JP5216580B2 - グリコペグ化第ｉｘ因子 - Google Patents

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２００５年５月２５日に出願の米国仮特許出願第６０／６８４，７２９号明細書、２００５年８月１２日に出願の米国仮特許出願第６０／７０７，９９４号明細書、および２００５年８月２３日に出願の米国仮特許出願第６０／７１０，５３５号明細書に基づいて優先権を主張しており、それらの各々は、すべての目的について、それらの全体が参照により本願明細書において援用されている。

発明の背景
ビタミンＫ依存タンパク質（例えば、第ＩＸ因子）は、９〜１３のγ−カルボキシグルタミン酸残基（Ｇｌａ）を、それらのアミノ末端の４５残基に含有する。Ｇｌａ残基は、タンパク質前駆体中のグルタミン酸残基の側鎖をカーボキシレート化するためにビタミンＫを用いる酵素によって肝臓において産生される。ビタミンＫ依存タンパクが、多数の生物学的プロセスに関与しており、そのうち、最もよく記載されているのは、血液凝固である（ネルセスツェン（Ｎｅｌｓｅｓｔｕｅｎ），「Ｖｉｔａｍ．Ｈｏｒｍ．」５８：３５５〜３８９ページ（２０００年）において概説されている）。ビタミンＫ依存タンパク質としては、タンパク質Ｚ、タンパク質Ｓ、プロトロンビン（第ＩＩ因子）、第Ｘ因子、第ＩＸ因子、タンパク質Ｃ、第ＶＩＩ因子、Ｇａｓ６、およびマトリックスＧＬＡタンパク質が挙げられる。第ＶＩＩ、ＩＸ、ＸおよびＩＩ因子は、プロコアギュレーションプロセスにおいて機能し、一方、タンパク質Ｃ、タンパク質Ｓおよびタンパク質Ｚは、抗凝固役割において役立つ。Ｇａｓ６は、成長停止特異的遺伝子６（ｇａｓ６）によってコード化された成長停止ホルモンであって、タンパク質Ｓに関連する。マンフィオレッティ（Ｍａｎｆｉｏｌｅｔｔｉ）ら、「Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．」１３：４９７６〜４９８５ページ（１９９３年）を参照のこと。マトリックスＧＬＡタンパク質は、通常、骨中に見出され、および循環における軟部組織の石灰化の予防に重要である。ルオ（Ｌｕｏ）ら、「Ｎａｔｕｒｅ」３８６：７８〜８１ページ（１９９７年）。

血液凝固の制御は、血液凝固の形成不全ならびに不必要な血液凝固の形成である血栓症、の両方を含む、多数の健康問題への先導を提示するプロセスである。不必要な凝血塊を予防する薬剤が多くの状況において用いられており、多様な薬剤が入手可能である。残念なことに、最新の療法は望ましくない副作用を有する。経口的に投与されたワルファリン（Ｗａｒｆａｒｉｎ）などの抗凝固剤は肝臓におけるビタミンＫの作用を抑制することにより作用し、これにより、ビタミンＫ依存タンパク質中のグルタミン酸残基の完全なカルボキシ化を予防し、活性タンパク質の循環系における低下された濃度および凝固形成能の低減をもたらす。ワルファリン（Ｗａｒｆａｒｉｎ）治療は、薬物の、その目標との競合する性質によって複雑化されている。食物由来のビタミンＫの変動が、ワルファリン（Ｗａｒｆａｒｉｎ）の過剰投与量または過少投与量をもたらす可能性がある。凝固活性度の変動は、この治療の望ましくない結果である。

低分子量ヘパリンを含むヘパリンなどの投与された物質もまた、通例用いられる抗凝固剤である。さらに、これらの化合物もまた、過量投与されやすく、注意深くモニターされなければならない。

より新しい抗凝固剤のカテゴリーとしては、第ＶＩＩａおよびＩＸａ因子などの活性サイト変性ビタミンＫ依存凝固因子が挙げられる。活性サイトは、アミノ酸または短鎖ペプチドのクロロメチルケトン誘導体などのセリンプロテアーゼ抑制因子によってブロックされる。活性サイト−変性タンパク質は、それらの各々の補助因子と錯体を形成する能力を維持するが、これらは不活性であり、これにより酵素活性を産出せず、補助因子の、それぞれの活性酵素との錯化を予防する。要するに、これらのタンパク質は、抗凝固治療の有益性を、他の抗凝固剤の有害な副作用無しで提供するように思われる。活性サイト変性第Ｘａ因子が、この群における他の可能性のある抗凝固剤である。その補助因子タンパク質は第Ｖａ因子である。活性サイト変性活性化タンパク質Ｃ（ＡＰＣ）はまた、凝固の有効な抑制剤を形成し得る。ソレンセン（Ｓｏｒｅｎｓｅｎ）ら「Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．」２７２：１１８６３〜１１８６８ページ（１９９７年）を参照のこと。活性サイト変性ＡＰＣは第Ｖａ因子に結合し、第Ｘａ因子に結合することを妨げる。

ビタミンＫ依存凝固因子の使用の主な妨げはコストである。ビタミンＫ依存タンパク質の生合成は、少数の動物細胞タイプ中に存在する、無傷のグルタミン酸カルボキシ化系に依存している。これらのタンパク質の過剰産生は、この酵素系によって限定されている。しかも、これらのタンパク質の有効な投与量は高い。通例の投与量は、１０００μｇのペプチド／ｋｇ体重である。前述のハーカー（Ｈａｒｋｅｒ）ら、１９９７年を参照のこと。

治療的ペプチドの使用を妨害する他の現象は、タンパク質グリコシル化の周知の態様がペプチドによって示される比較的短いインビボ半減期であるということである。全般的には、短いインビボ半減期の問題は、治療的グリコペプチドが高投与量で頻繁に投与されなければならないことを意味し、これは、最終的には、より長期に持続する、より有効な糖タンパク質治療薬の形成についてより効率的な方法が利用可能であった場合に必要とされ得る場合よりもより高価な健康管理コストになる。

第ＶＩＩａ因子が、例えば、この問題を説明する。第ＶＩＩおよびＶＩＩａ因子は、約２〜４時間の循環半減時間をヒト中で有する。すなわち、２〜４時間内に、血清中のペプチドの濃度が半分に低減される。第ＶＩＩａ因子が、一定の形態の血友病を治療するために凝血原として用いられる場合、標準的なプロトコルは、ＶＩＩａを、２時間毎に高投与量で（４５〜９０．ｍｕ．ｇ／ｋｇ体重）注射することである。ヘッドナー（Ｈｅｄｎｅｒ）ら、「Ｔｒａｎｓｆｕｓ．Ｍｅｄ．Ｒｅｖ．」７：７８〜８３ページ（１９９３年）を参照のこと。それ故、これらのタンパク質の凝血原または抗凝固剤としての使用は（第ＶＩＩａ因子の場合には）、タンパク質が、頻繁な間隔で高投与量で投与されることを必要とする。

経済的なグリコペプチド治療薬の提供の問題に対する１つの解決法は、ペプチドをより長いインビボ半減期で提供することであった。例えば、向上した薬物動態学的特性を有するグリコペプチド治療薬が、合成ポリマーをペプチド主鎖に結合することにより形成されてきた。ペプチドに複合化された例示的なポリマーは、ポリ（エチレングリコール）（「ＰＥＧ」）である。ペプチド治療薬を誘導体化するためのＰＥＧの使用が、ペプチドの免疫原性を低減させるために実施されてきた。例えば、米国特許第４，１７９，３３７号明細書（デ−ビス（Ｄａｖｉｓ）ら）が、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはポリプロピレングリコールにカップリングされた酵素およびペプチドホルモンなどの非免疫原性ポリペプチドを開示する。低減された免疫原性に追加して、循環におけるクリアランス時間は、問題になっているポリペプチドのＰＥＧ−複合体の増加したサイズにより長期化されている。

ＰＥＧおよびその誘導体の、ペプチドに対する結合の基本的な様式は、ペプチドアミノ酸残基を介した非特異的結合である（例えば、米国特許第４，０８８，５３８号明細書、米国特許第４，４９６，６８９号明細書、米国特許第４，４１４，１４７号明細書、米国特許第４，０５５，６３５号明細書、および国際公開第８７／０００５６号パンフレットを参照のこと）。ＰＥＧのペプチドに対する結合の他の様式は、グリコペプチド上のグリコシル残基の非特異的な酸化を介する（例えば、国際公開第９４／０５３３２号パンフレットを参照のこと）。

これらの非特異的方法において、ポリ（エチレングリコール）が、ランダムな、非特異的な方策でペプチド主鎖上の反応性残基に添加される。当然、ＰＥＧ分子のランダムな添加は、最終産生物の均質性の欠如、およびペプチドの生物学的または酵素活性の低減に対する可能性を含むその欠点を有する。従って、治療的ペプチドの産生には、特異的に標識化された、容易に特徴化可能で、基本的に均質な産生物の形成をもたらす誘導体化ストラテジーが優れている。このようは方法が開発された。

特異的に標識化された、均質なペプチド治療薬は、酵素の作用を通してインビトロで産生されることができる。合成ポリマーまたは他の標識をペプチドに結合させる典型的な非特異的方法とは異なり、酵素に基づいた合成は、位置選択性および立体選択性の利点を有する。標識化されたペプチドの合成について用いられる酵素の２つの重要なクラスは、グリコシルトランスフェラーゼ（例えば、シアリルトランスフェラーゼ、オリゴサッカリルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ）、およびグリコシダーゼである。これらの酵素は、糖質の特異的な結合のために用いられることができ、これが、続いて治療的部位を含むよう変性されることができる。あるいは、グリコシルトランスフェラーゼおよび変性グリコシダーゼは、変性糖質をペプチド主鎖に直接的に転移させるために用いられることができる（その各々が本願明細書において参照により援用されている、例えば、米国特許第６，３９９，３３６号明細書、および米国特許出願公開第２００３／００４００３７号明細書、米国特許出願公開第２００４／０１３２６４０号明細書、米国特許出願公開第２００４／０１３７５５７号明細書、米国特許出願公開第２００４／０１２６８３８号明細書、および米国特許出願公開第２００４／０１４２８５６号明細書を参照のこと）。化学的および酵素的合成エレメントの両方を組み合わせる方法もまた公知である（例えば、ヤマモト（Ｙａｍａｍｏｔｏ）ら「Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．」３０５：４１５〜４２２ページ（１９９８年）および参照により本願明細書において援用される米国特許出願公開第２００４／０１３７５５７号明細書を参照のこと）。

第ＩＸ因子は、きわめて価値のある治療的ペプチドである。第ＩＸ因子の市販されている形態が今日用いられているが、これらのペプチドは、得られる単離された糖タンパク質産生物の薬物動態学性を増強させる、変性によって向上されることができる。それ故、向上した有効性およびより良好な薬物動態学性を有する、より長期に持続する第ＩＸ因子ペプチドについて、技術分野において必要性が未だある。しかも、最大数の個体について効果的であるためには、何度も繰り返して容易に再現することができ、予想可能であると共に基本的に均質な構造を有する、向上した治療的薬物動態学性を備えた第ＩＸ因子ペプチドを、産業規模で製造することが可能でなければならない。

幸いにも、向上した薬物動態学性を備える第ＩＸ因子ペプチド、およびこれらの製造方法が、現在は発見されている。向上した薬物動態学性を備える第ＩＸ因子ペプチドに追加して、本発明はまた、産業的に実用的であると共に、これらの第ＩＸ因子ペプチドの製造についての経済的な方法を提供する。本発明の第ＩＸ因子ペプチドは、ＰＥＧ部位のような変性基、治療的部位、生体分子等を含む。本発明は、従って、第ＩＸ因子が有効な治療を提供する状態および疾病の治療についての、向上した治療的有効性および向上した薬物動態学性を備える第ＩＸ因子ペプチドについての必要性を満たす。

本発明の概要
例えば、水溶性ポリマー、水不溶性ポリマー、標的指向化部位等といった、１つまたは複数の変性基を有する第ＩＸ因子の制御された変性は、従来得ることが可能ではなかった特性を有するＦＩＸポリマーを提供することが現在は発見されている。

例示の態様においては、第ＩＸ因子ペプチドが、例えばポリ（エチレングリコール）部位といった水溶性ポリマー部位で変性されて、関連する天然の（非複合化）第ＩＸ因子と比して驚異的に向上した薬物動態学的特性を有する、新規な第ＩＸ因子誘導体がもたらされる。しかも、複合化された第ＩＸ因子は、少なくとも非複合化ペプチドの薬理学的活性を維持する。

第１の態様において、本発明は、同等の非複合化ＦＩＸペプチドと比して増強されたＴ_１／２を有する、第ＩＸ因子および水溶性ポリマーの複合体を提供する。好ましい実施形態において、これらのペプチドは、非複合化ペプチドと比して増強された回収をも示す。

例示的実施形態において、本発明の第ＩＸ因子複合体は、水溶性ポリマーに複合化された糖質供与体と、変性糖質部位を供与体からグリコシルまたはペプチドのアミノ酸残基に転移させることが可能である酵素とを用いる、水溶性ポリマーの第ＩＸ因子ペプチドへの「グリコ複合化」によって調製される。本発明の第ＩＸ因子複合体の調製についての例示的ストラテジーは、「グリコペグ化（ｇｌｙｃｏＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ）」に依存している。

本発明の「グリコペグ化」第ＩＸ因子分子は、グリコシル化または非グリコシル化第ＩＸ因子ペプチドと、その構造中にポリ（エチレングリコール）部位を含む酵素性転移可能糖部位との複合体の酵素媒介形成によって産生される。ＰＥＧ部位は、糖部位に、直接的に（すなわち、２つの反応性基の反応によって形成された単一の基を介して）、または例えば置換または非置換のアルキル、置換または非置換のヘテロアルキル等といったリンカー部位を介して結合されている。

高分子変性部位は、第ＩＸ因子のグリコシル部位のいずれの位置にも結合されることができる。しかも、高分子変性部位は、野生型または変異第ＩＸ因子ペプチドのアミノ酸配列におけるいずれの位置にあるグリコシル残基にも結合されることができる。

例示的実施形態において、本発明は、グリコシルリンキング基を介して高分子変性部位に複合化された第ＩＸ因子ペプチドを提供する。例証的な第ＩＸ因子ペプチド複合体は、

から選択される式を有するグリコシルリンキング基を含む。

式ＩおよびＩＩにおいて、Ｒ^２はＨ、ＣＨ_２ＯＲ^７、ＣＯＯＲ^７またはＯＲ^７であり、ここでＲ^７は、Ｈ、置換または非置換のアルキルまたは置換または非置換のヘテロアルキルを表す。符号Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｒ^６およびＲ^６’は、独立に、Ｈ、置換または非置換のアルキル、ＯＲ^８、ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ^９を表す。指数ｄは０または１である。Ｒ^８およびＲ^９は、Ｈ、置換または非置換のアルキル、置換または非置換のヘテロアルキルまたはシアル酸から独立に選択される。Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｒ^６またはＲ^６’の少なくとも１つは、例えばＰＥＧといった高分子変性部位を含む。例示的実施形態において、Ｒ^６およびＲ^６’は、それらが結合している炭素と共に、シアル酸の側鎖の成分である。さらなる例示的実施形態において、この側鎖は高分子変性部位で官能基化される。

他の態様においては、本発明は、それを必要とする患者の状態を治療する方法を提供する。例証的な状態としては、患者における易感染性血液凝固によって特徴付けられるものが挙げられる。方法は、患者における状態を改善させるために有効である量の本発明のポリマー変性第ＩＸ因子ペプチドを患者に投与するステップを含む。

さらなる態様において、本発明は、哺乳動物における血液凝固を増強させる方法を提供する。方法は、哺乳動物において凝血塊を増強させるに有効な量の本発明のポリマー変性第ＩＸ因子ペプチドを哺乳動物に投与するステップを含む。

本発明はまた、第ＩＸ因子での治療を必要とする哺乳類患者における状態を治療する方法を提供する。方法は、患者に、患者の状態を改善させるのに有効である量の本発明のポリマー変性第ＩＸ因子ペプチドを投与するステップを含む。

