Campo da Invenção:
A presente invenção se relaciona de forma geral a conjugados que compreendem uma porção de Fator VIII (ou seja, uma porção com atividade de Fator VIII) e um polímero.
Além disso, a invenção se relaciona a composições que compreendem os conjugados, métodos para a síntese dos conjugados e métodos para tratamento de pacientes.
Fundamentos da Invenção:
A hemostasia é o processo de suspensão do fluxo de saída de sangue de um vaso sangüíneo danificado. Para os mamíferos, bem como para muitos outros organismos, o processo hemostático tem importância crítica para a sobrevivência. Defeitos no processo hemostático podem resultar, por exemplo, na incapacidade de formar eficazmente coágulos sangüíneos que servem para interromper a perda de sangue após trauma vascular. Em humanos, indivíduos que sofrem da incapacidade de formar coágulos sangüíneos são chamados hemofílicos. Uma preocupação particular para os hemofílicos é o risco de vida causado por um sangramento que, uma vez iniciado, nunca será interrompido.
Geralmente, os hemofílicos não possuem a capacidade de produzir quantidades eficazes de uma ou mais substâncias necessárias à formação de coágulos sangüíneos. Por exemplo, hemofílicos que sofrem de hemofilia A (também denominada “hemofilia clássica”) são incapazes de produzir níveis eficazes de Fator VIII (também conhecido como “fator A anti-hemofilia”, “globulina anti-hemofílica” e “GAH”). O
Fator VIII é um componente-chave de uma das várias “cascatas” de reações que resultam na formação de coágulos sangüíneos. Crítico para a cascata de reações chamadas de “via intrínseca”, o Fator VIII em última análise influencia a conversão de fibrinogênio no componente principal de coágulos sangüíneos, a fibrina.
Embora a via intrínseca da formação do coágulo sangüíneo seja relativamente complexa, o papel do Fator VIII pode ser descrito resumidamente. Na presença de quantidades relativamente pequenas de trombina (liberada, por exemplo, pelas células de tecidos rompidos), o Fator VIII é convertido em sua forma ativada, conhecida como Fator VIIIa. O Fator VIIIa (juntamente com outras substâncias), por sua vez, ativa outro fator, o Fator X, em Fator Xa. A seguir, o Fator Xa (juntamente com outras substâncias) converte protrombina em trombina, tendo como conseqüência a produção de uma quantidade relativamente grande de trombina ao longo do tempo. Quantidades relativamente grandes de trombina convertem eficazmente fibrinogênio em fibrina. A fibrina, por sua vez, forma a matriz ou treliça responsável pela formação de coágulos sangüíneos. O papel do Fator VIII na via intrínseca da coagulação sangüínea é mostrado esquematicamente abaixo.
Afetando um ou dois indivíduos do sexo masculino para cada 10.000 nascidos vivos em todas as populações, a hemofilia A pode ser resultado de qualquer uma das várias mutações do gene do Fator VIII, que se localiza no cromossomo X. Dependendo da mutação em particular, a hemofilia A pode se manifestar como grave, moderada ou leve. Indivíduos que sofrem das formas mais graves de hemofilia A são desprovidos inteiramente da capacidade de expressar formas ativas de Fator VIII. Clinicamente, indivíduos atingidos pela hemofilia A apresentam hemorragia muscular, hemorragia articular, machucam-se facilmente e têm sangramento prolongado por ferimentos. A idade média dos indivíduos que sofrem de hemofilia A sem tratamento é de vinte anos. O tratamento atual da hemofilia A envolve a infusão de concentrado exógeno de Fator VIII coletado de plasma humano ou preparado através de técnicas de DNA recombinante. Uma vez que estes tratamentos servem apenas para suplementar a ausência de níveis eficazes de Fator VIII, os indivíduos que sofrem de deficiência do Fator VIII necessitam de injeções regulares de concentrado de Fator VIII ao longo de toda a vida.
São disponíveis várias formas comerciais de concentrados de Fator VIII para fornecer terapia de substituição para pacientes que sofrem de hemofilia A. Por exemplo, produtos de concentrado derivado do sangue de Fator VIII vendidos sob os nomes comerciais Hemofil® M (Baxter, Deerfield, IL), Koate®-DVI (Bayer, Research Tringle Park, NC), Monarc-M® (American Red Cross, Washington, D.C.) e Monoclate-P® (Aventis, Bridgewater, NJ). Com relação aos concentrados de Fator VIII preparados de forma recombinante, são fornecidos produtos comerciais sob os nomes Helixate® FS (Aventis, Bridgewater, NJ), Kogenate FS® (Bayer, Research Triangle Park, NC), Recombinate® (Baxter, Deerfield, IL), Advate® (Baxter, Deerfield, IL) e ReFacto® (Wyeth/Genetics Institute, Cambridge, MA).
Geralmente preferem-se fontes recombinantes de concentrados de Fator VIII em relação às fontes derivadas do sangue, uma vez que estas últimas envolvem o risco de transmissão de vírus e/ou outras doenças associadas à doação de sangue. Embora formulações de origem recombinante não possuam estas desvantagens, o processamento de produtos de origem recombinante frequentemente necessita da presença de certas proteínas como, por exemplo, albumina, que inevitavelmente estarão presentes na formulação final administrada ao paciente. Freqüentemente, pacientes que recebem tais formulações desenvolvem reações alérgicas a estas proteínas estranhas. Em qualquer caso, produtos tanto derivados do quanto de origem recombinante apresentam a desvantagem de necessitarem de administrações repetidas.
A PEGuilação, ou a anexação de um derivado de poli(etileno glicol) a uma proteína, foi descrita como um meio de reduzir a imunogenicidade, além de ser uma forma de prolongar a meia-vida da proteína in vivo. Com relação ao Fator VIII, no entanto, experiências prévias com a formação de conjugados proteína-polímero mostraram ser de pouco valor preditivo em relação ao acoplamento de polímero ao Fator VIII. Veja a Patente U.S. N° 4.970.300.
Apesar destas dificuldades, foram descritas tentativas de preparação de composições satisfatórias de conjugados de certos polímeros ao Fator VIII. Por exemplo, a Patente U.S. N° 4.970.300, citada anteriormente, descreve a PEGuilação de Fator VIII usando um derivado de poli(etileno glicol) específico com um peso molecular entre cerca de 500 a 5.000. Além disso, a Patente U.S. N° 6.048.720 descreve uma proteção eficaz contra a degradação em um ambiente in vitro quando quatro a cinco filamentos de monometoxi poli(etileno glicol) são conjugados ao Fator VIII.
Nenhum destes conjugados descritos, no entanto, provou solucionar de forma satisfatória os problemas associados às terapias atuais baseadas em Fator VIII. Por exemplo, conjugados compostos de polímeros relativamente pequenos (por exemplo, de cerca de 5.000 Dáltons ou menos) podem não fornecer adequadamente meia vida prolongada in vivo e/ou não reduzir suficientemente a resposta imune. Além disso, conjugados que têm muitos polímeros individuais anexados ao Fator VIII têm maior probabilidade de ter atividade reduzida como resultado dos locais de bloqueio do(s) polímero(s) necessários para a atividade.
Dessa forma, ainda existe necessidade na técnica do fornecimento de conjugados adicionais entre polímeros hidrossolúveis e porções que tenham atividade de Fator VIII. A presente invenção é, portanto, dirigida a tais conjugados, bem como a composições que compreendem os conjugados e métodos relacionados, como aqui descritos, os quais, se acredita, sejam novos e completamente inéditos na técnica.
Sumário da Invenção:
Conseqüentemente, é um objetivo primário dessa invenção fornecer uma composição que compreende vários conjugados, preferivelmente, embora não necessariamente, cada um tendo de um a três polímeros hidrossolúveis anexados de forma covalente a uma porção de Fator VIII, em que cada polímero hidrossolúvel preferivelmente tem um peso molecular médio nominal na faixa de mais de 5.000 Dáltons a cerca de 100.000 Dáltons.
É outro objetivo da invenção fornecer tal conjugado em que cada um dos polímeros hidrossolúveis seja um poli(óxido de alquileno).
É outro objetivo adicional da invenção fornecer tal conjugado em que cada um dos polímeros hidrossolúveis seja um poli(etileno glicol).
É ainda um objetivo da invenção fornecer um conjugado que compreenda vários conjugados monoPEGuilados de porção de Fator VIII.
É ainda um objetivo adicional da invenção fornecer um método para a preparação de conjugados de polímero que compreenda as etapas de colocação em contato de um ou mais polímeros hidrossolúveis ativados com uma porção de Fator VIII sob condições suficientes para resultar em vários conjugados, preferivelmente, embora não necessariamente, cada um tendo de um a três polímeros hidrossolúveis anexados de forma covalente a uma porção de Fator VIII, em que o polímero hidrossolúvel tenha, preferivelmente, um peso molecular médio nominal na faixa de mais de 5.000 Dáltons a cerca de 150.000 Dáltons.
É um objetivo adicional da invenção fornecer um método para o tratamento de um paciente que necessite de terapia com Fator VIII, que compreenda a etapa de administração ao paciente de uma composição como aqui descrita, em que a 7/76 composição contenha uma quantidade terapeuticamente eficaz de um ou mais dos conjugados.
É ainda um objetivo adicional da invenção fornecer um método para a preparação de um conjugado hidrossolúvel de polímero-porção de Fator VIII que compreenda a etapa de colocação em contato, sob condições de conjugação, uma porção de Fator VIII com um reagente polimérico.
Objetivos adicionais, vantagens e características inéditas da invenção serão exibidos na descrição a seguir e, em parte, se tornarão evidentes para aqueles com habilidade na técnica mediante leitura do texto a seguir, ou podem ser aprendidas pela prática da invenção.
Em uma modalidade, portanto, é fornecida uma composição que compreende vários conjugados, preferivelmente, embora não necessariamente, cada um tendo de um a três polímeros hidrossolúveis anexados de forma covalente a uma porção de Fator VIII, em que cada polímero hidrossolúvel preferivelmente tem um peso molecular médio nominal na faixa de mais de 5.000 Dáltons a cerca de 150.000 Dáltons. Embora possa ser usada qualquer porção de Fator VIII, prefere-se que as composições compreendam o próprio Fator VIII (como descrito, por exemplo, na Patente U.S. N° 4.757.006), Fator Villa (ou seja, a forma ativada de Fator VIII produzida quando o Fator VIII é colocado em contato com quantidades relativamente pequenas de trombina), Fator Viii:vWF (ou seja, Fator Viii ligado ao Fator de von Willebrand) e/ou versões truncadas de Fator Viii, tais como Fator Viii desprovido do Domínio B (como descrito, por exemplo, na Patente U.S. N° 4.868.112).
Os polímero(s) pode ser qualquer polímero hidrossolúvel, e a invenção não é limitada quanto a este aspecto. Prefere-se, no entanto, que cada polímero presente no conjugado seja selecionado do grupo que consiste em poli(óxido de alquileno), poli(vinil pirrolidona), poli(vinil álcool), polioxazolina, poli(acriloilmorfolino), e combinações destes. Prefere-se particularmente, no entanto, que um poli(óxido de alquileno), tal como um derivado de poli(etileno glicol), seja usado como o polímero na presente invenção.
Os conjugados aqui descritos reduzem, de forma vantajosa, a imunogenicidade, um problema encontrado por muitos hemofílicos tratados com fontes exógenas de Fator VIII. Além disso, os presentes conjugados necessitam de uma freqüência diminuída de dosagem, comparados às composições de Fator VIII sem conjugados. Pela redução da freqüência de dosagem, os conjugados diminuem vantajosamente o número de injeções dolorosas a que os hemofílicos devem se submeter a fim de fornecer níveis sustentados de um agente com atividade de Fator VIII.
Em outra modalidade, é fornecido um método para a preparação de um conjugado. O método compreende a etapa de colocação em contato de um ou mais polímeros hidrossolúveis ativados, (ou seja, um reagente polimérico) preferivelmente tendo um peso molecular médio nominal na faixa de mais de 5.000 Dáltons a cerca de 150.000 Dáltons, com uma porção de Fator VIII. A ativação do polímero hidrossolúvel pode ser obtida por qualquer método conhecido na técnica, desde que o polímero resultante, sob as condições adequadas de pH, temperatura, e assim por diante, formem uma ligação covalente, de forma que uma porção do Fator VIII seja anexada de forma covalente ao polímero. A colocação em contato de um ou mais polímeros hidrossolúveis ativados com uma porção do Fator VIII é realizada sob aquelas condições necessárias para que o polímero hidrossolúvel ativado forme uma adesão covalente no local desejado na porção. O método resulta em vários conjugados, preferivelmente, embora não necessariamente, cada um tendo de um a três polímeros hidrossolúveis anexados de forma covalente a uma porção do Fator VIII. Em alguns casos, o conjugado pode compreender um único polímero anexado a duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito ou mais porções de Fator VIII. Opcionalmente, a composição resultante pode ser adicionalmente processada, a fim de remover espécies indesejadas tais como, por exemplo, conjugados tendo um número indesejado de polímeros. A fim de remover tais espécies indesejadas, podem ser usadas técnicas de purificação como, por exemplo, cromatografia por exclusão de tamanho.
Ainda em outra modalidade da invenção, são fornecidas composições que compreendem um conjugado da invenção em combinação com um excipiente farmaceuticamente aceitável. As composições englobam todos os tipos de formulações e, em particular, aquelas que são adequadas para injeção, tais como pós que possam ser reconstituídos, além de líquidos (por exemplo, suspensões e soluções).
Em uma modalidade adicional da invenção, é fornecido um método de administração do conjugado. O método de administração compreende a etapa de administração ao paciente de uma composição como aqui descrita, em que a composição contém uma quantidade terapeuticamente eficaz do conjugado. Tipicamente, a etapa de administração da composição contendo conjugado é efetuada por injeção (por exemplo, injeção intramuscular, injeção intravenosa, injeção subcutânea, e assim por diante).
Breve Descrição das Figuras:
A FIG. 1 é um diagrama de SEC que corresponde à mistura de reação formada mediante peguilação de Fator VIII desprovido do Domínio B com mPEG-SPA, 30K, como descrito no Exemplo 6.
A FIG. 2 é um diagrama de SEC que corresponde ao conjugado purificado de Fator VIII Desprovido do Domínio B- PEG preparado pela conjugação da proteína ao mPEG-SPA, 30K, como descrito no Exemplo 6.
