KR101207247B1 - 티올-선택성 수용성 중합체 유도체 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 단백질의 시스테인 잔기에 함유된 것과 같은, 티올기에 선택적으로 커플링하기에 적합한 티올 선택성 말단을 가진 수용성, 중합체 유도체를 제공한다.

Description

티올-선택성 수용성 중합체 유도체 {THIOL-SELECTIVE WATER-SOLUBLE POLYMER DERIVATIVES}
본 발명은 폴리에틸렌 글리콜과 같은 수용성 중합체의 티올-선택성 유도체의 제조 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 : (i) 하나 이상의 말단에서 단백질 또는 다른 활성제의 티올기에 커플링하기 적합한 티올, 보호된 티올, 또는 다른 기를 가진 중합체의 제조 방법 (ii) 티올-선택성 중합체 그 자체, (iii) 그의 컨쥬게이트, 및 (iv) 상기 중합체를 유용하게 하는 방법에 관한 것이다.
생물공학에서의 최근의 발전으로 인해, 치료성 단백질 및 다른 생물분자, 예를 들어, 항체 및 항체 절편이 현재, 상기 생물분자를 더욱 광범위하게 유용하도록 하면서 대규모로 제조될 수 있다. 불행하게도, 잠재적인 치료성 생물분자의 임상적 유용성은 종종 그의 빠른 단백용해성 분해, 제조, 저장 또는 투여시의 불안정성, 또는 그의 면역원성으로 인해 방해받기도 한다. 치료적 용도로 단백질 및 다른 생물분자를 투여하는 데 대한 지속적인 관심으로 인해, 상기 결함을 극복하려는 다양한 접근이 연구되고 있다.
광범위하게 연구되고 있는 하나의 상기 접근은 단백질 및 다른 잠재적으로 치료성 생물분자의 폴리에틸렌 글리콜 또는 "PEG" 와 같은 수용성 중합체의 공유 부착으로 인한 개질이다 (Abuchowski, A., 등, J. Biol . Chem . 252 (11), 3579 (1977) ; Davis, S., 등, Clin . Exp Immunol ., 46, 649-652 (1981)). 종종 PEG-컨쥬게이트 또는 PEG화된 단백질이라고 불리는 PEG-개질된 단백질의 생물학적 특성은 많은 경우, 그의 비-PEG화된 대조물의 것을 넘어서서 상당히 향상된 것으로 보여진다 (Herman, 등, Macromol . Chem . Phys ., 195, 203-209 (1994)). 폴리에틸렌 글리콜-개질된 단백질은 단백용해성 분해에 대한 증가된 저항으로 인해 체내에서 더 긴 순환 시간을 가지고 있으며, 또한 증가된 열안정성을 가지고 있는 것으로 보인다 (Abuchowski, A., 등, J. Biol . Chem ., 252, 3582-3586 (1977)). 생물효능 (bioefficacy) 에 있어서의 유사한 증가는 예를 들어 항체 및 항체 절편과 같은 다른 생물분자와 함께 관찰된다 (Chapman, A., Adv . Drug Del . Rev. 54, 531-545 (2002)).
전형적으로, 폴리에틸렌 글리콜의 약물 또는 다른 표면으로의 부착은 활성화된 PEG 유도체, 즉, 생물분자 예를 들어, 단백질의 리신, 시스테인 및 유사한 잔기) 의 친핵성 중심부와의 반응에 적합한 하나 이상의 활성화된 말단을 가진 PEG 를 이용하여 달성된다. 단백질의 리신 측쇄에 존재하는 것과 같은 단백질 아미노기와 활성화된 PEG 의 반응을 기재로 한 방법이 가장 흔하게 이용된다. 단백질의 아미노기와의 반응에 적합한 활성화된 말단기를 가진 폴리에틸렌 글리콜은 PEG-알데히드 (Harris, J. M., Herati, R. S., Polym Prepr. (Am . Chem . Soc ., Div. Polymer . Chem), 32(1), 154-155 (1991)), 혼합된 무수물, N-히드록시숙신이미드 에스테르, 카르보닐이마다졸리드 및 클로로시아누레이트 (Herman, S., 등, Macromol. Chem . Pays . 195. 203-209 (1994)) 를 포함한다. 많은 단백질이 PEG 개질 동안에 활성을 유지하고 있는 것으로 보인다 하더라도, 일부 경우, 단백질 아미노기를 통한 중합체 부착은 특정 리신 잔기의 유도체화가 단백질을 불활성화시키는 경우처럼 불필요할 수 있다 (Suzuki, T., 등, Biochimica et Biophysica Acta 788, 248-255 (1984)). 따라서, 시스테인과 같은 부착을 위한 또다른 표적 아미노산을 이용하여 PEG 에 의해 단백질을 개질하는 추가의 방법을 갖고 있는 것이 유리할 것이다. 시스테인상의 단백질 티올기로의 부착은, 시스테인이 전형적으로 리신보다 단백질에 덜 있다는 점에서, 아미노산을 함유하는 상기 티올로의 공액 시 단백질 비활성화의 가능성을 감소시키는 이점을 제공할 수 있다.
티올-선택성 반응성 말단기를 가진 폴리에틸렌 글리콜 유도체는 말레이미드, 비닐 술폰, 요오도아세트아미드, 티올, 및 디술피드를 포함한다. 상기 유도체는 모두 단백질의 시스테인 측쇄에 커플링하는 데 이용된다 (Zalipsky, S. Bioconjug. Chem. 6, 150- 165 (1995) ; Greenwald, R. B. 등, Crit . Rev . Ther . Drug Carrier Syst. 17, 101-161 (2000) ; Herman, S., 등, Macromol . Chem . Phys . 195, 203- 209 (1994)). 그러나, 많은 상기 시약은 그의 합성 및 정제에 있어서의 어려움으로 인해 광범위하게 이용되지 못하였다. 예를 들어, Woghiren 등의 방법 (Woghiren, C., 등, Bioconjugate Chem ., 4, 314- 318 (1993)) 은 특정 티올-보호된 PEG 시약을 형성하기 위해 일련의 합성 전환 및 정제 단계를 필요로 한다. 우선, 메톡시-PEG 는 토실 클로라이드와 반응하고, 이어서 반응 생성물을 정제하여, 상응하는 토실-PEG 를 복구한다. 다음, 토실-PEG 는 티오아세테이트염과의 반응으로 상응하는 PEG-티오아세테이트로 전환되고, 또다른 정제 단계가 이어진다. 다음, 메탄올로의 알콜용해가 PEG-티오아세테이트 상에서 수행되고, 칼럼 크로마토그래피가 이어져서, 정제된 티올레이트염을 수득하며, 이는 디티오트레이톨로 환원되어, 상응하는 PEG-티올을 형성한다. 다음, 생성된 PEG 티올은 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제된다. 다음, PEG-티올과 4,4'-디피리딜 디술피드의 반응에 의해 티올의 보호된 형태가 제조되고, 이어서 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제된다. 요약하자면, PEG 를 그의 티올-보호된 형태로의 전환시키기 위한 Woghiren 의 방법은 5 개의 상이한 반응 단계 및 추가의 5 개의 분리된 정제 단계가 필요하며, 상기 및 다른 유사한 합성 접근을 불필요하고 극도로 시간 소모적으로 만든다.
1 관능적 티올 특정 PEG 유도체로의 대부분의 기존의 경로에 있어서의 또다른 분명한 결함은, 다수의 정제 단계에도 불구하고 1 관능적 PEG 원재료에 존재하는 디올로부터 발생하는 2 관능화된 PEG 를 제거하는 있어서의 무능력이다.
따라서, PEG 분절의 본래의 모습을 유지하면서 (즉, 온화한 반응 조건하에서 수행되는), 수월하고 간단한 즉, 최소의 반응 및 정제 단계를 필요로 하며, 추가로 고수율로 고순도의 티올-선택성 PEG 유도체를 공급할 수 있는, 고순도, 활성화된 PEG-티올 및 다른 티올-선택성 PEG 유도체의 제조 방법이 필요하다. 상기 방법은 출원인에 의해 개발되었으며, 하기에 더욱 상세히 기술된다.
한 측면에서, 본 발명은 수용성 중합체 (티올 선택성 기, 즉, 티올, 티올레이트, 또는 보호된 티올과 같은 티올과 우선적으로 반응하는 기인 하나 이상의 말단을 가진 중합체) 의 티올-선택성 유도체의 제조 방법을 제공한다. 더욱 특히, 상기 방법은 (i) 여기에서 일반적으로 "POLY- E" 라고 하는 친전자체 (-E) 로 활성화된 말단을 가진 "POLY" 라고 하는, 수용성 중합체 분절을 포함하는 수용성 중합체를 제공하고, 이어서 (ii) 상기 중합체를 친전자체 및 친핵체 사이의 반응을 향상시키기에 효과적인 조건하에서 친핵체 (-NU) 및 티올-선택성 잔기 둘 다를 포함하는 반응체 분자와 반응시켜, "POLY-S" (여기서, 상기 용어에서 "S" 는 티올-선택성 잔기를 말함) 라고 하는 티올-선택성 말단을 가진 수용성 중합체를 형성하는 단계를 포함한다. 반응체 분자 내에 함유될 수 있는 티올-선택성 잔기는 티올, 보호된 티올, 디술피드, 말레이미드, 비닐 술폰, 요오도아세트아미드, 및 오르토피리딜 디술피드를 포함한다.
본 발명의 한 특별한 구현예에서, 티올-선택성 잔기는 티올, 보호된 티올, 및 디술피드로 이루어진 군으로부터 선택된다.
반응체 분자 내에 함유된 티올-선택성 잔기가 디술피드 결합인 경우, 상기 방법은 말단 티올기를 가진 수용성 중합체 (여기서, "POLY-SH" 라 함) 를 형성하기 위해, 추가로 POLY-S 내에서 디술피드 결합을 환원시키는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 한 구현예에서, 예를 들어, 단계 (i) 에서 제공된 중합체가 말단-캡핑 (end-capped) 된 선형 중합체 또는 단지 하나의 반응성 친전자성 말단만을 가진 1 관능적으로-활성화된 중합체인 경우, 단계 (ii) 로부터의 POLY-S 생성물 조성물은 약 95 몰% 초과의 목적하는 1 관능적으로 치환된 POLY-S 를 포함한다. 바람직하게는, 상기 구현예에서, 단계 (i) 에서 제공된 중합체는 전체 중합체 성분에 대해, 폴리알킬렌 옥시드 디올 및/또는 폴리알킬렌 옥시드 디올의 2 관능적 친전자적으로-활성화된 유도체의 조합의 약 5% 미만을 함유하는 폴리알킬렌 옥시드이다.
또다른 관련 구현예에서, 예를 들어, 개시 중합체가 하나의 반응성 친전자성 말단만을 가진 말단-캡핑된 또는 1 관능적으로-활성화된 중합체인 경우, 단계 (ii) 로부터의 POLY-S 생성물은 2 관능적으로-치환된 POLY-S 의 약 5% 미만을 포함한다.
추가의 구현예에서, 단계 (i) 의 중합체는 카르복실산 또는 활성화된 카르복실산 유도체인 친전자체 (-E) 를 포함한다. 상기 친전자체는 카르복실산, 아미드, 카르복실산 에스테르, 카르보네이트 에스테르, 카르본산, 산 할라이드, 및 무수물을 포함한다. 본 발명의 한 특정 구현예에서, 단계 (i) 의 중합체는 폴리에틸렌 글리콜의 N-히드록시숙신이미딜 프로피오네이트 또는 N-히드록시숙신이미딜 부타노에이트 유도체이다.
또다른 구현예에서, 친전자체, E 는 카르복실산 또는 활성화된 카르복실산 유도체이며, POLY-E, 또는 그의 전구체는 반응 단계 전에 정제된다. 바람직한 정제 방법은 화학적 및 크로마토그래프적 방법을 포함한다. 상기 방법의 바람직한 구현예에서, POLY-E 는 반응 단계 전에 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제된다. 더욱 특정 구현예에서, POLY-E 는 이온 교환 크로마토그래피 또는 IEC 에 의해 정제된다.
반응체 분자는 친핵체 (-NU) 를 포함한다. 적합한 친핵체는 일차 아미노, 이차 아미노, 히드록시, 이미노, 티올, 티오에스테르, 및 이용가능한 경우 그의 음이온성 대조물을 포함한다. 특별한 구현예에서, 반응체 분자는 일차 또는 이차 아미노기인 친핵체를 포함한다.
또다른 구현예에서, 반응체 분자 일반적으로 말단기로서 동일한 친핵체 (-NU) 를 포함하는 대칭성의 디술피드 시약으로, 여기서 상기 반응 단계는 중심 디술피드 결합을 가진 대칭성의 중합체를 형성한다. 특정 구현예에서, 친전자적으로 활성화된 중합체와의 반응을 위한 분자는 시스타민 또는 시스테아민이다. 대안적으로, 반응체 분자는 아민염으로서 임의로 보호된 N-(2-아미노-에틸)3-말레이미도-프로피온아미드이다.
티올-선택성 잔기가 티올인 방법의 추가의 구현예에서, 상기 방법은 추가로 POLY-S 티올을 단백질의 티올 또는 보호된 티올기와 반응시켜 일반적으로 여기에서 POLY-S-S-단백질이라 하는 디술피드-연결 중합체-단백질 컨쥬게이트를 형성하는 단계를 포함한다.
본 발명은 추가로 상기 방법에 의해 생성되는 디술피드-연결 중합체 단백질 컨쥬게이트를 제공한다.
또다른 측면에서, 본 발명은 일반적으로 여기에서 POLY-S 라 하는, 상기 방법에 의해 생성되는 티올-선택성 말단을 가진 수용성 중합체를 포함한다. 실례의 티올-선택성기는 티올, 보호된 티올, 디술피드, 말레이미드, 비닐 술폰, 요오도아세트아미드 및 요오도아세테이트와 같은 α-할로아세틸 화합물, 수은, 아릴 할라이드, 디아조아세테이트, 및 오르토피리딜 디술피드를 포함한다.
본 발명에 이용하기 적합한 수용성 중합체 분절은 폴리비닐피롤리돈, 폴리비닐알콜, 폴리아크릴로일모르폴린, 폴리옥사졸린, 및 폴리옥시에틸화된 폴리올을 포함한다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 중합체는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 과 같은 폴리알킬렌 옥시드이다.
본 발명의 중합체는 추가로 C1-C20 알콕시, 바람직하게는 메톡시, 에톡시 또는 벤질옥시와 같은 말단-캡핑기 (end-capping group) 를 포함한다.
본 발명의 또다른 구현예에서, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜 중합체와 같은 중합체는 약 200 내지 약 100,000 달톤, 또는 약 200 내지 약 60,000 달톤, 또는 약 500 내지 약 40,000 달톤으로 이루어진 군으로부터 선택되는 공칭 평균 분자 질량을 가진다. 바람직한 구현예에서, 중합체는 약 20,000 내지 약 40,000 달톤 범위의 분자량을 가진다. 한 바람직한 폴리에틸렌 글리콜 중합체는 약 20,000 달톤의 분자량을 가진다.
본 발명의 방법 및 조성물에 이용하기 적합한 중합체는 선형, 분지형, 포크형 (forked) 및 다중-팔 (multi-armed) 을 포함한 많은 상이한 기하학구조 (geometry) 를 가질 수 있다. 선형 구조를 가진 중합체는 1 관능적, 동종 2 관능적 (homodifunctional) 및 헤테로 2 관능적 중합체를 포함한다.
또다른 구현예에서, 본 발명에 이용되기 위한 중합체 분절은 가수분해가능한 연결을 포함할 수 있다.
또다른 측면에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 수용성 중합체의 티올 유도체의 제조 방법을 제공한다. 단계 (i) 은 여기에서 구체적으로 POLY-L0 ,1-E (I) 이라 하는 친전자적으로-활성화된 중합체를 제공하는 것을 포함한다. 선행 구조에서, POLY 는 수용성 중합체 분절이고, Lo 가 링커의 부재를 지시하고 L1 이 상기 링커의 존재를 지시하는 경우, L 은 임의의 링커이며, E 는 친전자체이다. 단계 (ii) 는 E 및 NU 사이에 반응을 촉진시키기에 효과적인 조건하에, POLY-L0 ,1-E 를 더욱 구체적으로 여기에서 (NU-Y-S-)2 라고 하는 대칭성의 디술피드 시약과 반응시켜서 (여기에서, NU 는 친핵체이고, Y 는 "NU" 및 티올-선택성 기, 이 경우 디술피드 사이에 삽입된 기이며, S 는 황 원자임), POLY-L0 ,1-X-Y-S-S-Y-X-L0 ,1-POLY ((POLY-L0,1-X-Y-S-)2), (II) (여기서, X 는 E 및 NU 사이의 반응으로부터 생성되는 기임) 를 형성하는 것을 포함한다. 바람직한 Y 기는 탄소수 약 2 내지 약 10 을 포함하는 알킬렌, 치환된 알킬렌, 시클로알킬렌, 치환된 시클로알킬렌, 아릴, 및 치환된 아릴로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또다른 구현예에서, 상기 방법은 추가로 (POLY-L0 ,1-X-Y-S-)2 에서 디술피드 결합을 환원시켜, POLY-L0 ,1-X-Y-SH, (III) (여기서, "-SH" 는 티올임) 를 형성하는 (iii) 의 단계를 포함할 수 있다.
중합체에 함유되어 있는 바람직한 L 은 C1-C10 알킬 및 C1-C10 치환된 알킬을 포함한다. 한 구현예에서, 링커는 (CH2)1, 2, 3, 4 및 5 로 이루어진 군으로부터 선택된다.
대표적인 E 는 카르복실산, 카르복실산 에스테르, 아미드, 카르보네이트 에스테르, 카르본산, 산 할라이드, 및 무수물과 같은 카르복실산 또는 활성화된 카르복실산 유도체를 포함한다. 한 특별한 구현예에서, E 는 숙신이미딜 에스테르이다.
대칭성의 디술피드 시약에서 NU 는 아미노, 히드록시, 이미노, 및 티올을 포함한다. 한 특정 구현예에서, NU 는 -NH2 이다.
POLY-L0 ,1-X-Y-S-S-Y-X-L0 ,1-POLY ((POLY-L0 ,1-X-Y-S-)2) 에 함유되어 있는 생성 X 기는 아미드, 카르바메이트, 카르보네이트 에스테르, 에테르, 및 티오에스테르를 포함한다.
한 구현예에서, POLY 는 구조 -(CH2CH2O)nCH2CH2- (여기서, n 은 10 내지 약 4,000, 바람직하게는 약 20 내지 약 1,000 의 범위임) 를 포함한다.
또다른 구현예에서, POLY 는 폴리에틸렌 글리콜과 같은 말단-캡핑된 폴리알킬렌 옥시드이고, L 은 Lo 또는 -CH2- 이며, E 는 N-히드록시숙신이미딜 에스테르이다.
또다른 구현예에서, 대칭성의 디술피드 시약은 시스타민 (cystamine) (여기서, NU 는 일차 아미노이고, Y 는 -(CH2)2 임) 이다.
또다른 측면에서, 본 발명은 중합체-단백질 컨쥬게이트의 제조 방법을 제공하는데, 상기 방법은 : (i) 친전자적으로-활성화된 중합체, POLY-L0 ,1-E (여기서, POLY, L, 및 E 는 이전에 정의된 바와 같음) 를 제공하고, (ii) E 및 NU 사이의 반응을 촉진시키기에 효과적인 조건하에서, POLY-L0 ,1-E 를 대칭성의 디술피드 시약, (NU-Y-S-)2 (여기서, NU, Y 및 S 는 이전에 정의된 바와 같음) 와 반응시켜, POLY-L0,1-X-Y-S-S-Y-X-L0,1-POLY ((POLY-L0 ,1-X-Y-S-)2) (여기서, X 는 E 및 NU 사이의 반응으로부터 생성되는 기임) 를 형성하고, (iii) (POLY-L0 ,1-X-Y-S-)2 내의 디술피드 결합을 환원시켜, POLY-L0 ,1-X-Y-SH 를 형성하고, (iv) POLY-L0 ,1-X-Y-SH 를 단백질의 티올 또는 보호된 티올기와 반응시켜, 단백질 컨쥬게이트인 POLY-L0 ,1-X-Y-S-S-단백질,(V) 를 형성하는 단계를 포함한다.
상기 방법의 한 구현예에서, 단백질은 치료성 단백질이다.
또다른 측면에서, 본 발명은 하기 구조 :
POLY-L0 ,1-C(0)G-Y-S-W,
(VI)
를 포함하는 활성화된 중합체를 제공한다.
구조 VI 에서, G 는 0, -NH, -NR2 (여기서, R2 는 저급 알킬임) 로 이루어진 군으로부터 선택되는 헤테로원자이고, S 및 W 는 H 또는 보호기이다. 남은 변수는 이전에 정의된 바와 같다. 구조 VI 에서, -C(O)G- 는 "X" 의 특별한 구현예이다.
활성화된 중합체에서 이용되는 링커, L1 은 탄소수 1 내지 10 의 지방족 링커를 포함한다. 특별한 링커는 (CH2)1, 2, 3, 4 및 5 를 포함한다.
본 발명의 한 측면의 특별한 구현예에서, POLY 는 말단-캡핑된 폴리에틸렌 글리콜이고, L 은 부재이거나 또는 -CH2- 이고, G 는 -NH 이고, Y 는 (CH2)2 이다.
