CN114867745A - Asic1通道拮抗剂抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种预防或治疗缺血性中风的组合物和方法。本发明还包括向患有或易患缺血性中风的受试者施用有效量的抗ASIC1a抗体，以达到治疗的效果。

Description

ASIC1通道拮抗剂抗体
技术领域
本发明整体上涉及预防或治疗与ASIC1a活性和/或信号传导相关的疾病的组合物和方法。更具体地，本发明提供向受试者施用有效量的抗ASIC1a抗体，以治疗患有或易患缺血性中风以及由ASIC1a活性和/或信号传导引起或与之相关的相关症状的受试者。
背景技术
提供以下描述以帮助读者理解。不承认所提供信息或所引用参考文献是现有技术。
酸敏感离子通道(ASIC)是由胞外质子门控的。ASIC是由胞外酸中毒激活的阳离子通道。已经鉴定出编码以下六个ASIC亚基的至少四个基因：ASIC1a、ASIC1b、ASIC2a、ASIC2b、ASIC3和ASIC4，其中“a”和“b”名称分别表示ASIC1和ASIC2基因的可变剪接变体ACCN2和ACCN1。对阿米洛利(amiloride)阻断敏感的功能性ASIC通道由以同聚体或异聚体形式组装的三个亚基构成。ASIC1a在脑中高度表达，并且与其它ASIC同种型形成功能同聚体或异聚体通道。由于激活阈值接近pH 7.0，ASIC1a用作脑中酸中毒的主要传感器，并且与正常和病理生理有关。
发明内容
一方面，本发明提供了用于治疗有需要的受试者的缺血性中风的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包括重链免疫球蛋白可变结构域(VH)和轻链免疫球蛋白可变结构域(VL)，其中所述VH包括：选自由以下序列组成的组中的VH-CDR1：SEQ ID NO:3、13、23、33、43和53；选自由以下序列组成的组中的VH-CDR2序列：SEQ ID NO:4、14、24、34、44和54；以及，选自由以下序列组成的组中的VH-CDR3：SEQ ID NO:5、15、25、35、45和55；并且所述VL包括：选自由以下序列组成的组中的VL-CDR1：SEQ ID NO:8、18、28、38、48和58；选自由以下序列组成的组中的VL-CDR2：SEQ ID NO:9、19、29、39、49和59；以及，选自由以序列下组成的组中的VL-CDR3：SEQ ID NO:10、20、30、40、50和60。
另外地或可替代地，在一些实施方案中，所述VH包括选自由SEQ ID NO:2、12、22、32、42和52组成的组中的氨基酸序列。另外地或可替代地，在一些实施方案中，所述VL包括选自由SEQ ID NO:7、17、27、37、47和57组成的组中的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包括的VH氨基酸序列和VL氨基酸序列分别为：SEQ ID NO:2和SEQ IDNO:7(ASC01)；SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:17(ASC02)；SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:27(ASC03)；SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:37(ASC04)；SEQ ID NO:42和SEQ ID NO:47(ASC05)；或SEQ ID NO:52和SEQ ID NO:57(ASC06)。另外地或可替代地，在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段是ASC06。
另外地或可替代地，在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段进一步包括Fc结构域，其为选自由IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgM、IgD和IgE组成的组中的同种型。另外地或可替代地，在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段选自由Fab、F(ab')2、Fab'、scFv和Fv组成的组。另外地或可替代地，在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段是单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体或双特异性抗体。
另外地或可替代地，在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包括的VH氨基酸序列和VL氨基酸序列分别为：SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:7(ASC01)；SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:17(ASC02)；SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:27(ASC03)；SEQ ID NO:32和SEQ IDNO:37(ASC04)；SEQ ID NO:42和SEQ ID NO:47(ASC05)；或，SEQ ID NO:52和SEQ ID NO:57(ASC06)。
另外地或可替代地，在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段与ASIC1a蛋白结合。另外地或可替代地，在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段与表达ASIC1a蛋白或其片段的细胞结合。另外地或可替代地，在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段与ASIC1a蛋白或全长ASIC1a蛋白的胞外结构域结合。另外地或可替代地，在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段与跨越两个ASIC1a亚基的表位结合。另外地或可替代地，在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段抑制质子诱导的ASIC1a电流。
一方面，本发明技术提供了减轻有需要的受试者的缺血性中风的一种或多种症状的方法，所述方法包括：向所述受试者施用治疗有效量的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包括重链免疫球蛋白可变结构域(VH)和轻链免疫球蛋白可变结构域(VL)，其中所述VH包括：选自由以下序列组成的组中的VH-CDR1：SEQ ID NO:3、13、23、33、43和53；选自由以下序列组成的组中的VH-CDR2：SEQ ID NO:4、14、24、34、44和54；以及，选自由以下序列组成的组中的VH-CDR3：SEQ ID NO:5、15、25、35、45和55；并且所述VL包括：选自由以下序列组成的组中的VL-CDR1序列：SEQ ID NO:8、18、28、38、48和58；选自由以下序列组成的组中的VL-CDR2：SEQ ID NO:9、19、29、39、49和59；以及选自由以下序列组成的组中的VL-CDR3：SEQ ID NO:10、20、30、40、50和60。
另外地或可替代地，在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段进一步包括Fc结构域，其为选自由IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgM、IgD和IgE组成的组中的同种型。另外地或可替代地，在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段选自由Fab、F(ab')2、Fab'、scFv和Fv组成的组。另外地或可替代地，在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段是单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体或双特异性抗体。
另外地或可替代地，在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段与ASIC1a蛋白结合。另外地或可替代地，在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段与ASIC1a蛋白或全长ASIC1a蛋白的胞外结构域结合。另外地或可替代地，在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段与跨越两个ASIC1a亚基的表位结合。另外地或可替代地，在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段抑制ASIC1a。另外地或可替代地，在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段抑制ASIC1a电流。另外地或可替代地，在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段抑制质子诱导的ASIC1a电流。
另外地或可替代地，在一些实施方案中，所述缺血性中风的一种或多种症状是：面部、手臂或腿部突然虚弱无力、麻痹或麻木；面部一侧下垂；思维混乱；说话困难；理解言语困难；一只或两只眼睛视力困难；视力模糊；视力变暗；复视；呼吸困难；眩晕；行走困难；失去平衡；失去协调；不明原因的跌倒；意识丧失；突然头痛；或剧烈头痛。另外地或可替代地，在一些实施方案中，所述缺血性中风的一种或多种症状是突然发作的面部虚弱无力、面部一侧下垂、手臂垂落或异常言语。
一方面，本发明提供了一种用于治疗有需要的受试者的缺血性中风的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包括：(a)轻链免疫球蛋白可变结构域序列(VL)，所述VL与SEQ ID NO:7、17、27、37、47或57中的任一个所示的轻链免疫球蛋白可变结构域序列有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％同一性；和/或(b)重链免疫球蛋白可变结构域序列(VH)，所述VH与SEQ IDNO:2、12、22、32、42或52中的任一个所示的重链免疫球蛋白可变结构域序列有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％同一性。
一方面，本发明提供了一种抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包括重链免疫球蛋白可变结构域(VH)和轻链免疫球蛋白可变结构域(VL)，其中所述VH包括：选自由以下序列组成的组中的VH-CDR1：SEQ ID NO:3、13、23、33和43；选自由以下序列组成的组中的VH-CDR2：SEQ ID NO:4、14、24、34和44；以及选自由以下序列组成的组中的VH-CDR3：SEQ ID NO:5、15、25、35和45；并且所述VL包括：选自由以下序列组成的组中的VL-CDR1：SEQ ID NO:8、18、28、38和48；选自由以下序列组成的组中的VL-CDR2：SEQ ID NO:9、19、29、39和49；以及选自由以下序列组成的组中的VL-CDR3：SEQ ID NO:10、20、30、40和50。另外地或可替代地，在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段进一步包括Fc结构域，其为选自由IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgM、IgD和IgE组成的组中的同种型。另外地或可替代地，在一些实施方案中，所述抗原结合片段选自由Fab、F(ab')2、Fab'、scFv和Fv组成的组。另外地或可替代地，在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段是单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体或双特异性抗体。另外地或可替代地，在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段与ASIC1a蛋白结合。另外地或可替代地，在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段与ASIC1a蛋白或全长ASIC1a蛋白的胞外结构域结合。另外地或可替代地，在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段与跨越两个ASIC1a亚基的表位结合。另外地或可替代地，在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段抑制ASIC1a电流。另外地或可替代地，在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段抑制质子诱导的ASIC1a电流。
一方面，本发明提供了一种组合物，所述组合物包括本文所公开的任何实施方案的抗体。另外地或可替代地，在一些实施方案中，其核酸序列选自由以下序列组成的组：SEQID NO:1、6、11、16、21、26、31、36、41、46、51和56。
一方面，本发明提供了一种表达本文所公开的任何核酸的宿主细胞或载体。
一方面，本发明提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括本文所公开的任何实施方案的抗体或其抗原结合片段以及其使用说明书。另外地或可替代地，在一些实施方案中，本文所公开的任何实施方案的抗体或其抗原结合片段与至少一种选自由放射性标记、荧光标记和显色标记组成的组中的可检测标记偶联。另外地或可替代地，在一些实施方案中，所述试剂盒进一步包括第二抗体，所述第二抗体与所述抗体或其抗原结合片段特异性地结合。
一方面，本发明提供了一种用于检测生物样品中的ASIC1a蛋白的方法，所述方法包括：使所述生物样品与本文所公开的任何实施方案的抗体或其抗原结合片段接触，其中所述抗体或其抗原结合片段与可检测标记缀合；以及检测所述生物样品中的所述可检测标记的存在和其水平。
附图简要说明
图1示出了经纯化的scFv抗体ASC01-ASC06与含有截短的hASIC1a(氨基酸13-464；下文称为“ΔhASIC1a”)的纳米盘的结合，通过ELISA测量。空纳米盘用作阴性对照。
图2示出了展示六种scFv抗体与在表面表达hASIC1a的细胞的相互作用的共聚焦显微镜图像。用编码hASIC1a-eYFP(绿色)的质粒瞬时转染CHO-K1细胞并用ASC01-ASC06(红色)对其进行染色，通过DAPI(蓝色)标记细胞核，比例尺＝10μm。
图3A示出了用ASC06 scFv和ASC06-IgG1抗体染色的CHO-K1/hASIC1a细胞。用编码hASIC1a-eYFP(绿色)的质粒瞬时转染CHO-K1细胞并用ASC06 scFv和ASC06-IgG1抗体(红色)对其进行染色，通过DAPI(蓝色)标记细胞核，比例尺＝10μm。
图3B示出了ASC06-IgG1对ΔhASIC1a的结合亲和力，使用Biacore SPR(表面等离子体共振)系统通过单循环动力学(SCK)模型测定。线形图描绘了共振单位(RU，其反映表面的分析物结合能力的变化)随时间的函数。ASC06-IgG1对ΔhASIC1a的结合亲和力测定为7.9nM。
图4A示出了ASC06-IgG1的物种特异性的共聚焦显微镜图像。用hASIC1a-eYFP、mASIC1a-eYFP或rASIC1a-eYFP(绿色)质粒瞬时转染CHO-K1细胞并用ASC06-IgG1(红色)对其进行染色。DAPI(蓝色)用于对细胞核进行染色。比例尺＝10μm。
图4B示出了ASC06-IgG1的物种特异性和ASIC1亚型特异性，通过FACS分选测定。用hASIC1a-eYFP、mASIC1a-eYFP、rASIC1a-eYFP、hASIC1b-eYFP、hASIC2a-eYFP、hASIC2a/2b-eYFP和hASIC3a-eYFP质粒瞬时转染CHO-K1细胞并用Alexa555缀合的ASC06-IgG1对其进行染色。对10,000个细胞进行分选。在FACS图谱的右上象限中显示的Alexa555-和eYFP-双阳性细胞表明ASC06-IgG1与给定的ASIC1亚型或同源物结合。
图5A示出了在不存在或存在不同剂量的ASC06-IgG1(100nM，300nM)的情况下，单个hASIC1a稳定CHO-K1细胞的代表性电流迹线。电流迹线上方的灰线示出了胞外pH值从pH7.4降至pH 6.0的时间，并进行了记录。电流迹线上方的黑线表示使用指定的药剂进行处理。用pH 6处理的细胞作为阴性对照，并且毒液肽Psalmotoxin-1(PcTx1)用作阳性对照。“洗涤”表示在300nM ASC06-IgG1的处理，随后输注洗涤溶液15分钟之后电流恢复。
图5B示出了ASC06-IgG1对酸诱导的hASIC1a电流的剂量依赖性抑制。测量的表观IC50值为85±6nM(N＝3-5)。数据示出为五次重复的平均值±标准偏差。
图5C示出了在用ASC06-IgG1或PcTx1处理后的冲刷时间期间的hASIC1a电流的冲刷实验。线形图示出了相对电流随冲刷时间(分钟)的函数(N＝4)。
图6A示出了ASC06-IgG1对酸诱导的ASIC1a介导的钙流入的抑制。示出了在存在各种浓度的ASC06-IgG1(30到0.12nM，以1:3连续稀释)的情况下，稳定过表达hASIC1a-mCherry(4C12)的CHO-K1细胞中酸诱导的钙流入的代表性进展曲线。
图6B示出了ASC06-IgG1对酸诱导的钙流入的剂量依赖性抑制(N＝6)。
图7A示出了pH(pH＝5.5、6.0和7.4)对具有和不具有膜表达的hASIC1a-eYFP的CHO-K1细胞的活力的影响，通过细胞质脱氢酶活性测量(N＝5-6)。
图7B示出了pH(pH＝5.5、6.0和7.4)对具有和不具有膜表达的hASIC1a-eYFP的CHO-K1细胞的影响。条形图示出了释放的LDH含量(N＝5-6)。
图7C示出了ASC06-IgG1对酸中毒诱导的细胞死亡的剂量依赖性保护，通过在浓度增加的ASC06-IgG1的情况下，对hASIC1a-eYFP稳定细胞的活力测量。数据示出为四次重复的平均值±标准偏差(N＝3-5)。
图7D示出了ASC06-IgG1对酸中毒诱导的细胞死亡的剂量依赖性保护，通过在浓度增加的ASC06-IgG1的情况下，对hASIC1a-eYFP稳定细胞的LDH释放测量。数据示出为三次到五次重复的平均值±标准偏差(N＝3-5)。
图8A示出了小鼠大脑中动脉闭塞(MCAO)诱导的缺血性中风模型体内研究的实验设计的示意图。
图8B(上图)示出了脑切片的图像，其展示了在MCAO诱导的缺血性中风模型小鼠中，用PBS(假手术对照，N＝6)、同种型对照(N＝6)、ASC06-IgG1(N＝6)和PcTx1(N＝6)处理后，通过用活性染料2,3,5-三苯基四唑盐酸盐(TTC)染色检测到的梗死区域。图8B(下图)示出了条形图，展示了来自如在图8B(上图)中处理的小鼠的脑中梗死区域的面积。与假手术对照组相比，*表示p值<0.05，**表示p值<0.01。NS＝不显著。
图9A-9C示出了hASIC1a(hASIC1a-ECD)胞外结构域复合物与ASC06-Fab复合物的负染色电子显微镜图像。图9A示出了未经处理的图像的子区域。比例尺＝50nm。图9B示出了选自图9A的代表性单颗粒。比例尺＝10nm。图9C示出了基于单颗粒(N＝5,064)的对应代表性等级平均值。比例尺＝10nm。
图9D示出了ASC06-IgG1的构象表位，通过分子动力学模拟检测到。第一亚基显示在图像的左侧，并且第二亚基显示在右侧。第一亚基包含β折叠的部分，其位于图像底部，第二亚基的后面。用点示出(第一亚基中的深灰色点，第二亚基中的浅灰色点)的ASC06-IgG1的结合位点由两个ASIC1a亚基形成。
图9E示出了在与ASC06-IgG1结合中起作用的hASIC1a蛋白中氨基酸残基的鉴定。使用基于FACS的方法测定用指定的丙氨酸取代突变体hASIC1a-eYFP蛋白瞬时转染的CHO-K1细胞与ASC06-IgG1的结合。上图示出了其中不包含第一抗体、仅包含第二抗体的阴性对照(NC)。下图示出了ASC06-IgG1与细胞共同孵育的实验。示出了表达野生型hASIC1a蛋白的细胞的阳性对照。也在图左侧示出了另一个阴性对照，其中CHO-K1细胞不表达hASIC1a。
图10A示出了ASC06-IgG1与6H7细胞系的剂量依赖性结合，所述6H7细胞系是表达hASIC1a-eYFP融合蛋白的稳定品系。数据示出了表观结合亲和力为2.06±0.01nM(n＝3)。
图10B(上图)示出了来自用hASIC1a-mCherry(红色)稀疏转染的mASIC1aKO小鼠的皮质的ASC06-IgG1染色的原代神经元(绿色)的共聚焦显微镜图像。微分干涉对比(DIC)视图示出了与神经元的荧光视图合并的明场图像。图10B(下图)示出了神经突的放大区域，表明ASC06-IgG1结合发生在突触后树突中。
图11A示出了ASC06-IgG1对hASIC1a稳态脱敏(SSD)曲线的影响(n＝6-8)。
图11B示出了ASC06-IgG1对hASIC1a质子激活曲线的影响(n＝5)。
图12A示出了ΔhASIC1a纳米盘的组成的SDS-PAGE分析。右侧展示的ΔhASIC1a纳米盘使用计算建模，其中顶部的蓝色、黄色和紫色条带代表假定的ΔhASIC1a三聚体构型，盘侧的红色条带代表MSP1，并且白色球簇代表1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DMPC)。空纳米盘是指使用乙酰胆碱而不是ΔhASIC1a的纳米盘组装。
图12B示出了动态光散射(DLS)测量的结果，展示了纳米盘组装的尺寸。插入的图像示出了标有经计算的直径的建模颗粒。
图12C示出了“差异富集”淘选中阳性噬菌粒的输出。
图12D示出了经纯化的单链(ASC06)和全长(ASC06-IgG1)抗体的SDS-PAGE分析。
图13A示出了使用商业山羊多克隆抗ASIC1a抗体或ASC06-IgG1对来自CHO-K1细胞(“-”)或表达hASIC1a-eYFP的CHO-K1稳定细胞系(“+”)的细胞裂解物进行的蛋白质印迹分析。
图13B示出了用ASC06-IgG1免疫沉淀并通过商业抗eYFP抗体分析的CHO-K1细胞(“-”)或表达hASIC1a-eYFP的CHO-K1稳定细胞系(“+”)的细胞裂解物的蛋白质印迹。
图14示出了由hASIC1a-ECD和ASC06-Fab组装的复合物的凝胶过滤曲线。示出了单独的hASIC1a-ECD、单独的ASC06-Fab以及复合物的凝胶过滤曲线。使用Superdex 200尺寸排除色谱柱(24mL体积)。
图15示出了PcTx1-Fc的SPR传感图。基于单循环动力学方法，PcTx1-Fc对ΔhASIC1a的结合亲和力被测定为1.0nM。
