KR101031206B1 - 말레암산 중합체 유도체 및 이의 바이오컨쥬게이트 - Google Patents

말레암산 중합체 유도체 및 이의 바이오컨쥬게이트 Download PDF

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Abstract

본 발명의 수용성 중합체의 말레암산 유도체, 화학적으로 안정한 수용성 중합체 숙신암산-활성제 컨쥬게이트, 및 상기 중합체 반응물 및 이의 컨쥬게이트의 재생산적인 제조, 특성화 및 사용에 관한 것이다.

Description

말레암산 중합체 유도체 및 이의 바이오컨쥬게이트{MALEAMIC ACID POLYMER DERIVATIVES AND THEIR BIOCONJUGATES}
[본 발명의 분야]
본 발명은 일반적으로 고분자화학 분야, 및 더욱 특히 말레이미드- 또는 말레암산 기능화 수용성 중합체 예컨대, 폴리에틸렌 글리콜로부터 제조된 화학적 안정한 활성제(active agent) 컨쥬게이트 및, 상기 중합체 반응물 및 컨쥬게이트를 합성, 특성화, 및 사용 방법에 관한 것이다.
[본 발명의 배경지식]
최근 바이오기술의 진보로 인해, 치료상의 단백질 및 기타 생체분자, 예를 들어, 항체 및 항체 단편은 현재 상기 생체분자를 더욱 넓게 사용할 수 있게 대규모로 제조할 수 있다. 공교롭게도, 치료상 가능한 생체분자의 임상 유용성은 종종 이의 빠른 단백질 분해, 저생체이용율, 제조, 저장 또는 투여상 불안정성 및 이의 면역원성에 의해 방해된다. 치료상 사용을 위한 단백질 및 기타 생체분자 투여에 대한 지속적인 관심 때문에, 상기 결점을 극복하기 위한 다양한 접근법이 연구되고 있다.
많이 연구된 하나의 접근법으로는 단백질 및 폴리에틸렌 글리콜 또는 "PEG"과 같은 수용성 중합체에 공유 결합된 기타 치료 가능한 분자의 개질이다 [Abuchowski, A., 등, J. Biol. Chem. 252 (11), 3579 (1977); Davis, S.,등., Clin. Exp Immunol., 46,649-652 (1981)]. PEG 컨쥬게이트 또는 페길화 단백질로 언급되는 PEG-개질된 단백질의 생물학적 특성이, 많은 경우에, 이의 비페길화 대조물의 것이상으로 상당히 향상되는 것을 보여주고 있다[헤르만(Herman),등 Macromol. Chem. Phys., 195, 203-209 (1994)]. 폴리에틸렌 글리콜-개질된 단백질은 단백질분해에 대한 증가된 내성 때문에, 신체내의 더 긴 순환 시간을 가지는 것과 또한 증가된 내열성을 가지는 것을 보여주고 있다[Abuchowski, A., 등, J.Biol. Chem., 252, 3582-3586 (1977)]. 생체효능의 유사한 증가는 기타 생체 분자, 예를 들어, 항체 및 항체 단편에 의해 관찰된다[Chapman, A., Adv. Drug Del. Rev. 54,531-545 (2002)].
전형적으로, 폴리에틸렌 글리콜의 약 또는 기타 표면에 부착은 활성 PEG 유도체 즉, 생체분자의 친핵 중심과 반응하기에 적합한 하나이상의 활성된 말단(예를 들어, 리신, 시스테인 및 단백질의 유사한 잔기)을 가진 PEG를 이용하여 수행된다. 가장 일반적인 사용되는 것은 단백질 아미노기, 예컨대, 단백질의 리신 측쇄내에 존재하는 것과 활성된 PEG의 반응에 기초한 방법이다. 단백질의 아미노기와 반응에 적합한 활성화된 말단을 가진 폴리에틸렌 글리콜은 PEG-알데하이드[Harris, J. M., Herati, R. S., Polym Prepr. (Am. Chem. Soc., Div. Polym. Chem), 32 (1), 154-155 (1991)], 혼합된 무수물, N-히드록시숙신이미드 에스테르, 카포닐이미다졸리드, 및 클로로시아누레이트를 포함한다[Herman, S., 등., Macromol. Chem. Phys. 195, 203-209 (1994)].
비록 많은 단백질이 PEG 개질동안 활성이 유지되는 것이 보여지지만, 일부 경우에, 단백질 아미노기를 통해 부착된 중합체는, 예컨대, 특이 리신 잔기의 유도체화반응이 단백질을 비활성화 하는 경우와 같이, 바람직하지 않을 수 있다[Suzuki, T., 등, Biochimica et Biophysica Acta 788,248-255 (1984)]. 더군다나, 대부분의 단백질이 몇개의 사용가능한/이용할 수 있는 아미노기를 가지고 있기 때문에, 상기 형성된 중합체 컨쥬게이트는 전형적으로 모노-페길화, 디-페길화, 트리-페길화 종 등의 혼합물이고, 이것을 특성화하고 분리하는 것은 어렵고 또한 시간-소비일 수 있다.
추가로, 상기 혼합물은 종종 재생산 제조되지 않고, 이것은 규정된 승인 및 다음에 상업화를 위한 대규모 생산시에 문제점이 발생될 수 있다. 상기 문제점을 피하는 한가지 방법은 아민이외 작용기를 목표로 하는 위치-선택성 중합체 반응물을 사용하는 것이다. 하나의 특히 흥미로운 목적은 아미노산에 존재하는 단백질 내 티올기, 시스테인이다.
시스테인은 전통적으로 단백질 내에 리신보다 적은 양으로 존재하여, 상기 티올-함유 아미노산에 컨쥬게이션시에 단백질의 유도화반응의 가능성을 감소한다.
더욱이, 시스테인 위치에 컨쥬게이션은 종종 단일 종 중합체-컨쥬게이트의 형성이 되는 잘 알려진 방법으로 수행될 수 있다.
티올-선택 반응성 말단 기를 가진 폴리에틸렌 글리콜 유도체는 가장 잘 쓰이는 것으로 말레이미드로, 말레이미드, 비닐 설폰, 아이도아세트아미드, 티올, 및 디설피드를 포함한다. 상기 유도체는 모두 단백질 시스테인 측쇄에 커플링하기 위해 사용된다[Zalipsky, S. Bioconjug. Chem. 6,150-165 (1995); Greenwald, R. B. 등 Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 17,101-161 (2000); Herman, S., 등, Macromol. Chem. Phys. 195,203-209 (1994)]. 그러나, 다수의 상기 반응물들은 이의 합성과 정제에 어려움 때문에 넓게 이용되고 있지 않다.
말단 말레이미드 기를 가진 폴리에틸렌 글리콜 유도체는 설프히드릴-선택 반응물의 가장 잘 쓰이는 유형중에 하나이고, 수많은 원(source)로부터 상용된다. 비록 넓게 평가되고 인식되지는 않지만, 본 출원인은 많은 PEG-말레이미드가 공교롭게도 약물 후보물질에 컨쥬게이션 및/또는 저장시 가수분해적으로 불안정성을 보이는 것을 인식하였다. 더욱 특히, 컨쥬게이션 전후 모두 상기 말레이미드 고리의 상당한 가수분해 정도가 관찰되었다. 상기 불안정성은 약-컨쥬게이트 조성물 내에 약 컨쥬게이트의 다종의 형성을 일으킬 수 있다. 상기 다양한 약 컨쥬게이트 종은 유사한 생물학적 활성을 가지는 것 같지만 이의 약물 동력학적 특성은 다를 수 있다. 이것은 특히 생성 약 조성물이 특히 안전성 및 축척 수준이 알려지지 않은 약 컨쥬게이트 종의 불명확한 혼합물일 수 있기 때문에, 환자 투여용 조성물로 단점이 있다. 더욱이, 가수분해 속도에 영향을 주는 상이한 요소 때문에, 약 컨쥬게이트 배치 조성물 사이에 불일치는 추가 문제점으로 나타날 수 있다.
본 출원인에 의해 발견된 또 다른 가능한 문제점은 PEG 말레이미드로부터 제조된 컨쥬게이트의 탈-페길화가 변화된 약 및 이탈된 PEG 불순물의 혼합물을 생산하는 것이다. 상기 이유로, 본 출원인은 PEG 말레이미드가 목적 약 또는 기타 활성제상의 티올 기와 커플링하는데 바람직하지 않은 반응물일 수 있다는 것을 발 견하엿다. 상기 문제를 제기하기 위한 이전의 시도는 다소 가수분해 경향(즉, 고리-열림)에 의해 중합체 말레이미드의 안정성의 증가에 맞춰졌었다(예를 들어, 미국특허 출원 공보 No. US 2003/0065134를 참조).
그리하여, 본 출원인은, 바람직하게 위치-선택적 방향내에, 현재 사용가능한 티올-선택성 중합체 반응물의 단점을 극복하고 저장 및 커플링시에 안정한 생물학적 활성 분자에 커플링용으로 유용한 신규 활성 PEG의 발명을 위한 기술분야내에 지속적은 요구를 인식하였다.
본 발명은 상기 요구를 만족시켰다.
[본 발명의 요약]
본 발명은 (i) 저장 및 커플링시 안정한, (ii) 가수분해에 내성이 있고,(iii) 탈-페길화에 증가된 내성을 보이는 티올-선택성 중합체 반응물 및 이의 컨쥬게이트를 제공하고, 화학적으로 상당히 안정하고 명료한 약 컨쥬게이트 조성물의 형성은 하기에 자세하게 기재하였다.
본 발명은 통상적인 중합체 말레이미드 반응물에 다른 용도의 필요성의 출원인의 인식에 근거하였다. 상기 필요성에 대한 반응으로, 본 출원인은 현재까지 사용된 기타 접근법에 완전히 대조적인 접근법을 고안하였다. 즉, 다시말해, 말레이미드 고리의 가수분해를 방지하기 위한 통례적인 접근 및 시도보다, 본 출원인은 대신에 말레이미드 고리를 강제로 열어 "말레이미드"가 그것의 안정한 숙신암산 열린-고리 형태로 전환되는 중합체 반응물 및 컨쥬게이트를 제공한다.
더욱 특히, 하나의 측면에서, 본 발명에서 제공된 것은 수용성 중합체의 말 레이미드 기가 통상적으로 활성제에 커플링되기 전후 모두 강제적(고의로)으로 고리-열린 말레이미드산 형태로 전환되는 방법이다. 상기 방법으로, 하기를 갖는 말레암산 또는 숙신암산 중합체 조성물이 제공된다: (i) 명확한 구성성분, 및 (ii) 특히 이의 말레이미드-유도된, 숙신이미드 대조물에 비교하여, 가수분해에 대한 감소된 경향성.
더욱 특히, 한 측면에서, 본 발명은 중합체 컨쥬게이트 제조 방법을 제공한다. 상기 방법은 하기 단계를 포함한다: (a) 말레이미드 기를 함유하는 수용성 중합체 제공 단계, 및 (b) 수용성 중합체에 상기 활성제를 커플링하는데 효과적인 조건하에서 친핵체를 가지는 활성제와 상기 중합체가 마이클(Michael)-형 첨가 반응을 통해 중합체-숙신이미드-연결된 활성제 컨쥬게이트를 형성하는 반응. 그런 다음, 단계 (c)에서의 컨쥬게이트를 상기 숙신이미드 고리를 강제적으로 열수 있는 조건하에서 처리하여, 중합체-숙신암산-컨쥬게이트를 형성한다.
하나의 구현에서, 상기 말레이미드 고리는 가수분해 반응으로 강제적으로 열린다. 전형적으로, 상기 고리-열림 가수분해는 용액내에서 또는 고체 지지체상 있을 수 있는 염기의 존재하에 수행된다. 상기 가수분해를 수행하기 위한 전형적인 pH는 6 내지 12 범위 내에 있다.
또 다른 구현에서, 상기 가수분해는 화학적으로 안정한 중합체-숙신암산-컨쥬게이트 조성물을 제공하는 데 효과적인 조건하에서 수행된다.
상기 방법의 하나의 구현에서, 닫힌 고리-형의 전환을 기초로 상기 가수분해 반응은 최소한 상기 중합체 숙신암산 컨쥬게이트의 약 15% 이상이 형성될 때까지 수행된다. 다른 방법의 구현에서, 상기 가수분해 반응은 최소한 약 35%, 또는 50%, 또는 80%, 또는 95%, 또는 98% 이상 또는 본질적으로 100% 중합체 숙신암산 컨쥬게이트가 형성될 때까지, 즉, 상기 중합체 말레이미드 컨쥬게이트는 본질적으로 완전히 고리가 열릴 때까지 수행된다.
본 발명에 사용하기 위한 수용성 중합체는 폴리(알킬렌 옥시드), 폴리(비닐 피롤리돈), 폴리(비닐 알코올), 폴리옥사졸린, 폴리(아크릴로일모르폴린), 및 폴리 (옥시에틸화 폴리올)이다. 바람직한 수용성 중합체는 폴리에틸렌 글리콜이다.
또 다른 측면에서, 본 발명에서 제공된 것은 상기 기재된 방법에 의해 제조된 중합체 숙신암산 컨쥬게이트 조성물이다.
또 다른 측면에서, 본 발명에서 제공된 것은 하기를 포함하는 조성물이다:
Figure 112005035600115-pct00001
및/또는
Figure 112005035600115-pct00002
[식중, POLY는 수용성 중합체 단편이고, L은 임의 링커 (linker) 이고, 및 "Nu-활성제" 는 친핵체,"Nu"를 함유하는 활성제를 나타낸다. 바람직한 친핵체는 티올, 티올레이트, 및 아미노이다].
또 다른 측면에서, 본 발명은 수용성 중합체로 유도된 단백질은 제공하고, 여기서 상기 중합체는 시스테인 설피히드릴 기 또는 리신 아미노 기 모두에 공유결합하고 있는 숙신이미드 기를 통해 단백질에 커플되고 상기 숙시이미드 기의 대부분 모두 고리-열린 형태로 존재한다.
본 발명의 상기 및 다른 목적 및 특성은 하기 도면 및 상세한 명세서와 함께 나타내어 완전히 명백해 질 것이다.
[도면의 간단한 설명]
도. 1 은 대표적인 활성제(이 경우, 단백질)의 티올기와 중합체 말레이미드 및 중합체 말레암산 둘 모두의 반응으로 본 발명의 중합체-숙신암산 컨쥬게이트를 형성하는 대표적인 반응을 설명한다.
도. 2 는 대표적인 활성제(이 경우, 단백질)의 아미노기와 중합체 말레이미드 및 중합체 말레암산 둘 모두의 반응으로 본 발명의 중합체-숙신암산 컨쥬게이트를 형성하는 대표적인 반응을 설명한다.
도. 3 는 실시예 2에 상세하게 기재된 바와 같이 시간에 대한 대표적인 분지된 중합체 연결된 말레이미드의 농도의 대수 플롯이다.
[본 발명의 상세한 설명]
본 발명을 상세히 기재하기 전에, 본 발명은 특정 중합체, 합성 기술, 활성 제 등에 제한되지 않으며 매우 다양할 수 있다는 것을 이해해야 한다. 또한 본 발명에서 사용된 용어는 특정 구현예를 기재하기 위한 것이며 제한하기 위한 것이 아님을 이해해야 한다.
본 발명의 명세서 및 청구범위에서, 하기 용어는 하기 기재된 정의와 일치하여 사용될 것이다.
정의
하기 사용된 용어는 지시된 의미를 갖는다.
본 명세서 및 첨부된 특허청구범위에서 사용되는 바와 같이, 단수 형태 "a", "an", 및 "the"는, 그 내용이 확실하게 다른 것을 지시하기 전까지 복수 지시물을 포함한다.
본 발명에서 사용된 "PEG" 또는 "폴리(에틸렌 글리콜)"은 임의 수용성 폴리 (에틸렌 옥시드)을 의미한다. 전형적으로, 본 발명에서 사용된 PEG는 말단 산소(들)이 대체될지 안될지에 따라서 예를 들어, 합성 개질 동안, 하기 구조를 둘 중 하나는 포함할 것이다: "-(CH2CH20)n-" 또는 "- (CH2CH20)n-CH2CH2-". 3 내지 3000의 범위의 변수(n), 및 말단 기 및 전체 PEG의 구조는 다양할 수 있다. PEG가 추가로 링커 잔기(하기에 상세하게 기재됨)을 포함할 때, PEG 단편에 공유결합되는 경우, 링커를 포함하는 원자는 (i) 산소-산소 결합(-O-O-, 퍼옥시드 연결), 또는 (ii) 질소-산소 결합(N-O, O-N)를 형성하지 않는다. "PEG"는 즉 -CH2CH20-인 서브유닛(subunit)의 50% 초과의 대다수를 포함하는 중합체를 의미한다. 본 발명에서 사용하기 위한 PEG는 다양한 분자량, 분자 구조 또는 입체 형상(예를 들어, 분지형, 선형, 포크형(forked) PEG, 덴드리머성(dendritic) 등)을 갖는 PEG 를 포함하고, 하기에 자세하게 설명된다.
알파-, 오메가-디히드록시폴리 (에틸렌 글리콜)로서 알려진 "PEG 디올"는 또한 PEG가 상기와 같이 정의되듯이, HO-PEG-OH와 같은 간단한 형태로 나타낼 수있다.
본 발명의 중합체에 관계에서 "수용성(수용성)" 또는 "수용성 중합체 단편"은 실온에서 물에 용해되는 임의 단편 또는 중합체이다. 전형적으로, 수용성 중합체 또는 단편은 여과후 동일한 용액에 의해 투과되는 빛의 약 75%이상, 더 바람직하게 약 95% 이상이 통과될 것이다. 중량에 대해, 수용성 중합체 또는 단편은 적어도 약 35%(중량), 더욱 바람직하게 적어도 50%(중량), 더더욱 바람직하게 적어도 약 70%(중량), 더더욱 바람직하게 85%(중량)이 물에 용해되는 것이 바람직하다. 그러나 가장 바람직하게는, 수용성 중합체 또는 단편이 약 95%(중량)이 물에 용해되거나 완전히 용해된다.