A FIG. 3 é diagrama de SEC que corresponde à mistura de reação formada mediante PEGuilação de Fator VIII desprovido do Domínio B com mPEG-MAL, 20K, como descrito no Exemplo 7. Como pode ser observado, o rendimento do produto monoPEGuilado foi de aproximadamente 33%.
A FIG. 4 é um diagrama de SEC que corresponde ao conjugado purificado de Fator VIII Desprovido do Domínio B- PEG preparado pela conjugação da proteína a mPEG-MAL, 20K, como descrito no Exemplo 7. O conjugado purificado era um monômero com ~94% de PEG.
A FIG. 5 é um diagrama de SEC que corresponde à mistura de reação formada mediante PEGuilação de Fator VIII Desprovido do Domínio B com mPEG-SMB, 30K, como descrito no Exemplo 8, O rendimento da proteína monoPEGuilada (1-mer) foi de aproximadamente 41%.
Descrição Detalhada da Invenção:
Antes de descrever a presente invenção em detalhes, deve-se entender que essa invenção não se limita aos polímeros, técnicas sintéticas, porções de Fator VIII e semelhantes em particular, uma vez que estes podem variar.
Deve-se observar que, como usadas nessa especificação e nas reivindicações, as formas no singular “um”, “uma” e “o” ou “a” incluem referentes no plural, a menos que o contexto indique claramente de forma diferente. Dessa forma, por exemplo, referência a “um polímero” inclui um único polímero, além de dois ou mais do mesmo polímero ou de polímeros diferentes, referência a “um excipiente opcional” se refere a um único excipiente opcional, bem como a dois ou mais do mesmo excipiente opcional ou a excipientes opcionais diferentes, e semelhantes.
Ao descrever e reivindicar a presente invenção, a seguinte terminologia será usada de acordo com as definições descritas abaixo.“PEG”, “polietileno glicol” e “poli(etileno glicol)” como aqui usados, são intercambiáveis e visam englobar qualquer poli(etileno óxido) hidrossolúvel. Tipicamente, PEGs para uso de acordo com a invenção compreendem a seguinte estrutura “-(OCH2CH2)n”, na qual (n) é 2 a 4.000. Como aqui usado, PEG também inclui “-CH2CH2-O(CH2CH2O)n- CH2CH2-” e “-(OCH2CH2)nO-”, dependendo se os oxigênios terminais foram ou não deslocados. Ao longo da especificação e das reivindicações, deve-se lembrar que o termo “PEG” inclui estruturas que têm vários grupos de terminais ou “de cobertura de extremidade” e assim por diante. O termo “PEG” também significa um polímero que contém uma maioria, ou seja, mais de 50%, de subunidades de repetição -OCH2CH2-. Com relação às formas específicas, o
PEG pode assumir qualquer número entre vários pesos moleculares, além das estruturas ou geometrias, tais como “ramificado”, “linear”, “bifurcado”, “multifuncional” e semelhantes, a serem descritos com mais detalhes abaixo.
Os termos “coberto na extremidade” e “coberto terminalmente” são aqui usados de forma intercambiável para se referir a um terminal ou ao término de um polímero com uma porção de cobertura de extremidade. Tipicamente, embora não necessariamente, a porção de cobertura da extremidade compreende um grupo hidroxi ou C1-20 alcoxi, mais preferivelmente um grupo C1-10 alcoxi, e ainda mais preferivelmente, um grupo C1-5 alcoxi. Dessa forma, exemplos de porções de cobertura de extremidade incluem alcoxi (por exemplo, metoxi, etoxi e benziloxi), além de aril, heteroaril, ciclo, heterociclo e semelhantes. Deve-se lembrar que a porção de cobertura da extremidade pode incluir um ou mais átomos do monômero terminal no polímero (por exemplo, a porção de cobertura da extremidade “metoxi” em CH3(OCH2CH2)n). Além disso, formas saturadas, insaturadas, substituídas e não substituídas de cada um dos anteriormente citados são previstas. Além disso, o grupo de cobertura da extremidade também pode ser um silano. O grupo de cobertura da extremidade também pode ser composto de forma vantajosa de uma etiqueta detectável. Quando o polímero tem um grupo de cobertura da extremidade que compreende uma etiqueta detectável, a quantidade ou localização do polímero e/ou da porção (por exemplo, agente ativo) na qual o polímero é acoplado, pode ser determinada usando um detector adequado. Tais etiquetas incluem, sem limitação, substâncias fluorescentes e quimioluminescentes, porções usadas em etiquetagem de enzima, colorimétricas (por exemplo, corantes), íons metálicos, porções radioativas e semelhantes. Detectores adequados incluem fotômetros, películas, espectrômetros e semelhantes. O grupo de cobertura da extremidade também pode compreender de forma vantajosa um fosfolipídeo. Quando o polímero tem um grupo de cobertura da extremidade que compreende um fosfolipídeo, são fornecidas propriedades exclusivas ao polímero e ao conjugado resultante. Fosfolipídeos exemplares incluem, sem limitação, aqueles selecionados da classe de fosfolipídeos denominada fosfatidilcolinas. Fosfolipídeos específicos incluem, sem limitação, aqueles selecionados do grupo que consiste em dilauroilfosfatidilcolina, dioleilfosfatidilcolina, dipalmitoilfosfatidilcolina, dilteroilfosfatidilcolina, behenoilfosfatidilcolina, araquidoilfosfatidilcolina e lecitina.“De ocorrência não natural”, com relação a um polímero aqui descrito, significa um polímero que em sua totalidade não é encontrado na natureza. Um polímero da invenção de ocorrência não natural pode, no entanto, conter um ou mais monômeros ou segmentos de monômeros que são de ocorrência natural, desde que a estrutura global do polímero não seja encontrada na natureza.
O termo “hidrossolúvel”, como em um “polímero hidrossolúvel” é qualquer polímero que seja solúvel em água em temperatura ambiente. Tipicamente, um polímero hidrossolúvel transmitirá pelo menos cerca de 75%, mais preferivelmente pelo menos cerca de 95%, da luz transmitida pela mesma solução após filtração. Em termos de peso, um polímero hidrossolúvel será preferivelmente pelo menos cerca de 35% (por peso) solúvel em água, mais preferivelmente pelo menos cerca de 50% (por peso) solúvel em água, ainda mais preferivelmente cerca de 70% (por peso) solúvel em água, e ainda mais preferivelmente cerca de 85% (por peso) solúvel em água. Prefere-se principalmente, no entanto, que o polímero hidrossolúvel seja cerca de 95% (por peso) solúvel em água ou completamente solúvel em água.“Peso molecular médio nominal”, no contexto de um polímero hidrossolúvel de ocorrência não natural como, por exemplo, PEG, se refere ao peso molecular em massa médio do polímero, determinado tipicamente por cromatografia por exclusão de tamanho, MALDI (desabsorção/ionização de matriz assistida por laser), técnicas de dispersão de luz ou determinação da velocidade intrínseca em 1,2,4- triclorobenzo. Os polímeros são tipicamente polidispersos, possuindo valores baixos de polidispersividade de preferivelmente menos de cerca de 1,2, mais preferivelmente menos de cerca de 1,15, ainda mais preferivelmente menos de cerca de 1,10, e ainda mais preferivelmente menos de cerca de 1,05 e, principalmente, menos de cerca de 1,03.
O termo “ativo” ou “ativado”, quando usado em conjunto com um grupo funcional em particular, se refere ao grupo reativo funcional que reage prontamente com um eletrófilo ou um nucleófilo em outra molécula. Isto é o oposto do que ocorre com outros grupos que necessitam de catalisadores fortes ou de condições de reação altamente impraticáveis a fim de reagir (ou seja, um grupo “não reativo” ou “inerte”).
Como aqui usado, o termo “grupo funcional”, ou qualquer sinônimo deste, visa englobar formas protegidas deste, além de formas não protegidas.
Os termos “ligação” ou “ligante” são aqui usados para se referir a um átomo ou a uma coleção de átomos usados opcionalmente para ligar porções de interconexão, tais como um terminal de um segmento de polímero e uma porção de Fator VIII ou um eletrófilo ou nucleófilo de uma porção de Fator VIII. O ligante da invenção pode ser hidroliticamente estável ou pode incluir uma ligação fisiologicamente hidrolisável ou enzimaticamente degradável.
“Alquil” se refere a uma cadeia de hidrocarboneto, com comprimento que varia tipicamente de cerca de 1 a 15 átomos. Tais cadeias de hidrocarbonetos são preferivelmente, mas não necessariamente, saturadas, e podem ser cadeias ramificadas ou lineares, embora, tipicamente, sejam preferidas cadeias lineares. Grupos alquil exemplares incluem metil, etil, propil, butil, pentil, 1-metilbutil, 1-etilpropil, 3-metilpentil, e semelhantes. Como aqui usado, “alquil” inclui cicloalquil, além de alquil contendo cicloalquileno.
“Alquil inferior” se refere a um grupo alquil contendo de 1 a 6 átomos de carbono, e pode ser de cadeia linear ou ramificado, como exemplificado por metil, etil, n-butil, i- butil e t-butil.
“Cicloalquil” se refere a uma cadeia cíclica de hidrocarboneto saturada ou insaturada, incluindo compostos cíclicos unidos em ponte, fundidos ou em espiral, preferivelmente constituída de 3 a cerca de 12 átomos de carbono, mais preferivelmente 3 a cerca de 8 átomos de carbono. “Cicloalquileno” se refere a um grupo cicloalquil que é inserido em uma cadeia alquil pela ligação da cadeia em quaisquer dois carbonos no sistema de anel cíclico.
“Alcoxi” se refere a um grupo -O-R, em que R é alquil ou alquil substituído, preferivelmente C1-6 alquil (por exemplo, metoxi, etoxi, propiloxi e assim por diante).
O termo “substituído”, como em, por exemplo, “alquil substituído”, se refere a uma porção (por exemplo, um grupo alquil) substituído com um ou mais substituintes não interferentes, tais como, mas sem limitação: alquil, C3-8 cicloalquil, por exemplo, ciclopropil, ciclobutil, e semelhantes; halo, por exemplo, flúor, cloro, bromo e iodo; ciano; alcoxi, fenil inferior; fenil inferior substituído; e semelhantes. “Aril substituído” é aril tendo um ou mais grupos não interferentes como um substituinte. Para substituições em um anel fenil, os substituintes podem estar em qualquer orientação (ou seja, orto, meta ou para).
“Substituintes não interferentes” são aqueles grupos que, quando presentes em uma molécula, são tipicamente não reativos com outros grupos funcionais contidos dentro da molécula.
“Aril” significa um ou mais anéis aromáticos, cada um de 5 ou 6 átomos centrais de carbono. Aril inclui anéis aril múltiplos que podem estar fundidos, como em naftil, ou não fundidos, como em bifenil. Anéis aril também podem estar fundidos ou não fundidos a um ou mais anéis cíclicos hidrocarboneto, heteroaril ou heterocíclicos. Como aqui usado, “aril” inclui heteroaril.
“Heteroaril” É Um Grupo Aril Contendo De Um A Quatro Heteroátomos, Preferivelmente Enxofre, Oxigênio Ou Nitrogênio, Ou Uma Combinação Destes. Anéis Heteroaril Também Podem Estar Fundidos A Um Ou Mais Anéis Cíclicos De Hidrocarboneto, Heterocíclicos, Aril Ou Heteroaril.
“Heterociclo” ou “heterocíclico” significa um ou mais anéis de 5-12 átomos, preferivelmente 5-7 átomos, com ou sem caráter de insaturação ou aromático, e com pelo menos um átomo do anel que não seja um carbono. Heteroátomos preferidos incluem enxofre, oxigênio e nitrogênio.“Heteroaril substituído” é heteroaril tendo um ou mais grupos não interferentes como substituintes.
“Heterociclo substituído” é um heterociclo com uma ou mais cadeias laterais formadas por substituintes não interferentes.
“Eletrófilo” e “grupo eletrofílico” se referem a um íon ou átomo, ou coleção de átomos que podem ser iônicos, tendo um centro eletrofílico, ou seja, um centro que atrai elétrons, capaz de reagir com um nucleófilo.
“Nucleófilo” e “grupo nucleofílico” se refere a um íon ou átomo, ou coleção de átomos que podem ser iônicos, tendo um centro nucleofílico, ou seja, um centro que atrai um centro eletrofílico ou com um eletrófilo.
Uma ligação “fisiologicamente passível de clivagem” ou “hidrolisável” ou “degradável” é uma ligação que reage com água (ou seja, é hidrolisada) sob condições fisiológicas. Prefere-se as ligações que tenham uma meia-vida de hidrólise em pH 8, a 25°C, de menos de cerca de 30 minutos. A tendência de uma ligação hidrolisar na água dependerá não apenas do tipo geral de ligação que conecta dois átomos centrais, mas também dos substituintes anexados a esses átomos centrais. Ligações hidroliticamente apropriadas instáveis ou fracas incluem, sem limitação, éster de carboxilato, éster de fosfato, anidreto, acetais, cetais, éter de aciloxialquil, iminas, ortoésteres, peptídeos e oligonucleotídeos.
Uma “ligação enzimaticamente degradável” significa uma ligação que é submetida à degradação por uma ou mais enzimas.
Uma ligação ou união “hidroliticamente estável” se refere a uma união química, tipicamente uma união covalente, que é substancialmente estável na água, ou seja, não sofre hidrólise sob condições fisiológicas em qualquer grau apreciável ao longo de um período de tempo prolongado. Exemplos de ligações hidroliticamente estáveis incluem, sem limitação, as seguintes: ligações carbono-carbono (por exemplo, em cadeias alifáticas), éteres, amidas, uretanos, e semelhantes. Geralmente, uma ligação hidroliticamente estável é aquela que exibe uma taxa de hidrólise de menos de cerca de 1-2% por dia sob condições fisiológicas. As taxas de hidrólise de ligações químicas representativas podem ser encontradas ma maioria dos livros-texto de química.
