ES2270515T3 - Arginina deiminasa modificada. - Google Patents

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Abstract

La invención se refiere a una arginina deiminasa modificada con glicol de polietileno, a procedimientos para el tratamiento del cáncer y a procedimientos para el tratamiento y/o la inhibición de la metastasis.

Description

Arginina deiminasa modificada.
La presente invención se refiere a la arginina deiminasa modificada con polietilenglicol, a la utilización de la misma en la preparación de composiciones farmacéuticas para el tratamiento del cáncer y al tratamiento e inhibición de las metástasis.
El melanoma maligno (en fase 3) y el hepatoma son enfermedades mortales que provocan la muerte de la mayoría de los pacientes en el plazo de un año desde su diagnóstico. En Estados Unidos, aproximadamente 16.000 personas mueren al año a causa de estas enfermedades. La incidencia del melanoma está creciendo rápidamente en Estados Unidos y es incluso mayor en países como Australia. La incidencia del hepatoma en algunas partes del mundo donde la hepatitis es endémica es aún mayor. Por ejemplo, el hepatoma es una de las principales formas de cáncer en Japón y Taiwán. Por tanto, se necesitan urgentemente tratamientos eficaces para combatir estas enfermedades.
Para tratar algunas formas de cáncer se ha empleado la privación selectiva de aminoácidos esenciales. El ejemplo más conocido es el uso de L-asparaginasa para bajar los niveles de asparagina en el tratamiento de la leucemia linfoblástica aguda. La L-asparaginasa más comúnmente utilizada es la aislada de E. coli. Sin embargo, el uso clínico de esta enzima es arriesgado por su antigenicidad inherente y por su corta vida media en circulación, tal como se describe en Y.K. Park, y col. Anticancer Res., 1:373-376 (1981). La modificación covalente de la L-asparaginasa de E. coli con polietilenglicol reduce su antigenicidad y prolonga su vida media en circulación, tal como se describe, por ejemplo, en Park, Anticancer Res., supra; Y. Kamisaki y col. J. Pharmacol Exp. Ther., 216:410-414 (1981) y Y. Kamisaki y col. Gann., 73: 47-474 (1982). PEG-h-GH mostró un mayor EC_{50} con la velocidad de eliminación inversamente proporcional al peso molecular real (Clark R. y col. J. Biol. Chem., 1996, 271, 21969-77). Kita Y. y col. (Drug Design and Delivery, 1990, 6, 157-167) han demostrado que el interferón-\gamma humano recombinante conjugado con PEG tiene una mayor vida media, mientas casi no se observó eliminación. Aunque se han hecho grandes esfuerzos por identificar otras enzimas de degradación de aminoácidos esenciales para el tratamiento del cáncer, no se ha aprobado ninguna, en primer lugar porque la privación de aminoácidos esenciales, por definición, tiene numerosos y graves efectos secundarios.
Se sabe que las enzimas que degradan aminoácidos no esenciales tales como arginina pueden ser un medio eficaz para controlar algunas formas de cáncer. Por ejemplo, la arginina deiminasa (ADI) aislada de Pseudomonas pudita fue descrita por J.B. Jones en "The effect of Arginine Deiminase on Murine Leukemic Lymphoblasts", Tesis Doctoral, Universidad de Oklahoma, páginas 1-165 (1981). Aunque eficaz a la hora de matar células tumorales in vitro, la arginina deiminasa (ADI) aislada de P. pudita no mostró eficacia in vivo porque tenía poca actividad enzimática a un pH neutro y se eliminaba rápidamente de la circulación en los animales experimentales. La arginina deiminasa procedente de Mycoplasma arginini se describe por ejemplo en Takaku y col. Int. J. Cancer, 51:244-249 (1992) y en la Patente estadounidense Nº 5,474,928.
Sin embargo, un problema asociado al uso terapéutico de una proteína tan heteróloga es su antigenicidad. La modificación química de la arginina deiminasa a partir de Micoplasma arginini vía un grupo enlazante cloruro cianúrico con polietilenglicol fue descrita por Takaku y col. Jun. J. Cancer. Res., 84: 1195-1200 (1993). Sin embargo, la proteína modificada era tóxica cuando se metabolizaba debido a la liberación de cianuro del grupo enlazante cloruro cianúrico.
Existe la necesidad de composiciones que degraden aminoácidos no esenciales y que no conlleven los problemas asociados a la técnica anterior. La presente invención se refiere a éstas y a otros importantes fines.
El objeto de la presente invención es un compuesto que comprende arginina deiminasa enlazada covalentemente vía un grupo enlazante a polietilenglicol, donde el polietilenglicol tiene un peso molecular promedio en peso en el intervalo de 16.000 a 40.000.
Otra realización de la presente invención consiste en la utilización de dicho compuesto para preparar composiciones farmacéuticas para tratar tumores, incluidos, por ejemplo, sarcomas, hepatomas y melanomas. La invención también se refiere al uso de dicho compuesto para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento e inhibición de metástasis de células tumorales.
En la siguiente descripción detallada de la invención se aclaran éstos y otros aspectos de la presente invención.
Breve descripción de las figuras
Figura 1: indica las secuencias de aminoácidos de arginina deiminasa clonadas de Mycoplasma arginini (la secuencia de aminoácidos superior, SEQ ID NO: 1, identificada como ADIPROT), Mycoplasma arthritides (la secuencia de aminoácidos en medio, SEQ ID NO:2 identificada como ARTADIPRO) y Mycoplasma hominus (la secuencia de aminoácidos inferior, SEQ ID NO:3, identificada como HOMADIPRO).
Figuras 2A y 2B: gráficos que muestran el efecto de una dosis única de arginina deiminasa nativa y arginina deiminasa modificada con polietilenglicol (por ejemplo con un peso molecular de 5.000) sobre los niveles de seroarginina y de serocitrulina en ratones.
Figura 3: gráfico que muestra los efectos sobre los niveles de seroarginina cuando PEG 10.000 está enlazado covalentemente a ADI por medio de varios grupos de enlace.
Figura 4: gráfico que muestra el efecto que el grupo de enlace y el peso molecular del polietilenglicol tienen sobre la producción de citrulina en ratones a los que se les ha inyectado una dosis única de PEG-ADI.
Figuras 5A y 5B: gráficos que muestran la respuesta a la dosis que ADI-SS-PEG 5.000 tuvo sobre los niveles de seroarginina y serocitrulina.
