CN107108723B

CN107108723B - 精氨基琥珀酸合成酶的抗体和相关方法

Info

Publication number: CN107108723B
Application number: CN201580042814.4A
Authority: CN
Inventors: 何玮; 郭云云; 吴伯文
Original assignee: Tdw Group
Current assignee: Polaris Pharmaceutical Group Co.,Ltd.
Priority date: 2014-07-08
Filing date: 2015-07-08
Publication date: 2021-11-12
Anticipated expiration: 2035-07-08
Also published as: CN107108723A; US9938355B2; TW202104273A; TW201619202A; EP3166972B1; WO2016007625A1; EP3166972A1; TWI790481B; CN114106186A; EP3166972A4; TWI708789B; US20160009821A1

Abstract

本发明提供特异性结合至精氨基琥珀酸合成酶的抗体及其抗原结合片段，以及其相关组合物、试剂盒和使用方法，例如作为鉴定适于精氨酸剥夺或耗尽疗法的适合的受试者的伴随式诊断，所述精氨酸剥夺或耗尽疗法诸如ADI‑PEG 20和其他基于精氨酸脱亚胺酶(ADI)多肽的疗法。

Description

精氨基琥珀酸合成酶的抗体和相关方法

相关技术描述

精氨酸为人类的半必需氨基酸。对精氨酸而言为营养缺陷型的细胞需要自其周遭环境进行精氨酸摄取。精氨酸营养缺陷细胞(auxotrope)趋向于为营养缺陷的，因为它们缺乏经由尿素循环自代谢前体产生其自身精氨酸的能力。

一些肿瘤展现相对于氨基酸、尤其相对于氨基酸L-精氨酸的营养缺陷行为，因为所述肿瘤缺少精氨基琥珀酸合成酶(ASS)，所述酶为负责将L-瓜氨酸转化成L-精氨基琥珀酸的酶。因而，这些肿瘤类型需要L-精氨酸的细胞外来源以合成蛋白质。

正在开发基于精氨酸剥夺或耗尽的疗法以利用此营养缺陷行为。例如，精氨酸脱亚胺酶(ADI)疗法，例如ADI-PEG 20，可减少L-精氨酸的生理水平，并且使肿瘤缺失必需氨基酸，从而导致肿瘤死亡(参见，例如，Ott等,Invest New Drugs.31:425-34,2013)。其他实例包括L-天门冬酰胺酶用于在诸如急性淋巴母细胞性白血病的疾病的治疗中降低天冬酰胺的循环水平的用途。还描述了精氨酸降解酶的用途，所述降解酶已证明有效于治疗黑素瘤、肝瘤和一些肉瘤。(参见，例如，Sugimura等,Melanoma Res.2:191-6,1992；Takaku等,Jpn.J.Cancer Res.86:840-6,1995)。

然而，精氨酸剥夺可能并非在所有患者中为有效的。为此，已开发用于鉴定最适合于精氨酸剥夺或耗尽疗法的患者的方法，包括使用精氨基琥珀酸合成酶表达作为诊断标志物(参见，例如，WO 2002/063048；以及WO 2013/151568)。因此，本领域中需要改良试剂，所述改良试剂能够检测受试者或相关组织样品中的精氨基琥珀酸合成酶表达，并且进而鉴定适于精氨酸剥夺或耗尽疗法的患者。

附图简述

图1示出用于测定针对蛋白质精氨基琥珀酸合成酶的杂交瘤抗体克隆的免疫球蛋白亚型的ELISA分析的结果。

图2A示出来自针对蛋白质精氨基琥珀酸合成酶的杂交瘤抗体克隆的以下六个有效亚克隆的V_H序列的氨基酸比对：6-H6(SEQ ID NO:13)、6-C5(SEQ ID NO:14)、6-C1(SEQID NO:15)、6-L7(SEQ ID NO:16)、6-A5(SEQ ID NO:17)以及6-D6(SEQ ID NO:18)。图2B示出来自以下五个有效亚克隆的V_L序列的氨基酸比对：4-5(SEQ ID NO:19)、7-2(SEQ ID NO:20)、7-8(SEQ ID NO:21)、7-12(SEQ ID NO:22)以及7-4(SEQ ID NO:23)。

图3示出：亚克隆的V_H和V_L序列以相当于原始杂交瘤的水平结合至精氨基琥珀酸合成酶抗原。

图4示出通过利用抗精氨基琥珀酸合成酶单克隆抗体的免疫组织化学染色(免疫组织化学；IHC)在人类癌细胞系A431(图4A)和SKMEL-3(图4B)中检测精氨基琥珀酸合成酶表达。

图5示出通过利用抗精氨基琥珀酸合成酶单克隆抗体的免疫组织化学染色在正常人类组织(图5A，肾；图5B，皮肤；图5C，肝)中检测精氨基琥珀酸合成酶表达。

图6示出通过利用抗精氨基琥珀酸合成酶单克隆抗体的免疫组织化学染色在人类肝细胞癌(HCC)微阵列中检测精氨基琥珀酸合成酶表达。图6A示出精氨基琥珀酸合成酶表达的强阳性染色，并且图6B-图6C示出精氨基琥珀酸合成酶表达的阴性染色。

发明简述

本发明的实施方案包括分离的抗体或其抗原结合片段，其特异性结合至人类精氨基琥珀酸合成酶多肽并且(a)包含：重链可变区(V_H)序列，所述序列包含分别于SEQ ID NO:7、8和9中所列出的互补决定区V_HCDR1、V_HCDR2和V_HCDR3序列；以及轻链可变区(V_L)序列，所述序列包含分别于SEQ ID NO:10、11和12中列出的互补决定区V_LCDR1、V_LCDR2和V_LCDR3序列；或(b)竞争性抑制(a)与人类精氨基琥珀酸合成酶多肽的结合。

在某些实施方案中，V_H序列与SEQ ID NO:1至少90％一致。在某些实施方案中，V_L序列与SEQ ID NO:3至少90％一致。在某些实施方案中，V_H序列包含SEQ ID NO:1并且V_L序列包含SEQ ID NO:3。

在某些实施方案中，所述分离的抗体或其抗原结合片段竞争性抑制(a)与人类精氨基琥珀酸合成酶多肽的结合，其中(a)为包含SEQ ID NO:1中列出的V_H序列和SEQ ID NO:3中列出的V_L序列的小鼠单克隆抗体。

在某些实施方案中，所述分离的抗体或其抗原结合片段竞争性抑制(a)与人类精氨基琥珀酸合成酶多肽的结合，其中(a)为亚型IgG1或IgG2A的小鼠单克隆抗体。

在某些实施方案中，抗体为完整抗体。在某些实施方案中，抗体为单克隆抗体。在某些实施方案中，抗体选自单链抗体、Fab或Fab’片段、F(ab’)2片段、ScFv、缺乏铰链区的单价抗体以及微型抗体。在某些实施方案中，抗体包含小鼠或人类IgG Fc结构域，任选地IgG1或IgG2A Fc结构域。在某些实施方案中，抗体为亚型IgG1或IgG2A的小鼠单克隆抗体。

在某些实施方案中，分离的抗体或其抗原结合片段包含共价连接的可检测实体。在某些实施方案中，可检测实体为荧光团/荧光染料、基于碘的标签、放射性同位素或纳米粒子。

还包括组合物，所述组合物包含本文所述的抗体或其抗原结合片段和适合的载体。

某些实施方案涉及测定生物样品中人类精氨基琥珀酸合成酶多肽的量的方法，所述方法包括：(a)获得或接收任选地来自受试者的生物样品样品；(b)使生物样品与本文所述的抗体或其抗原结合片段接触；以及(c)测量样品中抗体或其抗原结合片段的量，其中抗体或其抗原结合片段的量决定样品中精氨基琥珀酸合成酶多肽的量。

还包括鉴定生物样品中精氨基琥珀酸合成酶的缺少的方法，所述方法包括：(a)获得或接收任选地来自受试者的生物样品；(b)使生物样品与本文所述的抗体或其抗原结合片段接触；(b)测量样品中抗体或其抗原结合片段的量，其中抗体或其抗原结合片段的量决定样品中精氨基琥珀酸合成酶多肽的量；以及(c)如果生物样品中精氨基琥珀酸合成酶多肽的量相对于对照减少，则鉴定样品中精氨基琥珀酸合成酶的缺少。

一些实施方案包括鉴定适于精氨酸剥夺疗法的受试者的方法，所述方法包括：(a)任选地经由保健提供者获得或接收来自受试者的生物样品提供者；(b)使生物样品与本文所述的抗体或其抗原结合片段接触；(c)测量样品中抗体或其抗原结合片段的量，其中抗体或其抗原结合片段的量决定样品中精氨基琥珀酸合成酶多肽的量；以及(d)如果生物样品中精氨基琥珀酸合成酶多肽的量相对于对照减少，则将受试者鉴定为适用于精氨酸剥夺疗法。

在某些实施方案中，步骤(a)包括自保健提供者接收生物样品，并且步骤(d)包括向相同或不同保健提供者提供关于生物样品中精氨基琥珀酸合成酶多肽的量的信息。

某些实施方案包括步骤(e)：向(d)的受试者施用至少一种精氨酸耗尽剂。

在某些实施方案中，精氨酸耗尽剂选自精氨酸脱亚胺酶(ADI)多肽、精氨酸酶多肽、精氨酸脱羧酶多肽和精氨酸激酶多肽。在特定实施方案中，ADI多肽为ADI-PEG 20。

在特定实施方案中，步骤(b)包括执行免疫组织化学(IHC)测定。

还包括用于诊断并治疗受试者的方法，所述方法包括：(a)分析测试的结果，所述测试指示来自受试者的生物样品中精氨基琥珀酸合成酶多肽的量，其中测试使用本文所述的抗体或其抗原结合片段来执行；(b)如果来自(a)的结果指示生物样品中精氨基琥珀酸合成酶多肽的量相对于对照减少，则将患者诊断为适用于精氨酸剥夺疗法；以及(c)通过施用至少一种精氨酸耗尽剂来治疗(b)的受试者。

一些实施方案包括用于治疗受试者的方法，所述方法包括：(a)请求测定来自受试者的生物样品中精氨基琥珀酸合成酶多肽的量的测试，其中测试使用本文所述的抗体或其抗原结合片段来执行；以及(b)如果来自(a)的测试指示生物样品中精氨基琥珀酸合成酶多肽的量相对于对照减少，则向受试者施用至少一种精氨酸耗尽剂。

在某些实施方案中，受试者为人类患者。在某些实施方案中，受试者患有或疑似患有癌症。在某些实施方案中，癌症选自黑素瘤、任选地为肝细胞癌的肝癌、胰腺癌、前列腺癌、间皮瘤、肉瘤、头颈癌、白血病、急性骨髓白血病、复发性急性骨髓白血病、乳腺癌、卵巢癌、结肠直肠癌、胃癌、神经胶质瘤、多形性神经胶质母细胞瘤、非小细胞肺癌(NSCLC)、肾癌、膀胱癌、子宫癌、食管癌、脑癌、子宫颈癌、睪丸癌以及胃癌。

在某些实施方案中，生物样品为活检样品。在某些实施方案中，活检样品为癌症或怀疑癌症活检样品。在某些实施方案中，活检样品选自皮肤组织、肝组织、胰腺组织、前列腺组织、间皮组织、上皮组织、卵巢组织、结肠直肠组织、胃组织、脑组织、肺组织、肾组织、膀胱组织、子宫组织、食道组织、子宫颈组织、睪丸组织、乳房组织以及间叶组织，诸如骨组织、软骨组织、脂肪组织、肌肉组织、血管组织、血液或造血细胞/组织。

在某些实施方案中，对照为参考标准、来自健康受试者的生物样品或来自同一受试者的健康生物样品。在某些实施方案中，对照为来自同一受试者的非癌性生物样品，任选地具有相同组织类型。

在某些实施方案中，生物样品中精氨基琥珀酸合成酶多肽的量相对于对照减少统计显著量。

在某些实施方案中，生物样品中精氨基琥珀酸合成酶多肽的量相对于对照减少约或至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。在某些实施方案中，生物样品中精氨基琥珀酸合成酶多肽的量不可检测或基本上不可检测。

在某些实施方案中，精氨酸耗尽剂选自精氨酸脱亚胺酶(ADI)多肽、精氨酸酶多肽、精氨酸脱羧酶多肽以及精氨酸激酶多肽。在某些实施方案中，ADI多肽为ADI-PEG 20。

一些实施方案包括用于诊断并治疗人类患者的癌症的方法，所述方法包括：(a)分析测试的结果，所述测试指示来自受试者的肿瘤活检样品中精氨基琥珀酸合成酶多肽的量，其中测试使用本文所述的抗体或其抗原结合片段来执行；(b)如果来自(a)的结果指示肿瘤活检样品中精氨基琥珀酸合成酶多肽的量相对于对照减少，则将患者诊断为适用于ADI-PEG 20疗法；以及(c)通过施用ADI-PEG 20来治疗(b)的受试者。

还包括用于治疗受试者的癌症的方法，所述方法包括：(a)请求测定来自受试者的肿瘤活检样品中精氨基琥珀酸合成酶多肽的量的测试，其中测试使用本文所述的抗体或其抗原结合片段来执行；以及(b)如果来自(a)的测试指示生物样品中精氨基琥珀酸合成酶多肽的量相对于对照减少，则向受试者施用ADI-PEG 20。

在某些实施方案中，癌症选自黑素瘤和肝细胞癌。

在特定实施方案中，步骤(a)包括分析来自免疫组织化学(IHC)测定的载玻片、图像或其他结果。

一些实施方案包括一种或多种试剂盒，所述试剂盒包含本文所述的分离的抗体或其抗原结合片段或组合物。某些试剂盒包括用于根据本文所述的方法使用抗体的说明书。一些试剂盒还包含用于例如酶联免疫吸附测定(ELISA)的材料，在所述测定中将抗体连接至固体底物以用于执行ELISA。某些试剂盒包含用于免疫组织化学(IHC)测定的材料。

一些试剂盒包括用于使用抗体来鉴定适于精氨酸剥夺疗法的受试者的说明书。在某些实施方案中，精氨酸剥夺疗法为精氨酸耗尽剂，任选地为ADI-PEG 20。某些试剂盒还包含至少一种精氨酸耗尽剂。在某些实施方案中，精氨酸耗尽剂选自精氨酸脱亚胺酶(ADI)多肽、精氨酸酶多肽、精氨酸脱羧酶多肽和精氨酸激酶多肽。在某些实施方案中，ADI多肽为ADI-PEG 20。

发明详述

除非另外定义，否则本文所使用的所有技术和科技术语均具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解相同的含义。尽管与本文所述的那些方法和材料类似或等效的任何方法和材料可用于本发明的实践或测试，但描述了优选的方法和材料。出于本发明的目的，以下定义下列术语。本文中所列的所有专利和非专利文献参考均以全文引用方式并入。

如本文所用的冠词“一(个/种)”是指一个(种)或一个(种)以上(即，至少一个(种))的所述冠词的语法对象。举例而言，“一个要素”意指一个要素或一个以上的要素。

“约”意指数量、水平、值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度变化多达参考数量、水平、值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度的30％、25％、20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％。

