KR20050105497A - 중합체-인자 ⅷ 부분 콘쥬게이트 - Google Patents

중합체-인자 ⅷ 부분 콘쥬게이트 Download PDF

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Abstract

인자 Ⅷ 부분 및 하나 이상의 수용성 중합체의 콘쥬게이트가 제공된다. 전형적으로는, 상기 수용성 중합체는 폴리(에틸렌 글리콜) 또는 이의 유도체이다. 또한, 상기 콘쥬게이트를 함유하는 조성물, 상기 콘쥬게이트의 제조 방법, 및 상기 콘쥬게이트를 함유하는 조성물을 환자에게 투여하는 방법이 제공된다.

Description

중합체-인자 Ⅷ 부분 콘쥬게이트 {POLYMER-FACTOR Ⅷ MOIETY CONJUGATES}
본 발명은 일반적으로 인자 Ⅷ 부분 (즉, 인자 Ⅷ 활성을 갖는 부분) 및 중합체를 포함하는 콘쥬게이트에 관한 것이다.
추가로, 본 발명은 상기 콘쥬게이트를 함유하는 조성물, 상기 콘쥬게이트의 합성 방법 및 환자 치료 방법에 관한 것이다.
지혈은 손상된 혈관으로부터의 혈액의 유출을 저지하는 과정이다. 수많은 다른 유기체 뿐만 아니라 포유류에 있어서, 지혈 과정은 지속적인 생존을 위해서는 매우 중요하다. 지혈 과정에서의 결함은, 예를 들어 혈관 손상에 따른 혈액의 손실을 중단시키는 유효한 혈병 형성의 불능을 초래할 수 있다. 인간에서, 혈병 형성 불능을 겪는 개인을 혈우병 환자로 지칭한다. 혈우병 환자에 대한 특별한 우려사항은 일단 시작한 출혈이 절대로 멈추지 않는, 생명을 위협하는 위험성이다.
일반적으로, 혈우병 환자는 혈병 형성에 필요한 하나 이상의 물질을 유효한 양으로 제조하는 능력이 결핍되어 있다. 예를 들어, A 형 혈우병 (또한 "고전적인 혈우병" 으로도 명명됨) 을 앓는 혈우병 환자는 유효한 수준의 인자 Ⅷ (이는 또한 "혈우병 인자 A" "혈우병 글로불린" 및 "AHG" 로도 공지되어 있음) 의 생성 불능이다. 인자 Ⅷ 은 혈병 형성을 초래하는 반응의 여러 "캐스캐이드" 중 하나의 중요한 구성원이다. "내인성 경로" 로 지칭되는 반응 캐스캐이드에 있어서 중요하게도, 인자 Ⅷ 은 궁극적으로 피브리노겐에서 혈병의 주요 구성원인 피브린으로의 변환에 영향을 준다.
혈병 형성의 내인성 경로가 상대적으로 복잡하다고 해도, 인자 Ⅷ 의 역할은 간단하게 기술될 수 있다. 상대적으로 소량의 트롬빈 (예를 들어, 파열된 조직의 세포에 의해 분비됨) 의 존재 하에, 인자 Ⅷ 은 인자 Ⅷa 로 공지되어 있는 그의 활성화 형태로 변환된다. 이어서, 인자 Ⅷa 는 (기타 물질과 함께) 또다른 인자인 인자 X 를 인자 Xa 로 활성화시킨다. 이후, 인자 Xa 는 (기타 물질과 함께) 프로트롬빈을 트롬빈으로 변환시키는데, 그 결과 경시적으로 상대적으로 다량의 트롬빈이 생성된다. 비교적 다량의 트롬빈이 피브리노겐을 피브린으로 유효하게 변환시킨다. 이어서, 피브린은 혈병 형성을 초래하는 매트릭스 또는 격자를 형성한다. 혈병 형성의 내인성 경로에서의 인자 Ⅷ 의 역할을 하기에 개략적으로 나타냈다.
모든 인구집단에서 매 10,000 명의 출생 인구당 1 또는 2 명의 남성에게 발생하는 A 형 혈우병은 인자 Ⅷ 유전자의 각종 돌연변이 중 임의의 한 가지로부터 초래될 수 있는데, 이는 X-염색체 상에 위치한다. 특별한 돌연변이에 따라서, A 형 혈우병은 그 자체로 심각하거나, 중간이거나 또는 경미하게 나타날 수 있다. 가장 심각한 형태의 A 형 혈우병이 있는 개인은 인자 Ⅷ 의 활성 형태를 발현하는 능력이 완전히 결핍되어 있다. 임상적으로, A 형 혈우병을 가진 개인은 근육 출혈, 관절 출혈, 잦은 타박상 및 상처로부터의 지속적인 출혈을 겪는다. 치료없이 A 형 혈우병을 앓는 개인의 평균 수명은 20 세이다. A 형 혈우병의 현재 치료법은 재조합 DNA 기술을 통해 제조되거나 또는 인간 혈장으로부터 수집되는 외인성 인자 Ⅷ 농축물을 이용한다. 상기 치료법은 인자 Ⅷ 의 유효 수준 미달을 보충할 뿐이므로, 인자 Ⅷ 로 인해 고통을 겪게 되는 개인들은 그의 생애 동안 인자 Ⅷ 농축물의 규칙적인 주입을 필요로 한다.
각종 시판되는 형태의 인자 Ⅷ 농축물은 A 형 혈우병을 앓는 환자에게 대체 요법의 제공을 가능하게 한다. 예를 들어, 혈액-유래의 인자 Ⅷ 농축물 제품은 Hemofil M (Baxter, Deerfield, IL), Koate-DVI (Bayer, Research Tringle Park, NC), Monarc-MTM (American Red Cross, Washington, D.C.) 및 Monoclate-P (Aventis, Bridgewater, NJ) 브랜드로 제공된다. 재조합하여 제조된 인자 Ⅷ 농축물에 있어서, 시판되는 제품은 Helixate FS (Aventis, Bridgewater, NJ), Kogenate FS (Bayer, Research Triangle Park, NC), Recombinate (Baxter, Deerfield, IL), Advate (Baxter, Deerfield, IL) 및 ReFacto (Wyeth/Genetics Institute, Cambridge, MA) 브랜드로 제공된다.
일반적으로, 인자 Ⅷ 농축물의 재조합성 공급원은 혈액-유래의 공급원보다 바람직한데, 이는 후자의 경우 바이러스 및/또는 수혈과 연관된 기타 질환을 옮길 위험을 수반하기 때문이다. 재조합 기재의 제형물은 상기 위험성을 피할 수 있지만, 재조합 기재의 제품 제조시에는 종종 알부민과 같은 특정 단백질이 필요한데, 이는 환자에게 투여되는 최종적인 제형물에 필연적으로 잔존하게 된다. 종종, 상기 제형물을 제공받은 환자에게서 상기 외래 단백질에 대한 알레르기 반응이 발생한다. 어느 쪽이든 혈액-유래의 제품 및 재조합 기재의 제품은 모두 반복 투여의 불리함을 안고 있다.
단백질에 대한 PEG화, 즉 폴리(에틸렌 글리콜) 유도체의 결합은 단백질의 생체내 반감기를 연장시키는 수단일 뿐만 아니라 면역원성을 감소시키는 수단으로서 기재되어 있다. 그러나, 인자 Ⅷ 에 있어서, 단백질-중합체 콘쥬게이트를 형성하는 이전의 실험들은, 인자 Ⅷ 에 대해 커플링시킨 중합체에 비해 약소한 기대치를 갖는 것으로 증명되었다. U.S. 특허 제 4,97O,300 호를 참고한다.
상기 난점에도 불구하고, 인자 Ⅷ 에 대한 특정 중합체의 콘쥬게이트의 만족스런 조성물을 제조하려는 시도가 기재되어 있다. 예를 들어, 상기 언급한 U.S. 특허 제 4,970,300 호에서는 약 500 내지 5,000 범위의 분자량을 가진 특이적 폴리(에틸렌 글리콜) 유도체를 이용한 인자 Ⅷ 의 PEG화가 기재되어 있다. 추가로, U.S. 특허 제 6,048,720 호에는 4 내지 5 개의 모노메톡시 폴리(에틸렌 글리콜) 가닥이 인자 Ⅷ 에 콘쥬게이션되는 경우 시험관내 환경에서의 분해에 대한 유효한 보호가 기재되어 있다.
그러나, 상기 기재된 콘쥬게이트 중 어느 것도 현재의 인자 Ⅷ 기재 요법과 연관된 문제점을 만족스럽게 해결하지 못하는 것으로 증명되었다. 예를 들어, 비교적 작은 중합체 (예를 들어, 약 5,000 돌턴 이하) 로 이루어진 콘쥬게이트는 생체내 반감기 연장 및/또는 충분히 감소된 면역 반응을 적합하게 제공할 수 없다. 또한, 인자 Ⅷ 에 결합된 다수의 개별적인 중합체를 가진 콘쥬게이트는 활성에 필요한 부위의 중합체 블로킹으로 인해 감소된 활성을 갖는 경향이 더욱 강하다.
이에 따라, 당업계에서는 수용성 중합체 및 인자 VII 활성을 가진 부분 사이의 추가적인 콘쥬게이트를 제공해야 할 필요성이 여전히 남아 있다. 따라서, 본 발명은 본원에 기재된 바와 같이 상기 콘쥬게이트 뿐만 아니라 상기 콘쥬게이트를 함유하는 조성물 및 관련된 방법에 관한 것이며, 이는 당업계에서 신규하며 전혀 제안된 적이 없는 것이다.
발명의 개요
따라서, 본 발명의 제 1 의 목적은, 바람직하게는, 반드시 그럴 필요는 없지만, 각각 인자 Ⅷ 부분에 공유결합된 1 내지 3 개의 수용성 중합체를 가진 여러 개의 콘쥬게이트를 함유하는 조성물을 제공하는 것이며, 여기서 각각의 수용성 중합체는 바람직하게는 5,000 돌턴 초과 내지 약 100,000 돌턴 범위의 공칭 (nominal) 평균 분자량을 갖는다.
본 발명의 또다른 목적은 각각의 수용성 중합체가 폴리(알킬렌 옥사이드)인 상기 콘쥬게이트를 제공하는 것이다.
본 발명의 추가적인 목적은 각각의 수용성 중합체가 폴리(에틸렌 글리콜)인 상기 콘쥬게이트를 제공하는 것이다.
본 발명의 추가적인 목적은 다수의 모노-PEG화 인자 Ⅷ 부분 콘쥬게이트를 포함하는 콘쥬게이트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 추가적인 목적은, 바람직하게는, 반드시 그럴 필요는 없지만, 각각 인자 Ⅷ 부분에 공유결합된 1 내지 3 개의 수용성 중합체를 가진 여러 개의 콘쥬게이트를 제공하는 조건 하에 하나 이상의 활성화된, 수용성 중합체를 인자 Ⅷ 부분에 접촉시키는 단계를 포함하는 중합체 콘쥬게이트 제조 방법을 제공하는 것으로, 여기서 수용성 중합체는 바람직하게는 5,000 돌턴 초과 내지 약 150,000 돌턴 범위의 공칭 평균 분자량을 갖는다.
본 발명의 또다른 목적은 유효량의 하나 이상의 상기 콘쥬게이트의 치료적 유효량을 함유하는 본원에 기재된 조성물을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 인자 Ⅷ 요법이 필요한 환자의 치료 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 추가적인 목적은 콘쥬게이션 조건 하에 인자 Ⅷ 부분을 중합체성 시약과 접촉시키는 단계를 포함하는 수용성 중합체-인자 Ⅷ 부분 콘쥬게이트의 제조 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 추가적인 목적, 장점 및 신규한 특징은 하기의 상세한 설명에 제시되어 있으며, 부분적으로는 하기 독해시 당업자에게 자명해지거나, 본 발명의 수행에 의해 습득될 수 있을 것이다.
한 구현예에서, 바람직하게는, 반드시 그럴 필요는 없지만, 각각 인자 Ⅷ 부분에 공유결합된 1 내지 3 개의 수용성 중합체를 가진 여러 개의 콘쥬게이트를 함유하는 조성물로서, 여기서 각각의 수용성 중합체가 바람직하게는 5,000 돌턴 초과 내지 약 150,000 돌턴 범위의 공칭 평균 분자량을 갖는 조성물이 제공된다. 임의의 인자 Ⅷ 부분을 이용할 수 있겠지만, 조성물이 인자 Ⅷ 그 자체 (예를 들어, U.S. 특허 제 4,757,006 호에 기재되어 있음), 인자 Ⅷa (즉, 인자 Ⅷ 을 비교적 소량의 트롬빈과 접촉시켜 생성되는 인자 Ⅷ 의 활성화 형태), 인자 Ⅷ:vWF (즉, von Willebrand 인자에 결합된 인자 Ⅷ) 및/또는 인자 Ⅷ 의 절단된 버젼, 예컨대 B-도메인 결실 인자 Ⅷ (예를 들어, U.S. 특허 제 4,868,112 호에 기재된 바와 같음) 을 포함하는 것이 바람직하다.
중합체(들)는 임의의 수용성 중합체일 수 있으며, 본 발명은 이에 관련하여 한정하지 않는다. 그러나, 콘쥬게이트에 존재하는 각각의 중합체가 폴리(알킬렌 옥사이드), 폴리(비닐 피롤리돈), 폴리(비닐 알코올), 폴리옥사졸린, 폴리(아크릴로일모르폴린) 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 바람직하다. 그러나, 특히 폴리(알킬렌 옥사이드), 예컨대 폴리(에틸렌 글리콜) 유도체를 본 발명에서 중합체로서 사용하는 것이 바람직하다.
본원에 기재된 콘쥬게이트는 유리하게는 인자 Ⅷ 의 외인성 공급원으로 치료되는 다수의 혈우병에 의해 발생되는 문제점인 면역원성을 감소시킨다. 또한, 본 발명의 콘쥬게이트는 콘쥬게이트가 결핍된 인자 Ⅷ 조성물에 비해 감소된 빈도의 투여를 필요로 한다. 투여 빈도를 감소시킴으로써, 상기 콘쥬게이트는 유리하게는, 인자 Ⅷ 활성을 가진 시약의 수준을 유지하기 위해 혈우병 환자들이 견뎌야만 하는 고통스런 주사의 횟수를 감소시킨다.
또다른 구현예에서, 콘쥬게이트의 제조 방법이 제공된다. 상기 방법은 바람직하게는 5,000 돌턴 초과 내지 약 150,000 돌턴 범위의 공칭 평균 분자량을 가진 하나 이상의 활성화된 수용성 중합체 (즉, 중합체성 시약) 를 인자 Ⅷ 부분에 접촉시키는 단계를 포함한다. 수용성 중합체의 활성화는, pH, 온도 등의 적절한 조건 하에, 생성되는 중합체가, 인자 Ⅷ 부분이 상기 중합체에 공유결합되도록 공유결합을 형성하는 한, 당업계에 공지된 임의의 방법으로 수행될 수 있다. 활성화된 수용성 중합체가 인자 Ⅷ 부분 내의 원하는 부위에서 공유결합을 형성하는데 필요한 조건들 하에서 하나 이상의 활성화된 수용성 중합체를 상기 인자 Ⅷ 부분에 접촉시킨다. 상기 방법으로, 바람직하게는 필수적인 것은 아니나, 각각 상기 인자 Ⅷ 부분에 공유결합한 1 내지 3 개의 수용성 중합체를 가진 복수의 콘쥬게이트가 생성된다. 어떤 경우, 상기 콘쥬게이트는 2 개, 3 개, 4 개, 5 개, 6 개, 7 개, 8 개 또는 그 이상의 인자 Ⅷ 부분에 결합하는 1 개의 중합체를 포함할 수 있다. 임의로는, 예를 들어 바람직하지 않은 수의 중합체들을 가진 콘쥬게이트와 같은 바람직하지 않은 화학종을 제거하기 위하여, 상기 생성되는 조성물을 추가로 가공할 수 있다. 이러한 바람직하지 않은 화학종을 제거하기 위하여, 크기-배제 크로마토그래피와 같은 정제 기술을 사용할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예에서는, 약학적으로 허용가능한 부형제와 배합된 본 발명의 콘쥬게이트를 함유한 조성물이 제공된다. 상기 조성물은 모든 종류의 제형, 특히 재구성될 수 있는 분말, 및 액 (예컨대, 현탁제 및 용제) 과 같이 주사에 적합한 것들을 포괄한다.
본 발명의 추가의 구현예에서는, 상기 콘쥬게이트를 투여하는 방법이 제공된다. 상기 투여 방법은, 본원에 기술된 바의 조성물을 환자에 투여하는 단계를 포함하고, 이때 상기 조성물은 치료적 유효량의 상기 콘쥬게이트를 함유한다. 전형적으로, 상기 콘쥬게이트-함유 조성물을 투여하는 단계는 주사 (예컨대, 근육내 주사, 정맥내 주사, 피하 주사 등) 로 이루어진다.
도 1 은, 실시예 6 에 기술된 바와 같이, B-도메인 결실 인자 Ⅷ 을 mPEG-SPA, 30K 로 PEG화하여 생성된 반응 혼합물에 대응하는 SEC 플롯이다.
도 2 는 실시예 6 에 기술된 바와 같이, 단백질을 mPEG-SPA, 30K 에 콘쥬게이션시켜 제조되는 정제된 B-도메인 결실 인자 Ⅷ-PEG 콘쥬게이트에 대응하는 SEC 플롯이다.
도 3 은 실시예 7 에 기술된 바와 같이, B-도메인 결실 인자 Ⅷ 을 mPEG-MAL, 20K 로 PEG화하여 생성된 반응 혼합물에 대응하는 SEC 플롯이다. 나타난 바와 같이, 모노-PEG화된 생성물의 수율은 대략 33 % 이다.