“Excipiente ou transportador farmaceuticamente aceitável” se refere a um excipiente que pode opcionalmente ser incluído nas composições da invenção, e que não causa quaisquer efeitos toxicológicos adversos ao paciente. “Quantidade farmacologicamente eficaz”, “quantidade fisiologicamente eficaz” e “quantidade terapeuticamente eficaz” são aqui usados de forma intercambiável para significar a quantidade de um conjugado de polímero-porção de Fator VIII que é necessária para fornecer um nível desejado do conjugado (ou da porção de Fator VIII não conjugada correspondente) na corrente sangüínea ou no tecido-alvo. A quantidade precisa dependerá de numerosos fatores, por exemplo, da porção de Fator VIII em particular, dos componentes e das características físicas da composição terapêutica, da população de pacientes direcionada, de considerações individuais do paciente, e semelhantes, e pode ser rapidamente determinada por aqueles com habilidade na técnica, com base nas informações aqui fornecidas.
“Multifuncional” significa um polímero com 3 ou mais grupos funcionais nele contidos, em que os grupos funcionais podem ser o mesmo ou diferentes. Reagentes poliméricos multifuncionais da invenção conterão tipicamente de cerca de 3-100 grupos funcionais, ou de 3-50 grupos funcionais, ou de 3-25 grupos funcionais, ou de 3-15 grupos funcionais, ou de 3 a 10 grupos funcionais ou conterão 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 grupos funcionais dentro da estrutura central do polímero.
O termo “porção de Fator VIII”, como aqui usado, se refere a uma porção com atividade de Fator VIII. A porção de Fator VIII também terá pelo menos um grupo eletrofílico ou grupo nucleofílico adequado para reação com um reagente polimérico. Tipicamente, embora não necessariamente, uma porção do Fator VIII é uma proteína. Além disso, o termo “porção de Fator VIII” engloba tanto uma porção do Fator VIII antes da conjugação quanto um resíduo da porção do Fator VIII após a conjugação. Como será explicado com mais detalhe abaixo, aquele com habilidade na técnica pode determinar se qualquer porção específica tem atividade de Fator VIII.
O termo “paciente”, se refere a um organismo vivo que sofre de, ou que tem tendência a, uma condição que pode ser evitada ou tratada pela administração de um agente ativo (por exemplo, conjugado), e inclui tanto humanos e animais.
“Opcional” ou “opcionalmente” significa que a circunstância descrita subseqüentemente pode ou não ocorrer, de forma que a descrição inclui casos nos quais a circunstância ocorre e casos nas quais não ocorre.
Resíduos de aminoácido em peptídeos são abreviados da seguinte forma: Fenilalanina é Phe ou F; Leucina é Leu ou L; Isoleucina é Ile ou I; Metionina é Met ou M; Valina é Val ou V; Serina é Ser ou S; Prolina é Pro ou P; Treonina é Thr ou T; Alanina é Ala ou A; Tirosina é Tyr ou Y; Histidina é His ou H; Glutamina é Gln ou Q; Asparagina é Asn ou N; Lisina é Lys ou K; Ácido aspártico é Asp ou D; Ácido glutâmico é Glu ou E; Cisteína é Cys ou C; Triptofano é Trp ou W; Arginina é Arg ou R; e Glicina é Gly ou G.
Abordando agora uma primeira modalidade da invenção, é fornecida uma composição que compreende vários conjugados, preferivelmente, embora não necessariamente, cada um tendo de um a três polímeros hidrossolúveis anexados de forma covalente a uma porção de Fator VIII, em que cada um dos polímeros hidrossolúveis preferivelmente tem um peso molecular médio nominal na faixa de mais de 5.000 Dáltons a cerca de 150.000 Dáltons.
O Fator VIII nativo é uma glicoproteína de 2.351 aminoácidos, de cadeia única, que é organizada estruturalmente como A1-A2-B-A3-C1-C2. A seqüência expressa de 2.351 aminoácidos é fornecida como ID. DE SEQ. N°: 1.
Quando o polipeptídeo expresso é translocado no lúmen do retículo endoplasmático, no entanto, uma seqüência sinalizadora de 19 aminoácidos é clivada, o que resulta em uma segunda seqüência. Esta segunda seqüência, aqui fornecida como ID. DE SEQ. N°: 2, desprovida dos 19aminoácidos principais, é usada convencionalmente por pesquisadores para designer uma localização numérica (por exemplo, Arg372) a um certo resíduo de aminoácido de Fator VIII. Dessa forma, a menos que especificado de outra forma, todas as designações de uma localização numérica de um resíduo de aminoácido, como aqui fornecidas, são baseadas na ID. DE SEQ. N°: 2.
Na presença de quantidades relativamente pequenas de trombina, o Fator VIII é clivado por trombina em Arg372, Arg740 e Arg1689 para a produção de Fator VIIIa. O Fator VIIIa é um heterotrímero composto da subunidade A1 ligada (por meio de um íon cobre) à cadeia leve clivada por trombina A3-C1-C2 e a subunidade livre A2 ligada por meio de interações iônicas a A1. Será observado que uma porção de Fator VIII não se limita meramente às formas “ativas” de Fator VIII (por exemplo, Fator VIIIa), e que o termo “porção de Fator VIII” engloba formas “precursoras”, além de outras substâncias que têm um efeito pró-coagulante similar.
Para uma porção específica, é possível determinar se aquela porção tem atividade de Fator VIII. Por exemplo, várias linhas animais foram procriadas intencionalmente com a mutação genética para hemofilia, de forma que um animal produzido por uma linha como esta tivesse níveis muito baixos e insuficientes de Fator VIII. Tais linhas são disponíveis a partir de várias fontes tais como, sem limitação, a “Division of Laboratories e Research”, “New York Department of Public Health”, Albany, NY e o “Department of Pathology”, da Universidade da Carolina do Norte, Chapel Hill, NC. Ambas essas fontes, por exemplo, fornecem caninos que sofrem de hemofilia A canina. A fim de testar a atividade de Fator VIII de uma porção específica em questão, a porção é injetada no animal doente, é feito um pequeno corte, e o tempo de sangramento é comparado ao de um controle saudável. Outro método útil para a determinação da atividade de Fator VIII é estabelecer a atividade de co-fator e pró-coagulante. Veja, por exemplo, Mertens e cols. (1993) Brit. J. Haematol. 85:133-42. Outros métodos conhecidos por aqueles com habilidade na técnica também podem ser usados para determinar se uma porção específica tem atividade de Fator VIII. Tais métodos são úteis para a determinação da atividade de Fator VIII tanto da própria porção (e, portanto, pode ser usada como uma “porção de Fator VIII”) quanto do conjugado de polímero- porção correspondente.
Exemplos não limitantes de porções de Fator VIII incluem os seguintes: Fator VIII; Fator VIIIa; Fator VIII:C; Fator VIII:vWF; Fator VIII desprovido do Domínio B (e outras versões truncadas de Fator VIII); proteínas híbridas, tais como aquelas descritas na Patente U.S. N° 6.158.888; proteínas glicosiladas com atividade de Fator VIII, tais como aquelas descritas na Publicação de Aplicação de Patente U.S. N° US2003/0077752; e miméticos de peptídeo com atividade de Fator VIII. Versões truncadas preferidas de Fator VIII (englobadas pelo termo “Fator VIII desprovido do Domínio B”) correspondem a uma proteína com a seqüência de aminoácidos de Fator VIII humano (ID. DE SEQ. N° 1) com uma deleção que corresponde a pelo menos 581 aminoácidos dentro da região entre Arg759 e Ser1.709, mais preferivelmente em que a deleção corresponde a uma da região entre Pro1.000 e Asp1.582, a região entre Thr778 e Pro1.659 e a região entre Thr778 e G1u1.694. Fragmentos biologicamente ativos, variantes de deleção, variantes de substituição ou variantes de adição de qualquer um dos anteriormente citados que mantenham pelo menos algum grau de atividade de Fator VIII também podem servir como uma porção de Fator VIII.
A porção com atividade de Fator VIII pode ser modificada vantajosamente para incluir um ou mais resíduos de aminoácido tais como, por exemplo, lisina, cisteína e/ou arginina, a fim de fornecer uma adesão fácil do polímero a um átomo dentro da cadeia lateral do aminoácido. Técnicas para a adição de resíduos de aminoácido são bem conhecidas por aqueles com habilidade na técnica. É feita referência a J. March, “Advanced Organic Chemistry: Reactions Mechanisms and Structure”, 4a Ed. (Nova York: Wiley-Interscience, 1992).
A porção de Fator VIII pode ser obtida a partir de fontes derivadas do sangue. Por exemplo, Fator VIII pode ser fracionado do plasma humano usando técnicas de precipitação e centrifugação conhecidas por aqueles com habilidade na técnica. Veja, por exemplo, Wickerhauser (1976) Transfusion 16(4):345-350 e Slichter e cols. (1976) Transfusion 16(6):616-626. O Fator VIII também pode ser isolado de granulócitos humanos. Veja Szmitkoski e cols. (1977) Haematologia (Budap.) 11(1-2):177-187.
Além disso, uma porção do Fator VIII também pode ser obtida a partir de métodos recombinantes. Resumidamente, métodos recombinantes envolvem a construção do ácido nucléico que codifica o polipeptídeo ou fragmento desejado, clonagem do ácido nucléico em um vetor de expressão, transformação de uma célula hospedeira (por exemplo, bactérias, levedura ou célula de mamífero como, por exemplo, célula de ovário de hamster chinês ou célula de rim de filhote de hamster) e expressão do ácido nucléico para a produção do polipeptídeo ou fragmento desejado. Métodos para a produção e expressão de polipeptídeos recombinantes in vitro e em células hospedeiras procarióticas e eucarióticas são conhecidos por aqueles com habilidade na técnica. Veja, por exemplo, a Patente U.S. N° 4.868.122.
Para facilitar a identificação e purificação do polipeptídeo recombinante, seqüências de ácido nucléico que codificam uma etiqueta de epitopo ou outra seqüência de afinidade de ligação podem ser inseridas ou adicionadas na estrutura com a seqüência de codificação produzindo, dessa forma, uma proteína de fusão composta do polipeptídeo desejado de um polipeptídeo adequado para ligação. Proteínas de fusão podem ser identificadas e purificadas inicialmente executando-se uma mistura contendo a proteína de fusão através de uma coluna de afinidade que abriga porções de ligação (por exemplo, anticorpos) dirigidos contra a etiqueta de epitopo, ou outra seqüência de ligação nas proteínas de fusão ligando, dessa forma, a proteína de fusão dentro da coluna. A seguir, a proteína de fusão pode ser recuperada pela lavagem da coluna com uma solução apropriada (por exemplo, ácido) para liberar a proteína de fusão ligada. O polipeptídeo recombinante também pode ser identificado e purificado pela lise das células hospedeiras, que separa o polipeptídeo, por exemplo, por cromatografia por exclusão de tamanho, e coleta do polipeptídeo. Estes e outros métodos para identificação e purificação de polipeptídeos recombinantes são conhecidos por aqueles com habilidade na técnica.
As composições da invenção podem compreender vários conjugados, cada um composto da mesma porção de Fator VIII (ou seja, dentro da composição inteira, é encontrado apenas um tipo de porção de Fator VIII). Além disso, a composição pode compreender vários conjugados nos quais qualquer conjugado específico é composto de uma porção selecionada do grupo que consiste em duas ou mais porções de Fator VIII diferentes (ou seja, dentro da composição inteira, são encontradas duas ou mais porções de Fator VIII diferentes). Otimamente, no entanto, substancialmente todos os vários conjugados na composição (por exemplo, 85% ou mais dos vários conjugados na composição) são, cada um, compostos da mesma porção de Fator VIII.
Além disso, prefere-se que a composição contendo os conjugados seja livre, ou substancialmente livre, de albumina. Prefere-se também que a composição seja livre, ou substancialmente livre, de proteínas que não possuam atividade de Fator VIII. Dessa forma, prefere-se que a composição seja 85%, mais preferivelmente 95%, e principalmente 99% livre de albumina. Adicionalmente, prefere-se que a composição seja 85%, mais preferivelmente 95%, e principalmente 99% livre de qualquer proteína que não tenha atividade de Fator VIII.
Como discutido previamente, cada conjugado compreende uma porção de Fator VIII anexada a um polímero hidrossolúvel. Com relação ao polímero hidrossolúvel, ele é não peptídico, atóxico, de ocorrência não natural e biocompatível. Com relação à biocompatibilidade, a substância é considerada biocompatível se os efeitos benéficos associados ao uso da substância isoladamente ou com outra substância (por exemplo, agente ativo tal como uma porção de Fator VIII) em conexão com tecidos vivos (por exemplo, administração a um paciente) superam quaisquer efeitos deletérios, como avaliado por um médico. Com relação à não imunogenicidade, uma substância é considerada não imunogênica se o uso desejado da substância in vivo não produz uma resposta imune indesejada (por exemplo, a formação de anticorpos) ou, caso seja produzida uma resposta imune, que tal resposta não seja considerada clinicamente significativa ou importante, como avaliada por um médico. Prefere-se particularmente que o polímero hidrossolúvel seja biocompatível e não imunogênico.
Além disso, o polímero é caracterizado tipicamente como tendo de 2 a cerca de 300 terminais. Exemplos de tais polímeros incluem, sem limitação, poli(alquileno glicóis) tais como polietileno glicol (PEG), poli(propileno glicol) (“PPG”), copolímeros de etileno glicol e propileno glicol e semelhantes, poli(poliol oxietilado), poli(álcool olefiníco), poli(vinilpirrolidona), poli (hidroxialquilmetacrilamida), poli (hidroxialquilmetacrilato), poli(sacarídeos), poli(ácido α-hidroxi), poli(vinil álcool), polifosfazeno, polioxazolina, poli(N-acriloilmorfolino), e combinações de qualquer um dos anteriormente citados.
O polímero não se limita a uma estrutura particular e pode ser linear (por exemplo, alcoxi PEG ou PEG bifuncional), ramificado ou com multi-ramificado (por exemplo, PEG bifurcado ou PEG anexado a uma estrutura central de poliol), dendrítico, ou com ligações degradáveis. Além disso, a estrutura interna do polímero pode estar organizada em qualquer um dos inúmeros padrões diferentes, e pode ser selecionada do grupo que consiste em homopolímero, copolímero alternante, copolímero aleatório, copolímero em bloco, tripolímero alternante, tripolímero aleatório e tripolímero em bloco.