상기 기술된 중합체 및 그의 컨쥬게이트를 포함하는 조성물 또한 여기에 제공될 수 있다.
또다른 측면에서, 본 발명은 하기 구조를 포함하는 중합체-컨쥬게이트를 제공한다 :
POLY-L0 ,1-C(0)G-Y-S-S-A
(VII)
(여기서, "A" 는 활성제를 지시하고, "S-A" 는 티올기를 가진 활성제의 잔기를 지시함).
본 발명의 한 측면의 한 구현예에서, 활성제는 단백질, 펩티드, 및 소분자로 이루어진 군으로부터 선택된다.
그를 필요로 하는 대상체에 본 발명의 중합체-컨쥬게이트를 투여함으로써 생물활성제를 전달하는 방법 또한 여기에 제공된다.
본 발명의 상기 및 다른 목적 및 특성은 하기 상세한 설명과 함께 더욱 전체적으로 분명해질 것이다.
정의
여기에 이용되는 하기 용어는 지시된 의미를 가진다. 명세서 및 첨부된 청구항에서 이용되는 바와 같이, 단수는, 달리 분명하게 내용상 지시되지 않는다면 복수의 대상물을 포함한다.
본 발명의 중합체의 내용에서, "티올 선택성 유도체"는 티올-반응성 기인 하나 이상의 말단을 가진 중합체를 의미한다. 우선적으로, 티올-선택성 기는 티올기와 우선적으로 반응하는 것이다. 본 발명의 티올-선택성 중합체는 바람직하게는 일부 반응 조건하에서 티올기에 대해 사실상 선택적일 것이다. 실례의 티올-선택성 기는 말레이미드, 비닐 술폰, 오르토피리딜 디술피드, 요오도아세트아미드, 티올 (-SH), 티올레이트 (-S), 또는 보호된 티올, 즉, 그의 보호된 형태내에 있는 티올기를 포함한다. 전형적인 티올 보호기는 티오에테르, 티오에스테르, 또는 디술피드를 포함한다. 티올에 대한 실례의 보호기는 [Greene, T., 및 Wuts, Peter G.M., I "PROTECTIVE GROUPS IN ORGANIC SYNTHESIS, Chapter 6, 3rd Edition, John Wiley 및 Sons, Inc., New York, 1999 (p.454-493)] 에서 찾을 수 있다.
"활성화된 카르복실산" 또는 "활성화된 카르복실산 유도체" 는 특히, 친핵성 아실 치환에 대해, 근원 카르복실산보다 더 반응성있는 카르복실산의 기능적인 유도체를 의미한다. 활성화된 카르복실산은 산 할라이드 (예를 들어 산 클로라이드), 무수물, 아미드 및 에스테르를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
여기에 이용되는 "PEG" 또는 "폴리(에틸렌 글리콜)" 은 임의의 수용성 폴리(에틸렌 옥시드)를 포함하도록 의미된다. 전형적으로, 본 발명에 이용되기 위한 PEG 는 예를 들어, 합성 전환 동안과 같이 말단 산소(들) 가 대체되는지 아닌지에 따라, 2 가지 하기 구조 : "-(CH2CH2O)n-" 또는 "-(CH2CH2O)n-1CH2CH2-," 중 하나를 포함할 것이다. 변수 (n) 은 3 내지 4000 의 범위이고, 전체 PEG 의 말단기 및 구조는 다양할 수 있다. PEG 가 추가로 링커 잔기 (하기에 더욱 상세하게 설명됨) 를 포함할 때, 링커를 포함하는 원자는, PEG 분절에 공유적으로 부착될 때, (i) 산소-산소 결합 (-O-O-, 과산화물 연결), 또는 (ii) 질소-산소 결합 (N-O, O-N) 을 형성하지 않는다. "PEG" 는 -CH2CH2O- 인 아단위의 대부분, 즉 50% 초과를 함유하는 중합체를 의미한다. 본 발명에 이용되기 위한 PEG 는 하기에 더욱 상세하게 설명되는, 다양한 분자량, 구조 또는 기하학구조 (예를 들어, 분지형,선형, 포크형 PEG, 수지상 등) 를 가진 PEG 를 포함한다.
알파-, 오메가-디히드록실폴리(에틸렌 글리콜) 로서 알려지기도 한 "PEG 디올" 은 HO-PEG-OH (PEG 는 상기 정의와 같음) 와 같은 간단한 형태로 나타낼 수 있다.
본 발명의 중합체의 내용에서 "수용성" 또는 "수용성 중합체 분절" 은 실온에서 수용성인 임의의 분절 또는 중합체이다. 전형적으로, 수용성 중합체 또는 분절은 여과 후에 동일한 용액에 의해 전달되는 빛의 약 75% 이상, 더욱 바람직하게는 약 95% 이상을 전달할 것이다. 중량에 대해, 수용성 중합체 또는 그의 분절은 바람직하게는 약 35% (중량) 이상 수용성이며, 더욱 바람직하게는 약 50% (중량) 이상 수용성이며, 더욱 더 바람직하게는 약 70% (중량) 이상 수용성이고, 더욱 더 바람직하게는 약 85% (중량) 이상 수용성이다. 그러나, 수용성 중합체 또는 그의 분절이 약 95% (중량) 이상 수용성이거나 완전히 수용성인 것이 가장 바람직하다.
"엔드 캡핑 (end-capping)" 또는 "말단-캡핑(end-capped) 된" 기는 PEG 와 같은 중합체의 말단에 존재하는 불활성 또는 비-반응성기이다. 말단-캡핑기는 전형적인 합성 반응 조건하에서 쉽게 화학적 전환을 수행하지 않는 것이다. 말단-캡핑기는 일반적으로 알콕시기, -OR (여기서, R 은 탄소수 1 - 20 으로 이루어진 유기 라디칼임) 이고, 바람직하게는 저급 알킬 (예를 들어, 메틸, 에틸) 또는 벤질이다. "R" 은 포화된 또는 불포화될 수 있고, 아릴, 헤테로아릴, 사이클, 헤테로시클로, 및 전술한 것의 임의의 치환된 형태를 포함한다. 예를 들어, 말단-캡핑된 PEG 는 전형적으로 구조 "RO-(CH2CH2O)nCH2CH2-" (여기서, R 은 상기 정의와 같음) 를 포함할 것이다. 대안적으로, 말단-캡핑기는 또한 유익하게도 검출가능한 라벨을 포함할 수 있다. 중합체가 검출가능한 라벨을 포함하는 말단-캡핑기를 가질 때, 중합체가 커플링되는 중합체 및/또는 잔기 (예를 들어, 활성제) 의 양 또는 위치는 적합한 검출계를 이용해 결정될 수 있다. 상기 라벨은 형광 물질, 케미루민서 (chemiluminescer), 효소 라벨링에 이용되는 잔기, 열량측정 (예를 들어, 색소), 금속 이온, 방사성 잔기 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 말단-캡핑기는 또한 유익하게도 인지질을 포함할 수 있다. 중합체가 인지질과 같은 말단-캡핑기를 가질 때, 독특한 특성 (말단-캡핑된 중합체와 유사하게 유기화된 구조를 형성하는 능력과 같은) 이 중합체에 부여된다. 실례의 인지질은 제한없이, 포스파티딜콜린이라는 인지질 부류로부터 선택되는 것들이다. 특정 인지질은 제한없이, 디라우로일포스파티딜콜린, 디올레일포스파티딜콜린, 디팔미토일포스파티딜콜린, 디스테아로일포스파티딜콜린, 베헤노일포스파티딜콜린, 아라키도일포스파티딜콜린, 및 레시틴으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것들을 포함한다.
본 발명의 중합체에 대해 "비-자연 발생적" 은 그 자체로 자연 상에서 발견되지 않는 중합체를 의미한다. 본 발명의 비-자연 발생적 중합체는 그러나, 전체 중합체 구조가 자연 상에서 발견되지 않는 이상, 자연 발생적 아단위의 하나 이상의 아단위 또는 분절을 함유할 수 있다.
PEG 와 같은 본 발명의 수용성 중합체의 내용에서 "분자 중량" 은 전형적으로 1,2,4-트리클로로벤젠 내에서 크기별 배제 크로마토그래피, 빛 산란 기술, 또는 고유 속도 결정 (intrinsic velocity determination) 에 의해 결정되는 중합체의 공칭 평균 분자 질량을 말한다. 본 발명의 중합체는 전형적으로 다분산적이며, 약 1.20 미만, 및 더욱 바람직하게는 1.10 미만의 의 낮은 다분산값을 가지고 있다.
용어 "반응성" 또는 "활성화된" 은 유기 합성의 통상적인 조건하에 쉽게 또는 실용 비율 (practical ratio) 에서 반응하는 관능기를 말한다. 상기는 반응하지 않거나 또는 반응하기 위해 강한 촉매 또는 비실용적인 반응 조건을 필요로 하는 기 (즉, "비반응성" 또는 "불활성" 기) 와는 반대이다.
반응 혼합물 내의 분자에 존재하는 관능기를 참조로 "쉽게 반응성이지 않는" 또는 "불활성" 은 반응 혼합물 내 목적하는 반응을 생성하기에 효과적인 조건하에서 대부분 그대로 남아 있는 기를 지시한다.
"보호기" 는 일부 반응 조건하에서 분자 내의 특별한 화학적으로 반응성 관능기의 반응을 예방하거나 막는 잔기이다. 보호기는 보호되는 화학적으로 반응성 기의 유형뿐만 아니라 적용되는 반응 조건 및 분자 내의 추가의 반응성 또는 보호기의 존재에 따라 다를 것이다. 보호될 수 있는 관능기는 예로써, 카르복실산기, 아미노기, 히드록시기, 티올기, 카르보닐기 등을 포함한다. 카르복실산에 대한 대표적인 보호기는 에스테르 (p-메톡시벤질 에스테르와 같은), 아미드 및 히드라지드를 포함하고 ; 아미노기를 위해서는, 카르바메이트 (tert-부톡시카르보닐과 같은) 및 아미드 ; 히드록시기를 위해서는, 에테르 및 에스테르 ; 티올기를 위해서는, 티오에테르 및 티오에스테르 ; 카르보닐기를 위해서는, 아세탈 및 케탈 등을 포함한다. 상기 보호기는 당업자에게 잘 공지되어 있고, 예를 들어, 참조로써 여기에 언급된 [T.W. Greene 및 G.M. Wuts, Protecting Groups in Organic Synthesis, Third Edition, Wiley, New York, 1999] 에 기술되어 있다.
"보호된 형태" 내의 관능기는 보호기를 가지고 있는 관능기를 말한다. 여기에 이용되는 바와 같이, 용어 "관능기" 또는 그의 임의의 유사어는 그의 보호된 형태를 포함하는 것으로 의미된다.
용어 "링커 (linker)" 는 여기에서 중합체 분절 및 친전자체와 같은 내부연결 잔기를 연결하는데 임의로 이용되는 분자 또는 분자의 모임을 의미하기 위해 이용된다. 본 발명의 링커는 일반적으로 가수분해적으로 안정적이다. "생리학적으로 절단가능한" 또는 "가수분해가능한" 또는 "분해가능한" 결합은 생리학적 조건하에서 물과 반응하는 (즉, 가수분해되는) 상대적으로 약한 결합이다. 물에서 가수분해되는 결합의 성향은 2 개의 중심 원자를 연결하는 연결의 일반적인 유형뿐만 아니라 상기 중심 원자에 부착되는 치환기에 의존할 것이다. 적절한 가수분해적으로 불안정한 또는 약한 연결은 카르복실레이트 에스테르, 포스페이트 에스테르, 무수물, 아세탈, 케탈, 아실옥시알킬 에테르, 이민, 오르토에스테르, 펩티드 및 올리고뉴클레오티드, 티오에스테르, 티올에스테르, 및 카르보네이트를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
"효소적으로 분해가능한 연결" 은 하나 이상의 효소에 의해 분해되는 연결을 의미한다.
"가수분해적으로 안정한" 연결 또는 링커는, 본 발명의 목적 및 특히 본 발명의 중합체를 참조로, 정상적인 생리학적 조건하에서 가수분해적으로 안정한 원자 또는 원자의 모임을 말한다. 즉, 가수분해적으로 안정한 연결은 신장된 시간을 넘어서 임의의 상당한 범위로 생리학적 조건하에서 가수분해를 수행하지 않는다. 가수분해적으로 안정한 연결의 예는 하기를 포함하나, 이에 제한되지 않는다 : 탄소-탄소 결합 (예를 들어, 지방족 쇄에서), 에테르, 아미드, 우레탄, 아민 등. 대표적인 화학적 결합의 가수분해율은 대부분의 표준 화학 교과서에서 찾을 수 있다.
중합체의 기하학구조 또는 전체 구조에 참조되는 "분지형" 은 둘 이상의 중합체 "팔 (arms)" 을 가진 중합체를 말한다. 분지형 중합체는 2 중합체 팔, 3 중합체 팔, 4 중합체 팔, 6 중합체 팔, 8 이상의 중합체 팔을 가질 수 있다. 고도의 분지형 중합체의 한 특정한 유형은 수지상 중합체 또는 덴드리머 (dendrimer) 로, 본 발명의 목적을 위해, 분지형 중합체의 것과 다른 구조를 가지고 있는 것으로 생각된다.
"분지점 (Branch point)" 은 중합체가 선형 구조로부터 하나 이상의 추가의 중합체 팔로 쪼개지거나 또는 분지하는 하나 이상의 원자를 포함하는 분기점을 말한다.
"덴드리머 (dendrimer)" 는 모든 결합이 규칙적인 분지 패턴 및 각각이 분지점을 구성하는 반복 단위로 중심의 초점 또는 핵심으로부터 방사형으로 나와 있는 둥글고, 크기별 단일분산 중합체이다. 덴드리머는 핵심 캡슐화와 같은 특정한 수지상 상태 성질을 나타내며, 그것들을 다른 중합체 유형으로부터 독특하게 한다.
"실질적으로" 또는 "본질적으로" 는 예를 들어, 일부 주어진 양의 95% 이상으로 거의 모든 또는 완전히를 의미한다.
"알킬" 또는 "알킬렌" 기는 분자에서의 위치 및 수소가 아닌 원자로의 기의 부착점의 수에 따라서, 전형적으로 길이로 약 1 내지 20 원자 범위인 탄화수소 쇄 또는 잔기를 말한다. 상기 탄화수소 쇄가 바람직하나 그렇게 지시되지 않는다면 본질적으로 포화되지 않고, 전형적으로는 직쇄가 바람직하다 하더라도 분지형 또는 직쇄일 수 있다. 실례의 알킬기는 메틸, 에틸, 프로필, 부틸, 펜틸, 1-메틸부틸, 1-에틸프로필, 3-메틸펜틸 등을 포함한다.
"저급 알킬" 또는 "저급 알킬렌" 은 메틸, 에틸, n-부틸, i-부틸, t-부틸과 같은 탄소수 1 내지 6 을 함유하는 상기에 정의된 바와 같은 알킬 또는 알킬렌기를 말하며, 직쇄 또는 분지형일 수 있다.
"시클로알킬" 또는 "시클로알킬렌" 은 분자 내에서의 그의 위치 및 수소가 아닌 다른 원자로의 부착점의 수에 따라서, 포화된 또는 불포화된 환형 탄화수소 쇄를 말하며, 바람직하게는 탄소수 3 내지 약 12, 더욱 바람직하게는 3 내지 약 8 로 이루어진 가교된, 융합된 또는 스피로 환형 화합물과 같은 폴리환형을 포함한다.
"저급 시클로알킬" 또는 "저급 시클로알킬렌" 은 탄소수 1 내지 6 을 함유하는 시클로알킬기를 말한다.
"지환족" 은 탄소수의 고리를 함유하는 임의의 지방족 화합물을 말한다. 지환족은 하나 이상의 알킬 또는 알킬렌으로 치환되는 상기에서 정의된 바와 같은 "시클로알킬" 또는 "시클로알킬렌" 기를 함유하는 것이다.
"비-방해 치환기" 는 분자 내에 있을 때, 분자 내에 함유된 다른 관능기와 전형적으로 비-반응성인 기이다.
예를 들어 "치환된 알킬" 에서와 같이, 용어 "치환된" 은 : C3-C8 시클로알킬, 예를 들어, 시클로프로필, 시클로부틸 등 ; 할로, 예를 들어, 플루오로, 클로로, 브로모 및 요오도 ; 시아노 ; 알콕시, 저급 페닐 ; 치환된 페닐 등과 같은, 그러나 이에 제한되지 않는, 하나 이상의 비-방해 치환기로 치환된 잔기 (예를 들어, 알킬기) 를 말한다. 페닐 고리상에서의 치환을 위해서, 치환기는 임의의 배향 (즉, 오르토, 메타, 또는 파라) 에서 있을 수 있다.
"알콕시" 는 -O-R 기 (여기서, R 은 알킬 또는 치환된 알킬, 바람직하게는 C1-C20 알킬 (예를 들어, 메톡시, 에톡시, 프로필옥시, 벤질 등), 바람직하게는 C1-C7 임) 를 말한다.
여기에 이용되는 바와 같이, "알케닐" 은 하나 이상의 이중 결합, 예를 들어 에테닐, n-프로페닐, 이소프로페닐, n-부테닐, 이소부테닐, 옥테닐, 데세닐, 테트라데세닐 등을 함유하는, 길이로 1 내지 15 원자의 분지형 또는 비분지형 탄화수소기를 말한다.
여기에 이용되는 용어 "알키닐" 은 하나 이상의 삼중 결합, 에티닐, n-프로피닐, 이소프로피닐, n-부티닐, 이소부티닐, 옥티닐, 데시닐 등을 함유하는, 길이로 2 내지 15 원자의 분지형 또는 비분지형 탄화수소기를 말한다.
"아릴" 은 각각이 핵심 탄소수 5 또는 6 인 하나 이상의 방향족 고리를 의미한다. 아릴은 나프틸에서와 같이 융합될 수 있는 또는 비페닐에서와 같이 융합될 수 없는 다수의 아릴 고리를 포함한다. 아릴 고리는 또한 하나 이상의 환형 탄화수소, 헤테로아릴 또는 헤테로환형 고리로 융합되거나 융합될 수 없다. 여기에 이용되는 바와 같이, "아릴" 은 헤테로아릴을 포함한다.
"헤테로아릴" 은 1 내지 4 의 헤테로원자, 바람직하게는 N, O, 또는 S, 또는 그의 조합을 함유하는 아릴기이다. 헤테로아릴 고리는 또한 하나 이상의 환형 탄화수소, 헤테로환형, 아릴, 또는 헤테로아릴 고리와 융합할 수 있다.
"헤테로사이클" 또는 "헤테로환형" 은 불포화 또는 방향족 특성이 있거나 없으면서, 탄소가 아닌 하나 이상의 고리 원자를 가진 5-12 원자, 바람직하게는 5-7 원자의 하나 이상의 고리를 의미한다. 바람직한 헤테로원자는 황, 산소, 및 질소를 포함한다.
"치환된 헤테로아릴" 은 치환기로서 하나 이상의 비-방해기를 가진 헤테로아릴이다.
"치환된 헤테로사이클" 은 비-방해 치환기로부터 형성된 하나 이상의 측쇄를 가진 헤테로사이클이다.
"친전자체" 는 이온, 원자 또는 이온일 수 있는 원자의 모임을 말하며, 친전자성 중심부, 즉 친핵체를 찾고, 반응할 수 있는 전자인 중심부를 가지고 있다.
"친핵체" 는 이온 또는 원자 또는 이온일 수 있는 원자의 모임을 말하며, 친핵성 중심부, 즉, 친전자성 중심부를 찾고, 친전자체와 반응할 수 있는 중심부를 가지고 있다.
여기에 이용되는 "활성제" 는 어느 정도 약학적이고, 종종 이로우며, 생체 내 또는 시험관내에서 언급될 수 있는 효과를 제공하는 임의의 제제, 약물, 화합물, 물질 또는 혼합물의 조성물을 포함한다. 상기는 음식물, 음식물 보충제, 영양제, 영양약학제품, 약물, 백신, 항체, 비타민, 및 다른 이로운 제제를 포함한다. 여기에 이용되는 바와 같이, 상기 용어는 환자에서 국소 또는 전신적 효과를 생성하는 임의의 생리학적으로 또는 약학적으로 활성 성분을 추가로 포함한다.
"약학적으로 허용가능한 부형제" 또는 "약학적으로 허용가능한 담체" 는 본 발명의 조성물 내에 함유될 수 있고, 환자에서 분명한 독성 효과를 야기하지 않는 부형제를 말한다.
"약리학적으로 효과적인 양," "생리학적으로 효과적인 양" 및 "치료적으로 효과적인 양" 은 혈류 또는 표적 조직에서 활성제 및/또는 컨쥬게이트의 목적하는 수준을 제공하는데 필요한 약학적 제조물 내에 존재하는 PEG 활성제 컨쥬게이트의 양을 의미하기 위해 여기에서 교환적으로 이용된다. 정확한 양은 예를 들어, 특별한 활성제, 약학적 제조물의 성분 및 물리적 특성, 의도되는 환자 수, 환자 상황 등과 같은 무수한 요인에 따라 달라질 것이고, 여기에 제공되는 정보 및 참조 문헌을 기재로 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있다.