图16展示了ASC06-IgG1既不干扰SSD也不干扰ASIC1a的激活。图16A示出了由pH6.0刺激在各种调节pH值下诱发的ASIC1a电流的代表性迹线。上图中的迹线示出了在不存在ASC06-IgG1的情况下的电流，并且下图中的迹线示出了在存在300nM ASC06-IgG1的情况下的电流。图16B示出了在调节pH为7.4的情况下，由范围为6.8到6.0的pH引发的代表性电流迹线。上图，不含ASC06-IgG1；下图，含有ASC06-IgG1(300nM)。未示出pH 7.2和pH 7.0激活的迹线，因为在这些条件下没有诱发电流。
图17A示出了在CHO-K1细胞或过表达hASIC1a-mCherry的稳定CHO-K1细胞(4C12)中的酸诱导后细胞质中钙流入的最大荧光强度。在指定的情况下，将4C12细胞与阿米洛利、PcTx1、ASC06-lgG1或同种型对照抗体一起预孵育。
图17B在存在阿米洛利、PcTx1、ASC06-lgG1或同种型对照抗体的情况下，4C12中酸诱导的钙流入的代表性进展曲线。将不相关的抗体作为同种型对照。
图18示出了ASC06-IgG1的尺寸排除色谱法-高效液相色谱法(SEC-HPLC)分析。将ASC06-IgG1(0.5mg/mL)与不同pH的胞外液在37℃下一起孵育持续6小时，随后进行SEC-HPLC分析。
图19A示出了ASC01的VH结构域的核苷酸序列(SEQ ID NO:1)。
图19B示出了ASC01的VH结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)。VHCDR1(SEQ ID NO:3)、VHCDR2(SEQ ID NO:4)和VHCDR3(SEQ ID NO:5)用带下划线的粗体字体表示。
图20A示出了ASC01的VL结构域的核苷酸序列(SEQ ID NO:6)。
图20B示出了ASC01的VL结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:7)。VLCDR1(SEQ ID NO:8)、VLCDR2(SEQ ID NO:9)和VLCDR3(SEQ ID NO:10)用带下划线的粗体字体表示。
图21A示出了ASC02的VH结构域的核苷酸序列(SEQ ID NO:11)。
图21B示出了ASC02的VH结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:12)。VHCDR1(SEQ ID NO:13)、VHCDR2(SEQ ID NO:14)和VHCDR3(SEQ ID NO:15)用带下划线的粗体字体表示。
图22A示出了ASC02的VL结构域的核苷酸序列(SEQ ID NO:16)。
图22B示出了ASC02的VL结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:17)。VLCDR1(SEQ ID NO:18)、VLCDR2(SEQ ID NO:19)和VLCDR3(SEQ ID NO:20)用带下划线的粗体字体表示。
图23A示出了ASC03的VH结构域的核苷酸序列(SEQ ID NO:21)。
图23B示出了ASC03的VH结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:22)。VHCDR1(SEQ ID NO:23)、VHCDR2(SEQ ID NO:24)和VHCDR3(SEQ ID NO:25)用带下划线的粗体字体表示。
图24A示出了ASC03的VL结构域的核苷酸序列(SEQ ID NO:26)。
图24B示出了ASC03的VL结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:27)。VLCDR1(SEQ ID NO:28)、VLCDR2(SEQ ID NO:29)和VLCDR3(SEQ ID NO:30)用带下划线的粗体字体表示。
图25A示出了ASC04的VH结构域的核苷酸序列(SEQ ID NO:31)。
图25B示出了ASC04的VH结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:32)。VHCDR1(SEQ ID NO:33)、VHCDR2(SEQ ID NO:34)和VHCDR3(SEQ ID NO:35)用带下划线的粗体字体表示。
图26A示出了ASC04的VL结构域的核苷酸序列(SEQ ID NO:36)。
图26B示出了ASC04的VL结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:37)。VLCDR1(SEQ ID NO:38)、VLCDR2(SEQ ID NO:39)和VLCDR3(SEQ ID NO:40)用带下划线的粗体字体表示。
图27A示出了ASC05的VH结构域的核苷酸序列(SEQ ID NO:41)。
图27B示出了ASC05的VH结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:42)。VHCDR1(SEQ ID NO:43)、VHCDR2(SEQ ID NO:44)和VHCDR3(SEQ ID NO:45)用带下划线的粗体字体表示。
图28A示出了ASC05的VL结构域的核苷酸序列(SEQ ID NO:46)。
图28B示出了ASC05的VL结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:47)。VLCDR1(SEQ ID NO:48)、VLCDR2(SEQ ID NO:49)和VLCDR3(SEQ ID NO:50)用带下划线的粗体字体表示。
图29A示出了ASC06的VH结构域的核苷酸序列(SEQ ID NO:51)。
图29B示出了ASC06的VH结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:52)。VHCDR1(SEQ ID NO:53)、VHCDR2(SEQ ID NO:54)和VHCDR3(SEQ ID NO:55)用带下划线的粗体字体表示。
图30A示出了ASC06的VL结构域的核苷酸序列(SEQ ID NO:56)。
图30B示出了ASC06的VL结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:57)。VLCDR1(SEQ ID NO:58)、VLCDR2(SEQ ID NO:59)和VLCDR3(SEQ ID NO:60)用带下划线的粗体字体表示。
具体实施方式
应了解，本发明的某些方面、方式、实施方案、变体和特征在以下以不同的详细成都进行了描述，以便提供对本发明实质上的理解。本发明提供了治疗缺血性中风和/或相关病症的方法。
虽然靶向本文所描述的ASIC1a蛋白的所例示抗体是scFv和IgG1抗体，但是此说明书旨在广泛地涵盖任何免疫结合剂，如IgG、IgM、IgA、IgD、IgE和经基因修饰的IgG及其片段，以及包括保留本文所述抗原结合活性的抗体的互补决定区(CDR)结构域的多肽。
定义
下文提供本发明中使用的某些术语的定义。除非另外定义，否则本文所使用的所有技术术语和科学术语通常具有与本发明技术所属领域的普通技术人员通常所理解的含义相同的含义。
如在本说明书和所附权利要求书所使用的，单数形式“一个(a)”、“一种(an)”和“所述(the)”包含其复数形式，除非上下文另外明确指明。例如，提及“细胞”包含两种或更多种细胞的组合等等。通常，本文所使用的命名法以及下文所描述的细胞培养、分子遗传学、有机化学、分析化学以及核酸化学与杂交中的实验步骤是本领域中众所周知并且通常采用的步骤。
如本文所使用的，提及数字的术语“约”是指通常包含在所述数字的任一方向上(大于或小于)的在1％、5％或10％范围内的数字，除非另有说明或以其它方式从上下文中显而易见(除非此类数字小于可能值的0％或超过可能值的100％)。
如本文中所使用的，向受试者“施用”药剂、药物或肽，包含向受试者引入或递送化合物以发挥其预期功能的任何途径。可以通过任何合适的途径进行施用，这些途径包含口服、鼻内施用、肠胃外施用(静脉内施用、肌内施用、腹膜内施用或皮下施用)或局部施用。在一些实施方案中，本发明技术的抗ASIC1a抗体通过颅内(脑室内)途径、鞘内途径或动脉内途径施用。施用包含自我施用和由他人施用。
如本文所使用的，术语“氨基酸”用于指含有至少一个氨基和至少一个羧基的任何有机分子。通常，至少一个氨基位于相对于羧基的α位点。术语“氨基酸”包含天然存在的氨基酸和合成氨基酸，以及以与天然存在的氨基酸类似的方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是由遗传密码编码的氨基酸以及稍后被修饰的氨基酸，例如，羟基脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸。氨基酸类似物是指具有与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构的化合物，即，与氢、羧基、氨基和R基团结合的α-碳，例如，高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍。此类类似物具有经修饰的R基(例如，正亮氨酸)或经修饰的肽骨架，但是保留了与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。氨基酸模拟物是指具有与氨基酸的通式化学结构不同的结构，但是以与天然存在的氨基酸类似的方式起作用的化学化合物。氨基酸在本文中可以通过其通常已知的三字母符号或通过IUPAC-IUB生物化学命名法委员会(the IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission)推荐的单字母符号表示。
如本文所使用的，术语“抗体”统称为免疫球蛋白或免疫球蛋白样分子，包含例如且不限于IgA、IgD、IgE、IgG和IgM、其组合以及在任何脊椎动物中，例如在人、山羊、兔子和小鼠等哺乳动物以及非哺乳动物物种中的免疫应答期间产生的类似分子，如鲨鱼免疫球蛋白。如本文所使用的，“抗体”(包含完整的免疫球蛋白)和“抗原结合片段”与目标分子(或一组与目标分子高度类似的分子)特异性地结合，以基本上排除与其它分子的结合(例如，对目标分子的结合亲和力比对生物样品中的其它分子的结合亲和力大至少103M-1、大至少104M-1或大至少105M-1的抗体和抗体片段)。术语“抗体”还包含如嵌合抗体(例如，人源化鼠抗体)、异源缀合抗体(如双特异性抗体)等经基因工程化的形式。还参见《皮尔斯目录与手册(Pierce Catalog and Handbook)》,1994-1995(伊利诺伊州罗克福德市皮尔斯化学公司(Pierce Chemical Co.,Rockford,Ill.))；Kuby,《免疫学期刊(J.,Immunology)》,第3版,纽约W.H.弗里曼公司(W.H.Freeman&Co.,New York),1997。
更具体地，抗体是指包括至少一个轻链免疫球蛋白可变区或重链免疫球蛋白可变区的多肽配体，所述可变区特异性识别并结合抗原的表位。抗体由重链和轻链构成，所述重链和所述轻链中的每个具有可变区，所述可变区被称为重链可变(VH)区和轻链可变(VL)区。VH区和VL区一起负责结合由抗体识别的抗原。通常，免疫球蛋白具有由二硫键互连的重(H)链和轻(L)链。有两种类型的轻链，λ(lambda)和κ(kappa)。有五种决定抗体分子的功能活性的主要的重链类别(或同种型)：IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。每条重链和轻链含有恒定区和可变区(所述区也被称为“结构域”)。总而言之，重链和轻链可变区特异性地结合抗原。轻链可变区和重链可变区含有被三个“互补决定区”或“CDR”高变区中断的“框架”区。已经定义构架区和CDR的范围(参见Kabat等人,《免疫学关注的蛋白的序列(Sequences of Proteinsof Immunological Interest)》,美国卫生和人类服务部(U.S.Department of Health andHuman Services),1991，所述文献通过引用并入本文)。Kabat数据库现在在线维持。不同轻链或重链的构架区的序列在物种内相对保守。抗体的构架区，即组成轻链和重链的组合构架区，主要采用β-折叠构象，并且CDR形成连接β折叠结构并且在一些情况下形成β-折叠结构的一部分的环。因此，框架区用于形成支架，所述支架通过链间非共价相互作用将CDR定位在正确的朝向上。
CDR主要负责与抗原的表位结合。每条链的CDR通常从N端开始顺序地编号为CDR1、CDR2和CDR3，并且通常还通过特定CDR所在的链来定义。因此，VHCDR3位于发现其的抗体的重链的可变结构域中，而VLCDR1是来自发现其的抗体的轻链的可变结构域的CDR1。结合ASIC1a蛋白的抗体将具有特定的VH区和VL区序列，并且从而具有特定的CDR序列。具有不同特异性的抗体(即针对不同抗原具有不同组合位点)具有不同的CDR。尽管不同抗体的CDR有所不同，但是CDR内仅有限数量位点的氨基酸直接参与抗原结合。CDR内的这些位点被称为特异性决定残基(SDR)。如本文所使用的，“本发明的抗ASIC1a抗体”是指抗体(包含单克隆抗体、多克隆抗体、人源化抗体、嵌合抗体、重组抗体、多特异性抗体、双特异性抗体等)以及抗体片段。抗体或其抗原结合片段与抗原特异性结合。
如本文所使用的，术语“抗体相关多肽”是指包含单链抗体在内的抗原结合抗体片段，所述抗原结合抗体片段可以包括单独的或与以下多肽元件的全部或部分组合的可变区：抗体分子的铰链区、CH1、CH2和CH3结构域。本发明中还包含可变区和铰链区、CH1、CH2和CH3结构域的任何组合。可用于本发明方法的抗体相关分子，例如但不限于Fab、Fab'和F(ab')2、Fd、单链Fv(scFv)、单链抗体、二硫键连接的Fv(sdFv)和包括VL或VH结构域的片段。实例包含：(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab')2片段，包括在铰链区处由二硫桥连接的两个Fab片段的双价片段；(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体的单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；(v)由VH结构域组成的dAb片段(Ward等人,《自然(Nature)》341:544-546,1989)；以及(vi)分离的互补决定区(CDR)。因此，“抗体片段”或“抗原结合片段”可以包括全长抗体的一部分，通常是其抗原结合区或可变区。抗体片段或抗原结合片段的实例包含：Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段；双功能抗体；双特异性抗体；线性抗体；单链抗体分子；以及由抗体片段形成的多特异性抗体。
如本文所使用的，术语“缀合”是指通过本领域技术人员已知的任何方法将两个分子缔合。合适的缔合类型包含化学键和物理键。化学键包含例如共价键和配位键。物理键包含例如氢键、偶极相互作用、范德华力、静电相互作用、疏水相互作用以及芳香族堆积。
如本文所使用的，术语“双功能抗体”是指具有两个抗原结合位点的小抗体片段，所述片段包括在同一条多肽链(VHVL)中相连接的轻链可变结构域(VL)和重链可变结构域(VH)。使用太短的连接子以至于同一条链上的两个结构域之间不能相互配对，结构域被迫与另一条链的互补结构域配对并且产生两个抗原结合位点。双功能抗体更全面地描述于例如以下中：EP 404,097；WO 93/11161；以及Hollinger等人,《美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》,90:6444-6448(1993)。
如本文所使用的，术语“单链抗体”或“单链Fv(scFv)”是指Fv片段的两个结构域VL和VH的抗体融合分子。单链抗体分子可以包括具有许多单个分子的聚合物，例如，二聚体、三聚体或其它聚合物。此外，虽然Fv片段的两个结构域VL和VH由单独的基因编码，但是这两个结构域可以使用重组方法，通过使这两个结构域能够成为单个蛋白链的合成连接子来连接，在所述单个蛋白链中，VL区和VH区配对以形成单价分子(被称为单链Fv(scFv))。Bird等人,(1988),《科学(Science)》242:423-426和Huston等人,(1988),《美国国家科学院院刊》85:5879-5883)。此类单链抗体可以通过重组技术或完整抗体的酶促或化学裂解来制备。
如本文所使用的，“抗原”是指抗体(或其抗原结合片段)可以选择性结合的分子。靶抗原可以是蛋白质、碳水化合物、核酸、脂质、半抗原或其它天然存在或合成的化合物。在一些实施方案中，靶抗原可以是多肽(例如，ASIC1a多肽)。还可以将抗原施用于动物以在动物中产生免疫应答。
术语“抗原结合片段”是指整个免疫球蛋白结构的片段，所述片段具有负责与抗原结合的多肽的部分。可用于本发明的抗原结合片段的实例包含scFv、(scFv)2、Fab、Fab'和F(ab')2，但不限于此。
使用本领域技术人员已知的常规技术获得任何上述抗体片段，并且以与完整抗体相同的方式针对结合特异性和中和活性对片段进行筛选。
“结合亲和力”意指分子(例如，抗体)的单个结合位点与其结合配偶体(例如，抗原或抗原肽)之间的非共价相互作用的总强度。分子X对其配偶体Y的亲和力通常可以由解离常数(KD)表示。亲和力可以通过本领域中已知的标准方法来测量，包含本文所描述的那些。低亲和力复合物含有通常倾向于容易从抗原解离的抗体，而高亲和力复合物含有通常倾向于与抗原结合保持更长时间的抗体。
如本文所使用的，术语“生物样品”意指源自活细胞的样品材料。生物样品可以包含从受试者分离的组织、细胞、细胞的蛋白质或膜提取物和生物流体(例如，腹水或脑脊液(CSF))以及存在于受试者体内的组织、细胞和流体。本发明技术的生物样品包含但不限于取自以下的样品：乳房组织、肾组织、子宫颈、子宫内膜、头部或颈部、胆囊、腮腺组织、前列腺、脑、脑下垂体、肾脏组织、肌肉、食道、胃、小肠、结肠、肝脏、脾脏、胰腺、甲状腺组织、心脏组织、肺组织、膀胱、脂肪组织、淋巴结组织、子宫、卵巢组织、肾上腺组织、睾丸组织、扁桃体、胸腺、血液、毛发、口腔、皮肤、血清、血浆、CSF、精子、前列腺液、精液、尿液、粪便、汗液、唾液、痰液、粘液、骨髓、淋巴和泪液。生物样品还可以从内部器官的活检或癌症中获得。生物样品可以从受试者中获得用于诊断或研究，或者可以从非患病个体中获得，作为对照或用于基础研究。样品可以通过标准方法获得，包含例如静脉穿刺和外科手术活检。在某些实施方案中，生物样品是皮肤组织、毛发、指甲、皮脂腺或肌肉活检样品。
如本文所使用的，“对照”是出于比较目的在实验中使用的替代样品。对照可以是“阳性”或“阴性”对照。例如，当实验的目的是确定治疗剂对特定类型疾病的治疗功效的相关性时，通常采用阳性对照(表现出期望的治疗效果的已知化合物或组合物)和阴性对照(未接受疗法或接受安慰剂的受试者或样品)。
如本文所使用的，术语“有效量”是指足以实现期望的治疗和/或预防效果的量，例如，使本文所描述的疾病或病症或与本文所述疾病或病症相关联的一或多种体征或症状得到预防或减轻的量。在治疗或预防应用的上下文中，向受试者施用的组合物的量将根据组合物、疾病的程度、类型和严重性以及个体的特性，如一般健康状况、年龄、性别、体重和药物耐受性的不同而变化。熟练的技术人员将能够根据这些和其它因素确定适当的剂量。组合物还可以与一种或多种另外的治疗化合物组合施用。在本文所描述的方法中，可以向具有本文所描述的疾病或病症的一或多种体征或症状的受试者施用治疗组合物。如本文所使用的，组合物的“治疗有效量”是指改善或消除疾病或病症的生理作用的组合物的量。可以通过一次或多次施用来给出治疗有效量。
“单独的”或“纯化的”的多肽或肽实质上不含细胞材料或来自衍生药剂的细胞或组织源的其它污染多肽，或基本上不含化学前体或被化学合成时的其它化学制品。例如，本发明的单独的抗ASIC1a抗体将不含干扰诊断或治疗用途的材料。此类干扰材料可以包含酶、激素以及其它蛋白质和非蛋白质溶质。
如本文所使用的，术语“表位”意指能够与抗体特异性结合的蛋白决定簇。表位通常由如氨基酸或糖侧链等分子的化学活性表面基团组成，并且通常具有特异性三维结构特性以及特异性电荷特性。构象表位与非构象表位的区别在于，在变性溶剂存在的情况下，与前者而非后者的结合丧失。在一些实施方案中，“表位”是本发明的抗ASIC1a抗体能够特异性地结合的ASIC1a蛋白三聚体的区，包含ASIC1a的胞外结构域。在一些实施方案中，表位可以跨越两个ASIC1a亚基。在一些实施方案中，表位是构象表位或非构象表位。为了筛选与表位结合的抗ASIC1a抗体，可以进行常规交叉阻断测定，如在《抗体实验室手册(Antibodies,A Laboratory Manual)》,冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory),EdHarlow和David Lane(1988)中所描述的。此测定可以用于确定抗ASIC1a抗体是否与本发明的抗ASIC1a抗体结合相同的位点或表位。可替代地或另外地，表位作图可以通过本领域已知的方法进行。例如，如在图9E中示出的，可以通过丙氨酸扫描对抗体序列进行诱变，以鉴定接触的残基。在不同的方法中，与ASIC1a蛋白的不同区相对应的肽可以用于与所述测试抗体或具有经表征或已知的表位的测试抗体和抗体的竞争测定中。
如本文所使用的，“表达”包含以下中的一者或多者：将基因转录成前体mRNA；对前体mRNA进行剪接和其它加工，以产生成熟的mRNA；mRNA稳定性；将成熟的mRNA翻译成蛋白质(包含密码子使用和tRNA可用性)；以及对翻译产物进行糖基化和/或其它修饰(如果正确表达和功能需要的话)。
如本文所使用的，术语“基因”是指DNA片段，其包含所有关于调节RNA产物的生物合成的所有信息，包括启动子、外显子、内含子以及控制表达的其它非翻译区。
如本文所使用的，术语“同源性”或“同一性”或“相似性”是指两个肽之间或两个核酸分子之间的序列相似性。可以通过比对每个序列中的位点来确定同源性。当比较序列中的位点被相同碱基或氨基酸占据时，则分子在所述位点处是同源的。序列之间的同源性程度是序列共享有匹配或同源位点的数量的函数。多核苷酸或多核苷酸区(或多肽或多肽区)与另一个序列具有一定百分比(例如，至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％)的“序列同一性”意味着，当比对时，在比较的两个序列中，有所述百分比的碱基(或氨基酸)是相同的。可以使用本领域已知的软件程序来确定此比对和百分比同源性或序列同一性。在一些实施方案中，默认参数用于比对。一种比对程序是BLAST，其使用默认参数。具体地，程序是BLASTN和BLASTP，其使用以下默认参数：遗传密码＝standard(标准)；过滤器＝none(无)；链＝both(两者)；截止＝60；期望＝10；矩阵＝BLOSUM62；描述＝50个序列；排序＝HIGH SCORE；数据库＝non-redundant(非冗余)，GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDS翻译+SwissProtein+SPupdate+PIR。这些程序的详细信息可以在国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)找到。生物学等效的多核苷酸是那些具有指定百分比同源性并编码具有相同或类似生物活性的多肽的多核苷酸。如果两个序列彼此共有低于40％的同一性或低于25％的同一性，则所述两个序列被视为“不相关”或“非同源”。