Tipicamente, PEG e outros polímeros hidrossolúveis são ativados com um grupo de ativação adequado, apropriado para acoplamento a um local desejado em uma porção do Fator VIII. Um reagente polimérico ativado possuirá um grupo reativo para reação com uma porção do Fator VIII. Reagentes poliméricos e métodos representativos para a conjugação destes polímeros a uma porção ativa são conhecidos na técnica e adicionalmente descritos em Zalipsky, S., e cols., “Use of Functionalized Poly(Etilene Glycols) for Modification of Polypeptides” em “Polyetilene Glycol Chemistry: Biotechnical and Biomedical Applications”, J. M. Harris, Plenus Press, Nova York (1992), e em Zalipsky (1995) Advanced Drug Reviews 16:157-182.
Tipicamente, o peso molecular médio nominal de qualquer polímero específico no conjugado é de cerca de 100 Dáltons a cerca de 150.000 Dáltons. Faixas exemplares, no entanto, incluem pesos moleculares médios nominais na faixa de mais de 5.000 Dáltons a cerca de 100.000 Dáltons, na faixa de cerca de 6.000 Dáltons a cerca de 90.000 Dáltons, na faixa de cerca de 10.000 Dáltons a cerca de 85.000 Dáltons, na faixa de cerca de 20.000 Dáltons a cerca de 85.000 Dáltons, e na faixa de cerca de 53.000 Dáltons a cerca de 85.000 Dáltons. Para qualquer polímero hidrossolúvel específico, PEGs tendo estas faixas de peso molecular são preferidos.
Pesos moleculares médios nominais exemplares para o segmento de polímero hidrossolúvel incluem cerca de 100 Dáltons, cerca de 200 Dáltons, cerca de 300 Dáltons, cerca de 400 Dáltons, cerca de 500 Dáltons, cerca de 600 Dáltons, cerca de 700 Dáltons, cerca de 750 Dáltons, cerca de 800 Dáltons, cerca de 900 Dáltons, cerca de 1.000 Dáltons, cerca de 2.000 Dáltons, cerca de 2.200 Dáltons, cerca de 2.500 Dáltons, cerca de 3.000 Dáltons, cerca de 4.000 Dáltons, cerca de 4.400 Dáltons, cerca de 5.000 Dáltons, cerca de 6.000 Dáltons, cerca de 7.000 Dáltons, cerca de 7.500 Dáltons, cerca de 8.000 Dáltons, cerca de 9.000 Dáltons, cerca de 10.000 Dáltons, cerca de 11.000 Dáltons,cerca de 12.000 Dáltons, cerca de 13.000 Dáltons, cerca de14.000 Dáltons, cerca de 15.000 Dáltons, cerca de 20.000 Dáltons, cerca de 22.500 Dáltons, cerca de 25.000 Dáltons,cerca de 30.000 Dáltons, cerca de 40.000 Dáltons, cerca de50.000 Dáltons, cerca de 60.000 Dáltons, e cerca de 75.000 Dáltons.
Quando usados como o polímero, PEGs compreenderão tipicamente um número de monômeros de (OCH2CH2). Como usado ao longo de toda a descrição, o número de unidades de repetição é identificado pelo subescrito “n” em “(OCH2CH2)n”. Dessa forma, o valor de (n) tipicamente cai dentro de uma ou mais das seguintes faixas: de 2 a cerca de 2.300, de cerca de 100 a cerca de 2.300, de cerca de 135 a cerca de 2.000, de cerca de 230 a cerca de 1.900, de cerca de 450 a cerca de 1.900, e de cerca de 1.200 a cerca de 1.900. Para qualquer polímero específico no qual o peso molecular seja conhecido, é possível determinar o número de unidades de repetição (ou seja, “n”) dividindo-se o peso molecular total do polímero pelo peso molecular da unidade de repetição.
Um polímero particularmente preferido para uso na invenção é um polímero coberto na extremidade, ou seja, um polímero com pelo menos um terminal coberto com um grupo relativamente inerte, tal como um grupo C1-6 alcoxi inferior. Quando o polímero é PEG, por exemplo, prefere-se usar um metoxi-PEG (comumente chamado mPEG), que é uma forma linear de PEG na qual um terminal do polímero é um grupo metoxi (-OCH3), enquanto o outro terminal é um grupo hidroxil ou outro grupo funcional que possa ser opcionalmente modificado quimicamente.
Em uma forma útil na presente invenção, PEG livre ou não ligado é um polímero linear terminado em cada extremidade com grupos hidroxil:HO-CH2CH2O-(CH2CH2O)m’-CH2CH2-OH,Em que (m’) tipicamente varia de zero a cerca de 4.000.
O polímero acima, alfa-, omega-dihidroxilpoli(etileno glicol), pode ser representado de forma resumida como HO- PEG-OH, no qual entende-se que o símbolo -PEG- pode representar a seguinte unidade estrutural: -CH2CH2O-(CH2CH2O)m’-CH2CH2-, Em que (m’) é como definido acima.
Outro tipo de PEG útil na presente invenção é metoxi- PEG-OH, ou resumidamente mPEG, no qual um terminal é o grupo relativamente inerte metoxi, enquanto o outro terminal é um grupo hidroxil. A estrutura de mPEG é fornecida abaixo.CH3O-CH2CH2O-(CH2CH2O)m’-CH2CH2-OHNa qual (m’) é como descrito acima.
Moléculas de PEG multi-ramificadas ou ramificadas, tais como aquelas descritas na Patente U.S. N° 5.932.462, também podem ser usadas como o polímero de PEG. Por exemplo, PEG pode ter a estrutura:
Na qual:polia e polib são estruturas centrais de PEG (iguais ou diferentes), tais como metoxi poli(etileno glicol);R” é uma porção não reativa, tal como H, metil ou uma estrutura central de PEG; eP e Q são ligações não reativas. Em uma modalidade preferida, o polímero de PEG ramificado é metoxi lisina dissubstituída de poli(etileno glicol). Dependendo da porção específica de Fator VIII usada, o grupo funcional éster reativo da lisina dissubstituída pode ser adicionalmente modificado para formar um grupo funcional adequado para reação com o grupo-alvo dentro da porção de Fator VIII. Estes polímeros podem ser lineares, ou estar em qualquer uma das formas acima descritas.
Além disso, o PEG pode compreender um PEG bifurcado. Um exemplo de um PEG bifurcado é representado pela seguinte estrutura:
Na qual: X é uma porção espaçadora de um ou mais átomos, e cada Z é um grupo terminal ativado ligado a CH por uma cadeia de átomos de comprimento definido. A Aplicação Internacional N° PCT/US99/05333, revela várias estruturas de PEG bifurcado capazes de serem usadas na presente invenção. A cadeia de átomos que liga os grupos funcionais Z ao átomo de carbono ramificado serve como um grupo de amarração e pode compreender, por exemplo, cadeias alquil, cadeias éter, cadeias éster, cadeias amida e combinações destas.
O polímero de PEG pode compreender uma molécula de PEG pendente com grupos reativos como, por exemplo, carboxil, anexados de forma covalente ao longo do comprimento do PEG, e não na extremidade da cadeia de PEG. Os grupos reativos pendentes podem ser anexados ao PEG diretamente ou através de uma porção espaçadora como, por exemplo, um grupo alquileno.
Além das formas acima descritas de PEG, o polímero também pode ser preparado com uma ou mais ligações fracas ou degradáveis no polímero, incluindo quaisquer dos polímeros acima descritos. Por exemplo, PEG pode ser preparado com ligações éster no polímero que sejam submetidas à hidrólise. Com mostrado abaixo, esta hidrólise resulta na clivagem do polímero em fragmentos de peso molecular mais baixo:-PEG-CO2-PEG- + H2O ► PEG-CO2H + HO-PEG-
Outras ligações hidroliticamente degradáveis, úteis como uma ligação degradável dentro da estrutura central de um polímero, incluem: ligações de carbonato; ligações de imina que resultem, por exemplo, da reação de uma amina e um aldeído (veja, por exemplo, Ouchi e cols. (1997) Polymer Preprints 38 (1):582-3); ligações de éster de fosfato formadas, por exemplo, pela reação de um álcool com um grupo fosfato; ligações de hidrazona que são formadas tipicamente por reação de uma hidrazida e um aldeído; ligações de acetal que são formadas tipicamente por reação entre um aldeído e um álcool; ligações de ortoéster que são, por exemplo, formadas por reação entre um formato e um álcool; ligações de amida formadas por um grupo amina, por exemplo, em uma extremidade de um polímero como, por exemplo, PEG, e um grupo carboxil de outra cadeia de PEG; ligações de uretano formadas por reação de, por exemplo, um PEG com um grupo isocianato terminal e um álcool de PEG; ligações peptídicas formadas por um grupo amina, por exemplo, em uma extremidade de um polímero como, por exemplo, PEG, e um grupo carboxil de um peptídeo; e ligações de oligonucleotídeo formadas por, por exemplo, um grupo fosforamidita, por exemplo, na extremidade de um polímero, e um grupo 5’ hidroxil de um oligonucleotídeo.
Tais características opcionais do conjugado de polímero, ou seja, a introdução de uma ou mais ligações degradáveis na cadeia do polímero, podem permitir um controle adicional sobre as propriedades farmacológicas finais desejadas do conjugado mediante administração. Por exemplo, um conjugado grande e relativamente inerte (ou seja, com uma ou mais cadeias de PEG de alto peso molecular a ele anexadas, por exemplo, uma ou mais cadeias de PEG com um peso molecular maior do que cerca de 10.000, em que o conjugado não possui essencialmente qualquer bioatividade) pode ser administrado, que seja hidrolisado para gerar um conjugado bioativo que possui uma porção da cadeia de PEG original. Dessa forma, as propriedades do conjugado podem ser mais eficazmente projetadas para equilibrar a bioatividade do conjugado ao longo do tempo.
Aqueles com habilidade na técnica reconhecerão que a discussão anterior em relação a segmentos de polímero substancialmente hidrossolúveis não é, de forma alguma, completa, e é meramente ilustrativa, e que todos os materiais poliméricos com as qualidades acima descritas são contemplados. Como aqui usado, o termo “reagente polimérico” geralmente se refere a uma molécula inteira, que pode compreender um segmento hidrossolúvel de polímero e um grupo funcional.
Como descrito acima, um conjugado da invenção compreende um polímero hidrossolúvel anexado de forma covalente a uma porção de Fator VIII. Tipicamente, para qualquer conjugado específico, haverá de um a três polímeros hidrossolúveis anexados de forma covalente a uma ou mais porções com atividade de Fator VIII. Em alguns casos, no entanto, o conjugado pode ter 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou mais polímeros hidrossolúveis anexados individualmente a uma porção de Fator VIII.
A ligação particular dentro da porção com atividade de Fator VIII e o polímero depende de inúmeros fatores. Tais fatores incluem, por exemplo, a química de ligação em particular empregada, da porção em particular com atividade de Fator VIII, dos grupos funcionais disponíveis dentro da porção com atividade de Fator VIII (seja para adesão a um polímero ou conversão a um local de adesão adequado), da possível presença de grupos reativos funcionais adicionais dentro da porção com atividade de Fator VIII, e semelhantes.
Os conjugados da invenção podem ser, embora não necessariamente, pró-medicamentos, o que significa que a ligação entre o polímero e uma porção do Fator VIII é degradável hidroliticamente para permitir a liberação da porção parente. Ligações degradáveis exemplares incluem éster de carboxilato, éster de fosfato, tioléster, anidreto, acetais, cetais, éter de aciloxialquil, iminas, ortoésteres, peptídeos e oligonucleotídeos. Tais ligações podem ser prontamente preparadas por modificação apropriada de uma porção do Fator VIII (por exemplo, do terminal C do grupo carboxil da proteína ou uma cadeia lateral de grupo hidroxil de um aminoácido como, por exemplo, serina ou treonina, contida dentro da proteína) e/ou do reagente polimérico que usa métodos de acoplamento normalmente empregados na técnica. Prefere-se principalmente, no entanto, ligações hidrolisáveis que são formadas rapidamente por reação de um polímero adequadamente ativado com um grupo funcional não modificado contido dentro da porção com atividade de Fator VIII.
Alternativamente, uma ligação hidroliticamente estável, tal como uma ligação de amida, uretano (também conhecido como carbamato), amina, tioéter (também conhecido como sulfeto), ou uréia (também conhecido como carbamida) também pode ser empregada como a ligação para acoplamento de uma porção do Fator VIII. Em alguns casos, no entanto, prefere-se que a ligação não seja uma ligação de carbamato e nem uma ligação de carbamida e, além disso, que nenhuma ligação seja formada com base na reação de um polímero derivado que abriga uma espécie de isocianato ou isotiocianato a uma porção de Fator VIII. Novamente, uma ligação hidroliticamente estável preferida é uma amida. Uma amida pode ser preparada rapidamente por reação de um grupo carboxil contido dentro de uma porção do Fator VIII (por exemplo, o terminal carboxil de uma porção peptídica com atividade de Fator VIII) com um polímero terminado em amino.
Os conjugados (ao contrário de uma porção não conjugada de Fator VIII) podem ou não possuir um grau mensurável de atividade de Fator VIII. Isso significa dizer que um polímero conjugado de acordo com a invenção possuirá um grau entre cerca de 0,1% a cerca de 100% ou mais da bioatividade da porção parente não modificada de Fator VIII. Preferivelmente, compostos que possuem pouca ou nenhuma atividade de Fator VIII contêm tipicamente uma ligação hidrolisável que conecta o polímero à porção, de forma que, independentemente da ausência de atividade no conjugado, a molécula parente ativa (ou um derivado desta) é liberada mediante clivagem induzida por água da ligação hidrolisável. Tal atividade pode ser determinada com o uso de um modelo adequado in vivo ou in vitro, dependendo da atividade conhecida da porção em particular com atividade de Fator VIII empregada.
Para conjugados que possuem uma ligação hidroliticamente estável que acopla a porção com atividade de Fator VIII ao polímero, o conjugado possuirá tipicamente um grau mensurável de atividade específica. Por exemplo, tais conjugados de polímero são caracterizados tipicamente como tendo uma atividade de pelo menos cerca de 2%, 5%, 10%, 15%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 80%, 85%, 90%, 95% 97%, 100%, ou mais, em relação àquela da porção parente não modificada com atividade de Fator VIII, quando medida em um modelo adequado, tais como aqueles conhecidos na técnica. Preferivelmente, compostos que têm uma ligação hidroliticamente estável (por exemplo, uma ligação de amida) possuirão pelo menos algum grau da bioatividade da porção parente não modificada com atividade de Fator VIII.
