KR20110031222A

KR20110031222A - 항ｐ２ｘ７ 펩티드 및 에피토프

Info

Publication number: KR20110031222A
Application number: KR1020117002763A
Authority: KR
Inventors: 줄리안 알렉산더 바든; 앵거스 기들리-베어드
Original assignee: 바이오셉트라 인터내셔널 리미티드
Priority date: 2008-07-04
Filing date: 2009-07-03
Publication date: 2011-03-24
Also published as: US10238716B2; NZ590146A; AU2009266430B2; JP2011526249A; AU2009266430A1; IL232394A0; JP2015038144A; CN102143978B; US9328155B2; US8597643B2; EP2318438A1; CN102143978A; US20110110959A1; US20160199442A1; EP2318438B1; ES2610225T3; EP2318438A4; IL210220A0; US20140135475A1; CA2729868C

Abstract

본 발명은 암에 관련된 비-기능적 P2X₇ 수용체에 대한 신규한 에피토프의 확인에 대한 발명이다. 에피토프는 세개의 서브유닛 수용체 간의 두개의 인접한 단량체들로부터 유래된 부위를 포함한다. 상기 에피토프에 결합하는 항체들 및 항체들를 생산하기 위한 펩티드들을 설명한다. 항체들 및 펩티드들은 암의 진단 및 치료에 유용하다.

Description

항Ｐ２Ｘ７ 펩티드 및 에피토프{ANTI-P2X7 PEPTIDES AND EPITOPES}

본 발명은 펩티드, 에피토프 및 그것의 모노클로날 항체의 생산에 관한 것이다.

본 명세서에서 어떤 선생기술에 대한 참조문헌은 이 선행기술이 오스트레일리아나 다른 국가에서 일반적인 종래 지식의 일부를 구성하거나 또는 이 선행기술이 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 사람에게 관련이 있는 것으로 입증, 이해 및 간주되는 것으로 합리적으로 예상될 수 있는 것이 아니며 승인하거나 또는 제안의 어떤 형태로 받아들여지지 않아야 한다.

퓨린(P2X) 수용체는 ATP-문열림(gated) 양이온-선택적 채널이다. 각 수용체는 3개의 단백질 서브유닛(subunits) 또는 단량체(monomers)로 이루어져 있다. 지금까지 P2X 단량체들을 암호화하는 일곱개의 독립적인 유전자들이 확인되었다: P2X₁, P2X₂, P2X₃, P2X₄, P2X₅, P2X₆, P2X₇ _.

P2X₇ 수용체는 이러한 수용체의 발현이 흉선 세포, 수지상 세포, 림프구, 대식세포 및 단핵구와 같이 세포 예정사(programmed cell death)를 거칠 가능성이 있는 세포들에 한정되는 것으로 알려져 있기 때문에 특별한 관심의 대상이다. 적혈구에서처럼 보통의 항상성에서 P2X₇ 수용체가 약간 발현한다.

흥미롭게도, 프롤린 210에서(도 1에서 서열번호 1에 따르면) cis 이성화를 가진 하나 또는 그 이상의 단량체들을 포함하고 ATP 결합 기능이 없는 P2X₇ 수용체는 전신생 세포(preneoplastic cells)와 신생 세포(neoplastic cells)와 같은 세포 예정사를 거치지 않을 수 있다고 알려진 세포들에서 발견된다. 수용체의 이러한 이형은 "비 기능적" 수용체로 언급된다.

항체는 비 기능적 P2X₇ 수용체에 결합하는 cis인 프롤린 210을 포함하는 펩티드로 면역화되어 생산된다. 그러나 그것들은 ATP에 결합할 수 있는 P2X₇ 수용체에는 결합하지 않는다. 따라서 이들 항체는 다양한 형태의 육종 및 조혈 암을 선택적으로 탐지하고 이러한 조건의 일부의 치료에 유용하다.

WO02/057306A1 및 WO03/020762A1는 모두 모노클로날 항체의 형태에서 기능적 P2X₇ 수용체와 비 기능적 P2X₇ 수용체 간을 구별하기 위한 프로브에 대하여 기재하고 있다.

모노클로날 항혈청은 연구, 진단 및 치료의 용도를 위하여 가치있는 시약인 모노클로날 항혈청을 만드는 복합혈청에서 발견되지 않는 어떤 혈청학적 특징을 갖는다. 이들에 대한 열쇠는 모노클로날 항체가 일반적으로 복합혈청에서 발견되는 대분분의 특이성의 친화도 보다 더 높은 항원에 대한 친화도를 갖는다는 것이다.

살아있는 세포에서 발현되는 비 기능적 P2X₇ 수용체에 대한 충분한 양의 모노클로날 항체, 그리고 특히, 다양한 진단 및 치료적 응용에 사용될 수 있는 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마를 얻는 것은 지금까지 매우 어려웠다. 더우기 발명자들은 살아있는 세포에서 기능적 P2X₇ 수용체에 대하여 발생한 어떤 모노클로날 항체를 알지 못한다. 이러한 시약, 특히 살아있는 세포에서 ATP 및 비-ATP 결합 P2X₇ 수용체들 간을 구별할 수 있는 새로운 항체에 대한 요구가 있다.

더우기, 발명자들이 알고 있는 한, 항 P2X₇ 항체는 P2X₇ 단량체와 이러한 단량체들 간에 형성된 삼량체 P2X₇ 수용체를 일반적으로 구분하지 않는다. P2X₇ 단량체에는 결합하지 않으나 삼량체 수용체에 결합하는 항체는 삼량체 수용체가 특히 진행된 신생 조직에서 발견되기 때문에 암의 단계 결정에 유리할 것이다.

본 발명은 살아있는 세포에서 비 기능적 P2X₇ 수용체에는 결합하지만 기능적 P2X₇ 수용체에는 결합하지 않는 항체를 만드는 펩티드 및 에피토프에 관한 발명이다. 이 펩티드들은 살아있는 세포에서 기능적 P2X₇ 수용체에는 결합하지만 비 기능적 P2X₇ 수용체에는 결합하지 않는 항체를 만드는 데에도 또한 유용하다. 본 발명은 또한 이러한 펩티드에 결합하는 항체, 이러한 펩티드를 포함하는 조성물, 항체를 생산하기 위하여 펩티드를 사용하는 방법 및 비 기능적 P2X₇ 수용체 발현과 관련된 질병의 진단 및 치료의 방법에 관한 발명이다.

어떤 실시예는 P2X₇ 수용체의 에피토프를 제공한다. 여기서 에피토프는 P2X₇ 수용체의 첫번째 단량체의 부위의 형태에서 첫번째 부위; 및 수용체의 두번째 단량체의 부위의 형태에서 두번째 부위; 여기서 첫번째 및 두번째 부위는 수용체의 단량체의 서열번호: 1의 위치 210에 있는 잔기의 cis 이상화에 의하여 수용체에서 형성되고; 그리고 여기서 첫번째 및 두번째 부위는 수용체에서 서로 가깝게 배열되어 에피토프를 형성하는 첫번째 및 두번째 부위의 항-P2X₇ 항체의 항원 결합 부위의 결합을 허용하는 것을 특징으로 한다.

다른 실시예는 상기와 같은 에피토프를 갖는 P2X₇ 수용체를 제공한다. 전형적으로 수용체의 하나 또는 그 이상의 단량체는 서열번호: 1의 단량체의 210번 위치에서 cis 이성화를 갖는다.

다른 실시예는 P2X₇ 수용체의 에피토프에 결합하는 항체를 제공한다. 여기서 에피토프는 P2X₇ 수용체의 첫번째 단량체의 부위의 형태에서 첫번째 부위; 및 수용체의 두번째 단량체의 부위의 형태에서 두번째 부위; 여기서 첫번째 및 두번째 부위는 수용체의 단량체의 서열번호: 1의 위치 210에 있는 잔기의 cis 이성화에 의하여 수용체에서 형성되고; 그리고 여기서 첫번째 및 두번째 부위는 수용체에서 서로 가깝게 배열되어 에피토프를 형성하는 첫번째 및 두번째 부위의 항-P2X₇ 항체의 항원 결합 부위의 결합을 허용하는 것을 특징으로 한다.

하나의 실시예는 상기에서 언급된 항체가 에피토프에 결합한 형태로 된 면역 복합체를 제공한다.

또 다른 실시예는 N 말단 잔기와 C 말단 잔기로 각각 정의되는 N 말단 부위와 C 말단 부위를 포함하는 펩티드를 제공한다, 여기서:

- N 말단 부위는 HNYTTRNIL 서열(서열번호: 2) 또는 최소한 4개 잔기인 그것의 단편을 포함하고;

- C 말단 부위는 프롤린, 알라닌 또는 글리신인 C 말단 잔기를 포함하며;

여기서 N 말단 부위의 C 말단 잔기는 C 말단 부위의 N 말단 잔기에 공유 결합으로 연결되어 있고;

여기서 C 말단 부위의 C 말단 잔기는 약 10 내지 40 Å(angstroms)의 길이를 갖는 링커에 의하여 추가적인 펩티드에 연결되어 있며;

그리고 여기서 상기 추가적인 펩티드는 KTTNVSLYPGYNFRYAKYYKENNVEKRTLIKVFGIRF DILVFGTGGKFD 서열(서열번호: 6) 또는 최소한 4개 잔기인 그것의 단편으로 구성되는 것을 특징으로 한다.

또 다른 실시예는 식: (A)(Xn)(B)으로 정의되는 펩티드를 제공한다, 여기서:

- (A)는 GHNYTTRNILP의 아미노산 서열(서열번호: 8) 또는 최소한 4개 잔기인 그것의 단편이고;

- (Xn)는 약 10 내지 40 Å(angstroms)의 길이의 링커이고, 상기 링커는 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기로 구성되어 있며;

- (B)는 AKYYKENNVEK의 아미노산 서열(서열번호: 9) 또는 최소한 4개 잔기인 그것의 단편이다.

추가적인 실시예는 하기의 서열: GHNYTTRNILPGAGAKYYKENNVEK (서열번호: 10)을 갖는 펩티드를 제공한다.

추가적인 실시예는 항체에 결합된 상기에서 언급된 펩티드의 한 형태로 면역 복합체를 제공한다. 일반적으로 항체는 비 기능적 P2X₇ 수용체에는 결합하나 기능적 P2X₇ 수용체에는 결합하지 않는다.

추가적인 실시예는 비 기능적 P2X₇ 수용체에 결합하는 항체를 생산하는 상기에서 언급된 펩티드의 용도를 제공한다.

추가적인 실시예는 개체가 암에 걸렸는지 여부를 결정하기 위한 상기에서 언급된 항체의 용도를 제공한다.

추가적인 실시예는 암에 걸린 개체를 치료하기 위한 상기에서 언급된 항체의 용도를 제공한다.

추가적인 실시예는 상기에서 언급된 항체 및 추가로 하기의 것을 포함하는 키트를 제공한다:

- 상기에서 언급된 펩티드;

암의 진단 또는 치료의 용도를 위한 서면 안내문을 포함하는 키트.

참조문헌은 본 발명의 실시예를 상세하게 하기 위한 것이다. 본 발명이 실시예와 관련하여 설명됨에 반하여, 본 발명은 실시예에 대한 발명에 한정하는 의도는 아니라는 것이 이해될 것이다. 반대로, 본 발명은 모든 대체물, 변이 및 동등물을 포함하는 것을 의도하고 , 그것은 청구항에 의하여 정의된 것처럼 본 발명의 범위에 포함된다.

당해 기술분야에서 통상의 기술을 가진 사람은 여기에서 설명된 것들과 유사하거나 또는 동등한 많은 방법 및 물질들을 알 수 있고, 본 발명에서 사용될 수 있다. 본 발명은 설명된 방법 및 물질에 결코 한정되지 않는다.

본 명세서에서 개시되고, 정의된 발명은 본문 또는 그림으로부터 언급되거나 분명한 개별적인 형태의 둘 또는 그 이상의 모든 대체가능한 조합에도 확장된다. 이들 다른 조합들 모두는 본 발명의 다양한 대체가능한 면을 구성한다.

여기에서 사용된, 문맥이 다른 것을 제외하고, 용어 "포함하다" 및 "포함하는", "포함된"과 같은 용어의 변이는 추가적인 첨가물, 요소, 정수 또는 단계들을 제외하기 위하여 의도된 것은 아니다.

여기에서 언급된 모든 특허 및 공지는 전체로 인용으로 인용된다.

본 발명의 시점에서 이용가능한 살아있는 세포에서 발현되는 비-기능적 P2X₇ 수용체에 대한 항-P2X₇ 항혈청은 모두 폴리클로날이다.

발명자들은 비 ATP-결합 P2X₇ 수용체(또 다른 명칭은 "비-기능적 수용체")에서 광범위하게 발현되는 에피토프를 확인하였다. 그것을 형성하는 에피토프 및 펩티드는 살아있는 세포에서 비-기능적 P2X₇ 수용체에 결합하는 모노클로날 항체를 생산하는데 유용하다는 것을 발견하였다.

살아있는 세포 결합은 예를 들면 상피 세포같은 세포에서 비 기능적 P2X₇ 수용체의 발현이 상피 암 또는 다른 종류와 같은 많은 암의 바이오 마커라고 생각되기 때문에 중요하다. 따라서, 살아있는 세포에 결합하는 모노클로날 항체로 비 기능적 P2X₇ 수용체의 발현으로 특징지어진 다양한 질병에 대한 항체 자체 또는 세포 독성 물질 컨쥬게이트된 항체의 형태로 시스테믹 치료제를 제공하는 것이 가능하게 되었다. 또한 비 기능적 P2X₇ 수용체의 발현에 의하여 특징지어진 질병을 생체 내 이미징 및 진단 또는 모니터링하기 위하여 제공하는 것이 가능하다.

본 발명자들은 여기에서 추가로 설명된 상세한 분자적 모델링으로부터 에피토프가 P2X₇ 수용체 즉 P2X₇ 단량체로부터 형성된 삼량체에서만 발견된다는 것을 관찰하였다. 좀더 특별하게, 에피토프는 삼량체 P2X₇ 수용체에서 이웃한 P2X₇ 단량체에 걸쳐있다. 비 기능적 삼량체 수용체에서 배열(align)되지 않은 각각의 P2X₇ 단량체는 그런 까닭에 에피토프를 포함하지 않는다. 이것은 암을 단계로 구분하는데 유리하게 한다. 단량체 P2X₇ 및 삼량체 수용체 모두에 결합하는 항체를 만들어내는 것이 더욱 어렵다.

이러한 명세서의 목적을 위하여, 하기의 정의는 일반적으로 적용되고, 언제든 가능하다면 단수로 사용되는 용어들은 또한 복수 기타 등등을 포함한다. 어떤 문서에서 함축되는 어떤 정의는 인용으로 사용되고, 그 정의는 하기에서 일반적으로 사용된다.

"퓨린 리셉터"는 일반적으로 리간드로서 퓨린(ATP와 같은)을 사용하는 수용체를 말한다.

"P2X₇ 수용체"는 일반적으로 서열번호: 1에서 나타나는 것처럼 주로 아미노산 서열을 가지는 단량체를 적어도 하나인 세 개의 단백질 서브유닛 또는 단량체로부터 형성된 퓨린 수용체를 말한다. P2X₇ 수용체가 세 개의 단량체로부터 형성되면, "삼량체" 또는 "삼량체의"이다. " P2X₇ 수용체"는 아래에서 기재된 바와 같이 기능적 또는 비 기능적 수용체이다. "P2X₇ 수용체"는 자연적으로 생긴 P2X₇ 수용체의 변이체를 포함한다. 여기서 P2X₇ 단량체는 P2X₇ 수용체를 형성하는 단량체(예를 들어 세포외 도메인 서열을 구성하는 형태 또는 그것의 절단형)의 자연적으로 생긴 절단 또는 분비된 형태, 자연적으로 생긴 변이체 형태(예를 들어, 대체적으로 이어진 형태) 및 자연적으로 생긴 대립형질 변이체를 포함하는 변이체, 대립형질 변이체 및 이성체를 잇는다. 본 발명의 실시예에서, 여기에서 개시된 본래의 서열 P2X₇ 단량체 폴리펩티드는 서열번호: 1에서 보여지는 총-길이 아미노산 서열을 포함하는 성숙하거나 또는 총-길이의 본래 서열의 폴리펩티드이다. 실시예에서 P2X₇ 수용체는 변이된, 예를 들어 서열번호:1에서 나타난 서열에서 다양한 아미노산들이 치환되는, 삭제 또는 잔기가 삽입된 아미노산 서열을 가질 수 있다.

"기능적 P2X₇ 수용체"는 일반적으로 ATP에 결합하기 위한 결합 부위 또는 틈을 가진 P2X₇ 수용체의 형태를 말한다. ATP에 결합하였을 때, 수용체는 세포 예정사의 하나의 결과인 세포질로 칼슘 이온의 유입이 가능한 구멍-유사 구조를 형성한다. 보통의 항상성에서, 기능적 P2X₇ 수용체의 발현은 일반적으로 흉선 세포와 같이 세포예정사를 거치는 세포에 한정된다. 또한 적혈구에서 기능적 P2X₇ 수용체가 약간 발현된다.