本発明のポリマー変性第ＩＸ因子ペプチドおよび薬学的に許容可能なキャリアを含む医薬品配合物もまた提供される。

本発明の他の目的および利点は、以下の詳細な説明から当業者に明らかになるであろう。

本発明および好ましい実施形態の詳細な説明
略語
ＰＥＧ、ポリ（エチレングリコール）；ＰＰＧ、ポリ（プロピレングリコール）；Ａｒａ、アラビノシル；Ｆｒｕ、フルクトシル；Ｆｕｃ、フコシル；Ｇａｌ、ガラクトシル；ＧａｌＮＡｃ、Ｎ−アセチルガラクトサミニル；Ｇｌｃ、グルコシル；ＧｌｃＮＡｃ、Ｎ−アセチルグルコサミニル；Ｍａｎ、マンノシル；ＭａｎＡｃ、マンノサミニルアセテート；Ｘｙｌ、キシロシル；ＮｅｕＡｃ（Ｎ−アセチルノイラミニル）、Ｓｉａ（シアリル）；Ｍ６Ｐ、マンノース−６−リン酸。

定義
そうではないと定義されていない限り、本明細書中普通に用いたすべての技術的および科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって通例理解されるものと同一の意味を有する。一般に、本願明細書において用いた命名および、細胞培養、分子遺伝子学、有機化学および核酸化学およびハイブリダイゼーションにおける実験手順は、技術分野において、周知であり、通例用いられるものである。標準技術が、核酸およびペプチド合成について用いられる。技術および手順は、一般に、技術分野の従来の方法および、種々の一般的な文献（一般に、参照により本願明細書において援用されるサムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、「ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、第２版．（１９８９年）、コールドスプリングハーバーラボラトリープレス（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．）を参照のこと）に従って実施され、これらは本書類の全体を通して提供されている。本願明細書において用いた命名および、以下に記載の分析化学、および有機合成における実験手順は、技術分野において周知であり、通例用いられるものである。標準技術、またはそれらの改良は、化学合成および化学分析のために用いられる。

本願明細書に記載のすべてのオリゴ糖は、非還元サッカライドについての名称または略記（すなわち、Ｇａｌ）、続いて、グリコシド結合（□または□）、環結合（１または２）、結合に関与する還元サッカライドの環位置の構成（２、３、４、６または８）、次いで、還元サッカライドの名称または略記（すなわち、ＧｌｃＮＡｃ）によって記載されている。各サッカライドは、好ましくはピラノースである。標準糖鎖生物学命名の概要については、「Ｅｓｓｅｎｔｉａｌｓ ｏｆ Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ」、バルキ（Ｖａｒｋｉ）ら編、ＣＳＨＬプレス（ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ）（１９９９年）を参照のこと。

オリゴ糖は、還元末端でのサッカライドが実際に還元糖質であるか否かにかかわらず、還元末端および非還元末端を有していると見なされる。許容された命名によれば、オリゴ糖は、非還元末端が左側および還元末端が右側で本願明細書において既述される。

用語「シアル酸」は、９炭素カルボキシル化糖質のファミリーのいずれかのメンバーを指す。シアル酸ファミリーの最も一般的なメンバーは、Ｎ−アセチル−ノイラミン酸（２−ケト−５−アセトアミド−３，５−ジデオキシ−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクトノヌロピラノース−１−オン酸（度々、Ｎｅｕ５Ａｃ、ＮｅｕＡｃ、またはＮＡＮＡとして略記される）。ファミリーの第２のメンバーは、ＮｅｕＡｃのＮ−アセチル基が、ヒドロキシル化されている、Ｎ−グリコリル−ノイラミン酸（Ｎｅｕ５ＧｃまたはＮｅｕＧｃ）である。第３のシアル酸ファミリーメンバーは、２−ケト−３−デオキシ−ノヌロソン酸（ＫＤＮ）（ナダノ（Ｎａｄａｎｏ）ら（１９８６年）「Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．」２６１：１１５５０〜１１５５７ページ；カナモリ（Ｋａｎａｍｏｒｉ）ら、「Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．」２６５：２１８１１〜２１８１９ページ（１９９０年））である。９−Ｏ−ラクチル−Ｎｅｕ５Ａｃまたは９−Ｏ−アセチル−Ｎｅｕ５Ａｃのような９−Ｏ−Ｃ_１〜Ｃ_６アシル−Ｎｅｕ５Ａｃ、９−デオキシ−９−フルオロ−Ｎｅｕ５Ａｃおよび９−アジド−９−デオキシ−Ｎｅｕ５Ａｃなどの９−置換シアル酸もまた含まれる。シアル酸ファミリーの概要については、例えば、バルキ（Ｖａｒｋｉ）、「Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ」２：２５〜４０ページ（１９９２年）；「Ｓｉａｌｉｃ Ａｃｉｄｓ：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ」、Ｒ．シャウアー（Ｒ．Ｓｃｈａｕｅｒ）編、（スプリンガーフェルラーグ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ）、ニューヨーク（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）（１９９２年））を参照のこと。シアリル化手順におけるシアル酸化合物の合成および使用は、１９９２年１０月１日公開の国際公開第９２／１６６４０号パンフレットに記載されている。

「ペプチド」は、モノマーがアミノ酸であり、アミド結合を介して結合されているポリマーを指し、あるいはポリペプチドとして称される。さらに、例えば、□−アラニン、フェニルグリシンおよびホモアルギニンといった非天然アミノ酸もまた含まれる。遺伝子−コード化されていないアミノ酸もまた、本発明において用いられ得る。しかも、変性されて、反応性基、グリコシル化サイト、ポリマー、治療的部位、生体分子等を含むアミノ酸もまた、本発明において用いられ得る。本発明において用いられるアミノ酸のすべては、Ｄ−またはＬ−異性体の一方であり得る。Ｌ−異性体が一般に好ましい。さらに、他のペプチド模倣薬もまた本発明において有用である。本願明細書において用いられるところ、「ペプチド」は、グリコシル化および非グリコシル化ペプチドの両方を指す。ペプチドを発現するシステムによって不完全にグリコシル化されたペプチドもまた含まれる。一般的な概要については、「ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ ＡＮＤ ＢＩＯＣＨＥＭＩＳＴＲＹ ＯＦ ＡＭＩＮＯ ＡＣＩＤＳ， ＰＥＰＴＩＤＥＳ ＡＮＤ ＰＲＯＴＥＩＮＳ」、Ｂ．バインスタイン（Ｂ．Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ）編、マルセルデッカー（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ）、ニューヨーク（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、２６７ページ（１９８３年）におけるスパトラ，Ａ．Ｆ．（Ｓｐａｔｏｌａ，Ａ．Ｆ．）を参照のこと。

用語「ペプチド複合体」は、本願明細書に規定のとおりペプチドが、変性糖質で複合化されている、本発明の種を指す。

用語「アミノ酸」は、天然に生じるおよび合成アミノ酸、ならびにアミノ酸類似体および天然に生じるアミノ酸と類似する方策で機能するアミノ酸模倣薬を指す。天然に生じるアミノ酸は遺伝子学コードによってコード化されるものであり、ならびに例えば、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタメート、およびＯ−ホスホセリンといった、後に変性されるアミノ酸である。アミノ酸類似体は、天然に生じるアミノ酸と同一の基礎的な化学構造を有する、すなわち、水素、カルボキシル基、アミノ基、およびＲ基に結合されるα炭素を有する化合物、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウム塩を指す。このような類似体は変性Ｒ基（例えばノルロイシン）または変性ペプチド主鎖を有するが、天然に生じるアミノ酸と同一の基礎的な化学構造を維持する。アミノ酸模倣薬は、アミノ酸の一般的な化学構造とは異なる構造を有するが、天然に生じるアミノ酸と類似の方策で機能する化学化合物を指す。

本願明細書において用いられるところ、用語「変性糖質」は、本発明のプロセスにおいて、酵素的にペプチドのアミノ酸またはグリコシル残基上に添加される、天然に生じるまたは天然に生じない炭水化物を指す。変性糖質は、特に限定されないが、糖質ヌクレオチド（モノ−、ジ−、およびトリ−リン酸塩）、活性化糖質（例えば、ハロゲン化グリコシル、グリコシルメシレート）および活性もされておらずヌクレオチドでもない糖質を含む酵素基質から選択される。「変性糖質」は、「変性基」で共有結合的に官能基化される。有用な変性基としては、限定されないが、ＰＥＧ部位、治療的部位、診断上の部位、生体分子等が挙げられる。変性基は、天然に生じていないか、または非変性炭水化物ではないことが好ましい。変性基での官能化の座位は、「変性糖質」が酵素的にペプチドに添加されることが回避されないように選択される。

用語「水溶性」は、いくらかの検出可能な程度の水中への溶解度を有する部位を指す。水溶性度を検出しおよび／または定量化する方法は、技術分野において周知である。例証的な水溶性ポリマーとしては、ペプチド、サッカライド、ポリ（エーテル）、ポリ（アミン）、ポリ（カルボン酸）等が挙げられる。ペプチドは、単一のアミノ酸、例えば、ポリ（リシン）から組成される混合配列を有することができる。例示的多糖はポリ（シアル酸）である。例示的ポリ（エーテル）はポリ（エチレングリコール）である。ポリ（エチレンイミン）が例示的ポリアミンであり、およびポリ（アクリル）酸が代表的なポリ（カルボン酸）である。

水溶性ポリマーのポリマー主鎖は、ポリ（エチレングリコール）（すなわちＰＥＧ）であることができる。しかしながら、他の関連するポリマーもまた、本発明の実施における使用に好適であること、および用語ＰＥＧまたはポリ（エチレングリコール）の使用は包括的であり、この観点において排他的ではないことが意図されることは、理解されるべきである。用語ＰＥＧとしては、アルコキシＰＥＧ、二官能性ＰＥＧ、多重アームＰＥＧ、フォークド(ｆｏｒｋｅｄ)ＰＥＧ、分岐ＰＥＧ、ペンデント（ｐｅｎｄｅｎｔ）ＰＥＧ（すなわち、ポリマー主鎖にペンデントする１つまたは複数の官能基を有するＰＥＧまたは関連ポリマー）、またはその中に分解性リンクを含むＰＥＧを含む、そのいずれかの形態でのポリ（エチレングリコール）が挙げられる。

ポリマー主鎖は、直鎖または分岐であることができる。分岐ポリマー主鎖は一般に技術分野において公知である。典型的には、分岐ポリマーは、中央分岐コア部位および中央分岐コアにリンクされた複数の直鎖ポリマー鎖を有する。ＰＥＧは、通例、分岐形態で用いられ、これは、エチレンオキシドの、グリセロール、ペンタエリスリトールおよびソルビトールなどの種々のポリオールへの添加により調製されることができる。中央分岐部位はまた、リシンなどの数々のアミノ酸から誘導されることができる。分岐ポリ（エチレングリコール）は、Ｒ（−ＰＥＧ−ＯＨ）_ｍとしての一般形態で表されることができ、ここで、Ｒはグリセロールまたはペンタエリスリトールなどのコア部位を表し、およびｍはアームの数を表す。その全体が参照により本願明細書において援用される米国特許第５，９３２，４６２号明細書に記載のものなどの多重アームＰＥＧ分子もまた、ポリマー主鎖として用いることができる。

多くの他のポリマーもまた、本発明に好適である。非ペプチド性および水溶性の、２〜約３００の終端を有するポリマー主鎖が、本発明において特に有用である。好適なポリマーの例としては、限定されないが、ポリ（プロピレングリコール）（「ＰＰＧ」）、エチレングリコールおよびプロピレングリコールのコポリマー等などの他のポリ（アルキレングリコール）、ポリ（オキシエチル化ポリオール）、ポリ（オレフィンアルコール）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（ヒドロキシプロピルメタクリルアミド）、ポリ（□−ヒドロキシ酸）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリホスファゼン、ポリオキサゾリン、その全体が参照により本願明細書において援用される米国特許第５，６２９，３８４号明細書に記載のものなどのポリ（Ｎ−アクリロイルモルホリン）、およびこれらのコポリマー、ターポリマー、および混合物が挙げられる。ポリマー主鎖の各鎖の分子量は異なることができるが、典型的には、約１００Ｄａ〜約１００，０００Ｄａ、度々、約６，０００Ｄａ〜約８０，０００Ｄａの範囲内である。

本願明細書におけるペプチド薬物を患者に投与するコンテクストにおいて、「曲線下の面積」または「ＡＵＣ」は、ゼロから無限までの時間の関数としての、患者の全身的循環における薬物の濃度を表す曲線下の合計面積として定義される。

本願明細書におけるペプチド薬物を患者に投与するコンテクストにおいて、用語「半減期」または「Ｔ_１／２」は、患者中の薬物のプラズマ（血漿）濃度が半分に低減されるために必要な時間として定義される。ペプチド薬物に関連して、多重クリアランスメカニズム、再分布、および技術分野において周知である他のメカニズムに応じて、２つ以上の半減期があり得る。通常は、αおよびβ半減期は、α相が再分布に関連すると共に、β相がクリアランスに関連するよう定義される。しかしながら、血流に拘束される、大部分のタンパク薬物では、少なくとも２つのクリアランス半減期があることができる。いくつかのグリコシル化ペプチドについては、急速なβ相クリアランスは、マクロファージの受容体を介して、または末端ガラクトース、Ｎ−アセチルガラクトースアミン、Ｎ−アセチルグルコースアミン、マンノース、またはフコースを認識する内皮細胞を介して媒介され得る。より遅いβ相クリアランスが、分子についての、有効半径＜２ｎｍ（およそ６８ｋＤ）での腎臓糸球体ろ過および／または組織における特異的または非特異的な摂取および代謝を介して生じ得る。グリコペグ化は、末端糖質（例えば、ガラクトースまたはＮ−アセチルガラクトースアミン）をキャップし得、これにより、これらの糖質を認識する受容体を介しての急速なα相クリアランスをブロックする。これはより大きい有効半径をも与え得、これにより分布および組織摂取の体積を低減させ、これにより遅いβ相を延長させる。それ故、グリコペグ化のα相およびβ相半減期への正確な影響は、技術分野において周知であるとおり、サイズ、グリコシル化の状態、および他のパラメータに応じて異なるであろう。さらなる「半減期」の説明が「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」（１９９７年、ＤＦＡクロメリン（Ｃｒｏｍｍｅｌｉｎ）およびＲＤシンデラー（Ｓｉｎｄｅｌａｒ）編、ハワ−ドパブリッシャ−ズ（Ｈａｒｗｏｏｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）、アムステルダム（Ａｍｓｔｅｒｄａｍ）、１０１〜１２０ページ）に見出される。

用語「終末半減期」または「終末Ｔ_１／２、」は、消失相の有効半減期を指す。例えば、２コンパートメントモデルについては、β相定数（β＝消失定数）を、消失相の半減期を算出するために用いることができる（例えば、Ｔ_１／２＝０．６９３／β）。

用語「回収（ｒｅｃｏｖｅｒｙ）」は、第１の投与後時間中に生じる最大の因子レベルから判定される量を指す。この数値は、増分値として、すなわち、ベースライン（投与前）レベルを差し引いた後に報告されるべきであり、次いで、（Ｕ／ｍＬ）／（Ｕ／ｋｇ）として、投与量ベース当たりで報告されるべきである。リー（Ｌｅｅ）ら、「血友病（Ｈｅｍｏｐｈｉｌｉａ）」（２００６年）、１２、（Ｓｕｐｐｌ．３）、１〜７を参照のこと。

本願明細書において用いられる用語「グリコ複合化」は、変性糖質種の、ポリペプチド、例えば、本発明の第ＩＸ因子ペプチドへのアミノ酸またはグリコシル残基の酵素的に媒介された複合化を指す。「グリコ複合化」の亜属は、変性糖質の変性基がポリ（エチレングリコール）、およびアルキル誘導体（例えば、ｍ−ＰＥＧ）または反応性誘導体（例えば、Ｈ_２Ｎ−ＰＥＧ、ＨＯＯＣ−ＰＥＧ）である「グリコール−ペグ化」である。

用語「大規模」および「産業規模」は、同義的に用いられ、少なくとも約２５０ｍｇ、好ましくは少なくとも約５００ｍｇ、およびより好ましくは少なくとも約１グラムの複合糖質を、単一の反応サイクルの完了時に生成する反応サイクルを指す。

本願明細書において用いられる用語「グリコシルリンキング基」は、変性基（例えば、ＰＥＧ部位、治療的部位、生体分子）が共有結合的に結合されているグリコシル残基（グリコシルリンキング基が変性基と複合体の残りとを接合している）を指す。本発明の方法において、「グリコシルリンキング基」は、グリコシル化または非グリコシル化ペプチドに共有結合的に結合されることとなり、これにより、剤をペプチド上のアミノ酸および／またはグリコシル残基にリンクする。「グリコシルリンキング基」は、一般に、ペプチドのアミノ酸および／またはグリコシル残基への「変性糖質」の酵素的な結合により「変性糖質」から誘導される。グリコシルリンキング基は、変性基−変性糖質カセットの形成（例えば、酸化□シッフ塩基形成□還元）中に分解されるサッカライド−由来構造であることができ、またはグリコシルリンキング基は無傷であり得る。「無傷のグリコシルリンキング基」は、変性基および複合体の残りをリンクするサッカライドモノマーが分解、例えばメタ過ヨウ素酸ナトリウムによって、例えば酸化されていない、グリコシル部位から誘導されるリンキング基を指す。本発明の「無傷のグリコシルリンキング基」は、天然に生じるオリゴ糖から、グリコシル単位の添加または１つまたは複数のグリコシル単位の親サッカライド構造からの除去により誘導され得る。