"말단-캡핑하는(end-capping)" 또는 "말단-캡핑된(end-capped)" 기는 PEG와 같은 중합체의 말단에 존재하는 비활성 또는 비반응 기이다. 말단-캡핑 기는 전형적인 합성 반응 조건하에서 쉽게 화학적 변형을 일으키지 않는 것이다. 말단 캡핑 기는 일반적으로 알콕시 기, -OR(식중, R은 탄소수 1 내지 20으로 구성된 유기 라디칼)이고 바람직하게 저급 알킬(예를 들어, 메틸, 에틸) 또는 벤질기이다. "R"은 포화 또는 불포화이고, 아릴, 헤테로아릴, 시클로, 헤테로시클로 및 상기 임의의 치환 형태를 포함한다. 예를 들어, 말단 캡팅된 PEG는 전형적으로 "RO-(CH2CH20)n-"(식중, R은 상기에 정의된 바와 같다) 구조를 포함할 것이다. 다른 방법으로, 상기 말단-캡핑 기는 또한 유리하게 검출할 수 있는 표지(label)을 포함한다. 상기 중합체가 검출할 수 있는 표지를 포함하는 말단-캡핑 기를 가질 때, 상기 중합체 및/또는 중합체에 커플된 잔기(예를 들어, 활성제)의 양 또는 위치는 적합한 검출기를 이용하여 측정할 수 있다. 상기 표지는 제한없이, 형광물질(fluorescers), 화학발광제(chemiluminescers), 효소 표지화에 사용된 잔기, 비색 (예, 염료), 금속 이온, 방사성 잔기 등을 포함한다. 상기 말단-캡핑기는 또한 유리하게 포스포리피드를 포함할 수 있다. 중합체가 말단-캡핑 기 예컨대, 포스포리피드를 가질때, 특이성(예컨대, 유사한 말단-캡핑된 중합체로 구성된 구조를 형성할 수 있는 특성)이 중합체에 첨가된다. 대표적인 예로 포스포리피드는, 제한없이, 포스파티딜콜린으로 불리는 포스포리피드과로부터 선택된 것을 포함한다. 특이적 포스포리피드는, 제한없이, 디라우로일포스파티딜콜린, 디올레일포스파티딜콜린, 디팔미토일포스파티딜콜린, 디스테로일포스파티딜콜린, 베헤노일포스파티딜콜린, 아라키도일포스파티딜콜린, 및 레시틴로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 포함한다.
본 발명의 중합체에 대해 "비 자연적 발생(Non-naturally occurring)" 는 완전한 중합체가 자연상에서 발견되지 않는 것을 의미한다. 그러나 모든 중합체 구조가 자연상에서 발견되지 못한 본 발명의 비-자연 발생 중합체는 하나이상의 자연 발생적인 서브유닛 또는 서브유닛의 단편을 함유할 수 있다
본 발명의 수용성 중합체의 관계에서 "분자량"은 중합체의 명목 평균 분자량으로 언급하고, 전형적으로 크기 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography), 광 산란 기술, 또는 1,2,4-트리클로로벤젠에서의 고유 속도 결정에 의해 결정된다. 본 발명의 중합체는 전형적으로 다분산성(polydisperse)이고, 1.20 미만의 저 다분산도 값을 갖는다.
용어 "반응성" 또는 "활성화된"은 유기 합성의 통상적인 조건하에서 빠르거나 실제 속도로 반응하는 작용기를 말한다.
이는 반응하기 위해서 강한 촉매 또는 매우 비실용적인 반응 조건이 요구되거나 반응하지 않은 기(즉, "비반응성" 또는 "비활성" 기)와는 대조적이다.
반응 혼합물에서 분자상에 존재하는 작용기를 참고로 "쉽지 않은 반응(Not readily reactive)" 또는 "비활성(inert)"은 반응 혼합물에서 요구되는 반응을 제조하는데 효과적인 조건하에서 대부분 손상되지 않은 기를 말한다.
"보호기(protecting group)"는 임의 반응 조건하에서 분자내에 특정 화학 반응성 작용기의 반응을 예방하거나 차단하는 잔기이다.
상기 보호기는 분자내에 추가 반응성 또는 보호기의 존재 및 사용된 반응 조건 뿐만 아니라 보호된 화학 반응성 기의 유형에 따라 다양할 수 있다.
보호될 수 있는 작용기는, 예로서, 카르복실산기, 아미노기, 히드록시기, 티올기, 카르보닐기 등을 포함한다. 카르복실산용 대표적인 보호기는 에스테르(예컨대, p-메톡시벤질 에스테르), 아미드 및 히드라자이드; 아미노기용, 카르바메이트(예컨대, tert-부톡시카르보닐) 및 아미드; 히드록시 기용 에테르 및 에스테르 ; 티올 기용, 티오에테르 및 티오에스테르; 카르보닐기용, 아세탈 및 케탈;등을 포함한다. 상기 보호기는 종래 기술의 당업자에 잘 공지되어있고 [예를 들어, T. W. Greene 및 G. M. Wuts, Protecting Groups in Organic Synthesis, Third Edition, Wiley, New York, 1999, 및 여기에 인용된 참고문헌]에 기재되어있다
"보호된 형태"내의 작용기는 보호기를 가지는 작용기를 말한다. 여기서 사용된 바와 같이, 용어 "작용기" 또는 이의 임의 동의어는 이의 보호된 형태를 포함하는 것을 의미한다.
본 발명에서 사용된 용어 "링커"는 서로 연결하는 잔기를 연결하기 위해 임의 사용된 원자의 수합 또는 원자, 예컨대, 중합체 단편 및 말레이미드를 말한다. 본 발명의 링커는 일반적으로 가수분해적으로 안정하다.
"생리학적으로 분해가능한" 또는 "가수분해 가능한" 또는 "분해가능한" 결합은 생리학적 조건하에서 물과 반응하는(즉, 가수분해되는) 비교적 약한 결합이다. 결합이 물속에서 가수분해되는 결합의 경향성은 두개의 중심 원자를 연결시키는 연결의 일반적인 유형 뿐만 아니라 이러한 중심 원자에 부착되는 치환기에 따라 달라질 것이다. 적절한 가수분해적으로 불안하거나 약한 연결로는, 카르복실레이트 에스테르, 포스페이트 에스테르, 무수물, 아세탈, 케탈, 아실옥시알킬 에테르, 이민, 오르토 에스테르, 펩티드 및 올리고뉴클레오티드, 티오에스테르, 티올에스테르, 및 카르보네이트를 포함되지만, 이에 제한되지 않는다.
"효소적으로 분해가능한 연결(enzymatically degradable linkage)"은 하나이상의 효소에 의해 분해되는 연결을 의미한다.
본 발명의 목적용, 및 특히 본 발명의 중합체에 참고문헌 내에 "가수분해적으로 안정한(hydrolytically stable)" 연결 또는 링커는 정상적인 생리학적 조건하에서 가수분해적으로 안정한 원자의 수합 또는 원자를 말한다. 다시 말해, 가수분해적으로 안정한 연결은 연장된 시간에 걸쳐 임의의 뚜렷한 정도로 가수분해를 겪지 않는 화학 결합, 일반적으로는 공유 결합을 말한다.
가수분해적으로 안정한 연결의 예로는 제한적이지 않지만, 하기를 포함한다: 탄소-탄소 결합(예를 들어, 지방족 사슬내), 에테르, 아미드, 우레탄, 아민 등. 대표적인 화학 결합의 가수분해 속도는 대부분의 표준 화학교과서에서 찾아볼 수 있다.
중합체의 전체 구조 또는 기하학에 대한 참고문헌내에 "분지형" 은 2개 이상의 중합체 "아암(arm)" 을 갖는 중합체를 말한다. 분지형 중합체는 2 중합체 아암, 3 중합체 아암, 4 중합체 아암, 6 중합체 아암, 8 중합체 아암 또는 그 이상을 가질수 있다. 고도의 분지형 중합체는 덴드리머성 중합체 또는 덴드리머(dendrimer)이고, 본 발명의 목적을 위한 것은 분지형 중합체의 것과 구별되는 구조를 갖는 것으로 여겨진다.
"분지점(Branch point)"은 하나이상의 추가 중합체 아암으로 선형 구조로부터 중합체 분지 또는 갈라지는 지점에 하나 이상의 원자를 포함하는 분기점을 말한다.
"덴드리머"는 모든 결합이 중심 초점 또는 규칙적인 분지 패턴 및 각각 분지점을 제공하는 반복 단위를 갖는 코어로부터 방사상으로 방출되는 구형의, 크기 일분산성(size monodisperse) 중합체이다. 덴드리머는 다른 유형의 중합체로부터 이를 특이하게 하는, 핵 캡슐화와 같은 특정 덴드리머성 상태 특성을 나타낸다.
"실제로 (Substantially)" 또는 "본질적인 (essentially)"은 거의 전체 또는 완전한, 예를 들어, 일부 주어진 양의 95% 이상을 의미한다.
"알킬" 또는 "알킬렌" 기는 수소 이외 원자에 상기 기가 연결된 지점의 수와 분자내에 이 위치에 따라서, 전형적으로 1 내지 20 원자 길이의 범위인 탄화수소 사슬 또는 잔기를 말한다. 상기 탄화수소 사슬은 반드시 그렇지는 않지만 바람직하게는 포화되고, 분지쇄 또는 직쇄일 수 있지만, 일반적으로는 직쇄가 바람직하다. 대표적인 알킬기는 메틸, 에틸, 프로필, 부틸, 펜틸,1-메틸부틸, 1-에틸프로필, 3-메틸펜틸 등을 포함한다.
"저급 알킬" 또는 "저급 알킬렌"은 탄소수 1 내지 6 을 함유하는 상기에서 정의된 것과 같이 알킬 또는 알킬렌기를 말하고, 메틸, 에틸, n-부틸, i-부틸, t-부틸로 예시된 바와 같은 직쇄 또는 분지쇄일 수 있다.
수소 이외 원자에 연결된 지점의 수 및 분자내의 이의 위치에 따라서, "시클로알킬" 또는 "시클로알킬렌"은 폴리시클릭 예컨대, 가교, 혼합, 또는 스피로(spiro) 시클릭 화합물, 바람직하게 3 내지 약 12 , 더욱 바람직하게 3 내지 8 탄소 원자로 이루어진 화합물을 포함하는 포화 또는 불포화 시클릭 탄화수소 사슬을 말한다.
"저급 시클로알킬" 또는 "저급 시클로알킬렌"은 1 내지 6 탄소원자를 포함하는 시클로알킬 기를 말한다.
"알리시클릭"은 탄소 원자 고리를 함유하는 임의 지방족 화합물을 말한다.
알리시클릭 기는 하나 이상의 알킬 또는 알킬렌으로 치환된 상기 정의된 "시클로알킬" 또는 "시클로알킬렌" 기를 함유하는 것이다.
"비-간섭 치환기(Non-interfering substituents)"는 분자내에 존재하는 경우, 일반적으로 분자 내에 함유된 다른 작용기와 비-반응성 기이다.
예를 들어, "치환 알킬"에서와 같은 용어 "치환"은 하나 이상의 비간섭 치환기, 예컨대, 이에 제한되지는 않으나 C3-C8 시클로알킬, 예컨대, 시클로프로필, 시클로부틸 등; 할로, 예컨대, 플루오로, 클로로, 브로모, 및 요오도; 시아노; 알콕시, 저급 페닐; 치환 페닐 등으로 치환된 잔기 (예. 알킬기) 를 말한다.
페닐 고리상의 치환을 위해, 상기 치환체는 임의 배향(즉, 오르토, 메타, 또는 파라)로 존재할 수 있다.
"알콕시"는 -O-R (R은 알킬 또는 치환 알킬, 바람직하게 Cl-C20 알킬 (예를 들어, 메틸, 에틸, 프로필, 벤질 등), 바람직하게 Cl-C7이다)기이다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, "알케닐"은 하나 이상의 이중 결합을 함유하는, 길이가 1 내지 15 원자 범위인 분지형 또는 비분지형 탄화수소기, 예컨대 에테닐, n-프로페닐, 이소프로페닐, n-부테닐, 이소부테닐, 옥테닐, 데세닐, 테트라데세닐 등에 관한 것이다.
본 발명에서 사용된 바와 같은 용어 "알키닐"은 하나 이상의 삼중 결합을 포함하는 길이가 2 내지 15 원자 범위인 분지형 또는 비분지형 탄화수소기, 에티닐, n-프로피닐, 이소프로피닐, 이소프로피닐, n-부티닐, 이소부티닐, 옥티닐, 데세닐, 등에 관한 것이다.
"아릴" 은 각각 5 또는 6 코어 탄소 원자를 갖는 하나 이상의 방향족 고리를 의미한다. 아릴은 나프틸에서와 같은 융합될 수 있거나 비페닐과 같은 비융합될 수 있는 다중 아릴 고리를 포함한다.
아릴 고리는 또한 하나 이상의 시클릭 탄화수소, 헤테로아릴, 또는 헤테로시클릭 고리와 융합되거나 비융합될 수 있다.
"헤테로아릴"은 1 내지 4 헤테로원자를 바람직하게 N, O, 또는 S, 또는 이의 조합물을 함유하는 아릴기이다. 헤테로아릴 고리는 또한 하나이상의 시클릭 탄화수소,헤테로시클릭, 아릴 또는 헤테로아릴 고리와 융합될 수 있다.
"헤테로사이클" 또는 "헤테로시클릭"은 불포화 또는 방향족 특성이 있거나 없거나 탄소가 아닌 하나 이상의 고리 원자를 갖는 5-12 원자, 바람직하게 5-7 원자의 하나 이상의 고리를 의미한다. 바람직한 헤테로 원자에는 황, 산소, 및 질소가 포함된다.
"치환 헤테로아릴"은 치환체로서 하나 이상의 비간섭기를 갖는 헤테로아릴이다.
"치환 헤테로사이클" 은 비간섭 치환기로부터 형성된 하나 이상의 측쇄를 갖는 헤테로사이클이다.
"친전자체" 는, 이온성일 수 있고, 친전자 중심, 즉 전자 추적 (electron seeking) 성이고 친핵체와 반응할 수 있는 중심을 갖는 이온 또는 원자 또는 원자 집단에 관한 것이다.
"친핵체" 는, 이온성일 수 있고, 친핵 중심, 즉 친전자 중심을 추적하거나 친전자체와 반응할 수 있는 중심을 갖는 이온 또는 원자 또는 원자 집단에 관한 것이다.
본 발명에서 사용된 용어 "활성제" 는 임의의 제제, 약물, 화합물, 생체내 또는 생체외에서 입증될 수 있는 어떠한 약리학적 (종종, 이로운) 효과를 제공하는 물질 또는 혼합물의 조성물을 포함하는 것으로 정의된다. 이는 식품, 식품보조제, 영양제, 영양기능식품, 약물, 백신, 항체, 비타민, 및 다른 이로운 제제 등을 포함한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 이러한 용어는 또한 환자에서 국소적 또는 전신적 효과를 생성하는 임의의 생리학적 또는 약리학적 활성 물질을 추가로 포함한다.
"약제학적으로 허용가능한 부형제" 또는 "약제학적으로 허용가능한 담체" 는 본 발명의 조성물에 포함될 수 있고 환자에 실질적인 독성학적 부작용을 야기하지 않는 부형제를 말한다.
"약리학적 유효량", "생리학적 유효량", 및 "치료적 유효량" 은 본원에서 교환가능하게 혈류 또는 표적 조직 내에서 목적한 수준의 활성제 및/또는 컨쥬게이트를 제공하는 데 필요한 약학 제제에 존재하는 PEG-활성제 컨쥬게이트의 양을 의미하는 데 사용된다. 정확한 양은 다수의 인자, 예컨대 특정 활성제, 약학 제제의 성분 및 물리적 특성, 의도된 환자 집단, 환자 고려사항 등에 따라 달라질 것이며, 본원에 제공되고 관련 문헌에서 입수가능한 정보에 기초하여 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 중합체의 관계에서 "다관능성" 은 그 안에 함유된 3 개 이상의 관 응기를 갖는 중합체를 의미하며, 상기 작용기는 동일하거나 상이할 수 있고 전형적으로, 중합체 말단에 존재한다. 본 발명의 다관능성 중합체는 일반적으로 약 3-100 개의 작용기, 3-50 개의 작용기, 또는 3-25 개의 작용기, 또는 3-15 개의 작용기, 또는 3 내지 10 개의 작용기를 함유할 것이며, 중합체 내에 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 개의 작용기를 포함할 것이다. "이관능성" 중합체는 그 안에, 전형적으로 중합체 말단에 함유된 두개 작용기를 가진 중합체이다. 상기 작용기가 동일할 경우, 중합체는 상동이관능성 (homodifunctional)이라고 한다. 상기 작용기가 상이한 경우, 중합체는 이종이관능성 (heterodifunctional)이라고 한다. 본 발명에 기재된 염기이거나 산성 반응물은 중성, 전하, 및 이의 염의 형태에 상응하는 것을 포함한다.
"폴리올레핀성 알코올"은 중합체 골격에 연결된 다(multiple)-팬던트 히드록시기를 가진 폴리에틸렌과 같은 올레핀 중합체 골격을 포함하는 중합체를 말한다. 대표적인 폴리올레핀성 알코올의 예로는 폴리비닐 알코올이다.
본 발명에서 사용된, "비-펩티드성"은 펩티드 연결이 실제 없는 중합체 골격을 말한다. 그러나, 상기 중합체는 반복 단량체 서브유닛, 예컨대, 예를 들어, 약 50 단량체 유닛당 1 펩티드 연결로 거리를 두는 펩티드 연결의 적은 수가 포함될 수 있다.
용어 "환자" 는 반드시는 아니지만 전형적으로 중합체-활성제 컨쥬게이트 형태인, 본 발명의 중합체 투여로 예방 또는 치료될 수 있는 상태를 겪거나 겪기 쉬운 생명체를 나타내며, 인간 및 동물이 모두 포함된다.
"임의" 또는 "임의로" 는 이후 기재되는 상황이 일어날 수도 일어나지 않을 수도 있음을 의미하여, 상기 기재에는 그 상황이 일어나는 상황 및 일어나지 않는 상황이 포함된다.
"잔기"는 하나 이상의 분자와 반응 후에 남겨진 분자의 부분을 의미한다. 예를 들어, 본 발명의 중합체 컨쥬게이트 내 생물학적 활성 분자 잔기는 중합체 반응물상에 반응성 기와 생물학적 활성 분자상 반응성 기의 반응의 결과의 공유 결합을 제외하고 생물학적 활성 분자의 부분에 상응한다.
용어 "컨쥬게이트"는 반응성 중합체 분자, 바람직하게 반응성 폴리(에틸렌 글리콜)에 대한 분자, 예를 들어, 생물학적 활성 분자 또는 임의 반응성 표면의 공유 결합의 결과로서 형성된 실체를 말한다.
용어 "전자 끌기 기"는 메조머릭 메카니즘(즉, π 결합을 통한 국소 전자 밀도를 첨가하거나 제거) 또는 유도성 메카니즘(즉, 전자음성도 잔기가 σ 결합을 통한 전자 밀도를 공여하여 결합에 극성을 띰) 을 통해 분자의 다른 영역으로부터 그 자체로 전자 밀도를 주는 화학적 잔기를 의미한다.
본 발명에 기재된 조성물, 중합체 및 컨쥬게이트의 관계에서 "화학적 안정"은 대기 상태에서 실제 중성 pH(예컨대, 6.8 내지 7.2)에서 완충 용액으로 저장되고 초기 시료 제조시간으로부터 측정될 때, 3달 기간에 걸쳐 이의 중합체 조성물 내에 5% 이하로 되는 (즉 다시 말해 본 중합체, 컨쥬게이트 등은, 적용될 수 있는 임의 중요한 방법으로, 예를 들어 원래 존재했던 이의 구조 및 양이 상이한 화학적 종을 일으키기 위한 탈-페길화 또는 가수분해에 의해 화학적으로 변형되거나 분해되지 않는다) 시료를 말한다.
