CN1169951C - 被修饰的精氨酸脱亚胺酶 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用聚乙二醇改性的精氨酸脱亚胺酶、治疗癌症的方法及治疗和/或抑制肿瘤转移的方法。

Description

被修饰的精氨酸脱亚胺酶
相关申请
本申请要求在1997年5月12日提出的美国临时专利申请序号NO.60/046,200和在1998年2月13日提出的美国专利申请序号NO.09/023,809的优先权。
发明领域
本发明涉及用聚乙二醇修饰的精氨酸脱亚胺酶(deiminase)，涉及治疗肿瘤的方法，涉及治疗和/或抑制肿瘤转移的方法。
发明背景
恶性黑色素瘤(3期)和肝细胞瘤是在被诊断出一年之内就致使大多数患者死亡的致死性疾病。在美国每年大约有16,000人死于这些疾病。黑色素瘤在美国的发病率正在快速增加，而在其他国家如澳大利亚，它的发病率更高。在世界上肝炎流行的地方，肝细胞瘤的发病率更高，例如在日本和台湾，肝细胞瘤是首要的癌症形式之一。对这些疾病的有效治疗是非常急需的。
选择性地缺失必需氨基酸的方法被用来治疗某些癌症。最著名的例子是应用L-天冬酰胺酶来降低天冬酰胺的水平以治疗急性成淋巴细胞白血病。最常应用的L-天冬酰胺酶是从大肠杆菌中分离提取的。然而，该酶的临床应用却被其固有的抗原性和短的循环半衰期所限制，如Y.K.Park等在Anticancer Res.，1：373-376(1981)中描述的。用聚乙二醇共价修饰的大肠杆菌L-天冬酰胺酶降低了其抗原性，延长了其循环半衰期，正如由Park在Anticancer Res.，同上；Y.Kamisaki等在J.Pharmacol.Exp.Ther.，216：410-414(1981)；和Y.Kamisaki等在Gann.，73：47-474(1982)中描述过的。尽管付出了巨大努力来鉴定其他用于治疗癌症的必需氨基酸降解酶，但没有发现一个是合适的，主要是因为缺失必需氨基酸---由其定义---会导致无数严重的副作用。
曾有报道说降解非必需氨基酸如精氨酸的酶可能是控制某些形式的癌症的有效方法。例如，由J.B.Jones在“精氨酸脱亚胺酶对小鼠白血病成淋巴细胞的作用”，博士论文，The University of Oklahoma，1-165页(1981)中描述的从恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)中提取的精氨酸脱亚胺酶(ADI)。尽管在体外能有效地杀死肿瘤细胞，从恶臭假单胞菌中提取的ADI在体内却没能表现出有效性，因为它在中性pH下几乎没有酶活性，并从实验动物的血液循环中被快速清除。来自精氨酸支原体的精氨酸脱亚胺酶被描述在，如Takaku et al，Int.J.Cancer，51：244-249(1992)中和在美国专利NO.5,474,928中，在此将其公开全部引为参考。然而，与这样一个异源蛋白质的治疗作用相关联的一个问题是它的抗原性。Takaku等在Jpn.J.Cancer Res.，84：1195-1200(1993)中描述了用聚乙二醇通过氰尿酰氯基团对从精氨酸支原体中提取的精氨酸脱亚胺酶的化学修饰作用。然而，这个修饰的蛋白质在代谢时却是有毒的，因为从氰尿酰氯连接基上释放了氰化物。
需要能降解非必需氨基酸但却没有与现有技术相联系的问题的组合物。本发明涉及这些和其他重要的目的。
发明概述
本发明涉及用聚乙二醇修饰的精氨酸脱亚胺酶。在一个优选的实施方案中，精氨酸脱亚胺酶被总体重均分子量为大约1,000到大约50,000的聚乙二醇直接地或通过一个生物相容性连接基团所修饰。
本发明的另一个实施方案涉及治疗包括(例如)肉瘤、肝细胞瘤和黑色素瘤的癌症的方法。本发明还涉及治疗和/或抑制肿瘤细胞转移的方法。
本发明的这些和其他方面将要在以下对本发明的详细描述中得到阐述。
图示的简要描述
图1描述精氨酸脱亚胺酶的氨基酸序列，所示序列分别克隆自精氨酸支原体(Mycoplasma arginini)(被标定为ADIPROT的上部氨基酸序列)、关节炎支原体(Mycoplasma arthritides)(被标定为ARTADIPRO的中间氨基酸序列)和人形支原体(Mycoplasma hominus)(被标定为HOMADIPRO的下部氨基酸序列)。
图2A和2B表示单剂量天然精氨酸脱亚胺酶和用聚乙二醇(如分子量为5,000)修饰的精氨酸脱亚胺酶对小鼠血清精氨酸水平和血清瓜氨酸水平的作用。