Figuras 5C y 5D: gráficos que muestran la curva dosis-respuesta que ADI-SS-PEG 20.000 tuvo sobre los niveles de seroarginina y serocitrulina.
Figura 6: gráfico que muestra la antigenicidad de ADI, ADI-SS-PEG 5.000 y ADI-SS-PEG 20.000 nativas.
Figura 7: gráfico que muestra el efecto que los tratamientos con ADI-SS-PEG 5.000, ADI-SS-PEG 12.000 o ADI-SS-PEG 20.000 tuvo sobre el tamaño del tumor en ratones a los que habían inyectado células de melanoma humano SK-mel 2.
Figura 8: gráfico que muestra el efecto que los tratamientos con ADI-PEG 20.000 tuvo sobre el tamaño del tumor en ratones a los que habían inyectado células de melanoma humano SK-mel 28, SK-mel 2 o M24-met.
Figura 9: gráfico que muestra el efecto que los tratamientos con ADI-PEG 5.000, ADI-PEG 12.000 o ADI-PEG 20.000 tuvo sobre la supervivencia de ratones a los que habían inyectado células de hepatoma humano SK-Hepl.
Descripción detallada de la invención
Las células normales no requieren arginina para su crecimiento ya que pueden sintetizar arginina a partir de citrulina mediante un procedimiento en dos etapas catalizado por la arginosuccinato-sintasa y la arginosuccinato-liasa. Por el contrario, los melanomas, hepatomas y algunos sarcomas no expresan la arginosuccinato-sintasa, por tanto, son auxotróficos para la arginina. De esta diferencia metabólica se puede sacar provecho para desarrollar una terapia segura y eficaz de tratamiento de estas formas de cáncer. La arginina deiminasa cataliza la conversión de arginina a citrulina y se puede utilizar para eliminar la arginina. Por consiguiente, la arginina deiminasa se puede utilizar para tratar melanomas, hepatomas y algunos sarcomas.
La arginina deiminasa nativa se puede encontrar en microorganismos, es antigénica y se elimina rápidamente de la circulación de los pacientes. Estos problemas se pueden remediar modificando covalentemente la arginina deiminasa con polietilenglicol (PEG). En lo sucesivo nos referiremos a la arginina deiminasa modificada con polietilenglicol (con un grupo enlazante) como "ADI-PEG". En comparación con la arginina deiminasa nativa, ADI-PEG conserva la mayor parte de su actividad enzimática, es bastante menos antigénica, tiene una vida media de circulación muy larga y es mucho más eficaz en el tratamiento de tumores.
"Polietilenglicol" o "PEG" se refiere a mezclas de polímeros de condensación de óxido de etileno y agua, en una cadena ramificada o lineal, representada por la fórmula H(OCH_{2}CH_{2})_{n}OH, donde n es al menos 4. El "polietilenglicol" o "PEG" se utiliza en combinación con un sufijo numérico para indicar el peso molecular promedio en peso aproximado del mismo.
Por ejemplo, PEG 20.000 se refiere a un polietilenglicol con un peso molecular promedio en peso de aproximadamente 20.000.
Un "melanoma" puede ser un tumor maligno o benigno que se origina en el sistema melanocítico de la piel y en otros órganos, incluidos la cavidad bucal, el esófago, el conducto anal, la vagina, las leptomeninges y/o la conjuntiva u ojo. El término "melanoma" incluye, por ejemplo, el melanoma acrolentiginoso, el melanoma amelanótico, el melanoma juvenil benigno, el melanoma léntigo maligno, el melanoma maligno, el melanoma nodular, el melanoma subungueal y el melanoma de extensión superficial.
Un "hepatoma" puede ser un tumor maligno o benigno del hígado, incluido, por ejemplo, el carcinoma hepatocelular.
El término "paciente" se refiere a un animal, preferiblemente un mamífero, en particular un ser humano.
El término "biocompatible" se refiere a aquellos materiales o compuestos que en general no son perjudiciales para las funciones biológicas y que no ocasionan ninguna toxicidad no aceptable, incluidos los estados alérgicos o de enfermedad.
En toda la descripción se utilizan las siguientes abreviaturas: PEG: polietilenglicol; ADI: arginina deiminasa; SS: succinimidil succinato; SSA: succinimidil succinimida; SPA: succinimidil propionato y NHS: N-hidroxisuccinimida.
\newpage
La presente invención se basa en el inesperado descubrimiento de que la ADI modificada con polietilenglicol proporciona excelentes resultados en el tratamiento de determinados tipos de cáncer y en la inhibición de las metástasis cancerosas. La ADI puede estar enlazada covalentemente al polietilenglicol mediante un grupo enlazante, en una realización preferente se utiliza un grupo de enlace.
En la presente invención, el gen de la arginina deiminasa puede derivarse, clonarse o producirse a partir de cualquier fuente, incluidos, por ejemplo, microorganismos, biotecnología recombinante o cualquier combinación de los mismos. Preferiblemente, la arginina deiminasa se clona a partir de microorganismos del género Mycoplasma. En especial, la arginina deiminasa se clona a partir de Mycoplasma arginini, Mycoplasma hominus, Mycoplasma arthritides o cualquier combinación de los mismos. En particular, la arginina deiminasa utilizada en la presente invención puede tener una o más de las secuencias de aminoácidos representadas en la Figura 1.
En una realización de la presente invención, el polietilenglicol (PEG) tiene un peso molecular promedio en peso de 16.000 a 40.000, preferentemente de 16.000 a 30.000, en especial de 16.000 a 28.000, más preferiblemente de 16.000 a 24.000, con especial preferencia de 18.000 a 22.000, en particular de 19.000 a 21.000 y muy especialmente de aproximadamente 20.000. En general, un polietilenglicol con un peso molecular de 30.000 o más es difícil de disolver y el rendimiento del producto formulado se reduce enormemente. El polietilenglicol puede ser de cadena ramificada o lineal, preferiblemente de cadena lineal. En general, al aumentar el peso molecular del polietilenglicol disminuye la inmunogenicidad de la ADI. Se puede utilizar un polietilenglicol con un peso molecular como el descrito en esta realización en conjunción con la ADI y un grupo enlazante biocompatible para el tratamiento de cánceres, incluidos, por ejemplo, melanomas, hepatomas y sarcomas, en especial melanomas.
