK-LC-13 en ratones desnudos BALB/c. Se muestran curvas de crecimiento de los volúmenes tumorales de ratones que recibieron vehículo de PBS (círculo), un ciclo corto de 20 días de ADI-PEG 20 (flechas de color negro) (cuadrado), o una dosificación continua de ADI-PEG 20 (flechas de color gris) (triángulo) a dosis de 1 UI por ratón (figura 13A), 2 UI por ratón (figura 13B) y 5 UI por ratón (figura 13C). Los volúmenes tumorales a la terminación del grupo de control el día 32 se muestran en la figura 13D.
La figura 14 muestra la viabilidad celular relativa con respecto a los respectivos tratamientos in vitro con ADI-PEG 20 y el inhibidor de la autofagia cloroquina.
La figura 15 muestra un gráfico de datos de xenoinjerto que demuestra que la combinación de ADI-PEG 20 y cisplatino da como resultado una actividad antitumoral mejorada en células de melanoma deficientes en ASS. La figura 16 muestra un gráfico de datos de xenoinjerto que demuestra que la combinación de ADI-PEG 20 y rapamicina da como resultado una actividad antitumoral mejorada contra la línea celular de carcinoma de células renales Caki-1 xenoinjertada.
Descripción detallada
La presente divulgación se refiere generalmente a métodos para tratar el cáncer con ADI, y en particular con ADI-PEG.
Las células normales no requieren arginina para crecer, ya que pueden sintetizar arginina a partir de citrulina en un proceso de dos etapas catalizado por ASS y ASL (véase la figura 1). En cambio, determinados cánceres no expresan ASS. Determinados cánceres no expresan ASL, y otros cánceres pueden tener expresión disminuida de o pueden no expresar ASS y/o ASL. Por lo tanto, estos cánceres son auxótrofos para arginina. Esta diferencia metabólica puede aprovecharse para desarrollar una terapia segura y eficaz para tratar estas formas de cáncer. La ADI cataliza la conversión de arginina en citrulina a través de la ruta de arginina dihidrolasa y, por lo tanto, puede usarse para eliminar arginina.
La práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique específicamente lo contrario, métodos convencionales de virología, inmunología, microbiología, biología molecular y técnicas de ADN recombinante dentro de la experiencia de la técnica, muchos de los cuales se describen a continuación con fines ilustrativos. Dichas técnicas se explican con todo detalle en la bibliografía. Véanse, p. ej., Current Protocols in Protein Science, Current Protocols in Molecular Biology o Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Nueva York, N.Y.(2009); Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology, 3a ed., Wiley & Sons, 1995; Sambrook y Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3a edición, 2001); Maniatis et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1982); DNA Cloning: A Practical Approach, vol. I y II (D. Glover, ed.); Oligonucleotide Synthesis (N. Gait, ed., 1984); Nucleic Acid Hybridization (B. Hames y S. Higgins, eds., 1985); Transcription and Translation (B. Hames y S. Higgins, eds., 1984); Animal Cell Culture (R. Freshney, ed., 1986); Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984) y otras referencias similares.
Como se utilizan en esta memoria descriptiva y en las reivindicaciones adjuntas, las formas en singular "un", "uno/una" y "el/la" incluyen referencias en plural a menos que el contenido indique claramente otra cosa.
En toda la presente memoria descriptiva, a menos que el contexto requiera lo contrario, la palabra "comprende" o variaciones tales como "comprende" o "comprender", se entenderá que implica la inclusión de un elemento o número entero o grupo de elementos o números enteros pero no la exclusión de ningún otro elemento o número entero o grupo de elementos o números enteros.
En la presente memoria descriptiva, cada realización debe aplicarse realizando los cambios necesarios a todas las demás realizaciones, salvo que se indique expresamente otra cosa.
Pueden usarse técnicas convencionales para ADN recombinante, síntesis de oligonucleótidos y cultivo y transformación de tejidos (p. ej., electroporación, lipofección). Pueden realizarse reacciones enzimáticas y técnicas de purificación según las especificaciones del fabricante o como se realiza habitualmente en la técnica o como se describe en el presente documento. Estas técnicas y procedimientos y otros relacionados pueden realizarse en general según métodos convencionales bien conocidos en la técnica y como se describe en diversas referencias generales y más específicas que se citan y analizan a lo largo de la presente memoria descriptiva. A menos que se proporcionen definiciones específicas, la terminología utilizada en relación con, y los procedimientos y las técnicas de laboratorio de, biología molecular, química analítica, química orgánica sintética, y química médica y farmacéutica que se describen en el presente documento son los conocidos y comúnmente usados en la técnica. Pueden usarse técnicas convencionales para tecnología recombinante, biología molecular, microbiología, síntesis química, análisis químicos, preparación farmacéutica, formulación y administración, y tratamiento de pacientes.
"Paciente" se refiere a un animal, en determinadas realizaciones, un mamífero y, en una realización específica, un ser humano.
"Biocompatible" se refiere a materiales o compuestos que en general no son perjudiciales para las funciones biológicas y que no darán lugar a ningún grado de toxicidad inaceptable, incluyendo estados alérgenos y patológicos.
A lo largo de la presente divulgación, se pueden usar las siguientes abreviaturas: PEG, polietilenglicol; ADI, arginina desiminasa; SS, succinato de succinimidilo; SSA, succinimidil succinamida; SPA, propionato de succinimidilo; NHS, N-hidroxi-succinimida; ASS1 o ASS, argininosuccinato sintetasa; ASL, argininosuccinato liasa.
En la presente invención, el gen ADI puede derivarse, clonarse o producirse a partir de cualquier fuente, incluyendo, por ejemplo, microorganismos, biotecnología recombinante o cualquier combinación de los mismos. Por ejemplo, puede clonarse arginina desiminasa de microorganismos de los géneros Mycoplasma, Clostridium, Bacillus, Borrelia, Enterococcus, Streptococcus, Lactobacillus, Giardia. En determinados aspectos, la arginina desiminasa se clona a partir de Mycoplasma pneumoniae, Mycoplasma hominis, Mycoplasma arginini, Steptococcus pyogenes, Steptococcus pneumoniae, Borrelia burgdorferi, Borrelia afzelii, Giardia intestinalis, Clostridium perfringens, Bacillus licheniformis, Enterococcus faecalis, Lactobacillus sake, o cualquier combinación de los mismos. En particular, la ADI usada en la presente invención puede comprender la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 o 2, o una variante de la misma, que tiene actividad ADI (p. ej., es capaz de metabolizar arginina en citrulina y amoniaco), o un fragmento de la misma que tiene actividad ADI.
En determinados aspectos de la presente divulgación, la ADI se clona a partir de microorganismos del género Mycoplasma. En aspectos adicionales, la ADI se clona a partir de Mycoplasma hominis, Mycoplasma arthritides o cualquier combinación de los mismos, y no se deriva de Mycoplasma arginini. En particular, la ADI usada en la presente divulgación puede tener la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 1 o 2, o una variante de la misma, que tiene actividad ADI (p. ej., es capaz de metabolizar arginina en citrulina y amoniaco), o un fragmento de la misma que tiene actividad ADI.
La ADI nativa se puede encontrar en microorganismos y es antigénica y se elimina rápidamente de la circulación en un paciente. Estos problemas pueden superarse modificando ADI. Por lo tanto, la presente divulgación proporciona una ADI modificada por un agente modificador, incluyendo, pero sin limitación, polímeros de macromoléculas, proteínas, péptidos, polisacáridos u otros compuestos. La arginina desiminasa y el agente modificador pueden unirse mediante enlaces covalentes o interacción no covalente para formar un conjugado estable o una composición estable para lograr un efecto deseado. En determinados aspectos, la ADI modificada conserva la actividad biológica de la ADI y tiene una semivida más larga in vivo y una antigenicidad más baja que la ADI sin modificar. En determinados aspectos, la ADI modificada conserva al menos el 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más de la actividad biológica de ADI sin modificar.
En un aspecto, un agente modificador puede ser un polímero o una proteína o un fragmento de los mismos que es biocompatible y puede aumentar la semivida de ADI en la sangre. El agente modificador puede acoplarse químicamente a ADI o, cuando corresponda, unirse a ADI a través de la expresión de proteína de fusión.
Los polímeros de macromoléculas pueden incluir un polímero de macromoléculas no peptídicas, que en determinados aspectos, puede tener su propia bioactividad. Los polímeros adecuados incluyen, pero sin limitación, compuestos de polienol, compuestos de poliéter, polivinilpirrolidona, poliaminoácidos, copolímero de éter divinílico y anhídrido maleico, N-(2-hidroxipropil)-metacrilamida, polisacárido, poliol polioxietilado, heparina o su fragmento, poli-alquil-etilenglicol y sus derivados, copolímeros de poli-alquil-etilenglicol y sus derivados, poli(éter viniletílico), a,P-poli[(2-hidroxietil)-DL-aspartamida], policarboxilatos, polioxietilen-oximetilenos, poliacriloil morfolinas, copolímero de compuestos amino y oxiolefina, ácido polihialurónico, polioxiranos, copolímero de ácido etanodioico y ácido malónico, poli(1,3-dioxolano), copolímero de etileno e hidracida maleica, ácido polisiálico, ciclodextrina, etc. En determinados aspectos, el polímero es polietilenglicol.
Los compuestos de polienol como se usan en el presente documento incluyen, pero sin limitación, polietilenglicol (incluyendo monometoxi polietilenglicol, monohidroxil polietilenglicol), alcohol polivinílico, alcohol polialílico, polibutenol y similares, y sus derivados, tales como lípidos.
Los compuestos de poliéter incluyen, pero sin limitación, polialquilenglicol (HO((CH2)xO)nH), polipropilenglicol, polioxirehileno (HO((CH2)2O)nH), alcohol polivinílico ((CH2CHOH)n).
Los poliaminoácidos incluyen, pero sin limitación, polímeros de un tipo de aminoácido o copolímeros de dos o más tipos de aminoácidos, por ejemplo, polialanina o polilisina, o copolímeros de bloque de los mismos.
Los polisacáridos incluyen, pero sin limitación, glucosano y sus derivados, por ejemplo, sulfato de dextrano, celulosa y sus derivados (incluyendo metilcelulosa y carboximetilcelulosa), almidón y sus derivados, polisacarosa, etc.
En un aspecto específico de la presente divulgación, ADI se modifica mediante acoplamiento con proteínas o péptidos, en el que una o más proteínas o péptidos están directa o indirectamente unidos a ADI. Las proteínas pueden ser proteínas existentes en la naturaleza o sus fragmentos, incluyendo, pero sin limitación, proteínas séricas humanas existentes en la naturaleza o sus fragmentos, tales como proteína de unión a tiroxina, transtiretina, a1-glucoproteína ácida, transferrina, fibrinógeno, inmunoglobulina, región Fc de Ig, albúmina y fragmentos de los mismos. Por "fragmento" se entiende cualquier parte de una proteína que es más pequeña que la proteína completa pero que conserva la función deseada de la proteína. La ADI puede estar unida directa o indirectamente a una proteína a través de un enlace covalente. La unión directa significa que un aminoácido de ADI está unido directamente a un aminoácido de la proteína modificadora, a través de un enlace peptídico o un enlace disulfuro. La unión indirecta se refiere a los enlaces entre ADI y una proteína modificadora, a través de grupos químicos originalmente existentes entre ellas o grupos químicos específicos añadidos por medios biológicos o químicos, o la combinación de los enlaces mencionados anteriormente.
La ADI se modifica mediante unión covalente con PEG. La ADI modificada covalentemente con PEG (con o sin un grupo de unión) puede denominarse en lo sucesivo en el presente documento "ADI-PEG". Cuando se compara con la ADI nativa, ADI-PEG conserva la mayor parte de su actividad enzimática, es mucho menos antigénica, tiene una semivida en circulación muy prolongada, y es mucho más eficaz en el tratamiento de tumores.
"Polietilenglicol" o "PEG" se refiere a mezclas de polímeros de condensación de óxido de etileno y agua, en una cadena ramificada o lineal, representados por la fórmula general H(OCH2CH2)nOH, en la que n es al menos 4. "Polietilenglicol" o "PEG" se usa en combinación con un sufijo numérico para indicar el peso molecular promedio en peso aproximado del mismo. Por ejemplo, PEG5.000 se refiere a PEG que tiene un peso molecular promedio en peso total de aproximadamente 5.000; PEG12.000 se refiere a PEG que tiene un peso molecular promedio en peso total de aproximadamente 12.000; y PEG20.000 se refiere a PEG que tiene un peso molecular promedio en peso total de aproximadamente 20.000.
En un aspecto de la presente divulgación, el PEG tiene un peso molecular promedio en peso total de aproximadamente 1.000 a aproximadamente 50.000; en un aspecto, de aproximadamente 3.000 a aproximadamente 40.000, y en otro aspecto, de aproximadamente 5.000 a aproximadamente 30.000; en determinados aspectos, de aproximadamente 8.000 a aproximadamente 30.000; en otros aspectos, de aproximadamente 11.000 a aproximadamente 30.000; en aspectos adicionales, de aproximadamente 12.000 a aproximadamente 28.000; en aún otros aspectos, de aproximadamente 16.000 a aproximadamente 24.000; y en otros aspectos, de aproximadamente 18.000 a aproximadamente 22.000; en otro aspecto, de 19.000 a aproximadamente 21.000, y en una realización, el PEG tiene un peso molecular promedio en peso total de aproximadamente 20.000. Generalmente, el PEG con un peso molecular de 30.000 o más es difícil de disolver, y los rendimientos del producto formulado se reducen en gran medida. El PEG puede ser una cadena lineal o ramificada, o en determinadas realizaciones, una cadena lineal. Generalmente, el aumento del peso molecular del PEG disminuye la inmunogenicidad de la ADI. El PEG que tiene un peso molecular descrito en esta realización se puede usar junto con ADI y, opcionalmente, un grupo de unión biocompatible, para tratar el cáncer, incluyendo, por ejemplo, leucemia mieloide aguda, tal como leucemia mieloide aguda recidivante, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer colorrectal, cáncer gástrico, glioma, glioblastoma multiforme, cáncer de pulmón no microcítico (CPNM), cáncer de riñón, cáncer de vejiga, cáncer de útero, cáncer esofágico, cáncer cerebral, cánceres de cabeza y cuello, cáncer de cuello de útero, cáncer de testículos, cáncer de estómago y cáncer de esófago.
En otro aspecto de la presente divulgación, el PEG tiene un peso molecular promedio en peso total de aproximadamente 1.000 a aproximadamente 50.000; en determinados aspectos de aproximadamente 3.000 a aproximadamente 30.000; en otros aspectos de aproximadamente 3.000 a aproximadamente 20.000; en un aspecto, de aproximadamente 4.000 a aproximadamente 12.000; en aún otros aspectos, de aproximadamente 4.000 a aproximadamente 10.000; en aspectos adicionales, de aproximadamente 4.000 a aproximadamente 8.000; aún otros aspectos, de aproximadamente 4.000 a aproximadamente 6.000; y aproximadamente 5.000 en otro aspecto. El PEG puede ser una cadena lineal o ramificada, y en determinados aspectos es una cadena lineal. El PEG que tiene un peso molecular descrito en este aspecto se puede usar junto con ADI y, opcionalmente, un grupo de unión biocompatible, para tratar la enfermedad de injerto contra huésped (EICH) o cáncer.
Aunque ADI-PEG es la ADI modificada ilustrativa descrita en el presente documento, como reconocerá el experto en la técnica, la ADI puede modificarse con otros polímeros o moléculas apropiadas para el efecto deseado, en particular, reducir la inmunogenicidad y aumentar la semivida en suero.
La ADI puede unirse covalentemente a un agente modificador, tal como PEG, con o sin un grupo de unión, aunque una realización preferida utiliza un grupo de unión.
El grupo de unión usado para unir covalentemente ADI a un agente modificador, p. ej., PEG, puede ser cualquier grupo de unión biocompatible. Como se ha analizado anteriormente, "biocompatible" indica que el compuesto o grupo no es tóxico y puede utilizarse in vitro o in vivo sin provocar lesiones, malestar, enfermedad o la muerte. Un agente modificador, tal como PEG, puede unirse al grupo de unión, por ejemplo, a través de un enlace de éter, un enlace éster, un enlace de tiol, o un enlace de amida. Los grupos de unión biocompatibles adecuados incluyen, por ejemplo, un grupo éster, un grupo amida, un grupo imida, un grupo carbamato, un grupo carboxilo, un grupo hidroxilo, un hidrato de carbono, un grupo succinimida (incluyendo, por ejemplo, succinato de succinimidilo (SS), propionato de succinimidilo (SPA), carboximetilato de succinimidilo (SCM), succinimidil succinamida (SSA), o N-hidroxisuccinimida (NHS)), un grupo epóxido, un grupo oxicarbonilimidazol (incluyendo, por ejemplo, carbonildimidazol (CDI)), un grupo nitrofenilo (incluyendo, por ejemplo, carbonato de nitrofenilo (NPC) o carbonato de triclorofenilo (TPC)), un grupo trisilato, un grupo aldehído, un grupo isocianato, un grupo vinilsulfona, un grupo tirosina, un grupo cisteína, un grupo histidina, o una amina primaria. En un aspecto, el grupo de unión biocompatible es un grupo éster y/o un grupo succinimida. En otra realización, el grupo de unión es Ss , SPA, SCM, SSA o NHS; en determinadas realizaciones, SS, SPA o NHS son más preferidos, y en otras realizaciones, SS o SPA son los más preferidos.
Como alternativa, la ADI se puede acoplar directamente a un agente modificador, tal como PEG (es decir, sin un grupo de unión) a través de un grupo amino, un grupo sulfhidral, un grupo hidroxilo o un grupo carboxilo.
La ADI se puede unir covalentemente a PEG, a través de un grupo de unión biocompatible, usando métodos conocidos en la técnica, como se describe, por ejemplo, en Park et al, Anticancer Res., 1:373-376 (1981); y Zaplipsky y Lee, Polyethylene Glycol Chemistry: Biotechnical and Biomedical Applications, J. M. Harris, ed., Plenum Press, Ny , Capítulo 21 (1992).