图3表示当PEG10,000通过不同的连接基团与ADI共价连接时对血清精氨酸水平的作用。
图4表示以单剂量PEG-ADI注射时，连接基团和聚乙二醇的分子量对小鼠中瓜氨酸产生的作用。
图5A和5B表示血清精氨酸和瓜氨酸水平对ADI-SS-PEG5,000的剂量反应。图5C和5D表示血清精氨酸和瓜氨酸水平对ADI-SS-PEG20,000的剂量反应。
图6表示天然ADI、ADI-SS-PEG5,000和ADI-SS-PEG20,000的抗原性。
图7表示用ADI-SS-PEG5,000、ADI-SS-PEG12,000或ADI-SS-PEG20,000治疗被注射了SK-mel 2人黑色素瘤细胞的小鼠时对肿瘤大小的作用。
图8表示用ADI-PEG20,000治疗被注射了SK-mel 28、SK-mel 2或M24-met人黑色素瘤细胞的小鼠时对肿瘤大小的作用。
图9表示用ADI-PEG5,000、ADI-PEG12,000或ADI-PEG20,000治疗被注射了人肝细胞瘤细胞SK-Hep 1的小鼠时对小鼠生存率的作用。
本发明的详细描述
正常细胞的生长不需要精氨酸，因为它们能通过由精氨琥珀酸合成酶和精氨琥珀酸裂解酶催化的一个两步反应从瓜氨酸合成精氨酸。相反地，黑色素瘤、肝细胞瘤和一些其他的肉瘤不表达精氨琥珀酸合成酶；因而它们是精氨酸的营养缺陷型。这个代谢差别可用来开发对治疗这些癌症的安全而有效的治疗剂。精氨酸脱亚胺酶催化精氨酸向瓜氨酸的转化，可以被用来清除精氨酸。因此，精氨酸脱亚胺酶可以被用来治疗黑色素瘤、肝细胞瘤和一些其他肉瘤。
天然精氨酸脱亚胺酶可在微生物中找到，是抗原性的，并在患者的血液循环中被快速清除掉。这些问题可通过用聚乙二醇(PEG)共价修饰精氨酸脱亚胺酶来克服。用聚乙二醇(通过或不通过连接基团)共价修饰的精氨酸脱亚胺酶在此可被称为“ADI-PEG”。与天然精氨酸脱亚胺酶相比，ADI-PEG保留了它的大部分酶活性，具有很少的抗原性，有一个大大延长的循环半衰期，在治疗肿瘤时是更有效的。
“聚乙二醇”或“PEG”是指环氧乙烷和水的直链或支链形式缩聚物的混合物，由一般分子式H(OCH2CH2)nOH来代表，在此n至少为4。用“聚乙二醇”或“PEG”连同其后面的数字后缀一同来表示它的大约平均分子量。例如，PEG5,000是指重均分子量大约为5,000的聚乙二醇；PEG12,000是指重均分子量大约为12,000的聚乙二醇；PEG20,000是指重均分子量大约为20,000的聚乙二醇。
“黑色素瘤”可以是一种从皮肤或其他器官(包括口腔、食道、肛门、阴道、小脑膜(leptomeningers)和/或结膜或眼睛)的黑色素细胞系统发展而来的恶性或良性肿瘤。术语“黑色素瘤”包括，例如，肢端-小痣(acral-lentginous)黑色素瘤、无黑色素的黑色素瘤、少年良性黑色素瘤、恶性小痣黑色素瘤、恶性黑色素瘤、结节黑色素瘤、甲床黑瘤和浅层扩散的黑色素瘤。
“肝细胞瘤”可以是肝的一种恶性或良性肿瘤，包括例如肝细胞性癌。
“患者”是指动物，优选指哺乳动物，更优选指人。
“生物相容性”是指通常地对生物学功能没有伤害和不会导致任何不可接受程度的毒性(包括过敏和疾病状态)的物质或化合物。
在本发明的公开中，以下的缩写可能被应用：PEG，聚乙二醇；ADI，精氨酸脱亚胺酶；SS，琥珀酸琥珀酰亚胺酯；SSA，琥珀酰亚胺基琥珀酰胺；SPA，丙酸琥珀酰亚胺酯；NHS，N-羟基琥珀酰亚胺。
本发明基于一个意外发现，即用聚乙二醇修饰的ADI具有治疗某些类型的癌症和抑制癌症转移的显著效果。ADI可以通过或不通过一个连接基团与聚乙二醇相联，尽管优选的实施方案应用了连接基团。
在本发明中，精氨酸脱亚胺酶的基因可从任何来源得到、克隆或生产，例如微生物、重组生物技术或其任何组合。优选地，精氨酸脱亚胺酶从支原体属的微生物中克隆得到。更优选地，精氨酸脱亚胺酶从精氨酸支原体、人形支原体、关节炎支原体或其任何组合中克隆得到。特别地，在本发明中应用的精氨酸脱亚胺酶可以具有一个或多个在图1中表示的氨基酸序列。