El grupo enlazante utilizado para unir la ADI al PEG puede ser cualquier grupo de enlace biocompatible. Tal como se ha analizado anteriormente, el término "biocompatible" indica que el compuesto o grupo es no tóxico y que se puede utilizar in vitro o in vivo sin causar daño, dolencia, enfermedad o muerte. El PEG puede estar enlazado al grupo de enlace, por ejemplo, vía un enlace éter, un enlace éster, un enlace tiol o un enlace amida. Entre los grupos de enlace biocompatibles adecuados se encuentran, por ejemplo, el grupo éster, el grupo amida, el grupo imida, el grupo carbamato, el grupo carboxilo, el grupo hidroxilo, carbohidratos, el grupo maleimida (incluidos, por ejemplo, succinimidil succinato (SS), succinimidil propionato (SPA), succinimidil carboximetilato (SCM), succinimidil succinimida (SSA) o N-hidroxisuccinimida (NHS)), el grupo epóxido, el grupo oxicarbonilimidazol (incluido, por ejemplo, carbonilimidazol (CDI)), el grupo nitrofenilo (incluidos, por ejemplo, nitrofenil carbonato (NPC) o triclorofenil carbonato (TPC)), el grupo trisilato, un grupo aldehído, un grupo isocianato, vinilsulfona, tirosina, cisteína, histidina o una amina primaria. Preferentemente, el grupo de enlace biocompatible es un grupo éster y/o un grupo maleimida. En particular, el grupo de enlace es SS, SPA, SCM, SSA o NHS; siendo preferentes SS, SPA o NHS, y en particular SS o SPA.
La ADI se puede enlazar covalentemente al PEG vía un grupo enlazante biocompatible utilizando métodos conocidos en la técnica, tal como se describe, por ejemplo, en Park y col. (1981) Anticancer Res., 1:373-376 y Zaplipsky y Lee, Polyethylene Glycol Chemistry: Biotechnical and Biomedical Applications, J.M. Harris, ediciones Plenum Press, Nueva York, Capítulo 21 (1992).
La unión de PEG a ADI aumenta la vida media en circulación de ADI. En general, PEG se une a una amida primaria de ADI. La elección del sitio de unión del polietilenglicol a la arginina deiminasa se determina según el papel de cada uno de los sitios dentro del dominio activo de la proteína, como será conocido por cualquier experto en la materia. El PEG se puede unir a las aminas primarias de la arginina deiminasa sin sufrir ésta una pérdida sustancial de actividad enzimática. Por ejemplo, la ADI clonada de Mycoplasma arginini, Mycoplasma arthritides y Mycoplasma hominus tiene aproximadamente 17 lisinas que se pueden modificar por este procedimiento. En otras palabras, las 17 lisinas son todas posibles sitios en los que la ADI puede unirse al PEG por medio de un grupo de enlace biocompatible tal como SS, SPA, SCM, SSA y/o NHS. PEG se puede unir también en otros sitios a ADI, como será obvio para cualquier experto en la técnica teniendo en cuenta la presente descripción.
De 1 a 30 moléculas de PEG se pueden enlazar covalentemente a ADI. Preferentemente, ADI se modifica con 7 a 15 moléculas de PEG, en especial con 9 a 12 moléculas de PEG. Es decir, del 30% al 70% de los grupos amino primarios de la arginina deiminasa se modifican con PEG, preferentemente del 40% al 60%, en especial del 45% al 55% y en particular aproximadamente el 50% de los grupos amino primarios de la arginina deiminasa. Cuando el PEG se enlaza covalentemente al extremo terminal de ADI, se utiliza preferentemente una molécula de PEG. Incrementar el número de unidades de PEG en ADI aumenta la vida media en circulación de la enzima. Sin embargo, incrementar el número de unidades de PEG en ADI disminuye la actividad específica de la enzima. Por consiguiente, se ha de alcanzar un equilibrio entre ambas situaciones, como será obvio para cualquier experto en la técnica teniendo en cuenta la presente invención.
En la presente invención, una característica común de los grupos de enlace biocompatibles preferentes es que se pueden unir a una amina primaria de la arginina deiminasa vía un grupo maleimida. Una vez se han acoplado a la arginina deiminasa, SS-PEG tiene un enlace éster próxima a PEG, que puede hacer este sitio sensible a la seroesterasa, que puede liberar PEG de ADI en el cuerpo. SPA-PEG y PEG2-NHS no tienen un enlace éster, por tanto no son sensibles a la seroesterasa.
En la presente invención, los grupos enlazantes individuales no parecen influir en la vida media en circulación de PEG-ADI o en su actividad enzimática específica. Sin embargo, para la presente invención es fundamental utilizar un grupo de enlace biocompatible. El PEG que está unido a la proteína puede ser tanto de cadena simple, como con SS-PEG, SPA-PEG y SC-PEG, como un PEG de cadena ramificada, como con PEG2-NHS. A continuación se muestran las fórmulas estructurales de los grupos enlazantes preferentes de la presente invención:
1
2
3
Por cantidad terapéuticamente eficaz de uno de los compuestos de la presente invención se entiende aquella cantidad que es eficaz para inhibir el crecimiento del tumor. Por lo general, el tratamiento se puede iniciar con dosis pequeñas que pueden ir aumentando en pequeñas cantidades hasta que, en estas circunstancias, se logre el efecto óptimo. En general, una dosis terapéutica de los compuestos de la presente invención puede ser de 1 a 200 mg/kg dos veces a la semana aproximadamente una vez cada dos semanas. Por ejemplo, la dosis puede ser de aproximadamente 1 mg/kg una vez a la semana o de 2 ml de una inyección intravenosa de aproximadamente 20 mg/kg una vez cada 3 días. La dosis óptima con ADI-SS-PEG 5.000 puede ser de aproximadamente dos veces a la semana mientras que la dosis óptima con ADI-SS-PEG 20.000 puede ser desde aproximadamente una vez a la semana a aproximadamente una vez cada dos semanas. PEG-ADI se puede mezclar con una solución salina de tampón fosfato o con cualquier otra solución apropiada conocida por los expertos en la técnica antes de su inyección. La formulación de PEG-ADI se puede administrar como un sólido (liofalato) o como una formulación líquida, según se desee.