본 발명의 내용중에, "가수분해 내성"인 중합체 또는 조성물은 대기 상태에서 실제 중성 pH(예컨대, 6.8 내지 7.2)에서 완충 용액으로 저장되고 초기 시료 제조시간으로부터 측정되는 3달 기간에 걸쳐 저장될 때, 5% 이하의 정도로 가수분해를 겪는 것이다.
"2 또는 3-치환 숙신암산"은 치환체의 위치, 예를 들어, 중합체 숙신암산, 여기서 숙신암산의 카르복실산기는 탄소수 1을 나타내고, 탄소 또는 탄소번호 2에 근접한 위치,등 상에 활성제의 부분인 친핵체를 말한다.
[본 발명의 개요]
관례상, 중합체 상에 위치한 말레이미드 기는 생체분자, 특히 하나 이상의 반응성 티올기를 함유하는 생체분자와 같은 활성제에 중합체를 공유결합하거나 컨쥬게이트하는데 사용된다. 상기 티올기는 자연발생적이거나 다른 방법으로는, 생체분자가 개질 또는 개조하여 말레이미드에 커플링하기에 적합한 티올을 함유할 수 있다. 임의 더욱 정확한 반응 조건, 예를 들어, 높은 pH 수준하에서, 생체분자상의 활성 아미노기는 중합체 유도체상의 말레이미드 기에 첨가하여 상응하는 컨쥬게이트를 형성할 수 있다. 일련의 실험을 통해, 본 출원인은 구조에 따라 중합체-말레이미드 유도체가 가수분해되기 쉬워 활성제에의 컨쥬게이션 전 또는 후에 중합체의 고리-열린 말레암산 형태를 형성하는 것을 인식하였다. 가수분해 반응은 중합체 유도체의 전체 구조에 따를 뿐만아니라, pH 의존성이다. 일반적으로, 가수분해의 속도가 pH 가 증가함에 따라 증가한다. 추가로, 생성 조성물의 습기 함량 및 pH에 따라, 중합체 컨쥬게이트의 고리-열린 형의 형성은 또한 건조 중합체 컨쥬게이트 조성물, 예를 들어, 활성제가 비-단백질 약인 것의 저장시에 발생할 수도있다. 고리 열림이 발생한 경우에, 생성 조성물은 실제로 고리-열린 및 고리-닫힌 컨쥬게이트일 수 있다. 일반적으로 상기 가수분해는, 특히 많은 약에서 장시간동안에 안정성 및 일관성이 아주 요구되는 특성일 경우, 상업상 약학적 조성물에 대해 문제점이 될 수 있다.
상기 문제에 대한 노력으로, 본 발명은 특정 말레암산 중합체 유도체, 이의 컨쥬게이트, 및 이를 포함하는 조성물과 함께, 이러한 말레암산-유도 중합체 유도체를 사용하고 제조하는 방법을 제공한다. 본 발명의 중합체는 컨쥬게이션 전 또는 더욱 바람직하게는 후 모두에, 말레이미드 고리의 가수분해를 시키거나 촉진함으로써 말레이미드-기능 중합체와 연관된 문제를 해결하기 위해 제공된다. 상기 방법으로, 고리-열린 중합체 말레암산 구조는 이의 말레이미드 (또는 숙신이미드) 대조물보다 훨씬 안정한 것이 제공된다. 바람직하게, 본 발명의 중합체 말레암산 조성물은 명확하고 대부분 중합체 말레암산 또는 중합체 숙신암산 컨쥬게이트의 변하지 않는 양을 가지고 있고, 본 발명의 상기 조성물은 포유류 실험자에 투여용 약학적 조성물로서 사용하는데 특히 적합한 것이다.
상기 접근법의 개요를 설명하는 두 예시된 반응도는 도 1 및 도 2로 제공된다. 반응도식 I (도 1)은, 생물학적 활성 분자(이 경우, 단백질)의 티올-기와 중합체-말레이미드 (구조 I) 및 중합체 말레암산 (구조 II) 둘의 반응을 예시적으로 설명한다. 도 1 및 2에서의 반응 조건은 대표적인 것으로 제한적이지 않다. 반응도식 II(도 2)는 유사하게 생물학적 활성 분자(이 경우, 단백질)의 아미노기와 중합체- 말레이미드 및 중합체 말레암산 둘의 반응을 예시적으로 설명하고 있다. 각각 도식에서, 컨쥬게이트된 숙신암산 생성물의 이성질체 구조 모두 나타낸다(구조 IV 및 V, 여기서, IV-A 및 V- A 는 티올-컨쥬게이트된 중합체 숙신암산에 상응하고 IV-B 및 V-B 는 아미노-컨쥬게이트된 중합체 숙신암산에 상응한다). 상기 두개 상이한 생성물은 말레이미드 고리의 이중결합의 두개 탄소 C-2 또는 C-3 에 유입되는 친핵체의 첨가로부터 생긴다.
도 1 또는 도 2에서 보면, 중합체 말레암산 II 에 활성제의 컨쥬게이션이 수행될 수 있지만, 상기 반응은 특히 느리다는 것을 알 수 있다. 상기 이유로, 바람직한 숙신암산 컨쥬게이트에 대한 더욱 바람직한 루트는 일반적으로 구조 III에 보여지는 바와 같이 중합체 숙신이미드 컨쥬게이트의 가수분해에 의한 것이다
즉 다시 말해, 상응하는 중합체 말레이미드 유도체와 비교하여, 말레암산 중합체 유도체는 상응하는 컨쥬게이트를 형성하기 위한 친핵제와의 반응성이 다소 낮다. 그리하여, 중합체 말레이미드에 컨쥬게이션 다음에 고리 열림은 일반적으로 중합체 말레이미드의 고리-열림 다음에 컨쥬게이션보다 바람직하지만, 두 접근법 모두 일반적으로 구조 IV 및 V에 보여지듯이, 중합체-숙신암산 컨쥬게이트의 형성을 일으킨다.
말레암산 및 숙신암산 중합체 유도체 및 컨쥬게이트의 형성
중합체 말레이미드
일반적으로, 본 발명의 상기 방법은 중합체 말레이미드로 출발하여 제공된다. 중합체 말레이미드는 Nektar,Huntsville, Alabama와 같은 상업원으로부터 수득될 수 있다. 예를 들어, 중합체 말레이미드 예컨대, mPEG(MAL)2, mPEG2 (MAL)2, mPEG2-MAL, 및 mPEG-MAL은 Nektar로부터 넓은 범위의 분자량으로 상용된다. 상기 중합체 말레이미드에 상응하는 구조는 표제 "Polyethylene Glycol and Derivatives for Biomedical Applications"의 Nektar 카달로그 8면에서 볼 수 있고, 참고문헌으로 혼입되어있다.
다른 방법으로, 본 발명의 중합체 말레이미드는 하기를 포함하는 수많은 합성 경로중 임의 경로에 의해 제조될 수 있다. 하나의 접근법에서, 말레이미드-말단 중합체는 아미노 기와 같은 말레이미드로 전환될 수 있는 작용기 또는 말레이미드 둘다 이의 작용기 중 하나로서 갖는 이관능성 반응물의 작용기와 중합체 단편(즉, 활성된 중합체 단편)에 연결된 작용기를 반응함으로써 제조된다.
이관능성 반응물과 중합체 단편의 반응은 전형적으로 가수분해적으로 안정한 연결을 통해, 중합체 말레이미드 또는 중합체 말레이미드 전구체 모두 제공하는 중합체 단편 반응물의 공유 결합을 초래한다.
예를 들어, 상기 이관능성 반응물은 구조 A-L-B(식중, A는 중합체 단편상의 제 2 작용기와 반응하여 연결을 형성하는 제 1 작용기이고 L은 POLY-L-B(B는 말레이미드로 쉽게 전환되는 작용기(예를 들어, 메톡시카르보닐 말레이미드와 반응하여 말레이미드로 전환될 수 있는 아민) 또는 말레이미드이다)이다)를 가질 수 있다. 상기 접근법에서, A는 활성된 중합체 반응물상에 목적 기와 반응하는데 적합한 수많은 작용기 예컨대, 할로, 히드록시, 활성 에스테르(예컨대, N-숙신이미딜 에스테르), 활성 카르보네이트, 아세탈, 알데히드, 알데히드 수화물, 알케닐, 아크릴레이트, 메타크릴레이트, 아크릴아미드, 활성 술폰, 티올, 카르복실산, 이소시아네이트, 이소티오시아네이트, 말레이미드, 비닐설폰, 디티오피리딘, 비닐피리딘, 아이오도아세트아미드, 및 에폭시드중 임의일 수 있다.
접근법이 출발 재료 또는 중간체로서 중합체 아민, POLY-L0,1-NH2을 사용하는 경우에, 아민은 예를 들어, 말레산 무수물을 이용하여 말레이미드로 변형시킬 수 있다. 바람직하게 , 상기 중합체 아민은 말레이미드 기로 전환하기 전에, 예를 들어 크로마토그래피 또는 임의 다른 적합한 방법으로 정제하여 최종 말레이미드 생성물의 순도를 향상시킨다. 하나의 특정 접근법에서, 중합체 아민은 먼저 말레산 무수물과 반응하여 열린 고리 아미드 카르복실산 중간체를 형성한 다음, 예를 들어, 나트륨 또는 칼륨 아세테이트와 같은 아세트산염 및 아세트산 무수물의 존재하에 상기 중간체를 가열하는 두번째 단계에서 고리가 닫힌다. 바람직하게, 상기 중간체는 약 50℃ 내지 약 140℃의 범위의 온도에서 약 0.2 내지 5시간동안 가열한다.
다른 방법으로, POLY-L0,1-NH2 상의 아미노 기는 N-메톡시카르보닐말레이미드 또는 엑소-7-옥소[2,2,1]비시클로헵탄-2,3-디카르복실산 무수물과 같은 반응물과 반응으로 말레이미드로 변형될 수 있다.
대표적인 중합체 말레암산 및 중합체 숙신암산 컨쥬게이트에 상응하는 구조(하기 섹션에서 제공된)는 상기에 기재된 바와 같은 상응하는 출발 재료 및 중간체에 미칠 수 있다.
활성제에 컨쥬게이션
중합체 말레이미드는 종래 기술에 공지된 적합한 반응 조건을 이용하여 생물학적 활성 분자 또는 활성제에 커플된다. 정확한 조건은 물론 특히 활성제, 말레이미드 기, 상기 중합체 반응물 자체 등에 마이클 형 첨가반응을 겪는 상기 친핵체에 따라서 다양할 수 있다.
적합한 컨쥬게이션 조건은 시간, 온도, pH, 반응물 농도, 용매 등의 중합체 말레이미드와 활성제 사이의 컨쥬게이션에 중요한 영향을 주는 조건이다.
상기 특정 조건은 다른 것 중에서, 활성제, 바람직한 컨주게이션 유형, 반응 혼합물의 기타 재료의 존재등에 따라 달라진다. 임의 특정 경우의 컨쥬게이션에 효과주는데 충분한 조건은 본 명세서, 관련 문서에 대한 참고문헌 및 또는 실험 방법을 통해 당업자에 의해 결정될 수 있다.
대표적인 컨쥬게이션 조건은 pH 약 6 내지 약 10, 및 예를 들어, pH 약 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0, 9.5, 또는 10에서 컨쥬게이션 반응을 수행하는 것을 포함한다. 더욱 특히 중합체 말레이미드는 전형적으로 pH 약 6-9.5 범위, 더욱 바람직하게 pH 약 7-9, 및 더더욱 바람직하게 pH 약 7 내지 8에서 설프히드릴-함유 활성제와 컨쥬게이트된다. 가장 바람직하게, 티올-선택성 컨쥬게이션은 pH 7 근처에서 수행된다.
반응 온도는 생체분자의 반응성에 고도로 의존하고 전형적으로 0℃ 내지 75 ℃, 바람직하게 10 ℃ 내지 45 ℃, 및 더욱 바람직하게 18 ℃ 내지 28 ℃의 범위일 수 있다. 더 높은 온도는 더 민감한 생체분자를 비활성시킬 수 있지만 더 나은 내성의 것을 전환하는데 필요할 수 있다.
컨쥬게이션 반응은 포스페이트 또는 아세테이트 완충액 또는 유사 반응계와 같은 완충액에서 수행될 수 있다.
일반적으로, 중합체 말레이미드의 근소한 몰 초과량이 사용되고, 예를 들어, 1.5 내지 15배 몰초과, 바람직게 2 배 내지 10배 몰 초과량이 사용된다. 상기 전구체 중합체 대 생물학적 활성분자의 몰비율은 1.0: 50, 바람직하게 1.0: 8.0, 및 더욱 바람직하게 1.04:1.5 이다. 중합체 반응물 대 활성제의 대표적인 비는 약 1:1(중합체 반응물:활성제), 1.5:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 8:1, 또는 10:1 이다.
상기 컨쥬게이션 반응은 추가의 컨쥬게이션이 없을 때까지 진행되고, 이것은 일반적으로 시간에 대한 반응의 진행을 모니터링 하여 측정할 수 있다. 상기 반응의 진행은 다양한 시점에서 반응 혼합물로부터 분취량을 빼내면서 모니터할 수 있고 SDS-PAGE 또는 MALDI-TOF 질량 분석 또는 임의 기타 적합한 분석 방법에 의해 반응 혼합물을 분석하면서 모니터할 수 있다. 형성된 컨쥬게이트의 양 또는 남겨진 비컨쥬게트된 중합체의 양에 대해 안정한 수준이 되면, 상기 반응은 완전하다고 추측된다. 다시, 반응시간은 특정 활성제의 반응성의 함수이고 활성제가 온도에 민감하고 반응이 느린 경우 더 길어진다. 상기의 경우, 적당한 반응 온도가 수반되는 길어진 반응 시간이 요구될 수 있다. 전형적인 반응시간은 5분 내지 10일, 바람직하게 30분 내지 48시간, 및 더욱 바람직하게 2 내지 17시간의 범위일 수 있고, 또 소규모 시험에 의해 결정된 바와 같이 구성성분의 반응성에 의존한다. 교반(예를 들어, 섞기, 흔들기 등)는 임의로 커플링 반응을 촉진하는데 사용될 수 있다. 입체적 방해된 설프히드릴 기를 위해, 요구된 반응 시간은 충분히 길어질 수 있다. 더 높은 pH에서 진행된 아미노 기와 반응은 티올기와 반응과 비교해서 상대적으로 느리다. 특히 반응 조건 및 방법론은 활성 분자가 적어도 부분 활성을 유지하는 것이어야 한다.
이렇게 제조된 컨쥬게이트는 추가로 MALDI, 모세관 전기영동, 겔 전기영동, 및/또는 크로마토그래피와 같은 분석 방법을 이용하여 특성할 수 있다. 중합체 말레이미드어에 활성제의 마이클 형 첨가반응의 결과 중합체 컨쥬게이트는 중합체 숙신이미드 컨쥬게이트 또는 컨쥬게이트된 중합체 숙신이미드(예를 들어. 구조 III 참고)로서 본 발명에서 언급된다.
말레이미드 고리 가수분해
본 발명의 중합체 말레이미드 또는 컨쥬게이트된 중합체 숙신이미드를 가지고(각각 구조 I 및 III에 상응하는), 상기 중합체 종은 이의 열린 고리 형으로 가수분해된다. 중합체 말레이미드를 출발물질로 하여, 상응하는 열린-고리 형태는 중합체 말레암산, 구조 II에 상응하는 것으로서 본 발명에서 언급된다. 컨쥬게이트된 중합체 숙신이미드 (III)로부터 유도된 경우에, 상응하는 열린-고리 형태는 구조 IV 또는 구조 V에 상응하는 컨쥬게이트된 중합체 숙신암산으로서 본 발명에서 언급된다. 구조 IV 및 V는 활성제의 친핵체기의 연결부위만 상이한 구조적 이성질체이다. 상기 말레이미드에 마이클 형 첨가반응을 통한 친핵체의 유입이 C1로 나타내는 열린 고리 형태의 최종의 카르복실 탄소에 대해 C2 지점, 또는 C3 지점 둘다 첨가될 수 있다. 일반적으로, 컨쥬게이트된 숙신암산은 중합 체 말레이미드, 바람직하게 활성제에 컨쥬게이트된 중합체 말레이미드를 측정할수 있는 정도로 중합체의 말레이미드 기가 가수분해 하는데 효과적인 조건 하에서 수성 염기에 노출함으로써 제조된다.
바람직하게 상기 가수분해 반응은 바람직한 가수분해 정도거나 고리가 열림을 달성하는 반응 조건에 맞추어 수행된다(물의 양, 온도, 반응물의 상대적 몰비 등)
전형적으로, 상기 가수분해 반응은 이의 닫힌-고리 중합체 대조물에 대해 컨쥬게이트되거나 비컨쥬게이트 모두, 중합체 열린 고리 형의 적어도 약 15% 이상 형성을 수행한다. 이제, 중합체 숙신암산 컨쥬게이트에 대해서 보면, 특히 본 발명의 바람직한 조성물은 이의 비가수분해된 중합체 대조물에 대해 약 35%이상, 바람직하게 40%, 45%, 50%, 55% 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, 또는 본질적으로 100% 컨쥬게이트된 중합체 숙신암산을 함유한다. 예를 들어, 60% 중합체 숙신암산 컨쥬게이트를 함유하는 가수분해된 중합체 조성물은 40% 컨쥬게이트된 중합체 숙신이미드를 함유한다(이의 닫힌 중합체 대조물).
가장 바람직하게, 가수분해는 완전해질 때까지, 즉 다시말해, 컨쥬게이트내에 중합체 말레이미드 또는 숙신이미드 기 모두 이의 고리-열린 형태로 전환되고 상기 생성 조성물이 닫힌 고리 형태의 임의 검출될 수 있는 양이 없을 때까지 수행된다. 역반응, 즉 탈가수분해 반응이 일어나는 경향이 고리-열린 정반응에 사용되는 가수분해 조건하에서 최소화되기 때문에, 완전한 열린 고리 중합체 컨쥬게이트는 가장 바람직하다. 상기에 기재된 바와 같이 부분 고리-열린 조성물에 대해, 완전하게 고리-열린 조성물은 탈페길화 또는 가수분해와 같은 추가 화학적 변형에 대해 가장 안정하다.
특히 가장 바람직한 조성물은 닫힌 고리 형의 약 50 중량% 미만 또는 40 중량% 미만을 함유하는 것이다.
닫힌 고리 형의 30% 미만 또는 더욱 바람직하게 약 15% 미만을 가지는 조성물이 더욱 바람직하다. 닫힌 고리 형의 10 중량% 미만 또는 5 중량%, 또는 심지어 2 중랑% 미만을 함유하는 조성물이 더더욱 바람직하다.