如本文所使用的，非人(例如，鼠类)抗体的“人源化”形式是含有衍生自非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合抗体。在大多数情况下，人源化抗体是人免疫球蛋白，其中受体的高变区残基被来自如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类动物等具有所期望的特异性、亲和力以及能力的非人物种(供体抗体)的高变区残基替代。在一些实施方案中，人免疫球蛋白的Fv框架区(FR)残基被对应的非人残基替代。此外，人源化抗体可以包括在受体抗体或供体抗体中未发现的残基。进行这些修饰以进一步改善抗体性能，如结合亲和力。通常，人源化抗体将包括至少一个并且通常两个可变结构域中的基本上所有可变结构域(例如，Fab、Fab'、F(ab')2或Fv)，其中所有或基本上所有的高变环对应于非人免疫球蛋白的那些环，并且所有或基本上所有的FR区是人免疫球蛋白共有FR序列的高变区，尽管FR区可以包含一个或多个改善结合亲和力的氨基酸取代。FR中这些氨基酸取代的数量通常在H链中不超过6个，并且在L链中不超过3个。人源化抗体任选地还可以包括免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，通常是人免疫球蛋白恒定区的至少一部分。另外的细节参见Jones等人,《自然》,321:522-525(1986)；Riechmann等人,《自然》332:323-327(1988)；以及Presta,《当代结构生物学评论(Curr.Op.Struct.Biol.)》,2:593-596(1992)。参见例如Ahmed和Cheung,《欧洲生化学会联合会快报(FEBS Letters)》588(2):288-297(2014)；Saxena和Wu,《免疫学前沿(Frontiers in immunology)》7:580(2016)。
如本文所使用的，当在两个或更多个核酸或多肽序列的上下文中使用时，术语“相同”或“同一性”百分比是指当在比较窗口或指定区之上针对最大对应性进行比较和比对时，如使用利用以下所描述的默认参数的BLAST或BLAST 2.0序列比较算法或通过手动比对和视觉检查(例如，NCBI网站)测量的，相同的或具有特定百分比的氨基酸残基或核苷酸相同的两个或更多个序列或子序列(即，在指定区(例如，编码本文所描述的抗体的核苷酸序列或本文所描述的抗体的氨基酸序列)上的约60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的同一性)。此类序列被称为“基本上相同”。此术语还指或可以应用于测试序列的补体。所述术语还包含具有缺失和/或添加的序列，以及具有取代的序列。在一些实施方案中，同一性存在于长度为至少约25个氨基酸或核苷酸，或长度为50-100个氨基酸或核苷酸的区内。
如本文所使用的，术语“完整抗体”或“完整免疫球蛋白”意指具有通过二硫键互连的至少两个重(H)链多肽和两个轻(L)链多肽的抗体。每条重链包含重链可变区(本文缩写为HCVR或VH)和重链恒定区。重链恒定区包含三个结构域CH1、CH2和CH3。每条轻链包含轻链可变区(本文缩写为LCVR或VL)和轻链恒定区。轻链恒定区包含一个结构域CL。VH区和VL区可以被进一步细分成被称作互补决定区(CDR)的高变区，其间散布着更保守的框架区(FR)。每个VH和VL由按以下顺序从氨基端到羧基端分布的三个CDR和四个FR构成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，包含免疫系统的不同细胞(例如，效应细胞)以及经典补体系统的第一组分(Clq)。
如本文所使用的，术语“个体”、“患者”或“受试者”可以是个体生物体、脊椎动物、哺乳动物或人。在一些实施方案中，个体、患者或受试者是人。
如本文所使用的，术语“单克隆抗体”是指从基本上同质抗体群体中获得的抗体，即所述群体中包括的单独抗体是相同的，除了可以少量存在的可能天然存在的突变之外。例如，单克隆抗体可以是衍生自单克隆(包含任何真核、原核或噬菌体克隆)的抗体，并且不是产生抗体的方法。单克隆抗体组合物对特定表位显示出单一结合特异性和亲和力。单克隆抗体是高度特异性的，针对单个抗原位点。此外，与通常包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的常规(多克隆)抗体制剂相比，每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。修饰语“单克隆”指示抗体的特性是从基本上同质的抗体群体中获得的，并且不应被解释为需要通过任何特定方法产生抗体。单克隆抗体可以使用本领域中已知的各种技术制备，包含例如但不限于杂交瘤、重组和噬菌体展示技术。例如，根据本发明方法使用的单克隆抗体可以通过由Kohler等人,《自然》256:495(1975)首次描述的杂交瘤方法制备，或者可以通过重组DNA方法(参见例如美国专利第4,816,567号)制备。例如，“单克隆抗体”也可以使用Clackson等人,《自然》352:624-628(1991)和Marks等人,《分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)》222:581-597(1991)中描述的技术从噬菌体抗体文库中分离。
如本文所使用的，术语“药学上可接受的载体”旨在包含与药物施用相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌化合物和抗真菌化合物、等渗化合物以及吸收延迟化合物等。药学上可接受的载体及其调配物是本领域技术人员已知的并且在例如在以下文献中进行描述：《雷明顿药物科学(Remington's Pharmaceutical Sciences)》(第20版,编辑：A.R.Gennaro,2000,宾夕法尼亚州费城利平科特威廉斯·威尔金斯出版公司(Lippincott,Williams&Wilkins,Philadelphia,PA.))。
如本文所使用的，病症或症状的“预防(prevention/preventing)”是指统计样品中，相对于未经处理的对照样品，减少了经处理的样品的病症或症状的出现，或相对于未经处理的对照样品，延迟了病症或症状的一种或多种症状的发作或减轻其严重性的化合物。
如本文所使用的，术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用以便意指包括通过肽键或经修饰的肽键(即肽等排体)彼此连接的两个或更多个氨基酸的聚合物。多肽是指一般被称作肽、糖肽或寡聚物的短链和通常被称作蛋白质的较长链两者。多肽可以含有除20个基因编码的氨基酸以外的氨基酸。多肽包含通过如翻译后加工等天然过程或通过本领域中众所周知的化学修饰技术进行修饰的氨基酸序列。
如本文所使用的，术语“分开的”治疗使用是指通过不同途径同时施用或者基本上同时施用至少两种有效成分。
如本文所使用的，术语“连续的”治疗使用是指在不同时间施用至少两种有效成分，施用途径相同或不同。更具体地，连续的使用是指在另一种或其它有效成分开始施用之前，完全施用一种有效成分。因此，在施用一种或多种其它有效成分前几分钟、几小时或几天，可以施用一种有效成分。在此情况下不存在同时治疗。
如本文所使用的，术语“同时”治疗使用是指以相同的途径同时或基本上同时施用至少两种活性成分。
如本文所使用的，“特异性结合”是指识别另一分子(例如，抗原)并与其结合，但是基本上不识别其它分子且不与其它分子结合的分子(例如，抗体或其抗原结合片段)。如本文所使用的，术语“特异性结合”特定分子(例如，多肽或多肽上的表位)可以例如通过这样的分子来表现，所述分子对与其结合的所述特定分子的KD为约10-4M、10-5M、10-6M、10-7M、10- 8M、10-9M、10-10M、10-11M或10-12M。术语“特异性结合”也可以指分子(例如，抗体或其抗原结合片段)与特定多肽(例如，ASIC1a多肽)或特定多肽上的表位结合，而基本上不与任何其它多肽或多肽表位结合的结合。
如本文所使用的，术语“受试者”、“个体”或“患者”可以为单个生物体、脊椎动物、哺乳动物或人。
如本文所使用的，“治疗(treat/treating/treatment)”涵盖对如人等受试者的本文所述疾病或病症的治疗，并且包含：(i)抑制疾病或病症，即，阻止疾病或病症发展；(ii)缓解疾病或病症，即，引起病症消退；(iii)减缓病症的进展；和/或(iv)抑制、缓解或减缓疾病或病症的一种或多种症状的进展。
还应了解，本文所描述的各种治疗病症的模式旨在表示“基本的”，其包含完全的治疗但也包含次于其的治疗，并且其中实现了一些生物学或医学相关的结果。治疗可以是对慢性疾病的连续长期治疗或用于治疗急性病状的单次或几次施用。
设想了本文所描述的抗ASIC1a抗体的氨基酸序列修饰。例如，可能期望改善抗体的结合亲和力和/或其它生物性质。抗ASIC1a抗体的氨基酸序列变体通过将适当的核苷酸改变引入抗体核酸中或通过肽合成来制备。此类修饰包含例如抗体的氨基酸序列内的残基的缺失和/或插入和/或取代。只要获得的抗体具有期望的性质，缺失、插入和取代的任何组合都可以获得所关注的抗体。修饰还包含蛋白质的糖基化模式的改变。用于取代诱变的最受关注的位点包含高变区，但是还设想了FR改变。“保守取代”在下表中示出。
Figure BDA0003558876390000211
一种类型的取代型变体涉及取代亲本抗体的一个或多个高变区残基。产生此类取代型变体的便利方法涉及使用噬菌体展示的亲和力成熟。具体地，使若干高变区位点(例如，6-7个位点)突变以在各位点处产生所有可能的氨基酸取代。由此产生的抗体变体以单价方式从丝状噬菌体颗粒展示，作为与包装在每个颗粒内的M13的基因III产物的融合物。然后针对噬菌体展示的变体的生物活性(例如，结合亲和力)对所述变体进行筛选，如本文所公开的。为了鉴定用于修饰的候选高变区位点，可以进行丙氨酸扫描诱变，以鉴定对抗原结合有显著贡献的高变区残基。可替代地或另外地，可能有利的是分析抗原-抗体复合物的晶体结构，以鉴定抗体与抗原之间的接触点。根据本文详述的技术，此类接触残基和相邻残基是供取代的候选者。一旦产生了此类变体，就如本文所描述的对所述变体组进行筛选，并且可以选择在一个或多个相关测定中具有类似或优异性质的抗体用于进一步开发。
缺血性中风的发病机制
中风是由于脑的一部分的富氧血液供应中断或减少引起的。没有氧气，脑细胞会在几分钟内开始死亡。中风通常表现为以下等症状：突然虚弱无力；面部、手臂或腿部，尤其是身体的一侧麻痹或麻木；面部一侧下垂；思维混乱；说话困难，如口齿不清，或理解言语困难；一只或两只眼睛看东西困难，如视力模糊或变暗，或一只或两只眼睛复视；呼吸问题；眩晕；行走困难；失去平衡或协调，导致例如不明原因的跌倒；意识丧失以及突发和剧烈头痛。最常见的症状包含突然发作的面部虚弱无力(例如，面部一侧下垂)、手臂垂落和异常言语。这些症状通常在几秒到几分钟内突然出现，并且在大多数情况下不会进一步发展。立即紧急治疗对于以最小的脑和功能能力损伤从中风中幸存至关重要。
当脑的一部分的血液供应因血凝块或其它颗粒阻塞血管而被切断时，就会发生约占所有中风的87％的缺血性中风。称为斑块的脂肪沉积物也可以通过在血管中积聚而导致阻塞。缺血性中风中的血液流动阻塞可能是由动脉粥样硬化引起的，随着时间的推移，动脉粥样硬化会导致动脉变窄。缺血性中风可能是由沿脑供血动脉的任何地方阻塞引起的。
缺血性中风可能是栓塞性中风，其中血凝块或斑块碎片在身体的其它部位(通常是心脏)形成并且行进到脑。一旦进入脑，凝块就会行进到小到足以阻塞其通道的血管。凝块滞留在血管里，阻塞血管并且导致中风。约15％的栓塞性中风发生在心房颤动(Afib)患者中。
缺血性中风可能是血栓性中风，这是由向脑供血的动脉之一内形成的血凝块引起的。此类型的中风通常见于高胆固醇水平和动脉粥样硬化患者。血栓性中风可能是大血管血栓形成或小血管疾病。大血管血栓形成发生在脑的大动脉中。在大多数情况下，大血管血栓形成是由长期动脉粥样硬化和快速血凝块形成的组合引起的。高胆固醇是此类型中风的常见危险因素。小血管疾病或腔隙性梗塞与高血压密切相关。
本发明的抗ASIC1a抗体
本发明描述了用于产生和使用本发明的抗ASIC1a抗体(例如，抗ASIC1a抗体或其抗原结合片段)的方法和组合物。本发明的抗ASIC1a抗体可以用于缺血性中风的诊断或治疗。本发明技术范围内的抗ASIC1a抗体包含但不限于与靶多肽特异性结合的单克隆、嵌合、人源化、双特异性抗体和双抗体、其同源物、衍生物或片段。
下表提供了本发明抗ASIC1a抗体的互补决定区(CDR)序列：
序列标号 描述 序列
SEQ ID NO:3 ASC01 V<sub>H</sub>CDR1 GGSINSGGYYWG
SEQ ID NO:4 ASC01 V<sub>H</sub>CDR2 YIYPRGSSYYNPSLRS
SEQ ID NO:5 ASC01 V<sub>H</sub>CDR3 VGYTGAFDI
SEQ ID NO:8 ASC01 V<sub>L</sub>CDR1 SGGNSNIGNNYVS
SEQ ID NO:9 ASC01 V<sub>L</sub>CDR2 DNNKRPS
SEQ ID NO:10 ASC01 V<sub>L</sub>CDR3 GTWDSSLSAGV
SEQ ID NO:13 ASC02 V<sub>H</sub>CDR1 GYTVTGYYIH
SEQ ID NO:14 ASC02 V<sub>H</sub>CDR2 WINPNLGVTNYAQKFQG
SEQ ID NO:15 ASC02 V<sub>H</sub>CDR3 ASTGGIFYDY
SEQ ID NO:18 ASC02 V<sub>L</sub>CDR1 TRSSGNIASNYVQ
SEQ ID NO:19 ASC02 V<sub>L</sub>CDR2 DDNQRPS
SEQ ID NO:20 ASC02 V<sub>L</sub>CDR3 QSYDSSSVI
SEQ ID NO:23 ASC03 V<sub>H</sub>CDR1 GGNFRKYSIS
SEQ ID NO:24 ASC03 V<sub>H</sub>CDR2 WISAYNGNTNYAQKLQG
SEQ ID NO:25 ASC03 V<sub>H</sub>CDR3 DFDPYYDAFDI
SEQ ID NO:28 ASC03 V<sub>L</sub>CDR1 TGTSSDVGAYNYVS
SEQ ID NO:29 ASC03 V<sub>L</sub>CDR2 DVSNRLS
SEQ ID NO:30 ASC03 V<sub>L</sub>CDR3 SSYRSGNSLA
SEQ ID NO:33 ASC04 V<sub>H</sub>CDR1 GGTFSTYAIN
SEQ ID NO:34 ASC04 V<sub>H</sub>CDR2 WMNPNSGNTGYAQKFQG
SEQ ID NO:35 ASC04 V<sub>H</sub>CDR3 YSYGMDV
SEQ ID NO:38 ASC04 V<sub>L</sub>CDR1 TLRSGINVGAYRIY
SEQ ID NO:39 ASC04 V<sub>L</sub>CDR2 KSDSDKQ
SEQ ID NO:40 ASC04 V<sub>L</sub>CDR3 AIWHSSAWV
SEQ ID NO:43 ASC05 V<sub>H</sub>CDR1 GYSFTNYYMH
SEQ ID NO:44 ASC05 V<sub>H</sub>CDR2 IISPSGRSTSFAQKFQG
SEQ ID NO:45 ASC05 V<sub>H</sub>CDR3 GAWSTDAFDI
SEQ ID NO:48 ASC05 V<sub>L</sub>CDR1 TGTSSDVGSYNLVS
SEQ ID NO:49 ASC05 V<sub>L</sub>CDR2 EGSKRPS
SEQ ID NO:50 ASC05 V<sub>L</sub>CDR3 SSFTGKGYV
SEQ ID NO:53 ASC06 V<sub>H</sub>CDR1 GFTFSSYAMS
SEQ ID NO:54 ASC06 V<sub>H</sub>CDR2 AISGSGGSTYYADSVKG
SEQ ID NO:55 ASC06 V<sub>H</sub>CDR3 DSFYGYSKGD
SEQ ID NO:58 ASC06 V<sub>L</sub>CDR1 TGTSSDVGAYNYVSW
SEQ ID NO:59 ASC06 V<sub>L</sub>CDR2 GVSNRPS
SEQ ID NO:60 ASC06 V<sub>L</sub>CDR3 SSYTSSSTYV
因此，所述抗体或其抗原结合片段(本发明的抗ASIC1a抗体)可以包括重链免疫球蛋白可变结构域(VH)和轻链免疫球蛋白可变结构域(VL)，其中所述VH包括本文所公开的互补决定区VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3；并且其中所述VL包括本文所公开的互补决定区VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3。
一方面，本发明提供了一种抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包括重链免疫球蛋白可变结构域(VH)和轻链免疫球蛋白可变结构域(VL)，其中所述VH包括：选自由SEQ ID NO:3、13、23、33、43和53组成的组中的VH-CDR1序列；选自由SEQ ID NO:4、14、24、34、44和54组成的组中的VH-CDR2序列；以及选自由SEQ ID NO:5、15、25、35、45和55组成的组中的VH-CDR3序列；并且所述VL包括：选自由SEQ ID NO:8、18、28、38、48和58组成的组中的VL-CDR1序列；选自由SEQ ID NO:9、19、29、39、49和59组成的组中的VL-CDR2序列；以及选自由SEQ ID NO:10、20、30、40、50和60组成的组中的VL-CDR1序列。
另外地或可替代地，在一些实施方案中，所述VH包括：选自由以下序列组成的组中的VH-CDR1序列：SEQ ID NO:3、13、23、33和43；选自由以下序列组成的组中的VH-CDR2序列：SEQ ID NO:4、14、24、34和44；以及选自由以下序列组成的组中的VH-CDR3序列：SEQ ID NO:5、15、25、35和45；并且所述VL包括：选自由以下序列组成的组中的VL-CDR1序列：SEQ ID NO:8、18、28、38和48；选自由以下序列组成的组中的VL-CDR2序列：SEQ ID NO:9、19、29、39和49；以及选自由以下序列组成的组中的VL-CDR3序列：SEQ ID NO:10、20、30、40和50。另外地或可替代地，在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段进一步包括选自由IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgM、IgD和IgE组成的组中的同种型的Fc结构域。另外地或可替代地，在一些实施方案中，所述抗原结合片段选自由以下组成的组：Fab、F(ab')2、Fab'、scFv和Fv。另外地或可替代地，在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段是单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体或双特异性抗体。另外地或可替代地，在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段与ASIC1a蛋白结合。另外地或可替代地，在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段与ASIC1a的胞外结构域结合。另外地或可替代地，在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段与跨越两个ASIC1a亚基的表位结合。另外地或可替代地，在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段抑制ASIC1a。另外地或可替代地，在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段抑制质子诱导的ASIC1a电流。
一方面，本发明提供了一种组合物，所述组合物包括本文所公开的任何实施方案的抗体。另外地或可替代地，在一些实施方案中，核酸序列选自由以下序列组成的组：SEQID NO:1、6、11、16、21、26、31、36、41、46、51和56。
一方面，本发明提供了一种表达本文所公开的任何核酸的宿主细胞或载体。
一方面，本发明提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括本文所公开的任何实施方案的抗体或其抗原结合片段以及使用说明书。另外地或可替代地，在一些实施方案中，本文所公开的任何实施方案的抗体或其抗原结合片段与至少一种选自由放射性标记、荧光标记和显色标记组成的组中的可检测标记偶联。另外地或可替代地，在一些实施方案中，所述试剂盒进一步包括第二抗体，所述第二抗体与所述抗体或其抗原结合片段特异性地结合。
一方面，本发明技术提供了一种用于检测生物样品中的ASIC1a蛋白的方法，所述方法包括：使所述生物样品与本文所公开的任何实施方案的抗体或其抗原结合片段接触，所述抗体或其抗原结合片段与可检测标记缀合；以及检测所述生物样品中的所述可检测标记的存在和水平。