Los métodos de la presente invención pueden comprender tanto aplicaciones in vitro como aplicaciones in vivo. En el caso de aplicaciones in vitro, incluidas aquellas de cultivos celulares, los compuestos descritos en la presente invención se pueden añadir a las células en los cultivos y luego incubarse. Los compuestos de la presente invención también se pueden utilizar para facilitar la producción de anticuerpos monoclonales y/o policlonales utilizando técnicas de producción de anticuerpos bien conocidas en la práctica. Los anticuerpos monoclonales y/o policlonales luego se pueden utilizar en gran variedad de aplicaciones de diagnóstico, como será evidente para cualquier experto en la materia.
Los medios de administración in vivo de los compuestos de la presente invención variarán dependiendo de la aplicación deseada. Como es evidente para cualquier experto en la materia, la administración de la composición PEG-ADI de la presente invención puede ser, por ejemplo, vía oral, intranasal, intraperitoneal, parenteral, intravenosa, intralinfática, intratumoral, intramuscular, intersticial, intraarterial, subcutánea, intraocular, intrasinovial, transepitelial y transdérmica.
Ejemplos
En los siguientes ejemplos se describe más a fondo la invención; éstos tienen el objeto de servir de ilustración, pero no pretenden limitar el alcance de la presente invención.
Ejemplo 1
Producción de ADI Recombinante
Se obtuvieron cultivos de Mycoplasma arginini (ATCC 23243), Mycoplasma hominus (ATCC 23114) y Mycoplasma arthritides (ATCC 23192) de la American Type Culture Collection, Rockville, Maryland.
La arginina deiminasa se clonó de Mycoplasma arginini, Mycoplasma hominus y Micoplasma arthritides y se expresó en E. coli de la forma descrita anteriormente por S. Misawa y col. J. Biotecnology, 36:145-155 (1994). En la presente se incorpora íntegramente dicha descripción a modo de referencia. En la Figura 1 se muestran las secuencias de aminoácidos de la arginina deiminasa de cada una de las especies anteriores. La secuencia de aminoácidos superior, identificada como ADIPROT, es de Mycoplasma arginini; la secuencia de aminoácidos en medio, identificada como ARTADIPRO, es de Mycoplasma arthritides y la secuencia de aminoácidos inferior, identificada como HOMADIPRO, es de Mycoplasma hominus. Más del 96% de cada una de las secuencias de aminoácidos están conservadas. La caracterización por métodos conocidos por los expertos en la materia de cada una de las proteínas con respecto a la actividad enzimática específica, K_{m}, V_{max} y pH óptimo reveló que eran bioquímicamente indistinguibles unas de otras. El pH óptimo se determinó utilizado un tampón citrato (pH 5-6,5), un tampón fosfato (pH 6,5-7,5) y un tampón borato (pH 7,5-8,5). K_{m} y V_{max} se determinaron incubando la enzima con varias concentraciones de arginina y cuantificando la producción de citrulina. La K_{m} de diversas enzimas era de aproximadamente 0,02 a 0,06 \muM y el V_{max} era de aproximadamente 15-20 \mumol/min/mg, valores que están dentro del error típico de cada una de ellas.
Los genes de la arginina deiminasa se amplificaron por una reacción en cadena de polimerasa utilizando el siguiente par de cebadores derivado de la secuencia publicada de M. arginini, como se describe, por ejemplo, en T. Ohno y col, Infect. Immun., 58:3788-3795 (1990).
5'-GCAATCGATGTGTATTTGACAGT-3' (SEC ID NO:4)
5'-TGAGGATCCTTACTACCACTTAACATCTTTACG-3' (SEC ID NO: 5)
Se clonó el producto de la reacción en cadena de polimerasa como un fragmento BamH1-HindIII en el plásmido de expresión pQE16. El análisis de la secuencia de ADN indicaba que este fragmento tenía la misma secuencia para el gen de la arginina deiminasa, tal como se describe en Ohno y col., Infect. Immun., supra. Los cinco codones TGA del gen ADI que codifican el triptófano de Mycoplasma cambiaron a codones TGG por mutagénesis dirigida por oligonucleótidos antes de la expresión génica en E. coli, como se describe, por ejemplo, en J.R. Sayers y col, Biotechniques, 13:592-596 (1992). La ADI recombinante se expresó en corpúsculos de inclusión a niveles del 10% del total de la proteína celular.
Las proteínas de cada una de las tres especies de Mycoplasma anteriores tienen aproximadamente un 95% de homología y se purifican fácilmente por cromatografía en columna. Se pueden aislar aproximadamente 1,2 g de proteína pura a partir de 1 litro de caldo de fermentación. La ADI recombinante es estable durante aproximadamente 2 semanas a 37ºC y durante al menos 8 meses cuando se almacena a 4ºC. Como establecen los métodos conocidos para los expertos en la técnica, las proteínas tenían una alta afinidad por la arginina (0,04 Mm) y un pH fisiológico óptimo de aproximadamente 7,2 a aproximadamente 7,4.
Ejemplo 2
Renaturalización y Purificación de ADI Recombinante
Se renaturalizó la proteína ADI con pequeñas modificaciones se como describe en Misawa y col., J. Biotechnology, 36:145-155 (1994). En la presente se incorpora íntegramente tal descripción a modo de referencia. Se volvieron a suspender 100 g de pasta celular en 800 ml de 10 Mm K_{2} PO_{4} a pH 7,0, 1 Mm EDTA (tampón 1) y se rompieron las células en dos pasos en un Microfluidizador (Microfluidics Corporation, Newton, MA). Se añadió Triton X-100 para obtener una concentración final del 4% (v/v). Se agitó el homogenado durante 30 minutos a 4ºC, luego se centrífugo durante 30 minutos a 13.000 g. Se recogieron los pellets y se volvieron a suspender en un litro del tampón 1 que contenía un 0,5% de Triton X-100. Se diafiltró la solución contra 5 volúmenes de un tampón de desnaturalización (50 mM Tris HCl, pH 8,5, 10 Mm DTT) utilizando cartuchos de fibra hueca con una capacidad de retención de 100 kD (Microgon S.A, Laguna Hills, CA). Se añadió guanidina\cdotHCl para obtener una concentración final de 6 M y se agitó la solución durante 15 minutos a 4ºC. Se diluyó a 100 la solución en un tampón de replegado 1, 10 mm K_{2}PO_{4}, con un pH de 7,0 y se agitó durante 48 horas a 15ºC, se eliminaron las partículas por centrifugación a 15.000 x g.