本願明細書において用いられる用語「標的指向化部位」は、特定の組織または身体の領域に選択的に局在化させるであろう種を指す。局在化は、分子決定因子、標的指向化剤または複合体の分子サイズ、イオン性相互作用、疎水性相互作用等の特異的な認識によって媒介される。剤を特定の組織または領域に標的指向化させる他のメカニズムは、当業者に公知である。例証的な標的指向化部位としては、抗体、抗体断片、トランスフェリン、ＨＳ−糖タンパク質、凝固因子、血清タンパク質、β−糖タンパク質、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＥＰＯ等が挙げられる。

本願明細書において用いられるところ、「治療的部位」は、治療について有用であるいずれかの剤を意味し、特に限定されないが、抗生物質、抗炎症剤、抗腫瘍薬、細胞毒、および放射性剤が挙げられる。「治療的部位」としては、生理活性剤のプロドラッグ、例えば多価剤といった２つ以上の治療的部位がキャリアに結合されているコンストラクトが挙げられる。治療的部位としてはまた、タンパク質およびタンパク質を含むコストラクトが挙げられる。例証的なタンパク質としては、限定されないが、顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭＣＳＦ）、インターフェロン（例えば、インターフェロン−□、−□、−□）、インターロイキン（例えば、インターロイキンＩＩ）、血清タンパク質（例えば、第ＶＩＩ、ＶＩＩａ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、およびＸ因子）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ＨＣＧ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）および黄体ホルモン（ＬＨ）および抗体融合タンパク質（例えば腫瘍壊死因子受容体（（ＴＮＦＲ）／Ｆｃドメイン融合タンパク質））が挙げられる。

本願明細書において用いられるところ、「薬学的に許容可能なキャリア」は、複合体と組み合わされたときに複合体の活性を保持すると共に、患者の免疫システムと非反応性であるいずれかの材料を含む。例としては、限定されないが、リン酸緩衝生理食塩水溶液、水、油／水エマルジョンなどのエマルジョン、および種々のタイプの湿潤剤などのいずれかの標準医薬品キャリアが挙げられる。他のキャリアとしてはまた、無菌溶液、コート錠剤を含む錠剤、およびカプセルが挙げられ得る。典型的には、このようなキャリアは、スターチ、ミルク、糖質、一定のタイプのクレイ、ゼラチン、ステアリン酸またはその塩、マグネシウムまたはステアリン酸カルシウム、タルク、植物脂肪または油、ガム、グリコール、または他の公知の賦形物などの賦形物を含有する。このようなキャリアとしてはまた、香料および着色添加剤または他の要素が挙げられ得る。このようなキャリアを含む組成物は、周知の従来の方法によって配合される。

本願明細書において用いられるところ、「投与する」とは、患者への、経口投与、座薬としての投与、局所的接触、静脈内、腹腔内、筋肉内、病巣内、鼻腔内または皮下投与または遅放出性デバイス、例えば、ミニ−浸透圧ポンプの移植を意味する。投与は、非経口的な、および経粘膜（例えば、経口、鼻の、膣の、肛門直腸の、または経皮的）を含むいずれかの経路による。非経口的な投与としては、例えば、静脈内、筋肉内、細動脈内、皮内、皮下、腹腔内、脳室内、および頭蓋内投与が挙げられる。しかも、腫瘍を治療するための注入が、例えばアポプトーシスを誘起する場合、投与は、腫瘍および／または腫瘍周囲の組織に直接的であり得る。送達の他のモードとしては、限定されないが、リポソーム配合物、静脈内注入、経皮パッチ等の使用が挙げられる。

用語「改善している」または「改善」は、症状の寛解、緩解または低減または患者の物理的または精神的健康における向上などの、いずれかの客観的または主観的パラメータを含む病状または状態の治療の成功のいずれかの証を指す。症状の改善は、客観的または主観的パラメータに基づくことができる（物理的試験および／または精神医学的評価の結果を含む）。

用語「治療」は、疾病または状態を「治療している」または「治療」を指し、疾病の症状をまだ経験または示してはいないが疾病に罹やすい可能性がある動物に疾病または状態が生じることを防止する（予防的治療）、疾病を抑制する（その発生を遅延させるまたは抑止させる）、疾病の症状または副作用からの軽減を提供する（対症療法を含む）、および疾病を軽減させる（疾病の退縮を生じさせる）ことを含む。

用語「有効量」または「に有効である量」または「治療的有効量」またはいずれかの文法的に均等な用語は、疾病を治療するために動物に投与されたときに、治療をその疾病について有効とするに十分な量を意味する。

用語「単離された」は、実質的にまたは基本的に、その材料の生成に用いられる成分を含まない材料を指す。本発明のペプチド複合体について、用語「単離された」は、実質的にまたは基本的に、ペプチド複合体の調製に用いられた混合物中に通常伴う材料である成分を含まない材料を指す。「単離された」および「純粋な」は、同義的に用いられる。典型的には、本発明の単離されたペプチド複合体は、好ましくは範囲として表される純度レベルを有する。ペプチド複合体についての純度の範囲の下限は、約６０％、約７０％または約８０％であり、および純度の範囲の上限は、約７０％、約８０％、約９０％または約９０％超である。

ペプチド複合体が約９０％を超えて純粋である場合、それらの純度もまた好ましくは範囲として表される。純度の範囲の下限は、約９０％、約９２％、約９４％、約９６％または約９８％である。純度の範囲の上限は、約９２％、約９４％、約９６％、約９８％または約１００％純度である。

純度は、いずれかの技術分野において認められた分析方法（例えば、銀染色ゲルでのバンド強度、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、ＨＰＬＣ、または類似の手段）によって測定される。

本願明細書において用いられる「個体群の基本的な各メンバー」は、ペプチドに付加される、ある選択された率の変性糖質がペプチド上の多数の、同一の受容体サイトに付加される、本発明のペプチド複合体の個体群の特徴を記載する。「個体群の基本的な各メンバー」は、変性糖質に複合化されたペプチド上のサイトの「均質性」を称し、少なくとも約８０％、好ましくは少なくとも約９０％およびより好ましくは少なくとも約９５％均質である本発明の複合体を指す。

「均質性」は、変性糖質が複合化される受容体部位の個体群にわたる構造的一貫性を指す。それ故、ほかのすべての変性糖質が複合化されている受容体サイトと同一の構造を有する受容体サイトに各変性糖質部位が複合化されている本発明のペプチド複合体において、ペプチド複合体は、約１００％均質であると考えられている。均質性は、典型的には、範囲として表される。ペプチド複合体についての均質性の範囲の下限は、約６０％、約７０％または約８０％であり、および純度の範囲の上限は約７０％、約８０％、約９０％または約９０％超である。

ペプチド複合体が約９０％以上均質である場合、それらの均質性もまた、好ましくは範囲として表される。均質性の範囲の下限は、約９０％、約９２％、約９４％、約９６％または約９８％である。純度の範囲の上限は、約９２％、約９４％、約９６％、約９８％または約１００％均質性である。ペプチド複合体の純度は、典型的には、当業者に公知である、例えば液体クロマトグラフィ−質量分光測定（ＬＣ−ＭＳ）、マトリックス支援レーザ脱離飛行時間型質量分析（ＭＡＬＤＩＴＯＦ）、毛管電気泳動等といった１つまたは複数の方法によって測定される。

グリコペプチド種を指す場合、「実質的に均一なグリコフォーム」または「実質的に均一なグリコシル化パターン」は、関心のあるグリコシルトランスフェラーゼ（例えば、フコシルトランスフェラーゼ）によってグリコシル化されている受容体部位の率を指す。例えば、□１，２フコシルトランスフェラーゼの場合には、実質的にすべての（以下に定義されているとおり）Ｇａｌ□１，４−ＧｌｃＮＡｃ−Ｒおよびそれらのシアリル化類似体が本発明のペプチド複合体においてフコシル化されている場合には、実質的に均一なフコシル化パターンが存在する。出発材料は、グリコシル化受容体部位（例えば、フコシル化Ｇａｌ□１，４−ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ部位）を含有し得ることは、当業者によって理解されるであろう。それ故、算出されるグリコシル化率は、本発明の方法によってグリコシル化された受容体部位、ならびに出発材料においてすでにグリコシル化された受容体部位を含むこととなる。

「実質的に均一な」の上記の定義における、用語「実質的に」は、一般に、少なくとも約４０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、またはより好ましくは少なくとも約９０％、およびより好ましくは少なくとも約９５％の特定のグリコシルトランスフェラーゼについての受容体部位がグリコシル化されていることを意味する。

置換基が、左から右に書かれたそれらの従来の化学式によって特定される場合、これらは、構造を右から左に書くことによりもたらされる化学的に同等の置換基を等しく包含し、例えば−ＣＨ_２Ｏ−は、−ＯＣＨ_２−をも言及することを意図する。

用語「アルキル」は、単独でまたは他の置換基の一部として、他に明記されていない限りにおいて、明示の数の炭素原子（すなわち、Ｃ_１〜Ｃ_１０は１〜１０個の炭素を意味する）を有し、完全に飽和、一価または多価不飽和であり得、および二価および多価ラジカルを含むことができる、直鎖または分岐鎖、または環状炭化水素ラジカル、またはこれらの組み合わせを意味する。飽和炭化水素ラジカルの例としては、限定されないが、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、シクロヘキシル、（シクロヘキシル）メチル、シクロプロピルメチル；例えば、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシル、ｎ−ヘプチル、ｎ−オクチルの同族体および異性体等などの基が挙げられる。不飽和アルキル基は、１つまたは複数の二重結合または三重結合を有するものである。不飽和アルキル基の例としては、限定されないが、ビニル、２−プロペニル、クロチル、２−イソペンテニル、２−（ブタジエニル）、２，４−ペンタジエニル、３−（１，４−ペンタジエニル）、エチニル、１−および３−プロピニル、３−ブチニル、およびより高級な同族体および異性体が挙げられる。用語「アルキル」はまた、特に記載のない限り、「ヘテロアルキル」などの以下により詳細に定義されるアルキルの誘導体を含むことを意図している。炭化水素基に限定されるアルキル基は、「ホモアルキル」と呼ばれる。

用語「アルキレン」は、単独でまたは他の置換基の一部として、限定されないが、−ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２−によって例示されるとおり、アルカンから誘導された二価ラジカルを意味し、およびさらに、「ヘテロアルキレン」としていかに記載の基のものを含む。典型的には、アルキル（またはアルキレン）基は、１〜２４個の炭素原子を含み、１０個以下の炭素原子を有する基が本発明において好ましいであろう。「低級アルキル」または「低級アルキレン」は、一般に８個以下の炭素原子を有するより短鎖のアルキルまたはアルキレン基である。

用語「アルコキシ」、「アルキルアミノ」および「アルキルチオ」（またはチオアルコキシ）はそれらの従来の意味で用いられ、および分子の残りに、それぞれ、酸素原子、アミノ基、または硫黄原子を介して結合されたアルキル基を指す。

用語「ヘテロアルキル」は、単独でまたは他の用語と組み合わされて、他に明記されていない限りにおいて、記載された数の炭素原子ならびに、Ｏ、Ｎ、ＳｉおよびＳからなる群から選択される少なくとも１個のヘテロ原子から構成されてなる、安定な直鎖または分岐鎖、または環状炭化水素ラジカル、またはこれらの組み合わせを意味し、ここで、窒素および硫黄原子は、任意に酸化されていてもよく、および窒素ヘテロ原子は任意により第４級化されていてもよい。ヘテロ原子Ｏ、ＮおよびＳおよびＳｉは、ヘテロアルキル基のいずれかの内部位置またはアルキル基が分子の残りに結合されている位置に置かれてもよい。例としては、限定されないが、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｏ−ＣＨ_３、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＮＨ−ＣＨ_３、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｎ（ＣＨ_３）−ＣＨ_３、−ＣＨ_２−Ｓ−ＣＨ_２−ＣＨ_３、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｓ（Ｏ）−ＣＨ_３、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｓ（Ｏ）_２−ＣＨ_３、−ＣＨ＝ＣＨ−Ｏ−ＣＨ_３、−Ｓｉ（ＣＨ_３）_３、−ＣＨ_２−ＣＨ＝Ｎ−ＯＣＨ_３、および−ＣＨ＝ＣＨ−Ｎ（ＣＨ_３）−ＣＨ_３が挙げられる。２個以下のヘテロ原子は、例えば、−ＣＨ_２−ＮＨ−ＯＣＨ_３および−ＣＨ_２−Ｏ−Ｓｉ（ＣＨ_３）_３などのように連続し得る。同様に、用語「ヘテロアルキレン」は、単独でまたは他の置換基の一部として、限定されないが、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｓ−ＣＨ_２−ＣＨ_２−および−ＣＨ_２−Ｓ−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＮＨ−ＣＨ_２−に例示されるとおりヘテロアルキルから誘導される二価ラジカルを意味する。ヘテロアルキレン基について、ヘテロ原子はまた、鎖終端の一方または両方を占めることができる（例えば、アルキレンオキシ、アルキレンジオキシ、アルキレンアミノ、アルキレンジアミノ等）。さらに、アルキレンおよびヘテロアルキレンリンキング基について、リンキング基の式が書かれている方向によっては、リンキング基の配向は示唆されない。例えば、式−Ｃ（Ｏ）_２Ｒ’−は、−Ｃ（Ｏ）_２Ｒ’−および−Ｒ’Ｃ（Ｏ）_２−の両方を表す。

用語「シクロアルキル」および「ヘテロシクロアルキル」は、それら自体で、または他の用語と組み合わされて、他に明記されていない限りにおいて、それぞれ、「アルキル」および「ヘテロアルキル」の環状形を表す。追加して、ヘテロシクロアルキルについて、ヘテロ原子は、複素環が、分子の残りに結合した位置を占めることができる。シクロアルキルの例としては、限定されないが、シクロペンチル、シクロヘキシル、１−シクロヘキセニル、３−シクロヘキセニル、シクロヘプチル等が挙げられる。ヘテロシクロアルキルの例としては、限定されないが、１−（１，２，５，６−テトラヒドロピリジル）、１−ピペリジニル、２−ピペリジニル、３−ピペリジニル、４−モルホリニル、３−モルホリニル、テトラヒドロフラン−２−イル、テトラヒドロフラン−３−イル、テトラヒドロチエン−２−イル、テトラヒドロチエン−３−イル、１−ピペラジニル、２−ピペラジニル等が挙げられる。

用語「ハロ」または「ハロゲン」は、それら自体または他の置換基の一部として、他に明記されていない限りにおいて、フッ素、塩素、臭素、またはヨウ素原子を意味する。さらに、「ハロアルキル」などの用語は、モノハロアルキルおよびポリハロアルキルを含むことを意味する。例えば、用語「ハロ（Ｃ_１〜Ｃ_４）アルキル」は、限定されないが、トリフルオロメチル、２，２，２−トリフルオロエチル、４−クロロブチル、３−ブロモプロピル等を含むことを意味する。

用語「アリール」は、他に明記されていない限りにおいて、共に縮合されている、または共有結合的にリンクされている単一の環または複数の環（好ましくは１〜３個の環）であることができる、多価不飽和の、芳香族置換基を意味する。用語「ヘテロアリール」は、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される１〜４個のヘテロ原子を含有するアリール基（または環）を指し、ここで、窒素および硫黄原子は任意により酸化されており、および窒素原子は任意により第４級化されている。ヘテロアリール基は、分子の残りにヘテロ原子を介して結合されていることができる。アリールおよびヘテロアリール基の非限定的な例としては、フェニル、１−ナフチル、２−ナフチル、４−ビフェニル、１−ピロリル、２−ピロリル、３−ピロリル、３−ピラゾリル、２−イミダゾリル、４−イミダゾリル、ピラジニル、２−オキサゾリル、４−オキサゾリル、２−フェニル−４−オキサゾリル、５−オキサゾリル、３−イソオキサゾリル、４−イソオキサゾリル、５−イソオキサゾリル、２−チアゾリル、４−チアゾリル、５−チアゾリル、２−フリル、３−フリル、２−チエニル、３−チエニル、２−ピリジル、３−ピリジル、４−ピリジル、２−ピリミジル、４−ピリミジル、５−ベンゾチアゾリル、プリニル、２−ベンズイミダゾリル、５−インドリル、１−イソキノリル、５−イソキノリル、２−キノキサリニル、５−キノキサリニル、３−キノリル、テトラゾリル、ベンゾ［ｂ］フラニル、ベンゾ［ｂ］チエニル、２，３−ジヒドロベンゾ［１，４］ジオキシン−６−イル、ベンゾ［１，３］ジオキソール−５−イルおよび６−キノリルが挙げられる。上記のアリールおよびヘテロアリール環系の各々の置換基は、以下に記載の許容可能な置換基の群から選択される。