"비 기능적 P2X₇ 수용체"는 일반적으로 하나 또는 그 이상의 단량체가 프롤린 210에서(서열번호 :1에 따를 때) cis 이성화를 갖는 P2X₇ 수용체의 형태를 말한다. 이성화는 예를 들어 단량체 일차 서열의 돌연변이 또는 비정상적인 전사 후 가공을 포함한 단량체의 잘못 접힘을 일으키는 어떤 분자적 사건으로부터 발생한다. 이성화의 하나의 결과는 수용체가 ATP에 결합하지 못하는 것이다. 이런 상황에서, 수용체는 구멍을 형성할 수 없고, 칼슘 이온이 세포질로 들어가는 것을 제한한다. 비 기능적 P2X₇ 수용체는 다양한 상피 및 조혈 암에서 발현된다.

"항체" 또는 "면역글로불린"은 항원에 결합하고, 외부의 물질을 확인하고 및/또는 중성화하는 면역 시스템에 기능을 하는 척추동물의 혈액 또는 다른 체액에서 발견된는 감마 글로불린 단백질이다.

항체는 일반적으로 2개의 동일한 가벼운(L, light) 사슬 및 두 개의 동일한 무거운(H, heavy) 사슬로 구성된 이성질의 사량체(heterotetrameric) 당단백질이다. 각 L 사슬은 하나의 공유 이황화 결합으로 하나의 H 사슬에 연결된다. 두 개의 H 사슬은 H 사슬의 이소타입에 따라 하나 또는 그 이상의 이황화 결합에 의하여 서로 연결되어 있다. 각 H 및 L 사슬은 또한 규칙적으로 공간을 가진 사슬 내 이황화 다리를 갖는다.

H 및 L 사슬은 특이적인 면역글로불린 도메인으로 정의된다. 좀더 특별하게, 각 H 사슬은 α 및 γ 사슬의 각각에 대한 3개의 불변 도메인(constant domain (C_H))과 μ및 ε 이소타입에 대한 4개의 불변 도메인에 따라오는 N 말단에서 가변 도메인(variable domain (V_H))을 갖는다. 각 L 사슬은 그것의 다른 한쪽 끝에 불변 도메인(constant domain (C_L))에 따라오는 N 말단에서 가변 도메인(variable domain (V_L))을 갖는다. V_L은 V_H와 배열되고, C_L은 C_H1의 첫번째 불변 도메인과 배열된다.

항체들은 다른 종류 또는 이소타입으로 나눌 수 있다. 면역글로불린은 5가지 종류가 있다:각각 α, δ, ε, γ 및 μ로 표시되는 무거운 사슬을 갖는 IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM이다. γ 및 α 종류는 추가로 C_H 서열과 기능에 약간의 작은 차이를 기초로 서브타입으로 나눌 수 있다. 예를 들어 인간은 다음의 서브타입을 발현한다:IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, 및 IgA2. 어떤 척추동물의 L 사슬은 그 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라 카파와 람다라고 불리는 두 개의 명확히 구분되는 타입 중 하나로 나뉜다.

불변 도메인은 이황화 결합으로 함께 결합된 양 무거운 사슬의 C 말단 영역을 포함하는 Fc 영역을 포함한다. ADCC와 같은 항체의 효과기 기능은 Fc 부위에 있는 서열에 의하여 결정된다. 부위는 또한 어떤 특정한 타입의 세포에서 발견되는 Fc 수용체(FcR)에 의하여 인식되는 부위다.

V_H 및 V_L의 페어링은 항체의 무거운 또는 가벼운 사슬의 아미노 말단 도메인을 포함하는 "가변 부위" 또는 "가변 도메인"을 형성한다. 무거운 사슬의 가변 도메인은 "V_H"으로 언급된다. 가벼운 사슬의 가변 도메인은 "V_L"으로 언급된다. V 도메인은 항원 결합에 영향을 미치고 특정 항원에 대한 특정 항체의 특이성을 정의하는 "항원 결합 부위"를 포함한다. V 영역은 약 110 개의 아미노산 잔기에 달하고 각 9-12 아미노산의 길이인 "과가변 부위(hypervariable regions)"(일반적으로 약 3개)이라고 불리는 극도의 가변성을 갖는 짧은 영역으로 나뉘는 15-30 아미노산 길이의 프레임워크 부위(framework regions (FRs))(일반적으로 3개)로 불리는 다소 불변적인 확장으로 구성되어 있다. FRs는 크게 β-시트 구조 및 과가변 부위는 β-시트를, 몇몇 경우에는 그것의 일부를 형성하고, 연결하는 루프를 형성한다.

"과가변 부위"는 서열에서 과 가변적이고 및/또는 구조적으로 정의된 루프를 형성하는 항체의 가변 도메인의 부위를 말한다. 일반적으로 항체는 6개의 과가변 부위를 포함한다: V_H에서 3개(Hl, H2, H3) 및 V_L에서 3개(Ll, L2, L3).

"프레임워크" 또는 "FR" 잔기들은 과가변부위 잔기들은 여기에서 정의된 것보다는 가변 도메인 잔기들이다.

"온전한" 또는 "전체" 항체는 C_L과 적어도 하나의 무거운 사슬 불변 도메인인 C_HI, C_H2 및 C_H3와 같은 항원-결합 부위를 포함하는 것이다. 불변 도메인은 본래의 서열 불변 도메인(예를 들어 인간 본래의 서열 불변 도메인) 또는 그것의 아미노산 서열 변이체일 수 있다.

"가변 도메인을 포함하는 전체 항체 단편"은 Fab, Fab', F(ab')₂, 및 Fv 단편; 이중체(diabodies); 단일-사슬 항체 분자; 및 항체 단편으로부터 형성된 다중 특이적 항체를 포함한다.

"Fab 단편"은 H 사슬()의 가변 부위 도메인과 전체 L사슬과, 하나의 무거운 사슬의 첫번째 불변 도메인(C_HI)으로 구성된다. 각 Fab 단편은 항원 결합의 측면에서 1가(monovalent), 예를 들어 단일 항원 결합 부위를 갖는다.

"Fab' 단편"은 항체 힌지 부위에 하나 또는 그 이상의 시스테인을 포함하는 C_HI 도메인의 카르복시 말단에 추가적인 소수의 잔기를 갖는 점에서 Fab 단편과 다르다. Fab'- SH는 여기에서 불변 도메인의 시스테인 잔기가 자유 티올(thiol) 그룹을 갖는 Fab'로 정의된다.

"F(ab')₂ 단편"은 2가의 항원-결합 활성을 갖는 두 개의 이황화 연결 Fab 단편에 대략 상응하고, 여전히 항원과 교차-결합할 수 있다.

"Fv"는 완전한 항원-인식 및 결합 부위를 포함하는 최소한의 항체 단편이다. 이러한 단편은 하나의 무거운 사슬 및 하나의 가벼운 사슬 가변 부위 도메인이 단단하고 비-공유적 결합하는 이량체로 구성된다.

단일-사슬 Fv(single-chain Fv, scFv) 종류에서, 하나의 무거운 그리고 하나의 가벼운 사슬 가변 도메인은 가벼운 사슬 및 무거운 사슬이 두개의-사슬 Fv 종류에서의 그것에 대한 "이량체" 구조 아날로그로 연관될 수 있는 것과 같이 유연성이 있는 펩티드 링커로 공유적으로 연결될 수 있다. 이러한 두 도메인의 접힘으로부터 항원 결합을 위한 아미노산 잔기에 기여하고 항체에서 항원 결합 특이성을 주는 6개의 과가변 루프(H 및 L 사슬로부터 각각 3개의 루프)가 나온다.

"sFv" 또는 "scFv"로 또한 약칭되는 "단일-사슬 Fv"는 단일 폴리펩티드 사슬을 형성하기 위항 연결된 V_H 및 V_L 항체를 포함하는 항체 단편이다. 바람직하게는, scFv 폴리펩티드는 scFv가 항원 결합을 위하여 요구되는 구조를 형성하는 V_H 및 V_L 간의 폴리펩티드 링커를 추가로 포함한다.

"단일 가변 도메인"은 전체 결함부위보다 낮은 친화도를 가짐에도 불구하고, 항원을 인식하고 결합하는 능력을 갖는 Fv(항원에 특이적인 3개의 CDRs만을 포함하는)의 절반이다.

"이중체(Diabodies)"는 두 개의 항체-결합 부위를 가진 항체 단편을 말한다. 여기서 단편은 동일한 폴리펩티드 사슬(VH-VL)에서 가벼운 사슬 가변 도메인(VL)에 연결된 무거운 사슬 가변 도메인(VH)을 포함한다. 작은 항체 단편은 V_H 및 V_L 도메인간의 짧은 링커(약 5-10개의 잔기들)를 가진 sFv 단편(전 단락 참조)을 구성함으로써 제공된다. V 도메인의 사슬 내(intra-chain)가 아닌 사슬 간(interchain)에 이루어져 2가의(bivalent) 단편, 예를 들어 두 개의 항원 결합 부위를 가지는 단편이 된다.

이중체는 이가(bivalent)이거나 이중특이적(bispecific)일 수 있다. 이중 특이적 이중체는 두개의 항체의 V_H 및 V_L 도메인이 다른 폴리펩티드 사슬에 존재하여 두개의 "크로스오버" sFv 단편의 이질이량체(heterodimers)이다. 삼중체 및 사중체도 또한 당해 기술에 일반적으로 알려져 있다.

"정제된 항체"는 확인되고 분리되고 및/또는 미리 존재하는 환경의 요소로부터 회복된 것이다. 오염물질 요소는 항체의 치료적 용도를 저해하는 물질로서, 효소, 호르몬 및 다른 단백질성 또는 비단백질성 용질을 포함할 수 있다.

"인간 항체"는 인간에 의하여 생산된 항체의 그것에 상응하는 아미노산 서열을 갖는 항체를 말한다. 인간 항체는 파지-디스플레이 라이브러리를 포함하여 당해 기술분야에서 알려진 다양한 기술들을 사용하여 생산될 수 있다. 인간 항체는 또한 항체를 내재적인 유전자에 의해서는 할 수 없지만, 항원성 도전에 반응하여 그러한 항체를 생산하도록 변형된 형질전환 동물에 투여함으로써 얻어질 수 있다.

비-인간(예를 들어 설치류) 항체의 "인간화된" 형태는 비-인간 항체로부터 유래된 최소한의 서열을 포함하는 키메라 항체이다. 대부분은, 인간화된 항체는 인간 면역글로불린(수용 항체(recipient antibody))으로서, 수용된 과가변 부위로부터의 잔기들은 필요한 항체 특이성, 친화성 및 능력을 가지는 마우스, 래트, 토기 또는 비-인간 영장류와 같은 비인간 종의 과가변 부위로부터의 잔기로 대체된다. 어떤 경우에는, 인간 면역글로불린의 프레임워크 부위(FR) 잔기가 비-인간 잔기로 대체된다. 게다가, 인간화된 항체들은 수용 항체 또는 공여 항체에서 발견되지 않는 잔기들을 포함할 수도 있다. 이러한 변형은 항체 형성을 추가로 개량하기 위하여 만들어진다. 일반적으로, 인간화된 항체는 적어도 하나, 그리고 전형적으로 둘, 가변 부위의 대체로 모두를 포함할 것이고, 여기서 과가변 루프의 모두 또는 대체로 모두는 비-인간 면역글로불린의 그것에 대응되고 FRs의 모두 또는 대체로 모두는 인간 면역글로불린의 그것에 대응된다. 인간화된 항체는 선택적으로 전형적으로 인간의 면역글로불린의 그것, 면역글로불린 불변 부위(Fc)의 최소한 일부분을 또한 포함할 수 있다.

"모노클로날 항체"는 대체로 동종인 항체의 군집으로부터 얻어진 항체를 말하고, 즉, 군집을 포함하는 각각의 항체는 적은 양에 존재할지도 모르는 자연적으로 생길 수 있는 돌연변이를 제 외하고 동일하다. 모노클로날 항체는 항원에서 단일 항원 부위 또는 결정부위에 대해 유도되어 상당히 특이적이다. 그것들의 특이성에 더하여, 모노클로날 항체는 다른 항체에 의하여 오염되지 않는다는 점에서 유리하다. 모노클로날 항체는 하이브리도마 방법으로 만들어진다. "모노클로날 항체"는 테크닉을 사용하여 파지 항체 라이브러리로부터 또한 분리될 수 있다.

용어 "항-P2X₇ 수용체 항체" 또는 "P2X₇ 수용체에 결합하는 항체"는 항체가 P2X₇수용체, 전형적으로 비 기능적 P2X₇ 수용체를 표적으로 하는 진단 및/또는 치료제로서 유용할 정도로 충분한 친화력을 가진 P2X₇ 수용체에 결합할 수 있는 항체를 말한다. 바람직하게는, 연관되지 않은 P2X₇ 수용체 딘백질에 대한 P2X₇ 수용체 항체의 결합의 정도는 예를 들어 방사성 면역어세이(radioimmunoassay, RIA)으로 측정하여 P2X₇ 수용체에 대한 항체의 결합의 약 10% 이하이다. 어떤 실시예에서, P2X₇ 수용체에 결합하는 항체는 < 1μM, < 100 nM, < 10 nM, < 1 nM, 또는 < 0.1 nM의 해리 상수(dissociation constant (Kd))를 갖는다. 항 비 기능적 P2X₇ 수용체 항체는 일반적으로 비 기능적 P2X₇ 수용체에 결합하나 기능적 P2X₇ 수용체에는 결합하지 않는 이러한 혈청학적 특징의 일부 또는 모두를 갖는다.

"친화도 성숙" 항체는 하나 또는 그 이상의 과가변 부위에서 하나 또는 그 이상의 변이를 가진 것으로, 그런 변이를 가지지 않은 부모 항체와 비교하여, 항원에 대한 항체의 친화도가 증진되는 결과가 된다. 바람직한 친화도 성숙 항체는 표적 항원에 대하여 나노몰 또는 심지어는 피코몰의 친화도를 가질 수 있다. 친화도 성숙 항체는 당해 기술에서 알려진 과정에 따라 생산된다.

"블로킹" 항체 또는 "길항제(antagonist)" 항체는 그것이 결합한 항원의 생물학적 활성을 저해 또는 감소시키는 것이다. 바람직한 블로킹 항체 또는 길항제 항체는 항원의 생물학적 활성을 대부분 또는 완전히 저해한다.

"작용제(agonist) 항체"는, 여기에서 사용된, 관심이 있는 폴리펩티드의 기능적 활성의 적어도 하나를 흉내내는 항체이다.

"결합 친화도"는 일반적으로 분자(예를 들어 항체)의 단일 결합 부위 및 그것의 결합 파트너(예를 들어 항원)간의 비공유적 상호작용의 총합의 힘을 말한다. 다르게 표시되어 있지 않다면, 여기에서 사용된, "결합 친화도"는 결합하는 쌍의 멤버들 간의 (예를 들어, 항체와 항원) 1:1 상호작용을 반영하는 본래의 결합 친화도를 말한다. 파트너 Y에 대한 분자 X의 친화도는 일반적으로 해리 상수(Kd)로 대표될 수 있다. 친화도는 여기에서 설명된 것을 포함하여 당해 기술분야에서 알려진 보통의 방법으로 측정될 수 있다. 낮은-친화도 항체는 일반적으로 항원에 천천히 결합하고, 쉽게 분리되는 경향이 있고 반면에 높은 친화도 항체는 일반적으로 항원에 빨리 결합하고 오래 결합하고 있는 경향이 있다. 결합 친화도를 측정하는 다양한 방법들이 본 발명의 목적을 위해 사용될 수 있는 어느 것이든 당해 기술 분야에 알려져 있다.

"에피토프"는 일반적으로 항체의 항원 결합 부위에 결합하는 항원의 일부분을 말한다. 에피토프는 항원 결합 부위를 형성하는 항체 CDRs의 과가변 루프가 일차 단백질 구조에서처럼 아미노산의 서열에 결합하는 의미에서 "선형"일 수 있다. 어떤 실시예에서, 에피토프는 "구조적인 에피토프"인데, 즉 삼차 또는 사차 단백질 구조에서 제시되는 것처럼 CDRs의 과가변 루프가 잔기들에 결합하는 것이다.

일 실시예는 P2X₇ 수용체의 에피토프를 제공한다.

에피토프는 하기의 부분으로 이루어진다:

- P2X₇ 수용체의 첫번째 단량체의 부위의 형태인 첫번째 부위; 및

- 상기 수용체의 두번째 단량체의 부위의 형태인 두번째 부위로 형성되고;

여기서 첫번째 부위 및 두번째 부위는 상기 수용체에서 상기 수용체의 단량체의 서열번호:1의 210번 위치에 있는 잔기의 시스(cis) 이성화(isomeriasation)에 의하여 형성되며;

그리고 여기서 첫번째 부위 및 두번째 부위는 수용체에서 하는 첫번째 부위 및 두번째 부위에 항-P2X₇ 항체의 항원결합부위의 결합이 허용되도록 상기 수용체에 서로 인접하도록 배열되어 있다.