가수분해 효과를 위해 사용된 조건이 되게 하면서, 가수분해는 일반적으로 염기조건하에서 수행된다. 상기 반응 혼합물 또는 상기 용액의 pH 를 중성 pH 로 올리면서, 상기 고리 열림 반응은 본질적으로 강제적으로 달성할 수 있다. 가장 효과적인(즉, 가장 짧은) 반응시간을 달성하기 위해, 상기 활성제의 활성 또는 보존에 악영향을 주지 않는한 가능한 가장 높은 pH, 예를 들어, 약 12 이하에서 가수분해하여 고리 열림을 달성하는 것이 바람직하다.
염기-촉진된 고리 열림은 염기 용액 또는 고체 지지체 재료, 즉, 이온 교환기에 연결된 염기를 이용하여 수행될 수 있다.
바람직한 염기는 요구하지 않은 부반응을 초래하지 않는 알맞은 속도의 고리 열림을 위한 적당한 pH 를 제공하는 것이다.
대표적인 염기로는 알칼리 금속 예컨대, 나트륨 또는 칼륨 금속; 수산화 알칼리 금속 예컨대, 수산화 리튬, 수산화 나트륨, 수산화 칼륨 등, 및 4차 수산화 암모늄 예컨대 수산화 테트라암모늄, 수산화 테트라부틸암모늄, 및 수산화 벤킬트리메틸암모늄을 포함한다.
전형적으로 상기 가수분해는 pH 약 6 내지 약 12 범위에서 수행된다. 즉 다시말해, 상기 가수분해는 하기로부터 선택된 pH에서 수행된다: 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0, 9.5, 10.0, 10.5, 11.0, 11.5, 또는 심지어 12.0. 바람직한 pH 범위는 약 7.5 내지 11이다.
상기 가수분해 반응은 임의로 완충액을 포함한다. 대포적이 완충액은 나트륨, 칼륨, 또는 음이온 암모늄 염 예컨대, 시트레이트, 알킬설포네이트, 히드록시드, 아세테이트, 카르보네이트, 테트라보레이트, 비카르보네이트, 포스페이트, 및 수소 포스페이트 뿐만 아니라 유기 완충액 예를 들어, HEPES, 즉 4-(2-히드록시에틸)-1- 피페르진에탄설폭산이다.
이상적으로, 소규모상으로, 요구하지 않은 부반응이 없고 전환율이 허용가능한 임의 것을 제조하기 위한 큰 공정을 수행하기 이전에 특정 말레이미드 또는 말레이미드 컨쥬게이트로 특정 염기 및 임의 완충 반응계를 측정해야만 한다.
가수분해를 이루기 위한 적합한 온도는 약 4℃내지 약 75 ℃, 바람직하게 0℃ 내지 약 60℃, 더욱 바람직하게 약 15℃ 내지 약 45℃, 및 더욱 바람직하게 18 ℃ 내지 약 30℃의 범위이다. 상기에 상술한 바와 같이, 반응 시간은 pH 의존적이다. 반응 시간은 전형적으로 약 5 분 내지 수일 예를 들어, 만약 부반응이 나타나지 않는다면 96시간이상의 범위일 것이다. 그러나 바람직한 시간은 약 30분 내지 약 24시간이고, 더욱 바람직하게 2 시간 내지 약 17 시간이다. 교반은 임의로 상기 반응을 촉진할 수 있다.
임의 예에서, 예를 들어, 완충액 및 중합체 말레이미드의 임의 농도에서 일부 완충액의 존재에서, 상기 고리 열림 반응은 시간상 낮아진다.
안정한 반응 속도를 달성하기 위해, 사용된 가수분해 조건하에서 장시간동안 안정한 pH를 제공하는 완충 반응계를 사용하는 것이 바람직할 수 있거나 다른 방안으로, 상기 pH는 모니터될 수 있고, 첨가된 염기는 주기적으로 필요하다면, 일정한 pH 범위를 유지할 수 있다. 그러나 일정 pH는 완전한 고리 열림을 수득하기 위한 요구되지 않는 것은 강조되어야 한다.
이상적으로, 중합체 숙신이미드 컨쥬게이트는 고리 열림의 요구되는 정도가 달성되기 위한 충분한 시간, 충분한 온도에서 염기에 노출된다. 상기 고리 열림 반응은 비활성된 활성제 또는 요구하지 않은 생성물의 혼합물을 야기할 수 있는 경쟁적 부반응의 발생의 가능성에 대해 pH 값의 범위 이상에서 발생할 수 있기 때문에, 바람직하게 짧은 반응 시간 예를 들어, 더 높은 pH 및 더 큰 가수분해 정도를 돕기 위해, 예를 들어, 숙신 이미드 고리 모두 가수분해되는 완전한 가수분해 조성물을 형성하기 위해을 달성을 비교하여 시도하는 것이 바람직하다. 그러므로, 비록 소규모의 시험 반응을 통해 바람직하지 않은 부반응을 최소화하기 위한 이상적인 pH를 결정해야 한다. 예를 들어, pH 5.0 내지 6.5 의 범위에서 부반응은 최소화되지만 중합체성 말레이미드 또는 이의 컨쥬게이트 둘다 고리 열림이 종종 금지되는 정도로 매우 천천히 일어난다.
예를 들어, Nektar (Huntsville, AL)로 부터 수득가능한 mPEG2-MAL-40K, 구조 VII, 는 상응하는 말레암산을 형성하기 위한 임의 조건하에서 말레이미드 고리 의 가수분해의 아주 제한된 정도를 겪는다.
Figure 112005035600115-pct00003
고리 열림 반응의 동역학에 상응하는 데이타는 실시예 2에 제공된다.
또한, 만약 상기 중합체 유도체가 생물학적 활성 분자에 컨쥬게이션을 위해 의도된 경우, 상기 가수분해 반응 조건 및 방법론은 생리학적 활성 분자가 적어도 부분 활성을 유지해야만 한다.
다음의 가수분해에서, 중합체 숙신암산 컨쥬게이트-함유 반응 혼합물의 pH는 전형적으로 약 5.5 내지 8로 맞춘다. 그런 다음 상기 조성물을 임의로 탈염화하고 건조, 예를 들어 동결건조 한다. 생성 조성물은 그런다음 추가로 침전하거나 크로마토그래피로 정제한다. 사용할 수 있는 상이한 크로마토그래피 분리 접근법은 SDS PAGE, 겔투과 크로마토그래피, 및 이온 교환 크로마토그래피를 포함한다.
바람직한 특정 접근법은 이온 교환 크로마토그래피이고, 이것은 상응하는 닫힌 고리 컨쥬게이트된 중합체 숙신이미드로부터 작용기로서 카르복실산을 가진 중합체 숙신암산 컨쥬게이트를 분리하는데 유리하다. pH 를 낮추고 조성물의 건조하는 예를 들어, 동결건조는 낮은 pH 및 물의 부재가 추가 가수분해에 불리하기 때문에, 특히 고리 열린 정도가 완전하지 않는, 다시 말해, 가수분해가 아직 완전하지 않는 조성물에 유리하다. 상기 방법에서, 상기 반응물 혼합물의 조성물은 본질적으로 임의 고리-열린 형태의 비-평형 양에서 "동결", 즉 화학적 안정하다.
더욱이, 본 발명에서 기재된 중합체 숙신암산 컨쥬게이트를 함유하는 조성물은 추가로 정제하여 또한 상이한 PEG화된 숙신암산 종을 수득/단리할 수 있다. 저 분자량 예를 들어, 약 20 kD 미만, 바람직하게 10 kD을 갖는 PEG에 대한 더 바람직한 및 다른 방법으로, 생성 혼합물은 정제하여 적용할수 있는 단백질 분자당 PEG 임의 수 분포를 수득할 수 있다. 예를 들어, 생성 혼합물은 단백질당 1 내지 5 PEG로의 평균을 얻을수 있고 전형적으로 단백질당 3 PEG의 평균을 수득할 수 있다. 최종 컨쥬게이트 반응 혼합물의 정제 단계는 사용된 중합체의 분자량, 특정 단백질, 요구되는 처방 계획, 및 잔류 활성 및 개별 컨쥬게이트(들)의 생체내 특성의 수많은 요소에 따라 달라질 것이다. 상기 접근법은 더욱 일반적으로 설히드릴 기 보다 주어진 단백질내에 더 많은 양으로 존재하는 전형적인 단백질 아미노 기와 PEG 말레이미드의 반응에 의해 제조된다.
요구된다면, 상이한 분자량을 가진 PEG 컨쥬게이트는 겔 여과 크로마토그래피를 이용하여 단리한다. 상기 접근법이 상이한 분자량을 가진 PEG 컨쥬게이트를 분리하는데 사용될 수 있다면, 상기 접근법은 일반적으로 단백질 내에 상이한 페길화된 지점을 가진 위치 이성질체를 분리하는데 효과적이지 못하다.
예를 들어, 겔 여과 크로마토그래피가 PEG 1-머, 2-머, 3-머 등의 각각 기타 혼합물을 분리하는데 사용되고 비록 회수된 PEG-머 조성물의 각각은 단백질 내에 상이한 반응성의 아미노기(예를 들어, 리신 잔기)에 연결된 PEG를 함유할 수 있다.
상기 분리 유형에 수행하기 위한 적합한 겔 여과 컬럼은 Superdex 및 Sephadex 컬럼은 Amersham Biosciences로 부터 시판된다.
특정 컬럼의 선택은 바람직한 분할 범위에 따라 달라질 것이다. 용출은 일반적으로 비-아민계 완충액, 예를 들어, 포스페이트, 아세테이트 등을 사용하여 수행된다. 상기 수합 분할은 수많은 다른 방법으로 분석될 수 있다. 예를 들어, (i) 단백질 함유를 위한 280 nm에서의 OD (ii) BSA 단백질 분석, (iii)PEG 함유를 위한 요오드 시험 (Sims G. E. C.,등, Anal. Biochem, 107, 60-63, 1980), 또는 다른 방법, iv) SDS PAGE 겔의 시행 다음에 요오드 바륨으로 염색 .
위치 이성질체의 분리는 역상 크로마토그래피, 예컨대, RP-HPLC C18 컬럼 (Amersham Biosciences 또는 Vydac) 또는 이온 교환 컬럼 예를 들어, Amersham Biosciences산 세파로오즈 이온 교환 컬럼을 이용한 이온 교환 크로마토그래피로 수행될 수 있다. 두 접근법은 모두 동일한 분자량(위치 이성질체)을 가진 PEG-생체분자 이성질체를 분리하는 데 사용될 수 있다.
생성 PEG-컨쥬게이트의 계획된 사용에 따라, 컨쥬게이션 및 임의 추가 분리 단계 후, 컨쥬게이트 혼합은 농축, 멸균 여과, 및 약 -20 ℃내지 약 -80 ℃의 저온에서의 저장될 수 있다. 다른 방법으로, 상기 컨쥬게이트를 동결건조하여 잔류 완충액이 있거나 없거나, 동결건조된 분말로서 저장된다. 일부 예에서, 컨쥬게이션시 사용된 완충액을, 예컨대, 나트륨 아세테이트를 동결건조시에 쉽게 제거 할 수 있는 휘발성 완충액 예컨대, 암모늄카르보네이트 또는 암모늄아세테이트로 교환하여 동결건조된 단백질 컨쥬게이트 분말 형성은 잔류 완충액이 없는 것이 바람직하다 다른 방법으로, 완충액 교환 단계는 제형 완충액을 사용함으로서 사용될 수 있어서, 동결건조된 컨쥬게이트는 마침내 포유동물에 투여용 및 제형 완충액으로 재구성하기에 적합한 형태이다.
전구체 말레이미드 중합체 유도체 및 중합체 숙신암산 컨쥬게이트
본 발명에 유용한 전구체 말레이미드 중합체 유도체는 일반적으로 수용성 중합체 단편에 커플된 하나이상의 말레이미드 치환체를 포함한다. 상기 말레이미드 치환체(들)은 수용성 중합체 단편에 직접적인 공유결합이거나, 다른 방법으로 연결 기 L 을 통해 중합체 단편에 연결될 수 있다. 일반화된 구조는 I로 하기에 제공되고, 여기서 임의 링커는 L로 나타내고, L0는 링커의 부재를 나타태고, L1은 링커의 존재함를 나타낸다.
Figure 112005035600115-pct00004
상응하는 중합체 말레암산, II, 및 중합체 숙신암산 컨쥬게이트, IV 및 V, 는 하기에 제공된 바와 같은 구조이다. 상기 구조는 모두 상호 관계를 갖기 때문에, POLY 및 L에 대한 본 발명의 설명과 구현은 상기 구조 모두와 동일하게 적용된다.
Figure 112005035600115-pct00005
[화학식 IV]
Figure 112005035600115-pct00006
[화학식 V]
Figure 112005035600115-pct00007
중합체 단편
상기에 예시된 구조에서 보여지는 바와 같이, 본 발명의 중합체 반응물 및 컨쥬게이트는 수용성 중합체 단편을 함유한다. 대표적인 POLY는 폴리 (알킬렌 글리콜s) 예컨대, 폴리 (에틸렌 글리콜), 폴리 (프로필렌 글리콜) ("PPG"), 에틸렌 글리콜 및 프로필렌 글리콜의 공중합체, 폴리 (올레핀성 알코올), 폴리 (비닐피롤리돈), 폴리 (히드록시알킬메타크릴아미드), 폴리 (히드록시알킬메타크릴레이트), 폴리 (사카라이드), 폴리 (α-히드록시산), 폴리 (비닐 알코올), 폴리포스파진, 폴리옥사졸린, 및 폴리 (N-아크릴로일모르폴린)을 포함한다. POLY는 상기의 임의의 상동중합체, 교차(alternating) 공중합체, 임의(random) 공중합체, 블럭(block) 공중합체, 교차 삼중합체, 임의 삼중합체, 또는 블럭 삼중합체일 수 있다.
상기 수용성 중합체 단편은 바람직하게, 비록 필수적이진 않지만, 폴리에틸렌 글리콜, "PEG", 또는 이의 유도체일 수 있다.
중합체 단편은, 예를 들어, POLY는 선형, 분지형 또는 포크될 수 있는 상이한 입체의 임의 수를 가질수 있다. 가장 전형적으로, POLY는, 예를 들어, 2 중합체 아암을 가진 선형 또는 분지형이다. 비록 대부분의 본 발명의 대부분의 논의는 예시된 POLY로서 PEG에 맞춰져 있고, 상기 논의 및 나타낸 구조는 상기에 기재된 수용성 중합체 단편의 임의를 포함하기 위해 쉽게 미칠 수 있다.
하나 이상의 반응성 말레이미드 말단을 가진 임의 수용성 중합체는 본 발명에 따라 중합체 숙신암산 컨쥬게이트 제조에 사용될 수 잇고 본 발명은 이에 제한되지 않는다. 비록 단일 반응성 말레이미드를 가진 수용성 중합체를 사용할 수 있지만, 2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 이상의 반응성 말레이미드를 가진 중합체는 본 발명에서 진술한바와 같이 이의 열린 고리 형태에 적합하게 사용될 수 있다. 수용성 중합체 단편에 연관된 말레이미드 또는 아미노 전구체 잔기의 수의 상한가의 비제한 예는 약 1 내지 약 500, 약 1 내지 약 100, 약 1 내지 약 80, 약 1 내지 40, 약 1 내지 약 20, 및 약 1 내지 약 10이다.
바람직한 POLY 에 대해서, 말단-캡핑된 PEG, 포크형 PEG, 분지형 PEG, 펜던트(pedant) PEG, 및 다소 바람직하게, 단량체 서브유닛을 분리하는 하나이상의 분리가능한 연결을 함유하는 PEG를 포함하면서, PEG는 이의 선형, 분지형, 멀티-아암 형내에서 폴리(에틸렌 글리콜)을 포함한다.
PEG 중합체 단편은 하기를 포함한다:-(CH2CH20)n-CH2CH2-[식중,(n)은 저형적으로 약 3 내지 약 4,000, 또는 약 3 내지 약 3,000, 또는 더욱 바람직하게 약 20 내지 약 1,000이다].
POLY는 말단-캡핑, 예를 들어, PEG가 비활성 말단-캡핑 기로 말단에 캡핑되는 말단-캡핑된 PEG일 수 있다. 바람직한 말단-캡핑된 PEG은 말단-캡핑 잔기로서 예컨대, 알콕시, 치환 알콕시, 알케닐옥시, 치환 알케닐옥시, 알키닐옥시, 치 환 알키닐, 아릴옥시, 치환 아릴옥시를 가진 것이다.
바람직한 말단-캡핑기는 메톡시, 에톡시, 및 벤질옥시이다. 상기 말단-캡핑기는 또한 포스포리피드를 유리하게 포함할 수 있다. 대표적인 포스포리피드는 포스파티딜콜린, 예컨대, 디라우로일포스파티딜콜린, 디올레일포스파티딜콜린, 디팔미토일포스파티딜콜린, 디스테로일포스파티딜콜린, 베헤노일포스파티딜콜린, 아라키도일포스파티딜콜린, 및 레시틴을 포함한다. 그러나, 하나의 구현에서, 본 발명의 중합체는 지방산 기 또는 기타 친유성 잔기가 실질적으로 없다.
이제 중합체 단편,POLY를 함유하는 임의 구조에 대해서 언급하며, 이 POLY는 하기에 상응하거나 포함될 수 있다:
"Z- (CH2CH20)n-" 또는 "Z-(CH2CH20)n-CH2CH2-",
[식중, n은 약 3 내지 약 4000, 또는 약 10 내지 4000, 및 Z 는 반응성 기이거나 말단-캡핑 기일수 있는 작용기이거나 포함한다]. Z의 예들로는 적용할 수 있는 활성 및 보호된 형태를 포함하는 히드록시, 아미노, 에스테르, 카르보네이트, 알데하이드, 아세탈, 알데하이드 하이드레이트, 케톤, 케탈, 케톤 하이드레이트, 알케닐, 아크릴레이트, 메타크릴레이트, 아크릴아미드, 설폰, 티올, 카르복실산, 이소시아네이트, 이소티오시아네이트, 히드라지드, 우레아, 말레이미드, 비닐설폰, 디티오피리딘, 비닐피리딘, 아이오도아세트아미드, 알콕시, 벤질옥시, 실란, 지질, 인지질, 비오틴, 및 형광물질을 포함한다. 작용기로는 예컨대, N-히드록시숙신이미딜 에스테르, 벤조트리아졸릴 카르보네이트, 아민, 비닐설폰, 말레이 미드, N-숙신이미딜 카르보네이트, 히드라지드, 숙신이미딜 프로피오네이트, 숙신이미딜 부타노에이트, 숙신이미딜 숙시네이트, 숙신이미딜 에스테르, 글리시딜 에테르, 옥시카르보닐이미다졸, p-니트로페닐 카르보네이트, 알데하이드, 오르토피리딜-디설피드 및 아크릴롤이 바람직하다.