본 발명의 중합체의 내용에서 "다수-관능적" 은 거기에 함유되는 3 이상의 관능기 (여기서, 관능기는 동일하거나 상이할 수 있으며, 전형적으로 중합체의 말단에 존재함) 를 가진 중합체 백본을 말한다. 본 발명의 다수-관능적 중합체는 전형적으로 약 3-100 관능기, 또는 3-5O 관능기, 또는 3-25 관능기, 또는 3-15 관능기, 또는 3 내지 10 관능기를 함유하거나, 또는 중합체 백본 내에서 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 관능기를 함유할 것이다.
"2 관능적" 중합체는 전형적으로 중합체 말단에서 거기에 함유되어 있는 2 개의 관능기를 가진 중합체를 말한다. 관능기가 동일할 때, 중합체는 동종 2 관능적이라고 말한다. 관능기가 상이할 때, 중합체는 헤테로 2 관능적이라고 한다.
여기에 기술된 염기성 또는 산성 반응체는 중성, 하전된, 및 그의 임의의 상응하는 염 형태를 포함한다.
"폴리올레핀성 알콜" 은 중합체 백본에 부착되는 다중 펜던트 히드록시기를 가진, 폴리에틸렌과 같은 올레핀 중합체 백본을 포함하는 중합체를 말한다. 실례의 폴리올레핀성 알콜은 폴리비닐 알콜이다.
여기에 이용되는 바와 같이, "비-펩티드성" 은 실질적으로 펩티드 연결이 없는 중합체 백본을 말한다. 그러나, 중합체는 예를 들어, 약 50 단량체 단위 당 약 1 이하의 펩티드 연결과 같이, 반복 단량체 아단위를 따라 자리잡은 최소수의 펩티드 연결을 포함할 수 있다.
용어 "환자" 는 전형적으로 그러나 본질적으로 중합체-활성제 컨쥬게이트의 형태에 있지 않은, 본 발명의 중합체를 투여함으로써 예방되거나 또는 치료될 수 있는 조건으로부터 고통받거나 또는 그럴 수 있는 살아있는 개체를 말하며, 인간 및 동물 둘 다를 포함한다.
"임의의" 또는 "임의로" 는 실질적으로 기술된 조건이 일어나거나 또는 일어날 수 없음을 말하며, 상기 설명은 조건이 일어나는 경우 및 일어나지 않는 경우를 포함한다.
"잔기" 에 의해 하나 이상의 분자와 반응한 후에 남아 있는 분자의 부분이 의미된다. 예를 들어, 본 발명의 중합체 컨쥬게이트 내의 생물학적으로 활성 분자 잔기는 전형적으로 중합체 시약 상의 반응성 기와 생물학적으로 활성 분자 상의 반응성기의 반응으로부터 발생하는 공유 연결을 제외하지 않으나, 생물학적으로 활성 분자의 부분에 상응한다. 용어 "컨쥬게이트" 는 예를 들어, 생물학적으로 활성인 분자 또는 임의의 반응성 표면과 같은 분자가, 반응성 중합체 분자, 바람직하게는 반응성 폴리(에틸렌 글리콜) 로 공유 부착함으로써 형성되는 독립체 (entity) 를 말하는 것이다.
"시스테아민" 은 2-아미노에탄티올, 또는 H2N-(CH2)2-SH 를 말한다.
"시스타민" 은 2,2'-디티오비스(에틸아민) 또는 (H2N-(CH2)2-S-)2 를 말한다.
수용성 중합체의 티올 -선택성 유도체의 제조 방법
방법의 개요
본 발명은 단백질 또는 다른 활성제 상의 티올기와의 반응에 적합한 수용성 중합체 유도체를 제조하는 방법을 제공한다. 상기 방법에서, 하나 이상의 반응성 친전자성 말단을 가진 수용성 중합체 분절은 친핵체 (중합체의 친전자성 말단과의 반응을 위한) 및 티올-선택성 잔기 둘 다를 함유하는 2 관능적 반응체 분자 (즉, 하기에 기술된 둘 이상의 관능기를 가지고 있는 반응체 분자) 와 반응한다. 대표적인 티올-선택성 잔기는 티올, 보호된 티올, 디술피드, 말레이미드, 오가노수은, 요오도아세트아미드, 비닐 술폰, 아릴 할라이드, 디아조아세테이트, 및 오르토피리딜 디술피드와 같은 알파-할로아세틸 화합물을 포함한다. 반응은 중합체의 친전자성 말단 및 반응체 분자의 친핵성 기 사이의 반응을 촉진시키기에 효과적인 조건하에 수행되어, 중합체 및 반응체 분자 사이의 공유 부착을 형성한다. 반응은 적용되는 특별한 반응체 분자에 따라서, 티올 (예를 들어, 티올, 보호된 티올, 디술피드, 말레이미드, 비닐 술폰, 요오도아세트아미드 또는 오르토피리딜 디술피드) 과의 반응에 선택적인 말단을 가진 활성화된 중합체를 형성한다. 범용화된 반응 도식은 하기에 나타나 있다.
Figure 112011104637377-pat00001
가장 간단한 형태에서, 상기 방법은 하나의 반응 단계에서 티올-선택성 말단 (예를 들어, 티올, 보호된 티올, 또는 말레이미드) 을 가진 활성화된 폴리에틸렌 글리콜 유도체를 제공할 수 있다. 반응체 분자가 중합체의 친전자성 말단과의 반응을 위한 티올-선택성 잔기와 경합하는 친핵체를 가지고 있는 경우, 예를 들어 친핵체가 실례의 반응체 ; 시스테아민에서와 같이, 아미노기이고 잔기를 함유하는 황이 티올 또는 티올레이트인 경우, 반응체 분자 상의 티올기의 보호는 반응체의 티올-중심부에서 중합체의 반응을 예방할 필요가 있을 수 있다. 대안적으로, 두 개의 경합하는 잔기의 반응율이 확연하게 상이하다면, 반응은 반응체 분자의 친핵성 중심부가 선택적으로 또는 우선적으로 중합체의 친전자체와 반응하는 조건하에 수행될 수 있다. 다음, 티올 또는 티올레이트 및 주어진 친전자체 사이의 반응으로부터 생성되는 불필요한 반응 생성물은 추가의 정제/분리 단계에 의해 제거될 수 있다.
적합한 친전자적으로 활성화된 중합체 및 분자 반응체에 대한 상세한 설명은 하기의 단락에서 제공된다.
한 바람직한 구현예에서, 반응체 분자는 중합체의 친전자성 기와의 반응을 위한 2 개의 동일한 친핵성을 가진 대칭성의 디술피드이다. 상기 접근은, 반응체 분자 내의 잠재적으로 상이한 친핵체 사이에 경합이 존재하지 않기 때문에 유익하다. 따라서, 적합한 반응 조건 (예를 들어, 친전자적으로 활성화된 중합체의 2 배 이상의 몰 초과가 적용될 때 - 대칭성의 디술피드 내의 친핵체기의 모두와 반응하기에 충분함) 하에서, 단지 하나의 활성화된 중합체 생성물만 형성된다.
실례의 대칭성의 반응체 분자는, 황 원자가 거기에 공유 부착되는 아미노, 히드록시, 티올, 이미노, 티오에스테르 등과 같은 친핵체 (NU) 를 가지고 있는 알킬렌, 치환된 알킬렌, 시클로알킬렌, 치환된 시클로알킬렌, 아릴, 또는 치환된 아릴기와 같은 동일한 Y 기에 각각 연결된, 중심 디술피드 (-S-S-) 결합, "(NU-Y-S)2" 를 가질 것이다. 한 상기 바람직한 대칭성 반응체 분자는 시스타민이다. 친전자적으로 활성화된 중합체와 시스타민과 같은 대칭성의 디술피드 시약과의 반응은 중심 디술피드 연결의 황 원자의 각각으로부터 신장되는 동일한 중합체 분절을 가진 대칭성의 디술피드 중합체를 형성한다. 상이한 친전자적으로 활성화된 중합체 및 반응체, 시스타민으로 수행되는 설명적인 반응은 실시예 (실시예 1-3) 에서 제공된다. 친전자적으로-활성화된 중합체는 전형적으로 매우 온화한 반응 조건 (예를 들어, 실온) 하에서, 상기 접근의 또다른 이점을 제공하면서, 2 관능성 반응체 분자와 반응한다. 더욱이, 전형적인 수율은 70% 초과, 바람직하게는 80% 초과, 더욱 바람직하게는 90% 초과이고, 종종 95% 초과이다.
생성 디술피드 중합체의 대칭으로 인해, 디티오트레이톨과 같은 환원제의 작용에 의한 절단은 2 몰의 상응하는 티올-선택성 중합체 유도체 ("POLY-S") 를 형성한다.
본 발명에 이용하기 위한 바람직한 중합체 (POLY-E) 는 메톡시-PEG 프로판온산 및 메톡시-PEG 부탄산 및 그의 활성화된 형태를 포함한다. 티올-선택성 말단을 가진 특히 바람직한 중합체 유도체가 여기에 기술된 구조 (11), (13), 및 (18) 에서 제공된다.
또다른 바람직한 구현예에서, 본 발명의 중합체 유도체는 중합체 산 또는 중합체 산-당량의 개시 물질로부터 제조되는데, 친핵체와의 반응에 앞서 중합체 산이 정제된다. 중합체 산 또는 중합체 산 당량은 카르복실산의 활성화된 유도체와 같은 카르복실산 또는 카르복실산-당량인 하나 이상의 관능기 또는 말단을 가진 본 발명의 수용성 중합체이다. 중합체 산의 용도 또는 제조는 그의 소스 (source) 에 따라 중합체 개시 물질에 존재할 수 있는 PEG 디올 또는 PEG 디올-유래 불순물의 이른 제거를 허용한다는 점에서, 추가의 이점을 제공한다.
본 발명의 많은 구현예에서 이용되는 바와 같이, 종종, 친전자적으로 활성화된 PEG 와 같은 폴리에틸렌 글리콜 개시 물질은 PEG 디올 불순물을 검출가능한 양, 종종 0.5% 내지 30 중량% 초과의 범위를 함유한다. 디올 (및 그의 반응 생성물) 이 극도로 제거/분리하기가 어려울 수 있기 때문에, 디올 불순물의 임의의 양은 문제가 될 수 있다. 추가로, 그의 반응성으로 인해, PEG-디올 (및 더욱 특별하게는 그의 전환 생성물) 은 커플링 반응 동안에 생물활성제와 반응하여, 컨쥬게이트 생성물의 혼합물의 형성할 수 있다. 컨쥬게이트의 생성 혼합물은 분석하기 어려울 수 있다, 즉 존재하는 디올-유래의 불순물의 범위를 결정하기 어려울 수 있다. 더욱이, 디올-유래된 컨쥬게이트 생성물로부터 목적하는 컨쥬게이트 생성물을 분리하는 것은 극도로 어려울 수 있고, 일부 경우에 있어서는, 달성하기가 불가능할 수 있다. 특히, 메톡시-PEG-OH 와 같은 고분자량 수용성 중합체 (예를 들어, 약 30,000 달톤 초과의 분자량을 가진) 는 PEG 개시 물질의 소스 및/또는 제조 방법에 따라서, 디올을 30 중량% 이상까지 함유할 수 있다. 상기에 언급된 바와 같이, 상기 디올 및 디올-유래된 불순물은 일련의 합성 전환 및/또는 컨쥬게이트 반응을 통해 수행될 때 특히 문제가 될 수 있다. 본 발명의 방법에서와 같이, 중합체 산의 이용은 예를 들어, 크로마토그래피에 의해 POLY-E 개시 물질 (또는 그의 당량하는 전구체) 을 정제하고, 본질적으로 반응성 PEG-디올 또는 반응성 PEG-디올 유래 불순물이 없는 티올-선택성 중합체 제형물을 궁극적으로 형성할 수 있게 한다.
출원인은 반응성 중합체 유도체 또는 결정적으로 중합체 컨쥬게이트의 형성을 야기하는 반응 또는 일련의 반응들의 프론트 엔드 (front end) 에서의 PEG-디올-관련 불순물의 분리가 유익하다는 것을 알았는데, 이는 상기 단계에서의 분리/정제가 다양한 중합체 컨쥬게이트 종의 분리의 경우에 비해 더욱 쉽게 달성되기 때문이다.
대안적으로, 불활성 mPEG-디올 유래 불순물을 제거 또는 정제하기 위한 접근으로서, 단계 (i) 에서 제공된 수용성 중합체인 POLY-E 는 공동-소유인 U.S. Patent No. 6,448,369 에 기술된 바와 같이 벤질옥시-PEG 로부터 제조된 디올-프리 PEG-OH 로부터 제조될 수 있다. 상기 접근에서, 벤질옥시-PEG-OH 개시 물질은 에틸렌 옥시드의 벤질옥시드 이온인 Bz-O- 로의 중합에 의해 우선적으로 제조되어, PEG-디올을 함유한 고순도의 1 관능적 벤질옥시 PEG 를 생성한다. 모든 PEG-OH 기를 불활성 메틸 에테르로 전환하고, 이어진 단계에서 벤질옥시기를 제거한 후, 상기 방법은 순수한, 디올-프리 메톡시-PEG-OH 를 제공한다. 상기 방법을 이용하는 데 있어서, PEG-디올은 그의 비-반응성 에테르 형태로 전환되어, 상기를 생성 조성물의 불활성 성분이 되게 한다.
요약하자면, 여기에 제공되는 방법은 (i) 다수의 성가신 반응 단계를 피하고, (ii) 다수의 보호/탈보호 단계를 반드시 필요로 하지 않고, (iii) 중합체 분절이 특히 손상받기 쉽지 않은 온화한 조건하에 수행되고, (iv) 전형적으로 90% 초과의 고수율의 생성물을 생성하고, (v) 티올-선택성 말단을 가진 중합체 유도체의 신규 부류를 제공한다. 본 발명의 전체 합성 방법, 시약, 중합체 유도체, 조성물, 및 컨쥬게이트는 하기에 더욱 상세하고 전체적으로 기술될 것이다.
중합체 반응체, POLY - L 0 ,1 -E
중합체 분절, POLY
하기는 본 발명의 티올-선택성 중합체뿐만 아니라, 방법의 친전자적으로 활성화된 중합체에 적용가능한, 여기에서 POLY 라고 하는 중합체 분절을 설명한다. 본 발명에 유용한 친전자적으로-활성화된 중합체 유도체는 일반적으로 수용성 중합체 분절에 커플링되는 하나 이상의 친전자체를 포함한다. 친전자체는 중합체 분절에 직접 공유 결합할 수도 있거나, 또는 대안적으로 링커인 L 을 통해 중합체 백본에 커플링될 수 있다.
대표적인 POLY 는 폴리(에틸렌 글리콜) 과 같은 폴리(알킬렌 글리콜), 폴리(프로필렌 글리콜) ("PPG"), 에틸렌 글리콜 및 프로필렌 글리콜의 공중합체, 폴리(올레피닉 알콜), 폴리(비닐피롤리돈), 폴리(히드록시알킬메타크릴아미드), 폴리(히드록시알킬메타크릴레이트), 폴리(사카라이드), 폴리(α-히드록실산), 폴리(비닐 알콜), 폴리포스파젠, 폴리옥사졸린, 및 폴리(N-아크릴로일모르폴린) 을 포함한다. POLY 는 상기의 임의의 동종중합체, 교차 공중합체, 랜덤 공중합체, 블록 공중합체, 교차 삼중합체, 랜덤 삼중합체, 또는 블록 삼중합체일 수 있다. 수용성 중합체 분절은 반드시는 아니라도, 바람직하게는 폴리(에틸렌 글리콜) "PEG" 또는 그의 유도체이다.
중합체 분절은 임의의 많은 상이한 기하학 구조를 가질 수 있는데, 예를 들어, POLY 는 선형, 분지형 또는 포크형일 수 있다. 가장 전형적으로, POLY 는 예를 들어, 2 개의 중합체 팔을 가진 선형 또는 분지형이다. 여기에 토의되는 많은 부분이 설명의 POLY 로서 PEG 에 집중되어 있더라도, 여기에 나타난 토의 및 구조는 상기에 기술된 임의의 수용성 중합체 분절을 포함하도록 쉽게 범위가 넓혀질 수 있다.
하나 이상의 친전자적으로 활성화된 말단을 가진 임의의 수용성 중합체가 본 발명의 방법에 따라 티올-선택성 중합체를 제조하는데 이용될 수 있다. 하나의 친전자적으로 활성화된 말단만을 가진 수용성 중합체가 전형적으로 여기에서 이용되고 설명된다 하더라도, 여기에서 앞으로 설명될 바와 같이 티올 선택성 중합체로 전환되기 적합한 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 또는 그 이상의 반응성 말단을 가진 중합체가 이용될 수 있다. 유익하게도, 수-중합체 분절 상의 히드록실 또는 다른 반응성 잔기의 수가 증가함에 따라, 친전자성 기를 도입하는데 이용가능한 위치의 수가 증가한다. 수용성 중합체 분절과 관련된 히드록실 및/또는 친전자성 잔기의 수의 상한의 비-제한적 예는 약 1 내지 약 500, 1 내지 약 100, 약 1 내지 약 80, 약 1 내지 약 40, 약 1 내지 약 20, 및 약 1 내지 약 10 을 포함한다.
현재 바람직한 POLY 로의 전환에서 PEG 는, 하기에 더욱 전체적으로 기술될 말단-캡핑된 PEG, 포크형 PEG, 분지형 PEG, 펜던트 PEG, 및 단량체 아단위를 분리하는 하나 이상의 분해가능한 연결을 함유한 PEG 를 포함하여, 임의의 그의 선형, 분지형 또는 다중-팔 형태에서 폴리(에틸렌 글리콜) 을 포함한다.
PEG 중합체 분절은 하기를 포함한다 : -(CH2CH2O)n-CH2CH2- (여기서, (n) 은 전형적으로 약 3 내지 약 4,000, 또는 약 3 내지 약 3,000, 또는 더욱 바람직하게는 약 20 내지 약 1,000 의 범위임).
POLY 는 말단-캡핑일 수 있다 (여기서, PEG 는 불활성 말단-캡핑기로 말단에서 캡핑되어 있음). 바람직한 말단-캡핑된 PEG 는 알콕시, 치환된 알콕시, 알케닐옥시, 치환된 알케닐옥시, 알키닐옥시, 치환된 알키닐옥시, 아릴옥시, 치환된 아릴옥시과 같은 말단-캡핑 잔기를 가진 것들이다. 바람직한 말단-캡핑기는 메톡시, 에톡시, 및 벤질옥시과 같은 C1-C20 알콕시이다. 말단-캡핑기는 또한 유익하게도 인지질을 포함할 수 있다. 실례의 인지질은 디라우로일포스파티딜콜린, 디올레일포스파티딜콜린, 디팔미토일포스파티딜콜린, 디스테아로일포스파티딜콜린, 베헤노일포스파티딜콜린, 아라키도일포스파티딜콜린, 및 레시틴과 같은 포스파티딜콜린을 포함한다.
현재 중합체 분절인 POLY 를 포함하는 임의의 구조에 관해서, POLY 는 하기에 상응하거나 또는 포함할 수 있다 :
"Z-(CH2CH2O)n-" 또는 "Z-(CH2CH2O)n-CH2CH2-",
(여기서, n 은 약 3 내지 약 4000, 또는 약 10 내지 약 4000 이고, Z 은 반응성 기 또는 말단-캡핑기일 수 있는 관능기이거나 또는 관능기를 포함함). Z 의 예는 적용가능한 그의 활성화되고 보호된 형태를 포함하여, 히드록시, 아미노, 에스테르, 카르보네이트, 알데히드, 아세탈, 알데히드 히드레이트, 케톤, 케탈, 케톤 히드레이트, 알케닐, 아크릴레이트, 메타크릴레이트, 아크릴아미드, 술폰, 티올, 카르복실산, 이소시아네이트, 이소티오시아네이트, 히드라지드, 우레아, 말레이미드, 비닐술폰, 디티오피리딘, 비닐피리딘, 요오도아세트아미드, 알콕시, 벤질옥시, 실란, 지질, 인지질, 비오틴, 및 플루오레신을 포함한다. N-히드록시숙신이미딜 에스테르, 1-히드록시벤조트리아졸릴 카르보네이트, 아민, 비닐술폰, 말레이미드, N-숙신이미딜 카르보네이트, 히드라지드, 숙신이미딜 프로피오네이트, 숙신이미딜 부타노에이트, 숙신이미딜 숙시네이트, 숙신이미딜 에스테르, 글리시딜 에테르, 옥시카르보닐이미다졸, p-니트로페닐 카르보네이트, 알데히드, 오르토피리딜-디술피드, 및 아크릴로일과 같은 관능기가 바람직하다.
중합체 반응체 (및 상응하는 생성물) 는 예를 들어, 2 개의 친전자체가 중심 POLY, 예를 들어, PEG 에 의해 내부연결되는 덤벨-형 또는 2 관능성 선형 구조를 가질 수 있다. 더욱 구체적으로는, 상기 POLY 는 구조 E1-PEG-E2 (여기서, E1 및 E2 는 여기에 기술된 독립적으로 선택되는 친전자체임) 로 나타내어질 수 있다. 바람직하게는, E1 및 E2 는 동일하다. 상기 분류에 속하는 실례의 PEGs 는 실시예 3, 예를 들어, (15) 및 (16) 에서 제공된다. 추가의 예는 참조로써 여기에 삽입된 내용인 U.S. Patent No. 5,900,461 에서 제공된다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 티올-선택성 중합체 또는 그의 전구체에 관해서 특히, 관능기인 Z 는 "L0 ,1-X-Y-S" 에 상응하여, 예를 들어, S-Y-X-L0 ,1-POLY-L0 ,1-X-Y-S, VIII 과 같은 중합체 분절의 어느 한 쪽상에서 동일한 기를 가진 동종-2 관능적 티올-선택성 중합체를 제공할 수 있다.