전형적으로 에피토프는 구조적인 에피토프이다. 이러한 실시예들에서, 첫번째 및 두번째 부위는 각각 서열번호:1의 하나 또는 그 이상의 잔기를 포함하는 분자적 공 간을 각각 정의한다. 전형적으로 첫번째 부위는 서열번호:1에서 보이는 서열을 갖는 단량체의 프롤린 210의 시스 이항화의 결과로 항체의 항원 결합 부위에 결합이 노출되는 서열번호:1의 하나 또는 그 이상의 잔기를 포함하는 분자적 공간을 정의하는 것이다. 이러한 잔기들은 Gly 200, His 201, Asn 202, Tyr 203, Thr 204, Thr 205, Arg 206, Asn 207, Ile 208, Leu 209 및 Pro 210을 포함한다. 일 실시예에서 첫번째 부위는 이러한 잔기들 중 적어도 하나를 포함한다. 전형적으로 두번째 부위에 얼마나 많은 잔기들이 존재하는가에 따라, 예를 들어 2 또는 3 이하일 수도 있음에도 불구하고, 첫번째 부위는 이러한 잔기들 중 적어도 4개를 포함한다. 일 실시예에서, 첫번째 부위는 하기의 표1에서 보이는 잔기들의 적어도 1 쌍을 포함한다:

His 201 Gly 200	Asn 202 Gly 200	Tyr 203 Gly 200	Thr 204 Gly 200	Thr 205 Gly 200	Arg 206 Gly 200	Asn 207 Gly 200	Ile 208 Gly 200	Leu 209 Gly 200
	Asn 202 His 201	Tyr 203 His 201	Thr 204 His 201	Thr 205 His 201	Arg 206 His 201	Asn 207 His 201	Ile 208 His 201	Leu 209 His 201
		Tyr 203 Asn 202	Thr 204 Asn 202	Thr 205 Asn 202	Arg 206 Asn 202	Asn 207 Asn 202	Ile 208 Asn 202	Leu 209 Asn 202
			Thr 204 Tyr 203	Thr 205 Tyr 203	Arg 206 Tyr 203	Asn 207 Tyr 203	Ile 208 Tyr 203	Leu 209 Tyr 203
				Thr 205 Thr 204	Arg 206 Thr 204	Asn 207 Thr 204	Ile 208 Thr 204	Leu 209 Thr 204
					Arg 206 Thr 205	Asn 207 Thr 205	Ile 208 Thr 205	Leu 209 Thr 205
						Asn 207 Arg 206	Ile 208 Arg 206	Leu 209 Arg 206
							Ile 208 Asn 207	Leu 209 Asn 207
								Leu 209 Ile 208

일 실시예에서 첫번째 부위는 표2에서 보여지는 잔기들의 2 또는 그 이상의 쌍을 포함한다.

첫번째 부위는 두 개의 세포외 도메인 접힘 중 더 큰 것에서 ATP 결합 부위의 형성에 직접적으로 관계된 하나 또는 그 이상의 주변적인 잔기들을 추가로 더 포함할 수 있다. 이것들은 Lys 193, Phe 275 및 Arg 294이다. Arg 125 는 두 개의 세포외 도메인 접힘 중 더 작은 것에 위치한다. 이렇게, 어떤 실시예에서, 첫번째 부위는 추가로 서열번호: 1의 Arg 125, Lys 193, Phe 275 및 Arg 294의 잔기의 하나 또는 그 이상을 추가로 포함한다. 첫번째 부위는 이러한 잔기들 단독으로 구성되지 않는다는 것을 이해할 수 있다. 상기에서 논의된 것처럼, 첫번째 부위는 서열번호:1에서 보이는 서열을 갖는 단량체의 Pro 210의 시스 이성화의 결과로서 항체의 항원결합부위에 결합하기 위하여 노출된 서열번호: 1의 하나 또는 그 이상의 잔기들을 포함하는 분자적 공간으로 정의된다. 본 명세서에서, Arg 125, Lys 193, Phe 275 및 Arg 294은 추가적으로 제공되기만 하고, 예를 들어 Gly 200, His 201, Asn 202, Tyr 203, Thr 204, Thr 205, Arg 206, Asn 207, Ile 208, Leu 209 잔기의 하나 또는 그 이상으로 대체되지는 않는다.

전형적으로 두번째 부위는 서열번호: 1에서 보여지는 서열을 갖는 단량체의 Pro 210의 시스 이성화의 결과로서 항체의 항원결합부위에 결합하기 위하여 노출된 서열번호: 1의 하나 또는 그 이상의 잔기들을 포함하는 분자적 공간으로 정의된다. 이러한 잔기들은 Lys 297, Tyr 298, Tyr 299, Lys 300, Glu 301, Asn 302, Asn 303, Val 304, Glu 305 및 Lys 306을 포함한다. 일 실시예에서 두번째 부위는 이런 잔기들 중 적어도 하나를 포함한다. 전형적으로 두번째 부위에 얼마나 많은 잔기들이 존재하는가에 따라, 예를 들어 2 또는 3 이하일 수도 있음에도 불구하고, 첫번째 부위는 이러한 잔기들 중 적어도 4개를 포함한다. 일 실시예에서, 두번째 부위는 적어도 하기의 표2에서 보이는 잔기의 적어도 1 쌍을 포함한다.

Tyr 298 Lys 297	Tyr 299 Lys 297	Lys 300 Lys 297	Glu 301 Lys 297	Asn 302 Lys 297	Asn 303 Lys 297	Val 304 Lys 297	Glu 305 Lys 297	Lys 306 Lys 297
	Tyr 298 Tyr 299	Tyr 298 Lys 300	Tyr 298 Glu 301	Tyr 298 Asn 302	Tyr 298 Asn 303	Tyr 298 Val 304	Tyr 298 Glu 305	Tyr 298 Lys 306
		Tyr 299 Glu 301	Tyr 299 Glu 301	Tyr 299 Asn 302	Tyr 299 Asn 303	Tyr 299 Val 304	Tyr 299 Glu 305	Tyr 299 Lys 306
			Lys 300 Glu 301	Lys 300 Asn 302	Lys 300 Asn 303	Lys 300 Val 304	Lys 300 Glu 305	Lys 300 Lys 306
				Glu 301 Asn 302	Glu 301 Asn 303	Glu 301 Val 304	Glu 301 Glu 305	Glu 301 Lys 306
					Asn 302 Asn 303	Asn 302 Val 304	Asn 302 Glu 305	Asn 302 Lys 306
						Asn 303 Val 304	Asn 303 Glu 305	Asn 303 Lys 306
							Val 304 Glu 305	Val 304 Lys 306
								Glu 305 Lys 306

어떤 실시예에서, 두번째 부위는 표 2에서 보여지는 잔기들의 2 또는 그 이상의 쌍들을 포함한다.

두번째 부위는 ATP 결합 부위의 형성에 직접적으로 관계된 하나 또는 그 이상의 주변적인 잔기들을 추가로 더 포함할 수 있다. 이것들은 Arg 307 및 Lys 311이다. 이렇게, 어떤 실시예에서, 두번째 부위는 추가로 Arg 307 및/또는 Lys 311을 추가로 포함한다. 두번째 부위는 이러한 잔기들 단독으로 구성되지 않는다는 것을 이해될 수 있다. 상기에서 논의된 것처럼, 첫번째 부위는 서열번호: 1에서 보여지는 서열을 갖는 단량체의 Pro 210의 시스 이성화의 결과로서 항체의 항원결합부위에 결합하기 위하여 노출된 서열번호: 1의 하나 또는 그 이상의 잔기들을 포함하는 분자적 공간으로 정의된다. 본 명세서에서, Arg 307 및 Lys 311은 추가로 제공되기만 하고, 예를 들어 Lys 297, Tyr 298, Tyr 299, Lys 300, Glu 301, Asn 302, Asn 303, Val 304, Glu 305 및 Lys 306 잔기의 하나 또는 그 이상으로 대체되지는 않는다.

어떤 실시예에서, 에피토프는 선형의 에피토프이거나 선형의 에피토프를 포함할 수 있다. 실시예들은 첫번째 부위가 표 3에서 서열번호: 1의 하기의 서열 중 하나를 포함하는 것을 포함한다:

Gly 200 내지 Tyr 203

His 201 내지 Thr 204

Asn 202 내지 Thr 205

Tyr 203 내지 Arg 206

Thr 204 내지 Asn 207

Thr 205 내지 Ile 208

Arg 206 내지 Leu 209

이러한 실시예에서, 에피토프의 두번째 부위는 표 4에서 서열번호: 1의 하기의 서열 중 하나를 포함할 수 있다:

Lys 297 내지 Lys 300

Tyr 298 내지 Glu 301

Tyr 299 내지 Asn 301

Lys 300 내지 Asn 303

Glu 301 내지 Val 304

Asn 301 내지 Glu 305

Asn 303 내지 Lys 306

어떤 실시예에서, 첫번째 부위는 두번째 부위보다 많은 잔기들을 포함한다. 다른 실시예에서, 두번째 부위는 첫번째 부위보다 더 많은 잔기들을 포함한다.

첫번째 및 두번째 부위는 각각 약 4에서 약 10개, 예를 들어 5, 6, 7, 8 또는 9개의 잔기를 포함할 수 있다. 두번째 분위에서 더 많은 잔기들이 존재하면, 첫번째 부위에서 더 적은 잔기들, 즉 4 이하, 예를 들어 2 또는 3, 이 존재할지도 모른다. 동일하게 기타 등등 적용된다.

여기에서 설명된 것처럼, 첫번째 및 두번째 부위는 수용체에서 서로 인접하게 배열되어 에피토프를 형성하는 첫번째 및 두번째 부위에 항-P2X₇ 수용체의 항원 결합 부위의 결합하게 할 수 있다. 좀더 상세하게, 발명자들은 떨어진 단량체들에 위치함에도 불구하고, 조합으로 첫번째 및 두번째 부위는 항체의 단일 항원 결합 부위로 결합할 수 있는 에피토프를 형성한다는 것을 발견하였다. 일반적으로, 에피토프의 첫번째 및 두번째 부위는 단지 약 40 Å(Angstroms) 공간적으로 떨어져 있다. 거리가 이보다 더 크다면, 더 적은 잔기들이 결합되는 경우에서 수용체에서 단량체들 간에 더 큰 거리를 횡단하도록 요구되기 때문에 항체 결합 친화도는 감소하는 경향이다. 15, 20, 25, 30, 35 Å(Angstroms)처럼 40 Å(Angstroms)보다 적은 거리가 가능함에도 불구하고, 일반적으로 첫번째 및 두번째 부위는 약 10Å(Angstroms) 공간적으로 떨어져 있다.

여기에서 설명된 에피토프는, 예를 들어 자연적으로 생긴 P2X₇ 수용체 또는 합성 P2X₇ 수용체의 단편과 같이, 대체로 정제되거나 또는 분리된 형태로 제공될 수 있다.

다른 실시예에서 상기에서 설명된 것처럼 에피토프를 포함하는 P2X₇ 수용체를 제공한다. 전형적으로 수용체의 단량체들 중 적어도 하나는 서열번호: 1에서 보여지는 것처럼 대체로 아미노산 서열을 갖는다. 수용체는 P2X₇ 수용체의 자연적으로 생긴 변이체일 수 있다. 예를 들어, 여기에서 P2X₇ 단량체들은 P2X₇ 수용체를 형성하는 단량체들의 자연적으로 생긴 절단되거나 분비된 형태(예를 들어, 세포외 도메인 서열로 구성되는 형태 또는 그것의 절단된 형태), 자연적으로 생긴 변이 형태(예를 들어 선택적으로 이어진 형태) 및 자연적으로 생기 대립형질 변이체를 포함하는 변이체, 대립형질 변이체 및 이소폼(isoforms)을 잇는다. 본 발명의 어떤 실시예에서, 본래의 서열 P2X₇ 단량체 폴리펩티드는 서열번호: 1에서 보이는 총-길이의 아미노산 서열을 포함하는 성숙하거나 또는 총-길이의 본래의 서열 폴리펩티드이다. 어떤 실시예에서 P2X₇ 수용체는 예를 들어 서열번호: 1에서 보이는 서열에서 다양한 아미노산들이 치환, 삭제, 또는 삽입되는 변형된 아미노산 서열을 가질 수 있다.

전형적으로 수용체는 상기에서 설명된 에피토프를 포함하는 비 기능적 P2X₇ 수용체이다. 시스 이성화는 예를 들어 단량체 일차 서열의 돌연변이 또는 비정상적인 번역 후 가공을 포함하는 단량체의 잘못 접힘을 일으키는 다른 분자적 사건으로부터 발생할 수 있다. 어떤 실시예에서, 수용체의 모든 단량체들이 단량체의 210번 위치에 있는 잔기의 시스 이성화를 갖는 것은 아니다. 예를 들어, 수용체의 단량체들의 1 또는 2개가 서열번호:1의 위치 210번에 있는 잔기의 시스 이성화를 가질 수 있다.

수용체는 상당히 정제되거나 분리된, 즉 세포로부터 분리된, 형태로 제공될 수 있다. 고형 상으로 제공되든지 또는 다른 것으로 제공되든지, 수용체의 동질적인 시료의 형태로 제공될 수 있다.

아래에서 상세히 설명된 것처럼, 발명자들은 상기에서 설명된 에피토프에 결합하기 위한 항원 결합 부위를 갖는 항체를 제작하였다. 이렇게 어떤 실시예에서 상기에서 설명된 것처럼, 에피토프에 결합하기 위한 항체를 제공하였다.

전형적으로 항원 결합 부위(또는 가변 도메인)의 적어도 하나의 CDR(complimentarity determining region)(또는 과가변부위)은 에피토프의 첫번째 부위에 결합하고, 그 항원 결합 부위의 적어도 다른 하나의 CDR은 에피토프의 두번째 부위에 결합한다. 일부 실시예에서, CDR의 두개는 첫번째 부위에 결합하고 다른 CDR은 두번째 부위에 결합한다. 다른 실시예에서, CDR의 두개는 두번째 부위에 결합하고 다른 CDR은 첫번째 부위에 결합한다. 일부 실시예에서, 하나의 CDR은 첫번째 부위에 결합하고, 다른 CDR은 두번째 부위에 결합하며 남은 CDR은 에피토프의 첫번째 또는 두번째 부위 중 어디에도 결합하지 않는다.

어떤 실시예는 항-비 기능적 P2X₇ 수용체 항체를 제공한다. 여기서 항체의 항원 결합 부위는 상기 표 1의 잔기들의 적어도 한 쌍에 결합하고, 상기 표 2의 잔기들의 적어도 한 쌍에 결합한다.

다른 실시예는 항-비 기능적 P2X₇ 수용체 항체를 제공한다. 여기서 항체의 항원 결합 부위는 상기 표 3의 적어도 하나의 서열에 결합하고, 상기 표 4의 적어도 하나의 서열에 결합한다.

다른 실시예는 항체에 결합된 상기에서 설명된 에피토프의 형태인 면역 복합체를 제공한다. 전형적으로, 에피토프는 P2X₇ 수용체에서 제공된다. 수용체의 모든 에피토프는 항체 또는 일부에만 결합한다. 예를 들어, 수용체의 3개 이하의 에피토프가 항체에 결합한다. 복합체는 수용체보다 많거나 또는 적은 항체 분자를 포함할 수 있다.

여기에서 설명된 것처럼, 비 기능적 P2X₇ 수용체의 3차원 모델을 사용하여, 발명자들은 발명의 에피토프에 결합하기 위한 항체를 생산하는데 사용될 수 있는 펩티드의 범위를 결정하였다. 이렇게, 어떤 실시예는, N- 및 C-말단 잔기로 각각 정의되는 N-말단 부위 및 C-말단 부위, N- 및 C-말단 부위를 포함하는 펩티드를 제공한다. 여기서:

- N-말단 부위는 하기 중 하나의 서열을 포함한다:

· HNYTTRNIL (SEQ ID NO: 2);

· GHNYTTRNIL (SEQ ID NO: 3);

· DFPGHNYTTRNIL (SEQ ID NO: 4);

· 적어도 4개의 잔기의 서열번호: 2 내지 4의 단편;

· 서열번호: 2-4 중 어느 하나의 서열, 여기서 D 잔기는 E, N 또는 Q 잔기로 보수적으로 치환된다; 여기서 F 잔기는 Y 또는 W 잔기로 보수적으로 치환된다;

여기서 G 잔기는 A, V, L 또는 I 잔기로 보수적으로 치환된다; 여기서 H 잔기는 K 또는 R 잔기로 보수적으로 치환된다; 여기서 N 잔기는 D, E 또는 Q 잔기로 보수적으로 치환된다; 여기서 Y 잔기는 F 또는 W 잔기로 보수적으로 치환된다; 여기서 T 잔기는 C, S 또는 M 잔기로 보수적으로 치환된다; 여기서 R 잔기는 H 또는 K 잔기로 보수적으로 치환된다; 여기서 I 잔기는 G, A, V 또는 L 잔기로 보수적으로 치환된다; 및 여기서 L 잔기는 G, A, V 또는 I 잔기로 보수적으로 치환된다;

· MPACCSCSDVFQYETNKVTRIQSMNYGTIKWFFHVIIFSYVCFALVSDKL YQRKEPVISSVHTKVKGIAEVKEEIVENGVKKLVHSVFDTADYTFPLQGN SFFVMTNFLKTEGQEQRLCPEYPTRRTLCSSDRGCKKGWMDPQSKGIQTG RCVVHEGNQKTCEVSAWCPIEAVEEAPRPALLNSAENFTVLIKNNIDFPG

HNYTTRNIL(서열번호: 5); 또는

· C 말단에서 HNYTTRNIL을 포함하는 서열번호: 5의 서열 내의 서열,

- C-말단 부위는 프롤린, 알라닌 또는 글리신인 C-말단 잔기를 포함한다, 여기서 N-말단 부위의 C-말단 잔기는 C-말단 부위의 N-말단 잔기에 공유적으로 결합된다.