도 4 는 실시예 7 에 기술된 바와 같이, 단백질을 mPEG-MAL, 20K 에 콘쥬게이션시켜 제조되는 정제된 B-도메인 결실 인자 Ⅷ-PEG 콘쥬게이트에 대응하는 SEC 플롯이다. 정제된 콘쥬게이트는 94 % 이하의 PEG 단량체였다.
도 5 는 실시예 8 에 기술된 바와 같이, B-도메인 결실 인자 Ⅷ 을 mPEG-SMB, 30K 로 PEG화하여 생성된 반응 혼합물에 대응하는 SEC 플롯이다. 모노-PEG화된 단백질 (1-mer) 의 수율은 대략 41 % 였다.
본 발명을 상세히 설명하기에 앞서, 본 발명은 특정한 중합체, 합성 방법, 인자 Ⅷ 부분 등에 제한되지 않는데, 이러한 것이 다양할 수 있기 때문이다.
본 명세서 및 목적하는 청구항에 사용된 바, 단수 형태 "a", "an" 및 "the" 는 문맥상 명백히 달리 해석되지 않는 한 복수의 대상물을 포함한다. 따라서, 예를 들어, "중합체" 에 대한 언급은, 1 개의 중합체 뿐 아니라 2 개 이상의 동일 또는 상이한 중합체들을 포함하며, "임의의 부형제" 에 대한 언급은 1 개의 임의의 부형제 뿐 아니라, 2 개 이상의 동일 또는 상이한 임의의 부형제들을 지칭한다.
본 발명을 설명하고 청구함에 있어서, 하기의 기술용어들이 하기 기술되는 정의에 따라 사용될 것이다.
본원에 사용된 바, "PEG", "폴리에틸렌 글리콜" 및 "폴리(에틸렌 글리콜)" 은 상호교환가능하고, 임의의 수용성 폴리(에틸렌 옥사이드)를 포괄하는 것으로 의도되었다. 전형적으로, 본 발명에 따른 사용을 위한 PEG 는 하기 구조 "-(OCH2CH2)n-" [식 중, (n) 은 2 내지 4000 임] 를 포함한다. 본원에서 사용되는 바, PEG 는 또한, 말단 산소가 치환되는지의 여부에 따라, "-CH2-CH2-O(CH2CH2O)n-CH2CH2-" 및 "-(OCH2CH2)nO-" 를 포함한다. 명세서 및 청구항 전체를 통해, "PEG" 라는 용어는 다양한 말단기 또는 "말단 캡핑 (end capping)" 기 등을 가지는 구조를 포함한다는 것을 상기해야 한다. "PEG" 라는 용어는 또한, -OCH2CH2- 반복 서브유닛이 대다수인, 즉, 50 % 를 초과하는 중합체를 의미한다. 특정한 형태에 관해, PEG 는 임의 수의 다양한 분자량을 가질 수 있을 뿐만 아니라, 하기에 보다 상세히 기술될 "분지형", "선형", "포크형", "다작용성" 등의 구조 또는 기하구조를 가질 수 있다.
"말단-캡핑된 (end-capped)" 및 "말단이 캡핑된 (terminally capped)" 이라는 용어는, 본원에서 상호교환가능하게 사용되고, 말단-캡핑 부분을 가진 중합체의 말단 또는 끝지점을 지칭한다. 전형적으로, 필연적인 것은 아니나, 상기 말단-캡핑 부분은 히드록시 또는 C1 -20 알콕시기, 좀 더 바람직하게는 C1 ~10 알콕시기, 및 더욱 더 바람직하게는 C1 -5 알콕시기를 포함한다. 따라서, 말단-캡핑 부분의 예로서는, 알콕시 (예컨대, 메톡시, 에톡시 및 벤질옥시), 뿐만 아니라 아릴, 헤테로아릴, 시클로, 헤테로시클로 등이 있다. 상기 말단-캡핑 부분이 상기 중합체 중의 말단 단량체의 하나 이상의 원자들 [예컨대, CH3(OCH2CH2)n- 중의 말단-캡핑 부분인 "메톡시"] 을 포함할 수 있음을 유념하여야 한다. 또한, 상기 각각의 포화, 불포화, 치환 및 비치환 형태도 의도된다. 나아가, 상기 말단-캡핑기는 또한 실란일 수 있다. 상기 말단-캡핑기는 또한 유리하게는 검출가능한 표지를 포함하고 있을 수 있다. 상기 중합체가 검출가능한 표지를 포함한 말단-캡핑기인 경우, 적당한 검출기를 사용하여 상기 중합체 및/또는 상기 중합체가 커플링된 부분 (예컨대, 활성제) 의 양 또는 위치를 측정할 수 있다. 이러한 표지로는, 이에 제한되지는 않으나, 형광자, 화학발광자, 효소 표지에 사용되는 부분, 비색 (예컨대, 염료), 금속 이온, 방사성 부분 등이 있다. 적당한 검출기로는, 광도계, 필름, 분광계 등이 있다. 말단-캡핑기는 또한 유리하게는 인지질을 포함할 수 있다. 상기 중합체가 인지질을 포함한 말단-캡핑기를 가진 경우, 상기 중합체 및 결과적으로 생성되는 콘쥬게이트에 독특한 특성이 부여된다. 인지질의 예로서는, 이에 제한되지는 않으나, 포스파티딜콜린이라 불리는 인지질의 부류로부터 선택되는 것들을 들 수 있다. 구체적인 인지질로서는, 이에 제한되지는 않으나, 디라우로일포스파티딜콜린, 디올레일포스파티딜콜린, 디팔미토일포스파티딜콜린, 디스테로일포스파티딜콜린, 베헤노일포스파티딜콜린, 아라키도일포스파티딜콜린 및 레시틴으로 이루어진 군에서 선택되는 것들을 들 수 있다.
본원에 기술된 바의 중합체와 관련하여 "비-자연발생적인"이라는 것은, 자연계에서 온전히 그대로 발견되지 않는 중합체를 의미한다. 그러나, 본 발명의 비-자연발생적인 중합체는, 전체 중합체 구조가 자연계에서 발견되지 않는 한, 자연발생적인 하나 이상의 단량체 또는 단량체들의 분절을 가질 수 있다.
"수용성 중합체" 에서와 같은 "수용성" 중합체라는 용어는 실온에서 수중에 용해가능한 임의의 중합체이다. 전형적으로, 수용성 중합체는 여과 후 동일 용액에 의해 투과되는 광의 약 75 % 이상, 좀 더 바람직하게는 약 95 % 이상을 투과시킬 것이다. 중량 기준으로, 수용성 중합체는 바람직하게는 약 35 (중량)% 이상이 수중에 가용적이고, 좀 더 바람직하게는 약 50 (중량)% 이상이 수중에 가용적이고, 더욱 더 바람직하게는 약 70 (중량)% 이상이 수중에 가용적이며, 더욱 더 바람직하게는 약 85 (중량)% 이상이 수중에 가용적이다. 그러나, 수용성 중합체의 약 95 (중량)% 가 수중에 가용적이거나 또는 완전히 수중에 가용적인 것이 가장 바람직하다.
PEG 와 같은 비-자연발생적인 수용성 중합체에 있어서 "공칭 평균 분자량" 은, 전형적으로 크기-배제 크로마토그래피, MALDI (matrix assisted laser desorption/ionization: 매트릭스 보조 레이저 탈착/이온화), 광산란 방법 또는 1,2,4-트리클로로벤젠 중에서의 고유 속도 측정으로 결정되는 상기 중합체의 질량 평균 분자량을 지칭한다. 상기 중합체들은 전형적으로 다분산적이며, 바람직하게는 약 1.2 미만, 좀 더 바람직하게는 약 1.15 미만, 더욱 더 바람직하게는 약 1.10 미만, 더더욱 바람직하게는 약 1.05 미만 및 가장 바람직하게는 약 1.03 미만의 낮은 다분산도 값을 갖는다.
"활성" 또는 "활성화" 라는 용어는, 특정 작용기와 관련하여 사용되는 경우, 또다른 분자 상의 친전자체 또는 친핵체와 쉽게 반응하는 반응성 작용기를 지칭한다. 이는 반응하기 위해서 강한 촉매 또는 실시하기가 매우 어려운 반응 조건을 요구하는 기들 (즉, "비-반응성" 또는 "비활성" 기) 과는 대조적이다.
본원에서 사용되는 바, "작용기" 라는 용어 또는 이의 임의의 동의어는 이들의 보호된 형태 뿐 아니라 보호되지 않은 형태도 포괄하는 것을 의미한다.
"결합" 또는 "결합자"라는 용어는 본원에서, 중합체 분절 및 인자 Ⅷ 부분의 말단, 또는 인자 Ⅷ 부분의 친전자체 또는 친핵체와 같이 상호결합 부분을 결합하는데 임의로 사용되는 원자 또는 원자들의 집합을 지칭하는 것으로 사용된다. 본 발명의 결합자는 가수분해상으로 안정하거나 생리학상으로 가수분해가능한 또는 효소적으로 분해가능한 결합을 포함할 수 있다.
"알킬" 은 전형적으로 길이가 약 1 내지 15 개 원자 범위인 탄화수소 사슬을 지칭한다. 이러한 탄화수소 사슬은 필연적인 것은 아니나 바람직하게는 포화이고, 분지쇄 또는 직쇄일 수 있으나, 전형적으로 직쇄가 바람직하다. 알킬기의 예로서는, 메틸, 에틸, 프로필, 부틸, 펜틸, 1-메틸부틸, 1-에틸프로필, 3-메틸펜틸 등이 포함된다. 본원에서 사용되는 바, "알킬" 로는, 시클로알킬 및 시클로알킬렌-포함 알킬이 포함된다.
"저급 알킬" 은 탄소수가 1 내지 6 인 알킬기를 지칭하며, 메틸, 에틸, n-부틸, i-부틸 및 t-부틸로 예시되는 바 직쇄 또는 분지쇄일 수 있다.
"시클로알킬" 은 가교된, 융합된 또는 스피로 (spiro) 환형 화합물을 포함하고, 바람직하게는 탄소수가 3 내지 약 12, 좀 더 바람직하게는 탄소수가 3 내지 약 8 인, 포화 또는 불포화 환형 탄화수소 사슬을 지칭한다.
"시클로알킬렌" 은 해당 환형 고리계 내의 임의의 두 탄소에서의 사슬의 결합에 의해 알킬 사슬로 삽입된 시클로알킬기를 지칭한다.
"알콕시" 는 -O-R 기를 지칭하며, 이때 R 은 알킬 또는 치환 알킬, 바람직하게는 C1 -6 알킬 (예컨대, 메톡시, 에톡시, 프로필옥시 등) 이다.
예를 들어, "치환 알킬"에서 "치환" 이라는 용어는, 이에 제한되는 것은 아니나, 예컨대 하기의 하나 이상의 비간섭 치환기로 치환된 부분 (예컨대, 알킬기) 을 지칭한다: 알킬, C3 -8 시클로알킬, 예컨대, 시클로프로필, 시클로부틸 등; 할로, 예컨대, 플루오로, 클로로, 브로모 및 요오도; 시아노; 알콕시, 저급 페닐; 치환 페닐; 등. "치환 아릴" 은, 치환기로서 하나 이상의 비간섭 기들을 가진 아릴이다. 페닐 고리 상의 치환에 있어서, 치환기들은 임의의 배향 (즉, 오르토, 메타 또는 파라) 으로 있을 수 있다.
"비간섭 치환기들" 은, 분자내에 존재하는 경우에 전형적으로 상기 분자 내에 포함된 다른 작용기들과 반응하지 않는 기들이다.
"아릴" 은 각각 5 또는 6 개의 코어 탄소 원자로 된 하나 이상의 방향족 고리를 의미한다. 아릴은, 나프틸에서와 같이 융합되거나 비페닐에서와 같이 융합되지 않을 수 있는 복수 개의 아릴 고리를 포함한다. 또한, 아릴 고리들은 하나 이상의 환형 탄화수소, 헤테로아릴 또는 헤테로시클릭 고리와 함께 융합되어 있거나 융합되어 있지 않을 수 있다. 본원에서 사용되는 바, "아릴" 로는 헤테로아릴이 포함된다.
"헤테로아릴" 은 1 개 내지 4 개의 헤테로원자, 바람직하게는 황, 산소 또는 질소 또는 이들의 조합을 포함한 아릴기이다. 헤테로아릴 고리 역시, 하나 이상의 환형 탄화수소, 헤테로시클릭, 아릴 또는 헤테로아릴 고리와 함께 융합될 수 있다.
"헤테로사이클" 또는 "헤테로시클릭" 은, 탄소가 아닌 고리 원자가 하나 이상이고, 불포화 또는 방향족 특성을 가지거나 그렇지 않은, 원자수가 5 내지 12 인, 바람직하게는 5 내지 7 인 하나 이상의 고리를 의미한다. 바람직한 헤테로원자로는, 황, 산소 및 질소가 있다.
"치환 헤테로아릴" 은 치환기로서 하나 이상의 비간섭 기들을 가진 헤테로아릴이다.
"치환 헤테로사이클" 은 비간섭 치환기들로부터 형성된 하나 이상의 측쇄를 가진 헤테로사이클이다.
"친전자체" 및 "친전자성 기" 는 친핵체와 반응할 수 있는 친전자성 중심, 즉, 전자 추적성 중심을 가진 이온 또는 이온성일 수 있는 원자 또는 원자들의 집합을 지칭한다.
"친핵체" 및 "친핵성 기" 는 친핵성 중심, 즉, 친전자성 중심을 추적하는 또는 친전자체를 가진 중심을 가진 이온 또는 이온성일 수 있는 원자 또는 원자들의 집합을 지칭한다.
"생리학상으로 절단가능한" 또는 "가수분해가능한" 또는 "분해가능한" 결합이란 생리학적 조건하에서 물과 반응하는 (즉, 가수분해되는) 결합이다. pH 8 및 25 ℃ 에서의 가수분해 반감기가 약 30 분 미만인 결합이 바람직하다. 수중에서 결합이 가수분해되는 경향은 2 개의 중심 원자를 결합하는 결합의 일반적 유형, 뿐만 아니라 이들 중심 원자에 결합되어 있는 치환기에도 좌우될 것이다. 가수분해상으로 불안정한 또는 약한, 적절한 결합로는, 이에 제한되지는 않으나, 카르복시레이트 에스테르, 포스페이트 에스테르, 무수물, 아세탈류, 케탈류, 아실옥시알킬 에테르, 이민류, 오르토에스테르류, 펩티드류 및 올리고뉴클레오티드류가 있다.
"효소적으로 분해가능한 결합" 은 하나 이상의 효소에 의해 분해되는 결합을 의미한다.
"가수분해상으로 안정한" 결합 또는 결합은 수중에서 실질적으로 안정한, 다시 말해, 생리학적 조건하에서 장기간에 걸쳐 조금이나마 식별가능한 정도로 가수분해되지 않는 화학 결합, 전형적으로 공유결합을 지칭한다. 가수분해상으로 안정한 결합의 예로서는, 이에 제한되지는 않으나, 하기가 있다: (예컨대, 지방족 사슬 중의) 탄소-탄소 결합, 에테르류, 아미드류, 우레탄류 등. 통상적으로, 가수분해상으로 안정한 결합은 생리학적 조건하에서 하루에 약 1 - 2 % 미만의 가수분해율을 보이는 것이다. 대표적인 화학 결합의 가수분해율은 대부분의 표준 화학 교과서들에서 찾아볼 수 있다.
"약학적으로 허용가능한 부형제 또는 담체" 는 본 발명의 조성물에 임의로 포함될 수 있고 환자에 대하여 아무런 유의미한 독물학상의 역효과를 일으키지 않는 부형제를 지칭한다. "약리학적 유효량", "생리학적 유효량", 및 "치료적 유효량" 은 본원에서 상호교환가능하게 사용되며, 혈류 또는 표적 조직에 원하는 수준의 콘쥬게이트 (또는 대응하는 비-콘쥬게이션된 인자 Ⅷ 부분) 를 제공하는데 필요한 중합체-인자 Ⅷ 부분 콘쥬게이트의 양을 의미한다. 정확한 양은 다수의 요인들, 예컨대, 특정한 인자 Ⅷ 부분, 상기 치료 조성물의 성분들 및 물리적 특징들, 목적하는 환자 집단, 개별 환자 상태 등에 따라 다를 것이고, 본원에서 제공되는 정보에 기초하여 당업자가 쉽게 결정할 수 있다.
"다-작용성" 이란, 3 개 이상의 작용기가 포함되어 있는 중합체를 의미하며, 이때 상기 작용기는 동일 또는 상이할 수 있다. 본 발명의 다-작용성 중합성 시약은 전형적으로, 약 3 내지 100 개의 작용기, 또는 3 내지 50 개의 작용기, 또는 3 내지 25 개의 작용기, 또는 3 내지 15 개의 작용기, 또는 3 내지 10 개의 작용기를 포함하거나, 또는 중합체 골격 내에 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 개의 작용기를 포함할 것이다.
본원에서 사용되는 바, "인자 Ⅷ 부분" 이라는 용어는 인자 Ⅷ 활성을 가진 부분을 지칭한다. 상기 인자 Ⅷ 부분은 또한, 중합성 시약과 반응하기에 적당한 하나 이상의 친전자성 기 또는 친핵성 기를 가질 것이다. 필연적인 것은 아니나, 상기 인자 Ⅷ 부분은 전형적으로 단백질이다. 또한, "인자 Ⅷ 부분" 이라는 용어는 콘쥬게이션 이전의 인자 Ⅷ 부분 및 콘쥬게이션 후의 인자 Ⅷ 부분 잔기를 모두 포함한다. 하기에 보다 상세히 설명될 것으로서, 당업자는 주어진 임의의 부분이 인자 Ⅷ 활성을 갖는지 결정할 수 있다.