如本文所用的，术语“氨基酸”旨在意指天然存在的氨基酸和非天然存在的氨基酸以及氨基酸类似物和模拟物。天然存在的氨基酸包括在蛋白质生物合成期间利用的20种(L)-氨基酸以及其他氨基酸，诸如，例如4-羟基脯氨酸、羟基赖氨酸、锁链素、异锁链素、高半胱氨酸、瓜氨酸以及鸟氨酸。非天然存在的氨基酸包括例如(D)-氨基酸、正亮氨酸、正缬氨酸、对氟苯丙氨酸、乙硫氨酸以及类似氨基酸，其为本领域技术人员所知。氨基酸类似物包括天然存在的氨基酸和非天然存在的氨基酸的修饰形式。这些修饰可包括例如氨基酸上化学基团和部分的取代或置换，或氨基酸的衍生化。氨基酸模拟物包括例如在功能上展现出类似性质，诸如参考氨基酸的电荷和电荷间距特性的有机结构。例如，模拟精氨酸(Arg或R)的有机结构将具有正电荷部分，所述正电荷部分位于类似分子空间中并且具有与天然存在Arg氨基酸的侧链的ε-氨基相同的移动性程度。模拟物还包括约束结构以便维持氨基酸或氨基酸官能基的最佳间距和电荷相互作用。本领域技术人员知晓或可判定何种结构构成功能上等效的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。

在本说明书全文中，除非上下文另外需要，否则单词“包含(comprise)”、“包含(comprises)”和“包含(comprising)”将理解为暗示包括所述步骤或要素或者步骤或要素的群组，而不排除任何其他步骤或要素或者步骤或要素的群组。“由…组成”意指包括且限于短语“由…组成”后接的内容。因此，短语“由...组成”指示所列要素为必需或必备的，并且不可存在其他要素。“基本上由…组成”意指包括所述短语之后所列出的任何要素，并且限于不干扰或贡献于本公开中对所列要素所规定的活动或动作的其他要素。因此，短语“基本上由…组成”指示所列要素为必需或必备的，但其他要素为任选的并且可存在或可不存在，这取决于所述其他要素是否实质上影响所列要素的活动或动作。

术语“生物样品”包括可自受试者收集且结合生物学状态的诊断或监测一起使用的生物材料。生物样品可包括临床样品，包括体液样品，诸如体腔液、尿液、脑脊髓液、血液以及其他生物学起源的液体样品；以及组织样品，诸如活检样品、肿瘤或疑似肿瘤样品和其他生物学起源的实体样品。生物样品还可包括在其收集之后以某一方式操纵的那些样品，诸如针对某些生物学成分、培养物或来源于所述培养物的细胞及其后代通过利用试剂处理、培养、溶解、富集进行操纵。

术语“缀合物”包括由于药剂或其他分子与本文所述的抗体的共价或非共价连接或键联而形成的实体，所述药剂或其他分子例如可检测实体、生物活性分子、PEG或其他聚合物。

“对照”诸如“对照受试者”或“对照组织”包括健康受试者或健康组织样品，例如非病理性或患病的组织样品。在某些实施方案中，对照包括来自不同健康受试者或所测试或诊断的相同受试者的非患病(例如，非癌性)组织。对照还可包括参考标准，例如，自一个或多个健康受试者或组织产生的标准值。

如本文所用的，术语“功能”和“功能性”及类似物是指生物功能、酶促功能或治疗功能。

“同源性”是指一致的氨基酸或构成保守取代的氨基酸的数目百分比。同源性可使用序列比较程序测定，所述序列比较程序诸如GAP(Deveraux等,Nucleic AcidsResearch.12,387-395,1984)，其以引用方式并入本文。以此方式，具有与本文中引用的那些序列类似或实质上不同的长度的序列可通过在比对序列中插入空隙来比较，这些空隙例如通过GAP所使用的比较算法来测定。

“分离的(isolated)”意指实质上或基本上不含在呈材料的天然状态时通常伴随所述材料的组分的材料。例如，如本文所用的“分离肽”或“分离多肽”及类似物包括自肽或多肽分子的天然细胞环境并且自与细胞的其他组分的缔合物中体外分离和/或纯化所述肽或多肽分子；即，其并不显著地与体内物质相缔合。在特定实施方案中，分离多肽为抗体。

“减小”量或“减少”量通常为“统计显著”量，并且可包括例如相对于对照的5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％减小(包括其间所有整数和范围)。本文描述了比较和“统计显著”量的其他实例。

在某些实施方案中，组合物中任何给定药剂(例如，抗体)的“纯度”可特定定义。例如，某些组合物可包含至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％纯(包括其间所有小数)的药剂，如例如且决非限制性地通过高效液相色谱(HPLC)所测定的，所述高效液体色谱为生物化学和分析化学中常用于分离、鉴定并定量化合物的柱色谱法的熟知形式。

术语“多肽”和“蛋白质”可在本文中互换使用以指代氨基酸残基的聚合物以及所述聚合物的变体和合成类似物。因此，这些术语适用于其中一个或多个氨基酸残基为合成的非天然存在的氨基酸的氨基酸聚合物，诸如对应天然存在的氨基酸的化学类似物；以及适用于天然存在的氨基酸聚合物。本文所述的多肽不限于特定长度的产物；因此，肽、寡肽和蛋白质包括于多肽的定义内，并且除非另外特别指示，否则这些术语可在本文中互换使用。本文所述的多肽还可包含表达后修饰，诸如糖基化、乙酰化、磷酸化以及类似修饰，以及本领域中已知的其他修饰，其为天然存在的和非天然存在的。多肽可为整个蛋白质，或其子序列、片段、变体或衍生物。

术语“参考序列”通常是指正与另一序列比较的核酸编码序列或氨基酸序列。本文所述的所有多肽和多核苷酸序列均作为参考序列来包括，包括由名称描述的那些序列以及在表和序列表中描述的那些序列。

如本文所用的术语“序列一致性”或例如包括“与...50％一致的序列”是指在比较窗口上在核苷酸对核苷酸基础上或在氨基酸对氨基酸基础上序列一致的程度。因此，“序列一致性百分比”可通过以下方式来计算：在比较窗口上比较两个最佳比对序列，确定两个序列中出现相同核酸碱基(例如，A、T、C、G、I)或一致氨基酸残基(例如，Ala、Pro、Ser、Thr、Gly、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Lys、Arg、His、Asp、Glu、Asn、Gln、Cys和Met)的位置数目以得出匹配位置的数目，将匹配位置的数目除以比较窗口中的总位置数目(即，窗口大小)，并且将结果乘以100来得出序列一致性百分比。包括与本文所述的任何参考序列具有至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％序列一致性(参见，例如，序列表)的核苷酸和多肽，通常其中多肽变体维持参考多肽的至少一种生物活性。

用于描述两种或更多种多核苷酸或多肽之间的序列关系的术语包括“参考序列”、“比较窗口”、“序列一致性”、“序列一致性百分比”和“实质一致性”。“参考序列”为至少12个但常常为15个至18个且往往至少25个单体单元长度，其包括核苷酸和氨基酸残基。因为两种多核苷酸可各自包含(1)在两种多核苷酸之间类似的序列(即，完全多核苷酸序列的仅一部分)；以及(2)在两种多核苷酸之间不同的序列，在两种(或更多种)多核苷酸之间的序列比较通常通过在“比较窗口”上比较两种多核苷酸的序列来执行，以鉴定并比较具有序列相似性的局部区域。“比较窗口”是指至少6个邻接位置、通常约50个至约100个邻接位置、更通常为约100个至约150个邻接位置的概念性节段，在所述比较窗口中在将两个序列最佳比对之后，将序列与具有相同数目的邻接位置的参考序列相比较。比较窗口可包含在与参考序列(不包含添加或缺失)相比较时约20％或更少的添加或缺失(即，空隙)，以达两种序列的最佳比对。用于比对比较窗口的序列的最佳比对可通过计算机化算法实现方案(WisconsinGenetics软件包7.0发布版中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA,Genetics Computer Group,575Science Drive Madison,WI,USA)或通过检查和由所选各种方法中的任何方法所产生的最佳比对(即，在比较窗口上产生更高百分比同源性)来进行。还可参考如例如通过Altschul等,Nucl.Acids Res.25:3389,1997所公开的BLAST家族程序。序列分析的详细论述可在Ausubel等,“Current Protocols in Molecular Biology,”John Wiley&SonsInc.,1994-1998,第15章的第19.3单元中找到。

“统计显著”意指结果不可能偶然发生。统计显著性可通过本领域中已知的任何方法来测定。显著性的常用量度包括p值，其为在虚无假设为真的情况下，将发生所观察事件的频率或机率。如果所获得p值小于显著性水平，则拒绝虚无假设。在简单情况下，显著性水平限定在0.05或更小的p值下。

术语“溶解度”是指本文所述的抗体溶解在液体溶剂中并且形成均质溶液的性质。溶解度通常表示为浓度，表示为每单位体积溶剂的溶质质量(g溶质/kg溶剂、g/dL(100mL)、mg/mL等等)、摩尔浓度、重量摩尔浓度、摩尔分数或其他类似浓度描述。每一溶剂量可溶解的溶质的最大平衡量为在指定条件下该溶质于该溶剂中的溶解度，所述指定条件包括温度、压力、pH以及溶剂的性质。在某些实施方案中，溶解度在生理学pH下或其他pH下测量，例如在pH 5.0、pH 6.0、pH 7.0或pH 7.4下测量。在某些实施方案中，溶解度在水或生理缓冲液诸如PBS或NaCl(具有或不具有NaP)中测量。在特定实施方案中，溶解度在相对较低pH(例如，pH 6.0)和相对较高盐(例如，500mM NaCl和10mM NaP)下测量。在某些实施方案中，溶解度在诸如血液或血清的生物学流体(溶剂)中测量。在某些实施方案中，温度可为约室温(例如，约20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃)或约体温(约37℃)。在某些实施方案中，抗体在室温下或在约37℃下具有至少约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25或30mg/mL的溶解度。

如本文所用的“受试者”包括展现症状或病状或处于展现症状或病状的风险或疑似展现症状或病状的任何动物，其可利用本文所述的抗体来诊断。适合的受试者(患者)包括实验室动物(诸如小鼠、大鼠、兔或天竺鼠)、农场动物和家畜或宠物(诸如猫或狗)。包括非人类灵长类动物并且优选地为人类患者。

如本文所用的“受试者亚群”或“患者亚群”包括特征为具有一个或多个区别性可测量和/或可鉴定特性的受试者或患者子集，所述特性将所述受试者或患者子集与所属较宽疾病类别(例如，癌症)中的其他患者相区别。这些特性包括疾病亚类、性别、生活方式、健康史、所涉及器官/组织、治疗史等等。在一些实施方案中，患者或受试者亚群的特征为在生物样品例如肿瘤样品中精氨基琥珀酸合成酶多肽的(例如，减少)量或水平。

“实质上”或“基本上”意指几乎全部地或完全地，例如某一给定数量的95％、96％、97％、98％、99％或更大。

“实质上不含”是指几乎完全或完全不存在给定数量，例如，某一给定数量的小于约10％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％或更小。例如，某些组合物可“实质上不含”细胞蛋白质、膜、核酸、内毒素或其他污染物。

如本文所用的“治疗(treatment/treating)”包括对疾病或病状的症状或病理学的任何合乎需要的效应，并且可包括所治疗疾病或病状的一种或多种可测量标记物的甚至最小改变或改良。“治疗(treatment或treating)”未必指示疾病或病状或其相关联症状的完全根除或治愈。接收此治疗的受试者为有需要的任何受试者。临床改良的示例性标记物对本领域技术人员而言为明显的。

术语“野生型”是指当与天然存在来源分离时具有基因或基因产物的特性的该基因或基因产物。野生型基因或基因产物(例如，多肽)为在群体中最常观察到的并且因此经任意设计而呈现基因的“正常”或“野生型”形式的该基因或基因产物。

抗体

某些实施方案涉及特异性结合至人类精氨基琥珀酸合成酶多肽的抗体，包括结合至其一个或多个邻接或非邻接片段或表位的那些抗体。在一些实施方案中，抗体通过本文所述的轻链可变区序列和/或重链可变区和/或其中所含的互补决定区(CDR)序列或抗原结合区(ABR)来定义，包括特异性结合至人类精氨基琥珀酸合成酶的这些序列的变体和组合。还包括竞争性抑制这些抗体与人类精氨基琥珀酸合成酶的结合的抗体。

示例性抗体序列提供于以下表1中。

因此，在某些实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含表1中的一个或多个序列(例如，SEQ ID NO:1、3、7-12)，包括其组合和变体。例如，在特定实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:1中列出的V_H序列和/或SEQ ID NO:3中列出的V_L序列。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含：重链可变区(V_H)，所述重链可变区包含SEQ ID NO:1中所含有的互补决定区V_HCDR1、V_HCDR2和V_HCDR3序列(例如，分别为SEQ ID NO:7、8和9)；和/或轻链可变区(V_L)，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:3中所含有的互补决定区V_LCDR1、V_LCDR2和V_LCDR3序列(例如，分别为SEQ ID NO:10、11和12)。在一些实施方案中，CDR序列根据Kabat、Clothia的规则或其组合来定义(还参见

国际ImMunoGeneTics

)。

如本文所用的术语“抗原结合片段”是指多肽片段，其含有结合至所关注抗原的免疫球蛋白重链和/或轻链的至少一个CDR。就此而言，本文描述的抗体的抗原结合片段可包含来自特异性结合至治疗或诊断靶标(诸如人类精氨基琥珀酸合成酶多肽，包括其片段)的抗体的V_H序列和V_L序列的1、2、3、4、5个或所有6个CDR。

术语“抗原”是指分子或分子的一部分，其能够通过选择性抗体或其抗原结合片段结合，并且另外能够用于动物中以产生能够结合至该抗原的表位的抗体。抗原可具有一个或多个表位。

术语“表位”包括任何决定簇，优选为多肽决定簇，其能够特异性结合至免疫球蛋白或T细胞受体。表位为抗原内由抗体结合的区域。在某些实施方案中，表位决定簇包括分子的化学活性表面基团，诸如氨基酸、糖侧链、磷酰基或磺酰基，并且在某些实施方案中，可具有特定三维结构特性和/或特定电荷特性。表位可相对于抗原的主要结构为邻接或非邻接的。

如果与抗体、其抗原结合片段和替代细胞或物质反应或缔合相比，所述抗体、其抗原结合片段更频繁地、更快速地以更大持续时间和/或以更大亲和力和特定细胞或物质反应或缔合，则认为所述抗体、其抗原结合片段展现出“特异性结合”或“优先结合”。如果与抗体结合至其他物质相比，所述抗体以更大亲和力、亲合力、更容易地和/或以更大持续时间结合至靶标，则所述抗体“特异性结合”或“优先地结合”至所述靶标。例如，特异性或优先地结合至特定表位的抗体为与所述抗体结合至其他表位相比，以更大亲和力、亲合力、更容易地和/或以更大持续时间结合该特定表位的抗体。还应理解通过例如以下方式来解读此定义：特异性或优先地结合至第一靶标的抗体(或部分或表位)可以或可以不特异性或优先地结合至第二靶标。因而，“特异性结合”或“优先结合”未必需要(尽管其可包括)唯一结合。通常但并非必要地，对结合的提及意指优先结合。