C 말단 부위는 시스 구조에서 프롤린의 형태로 단일 아미노산 잔기로 구성된다. 그 대신에 프롤린의 N-말단에 위치한 다른 프롤린을 포함할 수 있다.

전형적으로, C-말단 부위의 C-말단 잔기는 약 10 내지 40 Å(Angstroms)의 길이를 가진 링커로 추가적인 펩티드에 연결된다. 일 실시예에서 추가적인 펩티드는 서열번호: 6의 서열 또는 4개의 잔기 또는 그 이상인 그것의 단편으로 구성된다. 일 실시예에서 C-말단 부위는 시스 구조에서 프롤린인 C-말단 잔기를 포함한다.

일 실시예에서, 추가적인 펩티드는 P2X₇ 수용체 서열로부터 유래되고, 서열번호: 1의 P2X₇ 수용체의 단지 594 잔기를 갖는다. 특히, 추가적인 펩티드는 서열번호: 6의 서열 또는 서열번호: 6의 서열 내의 서열로 구성될 수 있다. 서열번호: 6내의 이러한 펩티드의 예는 표 5에서 설명된 서열을 갖는 것을 포함한다(도 1에 따라 번호를 매김):

K281 내지 K297	Y298 내지 G314
T282 내지 Y298	Y299 내지 I315
T283 내지 Y299	K300 내지 R316
N284 내지 K300	E301 내지 F317
V285 내지 E301	N302 내지 D318
S286 내지 N302	N303 내지 I319
L287 내지 N303	V304 내지 L320
Y288 내지 V304	E305 내지 V321
P289 내지 E305	K306 내지 F322
G290 내지 K306	R307 내지 G323
Y291 내지 R307	T308 내지 T324
N292 내지 T308	L309 내지 G325
F293 내지 L309	I310 내지 G326
R294 내지 I310	K311 내지 K327
Y295 내지 K311	V312 내지 F328
A296 내지 V312	F313 내지 D329
K297 내지 F313

표 5에서 보이는 펩티드는 6 내지 17 잔기의 길이를 가진다. 일 실시예에서, 펩티드 단편은 KYYKENNVEKRTLIKVF(서열번호: 7)의 서열로 구성되는 K297에서 F313이다.

C-말단 부위는 어떤 적당한 링커로 사용될 수 있는 적당한 컨쥬게이션 반응으로 추가적인 펩티드에 연결될 수 있다. 링커는 면역원성(immunogenicity)을 돕고 공간적 간섭을 최소화할 수 있는 특정한 길이의 것일 수 있다. 예를 들어, 링커는 10 Å 내지 40 Å의 길이일 수 있다. 바람직하게는 링커는 10 Å 또는 20 Å의 길이를 가질 수 있다.

링커는 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기의 아미노산 링커일 수 있다. 용어 "아미노산 링커"는 그러나 링커가 오로지 아미노산 잔기로만 구성되는 것을 의도하는 것은 아니다. 아미노산 링커는 상당히 본 발명의 펩티드를 저해하지 않는 아미노산 서열일 수 있다.

아미노산 링커의 아미노산 잔기는 바람직하게는 자연적으로 생긴 아미노산 또는 비자연적 아미노산 및 모두-L형태 또는 모두-D 형태 또는 그것의 혼합물이다. 예를 들어, 아미노산은 글리신, 알라닌, 류신, 세린, 발린 및 트레오닌에서 선택될 수 있다. 바람직하게는 링커는 글리신 및 알라닌으로부터 선택되는 하나 또는 두 개의 아미노산으로 구성된다.

어떤 실시예는 하기의 식으로 정의되는 펩티드를 제공한다: (A)(Xn)(B),

여기에서:

- (A)는 GHNYTTRNILP(서열번호: 8)의 아미노산의 서열 또는 적어도 4개의 아미노산인 그것의 단편이고;

- (Xn)는 길이가 10 내지 40 Å(angstroms)인 링커, 상기 링커는 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기로 구성되고;

- (B)는 AKYYKENNVEK(서열번호: 9)의 아미노산의 서열 또는 적어도 4개의 아미노산인 그것의 단편인 것을 특징으로 한다.

다른 실시예는 하기의 서열을 제공한다:

GHNYTTRNILPGAGAKYYKENNVEK (서열번호: 10).

본 발명의 펩티드는 고체 상 합성(solid phase synthesis) 및 재조합 DNA 기술을 포함하여 당해 기술에서 알려진 다양한 기술에 의하여 만들어질 수 있다.

당해 기술에서 알려진 것과 같이, 운반체(carrier)는 면역원성(immunogenicity)을 증가시키기 위하여 에피토프를 형성하는 펩티드에 컨쥬게이트되는 물질이다. 일부 운반체는 복합 운반체로 결합하여 증가된 분자량의 항원을 면역 반응이 일어나는 숙주(host)에 제공된다.

바람직한 운반체는 박테리아성 톡신 또는 톡소이드를 포함한다. 다른 적당한 운반체는 수막염균(N. meningitides) 외막 단백질, 소 혈청 알부민과 같은 알부민, 합성 펩티드, 열 충격 단백질(heat shock proteins), 백일해(Pertussis) 단백질, 헤모필러스 인플루엔자(H. influenza)의 단백질 D 및 클로스트리듐 디피실리균(C. difficile)의 독소 A, B 또는 C를 포함한다.

운반체가 박테리아성 톡신 또는 톡소이드이면, 디프테리아(diphtheria) 또는 파상풍(tetanus) 톡소이드가 선호된다.

바람직하게는 운반체는 본 발명의 펩티드와 상호작용할 수 있는 작용기(functional groups)를 포함하거나 펩티드와 상호작용할 수 있게 변형될 수 있다.

상기에서 언급된 것처럼, 본 발명의 펩티드는 살아있는 세포에서 비 기능적 P2X₇ 수용체에 결합하지만 살아있는 세포에서 기능적 P2X₇ 수용체에는 아닌 모노클로날 항체를 만들어내는데 유용하다. 추가적인 장점은 이러한 펩티드들이 또한 살아있는 세포에서 기능적 P2X₇ 수용체에 결합하지만, 살아있는 세포에서 비 기능적 P2X₇ 수용체에는 아닌 모노클로날 항체를 만들어내는데 이용될 수도 있다.

더 후반의 항체는 항체 요법이 조직적으로 적용될 수 있기 위해서 개체를 위하여 사용될 수 있기 때문에 특히 중요하다. 좀더 상세하게, 군집의 대부분은 림프 조직과 같은 조직들에서 기능적 P2X₇ 수용체의 발현을 조절하는 대립형질들을 포함한다. 이러한 조직 부위에서 수용체 발현은 전체적으로 보통의 생리인 것으로 이해된다. 반대로, 군집의 소수는 조직 부위에서 비 기능적 P2X₇ 수용체의 발현을 조절하는 하나 또는 그 이상의 대립형질들을 갖는다. 이러한 후반의 군집이 암의 치료를 위하여 살아있는 세포에서 발현되는 비 기능적 수용체에 결합하는 항체를 제공한다면, 이러한 치료는 비 기능적 수용체를 발현하는 림프구들을 제거하기 때문에 면역계에 영향을 미치는 위험이 있다.

따라서, 살아있는 세포에서 기능적 수용체에 결합하지만 비 기능적 수용체에는 아닌 것으로 여기에서 설명된 본 발명의 항체는 항체 치료가 적당히 변형된 형태로 제공되는지 또는 아닌지를 위한 개체를 선택을 돕는데 특히 유용하다. 그러한 어세이는 비-기능적 수용체 대한 항체를 사용하여 동일한 선별과 공동으로 사용될 수 있다. 이러한 방법으로 림프 조직에 기능적 수용체를 가진 환자 및 림프 조직에 비-기능적 수용체를 가진 환자는 기능적 또는 비-기능적 수용체의 낮은 발현 수준을 가진 환자로 나뉠 수 있다. 동시에 각 항체를 사용하는 것은 최소한 비-기능적-수용체에 치료적 항체를 가진 그들의 상태의 치료를 동반하여 그들의 면역 세포의 결핍의 결과로서 더 상세한 모니터링을 요구하는 환자의 구별을 가능하게 한다.

어떤 실시예는 살아있는 세포에서 기능적 P2X₇ 수용체에 결합하지만 비 기능적 P2X₇ 수용체에는 결합하지 않는 항체를 제공한다. 다른 실시예는 살아있는 세포에서 발현되는 비 기능적 P2X₇ 수용체에 결합하지만 기능적 P2X₇ 수용체에는 결합하지 않는 항체를 제공한다. 전형적으로 이러한 항체들은 본 발명의 펩티드에 대하여 발생하는 것들이다.

어떤 실시예에서 본 발명의 항체는 항체 분자 전체로서 10^-7M 내지 10^-13M 범위의 친화도를 가진다. 하이브리도마를 사용하는 것은 생산된 항체에 의한 하이브리도마 성장의 저해를 피하기 위하여 바람직하게 IgM으로 사용한다면 10^-7M을 요구하는 경향이다. 이러한 친화도는 항체 친화도 성숙을 포함한 숙련된 기술자에게 알려진 일반적인 기술을 사용하여 증가 또는 감소될 수 있다.

항체는 모노클로날 또는 폴리클로날 항혈청으로부터 얻어질 수 있다. 항체는 하이브리도마 또는 파지 디스플레이 라이브러리에 의하여 생산될 수 있다. 모노클로날 및 폴리클로날 항혈청은 일반적인 기술에 따라 아쥬반트와 함께 본 발명의 펩티드로 숙주를 면역화함으로써 얻어질 수 있다. 결과인 혈청은 혈청이 살아있는 세포에서 수용체 발현에 노출되었는지를 다양한 혈청학적 방법을 사용하여 선별될 수 있다.

본 발명을 이용하여 재조합 발현을 이용한 항체를 제공하는 것이 가능해진다. 예를 들어, 본 발명의 항체로 면역화함으로서 생긴 항체들의 CDRs는 서열분석되고, 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 결정되고 그리고 그때 항체의 재조합 합성을 위한 발현 벡터로 서브클론된다. 그때 키메라 항체, 즉 인간 가변 도메인 및 비 인간 불변 도메인을 포함하는 것, 인간화된 항체, 즉 비 인간 CDRs를 인간 항체 프레임워크 및 완전한 인간 항체로 이식함으로써 생기는 것, 을 개발하는 기회가 제공된다.

본 발명의 항체는 효과기 기능에 따라 변형되어 예를 들어 암을 치료함에 있어서 항체의 효과를 증가시킬 수 있다. 예를 들어, 항체 무거운 사슬의 불변 부위는 마우스 IgG2a, 마우스 IgG2a 또는 인간 IgG1 서브타입으로 바뀔 수 있다. 이렇게 생성된 항체는 개선된 세포성 세포독성(antibody dependent cellular cytotoxicity, ADCC) 또는 보체 매개 세포독성(complement mediated cytotoxicity, CMC)을 가질 수 있다. 또다른 변형에서, 푸코스(fucose)는 Fc 부위에서 제거될 수 있고, 또는 시알산(sialic acid) 잔기가 Fc 부위로 도입될 수 있다. 이렇게 생성된 항체는 항체 의존성 세포성 세포독성(ADCC) 또는 보체 매개 세포독성(CMC) 활성을 증가시킬 수 있다. 그러나 다른 변형에서, 시스테인 잔기는 Fc 부위로 도입될 수 있고, 그것 때문에 이 부위에서 사슬내 이황화 결합 형성이 허용된다. 이렇게 생성된 순종이량체 항체는 내부화 가능성(internalization capability)이 증가될 수 있고 그리고/또는 보체-매개 세포 사멸 및 항체 의존성 세포성 세포독성을 증가시킬 수 있다. 증가된 항암 활성을 갖는 순종이량체 항체는 또한 이종이중기능적인(heterobifunctional) 크로스-링커들을 사용하여 준비될 수 있다. 그 대신에, 항체는 Fc 부위를 변형하거나 혼합하도록 조작될 수 있고 그런 까닭에 보체 용해 및 항체 의존성 세포성 세포독성 가능성을 증가시킬 수 있다.

항체는 어떤 서브타입의 전체 항체일 수 있다. 항체가 항체 단편이면, 항체 단편은 dAb, Fab, Fd, Fv, F(ab')2, scFv 및 CDR로 구성되는 그룹에서 선택된다.

항체 또는 단편은 비드, 표면 또는 조직 배양 용기와 같은 고체 상에 제공될 수 있다.

그것의 항체 또는 단편은 살아있는 세포에서 발현되는 수용체에서 항체 또는 그것의 단편의 결합의 탐지를 위한 표지로 제공될 수 있다.

항체 및 단편은 의학적 이미지화의 용도를 위해 표지될 수 있다. 그러한 방법은 67 Cu, 90 Y, 125 I, 131 I, 186 Re, 188 Re, 211 At, 212 Bi을 포함한 동위원소와 같은 표지 또는 이미지화제의 화학적 부착, 수용가능한 운반체로 물질에 표지된 항체 또는 단편의 투여, 및 표적 위치에서 표지된 항체 또는 단편을 생체 내(in vivo) 이미지화를 수반한다. 동위원소-표지된 항체 또는 그것의 단편 여기서 설명된 암의 생체 내 이미지화에 특히 유용할 수 있다.

항체는 숙련된 당업자에 알려진 방법으로 정제될 수 있다. 정제 방법은, 여러 가지 가운데서, 선택적 침전, 액체 크로마토그래피, HPLC, 전기영동, 크로마토포커싱 및 다양한 친화도 기술을 포함한다.

일부 실시예에서, 여기에서 개시된 항체는 또한 항체의 다량체(multimeric) 형태를 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 항체는 단량체 면역 글로불린 분자의 항체 이량체, 삼량체 또는 고차 다량체의 형태일 수 있다.

항체의 교차연결은 당해기술에서 알려진 다양한 방법을 통해 할 수 있다. 예를 들어, 항체의 교차연결은 항체의 자연적인 응집을 통해, 화학적 또는 재조합 연결 기술을 통해, 또는 당해 기술에서 알려진 다른 방법으로 이루어질 수 있다. 예를 들어, 정제된 항체 준비는 항체 순종이량체(homodimers), 및 다른 고차 항체 다량체를 포함하는 단백질 응집을 지속적으로 형성할 수 있다. 특정 실시예에서, 관심있는 항체에 결합하기 위하여 두번째 항체를 사용함으로써 항체의 교차연결은 순종이량체를 형성하는데 사용될 수 있다. 교차연결제(crosslinker) 항체는 관심있는 항체와 비교하여 다른 동물로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 염소 항-마우스 항체(Fab 특이적)은 순종이량체를 형성하기 위하여 마우스 모노클로날 항체에 추가될 수 있다. 이러한 이가의 교차연결제 항체는 순종이량체를 형성하는 관심있는 두 항체의 Fab 또는 Fc 부위를 인식한다.

그 대신에, 항체 순종이량체는 당해 기술에서 알려진 화학적 연결 기술을 통해 만들어질 수 있다. 화학적 교차연결제는 순종 또는 이종이중기증적(heterobifunctional)일 수 있고 순종이량체를 형성하는 두 개의 항체와 공유적으로 결합할 것이다. 일부 실시예에서, 화학적 교차연결제는 항체 기능에 영향을 줄지도 모르기 때문에 항체의 항원-결합 부위와 상호작용하지 않는 것이 바람직하다. 당해 기술에서 숙련된 사람들에 의해 만들어질 수 있기 때문에, 항체는 Fab 부위에 교차연결될 수 있다.

아직 본 발명의 또 다른 면에서 살아있는 세포에서 발현된, P2X₇ 수용체에 상기에서 설명된 항체 또는 그것의 단편의 결합으로 형성된 면역 복합체를 제공한다. 수용체는 기능적이거나 비기능적일 수 있다.

또 다른 실시예는 상기에서 설명된 펩티드에 대한 항체 또는 그것의 단편의 결합으로 형성되는 면역 복합체를 제공한다.

본 발명의 에피토프 또는 펩티드를 포함하는 면역 복합체를 포함하여, 본 발명의 면역 복합체는 생체 외 또는 생체내에서의 탐지가 전종양형성 및 종양형성(neoplasia)을 포함하는 질병 또는 증상에 대한 존재 또는 소인(predisposition)를 나타내기 때문에 특히 중요하다.