상기 및 다른 관능기인 Z 는 여기에 참조로써 모두 삽입된 하기 참조에 기술되어 있다 : N-숙신이미딜 카르보네이트 (예를 들어, U.S. Patent Nos. 5,281,698, 5,468,478 참조), 아민 (예를 들어, Buckmann 등, Makromol. Chem. 182:1379 (1981), Zalipsky 등, Eur. Polym. J. 19:1177 (1983) 참조), 히드라지드 (예를 들어, Andresz 등, Makromol. Chem. 179:301 (1978) 참조), 숙신이미딜 프로피오네이트 및 숙신이미딜 부타노에이트 (예를 들어, Olson 등, in Poly(ethylene glycol) Chemistry & Biological Applications, pp 170-181, Harris & Zalipsky Eds., ACS, Washington, DC, 1997 참조 ; 또한 U.S. Patent No. 5,672,662 참조), 숙신이미딜 숙시네이트 (예를 들어, Abuchowski 등, Cancer Biochem. Biophys. 7:175 (1984) 및 Joppich 등, Makromol. Chem. 180:1381 (1979) 참조), 숙신이미딜 에스테르 (예를 들어, U.S. Patent No. 4,670,417 참조), 벤조트리아졸 카르보네이트 (예를 들어, U.S. Patent No. 5,650,234 참조), 글리시딜 에테르 (예를 들어, Pitha 등, Eur. J. Biochem. 94:11 (1979), Elling 등, Biotech. Appl. Biochem. 13:354 (1991) 참조), 옥시카르보닐이미다졸 (예를 들어, Beauchamp, 등, Anal. Biochem. 131:25 (1983), Tondelli 등, J. Controlled Release 1:251 (1985) 참조), p-니트로페닐 카르보네이트 (예를 들어, Veronese, 등, Appl. Biochem. Biotech., 11:141 (1985); 및 Sartore 등, Appl. Biochem. Biotech., 27:45 (1991) 참조), 알데히드 (예를 들어, Harris 등, J. Polym. Sci. Chem. Ed. 22:341 (1984), U.S. Patent No. 5,824,784, U.S. Patent 5,252,714 참조), 말레이미드 (예를 들어, Goodson 등, Bio/Technology 8:343 (1990), Romani 등, in Chemistry of Peptides and Proteins 2:29 (1984), 및 Kogan, Synthetic Comm. 22:2417 (1992) 참조), 오르토피리딜-디술피드 (예를 들어, Woghiren, 등, Bioconj. Chem. 4:314 (1993) 참조), 아크릴로일 (예를 들어, Sawhney 등, Macromolecules, 26:581 (1993) 참조), 비닐술폰 (예를 들어, U.S. Patent No. 5,900,461 참조).
또, 기술된 POLY 유형은 선형 중합체 분절, 및 또한 분지형 또는 포크형 중합체 분절을 포함하는 것을 의미한다. 중합체 분절이 분지형인 경우, POLY 구조는, 예를 들어 전체 POLY 구조의 부분을 형성하는 중합체 팔에 상응할 수 있다. 대안적으로, POLY 가 포크형 구조를 가지는 경우, POLY 는 예를 들어, 분지점 앞의 중합체 분절의 선형 부분에 상응할 수 있다.
POLY 는 또한 2 팔, 3 팔, 4 팔, 5 팔, 6 팔, 7 팔, 8 이상의 팔을 가진 분지형 PEG 분자를 포함한다. 본 발명의 티올-선택성 중합체를 제조하기 위해 이용되는 분지형 중합체는 2 내지 300 또는 그러한 반응성 말단을 어디에서나 가질 수 있다. 2 또는 3 중합체 팔을 가진 분지형 중합체 분절이 바람직하다. U.S. Patent No. 5,932,462 에 기술된 바와 같은 설명의 분지형 POLY 는 하기 구조에 상응한다 :
Figure 112011104637377-pat00002
상기 표현에서, R" 은 H, 메틸 또는 PEG 와 같은 비반응성 잔기이고, P 및 Q 는 비-반응성 연결이다. 바람직한 구현예에서, 분지형 PEG 중합체 분절은 메톡시폴리(에틸렌 글리콜) 디치환된 (disubstituted) 리신이다.
상기 특별한 분지형 구성에서, 분지형 중합체 분절은 중합체 반응체의 반응성 친전자성 기 또는 티올-선택성 중합체 생성물의 X 기의 위치화에 대한 "C" 분지점으로부터 신장된 단일 반응성 위치를 가지고 있다. 본 발명에 이용되는 것과 같은 분지형 PEG 는 전형적으로 4 개 미만의 PEG 팔을 가질 것이고, 더욱 바람직하게는 2 또는 3 개의 PEG 팔을 가질 것이다. 상기 분지형 PEG 는 그의 선형 PEG 대조물보다 더 크고, 더 짙은 중합체 구름과 커플링되는 단일 반응성 위치를 가지는 이점을 제공한다. 상기와 같은 친전자성 기를 가진 설명의 분지형 중합체는 Nektar (Huntsville, Alabama) 에서 시판되고, mPEG2-N 히드록시숙신이미드를 포함한다.
본 발명의 설명의 분지형 중합체 반응체 및 상응하는 티올-선택성 중합체는 각각 하기에 나타낸 구조를 가지고 있다 :
Figure 112011104637377-pat00003
(여기서, X, Y, 및 S 는 여기에 기술되어 있음). 구조 IX-B 에서, X 는 C(0)-G (여기서, G 는 -NH 임) 에 상응할 수 있다.
본 발명의 중합체의 제조에 이용되기 위한 분지형 중합체는 추가로 화학식 R(POLY)n 으로 더욱 일반적으로 나타나는 것들을 포함한다 (여기서, R 은 PEG 와 같은 2 이상의 POLY 팔을 신장하는 것으로부터의 중심 또는 핵심 분자임). 변수 n 은 POLY 팔의 수를 나타낸다 (여기서, 각각의 중합체 팔은 독립적으로 말단-캡핑 될 수 있거나 또는 대안적으로 그의 말단에서 반응성 관능기를 가질 수 있음). 전형적으로, 하나 이상의 중합체 팔은 말단 관능기를 가지고 있다. 본 발명의 상기 다중-팔 구현예에서, 각각의 PEG 팔은 전형적으로 그의 말단에서 친전자체 (또는 이전에 기술된 바와 같이 친전자체 및 친핵체 사이에서 상응하는 반응 생성물 ) 를 가지고 있다. 일반적으로 화학식 R(PEG)n 으로 나타내는 것들과 같은 분지형 PEG 는 상기에서 2 중합체 팔 내지 약 300 중합체 팔 (즉, n 은 2 내지 약 300 의 범위임) 을 가지고 있다. 바람직하게는, 상기 분지형 PEG 는 2 내지 약 25 중합체 팔, 더욱 바람직하게는 2 내지 약 20 중합체 팔, 더욱 더 바람직하게는 2 내지 약 15 이하의 중합체 팔을 가지고 있다. 3, 4, 5, 6, 7 또는 8 팔을 가진 다중-팔 중합체가 가장 바람직하다.
상기에 기술된 바와 같은 분지형 PEG 내의 바람직한 핵심 분자는 폴리올이다. 상기 폴리올은 에틸렌 글리콜, 알칸 디올, 알킬 글리콜, 알킬리덴 알킬 디올, 알킬 시클로알칸 디올, 1,5-데칼린디올, 4,8-비스(히드록시메틸)트리시클로데칸, 시클로알킬리덴 디올, 디히드록시알칸, 트리히드록시알칸 등을 포함하여, 탄소수 1 내지 10 및 1 내지 10 개의 히드록시기를 가진 지방족 폴리올을 포함한다. 만니톨, 소르비톨, 이노시톨, 자일리톨 (xylitol), 퀘브라치톨 (quebrachitol), 트레이톨 (threitol), 아라비톨, 에리트리톨 (erythritol), 아도니톨, 두시톨 (ducitol), 파코스 (facose), 리보스, 아라비노스, 크실로스 (xylose), 릭소스 (lyxose), 람노스 (rhamnose), 갈락토스, 글루코스, 프룩토스 (fructose), 소르보스 (sorbose), 만노스, 피라노스 (pyranose), 알트로스 (altrose), 탈로스 (talose), 타기토스 (tagitose), 피라노시드 (pyranoside), 수크로스, 락토스, 말토스 등과 같은 직쇄 또는 닫힌-고리 당 및 당 알콜을 포함하여, 환형지방족 폴리올 또한 적용될 수 있다. 추가의 지방족 폴리올은 글리세르알데히드, 글루코스, 리보스, 만노스, 갈락토스 및 관련 구조 이성질체의 유도체를 포함한다. 이용될 수 있는 다른 핵심 폴리올은 크라운 에테르, 시클로덱스트린, 덱스트린 및 전분 및 아밀로스와 같은 다른 탄수화물을 포함한다. 바람직한 폴리올은 글리세롤, 펜타에리트리톨, 소르비톨, 및 트리메틸올프로판을 포함한다.
본 발명의 티올-선택성 중합체에 상응하는 대표적인 다중-팔 구조는 하기에 나타나 있다 (여기서, n 은 바람직하게는 약 3 내지 약 8 의 범위임)
Figure 112011104637377-pat00004
본 발명의 티올-선택성 중합체의 제조에 이용되기 위한 추가의 다중-팔 중합체는 Nektar (Huntsville, Alabama) 사의 다중-팔 PEG 를 포함한다. 본 발명의 방법에 이용되기 위한 바람직한 다중-팔의 친전자적으로 활성화된 중합체는 하기 구조 :
Figure 112011104637377-pat00005
에 상응한다 (여기서, E 는 친전자성 기를 나타내고, PEG 는 -(CH2CH2O)nCH2CH2- 를 나타내고, m 은 3, 4, 5, 6, 7, 및 8 로 이루어진 군으로부터 선택됨). 물론, 상기 상응하는 티올-선택성 중합체 생성물은 친전자체인 E 가 "-X-Y-S" (XI -B) 로 대체되는 점을 제외하고, 상기에 나타낸 구조를 가지고 있다.
대안적으로, 중합체 분절은 전체의 포크형 구조를 가질 수 있다. 포크형 PEG 의 예는 하기 일반화된 구조에 상응한다 (여기서, 첫번째 구조는 친전자적으로활성화된 포크형 PEG 를 나타내고, 두번째 구조는 포크형 티올-선택성 중합체 생성물을 나타내는데 :
Figure 112011104637377-pat00006
여기서, PEG 는 여기에 기술된 임의의 PEG 의 형태이고, A 는 링커이고, 바람직하게는 산소, 황, 또는 -C(0)-NH- 와 같은 가수분해적으로 안정한 연결이며, F 및 F' 는 임의로 존재하는 가수분해적으로 안정한 스페이서기이고, E, X, Y 및 S 에 상응하는 다른 변수는 상기에 기술된 바와 같음). X, Y 및 S 에 대한 가능한 값의 일반적이고 구체적인 설명은 상기 구조에 적용가능하다. 실례의 링커 및 A, F 및 F' 에 상응하는 스페이서기는 국제 출원 No.PCT/US99/05333 에 기술되어 있고, 본 발명에 이용되기 위한 상기 유형의 중합체 분절을 형성하는데 유용하다. F 및 F' 는 동일하거나 상이할 수 있는 스페이서기이다. 상기의 한 특별한 구현예에서, PEG 는 mPEG 이고, A 는 -C(0)- NH- 에 상응하고, F 및 F' 는 둘 다 메틸렌 또는 -CH2- 이다. 중합체 분절의 상기 유형은 2 가지 활성제와의 반응에 유용하다 (여기서, 2 가지 활성제는 F 및 F' 의 선택에 따라, 정확하거나 또는 미리결정된 거리만큼 떨어져서 위치해 있음).
여기에 제공된 임의의 대표적인 구조에서, 하나 이상의 분해가능한 연결은 중합체 분절에 함유되어서, 처음 투여된 컨쥬게이트내에서보다 더 작은 PEG 쇄를 가진 PEG-디술피드 연결된 컨쥬게이트의 생체 내 발생을 허용할 수 있다. 적절한 생리학적으로 절단가능한 연결은 에스테르, 카르보네이트 에스테르, 카르바메이트, 술페이트, 포스페이트, 아실옥시알킬 에테르, 아세탈, 및 케탈을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 주어진 중합체 분절 내에 함유된 경우의 상기 연결은 저장 및 처음 투여시에 바람직하게 안정할 것이다. 더욱 특히, 일반적으로 상기에 기술된 바와 같이, 가수분해가능한 연결에 의해 연결된 2 이상의 중합체 분절은 하기 구조로 나타낼 수 있는데 : PEG1-W PEG2 (여기서, PEG1 및 PEG2 는 동일하거나 또는 상이할 수 있음) 및 W 는 약하고, 가수분해가능한 연결을 나타낸다. 상기 중합체 구조는 생체 내에서 제거 가능한 (즉, 절단가능한) PEG 팔 또는 PEG 팔의 부분을 함유한다.
본 발명의 컨쥬게이트를 제조하는데 이용되기 위한 선형 또는 분지형 구조를 가진 추가의 대표적인 PEG 는 Nektar Therapeutics (전에는 Shearwater Corporation, Huntsville, Alabama) 로부터 구입가능하다. 설명의 구조는 참조로써 여기에 표현적으로 삽입된 내용인 [Shearwater's 2001 catalogue entitled "Polyethylene Glycol and Derivatives for Biomedical Applications"] 에 기술되어 있다.
일반적으로, 수용성 중합체 분절의 공칭 평균 분자 질량인 POLY 는 다양할 것이다. POLY 의 공칭 평균 분자 질량은 전형적으로 하기 범위의 하나 이상에 속한다 : 약 100 달톤 내지 약 100,000 달톤 ; 약 500 달톤 내지 약 80,000 달톤 ; 약 1,000 달톤 내지 약 50,000 달톤 ; 약 2,000 달톤 내지 약 25,000 달톤 ; 약 5,000 달톤 내지 약 20,000 달톤. 수용성 중합체 분절 POLY 에 대한 실례의 공칭 평균 분자 질량은 약 1,000 달톤, 약 5,000 달톤, 약 10,000 달톤, 약 15,000 달톤, 약 20,000 달톤, 약 25,000 달톤, 약 30,000 달톤, 및 약 40,000 달톤을 포함한다. 저분자량 POLY 는 약 250, 500, 750, 1000, 2000, 또는 5000 달톤의 분자량을 가지고 있다. 실례의 티올-선택성 유도체는 실시예 1 - 3 에서 제공되는 5,000 달톤, 20,000 달톤 및 40,000 달톤으로 이루어진 군으로부터 선택되는 분자량을 가진 PEG 를 포함한다.
본 발명의 한 특별한 구현예에서, 여기에 제공되는 활성화된 티올-선택성 유도체는 하기 공칭 평균 분자 질량 중의 하나를 가진 PEG 분절을 가지고 있다 : 500, 1000, 2000, 3000, 5000, 10,000, 15,000, 20,000, 30,000 및 40,000 달톤.
아단위 수에 관하여, 본 발명에 이용되기 위한 PEG 는 전형적으로 하기 범위 중의 하나 이상에 속하는 수많은 (-OCH2CH2-) 아단위를 포함할 것이다 : 10 내지 약 4000 아단위, 약 20 내지 약 1000 아단위, 약 25 내지 약 750 아단위, 약 30 내지 약 500 아단위.
임의의 수많은 중합체 (POLY) 가 이용될 수 있더라도, 한 구현예에서, 중합체는 친수성 중합체, 즉, 폴리프로필렌 옥시드 또는 다른 유사한 소수성 중합체 분절의 약 25 미만의 아단위를 함유하는 중합체를 포함한다. 중합체는 대안적인 구현예에서, 폴리프로필렌 옥시드 또는 유사한 소수성 아단위가 없을 수 있다. 한 경우에 있어서, 중합체는 바람직하게는 플루론-형 중합체는 아니다. 또다른 특정 구현예에서, 상기 중합체는 바람직하게는 고체 지지체에 결합되어 있지 않다. 또다른 특정 경우에서, 본 발명의 중합체는 반드시 실질적으로 없더라도, 지방산기 또는 다른 친지성 잔기일 수 있는 것이다.
중합체 친전자성 기 ("E")
본 방법에 이용되기 위한 중합체는 티올-선택성 반응체 분자에 함유되어 있는 것과 같은 친핵체와의 반응에 적합한 하나 이상의 친전자체 또는 친전자성기 (-E) 를 함유한다. 실례의 친전자체는 활성화된 에스테르 (예를 들어, N-히드록시숙신이미딜 (NHS) 에스테르 또는 1-히드록시벤조트리아졸릴 에스테르), 활성 카르보네이트 (예를 들어, N-히드록시숙신이미딜 카르보네이트, 파라-니트로페닐카르보네이트, 및 1-히드록시벤조트리아졸릴 카르보네이트), 아세탈, 알데히드, 알데히드 히드레이트, 산 무수물과 같은 활성 무수물, 산 할라이드, 아릴 할라이드, 케톤, 카르복실산, 이소시아네이트, 이소티오시아네이트, 이미도에스테르 등을 포함한다. NHS 에스테르와 같은 활성화된 에스테르가 특히 바람직하다. 요약하자면, 일반화된 구조를 가진 중합체 분절인 POLY-L0 ,1-E 는 하나 이상의 말단에서 임의의 친전자성기를 가질 수 있다 (여기서, 실례의 친전자체는 상기에 기술된 것을 포함함).
중합체 링커, L
대부분의 경우, 중합체 분절은 친전자체에 직접 부착된다. 대안적으로, 중합체 분절은 사이에 끼어든 링커, L 을 통해 친전자체에 부착된다. 상기 링커가 유용한 경우, 상기는 일반적으로 여기에서 L1 으로 나타내어지고, 상기 링커가 존재하는 것을 의미한다. 상기 링커가 없는 경우, 일반적으로 여기에서 L0 로서 나타내어진다. 본 발명에 이용되기 위한 링커는 전형적으로 C1-C10 알킬 또는 C1-C10 치환된 알킬이다. 임의의 선형 저급 알킬 또는 분지형 저급 알킬 또는 그의 치환된 대조물이 유사하게 적용될 수 있더라도, 예를 들어, 중합체 분절이 PEG, 예를 들어, -(CH2CH2-O)n-CH2CH2- 인 경우와 같은 경우에, 하나의 특히 바람직한 링커는 메틸렌기인 -CH2- 이다.
정제된 친전자적으로 활성화된 중합체
Nektar, Huntsville, Alabama 사의 mPEG-숙신이미딜 프로피오네이트, mPEG-숙신이미딜 부타노에이트, mPEG-CM-HBA-NHS, mPEG2-NHS 등과 같은 크로마토그래프적으로 정제된 카르복실산 또는 그의 기능적인 당량과 같은 친전자적으로 활성화된 PEG 시약이 본 방법에서 이용되기에 특히 적합하다. 그의 산 기능성으로 인해, 상기 친전자적으로 활성화된 PEG 는 2 관능적 반응체 분자인 NU-Y-S 와의 반응에 이어서인 경우보다 전에 더 쉽게 정제되어, PEG-디올 또는 디올-유래된 불순물을 분리할 수 있다. 화학적-기재 분리 및 크로마토그래프적 방법이 바람직하더라도, POLY-E 의 정제는 당 기술분야에서 흔히 적용되는 수많은 정제 방법에 의해 달성될 수 있다. 하나의 상기 바람직한 크로마토그래피 방법은 이온-교환 크로마토그래피 또는 IEC 이다. IEC 는 예를 들어 PEG-산과 같은 임의의 하전된 분자의 분리에 유용하다. 특수 칼럼, 적용되는 pH 범위, 이온력, 완충 용액의 선택, 구배 등과 같은 전형적인 이온 교환 크로마토그래피 조건은 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있다.
일부 경우에, 겔 투과 크로마토그래피 또는 GPC 는 PEG-함유 반응체 및 유도체의 순도를 결정하기에 유용하다. 따라서, 한 경우, GPC 는 주어진 PEG-개시 물질 또는 PEG 반응에서, PEG-디올 또는 디올-유래된 불순물의 범위를 결정하는데 이용될 수 있다. 일단, 예를 들어 GPC 에 의해 PEG-디올의 존재 및 양을 결정하면, PEG-산과 같은 PEG-개시 물질 또는 유도체가 이온 교환 크로마토그래피에 의해 정제되어, 생성 PEG 조성물은 실질적으로 상기 2 관능적 PEG 불순물과 같이 존재하지 않으면서, 임의의 PEG-디올 또는 PEG-디올 관련 불순물을 제거한다.