La unión de PEG a ADI aumenta la semivida en circulación de ADI. Generalmente, el PEG se une a una amina primaria de ADI. La selección del sitio de unión de PEG u otro agente modificador, en la ADI está determinada por la función de cada uno de los sitios dentro del dominio activo de la proteína, como conocerá un experto en la técnica. El PEG puede unirse a las aminas primarias de ADI sin una pérdida sustancial de actividad enzimática. Por ejemplo, la ADI clonada de Mycoplasma arginini, Mycoplasma arthritides y Mycoplasma hominis tiene aproximadamente 17 lisinas que pueden modificarse mediante este procedimiento. En otras palabras, las 17 lisinas son todos posibles puntos en los que la ADI se puede unir al PEG a través de un grupo de unión biocompatible, tal como SS, SPA, SCM, SSA y/o NHS. El PEG también puede unirse a otros sitios en ADI, como resultaría evidente para un experto en la técnica a la vista de la presente divulgación.
Se pueden unir covalentemente de 1 a aproximadamente 30 moléculas de PEG a ADI. En determinadas realizaciones, la ADI se modifica con una molécula de PEG. En otras realizaciones, la ADI se modifica con más de una molécula de PEG. En un aspecto, la ADI se modifica con aproximadamente 7 a aproximadamente 15 moléculas de PEG, en una realización de aproximadamente 9 a aproximadamente 12 moléculas de PEG. En otro aspecto, la ADI se modifica con 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12 moléculas de PEG. En un aspecto específico, la ADI se modifica con 4,5 - 5,5 moléculas de PEG por ADI. En otra realización, la ADI se modifica con 5 ± 1,5 moléculas de PEG.
En otro aspecto, de aproximadamente el 30 % a aproximadamente el 70 % de los grupos amino primarios en ADI se modifican con PEG, en un aspecto, de aproximadamente el 40 % a aproximadamente el 60 %, o en determinados aspectos, de aproximadamente el 45 % a aproximadamente el 55 %, y en otros aspectos, aproximadamente el 50 % de los grupos amino primarios en la arginina desiminasa se modifican con PEG. Cuando el PEG está unido covalentemente al extremo terminal de la ADI, puede ser deseable tener solo 1 molécula de PEG utilizada. El aumento del número de unidades de PEG en la ADI aumenta la semivida en circulación de la enzima. Sin embargo, aumentar el número de unidades de PEG en la ADI disminuye la actividad específica de la enzima. Por lo tanto, es necesario lograr un equilibrio entre los dos, como resultaría evidente para un experto en la técnica a la vista de la presente divulgación.
En la presente divulgación, una característica común de los grupos de unión biocompatibles es que se unen a una amina primaria de arginina desiminasa a través de un grupo maleimida. Una vez acoplado con ADI, SS-PEG tiene un enlace éster al lado del PEG, que puede hacer que este sitio sea sensible a la esterasa sérica, que puede liberar PEG de ADI en el cuerpo. SPA-PEG y PEG2-NHS no tienen un enlace éster, por lo que no son sensibles a la esterasa sérica.
En la presente invención, los grupos de unión particulares no parecen influir en la semivida en circulación de ADI-PEG o su actividad enzimática específica. Sin embargo, en determinados aspectos, en la presente invención se usa un grupo de unión biocompatible. El PEG que se une a la proteína puede ser una cadena lineal, como con SS-PEG, SPA-PEG y SC-PEG, o se puede usar una cadena ramificada de PEG, como con PEG2-NHS.
En determinados aspectos, la IDA de la presente divulgación puede modificarse como se describe en la Patente de EE.UU. N.° 6.635.462. En particular, las modificaciones de uno o más de los residuos de aminoácidos de origen natural de ADI, en particular de Mycoplasma hominis, pueden proporcionar una enzima que se renaturaliza y se formula más fácilmente, mejorando así las técnicas existentes para la fabricación de ADI y composiciones terapéuticas que comprenden la misma. En un aspecto, la ADI de la presente divulgación se modifica para eliminar uno o más residuos de lisina (p. ej., la lisina puede sustituirse por otro aminoácido). En particular, en una realización, la ADI se modifica para estar libre de lisina en la posición 112, 374, 405 o 408 de SEQ ID NO:1.
En determinados aspectos, se modifican sitios de pegilación asociados con ADI ubicados en o adyacentes a la región catalítica de la enzima. Para los fines de la presente invención, la expresión "sitio de pegilación" puede definirse como cualquier sitio o posición de ADI que puede modificarse covalentemente con polietilenglicol. Un "sitio de pegilación" se puede considerar ubicado en o adyacente a la región catalítica de la enzima donde la pegilación del sitio da lugar a una reducción significativa de la actividad catalítica de la enzima. La pegilación de dichos sitios ha dado lugar tradicionalmente a la inactivación de la enzima. Por ejemplo, la ADI de Mycoplasma hominis tiene una lisina en la posición 112 que puede considerarse que está en o adyacente a la región catalítica de la enzima. La unión de PEG a esta lisina en la posición 112 puede inactivar la enzima. Asimismo, la ADI de Mycoplasma hominis tiene una cisteína en la posición 397 que puede considerarse que está en o adyacente a la región catalítica de la enzima. Las sustituciones de aminoácidos para cisteína en la posición 397 pueden inactivar la enzima. En particular, la sustitución con alanina, histidina, arginina, serina, lisina o tirosina de cisteína en la posición 397 puede dar lugar a una pérdida de toda la actividad enzimática detectable. La ADI de Mycoplasma hominis también tiene tres lisinas ubicadas cerca de esta cisteína conservada, en particular, Lys374, Lys405 y Lys408. La unión de PEG a Lys374, Lys405, Lys408 o combinaciones de las mismas puede inactivar la enzima.
Debe entenderse que la ADI procedente de otros organismos también puede tener sitios de pegilación correspondientes a la posición 112 de ADI de Mycoplasma hominis. Por ejemplo, la ADI de Steptococcus pyrogenes tiene lisina en la posición 104, la ADI de Mycoplasma pneumoniae tiene lisina en la posición 106, y la ADI de Giardia intestinalis tiene lisina en la posición 114. Asimismo, la ADI de algunos organismos puede tener lisinas correspondientes a la misma ubicación general que la posición 112 de la ADI de Mycoplasma hominis. La ubicación de lisina en la ADI de dichos organismos es conocida por la persona experta y se describe en la patente de EE.UU. n.° 6.635.462.
Por lo tanto, en una realización, la presente invención proporciona determinadas sustituciones de aminoácidos en la cadena polipeptídica de ADI. Estas sustituciones de aminoácidos proporcionan una ADI modificada que pierde menos actividad tras ser modificada por un agente modificador, p. ej., tras la pegilación. Al eliminar sitios de pegilación, u otros sitios de modificación conocidos, en o adyacentes a la región catalítica de la enzima, se puede lograr una modificación óptima, p. ej., pegilación, sin pérdida de actividad.
Debe entenderse que otras realizaciones de la invención se basan en el entendimiento de que determinadas características estructurales de la arginina desiminasa pueden prevenir o interferir con la renaturalización adecuada y rápida de la arginina desiminasa cuando se produce mediante tecnología recombinante. En particular, estas características estructurales obstaculizan o impiden que la enzima asuma una conformación activa durante la producción recombinante. Para los fines de la presente invención, la expresión "conformación activa" puede definirse como una estructura tridimensional que posibilita la actividad enzimática por arginina desiminasa sin modificar o modificada. La conformación activa puede, en particular, ser necesaria para catalizar la conversión de arginina en citrulina. La expresión "característica estructural" puede definirse como cualquier rasgo, cualidad o propiedad de la cadena polipeptídica resultante de un aminoácido o combinación de aminoácidos en particular. Por ejemplo, la arginina desiminasa puede contener un aminoácido que da lugar a un doblez o pliegue en la cadena peptídica normal y, por tanto, obstaculiza que la enzima asuma una conformación activa durante la renaturalización de la enzima. En particular, la arginina desiminasa de Mycoplasma hominis tiene una prolina en la posición 210 que puede dar lugar a un doblez o pliegue en la cadena peptídica, haciendo más difícil renaturalizar la enzima durante la producción recombinante. Debe entenderse que la arginina desiminasa procedente de otros organismos también puede tener sitios correspondientes a la posición 210 de la arginina desiminasa de Mycoplasma hominis.
Por lo tanto, la presente invención proporciona de nuevo determinadas sustituciones de aminoácidos en la cadena polipeptídica de la arginina desiminasa. Dichas sustituciones de aminoácidos pueden eliminar las características estructurales problemáticas en la cadena peptídica de la arginina desiminasa. Dichas sustituciones de aminoácidos proporcionan mejor renaturalización de la arginina desiminasa modificada. Estas sustituciones de aminoácidos hacen posible la renaturalización rápida de la arginina desiminasa modificada utilizando cantidades reducidas de tampón. Estas sustituciones de aminoácidos también pueden proporcionar mayores rendimientos de arginina desiminasa modificada renaturalizada. En un aspecto de la divulgación, la arginina desiminasa modificada tiene una única sustitución de aminoácido en P210. Como se ha mencionado anteriormente, la arginina desiminasa procedente de Mycoplasma hominis tiene el aminoácido prolina ubicado en la posición 210. Aunque no se pretende limitar la presente invención, actualmente se cree que la presencia del aminoácido prolina en la posición 210 da como resultado una doblez o pliegue en la cadena polipeptídica normal que aumenta la dificultad de renaturalizar (es decir, replegar) la arginina desiminasa. Las sustituciones de prolina en la posición 210 hacen posible la renaturalización rápida de arginina desiminasa modificada utilizando cantidades reducidas de tampón. Las sustituciones de prolina en la posición 210 también pueden proporcionar mayores rendimientos de arginina desiminasa modificada renaturalizada. En un aspecto preferido, la prolina en la posición 210 se sustituye con serina. Debe entenderse que de acuerdo con este aspecto de la divulgación, se pueden realizar otras sustituciones en la posición 210. Los ejemplos de otras sustituciones incluyen Pro210 a Thr210, Pro210 a Arg210, Pro210 a Asn210, Pro210 a Gln210 o Pro210 a Met210. Al eliminar esas características estructurales asociadas con el aminoácido de la posición 210 de la arginina desiminasa de tipo silvestre, se puede lograr el replegamiento adecuado de la enzima.
Los métodos de la presente divulgación pueden implicar in vitro o in vivo aplicaciones. En el caso de aplicaciones in vitro, incluyendo aplicaciones de cultivo celular, los compuestos descritos en el presente documento pueden añadirse a las células en cultivos y después incubarse. Los compuestos de la presente invención también pueden usarse para facilitar la producción de anticuerpos monoclonales y/o policlonales, usando técnicas de producción de anticuerpos bien conocidas en la técnica. Los anticuerpos monoclonales y/o policlonales se pueden usar después en una amplia variedad de aplicaciones de diagnóstico, como resultaría evidente para un experto en la técnica.
Los medios de administración in vivo de los compuestos de la presente invención variarán dependiendo de la aplicación prevista. La administración de las composiciones de ADI descritas en el presente documento, en forma pura o en una composición farmacéutica adecuada, puede realizarse mediante cualquiera de los modos aceptados de administración de agentes que sirven para utilidades similares. Las composiciones farmacéuticas se pueden preparar combinando ADI, p. ej., ADI-PEG, a DI-PEG 20, con un vehículo, diluyente o excipiente fisiológicamente aceptable apropiado, y pueden formularse en preparaciones en formas sólidas, semisólidas, líquidas o gaseosas, tales como comprimidos, cápsulas, polvos, gránulos, ungüentos, soluciones, supositorios, inyecciones, inhalantes, geles, microesferas y aerosoles. Asimismo, otros principios farmacéuticamente activos (incluyendo otros agentes antineoplásicos como se describen en otra parte del presente documento) y/o excipientes adecuados tales como sales, tampones y estabilizadores pueden estar presentes dentro de la composición, pero no es necesario. La administración puede realizarse mediante diversas vías diferentes, incluyendo la oral, parenteral, nasal, intravenosa, intradérmica, subcutánea o tópica. Los modos de administración dependen de la naturaleza de la afección que se va a tratar o prevenir. Por lo tanto, ADI-PEG, p. ej., ADI-PEG 20, puede administrarse por vía oral, intranasal, intraperitoneal, parenteral, intravenosa, intralinfática, intratumoral, intramuscular, intersticial, intraarterial, subcutánea, intraocular, intrasinovial, transepitelial y transdérmica. Una cantidad que, después de la administración, reduzca, inhiba, prevenga o retrase la progresión y/o metástasis de un cáncer se considera eficaz. En un determinado aspecto, las composiciones de ADI en el presente documento aumentan el tiempo de supervivencia medio de los pacientes en una cantidad estadísticamente significativa. En un aspecto, los tratamientos con ADI descritos en el presente documento aumentan el tiempo de supervivencia medio de un paciente en 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 7 semanas, 8 semanas, 9 semanas, 10 semanas, 15 semanas, 20 semanas, 25 semanas, 30 semanas, 40 semanas o más. En determinados aspectos, los tratamientos con ADI aumentan el tiempo de supervivencia medio de un paciente en 1 año, 2 años, 3 años o más. En un aspecto, los tratamientos con ADI descritos en el presente documento aumentan la supervivencia sin progresión en 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 7 semanas, 8 semanas, 9 semanas, 10 semanas o más. En determinados aspectos, los tratamientos con ADI descritos en el presente documento aumentan la supervivencia sin progresión en 1 año, 2 años, 3 años o más.
En determinados aspectos, la cantidad administrada es suficiente para dar lugar a regresión tumoral, según lo indicado por una disminución estadísticamente significativa de la cantidad de tumor viable, por ejemplo, una disminución de al menos un 50 % en la masa tumoral, o por la alteración (p. ej., disminución con significancia estadística) de las dimensiones de barrido. En determinadas realizaciones, la cantidad administrada es suficiente para dar lugar a enfermedad estable. En otros aspectos, la cantidad administrada es suficiente para dar lugar a reducción clínicamente relevante de los síntomas de una indicación de enfermedad en particular conocida por el médico experto.
En determinadas realizaciones, la cantidad administrada es suficiente para inhibir la síntesis de NO, inhibir la angiogénesis y/o es suficiente para inducir apoptosis en células tumorales o cualquier combinación de las mismas. La síntesis de NO, la angiogénesis y la apoptosis pueden medirse utilizando métodos conocidos en la técnica, véanse, p. ej., Current Protocols in Immunology or Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Nueva York, N.Y. (2009 y actualizaciones de la misma); Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology, 3a ed., Wiley & Sons, 1995; y otras referencias similares. En un aspecto particular, la cantidad administrada inhibe la síntesis de NO e inhibe el crecimiento del melanoma y crea sinergia con otras quimioterapias como se describe en el presente documento, tal como cisplatino. Por consiguiente, un aspecto de la presente divulgación proporciona un método para tratar el melanoma mediante la administración de ADI-PEG 20 en combinación con cisplatino, en el que el tratamiento agota el óxido nítrico (NO) endógeno.
La dosificación y duración precisas del tratamiento está en función de la enfermedad que se trate y puede determinarse empíricamente usando protocolos de prueba conocidos o probando las composiciones en sistemas modelo conocidos en la técnica y extrapolando a partir de los mismos. También se pueden realizar ensayos clínicos controlados. Las dosis también pueden variar según la gravedad de la afección que se va a aliviar. Una composición farmacéutica generalmente se formula y administra para ejercer un efecto terapéuticamente útil mientras se minimizan los efectos secundarios no deseados. La composición puede administrarse de una vez o puede dividirse en varias dosis menores para administrar en intervalos de tiempo. Para cualquier sujeto en particular, los regímenes de dosificación específicos pueden ajustarse a lo largo del tiempo según la necesidad individual.
Las composiciones de ADI se pueden administrar en solitario o en combinación con otros tratamientos contra el cáncer conocidos, tales como radioterapia, quimioterapia, trasplante, inmunoterapia, terapia hormonal, terapia fotodinámica, etc. Las composiciones también se pueden administrar en combinación con antibióticos.
Las vías típicas para administrar estas y otras composiciones farmacéuticas relacionadas incluyen, por tanto, sin limitación, oral, tópica, transdérmica, inhalación, parenteral, sublingual, bucal, rectal, vaginal e intranasal. El término parenteral, como se usa en el presente documento, incluye inyecciones subcutáneas, intravenosa, intramuscular, inyección intraesternal o técnicas de infusión. Las composiciones farmacéuticas de acuerdo con determinadas realizaciones de la presente invención se formulan para permitir que los principios activos contenidos en las mismas estén biodisponibles tras la administración de la composición a un paciente. Las composiciones que se administrarán a un sujeto o paciente pueden tomar la forma de una o más unidades de dosificación, donde, por ejemplo, un comprimido puede ser una única unidad de dosificación, y un recipiente de una composición de ADI descrita en el presente documento en forma de aerosol puede contener una pluralidad de unidades de dosificación. Los procedimientos reales de preparación de dichas formas farmacéuticas son conocidos o serán evidentes, para los expertos en la técnica; por ejemplo, véase Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20a Edición (Philadelphia College of Pharmacy and Science, 2000). La composición a administrar contendrá, en cualquier caso, una cantidad terapéuticamente eficaz de una ADI-PEG de la presente divulgación, tal como ADI-PEG 20, para el tratamiento de una enfermedad o afección de interés de acuerdo con las enseñanzas del presente documento.
Una composición farmacéutica divulgada en el presente documento puede estar en forma de sólido o líquido. En un aspecto, el vehículo o los vehículos están en partículas, de modo que las composiciones están, por ejemplo, en forma de comprimidos o polvo. El vehículo o los vehículos pueden ser líquidos, siendo las composiciones, por ejemplo, aceite anoral, líquido inyectable o un aerosol, que es útil en, por ejemplo, administración por inhalación. Cuando está destinada a administración oral, la composición farmacéutica generalmente está en forma sólida o líquida, donde las formas semisólidas, semilíquidas, en suspensión y en gel se incluyen en las formas consideradas en el presente documento ya sea como sólido o como líquido.