게다가, 상기에서 설명된 것처럼 살아있는 세포에서 기능적 P2X₇ 수용체에 대한 상기에서 설명된 항체 또는 그것의 단편의 결합으로 형성된 면역 복합체의 탐지는 비-기능적 P2X₇ 수용체 발현으로 특징지어진 질병 또는 증상에 대한 치료를 위한 개체의 적합성의 중요한 지표이다. 군집의 작은 백분율은 흉선 세포, 수지상 세포, 림프루, 대식세포 및 단핵구와 같은 그들의 조혈 세포에서 비-기능적 위치에 P2X₇ 수용체를 발현한다. 그런 까닭에 예를 들어 다른 비-조혈 세포에서 비-기능적 P2X₇의 존재 때문에 암의 위험이 있거나 또는 암을 가지는 것으로 확인한 개체에서 비-기능적 수용체를 위한 이러한 동형접합성(homozygous) 표현형을 확인하는 것이 중요하다.

이형접합성(heterozygous) 비-기능적 P2X₇ 수용체 표현형을 갖는 개체는 본 발명의 면역 복합체의 확인에 이로울 것이라는 것이 또한 믿어진다. 비-기능적 P2X₇ 수용체를 표적으로 하는 치료는 그들의 표현형을 고려하여 맞추어 지고, 적정될 수 있다.

이러한 탐지 방법은 아래에서 좀더 상세히 설명되었다.

면역 복합체에 포함된 항체 또는 항체 단편은 비드나 플레이트와 같은 고체 상에 부착될 수 있어 면역 복합체가 형성되었을 때 고체 상에 부착되어진다. 그 대신에, 면역복합체에 포함된 P2X₇ 수용체, 단량체 또는 그것의 단편이 고체 상에 부착될 수 있다.

항체는 면역 복합체의 형성의 탐지를 위해 표지될 수 있다.

면역 복합체는 면역 복합체의 수집을 위한 수집 항체와 같이 항체 또는 그것의 단편을 추가로 포함할 수 있다. 추가적인 항체 또는 그것의 단편은 항 P2X₇ 수용체 항체에 결합할 수 있을지도 모른다. 또한, 추가적인 항체 또는 그것의 단편은 수용체 또는 그것의 단편에 결합할 수 있을지도 모른다.

추가적인 항체 또는 그것의 단편은 상기에서 설명된 상과 같은 고체 상에 결합될 수 있다.

추가적인 항체는 면역 복합체의 형성의 탐지를 위해 표지될 수 있다. 표지의 예는 형광물질, 염료, 동위원소 등을 포함한다.

추가로 실시예는 펩티드에 대한 면역 반응을 가능하게 하기 위한 아쥬반트 또는 다른 분자와 함께 본 발명의 펩티드 또는 에피토프를 포함하는 조성물을 제공한다. 아쥬반트는 체액성 또는 세포성 면역반응 또는 둘 다를 가능하게 하기 위하여 선택될 수 있다. 어떤 실시예에서 이러한 조성물은 비 기능적 P2X₇ 수용체 관련 질병에 대한 백신화에 유용하다.

다른 실시예는 약학적 운반체, 첨가제 또는 희석액과 함께 본 발명의 항체를 포함하는 조성물을 제공한다. 이러한 조성물은 암 또는 다른 비 기능적 P2X₇ 수용체 관련 질병의 치료를 위한 항체의 전신적인 투여에 유용하다. 바람직한 실시예에서 항체는 단일 도메인 항체이다.

추가적인 실시예는 상피, 간엽, 생식, 신경, 늑막 또는 혈액 세포에서 비 기능적 P2X₇ 수용체의 발현으로 특징지어진 질병 또는 상태를 위한 치료, 진단 또는 모니터링의 방법, 상기 치료 진단 또는 모니터링을 요하는 개체에 항체를 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공하고, 여기서 상기 항체는 살아있는 세포에서 비 기능적 P2X₇ 수용체에 결합하지만 살아있는 세포에서 기능적 P2X₇ 수용체에는 결합하지 않는 항체를 말한다. 일 실시예에서 방법은 살아있는 세포에서 기능적 P2X₇ 수용체에 결합하지만 살아있는 세포에서 비 기능적 P2X₇ 수용체에는 결합하지 않는 항체를 사용하는 제 1단계를 포함한다.

어떤 실시예는 여기에서 설명한 것처럼 암을 가진 개체를 치료하기 위한 항체의 용도를 제공한다. 다른 실시예는 여기에서 설명한 것처럼 암을 가진 개체를 치료하기 위한 의약의 제조에의 항체의 용도를 제공한다. 다른 실시예는 본 발명의 에피토프 또는 펩티드에 결합하는 항체로 암을 가진 개체의 조직을 접촉하는 단계를 포함한 암에 걸린 개체를 치료하는 방법을 제공한다. 그 방법은 생체 내 또는 생체 외에서 시술될 수 있다.

전형적으로 암은 상피(유방, 전립선, 장, 폐, 피부, 자궁경부, 자궁, 질), 간엽, 생식, 신경, 늑막 또는 혈액 기원의 것이다.

항체는 상기에서 설명된 것처럼 항원 결합 부위, 면역글로불린 가변 부위, 항체, Fab, dab, scFv, 이중체, 삼중체, 융합 단백질, 컨쥬게이트 또는 약학적 조성물일 수 있다.

용량, 용법, 투여 경로 등은 아래에서 상세히 설명한다.

또 다른 실시예는 에피토프 또는 본 발명의 펩티드에 결합하기 위한 항원 결합 부위, 항원 결합 부위 및 약학적으로 허용가능한 수용체, 희석제 또는 첨가제를 포함한 면역글로불린 가변 부위, 항체, Fab, dab, scFv, 이중체, 삼중체, 융합 단백질 또는 컨쥬게이트를 포함한 약학적 조성물을 제공한다.

그것을 필요로 하는 개체에 항체를 준비하고 투여하는 방법은 당해 기술에 숙련된 자에게 잘 알려져 있거나 또는 손쉽게 결정된다. 투여 경로는 흡입 또는 국소로 예를 들어, 경구, 비경구(정맥 주사, 동맥주사, 복강내, 근육내, 피하, 직장 또는 질)일 수 있다. 투여의 한 형태는 완충액(예를 들어, 아세테이트, 인산염 또는 시트르산 완충액), 계면 활성제(예를 들어 복합 소르브산염), 선택적으로 안정화제(예를 들어 인간 알부민)을 포함하는, 주사용 용액 특히 정맥 주사 또는 동맥주사 투여용이거나, 드립(drip)용 용액이다. 다른 방법에서 항체는 질병 부위로 직접 전달되어 그 결과 병든 세포나 조직을 항체에 노출시키는 것을 증가시킬 수 있다.

비경구 투여를 위한 조제는 멸균 수용액(수용성 운반체는 염분 및 완충된 매체를 포함하는 물, 알콜/수용성 용액, 에멀젼 또는 현탁액을 포함한다) 또는 비-수용성(비-수용성 용질은 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 기름과 같은 식물성 기름, 및 에틸 올레이트와 같은 주사가능한 유기 에스터이다) 용액, 현탁액, 및 에멀젼을 포함한다. 약학적으로 허용 가능한 운반체는 0.01-0.1 M, 바람직하게는 인산염 완충액 또는 0.8% 소금물을 포함한다. 다른 일반적인 비구강 운송 수단은 인산 나트륨 용액, 링거의 덱스트로스, 덱스트로스 및 염화나트륨, 락테이티드 링거액(lactated Ringer's), 또는 고정 기름(fixed oils)을 포함한다. 정맥주사의 운송 수단은 유체(fluid) 및 링거 덱스트로스에 기초한 것처럼 영양 보충제, 전해질 보충제 및 유사물질을 포함한다. 방부제 및 기타 첨가제는 또한 예를 들어 항생제, 항산화제, 킬레이트제, 및 불활성 기체 및 유사물질과 같이 존재할 수 있다.

좀더 특별하게, 주사용 용도로 적당한 약학적 조성물은 멸균된 주사가능한 용액의 임기(extemporaneous) 제조를 위하여 멸균된 수용액(물에 녹을 수 있는) 또는 분산물질 및 멸균된 분말을 포함하고, 그러한 경우에, 조성물은 반드시 멸균되어야 하고 간편한 주사기능력(syringability)가 존재하는 정도인 유체(fluid)이어야 한다. 제조 및 보관의 조건하에서 안정하여야 하여야 하고 바람직하게는 박테리아 및 곰팡이과 같은 미생물의 오염 작용에 대하여 보존될 것이다. 운반체는 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 용액 폴리에틸렌 글리콜 및 유사물질) 및 그것의 적당한 혼합물을 포함하는 용매 또는 분산매일 수 있다. 적당한 용액성(fluidity)이 예를 들어, 레시틴(lecithin)과 같은 코팅제의 사용, 분산의 경우에 요구되는 분자 크기의 유지, 및 계면 활성제의 사용에 의하여 유지될 수 있다. 여기에서 개시된 치료방법에의 용도를 위해 적당한 제제는 레밍턴의 약학적 과학(Remington's Pharmaceutical Sciences), 맥 출판(Mack Publishing Co.), 16판(1980)에 설명되어 있다.

미생물의 작용의 예방은 다양한 항생제 및 항곰팡이제, 예를 들어, 파라벤(parabens), 클로로부탄올, 페놀, 아스코르브산, 티메로살(thimerosal) 및 유사물질로 얻어질 수 있다. 많은 경우에, 조성물에서 등장성(isotonic) 물질, 예를 들어, 만니톨, 소르비톨 또는 염화나트륨과 같은 당, 폴리알콜을 포함하는 것이 바람직할 것이다. 주사가능한 조성물의 지속적인 흡수는 조성물에서 흡수를 지연시키는 물질, 예를 들어, 암모늄 모노스테아레이트(aluminum monostearate) 및 젤라틴을 포함함으로써 얻어질 수 있다.

어떤 경우에, 멸균된 주사가능한 용액은 여기에서 열거된 성분들의 하나 또는 조합으로 적당한 용질에서 요구되는 양으로 활성 화합물(예를 들어, 항원 결합 부위)을 포함하고 필요하다면 필터로 멸균화로 뒤이어 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산은 상기에서 열거된 것들로부터 기본적인 분산매 및 필요한 다른 성분을 포함하여, 멸균 매체로 활성 화합물을 포함함으로써 제조된다. 멸균된 주사가능한 용액의 제조를 위해 멸균 분말의 경우에, 제조를 위한 선호되는 방법은 진공 건조 및 동결 건조이고, 그것은 전에 멸균-필터된 그것의 용액으로부터 어떤 추가적인 바랬던 성분을 더하여 활성 성분의 분말을 얻는다. 주사를 위한 제조는 선행기술에서 알려진 방법들에 따라 무균 조건하에서 가공되고, 앰플, 봉지, 병, 주사기 또는 바이알과 같은 용기에 채워지고, 그리고 밀봉된다. 추가로, 제조는 키트의 형태로 포장되고 팔린다. 제조물들은 바람직하게는 관련된 조성물들이 장애로부터 고통받거나 또는 취약해진 개체를 치료하는데 유용하다는 것을 표시하는 라벨 또는 포장 삽입광고를 가질 수 있을 것이다.

여기에서 설명된 것처럼 장애의 치료를 위하여, 본 발명의 조성물의 유효량은 투여 수단, 표적 위치, 환자의 생리적 상태, 환가가 인간인지 또는 동물인지 여부, 투여된 다른 의약, 및 치료가 예방적인지 또는 치료적인지 여부를 포함하여, 많은 다양한 요인들에 따라 달라진다. 대개, 환자는 인간이지만 형질전환 포유동물을 포함한 비-인간 포유동물도 또한 치료될 수 있다. 치료 용량은 안전성과 효율성을 최적화하기 위하여 당해 기술에서 숙련된 사람들에게 알려진 통상의 방법을 사용하여 적정될 수 있다.

항체로 어떤 장애를 치료하기 위하여, 용량은 예를 들어 숙주 체중의 약 0.0001 내지 100 ㎎/㎏의 범위일 수 있고 또한 좀더 일반적으로 0.01 내지 5 ㎎/㎏(예를 들어, 0.02 ㎎/㎏, 0.25 ㎎/㎏, 0.5 ㎎/㎏, 0.75 ㎎/㎏, 1 ㎎/㎏, 2 ㎎/㎏, 등)일 수 있다. 예를 들어 용량은 1 ㎎/㎏ 체중 또는 10 ㎎/㎏ 체중 또는 1-10 ㎎/㎏, 바람직하게는 적어도 1 ㎎/㎏의 범위 내일 수 있다. 상기 범위에서 용량 중간(Doses intermediate)은 또한 본 발명의 범위 내에서 의도될 수 있다. 개체는 매일, 격일, 매주 또는 경험적인 분석에 의하여 결정된 다른 스케쥴에 따라 투여될 수 있다. 예시적인 치료는 지속적인 기간, 예를 들어, 최소한 6개월의 기간 동안 복합적인 용량으로 투여를 수반한다. 추가적인 예시적인 치료 제도는 매 2주당 한번 또는 한 달에 한번 또는 매 3 내지 6개월에 한번 투여를 수반한다. 예시적인 용량 스케쥴은 매일 1-10 mg/kg 또는 15 mg/kg, 격일로 30 mg/kg 또는 매주 60 mg/kg을 포함한다. 일부 방법에서, 서로 다른 결합 특이성을 가진 2 또는 그 이상의 항원 결합 부위가 지속적으로 투여되고, 그 경우에 투여된 각 항원 결합 부위의 용량은 표시된 범위 내로 떨어진다.

본 발명의 에피토프 또는 펩티드에 결합하는 항체는 복합적인 경우에 투여될 수 있다. 단일 용량간의 간격은 매주, 매달 또는 매년이 될 수 있다. 간격은 또한 환자에게 표적 폴리펩티드 또는 표적 분자의 혈중 수준을 측정함으로써 나타나지는 것처럼 비정규적일 수 있다. 일부 방법에서, 용량은 1-1000 ㎍/㎖의 혈장 폴리펩티드 농도를 달성하도록 조정되고 일부 방법에서는 25-300 ㎍/㎖이다. 그 대신에, 항체는 지속적인 방출 제제로서 투여될 수 있고, 그 경우에 덜 빈번한 투여가 요구된다. 용량과 빈도는 환자에 있어서 항체의 반감기에 따라 다르다. 항체의 반감기는 또한 안정한 폴리펩티드 또는 성분, 예를 들어, 알부민 또는 PEG,에의 융합을 통해 지속될 수 있다. 일반적으로, 인간화된 항체는 가장 긴 반감기를 보여주고 그 다음으로 키메라 항체 및 비-인간 항체가 따른다. 일 실시예에서, 항체는 컨쥬게이트 되지 않은 형태로 투여될 수 있다. 또 다른 실시예에서 항체는 컨쥬게이트된 형태로 여러 번 투여될 수 있다.

투여 용량과 빈도는 치료가 예방적인지 또는 치료적인지에 따라 달라질 수 있다. 예방적 적용에서, 항체 또는 그것의 칵테일을 포함하는 조성물은 환자의 저항력을 증가시키기 위하여 질병 상태가 아직 아닌 또는 전-질병 상태인 환자에게 투여될 수 있다. 그러한 양은 "예방적 유효 용량"으로 정의된다. 이러한 용도에서, 정확한 양은 건강과 일반적인 면역에 대한 환자의 상태에 따라 다시 의존하지만, 일반적으로 용량당 0.1 내지 25 ㎎의 범위이고, 특히 0.5 내지 2.5 ㎎이다. 다소 적은 용량이 오랜 기간 동안 다소 자주는 아닌 간격으로 투여된다. 일부 환자는 그들의 남아있는 삶 동안 치료를 계속 받는다.

치료적 적용에서, 비교적 짧은 간격으로 다소 높은 용량(예를 들어, 결합 분자의 약 1 내지 400 ㎎/㎏, 예를 들어, 용량당 항체, 방사성 면역컨쥬게이트로 좀더 일반적으로 사용되는 것은 5 내지 25 ㎎의 용량으로, 그리고 사이토톡신-약물 컨쥬게이트된 분자에 대해서는 더 높은 용량)이 때로 병의 진행이 감소되거나 또는 종료될 때까지, 그리고 바람직하게는 환자가 질병의 증상이 일부 또는 완전한 개선을 보일 때까지 요구된다.

치료제는 예방적 및/또는 치료적 처치를 위하여 비경구, 국소, 정맥주사, 구강, 피하, 동맥주사, 두개 내, 복강 내, 비강 내, 근육내 수단으로 투여될 수 있고, 일부 방법에서, 치료제는 비 기능적 P2X₇ 수용체 세포가 모여있는 특정 조직으로 예를 들어 피하주사로, 직접 주사된다. 근육내 주사 또는 정맥 내 주입은 항체의 투여를 위하여 선호된다.

항체는 치료가 필요한 장애 또는 상태를 치료하는데 효과적인 다른 물질과 조합하여 선택적으로 투여될 수 있다(예를 들어, 예방적 또는 치료적).

또 다른 실시예는 상기에서 설명된 항원 결합 부위, 면역글로불린 가변 도메인, 항체, Fab, dab, scFv, 이중체, 삼중체, 융합 단백질, 컨쥬게이트 또는 약학적 조성물을 포함하는 키트 또는 제조물을 제공한다.