簡潔さのために、用語「アリール」は、他の用語と組み合わされて（例えば、アリーロキシ、アリールチオキシ、アリールアルキル）用いられるとき、上述のとおりアリールおよびヘテロアリール環の両方を含む。それ故、用語「アリールアルキル」は、アリール基が、炭素原子（例えば、メチレン基）が例えば酸素原子で置き換えられているアルキル基（例えばフェノキシメチル、２−ピリジルオキシメチル、３−（１−ナフチルオキシ）プロピル等）を含むアルキル基に結合されたラジカル（例えば、ベンジル、フェネチル、ピリジルメチル等）を含むことを意味する。

上記用語（例えば、アルキル」、「ヘテロアルキル」、「アリール」および「ヘテロアリール」）の各々は、示されたラジカルの置換および非置換形態の両方を含むことを意味する。各タイプのラジカルについての好ましい置換基が以下に提供されている。

アルキルおよびヘテロアルキルラジカル（度々、アルキレン、アルケニル、ヘテロアルキレン、ヘテロアルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、シクロアルケニル、およびヘテロシクロアルケニルとして称される基を含む）についての置換基は、一般的に「アルキル基置換基」として称され、これらは、特に限定されないが、ゼロから（２ｍ’＋１）の範囲の数（ここでｍ’はこのようなラジカル中の炭素原子の総数である）での、−ＯＲ’、＝Ｏ、＝ＮＲ’、＝Ｎ−ＯＲ’、−ＮＲ’Ｒ’’、−ＳＲ’、−ハロゲン、−ＳｉＲ’Ｒ’’Ｒ’’’、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＣＯ_２Ｒ’、−ＣＯＮＲ’Ｒ’’、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、−ＮＲ’’Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＮＲ’−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’’Ｒ’’’、−ＮＲ’’Ｃ（Ｏ）_２Ｒ’、−ＮＲ−Ｃ（ＮＲ’Ｒ’’Ｒ’’’）＝ＮＲ’’’’、−ＮＲ−Ｃ（ＮＲ’Ｒ’’）＝ＮＲ’’’、−Ｓ（Ｏ）Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）_２Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）_２ＮＲ’Ｒ’’、−ＮＲＳＯ_２Ｒ’、−ＣＮおよび−ＮＯ_２から選択される多様な基の１つまたは複数であることができる。Ｒ’、Ｒ’’、Ｒ’’’およびＲ’’’’は、各々、好ましくは、独立に、水素、置換または非置換のヘテロアルキル、置換または非置換のアリール、例えば、１−３ハロゲンで置換されたアリール、置換または非置換のアルキル、アルコキシまたはチオアルコキシ基、またはアリールアルキル基を指す。本発明の化合物が２つ以上のＲ基を含む場合、２つ以上のＲ’、Ｒ’’、Ｒ’’’およびＲ’’’’基がある場合と同様に、例えば、Ｒ基の各々は独立に選択される。Ｒ’およびＲ’’が同一の窒素原子に結合されている場合、これらは、窒素原子と組み合わされて、５−、６−、または７−員環を形成することができる。例えば、−ＮＲ’Ｒ’’は、限定されないが、１−ピロリジニルおよび４−モルホリニルを含むことを意図する。置換基の上記の考察から、当業者は、用語「アルキル」は、ハロアルキル（例えば、−ＣＦ_３および−ＣＨ_２ＣＦ_３）およびアシル（例えば、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ_３、−Ｃ（Ｏ）ＣＦ_３、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ_２ＯＣＨ_３等）などの水素基以外の基に結合された炭素原子を含む基を含むことを意図することを理解するであろう。

アルキルラジカルについて記載した置換基と同様に、アリールおよびヘテロアリール基についての置換基は、一般的に、「アリール基置換基」として称される。置換基は、ゼロから芳香族環系の開放原子価（ｏｐｅｎ ｖａｌｅｎｃｅ）の総数の範囲の数での、例えば：ハロゲン、−ＯＲ’、＝Ｏ、＝ＮＲ’、＝Ｎ−ＯＲ’、−ＮＲ’Ｒ’’、−ＳＲ’、−ハロゲン、−ＳｉＲ’Ｒ’’Ｒ’’’、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＣＯ_２Ｒ’、−ＣＯＮＲ’Ｒ’’、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、−ＮＲ’’Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＮＲ’−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’’Ｒ’’’、−ＮＲ’’Ｃ（Ｏ）_２Ｒ’、−ＮＲ−Ｃ（ＮＲ’Ｒ’’Ｒ’’’）＝ＮＲ’’’’、−ＮＲ−Ｃ（ＮＲ’Ｒ’’）＝ＮＲ’’’、−Ｓ（Ｏ）Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）_２Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）_２ＮＲ’Ｒ’’、−ＮＲＳＯ_２Ｒ’、−ＣＮおよび−ＮＯ_２、−Ｒ’、−Ｎ_３、−ＣＨ（Ｐｈ）_２、フルオロ（Ｃ_１〜Ｃ_４）アルコキシ、およびフルオロ（Ｃ_１〜Ｃ_４）アルキルから選択され、ここで、Ｒ’、Ｒ’’、Ｒ’’’およびＲ’’’’は、好ましくは、水素、置換または非置換のアルキル、置換または非置換のヘテロアルキル、置換または非置換のアリールおよび置換または非置換のヘテロアリールから独立に選択される。本発明の化合物が２つ以上のＲ基を含む場合、２つ以上のＲ’、Ｒ’’、Ｒ’’’およびＲ’’’’基がある場合と同様に、例えば、Ｒ基の各々は独立に選択される。後述のスキームにおいて、符号Ｘは上記の「Ｒ」を示す。

アリールまたはヘテロアリール環の隣接する原子上の置換基の２つは、任意により、式−Ｔ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＲＲ’）_ｑ−Ｕ−の置換基で置き換えられ得、式中、ＴおよびＵは、独立に−ＮＲ−、−Ｏ−、−ＣＲＲ’−または単結合であり、およびｑは、０〜３の整数である。あるいは、アリールまたはヘテロアリール環の隣接する原子上の置換基の２つは、任意により、式−Ａ−（ＣＨ_２）_ｒ−Ｂ−の置換基で置き換えられ得、式中、ＡおよびＢは、独立に−ＣＲＲ’−、−Ｏ−、−ＮＲ−、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）_２−、−Ｓ（Ｏ）_２ＮＲ’−または単結合であり、およびｒは、１〜４の整数である。このように形成された新たな環の単結合の１つは、任意により、二重結合で置き換えられ得る。あるいは、アリールまたはヘテロアリール環の隣接する原子上の置換基の２つは、任意により、式−（ＣＲＲ’）_ｓ−Ｘ−（ＣＲ’’Ｒ’’’）_ｄ−の置換基で置き換えられ得、式中、ｓおよびｄは、独立に０〜３の整数であり、およびＸは、−Ｏ−、−ＮＲ’−、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）_２−、または−Ｓ（Ｏ）_２ＮＲ’−である。置換基Ｒ、Ｒ’、Ｒ’’およびＲ’’’は、好ましくは、水素または置換または非置換の（Ｃ_１〜Ｃ_６）アルキルから独立に選択される。

本願明細書において用いられるところ、用語「ヘテロ原子」は、酸素（Ｏ）、窒素（Ｎ）、硫黄（Ｓ）およびシリコン（Ｓｉ）を含むことを意図する。

序文
上記のとおり、第ＩＸ因子は、血液凝固カスケードにおいて重要である。体中における第ＩＸ因子の欠乏は、血友病（タイプＢ）のタイプと特徴付けられる。この疾病の治療は、通常は、第ＩＸ因子のヒトプラズマタンパク質濃縮物の静脈内輸血に限定されている。しかしながら、時間および費用の実用的な不利益に追加して、血液濃縮物の輸血は、ウイルス性肝炎、後天性免疫不全症候群または血栓塞栓症のレシピエントへの感染のリスクを伴う。

第ＩＸ因子が治療的用途について重要でおよび有用な化合物である一方、組み換え細胞（米国特許第４，７７０，９９９号明細書）からの第ＩＸ因子の産生についての現在の方法は、かなり短い生物学的半減期と、免疫原性、機能の損失、同一の効果等を達成するために多量でおよびより頻繁な投与量の両方に対する要求の増加を潜在的に導く不正確なグリコシル化パターンとを有する産生物をもたらす

治療的目的のために用いられる組み換え型第ＩＸ因子の有効性を向上させるために、本発明は、グリコシル化および非グリコシル化第ＩＸ因子ペプチドのポリマー、例えば、ＰＥＧ（ｍ−ＰＥＧ）、ＰＰＧ（ｍ−ＰＰＧ）等との複合体を提供する。複合体は、治療的部位、診断上の部位、標的指向化部位等などの多様な種でのさらなる複合化によって追加的にまたは代替的に変性され得る。

本発明の複合体は、変性糖質の、グリコシル化または非グリコシル化ペプチドとの酵素反応によって形成される。グリコシル化サイトおよび／またはグリコシル残基は、例えばグリコ複合化により、変性基を有する糖質をペプチドに複合化させるための座位を提供する。例示的変性基は、ポリ（エチレングリコール）、例えば、メトキシ−ポリ（エチレングリコール）などの水溶性ポリマーである。例えば、水溶性ペプチドでの、第ＩＸ因子ペプチドの変性は、組み換え型第ＩＸ因子の患者の循環系中における安定性および滞留時間を向上させ、および／または組み換え型第ＩＸ因子の抗原性を低減させることができる。

本発明の方法は、実質的に均質な誘導体化パターンを有するペプチド複合体の構築を可能とする。本発明において用いられる酵素は、一般に、特定のアミノ酸残基、アミノ酸残基の組み合わせ、またはペプチドの特定のグリコシル残基について選択的である。方法はまた、変性ペプチド複合体の大規模生産に実用的である。それ故、本発明の方法は、予め選択された均一な誘導体化パターンを有するグリコペプチドの大規模な調製についての実用的な手段を提供する。

本発明はまた、例えば、低減されたクリアランス速度、または低減された免疫系または細胞内皮系（ＲＥＳ）による摂取速度に起因する長期化された治療的半減期を有するグリコシル化および非グリコシル化ペプチドの複合体を提供する。しかも、本発明の方法は、ペプチド上の抗原性決定因子をマスクする手段を提供し、それ故、ペプチドに対する宿主免疫応答を低減しまたは排除する。標的指向化剤の選択的結合はまた、ペプチドを、特定の標的指向化剤について特異的である特定の組織または細胞表面受容体に標的化させるために用いられることができる。

ペプチド複合体
ＦＩＸペプチドおよび水溶性ポリマー、例えばＰＥＧの間の複合体は、標準凝固アッセイにおいて、関連する非複合化ＦＩＸペプチドより有効性に著しく劣ることが知られている。それ故、水溶性ポリマーと複合化されたＦＩＸペプチドが、凝固アッセイにおいて、関連する非複合化ＦＩＸと比して著しく増強された活性を有することの発見は、重要で、かつ驚くべき結果である。本発明は、関連する非複合化ＦＩＸペプチドと比して標準凝固アッセイにおいて増強された活性を示す、水溶性ポリマーを有するＦＩＸ複合体を提供する。

それ故、第１の態様において、本発明は、水溶性ポリマーと複合化されていないＦＩＸペプチドのものと比して増強された凝固活性度を有する、ＦＩＸペプチドおよび水溶性ポリマーの間の複合体を提供する。好ましい実施形態において、非複合化ペプチドおよび複合体のペプチドは、同等のアミノ酸配列を有する。他の好ましい実施形態において、複合化および非複合化ペプチドは、約９０％を超えて相同的、好ましくは、約９５％を超えて相同的、より好ましくは、約９７％を超えて相同的およびさらに好ましくは、約９９％を超えて相同的である。

好ましい実施形態において、水溶性ポリマーは、直鎖または分岐ＰＥＧである。複合体が、１ペプチド当たり１〜約９のＰＥＧ部位を含むことが一般に好ましい。好ましい実施形態において、水溶性ポリマーは直鎖ＰＥＧであり、複合体は１ペプチド分子当たりおよそ６〜８ＰＥＧ部位を含む。他の好ましい実施形態において、水溶性ポリマーは分岐ＰＥＧであり、複合体はペプチド分子当たりおよそ１〜５のＰＥＧ部位を含む。

ＰＥＧが直鎖種である例示的実施形態において、ＰＥＧ部位は、約２００Ｄ〜約２０ｋＤの分子量を有する。ＰＥＧ部位が直鎖ＰＥＧ部位である好ましい実施形態において、直鎖ＰＥＧの分子量は、少なくとも約２００Ｄ、より好ましくは少なくとも約５００Ｄ、さらに好ましくは少なくとも約１ｋＤ、より好ましくは少なくとも約２ｋＤである。

ＰＥＧ種が分岐である他の例示的実施形態において、分岐ＰＥＧは２〜６つの直鎖ＰＥＧアームを含む。例証的なＰＥＧアームは、約２００Ｄ〜約３０ｋＤの分子量を有する。各アームは個別に選択された、少なくとも約２ｋＤ、好ましくは少なくとも約５ｋＤ、より好ましくは少なくとも約１０ｋＤ、さらにより好ましくは少なくとも約１５ｋＤの分子量を有することが一般に好ましい。

好ましいＰＥＧ種は、２つのＰＥＧアームを有する。本発明の２−アーム分岐構造の好ましい実施形態は、アミノ酸に基づいている。好ましいアミノ酸としては、セリン、システインおよびリシンが挙げられる。

好ましい実施形態において、本発明のＦＩＸ複合体は、インビボ凝固アッセイにおいて、２４時間時点で、同等の非複合化ペプチドの活性より少なくとも約１５％大きいインビボ凝固活性度を有する。本発明の好ましい第ＩＸ因子複合体は、少なくとも約４０％、好ましくは少なくとも約６０％、より好ましくは少なくとも約８０％、さらに好ましくは少なくとも約１００％、さらにより好ましくは少なくとも約１５０％、およびさらに好ましくは少なくとも約２００％で、同等の非複合化ペプチドを超えて増強された凝固活性度を２４時間時点で示す。

本発明の好ましい複合体は１〜４つの分岐ＰＥＧ部位を含み、この分岐ＰＥＧは、アミノ酸に基づいている（すなわち、ＰＥＧアームは、アミノ酸コアに共有結合的にリンクされている）。この複合体は、好ましくは、２４時間時点で、少なくとも約１００％、好ましくは少なくとも約１２０％、より好ましくは少なくとも約１４０％、さらにより好ましくは少なくとも約１６０％、さらに好ましくは少なくとも約１８０％およびより好ましくは少なくとも約２００％で、同等の非複合化ＦＩＸペプチドの活性を超えて増強された活性を、同一のアッセイにおいて有する。この実施形態において、分岐ＰＥＧ種は、少なくとも約１５ｋＤ、好ましくは少なくとも約２０ｋＤ、およびより好ましくは少なくとも約３０ｋＤの分子量を有する。好ましい分岐ＰＥＧ種は、約３０ｋＤの分子量を有し、さらに好ましくは、分岐ＰＥＧ種はリシン、セリンおよびシステインから選択されるメンバーであるアミノ酸に共有結合的に結合された２つの直鎖ＰＥＧ部位を含む。各分岐ＰＥＧ部位は、第ＩＸ因子ペプチドのアミノ酸またはグリコシル残基に共有結合的に結合されている。