상기 및 기타 작용기, Z, 는 하기의 참고문헌에 기재된다. 여기의 참고문헌은 모두 혼입되어있다: N-숙신이미딜 카르보네이트 (참조, U. S. 특허 Nos. 5,281, 698,5, 468,478), 아민 (참조, 예를 들어, Buckmann 등. Makromol. Chem. 182: 1379 (1981), Zalipsky 등. Eur. Polym. J. 19: 1177 (1983)), 히드라지드 (참조 예를 들어 , Andresz 등. Makromol. Chem. 179: 301 (1978) ), 숙신이미딜 프로피오네이트 및 숙신이미딜 부타노에이트(참조 예를 들어, Olson 등. Poly(ethylene glycol) Chemistry & Biological Applications, 170-181, Harris & Zalipsky Eds. , ACS, Washington, DC, 1997; 또한 참조 U. S. 특허 No. 5,672,662), 숙신이미딜 숙시네이트 (참조, 예를 들어, Abuchowski 등. Cancer Biochem. Biophys. 7: 175 (1984) 및 Joppich 등, Makromol. Chem. 180: 1381 (1979)), 숙신이미드 에스테르 (참조, 예를 들어, U. S. 특허 No. 4,670,417), 벤조트리아졸 카르보네이트 (참조 예를 들어 , U. S. 특허 No. 5,650,234), 글리시딜 에테르(참조, 예를 들어, Pitha 등. Eur. J. Biochem. 94: 11 (1979), Elling 등, Biotech. Appl.Biochem. 13: 354 (1991), 옥시카르보닐이미다졸(참조, 예를 들어, Beauchamp, 등, Anal. Biochem. 131: 25 (1983), Tondelli 등 J. Controlled Release 1: 251 (1985)), p-니트로페닐 카르보네이트 (참조, 예를 들어 , Veronese, 등, Appl. Biochem. Biotech. , 11: 141(1985); 및 Sartore 등, Appl. Biochem. Biotech., 27: 45 (1991)), 알데하이드 (참조, 예를 들어, Harris 등. J. Polym. Sci. Chem. Ed. 22: 341 (1984), U. S. 특허 No. 5,824,784, U. S. 특허 5,252,714), 말레이미드 (참조, 예를 들어 , Goodson 등. Bio/Technology 8: 343 (1990), Romani 등, in Chemistry of Peptides and Proteins 2: 29 (1984)), 및 Kogan, Synthetic Comm. 22: 2417 (1992)), 오르토피리딜-디설피드(참조, 예를 들어, Woghiren, 등. Bioconj.Chem. 4: 314 (1993) ), 아크릴롤(참조, 예를 들어, Sawhney 등, Macromolecules, 26: 581 (1993)),<BR> 비닐설폰 (참조, 예를 들어 , U. S. 특허 No. 5,900, 461).
다시, 바로 앞에서 보여진 POLY 구조는 선형 중합체 단편을 나타내거나 분지형 또는 포크형 중합체 단편의 부분을 형성할 수 있다. 중합체 단편이 분지형인 경우에, 바로 앞에 보여진 POLY 구조는 예를 들어, 전체 POLY 구조의 부분을 형성하는 중합체 아암에 상응할 수 있다. 다른 방법으로, POLY가 포크형 구조를 가진 경우에, POLY 구조는 예를 들어, 분지점이전의 중합체 단편의 선형 부분에 상응할 수 있다.
POLY 는 또한 2 아암, 3 아암, 4 아암, 5 아암, 6 아암, 7 아암, 8 아암 이상을 갖는 분지형 PEG 분자에 상응될 수 있다. 본 발명의 중합체 말레이미드 제조에 사용된 분지형 중합체는 언제든지 중합체 말레이미드 2 내지 300 또는 반응성 말단을 가질 수 있다. 바람직하게는 2 또는 3 중합체 아암을 갖는 분지형 중합체이다. U.S. 특허 No.5,932,462에 기재된 바와 같이 예시되어 설명된 분지형 POLY는 하기 구조에 상응한다.
Figure 112005035600115-pct00008
상기 구조에서, "R"은 비반응성 잔기, 예컨대, H, 메틸 또는 PEG, 및 P 및 Q 은 비반응성 연결이다. 특히 바람직한 구현에서, 분지형 PEG중합체 단편은 메톡시 폴리(에틸렌 글리콜) 2치환된 리신, 및 하기에 상응한다.
Figure 112005035600115-pct00009
상기 특정 분지형 배열에서, 상기 분지형 중합체 단편은 본 발명에서 기재된 바와 같은 링커를 통해 반응성 말레이미드의 위치를 정하기 위해 "C" 분지점으로부터 연장된 단일 반응 위치를 갖는다. 분지형 PEG 예컨대, 본 발명에서 사용하기 위한 것은 전형적으로 4 PEG 아암 미만을 가질 것이고 더욱 바람직하게, 2 또는 3 PEG 아암을 가질 것이다. 상기 분지형 PEG은 이의 선형 PEG 대조물보다 더 크고 밀집 중합체 구름과 커플되는 단일 반응 위치를 가지는 장점을 제공한다
특히 분지형 PEG 말레이미드는 하기 구조에 상응한다: (MeO-PEG-)iG-L0.1 -MAL[식중,MAL은 말레이미드를 나타내고, i 는 2 또는 3과 같고 G는 리신 또는 기타 적합한 아미노산 잔기이다].
본 발명의 예시하여 설명된 분지형 중합체 말레이미드는 하기에서 보여진 구조를 가진다.
Figure 112005035600115-pct00010
[식중, L은 본 발명에 기재된 임의 링커이다].
상기 예시적으로 보여진 분지형 구조를 가진 PEG 말레이미드는 일반적으로 상기 구조 VII에 상응한다. .
본 발명의 중합체 말레이드 제조에 사용된 분지형 PEG는 더 일반적으로 화학식 R(PEG)n로 나타내는 것을 포함한다[식중, R은 2 이상의 PEG 아암이 뻗어있는 중심 또는 중심 분자이다]. 변수 n은 PEG 아암의 수를 나타내고, 여기서, 상기 중합체 아암의 각각은 독립적으로 말단-캡핑되거나 대신 이의 말단에 반응 작용기르 가지고 있다. 본 발명의 멀티-아암된 구현은, 각 PEG 아암이 전형적으로 이의 말단에 말레이미드기를 가지고 있다.
분지형 PEG 예컨대, 일반적으로 화학식 R(PEG)d로 나타낸 것은 2 중합체 아암 내지 300 중합체 아암를 가진다 (즉, n 은 2 내지 약 300).
분지형 PEG 예컨대 상기는 바람직하게, 2 내지 약 25 중합체 아암, 더욱 바 람직하게 2 내지 약 20 중합체 아암, 및 더더욱 바람직하게 2 내지 약 15 중합체 아암이하를 가진다. 가장 바람직한 것은 3, 4, 5, 6, 7 또는 8 아암을 갖는 멀티-아암된 중합체이다.
상기 기술한 바와 같은 분지형 PEG 에서 바람직한 코어 분자는 폴리올이다. 이러한 폴리올로는, 에틸렌 글리콜, 알칸 디올, 알킬 글리콜, 알킬이덴 알킬 디올, 알킬 시클로알칸 디올, 1,5-디칼린디올, 4,8-비스(히드록시메틸)트리시클로데칸, 시클로알킬이덴 디올, 디히드록시알칸, 트리히드록시알칸 등을 포함하는, 탄소수가 1 내지 10 이고 히드록실기의 수가 1 내지 10 인 지방족 폴리올이 있다. 직쇄 또는 폐환 당류 및 당알콜류, 예컨대 만니톨, 소르비톨, 이노시톨, 자일리톨, 케브라키톨, 트레이톨, 아라비톨, 에리트리톨, 아도니톨, 둘시톨, 파코오스 (facose), 리보오스, 아라비노스, 자일로스, 릭소스 (lyxose), 람노스, 갈락토스, 글루코스, 프룩토스, 소르보스, 만노스, 피라노스, 알트로스, 탈로스, 타기토스 (tagitose), 피라노시드, 슈크로스, 락토오스, 말토스 등을 포함하는, 시클로지방족 폴리올 또한 이용가능하다. 부가적인 지방족 폴리올로는, 글리세랄데히드, 글루코스, 리보오스, 만노스, 갈락토스 및 관련 입체 이성질체들의 유도체들이 있다. 기타 사용될 수 있는 코어 폴리올로는, 크라운 에테르, 시클로덱스트린, 덱스트린 및 기타 탄수화물 예컨대 전분 및 아밀로오스가 있다. 바람직한 폴리올로는, 글리세롤, 펜타에리트리톨, 소르비톨 및 트리메틸올프로판이 있다.
상기 기재된 유형의 대표적인 멀티-아암 중합체 구조는 하기와 같다:
[화학식 VII]
Figure 112005035600115-pct00011
[식중, d 는 3 내지 약 100인 정수이고, R 은 3 이상의 히드록시기 또는 아미노기 또는 이의 조합물을 갖는 중심 코어 분자의 잔기이다].
본 발명에서 중합체 말레이미드의 제조에 사용된 멀티-아암 PEG는 Nektar, Huntsville, Alabama에서 상용되는 멀티-아암 PEG를 포함한다. 바람직한 구현에서, 본 발명의 멀티-아암 중합체 말레이미드는 하기에 상응하고 분자의 연결된 말레이미드의 특이성은 본 발명의 다른곳에서도 제공된다.
[화학식 VII]
Figure 112005035600115-pct00012
[식중, PEG 는 -(CH2CH20)nCH2CH2-,
M 은 하기와 같다:
Figure 112005035600115-pct00013
및 m 은 3, 4, 5, 6, 7, 및 8로 이루어진 군으로부터 선택된 것이다].
다른 방법으로, 상기 중합체 말레이미드는 전체 포크형 구조를 가진다.
포크형 PEG의 예는 하기 구조에 상응한다:
Figure 112005035600115-pct00014
[식중, PEG은 본 발명에 기재된 PEG의 임의 형이고, A는 연결 기이고, 바람직하게 가수분해적으로 안정한 연결, 예컨대, 수소, 황, 또는 -C(O)-NH-이고, F 및 F'은 임의 존재하는 가수분해적으로 안정한 스페이서 기이고 상기 기타 변수 L 및 말레이미드(MAL)는 상기에 정의된 바와 같다]. A, F 및 F' 에 상응하는 대표적인 링커 및 스페이서 기는 국제 출원 No.PCT/US99/05333에 기재되어있고, 본 발명의 사용하기 위한 상기 유형의 중합체 단편을 형성하는데 유용하다. F 및 F'은 동일하거나 상이할 수 있다. 본 발명의 특정한 구현에서, PEG는 mPEG이고, A 는 -C(O)-NH-에 상응하고, F 및 F'는 둘다 메틸렌 또는 -CH2-이다. 중합체 단편의 상기 유형은 두 활성제와 반응하기 위해 유용하고, 여기서, 두 활성제는 F 및 F'의 선택에 따라 정확하고 예비결정된 거리가 정해진다. .
예시적으로 설명된 분지형, 포크형 PEG는 하기에 보여지는 구조를 가진다. 여기서, 분지형 부분은 왼쪽이고, 포크형 부분은 오른쪽으로부터 뻗은 두 말레이미드 기를 갖는다.
Figure 112005035600115-pct00015
다른 방법으로, 본 발명에 중합체 말레이미드 제조에 사용을 위한 PEG 중합체 단편은 말단(들)보다 PEG 사슬의 길이에 따라 펜던트 반응기를 가진 PEG 분자로, 링커,L에 의해 연결된 하나 이상의 펜던트 말레이미드 기를 가지는 안정화된 중합체 말레이미드를 생산할 수 있다.
추가로, 다소 바람직한 구현에서, 상기 중합체 단편 그 자체에 가수분해시키는 하나 이상의 약하고 분해가능한 연결을 가질 수 있다. 중합체 단편내에 존재될 수 있는 예시적으로 설명하는 분해가능한 연결은 제한하진 않지만 카르보네이트, 이민, 포스페이트 에스테르, 및 히드라존을 포함한다.
일반적으로, 수용성 중합체 단편, POLY의 상기 명목 평균 분자량은 다양할 것이다. POLY의 명목 평균 분자량은 전형적으로 하기의 범위의 하나이상을 포함한다: 약 100 달톤 내지 약 100,000 달톤; 약 500 달톤 내지 약 80,000 달톤; 약 1,000 달톤 내지 약 50,000 달톤; 약 2,000 달톤 내지 약 25,000 달톤; 약 5,000 달톤 내지 약 20,000 달톤. 수용성 중합체 단편, POLY의 대표적인 명목 평균 분자량은 약 1,000 달톤, 약 5,000 달톤, 약 10,000 달톤, 약 15,000 달톤, 약 20,000 달톤, 약 25,000 달톤, 약 30,000 달톤, 및 약 40,000 달톤을 포함한다. 저 분자량 POLY는 약 250,500, 750,1000, 2000, 또는 5000 달톤의 분자량을 갖는다. 중합체-말레이미드에 상응하는 상기 임의 구조는 또한 심지어 명확하게 보여지진 않지만, 이의 상응하는 중합체 숙신암산 대조물을 포함하는 것을 의미한다. 그리하여, 본 발명의 모든 중합체 말레이미드 구조는 이의 열린-고리 형태내에 있는 말레이미드 고리를 제외하고 동일하게 미치는 것을 의미하고 비컨쥬게이트된(말레암산) 또는 컨쥬게이트된(숙신암산 컨쥬게이트)될 수 있다.
링커
이제, 링커 잔기에 대해서 보면, 링커 잔기 또는 간단히 본 발명의 "링커"는 일반적으로 변수 L로 나타낸다. 본 발명의 링커, L, 은 존재한다면, 전형적으로 약 1 내지 약 40 원자를 포함한다. 상기 링커는 상기 중합체 단편과 상기 중합체의 말레이미드 또는 말레암산 또는 숙신암산의 부분을 연결하는 전체 중합체 부분이다. 본 발명의 링커는 단일 원자 예컨대, 산소 또는 황, 두개 원자 또는 수많은 원자일 수 있다. 링커는 전형적으로, 자연상에서 필수적이진 않지만 자연상 선형이다. 링커의 전체 길이는 전형적으로 길이상 치환체는 포함하지 않고 단일 사슬내의 원자수인 1 내지 약 40 원자의 범위에 있다. 예를 들어, 전체 링커 길에에 대해 -CH2-를 하나의 원자로 세고, -CH2CH2O-를 길이상 3개 원자로 센다. 바람직하게, 링커는 약 1 내지 약 20 원자, 또는 약 2 내지 약 15 원자, 또는 약 1 내지 약 6 원자의 범위이고, 가수분해적으로 안정하다.
본 발명의 링커는 단일 작용기, 예컨대, 아미드, 에스테르, 우레탄, 또는 우레아일 수 있거나 작용기 측면에 위치한 메틸렌 또는 기타 알킬렌 기가 포함될 수 있다. 다른 방법으로, 링커는 동일하거나 상이한 작용기의 조합을 함유할 수 있다. 추가로, 본 발명의 링커는 임의로 하나 이상의 산소 또는 황 원자를 포함할 수 있는 알켈렌 사슬(즉 에테르 또는 티오에테르)일 수 있다. 바람직한 링커는 가수분해적으로 안정한 것이다. 구조의 관계에서 볼때, 링커는 전체 중합체의 부분으로서 여겨질 때, 퍼옥시드 결합 (-O-O-) 또는 -N-O-또는-O-N-결합을 함유하는 전체 구조를 초래하지 않는다.
구조 I, II의 관계에서, 본 발명의 링커는 임의의 하기가 될 수 있다:
Figure 112005035600115-pct00016
및 두개 이상의 상기의 임의 조합(여기서, (h)는 0 내지 6이고, (j)는 0 내지 20 이고, R6 은 H 또는 알킬, 치환 알킬, 알케닐, 치환 알케닐, 알키닐, 치환 알키닐, 아릴 및 치환 아릴로 이루어진 군으로부터 선택된 유기 라디칼이다).
그러나, 본 발명의 목적으로, 일련의 원자가 중합체 단편, POLY에 바로 근접할 때, 일련의 원자는 링커 잔기로 여겨지지 않고, 제한된 링커 잔기가 단지 중합 체 사슬의 범위에 나타낼 수 있는 것과 같이 원자는 기타 단량체를 제외한다.
예를 들어, 주어진 부분 구조" POLY-L-" [식중, 이경우의 POLY 는"CH30(CH2CH20)n-"로서 정의되고, 상기 정의가 단지 중합체의 범위만 나타내기 때문에, 상기 링커 잔기는 "-CH2CH20-"가 아닐수 있다. 그러나, 다시 말해서, 본 발명의 링커는 하나 이상의 연속적인 -CH2CH20- 부분을 가질수 없다. 예를 들어, 링커가 상기에 제공된 바와같은 예시적인 링커의 하나 이상의 조합에 의해 하나 또는 양쪽 측면에 위치한 하나 이상의 (-CH2CH20-)의 서브유닛을 함유될 것이다.
본 발명의 하나의 구현에서, 링커는 하기 구조를 가진다:
Figure 112005035600115-pct00017
[상기 링커에서, 개별적인 발생에서 R1 및 R2 은 각각 독립적으로 H 또는 알킬, 치환 알킬, 시클로알킬, 치환 시클로알킬, 알킬렌시클로알킬, 및 치환 알킬렌시클로알킬으로 이루어진 군으로부터 선택된 유기 라디칼이다]. 상기 구조에서, 0의 아래첨자는 특정 원자 또는 작용기의 부재를 나타낸다.
표시한 바와 같이 단일 말레이미드 말단 기 및 메톡시 캡을 이용하여, 임의 대표적인 PEG 말레이미드 구조는 하기 구조 1-4에 예시적으로 설명된다.
표 1에 보여진 링커, L,은 본 발명의 말레암산 중합체 및 컨쥬게이트를 형성 하기 위해 사용될 수 있다. 구조 3-ET로 나타낸 PEG 말레이미드는 말레이미드 링이 단순히 PEG 내에 말단 히드록시기에 대체되기 때문에, "링커없는(linkerless)"이라고 불린다. 하기에 보여진 대표적인 링커는 상기 기재된 중합체 단편의 임의 조합으로 사용될 수 있다; mPEG의 하기 구현은 오직 예시적으로 설명되는 것만을 의미한다.