상기 친전자적으로 활성화된 PEG 시약은 바람직하게는 실질적으로 순수하다, 즉, PEG-디올 또는 반응성 2 관능 PEG-디올 유래의 불순물이 없다. 바람직하게는, 개시 물질인 POLY-L0 ,1-E 는 임의의 상기 불순물의 약 10% 미만, 바람직하게는 임의의 상기 불순물의 약 5% 미만, 더욱 바람직하게는 임의의 상기 불순물의 약 2% 미만 또는 검출불가능한 양을 함유할 것이다. 상응하게도, 상기는 생성 티올-특정-관능화된 중합체인 POLY-S 가 바람직하게는 PEG-디올 유래의 2 관능화된 폴리에틸렌 글리콜 불순물의 분명한 양을 가지고 있지 않은 목적하는 중합체-기재 생성물의 90% 이상 또는 95% 이상 또는 98% 이상을 포함한다는 것을 의미한다. 발명의 방법을 수행할 때, 상기 불순물을 통해 수행함으로써 생성되는 상기 유형의 일부 2 관능화된 중합체 불순물, 특히 상응하는 디티올 또는 보호된 디티올은 제거하기가 매우 어려울 수 있다. 최종 활성화된 중합체 유도체에 대한 반응 도식을 통해 수행된다면, 상기 반응성 불순물은 단백질 또는 다른 활성제에 있는 기를 함유하는 티올-함유기와 같은 표적 커플링 잔기와 반응하여, 의도된 것들뿐만 아니라 중합체 컨쥬게이트을 제공할 수 있다.
티올 -선택성 반응 분자
본 발명의 방법에 따라서, POLY-L0 ,1-E 는 활성화된 중합체의 친전자성 기와의 반응을 위한 친핵체 (-NU) 및 상기에 기술된 티올-선택성 기 둘 다를 함유하는 반응체 분자와 반응한다. 일반적으로, 본 발명에서 이용되기 위한 분자 반응체는 구조 NU-Y-S (여기서, NU 는 친핵체이고, Y 는 NU 및 S 사이에 삽입된 기이고, S 는 티올-선택성기임) 를 가질 것이다.
"Y"
Y 는 전형적으로 자연상에서 선형으로 존재하나, 반드시 그렇지는 않다. Y 기의 전체 길이는 전형적으로 1 내지 약 20 원자, 또는 약 2 내지 15 원자의 범위일 것이다 (여기서, 길이로는 치환기를 세지 않고, 단일 쇄에 있는 원자의 수를 의미함). 예를 들어, -CH2- 는 전체 링커 길이에 대해 원자 1 개로 세어지고, -CH2CH2O- 는 길이에서 원자 3 개로 세어진다. 바람직하게는, Y 는 약 1 내지 약 20 원자, 또는 약 2 내지 약 15 원자, 또는 약 1 내지 약 6 원자의 길이를 가지고, 가수분해적으로 안정하다. 대표적인 Y 기는 하기 중의 임의일 수 있다 :
Figure 112011104637377-pat00007
시클로알킬렌기, 또는 치환된 시클로알킬렌기, -CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-NH-C(O)-CH2-CH2-, 및 전술한 것의 임의의 둘 이상의 조합.
본 발명에서 이용되기 위한 바람직한 Y 는 예를 들어, 알킬렌, 치환된 알킬렌, 시클로알킬렌, 치환된 시클로알킬렌, 아릴, 및 치환된 아릴을 포함한다. Y 는 전형적으로 탄소수 약 2 내지 약 10 을 포함하고, 임의로 추가의 비-방해 원자를 함유할 수 있다. 설명의 Y 기는 하기 구조를 가지고 있다 :
Figure 112011104637377-pat00008
(여기서, 각각의 경우에서 R1 및 R2 는 독립적으로 H 또는 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬, 치환된 시클로알킬, 알킬렌시클로알킬, 시클로알킬렌, 치환된 시클로알킬렌 및 치환된 알킬렌시클로알킬로 이루어진 군으로부터 선택되는 유기 라디칼임). 바람직하게는, Y 는 탄소수 2 내지 약 10 으로 이루어져 있다. 실례의 Y 기는 메틸렌 (-CH2-), 에틸렌 (-CH2CH2-), 프로필렌 (-CH2CH2CH2-), 부틸렌 (-CH2CH2CH2CH2-), 펜틸렌 (-CH2CH2CH2CH2CH2-), 2-메틸프로필, 치환된 대조물 등을 포함한다. 상기 구조의 특히 한 구현예에서, R1 및 R2 는 둘 다 H 이다.
또다른 바람직한 Y 기는 구조 : -(CH2)1,2,3,4,5-NH-C(0)-CH2CH2- 를 가지고 있다.
티올 -선택성 기, "S"
실례의 티올-선택성 기는 티올, 보호된 티올, 디술피드, 말레이미드, 비닐술폰, 요오도아세트아미드, 및 오르토피리딜 디술피드를 포함한다. 여기에 나타나 있는 "S" 는 임의의 티올-선택성 기를 나타낸다. 특히, "S" 는 티올, 티올레이트, 디술피드 또는 다른 보호된 티올기를 나타낸다. 디술피드 외에도 티올 잔기를 위한 보호기는 트리틸, 모노티오, 디티오 및 아미노티오 아세탈을 포함하여 알킬 및 벤질 티오에테르와 같은 티오에테르, 티오에스테르, 티오카르보네이트, 티오카르바메이트, 및 술페닐 유도체를 포함한다. 상기 실례의 "S" 기에 상응하는 구조는 하기에 제공된다 (여기서, 점선은 분자의 Y 부분에 부착되는 점을 지시함). A-SH 는 티올기를 가진 활성제를 말한다.
Figure 112011104637377-pat00009
친핵체
반응체 분자의 친핵체 부분은 당 기술분야에서 흔히 공지된 임의의 친핵체이다. 바람직한 친핵체는 일차 아미노, 이차 아미노, 히드록시, 이미노, 티올, 티오에스테르 등을 포함한다. 이차 아미노기는 전형적으로 메틸, 에틸과 같은 저급 알킬기를 치환기로서 가질 것이다.
따라서, 본 발명에 이용되기 위한 분자의 반응체 분자는 여기에 제공되는 NU, Y 및 S 기의 임의의 조합을 가지고 있다. 바람직한 분자 반응체는 시스타민, 설명의 대칭성 아미노 디술피드 화합물, 및 시스테아민, 아미노 티올을 포함하고, 뿐만 아니라 N-(2-아미노-에틸)-3-말레이미도-프로피온아미드이다. 실례의 분자 반응체인 시스타민으로 수행되는 반응체는 실시예 1-3 에서 제공되고, 분자 반응체인 N-(2-아미노-에틸)-3-말레이미도-프로피온아미드와의 실례의 반응 도식은 하기에 제공된다.
Figure 112011104637377-pat00010
반응 조건
분자 반응체 내의 중합체의 친전자성 기 및 친핵체 사이의 반응은, 반응을 수행하는 특별한 친전자체 및 친핵체 상에서의 경로에 따라, 전형적으로 온화한 반응 조건하에 수행되나, 반드시 그렇지는 않다. 전형적으로, 상기 반응은 약 100℃ 이하, 또는 65 ℃ 이하, 또는 40℃ 이하, 또는 약 25℃ 이하의 온도에서 수행된다. 반응 단계는 전형적으로 아세톤, 아세토니트릴, 클로로포름 및 디클로로메탄과 같은 염소화된 탄화수소, 벤젠, 톨루엔 또는 크실렌과 같은 방향족 탄화수소, 테트라히드로푸란 (THF), 디메틸포름아미드 (DMF), 또는 디메틸술폭시드와 같은 유기 용매 내에서 수행된다.
특별한 반응 조건 (용매, 반응체의 몰비율, 온도, 기압, 반응 시간) 은 특별한 반응체 및 목적하는 생성물의 선택에 따라 당업자에 의해 쉽게 결정될 것이다. 반응의 경로 또는 경과는 박막 크로마토그래피 또는 1H NMR 과 같은 임의의 무수한 흔한 분석 기술에 의해 모니터링될 수 있다.
티올-선택성 잔기가 보호된 티올인 경우, 추가의 탈보호 단계가 필요할 수 있다. 탈보호 조건은 보호기의 성질에 따라 다를 것이고, 상기는 예를 들어, [Greene, T., 및 Wuts, Peter G.M., "PROTECTIVE GROUPS IN ORGANIC SYNTHESIS, Chapter 6, 3rd Edition, John Wiley 및 Sons, Inc., New York, 1999 (p. 454-493)] 에서 기술된 바와 같이, 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있다 .
시스타민과 같은 대칭성 디술피드 시약이 분자 반응체로서 적용되는 경우, 생성 중합체 생성물은 중심 디술피드 결합을 가진 대칭성 중합체이다. 중심 디술피드 결합을 가진 대표적인 대칭성의 수용성 중합체는 반응 및 여기에 제공되는 POLY, L1, E, NU, Y 및 S 기의 설명을 기재로, 상기 염기성 특성을 가진 많은 대안적인 구조가 쉽게 계획될 수 있더라도, 구조 (10) 및 (12) 와 같이 제공된다. 다음, 대칭성 중합체 디술피드는 디티오트레이톨, Sn/HCl, Na/크실렌, 암모니아, 리튬 알루미늄 히드리드, 나트륨 보로히드리드 또는 당 기술분야에서 공지된 임의의 다른 환원제와 같은 적합한 환원제로써 환원되어, 예를 들어, (11) 및 (13) 등과 같은 상응하는 티올-말단 중합체로 전환될 수 있다.
티올 -선택성 중합체
또다른 측면에서, 본 발명은 또한 상기에 기술된 특성 및 성분을 가진 티올-선택성 중합체를 제공한다. 일반적으로, 티올-선택성 중합체는 하기 구조를 가진다 : POLY-L0 ,1-X-Y-S (여기서, 변수 L, X, Y 및 S 는 이전에 기술되었음). 상기 실례의 POLY, 링커, Y 기 및 S 기 모두는 상기 발명의 티올-선택성 중합체를 위한 일반화된 구조에 의해 포함된다. 바람직하게는, 중합체 시약의 친전자체 및 분자 반응체 상의 친핵체의 반응으로부터 생성되는 관능기인 X 는 아미드인 -C(0)-NH-, 또는 우레탄인 -O-C(O)-NH- 이다. 일부 경우에, 관능기 X 는 여기에서 "-G1-C(0)-G2-" (여기서, G1 및 G2 각각은 독립적으로 O, NH, 또는 S 와 같은 헤테로원자임) 라고 한다. 한 구현예에서, G1 은 없고, Y 는 C(0)-G 에 상응한다. 바람직하게는, G2 는 -NH 이다. 본 발명의 대칭성 중합체 디술피드는 일반적인 구조를 가지고 있는데 : (POLY-L0 ,1-X-Y-S-)2,II, 이는 여기에 기술된 POLY, 링커, 및 Y 기 모두를 포함한다.
중합체 시약의 저장
바람직하게는, 본 발명의 티올-선택성 중합체는 아르곤하 또는 질소하에서와 같은 불활성 대기하에 저장된다. 또한 본 발명의 중합체의 노출을 최소화하여 보습되도록 하는 것이 바람직하다. 따라서, 바람직한 저장 조건은 약 -15℃ 미만의 온도에서 건조한 아르곤 또는 또다른 건조한 불활성 기체 하이다. 불필요한 부반응의 속도는 더 낮은 온도에서 느리기 때문에, 저온 조건 하에서의 저장이 바람직하다. 중합체 생성물의 중합체 분절이 PEG 인 경우, PEG 부분은 산소와 천천히 반응하여, 분자의 PEG 부분을 따라서 과산화물을 형성한다. 과산화물의 형성은 궁극적으로 쇄 절단을 야기할 수 있으며, 따라서 여기에 제공되는 PEG 시약의 다분산성을 증가시킬 수 있다. 상기의 관점에서, 어두운 곳에 본 발명의 중합체를 저장하는 것이 추가로 바람직하다.
티올 -활성화된 중합체 컨쥬게이트
본 발명은 또한 여기에 기술된 임의의 티올-선택성 중합체의 반응에 의해 형성되는 컨쥬게이트를 포함한다. 특히, 본 발명의 티올-선택성 중합체는 반응에 이용가능한 하나 이상의 티올 또는 아미노기를 가진 활성제 또는 표면으로의 공액에 유용하다. 컨쥬게이트는 예를 들어, 티올, 말레이미드, 비닐술폰, 오르토피리딜디술피드와 같은 여기에 기술된 임의의 티올-선택성 기를 활성제 내에 함유된 수행가능한 티올과 반응시킴으로써 형성되는 관능기에 상응하는 구조를 가질 것이다.
예를 들어, 본 발명의 컨쥬게이트는 하기 구조를 가질 수 있다 : POLY-L0 ,1-X-Y-S-S-활성제, IV (여기서, S-S- 는 디술피드 결합임).
대안적으로, 본 발명의 컨쥬게이트는 하기 구조를 가질 수 있다 :
Figure 112011104637377-pat00011
(여기서, "-S-활성제" 는 티올 (-SH) 기를 포함하는 활성제, 바람직하게는 생물학적 활성제를 나타내고, 다른 변수는 이전에 기술된 바와 같음). 활성제가 하나의 반응성 티올기만을 함유하는 생물학적 활성제 또는 소분자인 경우, 전형적으로 단백질 내에 함유되고 공액에 수행가능한 술피드릴기의 상대적으로 낮은 수로 인해, 생성 조성물은 유익하게도 단지 단일 중합체 컨쥬게이트 종만을 함유할 수 있다. 일부 경우에, 단백질 또는 소분자 또는 다른 활성제는 공지된 위치에서 티올기를 가지도록 조작되고, 단지 단일 중합체 컨쥬게이트 종만을 포함하는 조성물을 유사하게 생성할 것이다. 상기 접근을 일반적으로 위치-특이적 개질이라고 한다.
대안적으로, 본 발명의 컨쥬게이트는 하기 구조를 가질 수 있다 :
Figure 112011104637377-pat00012
상기 구조에서, "-NH-활성제" 는 아미노기를 포함하는 활성제 또는 표면, 바람직하게는 생물학적 활성제를 나타내고, 다른 변수는 상기에 정의된 바와 같다. 일부 반응 조건하에, 말레이미드기는 단백질과 같은 활성제 내에 존재하는 것들과 같은 아미노기와 반응할 수 있다.
본 발명의 활성화된 중합체로의 커플링을 위한 시스테인 잔기는 자연발생적일 수 있거나 (즉, 그의 원래 형태에 있는 단백질에서 발생) 또는 표준 유전자 조작 기술을 이용해 자연-발생 아미노산의 자리에서 원래의 서열 내로 삽입될 수 있다. 티올기가 아미노기와 같은 다른 전형적인 중합체 부착 위치인 경우보다 단백질에 덜 있기 때문에, 중합체 유도체의 공유 부착은 표적 단백질의 더욱 선택적인 PEG 화를 야기할 수 있다. 즉, 본 발명의 중합체 유도체는 생성 중합체 컨쥬게이트 - 부모 단백질에 부착되는 중합체 유도체의 수 (모노 대 디- 대 트리-치환된 컨쥬게이트 등) 및 중합체 부착의 위치 둘 다를 초과하여 더 크게 조절할 수 있다 .
본 발명의 컨쥬게이트의 일반적인 특성은 상기에 상세히 기술되어 있다. 티올-선택성 중합체에 공유 부착되는 활성제는 하기로부터 분명하게 될 임의의 많은 유형의 분자, 독립체 (entity), 표면 등을 포함한다.
표적 분자 및 표면
본 발명의 티올-선택성 중합체는 필름, 화학적 분리 및 정제 표면, 고체 지지체, 금, 티타늄, 탄탈륨, 니오븀, 알루미늄, 스틸 및 그의 옥시드와 같은 금속/금속 옥시드 표면, 실리콘 옥시드, 거대분자, 및 소분자를 포함하는 많은 독립체에 공유 또는 비공유 결합될 수 있다. 또한, 본 발명의 중합체 및 방법은 생화학적 센서, 생체전자 스위치 및 게이트에 이용될 수도 있다. 본 발명의 중합체 및 방법은 또한 펩티드 합성, 중합체-코팅된 표면 및 중합체 그래프트의 제조를 위한 담체를 제조하는 데 적용되어, 친화성 파티셔닝 (partitioning) 을 위한 중합체-리간드 컨쥬게이트를 제고하고, 가교된 또는 비-가교된 히드로겔을 제조하고, 생반응기 (bioreactor) 를 위한 중합체-보조인자 부가물을 제조할 수 있다.
본 발명의 컨쥬게이트를 제공하는 데 이용되기 위한 생물학적인 활성제는 하기의 하나 이상일 수 있다. 적합한 제제는 예를 들어, 수면제 및 진정제, 정신 활력제, 신경 안정제, 호흡기 약물, 항경련제, 근육 이완제, 항파킨슨제 (도파민 안타고니스트), 진통제, 항-염증제, 항불안제 (불안 완화제), 식욕 억제제, 항편두통제, 근육 수축제, 항-감염제 (항생제, 항바이러스제, 항진균제, 백신), 항관절염제, 항말라리아제, 제토제, 항간질제, 기관지확장제, 사이토카인, 성장 인자, 항암제, 항혈전제, 항고혈압제, 심장혈관제, 항부정맥제, 항산화제, 항천식제, 피임제, 교감신경흥분제, 이뇨제, 지질 조절제, 항안드로겐제, 항기생충제, 항응고제, 종양제, 항종양제, 저혈당제, 영양제 및 보충제를 포함하는 호르몬제, 성장 보충제, 항장염제, 백신, 항체, 진단제, 및 조영제로부터 선택될 수 있다.
더욱 특히, 활성제는 소분자 (바람직하게는 불용성 소분자), 펩티드, 폴리펩티드, 단백질, 항체, 폴리사카라이드, 스테로이드, 뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드, 지방, 전해질 등을 포함하는 많은 구조적 분류 중 하나에 해당될 수 있으나 이에 한정되지 않는다. 바람직하게는, 본 발명의 중합체에 커플링하기 위한 활성제는 천연 술피드릴기 또는 덜 바람직하게는 천연 아미노기를 가지고 있거나, 또는 대안적으로 적합한 하나 이상의 반응성 술피드릴기 또는 아미노기를 함유하도록 개질되어 있다.
활성제의 특정 예로는 아스파리기나제, 암독소비르 (amdoxovir (DAPD)), 안티드, 비케플레민, 칼시토닌, 시아노비린, 데니루킨 디프티톡스, 에리스로포이에틴 (EPO), EPO 아고니스트 (예를 들어, 약 10-40 아미노산 길이로부터이면서, WO 96/40749 에 기술된 바와 같은 특정 핵심 서열을 포함하는 펩티드), 도네이즈 알파, 에리스로포이에시스 자극 단백질 (NESP), 인자 V, 인자 VII, 인자 VIIa, 인자 VIII, 인자 IX, 인자 X, 인자 XII, 인자 XIII, 본 뷜레브란트 인자 (von Willebrand factor)와 같은 응집 인자, 세레다제, 세레자임, 알파-글루코시다제, 콜라겐, 시클로스포린, 알파 데펜신, 베타 데펜신, 엑세딘-4, 과립구 콜로니 자극 인자 (GCSF), 트롬보포이에틴 (TPO), 알파-1 프로테이나제 억제제, 엘카토닌, 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자 (GMCSF), 피브리노겐, 필그라스팀, 성장 호르몬, 인간 성장 호르몬 (hGH), 성장 호르몬 방출 호르몬 (GHRH), GRO-베타, GRO-베타 항체, 골형성 단백질-2, 골형성 단백질-6, OP-1 과 같은 골형성 단백질 ; 산성 섬유아세포 성장 인자, 염기성 섬유아세포 성장 인자, CD-40 리간드, 헤파린, 인간 혈청 알부민, 저분자량 헤파린 (LMWH), 인터페론 알파, 인터페론 베타, 인터페론 감마, 인터페론 오메가, 인터페론 타우, 콘센서스 인터페론과 같은 인터페론 ; 인터루킨-1 수용체, 인터루킨-2, 인터루킨-2 융합 단백질, 인터루킨-1 수용체 안타고니스트, 인터루킨-3, 인터루킨-4, 인터루킨-4 수용체, 인터루킨-6, 인터루킨-8, 인터루킨-12, 인터루킨-13 수용체, 인터루킨-17 수용체와 같은 인터루킨 및 인터루킨 수용체, 락토페린 및 락토페린 절편, 황체화 호르몬 방출 호르몬 (LHRH), 인슐린, 프로-인슐린, 인슐린 유사체 (예를 들어, U.S. Patent No. 5,922,675 에 기술된 모노-아실화된 인슐린), 아밀린, C-펩티드, 소마토스타틴, 옥트레오티드를 포함하는 소마토스타틴 유사체, 바소프레신, 여포 자극 호르몬 (FSH), 인플루엔자 백신, 인슐린-라이크 성장 인자 (IGF), 인슐린트로핀, 대식세포 콜로니 자극 인자 (M-CSF), 알테플라제, 유로키나제, 레테플라제, 스트렙토키나제, 파미테플라제, 라노테플라제 및 테네테플라제와 같은 플라스미노젠 활성제, 신경 성장 인자 (NGF), 오스테오프로테게린, 혈소판-유래 성장 인자, 조직 성장 인자, 전환 성장 인자-1, 혈관 내피 성장 인자, 백혈병 억제 인자, 케라티노사이트 성장 인자 (KGF), 신경교세포 성장 인자 (GGF), T 세포 수용체, CD 분자/항원, 종양 괴사 인자 (TNF), 단핵구 화학유인성 단백질-1, 내피 성장 인자, 부갑상선 호르몬 (PTH), 글루카곤-라이크 펩티드, 소마토트로핀, 티모신 알파 1, 티모신 알파 1 IIb/IIIa 억제제, 티모신 베타 10, 티모신 베타 9, 티모신 베타 4, 알파-1 안티트립신, 포스포디에스테라제 (PDE) 화합물, VLA-4 (매우 늦은 항원-4), VLA-4 억제제, 비스포스포네이트, 호흡기세포융합바이러스 항체, 낭포성 섬유증 막 조절제 (CFTR) 유전자, 데옥시레이보뉴클레아제 (Dnase), 살균/침투 증가 단백질 (BPI), 및 항-CMV 항체를 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다. 예시적인 모노클로날 항체는 에타네르셉트 (etanercept) (IgG1의 Fc 부위에 연결된 인간 75 kD TNF 수용체의 세포외 리간드-결합 부위로 이루어진 이량체 융합 단백질), 아브식시마브(abciximab), 아펠리오모마브(afeliomomab), 바시릭시마브(basiliximab), 다클리쥬마브(daclizumab), 인플릭시마브(infliximab), 이브리튜모마브 티우에섹탄 (ibritumomab tiuexetan), 미투모마브(mitumomab), 무로모나브-CD3 (muromonab-CD3), 요오드 131 토시투모마브 컨쥬게이트 (iodine 131 tositumomab conjugate), 올리주마브 (olizumab), 리툭시마브(rituximab), 및 트라스투주마브 (trastuzumab) 를 포함한다.