"환자" 라는 용어는 활성제 (예컨대, 콘쥬게이트) 의 투여로 예방 또는 치료될 수 있는 질환에 걸려 있거나 걸리기 쉬운 살아있는 유기체를 지칭하며, 인간 및 동물 모두를 포함한다.
"임의적" 또는 "임의적으로" 는 후술하는 상황이 일어날 수도 있고 일어나지 않을 수도 있음을 의미함으로써, 상기의 기재는 그 상황이 일어나는 경우 및 일어나지 않는 경우를 포함한다.
펩티드 내 아미노산 잔기는 하기와 같이 약칭된다: 페닐알라닌은 Phe 또는 F; 루신은 Leu 또는 L; 이소루신은 Ile 또는 I; 메티오닌은 Met 또는 M; 발린은 Val 또는 V; 세린은 Ser 또는 S; 프롤린은 Pro 또는 P; 트레오닌은 Thr 또는 T; 알라닌은 Ala 또는 A; 티로신은 Tyr 또는 Y; 히스티딘은 His 또는 H; 글루타민은 Gln 또는 Q; 아스파라긴은 Asn 또는 N; 리신은 Lys 또는 K; 아스파르트산은 Asp 또는 D; 글루탐산은 Glu 또는 E; 시스테인은 Cys 또는 C; 트립토판은 Trp 또는 W; 아르기닌은 Arg 또는 R; 및 글리신은 Gly 또는 G.
다시 본 발명의 제 1 구현예로 돌아가자면, 필수적인 것은 아니지만 바람직하게는, 각각 인자 Ⅷ 부분에 공유결합된 1 내지 3 개의 수용성 중합체를 갖는 복수 개의 콘쥬게이트를 함유한 조성물이 제공되는데, 여기서 상기 수용성 중합체는 각각 바람직하게는 5,000 돌턴 초과 내지 약 150,000 돌턴 범위의 공칭 평균 분자량을 갖는다.
원래의 인자 Ⅷ 은 구조가 A1-A2-B-A3-C1-C2 와 같이 조직된, 2,351 개의 아미노산으로 이루어진 단쇄 당단백질이다. 발현된 2,351 개의 아미노산 서열은 서열 번호 1로서 제공된다. 그러나, 발현된 폴리펩티드가 소포체의 내강으로 이동하면, 19 개-아미노산 서열이 절단되어, 제 2 서열이 생긴다. 본원에서 서열 번호 2로서 제공되는, 앞쪽의 19 개 아미노산이 결실된 상기 제 2 서열은, 통상적으로 연구자들이 인자 Ⅷ 의 주어진 아미노산 잔기에 숫자상 위치 (예컨대, Arg372) 를 할당하는 데 사용된다. 즉, 구체적으로 지적하지 않는 한, 본원에 제공된 아미노산 잔기의 모든 숫자상 위치 할당은 서열 번호 2를 기준으로 한다.
상대적으로 소량의 트롬빈 존재하에서, 인자 Ⅷ 은 Arg372, Arg74O, 및 Arg1689 위치에서 트롬빈에 의해 절단되어 인자 Ⅷa 를 생성한다. 인자 Ⅷa 는 트롬빈-절단 경량쇄 A3-C1-C2 에 (구리 이온을 통해서) 결합된 A1 서브유닛 및 이온성 상호작용을 통해서 A1 에 결합된 유리 A2 서브유닛을 포함한 이종삼량체이다. 인자 Ⅷ 부분은 단지 인자 Ⅷ 의 "활성" 형태 (예컨대, 인자 Ⅷa) 에만 제한되는 것은 아니며, "인자 Ⅷ 부분" 이란 용어에는 "전구체" 형태 뿐만 아니라 유사한 전구응고제 효과를 갖는 기타 물질도 포함됨을 인지하게 될 것이다.
임의의 주어진 부분에 대해서, 이 부분이 인자 Ⅷ 활성을 갖는지를 측정하는 것이 가능하다. 예를 들면, 몇몇 동물 계통을 의도적으로 혈우병에 대한 유전적 돌연변이를 나타내도록 양육시키면, 이러한 계통으로부터 산출된 동물은 매우 낮고 불충분한 수준의 인자 Ⅷ 을 갖게 된다. 이러한 계통은 제한 없이, [Division of Laboratories and Research, New York Department of Public Health, Albany, NY] 및 [Department of Pathology, University of North Carolina, Chapel Hill, NC] 와 같은 각종 공급원으로부터 입수할 수 있다. 이들 공급원은 둘 다, 예를 들면, 갯과 (canine) 혈우병 A 에 걸린 갯과 동물을 제공한다. 임의의 주어진 해당 부분의 인자 Ⅷ 활성을 시험하기 위해서, 상기 부분을 병에 걸린 동물에 주사하고, 작은 상처를 내서, 건강한 대조군과 출혈 시간을 비교한다. 인자 Ⅷ 활성을 측정하기에 유용한 또 다른 방법은 공동인자 및 전구응고제 활성을 측정하는 것이다. 예를 들면, [Mertens et al., (1993) Brit. J. Haematol. 85: 133-42] 을 참조한다. 당업자에게 공지되어 있는 다른 방법도 주어진 부분이 인자 Ⅷ 활성을 갖는지를 측정하는 데 사용할 수 있다. 이러한 방법은 상기 부분 그 자체 (즉 "인자 Ⅷ 부분" 으로서 사용할 수 있음) 뿐만 아니라 해당하는 중합체-부분 콘쥬게이트 둘 다의 인자 Ⅷ 활성을 측정하기에 유용하다.
인자 Ⅷ 부분의 비제한적 예에는 하기와 같은 것들이 포함된다: 인자 Ⅷ; 인자 Ⅷa; 인자 Ⅷ:C; 인자 Ⅷ:vWF; B-도메인 결실 인자 Ⅷ (및 인자 Ⅷ 의 기타 결실 버젼); 혼성 단백질, 예컨대 U.S. 특허 제 6,158,888 호에 기재되어 있는 것; 인자 Ⅷ 활성을 갖는 글리코실화 단백질, 예컨대 U.S. 특허 출원 공개공보 제 US2003/0077752 호에 기재되어 있는 것; 및 인자 Ⅷ 활성을 갖는 펩티드 모방물. 바람직한 결실형 인자 Ⅷ 버젼 ("B-도메인 결실 인자 Ⅷ" 이란 용어 포함) 은 Arg759 와 Ser1709 사이 영역 내에 581 개 이상의 아미노산에 해당하는 결실 (보다 바람직하게는 Pro1000 과 Asp1582 사이 영역, Thr778 과 Pro1659 사이 영역, 및 Thr778과 Glu1694 사이 영역 중 하나의 결실) 이 존재하는 인간 인자 Ⅷ 의 아미노산 서열 (서열 번호 1) 을 갖는 단백질에 해당한다. 인자 Ⅷ 활성을 어느 정도 이상 유지하는, 상기한 것들의 임의의 생물학적 활성 절편, 결실 변이체, 치환 변이체 또는 첨가 변이체도 인자 Ⅷ 부분으로 사용할 수 있다.
인자 Ⅷ 활성을 갖는 부분은 아미노산의 측쇄 내 원자에 중합체를 용이하게 결합시킬 수 있도록, 예를 들면, 리신, 시스테인 및/또는 아르기닌과 같은 아미노산 잔기를 하나 이상 포함하도록 개질시키는 것이 유리할 수 있다. 아미노산 잔기를 첨가하는 기술은 당업자에게 익히 공지되어 있다. [J. March, Advanced Organic Chemistry: Reactions Mechanisms and Structure, 4th Ed. (New York: Wiley-Interscience, 1992)] 을 참조한다.
인자 Ⅷ 부분은 혈액-유래의 공급원으로부터 수득할 수 있다. 예를 들면, 인자 Ⅷ은 당업자에게 공지되어 있는 침전 및 원심분리 기술을 사용하여 인간 혈장으로부터 분획화시킬 수 있다. 예를 들면, [Wickerhauser (1976) Transfusion 16(4): 345-350] 및 [Slichter et al. (1976) Transfusion 16(6): 616-626] 을 참조한다. 인자 Ⅷ은 또한 인간 과립구로부터 분리할 수도 있다. [Szmitkoski et al. (1977) Haematologia (Budap.) 11(1-2): 177-187] 을 참조한다.
또한, 인자 Ⅷ 부분은 재조합 방법으로도 수득할 수 있다. 요약하자면, 재조합 방법은 목적한 폴리펩티드 또는 절편을 코딩하는 핵산을 구성하는 단계, 상기 핵산을 발현 벡터에 클로닝하는 단계, 숙주 세포 (예를 들면, 박테리아, 효모, 또는 포유류 세포, 예컨대 차이니즈 햄스터 난소 세포 또는 새끼 햄스터 신장 세포) 를 형질전환시키는 단계, 및 핵산을 발현시켜 목적한 폴리펩티드 또는 절편을 생성시키는 단계를 포함한다. 시험관 내 및 원핵생물과 진핵생물 숙주 세포 내에서 재조합 폴리펩티드를 생성시키고 발현시키는 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들면, U.S. 특허 제 4,868,122 호를 참조한다.
재조합 폴리펩티드의 동정 및 정제를 원활하게 하기 위해서, 에피토프 표지를 코딩하는 핵산 서열 및 기타 친화성 결합 서열을 코딩 서열이 있는 프레임 내에 삽입 또는 첨가함으로써, 목적한 폴리펩티드 및 결합에 적당한 폴리펩티드를 함유한 융합 단백질을 생성시킬 수 있다. 먼저 융합 단백질을 함유한 혼합물을, 융합 단백질 내 에피토프 표지 또는 기타 결합 서열에 대한 결합 부분 (예컨대, 항체) 이 존재하는 친화성 칼럼에 흘려보내서, 칼럼 내에 융합 단백질을 결합시킴으로써, 융합 단백질을 동정 및 정제할 수 있다. 그 다음, 적절한 용액 (예컨대, 산) 으로 칼럼을 세척하여 결합된 융합 단백질을 방출시킴으로써, 융합 단백질을 회수할 수 있다. 재조합 폴리펩티드는 또한, 숙주 세포를 용해하여, 예를 들어 크기 배제 크로마토그래피로 폴리펩티드를 분리한 다음, 폴리펩티드를 수집함으로써 동정 및 정제할 수도 있다. 재조합 폴리펩티드를 동정 및 정제하는 이들 방법 및 기타 방법들은 당업자에게 공지되어 있다.
본 발명의 조성물은 복수 개의 콘쥬게이트를 함유할 수 있는데, 각 콘쥬게이트는 동일한 인자 Ⅷ 부분을 포함한다 (즉, 전체 조성물 내에서 단지 한 유형의 인자 Ⅷ 부분만이 발견된다). 또한, 상기 조성물은 임의의 주어진 콘쥬게이트가 2 이상의 상이한 인자 Ⅷ 부분으로 이루어진 군에서 선택된 부분을 포함하는, 복수 개의 콘쥬게이트를 함유할 수 있다 (즉, 전체 조성물 내에서 2 이상의 상이한 인자 Ⅷ 부분이 발견된다). 그러나, 조성물 내의 실질적으로 모든 복수 개의 콘쥬게이트 (예컨대, 조성물 내 복수 개의 콘쥬게이트의 85 % 이상) 가 각각 동일한 인자 Ⅷ 부분을 포함하는 것이 가장 적절하다.
더 나아가, 콘쥬게이트를 함유한 조성물은 알부민이 없거나 실질적으로 없는 것이 바람직하다. 또한, 조성물은 인자 Ⅷ 활성을 갖지 않는 단백질이 없거나 실질적으로 없는 것이 바람직하다. 즉, 조성물은 알부민이 85 %, 보다 바람직하게는 95 %, 및 가장 바람직하게는 99 % 없는 것이 바람직하다. 부가적으로, 조성물은 인자 Ⅷ 활성을 갖지 않는 단백질이 85 %, 보다 바람직하게는 95 %, 및 가장 바람직하게는 99 % 없는 것이 바람직하다.
앞서 논의한 바와 같이, 각 콘쥬게이트는 수용성 중합체에 결합된 인자 Ⅷ 부분을 포함한다. 상기 수용성 중합체와 관련하여, 수용성 중합체는 비펩티드성, 비독성, 비-자연발생적, 및 생체적합적이다. 생체적합성과 관련해서는, 물질이 생체 조직과 관련하여 단독으로 또는 또다른 물질 (예컨대, 인자 Ⅷ 부분과 같은 활성제) 과 함께 사용될 때 (예컨대, 환자에 대한 투여), 임의의 해로운 효과보다 이로운 효과가 더 크다고 내과의와 같은 임상의에 의해서 판단되는 경우, 그 물질은 생체적합적인 것으로 간주된다. 비-면역원성과 관련해서는, 물질의 생체 내에서의 의도적 사용이 원하지 않는 면역 반응 (예컨대, 항체의 형성) 을 생성하지 않거나, 만약 면역 반응이 생성되어도, 이러한 반응이 임상적으로 유의적이거나 중요하다고 임상의에 의해서 판단되지 않는 경우, 그 물질은 비면역원성인 것으로 간주된다. 수용성 중합체는 생체적합적이고 비면역원성인 것이 특히 바람직하다.
추가로, 중합체는 전형적으로 2 내지 약 300 개의 말단을 갖는 것을 특징으로 한다. 이러한 중합체의 예에는 폴리(알킬렌 글리콜), 예컨대 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 폴리(프로필렌 글리콜) ("PPG"), 에틸렌 글리콜과 프로필렌 글리콜 등의 공중합체, 폴리(옥시에틸렌화 폴리올), 폴리(올레핀성 알코올), 폴리(비닐피롤리돈), 폴리(히드록시알킬메트아크릴아미드), 폴리(히드록시알킬메트아크릴레이트), 다당류, 폴리(α-히드록시산), 폴리(비닐 알코올), 폴리포스파젠, 폴리옥사졸린, 폴리(N-아크릴로일모르폴린), 및 이들의 임의 배합물이 포함되지만 이에 한정되는 것은 아니다.
중합체는 특정 구조에만 한정되는 것은 아니며, 선형 (예컨대, 알콕시 PEG 또는 2작용성 PEG), 분지형 또는 다지형 (예컨대, 포크형 PEG 또는 폴리올 코어에 결합된 PEG) 이거나, 수지상이거나, 또는 분해가능한 결합기가 있을 수 있다. 또한, 중합체의 내부 구조는 임의 개수의 상이한 패턴으로 조직될 수 있으며, 단독중합체, 교대 공중합체, 불규칙 공중합체, 블록 공중합체, 교대 삼중공중합체, 불규칙 삼중공중합체, 및 블록 삼중공중합체로 구성된 군에서 선택될 수 있다.
전형적으로, PEG 및 기타 수용성 중합체는 인자 Ⅷ 부분 상 목적한 부위에 커플링되기에 적절한 활성화기로 활성화된다. 활성화된 중합체성 시약은 인자 Ⅷ 부분과의 반응을 위한 반응기를 보유하게 될 것이다. 활성 부분에 이들 중합체를 콘쥬게이션시키기 위한 대표적인 중합체성 시약 및 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 추가로 문헌 [Zalipsky, S., et al., "Use of Functionalized Poly(Ethylene Glycols) for Modification of Polypeptides" in Polyethylene Glycol Chemistry: Biotechnical and Biomedical Applications, J. M. Harris, Plenus Press, New York (1992)], 및 [Zalipsky (1995) Advanced Drug Reviews 16: 157-182] 에 기재되어 있다.
전형적으로, 콘쥬게이트 내 임의의 주어진 중합체의 공칭 평균 분자량은 약 100 돌턴 내지 약 150,000 돌턴이다. 그러나, 예시적 범위에는 5,000 돌턴 초과 내지 약 100,000 돌턴 범위, 약 6,000 돌턴 내지 약 90,000 돌턴 범위, 약 10,000 돌턴 내지 약 85,000 돌턴 범위, 약 20,000 돌턴 내지 약 85,000 돌턴 범위, 및 약 53,000 돌턴 내지 약 85,000 돌턴 범위의 공칭 평균 분자량이 포함된다. 임의의 주어진 수용성 중합체에 대해서, 상기 분자량 범위를 갖는 PEG가 바람직하다.
수용성 중합체 분절에 대한 예시적 공칭 평균 분자량에는 약 100 돌턴, 약 200 돌턴, 약 300 돌턴, 약 400 돌턴, 약 500 돌턴, 약 600 돌턴, 약 700 돌턴, 약 750 돌턴, 약 800 돌턴, 약 900 돌턴, 약 1,000 돌턴, 약 2,000 돌턴, 약 2,200 돌턴, 약 2,500 돌턴, 약 3,000 돌턴, 약 4,000 돌턴, 약 4,400 돌턴, 약 5,000 돌턴, 약 6,000 돌턴, 약 7,000 돌턴, 약 7,500 돌턴, 약 8,000 돌턴, 약 9,000 돌턴, 약 10,000 돌턴, 약 11,000 돌턴, 약 12,000 돌턴, 약 13,000 돌턴, 약 14,000 돌턴, 약 15,000 돌턴, 약 20,000 돌턴, 약 22,500 돌턴, 약 25,000 돌턴, 약 30,000 돌턴, 약 40,000 돌턴, 약 50,000 돌턴, 약 60,000 돌턴, 및 약 75,000 돌턴이 포함된다.
중합체로서 사용될 때, PEG 는 전형적으로 다수의 (OCH2CH2) 단량체를 포함할 것이다. 명세서 전반에서 사용될 때, 반복 단위의 수는 "(OCH2CH2)n" 의 아래첨자 "n" 에 의해서 확인된다. 즉, (n) 의 값은 하기 범위 중 하나 이상에 속한다: 2 내지 약 2,300, 약 100 내지 약 2,300, 약 135 내지 약 2,000, 약 230 내지 약 1,900, 약 450 내지 약 1,900, 및 약 1,200 내지 약 1,900. 분자량이 알려져 있는 임의의 주어진 중합체에 대해서는, 중합체의 총 분자량을 반복 단위의 분자량으로 나눔으로써 반복 단위의 수 (즉, "n") 를 구할 수 있다.