在一些实施方案中，VHCDR1包括SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列，VHCDR2包括SEQID NO:4所示的氨基酸序列，并且VHCDR3包括SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列；并且VLCDR1包括SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列，VLCDR2包括SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列，并且VLCDR3包括SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，VHCDR1包括SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列，VHCDR2包括SEQID NO:14所示的氨基酸序列，并且VHCDR3包括SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列；并且VLCDR1包括SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列，VLCDR2包括SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列，并且VLCDR3包括SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，VHCDR1包括SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列，VHCDR2包括SEQID NO:24所示的氨基酸序列，并且VHCDR3包括SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列；并且VLCDR1包括SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列，VLCDR2包括SEQ ID NO:29所示的氨基酸序列，并且VLCDR3包括SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，VHCDR1包括SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列，VHCDR2包括SEQID NO:34所示的氨基酸序列，并且VHCDR3包括SEQ ID NO:35所示的氨基酸序列；并且VLCDR1包括SEQ ID NO:38所示的氨基酸序列，VLCDR2包括SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列，并且VLCDR3包括SEQ ID NO:40所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，VHCDR1包括SEQ ID NO:43所示的氨基酸序列，VHCDR2包括SEQID NO:44所示的氨基酸序列，并且VHCDR3包括SEQ ID NO:45所示的氨基酸序列；并且VLCDR1包括SEQ ID NO:48所示的氨基酸序列，VLCDR2包括SEQ ID NO:49所示的氨基酸序列，并且VLCDR3包括SEQ ID NO:50所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，VHCDR1包括SEQ ID NO:53所示的氨基酸序列，VHCDR2包括SEQID NO:54所示的氨基酸序列，并且VHCDR3包括SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列；并且VLCDR1包括SEQ ID NO:58所示的氨基酸序列，VLCDR2包括SEQ ID NO:59所示的氨基酸序列，并且VLCDR3包括SEQ ID NO:60所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述VH包括选自由SEQ ID NO:2、12、22、32、42和52组成的组中的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述VL包括选自由SEQ ID NO:7、17、27、37、47和57组成的组中的氨基酸序列。
所述抗体或其抗原结合片段(本发明的抗ASIC1a抗体)可以与ASIC1a蛋白特异性结合。在一些实施方案中，本发明的抗ASIC1a抗体可以与ASIC1a的胞外结构域结合。在一些实施方案中，本发明的抗ASIC1a抗体可以与跨越两个ASIC1a亚基的表位结合。
在一些实施方案中，本发明的抗ASIC1a抗体抑制ASIC1a三聚体的功能。在一些实施方案中，本发明的抗ASIC1a抗体稳定ASIC1a三聚体。在一些实施方案中，本发明的抗ASIC1a抗体抑制ASIC1a与其它ASIC1异构体的异寡聚化(例如，异三聚化)。
在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段是抗体、scFv、(scFv)2、Fab、Fab'、F(ab')2或scFv-Fc抗体。在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段是scFv抗体。在一些实施方案中，所述scFv抗体是ASC01、ASC02、ASC03、ASC04、ASC05或ASC06。
制剂
举例来说，本发明技术的抗ASIC1a抗体在简单的递送媒剂中配制。然而，本发明技术的抗ASIC1a抗体可以被冻干或掺入到凝胶、乳膏、生物材料、缓释递送媒剂中。
本发明的抗ASIC1a抗体通常与药学上可接受的载体组合。术语“药学上可接受的载体”是指本身不诱导对接受组合物的个体有害的抗体的产生并且可以在没有过度毒性的情况下施用的任何药物载体。合适的载体可以是大的、代谢缓慢的大分子，如蛋白质、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合氨基酸和氨基酸共聚物。此类载体是本领域普通技术人员众所周知的。治疗组合物中的药学上可接受的载体可以包含流体，如水、盐水、甘油和乙醇。此类媒剂中还可以存在辅助物质，如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。药物组合物中还可以存在药学上可接受的盐，例如无机酸盐，如盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐、硫酸盐等；以及有机酸的盐，如乙酸盐、丙酸盐、丙二酸盐、苯甲酸盐等。
施用模式和有效剂量
可以采用本领域技术人员已知的用于使细胞、器官或组织与本发明的免疫球蛋白相关组合物接触的任何方法。合适的方法包含体外、离体或体内方法。体内方法通常包含将本发明的抗ASIC1a抗体，如上文所描述的那些，施用于哺乳动物，合适的人。当在体内用于治疗时，将本发明的抗ASIC1a抗体以有效量(即，具有期望的治疗效果的量)施用于受试者。剂量和给药方案将取决于受试者的症状程度、所使用的本发明的特定抗ASIC1a抗体的特性，例如，其治疗指数、受试者和受试者病史。
有效量可以通过内科医师和临床医生所熟悉的方法在临床前试验和临床试验期间确定。可用于所述方法的有效量的本发明的抗ASIC1a抗体可以通过施用药物化合物的多种众所周知的方法中的任一种施用于有需要的哺乳动物。本发明的抗ASIC1a抗体可以全身或局部施用。
本文所描述的免疫球蛋白相关组合物可以掺入到药物组合物中以单独或组合施用于受试者，以便治疗或预防本文所描述的病症。此类组合物通常包含活性剂和药学上可接受的载体。如本文所使用的，术语“药学上可接受的载体”包含与药物施用相容的盐水、溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂以及吸收延迟剂等。还可以将补充的活性化合物掺入到组合物中。
药物组合物通常被配制为与其预期施用途径相容。施用途径的实例包含肠胃外(例如，静脉内、皮内、腹膜内或皮下)、口服、吸入、经皮(局部)、眼内、离子电渗和经粘膜施用。用于肠胃外、皮内或皮下施加的溶液或悬浮液可以包含以下组分：无菌稀释剂，如注射用水、盐水溶液、不挥发性油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶剂；抗细菌剂，如苄甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，如乙二胺四乙酸；缓冲剂，如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐，以及用于调节张力的试剂，如氯化钠或右旋糖。可以用如盐酸或氢氧化钠等酸或碱调整pH。肠胃外制剂可以封装在由玻璃或塑料制成的安瓶、一次性注射器或多剂量小瓶中。为了患者或治疗医师的方便，剂量调配物可以提供在含有治疗过程(例如，7天的治疗)的全部必要设备(例如，药物小瓶、稀释剂小瓶、注射器和针头)的试剂盒中。
在一些实施方案中，本文所描述的免疫球蛋白相关组合物通过肠胃外途径施用。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段通过局部途径施用。
适合于可注射用途的药物组合物可以包含无菌水溶液(在水溶性的情况下)或用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。对于静脉内施用，合适的载体包含生理盐水、抑菌水、Cremophor ELTM(新泽西州帕西波尼市的巴斯夫公司(BASF,Parsippany,N.J.))或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。在所有情况下，用于肠胃外施用的组合物必须是无菌的并且应具有达到易于注射的程度的流动性。载体应当在制造和储存条件下稳定，并且必须能够抵抗如细菌和真菌等微生物的污染。
本发明组合物的抗ASIC1a抗体可以包含载体，所述载体可以是溶剂或分散介质，其含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)以及其合适的混合物。可以通过使用如卵磷脂等包衣、通过在分散体的情况下维持所需粒度大小以及通过使用表面活性剂来维持恰当的流动性。可以通过各种抗细菌剂以及抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞以及类似物质来防止微生物的作用。可以包含谷胱甘肽和其它抗氧化剂以防止氧化。在许多情况下，组合物中包含等渗剂，例如糖，多元醇，如甘露醇、山梨糖醇或氯化钠。可注射组合物的延长吸收可以通过在组合物中包含延迟吸收的药剂例如单硬脂酸铝或明胶来实现。
无菌可注射溶液可以通过将所需量的活性化合物根据需要与以上列举的成分中的一种或其组合一起掺入适当溶剂中，随后过滤灭菌处理来制备。通常，分散体通过将活性化合物掺入到无菌媒剂中来制备，所述无菌媒剂含有基础分散介质以及来自以上列举的那些成分的所需其它成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，典型的制备方法包含真空干燥和冷冻干燥，所述真空干燥和冷冻干燥可以产生活性成分加上来自其先前无菌过滤溶液的任何另外的期望成分的粉末。
口服组合物通常包含惰性稀释剂或可食用载体。出于口服治疗性施用的目的，活性化合物可以掺入赋形剂并且以片剂、锭剂或胶囊剂例如明胶胶囊剂的形式使用。口服组合物还可以使用用作嗽口水的液体载剂进行制备。可以包含药学上相容的粘结剂和/或佐剂材料作为组合物的一部分。片剂、丸剂、胶囊、锭剂等可以含有以下成分中的任何成分或具有类似性质的化合物：粘结剂，如微晶纤维素，黄蓍胶或明胶；赋形剂，如淀粉或乳糖；崩解剂，如海藻酸、Primogel或玉米淀粉；润滑剂，如硬脂酸镁或Sterotes；助流剂，如胶体二氧化硅；甜味剂，如蔗糖或糖精；或调味剂，如薄荷、水杨酸甲酯或橙味调味剂。
对于通过吸入施用，本发明的抗ASIC1a抗体可以以气溶胶喷雾形式递送，所述气溶胶喷雾来自含有适合的推进剂，例如气体(如二氧化碳)的加压容器或分配器，或者来自雾化器。此类方法包含在美国专利6,468,798中描述的那些方法。
如本文所描述的本发明的抗ASIC1a抗体的全身施用还可以是通过经粘膜或经皮的方式。对于经粘膜或经皮施用，在制剂中使用适于要渗透的屏障的渗透剂。此类渗透剂通常是本领域中已知的并且就经粘膜施用而言，包含例如洗涤剂、胆盐和梭链孢酸衍生物。经粘膜施用可以通过使用鼻腔喷雾剂来完成。对于经皮施用，将活性化合物调配成如本领域通常已知的软膏剂、药膏剂、凝胶剂或乳膏剂。在一个实施方案中，经皮施用可以通过离子电渗进行。
本发明的抗ASIC1a抗体可以在载体系统中配制。所述载体可以是胶体系统。胶体系统可以是脂质体、磷脂双层媒剂。在一个实施方案中，本发明的治疗性抗ASIC1a抗体被封装在脂质体中，同时维持本发明抗ASIC1a抗体的完整性。本领域技术人员将会理解，有多种用于制备脂质体的方法。(参见Lichtenberg等人,《生物学分析方法(MethodsBiochem.Anal.)》33:337-462(1988)；Anselem等人,《脂质体技术(LiposomeTechnology)》,CRC出版社(CRC Press)(1993))。脂质体调配物可以延迟清除并增加细胞摄取(参见Reddy,《治疗纪事药物治疗年鉴(Ann.Pharmacother.)》,34(7-8):915-923(2000))。还可以将活性剂装载到由药学上可接受的成分制备的颗粒中，所述药学上可接受的成分包含但不限于可溶性、不溶性、可渗透性、不可渗透性、可生物降解性或胃滞留性聚合物或脂质体。此类颗粒包含但不限于纳米颗粒、可生物降解性纳米颗粒、微粒、可生物降解性微粒、纳米球、可生物降解性纳米球、微球、可生物降解性微球、胶囊、乳液、脂质体、胶束和病毒载体系统。
所述载体也可以是聚合物，例如可生物降解性、生物相容性聚合物基质。在一个实施方案中，本发明的抗ASIC1a抗体可以嵌入到聚合物基质中，同时维持蛋白质完整性。聚合物可以是天然的，如多肽、蛋白质或多糖，或者是合成的，如聚α-羟基酸。实例包含由例如胶原、纤连蛋白、弹性蛋白、乙酸纤维素、硝酸纤维素、多糖、纤维蛋白、明胶以及其组合制成的载体。在一个实施方案中，聚合物是聚乳酸(PLA)或共聚乳酸/乙醇酸(PGLA)。聚合物基质可以以多种形式和大小制备并分离，包含微球和纳米球。聚合物制剂可以延长治疗效果的持续时间。(参见Reddy,《治疗纪事药物治疗年鉴》,34(7-8):915-923(2000))。用于人生长激素(hGH)的聚合物调配物已经用于临床试验。(参见Kozarich和Rich,《化学生物学(Chemical Biology)》,2:548-552(1998))。
聚合物微球缓释制剂的实例在PCT公开WO 99/15154(Tracy等人)、美国专利5,674,534和5,716,644(均授予Zale等人)、PCT公开WO 96/40073(Zale等人)和PCT公开WO00/38651(Shah等人)中进行描述。美国专利5,674,534和5,716,644以及PCT公开WO 96/40073描述了含有促红细胞生成素颗粒的聚合物基质，所述促红细胞生成素颗粒用盐稳定以防止聚集。
在一些实施方案中，本发明的抗ASIC1a抗体可以与载体一起制备，所述载体将保护本发明的抗ASIC1a抗体免于从体内快速消除，如控释制剂，包含植入物以及微囊包封的递送系统。可以使用可生物降解的、生物相容的聚合物，如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。此类制剂可以使用已知的技术制备。这些材料还可以从阿尔扎公司(Alza Corporation)和新星制药有限公司(Nova Pharmaceuticals,Inc.)商购获得。脂质体悬浮液(包含靶向具有针对细胞特异性抗原的单克隆抗体的脂质体)也可以用作药学上可接受的载体。可以根据本领域技术人员已知的方法来制备这些调配物，例如在美国专利4,522,811中所描述的方法。
还可以配制本发明的抗ASIC1a抗体以增强胞内递送。例如，脂质体递送系统是本领域已知的，参见例如，Chonn和Cullis,“脂质体药物递送系统的最新进展(RecentAdvances in Liposome Drug Delivery Systems)”,《生物技术当前述评(CurrentOpinion in Biotechnology)》6:698-708(1995)；Weiner,“用于蛋白质递送的脂质体：选择制造和开发过程(Liposomes for Protein Delivery:Selecting Manufacture andDevelopment Processes)”,《免疫方法(Immunomethods)》,4(3):201-9(1994)；以及Gregoriadis,“用于药物递送的工程化脂质体：进展和问题(Engineering Liposomes forDrug Delivery:Progress and Problems)”,《生物科技趋势(Trends Biotechnol.)》,13(12):527-37(1995)。Mizguchi等人,《癌症快报(Cancer Lett.)》,100:63-69(1996)描述了融合脂质体将蛋白质在体内和在体外递送到细胞的用途。
本发明抗ASIC1a抗体的剂量、毒性和治疗功效可以通过细胞培养物或实验动物中的标准制药程序来确定，例如，以用于确定LD50(使50％的群体致死的剂量)和ED50(对50％的群体具有治疗有效性的剂量)。毒性作用与治疗效果之间的剂量比为治疗指数，并且所述治疗指数可以被表示为比率LD50/ED50。在一些实施方案中，本发明的抗ASIC1a抗体表现出高治疗指数。尽管可以使用表现出有毒副作用的本发明的抗ASIC1a抗体，但是应该注意设计将此类化合物靶向到受影响组织的部位的递送系统，从而使对未感染细胞的潜在损伤最小化并由此减少副作用。
从细胞培养测定和动物研究中获得的数据可以用于配制在人类中使用的一系列剂量。此类化合物的剂量处于包含ED50在内的具有很小毒性或没有毒性的循环浓度范围内。剂量可以根据所采用的剂型和所利用的施用途径而在这个范围内变化。对于这些方法中使用的任何本发明抗ASIC1a抗体，治疗有效剂量可以最初根据细胞培养测定估计。在动物模型中可以将剂量配制为循环血浆浓度范围，所述范围包含如在细胞培养中测定的IC50(即，测试化合物的实现症状的半数最大抑制的浓度)在内的。此类信息可以用于更准确地确定人类中有用的剂量。可以通过高效液相色谱法来测量血浆中的水平。
典型地，足以实现治疗或预防作用的本发明的抗ASIC1a抗体的有效量的范围为约0.000001毫克/千克体重/天到约10,000毫克/千克体重/天。合适地，剂量范围为约0.0001毫克/千克体重/天到约100毫克/千克体重/天。例如，剂量可以是1毫克/千克体重/天、两天或三天或10毫克/千克体重/天、两天或三天，或者在1-10毫克/千克体重/周、两周或三周的范围内。在一个实施方案中，本发明抗ASIC1a抗体的单剂量范围为0.001-10,000微克/千克体重。在一个实施方案中，本发明的抗ASIC1a抗体在载体中的浓度范围为0.2微克/递送毫升到2000微克/递送毫升。示例性治疗方案需要每天一次或每周一次地施用。在治疗性应用中，有时要求相对短的间隔下相对高的剂量，直到疾病进展减轻或终止并且直到受试者表现出疾病症状的部分或完全改善。此后，可以进行患者预防方案。
在一些实施方案中，治疗有效量的本发明抗ASIC1a抗体可以被定义为，靶组织处10-12摩尔到10-6摩尔(例如，大约10-7摩尔)的本发明的抗ASIC1a抗体浓度。此浓度可以根据0.001mg/kg到100mg/kg的全身剂量或按体表面积计的等效剂量进行递送。优化剂量时程以维持靶组织的治疗浓度。在一些实施方案中，剂量通过每日或每周单次给药来施用，但是也可以包含连续施用(例如，肠胃外输注或经皮施用)。在一些实施方案中，本发明的抗ASIC1a抗体的剂量以“低”、“中”或“高”剂量水平提供。在一个实施方案中，提供的低剂量为约0.0001毫克/千克/小时到约0.5毫克/千克/小时，合适地为约0.001毫克/千克/小时到约0.1毫克/千克/小时。在一个实施方案中，提供的中剂量为约0.01毫克/千克/小时到约1.0毫克/千克/小时，合适地为约0.01毫克/千克/小时到约0.5毫克/千克/小时。在一个实施方案中，提供的高剂量为约0.5毫克/千克/小时到约10毫克/千克/小时，合适地为约0.5毫克/千克/小时到约2毫克/千克/小时。
例如，治疗有效量可以部分地或完全地缓解缺血性中风的一种或多种症状，包含突然虚弱无力；面部、手臂或腿部，尤其是身体的一侧麻痹或麻木；面部一侧下垂；思维混乱；说话困难，如口齿不清，或理解言语困难；一只或两只眼睛看东西困难，如视力模糊或变暗，或一只或两只眼睛复视；呼吸问题；眩晕；行走困难；失去平衡或协调，导致例如不明原因的跌倒；意识丧失以及突发和剧烈头痛。治疗有效量可以部分地或完全地缓解缺血性中风的一种或多种症状，包含但不限于突然发作的面部虚弱无力(如面部一侧下垂)、手臂垂落和异常言语。
本领域技术人员将理解，某些因素可能影响治疗受试者所需的有效剂量和时间安排，这些因素包含但不限于疾病或病症的严重性、之前的治疗、所述受试者的总体健康情况和/或年龄以及存在的其它疾病。此外，用治疗有效量的本文所描述的药物组合物对受试者进行的治疗可以包含单次治疗或系列治疗。
根据本发明方法治疗的哺乳动物可以是任何哺乳动物，例如包含：如绵羊、猪、牛和马等农场动物；如狗和猫等宠物动物；如大鼠、小鼠和兔等实验室动物。在一些实施方案中，所述哺乳动物是人。
本发明的抗ASIC1a抗体的用途
综述：本发明的抗ASIC1a抗体可用于本领域已知的与ASIC1a蛋白或其突变体的定位和/或定量相关的方法中(例如，用于测量适当生理样品中ASIC1a蛋白的水平、用于诊断方法、用于多肽成像等)。本发明的抗ASIC1a抗体可用于通过如亲和色谱法或免疫沉淀等标准技术分离ASIC1a蛋白。本发明的抗ASIC1a抗体可以用于从生物样品(例如，哺乳动物血清或细胞)中纯化天然免疫反应性ASIC1a蛋白，以及纯化在宿主系统中表达的重组产生的免疫反应性ASIC1a蛋白。此外，本发明的抗ASIC1a抗体可以用于检测免疫反应性ASIC1a蛋白或其片段(例如，在血浆、细胞裂解物或细胞上清液中)，以评估免疫反应性多肽的丰度和表达模式。作为临床测试程序的一部分，本发明的抗ASIC1a抗体可以用于诊断性监测组织中的免疫反应性ASIC1a蛋白水平，以确定给定治疗方案的功效。如上所述，可以通过将本发明抗ASIC1a抗体与可检测物质偶联(即，物理连接)来促进检测。
ASIC1a蛋白的检测：用于检测生物样品中是否存在免疫反应性ASIC1a蛋白的示例性方法包括，从测试受试者中获得生物样品并且使所述生物样品与能够检测免疫反应性ASIC1a蛋白的本发明技术的抗ASIC1a抗体接触，使得在生物样品中检测免疫反应性ASIC1a蛋白的存在。检测可以通过连接到抗体的可检测标记来完成。
关于本发明抗ASIC1a抗体的术语“标记的”，旨在涵盖通过将可检测物质与抗体偶联(即，物理连接)来直接标记抗体，以及通过与另一种直接标记的化合物如第二抗体反应来间接标记抗体。间接标记的实例包含使用荧光标记的第二抗体检测第一抗体，以及用生物素对DNA探针进行末端标记，从而可以用荧光标记的链霉亲和素进行检测。
在一些实施方案中，本文所公开的本发明的抗ASIC1a抗体与一种或多种可检测标记缀合。对于此类用途，本发明的抗ASIC1a抗体可以通过显色、酶促、放射性同位素、同位素、荧光、毒性、化学发光、核磁共振造影剂或其它标记的共价或非共价连接进行可检测地标记。
合适的显色标记的实例包含二氨基联苯胺和4-羟基偶氮-苯-2-羧酸。合适的酶标记的实例包含苹果酸脱氢酶、葡萄球菌核酸酶、Δ-5-类固醇异构酶、酵母醇脱氢酶、α-甘油磷酸酯脱氢酶、磷酸丙糖异构酶、过氧化物酶、碱性磷酸酶、天冬酰胺酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、核糖核酸酶、脲酶、过氧化氢酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、葡糖淀粉酶和乙酰胆碱酯酶。
合适的放射性同位素标记的实例包含3H、111In、125I、131I、32P、35S、14C、51Cr、57To、58Co、59Fe、75Se、152Eu、90Y、67Cu、217Ci、211At、212Pb、47Sc、109Pd等。111In是用于体内成像的示例性同位素，因为其避免了肝脏对125I或131I标记的ASIC1a-蛋白结合抗体的脱卤问题。另外，此同位素具有对成像更有利的γ发射能量(Perkins等人,《欧洲核医学杂志(Eur.J.Nucl.Med.)》70:296-301(1985)；Carasquillo等人,《核医学杂志(J.Nucl.Med.)》25:281-287(1987))。例如，与具有1-(P-异硫氰基苄基)-DPTA的单克隆抗体偶联的111In在非肿瘤组织，特别是肝脏中几乎不被摄取，并且增强了肿瘤定位的特异性(Esteban等人,《核医学杂志》28:861-870(1987))。合适的非放射性同位素标记的实例包含157Gd、55Mn、162Dy、52Tr和56Fe。