다른 실시예는 상기에서 언급된 치료적 적용에 사용하기 위한 키드를 제공한다. 키트는 하기를 포함한다:

- 항원 결합 부위, 면역글로불린 가변 도메인, 항체, Fab, dab, scFv, 이중체, 삼중체, 융합 단백질, 컨쥬게이트 또는 약학적 조성물의 하나 또는 그 이상의 형태로 된 치료적 조성물을 포함하는 용기;

- 사용을 위한 안내 표지 또는 포장 삽입물.

어떤 실시예에서 키트는 상기에서 설명된 암의 치료 또는 암-관련 합병증을 예방하기 위하여 하나 또는 그 이상의 추가적인 유효 성분 또는 요소를 포함할 수 있다.

키트 또는 "제조물"은 용기 및 표지 또는 포장 삽입물을 포함할 수 있다. 적당한 용기는 예를 들어, 병, 바이알, 주사기, 블리스터 팩(blister pack) 등을 포함한다. 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 물질로 만들어질 수 있다. 용기는 상태를 치료하는데 유효한 치료용 조성물을 포함하고 멸균 포장(sterile access port)(예를 들어 용기는 피하 주사 바늘에 의해 뚫릴 수 있는 마개(stopper)를 갖는 정맥주사용 용액 봉지 또는 바이알일 수 있다. 표지 또는 포장 삽입물은 치료용 조성밀이 선택의 상태를 치료하는데 사용된다는 것을 표시한다. 일 실시예에서, 표지 또는 포장 삽입물은 사용을 위한 안내를 포함하고 치료용 조성물이 암을 치료하거나 또는 암으로부터 유발된 합병증을 예방하는데 사용될 수 있다는 것을 표시한다.

키트는 (a) 약학적 조성물; 및 (b)그것에 담긴 두번째 유효 성분을 포함하는 두번째 용기를 포함할 수 있다. 본 발명의 이 실시예에서 키트는 그 및 다른 유효성분이 장애를 치료하거나 암으로부터 유발된 합병증을 예방하는 데 사용될 수 있다는 것을 나타내는 포장 삽입물을 추가로 포함할 수 있다. 그 대신에, 또는 추가로, 키트는 주사용 세균발육저지수(bacteriostatic water for injection, BWFI), 인산염-완충 소금액(phosphate-buffered saline), 링거의 용액 및 덱스트로스 용액과 같은, 약학적으로 허용가능한 완충액을 포함하는 두번째(혹은 세번째) 용기를 추가로 포함할 수 있다. 다른 완충액, 희석액, 필터, 바늘 및 주사기를 포함하는, 상업적 및 사용자 관점에서 요구하는 다른 물질을 추가로 포함할 수 있다.

어떤 실시예는, 개체가 암에 걸렸는지 여부를 결정하기 위하여 여기에서 설명된 항체의 용도를 제공한다. 다른 실시예는 개체가 암에 걸렸는지 여부를 결정하기 위한 수단의 제조에 여기에서 설명된 항체의 용도를 제공한다. 다른 실시예에서 본 발명에 따라 면역 복합체를 형성하는 조건에서 본 발명에 따라 암을 항체로 결정하기 위하여 개체의 조직을 접촉하는 단계 및 면역 복합체가 형성되는지 여부를 결정하는 단계를 포함하는 개체가 암에 걸렸는지 여부를 결정하는 방법을 제공함으로써 면역 복합체의 형성이 개체가 암에 걸렸다는 것을 결정한다. 방법은 생체 내 또는 생체 외에서 시행될 수 있다.

일 실시예에서, 항체는 상기에서 설명된 것처럼 항원 결합 부위, 면역글로불린 가변 도메인, 항체, Fab, dab, scFv, 이중체, 삼중체, 융합 단백질, 컨쥬게이트 또는 진단용 조성물의 형태이고, 조직 또는 세포에 시약의 결합을 탐지한다.

제자리(in situ) 진단을 위하여, 항원 결합 부위 또는 그것의 어떤 활성 및 기능적인 부분은 예를 들어, 정맥, 복강 내, 두개 내, 동맥 주사와 같은 당해 기술에서 알려진 방법으로 진단되기 위하여 생체에 투여될 수 있고 그 결과 본 발명에 따른 항원 결합 부위와 비-기능적 P2X₇ 수용체에 있는 에피토프 부위 간의 특이적 결합이 발생할 수 있다. 항원/항체 복합체는 항원 결합 부위 또는 그것의 기능적 단편에 부착된 단편 또는 어떤 당해 기술분야게 알려진 탐지 방법을 통해 편리하게 탐지될 수 있다.

본 발명에 따르고 여기에서 설명된 것같은 진단 응용에 사용된 면역어세이는 전형적으로 탐지를 위하여 표지된 항원, 항체 또는 이차 시약을 필요로 한다. 이러한 단백질 또는 시약은 효소, 동위원소, 및 색깔이 있는 입자에 한정되지 않고, 콜로이드성 금 및 라텍스 비드와 같은 것을 포함하는 형광성(fluorescent), 발광성(luminescent) 및 색원성(chromogenic) 물질을 포함하는 당해 기술에서 보통의 기술의 가진 사람들에게 일반적으로 알려진 화합물로 표지될 수 있다. 이들 중, 방 사성 표지는 거의 모든 타입의 어세이와 대부분의 변이에 사용될 수 있다. 효소-컨쥬게이트된 표지는 방사성을 피해야 할 때나 신속한 결과가 필요할 때 특히 유용하다. 형광 색소(Fluorochromes)는, 사용하려면 고가의 장비가 필요함에도 불구하고, 매우 민감한 탐지 방법을 제공한다. 이러한 어세이에 유용한 항체는 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체 및 친화도 정제 폴리클로날 항체를 포함한다.

그 대신에, 항체는 단백질 A 또는 G 또는 두번째 항체와 같이, 면역 글로불린에 친화도를 갖는 표지된 물질과의 반응으로 간접적으로 표지될 수 있다. 항체는 두번째 물질과 컨쥬게이트될 수 있고 항원 결합 부위에 컨쥬게이트된 두번째 물질에 친화도를 갖는 표지된 세번째 물질로 탐지될 수 있다. 예를 들어, 항체는 비오틴에 컨쥬게이트될 수 있고 항원 결합 부위-비오틴 컨쥬게이트는 표지된 아비딘 또는 스트렙트아비딘을 사용하여 탐지될 수 있다. 유사하게, 항체는 햅텐(hapten)에 컨쥬게이트될 수 있고 항체-햅텐 컨쥬게이트는 표지된 항-햅텐 항체를 사용하여 탐지될 수 있다.

현재 면역어세이는 분석물의 존재를 탐지하기 위하여 이중 항체 방법을 사용하는데, 여기서, 항체는 탐지가능한 표지로 표지된 두번째 항체의 반응성에 의하여 간접적으로 표지된다. 두번째 항체는 항체가 유래된 동물의 항체에 결합하는 것이 바람직하다. 다른 말로, 항체가 마우스 항체라면, 그때 표지된 두번째 항체는 항-마우스 항체이다. 여기에서 설명된 어세이에 사용된 항체를 위하여, 이러한 표지는 바람직하게는 항체-코팅된 비드, 특히 마그네틱 비드이다. 여기에서 설명된 면역어세이에서 사용된 항원 결합 부위를 위하여, 표지는 바람직하게는 방사성, 형광성 또는 전자화학발광성 물질과 같은 탐지 가능한 물질이다.

대체적인 이중 항체 시스템, 분석물의 존재의 빠른 결정에 적응되기 때문에 종종 신속한 포맷 시스템으로 언급된, 은 또한 본 발명의 범위 내에서 채택될 수 있다. 시스템은 항원 결합 부위와 분석물 간의 높은 친화도를 요구한다. 본 발명의 일 실시예에 따라, 비-기능적 P2X₇ 수용체의 존재는 P2X₇ 수용체 단백질에 각각 특이적인, 한 쌍의 항원 결합 부위를 사용하여 결정된다. 항원 결합 부위의 상기 쌍 중의 하나는 "디텍터 항원 결합 부위"로 여기에서 언급되고 항원 결합 부위의 상기 쌍 중의 다른 것은 "캡쳐 항원 결합 부위"로 여기에서 언급된다. 본 발명의 항원 결합 부위는 디텍터 항원 결합 부위 또는 캡쳐 항원 결합 부위 중 하나로 사용될 수 있다. 본 발명의 항원 결합 부위는 또한 단일 어세이에서 함께, 캡쳐 및 디텍터 항원 결합 부위 모두로 사용될 수 있다. 본 발명의 일 실시예는 생물학적 액체의 시료에서 비-기능적 P2X₇ 수용체를 탐지하기 위한 이중 항원 결합 부위 샌드위치 방법을 이렇게 사용한다. 이러한 방법에서, 분석물(비-기능적 P2X₇ 수용체 단백질)은 디텍터 항원 결합 부위 또는 고체 지지체에 비가역적으로 고정된 캡쳐 항원 결합 부위간에 샌드위치된다. 디텍터 항원 결합부위는 항원 결합 부위-분석물 샌드위치 및 이렇게 분석물의 존재를 확인하기 위하여, 탐지가능한 표지를 포함할 것이다.

예시적인 고체 상 물질은, 그것에 한정되는 것은 아니고, 방사성 면역어세이 및 효소 면역어세이의 분야에서 잘 알려진 마이크로타이터 플레이트, 폴리스티렌 시험 관, 마그네틱, 플라스틱, 또는 유리 비드 및 슬라이드를 포함한다. 고체 상에 항원 결합 부위를 커플링하는 방법은 또한 당해 기술에서 보통의 기술을 가진 사람들에게 잘 알려져 있다. 좀더 최근에, 나일론, 나이트로셀룰로오스, 셀룰로오스 아세테이느, 유리섬유 및 다른 다공성 폴리머와 같은 다양한 다공성 물질이 고체 지지체로 사용되고 있다.

또 다른 실시예는 상기에서 언급된 항원 결합 부위, 면역글로불린 가변 도메인, 항체, Fab, dab, scFv, 이중체, 삼중체, 융합 단백질 또는 컨쥬게이트를 포함하는 진단용 조성물, 희석제 및 선택적으로 표지를 제공한다.

진단용 조성물에 사용된 항체는 탐지 가능하게 표지된 것이 바람직하다. 다양한 기술이 생분자 표지에 이용가능하고, 당해 기술분야에서 숙련된 사람에게 잘 알려져 있으며 본 발명의 범위 내에서 고려된다. 당해 기술에서 보통의 기술을 가진 사람에게 알려진 많은 다른 표지 및 표지 방법들이 있다. 본 발명에서 사용될 수 있는 표지 유형의 예는 효소, 동위원소, 콜로이드성 금속, 형광 화합물, 화학발광 화합물 및 생발광 화합물을 포함한다.

일반적으로 사용되는 표지는, 그 중에서도, 형광 색소(플로레신(fluorescein), 로다민(rhodamine), 텍사스 레드(Texas Red) 등 같은), 효소(고추 냉이 과산화효소(horse radish peroxidase), b-갈락토시데이즈(galactosidase), 알카라인 포스패태이즈(alkaline phosphatase)), 방사성 동위원소(³²P 또는 ¹²⁵I와 같은), 비오틴, 디곡시게닌(digoxygenin), 콜로이드성 금속, 화학- 또는 생발광 화합물(디옥스태인(dioxetanes), 루미놀 또는 아크리디늄(acridiniums))을 포함한다. 효소 또는 비오티닐 그룹(biotinyl groups)의 공유적 커플링, 요오드화, 인산화, 비오틴화, 등과 같은 표지 과정은 당해 기술분야에서 잘 알려져 있다.

탐지 방법은, 이에 한정되지는 않으나, 방사능 사진 촬영(autoradiography), 형광 현미경관찰(fluorescence microscopy), 직접 및 간접적인 표소 반응 등을 포함한다. 일반적으로 사용되는 탐지 어세이는 방사성 동위원소 또는 비-방사성 동위원소의 방법을 포함한다. 이들은, 그 중에서도, 웨스턴 블로팅, 오버레이-어세이(overlay-assays), 방사성 면역 어세이(Radioimmuno Assay, RIA) 및 면역 방사성면역학적 어세이(Immune Radioimmunometric Assay, IRMA), 효소 면역 어세이(Enzyme Immuno Assay, EIA), 효소 매개 면역 흡착 어세이(Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay, ELISA), 형광 면역 어세이(Fluorescent Immuno Assay, FIA) 및 화학발광 면역 어세이(Chemioluminescent Immune Assay, CLIA)를 포함한다.

또 다른 실시예에서 항원 결합 부위, 상기에서 설명된 것처럼 면역글로불린 가변 도메인, 항체, Fab, dab, scFv, 이중체, 삼중체, 융합 단백질, 컨쥬게이트 또는 진단용 조성물을 포함하는 키트 또는 제조물을 제공한다.

다른 실시예에서 상기 언급된 진단 적용에 사용하기 위한 키트를 제공한다. 키트는 하기를 포함한다:

- 본 발명에 따른 항체 및 선택적으로:

- 본 발명에 따른 펩티드;

- 용도 안내용 표지 또는 포장 삽입물.

키트 또는 "제조물"은 용기 및 용기 위에 또는 부수된 표지 또는 포장 삽입물을 포함할 수 있다. 적당한 용기는 예를 들어, 병, 바이알, 주사기, 블리스터 팩 등을 포함한다. 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 물질로 제조될 수 있다. 용기는 암의 탐지에 효과적인 진단용 조성물을 포함하고 멸균 접촉 포트(sterile access port)(예를 들어 용기는 피하 주사 바늘로 뚫을 수 있는 마개를 가진 정맥주사용액 봉지 또는 바이알일 수 있다)를 가질 수도 있다. 표지 또는 포장 삽입물은 진단용 조성물이 선택의 장애를 탐지하는데 사용된다는 것을 표시한다. 일 실시예에서, 표지 또는 포장 삽입물은 용도에 대한 안내를 포함하고 진단용 조성물이 암을 탐지하는데 사용될 수 있다는 것을 나타낸다.

키트는 (a) 진단용 조성물; 및 (b) 여기에서 포함된 두번째 진단 시약 또는 두번째 표지를 가진 두번째 용기를 포함할 수 있다. 다른 완충액, 희석제, 필터 등을 포함하는, 상업적이고 사용자 관점에서 요구될 수 있는 다른 물질을 추가로 포함할 수 있다.

항체 결합을 위한 추정적인 에피토프를 확인하기 위하여 비 기능적 P2X ₇ 수용체의 삼차원 모델 결정

P2X₇ 단량체 구조는 핸슨 등 1998 (Hansen, M.A., Barden, J.A., Balcar, V.J., Keay, K.A., Bennett, M.R. (1997) Biochem. Biophys. Res. Commun. 236, 670-675. Structural motif and characteristics of the extracellular domain of P2X receptors)에 의하여 수행된 모델링에 근거하고, 여기서 구조적 상동성은 P2X 서브타입들 간에 결정되었다. 추가적인 구조적 상동성은 Hansen supra에서 확인된 두개의 세포막외(extracellular) 도메인 중 더 큰 것에 적용된 것처럼 PDB 데이타베이스에서 Ser 전이효소 구조로 얻었다.

상기 모델은 ATP 결합을 위하여 결정적인 잔기들을 확인하기 위한 기초가 되었다. 이렇게 확인된 잔기들은 위치 지정 돌연변이화를 통해 알라닌으로 치환되었고 돌연변이된 수용체는 P2X₇ 채널/ 포어의 기능을 측정하기 위한 목적으로 HEK 세포에서 발현되었다.

발현된 수용체에 결합하는 ATP가 결합하지 못하기 때문에 기능 상실에 책임이 있는 것으로 개별적으로 확인된 결정적인 잔기가 큰 세포막외 도메인의 모델의 다른 위치에서 확인되었다. 예를 들어, Arg 307 및 Lys 311(서열번호: 1의)은 ECD의 한쪽편에 있고 반면에 Lys193, Arg 294, His 201 및 Phe 275 (서열번호: 1의)은 약 30 Å(Angstroms)의 거리로 ECD의 반대쪽 편에 위치한다.

이러한 결과는 단량체들의 조립은 필수적인 아미노산의 서로 다른 클러스터들 간에 삼차원에서 가깝게 연합하는 것을 필요로 한다는 것을 제안한다. 잔기들이 구조적인 공간에서 가깝게 위치하는 삼량체의 모델링은 인접한 단량체들에서 에피토프 타겟이 제안되는 모델로 되었다. 오직 비 기능적인 수용체가 E200에 대한 항체에 결합할 수 있기 때문에 우리는 서열번호: 1의 200 내지 216 부위(여기서 E200)가 비-기능적 P2X₇에 노출되었다고 관찰하였다. 오직 비 기능적인 수용체가 E300에 대한 항체에 결합할 수 있기 때문에 우리는 서열번호:1의 297 내지 313 부위(여기서 E300)가 비-기능적 P2X₇에 노출되었다고 또한 관찰하였다. 우리의 모델링에 따르면, 이러한 에피토프들은 조립된 삼량체 모델에서 구조적인 공간에서 인접하고 있다.