在本发明的一个实施方案中，聚乙二醇(PEG)的总体重均分子量为从约1,000到约50,000；更优选地为从约3,000到约40,000；更优选地为从约5,000到约30,000；更优选地为从约8,000到约30,000；更优选地为从约11,000到约30,000；更优选地为从约12,000到约28,000；更加优选地为从约16,000到约24,000；更优选地为从约18,000到约22,000；更优选地为从约19,000到约21,000；最优选地到约20,000。一般地，具有30,000或更高分子量的聚乙二醇难于溶解，制剂产量因而大大降低。所用聚乙二醇可是直链或支链，优选为直链形式的。一般地，增加聚乙二醇的分子量可降低ADI的免疫原性。具有在本实施方案中描述的分子量的聚乙二醇可以与ADI和任选地一个生物相容性连接基团结合以用于治疗癌症，包括例如黑色素瘤、肝细胞瘤和肉瘤，优选黑色素瘤。
在本发明的另一个实施方案中，聚乙二醇(PEG)的总体重均分子量为从约1,000到约50,000；更优选地为从约3,000到约30,000；更优选地为从约3,000到约20,000；更优选地为从约4,000到约12,000；更优选地为从约4,000到约10,000；更优选地为从约4,000到约8,000；更加优选地为从约4,000到约6,000，最优选地为约5,000。所用聚乙二醇可是直链或支链，优选为直链形式的。具有在本实施方案中描述的分子量的聚乙二醇可以与ADI和任选地一个生物相容性连接基团结合以用于治疗癌症，包括例如黑色素瘤、肝细胞瘤和肉瘤，优选肝细胞瘤。
用来共价连接PEG和ADI的连接基团可以是任何生物相容性连接基团。如上所述，“生物相容性”表示化合物或基团是非毒性的，可以在体外或体内应用而并不引起损伤、病患、疾病或死亡。例如，PEG可以通过酯键、醚键、硫醇键或者酰胺键与连接基团相连。合适的生物相容性连接基团包括，例如，酯基、酰胺基、亚酰胺基、氨基甲酸酯基、羧基、羟基、碳水化合物、琥珀酰亚胺基团(包括，例如，琥珀酸琥珀酰亚胺酯(SS)、丙酸琥珀酰亚胺酯(SPA)、羧甲酸琥珀酰亚胺酯(SCM)、琥珀酰亚胺基琥珀酰胺(SSA)或N-羟基琥珀酰亚胺(NHS))、环氧基、氧基羰基咪唑基(包括，例如，羰基二咪唑基(CDI))、硝苯苯基(包括，例如，碳酸硝基苯酯(NPC)或碳酸三氯苯酯(TPC))、trysylate基、醛基、异氰酸酯基、乙烯砜基、酪氨酸基、半胱氨酸基、组氨酸基或伯胺。优选地，生物相容性连接基是酯基和/或琥珀酰亚胺基团。更优选地，连接基为SS、SPA、SCM、SSA或NHS，其中SS、SPA或NHS是更优选的，SS或SPA是最优选的。
另一选择是，ADI可以通过氨基、巯基、羟基或羧基直接与PEG结合(即不用连接基)。
ADI可通过生物相容性连接基团与PEG共价结合，其方法在本领域中己有描述，例如，Park等，Anticancer Res.，1：373-376(1981)；Zaplipsky与Lee，《聚乙二醇化学：生物技术与生物医学应用》，J.M.Harris编，Plenum Press，N.Y.，21章(1992)。在此将这些文献公开全部引入本文作参考。
把PEG连接到ADI上会增加ADI的循环半衰期。一般地，PEG与ADI的伯胺相连。在精氨酸脱亚胺酶上聚乙二醇的结合位点的选择是由在蛋白质的活性域中的每一个这样的位点的角色来决定的，这是本领域技术人员所知晓的。PEG可被连接到精氨酸脱亚胺酶的伯胺上去而不显著地损失酶活性。例如，从精氨酸支原体、关节炎支原体和人形支原体中克隆的ADI有17个可被此程序修饰的赖氨酸。换言之，这17个赖氨酸都是ADI可通过生物相容性连接基团如SS、SPA、SCM、SSA和/或NHS与PEG相连接的可能位点。PEG也可以与ADI上的其他位点相连接。结合本发明的公开，这对于本领域的技术人员来说将是显而易见的。
1到30个PEG分子可被共价连接到ADI上。优选地，ADI被7到15个PEG分子修饰，更优选地是9到12个PEG分子。易言之，精氨酸脱亚胺酶上伯氨基的大约30％到70％被PEG修饰，优选为40％到60％，更优选为45％到55％，最优选为精氨酸脱亚胺酶上50％的伯氨基被PEG修饰。当PEG与ADI末端共价连接时，优选只有1个PEG分子被应用。增加ADI上的PEG单位的数目能增加该酶的循环半衰期，然而增加ADI上的PEG单位的数目却会减少该酶的比活性。因而，需要在这两者之间达成平衡。从本发明公开的来看，这一点对于本领域的技术人员来说将是显而易见的。
在本发明中，最优选的生物相容性连接基团的一个共同特点是它们都通过琥珀酰亚胺基团与精氨酸脱亚胺酶的伯胺相连。一旦与精氨酸脱亚胺酶偶联，SS-PEG就在紧邻PEG处有一酯连接，它可使此位点对血清酯酶敏感，可在体内使PEG从ADI上释放出来。SPA-PEG和PEG2-NHS没有酯连接，因此它们对血清酯酶不敏感。