Como una composición sólida para la administración oral, la composición farmacéutica divulgada en el presente documento puede formularse en un polvo, gránulo, comprimido formado por compresión, píldora, cápsula, goma de mascar, oblea o similar. Tal composición sólida contendrá típicamente uno o más diluyentes inertes o vehículos comestibles. Asimismo, pueden estar presentes uno o más de los siguientes: aglutinantes tales como carboximetilcelulosa, etilcelulosa, celulosa microcristalina, goma de tragacanto o gelatina; excipientes tales como almidón, lactosa o dextrinas, agentes disgregantes tales como ácido algínico, alginato de sodio, Primogel, almidón de maíz y similares; lubricantes tales como estearato de magnesio o Sterotex; emolientes tales como dióxido de silicio coloidal; agentes edulcorantes tales como sacarosa o sacarina; un agente saporífero tal como menta, salicilato de metilo o saporífero de naranja; y un agente colorante. Cuando la composición farmacéutica está en forma de una cápsula, por ejemplo, una cápsula de gelatina, puede contener, además de materiales del tipo anterior, un vehículo líquido tal como polietilenglicol o aceite.
La composición farmacéutica puede estar en forma de un líquido, por ejemplo, un elixir, jarabe, solución, emulsión o suspensión. El líquido puede ser para administración oral o para administración por inyección, a modo de dos ejemplos. Cuando está destinada a administración oral, la composición preferente contiene, además de los presentes compuestos, uno o más de un agente edulcorante, conservantes, tinte/colorante y un potenciador del aroma. En una composición destinada a administrarse mediante inyección pueden incluirse uno o más de un tensioactivo, conservante, agente humectante, agente dispersante, agente de suspensión, tampón, estabilizador y agente isotónico.
Las composiciones líquidas divulgadas en el presente documento, ya sean soluciones, suspensiones u otra forma similar, pueden incluir uno o más de los siguientes adyuvantes: diluyentes estériles tales como agua para inyección, solución salina, en determinados aspectos, una solución salina fisiológica, solución de Ringer, cloruro de sodio isotónico, aceites no volátiles tales como mono o diglicéridos sintéticos que pueden actuar como disolvente o medio de suspensión, polietilenglicoles, glicerina, propilenglicol u otros disolventes; agentes antibacterianos tales como alcohol bencílico o metil parabeno; antioxidantes, tales como ácido ascórbico o bisulfito de sodio; agentes quelantes, tales como ácido etilendiaminatetraacético; tampones, tales como acetatos, citratos o fosfatos y agentes para el ajuste de la tonicidad, tales como cloruro de sodio o dextrosa. La preparación parenteral puede estar contenida en ampollas, jeringas desechables o viales multidosis hechos de vidrio o plástico. La solución salina fisiológica es un adyuvante preferente. Una composición farmacéutica inyectable es preferentemente estéril.
Una composición farmacéutica líquida destinada a administración parenteral u oral debe contener una cantidad de ADI como se describe en el presente documento, tal como ADI-PEG 20, de modo que se obtenga una dosis adecuada. Típicamente, esta cantidad es al menos un 0,01 % de la IDA en la composición. Cuando está destinada a administración oral, esta cantidad puede variar entre el 0,1 y aproximadamente el 70 % del peso de la composición. Determinadas composiciones farmacéuticas orales contienen entre aproximadamente un 4 % y aproximadamente un 75 % de ADI-PEG. En determinados aspectos, las composiciones y preparaciones farmacéuticas de acuerdo con la presente invención se preparan de manera que una unidad de dosificación parenteral contenga entre el 0,01 y el 10 % en peso de ADI-PEG antes de la dilución.
La composición farmacéutica divulgada en el presente documento puede estar destinada a la administración tópica, en cuyo caso el vehículo puede comprender convenientemente una solución, emulsión, pomada o base de gel. La base, por ejemplo, puede comprender uno o más de los siguientes: vaselina, lanolina, polietilenglicoles, cera de abeja, aceite mineral, diluyentes tales como agua y alcohol, y emulsionantes y estabilizantes. Pueden estar presentes agentes espesantes en una composición farmacéutica para administración tópica. Si está destinada a administración transdérmica, la composición puede incluir un parche transdérmico o dispositivo de iontoforesis. La composición farmacéutica divulgada en el presente documento puede estar destinada a la administración rectal, en forma, por ejemplo, de un supositorio, que se fundirá en el recto y liberará el fármaco. La composición para administración rectal puede contener una base oleaginosa como excipiente no irritante adecuado. Dichas bases incluyen, sin limitación, lanolina, manteca de cacao y polietilenglicol.
La composición farmacéutica divulgada en el presente documento puede incluir diversos materiales, que modifican la forma física de una unidad de dosificación sólida o líquida. Por ejemplo, la composición puede incluir materiales que forman una capa de revestimiento alrededor de los principios activos. Los materiales que forman la capa de revestimiento son normalmente inertes y se pueden seleccionar entre, por ejemplo, azúcar, goma laca y otros agentes de recubrimiento entérico. Como alternativa, los principios activos se pueden encerrar en una cápsula de gelatina. La composición farmacéutica en forma sólida o líquida puede incluir un agente que se une a ADI-PEG y, por lo tanto, ayuda a la liberación del compuesto. Los agentes adecuados que pueden actuar con esta función incluyen anticuerpos monoclonales o policlonales, una o más proteínas o un liposoma. La composición farmacéutica divulgada en el presente documento puede consistir esencialmente en unidades de dosificación que se pueden administrar como aerosol. El término aerosol se utiliza para indicar diversos sistemas que varían desde los de naturaleza coloidal a sistemas que consisten en envases presurizados. La administración puede ser mediante un gas licuado o comprimido o mediante un sistema de bomba adecuado que distribuye los principios activos. Los aerosoles se pueden administrar en sistemas monofásicos, bifásicos o trifásicos para administrar el principio o principios activos. La administración del aerosol incluye el recipiente necesario, activadores, válvulas, recipientes secundarios y similares, que juntos pueden formar un kit. Un experto habitual en la técnica, puede determinar sin experimentación indebida aerosoles preferentes.
Las composiciones farmacéuticas pueden prepararse mediante metodología bien conocida en la técnica farmacéutica. Por ejemplo, una composición farmacéutica destinada a administrarse mediante inyección se puede preparar combinando una composición que comprende ADI-PEG como se describe en el presente documento y, opcionalmente, una o más de sales, tampones y/o estabilizadores, con agua destilada estéril para formar una solución. Se puede añadir un tensioactivo para facilitar la formación de una solución o suspensión homogénea. Los tensioactivos son compuestos que interaccionan de forma no covalente con la composición de ADI-PEG para facilitar la disolución o suspensión homogénea del ADI-PEG en el sistema de administración acuoso.
Las composiciones pueden administrarse en una cantidad terapéuticamente eficaz, que variará dependiendo de una diversidad de factores, incluyendo la actividad del compuesto específico (por ejemplo, ADI-PEG) empleado; la estabilidad metabólica y duración de acción del compuesto; la edad, el peso corporal, el estado de salud general, el sexo y la dieta del paciente; el modo y el momento de administración; la tasa de excreción; la combinación farmacológica; la gravedad del trastorno o la afección particular; y el sujeto que se somete a terapia.
Una cantidad terapéuticamente eficaz de uno de los compuestos de la presente divulgación es una cantidad que es eficaz para inhibir el crecimiento tumoral. Generalmente, el tratamiento se inicia con pequeñas dosis que pueden aumentarse en pequeños incrementos hasta que se logre el efecto óptimo según las circunstancias. Generalmente, una dosis terapéutica de los compuestos de la presente divulgación puede ser de aproximadamente 1 a aproximadamente 200 mg/kg dos veces a la semana a aproximadamente una vez cada dos semanas. Por ejemplo, la dosis puede ser de aproximadamente 1 mg/kg una vez a la semana como una inyección intravenosa de 2 ml a aproximadamente 20 mg/kg una vez cada 3 días. En un aspecto adicional, la dosis puede ser de aproximadamente 50 UI/m2 a aproximadamente 700 UI/m2, administrada aproximadamente una vez cada 3 días, aproximadamente una vez a la semana, aproximadamente dos veces a la semana o aproximadamente una vez cada 2 semanas. En determinados aspectos, la dosis puede ser de aproximadamente 50 UI/m2, 60 UI/m2, 70 UI/m2, 80 UI/m2, 90 UI/m2, 100 UI/m2, 110 UI/m2, 120 UI/m2, 130 UI/m2, 140 UI/m2, 150 UI/m2, 160 UI/m2, 170 UI/m2, 180 UI/m2, 190 UI/m2, 200 UI/m2, 210 UI/m2, 220 UI/m2, 230 UI/m2, 240 UI/m2, 250 UI/m2, 260 UI/m2, 270 UI/m2, 280 UI/m2, 290 UI/m2, 300 UI/m2, 310 UI/m2, aproximadamente 320 UI/m2, aproximadamente 330 UI/m2, 340 UI/m2, aproximadamente 350 UI/m2, 360 UI/m2, 370 UI/m2, 380 UI/m2, 390 UI/m2, 400 UI/m2, 410 UI/m2, 420 UI/m2, 430 UI/m2, 440 UI/m2, 450 UI/m2, 500 UI/m2, 550 UI/m2, 600 UI/m2, 620 UI/m2, 630 UI/m2, 640 UI/m2, 650 UI/m2, 660 UI/m2, 670 UI/m2, 680 UI/m2, 690 UI/m2, o aproximadamente 700 UI/m2 administrada aproximadamente una vez cada 3 días, aproximadamente una vez a la semana, aproximadamente dos veces a la semana o aproximadamente una vez cada 2 semanas. En determinados aspectos en los que un sujeto puede desarrollar una respuesta inmunitaria anti-ADI, la dosis puede modificarse según lo desee el médico experto.
La dosis óptima con ADI-SS-PEG5.000 puede ser aproximadamente dos veces por semana, mientras que la dosis óptima con ADI-SS-PEG20.000 puede ser de aproximadamente una vez a la semana a aproximadamente una vez cada dos semanas. En determinados aspectos, la dosis óptima con ADI-SS-PEG20.000 puede ser aproximadamente dos veces por semana. En un aspecto de la presente divulgación, ADI-PEG puede mezclarse con una solución salina tamponada con fosfato, o cualquier otra solución apropiada conocida por los expertos en la técnica, antes de la inyección. En un aspecto, una composición líquida que comprende ADI-PEG comprende de aproximadamente 10 a aproximadamente 12 mg de ADI, aproximadamente 20 a aproximadamente 40 mg de polietilenglicol, 1,27 mg fosfato de sodio monobásico al 5 %, USP; aproximadamente 3 mg fosfato de sodio dibásico al 5 %, USP; 7,6 mg cloruro de sodio al 5 %, USP; a un pH de aproximadamente 6,6 a aproximadamente 7; en una cantidad adecuada de agua para inyección (p. ej., aproximadamente 1 ml o aproximadamente 2 ml). La composición líquida de la invención comprende ADI-PEG e histidina-HCl como tampón. El tampón es de aproximadamente 0,0035 M de histidina-HCl a aproximadamente 0,35 M de histidina-HCl. En una realización particular de la invención, la composición se formula en un tampón que comprende histidina-HCl 0,035 M a pH 6,8 con cloruro sódico 0,13 M. En otro aspecto de la divulgación, la composición se formula en un tampón que comprende tampón de fosfato de sodio 0,02 M a pH 6,8 con cloruro de sodio 0,13 M.
En un aspecto, una composición que comprende ADI o ADI-PEG tiene un pH de aproximadamente 5 a aproximadamente 9, de aproximadamente 6 a aproximadamente 8 o de aproximadamente 6,5 a aproximadamente 7,5. En algunos aspectos, la composición que comprende ADI tiene un pH de aproximadamente 6,8 ± 1,0. La composición de la invención tiene un pH de aproximadamente 6,5 a aproximadamente 7,5.
En un aspecto, el PEG libre en una composición que comprende ADI-PEG está entre el 1-10 % y, en un aspecto adicional, es menos del 7 %, menos del 6 %, menos del 5 %, menos del 4 %, menos del 3 %, menos del 2 % o menos del 1 % del PEG total. En determinados aspectos, la ADI nativa en una composición que comprende ADI-PEG es menos de aproximadamente el 1 %, 0,9 %, 0,8 %, 0,7 %, 0,6 %, 0,5 %, 0,4 %, 0,3 %, 0,2 % o menos del 0,1 %. Generalmente, las composiciones que comprenden ADI-PEG tienen impurezas totales inferiores o iguales a aproximadamente el 4 %, 3 %, 2 %, 1,5 %, 1 % o el 0,5 %.
En un aspecto, el sulfhidrilo libre en una composición que comprende ADI o ADI-PEG es superior a aproximadamente el 90 %. En algunos aspectos, el sulfhidrilo libre en una composición que comprende ADI o ADI-PEG es aproximadamente el 91 %, aproximadamente el 92 %, aproximadamente el 93 %, aproximadamente el 94 % o aproximadamente el 95 %, aproximadamente el 96 %, aproximadamente el 97 %, aproximadamente el 98 %, aproximadamente el 99 % o más.
En un aspecto, la ADI o ADI-PEG en una composición tiene una Km de aproximadamente 0,5 pM a aproximadamente 15 pM, y en un aspecto adicional, es de aproximadamente 1 pM a aproximadamente 12 pM, de aproximadamente 1 pM a aproximadamente 10 pM, de aproximadamente 1,5 pM a aproximadamente 9 pM, de aproximadamente 1,5 pM a aproximadamente 8 pM, o de aproximadamente 1,5 pM a aproximadamente 7 pM. En determinados aspectos, la ADI o ADI-PEG en una composición tiene una Km de aproximadamente 1,5 pM a aproximadamente 6,5 pM. En algunas realizaciones, la a Di o ADI-PEG en una composición tiene una Km de aproximadamente 1,5 pM, aproximadamente 2 pM, aproximadamente 2,5 pM, aproximadamente 3 pM, aproximadamente 3,5 pM, aproximadamente 4 pM, aproximadamente 4,5 pM, aproximadamente 5 pM, aproximadamente 5,5 pM, aproximadamente 6 pM, aproximadamente 6,5 pM o aproximadamente 7 pM.
En un aspecto, la ADI o ADI-PEG en una composición tiene una Kcat de aproximadamente 0,5 s_1 a aproximadamente 15 s-1, y en un aspecto adicional, es de aproximadamente 1 s_1 a aproximadamente 12 s-1, de aproximadamente 1 s_1 a aproximadamente 10 s-1, de aproximadamente 1,5 s_1 a aproximadamente 9 s-1, de aproximadamente 2 s_1 a aproximadamente 8 s-1, o de aproximadamente 2,5 s_1 a aproximadamente 7 s-1. En determinados aspectos, la ADI o ADI-PEG en una composición tiene una Kcat de aproximadamente 2,5 s_1 a aproximadamente 7,5 s-1. En algunos aspectos, la ADI o ADI-PEG en una composición tiene una Kcat de aproximadamente 2,5 s-1, aproximadamente 3 s-1, aproximadamente 3,5 s-1, aproximadamente 4 s-1, aproximadamente 4,5 s-1, aproximadamente 5 s-1, aproximadamente 5,5 s-1, aproximadamente 6 s-1, aproximadamente 6,5 s-1, aproximadamente 7 s-1, aproximadamente 7,5 s_1 o aproximadamente 8 s-1.
En un aspecto, la ADI o ADI-PEG en una composición tiene una conductividad (también denominada en la técnica como conductancia específica) de aproximadamente 5 mS/cm a aproximadamente 20 mS/cm, y en aspectos adicionales, de aproximadamente 5 mS/cm a aproximadamente 15 mS/cm, de aproximadamente 7 mS/cm a aproximadamente 15 mS/cm, de aproximadamente 9 mS/cm a aproximadamente 15 mS/cm, o de aproximadamente 10 mS/cm a aproximadamente 15 mS/cm. En algunos aspectos, la ADI o ADI-PEG en una composición tiene una conductividad de aproximadamente 9 mS/cm, aproximadamente 10 mS/cm, aproximadamente 11 mS/cm, aproximadamente 12 mS/cm o aproximadamente 13 mS/cm, aproximadamente 14 mS/cm o aproximadamente 15 mS/cm. En determinados aspectos, la ADI o ADI-PEG en una composición tiene una conductividad de aproximadamente 13 mS/cm ± 1,0 mS/cm.
En un aspecto, la ADI o ADI-PEG en una composición tiene una osmolalidad de aproximadamente 50 mOsm/kg a aproximadamente 500 mOsm/kg, de aproximadamente 100 mOsm/kg a aproximadamente 400 mOsm/kg, de aproximadamente 150 mOsm/kg a aproximadamente 350 mOsm/kg, de aproximadamente 200 mOsm/kg a aproximadamente 350 mOsm/kg, o de aproximadamente 250 mOsm/kg a aproximadamente 350 mOsm/kg. En determinados aspectos, la ADI o ADI-PEG en una composición tiene una osmolalidad de aproximadamente 300 ± 30 mOsm/kg.
Las composiciones que comprenden ADI-PEG de la presente divulgación también se pueden administrar simultáneamente con, antes de, o después de la administración de uno o más de otros agentes terapéuticos. Dicha terapia de combinación puede incluir la administración de una formulación de dosificación farmacéutica individual que contiene un compuesto de la divulgación y uno o más agentes activos adicionales, así como la administración de composiciones que comprenden ADI-PEG (p. ej., ADI-PEG 20) de la invención y cada agente activo en su propia formulación de dosificación farmacéutica separada. Por ejemplo, ADI-PEG, como se describe en el presente documento, y el otro agente activo pueden administrarse al paciente juntos en una única composición de dosificación oral tal como un comprimido o una cápsula, o cada agente puede administrarse en formulaciones de dosificación oral separadas. De forma similar, ADI-PEG, como se describe en el presente documento, y el otro agente activo pueden administrarse al paciente juntos en una única composición de dosificación parenteral individual tal como en una solución salina u otra solución fisiológicamente aceptable, o cada agente puede administrarse en formulaciones de dosificación parenteral separadas. Cuando se usan formulaciones de dosificación separadas, las composiciones que comprenden ADI-PEG y uno o más agentes activos adicionales se pueden administrar esencialmente al mismo tiempo, es decir, de manera simultánea o en momentos escalonados por separado, es decir, de manera secuencial y en cualquier orden; se entiende que una terapia de combinación incluye todos estos regímenes.