본 발명에서 사용하기에 특히 바람직한 하나의 중합체는 말단 캡핑 중합체, 즉 상대적으로 비활성인 기, 예컨대 저급 C1 -6 알콕시기로 하나 이상의 말단이 캡핑된 중합체이다. 예를 들어 중합체가 PEG 일 때, 중합체의 한 쪽 말단은 메톡시 (-OCH3) 기이고, 다른 쪽 말단은 히드록시기 또는 화학적으로 임의 개질시킬 수 있는 기타 작용기인, 선형 PEG인 메톡시-PEG (통상적으로는 mPEG 로 지칭됨) 를 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명에서 유용한 하나의 형태에 있어서, 유리되거나 결합되지 않은 PEG 는 각 말단이 히드록시기로 종결되는 하기와 같은 선형 중합체이다:
HO-CH2CH2O-(CH2CH2O)m'-CH2CH2-0H
[식 중, (m') 는 전형적으로 0 내지 약 4,000 범위이다].
상기 알파-,오메가-디히드록시폴리(에틸렌 글리콜) 중합체는 HO-PEG-OH 와 같은 간단한 형태로 나타낼 수 있는데, 여기서 -PEG- 기호는 하기 구조 단위를 나타낼 수 있음을 이해해야 한다:
-CH2CH2O-(CH2CH2O)m'-CH2CH2-
[식 중, (m') 는 상기 정의한 바와 같다].
본 발명에서 유용한 PEG 의 또 다른 유형은 메톡시-PEG-OH, 또는 간단히 mPEG 인데, 여기서 한 쪽 말단은 상대적으로 비활성인 메톡시기이고, 다른 쪽 말단은 히드록시기이다. mPEG 의 구조는 하기와 같다.
CH3O-CH2CH2O-(CH2CH2O)m'-CH2CH2-OH
(식 중, (m') 는 상기 기술된 바와 같음).
다중-팔 또는 분지형 PEG 분자, 예컨대 U.S. 특허 제 5,932,462 호에 기술된 것 또한 PEG 중합체로서 사용될 수 있다. 예를 들어, PEG 는 하기 구조를 가질 수 있다:
(식 중, POLYa 및 POLYb 는 예컨대 메톡시 폴리(에틸렌 글리콜)과 같은 PEG 골격 (동일하거나 또는 상이함) 이고;
R" 는 예컨대 H, 메틸 또는 PEG 골격과 같은 비반응성 부분이고;
P 및 Q 는 비반응성 결합임). 바람직한 구현예에서, 분지형 PEG 중합체는 메톡시 폴리(에틸렌 글리콜) 2치환 리신이다. 사용되는 특정 인자 Ⅷ 부분에 따라서, 2치환 리신의 반응성 에스테르 작용기는 추가로 개질되어 인자 Ⅷ 부분 내의 표적기와 반응하기 적합한 작용기를 형성할 수 있다.
이러한 중합체는 선형일 수 있거나, 또는 임의의 상기-기술된 형태일 수 있다.
또한, PEG 는 포크형 PEG 를 포함할 수 있다. 포크형 PEG 의 예는 하기 구조로 나타내어진다:
(식 중, X 는 하나 이상의 원자의 스페이서 부분이고, 각각의 Z 는 한정된 길이의 원자 쇄에 의해 CH 에 결합된 활성화된 말단기임). 국제 출원 No. PCT/US99/05333 은 본 발명에 사용될 수 있는 다양한 포크형 PEG 구조를 개시한다. Z 작용기를 분지형 탄소 원자에 결합하는 원자의 쇄는 테터링 (tethering) 기로서 작용하고, 예를 들어, 알킬쇄, 에테르쇄, 에스테르쇄, 아미드쇄 및 이의 조합을 포함할 수 있다.
PEG 중합체는 PEG 쇄의 말단에서보다 PEG 의 길이를 따라 공유결합된, 예컨대 카르복시과 같은 반응성기를 갖는 펜던트 PEG 분자를 포함할 수 있다. 펜던트 반응성 기는 PEG 에, 직접 또는 예컨대 알킬렌기와 같은 스페이서 부분을 통해 결합될 수 있다.
상기-기술된 PEG 형태뿐만 아니라, 중합체는 또한 임의의 상기 기술된 중합체를 포함하여, 중합체 내의 하나 이상의 약하거나 또는 분해가능한 결합과 함께 제조될 수 있다. 예를 들어, PEG 는 중합체 내의 가수분해되는 에스테르 결합과 함께 제조될 수 있다. 하기에 나타낸 바와 같이, 상기 가수분해는 중합체를 절단하여 더 낮은 분자량의 절편이 되게 한다:
중합체 골격에서 분해가능한 결합으로서 유용한, 가수분해적으로 분해가능한 기타 결합은 카르보네이트 결합; 예를 들어, 아민 및 알데히드의 반응으로부터초래된 이민 결합 (예를 들어, [Ouchi 등 (1997) Polymer Preprints 38(1):582-3] 참조); 예를 들어, 알코올을 포스페이트기와 반응시킴으로써 형성된 포스페이트 에스테르 결합; 전형적으로 히드라지드 및 알데히드의 반응에 의해 형성된 히드라존 결합; 전형적으로 알데히드 및 알코올 사이의 반응에 의해 형성된 아세탈 결합; 예를 들어, 포르메이트 및 알코올 사이의 반응에 의해 형성된 오르토에스테르 결합; 예를 들어, PEG 와 같은 중합체의 말단에서의 아민기 및 또다른 PEG 쇄의 카르복시기에 의해 형성된 아미드 결합; 예를 들어, 말단 이소시아네이트기가 있는 PEG 및 PEG 알코올의 반응으로부터 형성된 우레탄 결합; 예를 들어, PEG 와 같은 중합체의 말단에서의 아민기 및 펩티드의 카르복시기에 의해 형성된 펩티드 결합; 및 예를 들어, 중합체의 말단에서의 포스포르아미디트기 및 올리고뉴클레오티드의 5' 히드록시기에 의해 형성된 올리고뉴클레오티드 결합을 포함한다.
중합체 콘쥬게이트의 상기 임의의 특성, 즉, 하나 이상의 분해가능한 결합을 중합체 쇄로 도입하면 투여 시 콘쥬게이트의 최종의 목적하는 약리학적 성질을 추가로 조절할 수 있다. 예를 들어, 크고 상대적으로 비활성인 콘쥬게이트 (즉, 거기에 결합된 하나 이상의 고분자량 PEG 쇄, 예를 들어, 약 10,000 초과의 분자량을 갖는 하나 이상의 PEG 쇄 (여기서, 콘쥬게이트는 본래 생물활성을 갖고 있지 않음) 를 가짐) 가 투여될 수 있으며, 이는 가수분해되어, 원래의 PEG 쇄의 부분을 갖는 생물활성 콘쥬게이트를 발생시킨다. 상기 방법으로, 콘쥬게이트의 성질을 더욱 효과적으로 맞추어 경시적으로 콘쥬게이트의 생물활성을 균형잡을 수 있다.
당업자는 실질적으로 수용성인 중합체 분절에 대한 전술의 토의가 결코 철저하지 않고, 단지 예시적일 뿐이며, 상기 기술된 질을 갖는 모든 중합체성 물질은 상보적이라는 것을 깨달을 것이다. 여기에 사용되는 바와 같이, 용어 "중합체성 시약" 은 일반적으로 수용성 중합체 분절 및 작용기를 포함할 수 있는 전체 분자를 말한다.
상기에 기술된 바와 같이, 본 발명의 콘쥬게이트는 인자 Ⅷ 부분에 공유결합된 수용성 중합체를 포함한다. 전형적으로, 임의의 주어진 콘쥬게이트는, 인자 Ⅷ 활성을 갖는 하나 이상의 부분에 공유결합된 1 내지 3 개의 수용성 중합체가 있을 것이다. 그러나, 일부 경우에, 콘쥬게이트는 인자 Ⅷ 부분에 개별적으로 결합된 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 개 또는 그 이상의 수용성 중합체를 가질 수 있다.
인자 Ⅷ 활성을 갖는 부분 및 중합체의 특수한 결합은 수많은 요소에 의존한다. 상기 요소는 예를 들어, 적용되는 특수한 결합 화학, 인자 Ⅷ 활성을 갖는 특수한 부분, 인자 Ⅷ 활성을 갖는 부분 내의 이용가능한 작용기 (중합체로의 결합 또는 적합한 결합 위치로의 전환을 위한 것), 인자 Ⅷ 활성을 갖는 부분 내의 추가의 반응성 작용기의 존재 가능성 등을 포함한다.
본 발명의 콘쥬게이트는 필수적이지는 않으나, 프로드러그일 수 있으며, 이는 중합체 및 인자 Ⅷ 부분 사이의 결합이 가수분해적으로 분해가능하여, 부모 부분 (parent moiety) 이 방출되는 것을 의미한다. 예시적인 분해가능한 결합은 카르복시레이트 에스테르, 포스페이트 에스테르, 티올에스테르, 무수물, 아세탈, 케탈, 아실옥시알킬 에테르, 이민, 오르토에스테르, 펩티드 및 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 상기 결합은 당업계에서 흔히 적용되는 커플링 방법을 이용하여 인자 Ⅷ 부분 (예를 들어, 단백질의 카르복시기 C 말단 또는 예컨대 세린 또는 트레오닌과 같이 단백질 내에 함유된 아미노산의 측쇄 히드록시기) 및/또는 중합체성 시약의 적절한 개질에 의해 쉽게 제조될 수 있다. 그러나, 적합하게 활성화된 중합체를 인자 Ⅷ 활성을 갖는 부분 내에 함유된 비-개질된 작용기와 반응시킴으로써 쉽게 형성되는 가수분해가능한 결합이 가장 바람직하다.
대안적으로, 가수분해적으로 안정한 결합, 예컨대 아미드, 우레탄 (카르바메이트라고도 알려짐), 아민, 티오에테르 (설피드라고도 알려짐), 또는 우레아 (카르브아미드라고도 알려짐) 결합 또한 인자 Ⅷ 부분을 커플링하는 결합으로서 적용될 수 있다. 그러나, 일부 경우에, 결합은 카르바메이트 결합이 아니고, 카르브아미드 결합이 아니며, 더욱이, 이소시아네이트 또는 이소티오시아네이트 종을 갖는 중합체 유도체의 인자 Ⅷ 부분으로의 반응을 기반으로 해서는 어떠한 결합도 형성되지 않는 것이 바람직하다. 또, 가수분해적으로 안정한 바람직한 결합은 아미드이다. 아미드는 인자 Ⅷ 부분 (예를 들어, 인자 Ⅷ 활성을 갖는 펩티드 부분의 말단 카르복시) 내에 함유된 카르복시기와 아미노 말단 중합체의 반응에 의해 쉽게 제조될 수 있다.
상기 콘쥬게이트 (콘쥬게이션되지 않은 인자 Ⅷ 부분과 반대임) 는 인자 Ⅷ 활성을 측정가능한 정도로 가질 수 있거나 또는 가질 수 없다. 즉, 본 발명에 따른 중합체 콘쥬게이트는 어디서나 비개질된 부모 인자 Ⅷ 부분의 약 0.1% 내지 약 100% 이상의 생물활성을 가질 것이다. 바람직하게는, 인자 Ⅷ 활성을 거의 가지지 않거나 또는 전혀 가지지 않는 화합물은 전형적으로 상기 부분에 중합체를 결합하는 가수분해가능한 결합을 포함하며, 콘쥬게이트에서의 활성의 결함과는 상관없이, 가수분해가능한 결합이 수성-유발 절단될 때 활성 부모 분자 (또는 그의 유도체) 가 방출된다. 상기 활성은 적용되는 인자 Ⅷ 활성을 갖는 특수한 부분의 공지된 활성에 따라, 적합한 생체내 또는 시험관내 모델을 이용하여 결정될 수 있다.
인자 Ⅷ 활성을 갖는 부분을 중합체에 커플링시키는 가수분해적으로 안정한 결합을 갖는 콘쥬게이트에 대해, 상기 콘쥬게이트는 전형적으로 측정가능한 정도의 특정 활성을 가질 것이다. 예를 들어, 상기 중합체 콘쥬게이트는 당업계에서 공지된 것과 같은 적합한 모델에서 측정될 때, 인자 Ⅷ 활성을 갖는 비개질된 부모 부분의 것에 대해 전형적으로 약 2 %, 5 %, 10 %, 15 %, 25 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 100 % 또는 그 이상의 활성을 갖는 것을 특징으로 한다. 바람직하게는, 가수분해적으로 안정한 결합 (예를 들어, 아미드 결합) 을 갖는 화합물은 인자 Ⅷ 활성을 갖는 비개질된 부모 부분의 생물활성의 어느 정도 이상을 가질 것이다.
본 발명에 따른 예시적인 중합체 콘쥬게이션을 이제 기술할 것이고, 여기서 인자 Ⅷ 활성을 갖는 부분은 단백질이다. 전형적으로, 상기 단백질은 원래의 인자 Ⅷ 과 (적어도 부분적으로) 유사한 아미노산 서열을 공유하는 것으로 생각된다. 따라서, 원래의 인자 Ⅷ 단백질 내의 특정 위치 또는 원자를 참고할 것이나, 상기 참조는 단지 편의상이며, 당업자는 인자 Ⅷ 활성을 갖는 다른 부분에서의 상응하는 위치 또는 원자를 쉽게 결정할 수 있을 것이다. 특히, 원래의 인자 Ⅷ 에 대한 본원의 설명은 인자 Ⅷa, 인자 Ⅷ:vWF 및 B-도메인 결실 인자 Ⅷ 버젼 뿐만 아니라 상기의 것들 중 임의의 절편, 결실 변이체, 치환 변이체 또는 첨가 변이체에 적용가능하다.
인자 Ⅷ 부분 상의 아미노기는 인자 Ⅷ 부분과 수용성 중합체 사이의 결합점을 제공한다. 원래의 인자 Ⅷ 은 158 아민-함유 리신 잔기 (전체 단백질의 6.8 중량%) 및 하나의 아미노 말단을 포함한다. 인자 Ⅷa 에 대해서는, 78 리신 잔기 (전체 단백질의 5.5 중량%) 및 2 개의 아미노 말단 (인자 Ⅷ 의 절단으로부터 생성됨) 이 있다. 결과적으로, 2 차 또는 3 차 구조의 측면에도 불구하고, 인자 Ⅷ 및 인자 Ⅷa (뿐만 아니라 임의의 펩티드 인자 Ⅷ 부분, 예를 들어, B-도메인 결실 인자 Ⅷ) 둘 다 콘쥬게이션 반응에 참가할 수 있는 다수의 아민을 가진다.
인자 Ⅷ 부분의 이용가능한 아민과의 공유결합을 형성하기에 유용한 적합한 수용성 중합체성 시약의 예는 많이 있다. 상응하는 콘쥬게이트에 따른 구체적인 예는 하기 표 1 에 제공된다. 표에서, 변수 (n) 은 반복 단량체 단위의 수를 나타내고, "-NH-F8" 은 수용성 중합체와의 콘쥬게이션 후의 인자 Ⅷ 부분을 나타낸다. 표 1 에 있는 각 중합체 부분은 "CH3" 기에서 종결되는 반면, 다른 기 (예컨대 H 및 벤질) 가 그에 치환될 수 있다.
중합체성 시약의 인자 Ⅷ 부분의 아미노기로의 콘쥬게이션은 실험 없이 당업자에 의해 달성될 수 있다. 한 전형적인 접근은 예를 들어, 인자 Ⅷ 부분의 1 차 아민과, 케톤, 알데히드 또는 그의 수화된 형태 (예를 들어, 케톤 수화물, 알데히드 수화물) 로 작용화된 중합체와의 콘쥬게이션에 사용되는 환원성 아민화 반응이다. 상기 접근에서, 인자 Ⅷ 부분의 1 차 아민은 알데히드 또는 케톤 (또는 수화된 알데히드 또는 케톤의 상응하는 히드록시-함유 기) 의 카르보닐기와 반응하여, Schiff 염을 형성한다. 다음으로, Schiff 염은 예컨대 소듐 보로히드라이드와 같은 환원제를 사용하여 안정한 콘쥬게이트로 환원적으로 전환될 수 있다. 선택 반응 (예를 들어, N-말단에서 가능함) 은 특히 케톤 또는 알파-메틸 분지형 알데히드로 작용화된 중합체로 및/또는 특정 반응 조건 (예를 들어, 감소된 pH) 하에 가능하다.
중합체에 결합하는 위치로서 작용할 수 있는 인자 Ⅷ 내의 바람직한 아민기는 하기 리신 잔기: Lys493, Lys496, Lys499, Lys1804, Lys1808, Lys1813, Lys1818, Lys2183, Lys2207, Lys2227, Lys2236 에서 발견되는 아민기를 포함하며, Lys496, Lys1804 및 Lys1808 이 특히 바람직하다. 번호는 서열 번호 2 에 제공되는 서열에 상응한다. 상기 언급된 바와 같이, 인간 인자 Ⅷ 이외의 단백질 내에 있는 상기 리신 잔기 각각에 상응하는 아민기는 콘쥬게이션에 유용한 위치로서 작용할 수 있다. 또한, 단백질인 임의의 인자 Ⅷ 부분의 N-말단은 중합체 결합 위치로서 작용할 수 있다.