在本发明中，特别的连接基团似乎并不影响PEG-ADI的循环半衰期或其酶比活性。然而，在本发明中应用生物相容性基团是重要的。与蛋白质相连的PEG或者是一个单链，如在SS-PEG、SPA-PEG或SC-PEG中，或者也可应用PEG的支链，如在PEG2-NHS中。在本发明中优选的连接基团的结构式列于下。
SS-PEG：
SPA-PEG：
PEG2-NHS：
本发明的化合物的治疗有效剂量是能有效地抑制肿瘤生长的剂量。一般地，治疗以小剂量开始，以便不断增加剂量直到达到此条件下的最适。一般地，本发明的化合物的治疗剂量可以从大约1到大约200mg/kg，每星期两次到每两星期一次。例如，剂量可以是2ml静脉内注射剂形式的大约1mg/kg每星期一次，到大约20mg/kg每3天一次。ADI-SS-PEG5,000的最适剂量可以是大约每星期两次，而ADI-SS-PEG20,000的最适剂量可以是从大约每星期一次到每两星期一次。在注射前，PEG-ADI可与磷酸盐缓冲液或为本领域的熟练人员所熟知的任何其他适合的溶液混合。PEG-ADI制剂可如需求的那样以固体(冷冻干燥)或液体制剂形式给药。
本发明的方法可包括在体内或在体外的应用。在体外的应用(包括细胞培养的应用)中，可将在此描述的化合物加到培养的细胞中去并接着温育。应用在该领域中周知的抗体生产技术，本发明的化合物也可用来促进单克隆和/或多克隆抗体的产生。单克隆和/或多克隆抗体可被广泛用于诊断，这对于本领域的熟练人员来说是显然的。
在体内施用本发明的化合物的方法依赖于要达到的目的。正如本领域的熟练人员所认识到的那样，施用本发明的化合物PEG-ADI可通过以下途径完成，例如口腔内、鼻腔内、腹膜内、肠胃外、静脉内、淋巴管内、肿瘤内、肌肉内、间质内(interstitally)、动脉内、皮下、眼内、滑膜腔内(intrasynoial)、经上皮、经皮施用来完成。
实施例
本发明在以下的实施例中得到进一步的说明。这些实施例只是为了说明的目的，而不是用来限定本发明的范围。
实施例1：重组ADI的生产
从美国典型培养物保藏中心(Rockville，Maryland)得到精氨酸支原体(ATCC23243)、人形支原体(ATCC23114)、关节炎支原体(ATCC23192)培养物。
从精氨酸支原体、人形支原体和关节炎支原体中克隆出精氨酸脱亚胺酶，在大肠杆菌中表达，方法如S.Misawa等在J.Biotechnology，36：145-155(1994)中的描述，在此将该文献全部引为参考。图1给出了从每一个上述种而来的精氨酸脱亚胺酶的氨基酸序列。上面的氨基酸序列被标示为ADIPROT，是从精氨酸支原体来的；中间的氨基酸序列被标示为ARTADIPRO，是从关节炎支原体来的；下面的氨基酸序列被标示为HOMADIPRO，是从人型支原体来的。每一种氨基酸序列都有多于96％的保守性。通过本领域的熟悉人员知晓的方法鉴定的各个蛋白质的特征，包括酶的比活性、Km、Vmax和最适pH，都揭示出它们是生化不可区分的。最适pH应用柠檬酸盐缓冲液(pH 5-6.5)、磷酸盐缓冲液(pH6.5-7.5)和硼酸盐缓冲液(pH7.5-8.5)来确定。通过把酶与不同浓度的精氨酸温育并定量生成的瓜氨酸的方法来测定Km和Vmax。不同酶的Km为大约0.02到0.06μM，Vmax为大约15-20μmol/分钟/mg，这些数值都在各自的标准误差之内。
用聚合酶链式反应扩增精氨酸脱亚胺酶基因，应用由如T.Ohno等在Infect.Immun.，58：3788-3795(1990)(在此全部引为参考)中公布的精氨酸支原体的序列衍生的如下的引物对：
5’-GCAATCGATGTGTATTTGACAGT-3’
5’-TGAGGATCCTTACTACCACTTAACATCTTTACG-3’
聚合酶链式反应产品作为Bam H1-Hind III片段被克隆到表达质粒pQE16上去。DNA序列分析表明本片段与如上由T.Ohno等在Infect.Immun.，(同上)中描述的具有相同的序列。在支原体中编码色氨酸的ADI基因内的5个TGA密码子在大肠杆菌中进行基因表达前通过寡聚核苷酸定点诱变被改变为TGG密码子，这一技术由例如J.R.Sayers等在Biotechniques，13：592-596(1992)中给出。在内涵体中表达的重组ADI占细胞总蛋白10％的水平。