Se concentró el sobrenadante resultante en una columna Q-Sefarosa de Flujo Rápido (Pharmacia S.A., Piscataway, NJ) preequilibrada con tampón de replegado. Se eluyó la ADI utilizando un tampón de replegado que contenía 0,2 M NaCl. El procedimiento de purificación dio la proteína ADI con un pureza > 95% según se calculó mediante análisis SDS-PAGE (Electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS). Se produjeron 8 g de proteína ADI renaturalizada a partir de 1 kg de pasta celular, lo que corresponde a 200 mg de ADI purificada por litro de fermentación.
Se determinó la actividad de ADI por micromodificación del método descrito por Oginski y col., Meth. Enzymol., (1957) 3:639-642. Se colocaron 10 \mul de muestras en 0,1 M Na_{2}PO_{4}, a un pH 7,0 (tampón de ensayo BUN) en una placa microtitulada de 96 pocillos, se añadieron 40 \mul de arginina 0,5 mM en un tampón de ensayo BUN y se cubrió la placa e incubó a 37ºC durante 15 minutos. Se añadieron 20 \mul de reactivo completo BUN (Sigma Diagnostics) y se incubó la placa durante 10 minutos a 100ºC. Luego se enfrió la placa a 22ºC y se analizó a 490 nm con un lector de placas microtituladas (Molecular Devices Inc.). 1,0 IU es la cantidad de enzima que convierte 1 \mumol de L-arginina a L-citrulina por minuto. Las concentraciones de proteína se determinaron utilizando Reactivo para Tinción de Proteínas con Azul de Coomassie Pierce (Pierce Co., Rockford, IL) con seroalbúmina bovina como patrón.
La actividad enzimática de la ADI purificada fue de 17-25 IU/mg.
Ejemplo 3
Unión de PEG a ADI
Se enlazó covalentemente PEG a ADI en un tampón fosfato 100 mM, a un pH 7,4. Brevemente, se mezcló ADI en el tampón fosfato con un exceso de 100 moles de PEG. Se agitó la mezcla a temperatura ambiente durante 1 hora, luego se dializó bien la mezcla para eliminar el PEG no incorporado.
Se realizó un primer experimento en el que se evaluó el efecto del grupo enlazante utilizado en las composiciones PEG-ADI. Se enlazaron covalentemente PEG y ADI por medio de diferentes grupos de enlace: un grupo éster o un grupo maleimida, incluidos SS, SSA, SPA y SSPA, teniendo el PEG un peso molecular promedio en peso de 5.000, 10.000, 12.000, 20.000, 30.000 y 40.000, un grupo epoxi, PEG-epoxi, donde el PEG tenía un peso molecular promedio en peso de 5.000 y un grupo PEG ramificado, PEG2-NHS, donde el PEG tenía un peso molecular promedio en peso de 10.000, 20.000 y 40.000.
Se inyectaron 5,0 IU de las composiciones resultantes en ratones (5 ratones en cada grupo). Se sacó sangre del plexo retro-orbital de los ratones (100 \mul) para determinar los niveles en suero de arginina. Inmediatamente después de recogerla, se añadió un volumen igual de ácido tricloroacético al 50% (p/v). Se eliminó el precipitado por centrifugación (13.000 x g durante 30 minutos) y se retiró el sobrenadante y almacenó congelado a -70ºC. A continuación se analizaron las muestras utilizando un analizador automático de aminoácidos y reactivos de Beckam Instruments utilizando los protocolos facilitados por el fabricante. Los límites de sensibilidad de la citrulina en este método eran de aproximadamente 2-6 \muM y la reproducibilidad de las medidas estaba en el rango de aproximadamente el 8%. Se determinó la cantidad de seroarginina mediante un análisis de aminoácidos. Como se puede observar por los resultados de la Figura 3, el grupo de enlace que enlaza covalentemente el PEG y la ADI no tenía un efecto apreciable en la capacidad de la ADI para reducir la seroarginina in vivo. Es decir, el grupo de enlace puede no ser fundamental para los resultados del experimento, salvo que para las aplicaciones in vivo se deba usar un grupo de enlace no tóxico.
Se realizó un segundo experimento en el que se evaluaron el efecto del grupo de enlace y el peso molecular del PEG en los niveles de serocitrulina in vivo. Se administraron varias composiciones de ADI y PEG-ADI en una cantidad de 5,0 IU a los ratones (5 en cada grupo). Para determinar los niveles en suero de la citrulina, se sacó sangre del plexo retro-orbital de los ratones (100 \mul). Inmediatamente después de recogerla, se añadió un volumen igual de ácido tricloroacético al 50% (p/v). Se eliminó el precipitado por centrifugación (13.000 x g durante 30 minutos) y se retiró el sobrenadante y almacenó congelado a -70ºC. A continuación se analizaron las muestras utilizando un analizador automático de aminoácidos y reactivos de Beckam Instruments utilizando los protocolos facilitados por el fabricante. Los límites de sensibilidad de la citrulina en este método eran de aproximadamente 2-6 \muM y la reproducibilidad de las medidas estaba dentro de aproximadamente el 8%. Se determinó la cantidad de citrulina y el área por debajo de la curva se aproximó y expresó como \mumol/días.
En la Figura 4, los círculos en blanco indican la cantidad de citrulina producida por la ADI nativa, los círculos en negro son ADI-SC-PEG, los cuadrados en blanco son ADI-SS-PEG, los triángulos en blanco son ADI-SPA-PEG y los triángulos en negro son la cadena ramificada PEG-NHS-PEG_{2}. Los resultados de la Figura 4 demuestran que el peso molecular del PEG determina la eficacia de la composición de PEG-ADI. La eficacia de las composiciones PEG-ADI no está necesariamente basada en el método o medio de unión de PEG a ADI, salvo que se deba usar un grupo de enlace compatible en las aplicaciones in vivo.
Los resultados de la Figura 4 demuestran que el peso molecular óptimo del PEG es 20.000. Aunque PEG30.000 parece ser superior a PEG20.000 en lo que a su farmacodinámica se refiere, PEG30.000 es menos soluble, lo que hace que sea más difícil trabajar con él. Los rendimientos basados en la recuperación de la actividad enzimática fueron de aproximadamente un 90% para PEG5.000 y PEG12.000, aproximadamente un 85% para PEG20.000 y aproximadamente un 40% para PEG30.000. Por tanto, PEG20.000 muestra el mejor equilibrio entre rendimiento y vida media en circulación, como se determina por la producción de citrulina.