免疫结合通常是指例如举例说明而非限制地由于静电、离子、亲水性和/或疏水性吸引或排斥、立体力、氢键结、范德华力以及其他相互作用而在免疫球蛋白分子与免疫球蛋白对其而言具特异性的抗原之间发生的非共价相互作用类型。免疫结合相互作用的强度或亲和力可以相互作用的解离常数(K_d)来表示，其中较小K_d表示较大亲和力。所选多肽的免疫结合性质可使用本领域中熟知的方法来定量。一种此类方法需要测量抗原结合位点/抗原复合物形成和解离的速率，其中那些速率取决于复合物配偶体的浓度、相互作用的亲和力，并且取决于在两个方向上同等地影响速率的几何参数。因此，“缔合速率常数”(k_on)和“解离速率常数”(k_off)可通过计算浓度和缔合与解离的实际速率来测定。k_off/k_on的比率允许消除与亲和力不相关的所有参数，且因此等于解离常数K_d。

抗体及其抗原结合片段的免疫结合性质可使用本领域中熟知的方法来定量(参见Davies等,Annual Rev.Biochem.59:439-473,1990)。在一些实施方案中，据说当平衡解离常数为约≤10^-7或10^-8M时，抗体特异性结合抗原或其表位。在一些实施方案中，蛋白质平衡解离常数可为约≤10^-9M或≤10^-10M。在某些说明性实施方案中，蛋白质对本文所述的抗原或靶标(所述蛋白质与其特异性结合)具有约、至少约或不超过约0.01、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40或50nM的亲和力(K_d)。

如上所述，本文所述的抗体特异性结合至人类精氨基琥珀酸合成酶多肽或其片段或表位。精氨基琥珀酸合成酶(synthase)或合成酶(synthetase)(ASS或ASS1)(EC6.3.4.5)为催化精氨基琥珀酸由瓜氨酸和天冬氨酸酯合成的酶。精氨基琥珀酸合成酶负责尿素循环的第三步骤和瓜氨酸-NO循环的反应之一。人类精氨基琥珀酸合成酶的主要氨基酸序列示出于以下表2中。

因此，本文所述的抗体特异性结合至SEQ ID NO:5的多肽或其片段或表位。在某些实施方案中，这些抗体特异性结合至SEQ ID NO:5的约或至少约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40或50个或更多个氨基酸的邻接片段。

在某些实施方案中，如本文所述的抗体及其抗原结合片段包括分别插入在重链架构区(FR)组与轻链架构区(FR)组之间的重链CDR组和轻链CDR组，所述架构区(FR)组对CDR提供支撑并且限定CDR相对于彼此的空间关系。如本文所用的，术语“CDR组”是指重链V区或轻链V区的三个高变区。自重链或轻链的N末端起，这些区域分别表示为“CDR1”、“CDR2”和“CDR3”。因此，抗原结合位点包括六个CDR，包含来自每个重链V区和轻链V区的CDR组。包含单一CDR(例如，CDR1、CDR2或CDR3)的多肽在本文中称为“分子识别单元”。许多抗原抗体复合物的结晶学分析已证明：CDR的氨基酸残基与所结合抗原形成广泛接触，其中最广泛抗原接触为与重链CDR3的接触。因此，分子识别单元主要负责抗原结合位点的特异性。

如本文所用的，术语“FR组”是指四个侧接氨基酸序列，其限定重链V区或轻链V区的CDR组的CDR。一些FR残基可接触所结合抗原；然而，FR主要负责将V区折叠成抗原结合位点，尤其为直接相邻于CDR的FR残基。在FR内，某些胺基残基和某些结构特点为极高度保守的。就此而言，所有V区序列均含有大约90个氨基酸残基的内部二硫化物环。当V区折叠成结合位点时，CDR显示为形成抗原结合表面的突出环基序。一般认为，存在FR的影响CDR环成为某些“典型”结构的折叠形状的保守结构区—与精确CDR氨基酸序列无关。另外，已知某些FR残基参与非共价域间接触，从而稳定抗体重链和轻链的相互作用。

可参考Kabat,E.A.等,Sequences of Proteins of Immunological Interest.第4版,US Department of Health and Human Services.1987及其更新内容来确定免疫球蛋白可变结构域的结构和位置。

在一些实施方案中，抗体为“单克隆抗体”，其是指同源抗体群体，其中单克隆抗体包含涉和表位的选择性结合的氨基酸(天然存在的氨基酸和非天然存在的氨基酸)。单克隆抗体针对单一表位具有高特异性。术语“单克隆抗体”不仅涵盖完整单克隆抗体和全长单克隆抗体，而且涵盖其片段(诸如Fab、Fab’、F(ab’)₂、Fv)、单链(scFv)、其变体、包含抗原结合部分的融合蛋白质、人源化单克隆抗体、嵌合单克隆抗体以及免疫球蛋白分子的任何其他修饰构型，所述免疫球蛋白分子包含具有所需特异性和结合至表位的能力的抗原结合片段(表位识别位点)。并不意味着在抗体的来源或制成(例如，通过杂交瘤、噬菌体选择、重组表达、转基因动物)所述抗体的方式方面受到限制。术语包括在“抗体”的定义下的本文所述的完整免疫球蛋白以及片段等等。

蛋白水解酶木瓜酶优先地裂解IgG分子以产生若干片段，其中两个片段(F(ab)片段)各自包含具有完整抗原结合位点的共价异源二聚物。酶胃蛋白酶能够裂解IgG分子以提供若干片段，包括含有两个抗原结合位点的F(ab’)₂片段。根据本发明的某些实施方案来使用的Fv片段可通过IgM以及在极少情形下IgG或IgA免疫球蛋白分子的优先蛋白水解裂解来产生。然而，Fv片段更通常使用本领域中已知的重组技术来得到。Fv片段包括非共价V_H::V_L异源二聚物，其包括保持天然抗体分子的大部分抗原识别和结合能力的抗原结合位点。参见Inbar等,PNAS USA.69:2659-2662,1972；Hochman等,Biochem.15:2706-2710,1976；以及Ehrlich等,Biochem.19:4091-4096,1980。

在某些实施方案中，涵盖单链Fv或scFV抗体。例如，κ抗体(Ill等,Prot.Eng.10:949-57,1997)；微型抗体(Martin等,EMBO J 13:5305-9,1994)；双抗体(Holliger等,PNAS90:6444-8,1993)；或Janusins(Traunecker等,EMBO J 10:3655-59,1991；以及Traunecker等,Int.J.Cancer Suppl.7:51-52,1992)可使用标准分子生物学技术遵循本申请关于选择具有所需特异性的抗体的教义来制备。

单链Fv(sFv)多肽为共价连接的V_H::V_L异源二聚物，其表达自包含由肽编码接头连接的V_H编码基因和V_L编码基因的基因融合物。Huston等,(PNAS USA.85(16):5879-5883,1988)。已描述许多方法来分辨用于将来自抗体V区的天然聚集—但化学分离—轻链多肽链和重链多肽链转化成sFv分子的化学结构，所述sFv分子将折叠成实质上类似于抗原结合位点的结构的三维结构。参见，例如，Huston等的美国专利号5,091,513和5,132,405；以及Ladner等的美国专利号4,946,778。

在某些实施方案中，抗体或其抗原结合片段为人源化的。这些实施方案是指嵌合分子，其通常使用重组技术制备，具有来源于来自非人类物种的免疫球蛋白的抗原结合位点并具有基于人类免疫球蛋白的结构和/或序列的分子的剩余免疫球蛋白结构。抗原结合位点可包含融合于恒定结构域上的完全可变结构域，或仅接枝于可变结构域中的适当架构区上的CDR。表位结合位点可为野生型的或通过一个或多个氨基酸取代修饰。这消除作为人类个体中的免疫原的恒定区，但保留对外来可变区的免疫反应的可能性(LoBuglio等,PNASUSA 86:4220-4224,1989；Queen等,PNAS USA.86:10029-10033,1988；Riechmann等,Nature.332:323-327,1988)。用于抗体的人源化的说明性方法包括美国专利号7,462,697中所述的方法。

另一种方法不仅关注于提供源于人类的恒定区，而且也关注修饰可变区以便将所述可变区尽可能紧密地改造成人类形式。已知的是，重链和轻链两者的可变区含有三个互补决定区(CDR)，其响应于所论述的表位而变化并且决定结合能力，其侧接有四个架构区(FR)，所述架构区在给定物种中相对保守并且推定地提供用于CDR的支架。当相对于特定表位来制备非人类抗体时，可变区可通过将来源于非人类抗体的CDR接枝于存在于人类抗体中待修饰的FR上来“改造”或“人源化”。此方法对各种抗体的应用已由以下各项报导：Sato等,Cancer Res.53:851-856,1993；Riechmann等,Nature 332:323-327,1988；Verhoeyen等,Science 239:1534-1536,1988；Kettleborough等,Protein Engineering.4:773-3783,1991；Maeda等,Human Antibodies Hybridoma 2:124-134,1991；Gorman等,PNAS USA.88:4181-4185,1991；Tempest等,Bio/Technology 9:266-271,1991；Co等,PNAS USA.88:2869-2873,1991；Carter等,PNAS USA.89:4285-4289,1992；以及Co等,J Immunol.148:1149-1154,1992。在一些实施方案中，人源化抗体保存所有CDR序列(例如，人源化小鼠抗体，其含有来自小鼠抗体的所有六个CDR)。在其他实施方案中，人源化抗体具有一个或多个CDR(一个、两个、三个、四个、五个、六个)，其相对于原始抗体来改变，也称为“来源于”来自原始抗体的一个或多个CDR的一个或多个CDR。

本文所述的抗体及其抗原结合片段可包含来自任何种类的哺乳动物的具有任何种类的免疫球蛋白亚型(例如，IgA、IgD、IgE、IgG、IgM，包括其子类及组合，例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)的轻链恒定区或重链恒定区(例如，Fc区)，所述哺乳动物诸如小鼠、人类、兔或山羊。“Fc区”序列通常来源于免疫球蛋白(Ig)分子的重链。典型Ig分子由两条重链和两条轻链构成。重链可分成至少三个功能区：Fd区、Fc区(片段可结晶区)和铰链区，后者仅在IgG、IgA和IgD免疫球蛋白中找到。Fd区包含重链的可变(VH)结构域和恒定(CH1)结构域，并且连同轻链的可变(VL)结构域和恒定(CL)结构域一起形成抗原结合片段或Fab区。

IgG、IgA和IgD免疫球蛋白的Fc区包含重链恒定结构域2和3，其分别命名为CH2区和CH3区；并且IgE和IgM免疫球蛋白的Fc区包含重链恒定结构域2、3和4，其分别命名为CH2区、CH3区和CH4区。Fc区主要负责免疫球蛋白效应物功能，其包括例如补体固定和与效应物细胞的同源Fc受体的结合。

铰链区(在IgG、IgA和IgD找到)充当柔性间隔物，其允许Fab部分在空间中相对于Fc区自由地移动。与恒定区对比，铰链区在结构上不同，在免疫球蛋白类别和子类中在序列和长度两者上有所变化(参见以上)。铰链区还可含有一个或多个糖基化位点，其包括许多结构上相异类型的位点以用于碳水化合物连接。例如，IgA1在铰链区的17氨基酸节段内含有五个糖基化位点，从而赋予铰链区多肽赋予对肠蛋白酶的显著抵抗力。CH2结构域的铰链近端区中的残基还可影响免疫球蛋白与其相应Fc受体之间的相互作用的特异性(参见，例如，Shin等,Intern.Rev.Immunol.10:177-186,1993)。

如本文所用的术语“Fc区”或“Fc片段”或“Fc”因此是指抗体的一部分或其抗原结合片段，其含有来自一个或多个所选免疫球蛋白的CH2区、CH3区和/或CH4区中的一种或多种，包括其片段和变体以及组合。“Fc区”还可包括免疫球蛋白的重链恒定区的一个或多个铰链区。在某些实施方案中，Fc区不含有免疫球蛋白的CH1区、CL区、VL区和/或VH区中的一种或多种。

Fc区可包含任何一个或多个免疫球蛋白类别的CH2区、CH3区、CH4区和/或铰链区，包括但不限于IgA、IgD、IgE、IgG、IgM，包括其子类和组合。在一些实施方案中，Fc区来自IgA免疫球蛋白(例如，小鼠、人类、兔、山羊)，包括子类IgA1和/或IgA2。在某些实施方案中，Fc区来自IgD免疫球蛋白(例如，小鼠、人类、兔、山羊)。在特定实施方案中，Fc区来自IgE免疫球蛋白(例如，小鼠、人类、兔、山羊)。在一些实施方案中，Fc区来自IgG免疫球蛋白(例如，小鼠、人类、兔、山羊)，包括子类IgG1、IgG2、IgG3和/或IgG4。在某些实施方案中，Fc区来自IgM免疫球蛋白(例如，小鼠、人类、兔、山羊)。

还包括抗体或其抗原结合片段，其包含表1中的序列的“变体”(例如，SEQ ID NO:1、3、7-12的变体)。如本文中所用的术语“变体”序列是指与本文公开的参考序列(例如，表1，SEQ ID NO:1、3、7-12)相差一个或多个取代、缺失(例如，截断)、添加和/或插入的多肽或多核苷酸序列。某些变体因此包括本文所述的参考序列的片段。变体多肽为生物活性的，即，其持续具有参考多肽的结合活性。这些变体可由例如遗传多态性和/或人类操纵而产生。

在许多情况下，生物活性变体将含有一个或多个保守取代。“保守取代”为氨基酸由具有类似性质的另一个氨基酸取代以使得肽化学领域技术人员将预期多肽的二级结构和疏水性质实质上不会改变的取代。如上所述，可在本发明的多核苷酸和多肽的结构中进行修饰，并且仍获得编码具有合乎需要特性的变体或衍生多肽的功能分子。当意图改变多肽的氨基酸序列以产生本发明的多肽的等效或甚至改良的变体或部分时，本领域技术人员将通常根据以下表A改变编码DNA序列的密码子中的一种或多种。

例如，蛋白质结构中的某些氨基酸可由其他氨基酸取代，而没有与例如像抗体的抗原结合区或底物分子上的结合位点的结构的相互作用结合能力的可观损失。因为蛋白质的相互作用能力和性质限定该蛋白质的生物功能活性，所以可在蛋白质序列中并且当然可在其基本DNA编码序列中做出某些氨基酸序列取代，并且虽然如此仍获得具有类似性质的蛋白质。因此涵盖的是，可在所公开组合物的肽序列或编码所述肽的相应DNA序列中做出各种改变，而没有其实用性的可观损失。