来自上面三种支原体的各种蛋白质具有大约95％的同源性，并可用柱层析纯化。从1升发酵液中可提取大约1.2克纯蛋白。重组ADI在37℃下能稳定2个星期，在4℃下至少能保存8个月。应用为本领域的熟练人员所知晓的方法测定，该蛋白对精氨酸有高亲和性(0.04μM)，最适生理pH为从7.2到7.4。
实施例2：重组ADI的复性与纯化
用被较少修饰的ADI蛋白质复性，其方法被Misawa等在J.Biotechnology，36：145-155(1994)中描述，在此将其全部引做参考。100克细胞浆被重新悬浮于800ml 10mM K2PO4(pH 7.0)、1mM EDTA(缓冲液1)中，细胞在微流量计(Microfluidics Corporation，Newton，MA)中通过两次以打散细胞。加入Triton X-100使其终浓度为4％(v/v)。在4℃将匀浆物搅拌30分钟，接着用13,000g离心30分钟。收集沉淀并重新悬浮在含有0.5％Triton X-100的1升缓冲液1中。用具有100kD截留率的空纤维柱(Microgon Inc.，Laguna Hills，CA)将溶液对5倍体积的变性缓冲液(50mM Tris HCl，pH 8.5，10mM DTT)透滤。加入盐酸瓜氨酸使其终浓度为6M，在4℃下将溶液搅拌15分钟。将溶液在重折叠缓冲液1(10mM K2PO4，pH7.0)中稀释100倍，在15℃下搅拌48小时，用15,000g离心去除颗粒。
得到的上清液在事先用重折叠缓冲液平衡过的Q Sepharose PastFlow(Pharmacia Inc.，Piscataway，NJ)柱上浓缩。用含有0.2M NaCl的重折叠缓冲液洗脱ADI。此纯化程序产生ADI蛋白质，由SDS-PAGE测定其纯度大于95％。从1千克细胞浆中能产生8克纯的复性ADI蛋白质，这相当于每升发酵液中产生200mg纯化的ADI。
用由Oginsky等在Meth.Enzymol.，(1957)3：639-642中描述的微修饰法测定ADI的活性。把在0.1M Na2PO4，pH 7.0(BUN测定缓冲液)中的10μl样品置于96孔微滴定培养板中，加入40μl在BUN测定缓冲液中的0.5mM精氨酸，盖上培养板，在37℃下温育15分钟。加入20μl完全BUN试剂(Sigma Diagnostics)，把培养板在100℃下温育10分钟。接着把培养板冷却至22℃，并在490nm下用微滴定板读数仪(Molecular Devices，Inc.)分析。每分钟能把1μmol L-精氨酸转化为L-瓜氨酸的酶量定为1.0IU。用Pierce考马斯蓝蛋白测定试剂(PierceCo.，Rockford，IL)测定蛋白浓度，用牛血清白蛋白做标准。
纯化的ADI制剂的酶活性为15-25IU/mg。
实施例3：PEG和ADI的连接
PEG在100mM磷酸盐缓冲液(pH 7.4)中与ADI共价连接。简言之，在磷酸盐缓冲液中的ADI与过量100摩尔的PEG混合。在室温下搅拌反应1小时，接着把混合物透析以除去未结合的PEG。
第一个实验用来评估在PEG-ADI复合物中应用的连接基团的作用。PEG10,000和ADI通过四种不同的连接基团形成共价键：酯基或琥珀酰亚胺基团，包括SS、SSA、SPA和SSPA，在此PEG的总体重均分子量为5,000、10,000、12,000、20,000、30,000和40,000；环氧基，环氧-PEG，在此PEG的总体重均分子量为5,000；支链PEG基，PEG2-NHS，在此PEG的总体重均分子量为10,000、20,000和40,000。
把得到的复合物5.0IU注射到小鼠中去(每组5只小鼠)。为确定血清中的精氨酸水平，小鼠被从眼眶后的血管丛处放血(100μl)。收集后立即加入等体积50％(w/v)的三氯乙酸。离心(13,000g，30分钟)除去沉淀，把上清取出并贮存在-70℃。用从Beckman Instruments得到的自动氨基酸分析仪和试剂分析样品，使用制造商提供的操作程序。此方法对瓜氨酸的灵敏度极限为约2-6μM，测量值的重复性在8％之内。用氨基酸分析来确定血清精氨酸的量。正如图3的结果所显示的，共价连接PEG和ADI的连接基团并没有令人欣喜的使ADI降低体内血清精氨酸水平的效果。易言之，连接基团对实验结果并不是必需的，除了在体内的应用中必须使用无毒的连接基团之外。