Por lo tanto, en determinadas realizaciones, también se contempla la administración de las composiciones de ADI de la presente divulgación en combinación con uno o más agentes terapéuticos adicionales. Dichos agentes terapéuticos pueden estar aceptados en la técnica como un tratamiento convencional para una patología en particular como se describe en el presente documento, tal como un cáncer en particular o EICH. Los agentes terapéuticos ilustrativos contemplados incluyen citocinas, factores de crecimiento, esteroides, AINE, FAME, antiinflamatorios, agentes quimioterapéuticos, radioterapia, inhibidores de la autofagia u otros agentes activos y auxiliares.
En determinados aspectos, las composiciones de ADI divulgadas en el presente documento pueden administrarse junto con cualquier cantidad de agentes quimioterapéuticos. Los ejemplos de agentes quimioterapéuticos incluyen agentes alquilantes tales como tiotepa y ciclofosfamida (CYTOXAN™); alquilsulfonatos, tales como busulfano, improsulfano y piposulfano; aziridinas, tales como benzodopa, carbocuona, meturedopa y uredopa; etileniminas y metilmelaminas, incluyendo altretamina, trietilenmelamina, trietilenfosforamida, trietilentiofosforamida y trimetilolomelamina; mostazas de nitrógeno, tales como clorambucilo, clornafazina, colofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, clorhidrato de óxido de mecloretamina, melfalán, novembiquina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostaza de uracilo; nitrosoureas, tales como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina, ranimustina; antibióticos tales como aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, calicheamicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina, cromomicinas, dactinomicina, daunorrubicina, detorrubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorrubicina, epirubicina, esorrubicina, idarrubicina, marcelomicina, mitomicinas, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorrubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorrubicina; antimetabolitos, tales como metotrexato y 5-fluorouracilo (5-FU); análogos de ácido fólico, tales como denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; análogos de purina, tales como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos de pirimidina, tales como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, didesoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina, 5-FU; andrógenos, tales como calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano, testolactona; antisuprarrenales, tales como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; reabastecedor del ácido fólico, tal como ácido frolínico; aceglatona; glucósido de aldofosfamida; ácido aminolevulínico; amsacrina; bestrabucilo; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diazicuona; elformitina; acetato de eliptinio; etoglúcido; nitrato de galio; hidroxiurea; lentinano; lonidamina; mitoguazona; mitoxantrona; mopidamol; nitracrina; pentostatina; fenamet; pirarrubicina; ácido podofilínico; 2-etilhidrazida; procarbazina; PSK.RTM.; razoxano; sizofirano; espirogermanio; ácido tenuazónico; triazicuona; 2,2',2"-triclorotrietilamina; uretano; vindesina; dacarbazina; manomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobromano; gacitosina; arabinósido ("Ara-C"); ciclofosfamida; tiotepa; taxoides, p. ej., paclitaxel (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.) y docetaxel (TAXOTERE®., Rhne-Poulenc Rorer, Antony, Francia); clorambucilo; gemcitabina; 6-tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; análogos de platino, tales como cisplatino y carboplatino; vinblastina; platino; etopósido (VP-16); ifosfamida; mitomicina C; mitoxantrona; vincristina; vinorelbina; navelbina; novantrona; tenipósido; daunomicina; aminopterina; xeloda; ibandronato; CPT-11; inhibidor de la topoisomerasa RFS 2000; difluorometilomitina (DMFO); derivados de ácido retinoico tales como Targretin™ (bexaroteno), Panretin™ (alitretinoína); ONTAK™ (denileucina diftitox); esperamicinas; capecitabina; y sales farmacéuticamente aceptables, ácidos o derivados de cualquiera de los anteriores. También se incluyen en esta definición agentes antihormonales que actúan para regular o inhibir la acción hormonal en tumores tales como antiestrógenos incluyendo, por ejemplo, tamoxifeno, raloxifeno, 4(5)-imidazoles inhibidores de aromatasa, 4-hidroxitamoxifeno, trioxifeno, keoxifeno, LY117018, onapristona y toremifeno (Fareston); y antiandrógenos, tales como flutamida, nilutamida, bicalutamida, leuprolida y goserelina; Los agentes quimioterapéuticos adicionales incluyen sorafenib y otros inhibidores de proteína cinasa, tales como afatinib, axitinib, bevacizumab, cetuximab, crizotinib, dasatinib, erlotinib, fostamatinib, gefitinib, imatinib, lapatinib, lenvatinib, mubritinib, nilotinib, panitumumab, pazopanib, pegaptanib, ranibizumab, ruxolitinib, trastuzumab, vandetanib, vemurafenib y sunitinib; sirolimus (rapamicina), everolimus y otros inhibidores de mTOR. También se contemplan para su uso en el presente documento sales, ácidos o derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores.
En determinados aspectos, las composiciones de ADI divulgadas en el presente documento pueden administrarse junto con cualquier cantidad de inhibidores de la autofagia. En algunos aspectos preferidos, el inhibidor de la autofagia se selecciona del grupo que consiste en: cloroquina, 3-metiladenina, hidroxicloroquina (Plaquenil.TM.), bafilomicina A1, 5-amino-4-imidazol carboxamida ribósido (AICAR), ácido okadaico, toxinas de algas supresoras de la autofagia que inhiben proteína fosfatasas de tipo 2A o tipo 1, análogos de AMPc y fármacos que elevan los niveles de AMPc, adenosina, N6-mercaptopurina ribósido, wortmanina y vinblastina. Asimismo, también se puede usar antisentido o ARNip que inhibe la expresión de proteínas esenciales para la autofagia, tal como, por ejemplo, ATG5.
En un aspecto, la combinación de ADI-PEG con uno o más agentes terapéuticos actúa de forma aditiva o sinérgica. A este respecto, en el presente documento se describen agentes sinergizantes, que incluyen un agente terapéutico (p. ej., agente quimioterapéutico, inhibidor de la autofagia, inhibidor de mTOR o cualquier otro agente terapéutico utilizado para el tratamiento del cáncer, EICH o enfermedad inflamatoria intestinal como se describe en el presente documento) que es capaz de actuar de manera sinérgicamente con ADI-PEG como se proporciona en el presente documento, donde dicha sinergia se manifiesta como un efecto detectable que es mayor (es decir, de manera estadísticamente significativa en relación con una condición de control adecuada) en magnitud que el efecto que puede detectarse cuando el agente quimioterapéutico está presente pero la composición de ADI-PEG está ausente y/o cuando la ADI-PEG está presente pero el agente quimioterapéutico está ausente. Se conocen en la técnica métodos para medir la sinergia (véase, p. ej., Cancer Res 15 de enero de 2010, 70; 440).
Las composiciones que comprenden ADI, y opcionalmente otros agentes terapéuticos, como se describen en el presente documento, pueden usarse en métodos terapéuticos para el tratamiento del cáncer y métodos para prevenir la metástasis de un cáncer. Por lo tanto, la presente divulgación proporciona métodos para tratar, aliviar los síntomas o inhibir la progresión o para prevención de diversos cánceres diferentes. En otro aspecto, la presente divulgación proporciona métodos para tratar, aliviar los síntomas o inhibir la progresión de la EICH. En particular, la presente divulgación proporciona métodos para tratar, aliviar los síntomas o inhibir la progresión de un cáncer o EICH en un paciente que comprende administrar al paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de composición de ADI como se describe en el presente documento, de este modo tratando, aliviando los síntomas o inhibiendo la progresión del cáncer o EICH. Por lo tanto, las composiciones de ADI descritas en el presente documento pueden administrarse a un individuo aquejado de enfermedad inflamatoria intestinal (p. ej., enfermedad de Crohn; colitis ulcerosa), EICH o un cáncer, incluyendo, pero sin limitación, leucemia (p. ej., leucemia mieloide aguda y leucemia mieloide aguda recidivante), melanoma, sarcomas (incluyendo, pero sin limitación, sarcomas metastásicos, leiomiosarcoma uterino), cáncer de páncreas, cáncer de próstata (tal como, pero sin limitación, cáncer de próstata resistente a hormonas), mesotelioma, leucemia linfática, leucemia mielógena crónica, linfoma, cáncer de pulmón microcítico, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer colorrectal, cáncer gástrico (incluyendo, pero sin limitación, adenocarcinoma gástrico), glioma, glioblastoma multiforme, retinoblastoma, neuroblastoma, cáncer de pulmón no microcítico (CPNM), cáncer de riñón (incluyendo, pero sin limitación, carcinoma de células renales), cáncer de vejiga, cáncer de útero, cáncer esofágico, cáncer cerebral, cánceres de cabeza y cuello (incluyendo, pero sin limitación, carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello; cáncer de lengua), cáncer de cuello de útero, cáncer de testículos, vesícula biliar, colangiocarcinoma y cáncer de estómago.
En un aspecto, la presente divulgación proporciona un método para tratar, aliviar los síntomas o inhibir la progresión de una leucemia mieloide, tal como, pero sin limitación, leucemia mieloide aguda (AML), mediante la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de una ADI-PEG 20. En determinados aspectos, la leucemia mieloide aguda, tal como AML, es deficiente en ASS, ASL o ambos. En otro aspecto, la leucemia mieloide aguda, (p. ej., AML) no comprende la translocación t(15; 17). En un aspecto adicional, la presente divulgación proporciona un método para tratar la AML que comprende administrar ADI-PEG 20 aproximadamente una vez cada 3 días, aproximadamente una vez a la semana, aproximadamente dos veces a la semana o aproximadamente una vez cada 2 semanas. En determinados aspectos, la dosis de ADI-PEG 20 administrada para el tratamiento de la AML se encuentra entre aproximadamente 160 UI/m2 y aproximadamente 360 UI/m2, y en otros aspectos es de aproximadamente 160 UI/m2, aproximadamente 170 UI/m2, 180 UI/m2, 190 UI/m2, 200 UI/m2, 210 UI/m2, 220 UI/m2, 230 UI/m2, 240 UI/m2, 250 UI/m2, 260 UI/m2, 270 UI/m2, 280 UI/m2, 290 UI/m2, 300 UI/m2, 310 UI/m2, aproximadamente 320 UI/m2, aproximadamente 330 UI/m2, 340 UI/m2, aproximadamente 350 UI/m2, aproximadamente 360 UI/m2, aproximadamente 370 UI/m2, 380 UI/m2, 390 UI/m2, 400 UI/m2, 410 UI/m2, 420 UI/m2, 430 UI/m2, 440 UI/m2, 450 UI/m2, 500 UI/m2, 550 UI/m2, 600 UI/m2, 640 UI/m2, o aproximadamente 700 UI/m2. En determinados aspectos, en los que el tratamiento de la AML con ADI-PEG induce una respuesta inmunitaria contra la ADI, la presente divulgación proporciona un método para tratar la AML, en el que la dosis de ADI se duplica y puede aumentarse a 640 UI/m2 por semana o más. En un aspecto particular, la IDA para el tratamiento de la AML se modifica con 3,5-6,5, o en un aspecto, 4,5-5,5 moléculas de PEG por IDA. En otro aspecto, la presente divulgación proporciona un método para tratar la AML mediante la administración de una composición que comprende ADI-PEG 20, en el que la composición comprende una ADI modificada con 5 ± 1,5 moléculas de PEG y, en un aspecto, 5 ± 1,5 moléculas de PEG de cadena lineal, y, en determinados aspectos, la composición comprende menos de aproximadamente un 0,5 % de ADI nativa (es decir, sin modificar con PEG) y/o menos de aproximadamente un 5 % de PEG libre. En un aspecto adicional, la composición comprende un tampón de histidina - HCl.
En un aspecto, la presente divulgación proporciona un método para tratar, aliviar los síntomas o inhibir la progresión de sarcomas, incluyendo, pero sin limitación, sarcomas metastásicos, mediante la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de una ADI-PEG 20. En determinados aspectos, el sarcoma es deficiente en ASS, ASL o ambos. En un aspecto adicional, la presente divulgación proporciona un método para tratar un sarcoma que comprende administrar ADI-PEG 20 aproximadamente una vez cada 3 días, aproximadamente una vez a la semana, aproximadamente dos veces a la semana o aproximadamente una vez cada 2 semanas. En determinados aspectos, la dosis de ADI-PEG 20 administrada para el tratamiento de la AML se encuentra entre aproximadamente 160 UI/m2 y aproximadamente 360 UI/m2, y en otros aspectos es de aproximadamente 160 UI/m2, aproximadamente 170 UI/m2, 180 UI/m2, 190 UI/m2, 200 UI/m2, 210 UI/m2, 220 UI/m2, 230 UI/m2, 240 UI/m2, 250 UI/m2, 260 UI/m2, 270 UI/m2, 280 UI/m2, 290 UI/m2, 300 UI/m2, 310 UI/m2, aproximadamente 320 UI/m2, aproximadamente 330 UI/m2, 340 UI/m2, aproximadamente 350 UI/m2, aproximadamente 360 UI/m2, aproximadamente 370 UI/m2, 380 UI/m2, 390 UI/m2, 400 UI/m2, 410 UI/m2, 420 UI/m2, 430 UI/m2, 440 UI/m2, 450 UI/m2, 500 UI/m2, 550 UI/m2, 600 UI/m2, 640 UI/m2, o aproximadamente 700 UI/m2. En determinados aspectos, en los que el tratamiento de un sarcoma con ADI-PEG induce una respuesta inmunitaria contra la ADI, la presente divulgación proporciona un método para tratar un sarcoma, en el que la dosis de ADI se duplica y puede aumentarse a 640 UI/m2 por semana o más. En un aspecto particular, la IDA para el tratamiento de la AML se modifica con 3,5-6,5, o en un aspecto, 4,5-5,5 moléculas de PEG por IDA. En otro aspecto, la presente divulgación proporciona un método para tratar un sarcoma, incluyendo un sarcoma metastásico, mediante la administración de una composición que comprende ADI-PEG 20, en el que la composición comprende una ADI modificada con 5 ± 1,5 moléculas de PEG y, en un aspecto, 5 ± 1,5 moléculas de PEG de cadena lineal, y, en determinados aspectos, la composición comprende menos de aproximadamente un 0,5 % de ADI nativa (es decir, sin modificar con PEG) y/o menos de aproximadamente un 5 % de PEG libre. En un aspecto adicional, la composición comprende un tampón de histidina - HCl.
En un aspecto, la presente divulgación proporciona un método para tratar, aliviar los síntomas o inhibir la progresión del cáncer de páncreas mediante la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de ADI-PEG 20 en combinación con un inhibidor de la autofagia, tal como, pero sin limitación, cloroquina, 3-metiladenina, hidroxicloroquina, bafilomicina A1, 5-amino-4-imidazol carboxamida ribósido (AICAR), ácido okadaico, N6-mercaptopurina ribósido, wortmanina y vinblastina. En determinados aspectos, el cáncer de páncreas es deficiente en ASS, ASL o ambos. En un aspecto adicional, la presente divulgación proporciona un método para tratar el cáncer de páncreas que comprende administrar ADI-PEG 20 aproximadamente una vez cada 3 días, aproximadamente una vez a la semana, aproximadamente dos veces a la semana, o aproximadamente una vez cada 2 semanas; en combinación con una cantidad terapéuticamente eficaz de un inhibidor de la autofagia, tal como cloroquina. A este respecto, una dosis terapéuticamente eficaz de cloroquina puede ser una dosis inicial de aproximadamente 600 mg de base seguida de 300 mg de base adicionales y una dosis única de 300 mg de base en dos días consecutivos. Esto representa una dosis total de 2,5 g de fosfato de cloroquina o 1,5 g de base en tres días. En aspectos adicionales, la dosis puede ser de aproximadamente 300 mg de base. La dosis de cloroquina, u otro inhibidor de la autofagia, puede modificarse según sea necesario por un médico experto usando dosis conocidas en la técnica. Como entenderá el experto en la técnica, el inhibidor de la autofagia se puede administrar antes, al mismo tiempo o después de una composición que comprende ADI-PEG 20. En determinados aspectos, la dosis de ADI-PEG 20 administrada para el tratamiento del cáncer de páncreas se encuentra entre aproximadamente 160 UI/m2 y aproximadamente 360 UI/m2, y en otros aspectos es de aproximadamente 160 UI/m2, aproximadamente 170 UI/m2, 180 UI/m2, 190 UI/m2, 200 UI/m2, 210 UI/m2, 220 UI/m2, 230 UI/m2, 240 UI/m2, 250 UI/m2, 260 UI/m2, 270 UI/m2, 280 UI/m2, 290 UI/m2, 300 UI/m2, 310 UI/m2, aproximadamente 320 UI/m2, aproximadamente 330 UI/m2, 340 UI/m2, aproximadamente 350 UI/m2, aproximadamente 360 UI/m2, aproximadamente 370 UI/m2, 380 UI/m2, 390 UI/m2, 400 UI/m2, 410 UI/m2, 420 UI/m2, 430 UI/m2, 440 UI/m2, 450 UI/m2, 500 UI/m2, 550 UI/m2, 600 UI/m2, 640 UI/m2, o aproximadamente 700 UI/m2. En determinados aspectos, en los que el tratamiento del cáncer de páncreas con ADI-PEG en combinación con cloroquina induce una respuesta inmunitaria contra la ADI, la presente divulgación proporciona un método para tratar el cáncer de páncreas, en el que la dosis de ADI se duplica y puede aumentarse a 640 UI/m2 por semana o más. En un aspecto particular, la IDA para el tratamiento del cáncer de páncreas se modifica con 3,5-6,5 o, en un aspecto, 4,5-5,5 moléculas de PEG por IDA. En otro aspecto, la presente divulgación proporciona un método para tratar el cáncer de páncreas mediante la administración de cloroquina, u otro inhibidor de la autofagia apropiado, en combinación con una composición que comprende ADI-PEG 20, en el que la composición comprende una ADI modificada con 5 ± 1,5 moléculas de PEG, y en un aspecto, 5 ± 1,5 moléculas de PEG de cadena lineal, y, en determinados aspectos, la composición comprende menos de aproximadamente un 0,5 % de ADI nativa (es decir, sin modificar con PEG) y/o menos de aproximadamente un 5 % de PEG libre. En un aspecto adicional, la composición comprende un tampón de histidina - HCl.