공유 부착에 적합한 추가의 제제는 아미포스틴 (amifostine), 아미오다론 (amiodarone), 아미노카프론산 (aminocaproic acid), 아미노히푸레이트 소듐 (aminohippurate sodium), 아미노글루테티미드 (aminoglutethimide), 아미노레불린산 (aminolevulinic acid), 아미노살리실산 (aminosalicylic acid), 암사크린 (amsacrine), 아나그렐리드 (anagrelide), 아나스트로졸 (anastrozole), 아스파라기나제 (asparaginase), 안트라시클린 (anthracyclines), 벡사로텐 (bexarotene), 비칼루타미드 (bicalutamide), 블레오마이신 (bleomycin), 부세렐린 (buserelin), 부술판 (busulfan), 카베르골린 (cabergoline), 카페시타빈 (capecitabine), 카르보플라틴 (carboplatin), 카르무스틴 (carmustine), 클로람부신 (chlorambucin), 실라스타틴 소듐 (cilastatin sodium), 시스플라틴 (cisplatin), 클라드리빈 (cladribine), 클로드로네이트 (clodronate), 시클로포스파미드 (cyclophosphamide), 시프로테론 (cyproterone), 시타라빈 (cytarabine), 캄토테신(camptothecins), 13-시스 레티논산, 모든 트란스 레티논산 ; 다카르바진 (dacarbazine), 닥티노마이신 (dactinomycin), 다우노루비신 (daunorubicin), 데페록사민 (deferoxamine), 덱사메타손(dexamethasone), 디클로페낙 (diclofenac), 디에틸스틸베스트롤 (diethylstilbestrol), 도세탁셀 (docetaxel), 독소루비신 (doxorubicin), 에피루비신 (epirubicin), 에스트라무스틴 (estramustine), 에토포시드 (etoposide), 엑세메스탄 (exemestane), 펙소페나딘 (fexofenadine), 플루다라빈 (fludarabine), 플루드로코르티손 (fludrocortisone), 플루오로우라실, 플루옥시메스테론 (fluoxymesterone), 플루타미드 (flutamide), 폰다파리눅스 (fondaparinux), 플루베스트랜트 (fulvestrant), 감마-하이드록시부틸레이트, 겜시타빈 (gemcitabine), 에피네프린, L-도파, 히드록시우레아, 이다루비신(idarubicin), 이포스파미드 (ifosfamide), 이마티니브(imatinib), 이리노테칸 (irinotecan), 이트라코나졸 (itraconazole), 고세렐린 (goserelin), 레트로졸 (letrozole), 루코보린 (leucovorin), 레바미졸 (levamisole), 리시노프릴 (lisinopril), 로보티록신 소듐 (lovothyroxine sodium), 로무스틴 (lomustine), 메클로레타민 (mechlorethamine), 메드록시프로게스테론 (medroxyprogesterone), 메게스트롤 (megestrol), 멜팔란 (melphalan), 메르캅토푸린 (mercaptopurine), 메타라미놀 비타르트레이트 (metaraminol bitartrate), 메토트렉세이트 (methotrexate), 메토클로프라미드 (metoclopramide), 멕실레틴 (mexiletine), 미토마이신 (mitomycin), 미토탄(mitotane), 미톡산트론 (mitoxantrone), 날록손 (naloxone), 니코틴, 닐루타미드 (nilutamide), 옥트레오티드 (octreotide), 옥사리플라틴 (oxaliplatin), 파미드로네이트 (pamidronate), 펜토스타틴 (pentostatin), 필카마이신 (pilcamycin), 포르피머 (porfimer), 프레드니손 (prednisone), 프로카르바진 (procarbazine), 프로클로르페라진 (prochlorperazine), 온단세트론, 랄티트렉세드 (raltitrexed), 시롤리무스 (sirolimus), 스트렙토조신 (streptozocin), 타크롤리무스 (tacrolimus), 타목시펜 (tamoxifen), 테모졸로미드 (temozolomide), 테니포시드 (teniposide), 테스토스테론, 테트라히드로카나비놀 (tetrahydrocannabinol), 탈리도미드 (thalidomide), 티오구아닌, 티오테파, 토포테칸, 트레티노인 (tretinoin), 발루비신 (valrubicin), 빈블라스틴 (vinblastine), 빈크리스틴 (vincristine), 빈데신 (vindesine), 비노렐빈 (vinorelbine), 돌라세트론 (dolasetron), 그라니세트론 (granisetron); 포르모테롤 (formoterol), 플루티카손 (fluticasone), 루프로리드 (leuprolide), 미다졸람 (midazolam), 알프라졸람 (alprazolam), 암포테리신 B (amphotericin B), 포도피로톡신 (podophylotoxin), 뉴클레오시드 항바이러스제, 아로일 히드라존, 수마트립탄 (sumatriptan) ; 에리트로마이신 (erythromycin), 올레안도마이신 (oleandomycin), 트롤레안도마이신 (troleandomycin), 록시트로마이신 (roxithromycin), 클라리트로마이신 (clarithromycin), 다베르신 (davercin), 아지트로마이신 (azithromycin), 플루리트로마이신 (flurithromycin), 디리트로마이신 (dirithromycin), 조사마이신 (josamycin), 스피로마이신 (spiromycin), 미데카마이신 (midecamycin), 루코마이신 (leucomycin), 미오카마이신 (miocamycin), 로키타마이신 (rokitamycin), 안다지트로마이신 (andazithromycin) 및 스위놀리드 A (swinolide A) 와 같은 마크롤리드 (macrolide) ; 시프로플록사신 (ciprofloxacin), 오플록사신 (ofloxacin), 레보플록사신 (levofloxacin), 트로바플록사신 (trovafloxacin), 알라트로플록사신 (alatrofloxacin), 목시플록시신 (moxifloxicin), 노르플록사신 (norfloxacin), 에녹사신 (enoxacin), 그레파플록사신 (grepafloxacin), 가티플록사신 (gatifloxacin), 로메플록사신 (lomefloxacin), 스파플록사신 (sparfloxacin), 테마플록사신 (temafloxacin), 페플록사신 (pefloxacin), 아미플록사신 (amifloxacin), 플레록사신 (fleroxacin), 토수플록사신 (tosufloxacin), 프롤리플록사신 (prulifloxacin), 이를록사신 (irloxacin), 파주플록사신 (pazufloxacin), 클리나플록사신 (clinafloxacin), 및 시타플록사신 (sitafloxacin) 과 같은 플루오로퀴놀론; 젠타미신 (gentamicin), 네틸미신 (netilmicin), 파라메신 (paramecin), 토브라마이신 (tobramycin), 아미카신 (amikacin), 카나마이신 (kanamycin), 네오마이신 및 스트렙토마이신, 반코마이신, 테이코플라닌 (teicoplanin), 람폴라닌 (rampolanin), 미데플라닌 (mideplanin), 콜리스틴 (colistin), 다프토마이신 (daptomycin), 그라미시딘 (gramicidin), 콜리스티메테이트 (colistimethate)와 같은 아미노글리코시드 ; 폴리믹신 B (polymixin B), 카프레오마이신 (capreomycin), 바시트라신 (bacitracin), 페넴 (penem) 과 같은 폴리믹신 ; 페니실린 G, 페니실린 V와 같은 페니실린-감수성 제제를 포함하는 페니실린 ; 메티실린, 옥사실린, 클록사실린, 디클록사실린, 플록사실린, 나프실린과 같은 페니실리나제-저항성 제제 ; 암피실린, 암목시실린 및 헤타실린, 실린 및 갈람피실린과 같은 그람 음성 미생물 활성제 ; 카르베니실린 (carbenicillin), 티카르실린 (ticarcillin), 아즐로실린 (azlocillin), 메즐로실린 (mezlocillin), 및 피페라실린 (piperacillin) 과 같은 항슈도모날 페니실린; 세프포독심 (cefpodoxime), 세프프로질 (cefprozil), 세프트부텐 (ceftbuten), 세프티족심 (ceftizoxime), 세프트리악손 (ceftriaxone), 세팔로틴 (cephalothin), 세파피린 (cephapirin), 세파렉신 (cephalexin), 세프라드린 (cephradrine), 세폭시틴 (cefoxitin), 세파만돌 (cefamandole), 세파졸린 (cefazolin), 세팔로리딘 (cephaloridine), 세파클로르 (cefaclor), 세파드록실 (cefadroxil), 세팔로글리신 (cephaloglycin), 세푸록심 (cefuroxime), 세포라나이드 (ceforanide), 세포탁심 (cefotaxime), 세파트리진 (cefatrizine), 세파세트릴 (cephacetrile), 세페핌 (cefepime), 세픽심 (cefixime), 세포니시드 (cefonicid), 세포페라존 (cefoperazone), 세포테탄 (cefotetan), 세프메타졸 (cefmetazole), 세프타지딤 (ceftazidime)과 같은 세팔로스포린, 로라카르베프 (loracarbef), 및 목살락탐 (moxalactam), 아즈트레오남 (aztreonam) 과 같은 모노박탐 (monobactams); 및 이미페넴 (imipenem), 메로페넴 (meropenem), 펜트아미딘이세티오우에이트 (pentamidine isethiouate), 알부테롤 술페이트(albuterol sulfate), 리도카인 (lidocaine), 메타프로테레놀 술페이트 (metaproterenol sulfate), 베클로메타손 디프레피오네이트 (beclomethasone diprepionate), 트리암시놀론 아세트아미드 (triamcinolonee acetamide), 부데소니드 아세토니드 (budesonide acetonide), 플루티카손 (fluticasone), 이프라트로퓸 브로미드 (ipratropium bromide), 플루니솔리드 (flunisolide), 크로몰린 소듐 (cromolyn sodium), 및 에르고타민 타르트레이트 (ergotamine tartrate); 파클리탁셀 (paclitaxel)과 같은 탁산 (taxanes) ; SN-38, 및 티르포스틴 (tyrphostines) 을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 고분자에 결합하기 위해 필요한 바람직한 펩타이드 또는 단백질은 EPO, IFN-α, IFN-β, IFN-γ, 콘센서스 IFN, 인자 VII, 인자 VIII, 인자 IX, IL-2, 리미카데 (remicade (인플리시마브,infliximab)), 리툭산 (Rituxan (리툭시마브, ribuximab)), 엔브렐 (Enbrel (에타네르셉트, etanercept)), 시나기스 (Synagis (팔리비주마브 (palivizumab)), 레오프로 (Reopro (아브식시마브, abciximab)), 헤르셉틴 (Herceptin (트라스투지마브, trastuzimab)), tPA, 세리짐 (Cerizyme (이미글루세라제, imiglucerase)), 헤파티투스-B 백신 (Hepatitus-B vaccinee), rDNAse, 알파-1 프로테이나제 억제제, GCSF, GMCSF, hGH, 인슐린, FSH 및 PTH 를 포함한다.
상기 예시적인 생물학적 활성제는 가능한 유사체, 아고니스트, 안타고니스트, 억제제, 이성질체 및 그의 약학적으로 허용되는 염 형태를 포함하는 것을 의미한다. 펩티드 및 단백질에 대해, 본 발명은 그의 생물학적 활성 절편뿐만 아니라 합성, 재조합, 천연, 글리코실화된, 및 비-글리코실화된 형태를 포함하는 것으로 의도된다. 상기 생물학적 활성 단백질은, 생성 변이 단백질이 부모 (원래) 단백질의 활성도가 어느 정도 이상을 가지는 한, 치환 (예를 들어, 시스테인), 삭제 등이 된 하나 이상의 아미노산을 가진 변이체를 포함하도록 추가로 의미된다.
여기에 기술된 컨쥬게이트 또는 방법은 또한 히드로겔 제형물에까지 넓혀질 수 있다.
공액 방법
적합한 공액 조건은 중합 시약 및 활성제 사이의 공액에 영향을 미치기에 충분한 시간, 온도, pH, 시약 농도, 용매 등의 조건이다. 당 기술분야에 공지된 바와 같이, 특정 조건은 다른 것들, 활성제, 목적하는 공액의 유형, 반응 혼합물 내의 다른 물질의 존재 등에 의존한다. 임의의 특정 경우에서의 공액에 영향을 미치는 조건은 참조 문헌을 참조하여, 및/또는 일반 실험을 통해, 여기에 개시된 자료에 따라 당업자에 의해 결정될 수 있다.
실례의 공액 조건은 pH 약 6 내지 약 10, 예를 들어, pH 약 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0, 9.5 또는 10 에서 공액 반응을 수행하는 것을 포함한다. 반응은 약 5 분 내지 약 72 시간, 바람직하게는 약 30 분 내지 약 48 시간, 더욱 바람직하게는 약 4 시간 내지 약 24 시간 이하로 수행하도록 한다. 공액 반응의 온도는 반드시 그런 것은 아니라도, 전형적으로 약 0℃ 내지 약 40℃ 의 범위 내이고 ; 공액은 종종 실온 이하에서 수행된다. 공액 반응은 종종 포스페이트 또는 아세테이트 완충 용액 또는 유사한 시스템과 같은 완충 용액 내에서 수행된다.
시약 농도에 대해, 중합 시약의 초과는 전형적으로 활성제와 조합된다. 그러나, 일부 경우에서, 중합 시약 상의 활성 기의 수의 화학양론적 양 대 활성제의 양을 가지는 것이 바람직하다. 중합 시약 대 활성제의 실례의 비율은 약 1:1 (중합 시약 : 활성제), 1.5:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 8:1, 또는 10:1 의 몰비를 포함한다. 공액 반응은 실질적으로 추가의 공액이 일어나지 않을 때까지 진행되도록 하며, 이는 일반적으로 시간이 지나면서 반응의 진행을 모니터링함으로써 결정될 수 있다.
반응의 진행은 다양한 시점에서 반응 혼합물로부터 분취액을 취해, SDS-PAGE 또는 MALDI-TOF 질량 분석계 또는 임의의 다른 적합한 분석 방법에 의해 반응 혼합물을 분석함으로써 모니터링될 수 있다. 형성된 컨쥬게이트의 양 또는 남아 있는 공액되지 않은 중합체의 양에 대해 일단 안정기가 도달되면, 반응은 완료된 것으로 가정한다. 전형적으로, 공액 반응은 수분 내지 수시간 (예를 들어, 5 분 내지 24 시간 이상) 으로 어디에서나 일어난다. 결과 생성물 혼합물은 반드시 정제되지 않더라도, 초과 시약, 비공액된 반응체 (예를 들어, 활성제), 불필요한 다중-공액된 종, 및 자유 또는 비반응된 중합체를 분리해 내는 것이 바람직하다. 다음, 생성 컨쥬게이트는 MALDI, 모세관 전기영동법, 겔 전기영동법, 및/또는 크로마토그래피와 같은 분석 방법을 이용해서 추가로 특정될 수 있다.
더욱 바람직하게는, 본 발명의 티올-선택성 중합체는 약 6 - 9 (예를 들어, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 또는 9) 의 pH, 더욱 바람직하게는 약 7 - 9 의 pH, 더욱 더 바람직하게는 약 7 내지 8 의 pH 의 범위에서, 술피드릴-함유 활성제에 공액된다. 일반적으로, 중합체 시약의 가벼운 몰 초과는 예를 들어, 1.5 내지 15-배 몰 초과, 바람직하게는 2-배 내지 10 배 몰 초과가 적용된다. 반응 시간은 일반적으로 실온에서 약 15 분 내지 수시간, 예를 들어 8 이상의 시간의 범위이다. 입체적으로 방해받은 술피드릴기에 대해, 필요한 반응 시간은 확실히 더 길 수 있다. 본 발명의 중합체가 티올-선택성이기 때문에, 티올-선택성 공액은 바람직하게는 약 7 의 pH 에서 수행된다.
분리
임의로, 본 발명의 티올-선택성 중합체와 생물학적 활성제를 반응시킴으로써 생성된 컨쥬게이트는 예를 들어, PEG-종과 같은 상이한 종을 수득/단리하기 위해 또는 불필요한 반응 부-생성물을 제거하기 위해 정제된다.
필요하다면, 상이한 분자량을 가진 PEG 공액은 겔 투과 크로마토그래피를 이용해 단리될 수 있다. 상기 접근이 상이한 분자량을 가진 PEG 공액을 분리하기 위해 이용될 수 있는 반면, 상기 접근은 일반적으로 단백질 내의 상이한 PEG 화 위치를 가진 위치 이성질체를 분리하는데 비효율적이다. 복구된 PEG-머 조성물의 각각이 단백질 내의 상이한 반응기에 부착된 PEG 를 함유할 수 있다고 하더라도, 예를 들어, 겔 투과 크로마토그래피는 PEG 1-머, 2-머, 3-머 등의 각각의 다른 혼합물로부터 분리하는데 이용될 수 있다.
상기 유형의 분리를 수행하는 데 적합한 겔 여과 칼럼은 Amersham Biosciences 사의 Superdex™ 및 Sephades™ 칼럼을 포함한다. 특정 칼럼의 선택은 목적하는 분획 범위에 의존할 것이다. 용출은 일반적으로 비-아민 기재 완충 용액을 이용해 수행된다. 수합된 분획은 예를 들어, (i) 단백질 함량을 알아 보기 위한 280 nm 에서의 OD, (ii) BSA 단백질 분석, (iii) PEG 함량을 알아 보기 위한 요오드 테스트 (Sims G.E.C., 등, Anal . Biochem , 107, 60-63, 1980) 또는 대안적으로, (iv) SDS PAGE 겔을 달리고 이어서, 바륨 요오다이드로 염색하는 것과 같은 많은 상이한 방법을 이용해 분석될 수 있다.
위치 이성질체의 분리는 예를 들어, RP-HPLC C18 칼럼 (Amersham Biosciences 또는 Vydac) 을 이용한 역상 크로마토그래피 또는 예를 들어, Amersham Biosciences 사의 Sepharose™ 이온 교환 칼럼과 같은 이온 교환 칼럼을 이용한 이온 교환 크로마토그래피를 이용함으로써 수행될 수 있다. 어느 접근이든 동일한 분자량을 가진 PEG-생물분자 이성질체 (위치 이성질체) 를 분리하는 데 이용될 수 있다.
생성 PEG-컨쥬게이트의 의도된 용도, 하기 공액, 및 임의로 추가의 분리 단계에 따라, 컨쥬게이트 혼합물이 농축, 살균 여과, 및 약 -20℃ 내지 약 -80℃ 의 저온에서 저장될 수 있다. 대안적으로, 컨쥬게이트는 잔존 완충 용액이 있거나 또는 없이, 동결건조되어, 동결건조된 파우더로서 저장될 수 있다. 일부 경우에, 예를 들어, 소듐 아세테이트와 같은 공액에 이용된 완충 용액을 동결건조 동안에 쉽게 제거될 수 있는 암모늄 카르보네이트 또는 암모늄 아세테이트와 같은 휘발성 완충 용액으로 교환하여, 동결건조된 단백질 컨쥬게이트 파우더 제형물이 잔존 완충 용액이 없는 것이 바람직하다. 대안적으로, 완충 용액 교환 단계는 제형물 완충 용액을 이용해 이용되어, 동결건조된 컨쥬게이트가 제형물 완충 용액 내로 재구성 및 궁극적으로는 포유류에 투여하기 적합한 형태에 있을 수 있다.
약학적 조성물
본 발명은 또한 약학적 부형제와 병용하여 여기에 제공된 컨쥬게이트를 포함하는 약학적 제조물을 포함한다. 일반적으로, 컨쥬게이트 자체는 고체 형태 (예를 들면, 침전물) 또는 용액 내에 있을 것이며, 이는 고체 또는 액체 형태일 수 있는 적합한 약학적 부형제와 병용될 수 있다.