在做出此类改变时，可考虑氨基酸的疏水指数。本领域中通常理解疏水氨基酸指数在对蛋白质赋予相互作用生物功能中的重要性(Kyte&Doolittle,1982,以引用方式并入本文)。所接受的是，氨基酸的相对疏水特性有助于所得蛋白质的二级结构，其继而限定蛋白质与其他分子的相互作用，所述其他分子例如酶、底物、受体、DNA、抗体、抗原以及类似物。已基于各种氨基酸的疏水性和电荷特性来指定所述氨基酸的疏水指数(Kyte&Doolittle,1982)。这些值为：异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；苏氨酸(-0.7)；丝氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；组氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸酯(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；赖氨酸(-3.9)；以及精氨酸(-4.5)。本领域中已知的是，某些氨基酸可由具有类似疏水指数或评分的其他氨基酸取代，并且仍产生具有类似生物活性的蛋白质，即，仍获得生物学功能等效的蛋白质。在做出这些改变时，疏水指数在±2内的氨基酸的取代为优选的，疏水指数在±1内的氨基酸的取代为尤其优选的，并且疏水指数在±0.5内的氨基酸的取代为甚至尤其更优选的。

本领域中还理解的是，可基于亲水性来有效地做出类似氨基酸的取代。美国专利4,554,101(特别地以全文引用方式并入本文中)阐述：如受蛋白质的相邻氨基酸的亲水性所支配的，蛋白质的最大局部平均亲水性与所述蛋白质的生物性质有关。如美国专利4,554,101中所详述的，已对氨基酸残基指定以下亲水性值：精氨酸(+3.0)；赖氨酸(+3.0)；天冬氨酸酯(+3.0±1)；谷氨酸(+3.0±1)；丝氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；苏氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5±1)；丙氨酸(-0.5)；组氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；甲硫氨酸(-1.3)；缬氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；异亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)；色氨酸(-3.4)。应理解，氨基酸可由具有类似亲水性值的另一个氨基酸取代，并且仍获得生物学等效且尤其免疫学等效的蛋白质。在这些改变中，亲水性值在±2内的氨基酸的取代为优选的，亲水性值在±1内的氨基酸的取代为尤其优选的，并且亲水性值在±0.5内的氨基酸的取代为甚至尤其更优选的。

如以上所概述，氨基酸取代因此通常基于氨基酸侧链取代基的相对相似性，例如基于其疏水性、亲水性、电荷、大小以及类似特性。将各种前述特性考虑在内的示例性取代为本领域技术人员所熟知的，并且包括：精氨酸和赖氨酸；谷氨酸和天冬氨酸酯；丝氨酸和苏氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；以及缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。

氨基酸取代可进一步基于残基的极性、电荷、溶解度、疏水性、亲水性和/或两亲性质的相似性来做出。例如，带负电氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；带正电氨基酸包括赖氨酸和精氨酸；并且具有未带电极性头部基团的具有类似亲水性值的氨基酸包括亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸；甘氨酸和丙氨酸；天冬酰胺和谷氨酰胺；以及丝氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸。可表示保守性改变的其他氨基酸群组包括：(1)ala、pro、gly、glu、asp、gln、asn、ser、thr；(2)cys、ser、tyr、thr；(3)val、ile、leu、met、ala、phe；(4)lys、arg、his；以及(5)phe、tyr、trp、his。

变体还可或可选地含有非保守性改变。在一更优选实施方案中，变体多肽与天然或参考序列相差约或少于约10、9、8、7、6、5、4、3、2个氨基酸或甚至1个氨基酸的取代、缺失或添加。变体还可(或可选地)通过例如对多肽的免疫原性、二级结构、酶促活性和/或疏水性质具有最小影响的氨基酸的缺失或添加来修饰。

一般而言，变体将显示与参考多肽序列(例如，表1，SEQ ID NO:1、3、7-12)至少约30％、40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相似性或序列一致性或序列同源性。此外，涵盖与参考序列相差约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100个氨基酸(包括其间所有整数和范围)的添加(例如，C末端添加、N末端添加、两者兼有)、缺失、截断、插入或取代(例如，保守取代)，但保持亲本或参考多肽序列的性质或活性的序列。

在一些实施方案中，变体多肽与参考序列相差至少一个但小于50、40、30、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3或2个氨基酸残基。在其他实施方案中，变体多肽与参考序列相差至少1％但小于20％、15％、10％或5％的残基。(如果此比较需要比对，则序列应针对最大相似性来比对。在一些情况下，因缺失或插入或失配而处于“环”外的序列视为差异。

序列之间的序列相似性或序列一致性(所述术语在本文中可互换使用)的计算执行如下。为测定两个氨基酸序列或两个核酸序列的一致性百分比，出于最佳比较目的来比对序列(例如，可将空隙引入第一氨基酸或核酸序列和第二氨基酸或核酸序列的一者或两者中以达最佳比对，并且出于比较目的可忽视非同源序列)。在某些实施方案中，出于比较目的而比对的参考序列的长度为参考序列的长度的至少30％、优选至少40％、更优选至少50％、60％以及甚至更优选至少70％、80％、90％、100％。随后比较对应氨基酸位置或核苷酸位置处的氨基酸残基或核苷酸。当第一序列中的位置由与第二序列中的对应位置相同的氨基酸残基或核苷酸占据时，则分子在该位置处为一致的。

两个序列之间的一致性百分比随序列共享的一致位置的数目而变化，这考虑了空隙的数目和每个空隙的长度，需要引入所述空隙以达两个序列的最佳比对。

可使用数学算法来完成序列的比较和两个序列之间的一致性百分比的测定。在一个优选实施方案中，使用已并入GCG软件包中的GAP程序中的Needleman和Wunsch(J.Mol.Biol.48:444-453,1970)算法、使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵以及16、14、12、10、8、6或4的空隙加权值和1、2、3、4、5或6的长度加权值来测定两个氨基酸序列之间的一致性百分比。在又一个优选实施方案中，使用GCG软件包中的GAP程序、使用NWSgapdna.CMP矩阵以及40、50、60、70或80的空隙加权值和1、2、3、4、5或6的长度加权值来测定两个核苷酸序列之间的一致性百分比。一组优选参数包括Blossum62评分矩阵，其中空隙罚分为12、空隙延伸罚分为4并且框架移位空隙罚分为5。

两个氨基酸或核苷酸序列之间的一致性百分比可使用已并入ALIGN程序(2.0版)中的E.Meyers和W.Miller(Cabios.4:11-17,1989)的算法、使用PAM120加权残基表、空隙长度罚分12和空隙罚分4来测定。

本文所述的核酸和蛋白质序列可用作“查询序列”以执行针对公共数据库的搜索，以便例如鉴定其他家族成员或相关序列。这些搜索可使用Altschul,等,(1990,J.Mol.Biol,215:403-10)的NBLAST和XBLAST程序(2.0版)执行。BLAST核苷酸搜索可利用NBLAST程序、评分＝100、字长＝12来执行，以获得与本发明的核酸分子同源的核苷酸序列。BLAST蛋白质搜索可利用XBLAST程序、评分＝50、字长＝3来执行，以获得与本发明的蛋白质分子同源的氨基酸序列。为获得用于比较目的的空隙化比对，可利用如Altschul等,(Nucleic Acids Res.25:3389-3402,1997)中所述的空隙化BLAST。当利用BLAST和空隙化BLAST程序时，可使用相应程序(例如，XBLAST和NBLAST)的默认参数。

在一个实施方案中，如上所述，可使用BLAST比对工具评估多核苷酸和/或多肽。局部比对简单地由一对序列节段组成，序列节段之一来自进行比较的每个序列。Smith-Waterman或Sellers算法的修改形式将找出评分无法通过延伸或修整而改良的所有节段对，其称为高评分节段对(HSP)。BLAST比对的结果包括统计学量度，以指示可有机会单独预期BLAST评分的可能性。

原始评分S由与每个比对序列相关联的空隙和取代的数目计算，其中较高相似性评分指示更显著比对。取代评分由查找表(参见PAM,BLOSUM)给出。

空隙评分通常计算为空隙开放罚分G和空隙延伸罚分L的总和。对于长度n的空隙而言，空隙成本将为G+Ln。空隙成本、G和L的选择为经验性的，但习惯对G选择高值(10-15)，例如11，而对L选择低值(1-2)，例如1。

比特评分S’得自原始比对评分S，其中已考虑所使用评分系统的统计学性质。比特评分相对于评分系统加以正规化，因此所述比特评分可用于比较来自不同搜索的比对评分。术语“比特评分”和“相似性评分”可互换使用。比特评分给出对所述比对良好程度如何的指示；评分愈高，比对愈好。

E-值或预期值描述具有类似评分的序列将偶尔出现在数据库中的可能性。其为具有相当于或好于S的评分的不同比对数目的预测值，预期所述评分偶尔出现在数据库搜索中。E-值愈小，比对愈显著。例如，具有e^-117的E值的比对意指：具有类似评分的序列极不可能偶尔简单地出现。另外，用于比对一对随机氨基酸的预期评分需要为负，否则长的比对将趋向于具有高评分，这独立于所比对节段是否相关。另外，BLAST算法使用适当取代矩阵、核苷酸或氨基酸，并且针对空隙化比对而言，使用空隙创建和延伸罚分。例如，多肽序列的BLAST比对和比较通常使用BLOSUM62矩阵、空隙存在罚分11和空隙延伸罚分1来进行。

在一个实施方案中，序列相似性评分由使用BLOSUM62矩阵、空隙存在罚分11和空隙延伸罚分1进行的BLAST分析来报导。

在一个特定实施方案中，本文中提供的序列一致性/相似性评分是指使用GAP第10版(GCG,Accelrys,San Diego,Calif.)、使用以下参数获得的值：对核苷酸序列而言的一致性％和相似性％，使用空隙加权值50和长度加权值3以及nwsgapdna.cmp评分矩阵；对氨基酸序列而言的一致性％和相似性％，使用空隙加权值8和长度加权值2以及BLOSUM62评分矩阵(Henikoff和Henikoff,PNAS USA.89:10915-10919,1992)。GAP使用Needleman和Wunsch(J Mol Biol.48:443-453,1970)的算法来找出最大化匹配数目并最小化空隙数目的两个完全序列的比对。

在一个特定实施方案中，变体多肽包含可与参考多肽序列最佳比对的氨基酸序列(参见，例如，表、序列表；SEQ ID NO:1、3、7-12)，以产生为至少约50、60、70、80、90、100、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990、1000或更多的BLAST比特评分或序列相似性评分，包括其间所有整数和范围，其中BLAST比对使用BLOSUM62矩阵、空隙存在罚分11和空隙延伸罚分1。

如上所述，参考多肽可以包括氨基酸取代、缺失、截断、添加和插入的各种方式改变。用于这些操纵的方法为本领域中通常已知的。例如，参考多肽的氨基酸序列变体可通过DNA中的突变来制备。用于诱变和核苷酸序列改变的方法为本领域中熟知的。参见，例如，Kunkel(PNAS USA.82:488-492,1985)；Kunkel等,(Methods in Enzymol.154:367-382,1987)；美国专利号4,873,192；Watson,J.D.等,(“Molecular Biology of the Gene”,第四版,Benjamin/Cummings,Menlo Park,Calif.,1987)以及其中引用的参考文献。关于不影响所关注蛋白质的生物活性的适当氨基酸取代的指导可在Dayhoff等,(1978)Atlas ofProtein Sequence and Structure(Natl.Biomed.Res.Found.,Washington,D.C.)的模型中找到。

用于筛选通过这些修饰制成的组合文库的基因产物并且用于筛选具有所选性质的基因产物的cDNA文库的方法为本领域中已知的。对快速筛选通过参考多肽的组合诱变所产生的基因文库而言，这些方法为可接受的。作为一个实例，递回整体诱变(REM)可与筛选测定组合使用来鉴定多肽变体，所述递回整体诱变为一种增强文库中功能突变体的出现频率的技术(Arkin和Yourvan,PNAS USA 89:7811-7815,1992；Delgrave等,ProteinEngineering.6:327-331,1993)。

还包括抗体或其抗原结合片段，其“竞争性抑制”本文所述的抗体(参见，例如，实施例1)与人类精氨基琥珀酸合成酶多肽的结合。用于通过竞争性抑制测定mAb特异性和亲和力的方法可例如在Harlow等,Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1988)；Colligan等编,Current Protocolsin Immunology,Greene Publishing Assoc.and Wiley Interscience,N.Y.,(1992,1993)；Muller,Meth.Enzymol.92:589-601,1983；以及Jia,X-C.等,J.Immunol.Methods288:91-98,2004(所述文献各自以引用方式并入)中找到。

特定实施方案包括抗体或其抗原结合片段，其竞争性抑制抗体与人类精氨基琥珀酸合成酶(SEQ ID NO:5)的结合，其中抗体(其受到竞争性抑制)包含SEQ ID NO:1中列出的V_H序列和/或SEQ ID NO:3中列出的V_L序列。在特定实施方案中，抗体(其受到竞争性抑制)为如本文所述的单克隆抗体，例如，完整单克隆抗体，诸如IgG抗体，。在特定实施方案中，抗体(其受到竞争性抑制)为IgG1或IgG2a免疫球蛋白亚型。

在某些实施方案中，抗体或其抗原结合片段缀合至或共价地连接至可检测实体，例如以促进检测。示例性可检测实体包括而不限于基于碘的标签、放射性同位素、荧光团/荧光染料以及纳米粒子。

示例性基于碘的标签包括泛影酸(

GE Healthcare)及其阴离子形式，即泛影酸盐。泛影酸为用于先进X射线技术诸如CT扫描中的放射性显影剂。还包括以下所述的碘放射性同位素。

可用作可检测实体的示例性放射性同位素包括³²P、³³P、³⁵S、³H、¹⁸F、11C、¹³N、¹⁵O、¹¹¹In、¹⁶⁹Yb、⁹⁹mTC、⁵⁵Fe，以及碘的同位素，诸如¹²³I、¹²⁴I、¹²⁵I以及¹³¹I。这些放射性同位素具有不同的半衰期、衰变类型和能量水平，其可特制来匹配特定协定的需要。

可用作直接可检测实体的荧光团或荧光染料的实例包括荧光素、四甲基若丹明、德克萨斯红、Oregon

以及许多其他实例(例如，Haugland,Handbook ofFluorescent Probes-第9版,2002,Molec.Probes,Inc.,Eugene OR；Haugland,TheHandbook:A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies-第10版,2005,Invitrogen,Carlsbad,CA)。还包括发光染料或其他可检测染料。通过染料发射的光可为可见光或不可见光，诸如紫外光或红外光。在示例性实施方案中，染料可为荧光共振能量传递(FRET)染料；咕吨染料，诸如荧光素和若丹明；在α或β位置具有氨基的染料(诸如萘胺染料、1-二甲基氨基萘基-5-磺酸盐、1-苯胺基-8-萘磺酸盐和2-对-甲苯胺基-6-萘磺酸盐)；具有3-苯基-7-异氰酸基香豆素的染料；吖啶，诸如9-异硫氰基吖啶和吖啶橙；芘，苯并噁二唑和二苯乙烯；具有3-(ε-羧基戊基)-3’-乙基-5,5’-二甲基氧杂羰花青(CYA)的染料；6-羧基荧光素(FAM)；5&6-羧基若丹明-110(R110)；6-羧基若丹明-6G(R6G)；N,N,N’,N’-四甲基-6-羧基若丹明(TAMRA)；6-羧基-X-若丹明(ROX)；6-羧基-4’,5’-二氯-2’,7’-二甲氧基荧光素(JOE)；ALEXA FLUOR^TM；Cy2；德克萨斯红和若丹明红；6-羧基-2’,4,7,7’-四氯荧光素(TET)；6-羧基-2’,4,4’,5’,7,7’-六氯荧光素(HEX)；5-羧基-2’,4’,5’,7’-四氯荧光素(ZOE)；NAN；NED；Cy3；Cy3.5；Cy5；Cy5.5；Cy7；以及Cy7.5；IR800CW,ICG,Alexa Fluor 350；AlexaFluor 488；Alexa Fluor 532；Alexa Fluor 546；Alexa Fluor 568；Alexa Fluor 594；Alexa Fluor 647；Alexa Fluor 680或Alexa Fluor 750。