Conjugados de polímero exemplares de acordo com a invenção serão agora descritos, nos quais a porção com atividade de Fator VIII é uma proteína. Tipicamente, espera-se que uma proteína como esta compartilhe (pelo menos em parte) uma seqüência de aminoácidos similar ao Fator VIII nativo. Dessa forma, embora seja feita referência a localizações ou átomos específicos dentro da proteína nativa de Fator VIII, esta referência é feita apenas por conveniência, e aqueles como habilidade na técnica serão capazes de determinar prontamente a localização ou átomo correspondente em outras porções que tenham atividade de Fator VIII. Em particular, a descrição aqui fornecida para Fator VIII nativo é aplicável ao Fator VIIIa, Fator VIII: vWF e às versões de Fator VIII desprovido do Domínio B, além de fragmentos, variantes de deleção, variantes de substituição ou variantes de adição de qualquer um dos anteriormente citados.
Grupos amino em porções de Fator VIII fornecem um ponto de adesão entre uma porção do Fator VIII e o polímero hidrossolúvel. Fator VIII nativo compreende 158 resíduos de lisina contendo amina (6,8 por cento do peso de toda a proteína) e um terminal amino. Com relação ao Fator VIIIa, há 78 resíduos de lisina (5,5 por cento do peso de toda a proteína) e dois terminais amino (que resultam da clivagem do Fator VIII). Conseqüentemente, não obstante considerações estruturais secundárias e terciárias, tanto o Fator VIII quanto o Fator VIIIa (além de qualquer porção peptídica de Fator VIII, por exemplo, Fator VIII desprovido do Domínio B) têm várias aminas disponíveis para participação nas reações de conjugação.
Há inúmeros exemplos de reagentes poliméricos hidrossolúveis adequados úteis para a formação de ligações covalentes com aminas disponíveis de uma porção de Fator VIII. Exemplos específicos, juntamente com o conjugado correspondente, são fornecidos na Tabela 1, abaixo. Na tabela, a variável (n) representa o número de unidades monoméricas de repetição e “-NH-F8” representa uma porção do Fator VIII após conjugação ao polímero hidrossolúvel. Embora cada porção polimérica apresentada na Tabela 1 termine em um grupo “CH3”, outros grupos (tais como H e benzil) podem substituí-lo.Tabela 1: Reagentes Poliméricos Específicos para Amina e o Conjugado de Porção de Fator VIII Formado A Partir Destes
A conjugação de um reagente polimérico com um grupo amino de uma porção de Fator VIII pode ser obtida por aquele com habilidade na técnica sem experimentação desnecessária. É típica de uma abordagem uma reação redutora de aminação usada, por exemplo, para conjugar uma amina primária de uma porção de Fator VIII com um polímero funcionalizado com uma cetona, aldeído ou formas hidratadas destes (por exemplo, hidrato de cetona, hidrato de aldeído). Nesta abordagem, a amina primária de uma porção do Fator VIII reage com o grupo carbonil do aldeído ou da cetona (ou do grupo contendo hidroxi correspondente de um hidrato de aldeído ou de cetona) formando, dessa forma, uma base de Schiff. A base de Schiff, por sua vez, pode ser então convertida redutivamente a um conjugado estável através do uso de um agente redutor como, por exemplo, borihidreto de sódio. Há a possibilidade de reações seletivas (por exemplo, no terminal N), particularmente com um polímero funcionalizado com uma cetona ou com um aldeído alfa-metil ramificado e/ou sob condições de reação específicas (por exemplo, pH reduzido).
Grupos amina preferidos no Fator VIII que podem servir como local para anexação de um polímero incluem aqueles grupos amina encontrados dentro dos seguintes resíduos de lisina: Lys493, Lys496, Lys499, Lys1.804, Lys1.808, Lys1.813, Lys1.818, Lys2.183, Lys2.207, Lys2.227, Lys2.236, com Lys496, Lys1.804 e Lys1.808 sendo particularmente preferidos. A numeração corresponde à seqüência fornecida na ID. DE SEQ. N° 2. Como estabelecido acima, o grupo amina que corresponde a cada um destes resíduos de lisina em uma proteína diferente do Fator VIII humano pode servir como um local útil para conjugação. Além disso, o terminal N de qualquer porção de Fator VIII que seja uma proteína pode servir como um local de adesão polimérica.
Grupos carboxil representam outro grupo funcional que pode servir como um serve de adesão na porção do Fator VIII. Estruturalmente, o conjugado compreenderá o seguinte:
em que F8 e o grupo carbonil adjacente correspondem à porção de Fator VIII contendo carboxil, X é uma ligação, preferivelmente um heteroátomo selecionado de O, N(H) e S, e POLI é um polímero hidrossolúvel como, por exemplo, PEG, opcionalmente terminando em uma porção de cobertura de extremidade.
A ligação C(O)-X resulta da reação entre um derivado polimérico que abriga um grupo funcional terminal e uma porção de Fator VIII contendo carboxil. Como discutido acima, a ligação específica dependerá do tipo de grupo funcional utilizado. Se o polímero for funcionalizado ou “ativado” na extremidade com um grupo hidroxil, a ligação resultante será um éster de ácido carboxílico e X será O. Se a estrutura central do polímero for funcionalizada com um grupo tiol, a ligação resultante será um tioéster e X será S. Quando certos polímeros multi-ramificados, ramificados ou bifurcados forem empregados, a porção C(O)X, e em particular a porção X, pode ser relativamente mais complexa e pode incluir uma estrutura de ligação mais longa.
Derivados hidrossolúveis contendo uma porção de hidrazida também são úteis para conjugação em grupos carboxil. Um exemplo de um derivado como este inclui um polímero com a seguinte estrutura:
o qual, mediante conjugação com uma porção de Fator VIII, tem a seguinte estrutura:
na qual F8 é uma porção do Fator VIII após conjugação e POLI é um polímero hidrossolúvel como, por exemplo, PEG, opcionalmente terminando em uma porção de cobertura de extremidade.
Grupos tiol contidos dentro de uma porção do Fator VIII podem servir como locais eficazes de adesão para o polímero hidrossolúvel. Em particular, resíduos de cisteína fornecem grupos tiol quando uma porção do Fator VIII é uma proteína. Os grupos tiol em tais resíduos de cisteína podem então ser reagidos com um PEG ativado que seja específico para reação com grupos tiol, por exemplo, um polímero de N- maleimidil ou outro derivado, como descrito na Patente U.S. N° 5.739.208 e na Publicação de Patente Internacional N° WO 01/62827.
Exemplos específicos, juntamente com o conjugado correspondente, são fornecidos na Tabela 2, abaixo. Na tabela, a variável (n) representa o número de unidades monoméricas de repetição e “-S-F8” representa uma porção do Fator VIII após conjugação ao polímero hidrossolúvel.
Embora cada porção polimérica apresentada na Tabela 1 termine em um grupo “CH3”, outros grupos (tais como H e benzil) podem substituí-lo.Tabela 2: Reagentes Poliméricos Específicos para Tiol e o
Conjugado de Porção de Fator VIII Formado A Partir Destes
Com relação aos conjugados formados a partir de polímeros hidrossolúveis que abrigam um ou mais grupos funcionais maleimida (independentemente se a maleimida reage com um grupo amina ou tiol em uma porção do Fator VIII), a forma(s) correspondente do ácido maleâmico do polímero hidrossolúvel também pode reagir com uma porção do Fator VIII. Sob certas condições (por exemplo, um pH de cerca de 7-9 e na presença de água), o anel de maleimida irá se “abrir” para formar o ácido maleâmico correspondente. O ácido maleâmico, por sua vez, pode reagir com um grupo amina ou tiol de uma porção de Fator VIII. Reações baseadas em ácido maleâmico exemplares são mostradas de forma esquemática abaixo. POLI representa opolímero hidrossolúvel, e F8 representa uma porção do FatorVIII.
Um conjugado representativo de acordo com a invenção pode ter a seguinte estrutura:POLI-L0,1-C(O)Z-Y-S-S-F8na qual POLI é um polímero hidrossolúvel, L é um ligante opcional, Z é um heteroátomo selecionado do grupo que consiste em O, NH e S, e Y é selecionado do grupo que consiste em C2-10 alquil, C2-10 alquil substituído, aril e aril substituído. Reagentes poliméricos que podem ser reagidos com uma porção de Fator VIII e resultam nesse tipo de conjugado são descritos na aplicação pendente depositada em 6 de janeiro de 2004, intitulada “Thiol Selective Water Soluble Polymer Derivatives”, e designada U.S. N° de Série 10/753.047.
Grupos tiol preferidos no Fator VIII que podem servir como um local para a adesão de um reagente polimérico incluem aqueles grupos tiol encontrados dentro dos seguintes resíduos de cisteína: Cys248, Cys310, Cys329, Cys630, Cys692, Cys711, Cys1.899, Cys1.903 e Cys2.000, com Cys630, Cys711 e Cys1.903, sendo particularmente preferidos. A numeração corresponde à seqüência fornecida na ID. DE SEQ. N° 2.
Com relação aos reagentes poliméricos, aqueles descritos nesse documento e em qualquer outro lugar podem ser adquiridos de fontes comerciais (por exemplo, Nektar Therapeutics, Huntsville AL). Além disso, métodos para a preparação dos reagentes poliméricos são descritos na literatura.Tipicamente, embora não necessariamente, a ligação entre uma porção do Fator VIII e o reagente polimérico inclui um ou mais átomos tais como um ou mais de carbono, nitrogênio, enxofre e combinações destes. Preferivelmente, a ligação compreende um grupo amida, amina secundária, carbamato, tioéter ou dissulfeto. Opcionalmente, átomos adicionais podem conectar a ligação à cadeia de monômeros de repetição dentro do reagente polimérico. Exemplos não limitantes de uma série específica de átomos que conectam uma porção do Fator VIII à cadeia de monômeros de repetição incluem aqueles selecionados do grupo que consiste em -O-, -S-, -S-S-, -C(O)-, -O-C(O)-, -C(O)-O-, -C(O)-NH-, -NH- C(O)-NH-, -O-C(O)-NH-, -C(S)-, -CH2-, -CH2-CH2-, -CH2-CH2- CH2-, -CH2-CH2-CH2-CH2-, -O-CH2-, -CH2-O-, -O-CH2-CH2-, -CH2- O-CH2-, -CH2-CH2-O-, -O-CH2-CH2-CH2-, -CH2-O-CH2-CH2-, -CH2- CH2-O-CH2-, -CH2-CH2-CH2-O-, -O-CH2-CH2-CH2-CH2-, -CH2-O-CH2- CH2-CH2-, -CH2-CH2-O-CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-O-CH2-, -CH2-CH2- CH2-CH2-O-, -C(O)-NH-CH2-, -C(O)-NH-CH2-CH2-, -CH2-C(O)-NH- CH2-, -CH2-CH2-C(O)-NH-, -C(O)-NH-CH2-CH2-CH2-, -CH2-C(O)-NH- CH2-CH2-, -CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-, -CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-, - C(O)-NH-CH2-CH2-CH2-CH2-, -CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-CH2-, -CH2-CH2- C(O)-NH-CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-, -CH2-CH2-CH2- C(O)-NH-CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-, -C(O)-O-CH2-, - CH2-C(O)-O-CH2-, -CH2-CH2-C(O)-O-CH2-, -C(O)-O-CH2-CH2-, -NH- C(O)-CH2-, -CH2-NH-C(O)-CH2-, -CH2-CH2-NH-C(O)-CH2-, -NH- C(O)-CH2-CH2-, -CH2-NH-C(O)-CH2-CH2-, -CH2-CH2-NH-C(O)-CH2- CH2-, -C(O)-NH-CH2-, -C(O)-NH-CH2-CH2-, -O-C(O)-NH-CH2-, -O- C(O)-NH-CH2-CH2-, -O-C(O)-NH-CH2-CH2-CH2-, - NH-CH2-, -NH- CH2-CH2-, -CH2-NH-CH2-, -CH2-CH2-NH-CH2-, -C(O)-CH2-, -C(O)- CH2-CH2-, -CH2-C(O)-CH2-, -CH2-CH2-C(O)-CH2-, -CH2-CH2-C(O)- CH2-CH2-, -CH2-CH2-C(O)-, -CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-NH-, - CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-NH-C(O)-, -CH2-CH2-CH2-C(O)-NH- CH2-CH2-NH-C(O)-CH2-, -CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-NH-C(O)-CH2-CH2-, -O-C(O)-NH-[CH2]0-6-(OCH2CH2)0-2-, -C(O)-NH-(CH2)1-6- NH-C(O)-, -NH-C(O)-NH-(CH2)1-6-NH-C(O)-, -O-C(O)-CH2-, -O-C(O)-CH2-CH2- e -O-C(O)-CH2-CH2-CH2-.
Os conjugados são tipicamente parte de uma composição. Geralmente, a composição compreende vários conjugados, preferivelmente, embora não necessariamente, cada um tendo de um a três polímeros hidrossolúveis anexados de forma covalente a uma porção de Fator VIII. As composições, no entanto, também podem compreender outros conjugados tendo quatro, cinco, seis, sete, oito ou mais polímeros anexados a qualquer porção específica que tenha atividade de Fator VIII. Além disso, a invenção inclui casos nos quais a composição compreende vários conjugados, cada conjugado compreendendo um polímero hidrossolúvel anexado de forma covalente a uma porção de Fator VIII, além de composições que compreendem dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito ou mais polímeros hidrossolúveis anexados de forma covalente a uma porção de Fator VIII.
O controle do número desejado de polímeros para qualquer porção específica pode ser obtido pela seleção do reagente polimérico adequado, da proporção de reagente polimérico para uma porção do Fator VIII, da temperatura, das condições de pH e de outros aspectos da reação de conjugação. Além disso, a redução ou eliminação dos conjugados indesejados (por exemplo, aqueles conjugados que têm quatro ou mais polímeros anexados) pode ser obtida através de meios de purificação.