本発明の他の好ましい複合体は、５〜９つ、より好ましくは、６〜８つの直鎖ＰＥＧ部位を含む。この実施形態において、ＰＥＧ部位は、少なくとも約５００Ｄ、好ましくは少なくとも約１ｋＤ、より好ましくは少なくとも約１．５ｋＤおよび、さらにより好ましくは少なくとも約２ｋＤである分子量を有する。直鎖ＰＥＧ部位は、ペプチドのアミノ酸またはグリコシル残基に共有結合的に複合化されている。この実施形態による複合体は、好ましくは、同等の非複合化ＦＩＸペプチドに比して、少なくとも約１５％、好ましくは少なくとも約２５％、より好ましくは少なくとも約３５％、さらに好ましくは少なくとも約４５％、およびさらにより好ましくは少なくとも約６０％増強された活性を、同一のアッセイにおいて有する。

他の好ましい実施形態において、分岐または直鎖ＰＥＧ種は、ペプチドのアミノ酸またはグリコシル残基に共有結合的に結合されている。ＰＥＧ種は、好ましくは、グリコシル残基のシアル酸部位に結合されている。ＰＥＧ種がアミノ酸に結合されている場合、これらは好ましくは、リシン、アスパラギン、セリンおよびスレオニンから選択されるメンバーであるアミノ酸にリンカー部位を介して結合されている。一般に好ましいリンカー構造は、少なくとも１つのグリコシル部位を含む。リンキング基がグリコシル残基であるか、または少なくとも１つのグリコシル部位を含む追加の実施形態は、以下のセクションにおいて詳細に考察されている。

好ましい実施形態において、水溶性ポリマーは、ｒｈＦＩＸのＡｓｎ１５７、Ａｓｎ１６７；Ｓｅｒ５３、Ｓｅｒ６１、Ｔｈｒ１５９、Ｔｈｒ１６９、およびＴｈｒ１７２から選択されるメンバーに結合されている。

複合化および非複合化ペプチドの凝固活性は、技術分野で標準の凝固アッセイ方法、例えば、標準マウステールカットアッセイ、ａＰＴＴアッセイ等を用いて、容易におよび規定どおりに計測される。

他の好ましい実施形態において、複合化ＦＩＸペプチドは、同等の非複合化ＦＩＸペプチドの終末半減期より、少なくとも約１０％大きい、好ましくは少なくとも約３０％大きい、より好ましくは少なくとも約５０％大きい、さらにより好ましくは少なくとも約７０％大きい、およびさらに好ましくは少なくとも約１００％大きい終末半減期を有する。

本願明細書において考察される本発明の態様および実施形態の各々において、第ＩＸ因子ペプチドは野生型ＦＩＸペプチドと同一の配列を有し得、または変異ペプチドであり得る。ペプチド複合体は、数々の形態の１つを有することができる。例示的実施形態において、ペプチド複合体は、第ＩＸ因子ペプチドと、ペプチドのアミノ酸にリンクされた変性基を含むことができる。例示的実施形態において、この変性基は第ＩＸ因子ペプチドにグリコシルリンキング基を介して結合されている。

それ故、第２の態様において、本発明は、変性糖質および第ＩＸ因子ペプチドの複合体を提供する。

例示的実施形態において、グリコシル基は無傷のグリコシルリンキング基である。他の例示的実施形態において、グリコシル基は、さらに変性基を含む。他の例示的実施形態において、変性基は、非グリコシド変性基である。他の例示的実施形態において、変性基は天然に生じるサッカライド部位を含まない。

他の例示的実施形態において、ペプチド複合体は、第ＩＸ因子ペプチドと、グリコペプチド炭水化物および直接的にペプチド主鎖のアミノ酸残基の両方に結合しているグリコシルリンキング基とを含むことができる。さらに他の例示的実施形態において、ペプチド複合体は、第ＩＸ因子ペプチドと、ペプチドのアミノ酸残基に直接的にリンクされた変性基とを含むことができる。この実施形態において、ペプチド複合体はグリコシル基を含まなくてもよい。これらの実施形態のいずれかにおいて、第ＩＸ因子ペプチドは、グリコシル化されていてもいなくてもよい。本発明はまた、第ＩＸ因子のグリカン構造を変性して、第ＩＸ因子および変性基の間の複合体を提供する方法を包含する。

本発明の複合体は、典型的には以下の一般構造に関連することとなる。

式中、符号ａ、ｂ、ｃ、ｄおよびｓは、正の、ゼロではない整数を表し、およびｔは、０または正の整数である。「剤」は、治療的剤、生理活性剤、可検出標識、水溶性部位（例えば、ＰＥＧ、ｍ−ＰＥＧ、ＰＰＧ、およびｍ−ＰＰＧ）等である。「剤」は、ペプチド、例えば、酵素、抗体、抗原等であることができる。リンカーは、以下のリンキング基の広いアレイのいずれかであることができる。あるいは、リンカーは、単結合または「ゼロオーダーリンカー」であり得る。

第ＩＸ因子ペプチド
第ＩＸ因子はクローン化されおよび配列されている。基本的に、あらゆる配列を有するあらゆる第ＩＸ因子ペプチドが、本発明の複合体の第ＩＸ因子ペプチド成分として用いられる。例示的実施形態において、ペプチドは、本願明細書において配列番号１として表される配列を有する。

本発明は、本願明細書に規定の配列によってはいかなる方法においても限定されない。第ＩＸ因子変異体は、例えば、チロシンが第１の位置においてアラニンによって置き換えられる米国特許第４，７７０，９９９号明細書、米国特許第５，５２１，０７０号明細書、第ＩＸ因子がアルキレンオキシド基にリンクされている米国特許第６，０３７，４５２号明細書、およびＤＮＡコード化第ＩＸ因子が少なくとも１つのスプライスサイトにおいて変性されている米国特許第６，０４６，３８０号明細書に記載されているとおり、技術分野において周知である。本願明細書において実施されているとおり、第ＩＸ因子の変異体は技術分野において周知であり、本開示は、公知の、または将来開発あるいは発見されるこれらの変異体を包含する。

変異または変性第ＩＸ因子の活性を測定する方法は、例えば、ビッグス（Ｂｉｇｇｓ）、「Ｈｕｍａｎ Ｂｌｏｏｄ Ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ ａｎｄ Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ（第１版）」、オックスフォード（Ｏｘｆｏｒｄ）、ブラックウェル（Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ）、サイエンティフィック（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、６１４ページ（１９７２年）に記載の１段活性化部分トロンボプラスチン時間アッセイなどの、技術分野において記載の方法を用いて行うことができる。簡潔には、本発明の方法に従って開発された第ＩＸ因子分子の生物活性をアッセイするためには、アッセイは、同量の活性化部分トロンボプラスチン試薬、血友病Ｂを有する患者から技術分野において周知である無菌瀉血技術を用いて単離された第ＩＸ因子欠乏プラズマ、およびサンプルまたは標準としてプールされた通常のプラズマで実施されることができる。このアッセイにおいては、１ｕｎｉｔ（単位）の活性は、１ミリリットルの通常のプールされたプラズマに存在する量として定義される。さらに、第ＩＸ因子の、第ＩＸ因子欠乏患者からのプラズマの凝固時間を通常に低減させる能力に基づいた生物活性についてのアッセイは、例えば、プロクター（Ｐｒｏｃｔｏｒ）およびラパポート（Ｒａｐａｐｏｒｔ）（「Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈ．」３６：２１２（１９６１年））に記載のとおり実施することができる。

本発明のペプチドは、少なくとも１つのＮ結合またはＯ結合グリコシル化サイトを含み、その少なくとも１つは、例えばＰＥＧ部位といった高分子変性部位を含むグリコシル残基に複合化されている。例示的実施形態において、ＰＥＧは、ペプチドに、無傷のグリコシルリンキング基を介して共有結合的に結合されている。グリコシルリンキング基は、ペプチドのアミノ酸残基またはグリコシル残基の一方に共有結合的に結合されている。あるいは、グリコシルリンキング基は、グリコペプチドの１つまたは複数のグリコシル単位に結合されている。本発明はまた、グリコシルリンキング基が、アミノ酸残基およびグリコシル残基の両方に結合された複合体を提供する。

好ましくは、第ＩＸ因子ペプチドのアミノまたはカルボキシ終端のいずれも高分子変性部位で誘導体化されない。

変性糖質
例示的実施形態において、本発明のペプチドは変性糖質と反応して、それ故ペプチド複合体を形成する。変性糖質は、「糖質供与部位」ならびに「糖質転移部位」を含む。糖質供与部位は、本発明の複合体として、ペプチドに、グリコシル部位またはアミノ酸部位の一方を介して結合されることとなる変性糖質のいずれかの部分である。糖質供与部位は、変性糖質からペプチド複合体のグリコシルリンキング基へのそれらの転換中に化学的に変質される原子を含む。糖質転移部位は、本発明の複合体として、ペプチドに結合されることとならない変性糖質のいずれかの部分である。例えば、本発明の変性糖質は、ペグ化糖質ヌクレオチド、ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧである。ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧについて、糖質供与部位（またはＰＥＧ−シアリル供与部位）はＰＥＧ−シアル酸を含む一方で、糖質転移部位（またはシアリル転移部位）はＣＭＰを含む。

本発明において用いられる変性糖質において、糖部位は、好ましくはサッカライド、デオキシ−サッカライド、アミノ−サッカライド、またはＮ−アシルサッカライドである。用語「サッカライド」およびその均等物、「サッカリル」、「糖質」、および「グリコシル」は、モノマー、ダイマー、オリゴマーおよびポリマーを指す。糖質部位はまた、変性基で官能基化されている。変性基は、糖部位、典型的には、糖質上のアミン、スルフヒドリルまたはヒドロキシル（例えば第１級ヒドロキシル）部位での複合化を介して複合化されている。例示的実施形態において、変性基は、糖質上のアミン部位、例えば、アミンと変性基の反応性誘導体との反応を介して形成されるアミド、ウレタンまたはウレアを介して結合されている。

いずれかの糖部位が、変性糖質の糖質供与部位として利用される。糖部位は、マンノース、ガラクトースまたはグルコース、または公知の糖質の立体化学を有する種などの公知の糖質であることができる。これらの変性糖質の一般式は以下である。

本発明の組成物の形成に有用である他の糖部位としては、限定されないが、フコースおよびシアル酸、ならびにグルコサミン、ガラクトサミン、マンノサミン、シアル酸の５−アミンアナログなどのアミノ糖等が挙げられる。糖部位は、自然に見出される構造であることができ、または変性されて変性基を複合化させるためのサイトを提供することができる。例えば、一実施形態においては、変性糖質は、９−ヒドロキシ部位がアミンと置き換えられたシアル酸誘導体を提供する。アミンは、選択された変性基の活性化アナログで容易に誘導体化される。

本発明において用いられる変性糖質の例が、本願明細書において参照により援用される国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ０５／００２５２２号明細書に記載されている。

さらなる例示的実施形態において、本発明は、上述のものなどのリンカー−変性基カセットを有する、６−ヒドロキシル位置が関連するアミン部位に転化された変性糖質を用いる。これらの変性糖質のコアとして用いられることができる例証的なグリコシル基としては、Ｇａｌ、ＧａｌＮＡｃ、Ｇｌｃ、ＧｌｃＮＡｃ、Ｆｕｃ、Ｘｙｌ、Ｍａｎ等が挙げられる。この実施形態による代表的な変性糖質は式

を有し、式中、Ｒ^１１〜Ｒ^１４は、Ｈ、ＯＨ、Ｃ（Ｏ）ＣＨ_３、ＮＨ_、およびＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ_３から独立に選択されるメンバーである。Ｒ^１０は、第ＩＸ因子および／または第ＩＸ因子ペプチド（−ＮＨ−（第ＩＸ因子および／または第ＩＸ因子））の他のグリコシル残基（−Ｏ−グリコシル）またはアミノ酸への結合（リンク）である。Ｒ^１４は、ＯＲ^１、ＮＨＲ^１またはＮＨ−Ｌ−Ｒ^１である。Ｒ^１およびＮＨ−Ｌ−Ｒ^１は上記のとおりである。

グリコシルリンキング基
例示的実施形態において、本発明は、本発明の変性糖質および第ＩＸ因子ペプチドの間に形成されるペプチド複合体を提供する。この実施形態において、変性糖質の糖質供与部位（糖部位および変性基などの）は、「グリコシルリンキング基」となる。あるいは、「グリコシルリンキング基」はペプチドおよび変性基の間に挿入されたグリコシル部位を指すことができる。

ペプチド上のグリコシル残基を付加および／または変性するために利用可能である方法の多用途性のために、グリコシルリンキング基は、実質的にいずれの構造も有することができる。以下の考察において、本発明は、フラノースおよびピラノースの選択された誘導体の使用に対する参照により例示される。当業者は、考察の焦点は例示の簡潔性についてであり、規定の構造および組成物はグリコシルリンキング基および変性糖質の属にわたって一般に適用可能であることを認識するであろう。グリコシルリンキング基は、事実上いずれのモノ−またはオリゴ糖を含むこともできる。グリコシルリンキング基は、アミノ酸に、側鎖またはペプチド主鎖の一方を介して結合されることができる。あるいはグリコシルリンキング基は、ペプチドに、糖部位を介して結合されることができる。この糖部位は、第ＩＸ因子ペプチド上のＯ結合またはＮ結合グリカン構造の部分であることができる。

例示的実施形態において、本発明は、式：

を有するグリコシルリンキング基を用い、式中、Ｊはグリコシル部位であり、Ｌは結合またはリンカーであり、およびＲ^１は変性基、例えば高分子変性基である。例証的な結合は、グリコシル部位上のＮＨ_２部位と、変性基上の補完的な反応性基との間に形成されるものである。例えば、Ｒ^１がカルボン酸部位を含む場合、この部位は、グリコシル残基上のＮＨ_２部位と活性化およびカップリングされて、構造ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ^１を有する結合をもたらし得る。Ｊは、好ましくは、例えば酸化性状態（例えば過ヨウ素酸ナトリウム）といった、ピラノースまたはフラノース構造を開裂させる状態に露出されることによって分解されていない、「無傷の」グリコシル部位である。

例証的なリンカーとしては、アルキルおよびヘテロアルキル部位が挙げられる。リンカーとしては、リンキング基、例えばアシル−ベースのリンキング基、例えば、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−、−ＯＣ（Ｏ）ＮＨ−等が挙げられる。リンキング基は、本発明の種の成分間、例えば、グリコシル部位およびリンカー（Ｌ）の間、またはリンカーおよび変性基（Ｒ^１）の間に形成される結合である。他の例示的リンキング基は、エーテル、チオエーテルおよびアミンである。例えば、一実施形態においては、リンカーは、グリシン残基などのアミノ酸残基である。グリシンのカルボン酸部位は、グリコシル残基上のアミンとの反応によって関連するアミドに転化され、およびグリシンのアミンは、変性基の活性化カルボン酸またはカーボネートとの反応によって関連するアミドまたはウレタンに転化される。

ＮＨ−Ｌ−Ｒ^１の例示的種は式：−ＮＨ｛Ｃ（Ｏ）（ＣＨ_２）_ａＮＨ｝_ｓ｛Ｃ（Ｏ）（ＣＨ_２）_ｂ（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｃＯ（ＣＨ_２）_ｄＮＨ｝_ｔＲ^１を有し、式中、指数ｓおよびｔは独立に０または１である。指数ａ、ｂおよびｄは、独立に０〜２０の整数であり、ｃは１〜２５００の整数である。他の類似のリンカーは、−ＮＨ部位が他の基、例えば−Ｓ、−Ｏまたは−ＣＨ_２によって置き換えられた種に基づいている。当業者認識するであろうとおり、指数ｓおよびｔに関連する括弧付きの部位の１つまたは複数は、置換または非置換のアルキルまたはヘテロアルキル部位で置き換えられることができる。

より具体的には、本発明は、ＮＨ−Ｌ−Ｒ^１が：ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ_２）_ａＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ_２）_ｂ（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｃＯ（ＣＨ_２）_ｄＮＨＲ^１、ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ_２）_ｂ（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｃＯ（ＣＨ_２）_ｄＮＨＲ^１、ＮＨＣ（Ｏ）Ｏ（ＣＨ_２）_ｂ（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｃＯ（ＣＨ_２）_ｄＮＨＲ^１、ＮＨ（ＣＨ_２）_ａＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ_２）_ｂ（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｃＯ（ＣＨ_２）_ｄＮＨＲ^１、ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ_２）_ａＮＨＲ^１、ＮＨ（ＣＨ_２）_ａＮＨＲ^１、およびＮＨＲ^１である化合物を用いる。これらの式において、指数ａ、ｂおよびｄは、独立に、０〜２０、好ましくは１〜５の整数から選択される。指数ｃは、１〜約２５００の整数である。