조립된 수용체의 모델의 정확도를 테스트하기 위하여, NMR 분석의 X-선 회절이 알려지지 않았음에도 불구하고, 수용체의 비-기능적 형태에 특이적인 항체에 결합할 수 있는 노출된 잔기로 구성된 경계면의 모델이 고안되었다. 인접한 단량체의 면에 제공된 E200 및 E300 부위의 요소들이 선택되고 모델에 따라서 간격을 두었고, 이러한 간격은 이론상 10 Å(Angstroms)이다. 비-기능적 수용체에서 접근가능한 제안된 경계면의 방향과 간격은 하기의 합성 펩티드 타겟의 구성을 위한 기초가 되었다.

E200 부위의 제공은 프롤린 210 잔기(서열번호: 1의)가 cis일 때만 발생한다. trans에서 이러한 잔기의 잠금은 E200 부위가 노출되지 않기 때문에 항체가 수용체에 결합할 수 없게 된다. trans에서 이러한 프롤린 210의 잠금은 기능적 수용체에 관계하는 구조와 일치한다. 기능적 수용체는 독특한(단일의) 구조를 가진다. 기능적 잔기들의 표면에 노출된 모든 잔기들은 기능적 수용체와 상호-반응하지 않는 비-기능적 수용체의 치료적 표적화를 포함하는 응용을 위하여 특이적 항체가 비 기능적 수용체에 결합하는 것을 이론적으로 피하는 에피토프에 기여할 수 있다. 프롤린 210이 trans에 있을 때 E200 부위에 있는 잔기들은 P2X₇ 단량체들의 올바른 포장에 의하여 형성된 ATP 결합 부위의 올바른 형성에 의하여 결합된 항체로부터 숨겨질 수 있다. 기능적 및 비-기능적 삼량체 간을 구별할 수 있는 선택적인 항체에 노출되는 이러한 잔기들은 오직 cis에서만 이다. 단량체에 대한 결함이 약 50-배 감소하기 때문에, 단량체 경계면을 표적화하고 양 반대되는 측면에 있는 잔기에 결합하는 비-기능적 삼량체에 대하여 개발된 항체는 삼량체-특이적 결합자로 설명될 수 있다.

펩티드 고안

비-기능적 P2X₇ 수용체에서 단량체들 간에 접근가능한 경계면을 형성하는 합성 펩티드의 특이적인 선택은 하나 또는 다른 단량체에 결합하기 위하여 선택된 단량체들 예를 들어 E200 또는 E300간에 연결할 수 있는 항체를 선별하기 위하여 E200 및 E300 부위의 각각에서 길이를 감소시키는 것과 관련되어 있다. E200 부위는 200 내지 216으로부터 200-211(서열번호:1의)까지의 길이가 감소되는 이유로, 부위는 여전히 두 개의 항체에 동시에 결합할 수 있고, 그리고 추가로 E200 또는 E300 에 각각 결합하는 것보다 E200 및 E300을 연결하는 항체를 선호하기 위하여 E300부위는 297 내지 313으로부터 296 내지 306(서열번호:1의)가 추가로 감소되었다. 잔기 211 및 296(서열번호: 1의)의 존재는 구조에서 적절하게 구분된 부위에 요구되는 간격을 위하여 추가되는 보충적인 AG 잔기로 고안되었다. 10년 작업의 결과인, 안내 모델로부터 추론된 것과 같이, 적적한 간격과 결합된 E200 및 E300 부위의 각각의 길이의 감소는 수용체에서 너무 폭넓게 분리된 잔기들을 포괄하고, 비틀림을 유도하고 그리고 친화력의 감소에 상응하는 항체들의 형성을 배제하였다.

GHNYTTRNILPGAGAKYYKENNVEK 의 서열의 형태인 합성 펩티드는 통상적인 기술에 따라 고체상 합성으로 준비되었고, Maleimidocaproyl-N-Hydroxysuccinimide (MCS) 링커를 사용하여 컨쥬게이트 되었다.

모노클로날 항체의 제작

3.1 방법

디프테리아 톡소이드(toxoid)에 컨쥬게이트된 300/300-펩티드의 형태로 상기에서 기재된 다양한 합성 펩티드들을 쥐에 접종하였다. 하나의 펩티드는 서열:GHNYTTRNILPGAGAKYYKENNVEK을 가진다. 최종 증진 전에, 동물의 활성을 탐색하고 가장 좋은 동물들을 증진시키고 죽였으며 비장을 채취하였다. 비장 세포를 분리하고, 제공된 포맷에 따라 최소 1:2 및 최대 1:5의 비율로 Sp2/0 융합 파트너 세포주와 융합시켰다. 남은 비장 세포는 배양 배지에서 3일간 배양하고 어세이 시스템에서의 양성대조군으로서 사용하기 위하여 상측액을 보관하였다.

융합 1 - 합성 E200/E300, 96 웰 플레이트를 사용하여, 대식세포 먹이 층으로 1 플레이트 조절된 배지만 있는 다른 4 플레이트.

대식세포 플레이트는 5번 및 10번이다.

혼성화 과정

1. 융합 튜브 1을 EBSS로 50 ㎖로 만들고 600 rpm에서 8분간 회전시킨다.

2. 튜브 1로부터 상층액을 제거하고, 10 ㎖ EBSS 첨가, 혼합, 15 ㎖ EBSS 첨가한다.

융합 튜브 2, 단계 1.

튜브 1 및 2를 600 rpm에서 8분간 회전시킨다.

3. 단계 2에서처럼 융합 튜브 2, 단계 1에서처럼 융합 튜브 3.

튜브 2 및 3을 600 rpm에서 8분간 회전시킨다.

4. 융합 튜브 1에서 상층액을 제거하고, 펠렛이 풀어지도록 튜브를 두드린다.

8분간 방치한다.

1 ㎖ 피펫으로 0.8 ㎖ PEG 혼합물을 첨가하고, 1분간 방울로 떨어뜨리고, 부드럽게 혼합한다.

수조에 1 분간 튜브를 둔다.

1 ㎖ 피펫으로 1 ㎖ Ⅰ no hepes을 첨가하고, 1분간 방울로 떨어뜨리고, 부드럽게 혼합한다.

20 ㎖ I no hepes을 첨가하고, 10 ㎖ 피펫으로 1분간 방울로 떨어뜨리고, 5분동안 두고, 부드럽게 혼합한다.

5. 단계 2에서처럼 튜브 3 그때 튜브 1 및 3을 함께 회전시킨다.

6. 단계 4에서처럼 튜브 2.

7. 튜브 1은 상층액을 제거하고, 10 ㎖ Isc(20% FBSI 추가) +/- HAT를 첨가하고,

혼합하고, 추가적으로 30 ㎖ Isc를 첨가한다.

8. 튜브 1 및 2를 함께 회전시킨다.

9. 단계 4에서처럼 튜브 3.

10. 튜브 1은 상층액을 제거하고, 10 ㎖ Isc(20% FBSI 추가) + HAT에서 혼합하고, 24 웰 포맷에 웰당 0.05 ㎖를 분주하거나 또는 50 ㎖에서 혼합하고 96 웰 포맷에 웰당 0.1 ㎖를 분주한다.

11. 단계 7에서처럼 튜브 2, 단계 4에서처럼 튜브 3, 모든 튜브들이 분주될 때까지 과정을 반복한다.

ELISAS

에피토프를 PVC(폴리비닐 클로라이드) 플레이트에 코팅하고 세포 상층액으로부터 항체를 잡기 위하여 사용한다. 알려진 양성 및 음성 대조군으로 비교되는 것은 알려지지 않았다.

부착된 BSA 캐리어 단백질과 EP200/300을 실험을 위한 ELISA 플레이트에 코팅하는 데 사용하였다.

상층액 시험

· 웰들이 차면, 시료 튜브 또는 플레이트에서 배지 0.05 ㎖를 제외하고 모두 제거한다.

· 항원생산을 위하여 실험하고, 양성은 증폭하고, 음성은 제거한다.

· +ve's는 배지 2 ㎖를 포함하는 25 ㎝ 플라스크로 옮기고 위로 향하게 둔다.

· 4㎖, 2×4 ㎖, 2×75 ㎝ 플라스크(12㎖)로 증폭시킨다. 플라스크 당 30 ㎖의 부피로 증폭시킨다. 차면 스탁(stocks)을 얼려둔다.

· 재시험된 상층액을 얼려둔다.

모든 ELISA 어세이에 사용된 표준 프로토콜

· 에피토프를 1 ㎍/㎖ 의 농도로 코팅하고, 웰당 50㎕되게 PBS로 희석하고, 상온에서 밤새 흔든다.

· (Ca/Mg이 없는) PBS로 잘 세척한다.

· PBS에 있는 0.1% 오브알부민을 웰당 200 ㎕되게 하고 1시간 동안 블로킹한다.

· PBS를 세척한다.

· (두번)스크린된 상층액을 웰당 50 ㎕되게 하고 상온에서 3시간 동안 흔든다.

· PBS로 3회 세척한다.

· 블로킹 용액에 1/100으로 희석된 토끼 항 마우스 HRP를 웰당 50㎕ 첨가하고, 상온에서 1.5시간 동안 흔든다.

· PBS로 4회 세척한다.

· 활성화 시키기 위하여 10 ㎖ 당 0.05 M 시트르산에 1.1 ㎎/㎖인 기질 시그마 ABTS (2,2'-Azino-bis(3-Ethylbenzthialzolin-6-Sulfonic acid Diammonium Salt) 및 2 ㎕ 과산화 수소를 신선하게 만든다.

· 30분간, 웰 당 100 ㎕를, 웰에 ABTS를 첨가하고 5% 옥살릭 산(Oxalic acid )을 웰당 25㎕첨가하여 반응을 종료시킨다.

· 시험파장 405/ 인용파장 490 ㎚에서 읽는다.

3.2 결과

수율은 대식세포를 포함하는 것을 제외하고 모든 플레이트에서 매우 낮다. ELISA 스크리닝을 세번하여 합성 펩티드에 특이성을 분비하는 37 클론을 확인하였다. 이러한 클론들 중 많은 것이 죽거나 분비를 멈추었다. 살아남은 것을 증폭시키고, 5개의 앰플로 얼렸다. E200 및 E300에 상호 반응성을 포함하는 혈청테스트를 다음의 실시예에서 실시하였다.

항체의 혈청학적 특징 분석

합성 펩티드에 대한 항체는 E200 또는 E300 부위의 서열을 가지는 펩티드에 대한 항체로 선별되었다. 이들 표적에 결합할 수 있음에도, 항체들은 합성 펩티드에 대한 결합을 선호하는 것으로 확인되었다.

4.1 상호 반응성 시험

실시예 3에서 얻어진 항체들을 합성 펩티드(COMP), U140(기능적 및 비 기능적 수용체 모두에서 발견되는 에피토프의 서열을 갖는 펩티드), 200(E200 부위의 서열을 갖는 펩티드), 300(E300부위의 서열을 갖는 펩티드) 및 U80(기능적 및 비 기능적 수용체 모두에서 발견되는 에피토프의 서열을 갖는 펩티드) 중 어느 하나에 대한 것인지 ELISA로 선별하였다. 결과는 하기의 표 및 도면 9에서 나타난다.

U80 상호 반응성은 동물들이 DT로 면역화되고 ELISA에서 사용된 U80이 DT 태그를 갖기 때문에 아마도 DT 태그 때문이다.

살아있는 암 세포에서 비 기능적 P2X ₇ 에 대한 모노클로날 항체 2F6의 결합

인간 발명의 정제된 항체가 형광 활성화 세포 분류기(fluorescence activated cell sorter, FACS)로 기능적 P2X₇을 발현하는 인간 조혈 세포 및 비 기능적 P2X₇를발현하는 악성 종양 세포주에 결합하는 지를 분석하였다. 표 6은 하나의 모노클로날 항체(MAb) 2F6가 이들 세포에 결합하는 지를 요약한다. FACS 분석은 음성 대조군 항체에 대하여 27.87 평균 형광 강도(mean fluorescence intensity, MFI)와 비교하여 334.62의 평균 형광 강도를 가진 전립선암 세포주 PC3에 대하여 MAb 2F6의 결합을 나타낸다. 비록 약하기는 하지만 유방암 세포주 MCF-7에 대한 MAb 2F6의 결합도 관찰되었다( 2F6 및 3D6 대조군에 대하여 각각 160.3 및 50.4의 MFI). 그러나 시험된 림프구에 대해서는 거의 결합이 탐지되지 않았다(표 6). 도 8은 다음의 FACS 분석 실험의 결과를 도시하고 이와 유사하게 MAb 2F6이 PC3 전립선암 세포주 및 MCF-7 유방암 TVH주에는 결합하지만 인간 림프구 시료에는 결합하지 않는다는 것을 보여준다.

종양 세포주 및 인간 림프구에 대한 MAb 2F6의 결합에 대한 FACS 분석

	PC3 Prostate Tumour Cell Line		MCF -7 Breast Tumour Cell Line		Human Lymphocytes
MAb	Mean Fluorescence Intensity ( MFI )	Percent Cells Positive	Mean Fluorescence Intensity ( MFI )	Percent Cells Positive	Mean Fluorescence Intensity ( MFI )	Percent Cells Positive
IgM Negative Control (3 D6 )	27.87	1	50.40	0	17.68	0
HLA (W6/32) Positive Control	NT*	NT	1667.92	87	3897.33	100
2F6	334.62	47	160.30	5	22.34	1

* NT : 시험되지 않음( Not tested)

본 명세서에서 정의되고 개시된 발명은 명세서 또는 도면에 언급되거나 또는 명확한 개체의 둘 또는 그 이상의 모든 다른 조합으로 확장할 수 있다. 이러한 다른 조합 모두는 본원 발명의 다양한 다른 측면을 구성한다.