예시적인 부형제는 탄수화물, 무기염, 항미생물제, 항산화제, 계면활성제, 완충 용액, 산, 염기 및 그의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것들을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
당과 같은 탄수화물, 알디톨, 알돈산, 에스테르화된 당과 같은 유도된 당, 및/또는 당 중합체는 부형제로서 존재할 수 있다. 특정한 탄수화물 부형제는 예를 들어 : 프룩토스, 말토스, 갈락토스, 글루코스, D-만노스, 소르보스 등과 같은 모노사카라이드 ; 락토스, 수크로스, 트레할로스, 셀로비오스 등과 같은 디사카라이드 ; 라피노스, 멜레지토스, 말토덱스트린, 덱스트린, 전분 등과 같은 폴리사카라이드 ; 및 만니톨, 자일리톨, 말티톨, 락티톨, 자일리톨, 소르비톨 (글루시톨), 피라노실 소르비톨, 미오이노시톨 등과 같은 알디톨을 포함한다.
부형제는 시트르산, 소듐 클로라이드, 포타슘 클로라이드, 소듐 술페이트, 포타슘 니트레이트, 소듐 포스페이트 모노베이직, 소듐 포스페이트 디베이직 및 그의 혼합물과 같은 무기염 또는 완충 용액을 또한 포함할 수 있다.
제조물은 미생물의 성장을 예방하거나 방해하기 위한 항미생물제를 또한 포함할 수 있다. 본 발명에 적합한 항미생물제의 비제한 예는 벤즈알코늄 클로라이드, 벤제토늄 클로라이드, 벤질 알콜, 세틸피리디늄 클로라이드, 클로로부탄올, 페놀, 페닐에틸 알콜, 페닐머큐릭 니트레이트, 티머졸 및 그의 혼합물을 포함한다.
항산화제가 제조물에 또한 존재할 수 있다. 항산화제는 산화를 예방하기 위해 이용되고, 그로 인해 제조물의 컨쥬게이트 또는 다른 성분의 오염을 예방한다. 본 발명에 이용되기 적합한 항산화제는 예를 들어, 아스코르빌 팔미테이트, 부틸화된 히드록시아니솔, 부틸화된 히드록시톨루엔, 히포포스포러스 산, 모노티오글리세롤, 프로필 갈레이트, 소듐 비술피트, 소듐 포름알데히드 술폭실레이트, 소듐 메타비술피트 및 그의 혼합물을 포함한다.
계면활성제가 부형제로서 존재할 수 있다. 예시적인 계면활성제는 하기를 포함한다 : 폴리소르베이트, 예를 들어 "트윈 20" 및 "트윈 80", 및 플루로닉스, 예를 들어 F68 및 F88 (둘 다 BASF, Mount Olive, New Jersey 사 제품) ; 소르비탄 에스테르 ; 지질, 예를 들어 레시틴과 같은 인지질, 및 다른 포스파티딜콜린, 포스파티딜에탄올아민 (바람직하게는 리포좀 형태에 있지 않더라도), 지방산 및 지방 에스테르 ; 스테로이드, 예를 들어 콜레스테롤 ; 및 킬레이트제, 예를 들어 EDTA, 아연 및 다른 적합한 양이온.
산 또는 염기가 제조물에 부형제로서 존재할 수 있다. 이용가능한 비제한적 산은 염산, 아세트산, 인산, 시트르산, 말산, 젖산, 포름산, 트리클로로아세트산, 질산, 과염소산, 인산, 황산, 푸마르산 및 그의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 포함한다. 적합한 염기의 예는 제한 없이, 소듐 히드록시드, 소듐 아세테이트, 암모늄 히드록시드, 포타슘 히드록시드, 암모늄 아세테이트, 포타슘 아세테이트, 소듐 포스페이트, 포타슘 포스페이트, 소듐 시트레이트, 소듐 포르메이트, 소듐 술페이트, 포타슘 술페이트, 포타슘 푸머레이트 및 그의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 염기를 포함한다.
약학적 제조물은 모든 유형의 제형물을 포함하고, 특히 예를 들어, 현탁액 및 용액 뿐만 아니라 재구성될 수 있는 파우더와 같은 주사용으로 적합한 것을 포함한다. 조성물 내의 컨쥬게이트 (즉, 여기에 기술된 활성제 및 중합체 사이에 형성된 컨쥬게이트) 의 양은 많은 요소에 따라 다양할 것이나, 상기 조성물이 단위 투여량 용기 (예를 들어, 바이알) 에 저장되었을 때 치료적으로 유효한 투여량이 되도록 하는 것이 최적일 것이다. 또한, 약학적 제조물은 주사기에 수용될 수 있다. 치료적인 유효 투여량은 어떤 양이 임상적으로 목적하는 종점을 나타내는지를 결정하기 위해 컨쥬게이트의 양을 증가시키면서 반복 투여함으로써 실험적으로 결정될 수 있다.
조성물 내의 임의의 각 부형제의 양은 부형제의 활성 및 조성물의 특정 필요에 따라 다양할 것이다. 전형적으로, 임의의 각 부형제의 최적량은 통상적인 실험, 즉 부형제의 다양한 양 (낮은 양부터 높은 양까지) 을 함유하는 조성물의 제조, 안정성 및 다른 척도의 시험, 및 결정적인 부작용 없이 최적 성능이 얻어지는 범위를 결정함으로써 결정된다.
그러나, 일반적으로 부형제는 약 1 내지 약 99 중량%, 바람직하게는 약 5 내지 약 98 중량%, 더욱 바람직하게는 부형제의 약 15 내지 약 95 중량%, 가장 바람직하게는 30 중량% 미만의 농도로 조성물 내에 존재한다.
다른 부형제와 함께 상기 약학적 부형제는 ["Remington : The Science & Practice of Pharmacy", 19th Ed., Williams & Williams, (1995), the "Physician's Desk Reference", 52nd Ed., Medical Economics, Montvale, NJ (1998), 및 Kibbe, A. H., Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3rd Ed., American Pharmaceutical Association, Washington, D.C., 2000] 에 설명되어 있다.
본 발명의 약학적 제조물은 전형적으로, 비록 반드시는 아니지만, 주사를 통해 투여되고, 따라서 일반적으로 투여 전에 즉시 액체 용액 또는 현탁액으로 있다. 약학적 제조물은 시럽, 크림, 연고, 정제, 파우더 등과 같은 다른 형태 또한 취할 수 있다. 폐, 직장, 경피, 경점막, 경구, 수막강내, 피하, 동맥내 등과 같은 다른 투여 형태 또한 포함된다.
이전에 설명된 바와 같이, 컨쥬게이트는 정맥 주사 또는 덜 바람직하게 근육내 또는 피하 주사에 의해 비경구적으로 주사되어 투여될 수 있다. 비경구 투여에 적합한 제형물 유형은 즉시 주사 용액, 사용 전에 용매와 혼합하는 건조 파우더, 즉시 주사 현탁액, 사용 전에 비히클과 혼합하는 건조 불용성 조성물, 및 투여 전에 희석하는 에멀션 및 액체 농축물 등을 포함한다.
투여 방법
본 발명은 또한 컨쥬게이트 치료에 반응하는 상태로 고통받는 환자에게 여기에 제공되는 컨쥬게이트를 투여하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 일반적으로 주사를 통하여 치료적 유효량의 컨쥬게이트 (바람직하게 약학적 제조물의 부분으로 제공되는) 를 투여하는 것을 포함한다. 투여 방법은 특정 컨쥬게이트의 투여에 의해 치료 또는 예방될 수 있는 임의의 상태를 치료하는데 이용될 수 있다. 당업자는 특정 컨쥬게이트가 효과적으로 치료할 수 있는 조건을 인식한다. 투여되는 실제 투여량은 치료되는 상태의 심각성, 건강 케어 전문가의 판단, 및 투여되는 컨쥬게이트 뿐만 아니라 대상체의 나이, 중량 및 일반적인 상태에 따라 다양할 것이다. 치료적 유효량은 당업자에게 공지되어 있고/있거나 적당한 참고 텍스트 및 문헌에 기술되어 있다. 일반적으로, 치료적 유효량은 약 0.001 mg 내지 100 mg, 바람직하게는 0.01 mg/일 내지 75 mg/일, 및 더욱 바람직하게는 0.10 mg/일 내지 50 mg/일의 범위일 것이다.
임의의 주어진 컨쥬게이트 (다시, 바람직하게는 약학적 제조물의 한 부분으로 제공되는) 의 단위 투여량은 임상의의 판단, 환자의 필요량 등에 따른 다양한 투여 계획에 따라 투여될 수 있다. 특정 투여 계획은 당업자에게 공지되어 있을 것이고, 통상적인 방법을 이용하여 실험적으로 결정될 수 있다. 예시적인 투여 계획은 일일 5 회, 일일 4 회, 일일 3 회, 일일 2 회, 일일 1 회, 한 주에 3 회, 한 주에 2 회, 한 주에 1 회, 한 달에 2 회, 한 달에 1 회, 및 그의 혼합을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 일단, 임상적 종점에 이르면, 조성물의 투여는 중지된다.
본 발명의 컨쥬게이트 투여의 한 장점은 각각의 수용성 중합체 부분이 절단될 수 있다는 것이다. 상기 결과는 중합체 크기 때문에 체내로부터의 제거가 잠재적으로 문제가 될 때 유익하다. 최적으로는, 각 수용성 중합체 부분의 절단은 우레탄, 아미드, 카르보네이트 또는 에스테르-함유 연결과 같은, 생리학적으로 절단가능한 및/또는 효소학적으로 분해가능한 연결의 이용을 통하여 유용하게 된다. 상기 방식으로, 컨쥬게이트의 제거 (각각의 수용성 중합체 부분의 절단을 통한) 는 목적하는 제거 특성을 제공하는 중합체 분자 크기 및 유형 관능기를 선택함으로써 조절될 수 있다. 당업자는 절단가능한 관능기 뿐만 아니라 중합체의 적절한 분자 크기를 결정할 수 있다. 예를 들어, 당업자는, 통상적인 실험을 이용하여, 먼저 상이한 중합체 중량 및 절단가능한 관능기를 가진 다양한 중합체 유도체를 제조하고, 이어서 상기 중합체 유도체를 환자에 투여하고 주기적인 혈액 및/또는 소변 샘플을 채취하여 제거 프로파일 (예를 들어, 주기적인 혈액 또는 소변 샘플링) 을 수득함으로써 적절한 분자 크기 및 절단가능한 관능기를 결정할 수 있다. 일단 각 시험 컨쥬게이트에 대한 일련의 제거 프로파일이 수득되면, 적합한 컨쥬게이트가 규정될 수 있다.
여기에 참조된 모든 기사, 서적, 출원, 출원 공개물 및 다른 공개물이 그 자체로 참조로써 삽입되어 있다.
하기 실시예는 본 발명의 영역을 제한하지 않으면서, 본 발명을 설명하고 있다.
실시예
재료 및 방법
1H NMR 데이타는 Bruker 사의 400 MHz 스펙트로미터를 이용해 수득되었다.
첨부된 실시예에서 언급된 PEG 시약은 Nektar Therapeutics, Huntsville, AL 사의 것이다.
1. mPEG -5K 프로피온산, N- 히드록시숙신이미드 ( NHS ) 에스테르의 제조.
PEG 시약, mPEG-5K 프로피온산, N-히드록시숙신이미드 (NHS) 에스테르를 하기와 같이 합성하였다.
A. M- PEG (5,000)-니트릴 (1)
겔 투과 크로마토그래피(GPC) 에 의해 결정된, M-PEG-OH (메톡시-PEG, MW=5,000 달톤, 50 g, 더 높은 분자량의 PEG-디올을 4 중량% 함유) 을 칼륨 히드록시드 (1.0 g) 가 첨가된 증류수 (50.0 ml) 에 용해시켰다. 상기 용액을 얼음조에서 0 - 5℃ 로 냉각시켰다. 아크릴로니트릴 (6.8 g) 을 천천히 첨가하고, 상기 용액을 0 - 5℃ 에서 2.5 시간 동안 교반하였다. 나트륨 2 수소 포스페이트를 첨가함으로써, 상기 용액의 pH 를 7 로 맞추었다. 생성물을 디클로로메탄(250, 100 및 50 ml) 으로 3 회 추출하였다. 조합된 유기층을 마그네슘 술페이트로 건조시키고, 여과하고, 농축시키고, 생성물을 0 - 5℃ 에서 에틸 에테르를 첨가함으로써 침전시켰다. 상기 침전물을 여과하여 제거하고 진공하에 건조시켰다.
수율 47.0 g. NMR (d6-DMSO): 2.74 ppm (t, 2H, -CH2-CN); 3.21 ppm, (s, 3H, -OCH3), 3.51 ppm (s, PEG 백본).
B. M- PEG (5,000)-아미드 (2)
M-PEG(5,000)-니트릴 (1) (47.0 g) 및 농축된 히드로클로르산 (235 g) 의 혼합물을 실온에서 48 시간 동안 교반하였다. 상기 용액을 물 2 리터로 희석시키고, 디클로로메탄 (300, 200, 및 100 ml) 으로 추출하였다. 조합된 유기 추출물을 물로 2 회 세척하고, 나트륨 술페이트로 건조시키고, 여과하고, 회전 증발로 농축시켜 건조시켰다.
수율 43.0 g. NMR (d6-DMSO): 2.26 ppm (t, 2H, -CH 2 -CONH2); 2.43 ppm (t, 2H, -CH 2 -COOH); 3.21 ppm (s, 3H, -OCH3), 3.51 ppm (s, PEG 백본).
C. M- PEG (5, OOO )-프로피온산, ( PEG 의 알파- 메톡시 , 오메가-프로피온산) (3)
M-PEG(5,000)-아미드 (2) (32.0 g) 를 2300 ml 의 증류수에 용해시키고, 200 g 의 칼륨 히드록시드를 첨가하고, 상기 용액을 실온에서 22 시간 동안 교반하였다. 나트륨 클로라이드 (300 g) 를 첨가하고, 상기 용액을 매회 300 ml 디클로로메탄으로 3 회 추출하였다. 상기 조합된 유기 추출물을 5% 옥살산, 물 (2 회) 로 세척하고, 나트륨 술페이트로 건조시켰다. 상기 용액을 농축시키고, 에틸 에테르를 첨가하여 생성물을 침전시켰다. 상기 생성물 M-PEG(5,000)-프로피온산 (3) 을 여과하여 수합하고, 진공으로 건조시켰다.
수율 28.0 g. NMR (d6-DMSO): 2.43 ppm (t, 2H, -CH 2 -COOH); 3.21 ppm (s, 3H, -OCH3), 3.51 ppm (s, PEG 백본).
2 관능적 ( difunctional ) 불순물의 제거 : PEG(10,000)-디프로피온산 (22 g) (개시 물질 내에 함유된 PEG 디올 불순물의 반응으로부터 유래된 것) 의 4 중량% 를 함유한 M-PEG(5,000)-프로피온산 (3) 을 2200 ml 의 탈이온수에 용해시키고, 생성 용액을 테트라보레이트 형태의 DEAE Sephadex A-25 크로마토그래프 칼럼에 적용시켰다. 나트륨 클로라이드 (2 mM 에서 14 mM 로 증가) 의 단계적 이온 구배를 적용하고, 분획 수합 (각각 약 60 ml 씩)을 시작하였다. 분획 4-25 는 순수 M-PEG(5,000)-프로피온산을 함유하였다. 연속한 2 개의 분획은 PEG 를 함유하지 않은 반면, 분획 28-36 는 순수한 PEG(10,000)-디프로피온산을 함유하였다. 순수한 M-PEG(5,000)-프로피온산을 함유한 분획을 조합하고, 농축시켰다 (약 100 ml 까지). 나트륨 클로라이드 (10 g) 를 첨가하고, pH 를 3 으로 조정하고, 생성물을 디클로로메탄으로 추출하였다. 유기층을 MgSO4 로 건조하고, 용매를 감압하에 증류시켜, 18.4 g 의 생성물을 수득하였다.
HPLC 분석은 생성물이 100 % 순수한 M-PEG(5,000)-프로피온산 (임의의 다른 불순물이 없는) 임을 보여주었다.
D. M- PEG (5,000)-프로피온산, NHS 에스테르 ( PEG (" 메톡시 - PEG - SPA ") 의 알파-메톡시, 오메가-프로피온산 숙신이미딜 에스테르), (4)
M-PEG(5,000)-프로피온산 (14.4 g) (3) 을 디클로로메탄 (60 ml) 내에 용해시켜서, N-히드록시숙신이미드 (0.36 g) 가 첨가된 용액을 형성하였다. 상기 용액을 0℃ 로 냉각시키고, 10 ml 디클로로메탄 내의 디시클로헥실카르보디이미드 (0.72 g) 의 용액을 적가하였다. 상기 용액을 아르곤 대기하에 실온에서 하룻밤 동안 교반하였다. 상기 반응 혼합물을 여과하고, 농축시키고, 생성물을 에틸 에테르를 첨가하여 침전시켰다.
최종 생성물의 수율 (4): 14.0 g. NMR (d6-DMSO): 2.81 ppm (s, 4H, NHS); 2.92 ppm (t, 2H, -CH2-COO-); 3.21 ppm, (s, 3H, -OCH3), 3.51 ppm (s, PEG 백본).
2. mPEG -20K 부탄산, N- 히드록시숙신이미드 ( NHS ) 에스테르의 제조 .
PEG 시약, mPEG-20K 부탄산, N-히드록시숙신이미드 (NHS) 에스테르를 하기와 같이 합성하였다.
A. M- PEG (20K)- 메탄술포네이트 (5)
M-PEG-OH (MW=20,000 달톤, 60g, 더 높은 분자량의 PEG-디올 (겔 투과 크로마토그래피(GPC) 에 의해 결정됨) 의 6 중량% 를 함유함) 를 300 ml 의 톨루엔에 용해시키고, 아르곤 대기하에 1 시간 동안 공비 증류하였다. 다음, 상기 용액을 실온으로 냉각시켰다. 상기 용액에 24 ml 의 무수 디클로로메탄 및 0.62 ml 의 트리에틸아민 (0.0044 몰) 을 첨가하였다. 0.28 ml 의 메탄술포닐 클로라이드 (0.0036 몰) 를 적가하였다. 상기 용액을 질소 대기하에 실온에서 하룻밤 동안 교반하였다. 다음, 나트륨 카르보네이트 (30 g) 를 첨가하고, 상기 혼합물을 1 시간 동안 교반하였다. 상기 용액을 여과하고, 용매를 감압하에 증류하였다. 수율 27.5g 1H NNR (d6-DMSO): 3.17 ppm (s, 3H, CH3-메탄술포네이트), 3.24 ppm (s, 3H, - OCH3), 3.51 ppm (s, PEG 백본), 4.30 ppm (m, -CH2-메탄술포네이트).
B. M- PEG (20,000)-부탄산 (8)
200 ml 의 디옥산에 용해된 에틸 말로네이트 (3.4 ml, 0.022 당량) 를 질소하에 둥근 바닥 플라스크 내의 나트륨 히드리드 (0.536 g, 0.022 당량) 및 톨루엔 (100 ml) 에 한 방울씩 적가하였다. 100 ml 의 톨루엔에 용해된 M-PEG(20K)-메탄술포네이트 (5) (40 g, 0.0020 몰) 를 상기 혼합물에 첨가하였다. 생성 혼합물을 하룻밤 동안 환류시켰다. 다음, 상기 반응 혼합물을 농축시켜, 원래 부피의 반이 되게 하고, 50 ml 의 10% 수성 NaC1 용액으로 추출하고, 50 ml 의 1% 수성 히드로클로르산으로 추출하고, 수성 추출물을 조합하였다. 수합된 수성층을 디클로로메탄 (150 ml x 3) 으로 추출하고, 유기층을 마그네슘 술페이트로 3 시간 동안 건조시키고, 여과하고, 증발시켜 건조시켰다.
수율 : 36 g 의 M-PEG 말론산 디에틸 에스테르 (6). NMR (d6 -DMSO) : 1.17 ppm (t, 6H, -CH3); 1.99 ppm (quartet, 2H, -CH2-CH); 3.21 ppm, (s, 3H, - OCH3); 3.51 ppm (s, PEG 백본); 4.10 ppm (quintet, 4H, -OCH2-CH3).
M-PEG 말론산 디에틸 에스테르 (6) (36 g) 를 24 g 의 나트륨 클로라이드를 함유한 480 ml 의 1N 나트륨 히드록시드에 용해시키고, 상기 혼합물을 1 시간 동안 교반하였다. 상기 혼합물의 pH 를 6N 히드로클로르산의 첨가로 3.0 으로 조정하고, 상기 혼합물을 디클로로메탄 (300 ml 및 200 ml) 으로 추출하였다. 상기 유기층을 마그네슘 술페이트로 건조시키고, 여과하고, 농축시키고, 차가운 에틸 에테르에 부었다. 상기 생성물 M-PEG(20,000)-말론산 (7) 을 여과로써 제거하고, 진공하에 건조시켰다.
수율 : 32 g. NMR (d6-DMSO); 1.0 ppm (q, 2H, -CH2CH2CH-); 2.90 ppm (t, 2H, -CH2CH-); 3.21 ppm (s, 3H, -OCH3); 3.51 ppm (s, PEG 백본); 12.1 ppm (s, 2H, -COOH).
M-PEG 말론산 (7) (30 g) 을 240 ml 의 디옥산에 용해시키고, 8 시간 동안 환류시킨 다음, 농축시켜 건조시켰다. 잔류물을 200 ml 의 물에 용해시키고, 디클로로메탄 (140 ml 및 100 ml) 으로 추출하고, 마그네슘 술페이트로 건조시키고, 상기 용액을 회전 증발로 농축시켰다. 잔류물을 차가운 에틸 에테르의 첨가로써 침전시켰다.