例示的実施形態において、ｃは、ＰＥＧ部位がおよそ１ｋＤ、５ｋＤ、１０ｋＤ、１５ｋＤ、２０ｋＤ、２５ｋＤ、３０ｋＤ、３５ｋＤ、４０ｋＤ、４５ｋＤ、５０ｋＤ、５５ｋＤ、６０ｋＤまたは６５ｋＤであるよう選択される。

簡便のために、このセクションの残りの部分において、グリコシルリンキング基はシアリル部位に基づくであろう。しかしながら、当業者は、マンノシル、ガラクトシル、グルコシル、またはフコシルなどの他のグリコシル部位が、シアリル部位の代わりに用いられることが可能であることを認めるであろう。

例示的実施形態において、グリコシルリンキング基は無傷のグリコシルリンキング基であり、ここで、グリコシル部位またはリンキング基を形成する部位は、化学的（例えば、メタ過ヨウ素酸ナトリウム）または酵素的（例えば、オキシダーゼ）プロセスによっては分解されていない。本発明の選択された複合体は、アミノ−サッカライド、例えば、マンノサミン、グルコサミン、ガラクトサミン、シアル酸等のアミン部位、に結合された変性基を含む。例示的実施形態において、本発明は、

から選択される式を有する無傷のグリコシルリンキング基を含むペプチド複合体を提供する。

式Ｉにおいて、Ｒ^２はＨ、ＣＨ_２ＯＲ^７、ＣＯＯＲ^７またはＯＲ^７であり、ここでＲ^７は、Ｈ、置換または非置換のアルキルまたは置換または非置換のヘテロアルキルを表す。ＣＯＯＲ^７がカルボン酸またはカーボキシレートである場合、両方の形態は、単一構造ＣＯＯ⁻またはＣＯＯＨの指名によって表される。式ＩおよびＩＩにおいて、符号Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｒ^６およびＲ^６’は、独立に、Ｈ、置換または非置換のアルキル、ＯＲ^８、ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ^９を表す。指数ｄは０または１である。Ｒ^８およびＲ^９は、Ｈ、置換または非置換のアルキル、置換または非置換のヘテロアルキル、シアル酸またはポリシアル酸から独立に選択される。Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｒ^６またはＲ^６’の少なくとも１つは変性基を含む。この変性基は、結合またはリンキング基を介してリンクされた、高分子変性部位、例えば、ＰＥＧであることができる。例示的実施形態において、Ｒ^６およびＲ^６’は、これらが結合している炭素と共に、シアル酸のピルビル側鎖の成分である。さらなる例示的実施形態において、ピルビル側鎖は、高分子変性基で官能基化されている。他の例示的実施形態において、Ｒ^６およびＲ^６’は、それらが結合している炭素と共にシアル酸の側鎖の成分であり、高分子変性基は、Ｒ^５の成分である。

このモチーフによる例証的な変性基−無傷のグリコシルリンキング基カセットは、式：

を有するものなどの、シアル酸構造に基づいている。

上記の式において、Ｒ^１およびＬは上記のとおりである。例示的Ｒ^１基の構造についてのさらなる詳細は以下に提供されている。

さらなる例示的実施形態において、複合体は、ペプチドおよび変性糖質の間に形成され、ここで、変性基が、リンカーを介して、変性糖質の６−炭素位置で結合されている。それ故、この実施形態による例示的グリコシルリンキング基は、式：

を有し、式中、ラジカルは、上記に考察されているとおりである。グリコシルリンキング基としては、限定されないが、グルコース、グルコサミン、Ｎ−アセチル−グルコサミン、ガラクトース、ガラクトサミン、Ｎ−アセチル−ガラクトサミン、マンノース、マンノサミン、Ｎ−アセチル−マンノサミン等が挙げられる。

一実施形態においては、本発明は、以下のグリコシルリンキング基：

を含むペプチド複合体を提供し、式中、Ｄは、−ＯＨおよびＲ^１Ｌ−ＨＮ−から選択されるメンバーであり；Ｇは、ＨおよびＲ^１−Ｌ−および−Ｃ（Ｏ）（Ｃ_１〜Ｃ_６）アルキルから選択されるメンバーであり；Ｒ^１は、直鎖または分岐ポリ（エチレングリコール）残基を含む部位であり；およびＬはリンカー、例えば、結合（「ゼロオーダー」）、置換または非置換のアルキルおよび置換または非置換のヘテロアルキルである。例示的実施形態において、ＤがＯＨであるとき、ＧはＲ^１−Ｌ−であり、およびＧが−Ｃ（Ｏ）（Ｃ_１〜Ｃ_６）アルキルであるとき、ＤはＲ^１Ｌ−ＮＨ−である。

本発明は、式：

を有するグリコシルリンキング基を含むペプチド複合体を提供する。

他の実施形態において、グリコシルリンキング基は、式：

を有し、式中、指数ｔは０または１である。

さらなる例示的実施形態において、グリコシルリンキング基は、式：

を有し、式中、指数ｔは０または１である。

他の実施形態において、グリコシルリンキング基は、式：

を有し、式中、指数ｐは、１〜１０の整数を表し；およびａは０または１の一方である。

例示的実施形態において、本発明のグリコペグ化ペプチド複合体は、以下に規定の式から選択される。

上記の式において、指数ｔは０〜１の整数であり、および指数ｐは１〜１０の整数である。符号Ｒ^１５’は、Ｈ、ＯＨ（例えば、Ｇａｌ−ＯＨ）、シアリル部位、シアリルリンキング基（すなわち、シアリルリンキング基−高分子変性基（Ｓｉａ−Ｌ−Ｒ^１）、または、ポリマー変性シアリル部位が結合されたシアリル部位（例えば、Ｓｉａ−Ｓｉａ−Ｌ−Ｒ^１）（「Ｓｉａ−Ｓｉａ^ｐ」））を表す。例証的なポリマー変性糖部位は、式ＩおよびＩＩによる構造を有する。本発明の例示的ペプチド複合体は、式ＩまたはＩＩによる構造を含むＲ^１５’を有する少なくとも１つのグリカンを含むこととなる。式ＩおよびＩＩの開放原子価を有する酸素は、好ましくは、グリコシドリンケージを介して、ＧａｌまたはＧａｌＮＡｃ部位の炭素に結合されている。さらなる例示的実施形態において、酸素は、ガラクトース残基の３位で炭素に結合されている。例示的実施形態において、変性シアル酸は、α２，３−でガラクトース残基にリンクされている。他の例示的実施形態において、シアル酸は、α２，６−でガラクトース残基にリンクされている。

例示的実施形態において、シアリルリンキング基は、ポリマー変性シアリル部位が結合しているシアリル部位（例えば、Ｓｉａ−Ｓｉａ−Ｌ−Ｒ^１）（「Ｓｉａ−Ｓｉａ^ｐ」）である。ここで、グリコシルリンキング基は、ガラクトシル部位に、シアリル部位：

を介してリンクされている。

このモチーフによる例示的種は、Ｓｉａ−Ｌ−Ｒ^１をグリカンの末端シアル酸に、Ｓｉａ−Ｓｉａ結合を形成する酵素、例えばＣＳＴ−ＩＩ、ＳＴ８Ｓｉａ−ＩＩ、ＳＴ８Ｓｉａ−ＩＩＩおよびＳＴ８Ｓｉａ−ＩＶを用いて複合化することにより調製される。

他の例示的実施形態において、ペプチド複合体上のグリカンは、群：

およびこれらの組み合わせから選択される式を有する。

上記式の各々において、Ｒ^１５’は、上記に考察されたとおりである。しかも、本発明の例示的ペプチド複合体は、式ＩまたはＩＩによる構造を有するＲ^１５部位を有する少なくとも１つグリカンを含むであろう。

グリコシルリンキング基は、式：

を有する少なくとも１つのグリコシルリンキング基を含み、式中、Ｒ^１５は、前記シアリルリンキング基であり；および指数ｐは１〜１０から選択される整数である。

例示的実施形態において、グリコシルリンキング部位は、式：

を有し、式中、ｂは０〜１の整数である。指数ｓは１〜１０の整数を表し；および指数ｆは１〜２５００の整数を表す。

例示的実施形態において、高分子変性基はＰＥＧである。他の例示的実施形態において、ＰＥＧ部位は約２０ｋＤａの分子量を有する。他の例示的実施形態において、ＰＥＧ部位は、約５ｋＤａの分子量を有する。他の例示的実施形態において、ＰＥＧ部位は、約１０ｋＤａの分子量を有する。他の例示的実施形態において、ＰＥＧ部位は、約４０ｋＤａの分子量を有する。

例示的実施形態において、グリコシルリンキング基は直鎖１０ｋＤａ−ＰＥＧ−シアリルであり、これらのグリコシルリンキング基の１つまたは２つは、ペプチドに共有結合的に結合されている。例示的実施形態において、グリコシルリンキング基は、直鎖２０ｋＤａ−ＰＥＧ−シアリルであり、これらのグリコシルリンキング基の１つまたは２つは、ペプチドに共有結合的に結合されている。例示的実施形態において、グリコシルリンキング基は、直鎖５ｋＤａ−ＰＥＧ−シアリルであり、およびこれらのグリコシルリンキング基の１つ、２つまたは３つは、ペプチドに共有結合的に結合されている。例示的実施形態において、グリコシルリンキング基は直鎖４０ｋＤａ−ＰＥＧ−シアリルであり、これらのグリコシルリンキング基の１つまたは２つは、ペプチドに共有結合的に結合されている。

変性基
本発明のペプチド複合体は、変性基を含む。この基は、ＦＧＦペプチドに、アミノ酸またはグリコシルリンキング基を介して共有結合的に結合されていることができる。「変性基」は、標的指向化部位、治療的部位、生体分子を含む多様な構造を包含することができる。さらに、「変性基」は、生体利用率またはその生体における半減期などのペプチドの特性を変えることができる、ポリマーである高分子変性基を含む。

例示的実施形態において、変性基は、複合体の成分としての標的指向化剤の存在により、特定の組織に選択的に局在化させる標的指向化剤である。例示的実施形態において、標的指向化剤はタンパク質である。例証的なタンパク質としては、トランスフェリン（脳、血液プール）、ＨＳ−糖タンパク質（骨、脳、血液プール）、抗体（脳、抗体−特異的な抗原を有する組織、血液プール）、凝固因子Ｖ−ＸＩＩ（損傷された組織、凝血塊、癌、血液プール）、血清タンパク質、例えば、α−酸糖タンパク質、フェチュイン（ｆｅｔｕｉｎ）、α−胎児タンパク質（脳、血液プール）、β２−糖タンパク質（肝臓、動脈硬化プラーク、脳、血液プール）、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、およびＥＰＯ（免疫刺激、癌、血液プール、赤血球過剰産生、神経保護）、アルブミン（半減期の増加）、およびリポタンパク質Ｅが挙げられる。

簡便性の目的のため、このセクションの残りにおける変性基は、水溶性および水不溶性ポリマーなどの高分子変性基に大きく基づいていることとなる。しかしながら、当業者は、標的指向化部位、治療的部位および生体分子などの他の変性基が高分子変性基の代わりに用いることが可能であることを認めるであろう。

変性基のリンカー
変性基のリンカーは、変性基（すなわち高分子変性基、標的指向化部位、治療的部位および生体分子）をペプチドに結合させるために役立つ。例示的実施形態において、高分子変性基は、一般に、以下に記載のとおり、リンカー、Ｌを介してコア上に、ヘテロ原子、例えば窒素を介してグリコシルリンキング基に結合されている。

Ｒ^１は高分子部位であり、Ｌは結合およびリンキング基から選択される。指数ｗは、１〜６、好ましくは１〜３およびより好ましくは１〜２から選択される整数を表す。例証的なリンキング基としては、置換または非置換のアルキル、置換または非置換のヘテロアルキル部位およびシアル酸が挙げられる。リンカーの例示的成分はアシル部位である。

本発明による例示的化合物は、上記式ＩまたはＩＩによる例示的化合物を有し、ここで、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｒ^６またはＲ^６’の少なくとも１つが、式：

を有する。

この実施形態による他の例において、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｒ^６またはＲ^６’の少なくとも１つが、式：

を有し、式中、ｓは０〜２０の整数であり、およびＲ^１は直鎖高分子変性部位である。

例示的実施形態において、高分子変性基−リンカー構造は、中央部位に結合された２つ以上の高分子鎖を含む分岐構造である。この実施形態において、構造は、式：

を有し、式中、Ｒ^１およびＬは、上記に考察されているとおりでありおよびｗ’は２〜６、好ましくは２〜４およびより好ましくは２〜３の整数である。

Ｌが結合である場合、これは、Ｒ^１の前駆体上の反応性官能基と、サッカリルコア上の補完的な反応性基の反応性官能基との間に形成される。Ｌが非ゼロオーダーリンカーである場合、Ｌの前駆体は、Ｒ^１前駆体との反応前に、グリコシル部位にあることができる。あるいは、ＬおよびＲ^１の前駆体は、続いてグリコシル部位に結合される、予め形成されたカセットに組み込まれることができる。本願明細書に規定のとおり、前駆体の、適切な反応性官能基との選択および調製は、当業者の能力の範囲内である。しかも、前駆体のカップリングは、技術分野においてよく理解されている化学によって進行する。

例示的実施形態において、Ｌは、高分子変性基が置換アルキルリンカーを介して結合されている変性糖質を提供するアミノ酸、または小型ペプチド（例えば、１〜４つのアミノ酸残基）から形成されるリンキング基である。例証的なリンカーとしては、グリシン、リシン、セリンおよびシステインが挙げられる。ＰＥＧ部位は、リンカーのアミン部位に、アミドまたはウレタン結合を介して結合されることができる。ＰＥＧは、システインおよびセリンの硫黄または酸素原子に、チオエーテルまたはエーテル結合を介して、それぞれリンクされる。

例示的実施形態において、Ｒ^５は高分子変性基を含む。他の例示的実施形態において、Ｒ^５は、高分子変性基と、変性基を分子の残りに接合するリンカーＬとの両方を含む。上記に考察されているとおり、Ｌは、直鎖または分岐構造であることができる。同様に、高分子変性基は分岐または直鎖であることができる。

水溶性ポリマー
多くの水溶性ポリマーが、当業者に公知であり、本発明の実施において有用である。用語、溶性ポリマーは、サッカライド（例えば、デキストラン、アミロース、ヒアルロン酸、ポリ（シアル酸）、ヘパラン、ヘパリン等）；ポリ（アミノ酸）、例えば、ポリ（アスパラギン酸）およびポリ（グルタミン酸）；核酸；合成ポリマー（例えば、ポリ（アクリル酸）、ポリ（エーテル）、例えば、ポリ（エチレングリコール））；ペプチド、タンパク質等などの種を包含する。本発明は、いずれかの水溶性ポリマーで、ポリマーは複合体の残りが結合されることができる点を含まなければならないという唯一の限定を伴って、実施され得る。

ポリマーを活性化するための方法はまた、国際公開第９４／１７０３９号パンフレット、米国特許第５，３２４，８４４号明細書、国際公開第９４／１８２４７号パンフレット、国際公開第９４／０４１９３号パンフレット、米国特許第５，２１９，５６４号明細書、米国特許第５，１２２，６１４号明細書、国際公開第９０／１３５４０号パンフレット、米国特許第５，２８１，６９８号明細書、さらに国際公開第９３／１５１８９号パンフレットに見出すことができ、および活性化ポリマーとペプチドと間の複合化の方法は、例えば凝固第ＶＩＩＩ因子と（国際公開第９４／１５６２５号パンフレット）、ヘモグロビンと（国際公開第９４／０９０２７号パンフレット）、酸素担持分子と（米国特許第４，４１２，９８９号明細書）、リボヌクレアーゼおよびスーパーオキシドジスムターゼと（ベロネーゼ（Ｖｅｒｏｎｅｓｅ）ら、「Ａｐｐ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．」１１：１４１〜４５ページ（１９８５年））に見出すことができる。