第二个实验用来衡量连接基团和PEG的分子量在体内对血清瓜氨酸的作用。把总量为5.0IU的ADI和PEG-ADI的各种组合施给小鼠(每组5只)。为确定血清中的精氨酸水平，小鼠被从眼眶后的血管丛处放血(100μl)。收集后立即加入等体积50％(w/v)的三氯乙酸。离心(13,000g，30分钟)除去沉淀，把上清取出并贮存在-70℃。用从Beckman Instruments得到的自动氨基酸分析仪和试剂分析样品，使用制造商提供的操作程序。此方法对瓜氨酸的灵敏度极限为约2-6μM，测量值的重复性在8％之内。确定瓜氨酸的量，用曲线下的面积大致表示，为μmol天。
在图4中，空白圆圈表示由天然ADI产生的瓜氨酸量，实心圆圈是ADI-SC-PEG，空白四方形是ADI-SS-PEG，空白三角形是ADI-SPA-PEG，实心三角是支链PEG-NHS-PEG2。图4的结果表明PEG的分子量决定PEG-ADI组合的效果。PEG-ADI复合物的有效性并不必然地基于PEG结合到ADI上的方法和手段，除了在体内的应用中必须使用生物相容性连接基团外。
图4的结果也显示PEG的最适分子量为20,000。尽管PEG30,000在药物动力学上看起来比PEG20,000优越，但PEG30,000更不溶解，这使它的应用更加困难。依赖于酶活性恢复的产量，对于PEG5,000和PEG12,000大约是90％，对于PEG20,000大约是85％，对于PEG30，000大约是40％。因而，正如由瓜氨酸产量所决定的那样，PEG20,000是在产量和循环半衰期之间的最佳平衡。
在第三个实验中，决定了血清精氨酸缺乏和瓜氨酸产生对ADI-SS-PEG5,000和ADI-SS-PEG20,000的剂量效应。小鼠(每组5只)被单次注射0.05IU、0.5IU或5.0IU ADI-SS-PEG5,000或ADI-SS-PEG20,000。在所示的时间如上所述收集血清，通过氨基酸分析来定量血清精氨酸(图5A和5C)和血清瓜氨酸(5B和5D)。两种制剂都诱导一种剂量依赖型的血清精氨酸水平降低和血清瓜氨酸水平增高。然而，由ADI-SS-PEG20,000诱导的效果比由ADI-SS-PEG5,000诱导的更好，持续期也更长。
实施例4：ADI介导的细胞毒性的选择性
用一些人类肿瘤来展示精氨酸脱亚胺酶介导的细胞毒性的选择性。特别地，人类肿瘤在体外被用来检验对ADI-SS-PEG5,000(50ng/ml)的敏感性。7天后检定培养物的存活。被定义为“被抑制的”培养物，必须有多于95％的细胞吸收台盼蓝染料。正常细胞的宿主也被检验，包括内皮细胞、平滑肌细胞、上皮细胞和成纤维细胞，并没有一个被ADI-SS-PEG5,000抑制。尽管精氨酸脱亚胺酶对于正常细胞和大多数肿瘤细胞没有明显的毒性，但ADI-SS-PEG5,000能大大地抑制从ATCC、MSKCC和欧洲商业性取得的所有人类黑色素瘤和肝细胞瘤。
         表1：精氨酸脱亚胺酶细胞毒性的选择性
    肿瘤类型     被测的肿瘤数     肿瘤抑制率(％)
    大脑     16     0
    结肠     34     0
    膀胱     3     0
    乳腺     12     0
    肾     5     0
    肉瘤     11     64
    肝细胞瘤     17     100
    黑色素瘤     37     100
在一组平行的实验里，mRNA被从肿瘤中分离出来。用人精氨琥珀酸合成酶cDNA做探针的Northern印迹显示在对精氨酸脱亚胺酶治疗的敏感性和不能表达精氨琥珀酸合成酶之间存在完全的一致性。此数据暗示ADI的细胞毒性是因其不能诱导精氨琥珀酸合成酶导致的。因而，这些细胞不能从瓜氨酸合成精氨酸，不能合成生长所必须的蛋白质。
实施例5：循环半衰期
Balb C小鼠(每组5只)被静脉内单剂量注射5.0IU的天然精氨酸脱亚胺酶或者用聚乙二醇修饰的精氨酸脱亚胺酶的不同制剂，如图3A与3B所示。为确定血清中的精氨酸与瓜氨酸水平，小鼠被从眼眶后的血管丛处放血(100μl)。收集后立即加入等体积50％(w/v)的三氯乙酸。离心(13,000g，30分钟)除去沉淀，把上清取出并贮存在-70℃。用从Beckman Instruments得到的自动氨基酸分析仪和试剂分析样品，使用由制造商提供的操作程序。此方法对精氨酸的灵敏度极限为约6pM，测量值的重复性在8％之内。
在单剂量施用天然ADI(实心圆圈)或ADI-SS-PEG(空白三角)后测量血清精氨酸水平的剂量依赖性下降，如图2A中实心圆圈所示；和血清瓜氨酸水平的上升，如图2B中空白三角所示。然而，血清精氨酸的下降和血清瓜氨酸的上升都是短暂的，它们很快恢复到正常。精氨酸缺乏的半衰期简列于下表。