Figure 112005035600115-pct00018
Figure 112005035600115-pct00019
일반적으로, 링커가 없는 동일한 수용성 중합체 말레이미드의 속도보다 증가된(즉, 빠른) 비커플된 중합체 말레이미드의 고리 열림 가수분해의 속도를 제공하는데 효과적인 링커가 바람직하다. 바람직한 구현에서, 상기 연결 기는 실온에서 측정할 경우, pH 7.5에서 말레이드의 고리 열림 가수분해 속도가 약 12시간 이하의 반감기를 가지는 것과 같은 고리 열림을 촉진시킨다. 더욱 바람직한 구현에서, 상기 연결기는 실온에서 측정할 경우, pH 9에서 말레이드의 고리 열림 가수분해 속도가 약 12시간 이하의 반감기를 가지는 것과 같은 고리 열림을 촉진시킨다.
고리 열림을 촉진하는 바람직한 연결 기는 링커없는 말레이미드, 즉, L3-ET , 짧은 알킬 링커를 가진 것, 예를 들어,L3-PR, 말레이미드 고리 질소에 연결된 에틸렌 또는 아릴 기, 예를 들어, L-MCH 및 Ll-pPHAL, 말레이미드 질소 원자 및 카르보닐기 사이의 짧은 알킬 링커를 가진 것, 예를 들어, Ll-AMET 및 가수분해에 중요한 입체 장애를 제공하지 않는 말레이미드 고리 질소로부터 전자 끌기 (withdrawal)를 증강하는 치환체를 함유하는 나열된 기의 다양한 변형을 포함한다. 말레이미드 또는 말레이미드-유도 질소의 약 6 원자내에, 즉, 말레이미드 또는 말레이미드-유도 질소의 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6 원자내에, 더욱 바람직하게 약 3 원자 내에 전자 끌기 기를 가지는 링커가 바람직하다. 본 발명의 중합체 및 컨쥬게이트는 상기 기재된 바와 같이 단일관능성(monofunctional), 이관능성(bifunctional), 및 다관능성(multi-functional)구조를 포함한다. 예를 들어,본 발명의 중합체 또는 컨쥬게이트의 중합체 말레이미드 전구체는 일반적으로 변수가 본원에 정의된 바와 같은 하기 구조로 기재될 수 있다:
Figure 112005035600115-pct00020
상기 구현에서, L's 는 동일하거나 상이할 수 있다. 특정 구현에서, 상기 중합체 반응물은 상동이관능성, 즉 다시말해, L's 둘다 동일하다.
숙신암산 컨쥬게이트
본 발명의 컨쥬게이트의 일반화된 특성은 상기에 자세하게 기재하였다. 중합체 숙신암산에 공유결합된 활성제는 하기로 부터 나타낼, 분자, 개체(entities), 표면 등과 같은 수많은 임의 유형을 포함한다.
목적 분자 및 표면
본 발명의 중합체 말레이미드 (열리고 닫힌 고리 모두)는 막, 화학적 분리 및 정제 표면, 고체 지지체 금속/금속 산화물 표면 예컨대, 금, 티타늄, 탄탈륨, 니오븀, 알루미늄, 스틸 및 이의 산화물, 규소 산화물, 마크로분자, 및 작은 분자를 포함하는 수많은 개체에 공유 결합이거나 비공유결합으로 연결될 수 있다.
추가로, 본 발명의 중합체 및 방법은 생화학적 센서, 바이오전자 스위치, 및 게이트로 사용될 수 있다.
본 발명의 중합체 및 방법은 또한 펩티드 합성, 중합체-코팅된 표면 및 중합체 이식의 제조용 담체 제조에 사용되어 가교 또는 비가교 히드로젤 및 바이오반응 기용 중합체-조요소 첨가제를 제조할 수 있다.
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본 발명에서 제안된 중합체성 반응물에 결합되는데 사용되기 위한 생물학적인 활성제는 하기의 하나 이상일 수 있다. 적합한 작용제는 예를 들어, 최면제 및 진정제, 심리적 활성 부여제, 안정제, 호흡기 약물, 진경제, 근육 이완제, 항파킨슨제 (도파민 길항제), 마취제, 항-염증제, 항불안제 (불안 완화제), 식욕 억제제, 항편두통제, 근육 수축제, 항-감염제 (항생제, 항바이러스제, 항진균제, 백신), 항관절염제, 항말라리아제, 제토제, 항간질제, 기관지확장제, 시토킨, 성장 인자, 항암제, 항혈전제, 항고혈압제, 심장혈관제, 항부정맥제, 항산화제, 항천식제, 피임제, 교감신경흥분제, 이뇨제, 지질 조절제, 남성호르몬제, 항기생충제, 항응집제, 종양제, 항종양제, 저혈당제, 영양제 및 보충제를 포함하는 호르몬제, 성장 보충제, 항장염제, 백신, 항체, 진단제, 및 대조제로부터 선택될 수 있다.
보다 특히, 활성제는 작은 분자 (바람직하게 불용성 작은 분자), 펩티드, 폴리펩티드, 단백질, 항체, 폴리사카라이드, 스테로이드, 뉴클레오타이드, 올리고뉴클레오타이드, 폴리뉴클레오타이드, 지방, 전해질 등을 포함하는 많은 구조적 분류 중 하나에 해당될 수 있으나 이에 한정되지 않는다. 바람직하게, 본 발명의 중합체에 커플링시키기 위한 활성제는 천연 아미노기 또는 설피디릴 기를 소유하거나, 또는 선택적으로 중합체 말레이미드에 커플링되는 것에 적합한 적어도 하나의 반응성 아미노기 또는 설피디릴 기를 포함하도록 변형된다.
본 발명의 중합체에 대한 공유 결합에 적합한 활성제의 특정 예로는 아스파리지네이즈, 암독소비르 (amdoxovir (DAPD)), 앤티드, 비케플레민, 칼시토닌, 시아노비린, 데니루킨 디프티톡스, 에리스로포이에틴 (EPO), EPO 길항제 (예를 들어, 약 10-40 아미노산 길이로부터이고 WO 96/40749에 설명된 것처럼 특이한 코어 서열을 포함하는 펩티드), 도네이즈 알파, 에리스로포에시스 자극 단백질 (NESP), 인자 V, 인자 VII, 인자 VIIa, 인자 VIM, 인자 IX, 인자 X, 인자 XII, 인자 XIII, 본 윌레브랜드 인자 (von Willebrand factor)와 같은 응집 인자, 세레데이즈, 세레자임, 알파-글루코시데이즈, 콜라겐, 시클로스포린, 알파 디펜신, 베타 디펜신, 엑스딘-4 (exedin-4), 그레눌로사이트 콜로니 자극 인자 (GCSF), 트롬보포이에틴 (TPO), 알파-1 프로티네이즈 억제제, 엘카토닌, 그레눌로사이트 마크로파지 콜로니 자극 인자 (GMCSF), 피브리노겐, 필그라스팀, 성장 호르몬, 인간 성장 호르몬 (hGH), 성장 호르몬 방출 호르몬 (GHRH), GRO-베타, GRO-베타 항체, 본 몰포제닉 단백질-2, 본 몰포제닉 단백질-6, OP-1과 같은 본 몰포제닉 단백질, 산성 피브로블라스트 성장 인자, 염기성 피브로블라스트 성장 인자, CD-40 리간드, 헤파린, 인간 혈청 알부민, 저분자량 헤파린 (LMWH), 인터페론 알파, 인터페론 베타, 인터페론 감마, 인터페론 오메가, 인터페론 타우, 콘센서스 인터페론과 같은 인터페론, 인터루킨-1 수용체, 인터루킨-2, 인터루킨-2 융합 단백질, 인터루킨-1 수용체 길항제, 인터루킨-3, 인터루킨-4, 인터루킨-4 수용체, 인터루킨-6, 인터루킨-8, 인터루킨-12, 인터루킨-13 수용체, 인터루킨-17 수용체와 같은 인터루킨 및 인터루킨 수용체, 락토페린 및 락토페린 단편, 루테나이징 호르몬 방출 호르몬 (LHRH), 인슐린, 프로-인슐린, 인슐린 유사체 (예를 들어, 미국 특허번호 5,922,675에 언급된 모노-아실화된 인슐린), 아밀린, C-펩티드, 소마토스타틴, 옥테레오타이드를 포함하는 소마토스타틴 유사체, 바소프레신, 여포 자극 호르몬 (FSH), 인플루엔자 백신, 인슐린-유사 성장 인자 (IGF), 인슐린트로핀, 마크로파지 콜로니 자극 인자 (M-CSF), 알테플레이즈, 유로키네이즈, 레테플레이즈, 스트렙토키네이즈, 파미테플레이즈, 라노테플레이즈 및 테네테플레이즈와 같은 플라스미노젠 활성제, 신경 성장 인자 (NGF), 오스테오프로테거린, 혈소판-유래된 성장 인자, 조직 성장 인자, 변형 성장 인자-1, 혈관 내피 성장 인자, 루케미아 저해 인자, 케라티노사이트 성장 인자 (KGF), 아교 성장 인자 (GGF), T 세포 수용체, CD 분자/항원, 종양 괴사 인자 (TNF), 모노사이트 화학유인물질 단백질-1, 내피 성장 인자, 부갑상선 호르몬 (PTH), 글루카곤-유사 펩티드, 소마토트로핀, 티모신 알파 1, 티모신 알파 1 IIb/IIIa 억제제, 티모신 베타 10, 티모신 베타 9, 티모신 베타 4, 알파-1 안티트립신, 포스포디에스테라제 (PDE) 화합물, VLA-4 (매우 늦은 항원-4), VLA-4 억제제, 비스포스포네이트, 호흡기세포융합바이러스 항체, 낭 섬유증 막 조절제 (CFTR) 유전자, 디옥시레보뉴클리에이즈 (Dnase), 살균/침투 증가 단백질 (BPI), 및 항-CMV 항체를 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다. 예시적인 모노클로날 항체는 이타네르셉트 (etanercept) (IgG1의 Fc 부분에 결합된 인간 75 kD TNF 수용체의 세포외 리간드-결합 부분으로 이루어진 이량체 융합 단백질), 아브식시마브(abciximab), 아페리모마브(afelimomab), 바시릭시마브(basiliximab), 다클리쥬마브(daclizumab), 인플릭시마브(infliximab), 이브리튜모마브 티욱세탄 (ibritumomab tiuxetan), 미투모마브(mitumomab), 무로모나드-CD3 (muromonad-CD3), I131토시투모마브(I131tositumomab) 컨쥬게이트, 리 M시마브(rituximab), 및 올리주마브 (olizumab), 트라스투쥬마브 (trastuzumab), 투비루마브 (tuvirumab)를 포함한다.
중합체에 대한 공유 결합에 적합한 부가적인 작용제는 아미포세틴 (amifostine), 아미오다론 (amiodarone), 아미노카프로익 산 (aminocaproic acid), 아미노히프레이트 소디움 (aminohippurate sodium), 아미노글루테티미드 (aminoglutethimide), 아미노이불리닉 산 (aminolevulinic acid), 아미노살리실릭 산 (aminosalicylic acid), 암사크린 (amsacrine), 아나그레라이드 (anagrelide), 아나스트로졸 (anastrozole), 아스파라지나제 (asparaginase), 안트라시클린 (anthracyclines), 벡사로텐 (bexarotene), 비칼루타미드 (bicalutamide), 블레오마이신 (bleomycin), 부세레린 (buserelin), 부설판 (busulfan), 카베르고린 (cabergoline), 카페시타빈 (capecitabine), 카보플라틴 (carboplatin), 카무스틴 (carmustine), 클로람부신 (chlorambucin), 실라스타틴 소디움 (cilastatin sodium), 시스플라틴 (cisplatin), 클라드리빈 (cladribine), 클로드로네이트 (clodronate), 시클로포스파마이드 (cyclophosphamide), 시프로테론 (cyproterone), 시타라빈 (cytarabine), 캠토테신(camptothecins), 13-시스 레티놀릭 산, 모든 트랜스 레티놀릭 산; 다카르바진 (dacarbazine), 닥티노마이신(dactinomycin), 다우노루비신 (daunorubicin), 디퍼록사민(deferoxamine), 덱사메타손(dexamethasone), 디클로페낙 (diclofenac), 디에틸스틸베스트롤 (diethylstilbestrol), 도세탁셀 (docetaxel), 독소루비신 (doxorubicin), 두타스테라이드 (dutasteride), 이피루비신 (epirubicin), 에스트라뮤스틴 (estramustine), 에토포사이드 (etoposide), 엑세메스탄 (exemestane), 펙소페나딘 (fexofenadine), 플루다라빈 (fludarabine), 플루드로코티손 (fludrocortisone), 플루오로우라실, 플루옥시메스테론 (fluoxymesterone), 플루타미드 (flutamide), 겜시타빈 (gemcitabine), 에피네프린, L-도파, 하이드록시유레아, 이다루비신(idarubicin), 이포스파마이드 (ifosfamide), 이마티니브(imatinib), 이리노테칸 (irinotecan), 이트라코나졸 (itraconazole), 고세레린 (goserelin), 레트로졸 (letrozole), 루코보린 (leucovorin), 레바미졸 (levamisole), 리시노프릴 (lisinopril), 로보티록신 소디움 (lovothyroxine sodium), 로무스틴 (lomustine), 메클로레타민 (mechlorethamine), 메드록시프로게스테론 (medroxyprogesterone), 메게스트롤 (megestrol), 멜파란 (melphalan), 메르캅토퓨린 (mercaptopurine), 메타라미놀 비타트레이트 (metaraminol bitartrate), 메토트렉세이트 (methotrexate), 메토클로프라미드 (metoclopramide), 멕실레틴 (mexiletine), 미토마이신 (mitomycin), 미토탄(mitotane), 미톡산트론 (mitoxantrone), 날로손 (naloxone), 니코틴, 니루타미드 (nilutamide), 니티시논 (nitisinone), 옥트레오티드 (octreotide), 옥사리플라틴 (oxaliplatin), 파미드로네이트 (pamidronate), 펜토스타틴 (pentostatin), 필카마이신 (pilcamycin), 폴피머 (porfimer), 프레드니손 (prednisone), 프로카르바진 (procarbazine), 프로클로페라진 (prochlorperazine), 온단세트론, 랄티트렉스트 (raltitrexed), 시로리머스 (sirolimus), 스트렙토조신 (streptozocin), 타크로리머스 (tacrolimus), 피메크로리머스 (pimecrolimus), 타목시펜 (tamoxifen), 테가세로드 (tegaserod), 테모조로미드 (temozolomide), 테니포시드 (teniposide), 테스토스테론 (testosterone), 테트라하이드로케나비놀 (tetrahydrocannabinol), 탈리도미드 (thalidomide), 티오구아닌, 티오테파, 토포테칸, 트레티노인 (tretinoin), 발데콕시브 (valdecoxib), 세레콕시브, 로페콕시브 (rofecoxib), 발루비신 (valrubicin), 빈블라스틴 (vinblastine), 빈크리스틴 (vincristine), 빈데스틴 (vindesine), 비노렐빈 (vinorelbine), 도라세트론 (dolasetron), 그라니세트론 (granisetron); 포르모테롤 (formoterol), 플루티카손 (fluticasone), 루프로리드 (leuprolide), 미다졸람 (midazolam), 알프라졸람 (alprazolam), 암포테리신 B (amphotericin B), 포도피로톡신 (podophylotoxins), 뉴클레오시드 항바이러스제, 아로일 히드라존 (aroyl hydrazones), 수마트립탄 (sumatriptan); 에리트로마이신 (erythromycin), 오레안도마이신 (oleandomycin), 트로리안도마이신 (troleandomycin), 록시트로마이신 (roxithromycin), 클라리트로마이신 (clarithromycin), 다베르신 (davercin), 아지트로마이신 (azithromycin), 플루리트로마이신 (flurithromycin), 디리트로마이신 (dirithromycin), 조사마이신 (josamycin), 스피로마이신 (spiromycin), 미데카마이신 (midecamycin), 루코마이신 (leucomycin), 미오카마이신 (miocamycin), 로키타마이신 (rokitamycin), 안다지트로마이신 (andazithromycin) 및 스위놀라이드 A (swinolide A)와 같은 마크로라이드; 시프로플록사신 (ciprofloxacin), 오플록사신 (ofloxacin), 레보플록사신 (levofloxacin), 트로바플록사신 (trovafloxacin), 아라트로플록사신 (alatrofloxacin), 목시플록시신 (moxifloxicin), 노르플록사신 (norfloxacin), 에녹사신 (enoxacin), 그레파플록사신 (grepafloxacin), 가티플록사신 (gatifloxacin), 로메플록사신 (lomefloxacin), 스파플록사신 (sparfloxacin), 테마플록사신 (temafloxacin), 페플록사신 (pefloxacin), 아미플록사신 (amifloxacin), 플레록사신 (fleroxacin), 투수플록사신 (tosufloxacin), 프루리플록사신 (prulifloxacin), 이르록사신 (irloxacin), 파쥬플록사신 (pazufloxacin), 클리나플록사신 (clinafloxacin), 및 시타플록사신 (sitafloxacin)과 같은 플루오로퀴놀론; 젠타미신 (gentamicin), 네틸미신 (netilmicin), 파라메신 (paramecin), 토브라마이신 (tobramycin), 아미카신 (amikacin), 카나마이신 (kanamycin), 네오마이신 및 스트렙토마이신, 반코마이신, 테이코플라닌 (teicoplanin), 람포라닌 (rampolanin), 미데플라닌 (mideplanin), 코리스틴 (colistin), 다프토마이신 (daptomycin), 그라마시딘 (gramicidin), 콜리스티메테이트 (colistimethate)와 같은 아미노글리코시드; 폴리믹신 B (polymixin B), 카프레오마이신 (capreomycin), 바시트라신 (bacitracin), 페넴 (penems)과 같은 폴리믹신; 페니실린 G, 페니실린 V와 같은 페니실린-감수성 작용제를 포함하는 페니실린; 메티실린, 옥사실린, 클록사실린, 디클록사실린, 플록사실린, 나프실린과 같은 페니실린-저항성 작용제; 암피실린, 아목시실린 및 헤타실린, 실린 및 갈람피실린과 같은 그람 음성 미생물 활성제; 카베니실린, 티카르실린, 아즐로실린, 메즐로실린, 및 피페라실린과 같은 항슈도모날 페니실린; 세프포독심 (cefpodoxime), 세프프로질 (cefprozil), 세프트부텐 (ceftbuten), 세프티족심 (ceftizoxime), 세프트리옥손 (ceftriaxone), 세팔로틴, 세파피린, 세파렉신, 세프라드린, 세폭시틴 (cefoxitin), 세파만돌 (cefamandole), 세파졸린 (cefazolin), 세팔로리딘 (cephaloridine), 세파클로 (cefaclor), 세파드록실 (cefadroxil), 세팔로글리신 (cephaloglycin), 세프록심 (cefuroxime), 세포라나이드 (ceforanide), 세포탁심 (cefotaxime), 세파트리진 (cefatrizine), 세파세트릴 (cephacetrile), 세페파임 (cefepime), 세픽심 (cefixime), 세포니시드 (cefonicid), 세포페라존 (cefoperazone), 세포테탄 (cefotetan), 세프메타졸 (cefmetazole), 세프타지딤 (ceftazidime)과 같은 세팔로스포린, 로라카베프 (loracarbef), 및 목사락탐 (moxalactam), 아즈트레오남 (aztreonam)과 같은 모노박탐 (monobactams); 및 이미페넴 (imipenem), 메로페넴 (meropenem), 펜트아미디네세티오네이트 (pentamidine isetionate), 알부테롤 설페이트(albuterol sulfate), 리도카인 (lidocaine), 메타프로테레놀 설페이트 (metaproterenol sulfate), 베클로메타손 디프레피오네이트 (beclomethasone diprepionate), 트리암시놀론 아세트아미드, 부데소나이드 아세토나이드, 플루티카손 (fluticasone), 이프라트로피움 브로마이드, 플루니솔라이드 (flunisolide), 크로몰린 소디움 (cromolyn sodium), 및 에르고타민 타르트레이트 (ergotamine tartrate); 팍리탁셀 (paclitaxel)과 같은 탁센 (taxanes); SN-38, 및 티르포스틴 (tyrphostines)을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 중합체 말레이미드에 커플링하기 위해 필요한 바람직한 펩티드 또는 단백질은 EPO, IFN-α, IFN-β, IFN-γ, 콘센서스 IFN, 인자 VII, 인자 VIII, 인자 IX,IL-2, 레미케이드(remicade)(인플릭시마브(infliximab)), 리툭산(Rituxan)(리툭시마브(rituximab)), 엔브렐(Enbrel)(이태너셉트(etanercept)), 시나지스(Synagis)(팔리비주마브(Palivizumab)), 리오프로(ReoPro)(압식시마브(Abciximab)) , 헤르세프틴(Herceptin)(트랜스지마브(transzimab)), tPA, 세레자임(Cerezyme)(이미글루세라제(Imiglucerase)), 헤파티터스-B 백신, rDNAse,알파-프로테아제 저해제, GCSF, GMCSF, hGH, 인슐린, FSH 및 PTH를 포함한다.