En un tercer experimento, se determinó la respuesta dosis dependiente de la depleción de seroarginina y la producción de citrulina con ADI-SS-PEG5.000 y ADI-SS-PEG20.000. Se administró una única inyección de 0,05 IU, 0,5 IU o 5,0 IU de ADI-SS-PEG5.000 o ADI-SS-PEG20.000 a ratones (5 en cada grupo). Se recogió el suero en los momentos indicados, tal como se describe arriba, y se efectuó un análisis de aminoácidos para cuantificar la seroarginina (Figuras 5A y 5C) y la serocitrulina (Figuras 5B y 5C). Ambas formulaciones provocaron una disminución dosis dependiente de la seroarginina y un aumento de la serocitrulina. Sin embargo, los efectos inducidos por ADI-SS-PEG20.000 fueron más pronunciados y de más larga duración que los efectos inducidos por ADI-SS-PEG5.000.
Ejemplo 4
Selectividad de la Citotoxicidad Mediada por ADI
Se demostró la selectividad de citotoxicidad mediada por la arginina deiminasa utilizando diversos tumores humanos. En concreto, se analizó in vivo la sensibilidad de los tumores humanos a ADI-SS-PEG5.000 (50 ng/ml). Se determinó la viabilidad de los cultivos después de 7 días. Para que un cultivo pueda definirse como "inhibido", más del 95% de las células deben absorber tinte azul Trypan. También se analizaron gran cantidad de células normales, incluidas células endoteliales, células del músculo liso, células epiteliales y fibroblastos, y ninguno de ellos fue inhibido por ADI-SS-PEG5.000. Aunque la arginina deiminasa no tiene una toxicidad apreciable en células normales y en la mayor parte de las células tumorales, ADI-SS-PEG5.000 inhibió en gran medida todos los melanomas y hepatomas humanos que se comercializaban por ATCC, MSKCC y Europa.
TABLA 1 Especificidad de la Citotoxicidad de la Arginina Deiminasa
Tipo de Tumor Número de tumores Tumores inhibidos (%)
analizados
Cerebro 16 0
Colon 34 0
Vesícula 3 0
Mama 12 0
Riñón 5 0
Sarcoma 11 64
Hepatoma 17 100
Melanoma 37 100
En un conjunto de experimentos paralelos, se aisló mRNA de los tumores. Los análisis Northern blot utilizando una sonda de ADNc de arginosuccinato-sintasa humana indicaron una total concordancia entre la sensibilidad al tratamiento con arginina deiminasa y la incapacidad de expresar la arginosuccinato-sintasa. Estos datos indican que la toxicidad de ADI es causada por la incapacidad para inducir la arginosuccinato-sintasa. Por tanto, estas células no pueden sintetizar arginina de citrulina y son incapaces de sintetizar las proteínas necesarias para el crecimiento.
Ejemplo 5
Vida Media en Circulación
Se inyectó vía intravenosa a ratones Balb-C (5 en cada grupo) una única dosis de 5,0 IU de arginina deiminasa nativa o de varias formulaciones de arginina deiminasa modificada con polietilenglicol, tal como indican las Figuras 3A y 3B. Para determinar los niveles en suero de la arginina y de la citrulina, se sacó sangre del plexo retro-orbital a los ratones (100 \mul). Inmediatamente después de recogerla se añadió un volumen igual de ácido tricloroacético al 50% (p/v). Se eliminó el precipitado por centrifugación (13.000 x g durante 30 minutos) y se retiró y almacenó el sobrenadante congelado a -70ºC. A continuación se analizaron las muestras utilizando un analizador automático de aminoácidos y reactivos de Beckam Instruments utilizando los protocolos facilitados por el fabricante. Los límites de sensibilidad de la arginina por este método eran de aproximadamente 6 pM y la reproducibilidad de las medidas estaban dentro de aproximadamente el 8%.
Se detectó una disminución dosis dependiente en los niveles de seroarginina, como muestran los círculos en negro de la Figura 2A y un aumento en la serocitrulina, como muestran los triángulos en blanco de la Figura 2B, a la administración de una dosis única de ADI nativa (círculos en negro) o ADI-SS-PEG (triángulos en blanco). Sin embargo, la disminución de seroarginina y el aumento de serocitrulina fueron efímeros y pronto volvió a la normalidad. En la Tabla de abajo se resume la vida media de la depleción de arginina.
TABLA 2 Vida Media de la Depleción de Seroarginina
Compuesto Vida Media en Días
ADI Nativa 1
ADI-SS-PEG5.000 5
ADI-SS-PEG12.000 15
ADI-SS-PEG20.000 20
ADI-SS-PEG30.000 22
Este experimento demuestra que las células y tejidos normales son capaces de convertir la citrulina en arginina intracelularmente mientras que los melanomas y hepatomas no pueden porque carecen de arginosuccinato-sintasa.
Ejemplo 6
Antigenicidad de la ADI modificada con PEG
Para determinar la antigenicidad de ADI, ADI-SS-PEG5.000 y ADI-SS-PEG20.000, se siguieron los procedimientos descritos en, por ejemplo, Park, Anticancer Res., supra y Kamisaki, J. Pharmacol Exp. Ther., supra. Brevemente, se inyectaron vía intravenosa a ratones Balb-C (5 en cada grupo) aproximadamente 0,5 IU (100 \mug de proteína) de ADI, ADI-SS-PEG5.000 o ADI-SS-PEG20.000 nativa, semanalmente durante 12 semanas. Se extrajo sangre del plexo retro-orbital a los animales (0,05 ml) al principio del experimento en las semanas 4, 8 y 12. Se aisló y almacenó el suero a -70ºC. Se determinaron las titulaciones de IgG anti-ADI mediante un ensayo de inmunoabsorción enzimática (prueba ELISA). Se añadieron 50 \mug de ADI a cada placa microtitulada de 96 pocillos y se incubó a temperatura ambiente durante 4 horas. Se enjuagaron las placas con PBS y luego se recubrieron con seroalbúmina bovina (1 mg/ml) para bloquear los sitios de unión para proteínas no específicas, y se almacenaron toda la noche a 4ºC. Al día siguiente se diluyó el suero de los ratones y se añadió a los pocillos. Después de 1 hora, se enjuagaron las placas con PBS y se añadió IgG conejo anti-ratón conjugado con peroxidasa a los pocillos. Se incubaron las placas durante 30 minutos y luego se midió la absorbancia UV resultante utilizando un lector de placas microtituladas. Se definió la titulación como la dilución más elevada de suero que tenía como resultado un aumento multiplicado por dos de la absorbancia de fondo (aproximadamente 0,50 OD).