合适的荧光标记的实例包含152Eu标记、荧光素标记、异硫氰酸标记、罗丹明(rhodamine)标记、藻红蛋白标记、藻蓝蛋白标记、别藻蓝蛋白标记、绿色荧光蛋白(GFP)标记、邻苯二甲醛标记和荧光胺标记。合适的毒素标记的实例包含白喉毒素、蓖麻毒素和霍乱毒素。
化学发光标记的实例包含鲁米诺(luminol)标记、异鲁米诺标记、芳香族吖锭酯标记、咪唑标记、吖锭盐标记、草酸酯标记、荧光素标记、荧光素酶标记以及水母发光蛋白标记。核磁共振造影剂的实例包含重金属核，例如Gd、Mn和铁。
本发明的检测方法可以用于体外和体内检测生物样品中的免疫反应性ASIC1a蛋白。用于检测免疫反应性ASIC1a蛋白的体外技术包含：酶联免疫吸附测定(ELISA)、蛋白质印迹、免疫沉淀、放射免疫测定和免疫荧光。此外，用于检测免疫反应性ASIC1a蛋白的体内技术包含，将本发明的标记的抗ASIC1a抗体引入到受试者体内。例如，本发明的抗ASIC1a抗体可以用放射性标志物标记，所述放射性标志物在受试者中的存在和位置可以通过标准成像技术来检测。在一个实施方案中，生物样品含有来自测试受试者的ASIC1a蛋白分子。
免疫测定和成像：本发明的抗ASIC1a抗体可以通过基于抗体的技术用于测定生物样品(例如，人血浆)中的免疫反应性ASIC1a蛋白水平。例如，可以用经典的免疫组织学方法研究组织中的蛋白质表达。Jalkanen,M.等人,《细胞生物学杂志(J.Cell.Biol.)》101:976-985,1985；Jalkanen,M.等人,《细胞生物学杂志》105:3087-3096,1987。可用于检测蛋白质基因表达的其它基于抗体的方法包含免疫测定，如酶联免疫吸附测定(ELISA)和放射免疫测定(RIA)。合适的抗体测定标记是本领域已知的，并且包含酶标记，如葡萄糖氧化酶和放射性同位素或其它放射性药剂，如碘(125I、121I、131I)、碳(14C)、硫(35S)、氚(3H)、铟(112In)和锝(99mTc)，以及荧光标记物，如荧光素、罗丹明和绿色荧光蛋白(GFP)，以及生物素。
除了测定生物样品中的免疫反应性ASIC1a蛋白水平之外，本发明的抗ASIC1a抗体还可以用于ASIC1a蛋白的体内成像。可用于此方法的抗体包含可通过X射线照相术、NMR或ESR检测的抗体。对于X射线照相术，合适的标记包含放射性同位素，如钡或铯，所述放射性同位素发出可检测的辐射但是不会对受试者造成明显的伤害。NMR和ESR的合适标志物包含具有可检测特性自旋的标志物，如氘，所述标志物可以通过标记相关scFv克隆的必须物质而引入本发明的抗ASIC1a抗体中。
已经用适当的可检测成像部分，如放射性同位素(例如，131I、112In、99mTc)、不透射线物质或可通过核磁共振检测的材料标记的本发明抗ASIC1a抗体被引入(例如，通过肠胃外、皮下或腹膜内)到受试者中。应理解，受试者的大小和所使用的成像系统将决定需要产生诊断图像的成像部分的数量。在放射性同位素部分的情况下，对于人类受试者，注射的放射性的量通常在99mTc的约5毫居里到20毫居里的范围内。然后，本发明的标记的抗ASIC1a抗体将在含有特定靶多肽的细胞位置处累积。例如，本发明的标记的抗ASIC1a抗体将在受试者体内累积在ASIC1a蛋白所在的细胞和组织中。
因此，本发明提供了一种医学病症的诊断方法，所述诊断方法包括：(a)通过测量本发明的抗ASIC1a抗体在个体的细胞或体液中的结合来测定免疫反应性ASIC1a蛋白的表达；(b)将样品中存在的免疫反应性ASIC1a蛋白的量与标准参照进行比较，其中通过与标准参照相比，免疫反应性ASIC1a蛋白水平的增加或减少指示医学病症。
亲和纯化：本发明的抗ASIC1a抗体可以用于从样品中纯化免疫反应性ASIC1a蛋白。在一些实施方案中，抗体被固定在固体支撑物上。此类固体支撑物的实例包括，塑料，如聚碳酸酯；复合碳水化合物如琼脂糖和琼脂糖凝胶；丙烯酸树脂如聚丙烯酰胺和乳胶珠。将抗体与此类固体支撑物偶联的技术是本领域中众所周知的(Weir等人,《实验免疫学手册(Handbook of Experimental Immunology)》第4版,英国牛津布莱克韦尔科学出版社(Blackwell Scientific Publications,Oxford,England),第10章(1986)；Jacoby等人,《酶学方法(Meth.Enzym.)》34纽约学术出版社(Academic Press,N.Y.)(1974))。
将抗原与抗体-支撑物基质结合的最简单的方法是将珠粒收集在柱中，并且使抗原溶液沿柱向下流动。这种方法的效率取决于所固定抗体与抗原之间的接触时间，所述接触时间可以通过降低流动速率来延长。当抗原流过时，所固定抗体会捕获所述抗原。或者，可以通过将抗原溶液与支撑物(例如，珠粒)混合并旋转或摇动浆料，使抗原与所固定抗体之间最大程度地接触，从而使抗原与抗体-支撑物基质接触。结合反应完成后，将浆料传送到收集珠粒的柱中。使用合适的洗涤缓冲液洗涤珠粒，然后洗脱纯净的或基本上纯净的抗原。
目标抗体或多肽可以与固体支撑物，如珠粒缀合。另外，如果需要的话，如珠粒等第一固体支撑物也可以通过任何合适的方式与第二固体支撑物缀合，所述第二固体支撑物可以是第二珠粒或其它支撑物，包含本文所公开的用于使多肽与支撑物缀合的那些。因此，本文所公开的关于多肽与固体支撑物缀合的任何缀合方法和方式也可以应用于第一支撑物与第二支撑物的缀合，其中第一固体支撑物和第二固体支撑物可以相同或不同。
用于使多肽与固体支撑物缀合的适当的连接子(其可以为交联剂)包含可以与支撑物表面的官能团、或与多肽或与两者反应的多种药剂。可用作交联剂的试剂包含同双官能试剂，并且具体地异双官能试剂。有用的双官能交联剂包含但不限于N-SIAB、二马来酰亚胺、DTNB、N-SATA、N-SPDP、SMCC和6-HYNIC。可以选择交联剂以在多肽与固体支撑物之间提供可选择性裂解的键。例如，光不稳定交联剂，如3-氨基-(2-硝基苯基)丙酸可以用作从固体支撑物裂解多肽的方式。(Brown等人,《分子多样性(Mol.Divers)》,第4-12页(1995)；Rothschild等人,《核酸研究(Nucl.Acids Res.)》,24:351-66(1996)；以及美国专利第5,643,722号)。其它交联剂在本领域是众所周知的。(参见例如，Wong(1991),同上；以及Hermanson(1996),同上)。
抗体或多肽可以通过羧基官能化珠粒与多肽的氨基端之间形成的共价酰胺键，或者相反地，通过氨基官能化珠粒与多肽的羧基端之间形成的共价酰胺键固定在如珠粒等固体支撑物上。另外，双官能三苯甲基连接子可以通过树脂上的氨基或羧基经由氨基树脂连接到支撑物，所述支撑物例如树脂(如，Wang树脂)上的4-硝基苯基活性酯。使用双官能三苯甲基方法，固体支撑物可能需要用如甲酸或三氟乙酸等挥发性酸处理，以确保多肽被裂解并且可以被去除。在此类情况下，多肽可以作为无珠粒膜片沉积在固体支撑物的孔底部或固体支撑物的平坦表面上。添加基质溶液之后，多肽可以被解吸到MS中。
疏水性三苯甲基连接子也可以通过使用挥发性酸或适当的基质溶液(例如，含有3-HPA的基质溶液)，作为酸不稳定性连接子从多肽裂解氨基连接的三苯甲基。酸不稳定性也可以改变。例如，三苯甲基、单甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基或三甲氧基三苯甲基可以变为多肽的合适的对取代或更多酸不稳定的三苯甲基胺衍生物，即可以在多肽上形成三苯甲基醚和三苯甲基胺键。因此，可以在酸性条件下(如果需要的话，包含在典型的MS条件下，其中基质(如3-HPA)作为一种酸)，通过破坏疏水性吸引力或通过裂解三苯甲基醚或三苯甲基胺键，而从疏水连接子中去除多肽。
可正交裂解的连接子还可以用于将第一固体支撑物(例如，珠粒)与第二固体支撑物结合，或者用于将目标多肽与固体支撑物结合。使用此类连接子，第一固体支撑物(例如，珠粒)可以从第二固体支撑物选择性地裂解，而不会裂解支撑物中的多肽；然后可以稍后从珠粒裂解多肽。例如，可以使用如DTT等还原剂裂解的二硫键连接子，其可以用于将珠粒与第二固体支撑物结合，并且酸可裂解的双官能三苯甲基可以用于将多肽固定到支撑物。根据需要，可以首先裂解多肽与固体支撑物的连接，例如使第一支撑物与第二支撑物之间的连接保持完整。三苯甲基连接子可以提供共价或疏水缀合，并且无论缀合的性质如何，三苯甲基在酸性条件下都容易裂解。
例如，珠粒可以通过连接基团与第二支撑物结合，所述连接基团可以被选择为具有使得珠粒与固体支撑物的高密度结合，或多肽与珠粒的高密度结合得以促进的长度和化学性质。此类连接基团可以具有例如“树状”结构，从而在固体支撑物上的每个连接位点提供多个官能团。此类连接基团的实例包含聚赖氨酸、聚谷氨酸、季戊四醇和三-羟基-氨基甲烷。
非共价结合连接：通过非共价相互作用，抗体或多肽可以与固体支撑物缀合，或者第一固体支撑物也可以与第二固体支撑物缀合。例如，由能够被磁化的铁磁材料制成的磁珠可以被吸引到磁性固体支撑物上，并且可以通过去除磁场而从支撑物上释放。可替代地，固体支撑物可以具有离子或疏水部分，所述固体支撑物可以允许离子或疏水部分分别与多肽，例如，含有连接的三苯甲基的多肽相互作用或与具有疏水特性的第二固体支撑物相互作用。
固体支撑物也可以具有特异性结合对的成员，并且因此可以与多肽或含有互补结合部分的第二固体支撑物缀合。例如，涂覆有亲和素或链霉亲和素的珠粒可以与掺入生物素部分的多肽结合，或与涂覆有生物素或生物素衍生物如亚氨基生物素的第二固体支撑物结合。
应认识到，本文所公开的或本领域另外已知的任何结合成员都是可逆的。因此，例如生物素可以掺入到多肽或固体支撑物中，并且相反，亲和素或其它生物素结合部分将分别掺入到支撑物或多肽中。预期能够用于本发明的其它特异性结合对包含但不限于激素及其受体、酶及其底物、核苷酸序列及其互补序列、抗体及与其特异性相互作用的抗原，以及本领域技术人员已知的其它此类结合对。
A.本发明的抗ASIC1a抗体的诊断用途
综述：本发明的抗ASIC1a抗体可用于诊断方法中。如此，本发明提供了在受试者中使用抗体诊断ASIC1a蛋白活性的方法。可以选择本发明的抗ASIC1a抗体，以使得它们对ASIC1a蛋白具有任何水平的表位结合特异性和非常高的结合亲和力。通常，抗体的结合亲和力越高，可以在免疫测定中执行的用于去除非特异性结合物质而不去除靶多肽的洗涤条件就越严格。因此，可用于诊断测定的本发明的抗ASIC1a抗体通常具有约108M-1、109M-1、1010M-1、1011M-1或1012M-1的结合亲和力。进一步地，期望用作诊断试剂的本发明的抗ASIC1a抗体具有足够的动力学缔合速率，以在标准条件下在至少12小时、至少5小时或至少1小时内达到平衡。
本发明的抗ASIC1a抗体可以用于以多种标准测定形式检测免疫反应性ASIC1a蛋白。此类形式包含免疫沉淀、蛋白质印迹、ELISA、放射免疫测定和免疫测定。参见Harlow和Lane,《抗体实验室手册》(纽约冷泉港出版社(Cold Spring Harbor Publications,NewYork),1988)；美国专利3,791,932；3,839,153；3,850,752；3,879,262；4,034,074,3,791,932；3,817,837；3,839,153；3,850,752；3,850,578；3,853,987；3,867,517；3,879,262；3,901,654；3,935,074；3,984,533；3,996,345；4,034,074；和4,098,876。生物样品可以从受试者的任何组织或体液中获得。在某些实施方案中，受试者处于癌症的早期阶段。在一个实施方案中，癌症的早期阶段通过从受试者中获得的样品中的ASIC1a蛋白的水平或表达模式确定。在某些实施方案中，样品选自由尿液、血液、血清、血浆、唾液、羊水、脑脊液(CSF)和活检的身体组织组成的组。
免疫测定或夹心测定是本发明的诊断方法的一种形式。参见美国专利4,376,110、4,486,530、5,914,241以及5,965,375。此类测定使用一种抗体，例如固定在固相上的本发明的抗ASIC1a抗体或本发明的抗ASIC1a抗体的抗体群，以及溶液中的另一种本发明的抗ASIC1a抗体或本发明抗ASIC1a抗体的抗体群。典型地，标记本发明抗ASIC1a抗体或本发明抗ASIC1a抗体的抗体群的溶液。如果使用抗体群，则所述抗体群可以含有与靶多肽内的不同表位特异性结合的抗体。因此，相同的抗体群可以用于固相和溶液抗体两者。如果使用本发明的抗ASIC1a抗体，则具有不同结合特异性的第一和第二ASIC1a蛋白单克隆抗体用于固相和液相。固相(也称为“捕获”)和溶液(也称为“检测”)抗体可以按任一顺序或同时与靶抗原接触。如果首先接触固相抗体，则所述测定被称为正向测定。相反地，如果首先接触溶液抗体，则所述测定被称为反向测定。如果靶标同时与两种抗体接触，则所述测定被称为同时测定。在将ASIC1a蛋白与本发明的抗ASIC1a抗体接触之后，将样品进行孵育，持续通常约10分钟到约24小时，并且通常约1小时。然后进行洗涤步骤，以去除样品中不与用作诊断试剂的本发明的抗ASIC1a抗体特异性地结合的组分。当固相和溶液抗体在单独的步骤中结合时，可以在任一个或两个结合步骤之后进行洗涤。洗涤之后，通常通过检测与固相连接的标记来对结合进行定量，其中所述连接借助于标记的溶液抗体的结合。通常，对于给定的抗体对或抗体群以及给定的反应条件，从含有已知浓度的靶抗原的样品中制备校准曲线。然后通过从校准曲线(即，标准曲线)中插值读取被测样品中的免疫反应性ASIC1a蛋白的浓度。可以通过平衡时结合的标记的溶液抗体的量或通过在达到平衡之前的一系列时间点对结合的标记溶液抗体的动力学测量来测量分析物。此类曲线的斜率是样品中的ASIC1a蛋白浓度的量度。
用于上述方法的合适支撑物包含例如硝化纤维素膜、尼龙膜和衍生化尼龙膜，以及颗粒，如琼脂糖、葡聚糖基凝胶、试纸、微粒、微球、磁性颗粒、试管、微量滴定孔、SEPHADEXTM(新泽西州皮斯卡塔韦安发玛西亚生物技术公司(Amersham PharmaciaBiotech,Piscataway N.J.))等。可以通过吸收或共价连接来进行固定。任选地，本发明的抗ASIC1a抗体可以与如生物素等连接子分子结合，以连接到如亲和素等表面结合连接子。
在一些实施方案中，本发明提供了与诊断剂缀合的抗ASIC1a抗体。所述诊断剂可以包括放射性或非放射性标记、造影剂(如用于磁共振成像、计算机断层扫描或超声)，并且放射性标记可以是γ-发射同位素、β-发射同位素、α-发射同位素、俄歇电子发射同位素、或正电子发射同位素。诊断剂是与抗体部分，即抗体或抗体片段或亚片段缀合施用的分子，并且通过定位含有抗原的细胞可用于诊断或检测疾病。
有用的诊断剂包含但不限于放射性同位素、染料(如具有生物素-链霉亲和素复合物)、造影剂、荧光化合物或分子及用于磁共振成像(MRI)的增强剂(例如，顺磁性离子)。美国专利6,331,175描述了MRI技术和与MRI增强剂缀合的抗体的制备，并且其通过引用以其整体并入本文。在一些实施方案中，诊断剂选自由放射性同位素、用于磁共振成像的增强剂和荧光化合物组成的组。为了用放射性金属或顺磁性离子装载抗体组分，可能需要使其与具有长尾的试剂反应，所述长尾用于连接多个供结合离子的螯合基团。此类尾可以是聚合物，如聚赖氨酸、多糖，或具有可以与螯合基团的侧基团结合的其它衍生化或可衍生化链，所述螯合基团例如为乙二胺四乙酸(EDTA)、二乙烯三胺五乙酸(DTPA)、卟啉、多胺、冠醚、双-缩氨基硫脲、聚肟及已知可用于此目的的类似基团。螯合物可以使用标准化学方法与本发明的抗体偶联。螯合物通常通过基团与抗体连接，所述基团能够在免疫反应性损失最小并且聚集，和/或在内部交联最小的情况下与分子形成键。美国专利4,824,659中公开了用于将螯合物与抗体缀合的其它方法和试剂。特别有用的金属螯合物组合包含与诊断同位素一起用于放射性成像的2-苄基-DTPA及其单甲基和环己基类似物。当与本发明的ASIC1a蛋白抗体一起使用时，相同的螯合物可在与如锰、铁和钆等非放射性金属复合的情况下用于MRI。
B.本发明的抗ASIC1a抗体的治疗用途
综述：在一些方面，本发明的抗ASIC1a抗体可用于本文所公开的方法中，所述方法提供了用于预防、改善或治疗缺血性中风和相关病症的疗法。
一方面，本发明提供了一种用于治疗有需要的受试者的缺血性中风的方法，所述方法包括：向所述受试者施用治疗有效量的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包括重链免疫球蛋白可变结构域(VH)和轻链免疫球蛋白可变结构域(VL)，其中所述VH包括：选自由以下序列组成的组中的VH-CDR1序列：SEQ ID NO:3、13、23、33、43和53；选自由以下序列组成的组中的VH-CDR2序列：SEQ ID NO:4、14、24、34、44和54；以及选自由以下序列组成的组中的VH-CDR3序列：SEQ ID NO:5、15、25、35、45和55；并且所述VL包括：选自由以下序列组成的组中的VL-CDR1序列：SEQ ID NO:8、18、28、38、48和58；选自由以下序列组成的组中的VL-CDR2序列：SEQ ID NO:9、19、29、39、49和59；以及选自由以下序列组成的组中的VL-CDR3序列：SEQ ID NO:10、20、30、40、50和60。
在一些实施方案中，所述VH包括VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3，并且所述VL包括VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3。在一些实施方案中，VHCDR1包括SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列，VHCDR2包括SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列，并且VHCDR3包括SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列；并且VLCDR1包括SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列，VLCDR2包括SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列，并且VLCDR3包括SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，VHCDR1包括SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列，VHCDR2包括SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列，并且VHCDR3包括SEQ IDNO:15所示的氨基酸序列；并且VLCDR1包括SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列，VLCDR2包括SEQID NO:19所示的氨基酸序列，并且VLCDR3包括SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，VHCDR1包括SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列，VHCDR2包括SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列，并且VHCDR3包括SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列；并且VLCDR1包括SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列，VLCDR2包括SEQ ID NO:29所示的氨基酸序列，并且VLCDR3包括SEQ IDNO:30所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，VHCDR1包括SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列，VHCDR2包括SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列，并且VHCDR3包括SEQ ID NO:35所示的氨基酸序列；并且VLCDR1包括SEQ ID NO:38所示的氨基酸序列，VLCDR2包括SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列，并且VLCDR3包括SEQ ID NO:40所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，VHCDR1包括SEQ ID NO:43所示的氨基酸序列，VHCDR2包括SEQ ID NO:44所示的氨基酸序列，并且VHCDR3包括SEQ ID NO:45所示的氨基酸序列；并且VLCDR1包括SEQ ID NO:48所示的氨基酸序列，VLCDR2包括SEQ ID NO:49所示的氨基酸序列，并且VLCDR3包括SEQ ID NO:50所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，VHCDR1包括SEQ ID NO:53所示的氨基酸序列，VHCDR2包括SEQID NO:54所示的氨基酸序列，并且VHCDR3包括SEQ ID NO:55所示的氨基酸序列；并且VLCDR1包括SEQ ID NO:58所示的氨基酸序列，VLCDR2包括SEQ ID NO:59所示的氨基酸序列，并且VLCDR3包括SEQ ID NO:60所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述VH包括选自由SEQ ID NO:2、12、22、32、42和52所示序列组成的组中的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述VL包括选自由SEQ ID NO:7、17、27、37、47和57所示序列组成的组中的氨基酸序列。
一方面，本发明提供了减轻有需要的受试者的缺血性中风的一种或多种症状的方法，所述方法包括：向所述受试者施用治疗有效量的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包括重链免疫球蛋白可变结构域(VH)和轻链免疫球蛋白可变结构域(VL)，其中所述VH包括：选自由以下序列组成的组中的VH-CDR1序列：SEQ ID NO:3、13、23、33、43和53；选自由以下序列组成的组中的VH-CDR2序列：SEQ ID NO:4、14、24、34、44和54；以及选自由以下序列组成的组中的VH-CDR3序列：SEQ ID NO:5、15、25、35、45和55；并且所述VL包括：选自由以下序列组成的组中的VL-CDR1序列：SEQ ID NO:8、18、28、38、48和58；选自由以下序列组成的组中的VL-CDR2序列：SEQ ID NO:9、19、29、39、49和59；以及选自由以下序列组成的组中的VL-CDR3序列：SEQ ID NO:10、20、30、40、50和60。