En un aspecto, la presente divulgación proporciona un método para tratar, aliviar los síntomas o inhibir la progresión del cáncer de pulmón microcítico mediante la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de ADI-PEG 20 en combinación con un inhibidor de la autofagia. En determinados aspectos, el cáncer de pulmón microcítico es deficiente en ASS, ASL o ambos. En un aspecto adicional, la presente divulgación proporciona un método para tratar el cáncer de pulmón microcítico que comprende administrar ADI-PEG 20 aproximadamente una vez cada 3 días, aproximadamente una vez a la semana, aproximadamente dos veces a la semana, o aproximadamente una vez cada 2 semanas; en combinación con una cantidad terapéuticamente eficaz de un inhibidor de la autofagia, tal como cloroquina. A este respecto, una dosis terapéuticamente eficaz de cloroquina puede ser una dosis inicial de aproximadamente 600 mg de base seguida de 300 mg de base adicionales y una dosis única de 300 mg de base en dos días consecutivos. Esto representa una dosis total de 2,5 g de fosfato de cloroquina o 1,5 g de base en tres días. En aspectos adicionales, la dosis puede ser de aproximadamente 300 mg de base. La dosis de cloroquina puede modificarse según sea necesario por un médico experto usando dosis conocidas en la técnica. Como entenderá el experto en la técnica, el inhibidor de la autofagia se puede administrar antes, al mismo tiempo o después de una composición que comprende ADI-PEG 20. En determinados aspectos, la dosis de ADI-PEG 20 administrada para el tratamiento del cáncer de pulmón microcítico se encuentra entre aproximadamente 160 UI/m2 y aproximadamente 360 UI/m2, y en otros aspectos es de aproximadamente 160 UI/m2, aproximadamente 170 UI/m2, 180 UI/m2, 190 UI/m2, 200 UI/m2, 210 UI/m2, 220 UI/m2, 230 UI/m2, 240 UI/m2, 250 UI/m2, 260 UI/m2, 270 UI/m2, 280 UI/m2, 290 UI/m2, 300 UI/m2, 310 UI/m2, aproximadamente 320 UI/m2, aproximadamente 330 UI/m2, 340 UI/m2, aproximadamente 350 UI/m2, aproximadamente 360 UI/m2, aproximadamente 370 UI/m2, 380 UI/m2, 390 UI/m2, 400 UI/m2, 410 UI/m2, 420 UI/m2, 430 UI/m2, 440 UI/m2, 450 UI/m2, 500 UI/m2, 550 UI/m2, 600 UI/m2, 640 UI/m2, o aproximadamente 700 UI/m2. En determinados aspectos, en los que el tratamiento del cáncer de pulmón microcítico con ADI-PEG en combinación con cloroquina induce una respuesta inmunitaria contra la ADI, la presente divulgación proporciona un método para tratar el cáncer de pulmón microcítico, en el que la dosis de ADI se duplica y puede aumentarse a 640 UI/m2 por semana o más. En un aspecto particular, la IDA para el tratamiento del cáncer de pulmón microcítico se modifica con 3,5-6,5 o, en un aspecto, 4,5-5,5 moléculas de PEG por IDA. En otro aspecto, la presente divulgación proporciona un método para tratar el cáncer de pulmón microcítico mediante la administración de cloroquina en combinación con una composición que comprende ADI-PEG 20, en el que la composición comprende una ADI modificada con 5 ± 1,5 moléculas de PEG y, en un aspecto, 5 ± 1,5 moléculas de PEG de cadena lineal, y, en determinados aspectos, la composición comprende menos de aproximadamente un 0,5 % de ADI nativa (es decir, sin modificar con PEG) y/o menos de aproximadamente un 5 % de PEG libre. En un aspecto adicional, la composición comprende un tampón de histidina - HCl.
En un aspecto, la presente divulgación proporciona un método para tratar, aliviar los síntomas o inhibir la progresión de sarcomas (incluyendo, pero sin limitación, sarcomas metastásicos) mediante la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de ADI-PEG 20 en combinación con un inhibidor de la autofagia. En determinados aspectos, el sarcoma es deficiente en ASS, ASL o ambos. En un aspecto adicional, la presente divulgación proporciona un método para tratar un sarcoma que comprende administrar ADI-PEG 20 aproximadamente una vez cada 3 días, aproximadamente una vez a la semana, aproximadamente dos veces a la semana, o aproximadamente una vez cada 2 semanas; en combinación con una cantidad terapéuticamente eficaz de un inhibidor de la autofagia, tal como cloroquina. A este respecto, una dosis terapéuticamente eficaz de cloroquina puede ser una dosis inicial de aproximadamente 600 mg de base seguida de 300 mg de base adicionales y una dosis única de 300 mg de base en dos días consecutivos. Esto representa una dosis total de 2,5 g de fosfato de cloroquina o 1,5 g de base en tres días. En aspectos adicionales, la dosis puede ser de aproximadamente 300 mg de base. La dosis de cloroquina puede modificarse según sea necesario por un médico experto usando dosis conocidas en la técnica. Como entenderá el experto en la técnica, el inhibidor de la autofagia se puede administrar antes, al mismo tiempo o después de una composición que comprende ADI-PEG 20. En determinados aspectos, la dosis de ADI-PEG 20 administrada para el tratamiento de un sarcoma se encuentra entre aproximadamente 160 UI/m2 y aproximadamente 360 UI/m2, y en otros aspectos es de aproximadamente 160 UI/m2, aproximadamente 170 UI/m2, 180 UI/m2, 190 UI/m2, 200 UI/m2, 210 UI/m2, 220 UI/m2, 230 UI/m2, 240 UI/m2, 250 UI/m2, 260 UI/m2, 270 UI/m2, 280 UI/m2, 290 UI/m2, 300 UI/m2, 310 UI/m2, aproximadamente 320 UI/m2, aproximadamente 330 UI/m2, 340 UI/m2, aproximadamente 350 UI/m2, aproximadamente 360 UI/m2, aproximadamente 370 UI/m2, 380 UI/m2, 390 UI/m2, 400 UI/m2, 410 UI/m2, 420 UI/m2, 430 UI/m2, 440 UI/m2, 450 UI/m2, 500 UI/m2, 550 UI/m2, 600 UI/m2, 640 UI/m2, o aproximadamente 700 UI/m2. En determinados aspectos, en los que el tratamiento de un sarcoma con ADI-PEG en combinación con cloroquina induce una respuesta inmunitaria contra la ADI, la presente divulgación proporciona un método para tratar un sarcoma, en el que la dosis de ADI se duplica y puede aumentarse a 640 UI/m2 por semana o más. En un aspecto particular, la IDA para el tratamiento de un sarcoma se modifica con 3,5-6,5, o en un aspecto, 4,5-5,5 moléculas de PEG por IDA. En otro aspecto, la presente divulgación proporciona un método para tratar un sarcoma mediante la administración de cloroquina en combinación con una composición que comprende ADI-PEG 20, en el que la composición comprende una ADI modificada con 5 ± 1,5 moléculas de PEG y, en un aspecto, 5 ± 1,5 moléculas de PEG de cadena lineal, y, en determinados aspectos, la composición comprende menos de aproximadamente un 0,5 % de ADI nativa (es decir, sin modificar con PEG) y/o menos de aproximadamente un 5 % de PEG libre. En un aspecto adicional, la composición comprende un tampón de histidina - HCl.
En un aspecto, la presente divulgación proporciona un método para tratar, aliviar los síntomas o inhibir la progresión de un melanoma mediante la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de ADI-PEG 20 en combinación con docetaxel. En determinados aspectos, el melanoma es deficiente en ASS, ASL o ambos. En un aspecto adicional, la presente divulgación proporciona un método para tratar un melanoma que comprende administrar ADI-PEG 20 aproximadamente una vez cada 3 días, aproximadamente una vez a la semana, aproximadamente dos veces a la semana, o aproximadamente una vez cada 2 semanas; en combinación con una cantidad terapéuticamente eficaz de docetaxel. A este respecto, una dosis terapéuticamente eficaz de docetaxel puede comprender 75 mg/m2 o 100 mg/m2 administrados por vía intravenosa durante entre 30 minutos y 1 hora aproximadamente cada 3 semanas. Como entenderá el médico experto, la dosis de docetaxel puede modificarse dependiendo de la indicación de la enfermedad y/o los tratamientos anteriores, y el docetaxel puede administrarse antes, al mismo tiempo o después de una composición que comprende ADI-PEG 20. En determinados aspectos, la dosis de ADI-PEG 20 administrada para el tratamiento de un melanoma se encuentra entre aproximadamente 160 UI/m2 y aproximadamente 360 UI/m2, y en otros aspectos es de aproximadamente 160 UI/m2, aproximadamente 170 UI/m2, 180 UI/m2, 190 UI/m2, 200 UI/m2, 210 UI/m2, 220 UI/m2, 230 UI/m2, 240 UI/m2, 250 UI/m2, 260 UI/m2, 270 UI/m2, 280 UI/m2, 290 UI/m2, 300 UI/m2, 310 UI/m2, aproximadamente 320 UI/m2, aproximadamente 330 UI/m2, 340 UI/m2, aproximadamente 350 UI/m2, aproximadamente 360 UI/m2, aproximadamente 370 UI/m2, 380 UI/m2, 390 UI/m2, 400 UI/m2, 410 UI/m2, 420 UI/m2, 430 UI/m2, 440 UI/m2, 450 UI/m2, 500 UI/m2, 550 UI/m2, 600 UI/m2, 640 UI/m2, o aproximadamente 700 UI/m2. En determinados aspectos, en los que el tratamiento de un melanoma con ADI-PEG en combinación con docetaxel induce una respuesta inmunitaria contra la ADI, la presente divulgación proporciona un método para tratar un melanoma, en el que la dosis de ADI se duplica y puede aumentarse a 640 UI/m2 por semana o más. En un aspecto particular, la IDA para el tratamiento de un melanoma se modifica con 3,5-6,5, o en un aspecto, 4,5 - 5,5, moléculas de PEG por ADI. En otro aspecto, la presente divulgación proporciona un método para tratar un melanoma mediante la administración de docetaxel en combinación con una composición que comprende ADI-PEG 20, en el que la composición comprende una ADI modificada con 5 ± 1,5 moléculas de PEG y, en un aspecto, 5 ± 1,5 moléculas de PEG de cadena lineal, y, en determinados aspectos, la composición comprende menos de aproximadamente un 0,5 % de ADI nativa (es decir, sin modificar con PEG) y/o menos de aproximadamente un 5 % de PEG libre. En un aspecto adicional, la composición comprende un tampón de histidina - HCl.
En un aspecto, la presente divulgación proporciona un método para tratar, aliviar los síntomas o inhibir la progresión de un melanoma mediante la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de ADI-PEG 20 en combinación con cisplatino. En determinados aspectos, el melanoma es deficiente en ASS, ASL o ambos. En un aspecto adicional, la presente divulgación proporciona un método para tratar un melanoma que comprende administrar ADI-PEG 20 aproximadamente una vez cada 3 días, aproximadamente una vez a la semana, aproximadamente dos veces a la semana, o aproximadamente una vez cada 2 semanas; en combinación con una cantidad terapéuticamente eficaz de cisplatino. A este respecto, una dosis terapéuticamente eficaz de cisplatino puede comprender la administración una vez por ciclo (cada 3-4 semanas) a 50-100 mg/m2, o diariamente durante 5 días para un total de 100 mg/m2 por ciclo. Como entenderá el médico experto, la dosis de cisplatino se puede modificar dependiendo de la indicación de la enfermedad, el paciente individual, y/o tratamientos anteriores, y el cisplatino puede administrarse antes, al mismo tiempo o después de una composición que comprende ADI-PEG 20. En determinados aspectos, la dosis de ADI-PEG 20 administrada para el tratamiento de un melanoma se encuentra entre aproximadamente 160 UI/m2 y aproximadamente 360 UI/m2, y en otros aspectos es de aproximadamente 160 UI/m2, aproximadamente 170 UI/m2, 180 UI/m2, 190 UI/m2, 200 UI/m2, 210 UI/m2, 220 UI/m2, 230 UI/m2, 240 UI/m2, 250 UI/m2, 260 UI/m2, 270 UI/m2, 280 UI/m2, 290 UI/m2, 300 UI/m2, 310 UI/m2, aproximadamente 320 UI/m2, aproximadamente 330 UI/m2, 340 UI/m2, aproximadamente 350 UI/m2, aproximadamente 360 UI/m2, aproximadamente 370 UI/m2, 380 UI/m2, 390 UI/m2, 400 UI/m2, 410 UI/m2, 420 UI/m2, 430 UI/m2, 440 UI/m2, 450 UI/m2, 500 UI/m2, 550 UI/m2, 600 UI/m2, 640 UI/m2, o aproximadamente 700 UI/m2. En determinados aspectos, en los que el tratamiento de un melanoma con ADI-PEG en combinación con cisplatino induce una respuesta inmunitaria contra la ADI, la presente divulgación proporciona un método para tratar un melanoma, en el que la dosis de ADI se duplica y puede aumentarse a 640 UI/m2 por semana o más. En un aspecto particular, la IDA para el tratamiento de un melanoma se modifica con 3,5-6,5, o en un aspecto, 4,5 - 5,5, moléculas de PEG por ADI. En otro aspecto, la presente divulgación proporciona un método para tratar un melanoma mediante la administración de cisplatino en combinación con una composición que comprende ADI-PEG 20, en el que la composición comprende una ADI modificada con 5 ± 1,5 moléculas de PEG y, en un aspecto, 5 ± 1,5 moléculas de PEG de cadena lineal, y, en determinados aspectos, la composición comprende menos de aproximadamente un 0,5 % de ADI nativa (es decir, sin modificar con PEG) y/o menos de aproximadamente un 5 % de PEG libre. En un aspecto adicional, la composición comprende un tampón de histidina - HCl.
En un aspecto, la presente divulgación proporciona un método para tratar, aliviar los síntomas o inhibir la progresión de carcinoma de células renales mediante la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de ADI-PEG 20 en combinación con un inhibidor de mTOR, tal como, pero sin limitación, rapamicina, temsirolimus, everolimus, y ridaforolimus. En determinados aspectos, el carcinoma de células renales es deficiente en ASS, ASL o ambos. En un aspecto adicional, la presente divulgación proporciona un método para tratar el carcinoma de células renales que comprende administrar ADI-PEG 20 aproximadamente una vez cada 3 días, aproximadamente una vez a la semana, aproximadamente dos veces a la semana, o aproximadamente una vez cada 2 semanas; en combinación con una cantidad terapéuticamente eficaz de un inhibidor de mTOR, tal como rapamicina. La dosis de rapamicina, u otro inhibidor de mTOR, puede determinarse según sea necesario por un médico experto usando dosis conocidas en la técnica. Como entenderá el experto en la técnica, el inhibidor de mTOR se puede administrar antes, al mismo tiempo o después de una composición que comprende ADI-PEG 20. En determinados aspectos, la dosis de ADI-PEG 20 administrada para el tratamiento de carcinoma de células renales se encuentra entre aproximadamente 160 UI/m2 y aproximadamente 360 UI/m2, y en otros aspectos es de aproximadamente 160 UI/m2, aproximadamente 170 UI/m2, 180 UI/m2, 190 UI/m2, 200 UI/m2, 210 UI/m2, 220 UI/m2, 230 UI/m2, 240 UI/m2, 250 UI/m2, 260 UI/m2, 270 UI/m2, 280 UI/m2, 290 UI/m2, 300 UI/m2, 310 UI/m2, aproximadamente 320 UI/m2, aproximadamente 330 UI/m2, 340 UI/m2, aproximadamente 350 UI/m2, aproximadamente 360 UI/m2, aproximadamente 370 UI/m2, 380 UI/m2, 390 UI/m2, 400 UI/m2, 410 UI/m2, 420 UI/m2, 430 UI/m2, 440 UI/m2, 450 UI/m2, 500 UI/m2, 550 UI/m2, 600 UI/m2, 640 UI/m2, o aproximadamente 700 UI/m2. En determinados aspectos, en los que el tratamiento de carcinoma de células renales con ADI-PEG en combinación con cloroquina induce una respuesta inmunitaria contra la ADI, la presente divulgación proporciona un método para tratar el carcinoma de células renales, en el que la dosis de ADI se duplica y puede aumentarse a 640 UI/m2 por semana o más. En un aspecto particular, la IDA para el tratamiento del carcinoma de células renales se modifica con 3,5-6,5 o, en un aspecto, 4,5-5,5 moléculas de PEG por IDA. En otro aspecto, la presente divulgación proporciona un método para tratar el carcinoma de células renales mediante la administración de rapamicina, u otro inhibidor de mTOR apropiado, en combinación con una composición que comprende ADI-PEG 20, en el que la composición comprende una ADI modificada con 5 ± 1,5 moléculas de PEG, y en un aspecto, 5 ± 1,5 moléculas de PEG de cadena lineal, y, en determinados aspectos, la composición comprende menos de aproximadamente un 0,5 % de ADI nativa (es decir, sin modificar con PEG) y/o menos de aproximadamente un 5 % de PEG libre. En un aspecto adicional, la composición comprende un tampón de histidina - HCl.