    表2：血清精氨酸缺乏的半衰期
    化合物     半衰期天数
    天然ADI     1
    ADI-SS-PEG5,000     5
    ADI-SS-PEG12,000     15
    ADI-SS-PEG20,000     20
    ADI-SS-PEG30,000     22
本实验表明正常细胞和组织能够在细胞内把瓜氨酸转回到精氨酸，而黑色素瘤和肝细胞瘤因为缺少精氨琥珀酸合成酶却不能。
实施例6：PEG修饰的ADI的抗原性
为测定天然ADI、ADI-SS-PEG5,000和ADI-SS-PEG20,000的抗原性，应用由例如Park在Anticancer Res.(同上)和Kamisaki在J.Pharmacol.Exp.Ther.(同上)中描述的程序。简言之，Balb C小鼠(每组5只)被静脉内每星期注射大约0.5IU(100μg蛋白质)天然ADI、ADI-SS-PEG5,000或ADI-SS-PEG20,000，共12星期。在实验开始和在第4、8、12周时，动物被从眼眶后的血管丛处放血(0.05ml)。血清被分离出来并贮存在-70℃。用ELISA测定抗ADI的IgG的滴度。50μg ADI被加到96孔微滴定培养板的每一孔中，在室温下温育4小时。用PBS洗培养板，接着用胎牛血清(1mg/ml)进行包被以封闭非特异蛋白结合位点，并贮存于4℃。第二天把小鼠的血清稀释并加到孔中。一小时后，用PBS洗培养板，把与过氧化物酶偶联的兔抗鼠IgG加到孔中。把培养板温育30分钟，接着用微滴定培养板阅读仪测定所得的UV吸收。滴度被定义为导致比背景吸收(大约0.50 OD)增加两倍的血清的最高稀释度。
结果示于图6。空白圆圈代表从注射天然ADI的动物中得到的数据，有非常的抗原性。实心圆圈代表从注射ADI-SS-PEG5,000的动物中得到的数据，而空白三角代表从注射ADI-SS-PEG20,000的动物中得到的数据。从图6可以看到，ADI-SS-PEG5,000和ADI-SS-PEG20,000比天然ADI具有显著少的抗原性。例如，4次的注射天然ADI就导致106的滴度，而4次任何的PEG-ADI制剂注射都没能产生任何可测的抗体。然而，在8次注射之后，ADI-PEG5,000具有大约102的滴度，而ADI-PEG20,000却没能诱导免疫系统的如此反应，直到12次注射之后。此结果显示把PEG结合到ADI上钝化了对蛋白质的免疫反应。
实施例7：人黑色素瘤的肿瘤抑制
测定PEG-ADI在裸鼠中对人黑色素瘤(SK-Mel 28)生长的作用。裸鼠(每组5只)被注射106个SK-mel 2人黑色素瘤细胞，允许细胞生长直到肿瘤直径到达大约3-5mm。小鼠或不被处理(空白圆圈)，或用5.0IU的ADI-SS-PEG5,000(实心三角)、ADI-SS-PEG12,000(空白三角)或ADI-SS-PEG20,000(实心圆圈)每星期处理一次，共处理12星期。每星期测量肿瘤大小，肿瘤的平均直径示于图7。
图8表示ADI-SS-PEG20,000对在裸鼠体内生长的三种人黑色素瘤(SK-mel 2，SK-mel 28，M24-met)的作用。允许肿瘤生长直到其直径大约为3-5mm。其后，动物被每星期注射一次5.0IU的ADI-SS-PEG20,000。结果示于图8，表明PEG-ADI抑制肿瘤生长，使肿瘤慢慢缩小并消失。因为肿瘤没有精氨琥珀酸合成酶，不能合成蛋白质(因为ADI消除了精氨酸而肿瘤不能制造它)，因而使细胞“饥饿致死”。
因为M24-met人黑色素瘤是高度转移性的，注射M24-met人黑色素瘤细胞的动物在处理后4周被处死，并确定动物肺中转移灶的数目。对照动物平均有32个转移灶，而用ADI-SS-PEG20,000处理的动物却没有任何转移灶。此结果似乎表明ADI-SS-PEG20,000不仅抑制原发性黑色素瘤的生长，也同时抑制转移灶的形成。
有趣的是，注意到在超过200只被试动物中，在对照组中的平均转移灶数目为49±18，而只在1只被处理的动物中发现一个单一转移灶被发现。
实施例8：人黑色素瘤的肿瘤抑制
检测PEG5,000-ADI在体内抑制人肝细胞瘤生长的能力。裸鼠(每组5只)被注射106 SK-Hep 1人肝细胞瘤细胞。肿瘤被允许生长两星期，接着用5.0IU的SS-PEG5,000-ADI(实心圆圈)、SS-PEG12,000-ADI(实心三角)或SS-PEG20,000-ADI(空白三角)将动物每星期处理一次。结果示于图9。未处理的动物(空白圆圈)都在3星期内死去。相比较，用ADI处理的动物有一个很较长的寿命，如图9中可见。所有存活的小鼠在6个月后被安乐死，尸检表明它们都没有肿瘤。