在一些实施方案中，所述VH包括VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3，并且所述VL包括VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3。在一些实施方案中，VHCDR1包括SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列，VHCDR2包括SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列，并且VHCDR3包括SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列；并且VLCDR1包括SEQ ID NO:中所示的氨基酸序列，VLCDR2包括SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列，并且VLCDR3包括SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，VHCDR1包括SEQ IDNO:13所示的氨基酸序列，VHCDR2包括SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列，并且VHCDR3包括SEQID NO:15所示的氨基酸序列；并且VLCDR1包括SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列，VLCDR2包括SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列，并且VLCDR3包括SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，VHCDR1包括SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列，VHCDR2包括SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列，并且VHCDR3包括SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列；并且VLCDR1包括SEQ IDNO:28所示的氨基酸序列，VLCDR2包括SEQ ID NO:29所示的氨基酸序列，并且VLCDR3包括SEQID NO:30所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，VHCDR1包括SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列，VHCDR2包括SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列，并且VHCDR3包括SEQ ID NO:35所示的氨基酸序列；并且VLCDR1包括SEQ ID NO:38所示的氨基酸序列，VLCDR2包括SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列，并且VLCDR3包括SEQ ID NO:40所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，VHCDR1包括SEQ ID NO:43所示的氨基酸序列，VHCDR2包括SEQ ID NO:44所示的氨基酸序列，并且VHCDR3包括SEQ ID NO:45所示的氨基酸序列；并且VLCDR1包括SEQ ID NO:48所示的氨基酸序列，VLCDR2包括SEQ ID NO:49所示的氨基酸序列，并且VLCDR3包括SEQ ID NO:50所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，VHCDR1包括SEQ ID NO:53所示的氨基酸序列，VHCDR2包括SEQ ID NO:54所示的氨基酸序列，并且VHCDR3包括SEQ ID NO:55所示的氨基酸序列；并且VLCDR1包括SEQ ID NO:58所示的氨基酸序列，VLCDR2包括SEQ ID NO:59所示的氨基酸序列，并且VLCDR3包括SEQ ID NO:60所示的氨基酸序列。
一方面，本发明提供了一种用于治疗有需要的受试者的缺血性中风的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包括：(a)轻链免疫球蛋白可变结构域序列，所述轻链免疫球蛋白可变结构域序列与SEQ ID NO:7、17、27、37、47或57中的任一个的轻链免疫球蛋白可变结构域序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％同一性；和/或(b)重链免疫球蛋白可变结构域序列(VH)，所述VH与SEQ ID NO:2、12、22、32、42或52中的任一个的重链免疫球蛋白可变结构域序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％同一性。
在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段与ASIC1a蛋白结合。在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段与ASIC1a的胞外结构域结合。在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段与跨越两个ASIC1a亚基的表位结合。在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段抑制ASIC1a三聚体的功能。
在一些实施方案中，缺血性中风的一种或多种症状为突然虚弱无力；面部、手臂或腿部，尤其是身体的一侧麻痹或麻木；面部一侧下垂；思维混乱；说话困难，如口齿不清，或理解言语困难；一只或两只眼睛看东西困难，如视力模糊或变暗，或一只或两只眼睛复视；呼吸问题；眩晕；行走困难；失去平衡或协调，导致例如不明原因的跌倒；意识丧失以及突发或剧烈头痛。在一些实施方案中，缺血性中风的一种或多种症状选自由以下组成的组：突然发作的面部虚弱无力(如面部一侧下垂)、手臂垂落和异常言语。
在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段是抗体、scFv、(scFv)2、Fab、Fab'、F(ab')2或scFv-Fc抗体。在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段是scFv抗体。在一些实施方案中，所述scFv抗体是ASC01、ASC02、ASC03、ASC04、ASC05或ASC06。
因此，例如，本发明的一种或多种抗ASIC1a抗体可以：(1)与其它活性剂或本发明的抗ASIC1a抗体共同配制，并单独或以组合制剂的形式同时施用或递送；(2)作为单独的制剂通过交替或平行方式递送；或(3)通过本领域已知的任何其它组合疗法方案使用。当以交替疗法递送时，本文所描述的方法可以包括例如以单独溶液、乳液、悬浮液、片剂、丸剂或胶囊形式，或通过不同注射液以单独注射的形式顺序地施用或递送活性成分。通常，在交替疗法期间，每种活性成分的有效剂量是顺序地(即，连续地)施用的，而在同时疗法中，两种或更多种活性成分的有效剂量是一起施用的。也可使用间歇性组合疗法的各种顺序。当以治疗有效量施用于患有医学疾病或病症并且需要治疗的受试者时，施用本发明的抗ASIC1a抗体和其它活性剂的组合可以产生协同生物学效应。此类方法的优点在于，预防、改善受试者的缺血性中风或治疗患有或易患缺血性中风的受试者，可以使用较低剂量的本发明抗ASIC1a抗体和/或其它活性剂。进一步地，通过使用较低剂量的本发明的抗ASIC1a抗体和/或其它活性剂，可以避免治疗的潜在副作用。
本文所描述的本发明的抗ASIC1a抗体如ASC01、ASC02、ASC03、ASC04、ASC05、ASC06等可用于预防或治疗疾病。具体地，本发明提供了对患有或易患缺血性中风的受试者的预防和治疗方法。因此，本发明提供了对患有或易患缺血性中风的受试者的预防和/或治疗方法，所述通过向受试者施用有效量的本发明的抗ASIC1a抗体来恢复突变体离子通道蛋白三聚体的功能。本发明通过向有需要的受试者施用治疗有效量的如本文所公开的抗ASIC1a抗体，如ASC01、ASC02、ASC03、ASC04、ASC05、ASC06等来提供对哺乳动物中患有或易患缺血性中风的受试者的治疗。
本发明的抗ASIC1a抗体的生物学效应的确定：
在各个实施方案中，进行了适合的体外或体内测定，以确定基于本发明的抗ASIC1a抗体的特定治疗效果，以及确定其施用是否具有治疗效果。在各个实施方案中，可以用代表性细胞系CHO-K1细胞，如本文所公开的CHO-K1/hASIC1a(过表达全长hASIC1a的稳定细胞系)进行体外测定。这些实验可以用于确定本发明的给定抗ASIC1a抗体是否在抑制ASIC1a蛋白三聚体的活性方面发挥了期望的效果。可以在人类受试者测试之前，在合适的动物模型系统中测试用于治疗的化合物，所述动物模型系统包含但不限于大鼠、小鼠、鸡、牛、猴、兔等。类似地，对于体内测试，可以在施用于人类受试者之前使用本领域中已知的任何动物模型系统。
在一些实施方案中，ASIC1a活性通过本领域中众所周知的测试来确定，包含但不限于电生理测定，如膜片钳，如本文所公开的。在一些实施方案中，ASIC1a活性通过测量动物模型中的生物活性来确定。在一些实施方案中，ASIC1a活性通过测量动物模型的疾病表型的拯救来确定，所述动物模型包含但不限于本文所公开的小鼠大脑中动脉闭塞(MCAO)诱导的缺血性中风模型。
施用模式和有效剂量
可以采用本领域技术人员已知的用于使细胞、器官或组织与本发明的免疫球蛋白相关组合物接触的任何方法。合适的方法包含体外、离体或体内方法。体内方法通常包含将免疫球蛋白相关组合物，如上文所描述的免疫球蛋白相关组合物，施用于哺乳动物，合适的人。当使用体内方法用于治疗时，将本发明的抗ASIC1a抗体以有效量(即，具有期望的治疗效果的量)施用于受试者。剂量和给药方案将取决于受试者的症状的程度、所使用的特定免疫球蛋白的特性，例如，其治疗指数、受试者和受试者病史。
有效量可以通过内科医师和临床医生所熟悉的方法在临床前试验和临床试验期间确定。可用于所述方法的有效量的免疫球蛋白可以通过用于施用药物化合物的多种众所周知的方法中的任一种施用于有需要的哺乳动物。免疫球蛋白可以全身或局部施用。
C.试剂盒
本发明提供了一种用于检测和/或治疗缺血性中风的试剂盒，所述试剂盒包括至少一种本发明的免疫球蛋白相关组合物(例如，本文所描述的任何抗体或抗原结合片段)或其功能变体(例如，取代型变体)。任选地，本发明的试剂盒的上述组分被包装在合适的容器中并贴上标记，以用于缺血性中风的诊断和/或治疗。上述组分可以以用于重构的水溶液，优选无菌溶液；或以冻干，优选无菌制剂的形式储存在单位或多剂量容器，例如密封安瓿、小瓶、瓶子、注射器和试管中。试剂盒可以进一步包括第二容器，所述第二容器容纳适用于将药物组合物稀释到更高体积的稀释剂。合适的稀释剂包含但不限于药物组合物的药学上可接受的赋形剂和盐水溶液。此外，试剂盒可以包括用于稀释药物组合物的说明书和/或用于施用药物组合物(无论稀释与否)的说明书。所述容器可以由如玻璃或塑料等各种材料形成，并且可以具有无菌接入端口(例如，容器可以是静脉内溶液袋或具有可以通过皮下注射针刺穿的塞子的小瓶)。试剂盒可以进一步包括更多个容器，所述更多个容器包括药学上可接受的缓冲液，如磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液和右旋糖溶液。试剂盒可以进一步包含从商业和用户的观点来看合乎期望的其它材料，包含其它缓冲液、稀释剂、过滤器、针、注射器、用于合适的宿主中的一种或多种宿主的培养基。试剂盒可以任选地包含说明书，所述说明书通常包含在治疗或诊断产品的商业包装中，其含有关于此类治疗或诊断产品的使用的适应症、用法、剂量、制造、施用、禁忌症和/或警告的信息。
所述试剂盒可用于检测生物样品中的免疫反应性ASIC1a蛋白的存在，所述生物样品例如任何体液，包含但不限于例如血清、血浆、淋巴、囊液、尿液、粪便、脑脊液、腹水或血液，以及包含身体组织的活检样品。例如，试剂盒可以包括：能够与生物样品中的ASIC1a蛋白结合的本发明的一种或多种人源化、嵌合或双特异性抗ASIC1a抗体(或其抗原结合片段)；用于确定样品中的ASIC1a蛋白量的配置；以及用于将样品中的免疫反应性ASIC1a蛋白的量与标准参照进行比较的配置。可以标记一种或多种抗ASIC1a抗体。试剂盒组分(例如，试剂)可以包装在合适的容器中。试剂盒可以进一步包括使用试剂盒检测免疫反应性ASIC1a蛋白的说明书。
对于基于抗体的试剂盒，所述试剂盒可以包括，例如，1)第一抗体，例如，连接到固体支撑物的本发明的人源化或嵌合抗ASIC1a抗体(或其抗原结合片段)，所述第一抗体与ASIC1a蛋白结合；以及任选地2)不同的第二抗体，其与ASIC1a蛋白或与第一抗体结合，并且与可检测标记缀合。
所述试剂盒还可以包括例如缓冲剂、防腐剂或蛋白质稳定剂。试剂盒可以进一步包括用于检测可检测标记所需的组分，例如，酶或底物。试剂盒还可以含有可以进行测定并且与测试样品进行比较的对照样品或一系列对照样品。试剂盒的每种组分可以封装在单独的容器内，并且所有容器可以连同解释使用所述试剂盒进行的测定的结果的说明书一起在单独的包装内。本发明的试剂盒可以在试剂盒容器上或在其中含有书面产品。书面产品描述了如何使用试剂盒中含有的试剂，例如，用于体外或体内检测ASIC1a蛋白，或用于治疗有需要的受试者的缺血性中风。在某些实施方案中，试剂的使用可以根据本发明的方法进行。
实施例
通过以下实施例进一步展示本发明，所述实施例不应被解释为以任何方式进行限制。对于以下每一个实施例，可以使用任何免疫结合剂，如本文所描述的IgG、IgM、IgA、IgD、IgE和经基因修饰的IgG以及其片段。通过举例的方式而非以限制方式，以下实施例中使用的scFv或IgG1抗体可以是ASC01、ASC02、ASC03、ASC04、ASC05或ASC06等。
实施例1：材料与方法
试剂和缩写：所有试剂均购自Sigma或按照最高分析等级另行说明。重组蛋白符号的使用格式为：物种(例如，人、小鼠、大鼠等)首字母的斜体小写字母用作符号中的第一个字母，后跟基因名称(例如，hASIC1a代表hASIC1a蛋白)。根据淘选结果，抗体被任意编号，如ASC00。带有或不带有“-IgG1”符号的任意数字分别表示scFv形式的抗体与Fc或全长IgG1(IgG1)融合。
细胞培养：将CHO-K1细胞系(#CRL-9618；ATCC)维持在含有10％(vol/vol)FBS(#1600074；Gibco)的F-12k培养基(#21127022；Gibco)中，而在FreeStyle293表达培养基(#12338026；ThermoFisher Scientific)中培养FreeStyle 293F(#R79007；ThermoFisherScientific)细胞系。在27℃下在ESF921培养基(#96-001-01；Expression Systems)中培养草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)9(Sf9)细胞(#12659017；Thermo-FisherScientific)。将从E18天龄的C57 BL/6小鼠或ASIC1a-/-小鼠中解剖的原代皮质神经元维持在补充有B27(#17504044；Gibco)和Glutamx I(35050061；Gibco)的神经基础培养基(21103049；Gibco)中。过表达全长hASIC1a(1-528个氨基酸)通道的CHO-K1/hASIC1a稳定细胞系通过如下方式产生：构建具有C端eYFP融合或C端mCherry融合的全长hASIC1a的cDNA，并将其克隆到表达pCDNA3.1-Neo的载体中，并且使用Lipofectin 2000将其转染到CHO-K1细胞中。通过抗生素，即遗传霉素(至多1mg/mL)选择CHO-K1/hASIC1a稳定细胞系，并通过融合的荧光蛋白eYFP(λex＝488nm；λem＝528nm)或mCherry荧光(λex＝587nm；λem＝610nm)使用流式细胞术进行验证。当在存在200μg/mL遗传霉素的情况下培养持续30天时，80％以上的阳性细胞存活。基于eYFP(6H7细胞系)和mCherry(4C12细胞系)的表达使用流式细胞术仪器(BD FACSAria III)对克隆稳定品系进行分选，并使用补充有10％(vol/vol)FBS和200μg/mL遗传霉素的F-12K培养基对所述克隆稳定品系进行扩增。hASIC1a特异性单克隆抗体，即ASC06用于进一步确认hASIC1a的过表达。
重组截短的hASIC1a的纯化：将编码截短hASIC1a(ΔhASIC1a)的cDNA与N端Flag-标签融合之后，克隆到pEG-BacMam表达载体(Howard Hughes Medical Institute，OregonHealth and Science University，Portland，OR的Eric Gouaux提供)中。然后使用BacMam系统在HEK293F细胞中异源表达ΔhASIC1a蛋白。Goehring等人,《自然实验手册(NatProtoc)》9:2574-2585(2014)。简而言之，将pEG BacMam-ΔhASIC1a构建体转化到DH10Bac大肠杆菌细胞(ΔhASIC1a杆粒)中。然后使用FuGENE转染试剂(Promega)将所得杆粒转染到Sf9细胞中以获得P3杆状病毒(扩增两次)。在37℃下，在1:25(病毒:细胞)的感染复数(MOI)下通过杆状病毒感染HEK293F细胞(每mL 2×106个细胞)持续24小时。在37℃下在，存在2mM丁酸钠的情况下孵育经感染的细胞48小时，以促进靶蛋白的表达。通过以每1分钟2,000×g离心采集细胞。
除非另有规定，否则在冰上执行以下步骤。首先将2L培养物中的细胞沉淀物重新悬浮于100mL的补充有蛋白酶抑制剂混合物(每50mL一片；Roche)的低渗缓冲液(10mMTris，pH 7.5，10mM MgCl2，20mM KCl)中。使用Dounce匀浆器(Dounce homogenizer)研磨细胞，并以80,000×g离心40分钟。重复所述过程一次后，将所得沉淀物重新悬浮于100mL高渗缓冲液(10mM Tris，pH7.5，10mM MgCl2，20mM KCl，1M NaCl)中，均质化并离心。再重复此程序一次。然后将所得沉淀物混合，并在含有蛋白酶抑制剂的50mL低渗缓冲液中用2mg/mL碘乙酰胺混合并处理30分钟。在细胞裂解缓冲液(100mM Tris，pH 7.5，1.6M NaCl，1％正十二烷基b-D-吡喃麦芽糖苷(DDM)、0.2％胆固醇琥珀酸单酯(CHS))中4℃温和搅拌3小时，提取重组ΔhASIC1a蛋白。在15,000×g下离心30分钟后，将上清液与抗FLAG M2磁珠(#M8823；Sigma)在温和搅拌下一起孵育过夜。用缓冲液A(50mM Tris，pH 7.5，800mM NaCl，10％甘油，0.1％DDM，0.02％CHS，10mM MgCl2)和缓冲液B(25mM Tris，pH 7.5，800mM NaCl，10％甘油，0.05％DDM，0.01％CHS)洗涤磁珠一次。使用补充有0.1mg/mL Flag肽的缓冲液B洗脱ΔhASIC1a蛋白，浓缩，使用SEC在Superdex 200柱(GE Heathcare)上进一步纯化并且浓缩以产生60μL的15mg/mL储备溶液。如在图12A中示出的，通过SDS-PAGE分析判断，所得同质ΔhASIC1a的纯度>90％。
hASIC1a通道的纳米盘组装：为了模拟细胞膜的脂质双层环境，通过将ΔhASIC1a蛋白与膜支架蛋白(MSP)和1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DMPC)以3:2:65的摩尔比混合，来将纯化的ΔhASIC1a蛋白掺入到脂质纳米盘中。通过用生物珠SM2温和搅拌(生物珠:DDM＝10:1(wt/wt)；Bio-Rad0)过夜来去除相关洗涤剂。使用Flag肽特异性磁珠将ΔhASIC1a嵌入的纳米盘与未组装的纳米盘分离。D'Antona等人,《生物化学(Biochemistry)》53:127-134(2014)。使用Superose 6柱(GE Heathcare)在含有20mM Tris、pH 7.5和150mMNaCl的缓冲液中进一步纯化并收集期望的ΔhASIC1a纳米盘组装体。在未添加ΔhASIC1a的情况下包装空纳米盘。通过SDS-PAGE、EM和动态光散射分析组装的ΔhASIC1a纳米盘的组成(图9A-C、12A、12B)。
基于差异富集的组合抗体库筛选：在对固定在链霉亲和素涂覆的磁珠(#21925；Pierce)上的生物素化ΔhASIC1a纳米盘进行三轮亲和富集后，从组合人单克隆scFv抗体噬菌体库(1011多样性)中选择hASIC1a特异性scFv抗体。使用经改进的程序进行噬菌体抗体库淘选。Xu等人,《分子神经科学前沿(Front Mol Neurosci)》10:298(2017)。简而言之，在每个循环中富集与抗原(ΔhASIC1a纳米盘)结合的噬菌粒(显示抗体库)并用甘氨酸-HCl(pH2.2)洗脱。XL1-蓝色细胞用于表达和扩增下一轮淘选的输出噬菌体。为了使非特异性富集最小化，使用差异富集噬菌体展示选择，其中在第二和第三个循环中，使用过量的空纳米盘(其量为ΔhASIC1a纳米盘的量的两倍)去除非特异性噬菌体，之后对ΔhASIC1a纳米盘进行淘选。在三次反复后，选择96个阳性菌落，并通过噬菌体ELISA进行分析。Xu等人,《分子神经科学前沿》10:298(2017)。对所有阳性克隆进行测序。使用国际免疫遗传学信息平台(international ImMunoGeneTics information platform)分析CDR3结构域的DNA和蛋白质序列。在对CDR3序列进行比对后，构建了系统发生树。六个独特的scFv序列高度富集。
抗体的表达和纯化：将编码候选scFv序列的基因克隆到经修饰的pFUSE表达载体(#pfuse-hg1fc2；Invivogen)中，以获得scFv-Fc融合蛋白，其中Fc为构成人IgG1的整个Fc结构域。对于全长IgG1抗体，将来自scFv载体的重链可变区(VH结构域)和轻链可变区(VL结构域)分别克隆到具有完整恒定重链结构域(CH1、CH2和CH3)和完整恒定轻链结构域(CL)的质粒中。将用scFv-Fc载体转染或与等摩尔的重链载体和轻链载体共转染的HEK293F细胞培养持续4天。离心之后，使用HiTrap蛋白A HP柱(#17-0403-03；GE Healthcare)与pH为3.4的柠檬酸盐洗脱缓冲液在
Figure BDA0003558876390000503
100(GE Healthcare)上纯化分泌到培养基中的scFv-Fc或全长IgG1抗体。然后将经纯化的抗体浓缩(15mg/mL)并在-80℃下储存在pH为7.4的PBS缓冲液中。如在图12D中示出的，SDS-PAGE分析示出，经纯化的单链和全长抗体的纯度为至少90％。
阴性染色电子显微镜(EM)：(1)样品制备和数据收集：通过用木瓜蛋白酶消化ASC06-IgG1，随后进行蛋白A亲和纯化和凝胶过滤，制备ASC06-IgG1的抗原结合片段(ASC06-Fab)。在HEK293F细胞中表达N端融合有IL-2标签和Flag标签的hASIC1a(hASIC1a-ECD)的胞外结构域，并通过抗Flag M2磁珠进行纯化，并且使用pH为7.4的PBS缓冲液进行凝胶过滤。在4℃下，将ASC06-Fab和hASIC1a-ECD以3:1的摩尔比在pH为7.4的PBS缓冲液中孵育过夜，以形成三级复合物。通过凝胶过滤进一步分离此复合物。如在图14中示出的，所述复合物形成了可与单独的ASC06-Fab和单独的hASIC1a-ECD两者区分开的明显的峰。收集含有此复合物的峰，并进行EM阴性染色。