<110> Biosceptre International Limited <120> ANTI-P2X7 PEPTIDES AND EPITOPES <130> 10fpi-12-19 <150> AU2008903451 <151> 2008-07-04 <150> PCT/AU2009/000869 <151> 2009-07-03 <160> 10 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 595 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Pro Ala Cys Cys Ser Cys Ser Asp Val Phe Gln Tyr Glu Thr Asn 1 5 10 15 Lys Val Thr Arg Ile Gln Ser Met Asn Tyr Gly Thr Ile Lys Trp Phe 20 25 30 Phe His Val Ile Ile Phe Ser Tyr Val Cys Phe Ala Leu Val Ser Asp 35 40 45 Lys Leu Tyr Gln Arg Lys Glu Pro Val Ile Ser Ser Val His Thr Lys 50 55 60 Val Lys Gly Ile Ala Glu Val Lys Glu Glu Ile Val Glu Asn Gly Val 65 70 75 80 Lys Lys Leu Val His Ser Val Phe Asp Thr Ala Asp Tyr Thr Phe Pro 85 90 95 Leu Gln Gly Asn Ser Phe Phe Val Met Thr Asn Phe Leu Lys Thr Glu 100 105 110 Gly Gln Glu Gln Arg Leu Cys Pro Glu Tyr Pro Thr Arg Arg Thr Leu 115 120 125 Cys Ser Ser Asp Arg Gly Cys Lys Lys Gly Trp Met Asp Pro Gln Ser 130 135 140 Lys Gly Ile Gln Thr Gly Arg Cys Val Val His Glu Gly Asn Gln Lys 145 150 155 160 Thr Cys Glu Val Ser Ala Trp Cys Pro Ile Glu Ala Val Glu Glu Ala 165 170 175 Pro Arg Pro Ala Leu Leu Asn Ser Ala Glu Asn Phe Thr Val Leu Ile 180 185 190 Lys Asn Asn Ile Asp Phe Pro Gly His Asn Tyr Thr Thr Arg Asn Ile 195 200 205 Leu Pro Gly Leu Asn Ile Thr Cys Thr Phe His Lys Thr Gln Asn Pro 210 215 220 Gln Cys Pro Ile Phe Arg Leu Gly Asp Ile Phe Arg Glu Thr Gly Asp 225 230 235 240 Asn Phe Ser Asp Val Ala Ile Gln Gly Gly Ile Met Gly Ile Glu Ile 245 250 255 Tyr Trp Asp Cys Asn Leu Asp Arg Trp Phe His His Cys Arg Pro Lys 260 265 270 Tyr Ser Phe Arg Arg Leu Asp Asp Lys Thr Thr Asn Val Ser Leu Tyr 275 280 285 Pro Gly Tyr Asn Phe Arg Tyr Ala Lys Tyr Tyr Lys Glu Asn Asn Val 290 295 300 Glu Lys Arg Thr Leu Ile Lys Val Phe Gly Ile Arg Phe Asp Ile Leu 305 310 315 320 Val Phe Gly Thr Gly Gly Lys Phe Asp Ile Ile Gln Leu Val Val Tyr 325 330 335 Ile Gly Ser Thr Leu Ser Tyr Phe Gly Leu Ala Ala Val Phe Ile Asp 340 345 350 Phe Leu Ile Asp Thr Tyr Ser Ser Asn Cys Cys Arg Ser His Ile Tyr 355 360 365 Pro Trp Cys Lys Cys Cys Gln Pro Cys Val Val Asn Glu Tyr Tyr Tyr 370 375 380 Arg Lys Lys Cys Glu Ser Ile Val Glu Pro Lys Pro Thr Leu Lys Tyr 385 390 395 400 Val Ser Phe Val Asp Glu Ser His Ile Arg Met Val Asn Gln Gln Leu 405 410 415 Leu Gly Arg Ser Leu Gln Asp Val Lys Gly Gln Glu Val Pro Arg Pro 420 425 430 Ala Met Asp Phe Thr Asp Leu Ser Arg Leu Pro Leu Ala Leu His Asp 435 440 445 Thr Pro Pro Ile Pro Gly Gln Pro Glu Glu Ile Gln Leu Leu Arg Lys 450 455 460 Glu Ala Thr Pro Arg Ser Arg Asp Ser Pro Val Trp Cys Gln Cys Gly 465 470 475 480 Ser Cys Leu Pro Ser Gln Leu Pro Glu Ser His Arg Cys Leu Glu Glu 485 490 495 Leu Cys Cys Arg Lys Lys Pro Gly Ala Cys Ile Thr Thr Ser Glu Leu 500 505 510 Phe Arg Lys Leu Val Leu Ser Arg His Val Leu Gln Phe Leu Leu Leu 515 520 525 Tyr Gln Glu Pro Leu Leu Ala Leu Asp Val Asp Ser Thr Asn Ser Arg 530 535 540 Leu Arg His Cys Ala Tyr Arg Cys Tyr Ala Thr Trp Arg Phe Gly Ser 545 550 555 560 Gln Asp Met Ala Asp Phe Ala Ile Leu Pro Ser Cys Cys Arg Trp Arg 565 570 575 Ile Arg Lys Glu Phe Pro Lys Ser Glu Gly Gln Tyr Ser Gly Phe Lys 580 585 590 Ser Pro Tyr 595 <210> 2 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 His Asn Tyr Thr Thr Arg Asn Ile Leu 1 5 <210> 3 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Gly His Asn Tyr Thr Thr Arg Asn Ile Leu 1 5 10 <210> 4 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Asp Phe Pro Gly His Asn Tyr Thr Thr Arg Asn Ile Leu 1 5 10 <210> 5 <211> 209 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Met Pro Ala Cys Cys Ser Cys Ser Asp Val Phe Gln Tyr Glu Thr Asn 1 5 10 15 Lys Val Thr Arg Ile Gln Ser Met Asn Tyr Gly Thr Ile Lys Trp Phe 20 25 30 Phe His Val Ile Ile Phe Ser Tyr Val Cys Phe Ala Leu Val Ser Asp 35 40 45 Lys Leu Tyr Gln Arg Lys Glu Pro Val Ile Ser Ser Val His Thr Lys 50 55 60 Val Lys Gly Ile Ala Glu Val Lys Glu Glu Ile Val Glu Asn Gly Val 65 70 75 80 Lys Lys Leu Val His Ser Val Phe Asp Thr Ala Asp Tyr Thr Phe Pro 85 90 95 Leu Gln Gly Asn Ser Phe Phe Val Met Thr Asn Phe Leu Lys Thr Glu 100 105 110 Gly Gln Glu Gln Arg Leu Cys Pro Glu Tyr Pro Thr Arg Arg Thr Leu 115 120 125 Cys Ser Ser Asp Arg Gly Cys Lys Lys Gly Trp Met Asp Pro Gln Ser 130 135 140 Lys Gly Ile Gln Thr Gly Arg Cys Val Val His Glu Gly Asn Gln Lys 145 150 155 160 Thr Cys Glu Val Ser Ala Trp Cys Pro Ile Glu Ala Val Glu Glu Ala 165 170 175 Pro Arg Pro Ala Leu Leu Asn Ser Ala Glu Asn Phe Thr Val Leu Ile 180 185 190 Lys Asn Asn Ile Asp Phe Pro Gly His Asn Tyr Thr Thr Arg Asn Ile 195 200 205 Leu <210> 6 <211> 49 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Lys Thr Thr Asn Val Ser Leu Tyr Pro Gly Tyr Asn Phe Arg Tyr Ala 1 5 10 15 Lys Tyr Tyr Lys Glu Asn Asn Val Glu Lys Arg Thr Leu Ile Lys Val 20 25 30 Phe Gly Ile Arg Phe Asp Ile Leu Val Phe Gly Thr Gly Gly Lys Phe 35 40 45 Asp <210> 7 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Lys Tyr Tyr Lys Glu Asn Asn Val Glu Lys Arg Thr Leu Ile Lys Val 1 5 10 15 Phe <210> 8 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Gly His Asn Tyr Thr Thr Arg Asn Ile Leu Pro 1 5 10 <210> 9 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Ala Lys Tyr Tyr Lys Glu Asn Asn Val Glu Lys 1 5 10 <210> 10 <211> 25 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Gly His Asn Tyr Thr Thr Arg Asn Ile Leu Pro Gly Ala Gly Ala Lys 1 5 10 15 Tyr Tyr Lys Glu Asn Asn Val Glu Lys 20 25

Claims

P2X₇ 수용체의 에피토프에 결합하는 항체로서,

상기 에피토프는,

- P2X₇ 수용체의 첫번째 단량체의 부의의 형태인 첫번째 부위; 및

- 상기 수용체의 두번째 단량체의 부위의 형태인 두번째 부위로 형성되고;

여기서 첫번째 부위 및 두번째 부위는 상기 수용체에서 상기 수용체의 단량체의 서열번호: 1의 210번 위치에 있는 잔기의 시스(cis) 이성화(isomeriasation)에 의하여 형성되고; 및

여기서 첫번째 부위 및 두번째 부위는 에피토프를 형성하는 첫번째 부위 및 두번째 부위에 항체의 항원결합부위의 결합이 허용될 수 있게 상기 수용체에 서로 인접하도록 배열되어 있는 것을 특징으로 하는 항체.
제 1항에 있어서, 상기 첫번째 부위는 서열번호: 1의 하기 잔기: Gly 200, His 201, Asn 202, Tyr 203, Thr 204, Thr 205, Arg 206, Asn 207, Ile 208 및 Leu 209 중 하나 또는 그 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체.
제 2항에 있어서, 상기 첫번째 부위는 서열번호: 1의 하기 잔기: Arg 125, Lys 193, Phe 275 및 Arg 294 중 하나 또는 그 이상을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 항체.
제 1항에 있어서, 상기 첫번째 부위는 서열번호: 1의 하기의 서열 중 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 항체;

Gly 200 내지 Tyr 203,
His 201 내지 Thr 204,
Asn 202 내지 Thr 205,
Tyr 203 내지 Arg 206,
Thr 204 내지 Asn 207,
Thr 205 내지 Ile 208,
Arg 206 내지 Leu 209.
제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 두번째 부위의 하기 잔기: Lys 297, Tyr 298, Tyr 299, Lys 300, Glu 301, Asn 301, Asn 303, Val 304, Glu 305 및 Lys 306 중 하나 또는 그 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체.
제 5항에 있어서, 상기 두번째 부위는 Arg 307 및/또는 Lys 311을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 항체.
제 1항에 있어서, 상기 두번째 부위는 서열번호: 1의 하기 서열 중 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 항체:

Lys 297 내지 Lys 300
Tyr 298 내지 Glu 301
Tyr 299 내지 Asn 301
Lys 300 내지 Asn 303
Glu 301 내지 Val 304
Asn 301 내지 Glu 305
Asn 303 내지 Lys 306.
상기 청구항들 중 어느 한 항에 있어서, 상기 첫번째 부위는 두번째 부위 보다 더 많은 잔기를 포함하는 것을 특징으로 하는 항체.
상기 청구항들 중 어느 한 항에 있어서, 상기 첫번째 부위는 약 4 내지 약 10개의 잔기를 포함하는 것을 특징으로 하는 항체.
상기 청구항들 중 어느 한 항에 있어서, 상기 두번째 부위는 첫번째 부위 보다 더 많은 잔기를 포함하는 것을 특징으로 하는 항체.
상기 청구항들 중 어느 한 항에 있어서, 상기 두번째 부위는 약 4 내지 약 10개의 잔기를 포함하는 것을 특징으로 하는 항체.
상기 청구항들 중 어느 한 항에 있어서, 상기 첫번째 부위 및 두번째 부위는 거리가 약 10Å(angstroms) 떨어져 있는 것을 특징으로 하는 항체.
상기 청구항들 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 대체로 정제되거나 분리된 형태인 것을 특징으로 하는 항체.
P2X₇ 수용체의 에피토프로서,

상기 에피토프는,

- P2X₇ 수용체의 첫번째 단량체의 부위의 형태인 첫번째 부위; 및

- 상기 수용체의 두번째 단량체의 부위의 형태인 두번째 부위로 형성되고;

여기서 첫번째 부위 및 두번째 부위는 상기 수용체에서 상기 수용체의 단량체의 서열번호: 1의 210번 위치에 있는 잔기의 시스(cis) 이성화(isomeriasation)에 의하여 형성되고; 및

여기서 첫번째 부위 및 두번째 부위는 에피토프를 형성하는 첫번째 부위 및 두번째 부위에 항-P2X₇ 항체의 항원결합부위의 결합이 허용되도록 상기 수용체에 서로 인접하도록 배열되어 있는 것을 특징으로 하는 에피토프.
제 14항에 있어서, 상기 에피토프는 대체로 정제되거나 분리된 형태인 것을 특징으로 하는 에피토프.
상기 청구항들 중 어느 한 항의 에피토프를 포함하는 P2X₇ 수용체.
제 16항에 있어서, 상기 수용체의 단량체들 중 모두가 하나의 단량체의 210 위치의 잔기가 시스(cis) 이성화(isomeriasation)를 가지지는 않는 것을 특징으로 하는 수용체.
제 16항에 있어서, 상기 수용체의 단량체들 중 2개가 210 위치의 잔기가 시스(cis) 이성화(isomeriasation)를 가진 것을 특징으로 하는 수용체.
제 16항에 있어서, 상기 수용체의 단량체들 중 하나가 210 위치의 잔기가 시스(cis) 이성화(isomeriasation)를 가진 것을 특징으로 하는 수용체.
상기 청구항들 중 어느 한 항에 있어서, 상기 수용체는 대체로 정제되거나 분리된 형태인 것을 특징으로 하는 수용체.
상기 청구항들 중 어느 한 항의 항체가 P2X₇ 수용체의 하나의 에피토프에 결합하는 형태인 면역 복합체.
상기 청구항들 중 어느 한 항에 있어서, 상기 수용체의 모든 에피토프가 항체에 의해 결합되는 것을 특징으로 하는 면역 복합체.
상기 청구항들 중 어느 한 항에 있어서, 상기 수용체의 3개 이하의 에피토프가 항체에 의해 결합되는 것을 특징으로 하는 면역 복합체.
상기 청구항들 중 어느 한 항에 있어서, 상기 복합체는 수용체들보다 더 많은 항체 분자를 포함하는 것을 특징으로 하는 면역 복합체.
상기 청구항들 중 어느 한 항에 있어서, 상기 복합체는 수용체들보다 더 적은 항체 분자를 포함하는 것을 특징으로 하는 면역 복합체.
N 말단 부위 및 C 말단 부위를 포함하는 펩티드로서, 상기 N 말단 부위 및 C 말단 부위는 N 및 C 말단 잔기에 의하여 각각 정의되며; 여기서

- N 말단 부위는 HNYTTRNIL의 서열(서열번호: 2) 또는 최소한 4개 잔기의 그것의 단편을 포함하고;

- C 말단 부위는 프롤린, 알라닌 또는 글리신인 C 말단 잔기를 포함하며;

여기서, N 말단 부위의 C 말단 잔기는 C 말단 부위의 N 말단 잔기에 공유적으로 연결되고;

여기서, C 말단 부위의 C 말단 잔기는 약 10에서 30 Å(angstroms)의 길이를 갖는 링커에 의하여 추가적인 펩티드로 연결되며; 및

여기서 상기 추가적인 펩티드는 KTTNVSLYPGYNFRYAKYYKENNVEKRTLIKVFGIRFDILVFGTGGK FD 서열 또는 최소한 4개 잔기인 그것의 단편으로 구성되는 것을 특징으로 하는 펩티드.
제 26항에 있어서, N 말단 부위는 HNYTTRNIL 서열(서열번호: 2)를 포함하는 것을 특징으로 하는 펩티드.
상기 청구항들 중 어느 한 항에 있어서, 상기 N 말단 부위는 GHNYTTRNIL 서열(서열번호: 3)을 포함하는 것을 특징으로 하는 펩티드.
상기 청구항들 중 어느 한 항에 있어서, 상기 N 말단 부위는 DFPGHNYTTRNIL 서열(서열번호: 4)을 포함하는 것을 특징으로 하는 펩티드.
상기 청구항들 중 어느 한 항에 있어서, 하기 서열번호: 2 내지 4 중 어느 하나와 관련된 것을 특징으로 하는 펩티드:

D 잔기가 E, N 또는 Q 잔기로 보수적으로 치환될 수 있고;
F 잔기가 Y 또는 W 잔기로 보수적으로 치환될 수 있으며;
G 잔기가 A, V, L 또는 I 잔기로 보수적으로 치환될 수 있고;
H 잔기가 K 또는 R 잔기로 보수적으로 치환될 수 있으며;
N 잔기가 D, E 또는 Q 잔기로 보수적으로 치환될 수 있고;
Y 잔기가 F 또는 W 잔기로 보수적으로 치환될 수 있으며;
T 잔기가 C, S 또는 M 잔기로 보수적으로 치환될 수 있고;
R 잔기가 H 또는 K 잔기로 보수적으로 치환될 수 있으며;
I 잔기가 G, A, V 또는 L 잔기로 보수적으로 치환될 수 있고; 및
L 잔기가 G, A, V 또는 I 잔기로 보수적으로 치환될 수 있음.
상기 청구항들 중 어느 한 항에 있어서, N-말단 부위는 하기의 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 펩티드;
MPACCSCSDVFQYETNKVTRIQSMNYGTIKWFFHVIIFSYVCFALVSDKL YQRKEPVISSVHTKVKGIAEVKEEIVENGVKKLVHSVFDTADYTFPLQGN SFFVMTNFLKTEGQEQRLCPEYPTRRTLCSSDRGCKKGWMDPQSKGIQTG RCVVHEGNQKTCEVSAWCPIEAVEEAPRPALLNSAENFTVLIKNNIDFPG
HNYTTRNIL(서열번호: 5).
상기 청구항들 중 어느 한 항에 있어서, N-말단 부위는 C 말단에 HNYTTRNIL를 포함하는 서열번호 5의 서열 내에 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 펩티드.
상기 청구항들 중 어느 한 항에 있어서, C 말단 부위의 C 말단 잔기는 프롤린인 것을 특징으로 하는 펩티드.
상기 청구항들 중 어느 한 항에 있어서, 프롤린은 시스(cis) 구조인것을 특징으로 하는 펩티드.
상기 청구항들 중 어느 한 항에 있어서, C 말단 부위는 프롤린, 글리신 또는 알라닌으로 구성된 것을 특징으로 하는 펩티드.
상기 청구항들 중 어느 한 항에 있어서, C 말단 부위는 프롤린인 것을 특징으로 하는 펩티드.
상기 청구항들 중 어느 한 항에 있어서, 링커는 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기인 것을 특징으로 하는 펩티드.
상기 청구항들 중 어느 한 항에 있어서, 링커는 하나 또는 둘의 아미노산인 것을 특징으로 하는 펩티드.
상기 청구항들 중 어느 한 항에 있어서, 아미노산 잔기는 글리신 및 알라닌에서 선택되는 것을 특징으로 하는 펩티드.
식: (A)(Xn)(B)에 의해 정의되는 펩티드로서, 여기서

- (A)는 GHNYTTRNILP의 아미노산의 서열 또는 적어도 4개의 아미노산인 그것의 단편이고;

- (Xn)는 길이가 10 내지 30 Å(angstroms)인 링커로서, 상기 링커는 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기로 구성되며;

- (B)는 AKYYKENNVEK의 아미노산의 서열 또는 적어도 4개의 아미노산인 그것의 단편인 것을 특징으로 하는 펩티드.
제 40항에 있어서, 상기 펩티드는 하기의 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 펩티드:
GHNYTTRNILPGAGAKYYKENNVEK.
상기 청구항들 중 어느 한 항에 따른 펩티드에 결합하는 항체.
상기 청구항들 중 어느 한 항의 펩티드가 항체에 결합된 형태인 면역 복합체.
비 기능적인 P2X₇ 수용체에 결합하는 항체를 생산하기 위한 상기 청구항들 중 어느 한 항에 따른 펩티드의 용도.
개체가 암에 걸렸는지 여부를 판단하기 위한 상기 청구항들 중 어느 한 항에 따른 항체의 용도.
암을 가진 개체를 치료하기 위한 상기 청구항들 중 어느 한 항에 따른 항체의 용도.
상기 청구항들 중 어느 한 항에 따른 항체 및 선택적으로 하기를 포함하는 키트로서:

제 26항 내지 제 41항 중 어느 하나에 따른 펩티드;

암의 진단 또는 치료의 용도를 위한 서면 안내서를 포함한 키트.