纳米粒子的大小范围通常为约1-1000nm，并且包括不同化学结构，诸如金和银粒子和量子点。当利用成角度入射白光来照射时，在约40-120nm范围变化的银或金纳米粒子将散射具有高强度的单色光。散射光的波长取决于粒子的大小。四至五种紧密接近的不同粒子将各自散射单色光，当单色光叠加时将得到特定、独特色彩。衍生化纳米粒子诸如银或金粒子可连接至较宽分子阵列，包括蛋白质、抗体、小分子、受体配体以及核酸。纳米粒子的特定实例包括金属纳米粒子和金属纳米壳，诸如金粒子、银粒子、铜粒子、铂粒子、镉粒子、复合物粒子、金中空球、金涂布二氧化硅纳米壳以及二氧化硅涂布金壳。还包括二氧化硅、乳胶、聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚丙烯酸酯、PVDF纳米粒子以及任何这些材料的有色粒子。

量子点为直径约1-5nm的发荧光晶体，其可通过在大波长范围上的光激发。在通过具有适当波长的光激发后，这些晶体以取决于所述晶体的化学组成和大小的波长发射光，诸如单色光。量子点诸如CdSe、ZnSe、InP或InAs具有独特光学性质；这些和类似量子点可购自许多商业来源(例如，NN-Labs,Fayetteville,AR；Ocean Nanotech,Fayetteville,AR；Nanoco Technologies,Manchester,UK；Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)。

抗体可通过本领域普通技术人员已知的各种技术中的任何技术来制备。参见，例如，Harlow和Lane,Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,1988。对所关注多肽具有特异性的单克隆抗体可例如使用Kohler和Milstein,Eur.J.Immunol.6:511-519,1976的技术和对所述技术的改进技术来制备。还包括利用转基因动物诸如小鼠来表达人类抗体的方法。参见，例如，Neuberger等,Nature Biotechnology14:826,1996；Lonberg等,Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101,1994；以及Lonberg等,Internal Review of Immunology 13:65-93,1995。特定实例包括

的

平台(参见，例如，美国专利号6,596,541)。抗体还可通过本文所述和本领域中已知的重组技术来制备。

本发明的抗体可用于本文所述的任何诊断和分析方法以及组合物中。

多核苷酸、宿主细胞和产生方法

某些实施方案涉及编码抗体及其抗原结合片段的多核苷酸，以及例如包含这些多核苷酸的载体，其中多核苷酸可操作地连接至一个或多个调节元件。还包括重组宿主细胞，其包含这些多核苷酸、载体、抗体及其抗原结合片段；另外包括重组产生所述细胞的方法。

抗体及其抗原结合片段可使用标准技术来制备。在特定实施方案中，抗体或其抗原结合片段在表达系统中表达为重组蛋白质，如本文所述和本领域中已知的。

多核苷酸可含有编码抗体或其抗原结合片段的核酸的一个或多个拷贝。在特定实施方案中，多核苷酸序列包含以下表3中的至少一个序列或其变体或片段。

适合的载体可选择或构建为含有适当调节序列，包括启动子序列、终止子序列、多腺苷酸化序列、增强子序列、标记基因以及适当的其他序列。载体适当时可为质粒(例如，病毒性的)、噬菌体或噬菌粒。对进一步细节而言，参见，例如，Molecular Cloning:aLaboratory Manual:第2版,Sambrook等,1989,Cold Spring Harbor Laboratory Press。用于操纵核酸，例如用于制备核酸构建体、进行诱变、测序、将DNA引入细胞中并进行基因表达以及分析蛋白质的许多已知的技术和方案详细地描述于Current Protocols inMolecular Biology,第二版,Ausubel等编,John Wiley&Sons,1992或其后续更新中。

如通过本领域技术人员将理解的，在一些情况下可能有利的是：产生具有非天然存在的密码子的编码多肽的核苷酸序列。例如，受特定原核或真核宿主偏好的密码子可被选择来增加蛋白质表达的速率，或产生具有合乎需要性质的重组RNA转录物，所述性质诸如半衰期，其比由天然存在的序列产生的转录物的半衰期长。这些多核苷酸通常称为“密码子优化的”。本文所述的任何多核苷酸可以密码子优化形式使用。在某些实施方案中，多核苷酸可被密码子优化以用于特定细菌，诸如大肠杆菌(E.coli)或酵母，诸如啤酒酵母菌(S.cerevisiae)(参见，例如，Burgess-Brown等,Protein Expr Purif.59:94-102,2008)。

在一些实施方案中，编码抗体或其抗原结合片段的核酸或载体被直接引入宿主细胞中，并且在足以诱导编码多肽的表达的条件下孵育细胞。因此，根据某些相关实施方案，提供一种重组宿主细胞，其包含编码本文所述的一种或多种抗体或其抗原结合片段(任选地与抗体的其他组分(例如，Fc区)组合)的多核苷酸，并且任选地包含另外的外源多核苷酸。

抗体或其抗原结合片段于宿主细胞中的表达可通过在适当条件下培养重组宿主细胞(含有多核苷酸)来达成。在通过表达而产生之后，可使用任何适合的技术将抗体或其抗原结合片段分离和/或纯化，并且随后按需要使用。术语“宿主细胞”用于指代其中已引入或能够引入编码一种或多种本文所述的抗体或其抗原结合片段的核酸序列的细胞。术语包括亲本细胞的后代，无论所述后代在形态上或在遗传构成上是否与原始亲本细胞一致，只要所选择基因存在即可。宿主细胞可针对某些特性来选择，所述特性例如氨基酰基tRNA合成酶的表达，所述氨基酰基tRNA合成酶可将非天然氨基酸并入抗体或其抗原结合片段中。

用于在各种不同宿主细胞中克隆并表达异源或重组蛋白质的系统为熟知的。适合的宿主细胞包括哺乳动物细胞、细菌、酵母以及杆状病毒系统。本领域中可用于表达蛋白质的哺乳动物细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾细胞、HEK-293细胞、NSO小鼠黑素瘤细胞以及许多其他细胞。有用的哺乳动物宿主细胞系的另外实例包括通过SV40转化的猴肾CV1系(COS-7，ATCC CRL1651)；人类胚胎肾系(针对在悬浮液培养物中的生长来亚克隆的293或293细胞，Graham等,J.Gen Virol.36:59(1977))；幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL 10)；小鼠塞氏细胞(TM4,Mather,Biol.Reprod.23:243-251(1980))；猴肾细胞(CV1ATCC CCL 70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76,ATCC CRL-1587)；人类宫颈癌细胞(HELA,ATCC CCL 2)；犬肾细胞(MDCK,ATCC CCL 34)；水牛大鼠肝细胞(BRL 3A,ATCC CRL 1442)；人类肺细胞(W138,ATCC CCL 75)；人类肝细胞(Hep G2,HB 8065)；小鼠乳腺肿瘤(MMT060562,ATCC CCL51)；TR1细胞(Mather等,Annals N.Y.Acad.Sci.383:44-68(1982))；MRC5细胞；FS4细胞；以及人类肝肿瘤系(Hep G2)。其他有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括DHFR-CHO细胞(Urlaub等,PNAS USA 77:4216(1980))；以及骨髓瘤细胞系，诸如NSO和Sp2/0。为回顾适用于抗体产生的某些哺乳动物宿主细胞系，参见，例如，Yazaki和Wu,Methods in Molecular Biology,第248卷(B.K.C Lo编,Humana Press,Totowa,N.J.,2003),第255-268页。某些优选哺乳动物细胞表达系统包括基于CHO和HEK293-细胞的表达系统，其包括293F细胞。哺乳动物表达系统可利用例如在T形烧瓶、滚瓶或细胞工厂中的黏附细胞系，或例如在1L和5L旋转器、5L、14L、40L、100L和200L搅拌槽生物反应器或20/50L和100/200L WAVE生物反应器以及本领域中已知的其他容器中的悬浮液培养物。

常用的优选细菌宿主为大肠杆菌。蛋白质于原核细胞诸如大肠杆菌中的表达在本领域中已良好确立。有关综述，参见，例如Pluckthun,A.Bio/Technology.9:545-551(1991)。在培养物中的真核细胞中的表达也可由本领域技术人员用来作为用于重组产生多肽的选项(参见Ref,Curr.Opinion Biotech.4:573-576,1993；以及Trill等,Curr.OpinionBiotech.6:553-560,1995)。在特定实施方案中，蛋白质表达可通过T7RNA聚合酶(例如，pET载体系列)来控制。这些和相关实施方案可利用表达宿主菌株BL21(DE3)，其为一种BL21的λDE3溶素原，其支持T7介导的表达并且在lon和ompT蛋白酶中缺乏以提高靶标蛋白质稳定性。还包括运载极少用于大肠杆菌中的编码tRNA的质粒的表达宿主菌株，诸如Rosetta^TM(DE3)和Rosetta 2(DE3)菌株。细胞溶解和样品处置还可使用试剂诸如

核酸酶和

蛋白质提取试剂来改进。对细胞培养而言，自动诱导培养基可提高包括高通量表达系统在内的许多表达系统的效率。此类型的培养基(例如，Overnight Express^TM自动诱导系统)经由代谢迁移而不添加诸如IPTG的人工诱导剂来逐步引出蛋白质表达。特定实施方案使用六组氨酸标记(诸如His·

融合物)，继而进行固定金属亲和力色谱(IMAC)纯化或相关技术。然而，在某些方面中，临床等级蛋白质可在使用或不使用亲和力标记的情况下自大肠杆菌包涵体分离(参见，例如，Shimp等,Protein Expr Purif.50:58-67,2006)。作为另一个实例，某些实施方案可使用冷休克诱导的大肠杆菌高产率生产系统，因为在低温下蛋白质于大肠杆菌中的过度表达提高其溶解度和稳定性(参见，例如，Qing等,Nature Biotechnology.22:877-882,2004)。

另外，宿主细胞菌株可针对其调变插入序列的表达或以所需方式加工所表达蛋白质的能力来加以选择。多肽的这些修饰包括但不限于翻译后修饰，诸如乙酰化、羧基化、糖基化、磷酸化、脂化以及酰化。裂解蛋白质的“蛋白质前体(prepro)”形式的翻译后加工亦可用于促进正确的插入、折叠和/或功能。除细菌细胞之外，可选择不同宿主细胞诸如酵母、CHO、HeLa、MDCK、HEK293以及W138来确保所关注蛋白质(例如，抗体)的正确修饰和加工，所述宿主细胞具有或甚至缺乏达成此类翻译后活性的特定细胞机器和特性机制。

对重组蛋白质的长期、高产率生产而言，稳定表达通常优选。例如，稳定地表达所关注多核苷酸的细胞系可使用表达载体来转化，所述表达载体可含有病毒复制起源和/或内源性表达元件，以及在相同或单独载体上的可选择标记基因。在载体引入之后，可使细胞在富集培养基中生长约1-2天，之后将培养基交换为选择性培养基。可选择标志物的目的为赋予选择抵抗力，并且可选择标志物的存在允许成功地表达所引入序列的细胞的生长和回收。稳定转化细胞的抗性克隆可使用适于细胞类型的组织培养技术来增殖。还可使用诸如通过瞬时转染或感染进行的瞬时生产。适用于瞬时生产的示例性哺乳动物表达系统包括基于HEK293(例如，293F细胞)和CHO的系统。

利用所关注多核苷酸序列转化的宿主细胞可在适用于由细胞培养物表达和回收蛋白质的条件下培养。某些特定实施方案利用无血清细胞表达系统。实例包括可在无血清培养基上生长的HEK293细胞和CHO细胞(参见，例如，Rosser等,Protein Expr.Purif.40:237-43,2005；以及美国专利号6,210,922)。

通过重组细胞产生的蛋白质可根据本领域中已知的各种技术纯化并表征。用于执行蛋白质纯化并分析蛋白质纯度的示例性系统包括快速蛋白质液相色谱(FPLC)(例如，AKTA和Bio-Rad FPLC系统)、高效液相色谱(HPLC)(例如，Beckman和Waters HPLC)。用于纯化的示例性化学方法包括离子交换色谱(例如，Q、S)、尺寸排阻色谱、盐梯度、亲和纯化(例如，Ni、Co、FLAG、麦芽糖、谷胱甘肽、蛋白质A/G)、凝胶过滤、反相、陶瓷

离子交换色谱以及疏水性相互作用柱(HIC)，以及本领域中已知的其他方法。还包括诸如以下各项的分析方法：SDS-PAGE(例如，考马斯、银染色)、免疫印迹、Bradford和ELISA，所述方法可用于生产或纯化过程的任何步骤期间，通常用以测量蛋白质组合物的纯度。

还包括将重组产生的蛋白质(例如，抗体)浓缩的方法。实例包括冻干，其通常在溶液含有除所关注蛋白质之外的难溶性组分时使用。冻干常常在HPLC运作之后执行，并且可自混合物移除大部分或所有挥发性组分。还包括超滤技术，其通常使用一种或多种选择性可渗透膜来浓缩蛋白质溶液。所述膜允许水和小分子通过并且保留蛋白质；溶液可通过机械泵、气体压力或离心以及其他技术来迫使抵靠所述膜。

在某些实施方案中，如根据本领域中的常规技术所测量的，抗体或其抗原结合片段具有至少约90％的纯度。在某些实施方案中，作为诊断组合物或某些治疗组合物，抗体或其抗原结合片段具有至少约95％的纯度。在特定实施方案中，作为治疗或医药组合物，抗体或其抗原结合片段具有至少约97％或98％或99％的纯度。在其他实施方案中，诸如当用作参考试剂或研究试剂时，抗体或其抗原结合片段可具有较小纯度，并且可具有至少约50％、60％、70％或80％的纯度。纯度可整体测量或相对于所选组分诸如其他蛋白质来测量，例如测量基于蛋白质的纯度。

在某些实施方案中，本文所述的组合物约为实质上无内毒素的，包括例如约95％无内毒素的、优选约99％无内毒素的并且更优选地约99.99％无内毒素的。可根据本领域中的常规技术来检测内毒素的存在，如本文所述的。在特定实施方案中，抗体或其抗原结合片段在实质上无血清的培养基中由真核细胞诸如哺乳动物或人类细胞制成。