通过将经纯化的hASIC1a-ECD和ASC06-Fab的复合物稀释至0.01mg/mL来制备EM样品。然后，将4μL样品液滴，在由薄且连续的碳膜(#BZ31024a；北京中镜科仪技术有限公司(Beijing Zhongjingkeyi Technology))覆盖的新辉光放电的铜网格上吸收持续1分钟。用两滴去离子水洗涤网格，随后用两滴0.75％(wt/vol)甲酸铀酰(#22450；电子显微镜科学公司(Electron Microscopy Sciences))对网格进行阴性染色持续1分钟，之后用滤纸吸干，然后风干。
用Tecnai G2 Spirit透射电子显微镜(FEI)记录所有显微照片，所述FEI配备有在120kV下操作的LaB6阴极，和4,000×4,000Eagle CCD相机，所述相机的校准放大倍率为67,000倍，导致像素大小为
Figure BDA0003558876390000501
EM图像处理和3D重建：Scipion软件套件用于所有图像处理步骤。de la Rosa-Trevín等人,《结构生物学杂志(J Struct Biol)》157:38-46(2016)。所有记录的显微照片首先被抽取两倍(导致像素大小为
Figure BDA0003558876390000502
)。然后，使用96×96像素的方框大小，用EMAN2Boxer函数从100张显微照片中手动选择总共5,064个颗粒。Tang等人,《结构生物学杂志》157(1):38-46(2007)。使用Xmipp CL2D函数生成无参考2D类平均值分析。de la Rosa-Trevín等人,《结构生物学杂志》184:321-328.(2013)。
分子动力学模拟：呈Fab格式的hASIC1a和ASC06的模型是通过使用Swiss Model网站通过同源性推导得出的。Biasini等人,《核酸研究》42:W252-W258(2014)。ASIC1a蛋白的模板是从截短的鸡肉蛋白的结构中获得的[蛋白质数据库(PDB)ID代码4FZ0]。为了将阴性染色结果与可能的原子模型进行比较，首先使用ClusPro 2.0服务器和抗体对接模式生成了Fab与hASIC1a的ECD(仅保留残基73-425)的一系列不同的可能对接。Comeau等人,《生物信息学(Bioinformatics)》28:2608-2614SR(2004)；以及Brenke等人,《生物信息学》28(20):2608-14(2012)。然后再选择八个Fab与hASIC1a的ECD的对接，所述hASIC1a的几何形状与阴性染色所描述的几何形状更相容，并且进行能量最小化，随后进行20ns分子动力学模拟以放松相互作用并稳定复合物的结构。在此程序之后，只有一个模型似乎满足在阴性染色实验中观察到的整体几何形状。使用Gromacs 4.6.7包和Amber14ffSB力场进行模拟。Pronk等人,《生物信息学》29:845-854(2013)；以及Lindorff-Larsen等人,《蛋白质(Proteins)》78:1950-1958(2010)。所有系统均用含有约0.15M Cl-和K+离子的全原子TIP3P水进行溶剂化，以模拟生理离子强度。
使用Berendsen恒温器和恒压器，将温度T和压力P分别保持恒定在300K和1atm。Berendsen等人,《化学物理学杂志(J Chem Phys)》81:3684-3690(1984)。使用快速平滑的颗粒网格Ewald求和进行长程静电相互作用，其中直接相互作用的截止值为1.0nm。Darden等人,《化学物理学杂志》98:10089-10093(1993)。
如在图12A中示出的，从与ASIC1a三聚体复合并填充有91DMPC分子的MSP1蛋白(PDB ID代码2MSC)的晶体结构开始获得插入在纳米盘中的ASIC1a的模型。
ELISA测定：在碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液中(#C3041；Sigma)，将亲和素(#21121；Pierce)稀释至2ng/μL的最终浓度。使用所得亲和素溶液涂覆96孔板(每孔25μL)，4℃下过夜。用含有0.05％Tween-20的磷酸盐缓冲溶液(PBST)洗涤(每孔150μL)经涂覆的板一次，随后在37℃下在每个孔中添加25μL生物素化ΔhASIC1a纳米盘溶液(2ng/μL)并孵育1小时。单独的PBST缓冲液和空纳米盘溶液(2ng/μL)分别用作背景和阴性对照。在去除孵育溶液后，使用PBST缓冲液冲洗所得板一次，并在PBST中与含有5％(vol/vol)牛奶(每孔150μL)的封闭溶液一起37℃孵育1小时。在封闭和PBST洗涤(一次)后，向每个孔中添加25μL scFv-Fc抗体溶液(在含有1％(vol/vol)牛奶的PBST中为10μg/mL)，并在37℃下孵育1小时。在进行HRP检测之前，使用PBST将所得板冲洗八次。将含有山羊抗人Fc HRP缀合的第二抗体(稀释比例1:5,000；#A0170；Sigma)和抗M13 HRP缀合的第二抗体(稀释比例1:5,000；#27-9421-01；GE/Amersham/Whatman)的溶液添加到上述板(每孔50μL)中并在37℃下孵育1小时。然后将板用PBST洗涤八次，随后向每个孔中添加50μL 2,2'-联氮基双[3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸]二铵盐溶液(#11684302001；Roche)。在室温下孵育20分钟后，在酶标仪(Enspire；珀金埃尔默公司(PerkinElmer))上测量每个孔中405nm处的吸收变化。
亲和力测定：使用表面等离子体共振(SPR)和流式细胞术研究单克隆抗体与hASIC1a之间的相互作用。在Biacore T200(GE Healthcare)上进行SPR结合研究。抗Flag抗体是与生物传感器芯片CM5系列S(GE Healthcare)的表面偶联的胺。然后将重组Flag标记的ΔhASIC1a固定到芯片表面上。将连续稀释的抗体ASC06-IgG1(1nM、5nM、10nM、50nM、100nM)施加于含有25mM HEPES、500mM NaCl、0.05％EDTA和0.05％DDM的运行缓冲液(pH7.4)中。结合/解离动力学被测量为SPR信号共振单元的变化。使用Biacore T200评估软件与单循环动力学模型计算表观结合亲和力。
在流式细胞术结合实验中，收集表达ASIC1a-eYFP的稳定细胞(6H7)，并将其重新悬浮于冰冷的FACS缓冲液(PBS，0.05％BSA，2mM EDTA)中。然后，在4℃下将等量的6H7细胞(每管50,000个细胞)与不同浓度的ASC06-IgG1一起孵育20分钟，用1mL冰冷的FACS缓冲液洗涤，离心，并且将沉淀物重新悬浮于100μL冰冷的FACS缓冲液中，所述缓冲液含有可识别人Fc的Alexa555缀合的第二抗体(1:800(vol/vol)稀释比；Life Technology)。在4℃下孵育15分钟后，将细胞洗涤两次并重新悬浮于FACS缓冲液中。在流式细胞仪(CytoFLEX S；Beckman Culter)上对细胞进行分选和分析以测定抗体与过表达hASIC1a的稳定细胞系的相对结合水平。记录并分析eYFP阳性细胞中的Alexa555的平均荧光强度以计算抗体的表观结合亲和力。
使用免疫细胞化学(ICC)进行细胞膜共定位研究：将细胞(CHO-K1)以每mL 2×105个细胞的浓度接种于聚D-赖氨酸涂覆的玻璃底24孔板上。培养12小时后，通过Lipofectin3000试剂用ASIC质粒转染CHO-K1细胞。在转染后二十四小时，将细胞固定在4％多聚甲醛中，并在封闭溶液(含5％山羊血清的PBS)中孵育30分钟。在4℃下将所得细胞与2μg/mLASC06-IgG1一起孵育过夜，随后进行三次PBS洗涤，每次持续5分钟，并与Alexa555缀合的山羊抗人第二抗体(Life Technology)一起孵育。在三次另外的PBS洗涤(每次洗涤5分钟)后，用DAPI(#10236276001；Roche)对细胞核进行染色。在25℃下，在激光扫描共聚焦显微镜(蔡司(ZEISS)LSM710)上进行ICC分析，所述显微镜具有63×N.A.1.4物镜。图像收集在1,024×1,024像素的EM-CCD相机上。用ZEN 2012专业软件进行数据采集和分析。
电生理实验：通过膜片钳放大器(Axon 200B；Axon仪器(Axon Instruments))使用标准全细胞记录技术从单个细胞记录向内细胞ASIC1a电流。使用Digidata1320A接口和带有Clampex和Clampfit软件(版本9.0.1；Axon仪器)的个人计算机对膜电流进行采样和分析。对于典型实验，使用的胞外液(ECF)含有150mM NaCl、5mM KCl、10mM HEPES、10mM D-葡萄糖、2mM CaCl2和1.0mM MgCl2，其中渗透压范围为320-335mOsm，并且用5m NaOH调整的pH为7.4。贴片电极(4-6MΩ)在300mOsm下含有30mM NaCl、120mM KCl、0.5mM CaCl2、1mMMgCl2、10mM HEPES、2mM MgATP和5mM EGTA(用5M KOH调整的pH为7.2)。激活ASIC1a的ECF与正常ECF相同，除了使用MES代替HEPES以将ECF维持在pH 6.0之外。在由安装在倒置显微镜上的ALA 8通道灌注系统(ALA科学仪器公司(ALA Scientific Instruments Inc.))产生的恒定灌注(约2-3毫升/分钟)下，将表面上分散分布单独CHO-ASIC1a稳定细胞(6H7)的盖玻片置于记录室中。在实现磨合(全细胞)配置后，细胞被电压钳制在-70mV的保持电位下。首先将正常的ECF(pH 7.4)灌注到贴片的细胞上，并且然后迅速施加pH为6.0的激活ECF以引发最大向内ASIC1a电流作为控制电流。当测试抗体的抑制效果时，将pH为7.4的含有不同浓度ASC06-IgG1的ECF从低到高浓度灌注到记录室中持续10-15分钟。为了测量对电流的抑制，将含有对应浓度的测试抗体的pH为6.0的激活ECF施加到同一贴片的6H7细胞上以产生可以相对于同一细胞的控制电流归一化的向内电流。浓度分别为30μM和100nM的小分子抑制剂阿米洛利(#S1811；Selleck)和毒液肽PcTx1(#4435s；Peptide Institute)用作抑制ASIC1a电流的阳性对照。从四到五个细胞获得的数据用于抑制效果的统计计算。
为了测量稳态脱敏(SSD)，调节ECF的pH被调整为7.6、7.4、7.2、7.0和6.8(在HEPES缓冲液中)，而将激活ECF维持在pH 6.0(在MES缓冲液中)。为了测量6H7稳定细胞中hASIC1a的pH激活，将调节ECF固定在pH 7.6(在HEPES缓冲液中)，并将激活ECF的pH调整为7.4、7.2、7.0、6.8、6.5、6.3和6.0。当稳定的细胞系6H7在存在和不存在300nM ASC06-IgG1的情况下被贴片时，记录hASIC1a电流。计算并绘制以传感图上最大振幅分数表示的相对电流(I/Imax)以构成SSD和pH激活曲线。每个数据点代表至少五个贴片的细胞的平均值。
钙流入：FLIPR钙5测定试剂盒(The FLIPR Calcium 5Assay kit)用于测定表达hASIC1a-mCherry的稳定CHO-K1细胞(4C12)中酸诱导的钙流入。在测定前24小时，以每孔10,000个细胞的密度将细胞接种于透明底96孔板中。根据制造商的说明书制备测定缓冲液和染料装载缓冲液(1.26mM CaCl2、0.5mM MgCl2、0.4mM MgSO4、5.33mM KCl、0.44mM KH2PO4、4.17mM NaHCO3、138mM NaCl、0.338mM Na2HPO4、20mM HEPES，pH 7.4)。使用前立即将丙磺舒添加到染料装载缓冲液中以达到2.5mM的最终浓度。在37℃下将50微升含有ASC06-IgG1的测定缓冲液与4C12细胞一起孵育30分钟，并添加等体积的染料装载缓冲液。阿米洛利以及PcTx1和同种型抗体分别用作阳性对照和阴性对照。在FDSS/μCELL酶标仪(Hamamatsu)上读取之前，将细胞与染料装载缓冲液一起孵育1小时。以50微升/秒的速度向细胞中添加100μL的pH为6.0的激活缓冲液(与测定缓冲液相同的组合物；pH调整为6.0)。在添加激活缓冲液(预读)前10秒和添加后170秒，在FDSS/μCELL(激发波长：480nm；发射波长：540nm)FLIPR读取器上连续记录在每个孔中产生的钙信号的进展曲线。为了测定ASC06-IgG1在抑制ASIC1a介导的电流中的IC50值，将ASC06-IgG1的1:3连续稀释施加于4C12细胞，每种浓度重复六次。
酸中毒诱导的细胞死亡：处理前1天，将hASIC1a-eYFP稳定细胞(6H7)和CHO-K1细胞以每孔10,000个细胞的密度接种于96孔板中。使用pH为5.5、6.0和7.4的ECF溶液在37℃下处理细胞持续6小时。为了测试ASC06-IgG1的拯救效果，将抗体溶解在酸性ECF(pH 5.5)中以使最终抗体浓度为0、50、100、300、500和1,000nM。首先在37℃下在对应浓度下将6H7细胞与抗体在细胞培养基中一起预孵育30分钟。在用对应的酸性ECF替换细胞培养基后，将细胞在37℃下孵育6小时，用PBS缓冲液(pH 7.4)洗涤，并且然后在1％FBS DMEM/F-12K培养基中培养过夜。使用LDH测定试剂盒(#88953；Thermo Fisher Scientific)收集过夜培养物的上清液以进行LDH释放测量。使用CCK-8测定试剂盒(#CK04；Dojindo)测定细胞活力。
大脑中动脉闭塞(MCAO)模型：动物护理和实验方案由中国上海交通大学医学院动物伦理委员会(Animal Ethics Committee of Shanghai Jiao Tong University Schoolof Medicine,Shanghai,China)批准。在再灌注前，使用大脑中动脉闭塞(MCAO)持续1小时，在雄性小鼠(C57 BL/6,20-25g)中建立左脑半球的短暂性缺血性中风。缺血后3小时，在不存在或存在神经保护剂的情况下，通过脑室内(i.c.v.)注射在脑半球的对侧施用总共4μL的媒剂溶液(PBS)、100nM PcTx1或3.0μg/μL无内毒素ASC06-IgG1(20μM)。使用无关的无内毒素抗体(3.0μg/μL，20μM)作为同种型对照。通过经颅激光多普勒监测脑血流，以确保成功诱导缺血。脑室内注射后24小时处死小鼠。快速解剖小鼠脑，并将其横切成连续间隔切片，随后用2％活性染料2,3,5-三苯基四唑盐酸盐(TTC)染色。通过从非缺血半球的面积减去缺血半球中用TTC染色的正常面积来计算梗死面积。通过将所有区段的梗死面积相加并乘以切片厚度来计算梗死体积。
数据分析：除非另有说明，否则结果表达为平均值±SD。使用OriginPro 2017统计软件，通过单向ANOVA执行数据分析。在P值<0.05时假设显著性。
实施例2：使用纳米盘选择抗hASIC1a的功能性抗体
截短的ASIC1a(氨基酸13-464；ΔhASIC1a)被过表达并纯化以组装可溶性hASIC1a展示系统。如本文所描述的，为了模拟类似天然膜环境并保持hASIC1a的天然胞外构象，截短的人ASIC1a蛋白被组装成纳米盘。除了添加ΔhASIC1a外，使用相同的程序制备空纳米盘。使用Superose 6尺寸排阻色谱法(SEC)纯化ΔhASIC1a装载的纳米盘(ΔhASIC1a纳米盘)。使用SDS-PAGE分析ΔhASIC1a纳米盘的组成。如在图12A中示出的，ΔhASIC1a蛋白和MSP1蛋白存在于纳米盘中。如通过SDS-PAGE分析判断的，纳米盘中的ΔhASIC1a蛋白纯度超过90％。对应于膜支架蛋白1(MSP1)和单体ΔhASIC1a的SDS/PAGE条带的光密度分析表明，MSP1与ΔhASIC1a的摩尔比为约2:3。通过动态光散射分析ΔhASIC1a纳米盘和空纳米盘。如在图12B中示出的，每个纳米盘显示仅一个峰，表明纳米盘是均质的。组装的ΔhASIC1a纳米盘的表观直径为约15.5nm，而空纳米盘的表观尺寸为约9.9nm(图12B)，这与ΔhASIC1a纳米盘中的ΔhASIC1a蛋白的掺入一致(图12B)。如在图12B中示出的，ΔhASIC1a纳米盘的计算模型计算出从胞外结构域(ECD)到纳米盘底部边缘的距离为约14.8nm，这是计算出的最大距离。
将生物素化的纳米盘与链霉亲和素涂覆的磁珠组合使用，以在含有1011个成员的噬菌体中淘选人scFv组合抗体库。如本文所描述的，为了使噬菌粒与纳米盘结构的非特异性相互作用最小化，利用使用空纳米盘的差异富集策略。三轮淘选之后，获得六个富集序列，六个抗体以scFv的形式纯化，并命名为ASC01-ASC06。
图19A和19B分别示出了ASC01重链可变区的核苷酸序列和氨基酸序列。图20A和20B分别示出了ASC01轻链可变区的核苷酸序列和氨基酸序列。图21A和21B中分别示出了ASC02重链可变区的核苷酸序列和氨基酸序列。图22A和22B中分别示出了ASC02轻链可变区的核苷酸序列和氨基酸序列。图23A和23B中分别示出了ASC03重链可变区的核苷酸序列和氨基酸序列。图24A和24B中分别示出了ASC03轻链可变区的核苷酸序列和氨基酸序列。图25A和25B中分别示出了ASC04重链可变区的核苷酸序列和氨基酸序列。图26A和26B中分别示出了ASC04轻链可变区的核苷酸序列和氨基酸序列。图27A和27B中分别示出了ASC05重链可变区的核苷酸序列和氨基酸序列。图28A和28B中分别示出了ASC05轻链可变区的核苷酸序列和氨基酸序列。图29A和29B中分别示出了ASC06重链可变区的核苷酸序列和氨基酸序列。图30A和30B中分别示出了ASC06轻链可变区的核苷酸序列和氨基酸序列。
实施例3：ΔhASIC1a纳米盘的结合能力
与空纳米盘相比，使用ELISA评估scFv形式的ASC01-ASC06抗体与ΔhASIC1a纳米盘的结合能力。如在图1中示出的，用ΔhASIC1a纳米盘观察到的ELISA信号比用空纳米盘观察到的信号要多，这表明scFv抗体的富集对纳米盘的ΔhASIC1a组分具有特异性。然后测量抗体的亲和力。下表示出了ASC01-ASC06(scFv形式)与ΔhASIC1a纳米盘的结合亲和力，如使用八重态系统测量的。ASC04和ASC06表现出对ΔhASIC1a纳米盘的最强亲和力。
Figure BDA0003558876390000561
Figure BDA0003558876390000571
实施例4：ASC01-ASC06与在细胞表面上表达的ASIC1a蛋白的结合
为了理解ASC01-ASC06是否与在细胞表面上表达的ASIC1a蛋白特异性地结合，使用免疫细胞化学评估抗体与CHO-K1/hASIC1a细胞的结合。CHO-K1/hASIC1a细胞过表达与eYFP融合的全长hASIC1a(1-528个氨基酸)蛋白。免疫细胞化学(ICC)研究示出eYFP(绿色)在细胞表面上表达。如在图2中示出的，与ASC01和ASC05相比，ASC02、ASC03、ASC04和ASC06(红色)更多地定位于表达hASIC1a-eYFP的细胞的质膜。与其它抗体相比，ASC06示出与hASIC1a-eYFP在染色膜上的共定位更多。ASC01-ASC05可能识别特异性ASIC1a或亚群。
将ASC06抗体转化成全长IgG1形式(ASC06-IgG1)以供进一步研究。ASC06-IgG1和ASC06纯化后的产率相似，均为约78mg/L。如在图12D中示出的，SDS-PAGE分析表明单链(ASC06)和全长(ASC06-IgG1)抗体的纯度超过90％，并在预期位置处示出蛋白条带。与ASC06(scFv形式)抗体相比，使用免疫细胞化学评估ASC06-IgG1与CHO-K1/hASIC1a细胞的结合。如在图3A中示出的，ASC06-IgG1示出了与hASIC1a在细胞表面(如ASC06)上的膜共定位。
ASC06-IgG1的结合特异性也使用来自ASIC1a KO小鼠(ASIC1a-/-)的原代皮质神经元示出。正如所预期的，在合并的微分干涉对比(DIC)显微镜视图中，来自KO小鼠的原代神经元示出与ASC06-IgG1没有表观结合。如在图10B中示出的，当用hASIC1a-mCherry瞬时转染神经元时，通过ASC06-IgG1验证和可视化hASIC1a在神经元膜上的表达。此外，神经炎中ASC06-IgG1信号的放大视图示出，瞬时表达和ASC06-IgG1标记的hASIC1a主要位于神经元的突触后树突中(图10B)。
实施例5：ASC06-IgG1与经纯化的ΔhASIC1a蛋白的结合亲和力
使用表面等离子体共振(SPR)测量ASC06-IgG1与经纯化的ΔhASIC1a蛋白的结合亲和力。将与Fc融合的毒液肽PcTx1(PcTx1-Fc)用作与ΔhASIC1a蛋白结合的阳性对照。如在图15中示出的，PcTx1-Fc示出了与ΔhASIC1a蛋白结合的表观Kd为1.0nM，与文献所报道的一致。Hoagland等人,《生物化学杂志(J Biol Chem)》285:41852-41862(2010)。如在图3B中示出的，ASC06-IgG1展现出与经纯化的ΔhASIC1a蛋白结合的表观KD值为7.9nM，如使用Biacore T200仪器通过SPR测量的。作为阳性对照，使用与Fc融合的毒液肽PcTx1(PcTx1-Fc)。
实施例6：ASC06-IgG1与在细胞表面上表达的ASIC1a蛋白的结合亲和力
使用定量荧光激活细胞分选(FACS)测定ASC06-IgG1与在细胞表面上表达的全长hASIC1a蛋白的结合亲和力。如在图10A中示出的，表观EC50值(提供50％的最大结合的浓度)被测定为2.06±0.01nM，这与针对经纯化的ΔhASIC1a测量的KD值(7.9nM)一致，表明截短的hASIC1a和细胞表面表达的全长hASIC1a具有相似的胞外构象。
实施例7：ASC06-IgG1的结合选择性
为了测试ASC06-IgG1的物种和亚型选择性，构建了对以下进行编码的载体：人ASIC1b-eYFP融合、大鼠ASIC1a-eYFP融合、小鼠ASIC1a-eYFP融合、hASIC2a-eYFP融合、hASIC2b-eYFP融合和hASIC3a-eYFP融合。用这些质粒瞬时转染CHO-K1细胞。进行FACS结合测定和免疫细胞化学(ICC)以测定ASC06-IgG1是否能够与细胞表面表达的ASIC同源物和同种型结合。如在图4A中示出的，ICC染色示出ASC06-IgG1与hASIC1a-eYFP、rASIC1a-eYFP和mASIC1a-eYFP的膜共定位与人与啮齿动物ASIC1a之间的高序列同源性一致。如在图4B中示出的，FACS结果显示ASC06-IgG1仅识别ASIC1a的人/小鼠/大鼠同源物，但不识别其它ASIC1亚型hASIC1b、hASIC2a、hASIC2a/2b或hASIC3a，表明ASC06-IgG1抗体的亚型选择性。
实施例8：ASC06-IgG1在细胞培养中的效力：膜片钳实验