Por exemplo, os conjugados de polímero-porção de Fator VIII podem ser purificados para se obter/isolar espécies diferentes de conjugados. Especificamente, a mistura do produto pode ser purificada para obter uma média de qualquer valor entre um, dois, três, quatro, cinco ou mais PEGs por porção de Fator VIII, tipicamente um, dois ou três PEGs por porção de Fator VIII. A estratégia para a purificação da mistura de reação final do conjugado dependerá de inúmeros fatores, incluindo, por exemplo, o peso molecular do reagente polimérico empregado, a porção de Fator VIII em particular, o regime de dosagem desejado e a atividade residual e propriedades in vivo do conjugado(s) individual.
Se desejado, conjugados com diferentes pesos moleculares podem ser isolados usando cromatografia com filtração em gel e/ou cromatografia por troca de íons. Ou seja, a cromatografia com filtração em gel é usada para fracionar proporções numeradas diferentemente de polímero- para-porção de Fator VIII (por exemplo, 1-mer, 2-mer, 3- mer, e assim por diante, em que “1-mer” indica 1 polímero para a porção de Fator VIII, “2-mer” indica dois polímeros para a porção de Fator VIII, e assim por diante) com base em seus diferentes pesos moleculares (em que a diferença corresponde essencialmente ao peso molecular médio da porção de polímero hidrossolúvel). Por exemplo, em uma reação exemplar na qual uma proteína de 100.000 Dáltons é conjugada aleatoriamente a um reagente polimérico com um peso molecular de cerca de 20.000 Dáltons, a mistura de reação resultante pode conter proteína não modificada (com um peso molecular de cerca de 100.000 Dáltons), proteína monoPEGuilada (com um peso molecular de cerca de 120.000 Dáltons), proteína diPEGuilada (com um peso molecular de cerca de 140.000 Dáltons), e assim por diante.
Embora esta abordagem possa ser usada para separar PEG e outros conjugados de polímero-porção de Fator VIII que tenham pesos moleculares diferentes, ela é geralmente ineficaz para separar isômeros posicionais que têm locais de adesão de polímero diferentes dentro de uma porção do Fator VIII. Por exemplo, a cromatografia com filtração em gel pode ser usada para separar um dos outros misturas de PEG 1-mers, 2-mers, 3-mers, e assim por diante, embora cada uma das composições recuperadas de PEG-mer contenha PEGs anexados a diferentes grupos amino reativos (por exemplo, resíduos de lisina) dentro da porção de Fator VIII.
Colunas de filtração em gel adequadas para a realização deste tipo de separação incluem Superdex® e colunas Sephadex® disponíveis por Amersham Biosciences (Piscataway, NJ). A seleção de uma coluna em particular dependerá da faixa de fracionamento desejada. A eluição é realizada, geralmente, com o uso de um tampão adequado como, por exemplo, fosfato, acetato ou semelhantes. As frações coletadas podem ser analisadas por inúmeros métodos diferentes, por exemplo, (i) densidade óptica (OD) a 280 nm quanto ao conteúdo de proteína, (ii) análise de proteína da albumina sérica bovina (BSA), (iii) testagem com iodo quanto ao conteúdo de PEG (Sims e cols. (1980) Anal. Biochem. 107: 60-63) , e (iv) eletroforese em gel de poliacrilamida de sódio dodecil sulfato (SDS PAGE), seguida por coloração com iodeto de bário.
A separação de isômeros posicionais é realizada por cromatografia de fase reversa usando uma coluna C18 de cromatografia líquida de fase reversa de alto rendimento (RP-HPLC) (Amersham Biosciences ou Vydac) ou por cromatografia por troca de íons usando uma coluna de troca de íons, por exemplo, uma coluna de troca de íons Sepharose®, disponível por Amersham Biosciences. Qualquer uma das abordagens pode ser usada para separar isômeros de polímero-agente ativo que tenham o mesmo peso molecular (isômeros posicionais).
As composições são, de preferência, substancialmente livres de proteínas que não possuem atividade de Fator VIII. Além disso, as composições, de preferência, são substancialmente livres de todos os outros polímeros hidrossolúveis anexados de forma não covalente. Além disso, pelo menos uma espécie de conjugado na composição tem pelo menos um polímero hidrossolúvel anexado a uma porção que transforma Fator X em Fator Xa. Em algumas circunstâncias, no entanto, a composição pode conter uma mistura de conjugados de polímero-porção de Fator VIII e Fator VIII não conjugado.
Opcionalmente, a composição da invenção ainda compreende um excipiente farmaceuticamente aceitável. Se desejado, o excipiente farmaceuticamente aceitável pode ser adicionado a um conjugado para formar uma composição.
Excipientes exemplares incluem, sem limitação, aqueles selecionados do grupo que consiste em carboidratos, sais inorgânicos, agentes antimicrobianos, antioxidantes, tensoativos, tampões, ácidos, bases e combinações destes.
Um carboidrato como, por exemplo, um açúcar, um açúcar derivado como, por exemplo, um alditol, ácido aldônico, um açúcar esterificado e/ou um polímero de açúcar, pode estar presente como excipiente. Excipientes de carboidrato específicos incluem, por exemplo: monossacarídeos, tais como frutose, maltose, galactose, glicose, D-manose, sorbose, e semelhantes; dissacarídeos, tais como lactose, sacarose, trehalose, celobiose, e semelhantes; polissacarídeos, tais como rafinose, melezitose, maltodextrinas, dextranas, amidos, e semelhantes; e alditóis, tais como manitol, xilitol, maltitol, lactitol, xilitol, sorbitol (glucitol), piranosil sorbitol, mioinositol, e semelhantes.
O excipiente também pode incluir um tampão ou sal inorgânico, tais como ácido cítrico, cloreto de sódio, cloreto de potássio, sulfato de sódio, nitrato de potássio, fosfato monobásico de sódio, fosfato dibásico de sódio e combinações destes.A composição também pode incluir um agente antimicrobiano para evitar ou deter o crescimento microbiano. Exemplos não limitantes de agentes antimicrobianos adequados para a presente invenção incluem cloreto de benzalcônio, cloreto de benzetônio, benzil álcool, cloreto de cetilpiridínio, clorobutanol, fenol, feniletil álcool, nitrato fenilmercúrico, timerosol e combinações destes.
Um antioxidante também pode estar presente na composição. Antioxidantes são usados para evitar oxidação evitando, dessa forma, a deterioração do conjugado ou de outros componentes da preparação. Antioxidantes adequados para uso na presente invenção incluem, por exemplo, ascorbil palmitato, hidroxianisol butilado, hidroxitolueno butilado, ácido hipofosforoso, monotioglicerol, propil galato, bissulfito de sódio, sulfoxilato de sódio formaldeído, metabissulfito de sódio, e combinações destes.
Um tensoativo pode estar presente como excipiente. Tensoativos exemplares incluem: polissorbatos, tais como “Tween 20” e “Tween 80”, e plurônicos, tais como F68 e F88 (ambos disponíveis por BASF, Mount Olive, New Jersey); ésteres de sorbitano; lipídeos, tais como fosfolipídeos como lecitina e outras fosfatidilcolinas, fosfatidiletanolaminas (embora preferivelmente não na forma lipossômica), ácidos graxos e ésteres graxos; esteróides, como colesterol; e agentes quelantes, tais como EDTA, zinco e outros cátions adequados.
Ácidos ou bases podem estar presentes na composição como excipiente. Exemplos não limitantes de ácidos que podem ser usados incluem aqueles ácidos selecionados do grupo que consiste em ácido hidroclórico, ácido acético, ácido fosfórico, ácido cítrico, ácido málico, ácido lático, ácido fórmico, ácido tricloroacético, ácido nítrico, ácido perclórico, ácido fosfórico, ácido sulfúrico, ácido fumárico, e combinações destes. Exemplos de bases adequadas incluem, sem limitação, bases selecionadas do grupo que consiste em hidróxido de sódio, acetato de sódio, hidróxido de amônio, hidróxido de potássio, acetato de amônio, acetato de potássio, fosfato de sódio, fosfato de potássio, citrato de sódio, formato de sódio, sulfato de sódio, sulfato de potássio, fumarato de potássio, e combinações destes.
A quantidade do conjugado (ou seja, o conjugado formado entre o agente ativo e o reagente polimérico) na composição irá variar dependendo de inúmeros fatores, mas será otimamente uma dose terapeuticamente eficaz quando a composição for estocada em um recipiente de dose unitária (por exemplo, um frasco). Além disso, a preparação farmacêutica pode ser abrigada em uma seringa. Uma dose terapeuticamente eficaz pode ser determinada experimentalmente por administração repetida de quantidades crescentes do conjugado a fim de determinar qual quantidade produz um resultado final clinicamente desejado.
A quantidade de qualquer excipiente individual na composição irá variar dependendo da atividade do excipiente e das necessidades particulares da composição. Tipicamente, a quantidade ótima de qualquer excipiente individual é determinada através de experimentação de rotina, ou seja, preparando composições contendo quantidades variáveis do excipiente (que variam de baixas a altas), examinando a estabilidade e outros parâmetros e, finalmente, determinando a faixa na qual se obtém um rendimento ótimo sem quaisquer efeitos adversos significativos.
Geralmente, no entanto, o excipiente estará presente na composição em uma quantidade de cerca de 1% a cerca de 99% por peso, preferivelmente de cerca de 5% a cerca de 98% por peso, mais preferivelmente de cerca de 15 a cerca de 95% por peso do excipiente, com concentrações menores do que 30% por peso sendo as mais preferidas.
Estes excipientes farmacêuticos citados anteriormente, juntamente com outros excipientes, são descritos em “Remington: The Science & Practice of Pharmacy”, 19a ed., Williams & Williams, (1995), em “Physician’s Desk Reference”, 52a ed., Medical Economics, Montvale, NJ (1998), e em Kibbe, A.H., “Handbook of Pharmaceutical Excipients”, 3a Edição, “American Pharmaceutical Association”, Washington, D.C., 2000.
As composições englobam todos os tipos de formulações e, em particular, aquelas que são adequadas para injeção, por exemplo, pós ou liofilizados que podem ser reconstituídos, além de líquidos. Exemplos de diluentes adequados para a reconstituição de composições sólidas antes da injeção incluem água bacteriostática para injeção, dextrose 5% em água, soro fisiológico tamponado com fosfato, solução de Ringer, soro fisiológico, água estéril, água deionizada, e combinações destes. Com relação a composições farmacêuticas líquidas, são previstas soluções e suspensões.
As composições da presente invenção são tipicamente, embora não necessariamente, administradas por meio de injeção e são, portanto, geralmente soluções ou suspensões líquidas imediatamente antes da administração. A preparação farmacêutica também pode assumir outras formas, tais como xaropes, cremes, pomadas, comprimidos, pós, e semelhantes. Também estão incluídos outros modos de administração, tais como pulmonar, retal, transdérmica, transmucosa, oral, intratecal, subcutânea, intra-arterial, e assim por diante.
A invenção também fornece um método para a administração de um conjugado como aqui fornecido a um paciente que sofre de uma condição que responde ao tratamento com conjugado. O método compreende a administração, geralmente por meio de injeção, de uma quantidade terapeuticamente eficaz do conjugado (fornecido, preferivelmente, como parte de uma composição farmacêutica). Como descrito previamente, os conjugados podem ser injetados de forma parenteral por injeção intravenosa ou, menos preferivelmente, por injeção intramuscular ou subcutânea. Tipos adequados de formulação para administração parenteral incluem soluções prontas para injeção, pós secos para combinação com um solvente antes do uso, suspensões prontas para injeção, composições secas insolúveis para combinação com um veículo antes do uso, e emulsões e concentrados líquidos para diluição antes da administração, entre outros.
O método de administração pode ser usado para tratar qualquer condição que possa ser remediada ou evitada pela administração do conjugado. Aqueles com habilidade na técnica sabem quais condições um conjugado específico pode tratar eficazmente. Por exemplo, os conjugados podem ser usados para tratar indivíduos que sofrem de hemofilia A. Além disso, os conjugados são adequados para uso como um profilático contra sangramento descontrolado, opcionalmente em pacientes que não sofrem de hemofilia. Dessa forma, por exemplo, o conjugado pode ser administrado a um paciente em risco de sangramento descontrolado antes da cirurgia.
A dose real a ser administrada irá variar, dependendo da idade, peso e condição geral do indivíduo, além da severidade da condição a ser tratada, da avaliação do profissional de saúde e do conjugado a ser administrado. Quantidades terapeuticamente eficazes são conhecidas por aqueles com habilidade na técnica e/ou são descritas nos textos de referência e na literatura pertinentes. Geralmente, uma quantidade terapeuticamente eficaz irá variar de cerca de 0,001 mg a 100 mg, preferivelmente em doses de 0,01 mg/dia a 75 mg/dia, e mais preferivelmente em doses de 0,10 mg/dia a 50 mg/dia.
A dosagem unitária de um conjugado específico (novamente, fornecido, preferivelmente, como parte de uma preparação farmacêutica) pode ser administrada em vários esquemas de dosagem, dependendo da avaliação do médico, das necessidades do paciente, e assim por diante. O esquema de dosagem específico será conhecido por aqueles com habilidade na técnica, ou pode ser determinado experimentalmente com o uso de métodos de rotina. Esquemas de dosagem exemplares incluem, sem limitação, administração cinco vezes ao dia, quatro vezes ao dia, três vezes ao dia, duas vezes ao dia, uma vez ao dia, três vezes por semana, duas vezes por semana, uma vez por semana, duas vezes ao mês, uma vez ao mês, e qualquer combinação destas. Tendo sido obtido o resultado final clínico, a dosagem da composição é suspensa.
Uma vantagem da administração de certos conjugados da presente invenção é que porções individuais do polímero hidrossolúvel podem ser retiradas por clivagem. Este resultado é vantajoso quando a depuração pelo organismo é um problema potencial em função do tamanho do polímero. Idealmente, a clivagem de cada porção de polímero hidrossolúvel é facilitada com o uso de ligações fisiologicamente cliváveis e/ou enzimaticamente degradáveis, tais como ligações de uretano, amida, carbonato ou contendo éster. Dessa forma, a depuração do conjugado (por meio de clivagem de porções individuais do polímero hidrossolúvel) pode ser modulada pela seleção do tamanho molecular do polímero e do tipo de grupo funcional que fornecesse as propriedades de depuração desejadas. Aqueles com habilidade na técnica podem determinar o tamanho molecular adequado do polímero, além do grupo funcional clivável. Por exemplo, aqueles com habilidade na técnica, usando experimentação de rotina, podem determinar um tamanho molecular e um grupo funcional clivável adequados preparando, primeiro, vários derivados do polímero com pesos de polímero e grupos funcionais cliváveis diferentes, e posteriormente obtendo o perfil de depuração (por exemplo, através de amostragem periódica de sangue ou de urina) pela administração do derivado do polímero a um paciente, e colhendo amostras periódicas de sangue e/ou de urina. Uma vez tendo sido obtida uma série de perfis de depuração para cada conjugado testado, pode ser identificado um conjugado adequado.