使用方法

本发明的实施方案包括使用本文所述的抗体及其抗原结合片段来测定样品诸如生物样品中精氨基琥珀酸合成酶多肽的存在、不存在、量或水平的方法。这些方法包括例如使用抗体或其抗原结合片段作为伴随式诊断来鉴定适于精氨酸剥夺疗法、包括适于施用至少一种精氨酸耗尽剂的受试者。在一些实施方案中，如果生物样品中精氨基琥珀酸合成酶多肽的量相对于对照减少，则认为受试者适用于精氨酸剥夺疗法。在特定实施方案中，所述方法包括使用抗体或其抗原结合片段作为伴随式诊断来鉴定患有或疑似患有展现精氨基琥珀酸合成酶的缺少(例如，精氨基琥珀酸合成酶的表达减少)的癌症或肿瘤的受试者，并且治疗待利用精氨酸剥夺疗法治疗的受试者或使所述受试者利用精氨酸剥夺疗法来治疗。

某些实施方案因此包括测定生物样品中人类精氨基琥珀酸合成酶多肽的量的方法，所述方法包括：(a)获得或接收任选地来自受试者的生物样品；(b)使生物样品与本文所述的抗体或其抗原结合片段接触；以及(c)测量样品中抗体或其抗原结合片段的量，其中抗体或其抗原结合片段的量决定样品中精氨基琥珀酸合成酶多肽的量。

还包括鉴定生物样品中精氨基琥珀酸合成酶的缺少的方法，所述方法包括：(a)获得或接收任选地来自受试者的生物样品；(b)使生物样品与本文所述的抗体或其抗原结合片段接触；(c)测量样品中抗体或其抗原结合片段的量，其中抗体或其抗原结合片段的量决定样品中精氨基琥珀酸合成酶多肽的量；以及(d)如果生物样品中精氨基琥珀酸合成酶多肽的量相对于对照减少，则鉴定为样品中精氨基琥珀酸合成酶的缺少。

一些实施方案包括鉴定适于精氨酸剥夺或耗尽疗法的受试者的方法，所述方法包括：(a)任选地经由保健提供者获得或接收来自受试者的生物样品提供者；(b)使生物样品与本文所述的抗体或其抗原结合片段接触；(c)测量样品中抗体或其抗原结合片段的量，其中抗体或其抗原结合片段的量决定样品中精氨基琥珀酸合成酶多肽的量；以及(d)如果生物样品中精氨基琥珀酸合成酶多肽的量相对于对照减少，则将受试者鉴定为适用于精氨酸剥夺疗法。

在一些实施方案中，步骤(a)包含自保健提供者接收生物样品，所述保健提供者诸如医师、诊所或医院。接收生物样品和/或执行测试的实体可与保健提供者相关联或与保健提供者分离。在特定实施方案中，接收样品和/或执行测试的实体为第三方诊断公司。在一些实施方案中，接收样品和/或执行测试的实体为临床或医院相关联的诊断实验室。在一些实施方案中，所述方法(例如，步骤(c)或(d))包含向相同或不同保健提供者(例如，医师)提供关于生物样品中精氨基琥珀酸合成酶多肽的量的信息。

任何这些和相关实施方案还可包括向(d)的受试者施用如本文所述和/或本领域中已知的至少一种精氨酸耗尽剂。

还包括用于诊断并治疗受试者的方法，所述方法包括：(a)分析测试的结果，所述测试指示来自受试者的生物样品中精氨基琥珀酸合成酶多肽的量，其中所述测试使用本文所述的抗体或其抗原结合片段来执行；(b)如果来自(a)的结果指示生物样品中精氨基琥珀酸合成酶多肽的量相对于对照减少，则将患者诊断为适用于精氨酸剥夺疗法；以及(c)通过施用至少一种精氨酸耗尽剂来治疗(b)的受试者。

用于治疗受试者的方法包括：(a)请求测定来自受试者的生物样品中精氨基琥珀酸合成酶多肽的量的测试，其中所述测试使用本文所述的抗体或其抗原结合片段来执行；以及(b)如果来自(a)的测试指示生物样品中精氨基琥珀酸合成酶多肽的量相对于对照减少，则向受试者施用至少一种精氨酸耗尽剂。

在特定实施方案中，受试者为哺乳动物，例如，人类患者。

在某些实施方案中，受试者患有或疑似患有癌症或肿瘤。癌症和肿瘤的实例包括黑素瘤、肝肿瘤、胰腺癌、前列腺癌、间皮瘤、肉瘤、头颈癌、白血病、急性骨髓白血病、复发性急性骨髓白血病、乳腺癌、卵巢癌、结肠直肠癌、胃癌、神经胶质瘤、多形性神经胶质母细胞瘤、非小细胞肺癌(NSCLC)、诸如肾细胞癌的肾癌、膀胱癌、子宫癌、食管癌、脑癌、子宫颈癌、睪丸癌以及胃癌。

术语“黑素瘤”包括由皮肤和其他器官的黑色素细胞系统产生的恶性或良性肿瘤，所述其他器官包括口腔、食道、肛管、阴道、软脑膜和/或结膜或眼睛。作为非限制性实例，术语“黑素瘤”包括肢端小痣性黑素瘤、无黑色素黑素瘤、良性幼年黑素瘤、小痣性恶性黑素瘤、恶性黑素瘤、结节状黑素瘤、甲下黑素瘤和浅表扩散性黑素瘤。

“肝肿瘤”可为肝的恶性或良性肿瘤，作为非限制性实例，其包括肝细胞癌、恶性肝肿瘤、纤维层状肝癌和肝细胞胆管癌、混合型肝细胞胆管癌以及未分化肝细胞癌。

术语“肉瘤”包括在结缔组织中产生的恶性或良性肿瘤，作为非限制性实例，所述结缔组织包括骨、软骨和横纹肌。肉瘤的实例包括但不限于脂肉瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、滑膜肉瘤、血管肉瘤、纤维肉瘤、神经纤维肉瘤、肠胃道间质瘤(GIST)、尤恩氏肉瘤、骨肉瘤以及软骨肉瘤。

“乳腺癌”是指乳房中产生的恶性或良性肿瘤，并且包括但不限于局部阶段性乳腺癌、区域阶段性肿瘤和远侧阶段性癌症。乳腺癌的实例包括但不限于腺癌(包括导管癌和小叶性癌)、小叶原位癌(LCIS)髓质癌、黏液素癌、乳头的佩吉特氏病、叶状肿瘤以及管状癌。

这些癌症的更特定实例包括鳞状细胞癌、小细胞肺癌、垂体癌、食管癌、星状细胞瘤、软组织肉瘤、非小细胞肺癌、肺的腺癌、肺的鳞状细胞癌、腹膜的癌症、肝细胞癌、肠胃癌、胰腺癌、神经胶质母细胞瘤、子宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝肿瘤、乳腺癌、结肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜或子宫癌、唾液腺癌、肾癌、肝癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌、脑癌、子宫内膜癌、睪丸癌、胆管癌、胆囊癌、胃癌、黑素瘤以及各种类型的头颈癌。在特定实施方案中，癌症为以下各项的癌症：乳房、大脑、前列腺、肾、胰腺、肺、甲状腺、结肠、子宫颈、卵巢、睪丸、直肠、胆囊、肛门、脾、肝、皮肤、骨、垂体、子宫内膜、胃、血液或淋巴腺。

生物样品可包括任何种类的样品、流体或组织。生物样品的非限制性实例包括血液、血浆、皮肤、毛发、毛囊、唾液、口腔黏膜、阴道黏膜、汗液、泪液、上皮组织、尿、精子、精液、精浆、前列腺液、排泄物、活检、腹水、脑脊髓液、淋巴液、组织提取物样品以及活检样品，诸如癌症或肿瘤活检样品或疑似癌症或肿瘤活检样品。癌性或肿瘤活检样品的特定实例包括来自以下各项的那些活检样品：皮肤组织、肝组织、胰腺组织、前列腺组织、间皮组织、上皮组织、卵巢组织、结肠直肠组织、胃组织、脑组织、肺组织、肾组织、膀胱组织、子宫组织、食道组织、子宫颈组织、睪丸组织、乳房组织以及间叶组织，诸如骨组织、软骨组织、脂肪组织、肌肉组织、血管组织、血液和造血细胞/组织。

在一些实施方案中，如果生物样品中精氨基琥珀酸合成酶多肽的量或水平相对于对照减少，则将生物样品鉴定为缺少精氨基琥珀酸合成酶，或将受试者鉴定或诊断为适用于精氨酸剥夺疗法。在一些实施方案中，对照为参考标准、来自健康受试者的生物样品或来自同一受试者的健康生物样品。在一些实施方案中，对照为来自同一受试者的非癌性生物样品，例如来自与癌症或疑似癌症相同组织类型的非癌性生物样品。

在特定实施方案中，例如，为鉴定适于精氨酸剥夺疗法的受试者，生物样品中精氨基琥珀酸合成酶多肽的量或水平相对于对照(例如，非癌性组织、参考标准)减少统计显著量。仅仅举例说明，在一些方面中，生物样品中精氨基琥珀酸合成酶多肽的量或水平相对于对照减少约或至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％，包括其间所有整数和范围。在特定实施方案中，生物样品中精氨基琥珀酸合成酶多肽的量或水平不可检测或实质上不可检测。

样品中抗体和因此精氨基琥珀酸合成酶多肽的存在、不存在、量或水平可根据本领域中的任何种类的技术测量。例如，某些实施方案可使用标准方法和检测器。实例包括免疫组织化学(IHC)、蛋白质印迹法、免测沉淀法、酶联免疫吸附测定(ELISA)、狭线印迹法以及肽质量指纹鉴定。某些实施方案可使用细胞分选或细胞可视化或成像装置/技术，以检测或定量抗体的量或水平。实例包括流式细胞术(或FACS)、免疫荧光分析(IFA)和原位杂交技术，诸如荧光原位杂交(FISH)。

某些实施方案可使用常规生物学方法、软件和系统以达诊断目的。计算机软件产品或方法通常包括或使用具有用于执行方法的逻辑步骤的计算机可执行指令的计算机可读介质。适合的计算机可读介质包括软盘、CD-ROM/DVD/DVD-ROM、硬盘驱动器、快闪存储器、ROM/RAM、磁带等等。计算机可执行指令可以适合的计算机语言或若干种语言的组合来写入。基本的计算生物学方法描述于例如Setubal和Meidanis等,Introduction toComputational Biology Methods(PWS Publishing Company,Boston,1997)；Salzberg,Searles,Kasif,(编),Computational Methods in Molecular Biology,(Elsevier,Amsterdam,1998)；Rashidi和Buehler,Bioinformatics Basics:Application inBiological Science and Medicine(CRC Press,London,2000)，以及Ouelette和BzevanisBioinformatics:A Practical Guide for Analysis of Gene and Proteins(Wiley&Sons,Inc.,第2版,2001)中。还参见美国专利号6,420,108。

还包括利用精氨酸剥夺或耗尽疗法治疗受试者的方法。在一些实施方案中，精氨酸剥夺或耗尽疗法包括精氨酸耗尽剂的施用。精氨酸耗尽剂的非限制性实例包括精氨酸脱亚胺酶(ADI)多肽、精氨酸酶多肽、精氨酸脱羧酶多肽以及精氨酸激酶多肽。

在特定实施方案中，精氨酸耗尽剂为ADI多肽，例如重组ADI多肽。治疗ADI多肽的实例描述于例如WO 2013/151568；以及美国申请号US 14/214,040；US 13/214,398；US 10/645,723；US 10/757,843中；所述专利均以全文引用的方式并入。ADI多肽可从包括例如微生物、重组生物技术或其任何组合的任何来源获得、克隆或产生。例如，ADI基因和多肽可自以下属的微生物克隆并制备：支原体属(Mycoplasma)、梭菌属(Clostridium)、芽孢杆菌属(Bacillus)、疏螺旋体属(Borrelia)、肠球菌属(Enterococcus)、链球菌属(Streptococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus)以及梨形鞭毛虫属(Giardia)。在某些实施方案中，ADI多肽来自肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)、人型支原体(Mycoplasmahominis)、精氨酸支原体(Mycoplasma arginini)、产脓链球菌(Steptococcus pyogenes)、肺炎链球菌(Steptococcus pneumoniae)、伯氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)、阿氏疏螺旋体(Borrelia afzelii)、肠兰贾地鞭毛虫(Giardia intestinalis)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、清酒乳杆菌(Lactobacillus sake)或其任何组合。

在某些实施方案中，ADI多肽来自支原体属的微生物。在一些实施方案中，ADI来自人型支原体、关节炎支原体(Mycoplasma arthritides)、精氨酸支原体或其任何组合。在特定实施方案中，ADI多肽包含SEQ ID NO:6(来自人型支原体的ADI，参见以下表4)的氨基酸序列，或其具有ADI活性(例如，能够将精氨酸代谢成瓜氨酸和氨)的变体或片段。在某些实施方案中，ADI多肽被修饰(例如，通过取代、缺失修饰)以移除SEQ ID NO:6的位置112、374、405和/或408处的至少一个赖氨酸。

天然ADI可在微生物中找到，并且为抗原性的并自患者的循环快速清除。可通过修饰ADI来克服这些问题。因此，在某些实施方案中，ADI多肽包含(例如，共价连接至)改性剂，包括但不限于大分子聚合物、蛋白质、肽、多糖或其他化合物。ADI多肽和改性剂可通过共价键或非共价相互作用连接，以形成稳定缀合物或稳定组合物，从而达成所需效应。在某些实施方案中，修饰的ADI多肽保持ADI的生物活性，并且相对于未修饰ADI具有更长体内半衰期和更低抗原性。在一些实施方案中，ADI多肽经由连接基团共价键结至聚乙二醇。在特定实施方案中，ADI多肽为ADI-PEG 20。

在一些实施方案中，精氨酸耗尽剂为精氨酸酶I多肽，例如，重组精氨酸酶I多肽。在特定实施方案中，精氨酸酶I多肽包含人类精氨酸酶I蛋白质的至少50个邻接氨基酸(参见UniProt:P05089)。在特定实施方案中，精氨酸耗尽剂为精氨酸酶II多肽，例如，重组精氨酸酶II多肽。在特定实施方案中，重组人类精氨酸酶II多肽包含人类精氨酸酶II蛋白质的至少50个邻接氨基酸(参见UniProt:P78540)。在一些实施方案中，精氨酸耗尽剂为包含金属辅因子诸如钴原子或锰原子的精氨酸酶多肽。在某些实施方案中，含钴精氨酸酶多肽为如例如WO 2010/051533中所述的多肽。

在一些实施方案中，精氨酸耗尽剂为精氨酸脱羧酶多肽，例如重组精氨酸脱羧酶多肽。在一些实施方案中，精氨酸耗尽剂包含人类精氨酸脱羧酶的至少50个邻接氨基酸(参见UniProt:Q96A70)。