使用电生理学方法表征ASC06-IgG1的功能。分析ASC06-IgG1抗体对细胞中酸诱导的、hASIC1a介导的电流的影响。PcTx1用作阳性对照。如在图5A中示出的，全细胞记录模式示出，降低胞外pH值(从pH 7.4降至pH 6.0)导致在过表达hASIC1a的稳定细胞系中形成电流。在不存在和存在ASC06-IgG1的情况下，记录并定量稳定细胞的hASIC1a介导的向内电流的振幅，其中毒液肽PcTx1(100nM)用作阳性对照。如在图5B-5C中示出的，ASC06-IgG1对至多80％的酸(pH6.0)诱导的电流表现出持续的(30分钟)和剂量依赖性抑制，其中表观IC50值为85±6nM。相比之下，如在图5A和5C中示出的，阳性对照PcTx1示出几乎完全的电流抑制。与洗涤后使用抗体的持续抑制不同，使用PcTx1的抑制可以在5分钟内轻易冲刷(图5C)。
为了理解ASC06-IgG1阻断hASIC1a电流的机制，在不存在和存在ASC06-IgG1的情况下，检查了hASIC1a的SSD和pH激活。测量了hASIC1a的SSD曲线和pH激活曲线的pH50(胞外pH值下降，其可以打开50％的ASIC1a通道)值，并将所述值与300nM ASC06-IgG1进行比较或不与其进行比较。如在图11A-11B中示出的，在施加具有不同pH值的调节胞外液(ECF)和在pH 6.0下的激活ECF时诱导SSD，而在施加具有不同pH值的激活ECF和在pH 7.6下的调节ECF时构建pH激活曲线。在300nM ASC06-IgG1的情况下，没有观察到SSD和pH激活的pH50值的显著差异。此外，如在图16A-16B中示出的，ASC06-IgG1既不干扰SSD，也不干扰ASIC1a的激活，如用/不用ASC06-IgG1处理的SSD和ASIC1a电流激活的代表性迹线示出的。因此，ASC06-IgG1似乎使用与质子浓度无竞争性的机制来阻断hASIC1a的激活。
实施例9：ASC06-IgG1在细胞培养中的效力：基于FLIPR的ASC06-IgG1抑制ASIC1a 介导的钙内流试验
使用表达hASIC1a-mCherry融合的稳定细胞系4C12，在FLIPR仪器上测量ASIC1a的钙流入。通过使用表达hASIC1a-mCherry融合的稳定细胞系测量钙敏感染料(Calcium 5,Molecular Devices)的胞内荧光信号，使用FLIPR仪器分析ASC06-IgG1抗体对细胞中酸诱导的、hASIC1a介导的钙流入的影响。在4C12细胞中，在记录的第10秒在pH 6.0下同源hASIC1a的激活似乎诱导了强烈的钙流入，而在没有hASIC1a表达的情况下，未观察到CHO-K1细胞的酸诱导的钙流入(图17A)。如在图6A和6B中示出的，在记录的第10秒在pH 6.0下，稳定细胞中的同源hASIC1a通道的激活似乎诱导了强烈的钙流入。hASIC1a特异性抗体ASC06-IgG1展示出对钙流入的剂量依赖性抑制，其中IC50为2.9±0.2nM。相比之下，如在图17B中示出的，非选择性小分子ASIC阻断剂阿米洛利在30μM下仅示出21％的抑制。
实施例10：ASC06-IgG1的pH稳定性
测试了ASC06-IgG1对酸性条件的耐受性。在37℃下将浓缩的ASC06-IgG1溶液(3.3μM)在不同pH值(7.4到5.0)下孵育6小时，并进行SEC-HPLC分析。如在图18中示出的，未观察到ASC06-IgG1的显著降解或聚集。
实施例11：ASC06-IgG1预防体外酸中毒诱导的细胞死亡
已知中风或缺血再灌注损伤中的胞外酸中毒会诱导ASIC1a通道的激活，从而导致中枢神经系统中的神经元死亡，这很可能是通过由ASIC1a介导的胞内钙和相关细胞信号传导的瞬时增加引起的。通过测量分别反映细胞活力和细胞毒性的细胞质脱氢酶的酶活性(CCK8测定)和分泌到细胞培养基中的乳酸脱氢酶(LDH)浓度来评估过表达hASIC1a的稳定细胞的存活率。如在图7A和7B中示出的，ASIC1a稳定细胞系(右图)示出了比对照CHO-K1细胞更高程度的pH敏感性，尤其是在pH 5.5下，表明观察到的对酸的增强应答是通过膜上的hASIC1a通道介导的。在相同的实验条件下并在pH 5.5下，ASC06-IgG1示出了显著的剂量依赖性保护效应(图7C和7D)。在存在1μM ASC06-IgG1的情况下，大约45％的表达ASIC1a的稳定细胞在pH 5.5下存活，而在不存在抗体的情况下存活率为约5％。与CCK8结果一致，在添加ASC06-IgG1后，释放到细胞培养基中的LDH的浓度也以剂量依赖性方式降低(图7D)。
这些结果表明本发明的抗ASIC1a抗体可用于预防酸中毒诱导的细胞死亡的方法。
实施例12：ASC06-IgG1预防体内酸中毒诱导的细胞死亡
为了确定抗体ASC06-IgG1在体外的保护作用是否可以扩展到体内的病理，使用大脑中动脉闭塞(MCAO)模型来研究抗体的神经保护作用。在再灌注前60分钟，通过MCAO在小鼠的左脑半球诱导缺血。如在图8A中示出的，在诱导缺血后三小时，将总共4μL的含有100nMPcTx1或3.0μg/L ASC06-IgG1的媒剂溶液(PBS)脑室内(i.c.v.)注射到小鼠的对侧半球中。与ASC06-IgG1浓度相同的无关抗体(同种型)作为阴性对照施用。在注射后24小时计算皮质和纹状体的梗死体积。如在图8B中示出的，PBS组中的缺血诱导显著的脑梗死(与对侧脑区相比，体积为大约42％)。PcTx1使梗死体积减小至约17％(图8B)。同种型抗体未示出任何保护效应。另一方面，与PcTx1一样，用ASC06-IgG1处理的组示出显著减少的梗死体积(减少至约23％)，表明针对中风的抗体具有强大的神经保护效应(图8B)。
这些结果表明本发明的抗ASIC1a抗体可用于预防酸中毒诱导的细胞死亡和治疗缺血性中风的方法。
实施例13：ASC06-IgG1与hASIC1a的构象表位结合
如本文所展现的，抗体ASC06-IgG1被示出为能够识别经纯化的ASIC1a蛋白和在细胞表面上表达的ASIC1a蛋白并与其结合。为了表征ASC06-IgG1与hASIC1a之间的相互作用，在蛋白质印迹分析中使用了表达hASIC1a-eYFP融合蛋白的6H7稳定品系。如在图13A中示出的，ASC06-IgG1在蛋白质印迹测定中不能识别过表达ASIC1a的细胞的细胞裂解物中的hASIC1a。相比之下，商用山羊多克隆抗ASIC1抗体和抗eYFP抗体两者均能够检测6H7裂解物中分子量为约100kDa的hASIC1a-eYFP蛋白(图13A和数据未示出)。这一观察表明，抗体以构象依赖性方式识别ASIC1a。
ASC06-IgG1用于减少细胞裂解物中的天然hASIC1a-YFP，随后使用抗eYFP蛋白质印迹进行hASIC1a-YFP检测。如在图13B中示出的，观察到代表hASIC1a-eYFP的约100kDa的清晰条带，表明ASC06-IgG1以构象依赖性方式识别hASIC1a。
为了理解ASC06与hASIC1a的结合的性质，通过混合hASIC1a-ECD与ASC06-Fab形成复合物。使用凝胶过滤解析复合物hASIC1a-ECD和ASC06-Fab。如在图14中示出的，hASIC1a-ECD在溶液中以同源三聚体的形式存在，并与三个ASC06-Fab一起形成稳定的复合物。
为了进一步了解抗体结合的性质，对hASIC1a(hASIC1a-ECD)和呈Fab格式的ASC06(ASC06-Fab)的胞外结构域的复合物进行阴性染色EM研究。如在图9A中示出的，未经处理的阴性染色EM图像显示，大部分颗粒示出对所形成的复合物呈三角形布置；同时，还观察到回旋镖形状和其它形状的颗粒，所述颗粒可能代表缺失一个或两个ASC06-Fab的复合物。如在图9A中示出的，EM结果示出每个ASC06-Fab与hASIC1a-ECD-ASC06-Fab复合物结合。如在图9D中示出的，基于分子动力学模拟模型，预测ASIC1a的若干个氨基酸对ASC06-IgG1与hASIC1a的结合非常重要。如在图9C中示出的，2D平均分析结果示出了具有清晰结构域划分的三角形形状的复合物，从而示出了ASC06-Fab与hASIC1a-ECD的三聚体配置的相互作用。将分子对接与分子动力学模拟组合，获得了粗略再现表观实验几何形状的模型(图9D)。如在图9A-9C中示出的，表位位于由两个hASIC1a-ECD亚基形成的表面上。
为了确认这些氨基酸的作用，进行了丙氨酸突变，并鉴定了四种对抗体结合非常重要的氨基酸。构建对hASIC1a-eYFP的单氨基酸突变进行编码的质粒并将其瞬时转染到CHO-K1细胞中。然后执行FACS结合测定以测试ASC06-IgG1是否仍与表达突变的hASIC1a的细胞表面结合。如在图9E中示出的，与可以与ASC06-IgG1结合的WT hASIC1a不同，hASIC1aY360A突变或hASIC1a N322A突变会降低ASC06-IgG1的结合能力；hASIC1a Y318A突变消除了ASC06-IgG1的结合，hASIC1a F252A突变也是如此。
等效方案
本发明技术不限于在本申请中所描述的特定实施方案，所述实施方案旨在作为本发明技术的各个方面的单一说明。如对本领域技术人员而言显而易见的，在不脱离本发明技术的精神和范围的情况下，可以对本发明技术进行许多修改和变化。根据以上描述，除了本文所列举的方法和设备之外，在本发明技术的范围内的在功能上等效的方法和设备对本领域技术人员而言是显而易见的。此类修改和变化旨在落入所附权利要求的范围之内。本发明的范围仅由权利要求，以及权利要求中的等同方案进行限定。应理解，本发明技术不限于特定方法、试剂、化合物、组合物或生物系统，当然，所述特定方法、试剂、化合物、组合物或生物系统可以变化。还应当理解，本文使用的术语仅出于描述特定实施方案的目的而并非旨在进行限制。
另外，在以马库什(Markush)组合的方式描述本公开的特征或方面的情况下，本领域技术人员将认识到，本公开也由此以马库什组合中的任何单个成员或成员子组的形式进行描述。
如本领域技术人员理解的，出于任何和所有目的，特别是在提供书面描述方面，本文所公开的所有范围还涵盖任何和所有可能的子范围及其子范围的组合。任何所列范围都可以容易地识别为充分描述并使得能够将相同范围拆分为至少相等的两份、三份、四份、五份、十份等。作为非限制性实例，本文所讨论的每个范围可以容易地被拆分为下三分之一、中三分之一和上三分之一等。如本领域的技术人员还将理解，如“至多”、“至少”、“大于”、“小于”等的所有语言都包含所叙述的数字并且指随后可以拆分为如上文所讨论的子范围的范围。最后，如本领域技术人员理解的，范围包含每个单独的成员。因此，例如，具有1-3个细胞的组是指具有1个、2个或3个细胞的组。类似地，具有1-5个细胞的组是指具有1个、2个、3个、4个或5个细胞的组等等。
在本文中提到或引用的所有专利、专利申请、临时申请和出版物在其不与说明书中的明确教导不一致的基础上以全文引用的方式并入本文中，包含所有附图和表格。
在权利要求中阐述了其它实施方案。

Claims (39)

1.一种用于治疗有需要的受试者的缺血性中风的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包括重链免疫球蛋白可变结构域(VH)和轻链免疫球蛋白可变结构域(VL)，
其中所述VH包括：选自由SEQ ID NO:3、13、23、33、43和53所示序列组成的组中的VH-CDR1；选自由SEQ ID NO:4、14、24、34、44和54所示序列组成的组中的VH-CDR2；以及选自由SEQ ID NO:5、15、25、35、45和55所示序列组成的组中的VH-CDR3序列；并且
所述VL包括：选自由SEQ ID NO:8、18、28、38、48和58所示序列组成的组中的VL-CDR1；选自由SEQ ID NO:9、19、29、39、49和59所示序列组成的组中的VL-CDR2；以及选自由SEQ IDNO:10、20、30、40、50和60所示序列组成的组中的VL-CDR3。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段进一步包括选自由IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgM、IgD和IgE组成的组中的同种型的Fc结构域。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段选自由Fab、F(ab')2、Fab'、scFv和Fv组成的组。
4.根据权利要求1到3中任一项所述的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段为单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体或双特异性抗体。
5.根据权利要求1到4中任一项所述的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段与ASIC1a蛋白结合。
6.根据权利要求1到5中任一项所述的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段与ASIC1a的胞外结构域结合。
7.根据权利要求1到6中任一项所述的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段与跨越两个ASIC1a亚基的表位结合。
8.根据权利要求1到7中任一项所述的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段抑制质子诱导的ASIC1a电流。
9.根据权利要求1到8中任一项所述的方法，其中所述VH包括选自由SEQ ID NO:2、12、22、32、42和52组成的组中的氨基酸序列。
10.根据权利要求1到9中任一项所述的方法，其中所述VL包括选自由SEQ ID NO:7、17、27、37、47和57组成的组中的氨基酸序列。
11.根据权利要求1到10中任一项所述的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段包括HC氨基酸序列和LC氨基酸序列，所述HC氨基酸序列和LC氨基酸序列分别为：
SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:7(ASC01)；
SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:17(ASC02)；
SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:27(ASC03)；
SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:37(ASC04)；
SEQ ID NO:42和SEQ ID NO:47(ASC05)；或
SEQ ID NO:52和SEQ ID NO:57(ASC06)。
12.根据权利要求1到11中任一项所述的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段为ASC06。
13.一种用于减轻有需要的受试者的缺血性中风的一种或多种症状的方法，所述方法包括：向所述受试者施用治疗有效量的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包括重链免疫球蛋白可变结构域(VH)和轻链免疫球蛋白可变结构域(VL)，
其中所述VH包括：选自由SEQ ID NO:3、13、23、33、43和53所示序列组成的组中的VH-CDR1；选自由SEQ ID NO:4、14、24、34、44和54所示序列组成的组中的VH-CDR2；以及选自由SEQ ID NO:5、15、25、35、45和55所示序列组成的组中的VH-CDR3序列；并且
所述VL包括：选自由SEQ ID NO:8、18、28、38、48和58所示序列组成的组中的VL-CDR1；选自由SEQ ID NO:9、19、29、39、49和59所示序列组成的组中的VL-CDR2；以及选自由SEQ IDNO:10、20、30、40、50和60所示序列组成的组中的VL-CDR3。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段包括HC氨基酸序列和LC氨基酸序列，所述HC氨基酸序列和LC氨基酸序列分别为：
SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:7(ASC01)；
SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:17(ASC02)；
SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:27(ASC03)；
SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:37(ASC04)；
SEQ ID NO:42和SEQ ID NO:47(ASC05)；或
SEQ ID NO:52和SEQ ID NO:57(ASC06)。
15.根据权利要求13或1所述的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段进一步包括选自由IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgM、IgD和IgE所组成的组中的同种型的Fc结构域。
16.根据权利要求13到15中任一项所述的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段选自由Fab、F(ab')2、Fab'、scFv和Fv组成的组。
17.根据权利要求13到16中任一项所述的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段为单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体或双特异性抗体。
18.根据权利要求13到17中任一项所述的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段与ASIC1a蛋白结合。
19.根据权利要求13到18中任一项所述的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段与ASIC1a的胞外结构域结合。
20.根据权利要求13到19中任一项所述的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段与跨越两个ASIC1a亚基的表位结合。
21.根据权利要求13到20中任一项所述的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段抑制质子诱导的ASIC1a电流。
22.根据权利要求13到21中任一项所述的方法，其中所述缺血性中风的一种或多种症状为突然发作的面部、手臂或腿部虚弱无力、麻痹或麻木；面部一侧下垂；思维混乱；说话困难；理解言语困难；一只或两只眼睛视力困难；视力模糊；视力变暗；复视；呼吸困难；眩晕；行走困难；失去平衡；失去协调；不明原因的跌倒；意识丧失；突然头痛；或剧烈头痛。
23.根据权利要求13到22中任一项所述的方法，其中所述缺血性中风的一种或多种症状为突然发作的面部虚弱无力、面部一侧下垂、手臂垂落或异常言语。
24.一种用于治疗有需要的受试者的缺血性中风的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包括：
(a)轻链免疫球蛋白可变结构域序列，所述轻链免疫球蛋白可变结构域序列与SEQ IDNO:7、17、27、37、47或57所示序列中任一轻链免疫球蛋白可变结构域序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％同一性；和/或(b)重链免疫球蛋白可变结构域序列(VH)，所述VH与SEQ ID NO:2、12、22、32、42或52所示序列中任一重链免疫球蛋白可变结构域序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％同一性。
25.一种抗体或其抗原结合片段，其包括重链免疫球蛋白可变结构域(VH)和轻链免疫球蛋白可变结构域(VL)，
其中所述VH包括：选自由SEQ ID NO:3、13、23、33和43所示序列组成的组中的VH-CDR1；选自由SEQ ID NO:4、14、24、34和44所示序列组成的组中的VH-CDR2；以及选自由SEQ IDNO:5、15、25、35和45所示序列组成的组中的VH-CDR3序列；并且
所述VL包括：选自由SEQ ID NO:8、18、28、38和48所示序列组成的组中的VL-CDR1；选自由SEQ ID NO:9、19、29、39和49所示序列组成的组中的VL-CDR2；以及选自由SEQ ID NO:10、20、30、40和50所示序列组成的组中的VL-CDR3。
26.根据权利要求25所述的抗体或其抗原结合片段，其进一步包括选自由IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgM、IgD和IgE组成的组中的同种型的Fc结构域。
27.根据权利要求25或26所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗原结合片段选自由Fab、F(ab')2、Fab'、scFv和Fv组成的组。
28.根据权利要求25到27中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段为单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体或双特异性抗体。
29.根据权利要求25到28中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段与ASIC1a蛋白结合。
30.根据权利要求25到29中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段与ASIC1a的胞外结构域结合。
31.根据权利要求25到30中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段与跨越两个ASIC1a亚基的表位结合。
32.根据权利要求25到31中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段抑制ASIC1a电流。
33.一种核酸，其编码根据权利要求25到32中任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
34.一种核酸，其选自由SEQ ID NO:1、6、11、16、21、26、31、36、41、46、51和56所示序列组成的组。
35.一种宿主细胞或载体，其表达根据权利要求33或34所述的核酸。
36.一种试剂盒，其包括根据权利要求25到32中任一项所述的抗体或其抗原结合片段以及使用说明书。
37.根据权利要求36所述的试剂盒，其中所述抗体或其抗原结合片段与至少一种选自由放射性标记、荧光标记和显色标记组成的组中的可检测标记偶联。
38.根据权利要求36或37所述的试剂盒，其进一步包括第二抗体，所述第二抗体与所述抗体或其抗原结合片段特异性地结合。
39.一种用于检测生物样品中的ASIC1a蛋白的方法，所述方法包括：使所述生物样品与权利要求25到32中任一项所述的抗体或其抗原结合片段接触，所述抗体或其抗原结合片段与可检测标记缀合；以及，检测所述生物样品中的所述可检测标记的存在和水平。
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