수율 : 22 g 의 M-PEG(20,000)-부탄산 (8). 1H NMR (d6-DMSO): 1.72 ppm (quintet, 2H, -CH2CH2-COOH); 2.40 ppm (t, 4H, -CH2CH2-COOH); 3.21 ppm (s, 3H, OCH3); 3.51 ppm (s, PEG 백본). HPLC 분석은 상기 생성물이 개시 물질 내에 함유된 더 높은 분자량 PEG-디올 유래의 M-PEG(20,000)-부탄산의 94 중량% 및 PEG-디부탄산의 6 중량% 를 함유하고 있음을 보여주었다.
더 높은 분자량 반응성 PEG 종을 제거하기 위해, PEG-디부탄산 (22 g) 의 6 중량% 를 함유한 M-PEG(20K)-부탄산을 2200 ml 의 탈이온수에 용해시키고, 테트라보레이트 형태의 DEAE Sephadex A-50 칼럼에 적용하였다. 나트륨 클로라이드의 단계적 이온 구배 (1 mM 에서 4 mM 로 증가) 를 적용하고, 분획을 수합하였다.
순수한 M-PEG(20,000)-부탄산을 함유한 분획을 조합하고, 수합하였다. 후에 순수한 PEG-디부탄산을 함유한 분획을 용출하였다. 순수한 M-PEG(20,000)-부탄산을 함유한 조합된 분획을 농축시켰다 (약 200 ml 로). 나트륨 클로라이드 (20 g) 를 첨가하고, pH 를 3 으로 조정하고, 생성물을 디클로로메탄으로 추출하였다. 추출물을 건조시키고 (MgSO4), 용매를 감압하에 증류시켜 13.6 g 의 생성물을 수득하였다.
HPLC 분석은 상기 생성물이 더 높은 분자량 PEG 종이 없는 100 % 순수한 M-PEG(20,000)-부탄산 (8) 임을 보여주었다.
C. M- PEG (20 000)-부탄산, NHS 에스테르 (9)
M-PEG(20,000)-부탄산 (8) (13.6 g) 을 디클로로메탄 (40 ml) 에 용해시키고, N-히드록시숙신이미드 (0.094 g) 를 상기 용액에 첨가하였다. 상기 용액 을 0℃ 에서 냉각시키고, 10 ml 디클로로메탄 내의 디시클로헥실카르보드이미드, DCC, (0.196 g) 용액을 적가하였다. 상기 용액을 실온에서 하룻밤 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 여과하고, 농축시키고, 에틸 에테르를 첨가하여 침전시켰다.
최종 생성물의 수율 : 13.1 g. NMR (d6-DMSO): 1.83 ppm (quintet, 2H, - CH2CH2CH2COO-); 2.70 ppm (t, 2H, -CH2-COO-); 2.81 ppm (4H, NHS); 3.21 ppm (s, 3H, -OCH3); 3.51 ppm (s, PEG 백본).
실시예 1
mPEG (5K)- 티올 ,
MPEG (5K)- CH 2 CH 2 CONHCH 2 CH 2 SH (11) 의 제조
메톡시-PEG-SK-티올을 Shearwater Corporation, 현재 Nektar Therapeutics, (Shearwater Catalog 2001, 생물의학 적용을 위한 폴리에틸렌 글리콜 및 유도체), Huntsville, Alabama 에서 시판되는 실례의 친전자적으로 활성화된 PEG, mPEG-5K 프로피온산, N-히드록시숙신이미드 (NHS) 에스테르 (mPEG-5K 숙신이미딜 프로피오네이트라고 하기도 함) 로부터 고순도 및 고수율로 제조하였다.
mPEG-5K 숙신이미딜 프로피오네이트의 제조는 일반적으로 U.S. Patent No. 5,672,662 (Shearwater Polymers) 및 상기 "재료 및 방법" 단락에 기술되어 있다.
M- PEG (5,000)- 티올 (11) 의 합성
Figure 112011104637377-pat00013
M-PEG 프로피온산, NHS 에스테르, (4), (MW = 5,268, 10.0 g, 1.898 mmol) 를 시스타민 디히드로클로라이드 (0.2278 g, 1.012 mmol) 및 트리에틸아민 (0.66 ml) 이 첨가된 디클로로메탄 (100 ml) 에 용해시켰다. 상기 용액을 아르곤 대기하에 실온에서 하룻밤 동안 교반하였다. 겔 투과 크로마토그래피 (GPC) 분석은 상기 반응 혼합물이 97.53 % 수율로 목적하는 생성물 (10) (약 10,000 의 분자량을 가진 대칭 디술피드) 및 2.14% 수율로 M-PEG(5,000)-프로피온산을 함유하고 있음을 보여주었다.
다음, 디티오트레이톨 (DTT) (0.88 g, 0.005705 몰) 및 트리에틸아민 (0.5 ml) 을 첨가하고, 반응 혼합물을 아르곤 하에 실온에서 3 시간 동안 교반하였다. 다음, 2,6-디-tert-부틸-4-메틸페놀 (BHT) (0.05 g) 을 첨가하고, 상기 용매를 감압하에 증류시켰다. 조 티올 생성물 (11) 을 디클로로메탄 (20 ml) 내에 용해시키고, 이소프로필 알콜로 0 - 5℃ 에서 침전시켰다. 건조 후의 수율은 8.80 g 이었다.
GPC 분석 : 목적 생성물: M-PEG(5,000)-티올, (11), 96.05 % 수율 ; M PEG(5,000)-프로피온산, 0.57 % 수율 ; 비-환원된 이량체 (non-reduced dimer), (10), 3.07 %. NMR (d6-DMSO): 1.52 ppm (t, 1H, -SH); 2.31 ppm (t, 2H, -CH2-CO-); 2.66 ppm (dt, 2H, -CH2-S-); 3.21 ppm, (s, 3H, -OCH3), 3.51 ppm (s, PEG 백본); 8.05 ppm (t, 1H, -NH-).
실례의 디술피드 중간체 (10) 및 환원된 PEG-티올 생성물 (11) 둘 다를 단지 2 단계만을 필요로 하는 단순한 반응 도식을 이용하여 고수율 및 고순도로 제조하였다. 실례의 시약인 시스타민은 시판되고, 거기에서 아미노기는 카르보닐 생성물 상의 숙신이미딜기로 쉽게 치환된다. 2 개의 말단 반응성 아미노기를 가진 대칭성의 시약의 화학양론적 양의 실례의 용도는 시약의 초과로 인해 오염되지 않는 단지 하나의 치환 생성물을 형성함으로 인해, 반응 "클리너 (cleaner)" 를 만든다. 생성 PEG-티올 생성물은 예를 들어, 단백질의 약물 또는 시스테인 잔기 내에 함유되어 있는 반응성 티올기에 커플링하기에 적합하여, 상응하는 PEG 컨쥬게이트를 형성한다. 여기에 기술된 PEG 연결 (즉, PEG 쇄 또는 백본을 약물 또는 다른 종에 있는 반응성 티올기에 연결하는 링커 부분 분자) 이 안정적이고, 쉽게 합성될 수 있고, 다수의 합성 단계, 보호-탈보호 단계, 및 다수의 정제가 필요 없이 단백질 또는 다른 반응성 분자를 개질하거나 또는 PEG 화하는데 선택적으로 이용될 수 있는 수용성이고, 비-자연 발생적인 중합체의 신규 부류를 제공한다.
실시예 2
mPEG (20K)- 티올 , CH 3 O ( CH 2 CH 2 O )n(20K)- CH 2 CH 2 CH 2 CONHCH 2 CH 2 SH (13) 의 제조
메톡시-PEG-20K-티올을 Shearwater Corporation, 현재 Nektar Therapeutics, (Shearwater Catalog 2001, 생물의학 적용을 위한 폴리에틸렌 글리콜 및 유도체), Huntsville, Alabama 에서 시판되는 실례의 친전자적으로 활성화된 PEG, mPEG-20K 부탄산, N-히드록시숙신이미드 (NHS) 에스테르 (mPEG-20K 숙신이미딜 부타노에이트라고 하기도 함) 로부터 고순도 및 고수율로 제조하였다.
mPEG-5K 숙신이미딜 부타노에이트의 제조는 일반적으로 U.S. Patent No. 5,672,662 (Shearwater 중합체s) 및 상기 "재료 및 방법" 단락에 기술되어 있다.
M- PEG (20,000)- 티올 (13) 의 합성
Figure 112011104637377-pat00014
M-PEG(20K)-부탄산, NHS 에스테르 (9), (MW = 20,000, 10.0 g, 0.500 mmol) 를 디클로로메탄 (100 ml) 에 용해시키고, 시스타민 디히드로클로라이드 (0.564 g, 0.251 mmol) 및 트리에틸아민 (0.167 ml) 을 첨가하였다. 상기 용액을 아르곤 대기하에 실온에서 하룻밤 동안 교반하였다. GPC 분석은 상기 반응 혼합물이 98.5 % 로 순수한 목적하는 생성물 (10) (약 40,000 의 분자량을 가진 이량체 (12)) 및 1.5% 의 M-PEG(20,000)-부탄산을 함유하고 있음을 보여주었다.
디티오트레이톨 (DTT) (0.23 g, 1.500 mmoles) 및 트리에틸아민 (0.5 ml) 을 첨가하고, 반응 혼합물을 아르곤 하에 실온에서 3 시간 동안 교반하였다. 다음, BHT (0.05 g) 를 첨가하고, 상기 용매를 감압하에 증류시켰다. 조 생성물을 디클로로메탄 (20 ml) 내에 용해시키고, 이소프로필 알콜로 0 - 5℃ 에서 침전시켰다.
건조 후 수율 9.20 g.
HPLC 분석 : M-PEG(20K)-티올 (13), 96.0% 수율, M-PEG(20,000)-부탄산 1.5%, 비-환원된 이량체 (non-reduced dimer) 2.5%.
상기 실시예 1 에서와 유사하게, 상기 실시예는 또다른 대표적인 PEG-티올 (그의 상응하는 디술피드 전구체뿐만 아니라) 의 제조를 설명하고 있다. 합성은 수월하고 실례의 PEG 시약 상에 친전자성 카르보닐 탄소에서 시스타민 상의 대표적인 친핵체 아미노기의 치환 (9), 이어서 디술피드의 환원으로 인해 상응하는 PEG-티올을 수득하는 단지 2 단계만을 필요로 한다. 대칭 디술피드 시약의 이용은 합성을 단순화시키고, PEG-티올 생성물의 정제를 불필요하게 한다. PEG-티올은 고수율 (90% 초과, 사실상 95% 초과) 로 형성되고, 예를 들어, 치료성 단백질의 시스테인 잔기에 남아 있거나, 또는 단백질 또는 폴리펩티드 내로 화학적 수단에 의해 도입되거나, 또는 소분자 또는 다른 활성제 내에 존재하는 반응성 티올기와 커플링하기에 적합하다.
실시예 3
PEG (40K)-디- 티올 ,
HSCH 2 CH 2 NH (0)CCH 2 O- PEG -40K- CH 2 C (0)HNCH 2 CH 2 SH (18) 의 제조
PEG-40K-디-티올 (18) 을 하기에서와 같이, 2 관능적 PEG 시약, PEG-40K 디카르복실산으로부터 제조하였다.
A. PEG (40,000)-디- 카르복실산 , 에틸 에스테르, (14)
HO-PEG-OH (MW=40,000 달톤, 50 g, 2.50 히드록시 mequiv.) 를 750 ml 의 톨루엔에 용해시키고, 아르곤 대기하에 1 시간 동안 공비 증류시켰다. 150 ml 톨루엔을 반응 혼합물로부터 증류하였다. 다음, 상기 용액을 40℃ 로 냉각시키고, tert-부탄올 (4.0 ml, 4 mmoles) 내의 1.0 M 용액의 칼륨 tert-부톡시드를 첨가하고, 이어서 에틸 브로모아세테이트 (1.4 g, 8.4 mmoles) 를 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 질소 대기하에 실온에서 하룻밤 동안 교반하였다. 상기 용매를 감압하에 증류시키고, 조 생성물을 디클로로메탄 내에 용해시키고, 에틸 에테르를 첨가하였다. 침전된 생성물을 여과로써 단리하고, 감압하에 건조시켰다. 수율 42.3 g.
B. PEG (40,000)-디- 카르복실산 (15)
400 ml 1M NaOH 내의 PEG (40,000)-디카르복실산 에틸 에스테르 (14) 의 40.0 그람 (1.0 mmoles) 의 용액을 실온에서 3 시간 동안 교반하였다. 다음, 상기 혼합물의 pH 를 2 로 조정하고, 상기 생성물을 디클로로메탄으로 추출하였다. 다음, 상기 용매를 감압하에 증류시켰다. 조 생성물을 디클로로메탄 (100 ml) 내에 용해시키고, 에틸 에테르 (900 ml) 를 첨가하였다. 침전된 생성물을 여과로써 단리하고, 감압하에 건조시켰다. HPLC 분석 : PEG (40,000)-디카르복실산 86.5%, PEG (40,000)-모노-카르복실산 13.0%, HO-PEG(40,000)-OH 0.5%.
수율 33.1 g. 1H-NMR (d6-DMSO): 3.51 ppm (s, PEG 백본); 4.02 ppm (4H, OCH2COO-)
수득된 생성물 (30 g) 을 3000 ml 의 탈이온수에 용해시키고, 테트라보레이트 형태의 DEAE Sephadex A-50 크로마토그래프 칼럼에 적용하였다. 나트륨 클로라이드의 단계적 이온 구배 (2 mM 에서 10 mM 로 증가) 를 적용하고, 분획을 수합하였다. PAA 테스트에 양성인 분획, 즉, PEG (40,000)-디-카르복실산을 함유한 분획을 조합하고 농축시켰다 (약 300 ml 로). 나트륨 클로라이드 (30 g) 를 첨가하고, pH 를 3 으로 조정하고, 생성물을 디클로로메탄으로 추출하였다. 상기 추출물을 건조시키고 (MgSO4), 상기 용매를 감압하에 증류시켜 21.6 g 의 생성물, (15) 을 수득하였다.
상기 생성물 (15) 은 HPLC 로써 순수한 디-산, 즉, 100 % PEG (40,000)-디-카르복실산임을 보여 주었다.
C. PEG (40,000)-디- 카르복실산 , NHS 에스테르, (16)
PEG (40,000)-디-카르복실산 (15) (20 g) 을 N-히드록시숙신이미드 (0.138 g) 이 첨가된 디클로로메탄 (200 ml) 에 용해시켰다. 상기 용액을 0℃ 로 냉각시키고, 5 ml 디클로로메탄 내의 디시클로헥실카르보디이미드 (0.290 g) 용액을 적가하고, 상기 용액을 실온에서 하룻밤 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 여과하고, 농축시키고, 에틸 에테르를 첨가하여 침전시켰다. 최종 생성물의 수율, (16) : 18.3 g.
1H NMR (d6-DMSO): 2.83 ppm (8H, NHS); 3.51 ppm (s, PEG 백본); 4.61 ppm (4H,-OCH2COO-).
D. PEG (40,000)-디- 티올 (18)
Figure 112011104637377-pat00015
PEG(40,000)-디-카르복실산, NHS 에스테르 (16) (MW = 40,000, 18.0 g, 0. 900 mequiv.) 를 디클로로메탄 (150 ml) 내에 용해시키고, 시스타민 디히드로클로라이드 (1.01 g, 4.5 mmoles) 및 트리에틸아민 (1.70 ml) 을 첨가하였다. 용액 을 아르곤 대기하에 실온에서 하룻밤 동안 교반하였다. 상기 용액을 농축시키고, 실온에서 900 ml 의 이소프로필 알콜을 첨가하였다. 침전된 생성물을 여과로써 제거하고, 감압하에 건조시켰다.
NMR 분석은 모든 NHS 에스테르가 소비되고, 목적하는 디술피드 생성물 (17) 이 형성됨을 보여 주었다. 상기 생성물을 디클로로메탄 (150 ml) 내에 용해시키고, 디티오트레이톨 (DTT) (0.84 g, 5.446 mmoles) 및 트리에틸아민 (2.0 ml) 을 첨가하고, 상기 반응 혼합물을 아르곤 대기하 실온에서 3 시간 동안 교반하였다. 다음, BHT (0.09 g) 를 첨가하고, 상기 용매를 감압하에 증류시켰다. 잔류의 - 조 디티올 생성물 (18) 을 디클로로메탄 (40 ml) 내에 용해시키고, 실온에서 이소프로필 알콜로 침전시켰다. 건조 후 수율 14.3 g.
1H NMR (d6-DMSO): 1.07 ppm (t, 2H, -SH); 2. 66 ppm (dt, 4H, - CH2-S-); 3.51 ppm (s, PEG 백본); 3.90 ppm (s, 4H, -OCH2CO-, 8.05 ppm (t, 2H, -NH-).

Claims (39)

  1. 수용성 중합체의 티올-선택성 유도체의 제조 방법으로서, 하기의 단계를 포함하는 방법 :
    (i) 카르복실산, 카르복실산 유도체, 카르복실산 에스테르, 카르보네이트 에스테르, 카르본산, 산 할라이드 및 무수물로 이루어진 군으로부터 선택되는 친전자체 ("-E") 로 활성화된 하나의 말단을 가진 수용성 중합체 분절 ("POLY") 을 포함하는 수용성 중합체를 제공하는 단계, 및
    (ii) 상기 중합체를 대칭성의 디술피드인 (NU-Y-S-)2 와 반응시켜 (여기에서, NU 는 친핵체이고, Y 는 탄소 원자 2 내지 10 개를 포함하는 알킬렌, 치환된 알킬렌, 시클로알킬렌, 치환된 시클로알킬렌, 아릴 및 치환된 아릴로 이루어진 군에서 선택되고, S 는 황 원자임), POLY-L0,1-X-Y-S-S-Y-X-L0,1-POLY (여기서, X 는 친전자체 및 친핵체 사이의 반응으로부터 생성되는 기이고, L 은 임의의 링커이며, L0 는 링커의 부재를 가리키고, L1 은 링커의 존재를 가리킴) 를 형성하는 단계를 포함하는 방법으로서,
    상기 수용성 중합체 분절의 공칭 평균 분자량이 1,000 달톤 내지 50,000 달톤인 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 POLY-L0,1-X-Y-S-S-Y-X-L0,1-POLY 내의 디술피드 결합을 환원시켜 POLY-L0,1-X-Y-SH 를 형성하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 수용성 중합체 분절이 폴리(알킬렌 옥시드), 폴리(비닐 피롤리돈), 폴리(비닐 알콜), 폴리옥사졸린, 폴리(아크릴로일모르폴린), 및 폴리(옥시에틸화된 폴리올) 로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 제 3 항에 있어서, 수용성 중합체 분절이 폴리알킬렌 옥시드인 방법.
  7. 제 6 항에 있어서, 상기-수용성 중합체 분절이 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 인 방법.
  8. 제 7 항에 있어서, 상기 폴리에틸렌 글리콜이 말단-캡핑 (end-capped) 되는 방법.
  9. 제 1 항에 있어서, 상기 (ii) 의 반응 단계 전에 단계 (i) 로부터의 상기 수용성 중합체를 정제하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  10. 제 1 항에 있어서, 상기 (ii) 의 반응 전에 단계 (i) 로부터의 상기 수용성 중합체를 정제하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  11. 제 9 항에 있어서, 상기 정제 단계가 크로마토그래피 또는 화학적 분리를 포함하는 방법.
  12. 제 10 항에 있어서, 상기 정제 단계가 이온 교환 크로마토그래피를 포함하는 방법.
  13. 제 6 항에 있어서, 단계 (i) 에서 제공되는 상기 중합체가 5% 미만의 폴리알킬렌 옥시드 디올을 함유하는 방법.
  14. 제 1 항에 있어서, 상기 친핵체가 일차 아미노, 이차 아미노, 히드록시, 이미노, 티올, 및 티오에스테르로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  15. 제 14 항에 있어서, 상기 친핵체가 일차 또는 이차 아미노인 방법.
  16. 제 7 항에 있어서, 상기 중합체가 알콕시, 치환된 알콕시, 알케닐옥시, 치환된 알케닐옥시, 알키닐옥시, 치환된 알키닐옥시, 아릴옥시, 및 치환된 아릴옥시로 이루어진 군으로부터 선택되는 말단-캡핑기 (end-capping group) 를 포함하는 방법.
  17. 제 7 항에 있어서, 단계 (i) 에서의 상기 중합체가 폴리에틸렌 글리콜의 N-히드록시숙신이미딜 프로피오네이트 또는 N-히드록시숙신이미딜 부타노에이트인 방법.
  18. 제 1 항에 있어서, 상기 분자가 시스타민 또는 시스테아민인 방법.
  19. 삭제
  20. 제 2 항에 있어서, 상기 POLY-L0,1-X-Y-SH 를 단백질의 티올 또는 보호된 티올기와 반응시켜, 디술피드-연결 중합체-단백질 컨쥬게이트 ("POLY-L0,1-X-Y-S-S-단백질") 를 형성하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  21. 제 7 항에 있어서, 상기 폴리에틸렌 글리콜이 선형, 분지형, 포크형 (forked), 및 다중-팔 (multi-armed) 로 이루어진 군으로부터 선택되는 구조를 가지는 방법.
  22. 제 7 항에 있어서, 상기 폴리에틸렌 글리콜이 가수분해가능한 연결을 포함하는 방법.
  23. 삭제
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