例証的な水溶性ポリマーは、ポリマーのサンプル中の実質的な割合のポリマー分子がおよそ同一分子量である（このようなポリマーは「均一分散」されている）ものである。

本発明は、ポリ（エチレングリコール）複合体を参照することによりさらに例示される。ＰＥＧの官能化および複合化についての数々のレビューおよび専攻論文が入手可能である。例えば、ハリス（Ｈａｒｒｉｓ）、「Ｍａｃｒｏｎｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．」Ｃ２５：３２５〜３７３ページ（１９８５年）；スカウテン（Ｓｃｏｕｔｅｎ）、「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」１３５：３０〜６５ページ（１９８７年）；ウォン（Ｗｏｎｇ）ら、「Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈｎｏｌ」１４：８６６〜８７４ページ（１９９２年）；デルガド（Ｄｅｌｇａｄｏ）ら、「Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ」９：２４９〜３０４ページ（１９９２年）；ザリプスキー（Ｚａｌｉｐｓｋｙ）、「Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．」６：１５０〜１６５ページ（１９９５年）；およびバードラ（Ｂｈａｄｒａ）ら、「Ｐｈａｒｍａｚｉｅ」、５７：５〜２９ページ（２００２年）を参照のこと。反応性ＰＥＧ分子の調製および反応性分子を用いる複合体を形成するための経路は、技術分野において公知である。例えば、米国特許第５，６７２，６６２号明細書には、直鎖または分岐ポリ（アルキレンオキシド）、ポリ（オキシエチル化ポリオール）、ポリ（オレフィン性アルコール）、およびポリ（アクリロモルホリン）から選択されるポリマー酸の活性エステルの水溶性および単離可能な複合体が開示されている。

米国特許第６，３７６，６０４号明細書には、水溶性および非ペプチド性ポリマーの水溶性１−ベンゾトリアゾリルカーボネートエステルを、ポリマーの末端ヒドロキシルをジ（１−ベンゾトリアゾイル）カーボネートと有機溶剤中に反応させることにより調製する方法が記載されている。活性エステルが、タンパク質またはペプチドなどの生理活性剤で複合体を形成するために用いられる。

国際公開第９９／４５９６４号パンフレットは、生理活性剤と、ポリマー主鎖に安定リンケージを介してリンクされた少なくとも１つの終端を有するポリマー主鎖を含む活性化水溶性ポリマーとを含む複合体を記載しており、ここで、少なくとも１つの終端は、分岐部位にリンクされた近位反応性基を有する分岐部位を含み、ここで、生理活性剤は、近位反応性基の少なくとも１つにリンクされている。他の分岐ポリ（エチレングリコール）が、国際公開第９６／２１４６９号パンフレットに記載されており、米国特許第５，９３２，４６２号明細書には、反応性官能基を含む分岐終端を含む分岐ＰＥＧ分子で形成された複合体が記載されている。遊離反応性基が、タンパク質またはペプチドなどの生体活性種と反応して、ポリ（エチレングリコール）および生体活性種の間の複合体を形成するために利用可能である。米国特許第５，４４６，０９０号明細書には、二官能性ＰＥＧリンカーおよびペプチドを各ＰＥＧリンカー終端で有する複合体の形成におけるその使用が記載されている。

分解性ＰＥＧリンクを含む複合体が、国際公開第９９／３４８３３号パンフレット；および国際公開第９９／１４２５９号パンフレット、ならびに米国特許第６，３４８，５５８号明細書に記載されている。このような分解性リンケージは、本発明に適用可能である。

上記に規定されたポリマー活性化の技術分野で認識された方法が、本願明細書に規定の分岐ポリマーの形成において、およびまたはこれらの分岐ポリマーの他の種、例えば、糖質、糖質ヌクレオチド等への複合化のために、本発明のコンテクストにおいて用いられる。

例示的水溶性ポリマーは、ポリ（エチレングリコール）、例えば、メトキシ−ポリ（エチレングリコール）である。本発明において用いられるポリ（エチレングリコール）は、いずれの特定の形態または分子量範囲に限定されない。非分岐ポリ（エチレングリコール）分子について、分子量は、好ましくは、５００および１００，０００の間である。２０００〜６０，０００の分子量が好ましく用いられ、および約５，０００〜約４０，０００の分子量が好ましい。

他の例示的実施形態において、ポリ（エチレングリコール）分子は、以下から選択される。

他の実施形態において、ポリ（エチレングリコール）は、２つ以上の結合されたＰＥＧ部位を有する分岐ＰＥＧである。分岐ＰＥＧの例が、米国特許第５，９３２，４６２号明細書；米国特許第５，３４２，９４０号明細書；米国特許第５，６４３，５７５号明細書；米国特許第５，９１９，４５５号明細書；米国特許第６，１１３，９０６号明細書；米国特許第５，１８３，６６０号明細書；国際公開第０２／０９７６６号パンフレット；コデラ（Ｋｏｄｅｒａ）Ｙ．、「Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」５：２８３〜２８８ページ（１９９４年）；およびヤマサキ（Ｙａｍａｓａｋｉ）ら、「Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．」、５２：２１２５〜２１２７ページ、１９９８年に記載されている。好ましい実施形態において、分岐ＰＥＧの各ポリ（エチレングリコール）の分子量は、４０，０００ダルトン以下である。

代表的な高分子変性部位としては、例えば、セリン、システイン、リシン、および小型ペプチド、例えば、ｌｙｓ−ｌｙｓといった、側鎖含有アミノ酸に基づく構造が挙げられる。例証的な構造は：

を含む。

当業者は、ジリシン構造における遊離アミンはまた、アミドまたはウレタン結合を介してＰＥＧ部位でペグ化されることができることを認識するであろう。

他の実施形態において、高分子変性部位は、トリ−リシンペプチドに基づく分岐ＰＥＧ部位である。トリ−リシンは、モノ−、ジ−、トリ−、またはテトラ−ＰＥＧ化されていることができる。この実施形態による例証的な種は、式：

を有し、式中、指数ｅ、ｆ’およびｆは、１〜２５００の独立に選択される整数であり；および指数ｑ、ｑ’およびｑ’’は、１〜２０の独立に選択される整数である。

当業者に明らかであろうとおり、本発明において用いられる分岐ポリマーは、上記に規定のテーマ上のバリエーションを含む。例えば上記に示されるジリシンＰＥＧ複合体は、３つの高分子サブユニットを含むことができ、第３のものは、上の構造においては非変性であるとして示される□−アミンに結合されている。同様に、所望の方法により高分子変性部位で標識化された３つまたは４つの高分子サブユニットで官能基化されたトリ−リシンの使用は、本発明の範囲内にある。

本願明細書において考察されるところ、本発明の複合体において用いられるＰＥＧは直鎖または分岐であることができる。本発明のこの実施形態によるペプチド複合体を含有する分岐ＰＥＧの形成に用いられる例示的前駆体は、式：

を有する

本発明のこの実施形態によるペプチド複合体を含有する分岐ＰＥＧの形成に用いられる他の例示的前駆体は、式：

を有し、式中、指数ｍおよびｎは、０〜５０００から独立に選択される整数である。Ａ^１、Ａ^２、Ａ^３、Ａ^４、Ａ^５、Ａ^６、Ａ^７、Ａ^８、Ａ^９、Ａ^１０およびＡ^１１は、Ｈ、置換または非置換のアルキル、置換または非置換のヘテロアルキル、置換または非置換のシクロアルキル、置換または非置換のヘテロシクロアルキル、置換または非置換のアリール、置換または非置換のヘテロアリール、−ＮＡ^１２Ａ^１３、−ＯＡ^１２および−ＳｉＡ^１２Ａ^１３から独立に選択されるメンバーである。Ａ^１２およびＡ^１３は、置換または非置換のアルキル、置換または非置換のヘテロアルキル、置換または非置換のシクロアルキル、置換または非置換のヘテロシクロアルキル、置換または非置換のアリール、および置換または非置換のヘテロアリールから独立に選択されるメンバーである。

この式による分岐ポリマー種は、基本的に純粋な水溶性ポリマーである。Ｘ^３’は、イオン化性（例えば、ＯＨ、ＣＯＯＨ、Ｈ_２ＰＯ_４、ＨＳＯ_３、ＮＨ_２、およびこれらの塩等）または例えば前記の他の反応性官能基を含む部位である。Ｃは炭素である。Ｘ^５、Ｒ^１６およびＲ^１７は、非反応性基（例えば、Ｈ、非置換アルキル、非置換ヘテロアルキル）および高分子アーム（例えば、ＰＥＧ）から独立に選択される。Ｘ^２およびＸ^４は、同一のまたは異なり得る、好ましくは基本的に、生理学的状態下で非反応性であるリンケージ断片である。例示的リンカーは芳香族またはエステル部位のいずれも含まない。あるいは、これらのリンケージは、生理学的に関連性のある状態下、分解されると設計されている１つまたは複数の部位、例えば、エステル、ジスルフィド等を含むことができる。Ｘ^２およびＸ^４は、高分子アームＲ^１６およびＲ^１７をＣに接合する。Ｘ^３’がリンカー、糖質またはリンカー−糖質カセット上の補完的な反応性基の反応性官能基と反応されるとき、Ｘ^３’は、リンケージ断片Ｘ^３の成分に転化される。

Ｘ^２、Ｘ^３およびＸ^４についての例証的なリンケージ断片は独立に選択され、およびＳ、ＳＣ（Ｏ）ＮＨ、ＨＮＣ（Ｏ）Ｓ、ＳＣ（Ｏ）Ｏ、Ｏ、ＮＨ、ＮＨＣ（Ｏ）、（Ｏ）ＣＮＨおよびＮＨＣ（Ｏ）Ｏ、およびＯＣ（Ｏ）ＮＨ、ＣＨ_２Ｓ、ＣＨ_２Ｏ、ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ、ＣＨ_２ＣＨ_２Ｓ、（ＣＨ_２）_ｏＯ、（ＣＨ_２）_ｏＳまたは（ＣＨ_２）_ｏＹ’−ＰＥＧを含み、ここで、Ｙ’は、Ｓ、ＮＨ、ＮＨＣ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、ＮＨＣ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）ＮＨ、またはＯであり、ｏは、１〜５０の整数である。例示的実施形態において、リンケージ断片Ｘ^２およびＸ^４は異なるリンケージ断片である。

例示的実施形態において、前駆体（式ＩＩＩ）、またはその活性化誘導体は、活性化糖質または糖質ヌクレオチドと、Ｘ^３’と例えば、アミンといった、糖質部位上の補完的な反応性基の基との反応を介して反応され、およびこれにより糖質と結合される。あるいは、Ｘ^３’は、リンカーＬへの前駆体上の反応性官能基と反応される。式ＩおよびＩＩのＲ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｒ^６またはＲ^６’の１つまたは複数は、分岐高分子変性部位を含むことができ、またはこの部位はＬを介して結合されている。

例示的実施形態において、部位：

は、リンカーアームＬである。この実施形態において、例示的リンカーは、天然または非天然アミノ酸、アミノ酸アナログまたはアミノ酸模倣薬、または１つまたは複数のこのような種から形成される小型ペプチドから誘導される。例えば、本発明の化合物において見出される一定の分岐ポリマーは、式：

を有する。

Ｘ^ａは、分岐高分子変性部位の前駆体の反応性官能基、例えば、Ｘ^３’および糖質部位上の反応性官能基、またはリンカーへの前駆体の反応によって形成されるリンケージ断片である。例えば、Ｘ^３’がカルボン酸である場合、これは活性化され、および直接的に、アミノ−サッカライド（例えば、Ｓｉａ、ＧａｌＮＨ_２、ＧｌｃＮＨ_２、ＭａｎＮＨ_２等）から側鎖であるアミン基に結合されて、アミドであるＸ^ａを形成することができる。追加の例示的反応性官能基および活性化前駆体が、本明細書において以下に記載されている。指数ｃは１〜１０の整数を表す。他の符号は、上記に考察されたものと同一である。

他の例示的実施形態において、Ｘ^ａは、他のリンカー：

で形成されるリンキング部位であり、式中、Ｘ^ｂは第２のリンケージ断片であり、Ｘ^ａについて規定された群のものからから独立に選択され、および、Ｌと同様に、Ｌ^１は結合、置換または非置換のアルキルまたは置換または非置換のヘテロアルキルである。

Ｘ^ａおよびＸ^ｂについての例証的な種としては、Ｓ、ＳＣ（Ｏ）ＮＨ、ＨＮＣ（Ｏ）Ｓ、ＳＣ（Ｏ）Ｏ、Ｏ、ＮＨ、ＮＨＣ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）ＮＨおよびＮＨＣ（Ｏ）ＯおよびＯＣ（Ｏ）ＮＨが挙げられる。

他の例示的実施形態において、Ｘ^４は、α−アミン部位および／または側鎖ヘテロ原子が高分子変性部位で変性されている、アミノ酸、ジペプチド（例えば、Ｌｙｓ−Ｌｙｓ）またはトリ−ペプチド（例えば、Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ）であるＲ^１７へのペプチド結合である。

さらなる例示的実施形態において、本発明のペプチド複合体は：

から選択される式を有する、例えばＲ^１５部位といった部位を含み、式中、種々の符号によって表されているラジカルのアイデンティティは、本願明細書中上記に考察されているものと同一である。Ｌ^ａは、ＬおよびＬ^１について上記に考察されているとおり、結合またはリンカーであり、例えば、置換または非置換のアルキルまたは置換または非置換のヘテロアルキル部位である。例示的実施形態において、Ｌ^ａは、示されているとおり、高分子変性部位で官能基化されているシアル酸の側鎖の部位である。例証的なＬ^ａ部位は、１つまたは複数のＯＨまたはＮＨ_２を含む置換または非置換のアルキル鎖を含む。

さらに他の例示的実施形態において、本発明は、式：

を有する、例えばＲ^１５部位といった部位を含むペプチド複合体を提供する。

種々の符号で表されるラジカルのアイデンティティは、本願明細書中上記に考察されたものと同一である。当業者が認識するであろうとおり、式ＶＩＩおよびＶＩＩＩ中のリンカーアームは、本願明細書に規定の他の変性糖質に同等に適用可能である。例示的実施形態において、式ＶＩＩおよびＶＩＩＩの種は、本願明細書に規定のグリカン構造に結合されたＲ^１５部位である。

さらに他の例示的実施形態において、第ＩＸ因子ペプチド複合体は：

から選択されるメンバーである式を有するＲ^１５部位を含み、式中、ラジカルのアイデンティティは、上記に考察されているとおりである。Ｌ^ａについての例示的種は、−（ＣＨ_２）_ｊＣ（Ｏ）ＮＨ（ＣＨ_２）_ｈＣ（Ｏ）ＮＨ−であり、式中、指数ｈおよびｊは、０〜１０から独立に選択される整数である。さらなる例示的種は、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−である。指数ｍおよびｎは、０〜５０００から独立に選択される整数である。Ａ^１、Ａ^２、Ａ^３、Ａ^４、Ａ^５、Ａ^６、Ａ^７、Ａ^８、Ａ^９、Ａ^１０およびＡ^１１は、Ｈ、置換または非置換のアルキル、置換または非置換のヘテロアルキル、置換または非置換のシクロアルキル、置換または非置換のヘテロシクロアルキル、置換または非置換のアリール、置換または非置換のヘテロアリール、−ＮＡ^１２Ａ^１３、−ＯＡ^１２および−ＳｉＡ^１２Ａ^１３から独立に選択されるメンバーである。Ａ^１２およびＡ^１３は、置換または非置換のアルキル、置換または非置換のヘテロアルキル、置換または非置換のシクロアルキル、置換または非置換のヘテロシクロアルキル、置換または非置換のアリール、および置換または非置換のヘテロアリールから独立に選択されるメンバーである。

例示的実施形態において、グリコシルリンキング基は、以下の式による構造を有する。

上記に規定の本発明の実施形態は、ポリマーが水溶性ポリマー、特に、ポリ（エチレングリコール）（「ＰＥＧ」）、例えば、メトキシ−ポリ（エチレングリコール）である種を参照することによりさらに例示される。当業者は、以下のセクションにおける焦点は例示の簡潔性のためであり、ＰＥＧを例示的ポリマーとして用いる規定の種々のモチーフは、ＰＥＧ以外のポリマーが用いられる種に同等に適用可能であることを認識するであろう。

例えば、１ｋＤａ、２ｋＤａ、５ｋＤａ、１０ｋＤａ、１５ｋＤａ、２０ｋＤａ、２５ｋＤａ、３０ｋＤａ、３５ｋＤａ、４０ｋＤａおよび４５ｋＤａといったいずれかの分子量のＰＥＧが本発明において用いられる。

例示的実施形態において、Ｒ^１５部位は、群：

から選択されるメンバーである式を有する。

上記構造の各々において、リンカー断片−ＮＨ（ＣＨ_２）_ａ−は存在することも、存在していないこともできる。

他の例示的実施形態において、ペプチド複合体は、群：

から選択されるＲ^１５部位を含む

上記式の各々において、指数ｅおよびｆは、１〜２５００の整数から独立に選択される。さらなる例示的実施形態において、ｅおよびｆは、約１ｋＤａ、２ｋＤａ、５ｋＤａ、１０ｋＤａ、１５ｋＤａ、２０ｋＤａ、２５ｋＤａ、３０ｋＤａ、３５ｋＤａ、４０ｋＤａおよび４５ｋＤａであるＰＥＧ部位を提供するよう選択される。符号Ｑは、置換または非置換のアルキル（例えば、Ｃ_１〜Ｃ_６アルキル、例えば、メチル）、置換または非置換のヘテロアルキルまたはＨを表す。