카르복시기는 인자 Ⅷ 부분 상의 결합점으로서 작용할 수 있는 또다른 작용기를 나타낸다. 구조적으로, 상기 콘쥬게이트는 하기를 포함할 것이다 :
(식 중, F8 및 인접 카르보닐기는 카르복시-함유 인자 Ⅷ 부분에 상응하고, X 는 결합, 바람직하게는 O, N(H) 및 S 로부터 선택되는 헤테로원자이고, POLY 는 임의로 말단-캡핑 부분에서 종결하는 PEG 와 같은 수용성 중합체임).
C(O)-X 결합은 말단 작용기를 갖는 중합체성 유도체 및 카르복시-함유 인자 Ⅷ 부분 사이의 반응으로부터 생성된다. 상기에 토의된 바와 같이, 특정 결합은 이용하는 작용기의 유형에 의존할 것이다. 중합체가 말단-작용화되거나 또는 히드록시기로 "활성화된" 경우, 생성되는 결합은 카르복시산 에스테르일 것이고, X 는 O 일 것이다. 중합체 골격이 티올기로 작용화된 경우, 생성되는 결합은 티오에스테르일 것이고, X 는 S 일 것이다. 특정한 다중-팔, 분지형 또는 포크형 중합체가 적용된 경우, C(O)X 부분, 특히 X 부분은 상대적으로 더 복잡할 수 있고, 더 긴 결합 구조를 포함할 수 있다.
히드라지드 부분을 함유하는 수용성 유도체 또한 카르복시기에서 콘쥬게이션하기에 유용하다. 상기 유도체의 예는 하기 구조를 갖는 중합체를 포함하며:
이는 인자 Ⅷ 부분과의 콘쥬게이션시, 하기 구조를 가진다:
(식 중, F8 은 콘쥬게이션 후의 인자 Ⅷ 부분이고, POLY 는 말단-캡핑 부분에서 임의로 종결되는 예컨대 PEG 와 같은 수용성 중합체임).
인자 Ⅷ 부분 내에 함유된 티올기는 수용성 중합체에 대한 결합의 유효 위치로서 작용할 수 있다. 특히, 시스테인 잔기는 인자 Ⅷ 부분이 단백질일 때, 티올기를 제공한다. 이 때, 상기 시스테인 잔기 내의 티올기는 U.S. 특허 제 5,739,208 호 및 국제 출원 공개공보 No. WO 01/62827 에서 기술된 바와 같이, 예를 들어, N-말레이미딜 중합체 또는 기타 유도체와 같은, 티올기와의 반응에 특효인 활성화된 PEG와 반응될 수 있다.
상응하는 콘쥬게이트에 따른 특정한 예는 하기의 표 2 에 제공된다. 하기 표에서, 변수 (n) 은 반복되는 단량체성 단위를 나타내며 "-S-F8" 은 수용성 중합체와의 콘쥬게이션 후의 인자 Ⅷ 부분을 나타낸다. 표 1 에 나타난 각각의 중합체성 부위가 "CH3" 기로 끝나는 한편 다른 기 (예컨대 H 및 벤질) 가 그에 치환될 수 있다.
하나 이상의 말레이미드 작용기 (상기 말레이미드와 인자 Ⅷ 부분 상의 아민 또는 티올기와의 반응 여부와 상관없이) 를 갖는 수용성 중합체로부터 형성되는 콘쥬게이트에 대해, 상기 수용성 중합체의 상응하는 말레아믹산 형태(들)는 또한 인자 Ⅷ 부분과 반응할 수 있다. 임의의 조건에서 (예를 들어, 물의 존재하에서 약 7 내지 9 의 pH) 말레이미드 고리는 "개환" 하여 상응하는 말레아믹산을 형성할 것이다. 이어서, 말레아믹산을 인자 Ⅷ 부분의 아민 또는 티올기와 반응할 수 있다. 예시적인 말레아믹산-기재 반응은 하기에 개략적으로 제시된다. POLY 는 수용성 중합체를 나타내고, F8 은 인자 Ⅷ 부분을 나타낸다.
본 발명에 따른 대표적인 콘쥬게이트는 하기의 구조를 가질 수 있다:
POLY-L0 ,1-C(O)Z-Y-S-S-F8
[식 중, POLY 는 수용성 중합체이며, L 은 선택적 결합기이며, Z 는 O, NH 및 S 로 이루어진 군으로부터 선택된 헤테로원자이며, Y 는 C2 -10 알킬, C2 -10 치환 알킬, 아릴, 및 치환 아릴로 이루어진 군으로부터 선택된다].
인자 Ⅷ 부분과 반응할 수 있으며 이러한 유형의 콘쥬게이트를 초래하는 중합체성 시약이 U.S. Serial No. 10/753,047 의 2004 년 1 월 6 일 제출된 "Thiol Selective Water Soluble Polymer Derivatives" 라는 제목의 동시계속출원에 기술되어 있다.
중합체성 시약을 결합시키는 부위로 사용될 수 있는 인자 Ⅷ 내의 바람직한 티올기는 하기의 시스테인 잔기: Cys248, Cys310, Cys329, Cys630, Cys692, Cys711, Cys1899, Cys1903 및 Cys2000 내에서 발견되는 티올기를 포함하고, Cys630, Cys711 및 Cys1903 이 특히 바람직하다. 번호는 서열 번호 2 에 제공된 서열에 상응한다.
중합체성 시약에 대해, 여기 및 다른 곳에 기술된 것은 제조업자 (예를 들어, Nektar Therapeutics, Huntsville AL) 로부터 구입할 수 있다. 부가적으로, 중합체성 시약을 제조하기 위한 방법은 문헌에 기술되어 있다.
필연적이지는 않지만 전형적으로, 인자 Ⅷ 부분 및 중합체성 시약 간의 결합은 하나 이상의 원자, 예컨대 하나 이상의 탄소, 질소, 황 및 이의 배합물을 포함한다. 바람직하게는, 결합이 아미드, 2차 아민, 카르바메이트, 티오에테르, 또는 디설피드기를 포함한다. 임의로, 부가적인 원자는 상기 결합을 중합체성 시약 내에서 반복 단량체의 사슬에 결합시킬 수 있다. 인자 Ⅷ 부분을 반복 단량체의 사슬에 결합하는, 일련의 특정한 원자의 제한적이지 않은 예는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 포함한다:
이러한 콘쥬게이트는 전형적으로 조성물의 일부이다. 일반적으로, 상기 조성물은 복수의 콘쥬게이트를 포함하며, 필수적이지는 않지만 바람직하게는, 각각이 하나의 인자 Ⅷ 부분에 공유결합된 1 내지 3 개의 수용성 중합체를 갖는다. 그러나 상기 조성물은 인자 Ⅷ 활성을 갖는 임의의 주어진 부분에 결합된 4, 5, 6, 7, 8 개 또는 그 이상의 중합체를 갖는 다른 콘쥬게이트를 포함할 수도 있다. 부가적으로, 본 발명은 조성물이, 각각의 콘쥬게이트가 1 개의 인자 Ⅷ 부분에 공유결합된 1 개의 수용성 중합체를 포함하는 복수의 콘쥬게이트를 포함하는 경우 뿐만 아니라, 1 개의 인자 Ⅷ 부분에 공유결합된 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 개 또는 그 이상의 수용성 중합체를 함유하는 조성물을 포함한다.
임의의 주어진 부분에 있어서 중합체를 원하는 개수로 조절하는 것은 적합한 중합체성 시약, 중합체성 시약 대 인자 Ⅷ 부분의 비율, 온도, pH 조건 및 콘쥬게이션 반응의 다른 측면을 선택하여 달성할 수 있다. 부가적으로, 바람직하지 않은 콘쥬게이트 (예를 들어, 4 개 이상의 중합체가 결합된 콘쥬게이트) 의 감소 또는 제거는 정제 방법에 의해 달성될 수 있다.
예를 들어, 중합체-인자 Ⅷ 부분 콘쥬게이트를 정제하여 상이한 콘쥬게이션된 종을 수득/단리할 수 있다. 특히, 생성물 혼합물을 정제하여 평균적으로 인자 Ⅷ 부분 당 1, 2, 3, 4, 5 개 또는 그 이상의 PEG, 전형적으로, 인자 Ⅷ 부분 당 1, 2 또는 3 개의 PEG 를 수득할 수 있다. 최종적 콘쥬게이트 반응 혼합물의 정제 방법은, 예를 들어, 사용된 중합체성 시약의 분자량, 특정 인자 Ⅷ 부분, 바람직한 투여법, 및 잔여 활성도 및 개별적 콘쥬게이트(들)의 생체내 특성을 포함하는 다수의 요소에 좌우될 것이다.
원한다면, 상이한 분자량을 갖는 콘쥬게이트는 겔 크로마토그래피 및/또는 이온 교환 크로마토그래피를 사용하여 단리될 수 있다. 즉, 겔 여과 크로마토그래피를 사용하여 다르게 번호 매김된 중합체-대-인자 Ⅷ 부분 비율 (예를 들어, 1-머, 2-머, 3-머, 등, 여기서 "1-머" 는 인자 Ⅷ 부분 당 1 중합체를 나타내며, "2-머" 는 인자 Ⅷ 부분 당 2 중합체를 나타냄 등) 을 이들의 상이한 분자량 (여기서, 차이는 본질적으로 수용성 중합체 부분의 평균 분자량에 상응함) 에 기초해 분류한다. 예를 들어, 100,000 돌턴 단백질이 약 20,000 돌턴의 분자량을 갖는 중합체성 시약에 무작위로 콘쥬게이션된 예시적인 반응에서, 생성된 반응 혼합물은 비개질 단백질 (약 100,000 돌턴의 분자량을 가짐), 1-PEG화 단백질 (약 120,000 돌턴의 분자량을 가짐), 2-PEG화 단백질 (약 140,000 돌턴의 분자량을 가짐) 등을 포함할 수 있다.
이러한 접근법을 사용하여, 상이한 분자량을 갖는 PEG 및 기타 중합체-인자 Ⅷ 부분 콘쥬게이트를 단리시킬 수 있는 반면, 이러한 접근법은 일반적으로 인자 Ⅷ 부분 내에 상이한 중합체 결합 부위를 갖는 위치 이성질체를 분리기키기에는 비효율적이다. 예를 들어, 각각의 회수된 PEG-머 조성물이 인자 Ⅷ 부분 내에서 상이한 반응성 아미노기 (예를 들어, 리신 잔기) 에 결합된 PEG 를 포함할 수 있음에도 불구하고, 겔 여과 크로마토그래피를 사용하여 PEG 1-머, 2-머, 3-머 등의 혼합물을 서로로부터 분리시킬 수 있다.
이러한 유형의 분리를 수행하는데 적합한 겔 여과 칼럼은 Amersham Biosciences (Piscataway, NJ) 에서 시판되는 SuperdexTM 및 SephadexTM 칼럼을 포함한다. 특정한 칼럼의 선택은 원하는 분리 범위에 따라 좌우된다. 용리는 일반적으로 적합한 완충액, 예컨대 포스페이트, 아세테이트 등을 사용하여 수행된다. 수집된 분획물은 다수의 상이한 방법, 예를 들어, (i) 단백질 함량에 대한 280 nm 에서의 광학적 밀도 (OD), (ii) 소혈청 알부민 (BSA) 단백질 분석, (iii) PEG 함량에 대한 요오드 시험 (Sims et al . (1980) Anal . Biochem , 107: 60-63), 및 (iv) 소듐 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (SDS PAGE) 에 연이은 요오드화 바륨으로의 염색에 의해 분석될 수 있다.
위치 이성질체의 분리는 역상 고성능 액체 크로마토그래피 (RP-HPLC) C18 칼럼 (Amersham Biosciences 또는 Vydac) 을 이용하는 역상 크로마토그래피 또는 이온 교환 칼럼, 예를 들어, Amersham Biosciences 로부터 시판되는 SepharoseTM 이온 교환 칼럼을 사용하는 이온 교환 크로마토그래피에 의해 수행된다. 두 접근법 중 하나를 사용하여 동일한 분자량을 갖는 중합체-활성제 이성질체 (위치 이성질체) 를 분리시킬 수 있다.
상기 조성물은 바람직하게는 인자 Ⅷ 활성을 갖지 않는 단백질이 실질적으로 없다. 부가적으로, 상기 조성물은 바람직하게는 비공유결합된 기타의 모든 수용성 중합체가 실질적으로 없다. 추가적으로, 조성물 내의 콘쥬게이트 중 하나 이상의 종은 인자 X 를 인자 Xa 로 변환시키는 부분에 결합된 하나 이상의 수용성 물 중합체를 갖는다. 그러나, 어떤 경우에는 조성물이 중합체-인자 Ⅷ 부분 콘쥬게이트 및 콘쥬게이션되지 않은 인자 Ⅷ 의 혼합물을 포함할 수 있다.
임의로, 본 발명의 조성물은 추가적으로 약학적으로 허용되는 부형제를 함유한다. 원한다면, 약학적으로 허용되는 부형제를 첨가하여 콘쥬게이션시켜 조성물을 형성할 수 있다.
예시적인 부형제는, 제한 없이 탄수화물, 무기염, 항생제, 항산화제, 계면활성제, 완충제, 산, 염기, 및 이의 배합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 포함한다.
탄수화물, 예컨대 당, 유도체화 당 예컨대 알디톨, 알돈산, 에스테르화 당, 및/또는 당 중합체가 부형제로서 존재할 수 있다. 특정한 탄수화물 부형제는 예를 들어 하기를 포함한다: 단당류, 예컨대 프룩토스, 말토스, 갈락토스, 글루코스, D-만노오스, 소르보스, 등; 이당류, 예컨대 락토오스, 수크로스, 트레할로스, 셀로비오스, 등; 다당류, 예컨대 라피노스, 멜레지토스, 말토덱스트린, 덱스트란, 전분 등; 알디톨, 예컨대 만니톨, 자일리톨, 말티톨, 락티톨, 자일리톨, 소르비톨 (글루시톨), 피라노실 소르비톨, 마이오이노시톨, 등.
상기 부형제는 또한 무기염 또는 완충액, 예컨대 시트르산, 소듐 클로라이드, 포타슘 클로라이드, 소듐 설페이트, 포타슘 니트레이트, 제1인산 나트륨, 제2인산 나트륨 및 이의 배합물을 포함할 수 있다.
상기 조성물은 또한 세균 증식을 예방하거나 막기 위한 항생제를 포함할 수 있다. 본 발명에 적합한 항생제의 제한적이지 않은 예는 벤즈알코늄 클로라이드, 벤즈에토늄 클로라이드, 벤질 알코올, 세틸피리디늄 클로라이드, 클로로부탄올, 페놀, 페닐에틸 알코올, 페닐머큐릭 니트레이트, 티메르솔, 및 그의 배합물을 포함한다.
항산화제 또한 조성물에 존재할 수 있다. 항산화제는 산화를 방지하기 위해 사용되며, 그로 인해 콘쥬게이트 또는 제제의 기타 성분의 약화를 방지한다. 본 발명에 사용하기에 적합한 항산화제는, 예를 들어, 아스코르빌 팔미테이트, 부틸화 히드록시아니솔, 부틸화 히드록시톨루엔, 차아인산, 모노티오글리세롤, 프로필 갈레이트, 소듐 비설파이트, 소듐 포름알데히드 설폭실레이트, 소듐 메타비설파이트, 및 그의 배합물을 포함한다.
계면활성제는 부형제로 존재할 수 있다. 예시적인 계면활성제는 하기를 포함한다: 폴리소르베이트, 예컨대 "Tween 20" 및 "Tween 80", 및 플루로닉 예컨대 F68 및 F88 (모두 BASF, Mount Olive, New Jersey 로부터 시판됨); 소르비탄 에스테르; 지질, 예컨대 인지질 예컨대 레시틴 및 기타 포스파티딜콜린, 포스파티딜에탄올아민 (바람직하게는 리포솜 형태가 아님), 지방산 및 지방 에스테르; 스테로이드, 예컨대 콜레스테롤; 및 킬레이트제, 예컨대 EDTA, 아연 및 기타 적합한 양이온.
산 및 염기는 조성물 내에 부형제로서 존재할 수 있다. 사용될 수 있는 산의 제한적이지 않은 예는 염산, 아세트산, 인산, 시트르산, 말산, 락트산, 포름산, 트리클로로아세트산, 질산, 과염소산, 인산, 황산, 푸마르산 및 그의 배합물로 이루어진 군으로부터 선택된 산을 포함한다. 적합한 염기의 예는, 제한 없이, 소듐 히드록시드, 소듐 아세테이트, 암모늄 히드록시드, 포타슘 히드록시드, 암모늄 아세테이트, 포타슘 아세테이트, 소듐 포스페이트, 포타슘 포스페이트, 소듐 시트레이트, 소듐 포르메이트, 소듐 설페이트, 포타슘 설페이트, 포타슘 푸마레이트, 및 그의 배합물로 이루어진 군으로부터 선택된 염기를 포함한다.
조성물 내의 콘쥬게이트 (즉, 활성제 및 중합체성 시약 간에 형성된 콘쥬게이트) 의 양은 몇개의 요인에 따라 좌우되지만, 조성물이 단위 투약용 용기 (예를 들어, 바이알) 에 저장될 경우 최적으로는 치료적 유효량일 것이다. 부가적으로, 약학적 제제는 주사기 내에 넣을 수 있다. 치료적 유효량은 임상적으로 바람직한 종료점을 초래하는 양을 측정하기 위해 콘쥬게이트의 증가하는 양의 반복 투여에 의해 실험적으로 측정될 수 있다.
조성물 내의 임의의 개별적인 부형제의 양은 부형제의 활성도 및 조성물의 특정한 필요에 따라 변화할 것이다. 전형적으로, 임의의 개별적인 부형제의 최적의 양은 일상적인 실험을 통해, 즉, 다양한 양의 부형제 (저량 내지 고량의 범위에 이름) 를 함유하는 조성물의 제조, 안정성 검사 및 다른 요인을 측정한 후, 현저한 부작용 없이 최상의 효능을 달성하는 범위를 측정함으로써 결정된다.