在特定实施方案中，精氨酸耗尽剂为聚乙二醇化多肽。

在一些情况下，本文中提供的方法可包括在精氨酸耗尽剂的施用之前、与所述施用并行或在所述施用之后向受试者施用一种或多种化学治疗剂或其他抗癌剂。在某些实施方案中，待利用精氨酸剥夺疗法治疗的受试者经历、已经历或将要经历手术、辐射疗法、免疫疗法和/或激素疗法。

组合物和试剂盒

还包括组合物，所述组合物包含本文所述的抗体或其抗原结合片段，其任选地与适合的载体组合。组合物或载体可为液体、半液体、半固体或固体。

溶液或悬浮液可包括例如无菌稀释剂(诸如水)、盐水溶液(例如，磷酸盐缓冲盐水(PBS)、生理盐水、林格氏溶液、等张氯化钠)、固定油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶剂；抗微生物剂(诸如苄醇和对羟基苯甲酸甲酯)；抗氧化剂(诸如抗坏血酸和亚硫酸氢钠)、螯合剂(诸如乙二胺四乙酸(EDTA))；和/或缓冲液(诸如，乙酸盐、柠檬酸盐、磷酸盐以及其他有机酸)，包括前述各项的组合。作为适合的载体，还包括含有增稠剂和增溶剂的溶液，所述增稠剂和助溶剂诸如葡萄糖、聚乙二醇、聚丙二醇以及其混合物。可添加表面活性剂以促进均质溶液或悬浮液的形成。表面活性剂为与抗体或其抗原结合片段非共价地相互作用以便促进缀合物于水性系统中的溶解或均质悬浮的化合物。

载体的另外实例包括低分子量(例如，小于约10个残基)多肽或肽；蛋白质，诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯啶酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、双糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；糖醇，诸如甘露糖醇或山梨糖醇；成盐抗衡离子，诸如钠；和/或非离子表面活性剂，诸如聚山梨醇酯20(TWEEN^TM)、聚乙二醇(PEG)和泊洛沙姆(PLURONICS^TM)和类似物。

在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段可包埋在例如通过凝聚技术或通过界面聚合作用制备的微胶囊(例如分别为羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)中、在胶态药物递送系统(例如，脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米粒子和纳米胶囊)中或在粗乳液中。这些技术公开于Remington's Pharmaceutical Sciences,第16版,Oslo,A.编(1980)中。粒子或脂质体还可包含其他诊断剂，诸如可检测实体。

在特定实施方案中，抗体或其抗原结合片段为冷冻-干燥的或冻干的、冷冻干燥的。这些术语是指冷冻抗体组合物并且随后减少周围压力以允许组合物中的冷冻水直接自固相升华至气相的脱水过程。还包括固体组合物，诸如粉末、颗粒、压缩片剂、丸剂、胶囊以及类似物。在一些实施方案中，固体组合物含有一种或多种稀释剂或可食用载体。在某些实施方案中，可存在以下一种或多种：粘合剂，诸如羧甲基纤维素、乙基纤维素、微晶纤维素、黄蓍胶或明胶；以及赋形剂，诸如淀粉、乳糖或糊精；崩解剂，诸如海藻酸、海藻酸钠、Primogel、玉米淀粉和类似物。

某些实施方案包括试剂盒，其包含如本文所述的一种或多种抗体或其抗原结合片段，其任选地处于一个或多个容器中。试剂盒可包括关于如何使用和/或制备抗体以例如用作检测剂和/或诊断剂的书面说明书。在一些实施方案中，书面说明书描述如何使用抗体或其抗原结合片段来鉴定适于例如利用精氨酸耗尽剂的精氨酸剥夺疗法的受试者。在一些实施方案中，试剂盒包含用于例如酶联免疫吸附测定(ELISA)或类似测定的材料，其中抗体或其抗原结合片段连接或可连接至固体底物以用于执行ELISA或类似测定。在一些实施方案中，试剂盒包含用于免疫组织化学(IHC)测定的材料。

本文中的试剂盒还可包括适合于或意图用于所治疗适应症或所需诊断应用的一种或多种另外的治疗剂或其他组分。另一种治疗剂可在需要时包含在第二容器中。另外的治疗剂的实例包括例如如本文所述的精氨酸耗尽剂，诸如精氨酸脱亚胺酶(ADI)多肽、精氨酸酶多肽、精氨酸脱羧酶多肽和精氨酸激酶多肽。在特定实施方案中，精氨酸耗尽剂为ADI-PEG 20。

以下实施例经由说明方式而非经由限制方式来提供。

实施例

实施例1

针对精氨基琥珀酸合成酶的杂交瘤抗体的测序和表征

执行实验来鉴定针对蛋白质精氨基琥珀酸合成酶的杂交瘤抗体克隆的V_H和V_L序列。执行酶联免疫吸附测定(ELISA)分析来测定作为小鼠IgG2A的杂交瘤亚型(参见图1)。随后自杂交瘤细胞中提取RNA，并且通过聚合酶链反应(PCR)扩增重链和轻链的可变区并且将其亚克隆至小鼠IgG1表达载体中。

为表征V_H序列，鉴定并比对六个有效亚克隆的氨基酸序列(参见图2A)。为表征V_L序列，鉴定并比对五个有效亚克隆的氨基酸序列(参见图2B)。基于这些克隆间的序列相似性，测定V_H和V_L核苷酸和氨基酸序列，如以下表E1所示。

在293F细胞中重组表达亚克隆V_H和V_L序列(于小鼠IgG1表达载体中)，将其分离，并且通过ELISA测试相对于原始杂交瘤而言与精氨基琥珀酸合成酶抗原的结合。如图3所示，来自以上表E1的V_H和V_L序列显示与精氨基琥珀酸合成酶抗原0218和0529的强的特异结合。

实施例2

通过免疫组织化学检测临床样品中的精氨基琥珀酸合成酶

执行实验来测定用于检测各种临床样品中精氨基琥珀酸合成酶的表达水平的免疫组织化学测定的准确度和精确度。针对精氨基琥珀酸合成酶的单克隆抗体(参见实施例1)与Leica Bond聚合物精制检测试剂盒一起组合使用，以检测在超过100种不同组织中的表达，所述组织包括正常组织和各种肿瘤组织，诸如肝肿瘤(例如，肝细胞癌)、淋巴瘤、肾细胞癌、横纹肌肉瘤、神经胚细胞瘤、精细胞瘤、黑素瘤、骨髓(AML)、结肠癌、肺癌、甲状腺癌、子宫癌、胃癌、脑癌以及乳腺癌。临床样品组由总计103种组织组成：60种阳性组织和43种阴性组织。

精氨基琥珀酸合成酶免疫反应性通常位于细胞质中，但也可观察到核染色。对染色的解释通过病理学家手动执行。报导具有阳性染色的肿瘤细胞的百分比和平均染色强度。

方法。将福马林固定、石蜡包埋试样以4-5μm切片并且安装在带正电载玻片上。使载玻片风干并且随后置放于60℃烘箱中持续60分钟。使用Leica Bond III仪器将载玻片染色。使用标准Leica Bond脱蜡方案自载玻片移除石蜡。利用Bond ER1对组织进行5分钟的抗原回收，或利用Bond ER2进行20分钟的抗原回收。

将小鼠抗精氨基琥珀酸合成酶单克隆抗体以0.625μg/mL的浓度涂覆于载玻片并且孵育15min，或以0.4μg/mL的浓度涂覆并孵育30分钟。使用Leica Bond聚合物精制检测试剂盒使后初次染色(staining-post primary)可视化8分钟，并且使聚合物可视化8分钟。随后利用Peroxide Block处理载玻片五分钟，继而通过Mixed DAB Refine处理十分钟。利用苏木精将染色区段复染色7分钟。随后将载玻片脱水并且加以滑动覆盖。

结果。总体而言，103种样品中的60种显示上皮细胞和内皮细胞的一致阳性细胞质染色，而各种肿瘤类型中的肿瘤细胞不显示精氨基琥珀酸合成酶的表达。肿瘤组织对比正常组织的染色图案在所有情况下均与文献中所报导相符。测定间再现性研究显示染色批次之间的100％一致性。将如文献中报导的阳性样品和阴性样品测试多次，并且它们与文献一致。在脱钙样品与非脱钙样品之间未观察到显著染色差异。

示例性结果展示于图4-图6中。

图4示出通过利用抗精氨基琥珀酸合成酶单克隆抗体的免疫组织化学染色检测在人类癌细胞系A431(图4A)和SKMEL-3(图4B)中的精氨基琥珀酸合成酶表达。

图5示出通过利用抗精氨基琥珀酸合成酶单克隆抗体的免疫组织化学染色检测在正常人类组织(图5A，肾；图5B，皮肤；图5C，肝)中的精氨基琥珀酸合成酶表达。

图6示出通过利用抗精氨基琥珀酸合成酶单克隆抗体的免疫组织化学染色检测在人类肝细胞癌(HCC)中的精氨基琥珀酸合成酶表达。图6A展示精氨基琥珀酸合成酶表达的强阳性染色，并且图6B-图6C展示精氨基琥珀酸合成酶表达的阴性染色。

这些研究指示：通过免疫组织化学(IHC)分析测得的抗精氨基琥珀酸合成酶单克隆抗体的效能特性对各种组织类型中的临床诊断应用而言为可接受的。

序列表

<110> TDW GROUP

HE, Wei

GUO, Yunyun

WU, Bor-Wen

<120> 精氨基琥珀酸合成酶的抗体和相关方法

<130> TDWG-005/01WO

<150> US 62/022,066

<151> 2014-07-08

<160> 23

<170> PatentIn版本3.5

<210> 1

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 通过比对六个有效亚克隆测定的VH链

<400> 1

Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu

1 5 10 15

Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Ser Ile His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Thr Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Thr Glu Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Ala Leu Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Leu Lys Asn Leu Arg Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys

85 90 95

Gly Ser Ser Tyr Ser Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser

100 105 110

Ser

<210> 2

<211> 339

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 通过比对六个有效亚克隆测定的VH链

<400> 2

cagatccagt tggtgcagtc tggacctgag ttgaagaagc ctggagagac agtcaagatc 60

tcctgcaaga cttctggtta taccttcaca gactattcaa tacactgggt gaagcaggct 120

ccaggaaagg gtttaacgtg gatgggctgg ataaacactg agactggtga gccaacttat 180

gcagatgact tcaagggacg ctttgccctc tctttggaaa cctctgccag cactgcctat 240

ttgcagctca agaacctcag aaatgaggac acggctacat atttctgtgg tagttcttat 300

tcttactggg gccaagggac tctggtcact gtctcttca 339

<210> 3

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 通过比对五个有效亚克隆测定的VL链

<400> 3

Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Glu Asn Ser

20 25 30

Asn Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Phe Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Leu Gln Val

85 90 95

Lys His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 4

<211> 336

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 通过比对五个有效亚克隆测定的VL链

<400> 4

gatgttgtga tgacccaaac tccactctcc ctgcctgtca gtcttggaga tcaagcctcc 60

atctcttgca ggtctagtca gagccttgaa aacagtaatg gaaagaccta tttgaactgg 120

ttcctccaga aaccaggcca gtctccacag ctcctgatct acagggtttc caaccgattt 180

tctggggtcc cagacaggtt cagtggcagt ggatcaggga ctgaattcac actgaaaatc 240

agcagagtgg aggctgagga tttgggagtt tatttctgcc tccaagttaa acatgtcccg 300

tggacgttcg gtggaggcac caagctggaa atcaaa 336

<210> 5

<211> 412

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 5

Met Ser Ser Lys Gly Ser Val Val Leu Ala Tyr Ser Gly Gly Leu Asp

1 5 10 15

Thr Ser Cys Ile Leu Val Trp Leu Lys Glu Gln Gly Tyr Asp Val Ile

20 25 30

Ala Tyr Leu Ala Asn Ile Gly Gln Lys Glu Asp Phe Glu Glu Ala Arg

35 40 45

Lys Lys Ala Leu Lys Leu Gly Ala Lys Lys Val Phe Ile Glu Asp Val

50 55 60

Ser Arg Glu Phe Val Glu Glu Phe Ile Trp Pro Ala Ile Gln Ser Ser

65 70 75 80

Ala Leu Tyr Glu Asp Arg Tyr Leu Leu Gly Thr Ser Leu Ala Arg Pro

85 90 95

Cys Ile Ala Arg Lys Gln Val Glu Ile Ala Gln Arg Glu Gly Ala Lys

100 105 110

Tyr Val Ser His Gly Ala Thr Gly Lys Gly Asn Asp Gln Val Arg Phe

115 120 125

Glu Leu Ser Cys Tyr Ser Leu Ala Pro Gln Ile Lys Val Ile Ala Pro

130 135 140

Trp Arg Met Pro Glu Phe Tyr Asn Arg Phe Lys Gly Arg Asn Asp Leu

145 150 155 160

Met Glu Tyr Ala Lys Gln His Gly Ile Pro Ile Pro Val Thr Pro Lys

165 170 175

Asn Pro Trp Ser Met Asp Glu Asn Leu Met His Ile Ser Tyr Glu Ala

180 185 190

Gly Ile Leu Glu Asn Pro Lys Asn Gln Ala Pro Pro Gly Leu Tyr Thr

195 200 205

Lys Thr Gln Asp Pro Ala Lys Ala Pro Asn Thr Pro Asp Ile Leu Glu

210 215 220

Ile Glu Phe Lys Lys Gly Val Pro Val Lys Val Thr Asn Val Lys Asp

225 230 235 240

Gly Thr Thr His Gln Thr Ser Leu Glu Leu Phe Met Tyr Leu Asn Glu

245 250 255

Val Ala Gly Lys His Gly Val Gly Arg Ile Asp Ile Val Glu Asn Arg

260 265 270

Phe Ile Gly Met Lys Ser Arg Gly Ile Tyr Glu Thr Pro Ala Gly Thr

275 280 285

Ile Leu Tyr His Ala His Leu Asp Ile Glu Ala Phe Thr Met Asp Arg

290 295 300

Glu Val Arg Lys Ile Lys Gln Gly Leu Gly Leu Lys Phe Ala Glu Leu

305 310 315 320

Val Tyr Thr Gly Phe Trp His Ser Pro Glu Cys Glu Phe Val Arg His

325 330 335

Cys Ile Ala Lys Ser Gln Glu Arg Val Glu Gly Lys Val Gln Val Ser

340 345 350

Val Leu Lys Gly Gln Val Tyr Ile Leu Gly Arg Glu Ser Pro Leu Ser

355 360 365

Leu Tyr Asn Glu Glu Leu Val Ser Met Asn Val Gln Gly Asp Tyr Glu

370 375 380

Pro Thr Asp Ala Thr Gly Phe Ile Asn Ile Asn Ser Leu Arg Leu Lys

385 390 395 400

Glu Tyr His Arg Leu Gln Ser Lys Val Thr Ala Lys

405 410

<210> 6

<211> 409

<212> PRT

<213> 人型支原体(Mycoplasma hominis)