En la Figura 6 se muestran los resultados. Los círculos en blanco representan los datos obtenidos de los animales a los que se había inyectado ADI nativa, que era muy antigénica. Los círculos en negro representan los datos obtenidos de los animales a los que se había inyectado con ADI-SS-PEG5.000, mientras que los triángulos en blanco representan los datos obtenidos de los animales a los que se había inyectado ADI-SS-PEG20.000. Como se puede observar en la Figura 6, ADI-SS-PEG5.000 y ADI-SS-PEG20.000 son significativamente menos antigénicos que la ADI nativa. Por ejemplo, tan sólo 4 inyecciones de ADI nativa tuvieron como resultado una titulación de aproximadamente 10^{6}, mientras que 4 inyecciones de cualquiera de las formulaciones PEG-ADI no produjeron ningún anticuerpo perceptible. Sin embargo, después de 8 inyecciones, ADI-PEG5.000 tenía una titulación de 10^{2}, mientras que ADI-PEG20.000 no indujo tanta de una reacción inmunitaria hasta después de 12 inyecciones. Los resultados demuestran que la unión de PEG a ADI suaviza la reacción inmunitaria para la proteína.
Ejemplo 7
Inhibición Tumoral en Melanomas Humanos
Se determinó el efecto de PEG-ADI sobre el crecimiento de melanomas humanos (SK-MEL 28) en ratones sanos. Se inoculó a ratones sanos (5 en cada grupo) con células de melanoma humano 10^{6} SK-MEL 2, a las que se dejaron crecer hasta que los tumores alcanzaron un diámetro de aproximadamente 3-5 mm. Se dejó a los ratones sin tratar (círculos en blanco) o se trataron una vez por semana durante 12 semanas con 5,0 IU de ADI-SS-PEG5.000 (triángulos en negro), ADI-SS-PEG12.000 (triángulos en blanco) o ADI-SS-PEG20.000 (círculos en negro). Se midió el tamaño del tumor semanalmente, el diámetro medio de los tumores se muestra en la Figura 7.
La Figura 8 muestra la eficacia de ADI-SS-PEG20.000 en tres melanomas humanos (SK-mel 2, SK-mel 28, M24-met) que han crecido in vivo en ratones sanos. Se inocularon células de melanoma humano 10^{6} SK-mel 2, SK-mel 28 o M24-met a ratones sanos (5 en cada grupo). Se dejaron crecer los tumores hasta que tuvieron un diámetro de aproximadamente 3-5 mm. A partir de entonces, se inyectó a los animales una vez a la semana con 5,0 IU de ADI-SS-PEG20.000. En la Figura 8 se muestran los resultados, que demuestran que PEG-ADI inhibió el crecimiento tumoral y que al final los tumores empezaron a experimentar un retroceso y a desaparecer. Debido a que los tumores no tenían argininosuccinato-sintasa no podían sintetizar las proteínas (porque ADI eliminaba la arginina y los tumores no podían producirla) de tal modo que las células "morían de inanición".
Ya que el melanoma humano M24-met es muy metastásico, se sacrificó a los animales a los que se habían inoculado células de melanoma humano M-24-met después de 4 semanas de tratamiento y se determinó el número de metástasis en los pulmones de los animales. Los animales control tenían una media de 32 metástasis, mientras que los animales tratados con ADI-SS-PEG20.000 no tenían metástasis. Los resultados parecen indicar que ADI-SS-PEG20.000 no sólo inhibió el crecimiento de los tumores primarios de melanoma, sino que también inhibió la formación de metástasis.
Es interesante observar que de más de 200 animales analizados, el número medio de metástasis en el grupo control era de 49 \pm 18, mientras que sólo se observó una única metástasis en 1 animal tratado.
Ejemplo 8
Inhibición Tumoral en Hepatomas Humanos
Se analizó la capacidad de PEG5.000-ADI para inhibir el crecimiento de hepatomas humanos in vivo. Se inocularon células SK-Hep 1 de hepatoma humano, 10^{6}, a ratones sanos (5 en cada grupo). Se dejaron crecer los tumores durante dos semanas y luego se trataron los animales una vez a la semana con 5,0 IU de SS-PEG5.000-ADI (círculos en negro), SS-PEG12.000-ADI (triángulos en negro) o SS-PEG20.000-ADI (triángulos en blanco). En la Figura 9 se muestran los resultados. Todos los animales que no habían sido tratados (círculos en blanco) murieron en un plazo de tres semanas. Por el contrario, los animales tratados con ADI tuvieron una esperanza de vida más larga, como puede observarse en la Figura 9. Se sacrificaron los ratones supervivientes después de 6 meses y la necropsia indicó que estaban libres de tumores.
Sorprendentemente, PEG5.000-ADI era muy eficaz a la hora de inhibir el crecimiento del hepatoma in vivo. Se desconoce el mecanismo exacto por el que esto sucede. Sin vincula la invención a ninguna teoría en particular, parece que las proteínas formuladas con SS-PEG5.000-ADI quedan secuestradas por el hígado. Los pesos moleculares más grandes de PEG no, lo que puede deberse a la singularidad del endotelio hepático y a que los espacios (ventanas) son de tal tamaño que los pesos moleculares más grandes de los conjugados PEG-ADI quedan excluidos.
Ejemplo 9
Aplicación a Seres Humanos
Se incubaron ex vivo PEG5.000-ADI y PEG20.000-ADI con suero humano normal y se determinó el efecto sobre la concentración de arginina mediante un análisis de aminoácidos, en el que se halló que la enzima era completamente activa y capaz de degradar toda la arginina detectable con la misma cinética que en los experimentos con ratones. La reacción se llevó a cabo a un volumen de 0,1 ml durante un tiempo de 1 hora a 37ºC. Además, los niveles de arginina y citrulina en suero humano son idénticos a los encontrados en ratones. Las proteínas-PEG circulan más tiempo en los seres humanos de lo que lo hacen en los ratones. Por ejemplo, la vida media en circulación del conjugado PEG-adenosina deiminasa, asparaginasa, glucocerbrocidasa, uricasa, hemoglobulina y superóxido dismutasa tienen todos un vida media de 5 a 10 veces superior a las correspondientes formulaciones en ratones. Lo que esto ha venido significando es que la dosis humana más frecuente es 1/5 a 1/10 de la utilizada en ratones. Por consiguiente, PEG-ADI debería circular incluso más tiempo en los seres humanos que en los ratones.