Deve-se entender que, embora a invenção tenha sido descrita em conjunto com as modalidades específicas 60/76 preferidas desta, a descrição precedente, além dos exemplos que vêm a seguir, visam ilustrar, e não limitar, o escopo da invenção. Outros aspectos, vantagens e modificações dentro do escopo da invenção serão aparentes para aqueles com habilidade na técnica, aos quais pertence a invenção.
Todos os artigos, livros, patentes e outras publicações aqui citados podem ser consultadas por aqueles com habilidade na técnica.
Experimental:
A prática da invenção irá empregar, a menos que indicado de outra forma, técnicas convencionais de síntese orgânica e semelhantes, que são do conhecimento daqueles com habilidade na técnica. Tais técnicas são totalmente explicadas na literatura. Veja, por exemplo, J. March, “Advanced Organic Chemistry: Reactions Mechanisms and Structure”, 4a Ed. (Nova York: Wiley-Interscience, 1992), supra.
Nos exemplos seguintes, foram feitos esforços para assegurar a precisão com relação aos números usados (por exemplo, quantidades, temperaturas etc.), mas alguns erros e desvios experimentais devem ser esperados. A menos que indicado de forma diferente, a temperatura está em graus Celsius e a pressão na pressão atmosférica, ou próxima a ela, ao nível do mar.Abreviações:DCM diclorometanomPEG-SPA mPEG-succinimidil propionatomPEG-SBA mPEG-succinimidil butanoatomPEG-OPSS mPEG-ortopiridil-dissulfetomPEG-MAL mPEG-maleimida, CH3O- 61/76(CH2CH2O)n-CH2CH2-MALmPEG-SMB mPEG-succinimidilα-metilbutanoato, CH3O- (CH2CH2O) n—CH2CH2-CH(CH3)-C(O)-O-succinimidamPEG-ButirALDCH3O-(CH2CH2O)n-CH2CH2-O-C(O)-NH-(CH2CH2O)4CH2CH2CH2C(O)HmPEG-PIP CH3O-(CH2CH2O)n-CH2CH2-C(O)-piperidin-4-onaSUC succinimida ou succinimidilNaCNBH3 cianoborohidreto de sódioHCl ácido hidroclóricoHEPES ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinaetanossulfônicoNMR ressonância nuclear magnéticaDCC 1,3-diciclohexilcarbodiimidaDI deionizadaMW peso molecularr.t. temperatura ambienteK ou kDa kilodáltonsSEC cromatografia por exclusão detamanhoHPLC cromatografia líquida de altaperformanceFPLC cromatografia líquida rápida deproteínaSDS-PAGE eletroforese em gel poliacrilamida de sódio dodecil sulfatoMALDI-TOF Duração de Desabsorção deIonização da Matriz Assistida porLaser
Materiais:
Todos os reagentes de PEG citados nos exemplos a seguir estão disponíveis comercialmente, a menos que indicado de forma diferente.mPEG-succinimidil propionato, mPEG-SPA, peso molecular, 30K (Mn = 31,3 kDa, Nektar Therapeutics)mPEG-ortopiridil-dissulfeto, mPEG-OPSS, peso molecular, 10K (Mn = 10,3 kDa, Nektar Therapeutics)mPEG-maleimida, mPEG-MAL, peso molecular, 20K (Mn =21,8 kDa, Nektar Therapeutics)mPEG-maleimida, mPEG-MAL, peso molecular, 30K (Mn =31,4 kDa, Nektar Therapeutics)mPEG-succinimidil α-metilbutanoato, mPEG-SMB, peso molecular, 30K (Mn = 30,5 kDa, Nektar Therapeutics)mPEG-butiraldeído, mPEG-ButirALD, peso molecular, 30K (Mn = 31,5 kDa, Nektar Therapeutics)L-Histidina, certificado quanto ao desempenho biotecnológico (Sigma)HEPES, certificado quanto ao desempenho biotecnológico, 99,5+% (Sigma)Dihidrato, Cloreto de cálcio, para biologia molecular, 99% (Sigma)Cloreto de sódio, para biologia molecular (Sigma)Tween 80, Sigma Ultra, (Sigma)Etil álcool, USP, Absoluto-200 Proof (AAPER)Polietileno glicol, PM 3.350, SigmaUltra (Sigma)Cassete de Diálise Slide-A-Lyzer, capacidade de 0,5-3 ml, ou 3-12 ml (Pierce)Ácido acético, reagente A.C.S., 99,7+% (Aldrich)1 N Ácido acético, padrão volumétrico (VWR) 1 N Hidróxido de sódio, padrão volumétrico (J.T.Baker) Cianoborohidreto de sódio, 95% (Aldrich) Tris/glicina/SDS, 10x, tampão de eletroforese de proteína (Bio-Rad)Tampão de amostra de Laemmli (Bio-Rad)SigmaMarker, amplitude baixa (P.M. 6.500-66.000)(Sigma)SigmaMarker, amplitude alta (P.M. 36.000-205.000)(Sigma)Gel pronto de Tris 7,5%-HCl (10 poços, 30 μl,Bio-Rad)Reagente de corante azul GelCode (Pierce)
Métodos (Analíticos): Análise SEC-HPLC
Foi realizada cromatografia por exclusão de tamanho (SEC) em um sistema Agilent 1100 HPLC (Agilent). As amostras foram analisadas usando uma coluna BIOSEP-SEC-S 4.000 (Phenomenex) e uma fase móvel de histidina 45 mM, cloreto de cálcio 4,5 mM, cloreto de sódio 0,36 M, Tween 80 0,009% (v/v) e etil álcool 10%, pH 6,7. A taxa de fluxo para a coluna era de 0,3 ml/min. Proteína e conjugados PEG- proteína eluídos foram detectados por UV em um comprimento de onda de 280 nm.
Análise SDS-PAGE:
As amostras foram analisadas por eletroforese em gel de sódio dodecil sulfato-poliacrilamida (SDS-PAGE) usando o Sistema e Eletroforese em Gel Mini-PROTEAN 3 Precast (BioRad). As amostras foram misturadas com 2 x tampão de amostra de Laemmli, e foram colocadas em um banho-maria a 95°C por ~5 minutos. Então, as amostras preparadas foram carregadas em um gel pronto de Tris-HCl a 7,5% e executadas por aproximadamente 30 minutos a 200 V, usando tampão de eletroforese Tris/glicina/SDS.
Outros Métodos: Purificação de Conjugados de PEG-Fator VIII
Uma coluna de filtração em gel Superose 6 HR 10/30, 24 ml (Amersham) foi usada com um sistema de FPLC e sistema principal AKTA (Amersham) para purificar os conjugados de PEG-Fator VIII nos Exemplos 6-11. A taxa de fluxo foi de 0,3 ml/min e o tampão de eluição foi Histidina 50 mM, NaCl 0,5 M, CaCl2 4,0 mM, e Tween 80 0,01% (p/v), pH 6,7.
Troca de tampão de Solução de Estoque de Fator VIII
Um Cassete de Diálise Slide-A-Lyzer (3-12 ml, 10.000 PMCO, Pierce) foi removido da bolsa protetora, e encharcado em H2O MiliQ por 15 minutos (a água foi trocada a cada 5 minutos). A solução de estoque de Fator VIII (0,398 mg/ml em Histidina 50 mM, NaCl 0,5 M, CaCl2 4,0 mM, PEG 3.350 0,1% (p/v), Tween 80 0,01% (p/v), pH 6,7) foi então transferida na cavidade do cassete através de uma das entradas-guia no topo da vedação. O cassete foi colocado em um cubeta de 1 l de tampão de HEPES (HEPES 50 mM, NaCl 0,5 M, CaCl2 5 mM, PEG 3.350 0,1% (p/v), Tween 80 0,01% (v/v), pH 7,0) com uma bóia de flutuação anexada ao topo do cassete. A cubeta foi então colocada na placa de agitação para começar a diálise a 4°C. O tampão de HEPES foi trocado quatro vezes em intervalos de 2-3 horas, e foi então deixado em uma sala fria (4°C) para diálise de um dia para o outro. Após a diálise, a câmara do cassete foi injetada com ar e a amostra dialisada foi retirada do cassete. A concentração de Fator VIII no tampão de HEPES foi medida a UV 280nm em um Espectrofotômetro SPECTRA max PLUS (Molecular Devices).Exemplo 1: PEGuilação de Fator VIII Desprovido de Domínio B com mPEG-SPA, 20KmPEG-Succinimidil propionato com um peso molecular de 20.000 Dáltons é obtido de Nektar Therapeutics, (Huntsville, AL). A estrutura básica do reagente do polímero é fornecida abaixo:
Fator VIII desprovido do Domínio B é dissolvido em água deionizada, à qual é adicionada trietilamina para elevar o pH até 7,2-9. À solução acima é adicionado um excesso molar de 1,5 a 10 vezes do reagente de PEG, mPEG- SPA. A mistura resultante é agitada em temperatura ambiente por várias horas.
A mistura de reação é analisada por SDS-PAGE para determinar o grau de PEGuilação da proteína. O grau de PEGuilação, 1-mer, 2 mers etc., também pode ser determinado por qualquer uma das inúmeras técnicas analíticas apropriadas para proteínas deste tamanho como, por exemplo, dispersão do ângulo de luz. Os picos exibidos para espécies nativas e mono-PEGuiladas diferem em aproximadamente 20.000 Da. O aumento da proporção de reagente de PEG para proteína, eleva o grau de poliPEGuilação, ou seja, a formação de 2-mers, 3-mers etc.
Exemplo 2: PEGuilação de Fator VIII Desprovido de Domínio B com mPEG-SBAmPEG-Succinimidil butanoato com um peso molecular de 10.000 dáltons é obtido de Nektar Therapeutics, (Huntsville, AL). A estrutura básica do reagente do polímero é fornecida abaixo:
Fator VIII Desprovido de Domínio B é dissolvido em água deionizada, à qual é adicionada trietilamina para elevar o pH até 7,2-9. A esta solução é então adicionado um excesso molar de 1,5 a 10 vezes mPEG-SBA. A mistura resultante é agitada em temperatura ambiente por várias horas.
A mistura de reação é analisada por SDS-PAGE para determinar o grau de PEGuilação da proteína.Exemplo 3: PEGuilação de Fator VIII Desprovido de Domínio B com mPEG-MAL, 20KmPEG-Maleimida com um peso molecular de 20.000 dáltons é obtido de Nektar Therapeutics, (Huntsville, AL). A estrutura básica do reagente do polímero é fornecida abaixo:
Fator VIII desprovido do Domínio B é dissolvido em tampão. A esta solução de proteína é adicionado um excesso molar de 3-5 vezes de mPEG-MAL. A mistura é agitada em temperatura ambiente sob uma atmosfera inerte por várias horas. A mistura de reação é analisada e purificada por HPLC para fornecer uma mistura de espécies conjugadas. Exemplo 4: PEGuilação de Fator VIII Desprovido de Domínio B com mPEG-OPSS, 20K
O reagente de polímero seletivo para sulfidril, mPEG- ortopiridildissulfeto (estrutura mostrada acima), com um peso molecular de 20.000, é obtido de Nektar Therapeutics (Huntsville, AL). Um excesso molar de cinco vezes de mPEG- OPSS é adicionado ao Fator VIII desprovido do Domínio B em uma solução tamponada. A mistura de reação é agitada por várias horas em temperatura ambiente sob uma atmosfera inerte para formar o conjugado desejado com uma ligação dissulfeto conectando o polímero à proteína.Exemplo 5: PEGuilação de Fator VIII Desprovido de Domínio B com mPEG-PIP, 5K
O reagente polimérico acima, mostrado tanto a cetona quanto o cetal correspondente, é preparado como descrito na Aplicação de Patente Provisória da Nektar Therapeutics N° 60/437.325, intitulada “Polymer Derivatives and Conjugates Thereof”.
Para preparar o reagente polimérico acima, a uma solução de metoxi-polietileno glicol-succinimidil propionato com uma média de peso de peso molecular de 5.000 Dáltons (1,0 g, 0,002 moles) em cloreto de metileno (20 ml), são adicionados trietil amina (0,084 ml, 0,006 moles) e monohidrato de hidrocloreto de 4-piperidona (0,077g, 0,005 mol). A mistura de reação é agitada em temperatura ambiente sob uma atmosfera de nitrogênio de um dia para o outro, e então purificada antes da conjugação. Alternativamente, o reagente do polímero pode ser adquirido de Nektar Therapeutics.
Para efetuar a conjugação, é adicionado a uma solução de Fator VIII desprovido do Domínio B em tampão aquoso um excesso molar de 20 vezes de mPEG-PIP, 5K. A solução resultante é colocada em um agitador orbital Roto Mix® (Thermolyne Corp., Dubuque, IA) ajustado para baixa velocidade para facilitar a reação em temperatura ambiente. Após 15 minutos, é adicionado NaCNBH3 aquoso em uma quantidade igual a um excesso molar de 50 vezes em relação ao Fator VIII desprovido do Domínio B. As alíquotas são retiradas em intervalos cronometrados da mistura de reação, e são analisadas por SDS-PAGE (usando géis disponíveis por Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA).