그러나, 일반적으로 부형제는 조성물 내에 약 1 중량% 내지 약 99 중량%, 바람직하게 약 5 중량% 내지 약 98 중량%, 더욱 바람직하게 약 15 내지 약 95 중량% 의 양으로 존재할 것이고, 30 중량% 미만의 농도가 가장 바람직하다.
상기 앞서 말한 약학적 부형제는 다른 부형제와 함께 ["Remington: The Science & Practice of Pharmacy", 19th ed., Williams & Williams, (1995)], ["Physician's Desk Reference", 52nd ed., Medical Economics, Montvale, NJ (1998)], 및 [Kibbe, A.H., Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3rd Edition, American Pharmaceutical Association, Washington, D.C., 2000] 에 기술되어 있다.
상기 조성물은 모든 유형의 제형, 특히 주사에 적합한 것들, 예를 들어, 재구성할 수 있는 분말 또는 급속냉동체 뿐 아니라 액체를 포함한다. 주사 전에 고체 조성물을 재구성하는데 적합한 희석제의 예는 주사용 세균 발육 억제수, 수중 포도당 5 %, 인산-완충 식염수, 링거액, 식염수, 멸균수, 탈 이온수, 및 이의 배합물을 포함한다. 액체 약학적 조성물에 관해서, 용액 및 현탁액이 계획된다.
본 발명의 조성물은 전형적으로, 필수적이지는 않더라도, 주사를 통해 투여되고, 그러므로 일반적으로 투여 바로 직전에는 액체 용액 또는 현탁액이다. 약학적 제제는 또한 다른 형태, 예컨대 시럽, 크림, 연고, 정제, 분말 등의 형태를 취할 수 있다. 다른 투여 방식은 또한, 예컨대 폐, 직장, 경피, 경점막, 경구, 척수강내, 피하, 동맥내 등을 포함한다.
본 발명은 또한 콘쥬게이트 처리에 바로 반응하는 질환으로 고생하는 환자에게 본원에 제공되는 바와 같은 콘쥬게이트를 투여하는 방법을 제공한다. 본 방법은 일반적으로 주사를 통해, 치료적 유효량의 콘쥬게이트 (바람직하게는 약학적 조성물의 일부로서 제공됨) 를 투여하는 것을 포함한다. 상기 기술된 바와 같이, 콘쥬게이트는 비경구로 정맥내 주사에 의해서, 또는 덜 바람직하게는 근육내 또는 피하 주사에 의해 주사하여 투여할 수 있다. 비경구 투여에 적합한 제형 유형은 기타의 것들 중, 바로 주사가능한 용액, 사용 전에 용매와 배합하는 건식 분말, 바로 주사가능한 현탁제, 사용 전에 운반체와 배합하는 건식 불용성 조성물, 및 투여 전에 희석시키는 에멀션 및 액체 농축물을 포함한다.
상기 투여 방법은 콘쥬게이트의 투여에 의해 치료되거나 예방할 수 있는 임의의 상태를 치료하는데 사용할 수 있다. 당업자는 어떤 상태를 특정 콘쥬게이트가 효과적으로 치료할 수 있는지를 알고 있다. 예를 들면, 상기 콘쥬게이트는 혈우병 A 를 앓고 있는 개인을 치료하는데 사용될 수 있다. 게다가, 상기 콘쥬게이트는 임의로 혈우병을 앓지 않는 환자에서, 억제되지 않는 출혈에 대한 예방제로 사용하기에 적합하다. 그러므로 예를 들면, 상기 콘쥬게이트는 억제되지 않는 출혈에 대한 위험이 있는 환자에게 수술 전에 투여할 수 있다.
투여될 실제 용량은 환자의 연령, 체중, 및 일반적인 상태 뿐만 아니라 치료할 상태의 심각성, 건강 관리 전문가의 판단, 및 투여되는 콘쥬게이트에 따라 다양할 것이다. 치료적 유효량은 당업자에 공지되어 있고/있거나 적절한 참고 도서 및 문헌에 기술되어 있다. 일반적으로, 치료적 유효량은 약 0.001 mg 내지 100 mg 의 범위, 바람직하게는 0.01 mg/일 내지 75 mg/일의 투여량, 더욱 바람직하게는 0.10 mg/일 내지 50 mg/일의 투여량일 것이다.
임의의 주어진 콘쥬게이트 (또, 바람직하게는 약학적 제제의 일부로 제공됨) 의 단위 투여량은 임상의의 판단, 환자에게 필요한 정도 등에 따라 다양한 투여 계획에 따라 투여될 수 있다. 특정 투여 계획은 당업자가 알거나 일상적 방법을 사용하여 실험적으로 측정할 수 있다. 예시적인 투여 계획은, 제한 없이, 하루에 5 번 투여, 하루에 4 번, 하루에 3 번, 매일 2 번, 매일 1 번, 매주 3 번, 매주 2 번, 매주 1 번, 매달 2 번, 매달 1 번, 및 이의 임의의 조합을 포함한다. 일단 임상의 종료점에 도달하면, 상기 조성물의 투여를 중지한다.
본 발명의 특정 콘쥬게이트를 투여하는 것의 한가지 장점은, 개개의 수용성 중합체 부분을 잘라낼 수 있다는 것이다. 중합체 크기 때문에 본체로부터의 제거가 잠재적으로 문제가 될 때 상기와 같은 결론은 이득이다. 최적으로, 각 수용성 중합체 부분의 절단은 생리학적으로 절단가능하고/하거나 효소적으로 분해가능한 결합, 예컨대 우레탄, 아미드, 카르보네이트 또는 에스테르-함유 결합의 사용을 통해 용이해 진다. 상기 방법으로, 콘쥬게이트의 절단은 (개개의 수용성 중합체 부분의 절단을 통해) 원하는 절단성을 제공하는 중합체 분자 크기 및 유형 작용기를 선택함으로써 조절할 수 있다. 당업자는 중합체의 적합한 분자 크기 뿐 아니라, 절단가능한 작용기를 결정할 수 있다. 예를 들면, 당업자는, 일상적인 실험을 사용해서, 먼저 상이한 중합체 중량 및 절단가능한 작용기를 갖는 다양한 중합체 유도체를 제조하고, 그 다음 중합체 유도체를 환자에 투여하고 주기적으로 혈액 및/또는 소변 샘플을 취하여 절단 프로파일 (예를 들어, 주기적 혈액 또는 소변 샘플링을 통해) 을 수득함으로써 적합한 분자 크기 및 절단가능한 작용기를 결정할 수 있다. 각각의 시험 콘쥬게이트에 대해 일련의 절단 프로파일이 일단 수득되면, 적합한 콘쥬게이트를 동정할 수 있다.
본 발명이 이의 바람직한 특정 구현예와 함께 기재되어 있지만, 하기 기재 뿐 아니라, 하기 실시예는 예증하기 위한 것이지 본 발명의 범주를 제한하려는 것이 아니다. 본 발명의 범주내에서 다른 측면, 장점 및 변경은 본 발명이 속한 업계의 당업자에게는 명백할 것이다.
당업자는 본원에 참조된 모든 기사, 책, 특허 및 기타 출판물을 참조할 수 있다.
실험
본 발명의 실행은, 달리 지시되지 않는다면, 당업계의 기술 분야에 속한 유기 합성 등의 통상적인 기술을 사용할 것이다. 상기 기술은 문헌에 충분히 설명되어 있다. 예를 들면, 상기 [J. March, Advanced Organic Chemistry: Reactions Mechanisms and Structure, 4th Ed. (New York: Wiley-Interscience, 1992)] 를 참조한다.
하기 실시예에서, 사용된 숫자 (예를 들어, 양, 온도 등) 에 대해서 정확성을 확실히 하려는 노력을 했지만, 일부 실험적인 오차 및 편차를 참작해야만 한다. 다르게 지시되지 않는다면, 온도는 섭씨 C 이고, 압력은 수평선에서의 대기압 또는 그 근처이다.
약어:
DCM 디클로로메탄
mPEG-SPA mPEG-숙신이미딜 프로피오네이트
mPEG-SBA mPEG-숙신이미딜 부타노에이트
mPEG-OPSS mPEG-오르토피리딜-디설피드
mPEG-MAL mPEG-말레이미드, CH3O-(CH2CH2O)n-CH2CH2-MAL
mPEG-SMB mPEG-숙신이미딜 α-메틸부타노에이트, CH3O-(CH2CH20)n-CH2CH2-CH(CH3)-C(O)-O-숙신이미드
mPEG-ButyrALD CH3O-(CH2CH2O)n-CH2CH2-O-C(O)-NH-(CH2CH2O)4CH2CH2CH2C(O)H
mPEG-PIP CH3O-(CH2CH2O)n-CH2CH2-C(O)-피페리딘-4-온
SUC 숙신이미드 또는 숙신이미딜
NaCNBH3 소듐 시아노보로히드라이드
HCl 염산
HEPES 4-(2-히드록시에틸)-1-피페라진에탄설폰산
NMR 핵 자기 공명
DCC 1,3-디시클로헥실카르보디이미드
DI 탈이온화
MW 분자량
r.t. 실온
K 또는 kDa 킬로돌턴
SEC 크기 배제 크로마토그래피
HPLC 고성능 액체 크로마토그래피
FPLC 고속 단백질 액체 크로마토그래피
SDS-PAGE 소듐 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동
MALDI-TOF 매트릭스 보조 레이저 탈착 이온화 비행시간
재료:
첨부한 실시예에 언급된 모든 PEG 시약은 다른 지시가 없다면 시판된다.
mPEG-숙신이미딜 프로피오네이트, mPEG-SPA, 분자량, 30K (Mn=31.3 kDa, Nektar Therapeutics)
mPEG-오르토피리딜-디설피드, mPEG-OPSS, 분자량, 10K (Mn=10.3 kDa, Nektar Therapeutics)
mPEG-말레이미드, mPEG-MAL, 분자량, 20K (Mn=21.8 kDa, Nektar Therapeutics)
mPEG-말레이미드, mPEG-MAL, 분자량, 30K (Mn=31.4 kDa, Nektar Therapeutics)
mPEG-숙신이미딜 α-메틸부타노에이트, mPEG-SMB, 분자량, 30K (Mn=30.5 kDa, Nektar Therapeutics)
mPEG-부티르알데히드, mPEG-ButyrALD, 분자량, 30K (Mn=31.5 kDa, Nektar Therapeutics)
L-히스티딘, 생명공학적 성능이 입증된 것 (Sigma)
HEPES, 생명공학적 성능이 입증된 것, 99.5+ % (Sigma)
칼슘 클로라이드, 2수화물, 분자생물학용, 99 % (Sigma)
소듐 클로라이드, 분자생물학용 (Sigma)
Tween 80, Sigma Ultra, (Sigma)
에틸 알코올, USP, Absolute-200 Proof (AAPER)
폴리에틸렌 글리콜, MW 3,350, SigmaUltra (Sigma)
슬라이드 측정식 (Slide-A-Lyzer) 투석 카세트, 0.5 - 3 ml, 또는 3 - 12 ml 용량 (Pierce)
아세트산, A.C.S. 시약, 99.7+ % (Aldrich)
1N 아세트산, 표준 용액 (VWR)
1N 소듐 히드록시드, 표준 용액 (J.T.Baker)
소듐 시아노보로히드라이드, 95 % (Aldrich)
Tris/글리신/SDS, 10 x, 단백질 전기영동 완충액 (Bio-Rad)
Laemmli 샘플 완충액 (Bio-Rad)
SigmaMarker, 저범위 (M.W. 6,500 - 66,000) (Sigma)
SigmaMarker, 고범위 (M.W. 36,000 - 205,000) (Sigma)
7.5 % Tris-HCl 바로 사용가능한 겔 (10-웰, 30 ul,Bio-Rad)
GelCode 청색 염색 시약 (Pierce)
(분석) 방법
SEC - HPLC 분석
크기 배제 크로마토그래피 (SEC) 를 Agilent 1100 HPLC 시스템 (Agilent) 상에서 수행했다. BIOSEP-SEC-S 4000 칼럼 (Phenomenex), 및 45 mM 히스티딘, 4.5 mM 칼슘 클로라이드, 0.36 M 소듐 클로라이드, 0.009 % (v/v) Tween 80 및 10 % 에틸 알코올, pH 6.7 의 유동상을 사용해서 샘플을 분석했다. 칼럼의 유속은 0.3 ml/분이었다. 용리된 단백질 및 PEG-단백질 콘쥬게이트를 280 nm 의 파장에서 UV 로 검출했다.
SDS - PAGE 분석
Mini-PROTEAN 3 Precast 겔 전기영동 시스템 (Bio-Rad) 을 사용하여 소듐 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (SDS-PAGE) 에 의해 샘플을 분석했다. 샘플을 2 x Laemmli 샘플 완충액과 혼합하고, 95 ℃ 수조에 ~ 5 분 동안 방치했다. 그 다음, 제조된 샘플을 7.5 % Tris-HCl 바로 사용가능한 겔 상에 놓고, Tris/글리신/SDS 전기영동 완충액을 사용해서 200 V 에서 대략 30 분 동안 내렸다.
기타 방법
PEG -인자 Ⅷ 콘쥬게이트의 정제
실시예 6 - 11에서 PEG-인자 Ⅷ 콘쥬게이트를 정제하기 위해 Superose 6 HR 10/30, 24 ml 겔 여과 칼럼 (Amersham) 을 FPLC 시스템 및 AKTA 프라임 시스템 (Amersham) 과 함께 사용했다. 유속은 0.3 ml/분이고, 용리 완충액은 50 mM 히스티딘, 0.5 M NaCl, 4.0 mM CaCl2, 및 0.01 % (w/v) Tween 80, pH 6.7 이었다.
인자 Ⅷ 저장 용액의 완충액 교환
보호 주머니로부터 슬라이드 측정식 투석 카세트 (3 - 12 ml, 10,000 MWCO, Pierce) 를 제거하고, MiliQ H2O 에 15 분 동안 담궜다 (물을 매 5 분마다 바꿔주었다). 그 다음 인자 Ⅷ 저장 용액 [50 mM 히스티딘, 0.5 M NaCl, 4.0 mM CaCl2, 0.1 % (w/v) PEG 3,350, 0.01 % (w/v) Tween 80, pH 6.7 중 0.398 mg/ml] 을 개스킷의 상부에 있는 가이드 포트 (guide port) 중 하나를 통해 카세트 구멍으로 옮겼다. 카세트의 상부에 부착된, 부양 부표가 있는 HEPES 완충액 [50 mM HEPES, 0.5 M NaCl, 5 mM CaCl2, 0.1 % (w/v) PEG 3,350, 0.01 % (v/v) Tween 80, pH 7.0] 1L 비이커에 카세트를 놓았다. 그 다음 비이커를 교반판 상에 두고 4 ℃ 에서 투석을 시작하였다. HEPES 완충액을 2 ~ 3 시간 간격으로 4 번 교환해주고, 냉장실 (4 ℃) 에 두고 밤새 투석했다. 투석 후에, 카세트 챔버에 공기를 주입하고, 투석된 샘플을 카세트로부터 회수하였다. HEPES 완충액 중의 인자 Ⅷ 의 농도를 SPECTRA max PLUS 분광계 (Molecular Devices) 로부터 UV 280 nm 에서 측정했다.
실시예 1
mPEG-SPA, 20K 를 이용한, B-도메인 결실 인자 Ⅷ 의 PEG화
분자량이 20,000 돌턴인 mPEG-숙신이미딜 프로피오네이트를 Nektar Therapeutics (Huntsville, AL) 로부터 구했다. 중합체성 시약의 기본 구조는 하기와 같았다:
B-도메인 결실 인자 Ⅷ 을 탈이온수에 용해시키고, 여기에 트리에틸아민을 첨가하여 pH 를 7.2 - 9 로 올렸다. 상기 용액에 1.5 내지 10 배 몰 과량의 PEG 시약, mPEG-SPA 을 첨가하였다. 수득된 혼합물을 실온에서 수 시간 동안 교반하였다.
단백질의 PEG화 정도를 측정하기 위해 반응 혼합물을 SDS-PAGE 로 분석하였다. 1-머, 2-머 등의 PEG화 정도는, 또한 광각 산란법과 같이 상기 크기의 단백질에 적합한 임의의 다수의 분석 기술로도 측정할 수 있다. 원래의 종 및 모노-PEG화된 종에 대해 나타난 피크는 대략 20,000 Da 의 차이가 있었다. PEG 시약 대 단백질의 비율을 증가시키니 폴리-PEG화, 즉, 2-머, 3-머 등의 형성 정도도 증가하였다.
실시예 2
mPEG-SBA 를 이용한, B-도메인 결실 인자 Ⅷ 의 PEG화
분자량이 10,000 돌턴인 mPEG-숙신이미딜 부타노에이트를 Nektar Therapeutics (Huntsville, AL) 로부터 구했다. 중합체성 시약의 기본 구조는 하기에 나타냈다:
B-도메인 결실 인자 Ⅷ 을 탈이온수에 용해시키고, 여기에 트리에틸아민을 첨가하여 pH 를 7.2 - 9 로 올렸다. 그 다음 상기 용액에 1.5 내지 10 배 몰 과량의 mPEG-SBA 을 첨가하였다. 수득된 혼합물을 상온에서 수 시간 동안 교반하였다.
단백질의 PEG화 정도를 측정하기 위해 반응 혼합물을 SDS-PAGE 로 분석하였다.