상기 예시적인 생물학적 활성제는 가능한 유사체, 작용제, 길항제, 억제제, 이성질체 및 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함하는 것을 의미한다. 펩티드 및 단백질에 관하여서는, 본 발명은 그의 생물학적 활성 단편 뿐만 아니라 합성, 재조합, 천연, 글리코실화된, 및 비-글리코실화된 형태를 포함하는 것으로 의도된다. 상기 생물학적 활성 단백질은 생성 변형된 단백질이 적어도 근원(천연) 단백질의 활성 정도를 가지는 한 추가로 치환(예를 들어, 시스테인), 삭제, 등의 하나 이상의 아미노산을 가지는 변형체를 포함한다.
본 발명에 기재된 컨쥬게이트 또는 방법은 하이드로젤 제형에 영향일 미칠 수 있다.
약학적 조성물
본 발명은 약학적 부형제와 결합된 본 발명의 컨쥬게이트를 포함하는 약학적 제형을 또한 포함한다. 일반적으로, 컨쥬게이트 자체는 고체 형태 (예를 들면, 침전물)인데, 이것은 고체 또는 액체 형태일 수 있는 적당한 약학적 부형제와 결합될 수 있다.
예시적인 부형제는 탄수화물, 무기염, 항미생물제, 항산화제, 계면활성제, 버퍼, 산, 염기 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 것들을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
당, 알디톨, 알도닉 산 (aldonic acid), 에스테르화된 당과 같은 유도된 당, 및/또는 당 중합체와 같은 탄수화물은 부형제로서 존재할 수 있다. 특정한 탄수화물 부형제는 예를 들어, 프락토스, 말토스, 갈락토스, 글루코스, D-만노스, 솔보스 등과 같은 모노사카라이드; 락토스, 슈크로스, 트레할로스, 셀로비오스 등과 같은 디사카라이드; 라피노스, 멜레지토스, 말토덱스트린, 덱스트린, 스타치 등과 같은 폴리사카라이드; 및 만니톨, 자일리톨, 말티톨, 락시톨, 자일리톨, 솔비톨 (글루시톨), 피라노실 솔비톨, 미오이노시톨 등과 같은 알디톨을 포함한다.
부형제는 시트르산, 소디움 클로라이드, 포타슘 클로라이드, 소디움 설페이트, 포타슘 니트레이트, 소디움 포스페이트 모노베이직, 소디움 포스페이트 디베이직 및 이들의 혼합물과 같은 무기염 또는 버퍼를 또한 포함할 수 있다.
제형은 미생물의 성장을 방해하거나 예방하기 위해서 항미생물제를 또한 포함할 수 있다. 본 발명에 적합한 항미생물제의 제한되지 않는 예는 벤잘코늄 클로라이드, 벤제토니움 클로라이드, 벤질 알콜, 세틸피리디늄 클로라이드, 클로로부탄올, 페놀, 페닐에틸 알콜, 페닐머큐릭 니트레이트, 티머졸 및 이들의 혼합물을 포함한다.
항산화제가 제형에 또한 존재할 수 있다. 항산화제는 산화를 막기 위하여 사용되는데, 이에 따라 제형의 컨쥬게이트 또는 다른 성분들의 오염을 막는다. 본 발명에서 사용되는 적합한 항산화제는 예를 들어, 아스코르빌 팔미테이트, 부틸화된 하이드록시안니솔, 부틸화된 하이드록시톨루엔, 히포포스포러스 산, 모노티오글리세롤, 프로필 갈레이트, 소디움 비설피트, 소디움 포름알데히드 설폭실레이트, 소디움 메타비설피트 및 이들의 혼합물을 포함한다.
계면활성제가 부형제로서 포함될 수 있다. 예시적인 계면활성제는 하기를 포함한다: 폴리소르베이트, 예를 들어 "트윈 20" 및 "트윈 80", 및 플루로닉스, 예를 들어 F68 및 F88 (둘다 BASF, 마운트 올리브, 뉴 저지로부터 입수가능함); 솔비탄 에스테르; 지질, 예를 들어 인지질, 예를 들어 레시틴 및 다른 포스파티딜에탄올아민 (바람직하게 리포솜 타입이 아니지만), 지방산 및 지방성 에스테르; 스테로이드, 예를 들어 콜레스테롤; 및 킬레이트제, 예를 들어 EDTA, 아연 및 다른 적합한 양이온.
산 또는 염기가 제형에 부형제로서 포함될 수 있다. 사용 가능한 제한적이지 않은 산은 염산, 아세트산, 인산, 시트르산, 말산, 젖산, 포름산, 트리클로로아세트산, 질산, 과염소산, 인산, 황산, 푸마르산 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 것들을 포함한다. 적합한 염기의 예로는 소디움 하이드록사이드, 소디움 아세테이트, 암모늄 하이드록사이드, 포타슘 하이드록사이드, 암모늄 아세테이트, 포타슘 아세테이트, 소디움 포스페이트, 포타슘 포스페이트, 소디움 시트레이트, 소디움 포르메이트, 소디움 설페이트, 포타슘 설페이트, 포타슘 푸머레이트 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 염기를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
약학적 제형은 모든 유형의 제형을 포함하고, 특히 예를 들어, 서스펜젼 및 용액 뿐만 아니라 물을 타서 사용할 수 있는 파우더와 같이 주사용으로 적합한 것들을 포함한다. 조성물 내의 컨쥬게이트 (즉, 본 발명의 활성제 및 중합체 사이에서 형성된 컨쥬게이트)의 함량은 많은 요소들에 따라 다양할 수 있으나, 상기 조성물이 단위 용량 컨테이너 (예를 들어, 바이알)에 저장되었을 때 치료적으로 유효량이 되도록 하는 것이 바람직하다. 게다가, 약학적 제형은 시린지에 수용될 수 있다. 치료적인 유효량은 어떤 함량이 임상적으로 바람직한 종말점을 나타내는지를 결정하기 위하여 컨쥬게이트의 함량을 증가시킨 반복된 투여에 의해 실험적으로 결정될 수 있다.
조성물에서 각 부형제의 함량은 부형제의 활성 및 조성물의 특정 필요에 따라 다양할 수 있다. 전형적으로, 각 개별 부형제의 최적 함량은 통상적인 실험, 즉 부형제의 다양한 함량 (낮은 함량부터 높은 함량까지)을 포함하는 조성물의 제조, 안정성 및 다른 변수들의 시험, 및 중요한 부작용 없이 최적 성능이 얻어지는 범위를 결정을 통해서 결정된다.
그러나, 일반적으로 조성물에서 부형제는 약 1 내지 약 99 중량%, 바람직하게는 약 5 내지 약 98 중량%, 보다 바람직하게는 약 15 내지 약 95 중량%, 가장 바람직하게는 30 중량% 미만으로 존재한다.
다른 부형제와 함께 상기 약학적 부형제들은 "레밍톤: 약학의 과학 & 실습", 19 판, 윌리암스 & 윌리암스, (1995), "외과의사의 데스크 참고자료", 52 판, 의학 경제학, 몽발르, NJ (1998), 및 크리브, A. H., 약학적 부형제의 안내서, 3 판, 미국 약학회, 워싱톤, D.C., 2000.에 설명되어 있다.
본 발명의 약학적 제형은 전형적으로, 비록 반드시는 아니지만, 주사를 통해서 투여되고, 따라서 투여 전에 일반적으로 즉시 액체 용액 또는 서스펜젼으로 된다. 약학적 제형은 시럽, 크림, 연고, 정, 파우더 등과 같은 다른 형태 또한 가능하다. 폐, 직장, 경피, 점막, 경구, 경막, 피하, 동맥 속 등과 같은 다른 투여 모드 또한 포함된다.
상기에서 설명한 바와 같이, 컨쥬게이트는 정맥 주사 또는 덜 바람직하게 근육내 또는 피하 주사에 의해 비경구적으로 주사되어 투여될 수 있다. 비경구 투여를 위한 적합한 제형 유형은 즉시 주사 용액, 사용 전에 용매와의 혼합을 위한 건조 파우더, 즉시 주사가능한 서스펜젼, 사용 전에 담체와 혼합하기 위한 건조 불용성 조성물, 및 에멀션 및 투여 전에 희석을 위한 액체 농축물 등을 포함한다.
투여 방법
본 발명은 본 발명의 컨쥬게이트를 컨쥬게이트 치료에 반응하는 상태로 고통받는 환자에게 투여하는 방법을 또한 제공한다. 상기 방법은 일반적으로 주사를 통하여 컨쥬게이트 (바람직하게 약학적 제형의 부분으로 제공되는)의 치료적인 유효량을 투여하는 것을 포함한다. 투여 방법은 특정 컨쥬게이트의 투여에 의해 치료 또는 예방될 수 있는 어떤 상태를 치료하는데 사용될 수 있다. 본 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 특정 컨쥬게이트가 효과적으로 치료할 수 있는 조건을 인식할 것이다. 투여되는 실제 함량은 치료되는 상태의 심각성, 건강 케어 전문가의 판단, 및 투여되는 컨쥬게이트 뿐만 아니라 환자의 나이, 중량 및 일반적인 상태에 따라 다양할 수 있다. 치료적인 유효량은 본 발명 분야의 당업자 및/또는 적당한 참고문헌 및 논문에 공지되어 있다. 일반적으로, 치료적인 유효량은 약 0.001 mg 내지 100 mg, 바람직하게는 0.01 mg/일 내지 75 mg/일, 및 보다 바람직하게는 0.10 mg/일 내지 50 mg/일이다.
어떤 주어진 컨쥬게이트 (또한, 바람직하게 약학적 제형의 부분으로 제공되는)의 단위 용량은 임상의의 판단에 따른 다양한 복용 계획, 환자의 필요량 등에 따라 투여될 수 있다. 특정 복용 계획은 본 발명이 속하는 분야의 당업자에게 알려져 있고, 통상적인 방법을 이용하여 실험적으로 결정될 수 있다. 예시적인 복용 계획은 하루에 5 번, 하루에 4 번, 하루에 3 번, 하루에 2 번, 하루에 1 번, 한주에 3 번, 한주에 2 번, 한주에 1 번, 한달에 2 번, 한달에 1 번, 및 이들의 혼합을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 일단, 임상적인 종말점에 이르면, 조성물의 복용은 중지된다.
본 발명의 컨쥬게이트 투여의 장점은 개별 수용성 중합체 부분이 쪼개질 수 있다는 것이다. 상기 결과는 중합체 크기 때문에 체내로부터의 제거가 잠재적으로 문제가 될 때 유용하다. 바람직하게, 각 수용성 중합체 부분의 쪼개짐은 우레탄, 아미드, 카르보네이트 또는 에스테르-포함하는 결합과 같은, 생리학적으로 쪼개질 수 있는 및/또는 효소학적으로 분해될 수 있는 결합의 사용을 통하여 촉진된다. 이런 방식으로, 컨쥬게이트의 제거 (개별 수용성 중합체 부분의 쪼개짐을 통한)는 바람직한 제거 특성을 제공하는 중합체 분자 크기 및 유형 작용기를 선택함으로써 조절될 수 있다. 당업자는 쪼개질 수 있는 작용기 뿐만 아니라 중합체의 적절한 분자 크기를 결정할 수 있다. 예를 들어, 당업자는, 통상적인 실험 방법을 이용하여, 먼저 다른 중합체 중량 및 쪼개질 수 있는 작용기를 가진 다양한 중합체 유도체를 제조하고, 그리고 나서, 상기 중합체 유도체들을 환자에게 투여하고 주기적인 혈액 및/또는 소변 시료를 채취하여 제거 프로필 (예를 들어, 주기적인 혈액 또는 소변 샘플링)을 얻음으로써 적절한 분자 크기 및 쪼개질 수 있는 작용기를 결정할 수 있다. 일단 각 시험 컨쥬게이트에 대한 일련의 제거 프로필이 얻어지면, 적합한 컨쥬게이트가 확인될 수 있다.
모든 논문, 책, 특허, 특허 출원 및 본 발명에 참고된 기타 출원은 완전한 형태로 혼입되어있다.
하기 실시예 뿐만 아니라, 본 발명이 임의 바람직한 특정구현으로 기재될 때, 본 발명의 범위를 제한하지 않고 예시적으로 설명하는 의도로 이해된다.
다르 측면에서, 본 발명의 범위내에서의 이점 및 변형은 본 발명에 속한 종래 기술의 당업자에게 보여질 것이다.
약어.
DCM: 디클로로메탄(dichloromethane)
NMR: 핵자기공명(nuclear magnetic resonance)
DI: 탈이온화(deionized)
r.t.: 실온
anh. : 무수물(anhydrous)
Da : 달톤(Daltons)
GPC : 겔 투과 크로마토그래피 (Gel Permeation Chromatography)
재료 및 반응물
다른 지시가 없는한 첨부된 실시예내에 언급된 모든 화학 반응물은 상용된다.
첨부된 실시예 내의 언급된 모든 PEG 반응물은 Nektar, Huntsville, AL.사에서 시판된다.
모든 1HNMR 데이타는 Bruker사에서 제조된 300 또는 400 MHz NMR 분광기에 의해 산출되었다.
실시예1
대표적인 연결된 PEG 말레이미드의 가수분해 속도
일련의 5000 달톤의 평균 분자량을 가진 대표적인 메톡시-PEG 말레이미드는 합성되고 연구되어졌다. 하기의 각각 구조에 대한 말레이미드의 가수분해 반응의 동력학은 각 mPEG 말레이미드의 용액을 약 7.5 pH 의 50 mM 인산 완충액의 5 mg/mL 농도에서, UV 흡수 297 nm파장에서 측정함으로써 결정되었다.
중합체 말레이미드의 일반화된 구조는 하기에 보여진다. 각각의 링커 (L1, L2, 및 L3)에 상응하는 정확한 구조는 하기의 표 1에 제공된다
Figure 112005035600115-pct00021
50 mM 인산 완충액(pH-7. 5)의 (5 mg/mL)농도에서, 297 nm 에서 UV 흡수로 측정된 mPEG (5 k-Da) 말레이미드의 가수분해 속도.
구조 반감기(시간) 상대비
L1-AMTR 8.8 3.66
L1-AMPE 19.4 1.66
L1-MCH 16.3 1.98
L2-BU 19.6 1.65
L2-HE 32.3 1.00
L3-ET 8.1 4.01
L3-PR 11.5 2.82
표 2에 데이타에서 보여지듯이, 예시하여 설명된 중합체 말레이미드의 가수분해 속도는 구조에 따라 변하였다. 상기 기에서, ET 링커가 가장 빠른 가수분해 속도를 보이는 반면 HE 링커는 가수분해에 가장 큰 내성을 가지고 있으며, 이는 심지어 상당히 마일드한 pH에서도 이의 말레이미드 고리가 가수분해에 대한 경향성을 나타낸다.
고리 열림을 촉진하는 바람직한 연결 기는 말레이미드 치환체(들), 즉 말레이미드 고리의 질소원자에 아주 근접(대부분 바람직하게 3 또는 그 정도의 원자 내의)한 내에서, 즉 강한 전자-끌기 기, EWG를 가진 것을 포함한다.
상기 L3-ET 링커,-O-에틸렌-는, 말레이미드 질소의 3 원자 이내에서 전기 끌기 원자, 산소를 가지고 이것은 증가된 가수분해 속도에 대한 경향성에 기여하는 것을 보인다. 가장 바람직하게 말레이미드 질소의 1, 2, 3 또는 4 원자내에 EWG를 가진 링커가 바람직하다.
실시예 2
분지형 및 연결된 중합체 말레이미드, M PEG2-MAL-40K의 가수분해
Figure 112005035600115-pct00022
상기에 나타낸 중합체 말레이미드, mPEG2-MAL-40K,는 Nektar (Huntsville, AL)사로부터 수득되었다. 상기 중합체 유도체는 하기에 기재된 바와 같이 상응하는 말레암산 유도체로를 형성하는 임의 조건하에서 말레이미드 고리의 가수분해의 제한된 정도를 겪었다.
상기 가수분해 반응은 근원 말레이미드의 감소 퍼센트를 관찰함으로써 분석적으로 모니터 하였다. 가수분해 반응의 동력학은 pH 약 5.5, 약 25℃, HEPES 완충된 용액에서 측정되었다.
선형 상관관계는 말레암산 또는 말레이미드 두 농도 대 시간의 두 대수의 플로팅에 의한 원 데이타로부터 수득하였다(이후 도 3에 보여진다).
상기 데이타는 그런 후에 가수분해 반응의 반감기를 결정하는데 사용되고 이것은 실험된 조건하에서 대략 34일이 되게 계산되었다. 그리하여, 상기 조건하에서, 상기 특정 말레이미드는 고리 열림에 대한 내성이 있었다. 그러나, 비완충된 물에서, 동일한 방법으로 측정할 때, 다시 25℃, 더 높은 pH에서,mPEG2-MAL-40K의 가수분해는 약 2.1일의 반감기가 측정되었다.