令人惊奇的是，PEG5,000-ADI在体内抑制肝细胞瘤生长是最有效的。这种现象发生的机制是未知的。本发明不被任何理论所束缚，看起来用SS-PEG5,000-ADI配制的蛋白质在肝中被隔离。较大分子量的PEG却不如此，这可能是因为肝内皮的独特性和空间(窗)的尺寸使得较大分子量的PEG-ADI偶合物被排除在外。
实施例9：对人的应用
PEG5,000-ADI和PEG20,000-ADI在体外与正常人血清温育，其对精氨酸浓度的作用由氨基酸分析确定，发现此酶有完全的活性，并能以涉及小鼠的实验中相同的动力学降解所有可测的精氨酸。反应用0.1ml体积在37℃反应1小时。并且，在人血清中的精氨酸和瓜氨酸水平与在小鼠中发现的相同。PEG-蛋白在人体中比在小鼠中循环更长的时间。例如，与腺苷脱亚胺酶、天冬酰氨酶、葡萄糖脑苷脂酶(glucocerbrocidase)、尿酸酶、血红蛋白和超氧化物歧化酶偶联的PEG的循环半衰期都比相同制剂在小鼠中的循环半衰期长5到10倍。这在过去意味着对人类的剂量通常是在小鼠中应用的剂量的1/5到1/10。依此，PEG-ADI在人体中应该比它在小鼠内循环更长的时间。
在此描述的每一种专利、专利申请和公开物的全部都在此被引为参考。
本发明的各种改变，除了在此描述的以外，结合本说明书，对于本领域中的熟练人员将是显而易见的。这些改变也同样落在所附的权利要求书的范围之内。

Claims (19)

1.一种化合物，该化合物包括通过连接基团与聚乙二醇共价相连的精氨酸脱亚胺酶，其中聚乙二醇具有范围在12,000到28,000的总体重均分子量，并且所述聚乙二醇通过所述的连接基团与所述精氨酸脱亚胺酶的伯胺、羟基或羧基共价相连，其中所述的连接基团选自酰胺基、亚酰胺基、氨基甲酸酯基、酯基、环氧基、羧基、醚基、酪氨酸基、半胱氨酸基、组氨酸基和其组合。
2.权利要求1的化合物，其中所说的连接基团是琥珀酰亚胺基团。
3.权利要求2的化合物，其中所说的琥珀酰亚胺基团是琥珀酸琥珀酰亚胺酯、丙酸琥珀酰亚胺酯、羧甲酸琥珀酰亚胺酯、琥珀酰亚胺基琥珀酰胺、N-羟基琥珀酰亚胺或其组合。
4.权利要求3的化合物，其中所说的琥珀酰亚胺基团是琥珀酸琥珀酰亚胺酯、丙酸琥珀酰亚胺酯或其组合。
5.权利要求1的化合物，其中所说的精氨酸脱亚胺酶来自支原体属的微生物。
6.权利要求5的化合物，其中所说的微生物选自由精氨酸支原体、人型支原体和关节炎支原体组成的一组微生物。
7.权利要求1的化合物，其中所说的精氨酸脱亚胺酶与7个到15个聚乙二醇分子共价连接。
8.权利要求7的化合物，其中所说的精氨酸脱亚胺酶与9个到12个聚乙二醇分子共价连接。
9.一种延长精氨酸脱亚胺酶的循环半衰期的方法，该方法包括通过连接基团把所说的精氨酸脱亚胺酶与聚乙二醇共价相连来修饰所说的精氨酸脱亚胺酶，其中聚乙二醇具有在12,000到28,000范围内的总体重均分子量，并且所述聚乙二醇通过所述的连接基团与所述精氨酸脱亚胺酶的伯胺、羟基或羧基共价相连，其中所述的连接基团选自酰胺基、亚酰胺基、氨基甲酸酯基、酯基、环氧基、羧基、醚基、酪氨酸基、半胱氨酸基、组氨酸基和其组合。
10.权利要求1所述化合物的用途，其用于制备治疗患者的肿瘤的药物的应用。
11.权利要求10的用途，其中所说的肿瘤是黑色素瘤。
12.权利要求11的用途，其中所说的聚乙二醇具有20,000的总体重均分子量。
13.权利要求11的用途，其中所说的连接基团是琥珀酰亚胺基团。
14.权利要求13的用途，其中所说的琥珀酰亚胺基团是琥珀酸琥珀酰亚胺酯、丙酸琥珀酰亚胺酯、羧甲酸琥珀酰亚胺酯、琥珀酰亚胺基琥珀酰胺、N-羟基琥珀酰亚胺或其组合。
15.权利要求10所述的用途，其中所述的肿瘤是肝细胞瘤。
16.权利要求15的用途，其中所说的连接基团是琥珀酰亚胺基团。
17.权利要求16的用途，其中所说的琥珀酰亚胺基团是琥珀酸琥珀酰亚胺酯、丙酸琥珀酰亚胺酯、羧甲酸琥珀酰亚胺酯、琥珀酰亚胺基琥珀酰胺、N-羟基琥珀酰亚胺或其组合。
18.权利要求10的用途，其中所说的肿瘤是肉瘤。
19.权利要求10的用途，其中所述的药物为用于治疗或抑制患者的肿瘤转移的药物。
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