<110> Phoenix Pharmacologics, Inc.
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<120> Arginina Deiminasa Modificada
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<130> PHOE0037
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\vskip0.400000\baselineskip
<140> 98 922 197.3
\vskip0.400000\baselineskip
<141> 1998-05-12
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\vskip0.400000\baselineskip
<150> USSN 09/023,809
\vskip0.400000\baselineskip
<151> 1998-02-13
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\vskip0.400000\baselineskip
<150> USSN 60/046,200
\vskip0.400000\baselineskip
<151> 1997-05-12
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<160> 5
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<170> PatentIn version.3.0
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<210> 1
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<211> 410
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<212> PRT
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<213> Mycoplasma arginini 
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<400> 1
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4
5 
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<210> 2
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<211> 410
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<212> PRT
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<213> Mycoplasma arthritides 
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<400> 2
6
7 
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<210> 3
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<211> 409
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<212> PRT
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<213> Mycoplasma hominus 
\newpage
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<400> 3
8
9 
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<210> 4
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<211> 23
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<212> DNA
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<213> Mycoplasma arginini 
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<400> 4
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gcaatcgatg tgtatttgac agt 
\hfill
23 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
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<211> 33
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<212> DNA
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<213> Mycoplasma arginini 
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tgaggatcct tactaccact taacatcttt acg 
\hfill
33 
\vskip1.000000\baselineskip

Claims (22)

1. Compuesto que comprende arginina deiminasa enlazada covalentemente vía un grupo enlazante a polietilenglicol, caracterizado porque el polietilenglicol tiene un peso molecular promedio en peso comprendido en el intervalo entre 16.000 y 40.000.
2. Compuesto según la reivindicación 1, caracterizado porque grupo enlazante se selecciona de entre el grupo consistente en un grupo succinimida, un grupo amida, un grupo imida, un grupo carbamato, un grupo éster, un grupo epoxi, un grupo carboxilo, un grupo hidroxilo, un carbohidrato, un grupo tirosina, un grupo cisteína, un grupo histidina y combinaciones de los mismos.
3. Compuesto según la reivindicación 2, caracterizado porque dicho grupo enlazante es un grupo succinimida.
4. Compuesto según la reivindicación 3, caracterizado porque dicho grupo succinimida es succinimidil succinato, succinimidil propionato, succinimidil carboximetilato, succinimidil succinimida, N-hidroxisuccinimida o combinaciones de los mismos.
5. Compuesto según la reivindicación 4, caracterizado porque dicho grupo succinimida es succinimidil succinato, succinimidil propionato o combinaciones de los mismos.
6. Compuesto según la reivindicación 1, caracterizado porque dicha arginina deiminasa procede de un microorganismo del género Mycoplasma.
7. Compuesto según la reivindicación 6, caracterizado porque dicho microorganismo se selecciona de entre el grupo consistente en Mycoplasma arginini, Mycoplasma hominus, Mycoplasma arthritides y combinaciones de los mismos.
8. Compuesto según la reivindicación 1, caracterizado porque dicha arginina deiminasa está enlazada covalentemente a 7-15 moléculas de polietilenglicol.
9. Compuesto según la reivindicación 8, caracterizado porque dicha arginina deiminasa está enlazada covalentemente a 9-12 moléculas de polietilenglicol.
10. Compuesto según la reivindicación 1, caracterizado porque dicho polietilenglicol tiene un peso molecular promedio en peso de 16.000 a 30.000.
11. Método para mejorar la vida media en circulación de la arginina deiminasa que comprende la modificación de dicha arginina enlazando covalentemente la citada arginina deiminasa vía un grupo enlazante a polietilenglicol, caracterizado porque dicho polietilenglicol tiene un peso molecular promedio en peso comprendido entre 16.000 y 40.000.
12. Utilización de un compuesto que comprende arginina deiminasa enlazada covalentemente vía un grupo enlazante a polietilenglicol caracterizada porque dicho polietilenglicol tiene un peso molecular promedio en peso comprendido entre 16.000 y 40.000 para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de tumores en pacientes.
13. Utilización según la reivindicación 12, caracterizada porque tal tumor es un melanoma.
14. Utilización según la reivindicación 13, caracterizada porque dicho polietilenglicol tiene un peso molecular promedio en peso de aproximadamente 20.000.
15. Utilización según la reivindicación 13, caracterizada porque dicho grupo enlazante es un grupo succinimida.
16. Utilización según la reivindicación 15, caracterizada porque dicho grupo succinimida es succinimidil succinato, succinimidil propionato, succinimidil carboximetilato, succinimidil succinimida, N-hidroxisuccinimida o combinaciones de los mismos.
17. Utilización según la reivindicación 12, caracterizada porque tal tumor es un hepatoma.
18. Utilización según la reivindicación 17, caracterizada porque dicho grupo enlazante es un grupo succinimida.
19. Utilización según la reivindicación 18, caracterizada porque dicho grupo succinimida es succinimidil succinato, succinimidil propionato, succinimidil carboximetilato, succinimidil succinimida, N-hidroxisuccinimida o combinaciones de los mismos.
20. Utilización según la reivindicación 12, caracterizada porque tal tumor es un sarcoma.
21. Utilización de un compuesto según la reivindicación 1 para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento y la inhibición de metástasis en pacientes.
22. Método para mejorar la actividad tumoral de la arginina deiminasa que comprende la modificación de dicha arginina deiminasa enlazando covalentemente dicha arginina deiminasa vía un grupo enlazante a polietilenglicol, caracterizado porque dicho polietilenglicol tiene un peso molecular promedio en peso comprendido entre 16.000 y 40.000 y porque el grupo enlazante se selecciona de entre el grupo consistente en un grupo succinimida, un grupo amida, un grupo imida, un grupo carbamato, un grupo éster, un grupo epoxi, un grupo carboxilo, un grupo hidroxilo, un carbohidrato, un grupo tirosina, un grupo cisteína, un grupo histidina y combinaciones de los mismos.
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