<400> 6

Met Ser Val Phe Asp Ser Lys Phe Asn Gly Ile His Val Tyr Ser Glu

1 5 10 15

Ile Gly Glu Leu Glu Thr Val Leu Val His Glu Pro Gly Arg Glu Ile

20 25 30

Asp Tyr Ile Thr Pro Ala Arg Leu Asp Glu Leu Leu Phe Ser Ala Ile

35 40 45

Leu Glu Ser His Asp Ala Arg Lys Glu His Gln Ser Phe Val Lys Ile

50 55 60

Met Lys Asp Arg Gly Ile Asn Val Val Glu Leu Thr Asp Leu Val Ala

65 70 75 80

Glu Thr Tyr Asp Leu Ala Ser Lys Ala Ala Lys Glu Glu Phe Ile Glu

85 90 95

Thr Phe Leu Glu Glu Thr Val Pro Val Leu Thr Glu Ala Asn Lys Lys

100 105 110

Ala Val Arg Ala Phe Leu Leu Ser Lys Pro Thr His Glu Met Val Glu

115 120 125

Phe Met Met Ser Gly Ile Thr Lys Tyr Glu Leu Gly Val Glu Ser Glu

130 135 140

Asn Glu Leu Ile Val Asp Pro Met Pro Asn Leu Tyr Phe Thr Arg Asp

145 150 155 160

Pro Phe Ala Ser Val Gly Asn Gly Val Thr Ile His Phe Met Arg Tyr

165 170 175

Ile Val Arg Arg Arg Glu Thr Leu Phe Ala Arg Phe Val Phe Arg Asn

180 185 190

His Pro Lys Leu Val Lys Thr Pro Trp Tyr Tyr Asp Pro Ala Met Lys

195 200 205

Met Pro Ile Glu Gly Gly Asp Val Phe Ile Tyr Asn Asn Glu Thr Leu

210 215 220

Val Val Gly Val Ser Glu Arg Thr Asp Leu Asp Thr Ile Thr Leu Leu

225 230 235 240

Ala Lys Asn Ile Lys Ala Asn Lys Glu Val Glu Phe Lys Arg Ile Val

245 250 255

Ala Ile Asn Val Pro Lys Trp Thr Asn Leu Met His Leu Asp Thr Trp

260 265 270

Leu Thr Met Leu Asp Lys Asn Lys Phe Leu Tyr Ser Pro Ile Ala Asn

275 280 285

Asp Val Phe Lys Phe Trp Asp Tyr Asp Leu Val Asn Gly Gly Ala Glu

290 295 300

Pro Gln Pro Gln Leu Asn Gly Leu Pro Leu Asp Lys Leu Leu Ala Ser

305 310 315 320

Ile Ile Asn Lys Glu Pro Val Leu Ile Pro Ile Gly Gly Ala Gly Ala

325 330 335

Thr Glu Met Glu Ile Ala Arg Glu Thr Asn Phe Asp Gly Thr Asn Tyr

340 345 350

Leu Ala Ile Lys Pro Gly Leu Val Ile Gly Tyr Asp Arg Asn Glu Lys

355 360 365

Thr Asn Ala Ala Leu Lys Ala Ala Gly Ile Thr Val Leu Pro Phe His

370 375 380

Gly Asn Gln Leu Ser Leu Gly Met Gly Asn Ala Arg Cys Met Ser Met

385 390 395 400

Pro Leu Ser Arg Lys Asp Val Lys Trp

405

<210> 7

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 通过比对六个有效亚克隆测定的VH CDR1

<400> 7

Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Ser

1 5

<210> 8

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 通过比对六个有效亚克隆测定的VH CDR2

<400> 8

Ile Asn Thr Glu Thr Gly Glu Pro

1 5

<210> 9

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 通过比对六个有效亚克隆测定的VH CDR3

<400> 9

Gly Ser Ser Tyr Ser Tyr

1 5

<210> 10

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 通过比对五个有效亚克隆测定的VL CDR1

<400> 10

Gln Ser Leu Glu Asn Ser Asn Gly Lys Thr Tyr

1 5 10

<210> 11

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 通过比对五个有效亚克隆测定的VL CDR2

<400> 11

Arg Val Ser

1

<210> 12

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 通过比对五个有效亚克隆测定的VL CDR3

<400> 12

Leu Gln Val Lys His Val Pro Trp Thr

1 5

<210> 13

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 来自杂交瘤抗体克隆的有效亚克隆(6-H6)的VH序列

<400> 13

Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu

1 5 10 15

Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Ser Ile His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Thr Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Thr Glu Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Ala Leu Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Leu Lys Asn Leu Arg Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys

85 90 95

Gly Ser Ser Tyr Ser Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser

100 105 110

Ser

<210> 14

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 来自杂交瘤抗体克隆的有效亚克隆(6-C5)的VH序列

<400> 14

Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Ser Lys Lys Pro Gly Glu

1 5 10 15

Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Ser Ile His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Thr Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Thr Glu Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Ala Leu Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Leu Lys Asn Leu Arg Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys

85 90 95

Gly Ser Ser Tyr Ser Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser

100 105 110

Ser

<210> 15

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 来自杂交瘤抗体克隆的有效亚克隆(6-C1)的VH序列

<400> 15

Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu

1 5 10 15

Thr Val Lys Ile Pro Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Ser Ile His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Thr Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Thr Glu Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Ala Leu Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Leu Lys Asn Leu Arg Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys

85 90 95

Gly Ser Ser Tyr Ser Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser

100 105 110

Ser

<210> 16

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 来自杂交瘤抗体克隆的有效亚克隆(6-L7)的VH序列

<400> 16

Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Glu Pro Gly Glu

1 5 10 15

Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Ser Ile His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Thr Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Thr Glu Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Ala Leu Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Leu Lys Asn Leu Arg Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys

85 90 95

Gly Ser Ser Tyr Ser Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser

100 105 110

Ser

<210> 17

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 来自杂交瘤抗体克隆的有效亚克隆(6-A5)的VH序列

<400> 17

Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu

1 5 10 15

Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Ser Ile His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Thr Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Thr Glu Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Ala Leu Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Leu Lys Asn Leu Arg Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys

85 90 95

Gly Ser Ser Tyr Ser Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser

100 105 110

Ser

<210> 18

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 来自杂交瘤抗体克隆的有效亚克隆(6-D6)的VH序列

<400> 18

Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu

1 5 10 15

Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Ser Ile His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Thr Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Thr Glu Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Ala Leu Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Leu Lys Asn Leu Arg Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys

85 90 95

Gly Ser Ser Tyr Ser Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser

100 105 110

Ser

<210> 19

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 来自杂交瘤抗体克隆的有效亚克隆(4-5)的VL序列

<400> 19

Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Glu Asn Ser

20 25 30

Asn Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Phe Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Leu Gln Val

85 90 95

Lys His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 20

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 来自杂交瘤抗体克隆的有效亚克隆(7-2)的VL序列

<400> 20

Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Glu Asn Ser

20 25 30

Asn Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Phe Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Leu Gln Val

85 90 95

Lys His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 21

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 来自杂交瘤抗体克隆的有效亚克隆(7-8)的VL序列

<400> 21

Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Glu Asn Ser

20 25 30

Asn Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Phe Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Leu Gln Val

85 90 95

Lys His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 22

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 来自杂交瘤抗体克隆的有效亚克隆(7-12)的VL序列

<400> 22

Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Glu Asn Ser

20 25 30

Asn Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Phe Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Val Pro Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Leu Gln Val

85 90 95

Lys His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 23

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 来自杂交瘤抗体克隆的有效亚克隆(7-4)的VL序列

<400> 23

Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Gln Ala Ser Thr Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Glu Asn Ser

20 25 30

Asn Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Phe Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Leu Gln Val

85 90 95

Lys His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

Claims

1.一种分离的抗体或其抗原结合片段，其特异性结合至人类精氨基琥珀酸合成酶多肽并且(a)包含：重链可变区(V_H)序列，所述V_H序列包含分别于SEQ ID NO:7、8和9中列出的互补决定区V_HCDR1、V_HCDR2和V_HCDR3序列；以及轻链可变区(V_L)序列，所述V_L序列包含分别于SEQ ID NO:10、11和12中列出的互补决定区V_LCDR1、V_LCDR2和V_LCDR3序列，其中所述抗原结合片段选自单链抗体、Fab或Fab’片段、F(ab’)2片段、Fv片段、ScFv、缺乏铰链区的单价抗体以及微型抗体。

2.如权利要求1所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述V_H序列与SEQ ID NO:1至少90％一致。

3.如权利要求1或2所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述V_L序列与SEQ IDNO:3至少90％一致。

4.如权利要求1所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述V_H序列包含SEQ ID NO:1并且所述V_L序列包含SEQ ID NO:3。

5.如权利要求1所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体为小鼠单克隆抗体，所述小鼠单克隆抗体包含SEQ ID NO:1中列出的V_H序列和SEQ ID NO:3中列出的V_L序列。

6.如权利要求5所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体为亚型IgG1或IgG2A的小鼠单克隆抗体。

7.如权利要求1所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体为完整抗体。

8.如权利要求1所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体为单克隆抗体。

9.如权利要求1所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包含小鼠或人类IgG Fc结构域。

10.如权利要求9所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中IgG Fc结构域为IgG1或IgG2A Fc结构域。

11.如权利要求1所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体为亚型IgG1或IgG2A的小鼠单克隆抗体。

12.如权利要求1所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其包含共价连接的可检测实体。

13.如权利要求1所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其包括可检测实体，所述可检测实体选自荧光团/荧光染料、基于碘的标签、放射性同位素和纳米粒子。

14.一种组合物，其包含如前述权利要求中任一项所述的抗体和适合的载体。

15.如权利要求1-13中任一项所述的抗体或其抗原结合片段在制备用于测定生物样品中人类精氨基琥珀酸合成酶多肽的量的试剂盒中的用途，包括：(a)获得或接收来自受试者的生物样品；(b)使所述生物样品与所述抗体或其抗原结合片段接触；以及(c)测量所述样品中所述抗体或其抗原结合片段的量，其中所述抗体或其抗原结合片段的量决定所述样品中所述精氨基琥珀酸合成酶多肽的量。

16.如权利要求15所述的用途，其中所述受试者患有癌症。

17.如权利要求16所述的用途，其中所述癌症选自黑素瘤、肝肿瘤、胰腺癌、前列腺癌、间皮瘤、淋巴瘤、小细胞肺癌、肉瘤、头颈癌、白血病、乳腺癌、卵巢癌、结肠直肠癌、胃癌、神经胶质瘤、非小细胞肺癌(NSCLC)、肾癌、膀胱癌、子宫癌、食管癌、脑癌以及睪丸癌。

18.如权利要求16所述的用途，其中所述癌症选自肝细胞癌、子宫颈癌、多形性神经胶质母细胞瘤和急性骨髓白血病。

19.如权利要求16所述的用途，其中所述癌症为复发性急性骨髓白血病。

20.如权利要求1-13中任一项所述的抗体或其抗原结合片段在制备用于鉴定生物样品中精氨基琥珀酸合成酶的缺少的试剂盒中的用途，包括：(a)获得或接收来自受试者的生物样品；(b)使所述生物样品与所述抗体或其抗原结合片段接触；(c)测量所述样品中所述抗体或其抗原结合片段的量，其中所述抗体或其抗原结合片段的量决定所述样品中精氨基琥珀酸合成酶多肽的量；以及(d)如果所述生物样品中所述精氨基琥珀酸合成酶多肽的量相对于参考标准、来自健康受试者的生物样品或来自同一受试者的健康生物样品减少，则鉴定为所述样品中精氨基琥珀酸合成酶的缺少。

21.如权利要求1-13中任一项所述的抗体或其抗原结合片段在制备用于鉴定适于精氨酸剥夺疗法的受试者的试剂盒中的用途，所述用途包括：(a)获得或接收来自所述受试者的生物样品；(b)使所述生物样品与所述抗体或其抗原结合片段接触；(c)测量所述样品中所述抗体或其抗原结合片段的量，其中所述抗体或其抗原结合片段的量决定所述样品中精氨基琥珀酸合成酶多肽的量；以及(d)如果所述生物样品中所述精氨基琥珀酸合成酶多肽的量相对于参考标准、来自健康受试者的生物样品或来自同一受试者的健康生物样品减少，则将所述受试者鉴定为适用于精氨酸剥夺疗法。

22.如权利要求21所述的用途，其中所述获得或接收是从保健提供者获得或接收。

23.权利要求1-13中任一项所述的抗体或其抗原结合片段在制备用于诊断受试者的药物中的用途，所述受试者基于在所述受试者中检测到相对于对照减少量的精氨基琥珀酸合成酶而适于精氨酸剥夺疗法，包括：(a)分析测试的结果，所述测试指示来自所述受试者的生物样品中精氨基琥珀酸合成酶多肽的量，其中所述测试使用所述抗体或其抗原结合片段来执行；(b)如果来自(a)的所述结果指示所述生物样品中精氨基琥珀酸合成酶多肽的量相对于参考标准、来自健康受试者的生物样品或来自同一受试者的健康生物样品减少，则将所述受试者诊断为适用于精氨酸剥夺疗法；以及(c)通过施用至少一种精氨酸耗尽剂来治疗(b)的所述受试者。

24.权利要求1-13中任一项所述的抗体或其抗原结合片段在制备用于诊断人类受试者的癌症的药物中的用途，包括：(a)分析测试的结果，所述测试指示来自所述受试者的肿瘤活检中精氨基琥珀酸合成酶多肽的量，其中所述测试使用所述抗体或其抗原结合片段执行；(b)如果来自(a)的所述结果指示所述肿瘤活检中精氨基琥珀酸合成酶多肽的量相对于参考标准、来自健康受试者的生物样品或来自同一受试者的健康生物样品减少，则将所述受试者诊断为适于ADI-PEG 20疗法；以及(c)通过施用ADI-PEG 20来治疗(b)的所述受试者。

25.如权利要求24所述的用途，其中所述癌症选自黑素瘤和肝细胞癌。

26.一种试剂盒，其包含如前述权利要求中任一项所述的分离的抗体或组合物。

27.如权利要求26所述的试剂盒，其包含关于根据如权利要求15-27中任一项所述的用途使用所述抗体的说明书。

28.如权利要求26或27所述的试剂盒，其还包含用于免疫组织化学(IHC)测定的材料和/或说明书。

29.如权利要求26或27所述的试剂盒，其还包含用于酶联免疫吸附测定(ELISA)的材料和/或说明书。

30.如权利要求29所述的试剂盒，其中所述抗体连接至固体基底以用于执行ELISA。

31.如权利要求26所述的试剂盒，其包含关于使用所述抗体来鉴定适于精氨酸剥夺疗法的受试者的说明书。

32.如权利要求31所述的试剂盒，其中所述精氨酸剥夺疗法为精氨酸耗尽剂。

33.如权利要求32所述的试剂盒，其中所述精氨酸耗尽剂为ADI-PEG 20。

34.如权利要求26所述的试剂盒，其还包含至少一种精氨酸耗尽剂。

35.如权利要求34所述的试剂盒，其中所述精氨酸耗尽剂选自精氨酸脱亚胺酶(ADI)多肽、精氨酸酶多肽、精氨酸脱羧酶多肽以及精氨酸激酶多肽。

36.如权利要求35所述的试剂盒，其中所述ADI多肽为ADI-PEG20。