En determinados aspectos, la presente divulgación proporciona un método para tratar, aliviar los síntomas o inhibir la progresión de un cáncer en un paciente que comprende administrar al paciente una composición que comprende ADI como se describe en el presente documento, en el que el cáncer no es melanoma, cáncer de páncreas, cáncer de próstata, cáncer de pulmón microcítico, mesotelioma, leucemia linfática, leucemia mielógena crónica, linfoma, hepatoma, ni sarcoma.
La presente divulgación también proporciona métodos para tratar, aliviar los síntomas o inhibir la progresión de un trastorno inflamatorio en un paciente que comprende administrar al paciente una composición que comprende ADI (p. ej., ADI-PEG, en particular ADI-PEG 20), como se describe en el presente documento, en solitario o en combinación con uno o más agentes terapéuticos diferentes. En un aspecto, la presente divulgación también proporciona métodos para tratar, aliviar los síntomas o inhibir la progresión de una enfermedad inflamatoria intestinal en un paciente que comprende administrar al paciente una composición que comprende ADI (p. ej., ADI-PEG, en particular ADI-PEG 20), como se describe en el presente documento, en solitario o en combinación con uno o más agentes terapéuticos diferentes. A este respecto, la presente divulgación proporciona métodos para tratar, aliviar los síntomas o inhibir la progresión de enfermedad de Crohn o colitis ulcerosa en un paciente que comprenden administrar al paciente una composición que comprende ADI (p. ej., ADI-PEG, en particular ADI-PEG 20), como se describe en el presente documento, en solitario o en combinación con uno o más agentes terapéuticos diferentes.
En otro aspecto, la presente divulgación proporciona un método para tratar, aliviar los síntomas o inhibir la progresión de un cáncer en un paciente que comprende administrar al paciente una composición que comprende ADI, y opcionalmente uno o más agentes terapéuticos adicionales, como se describe en el presente documento, en el que el cáncer es deficiente en ASS, ASL o ambos. A este respecto, la deficiencia de ASS o ASL puede ser una reducción de la expresión medida por la expresión de ARNm o expresión de proteína, o puede ser una reducción de la actividad de la proteína, y en general comprende una reducción estadísticamente significativa de la expresión o actividad según lo determinado por el experto en la técnica. La expresión o actividad reducida de ASS o a Sl puede ser una reducción de la expresión o actividad de aproximadamente el 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 % o más, en comparación con la expresión o actividad en una muestra de control adecuada que se sabe que no tiene cáncer. En determinados aspectos, la expresión o actividad de ASS o ASL se reduce al menos dos veces en comparación con la expresión o actividad en una muestra de control sin cáncer.
En determinados aspectos, la expresión o actividad reducida de ASS o ASL es resultado de la metilación del promotor de ASS o ASL. En otro aspecto, la reducción de la expresión o actividad de ASS o ASL es resultado de una mutación de ADN (p. ej., una o más mutaciones puntuales, pequeñas supresiones, inserciones y similares) o una anomalía cromosómica que da lugar a supresión del gen. En un aspecto, el cáncer es negativo para ASS o ASL, lo que significa que no se observa expresión ni actividad.
La reducción de la expresión o actividad de ASS o ASL se puede medir usando cualquier método conocido en la técnica, tales como, pero sin limitación, PCR cuantitativa, inmunohistoquímica, ensayos de actividad enzimática (p. ej., ensayo para medir la conversión de citrulina en argininosuccinato o la conversión de argininosuccinato en arginina y fumarato; p. ej., véase la figura 1), y similares.
Por lo tanto, la presente divulgación proporciona métodos para tratar, aliviar los síntomas o inhibir la progresión de un cáncer en un paciente que comprende administrar al paciente una composición que comprende ADI como se describe en el presente documento, en los que el cáncer presenta expresión o actividad reducida de ASS o ASL, o ambas, en los que el cáncer incluye, pero sin limitación, leucemia (p. ej., leucemia mieloide aguda y leucemia mieloide aguda recidivante), melanoma, sarcomas (incluyendo, pero sin limitación, sarcomas metastásicos, leiomiosarcoma uterino), cáncer de páncreas, cáncer de próstata (tal como, pero sin limitación, cáncer de próstata resistente a hormonas), mesotelioma, leucemia linfática, leucemia mielógena crónica, linfoma, cáncer de pulmón microcítico, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer colorrectal, cáncer gástrico (incluyendo, pero sin limitación, adenocarcinoma gástrico), glioma, glioblastoma multiforme, retinoblastoma, neuroblastoma, cáncer de pulmón no microcítico (CPNM), cáncer de riñón (incluyendo, pero sin limitación, carcinoma de células renales), cáncer de vejiga, cáncer de útero, cáncer esofágico, cáncer cerebral, cánceres de cabeza y cuello (incluyendo, pero sin limitación, carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello; cáncer de lengua), cáncer de cuello de útero, cáncer de testículos, vesícula biliar, colangiocarcinoma y cáncer de estómago.
Diversos estudios en la bibliografía han demostrado que ASS es deficiente en los siguientes tumores:
Tabla 1: Tumores deficientes en ASS
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(continuación)
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Por consiguiente, el tratamiento de estos cánceres deficientes en ASS se contempla específicamente en el presente documento, con ADI-PEG 20 en solitario o en combinación con otros tratamientos.
La presente divulgación proporciona además métodos para tratar, aliviar los síntomas o inhibir la progresión del cáncer en un paciente que comprende administrar al paciente una composición que comprende ADI como se describe en el presente documento (p. ej., ADI-PEG y en particular ADI-PEG 20), en combinación con un inhibidor de la autofagia. En un aspecto, la presente divulgación proporciona métodos tratar el cáncer en un paciente que comprenden administrar al paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición que comprende ADI como se describe en el presente documento en combinación con un inhibidor de la autofagia en el que el cáncer es cáncer de páncreas o cáncer de pulmón microcítico.
En determinados aspectos, la presente divulgación proporciona métodos de tratamiento donde la administración de las composiciones que comprenden ADI descritas en el presente documento agota la arginina en el plasma durante al menos un mes, 2 meses, 3 meses, 4 meses, 5 meses, 6 meses o más.
Ejemplos
Ejemplo 1
LA ARGININA DESIMINASA REDUCE LA VIABILIDAD DE LAS CÉLULAS DE LEUCEMIA MIELOIDE AGUDA DEFICIENTE EN ARGININOSUCCINATO SINTASA
La leucemia mieloide aguda (AML) es la leucemia más común en adultos y la segunda leucemia más común en niños, lo que representa una parte significativa de los costes de atención médica con diez mil casos diagnosticados al año solo en los EE.UU. La terapia basada en enzimas en forma de asparaginasa ha revolucionado el tratamiento de la leucemia linfoblástica aguda y existe un interés creciente en aprovechar defectos metabólicos tratables análogos en la AML. Los tumores auxotróficos de arginina debido a la deficiencia de la enzima limitante de la velocidad para la producción de arginina, argininosuccinato sintetasa (ASS), son susceptibles a las enzimas que degradan la arginina.
En este ejemplo, se determinó si la negatividad de ASS predeciría la eficacia de la arginina desiminasa pegilada (ADI-PEG 20) usando líneas celulares de AML y muestras de AML primarias. Se identificó una falta de proteína ASS en tres de las siete líneas celulares leucémicas (K562, Kasumi y KG-1) y en las nueve muestras de pacientes con AML de cariotipo citogenéticamente normal y anormal. La metilación del promotor de ASS se correlacionó con niveles reducidos de ARNm de ASS y ausencia de expresión de ASS. Los trefinos de médula ósea de pacientes con AML revelaron ausencia de proteína ASS en el 87 % (46/53) de las muestras mediante inmunohistoquímica, lo que indica que la expresión de a Ss puede usarse como un biomarcador de respuesta a ADI-PEG 20 in vivo. Se observaron niveles aumentados de ARNm de ASS y expresión de proteína ASS detectable en la leucemia promielocítica aguda con la translocación t(15;17).
De manera significativa, ADI-PEG 20 redujo la viabilidad de las líneas de AML negativas para ASS mientras que las líneas de control positivas para ASS, Fujioka y U937, fueron resistentes a la privación de arginina inducida por fármacos. Se han identificado muestras primarias de AML negativas para ASS con buen injerto en ratones NOD/SCID, y se han iniciado los estudios de la eficacia de ADI-PEG 20 utilizando este modelo de xenoinjerto primario de AML. Basándose en los resultados descritos en el presente documento y la eficacia potencial con baja toxicidad de la privación de arginina en seres humanos, se ha planificado un ensayo de fase II de ADI-PEG 20 en pacientes con AML recidivante.
Ejemplo 2
LA INHIBICIÓN DE LA AUTOFAGIA AUMENTA LA MUERTE CELULAR INDUCIDA POR ARGININA DESIMINASA DE CÉLULAS DE ADENOCARCINOMA PANCREÁTICO DEFICIENTE EN ARGININOSUCCINATO SINTASA
La función de la autofagia y su contribución a la muerte celular es controvertida. Se planteó la hipótesis de que la autofagia es protectora en el contexto de la privación de arginina y que la inhibición de la autofagia por hidroxicloroquina (ChQ) aumentaría la muerte celular.
La línea celular de cáncer de páncreas humano MIA-PaCa2 se trató in vitro e in vivo con arginina desiminasa pegilada (ADI-PEG) en solitario o en presencia de ChQ. La muerte celular se midió mediante yoduro de propidio (PI)-FACS para determinar el contenido de ADN sub-Gi, y la apoptosis se evaluó mediante citometría de flujo de Anexina V-PI. La escisión de la caspasa 3 se evaluó mediante transferencias de Western y ELISA. La autofagia se midió evaluando los niveles de expresión de LC3 y nucleoporina p62 (p62) mediante transferencias de Western y ELISA.
Se realizaron experimentos in vivo generando xenoinjertos subcutáneos en ratones atímicos seguidos de inyecciones intraperitoneales de PBS, ADI-PEG, ChQ o una combinación de ADI-PEG y ChQ. En el momento del sacrificio, se extrajeron los tumores para su análisis. Los lisados tumorales se analizaron mediante transferencia de Western para caspasa 3 y p62. También se realizaron ensayos de tinción inmunohistoquímica para caspasa 3 activada y fragmentación de ADN (TUNEL).
Para determinar si ADI induce apoptosis y autofagia de una manera dependiente de caspasa, las células se incubaron con ADI-PEG o una combinación de ADI-PEG y ZVAD-fmk, un inhibidor de pan-caspasa. Como se muestra en la figura 2A, la incubación con ADI-PEG aumentó el número de células en sub-Go/Gi, y este efecto fue reversible con la incubación conjunta del inhibidor de pan-caspasa ZVAD-fmk. La incubación de células de cáncer de páncreas in vitro con ADI-PEG (0,3 |jg/ml) durante 72 horas indujo la despolarización de la Anexina V, otro indicador de la apoptosis (figura 2B). Además, se demostró que la ADI induce la escisión de caspasa y la conjugación de LC3B con PE a las 72 horas de una manera dependiente de la dosis. Estos resultados indicaron que la ADI induce la apoptosis dependiente de caspasa y la autofagia in vitro.
Para determinar si la inhibición de la autofagia potencia la apoptosis inducida por ADI, las células se cultivaron con ADI-PEG (0,3 jg/m l) con o sin ChQ (5 jM ) durante 72 horas. El análisis de transferencia de Western reveló una inducción de la apoptosis por ADI medida por la escisión de la caspasa 3 (figura 3). Los niveles de p62, LC3B-I y LC3B-II se midieron mediante análisis de transferencia de Western con el fin de examinar el flujo autofágico. La adición de ChQ disminuyó el flujo autofágico como se muestra por un aumento en el nivel de p62 y un aumento en la acumulación tanto de LC3B-I como de LC3B-II (figura 3). Estos resultados demuestran que la ADI potenciada por ChQ indujo la apoptosis e inhibió el flujo autofágico in vitro.
Para examinar si la ChQ altera la cantidad de muerte celular apoptótica o no apoptótica cuando se usa en combinación con ADI, las células se incubaron con ADI-PEG en solitario o una combinación de ADI-PEG y ChQ. La adición de ChQ al cultivo celular condujo a un aumento en el porcentaje de células en sub-Go/Gi (figura 4B). En cambio, los cultivos incubados con ADI-PEG y ADI-PEG con ChQ mostraron un porcentaje similar de células positivas para Anexina V (figura 4A). Por consiguiente, estos resultados indican que la ChQ potencia la muerte celular no apoptótica in vitro.
Para evaluar el efecto de la ChQ sobre la supresión del crecimiento tumoral dependiente de ADI, se establecieron xenoinjertos subcutáneos de MIA PaCa-2 en ratones atímicos. A continuación, los ratones se trataron con PBS, ADI-PEG, ChQ o ADI-PEG ChQ durante hasta siete semanas. Los volúmenes tumorales se midieron dos veces por semana. Como se muestra en la figura 5, los ratones tratados con ADI-PEG ChQ tenían un volumen tumoral significativamente menor en comparación con los ratones tratados con ADI-PEG en solitario. Tras la eutanasia, los tumores se conservaron en formalina al 10 % y se tiñeron para determinar los marcadores de apoptosis, incluida la caspasa 3 activa, el aumento de p62, y la escisión del ADN (figura 6). Estos resultados demuestran que una combinación de ADI-PEG y ChQ exhibió una supresión sinérgica sobre el crecimiento tumoral.
En resumen, la privación de arginina indujo la autofagia y la muerte celular en líneas celulares deficientes en ASS. Se demostró que la autofagia desempeñaba un papel protector en la privación de arginina para las células de adenocarcinoma de páncreas, y la inactivación de la autofagia por hidroxicloroquina dio como resultado una supresión tumoral mejorada in vivo.
Ejemplo 3
LA ARGININA DESIMINASA INHIBE EL CRECIMIENTO TUMORAL DEL CÁNCER DE PULMÓN MICROCÍTICO DEFICIENTE EN ARGININOSUCCINATO SINTASA
El cáncer de pulmón microcítico (CPM) se caracteriza por una fuerte respuesta inicial a la quimioterapia, aunque la mayoría de los pacientes sufren una recaída (Dowell, Am J med Sci 339(1):68-76, 2010; Rodriguez y Lilenbaum, Curr Oncol Rep 12(5):327-334, 2010). En aquellos pacientes en los que falla la quimioterapia de primera línea, la probabilidad de respuesta a los tratamientos secundarios permanece alrededor del 10 %, y la supervivencia general en estos pacientes es de solo 3-4 meses. Además, el tratamiento actual carece de especificidad tumoral y da como resultado numerosas toxicidades y, en consecuencia, puede limitar la administración de agentes terapéuticos por debajo de la dosis máxima eficaz (Demedts et al, Eur Respir J 35(1):202-215, 2010; Dowell, Am J med Sci 339(1):68-76, 2010; Rodriguez y Lilenbaum, Curr Oncol Rep 12(5):327-334, 2010). Esta situación pone de relieve la necesidad del desarrollo continuo de agentes anticancerosos eficaces con altos índices terapéuticos.
Este ejemplo describe el grado de auxotrofia de la arginina en el CPM y la eficacia de la terapia con arginina ADI-PEG 20 en esta enfermedad.
Líneas celulares, anticuerpos y productos químicos
Se obtuvo un panel de 10 CPM del banco de células del Ludwig Institute for Cancer Research, New York Branch en el Memorial Sloan-Kettering Cancer Center (MSKCC). Las células se establecieron en MSKCC o se adquirieron en la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC (American Type Culture Collection); Manassas, VA, EE.UU.). Las células se cultivaron en medio RPMI-1640 complementado con suero fetal bovino al 10 % v/v, penicilina/estreptomicina al 5 % p/v (penicilina G 5000 unidades mM por sulfato de estreptomicina 5000 mg mM) y L-glutamina al 1 %. Se evaluó la expresión celular de la argininosuccinato sintetasa (ASS) por transferencia de Western usando un anticuerpo anti-ASS (Clon 25, BD Biosciences, San Jose, CA, EE.UU.). Se usaron LC3B (Cell Signaling, Danvers, MA, EE.UU.), caspasa-3 activa (Cell Signaling), caspasa-3 total (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA, EE.UU.) y actina (GeneTex, Irvine, CA, EE.UU) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se obtuvo clorhidrato de topotecán en Axxora (San Diego, CA, EE.UU.), y se obtuvo cloroquina en Sigma-Aldrich (St Louis, MO, EE.UU.).
Inmunohistoquímica
Se tiñeron tumores y tejidos normales usando el anticuerpo anti-ASS 195-21-1 (LICR, Nueva York, NY, EE.UU.), como se detalla en Jungbluth et al (Mod Pathol 23(Suppl 1):387A, 2010).
Análisis de transferencia de Western
Se prepararon lisados de células completas de líneas celulares de CPM en tampón de lisis RIPA (Tris-HCl 50 mM, SDS al 0,05 %, desoxicolato de sodio al 0,5 %, NaCl 150 mM, EDTA 5 mM más tampón de cóctel inhibidor de proteasa (Roche Applied Science, Indianápolis, IN, EE.UU.). Las cantidades de proteínas se determinaron mediante el ensayo de proteínas Pierce BCA (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, EE.UU.), y se resolvieron cantidades iguales de proteínas mediante SDS-PAGE utilizando geles del 4 - 12 % (NuPAGE, Invitrogen Life Technologies). Las proteínas se transfirieron a membranas de PVDF (Millipore, Billerica, MA, EE.UU.), se bloquearon con BSA al 5 % y se sondaron con los anticuerpos adecuados durante una noche a 4 °C. Después del lavado, las membranas se sondaron a continuación con el anticuerpo secundario apropiado antes de que se visualizaran finalmente las proteínas utilizando reactivo ECL (Perkin-Elmer, Fremont CA, e E.UU.).