A análise de SDS-PAGE indica a presença de derivados de PEG de Fator VIII desprovido do Domínio B com 1, 2 e 3 porções de PEG anexadas.Exemplo 6: Conjugação de Fator VIII Desprovido do Domínio B com mPEG-SPA, 30K
Antes da conjugação, foi realizada uma troca de tampão para Fator VIII desprovido do Domínio B (Fator VIII) para substituir histidina por HEPES.mPEG-SPA, 30K, estocado a -20°C sob argônio, foi aquecido até a temperatura ambiente. O mPEG-SPA aquecido (2,2 mg) foi dissolvido em 0,022 ml de HCl 2 mM para fornecer uma solução 10% de reagente de polímero. A solução de mPEG-SPA foi adicionada rapidamente a 3 ml de solução de
Fator VIII (0,412 mg/ml em HEPES 50 mM, NaCl 0,5 M, CaCl2 4,0 mM, PEG 3.350 0,1% (p/v), Tween 80 0,01% (p/v), pH 7,0) e bem misturada. Após 30 minutos de reação em temperatura ambiente, o frasco da reação foi transferido para uma sala fria (4°C), e outros 0,022 ml de solução de mPEG-SPA foram adicionados à mistura de reação, e bem misturados. O pH foi determinado (pH 7,0 ± 0,2). A proporção molar de mPEG-SPA para proteína foi de 20:1. A concentração final de mPEG-SPA foi de 1,445 mg/ml, e a concentração final de Fator VIII concentração foi de 0,406 mg/ml. Permitiu-se que a reação procedesse de um dia para o outro a 4°C em Rotomix (velocidade baixa, Thermolyne). O conjugado resultante recebeu o identificador “pz041701”.
A mistura do conjugado foi purificada com o uso de cromatografia com filtração em gel. Foi desenvolvido um método de cromatografia por exclusão de tamanho para análise das misturas de reação e dos produtos finais. A análise de SDS-PAGE também foi usada para caracterização das amostras.
Caracterização do Conjugado:
A mistura de conjugado resultante, antes da purificação, era uma mistura de Fator VIII PEG-monômero (ou 1-mer), dímero (ou 2-mer) e trímero (ou 3-mer), correspondendo aos identificadores “pz041701 (baixo)”, “pz041701 (médio)” e “pz041701 (alto)” respectivamente, como determinado por SEC. Isto significa dizer: “pz041701 (baixo)” corresponde principalmente a espécies mono- PEGuiladas de Fator VIII ou Fator VIII com uma porção de PEG a ele anexada; “pz041701 (médio)” corresponde primariamente a espécies di-PEGuiladas de Fator VIII, ou seja, Fator VIII com duas porções de PEG a ele anexadas; e “pz041701 (alto)” corresponde principalmente a Fator VIII com três porções de PEG a ele anexadas. Os diagramas de SEC correspondentes são mostrados nas FIGS. 1 e 2. A FIG. 1 mostra o diagrama de SEC que corresponde às frações coletadas mediante SEC da mistura de reação de Fator VIII. De acordo com os resultados da cromatografia por exclusão de tamanho (SEC), o rendimento de PEGuilação de mPEG-SPA- 30K-FVIII (pz041701 baixo) foi de ~39%. O rendimento de PEGuilação de mPEG30-SPA-30K-FVIII (pz041701 médio) foi de ~32%, e o rendimento de PEGuilação de mPEG-SPA-30K-FVIII (pz041701 alto) foi de ~11%, com percentagens baseadas nas quantidades relativas comparadas com todas as espécies presentes na mistura de reação resultante. A mistura do conjugado foi adicionalmente purificada por FPLC e analisada por SDS-PAGE.Exemplo 7: Conjugação de Fator VIII Desprovido do Domínio B com mPEG-MAL, 20K
Antes da conjugação, foi realizada uma troca de tampão para Fator VIII desprovido do Domínio B (Fator VIII) para substituir histidina por HEPES.mPEG-MAL, 20K, estocado a -20°C sob argônio, foi aquecido até a temperatura ambiente. O reagente de mPEG-MAL aquecido (4,4 mg) foi dissolvido em 0,044 ml de tampão de HEPES (HEPES 50 mM, 0,15 M NaCl, CaCl2 4,0 mM, Tween 80 0,01% (p/v), pH 7,0) para fazer uma solução 10% de mPEG- MAL. A solução de mPEG-MAL foi rapidamente adicionada a 4 ml de solução de Fator VIII (0,4324 mg/ml em HEPES 50 mM, NaCl 0,5 M, 4 mM CaCl2, PEG 3.350 0,1% (p/v), Tween 80 0,01% (p/v), pH 7,0) e bem misturada. Após 30 minutos de reação em temperatura ambiente, o frasco da reação foi transferido para a sala fria (4°C), e outros 0,044 ml de solução de mPEG-MAL foram adicionados à mistura de reação, seguida pela adição de mais três alíquotas de 0,044 ml de solução de mPEG-MAL ao longo de duas horas. O pH foi determinado (pH 7,0 ± 0,2). A proporção molar de mPEG-MAL para proteína foi de 100:1. A concentração final de mPEG- MAL foi de 5,213 mg/ml, e a concentração final de Fator VIII foi de 0,410 mg/ml. Permitiu-se que a reação procedesse de um dia para o outro a 4°C em Rotomix (velocidade baixa, Thermolyne). O conjugado recebeu o identificador “pz061201”.
A mistura do conjugado foi purificada com o uso de cromatografia com filtração em gel. Foi desenvolvido um método de cromatografia por exclusão de tamanho para análise das misturas de reação e dos produtos finais. A análise SDS-PAGE também foi usada para caracterização das amostras.
Caracterização do Conjugado (Produto Mono-Peguilado):
De acordo com os resultados da cromatografia por exclusão de tamanho (SEC), o rendimento de PEGuilação do conjugado monoPEGuilado (1-mer) foi de ~33% (FIG. 3). As frações de mistura do conjugado de Fator VIII foram combinadas e purificadas por FPLC, e então adicionalmente purificadas por cromatografia com filtração em gel. O produto final pz061201 foi analisado tanto por SDS-PAGE quanto por SEC, e a pureza do produto “pz061201” foi determinada como sendo aproximadamente 94% de monômero PEG Fator VIII (ou seja, Fator VIII monopeguilado), com ~6% de PEG Fator VIII de mers elevados (FIG 4). Exemplo 8: Conjugação de Fator VIII Desprovido do Domínio B com mPEG-SMB, 30K
Antes da conjugação, foi realizada uma troca de tampão para Fator VIII desprovido do Domínio B (Fator VIII) para substituir histidina por HEPES.mPEG-SMB, 30K, estocado a -20°C sob argônio, foi aquecido até a temperatura ambiente. O mPEG-SMB aquecido (6,5 mg) foi dissolvido em 0,065 ml de HCl 2 mM para formar uma solução 10% de mPEG-SMB. A solução de mPEG-SMB foi rapidamente adicionada a 4 ml de solução de Fator VIII (0,435 mg/ml em HEPES 50 mM, NaCl 0,5 M, CaCl2 5,0 mM, PEG 3.350 0,1% (p/v), Tween 80 0,01% (v/v), pH 7,0) e bem misturada. Após 30 minutos de reação em temperatura ambiente, o frasco da reação foi transferido para uma sala fria (4°C). O pH foi determinado (pH 7,0 ± 0,2). A proporção molar de mPEG-SMB para proteína foi de 20:1. A concentração final de mPEG-SMB foi de 1,599 mg/ml, e a concentração final de Fator VIII foi de 0,428 mg/ml. Permitiu-se que a reação procedesse por aproximadamente 48 horas a 4°C em Rotomix (velocidade baixa, Thermolyne), e foi então extinta pela adição de ácido acético (99,7+%) para reduzir o pH até 6,0 ± 0,3. O conjugado recebeu o identificador “pz082501”.
A mistura do conjugado foi purificada com o uso de cromatografia com filtração em gel. Foi desenvolvido um método de cromatografia por exclusão de tamanho para análise das misturas de reação e dos produtos finais. A análise SDS-PAGE também foi usada para caracterização das amostras.
Caracterização do Conjugado:
A mistura designada “pz082501” resultou da PEGuilação de Fator VIII com mPEG-SMB 30K em pH 7,0 ± 0,2. A mistura do conjugado foi purificada e analisada por SEC. Com base nos resultados da cromatografia por exclusão de tamanho (SEC), o rendimento de PEGuilação de pz082501, conjugado monoPEGuilado (Fator VIII 1-mer) foi de ~41% (FIG. 5). A mistura do produto foi adicionalmente purificada por FPLC e analisada por SDS-PAGE e SEC. A caracterização do produto conjugado Fator VIII PEG purificado, pz082501, foi de ~95% PEG Fator VIII mono-conjugado com ~5% de mers mais elevados.Exemplo 9: Conjugação de Fator VIII Desprovido do Domínio B com mPEG-OPSS, 10K
Antes da conjugação, foi realizada uma troca de tampão para Fator VIII desprovido do Domínio B (Fator VIII) para substituir histidina por HEPES.mPEG-OPSS, 10K, estocado a -20°C sob argônio, foi aquecido até a temperatura ambiente. mPEG-OPSS (1,2 mg) foi dissolvido em 0,012 ml de H2O para fazer uma solução 10% de mPEG-OPSS. A solução de mPEG-OPSS foi rapidamente adicionada a 0,5 ml de solução de Fator VIII [0,398 mg/ml em Histidina 50 mM, NaCl 0,5 M, CaCl2 4,0 mM, PEG 3.350 0,1% (p/v), Tween 80 0,01% (p/v), pH 6,7] e bem misturada. Após 30 minutos de reação em temperatura ambiente, o frasco da reação foi transferido para uma sala fria (4°C). O pH foi determinado (pH 6,7 ± 0,2). A proporção molar de mPEG- OPSS-10K para proteína foi de 100:1. A concentração final de mPEG-OPSS foi de 2,344 mg/ml, e a concentração final de Fator VIII foi de 0,389 mg/ml. Permitiu-se que a reaçãoprocedesse de um dia para o outro a 4°C em Rotomix(velocidade baixa, Thermolyne).
A mistura do conjugado foi purificada com o uso decromatografia com filtração em gel. Foi desenvolvido ummétodo de cromatografia por exclusão de tamanho para análise das misturas de reação e dos produtos finais. A análise SDS-PAGE também foi usada para caracterização das amostras. Os resultados e os rendimentos de peguilação usando o reagente de mPEG-OPSS foram similares àqueles no Exemplo 7, que empregou o reagente de mPEG-MAL com um peso molecular de 20K.Exemplo 10: Conjugação de Fator VIII Desprovido do Domínio B com mPEG-MAL, 30K
Antes da conjugação, foi realizada uma troca de tampão para Fator VIII desprovido do Domínio B (Fator VIII) para substituir histidina por HEPES.mPEG-MAL, 30K, estocado a -20K°C sob argônio, foi aquecido até a temperatura ambiente. O mPEG-MAL aquecido (1,0 mg) foi dissolvido em 0,010 ml de tampão de HEPES (HEPES 50 mM, 0,15 M NaCl, CaCl2 4,0 mM, Tween 80 0,01% (p/v), pH 7,0) para fazer uma solução 10% de mPEG-MAL. A solução de mPEG-MAL foi rapidamente adicionada a 0,5 ml de solução de Fator VIII (0,447 mg/ml em HEPES 50 mM, NaCl 0,5 M, CaCl24 mM, PEG 3.350 0,1% (p/v), Tween 80 0,01% (p/v), pH 7,0) e bem misturada. Após 30 minutos de reação em temperatura ambiente, o frasco da reação foi transferido para uma sala fria (4°C), e outros 0,010 ml de solução de mPEG-MAL foram adicionados à mistura de reação, seguidos pela adição de mais três alíquotas de 0,010 ml de solução de mPEG-MAL ao longo de duas horas. O pH foi determinado (pH 7,0 ± 0,2). A proporção molar de mPEG-MAL para proteína foi de 100:1. A concentração final de mPEG-MAL foi de 9,091 mg/ml, e a concentração final de Fator VIII foi de 0,406 mg/ml. Permitiu-se que a reação procedesse de um dia para o outro a 4°C em Rotomix (velocidade baixa, Thermolyne).
A mistura do conjugado foi purificada com o uso de cromatografia com filtração em gel. Foi desenvolvido um método de cromatografia por exclusão de tamanho para análise das misturas de reação e dos produtos finais. A análise SDS-PAGE também foi usada para caracterização das amostras. Os resultados e os rendimentos de PEGuilação usando o reagente de mPEG-MAL com um peso molecular de 30 K foram similares àqueles no Exemplo 7, que empregou o reagente de mPEG-MAL com um peso molecular de 20K.Exemplo 11: Conjugação de Fator VIII Desprovido do Domínio B com mPEG-Butir-ALD, 30K
Antes da conjugação, foi realizada uma troca de tampão para Fator VIII desprovido do Domínio B (Fator VIII) para substituir histidina por HEPES.
mPEG-Butir-ALD, 30K (mostrado acima), estocado a -20°C sob argônio, foi aquecido até a temperatura ambiente. O mPEG-Butir-ALD aquecido (3,8 mg) foi dissolvido em 0,038 ml de H2O para fazer uma solução 10% de mPEG-Butir-ALD. A solução de mPEG-Butry-ALD foi rapidamente adicionada a 0,5 ml de solução de Fator VIII (0,400 mg/ml em HEPES 50 mM, NaCl 0,5 M, CaCl2 5 mM, PEG 3.350 0,1% (p/v), Tween 80 0,01% (v/v), pH 7,0) e bem misturada. Após 15 minutos, foram adicionados 0,060 ml de 10 mM cianoborohidreto de sódio solução. O pH foi determinado (pH 7,0 ± 0,2). A proporção molar de mPEG-Butir-ALD para proteína foi de 100:1. A concentração final de mPEG-Butir-ALD foi de 6,355 mg/ml. A concentração final de Fator VIII foi de 0,334 mg/ml, e a concentração final de NaCNBH3 foi de 1,003 mM. Permitiu-se que a reação procedesse for 5 horas em temperatura ambiente, e então de um dia para o outro a 4°C em Rotomix (velocidade baixa, Thermolyne).
A mistura do conjugado foi purificada com o uso de cromatografia com filtração em gel. Foi desenvolvido um método de cromatografia por exclusão de tamanho para análise das misturas de reação e dos produtos finais. A análise SDS-PAGE também foi usada para caracterização das amostras. O rendimento do conjugado de Fator VIII mono-PEG foi de aproximadamente 20%.Exemplo 12: Atividade in vitro de Conjugados Exemplares de Fator VIII-PEG
Foram determinadas as atividades in vitro dos conjugados de Fator VIII-PEG descritos nos Exemplos 6, 7 e 8. Todos os conjugados de Fator VIII testados eram bioativos.