실시예 3
mPEG-MAL, 20K 를 이용한, B-도메인 결실 인자 Ⅷ 의 PEG화
분자량이 20,000 돌턴인 mPEG-말레이미드를 Nektar Therapeutics (Huntsville, AL) 로부터 구했다. 중합체성 시약의 기본 구조는 하기에 나타냈다:
B-도메인 결실 인자 Ⅷ 을 완충액에 용해시켰다. 상기 단백질 용액에 3 - 5 배 몰 과량의 mPEG-MAL 을 첨가하였다. 상기 혼합물을 실온에서 비활성 대기하에 수 시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 HPLC 에 의해 분석하고 정제하여, 콘쥬게이션된 종들의 혼합물을 제공하였다.
실시예 4
mPEG-OPSS, 20K 를 이용한, B-도메인 결실 인자 Ⅷ 의 PEG화
분자량이 20,000 인 설프히드릴-선택적 중합체 시약, mPEG-오르토피리딜-디설피드 (상기 제시된 구조) 를 Nektar Therapeutics (Huntsville, AL) 로부터 구했다. 5 배 몰 과량의 mPEG-OPSS 를 완충 용액 중의 B-도메인 결실 인자 Ⅷ 에 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 비활성 대기하에 수 시간 동안 교반하여 상기 단백질에 중합체를 결합시키는 디설피드 결합을 가진 목적하는 콘쥬게이트를 형성하였다.
실시예 5
mPEG-PIP, 5K 를 이용한, B-도메인 결실 인자 Ⅷ 의 PEG화
케톤 및 그에 대응되는 케탈 둘 모두로 제시된 상기 중합체성 시약을 발명의 명칭이 "중합체 유도체 및 그의 콘쥬게이트" 인 Nektar Therapeutics 의 가특허출원 제 60/437,325 호에 기재된 바와 같이 제조하였다.
상기 중합체성 시약을 제조하기 위하여, 메틸렌 클로라이드 (20 ml) 중 중량 평균 분자량이 5,000 돌턴인 메톡시 폴리에틸렌 글리콜-숙신이미딜 프로피오네이트 (1.0 g, 0.002 몰) 용액에 트리에틸 아민 (0.084 ml, 0.006 몰) 및 4-피페리돈 1수화 히드로클로라이드 (0.077 g, 0.005 몰) 를 첨가하였다. 반응 혼합물을 질소 대기 하에 실온에서 하룻밤 동안 교반한 후 콘쥬게이션 전 정제하였다. 선택적으로, 상기 중합체 시약은 Nektar Therapeutics 로부터 구입할 수 있다.
콘쥬게이션시키기 위하여, 수성 완충액 중 B-도메인 결실 인자 Ⅷ 용액에 20 배 몰 과량의 mPEG-PIP, 5K 를 첨가하였다. 생성된 용액을 저속으로 설정된 Roto Mix™ 회전 진탕기 (Thermolyne Corp., Dubuque, IA) 에 두고 실온에서 반응을 촉진시켰다. 15 분 후에, B-도메인 결실 인자 Ⅷ 에 비해 50 배 몰 과량에 상당하는 양의 수성 NaCNBH3 를 첨가하였다. 상기 반응 혼합물로부터 시간 간격을 두고 분취물을 채취하여 SDS-PAGE (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA 로부터 입수 가능한 겔을 사용) 로 분석하였다.
SDS-PAGE 분석은 1, 2 및 3 개의 PEG 부분이 결합된 B-도메인 결실 인자 Ⅷ 의 PEG 유도체가 존재하는 것을 나타내었다.
실시예 6
mPEG-SPA, 30K 를 이용한, B-도메인 결실 인자의 콘쥬게이션
콘쥬게이션 전에, B-도메인 결실 인자 Ⅷ (인자 Ⅷ) 에 대해 완충액 교환을 수행하여 히스티딘을 HEPES 로 치환하였다.
아르곤 하에 -20 ℃ 로 보관한 mPEG-SPA, 30K 를 주위 온도로 가온시켰다. 가온된 mPEG-SPA (2.2 mg) 를 2 mM HCl 0.022 ml 에 용해시켜 10 % 중합체 시약 용액을 제조하였다. 상기 mPEG-SPA 용액을 3 ml 의 인자 Ⅷ 용액 [50 mM HEPES 중 0.412 mg/ml, 0.5 M NaCl, 4.0 mM CaCl2, 0.1 % (w/v) PEG 3,35O, 0.01 % (w/v) Tween 80, pH 7.0] 에 신속히 첨가하고 잘 혼합하였다. 실온에서 30 분간 반응시킨 후에, 상기 반응 바이알을 냉장실 (4 ℃) 로 옮기고, 또다른 0.022 ml 의 mPEG-SPA 용액을 상기 반응 혼합물에 첨가하고 잘 혼합하였다. pH 를 측정하였다 (pH 7.0 ± 0.2). mPEG-SPA 대 단백질의 몰 비율은 20:1 이었다. 최종 mPEG-SPA 농도는 1.445 mg/ml 이었고, 최종 인자 Ⅷ 농도는 0.406 mg/ml 이었다. 상기 반응을 Rotomix (저속, Thermolyne) 상에서 4 ℃ 로 하룻밤 동안 수행하였다. 생성된 콘쥬게이트를 식별자 "pz041701" 로 명하였다.
상기 콘쥬게이트 혼합물을 겔 여과 크로마토그래피를 사용하여 정제하였다. 크기 배제 크로마토그래피 방법을 사용하여 반응 혼합물 및 최종 생성물을 분석하였다. 또한, SDS-PAGE 분석을 사용하여 샘플을 특징화하였다.
콘쥬게이트 특징화 . 정제 전, 생성된 콘쥬게이트 혼합물은, SEC 로 측정된 바와 같이, 식별자 "pz041701 (저)," "pz041701 (중)" 및 "pz041701 (고)" 에 각각 대응하는 인자 VII PEG-단량체 (즉 1-머), 이량체 (즉 2-머) 및 삼량체 (즉 3-머) 의 혼합물이었다. 즉: "pz041701 (저)" 는 대부분 인자 Ⅷ 모노-PEG화 종 즉 한 개의 PEG 부분이 결합된 인자 Ⅷ 에 대응하고; "pz041701 (중)" 은 주로 인자 Ⅷ 디-PEG화 종, 즉, 두 개의 PEG 부분이 결합된 인자 Ⅷ 에 대응하고; "pz041701 (고)" 는 대부분 세 개의 PEG 부분이 결합된 인자 Ⅷ 에 대응한다. 대응하는 SEC 플롯을 도 1 및 2 에 제시하였다. 도 1 은 인자 Ⅷ 반응 혼합물을 SEC 했을 때 수집된 분획들에 대응되는 SEC 플롯을 나타낸다. 크기 배제 크로마토그래피 (SEC) 결과에 따르면, mPEG-SPA-30K-FⅧ (pz041701 저) 의 PEG화 수율은 ~ 39 % 였다. 생성된 반응 혼합물에 존재하는 모든 종에 대한 상대적 함량에 기반한 백분율에 의하면, mPEG30-SPA-30K-FⅧ (pz041701 중) 의 PEG화 수율은 ~ 32 % 였고, mPEG-SPA-30K-FⅧ (pz041701 고) 의 PEG화 수율은 ~ 11 % 였다. 상기 콘쥬게이트 혼합물을 FPLC 로 추가로 정제하고, SDS-PAGE 로 분석하였다.
실시예 7
mPEG-MAL, 20K 를 이용한, B-도메인 결실 인자 Ⅷ 의 콘쥬게이션
콘쥬게이션 전에, B-도메인 결실 인자 Ⅷ (인자 Ⅷ) 에 대해 완충액 교환을 수행하여 히스티딘을 HEPES 로 치환하였다.
아르곤 하에 -20 ℃ 로 보관한 mPEG-MAL, 20K 를 주위 온도로 가온시켰다. 가온된 mPEG-MAL 시약 (4.4 mg) 을 0.044 ml 의 HEPES 완충액 [50 mM HEPES, 0.15 M NaCl, 4.0 mM CaCl2, 0.01 % (w/v) Tween 80, pH 7.0] 에 용해시켜 10 % mPEG-MAL 용액을 제조하였다. 상기 mPEG-MAL 용액을 4 ml 의 인자 Ⅷ 용액 [50 mM HEPES 중 0.4324 mg/ml, 0.5 M NaCl, 4 mM CaCl2, 0.1 % (w/v) PEG 3,35O, 0.01 % (w/v) Tween 80, pH 7.0] 에 신속히 첨가하고 잘 혼합하였다. 실온에서 30 분간 반응시킨 후에, 상기 반응 바이알을 냉장실 (4 ℃) 로 옮기고, 또다른 0.044 ml 의 mPEG-MAL 용액을 반응 혼합물에 첨가한 후, 2 시간에 걸쳐 0.044 ml 의 mPEG-MAL 용액의 세 개의 분취물을 더 첨가하였다. pH 를 측정하였다 (pH 7.0 ± 0.2). mPEG-MAL 대 단백질의 몰 비율은 100:1 이었다. 최종 mPEG-MAL 농도는 5.213 mg/ml 였고, 최종 인자 Ⅷ 농도는 0.410 mg/ml 였다. 상기 반응을 Rotomix (저속, Thermolyne) 상에서 4 ℃ 로 하룻밤 동안 진행시켰다. 상기 콘쥬게이트를 식별자 "pz061201" 로 명하였다.
상기 콘쥬게이트 혼합물을 겔 여과 크로마토그래피를 사용하여 정제하였다. 크기 배제 크로마토그래피 방법을 사용하여 반응 혼합물 및 최종 생성물을 분석하였다. 또한, SDS-PAGE 분석을 사용하여 샘플을 특징화하였다.
콘쥬게이트 특징화 (모노-PEG화 생성물).
크기 배제 크로마토그래피 (SEC) 결과에 따르면, 모노-PEG화 콘쥬게이트 (l-머) 의 PEG화 수율은 ~ 33 % 였다 (도 3). 인자 Ⅷ 콘쥬게이트 혼합 분획들을 수합하고 FPLC 로 정제시킨 후, 추가로 겔 여과 크로마토그래피로 정제하였다. pz061201 최종 생성물을 SDS-PAGE 및 SEC 모두로 분석하였고, "pz061201" 생성물의 순도는 ~ 6 % 의 인자 Ⅷ PEG 고량체를 가지는 대략 94 % 의 인자 Ⅷ PEG 단량체 (즉, 모노-PEG화 인자 Ⅷ) 인 것으로 측정되었다 (도 4).
실시예 8
mPEG-SMB, 30K 를 이용한, B-도메인 결실 인자 Ⅷ 의 콘쥬게이션
콘쥬게이션 전에, B-도메인 결실 인자 Ⅷ (인자 Ⅷ) 에 대해 완충액 교환을 수행하여 히스티딘을 HEPES 로 치환하였다.
아르곤 하에 -20 ℃ 로 보관한 mPEG-SMB, 30K 를 주위 온도로 가온시켰다. 가온된 mPEG-SMB (6.5 mg) 를 0.065 ml 의 2 mM HC1 에 용해시켜 10 % mPEG-SMB 용액을 제조하였다. 상기 mPEG-SMB 용액을 4 ml 의 인자 Ⅷ 용액 [50 mM HEPES 중 0.435 mg/ml, 0.5 M NaCl, 5.0 mM CaCl2, 0.1 % (w/v) PEG 3,35O, 0.01 % (v/v) Tween 80, pH 7.0] 에 신속히 첨가하고 잘 혼합하였다. 실온에서 30 분간 반응시킨 후에, 상기 반응 바이알을 냉장실 (4 ℃) 로 옮겼다. pH 를 측정하였다 (pH 7.0 ± 0.2). mPEG-SMB 대 단백질의 몰 비율은 20:1 이었다. 최종 mPEG-SMB 농도는 1.599 mg/ml 이었고, 최종 인자 Ⅷ 농도는 0.428 mg/ml 였다. 상기 반응을 Rotomix (저속, Thermolyne) 상에서 4 ℃ 로 대략 48 시간 동안 진행시킨 후, 아세트산 (99.7+ %) 을 첨가하여 급냉시켜 pH 를 6.0 ± 0.3 으로 저하시켰다. 상기 콘쥬게이트를 식별자 "pz082501" 로 명하였다.
상기 콘쥬게이트 혼합물을 겔 여과 크로마토그래피를 사용하여 정제하였다. 크기 배제 크로마토그래피 방법을 사용하여 반응 혼합물 및 최종 생성물을 분석하였다. 또한, SDS-PAGE 분석을 사용하여 샘플을 특징화하였다.
콘쥬게이트 특징화 : pH 7.0 ± 0.2 에서 mPEG-SMB30K 를 이용한, 인자 Ⅷ 의 PEG화를 통하여 "pz082501" 로 명한 혼합물을 수득하였다. 콘쥬게이트 혼합물을 정제하고 SEC 로 분석하였다. 크기 배제 크로마토그래피 (SEC) 로 결과에 의하면, 모노-PEG화 콘쥬게이트 (인자 Ⅷ 1-머) 인 pz082501 의 PEG화 수율은 ~ 41 % 였다 (도 5). 생성 혼합물을 추가로 FPLC 로 정제하고 SDS-PAGE 및 SEC 로 분석하였다. 정제된 인자 Ⅷ PEG 콘쥬게이트 생성물 pz082501 의 특징은 ~ 5 % 고량체를 가지는 ~ 95 % 의 모노-콘쥬게이션된 PEG 인자 Ⅷ 이었다.
실시예 9
mPEG-OPSS, 10K 를 이용한, B-도메인 결실 인자 Ⅷ 의 콘쥬게이션
콘쥬게이션 전에, B-도메인 결실 인자 Ⅷ (인자 Ⅷ) 에 대해 완충액 교환을 수행하여 히스티딘을 HEPES 로 치환하였다.
아르곤 하에 -20 ℃ 로 보관한 mPEG-OPSS, 10K 를 주위 온도로 가온시켰다. mPEG-OPSS (1.2 mg) 를 O.O12 ml 의 H20 에 용해시켜 10 % mPEG-OPSS 용액을 제조하였다. 상기 mPEG-OPSS 용액을 0.5 ml 의 인자 Ⅷ 용액 [50 mM 히스티딘 중 0.398 mg/ml, 0.5 M NaCl, 4.0 mM CaCl2, 0.1 % (w/v) PEG 3,35O, 0.01 % (w/v) Tween 80, pH 6.7] 에 신속히 첨가하고 잘 혼합하였다. 실온에서 30 분간 반응시킨 후에, 상기 반응 바이알을 냉장실 (4 ℃) 로 옮겼다. pH 를 측정하였다 (pH 6.7 ± 0.2). mPEG-OPSS-10K 대 단백질의 몰 비율은 100:1 이었다. 최종 mPEG-OPSS 농도는 2.344 mg/ml 이었고, 최종 인자 Ⅷ 농도는 0.389 mg/ml 이었다. 상기 반응을 Rotomix (저속, Thermolyne) 상에서 4 ℃ 로 하룻밤 동안 진행시켰다.
상기 콘쥬게이트 혼합물을 겔 여과 크로마토그래피를 사용하여 정제하였다. 크기 배제 크로마토그래피 방법을 사용하여 반응 혼합물 및 최종 생성물을 분석하였다. 또한, SDS-PAGE 분석을 사용하여 샘플을 특징화하였다. mPEG-OPSS 시약을 사용한 PEG화 결과 및 수율은 분자량이 20K 인 mPEG-MAL 시약을 사용한 실시예 7 의 것과 유사하였다.
실시예 10
mPEG-MAL, 30K 를 이용한, B-도메인 결실 인자 Ⅷ 의 콘쥬게이션
콘쥬게이션 전에, B-도메인 결실 인자 Ⅷ (인자 Ⅷ) 에 대해 완충액 교환을 수행하여 히스티딘을 HEPES 로 치환하였다.
아르곤 하에 -20 ℃ 로 보관한 mPEG-MAL, 30K 를 주위 온도로 가온시켰다. 가온된 mPEG-MAL (1.0 mg) 를 O.O10 ml 의 HEPES 완충액 [50 mM HEPES, 0.15 M NaCl, 4.0 mM CaCl2, 0.01 % (w/v) Tween 80, pH 7.0] 에 용해시켜 10 % mPEG-MAL 용액을 제조하였다. 상기 mPEG-MAL 용액을 0.5 ml 의 인자 Ⅷ 용액 [50 mM HEPES 중 0.447 mg/ml, 0.5 M NaCl, 4 mM CaCl2, 0.1 % (w/v) PEG 3,35O, 0.01 % (w/v) Tween 80, pH 7.0] 에 신속히 첨가하고 잘 혼합하였다. 실온에서 30 분간 반응시킨 후에, 상기 반응 바이알을 냉장실 (4 ℃) 로 옮기고, 또다른 0.010 ml 의 mPEG-MAL 용액을 반응 혼합물에 첨가한 후, 2 시간에 걸쳐 0.010 ml 의 mPEG-MAL 용액의 세 개의 분취물을 더 첨가하였다. pH 를 측정하였다 (pH 7.0 ± 0.2). mPEG-MAL 대 단백질의 몰 비율은 100:1 이었다. 최종 mPEG-MAL 농도는 9.091 mg/ml 였고, 최종 인자 Ⅷ 농도는 0.406 mg/ml 였다. 상기 반응을 Rotomix (저속, Thermolyne) 상에서 4 ℃ 로 하룻밤 동안 진행시켰다.
상기 콘쥬게이트 혼합물을 겔 여과 크로마토그래피를 사용하여 정제하였다. 크기 배제 크로마토그래피 방법을 사용하여 반응 혼합물 및 최종 생성물을 분석하였다. 또한, SDS-PAGE 분석을 사용하여 샘플을 특징화하였다. 분자량이 30K 인 mPEG-MAL 시약을 사용한 PEG화 결과 및 수율은 분자량이 20K 인 mPEG-MAL 시약을 사용한 실시예 7 의 것과 유사하였다.