PCR cuantitativa en tiempo real
Para la extracción de ARN, se disolvieron sedimentos celulares en 600 |jl de solución de reactivo TRI (Ambion, Austin, TX, EE.UU.) y a continuación se añadieron 60 j l de bromocloropano. A continuación, se añadieron al tubo aproximadamente dos gotas de compuesto de temperatura de corte óptima (Miles Inc., Elkhart, IN, EE.UU.) y la mezcla se agitó vorticialmente y se dejó en reposo a TA durante 2 min. Después de la centrifugación a 14.000 r.p.m. durante 10 min, el sobrenadante se eliminó a un tubo nuevo donde se añadió un volumen igual de isopropanol al 100 % para precipitar el ARN. Después de la centrifugación a 14.000 r.p.m., el sedimento de ARN se lavó en etanol al 75 % y se centrifugó de nuevo antes de resuspensión en 50 j l de agua tibia. La concentración de ARN se determinó usando un nanofotómetro (Implen Inc., Westlake Village, CA, EE.UU.).
Para la amplificación de ADNc, se añadieron 1,5 jg de ARN a una mezcla de reacción de ADNc que comprendía tampón de reacción 10X (Qiagen, Valencia, CA, EE.UU.), DNTPasa 5 mM (Qiagen), Oligo DT (Qiagen), transcriptasa inversa (Invitrogen Life Technologies) y RNAse Out (Invitrogen) en un volumen total de 20 jl. Para reacciones de PCR cuantitativa en tiempo real (qRT), se mezclaron 1,5 j l de ADNc con una mezcla de reacción que contenía 5 j l de SYBRGreen (Invitrogen), 0,02 j l de Rox, 0,2 j l de cebadores y agua para un volumen de reacción total de 10 jl. Para el ASS, los cebadores fueron F: 5'-TTTAAGCAGACTAAGGGG-3' (SEQ ID NO:3) y R: 5'-CCAT CCCAGGTTATAAGCACA-3' (SEQ ID NO:4). El análisis de qRT-PCR se realizó utilizando un sistema de PCR en tiempo real rápido 7500 (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, EE.UU.), con GAPDH utilizado para la normalización de la expresión. La cuantificación relativa de la expresión génica (cantidad relativa de ARN diana) se determinó usando la ecuación 2('ññCT).
Ensayos de proliferación
Para evaluar el efecto antiproliferativo de ADI-PEG 20 sobre las células adherentes, las células se colocaron en placas con una densidad de 2 x 103 células por pocillo en una placa de 96 micropocillos de cultivo tisular y se dejaron adherir durante una noche. Al día siguiente, las células se trataron con ADI-PEG 20 (DesigneRx Pharmaceuticals, Vacaville, CA, EE.UU., una subsidiaria de Polaris Group, San Diego, CA, EE.UU.) en un intervalo de 0 a 10 mUI ml-1. Después de incubación durante 120 h, se determinó la viabilidad celular usando (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-5-(3-carboximetoxifenil)-2-(4-sulfofenil)-2H-tetrazolio) (MTS, CellTiter 96 AQueous One Solution, Promega, Madison, WI, EE.UU.), de acuerdo con el protocolo del fabricante. Se añadieron veinte microlitros de reactivo MTS a los pocillos de ensayo y control apropiados antes de incubar la placa durante 2 h a 37 °C y leer la absorbancia a 490 nm. La absorbancia absoluta para cada tratamiento se determinó restando la absorbancia MTS de fondo y se calculó la desviación estándar y media. El efecto del inhibidor de la autofagia cloroquina (Sigma) sobre la proliferación celular se evaluó usando el ensayo MTS.
Para evaluar la actividad de ADI-PEG 20 en células no adherentes, las células se colocaron en placas a una densidad de 1 x 105 células por pocillo en una placa de 24 pocillos de cultivo tisular. A continuación, se añadió medio adicional que contenía ADI-PEG 20 para concentraciones finales que variaban de 0 a 10 mUI ml-1. Para medir los cambios en la proliferación después de la incubación con ADI-PEG 20 durante 120 h, las células se recogieron, se lavaron y se lisaron en tampón RIPA. A continuación, se determinó la proteína total para cada tratamiento usando el ensayo de proteína BSA como una medida del número total de células. Todos los tratamientos se realizaron al menos por triplicado.
Tinción con yoduro de propidio para tinción sub-G1
La apoptosis se midió mediante FACS de células teñidas con yoduro de propidio como se detalla por Riccardi et al (Riccardi y Nicoletti, Nat Protoc 1(3):1458-1461,2006). Las células se colocaron en placas de 24 pocillos y se trataron con ADI-PEG 20 durante 120 h. A continuación, las células se recogieron, se lavaron y se fijaron en etanol al 70 %. A continuación, el ADN se tiñó usando 20 jg ml-1 de yoduro de propidio que contenía 10 jg ml-1 de ARNasa A libre de ADNasa (Sigma-Aldrich). A continuación, se leyeron las células en un BD FACSCalibur (BD Biosciences) y se analizaron usando el software Flow Jo (Tree Star, Ashland, OR, EE.UU.).
Regulación negativa de ARN interferente pequeño de ASS
Para evaluar adicionalmente la importancia de la expresión de ASS celular en respuesta al tratamiento con ADI-PEG 20, se silenció la expresión de ASS mediante el uso de ARNip específico de ASS. Se obtuvieron construcciones de ARN de interferencia pequeño en Integrated DNA technologies (IDT, Coralville, IA, EE.UU.) contra la región codificante de ASS. Solo se seleccionaron construcciones de ARNip sin otras coincidencias de transcripción para experimentos adicionales.
Se pusieron en placas SW1222 positivas para argininosuccinato sintetasa a una densidad de 6 x 105 células por placa en 8 ml de medio en placas de cultivo tisular de 100 mm y se dejaron adherir durante una noche. Para la transfección, se añadieron 10 j l de ARNip de ASS 10 jM a 990 j l de medio Opti-MEM y se diluyeron 20 j l de reactivo Lipofectamine 2000 en 980 j l de medio Opti-MEM (Invitrogen Life Technologies). Estas mezclas se incubaron durante 5 min a TA antes de mezclarse e incubarse durante 20 min más a TA. A continuación, se añadió la mezcla de transfección a las células y se incubó durante 24 h a 37 °C. En este momento, las preparaciones de las células transfectadas se sacaron de la placa de cultivo y se colocaron en placas de 96 pocillos para evaluar el efecto de ADI-PEG 20 sobre el crecimiento de las células transfectadas. Se incubaron células adicionales durante 72 h más antes de procesarlas por PCR y análisis de transferencia de Western.
Estudio de eficacia de la arginina desiminasa-PEG20 in vivo
Se encontró que el CPM negativo para ASS SK-LC-13 era tumorigénico y se usó posteriormente para determinar la eficacia de a DI-PEG 20 in vivo. La actividad de ADI-PEG 20 también se evaluó en ratones con xenoinjertos de CPM positivo para ASS NCI-H69. Se establecieron xenoinjertos de cáncer de pulmón microcítico en ratones desnudos BALB/c hembra, de 3-4 semanas de edad que pesaban ~20 g (Charles River Labs, Wilmington, MA, EE.UU.). Para establecer los tumores, se mezclaron 10 x 106 células en medio 1:1 con Matrige1High Concentration (BD Biosciences) y se inyectaron por vía subcutánea en el área abdominal de los ratones. Se midió regularmente el crecimiento del tumor y se calculó el volumen tumoral usando la fórmula (VT = (largo x ancho2)/2). Todos los estudios en animales fueron aprobados por el MSKCC Institutional Animal Care and Use Committee. Los ratones fueron sacrificados cuando los tumores alcanzaron un volumen aproximado de 1000 mm3.
La eficacia antitumoral de ADI-PEG 20 se evaluó simultáneamente en ratones portadores de xenoinjertos de CPM SK-LC-13 moderados o grandes. En el primer estudio, el tratamiento se inició una vez que los tumores habían alcanzado un tamaño medio de 125 mm3. En el estudio de xenoinjertos grandes, el tratamiento se inició una vez que los tumores habían alcanzado un tamaño medio de 500 mm3. Se administró arginina desiminasa-PEG20 en dosis de 1, 2 y 5 UI por animal una vez cada 5 días durante 20 días (cinco dosis). Para evaluar el efecto de la dosificación sostenida, otros grupos (n = 5) en todos los niveles de dosis recibieron la administración continua de ADI-PEG 20 cada 5 días hasta que los tumores progresaron hasta el límite de tamaño de 1000 mm3. Adicionalmente, se evaluó la eficacia de ADI-PEG 20 en ratones portadores de xenoinjertos NCI-H69 positivos para ASS. En este caso, los ratones recibieron cinco dosis de 2 UI de ADI-PEG 20 durante 20 días una vez que el tumor alcanzó un tamaño medio de 150 mm3. En todos los estudios se administró arginina desiminasa-PEG20 mediante inyección intraperitoneal. La actividad específica de ADI-PEG 20 utilizada en estos estudios es de 9 UI mg_1 de proteína. Por lo tanto, 1 UI de ADI-PEG 20 por 20 g de ratón equivale a 160 UI itt2.
Medición de arginina y citrulina en suero
Para determinar el efecto del tratamiento con ADI-PEG 20 sobre los niveles sistémicos de arginina, se analizaron sueros de ratones usando cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC). La L-arginina y la L-citrulina se resolvieron con un instrumento de derivatización posterior a la columna Pickering Laboratories PCX 5200 (Pickering Laboratories, Mountain View, CA, EE.UU.) a una temperatura de reacción de 39 °C y un detector de fluorescencia. Todos los reactivos, incluidos el tampón y la columna, se utilizaron según lo sugerido por Pickering Laboratories. Los niveles totales de ADI-PEG 20 se midieron mediante ELISA, como se ha descrito previamente (Holtsberg et al, J Control Release 80(1-3):259-271, 2002).
Análisis estadístico
La eficacia del tratamiento con ADI-PEG 20 in vivo se evaluó comparando las medias de los grupos de control y de tratamiento utilizando pruebas t de dos colas no emparejadas al final de los grupos de control utilizando GraphPad Prism (versión 5.0, GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, EE.UU.). Se utilizó un nivel de confianza del 95 %, con un volumen tumoral medio declarado significativamente diferente si P <0,05.
RESULTADOS
El CPM con frecuencia carece de expresión de ASS
Dado que la falta de expresión de ASS se asocia generalmente con la sensibilidad a la ADI, se evaluó su expresión en tumores de CPM humanos. Como se muestra en la figura 7C, un análisis de inmunohistoquímica inicial (IHC) de tumores de CPM humanos reveló que algunos CPM tenían una falta casi total de expresión de ASS. Aproximadamente el 45 % (7 de 16) de los tumores en este análisis inicial demostraron poca o ninguna expresión de ASS. Por el contrario, la expresión robusta de ASS era evidente en tejidos normales, tal como la piel (figura 7A), y otros cánceres, tal como el carcinoma de colon (figura 7B; Jungbluth et al, Mod Pathol 23(Suppl 1):387A, 2010).
Dado que el análisis de inmunohistoquímica inicial ha mostrado una pérdida frecuente de expresión de ASS en tumores de CPM humanos, se evaluó el estado de expresión de ASS en un panel de líneas celulares de CPM. El análisis de transferencia de Western reveló que 5 de cada 10 (50 %) de las líneas celulares de CPM probadas carecían de una expresión significativa de ASS a nivel de proteína (figura 7D). La expresión celular de ASS según lo detectado por inmunotransferencia de tipo Western fue similar usando tanto el Clon 25 como los anticuerpos anti-ASS 195-21-1 (datos no mostrados). El análisis de los niveles de ARNm usando qRT-PCR demostró una correlación general entre el ARNm de ASS y los niveles de expresión de proteínas (figura 7E).
La arginina desiminasa-PEG20 inhibe la proliferación de líneas celulares de CPM negativas para ASS in vitro Se evaluó el efecto de ADI-PEG 20 sobre la proliferación celular in vitro tanto en células de CPM positivas para ASS como en aquellas carentes de expresión de la enzima. En estos experimentos se incluyeron células con características de cultivo tisular en crecimiento tanto adherentes como no adherentes. Se encontró una clara disminución de la proliferación dependiente de la dosis en las líneas celulares de CPM negativas para ASS adherentes SK-LC-13 y SW1271. No fue evidente ningún efecto sobre el crecimiento de la línea celular de carcinoma de colon positiva para ASS adherente SW1222 (figura 8A). En cuanto a las células no adherentes, las células ASS positivas demostraron una resistencia casi total a los efectos antiproliferativos de ADI-PEG 20, mientras que se observó de nuevo una disminución relativa en la proliferación en las células deficientes en ASS después del tratamiento con ADI-PEG 20 (figura 8B). Dado que se determinó que la línea celular sensible a ADI-PEG 20 SK-LC-13 era tumorigénica, se eligió como una línea celular modelo para experimentos posteriores in vitro e in vivo.
La arginina desiminasa-PEG20 induce autofagia y apoptosis independiente de caspasa
Como ocurre con la falta de nutrientes más general, se ha observado que el agotamiento de la arginina intracelular por ADI induce estrés metabólico y la posterior autofagia celular (Kim et al, Cancer Res 69(2):700-708, 2009; Savaraj et al, Curr Mol Med 10(4):405-412, 2010). Un ensayo para la formación de la proteína relacionada con la autofagia LC3-II evaluó si el tratamiento con ADI-PEG 20 era capaz de inducir la autofagia celular en el CPM. Aunque se observó cierta expresión basal de la expresión de LC3-II en SK-LC-13, el tratamiento con ADI-PEG 20 dio como resultado un aumento claro en el nivel celular detectable de la proteína (figura 9E). La cloroquina es un inhibidor conocido de la autofagia que altera las funciones lisosomales normales y, por lo tanto, da como resultado un aumento del nivel celular de LC3-II. Posteriormente, las células tratadas con cloroquina como control positivo demostraron una expresión muy robusta de LC3-II. El tratamiento combinado de células con ADI-PEG 20 y cloroquina dio como resultado una disminución pequeña pero significativa (P = 0,008) en la viabilidad en relación con los tratamientos individuales, lo que sugiere que la inhibición de la autofagia puede mejorar la eficacia de ADI-PEG 20 (figura 14).
Para determinar el posible mecanismo de los efectos antiproliferativos de ADI-PEG 20 se realizó un análisis FACS de la apoptosis por contenido de ADN sub-Gi. Las células se trataron durante 72 h antes de que se realizara el análisis. Se detectó poca apoptosis en las células no tratadas, mientras que se observó que topotecán 25 nM, usado como control positivo, causaba apoptosis en aproximadamente el 45 % de las células SK-LC-13 (figuras 9A y B). Aunque no es tan eficaz como el topotecán, la incubación con 1,0 y 10 mUI ml-1 de ADI-PEG 20 dio como resultado la inducción de apoptosis en ~6 % y el 16 % de las células, respectivamente (figuras 9C y D). Aunque la apoptosis fue evidente por el contenido de ADN sub-G1, no se observó activación de caspasas después del tratamiento de las células con ADI-PEG 20 en contraste con las células tratadas con topotecán (figura 9F).
El silenciamiento de la expresión de ASS induce sensibilidad a ADI-PEG 20
Después de la transfección con ARNip específico de ASS, se evaluó la expresión relativa de ASS en líneas celulares positivas para ASS con PCR en tiempo real. Como se muestra en la figura 10A, la transfección con ARNip de ASS redujo los niveles de ARNm de ASS en ~90 % después de 72 h de incubación. El análisis de transferencia de Western simultáneo demostró una fuerte reducción en la expresión de los niveles de proteína ASS en células tratadas con ARNip específico de ASS (figura 10B). Sin embargo, parte de la expresión de ASS permaneció en estas condiciones. El examen de la viabilidad celular mediante el ensayo MTS demostró que las células positivas para ASS tratadas con ARNip de ASS se volvieron sensibles a la privación de arginina inducida por ADI-PEG 20, lo que dio como resultado una viabilidad celular reducida, mientras que no se observó disminución de la viabilidad en las células de control o en las tratadas con ARNip entremezclado (figura 10C).
La arginina desiminasa-PEG20 inhibe el crecimiento de xenoinjertos de CPM
Se evaluó la eficacia antitumoral del tratamiento sistémico con ADI-PEG 20 in vivo en ratones desnudos BALB/c portadores de xenoinjertos de CPM humanos. Se realizaron estudios separados en ratones con tumores establecidos de aproximadamente 125 mm3, y en ratones con tumores más grandes (~500 mm3) al comienzo del tratamiento. En ratones portadores de xenoinjertos SK-LC-13 de tamaño moderado (124,6 ± 37,1 mm3), ADI-PEG 20 provocó una reducción significativa y dependiente de la dosis en el crecimiento tumoral en relación con los ratones de control (figuras 11A-C). Los ratones de control se sacrificaron el día 33 debido al volumen excesivo del tumor, en ese momento, el volumen tumoral medio de los ratones de control era significativamente mayor que los de los grupos de ratones tratados con ADI-PEG 20, independientemente de la dosis o el programa de tratamiento (P >0,0001 para todos los grupos de tratamiento; figura 11D). Al finalizar el estudio, los tumores tratados con una dosificación continua de 5 UI de ADI-PEG 20 cada 5 días fueron significativamente más pequeños que los que recibieron una dosis cada 5 días durante solo 20 días (P = 0,0063). Sin embargo, este efecto no se observó a los niveles de dosis de 1 y 2 UI, ya que el crecimiento del tumor avanzó a una velocidad comparable en los grupos que recibieron dosificaciones cortas y continuas. Posteriormente, los volúmenes tumorales medios de los ratones que recibieron dosificaciones cortas o continuas de ADI-PEG 20 no fueron significativamente diferentes al final de los respectivos grupos de dosificación corta debido al volumen tumoral excesivo (1 UI: P = 0,251; 2 UI: P = 0,084). El tratamiento de xenoinjertos de CPM positivos para ASS NCl-H69 con ADI-PEG 20 no produjo ningún efecto sobre el crecimiento tumoral (figura 12).