실시예 3
중합체 숙신이미드 컨쥬게이트의 가수분해 속도
대표적인 단백질 및 작은 분자 모델 컨쥬게이트의 가수분해 속도는 중합체-말단 말레이미드 자체 대 그들의 컨쥬게이트의 고리 열림 경향사이의 상관관계를 조사하기 위해 관찰되었다.
거대 생체분자 구성성분, 예컨대, 단백질은 액체 크로마토그래피 컬럼상에 머무름에 극대한 효과를 가지기 때문에, 일반적으로 중합체 자체보다 말레이미드 컨쥬게이트의 동력학을 측정하는데 더 어렵다. 상기 분석에서, 말레암산의 열린 산 형태는 열리지 않거나 닫힌 고리 형태로부터 명확하게 분리되지 않았다. 그러나, 크기 배제 크로마토그래피(HPLC-SE) 및 분석적 단백질 전기영동(SDS-PAGE) 은 모델 비단백질 화합물을 이용하여 준비된 컨쥬게이트 뿐만아니라 중합체성 말레이미드 단백질 컨쥬게이트의 고리 열림 특성을 측정하기 위해 추가로 사용하였다..
본 발명에서, 일반적으로 하기로 나타내는 두개 PEG-구형 단백질은 이의 고리 열림 특성을 조사하기 위해 연구되었다.
Figure 112005035600115-pct00023
상위 구조는 구형단백질(Glob Protein)2 의 PEG-말레이미드 컨쥬게이트(여기서, 구형단백질 2는 대략 48 kDa의 분자량을 가진 단백질이다). PEG 프로피온산(MW 30 kDa)으로부터 유도된 PEG 말레이미드에 컨쥬게이트되고 추가로, 상기 중합체 및 말레이미드 말단의 프로피온산 유도된 부분사이에 간섭된 중간 길이의 링커가 포함되었다. 상위 구조의 링커는 -C(O)-NH(CH2)2-NH-C(O)-CH2CH2-이다.
하위 구조는 구형단백질 1의 PEG-말레이미드 컨쥬게이트이고, 상기 단백질은 분자량 약 11 kDa이다. 상기 컨쥬게이트는 분자량 약 20 kDa의 링커없는 말레이미드 (mPEG-MAL)를 이용하여 제조하였다. 상응하는 PEG 말레이미드 구조 는 3-ET이다.
하위구조 (구형단백질 2)는 실온에서 pH 8.5에서 24시간 후에 완전하게 고리 열렸고, 이는 말레이미딜 종결된 중합체 유형의 불안정성을 나타내었다. 그리하여, 상기 중합체 컨쥬게이트는 고리-열림 반응을 촉진시키는 양호한 후보물질로 하학적 안정한 조성물을 제공하였다, 즉, 평형상태애서 상기중합체 숙신암산 컨쥬게이트를 포함하였다. 그러나 링커없는 형태에 대해, 상위 구조(구형단백질 1)내의 링커는 상위 구조내의 고리 구조가 17시간동안 50℃에서 가열시, pH 9에서, 17시간때까지 완전하게 고리 열리지 않기 때문에, 고리가 열리는데 지체함을 보였다.
실시예 4
모델 PEG-숙신이미드 컨쥬게이트의 고리 열림 특성
모델 화합물, 2-메르캅토에탄올에 컨쥬게이트된 임의 예시된 중합체 말레이미드의 가수분해 속도는, 고리-열림에 대한 컨쥬게이트의 경향성, 본 발명에서 제공된 고리-열림 접근법에 대한 이의 적합성을 평가하기 위해 측정하였다.
하기에 보여진 구조를 갖는 컨쥬게이트의 가수분해 속도(식중, 링커는 TRI, PEN, 및 MCH로 나타내는 부분을 포함한다)는 비컨쥬게이트된 말레이미드에 대해 상기에 기재된바와같이 수행되었다. 보여진 반감기는 상이한 두 pH값에서 취한 데이타로부터 계산되었다. 비컨쥬게이트된 말레이미드와 유사한, 상기 데이타는 가수분해 증가된 고리 열림을 가지며 떨어지는 pH에서, 반응 속도가 느려지는 것을 나타내었다. 숙신이미드 고리 (즉, TRI)에 근접한 가장 짧은 탄화수소 사슬을 가진 연결은 기타 연구된 컨쥬게이트와 비교했을때, 가장 빠르게 열렸다.
Figure 112005035600115-pct00024
실시예 5
링커없는 mPEG-말레이미드에 대한 다양한 pH에서의 가수분해
모델 화합물, 2-메르캅토에탄올과 mPEG-5K-말레이미드의 반응에 의해 형성된 컨쥬게이트의 가수분해 연구는 상기에서 기재된 바와같이 수행하였다. 다양한 pH에서 컨쥬게이트의 가수분해 반응의 동력학의 요약은 하기 표 4에 제공되었다.
2-메르캅토에탄올과 mPEG-5K-말레이미드의 반응에 의해 형성된 컨쥬게이트의 가수분해 연구
pH 반감기, 분
12 <5
11 <15
10 30
9 600
A. 2-메르캅토에탄올과 mPEG-5K-말레이미드 부산물의 합성
mPEG (5000 Da)-말레이미드(3.0g, 0.0006 몰, Nektar, Huntsville, Alabama)의 아세토니트릴 용액에(60 ml), 2-메르캅토에탄올(0.15g, 0.0190 몰)을 첨가하고 상기 혼합물을 아르곤 대기하에 실온에서 하룻밤동안 교반시켰다. 그런 다음 상기 용매를 감압하에서 증류제거 시켰다. 상기 잔류물은 디클로로메탄(7.5 ml)에 용해시킨 다음, 이소프로필 알코올을 첨가시켰다. 상기 침전 생성물을 여과제거시키고 감압하에서 건조시켰다. 수율:2.80 g
NMR (d6-DMSO): 2.78 ppm (bm,-S-CH2CH2OH, 2H), 3.24 ppm (s, -OCH3, 3H), 3.51 ppm (s, PEG 단편), 4.03 ppm (m,-CH-S-, 1H), 4.85 ppm (7, -OH, 1H).
B. PH 9에서 가수분해
mPEG-MAL-ME (0.2 g)를 증류수 4 ml에 용해시키고 상기 생성 용액을 0.1M 인산 완충액 (pH=9.3) 4ml에 첨가하였다. 상기 pH 를 0.01M NaOH을 첨가하여 바로 9.0로 맞추었다. 상기 용액 시료 0.25 ml을 1시간 간격으로 빼내어 HPLC로 분석하였다. 용액의 pH 측정시에 0.01M NaOH을 주기적으로 첨가하여 8.95-9. 05내의 범위를 유지하였다.
C. 숙신암산 컨쥬게이트의 단리
상기 기재된 바와 같이 가수분해 반응을 수행하여, pH 9 및 pH 12에서 수행된 반응으로부터 생성물을 단리하였다. 각 경우에, 생성물은 동일하였다. 가수분해의 두 생성물은 상응하는 2-위치 부가물 및 2-위치 부가물로 형성되었다. 생성물 지정(assignment)은 분광 시물레이션의 기초로 이루어졌다. 2-위치 부가물 3-위치 부가물의 몰비를 나타낸 NMR 분석은 71 대 29이었다.
본 발명의 많은 개질 및 기타 구현은 상기 명세서와 도면에 나타낸 기술의 장점을 가진 본 발명에 관련한 기술은 종래 기술의 하나가 될 것이다. 그러무르 본 발명은 기재된 특정 구현에 제한하지 않고 개질 및 기타 구현은 첨부된 청구범위내에 포함되도록 의도되었다. 비록 특정 용어가 본 발명에 사용되었고,이들은 제한의 목적이 아닌 포괄적이고 기술적인 것으로만 사용되었다.

Claims (65)

  1. 하기 단계를 포함하는 중합체 컨쥬게이트 제조 방법:
    (a) 말레이미드 기를 포함하는 수용성 중합체 제공 단계,
    (b) 중합체-숙신이미드-결합 활성제 컨쥬게이트를 형성하기 위해 마이클-형 첨가반응을 통해 상기 수용성 중합체에 상기 제제를 커플링하는데 효과적인 조건하에서, 친핵체를 포함하는 활성제와 상기 중합체를 반응 시키는 단계, 및
    (c) 상기 숙신이미드 고리를 강제적으로 열리게 하는데 효과적인 조건하에서, (b)의 컨쥬게이트를 처리하여 중합체-숙신암산-컨쥬게이트를 포함하는 중합체-컨쥬게이트 조성물을 형성하는 단계.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 처리 단계가 가수분해를 포함하는 방법.
  3. 제 2 항에 있어서, 상기 처리 단계가 수성 용매 또는 유기 용매에서 수행되는 방법.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 처리 단계가 염기 존재하에 수행되는 방법.
  5. 제 4 항에 있어서, 상기 염기가 금속 또는 비금속 수산화물, 4가 수산화 암모늄, 나트륨(Na°), 및 칼륨(K°) 으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  6. 제 4 항에 있어서, 상기 염기가 고체 지지체상 또는 용액 내에 있는 방법.
  7. 제 1 항에 있어서, 상기 처리 단계가 pH 가 약 6 내지 12 의 범위에서 수행되는 방법.
  8. 제 7 항에 있어서, 상기 처리 단계가 pH 가 약 7.5 내지 약 11 의 범위에서 수행되는 방법.
  9. 제 1 항에 있어서, 상기 처리 단계가 완충액에서 수행되는 방법.
  10. 제 1 항에 있어서, 상기 처리 단계가 화학적으로 안정한 조성물을 제공하는데 효과적인 조건하에서 수행되는 방법.
  11. 제 1 항에 있어서, 추가로 상기 조성물 내에 상기 숙신이미드 고리의 열림의 정도를 결정하는 단계를 포함하는 방법.
  12. 제 11 항에 있어서, 상기 처리 단계가 중합체-숙신암산-컨쥬게이트의 약 15% 이상 형성될 때까지 수행되는 방법.
  13. 제 11 항에 있어서, 상기 처리 단계가 중합체-숙신암산-컨쥬게이트의 약 35% 이상 형성될 때까지 수행되는 방법.
  14. 제 11 항에 있어서, 상기 처리 단계가 중합체-숙신암산-컨쥬게이트의 약 80% 이상 형성될 때까지 수행되는 방법.
  15. 제 11 항에 있어서, 상기 처리 단계가 중합체-숙신암산-컨쥬게이트의 약 95% 이상 형성될 때까지 수행되는 방법.
  16. 제 11 항에 있어서, 상기 처리 단계가 중합체-숙신암산-컨쥬게이트의 약 98% 이상 형성될 때까지 수행되는 방법.
  17. 제 1 항에 있어서, 상기 친핵체가 설프히드릴(티올)기 또는 아미노기인 방법.
  18. 제 1 항에 있어서, 상기 활성제가 단백질 또는 펩티드인 방법.
  19. 제 1 항에 있어서, 추가로 상기 조성물로부터 상기 중합체 숙신암산 컨쥬게이트를 회수하는 것을 포함하는 방법.
  20. 제 19 항에 있어서, 상기 회수 단계가 상기 중합체 숙신암산 컨쥬게이트를 침전시키는 것을 포함하는 방법.
  21. 제 19 항에 있어서, 상기 회수 단계가 상기 중합체 숙신암산 컨쥬게이트를 정제하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  22. 제 21 항에 있어서, 상기 정제 단계가 상기 중합체 숙신암산 컨쥬게이트를 크로마토그래피에 의해 정제하는 것을 포함하는 방법.
  23. 제 22 항에 있어서, 상기 크로마토그래피가 SDS-PAGE, 겔 투과 크로마토그래피, 및 이온 교환 크로마토그래피로 이루어진 군으로부터 선택된 방법.
  24. 제 1 항에 있어서, 상기 수용성 중합체가 폴리(알킬렌 옥시드), 폴리(비닐 피롤리돈), 폴리(비닐 알코올), 폴리옥사졸린, 폴리(아크릴로일모르폴린), 및 폴리 (옥시에틸화 폴리올)로 이루어진 군으로부터 선택된 방법.
  25. 제 24 항에 있어서, 상기 수용성 중합체가 폴리(알킬렌 옥시드)인 방법.
  26. 제 25 항에 있어서, 상기 수용성 중합체가 폴리(에틸렌 글리콜)인 방법
  27. 제 26 항에 있어서, 상기 폴리(에틸렌 글리콜)이 말단-캡핑 잔기를 포함하는 방법.
  28. 제 27 항에 있어서, 상기 말단-캡핑 잔기가 알콕시, 치환 알콕시, 알케닐옥시, 치환 알케닐옥시, 알키닐옥시, 치환 알키닐옥시, 아릴옥시 및 치환 아릴옥시로 이루어진 군으로부터 선택된 방법.
  29. 제 28 항에 있어서, 말단-캡핑 잔기가 메톡시, 에톡시, 및 벤질옥시로 이루어진 군으로부터 선택된 방법.
  30. 제 26 항에 있어서, 폴리(에틸렌 글리콜)이 약 100 달톤 내지 약 100,000 달톤의 명목 평균 분자를 가진 방법.
  31. 제 30 항에 있어서, 폴리(에틸렌 글리콜)이 약 1,000 달톤 내지 약 80,000 달톤의 명목 평균 분자를 가진 방법.
  32. 제 31 항에 있어서, 폴리(에틸렌 글리콜)이 약 2,000 달톤 내지 약 50,000 달톤의 명목 평균 분자를 가진 방법.
  33. 제 26 항에 있어서, 폴리(에틸렌 글리콜)이 선형, 분지형, 포크형, 및 멀티- 아암(arm)형으로 이루어진 군으로부터 선택된 구조를 갖는 방법.
  34. 제 26 항에 있어서, 상기 폴리(에틸렌 글리콜)이 하기 구조를 포함하는 방법:
    Z-(CH2CH20)n-CH2CH2-,
    [식중, n은 약 10 내지 약 4000이고, Z은 히드록시, 아미노, 에스테르, 카르보네이트, 알데하이드, 알데하이드 하이드레이트, 아세탈, 케톤, 케톤 하이드레이트, 케탈, 알케닐, 아크릴레이트, 메타크릴레이트, 아크릴아미드, 설폰, 티올, 카르복실산, 이소시아네이트, 이소티오시아네이트, 히드라지드, 우레아, 말레이미드, 비닐설폰, 디티오피리딘, 비닐피리딘, 아이도아세트아미드, 알콕시, 벤질옥시, 실란, 지질, 인지질, 비오틴, 및 형광물질로부터 이루어진 군으로부터 선택된 잔기를 포함한다].
  35. 제 1 항에 있어서, 상기 수용성 중합체가 상기 수용성 중합체 및 상기 말레이미드 기 사이에 삽입된 링커, L을 포함하는 방법.
  36. 제 35 항에 있어서, 상기 링커가 pH 9.0 의 인산 완충액에서 실온에서 측정될 때, 약 12시간 이하의 상기 수용성 중합체의 고리-열림 가수분해 반감기를 초래하는데 효과적인 방법.
  37. 제 26 항에 있어서, 상기 폴리에틸렌 글리콜 중합체가 상기 말레이미드기의 질소원자에 직접 결합되는 방법.
  38. 삭제
  39. 삭제
  40. 삭제
  41. 삭제
  42. 삭제
  43. 삭제
  44. 삭제
  45. 하기를 포함하는 화학적으로 안정한 조성물:
    [화학식 V]
    Figure 112005035600115-pct00025
    또는
    [화학식 IV]
    Figure 112005035600115-pct00026
    [식중 :
    POLY는 수용성 중합체 단편이고,
    L은 임의 링커이고,
    "Nu-활성제" 는 친핵체 "Nu"를 포함하는 활성제를 나타낸다].
  46. 제 45 항에 있어서, 상기 Nu가 티올 또는 티올레이트인 조성물.
  47. 제 46 항에 있어서, 상기 Nu가 시스테인 내에 함유된 티올 또는 티올레이트 이고 상기 활성제는 단백질 또는 펩티드인 조성물.
  48. 제 45 항에 있어서, Nu 가 아미노인 조성물.
  49. 제 45 항에 있어서, 상기 Nu가 리신 내에 함유된 아미노기 또는 말단 아민이고 상기 활성제는 단백질 또는 펩티드인 조성물.
  50. 제 45 항에 있어서, 분말 형태인 조성물.
  51. 제 45 항에 있어서, 용액 형태인 조성물.
  52. 제 45 항에 있어서, POLY-함유 구성성분에 대해, V 및 IV가 조합된 구조의 약 15 중량% 이상을 포함하는 조성물.
  53. 제 45 항에 있어서, POLY-함유 구성성분에 대해, V 및 IV가 조합된 구조의 약 35 중량% 이상을 포함하는 조성물.
  54. 제 45 항에 있어서, POLY-함유 구성성분에 대해, V 및 IV가 조합된 구조의 약 80 중량% 이상을 포함하는 조성물.
  55. 제 45 항에 있어서, POLY-함유 구성성분에 대해, V 및 IV가 조합된 구조의 약 95 중량% 이상을 포함하는 조성물.
  56. 제 45 항에 있어서, POLY-함유 구성성분에 대해, V 및 IV가 조합된 구조의 약 98 중량% 이상을 포함하는 조성물.
  57. 제 45 항에 있어서, L이 링커가 없는 동일한 수용성 중합체 말레이미드의 속도에 대해 V 또는 IV 둘의 비커플된 수용성 중합체 말레이미드 전구체의 말레이미드 기의 증가된 고리 열림 가수분해 속도를 제공하는데 효과적인 링커인 조성물.
  58. 제 45 항에 있어서, L이 pH 9의 인산 완충액내에서 실온에서 측정되는 경우, 약 12시간 이하의 V 또는 IV 둘의 비커플된 수용성 중합체 말레이미드 전구체의 고리 열림 가수분해 반감기가 되는데 효과적인 링커인 조성물.
  59. 제 45 항에 있어서, POLY가 폴리에틸렌 글리콜을 포함하고, 구조 V 및 IV 가 링커를 갖지 않는 조성물.
  60. 제 59 항에 있어서, POLY가 선형 폴리에틸렌 글리콜인 조성물.
  61. 제 45 항에 있어서, 상기 링커가 상기 숙신암산의 질소원자의 약 6 원자내에 전자 끌기 기(EWG)를 포함하는 조성물.
  62. 제 61 항에 있어서, 상기 링커가 상기 숙신암산의 질소원자의 약 3 원자내에 전자 끌기 기(EWG)를 포함하는 조성물.
  63. 제 45 항에 있어서, 상기 활성제가 생물학적 활성제인 조성물.
  64. 제 63 항에 따른 조성물을 포함하는 용량 단위 형태.
  65. 수용성 중합체로 유도된 단백질을 포함하는 조성물로서, 상기 중합체가 시스테인 설프히드릴기 또는 리신 아미노기에 공유결합된 숙신이미드 기를 통해 단백질에 커플되고, 실질적으로 조성물 내의 숙신이미드 기 모두가 고리-열린 형태로 존재하는 조성물.
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