실시예 11
mPEG-Butyr-ALD, 30K 를 이용한, B-도메인 결실 인자 Ⅷ 의 콘쥬게이션
콘쥬게이션 전에, B-도메인 결실 인자 Ⅷ (인자 Ⅷ) 에 대해 완충액 교환을 수행하여 히스티딘을 HEPES 로 치환하였다.
아르곤 하에 -20 ℃ 로 보관한 mPEG-Butyr-ALD, 30K 를 주위 온도로 가온시켰다. 가온된 mPEG-Butyr-ALD (3.8 mg) 를 O.O38 ml 의 H2O 에 용해시켜 10 % mPEG-Butyr-ALD 용액을 제조하였다. 상기 mPEG-Butyr-ALD 용액을 0.5 ml 의 인자 Ⅷ 용액 [50 mM HEPES 중 0.400 mg/ml, 0.5 M NaCl, 5 mM CaCl2, 0.1 % (w/v) PEG 3,35O, 0.01 % (v/v) Tween 80, pH 7.0] 에 신속히 첨가하고 잘 혼합하였다. 15 분 후, 10 mM 소듐 시아노보로히드라이드 용액 0.060 ml 를 첨가하였다. pH 를 측정하였다 (pH 7.0 ± 0.2). mPEG-Butyr-ALD 대 단백질의 몰 비율은 100:1 이었다. 최종 mPEG-Butyr-ALD 농도는 6.355 mg/ml 였다. 최종 인자 Ⅷ 농도는 0.334 mg/ml 였고, NaCNBH3 의 최종 농도는 1.003 mM 이었다. 상기 반응을 실온에서 5 시간 동안 진행시킨 후, Rotomix (저속, Thermolyne) 상에서 4 ℃ 로 하룻밤 동안 진행시켰다.
상기 콘쥬게이트 혼합물을 겔 여과 크로마토그래피를 사용하여 정제하였다. 크기 배제 크로마토그래피 방법을 사용하여 반응 혼합물 및 최종 생성물을 분석하였다. 또한, SDS-PAGE 분석을 사용하여 샘플을 특징화하였다. 인자 Ⅷ 모노-PEG 콘쥬게이트의 수율은 대략 20 % 였다.
실시예 12
예시적이 인자 Ⅷ-PEG 콘쥬게이트의 시험관내 활성
실시예 6, 7 및 8 에 기재된 인자 Ⅷ-PEG 콘쥬게이트의 시험관내 활성을 측정하였다. 시험된 인자 Ⅷ 콘쥬게이트 모두 생리활성적이었다.
<110> NEKTAR THERAPEUTICS AL, CORPORATION <120> POLYMER-FACTOR VIII MOIETY CONJUGATES <130> SHE0081.00 (PCT) <140> PCT/US04/06034 <141> 2004-02-26 <150> 60/450,578 <151> 2003-02-26 <160> 2 <170> PatentIn Ver. 3.2 <210> 1 <211> 2351 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Gln Ile Glu Leu Ser Thr Cys Phe Phe Leu Cys Leu Leu Arg Phe 1 5 10 15 Cys Phe Ser Ala Thr Arg Arg Tyr Tyr Leu Gly Ala Val Glu Leu Ser 20 25 30 Trp Asp Tyr Met Gln Ser Asp Leu Gly Glu Leu Pro Val Asp Ala Arg 35 40 45 Phe Pro Pro Arg Val Pro Lys Ser Phe Pro Phe Asn Thr Ser Val Val 50 55 60 Tyr Lys Lys Thr Leu Phe Val Glu Phe Thr Asp His Leu Phe Asn Ile 65 70 75 80 Ala Lys Pro Arg Pro Pro Trp Met Gly Leu Leu Gly Pro Thr Ile Gln 85 90 95 Ala Glu Val Tyr Asp Thr Val Val Ile Thr Leu Lys Asn Met Ala Ser 100 105 110 His Pro Val Ser Leu His Ala Val Gly Val Ser Tyr Trp Lys Ala Ser 115 120 125 Glu Gly Ala Glu Tyr Asp Asp Gln Thr Ser Gln Arg Glu Lys Glu Asp 130 135 140 Asp Lys Val Phe Pro Gly Gly Ser His Thr Tyr Val Trp Gln Val Leu 145 150 155 160 Lys Glu Asn Gly Pro Met Ala Ser Asp Pro Leu Cys Leu Thr Tyr Ser 165 170 175 Tyr Leu Ser His Val Asp Leu Val Lys Asp Leu Asn Ser Gly Leu Ile 180 185 190 Gly Ala Leu Leu Val Cys Arg Glu Gly Ser Leu Ala Lys Glu Lys Thr 195 200 205 Gln Thr Leu His Lys Phe Ile Leu Leu Phe Ala Val Phe Asp Glu Gly 210 215 220 Lys Ser Trp His Ser Glu Thr Lys Asn Ser Leu Met Gln Asp Arg Asp 225 230 235 240 Ala Ala Ser Ala Arg Ala Trp Pro Lys Met His Thr Val Asn Gly Tyr 245 250 255 Val Asn Arg Ser Leu Pro Gly Leu Ile Gly Cys His Arg Lys Ser Val 260 265 270 Tyr Trp His Val Ile Gly Met Gly Thr Thr Pro Glu Val His Ser Ile 275 280 285 Phe Leu Glu Gly His Thr Phe Leu Val Arg Asn His Arg Gln Ala Ser 290 295 300 Leu Glu Ile Ser Pro Ile Thr Phe Leu Thr Ala Gln Thr Leu Leu Met 305 310 315 320 Asp Leu Gly Gln Phe Leu Leu Phe Cys His Ile Ser Ser His Gln His 325 330 335 Asp Gly Met Glu Ala Tyr Val Lys Val Asp Ser Cys Pro Glu Glu Pro 340 345 350 Gln Leu Arg Met Lys Asn Asn Glu Glu Ala Glu Asp Tyr Asp Asp Asp 355 360 365 Leu Thr Asp Ser Glu Met Asp Val Val Arg Phe Asp Asp Asp Asn Ser 370 375 380 Pro Ser Phe Ile Gln Ile Arg Ser Val Ala Lys Lys His Pro Lys Thr 385 390 395 400 Trp Val His Tyr Ile Ala Ala Glu Glu Glu Asp Trp Asp Tyr Ala Pro 405 410 415 Leu Val Leu Ala Pro Asp Asp Arg Ser Tyr Lys Ser Gln Tyr Leu Asn 420 425 430 Asn Gly Pro Gln Arg Ile Gly Arg Lys Tyr Lys Lys Val Arg Phe Met 435 440 445 Ala Tyr Thr Asp Glu Thr Phe Lys Thr Arg Glu Ala Ile Gln His Glu 450 455 460 Ser Gly Ile Leu Gly Pro Leu Leu Tyr Gly Glu Val Gly Asp Thr Leu 465 470 475 480 Leu Ile Ile Phe Lys Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Asn Ile Tyr Pro 485 490 495 His Gly Ile Thr Asp Val Arg Pro Leu Tyr Ser Arg Arg Leu Pro Lys 500 505 510 Gly Val Lys His Leu Lys Asp Phe Pro Ile Leu Pro Gly Glu Ile Phe 515 520 525 Lys Tyr Lys Trp Thr Val Thr Val Glu Asp Gly Pro Thr Lys Ser Asp 530 535 540 Pro Arg Cys Leu Thr Arg Tyr Tyr Ser Ser Phe Val Asn Met Glu Arg 545 550 555 560 Asp Leu Ala Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu Ile Cys Tyr Lys 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Claims (61)

  1. 각각의 콘쥬게이트가 인자 Ⅷ 부분에 공유결합되어 있는 1 내지 3 개의 수용성 중합체를 갖는 복수 개의 콘쥬게이트를 함유하는 조성물에 있어서, 각각의 수용성 중합체의 공칭 평균 분자량이 5,000 돌턴 초과 내지 약 150,000 돌턴 범위인 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서, 각각의 콘쥬게이트에서의 수용성 중합체가 폴리(알킬렌 옥사이드), 폴리(비닐 피롤리돈), 폴리(비닐 알코올), 폴리옥사졸린, 및 폴리(아크릴로일모르폴린)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 조성물.
  3. 제 2 항에 있어서, 각각의 수용성 중합체가 폴리(알킬렌 옥사이드)인 조성물.
  4. 제 3 항에 있어서, 각각의 폴리(알킬렌 옥사이드)가 폴리(에틸렌 글리콜)인 조성물.
  5. 제 4 항에 있어서, 폴리(에틸렌 글리콜)의 말단이 히드록시, 알콕시, 치환 알콕시, 알켄옥시, 치환 알켄옥시, 알킨옥시, 치환 알킨옥시, 아릴옥시 및 치환 아릴옥시로 이루어지는 군으로부터 선택되는 말단-캡핑 부분으로 캡핑되는 조성물.
  6. 제 4 항에 있어서, 폴리(에틸렌 글리콜)의 말단이 메톡시로 캡핑되는 조성물.
  7. 제 4 항에 있어서, 폴리(에틸렌 글리콜)의 말단이 히드록시로 캡핑되는 조성물.
  8. 제 4 항에 있어서, 폴리(에틸렌 글리콜)의 공칭 평균 분자량이 약 6,000 돌턴 내지 약 100,000 돌턴 범위인 조성물.
  9. 제 8 항에 있어서, 폴리(에틸렌 글리콜)의 공칭 평균 분자량이 약 10,000 돌턴 내지 약 85,000 돌턴 범위인 조성물.
  10. 제 9 항에 있어서, 폴리(에틸렌 글리콜)의 공칭 평균 분자량이 약 20,000 돌턴 내지 약 85,000 돌턴 범위인 조성물.
  11. 제 10 항에 있어서, 폴리(에틸렌 글리콜)의 공칭 평균 분자량이 약 53,000 돌턴 내지 약 75,000 돌턴 범위인 조성물.
  12. 제 3 항에 있어서, 각각의 수용성 중합체가 선형인 조성물.
  13. 제 3 항에 있어서, 각각의 수용성 중합체가 분지형인 조성물.
  14. 제 3 항에 있어서, 인자 Ⅷ 부분이 인자 Ⅷ, 인자 Ⅷa, 인자 Ⅷ:C, 인자 Ⅷ:vWF, B-도메인 결실 인자 Ⅷ, 및 상기한 것들의 임의의 생물학적 활성 절편, 결실 변이체, 치환 변이체 또는 첨가 변이체로 이루어지는 군으로부터 선택되는 조성물.
  15. 제 14 항에 있어서, 인자 Ⅷ 부분이 인자 Ⅷ, 인자 Ⅷa, 인자 Ⅷ:C, 및 인자 Ⅷ:vWF 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 조성물.
  16. 제 14 항에 있어서, 인자 Ⅷ 부분이 B-도메인 결실 인자 Ⅷ 인 조성물.
  17. 제 3 항에 있어서, 인자 Ⅷ 부분이 재조합된 조성물.
  18. 제 3 항에 있어서, 인자 Ⅷ 부분이 혈액-유래인 조성물.
  19. 제 3 항에 있어서, 알부민이 실질적으로 없는 조성물.
  20. 제 3 항에 있어서, 인자 Ⅷ 활성을 갖지 않는 단백질이 실질적으로 없는 조성물.
  21. 제 3 항에 있어서, 비공유결합된 수용성 중합체가 실질적으로 없는 조성물.
  22. 제 3 항에 있어서, 인자 Ⅷ 활성을 가지는 부분의 활성형 부위에 하나 이상의 수용성 중합체가 공유결합되어 있는 조성물.
  23. 제 1 항에 있어서, 동결건조 형태의 조성물.
  24. 제 1 항에 있어서, 액체 형태의 조성물.
  25. 제 1 항에 있어서, 약학적으로 허용가능한 부형제를 추가로 함유하는 조성물.
  26. 제 1 항에 있어서, 각각의 콘쥬게이트가 아미드 결합을 갖는 조성물.
  27. 제 1 항에 있어서, 각각의 콘쥬게이트가 2차 아민 결합을 갖는 조성물.
  28. 제 1 항에 있어서, 각각의 콘쥬게이트가 카르바메이트 결합을 갖는 조성물.
  29. 제 1 항에 있어서, 각각의 콘쥬게이트가 티오에테르 결합을 갖는 조성물.
  30. 제 1 항에 있어서, 각각의 콘쥬게이트가 디설피드 결합을 갖는 조성물.
  31. 복수의 모노-PEG화 인자 Ⅷ 부분 콘쥬게이트를 함유하는 조성물.
  32. 제 31 항에 있어서, 각각의 모노-PEG화 인자 Ⅷ 부분 콘쥬게이트가, 히드록시, 알콕시, 치환 알콕시, 알켄옥시, 치환 알켄옥시, 알킨옥시, 치환 알킨옥시, 아릴옥시 및 치환 아릴옥시로 이루어지는 군으로부터 선택되는 말단-캡핑 부분으로 말단이 캡핑된 하나의 폴리(에틸렌 글리콜)을 포함하는 조성물.
  33. 제 31 항에 있어서, 폴리(에틸렌 글리콜)의 말단이 메톡시로 캡핑된 조성물.
  34. 제 31 항에 있어서, 폴리(에틸렌 글리콜)의 말단이 히드록시로 캡핑된 조성물.
  35. 제 31 항에 있어서, 각각의 모노-PEG화 인자 Ⅷ 부분 콘쥬게이트가, 공칭 평균 분자량이 5,000 돌턴 초과 내지 약 150,000 돌턴 범위인 폴리(에틸렌 글리콜) 을 포함하는 조성물.
  36. 제 35 항에 있어서, 폴리(에틸렌 글리콜)의 공칭 평균 분자량이 약 6,000 돌턴 내지 약 100,000 돌턴 범위인 조성물.
  37. 제 36 항에 있어서, 폴리(에틸렌 글리콜)의 공칭 평균 분자량이 약 10,000 돌턴 내지 약 85,000 돌턴 범위인 조성물.
  38. 제 37 항에 있어서, 폴리(에틸렌 글리콜)의 공칭 평균 분자량이 약 20,000 돌턴 내지 약 85,000 돌턴 범위인 조성물.
  39. 제 38 항에 있어서, 폴리(에틸렌 글리콜)의 공칭 평균 분자량이 약 53,000 돌턴 내지 약 75,000 돌턴 범위인 조성물.
  40. 제 31 항에 있어서, 각각의 모노-PEG화 인자 Ⅷ 부분 콘쥬게이트가 선형 폴리(에틸렌 글리콜)을 포함하는 조성물.
  41. 제 31 항에 있어서, 각각의 모노-PEG화 인자 Ⅷ 부분이 분지형 폴리(에틸렌 글리콜)을 포함하는 조성물.
  42. 제 31 항에 있어서, 각각의 모노-PEG화 인자 Ⅷ 부분 콘쥬게이트가, 인자 Ⅷ, 인자 Ⅷa, 인자 Ⅷ:C, 인자 Ⅷ:vWF, B-도메인 결실 인자 Ⅷ, 및 상기한 것들의 임의의 생물학적 활성 절편, 결실 변이체, 치환 변이체 또는 첨가 변이체로 이루어지는 군으로부터 선택되는 인자 Ⅷ 부분을 포함하는 조성물.
  43. 제 31 항에 있어서, 각각의 모노-PEG화 인자 Ⅷ 부분 콘쥬게이트가, 인자 Ⅷ, 인자 Ⅷa, 인자 Ⅷ:C, 및 인자 Ⅷ:vWF 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 인자 Ⅷ 부분을 포함하는 조성물.
  44. 제 31 항에 있어서, 각각의 모노-PEG화 인자 Ⅷ 부분 콘쥬게이트가 B-도메인 결실 인자 Ⅷ 을 포함하는 조성물.
  45. 제 31 항에 있어서, 각각의 모노-PEG화 인자 Ⅷ 부분 콘쥬게이트가 재조합 인자 Ⅷ 부분을 포함하는 조성물.
  46. 제 31 항에 있어서, 각각의 모노-PEG화 인자 Ⅷ 부분 콘쥬게이트가 혈액-유래의 인자 Ⅷ 부분을 포함하는 조성물.
  47. 제 31 항에 있어서, 알부민이 실질적으로 없는 조성물.
  48. 제 31 항에 있어서, 인자 Ⅷ 활성을 갖지 않는 단백질이 실질적으로 없는 조성물.
  49. 제 31 항에 있어서, 비공유결합된 수용성 중합체가 실질적으로 없는 조성물.
  50. 제 31 항에 있어서, 동결건조 형태의 조성물.
  51. 제 31 항에 있어서, 액체 형태의 조성물.
  52. 제 31 항에 있어서, 약학적으로 허용가능한 부형제를 추가로 함유하는 조성물.
  53. 제 31 항에 있어서, 각각의 콘쥬게이트가 아미드 결합을 갖는 조성물.
  54. 제 31 항에 있어서, 각각의 콘쥬게이트가 2차 아민 결합을 갖는 조성물.
  55. 제 31 항에 있어서, 각각의 콘쥬게이트가 카르바메이트 결합을 갖는 조성물.
  56. 제 31 항에 있어서, 각각의 콘쥬게이트가 티오에테르 결합을 갖는 조성물.
  57. 제 31 항에 있어서, 각각의 콘쥬게이트가 디설피드 결합을 갖는 조성물.
  58. 컨쥬게이션 조건 하에, 인자 Ⅷ 부분을 중합체성 시약과 접촉시키는 단계를 포함하는, 콘쥬게이트의 제조 방법.
  59. 인자 Ⅷ 요법을 필요로 하는 환자를 치료하는 방법에 있어서, 치료적 유효량의 상기 콘쥬게이트를 함유하는, 제 1 항 또는 제 31 항의 조성물을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  60. 제 59 항에 있어서, 환자가 A 형 혈우병을 앓고 있는 방법.
  61. 제 59 항에 있어서, 수술 전 2 일 이내에, 상기 조성물을 환자에게 투여하는 방법.
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