El análisis del suero de estos ratones antes (día 0), durante (día 12) y después (día 40) de la dosificación inicial de ADI-PEG 20 revela que los niveles en suero de ADI-PEG 20 eran dependientes de la dosis (figura 11E). En ratones en los que solo se administró ADI-PEG 20 hasta el día 20, se observó que los niveles séricos de la enzima volvían a los niveles iniciales para el día 40, de acuerdo con la semivida de ~7 días de ADI-PEG 20 en los ratones (Ensor et al, Cancer Res 62(19):5443-5450, 2002; Holtsberg et al, J Control Release 80(1-3):259-271, 2002). Además, este ciclo corto de tratamiento solo agotó temporalmente la arginina sérica, como se esperaba, que posteriormente volvió a niveles normales 20 días después de la última dosis (día 40) sin dosificación adicional de a DI-PEG 20 (figura 11F). Los niveles de citrulina aumentaron en una relación dependiente de la dosis con la arginina, con un ciclo más corto de ADI-PEG 20 en correlación con un retorno de los niveles de citrulina al valor inicial (figura 11G). Los niveles de citrulina aumentaron con la dosificación prolongada al nivel de 1 UI, lo que concuerda con la arginina sistémica remanente y que se metaboliza en citrulina, a pesar de que los niveles séricos de arginina están por debajo de los límites de detección. Se observó un pequeño aumento en los niveles de citrulina con la dosificación continua a los niveles de dosis de 2 y 5 UI.
En el segundo estudio de ADI-PEG 20 in vivo, se inició el tratamiento cuando los tumores habían crecido hasta un tamaño relativamente grande de 473,4 ± 161,0 mm3 Se observó de nuevo una inhibición dependiente de la dosis del crecimiento tumoral (figuras 13A-C), aunque esto no fue tan significativo como lo observado en animales portadores de xenoinjertos más pequeños. Los volúmenes tumorales se compararon al finalizar la cohorte de control el día 32 de este estudio (figura 13D). El tratamiento continuo con 1 UI de ADI-PEG 20 fue capaz de reducir significativamente el volumen tumoral en relación con los ratones de control (P = 0,007), mientras que un tratamiento de ciclo corto no dio como resultado una reducción estadísticamente significativa del tamaño tumoral (P = 0,07). Además, se observó que la dosificación continua provocaba una reducción moderadamente significativa (P = 0,26) en el volumen tumoral en relación con el tratamiento de ciclo corto, según se evaluó al finalizar el grupo de tratamiento corto el día 39. A dosis más altas de ADI-PEG 20, se observó una reducción significativa del volumen tumoral en relación con los controles no tratados con la administración tanto corta (P = 0,004) como continua (P = 0,0007) al nivel de 2 UI, y también tanto en los programas cortos (P = 0,0003) como continuos (P = 0,0001) al nivel de dosis de 5 UI. Sin embargo, la dosificación continua no mejoró significativamente las respuestas a estas dosis en relación con el tratamiento de ciclo corto.
En resumen, este ejemplo demuestra que una gran proporción de CPM carecen de la expresión de ASS, y que los CPM negativos para a Ss son sensibles a la terapia de privación de arginina. Aunque la frecuencia de la deficiencia de ASS no es igual a la ausencia casi total de expresión como se informa en el melanoma, el hecho es que el 50 % de los casi 30.000 nuevos casos de CPM notificados en los Estados Unidos cada año pueden ser susceptibles a la terapia de privación de arginina.
Los estudios in vitro que utilizan líneas celulares de CPM deficientes en ASS adherentes y no adherentes demostraron que ADI-PEG 20 provocó una eficacia antiproliferativa dependiente de la dosis. Los resultados descritos en el presente documento indican que la pérdida de proteína ASS está asociada con los efectos antiproliferativos de ADI-PEg 20 en células por lo demás idénticas, y valida además las sensibilidades relativas observadas en cánceres de CPM de diferente expresión de ASS. Dado que la inhibición de la autofagia citoprotectora puede potenciar los efectos antiproliferativos de ADI-PEG 20, la combinación de ADI-PEG 20 con 25 mM del inhibidor de la autofagia cloroquina se evaluó in vitro (Kim et al, Cancer Res 69(2):700 -708, 2009). Sin embargo, la combinación solo indujo un aumento moderado, aunque significativo (P = 0,008), en el efecto antiproliferativo de ADI-PEG 20 en células de CPM (figura 14). El tratamiento de CPM con ADI-PEG 20 provocó un aumento moderado en la población de células en el pico sub-Gi después de la tinción con yoduro de propidio, lo que sugiere que estas células habían experimentado apoptosis. El análisis de transferencia de Western reveló que ADI-PEG 20 no provocó la activación de caspasa en células de CPM SK-LC-13. Sin desear quedar ligados a teoría alguna, la respuesta celular general a la privación de arginina inducida por ADI-PEG 20 en células de CPM parece operar a través de un mecanismo complejo que involucra una respuesta metabólica inicial observada en la inducción de autofagia, seguida de la muerte celular independiente de caspasa.
Los estudios in vivo en ratones revelaron que el crecimiento de xenoinjertos SK-LC-13 fue anulado por ADI-PEG 20 de una manera dependiente de la dosis. Se observó una actividad antitumoral significativa a las dosis de 1, 2 y 5 UI por animal. Es importante destacar que, aunque se observó una inhibición más sólida del crecimiento tumoral en ratones portadores de tumores establecidos más pequeños (~120 mm3), ADI-PEG 20 también demostró una eficacia antitumoral significativa en ratones portadores de xenoinjertos grandes (~500 mm3). Aunque la comparación directa con otros tipos de tumores es difícil, la eficacia antitumoral observada con ADI-PEG 20 en xenoinjertos de CPM es similar y posiblemente superior a la observada usando dosis equivalentes de ADI-PEG 20 en diferentes tipos de tumores, incluidos los xenoinjertos de cáncer renal y de próstata.
Ejemplo 4
LA ARGININA DESIMINASA INHIBE EL CRECIMIENTO DE SARCOMAS METASTÁSICOS DEFICIENTES EN ASS
Aunque los sarcomas son un grupo raro de tumores, la mala respuesta a los regímenes clínicos actuales representa una importante necesidad no satisfecha en oncología. Es necesaria una mejor comprensión terapéutica de la biología y el metabolismo del crecimiento del sarcoma para desarrollar nuevas terapias para tratar a los pacientes con este grupo de tumores. La argininosuccinato sintasa (ASS) es la enzima limitante de la velocidad en la conversión de citrulina en arginina. Cuando no se expresa ASS, la arginina se convierte en un aminoácido esencial para una célula cancerosa que debe liberarse de la dieta.
El análisis inmunohistoquímico de 701 muestras de pacientes que representan 45 subtipos de sarcoma demostró que ASS no se expresa en más del 85 % de los sarcomas (619 de 701 muestras de pacientes). Esto sugirió que los sarcomas son sensibles a la terapia de privación de arginina usando arginina desiminasa pegilada (ADI-PEG 20).
El tratamiento de un panel de leiomiosarcoma, osteosarcoma, sarcoma alveolar de las partes blandas, tumor maligno de la vaina nerviosa periférica y líneas celulares de sarcoma de Ewing con ADI-PEG 20 dio como resultado la detención del ciclo celular pero no de la apoptosis cuando la expresión de ASS fue baja, mientras que la línea celular de osteosarcoma con alta expresión de ASS MG63 continuó dividiéndose. La respuesta en las líneas celulares de sarcoma dependió de la expresión de ASS, ya que los sarcomas óseos, sarcomas de tejidos blandos, sarcomas citogenéticos complejos y sarcomas dependientes de la translocación demostraron inhibición del ciclo celular tras el tratamiento con ADl-pEG 20. La CI50 para las líneas celulares tratadas con ADI-PEG 20 varió entre 0,02-0,1 pg/ml en líneas celulares sensibles con baja expresión de ASS.
Tratamiento de sarcomas que carecen de ASS con autofagia inducida por ADI-PEG 20. El agotamiento de la arginina por ADI-PEG 20 en sarcomas deficientes en ASS cuando se combina con cloroquina, un inhibidor de la autofagia, induce la muerte celular según lo medido por la Anexina V.
El xenoinjerto de la línea celular de osteosarcoma de baja expresión de ASS MNNG en ratones desnudos seguido de tratamiento con ADI-PEG 20 demostró una tasa de crecimiento tumoral significativamente más lenta en comparación con los controles tratados con PBS.
Con respecto a los ejemplos anteriores, cabe apreciar que en un modelo de xenoinjerto de carcinoma de células renales, se observó que ADI-PEG 20 más el inhibidor de la autofagia, hidroxicloroquina, no dio como resultado un efecto aditivo. Por lo tanto, el efecto de ADI-PEG 20 más inhibidores de la autofagia en cualquier cáncer en particular no es predecible, lo que resalta además los efectos sorprendentes de la presente divulgación.
Ejemplo 6
ADI-PEG 20 EN COMBINACIÓN CON CISPLATINO MEJORA SIGNIFICATIVAMENTE LA ACTIVIDAD ANTITUMORAL IN VIVO
También se realizó una prueba de xenoinjerto para evaluar la eficacia in vivo de ADI-PEG 20 en combinación con cisplatino. Se evaluó la eficacia terapéutica de ADI-PEG 20 in vivo, ya sea como agente único o en combinación con cisplatino en el tratamiento de dos modelos de xenoinjerto de melanoma humano diferentes en ratones desnudos. La dosis de cisplatino fue de 6 mg/kg o 18 mg/m2 (Km = 3) intraperitoneal (IP) administrada cada 6 días x 3 dosis. Esta misma dosis, extrapolada a seres humanos, sería de 40 mg/m2 (Km = 40), o una dosis total de 120 mg/m2 durante 3 semanas. Se administró ADI-PEG 20 a 53,3 UI/kg cada 6 días IM x 4 dosis. Esta misma dosis de ADI-PEG 20, extrapolada a seres humanos, sería de 160 UI/m2 o 18 mg/m2. Como se muestra en la figura 15, el tratamiento con la combinación de ADI-PEG 20 y cisplatino mostró una actividad significativamente mejorada en comparación con cualquier agente en solitario. Por lo tanto, los datos de xenoinjerto mostraron que la combinación de ADI-PEG 20 y cisplatino da como resultado una actividad tumoral mejorada en células de melanoma deficientes en ASS, incluso cuando el cisplatino se administró durante un periodo de tiempo limitado.
Ejemplo 7
ESTUDIO EN SERES HUMANOS DE FASE I DE ADI-PEG 20 EN COMBINACIÓN CON DOCETAXEL
Se inició un estudio de escalada de dosis de fase I, sin enmascaramiento, de un solo centro para determinar la dosis máxima tolerable y la toxicidad limitante de la dosis (MTD y DLT) de ADI-PEG 20 en combinación con docetaxel administrado por vía intravenosa (IV) cada tres semanas a pacientes con tumores sólidos avanzados. Los pacientes recibieron ADI-PEG 20 por vía intramuscular (IM) semanalmente en dosis crecientes seguidas 1 hora más tarde (el día 1) de docetaxel a 75 mg/m2 IV. La duración del ciclo es de 21 días. Se continuó con ADI-PEG 20 como una inyección IM semanal durante todo el proceso. Se produjo un aumento de la dosis utilizando un diseño estándar 3+3. Cada nueva cohorte del nivel dosis se incluyó 21 días después de que se incluyera el último sujeto en la cohorte anterior. 18 mg/m2 equivalen aproximadamente a 160 UI/m2.
El régimen de dosificación se resume en la Tabla 2 a continuación.
Tabla 2: Ré imen de dosificación de Docetaxel ADI-PEG 20
Figure imgf000029_0003
El esquema de tratamiento se resume en la Tabla 3 a continuación.
Tabla 3: Es uema de tratamiento
Figure imgf000029_0001
Los resultados iniciales de este estudio se resumen en la Tabla 4 a continuación. En particular, de 8 sujetos tratados hasta la fecha con la información disponible, los resultados del beneficio clínico objetivo son los siguientes:
Tabla 4: Resumen de los resultados del estudio
Figure imgf000029_0002
Por lo tanto, 6 de 8 (75 %) de los pacientes incluidos hasta la fecha tienen un beneficio clínico (enfermedad estable respuesta parcial respuesta completa).
Las dosis que se utilizan en este estudio son dosis bajas, ya que se han utilizado 18 mg/m2 en estudios de carcinoma hepatocelular de fase 3, y 36 mg/m2 han mostrado eficacia en el melanoma. Por consiguiente, estos primeros datos son bastante alentadores dada la respuesta positiva incluso a esta dosis baja y sugieren que la combinación de ADI-PEG 20 con Docetaxel es un tratamiento eficaz contra el cáncer. En particular, docetaxel está aprobado en los EE.UU. para el tratamiento de tumores en cáncer de mama, cáncer de pulmón no microcítico, cáncer de próstata refractario a hormonas, adenocarcinoma gástrico, y carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello. Además, se ha utilizado en el tratamiento de sarcomas, especialmente leiomiosarcoma uterino, y sobre cáncer variante. Como tal, el tratamiento de estos cánceres con docetaxel en combinación con ADI-PEG 20 se contempla específicamente en el presente documento.
Ejemplo 8
ADI-PEG 20 MÁS RAPAMICINA DEMUESTRA UN EFECTO SINÉRGICO EN UN MODELO DE XENOINJERTO IN VIVO DE CARCINOMA DE CÉLULAS RENALES
Se usó un modelo de xenoinjerto de ratón para estudiar los efectos de ADI-PEG 20 en solitario y en combinación con rapamicina para el tratamiento del carcinoma de células renales.
Se evaluó la actividad de ADI-PEG 20 en ratones portadores de xenoinjertos Caki-1 (ATCC N.° HTB-46™). Se

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Una composición líquida, que comprende arginina desiminasa (ADI) modificada covalentemente con polietilenglicol (ADI-PEG), comprendiendo además la composición histidina-HCl, que es de aproximadamente 0,0035 M de histidina-HCl a aproximadamente 0,35 M de histidina-HCl, en la que la composición tiene un pH de aproximadamente 6,5 a aproximadamente 7,5.
2. La composición líquida de la reivindicación 1, que comprende histidina-HCl 0,035 M a pH 6,8 con cloruro de sodio 0,13 M.
3. La composición líquida de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en la que la arginina desiminasa está unida covalentemente a:
(a) más de una molécula de polietilenglicol;
(b) de aproximadamente 9 a aproximadamente 12 moléculas de polietilenglicol; o
(c) 5 ± 1,5 moléculas de PEG.
4. La composición líquida de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que:
(a) el polietilenglicol tiene un peso molecular promedio en peso total de aproximadamente 1.000 a aproximadamente 40.000;
(b) el polietilenglicol tiene un peso molecular promedio en peso total de aproximadamente 10.000 a aproximadamente 30.000; o
(c) el polietilenglicol tiene un peso molecular de 20.000.
5. La composición líquida de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que el uno o más polietilenglicoles son polietilenglicoles de cadena lineal.
6. La composición líquida de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que la arginina desiminasa está unida covalentemente a PEG con un grupo de unión y, opcionalmente, en la que el grupo de unión es un grupo succinimida, opcionalmente seleccionado del grupo que consiste en succinato de succinimidilo, propionato de succinimidilo, carboximetilato de succinimidilo, succinimidil succinamida, N-hidroxisuccinimida, y combinaciones de los mismos.
7. La composición líquida de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que la arginina desiminasa no está aislada de Mycoplasma arginini.
8. La composición líquida de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que la arginina desiminasa se aísla de Mycoplasma hominis.
9. La composición líquida de acuerdo con la reivindicación 8, en la que la arginina desiminasa se ha modificado para que esté libre de al menos una lisina en la posición 112, 374, 405 o 408 de SEQ ID NO:1, o en la que la arginina desiminasa comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO:2.
10. La composición líquida de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores para su uso en un método de tratamiento de un cáncer en un paciente, comprendiendo el método administrar al paciente la composición líquida, en la que el cáncer presenta una expresión reducida de argininosuccinato sintetasa, en la que el cáncer se selecciona del grupo que consiste en melanoma, sarcomas, cáncer de páncreas, cáncer de pulmón microcítico, mesotelioma, cáncer de próstata, leucemia linfática, leucemia mielógena crónica, linfoma, retinoblastoma, neuroblastoma, colangiocarcinoma, leucemia mieloide aguda, leucemia mieloide aguda recidivante, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer colorrectal, cáncer gástrico, glioma, glioblastoma multiforme, cáncer de pulmón no microcítico (CPNM), cáncer de riñón, cáncer de vejiga, cáncer de útero, cáncer esofágico, cáncer cerebral, cánceres de cabeza y cuello, cáncer de cuello de útero, cáncer de testículo y cáncer de estómago.
11. La composición líquida para su uso de acuerdo con la reivindicación 10, en la que, en el método, la composición líquida se administra en combinación con uno o más agentes terapéuticos, en la que uno o más agentes terapéuticos se seleccionan del grupo que consiste en ciclofosfamida, gemcitabina, cisplatino, sorafenib, sunitinib, everolimus, rapamicina, docetaxel e inhibidores de la autofagia, en la que los inhibidores de la autofagia consisten en cloroquina, 3-metiladenina, hidroxicloroquina, bafilomicina A1,5-amino-4-imidazol carboxamida ribósido (AICAR), ácido okadaico, N6-mercaptopurina ribósido, wortmanina y vinblastina.
12. La composición líquida para su uso de acuerdo con la reivindicación 11, en la que la composición líquida se administra en combinación con el inhibidor de la autofagia y el cáncer es cáncer de páncreas o cáncer de pulmón microcítico.
13. La composición líquida para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12, en la que el método:
(a) inhibe la síntesis de NO, inhibe la angiogénesis, induce la apoptosis en células tumorales, o una combinación de las mismas, in vivo;
(b) da como resultado una enfermedad estable o aumenta el tiempo de supervivencia sin progresión en el paciente; o
(c) aumenta el tiempo de supervivencia sin progresión en el paciente.
14. La composición líquida para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13, en la que, en el método, la arginina en plasma:
(a) se agota durante al menos un mes; o
(b) se agota durante más de 2 meses.
15. La composición líquida para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 14, en la que el método comprende además la administración de un agente quimioterapéutico, en la que el agente quimioterapéutico se selecciona opcionalmente del grupo que consiste en ciclofosfamida, gemcitabina, cisplatino, sorafenib, sunitinib y everolimus.
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