他の分岐ポリマーは、例えば：

といったジリシン（Ｌｙｓ−Ｌｙｓ）ペプチドおよび、例えば：

といいたトリ−リシンペプチド（Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ）に基づいた構造を有する。

上記の図の各々において、指数ｅ、ｆ、ｆ’およびｆ’’は１〜２５００から独立に選択される整数である。指数ｑ、ｑ’およびｑ’’は１〜２０から独立に選択される整数である。

他の例示的実施形態において、変性基：

は、

から選択されるメンバーである式を有し、式中、Ｑは、Ｈおよび置換または非置換のＣ_１〜Ｃ_６アルキルから選択されるメンバーである。指数ｅおよびｆは１〜２５００から独立に選択される整数、および指数ｑは、０〜２０から選択される整数である。

他の例示的実施形態において、変性基：

は、

から選択されるメンバーである式を有し、式中、Ｑは、Ｈおよび置換または非置換のＣ_１〜Ｃ_６アルキルから選択されるメンバーである。指数ｅ、ｆおよびｆ’は１〜２５００から独立に選択される整数であり、およびｑおよびｑ’は１〜２０から独立に選択される整数である。

他の例示的実施形態において、分岐ポリマーは、以下の式による構造を有する。

式中、指数ｍおよびｎは、０〜５０００から独立に選択される整数である。Ａ^１、Ａ^２、Ａ^３、Ａ^４、Ａ^５、Ａ^６、Ａ^７、Ａ^８、Ａ^９、Ａ^１０およびＡ^１１は、Ｈ、置換または非置換のアルキル、置換または非置換のヘテロアルキル、置換または非置換のシクロアルキル、置換または非置換のヘテロシクロアルキル、置換または非置換のアリール、置換または非置換のヘテロアリール、−ＮＡ^１２Ａ^１３、−ＯＡ^１２および−ＳｉＡ^１２Ａ^１３から独立に選択されるメンバーである。Ａ^１２およびＡ^１３は、置換または非置換のアルキル、置換または非置換のヘテロアルキル、置換または非置換のシクロアルキル、置換または非置換のヘテロシクロアルキル、置換または非置換のアリール、および置換または非置換のヘテロアリールから独立に選択されるメンバーである。

式ＩＩＩａは、式ＩＩＩのサブセットである。式ＩＩＩａによって記載される構造はまた、式ＩＩＩによって包含される。

上記式による他の例示的実施形態において、分岐ポリマーは、以下の式による構造を有する。

例示的実施形態において、Ａ^１およびＡ^２は、各々−ＯＣＨ_３またはＨである。

例示的実施形態において、変性糖質はシアル酸であり、および本発明において用いられる選択される変性糖質化合物は、式：

を有する。

指数ａ、ｂおよびｄは、０〜２０の整数である。指数ｃは、１〜２５００の整数である。上記に規定の構造はＲ^１５の成分であることができる。

他の例示的実施形態において、糖質の第１級ヒドロキシル部位が変性基で官能基化される。例えば、シアル酸の９−ヒドロキシルは、関連するアミンに転化され、および官能基化されて、本発明による化合物を提供することができる。この実施形態による式は：

を含む。

上記に規定の構造は、Ｒ^１５の成分であることができる。

前述のセクションにおいてＰＥＧを参照することにより本発明が例示されているが、当業者が認識するであろうとおり、高分子変性部位のアレイは、本願明細書に規定の化合物および方法において用いられる。

選択された実施形態において、Ｒ^１またはＬ−Ｒ^１は分岐ＰＥＧ、例えば、上記に規定された種の１つである。例示的実施形態において、分岐ＰＥＧ構造はシステインペプチドに基づいている。この実施形態による例示的変性糖質は：

を含み、式中、Ｘ^４は結合またはＯである。上記構造の各々において、アルキルアミンリンカー−（ＣＨ_２）_ａＮＨ−が存在することも、存在していないこともできる。上記に規定の構造はＲ^１５／Ｒ^１５’の成分であることができる。

本願明細書において考察されるところ、本発明において用いられるポリマー変性シアル酸はまた、直鎖構造であり得る。それ故、本発明は：

などの構造から誘導されるシアル酸部位を含む複合体を提供し、式中、指数ｑおよびｅは、上記に考察されているとおりである。

例証的な変性糖質は、水溶性または水不溶性ポリマーで変性されている。有用ポリマーの例が、以下にさらに例示されている。

他の例示的実施形態において、ペプチドは、昆虫細胞から誘導され、ＧｌｃＮＡｃおよびＧａｌをマンノースコアに付加することにより再構築され、および直鎖ＰＥＧ部位を有するシアル酸を用いてグリコペグ化されて、式：

を有する少なくとも１つの部位を含む第ＩＸ因子ペプチドをもたらし、式中、指数ｔは、０〜１の整数であり；指数ｓは、１〜１０の整数を表し；および指数ｆは、１〜２５００の整数を表す。

水不溶性ポリマー
他の実施形態において、上記で考察されたものに類似の、変性糖質は、水溶性ポリマーではなく、水不溶性ポリマーを含む。本発明の複合体はまた、１種または複数種の水不溶性ポリマーを含み得る。本発明のこの実施形態は、治療的ペプチドを制御された方策で送達させる、ビヒクルとしての複合体の使用により例示されている。高分子薬物送達系は技術分野において公知である。例えば、ダン（Ｄｕｎｎ）ら編、「ＰＯＬＹＭＥＲＩＣ ＤＲＵＧＳ ＡＮＤ ＤＲＵＧ ＤＥＬＩＶＥＲＹ ＳＹＳＴＥＭＳ」ＡＣＳシンポジウムシリーズ第４６９巻、米国化学会（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ）、ワシントンＤ．Ｃ．（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．）１９９１年を参照のこと。当業者は、実質的にいずれの公知の薬物送達系も、本発明の複合体に適用可能であることを認識するであろう。

Ｒ^１、Ｌ−Ｒ^１、Ｒ^１５、Ｒ^１５’および他のラジカルについての上に既述のモチーフは、当業者に容易に利用可能である化学の使用を限定することなく直鎖および分岐構造に組み込まれ得る水不溶性ポリマーに同等に適用可能である。同様に、これらの種の、本願明細書において考察された変性糖質のいずれかへの組み込みは、本発明の範囲内にある。従って、本発明は、このような複合体の調製のために用いられる、直鎖または分岐水不溶性ポリマーで変性されたシアル酸および他の糖質部位および変性シアル酸種の活性化類似体｛例えばＣＭＰ−Ｓｉａ−（水不溶性ポリマー））を含む複合体を提供する。

代表的な水不溶性ポリマーとしては、限定されないが、ポリホスファジン、ポリ（ビニルアルコール）、ポリアミド、ポリカーボネート、ポリアルキレン、ポリアクリルアミド、ポリアルキレングリコール、ポリアルキレンオキシド、ポリアルキレンテレフタレート、ポリビニルエーテル、ポリビニルエステル、ポリハロゲン化ビニル、ポリビニルピロリドン、ポリグリコリド、ポリシロキサン、ポリウレタン、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリ（エチルメタクリレート）、ポリ（ブチルメタクリレート）、ポリ（イソブチルメタクリレート）、ポリ（ヘキシルメタクリレート）、ポリ（イソデシルメタクリレート）、ポリ（ラウリルメタクリレート）、ポリ（フェニルメタクリレート）、ポリ（メチルアクリレート）、ポリ（イソプロピルアクリレート）、ポリ（イソブチルアクリレート）、ポリ（オクタデシルアクリレート）ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（エチレンオキシド）、ポリ（エチレンテレフタレート）、ポリ（酢酸ビニル）、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、ポリビニルピロリドン、プルロニックおよびポリビニルフェノールおよびこれらのコポリマー。

本発明の複合体において用いられる合成的変性天然ポリマーとしては、限定されないが、アルキルセルロース、ヒドロキシアルキルセルロース、セルロースエーテル、セルロースエステル、およびニトロセルロースが挙げられる。合成的変性天然ポリマーの幅広いクラスの特に好ましいメンバーとしては、限定されないが、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシブチルメチルセルロース、セルロースアセテート、セルロースプロピオネート、セルロースアセテートブチレート、セルロースアセテートフタレート、カルボキシメチルセルロース、セルローストリアセテート、硫酸セルロースナトリウム塩、およびアクリル酸およびメタクリル酸エステルおよびアルギン酸のポリマーが挙げられる。

本願明細書において考察されたこれらのおよび他のポリマーは、シグマケミカル社（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）（ミズーリ州セントルイス（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ．）、ポリサイエンシズ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ）（ペンシルバニア州ウォーレントン（Ｗａｒｒｅｎｔｏｎ，ＰＡ．））、アルドリッチ（Ａｌｄｒｉｃｈ）（ウィスコンシン州ミルウォーキー（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ））、フルカ（Ｆｌｕｋａ）（ニューヨーク州ロンコンコマ（Ｒｏｎｋｏｎｋｏｍａ，ＮＹ））、およびバイオラッド（ＢｉｏＲａｄ）（カルフォルニア州リッチモンド（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ））などの商業的ソースから容易に得られ、あるいはこれらの供給者から得られたモノマーから標準技術を用いて合成することができる。

本発明の複合体において用いられる代表的な生分解性ポリマーとしては、限定されないが、ポリラクチド、ポリグリコリドおよびこれらのコポリマー、ポリ（エチレンテレフタレート）、ポリ（酪酸）、ポリ（吉草酸）、ポリ（ラクチド−コ−カプロラクトン）、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）、ポリ酸無水物、ポリオルトエステル、これらのブレンドおよびコポリマーが挙げられる。特定的に用いられるのは、コラーゲン、プルロニック等を含むものなどのゲルを形成する組成物である。

本発明において用いられるポリマーとしては、それらの構造の少なくとも１部分内に生体吸収性分子を有する水不溶性材料を含む「ハイブリッド」ポリマーを含む。このようなポリマーの例は、ポリマー鎖当たり、生体吸収性領域、親水性領域および複数の架橋性官能基を有する水不溶性コポリマーを含むものである。

本発明の目的のために、「水不溶性材料」は、水中にまたは水含有環境中に実質的に不溶性の材料を含む。それ故、コポリマーの一定の領域またはセグメントは親水性またはさらには水溶性であり得るが、ポリマー分子は、全体として、いずれかの実体的な手段では水中に溶解しない。

本発明の目的のために、用語「生体吸収性分子」は、身体によって代謝されるまたは分解して再吸収される、および／または通常の排泄経路を介して排出されることが可能である領域を含む。このような代謝産物または分解産生物は、好ましくは実質的に身体に対して無毒である。

生体吸収性領域は、コポリマー組成物が、全体として水溶性を呈さない限り、疎水性または親水性であり得る。それ故、生体吸収性領域は、ポリマーが全体として水不溶性のままである優先度に基づいて選択される。従って、相対的特性、すなわち、含有される官能基の種類、および生体吸収性領域および親水性領域の相対的割合は、有用な生体吸収性組成物が水不溶性のままであることを保障するよう選択される。

例証的な吸収性ポリマーとしては、例えば、ポリ（□−ヒドロキシ−カルボン酸）／ポリ（オキシアルキレン）の合成的に産生される吸収性ブロックコポリマー（コーン（Ｃｏｈｎ）ら、米国特許第４，８２６，９４５号明細書を参照のこと）が挙げられる。これらのコポリマーは、架橋されておらず、水溶性であり、そのため、身体が、分解されたブロックコポリマー組成物を排出することができる。ヨーネス（Ｙｏｕｎｅｓ）ら、「Ｊ Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．」２１：１３０１〜１３１６ページ（１９８７年）；およびコーン（Ｃｏｈｎ）ら、「Ｊ Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．」２２：９９３〜１００９ページ（１９８８年）を参照のこと。

本願において好ましい生体吸収性ポリマーとしては、ポリ（エステル）、ポリ（ヒドロキシ酸）、ポリ（ラクトン）、ポリ（アミド）、ポリ（エステル−アミド）、ポリ（アミノ酸）、ポリ（無水物）、ポリ（オルトエステル）、ポリ（カーボネート）、ポリ（ホスファジン）、ポリ（ホスホエステル）、ポリ（チオエステル）、多糖類およびこれらの混合物から選択される１つまたは複数の成分が挙げられる。よりさらに好ましくは、生体吸収性ポリマーはポリ（ヒドロキシ）酸成分を含む。ポリ（ヒドロキシ）酸のうち、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリカプロン酸、ポリ酪酸、ポリ吉草酸ならびに、これらのコポリマーおよび混合物が好ましい。

インビボで吸収される（「生体吸収性」）断片の形成に追加して、本発明の方法において用いられる好ましい高分子コーティングはまた、排出性および／または代謝性の断片を形成することができる。

より高オーダーのコポリマーもまた本発明において用いることができる。例えば、１９８４年３月２０日に付与された、ケイシー（Ｃａｓｅｙ）ら、米国特許第４，４３８，２５３号明細書には、ポリ（グリコール酸）およびヒドロキシル−末端ポリ（アルキレングリコール）のエステル交換から産生されたトリ−ブロックコポリマーが開示されている。このような組成物は、吸収性モノフィラメント縫合糸として用いられるために開示されている。このような組成物の柔軟性は、テトラ−ｐ−トリルオルトカルボネートなどの芳香族オルトカルボネートのコポリマー構造への組み込みによって制御される。

乳酸および／またはグリコール酸ベースの他のポリマーもまた用いることができる。例えば、１９９３年４月１３日に付与された、スピヌ（Ｓｐｉｎｕ）、米国特許第５，２０２，４１３号明細書には、ラクチドおよび／またはグリコリドのオリゴマー系ジオールまたはジアミン残基の一方への開環重合、続いて、ジイソシアネート、塩化ジアシルまたはジクロロシランなどの二官能性化合物での鎖延長によって生成される、規則的に配列されたポリラクチドおよび／またはポリグリコリドのブロックを有する生分解性マルチ−ブロックコポリマーを開示する。

本発明において有用なコーティングの生体吸収性領域は、加水分解的におよび／または酵素的に開裂性であるよう設計されることができる。本発明の目的のために、「加水分解的に開裂性」は、コポリマー、特に生体吸収性領域の、水または水含有環境における加水分解に対する感受性を指す。同様に、本願明細書において用いられる「酵素的に開裂性」は、コポリマー、特に生体吸収性領域の、内在性のまたは外因性の酵素による開裂に対する感受性を指す。

身体内に置かれたとき、親水性領域は、排出性および／または代謝性の断片に処理されることができる。それ故、親水性領域としては、例えば、ポリエーテル、ポリアルキレンオキシド、ポリオール、ポリ（ビニルピロリジン）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（アルキルオキサゾリン）、多糖類、炭水化物、ペプチド、タンパク質およびこれらのコポリマーおよび混合物を挙げることができる。しかも、親水性領域はまた、例えば、ポリ（アルキレン）オキシドであることができる。このようなポリ（アルキレン）オキシドとしては、例えば、ポリ（エチレン）オキシド、ポリ（プロピレン）オキシドおよびこれらの混合物およびコポリマーを挙げることができる。

ヒドロゲルの成分であるポリマーはまた、本発明において有用である。ヒドロゲルは、比較的多量の水を吸収することができる高分子材料である。ヒドロゲル形成性化合物の例としては、限定されないが、ポリアクリル酸、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリジン、ゼラチン、カラゲナンおよび他の多糖類、ヒドロキシエチレンメタクリル酸（ＨＥＭＡ）、ならびにこれらの誘導体等が挙げられる。安定で、生分解性および生体吸収性を有するヒドロゲルを生成することができる。しかも、ヒドロゲル組成物は、１つまたは複数のこれらの特性を示すサブユニットを含むことができる。

架橋を介してその完全性が制御されうる生体適合性ヒドロゲル組成物は公知であり、および本発明の方法における使用に好ましい。例えば、１９９５年４月２５日に付与されたハッベル（Ｈｕｂｂｅｌｌ）ら、米国特許第５，４１０，０１６号明細書、および１９９６年６月２５日に付与された米国特許第５，５２９，９１４号明細書には、２つの加水分解的に不安定な延長部の間に挟まれた水溶性中央ブロック断片を有する架橋ブロックコポリマーである水溶性系が開示されている。このようなコポリマーは、光重合性アクリレート官能基でさらに末端封止される。架橋されたとき、これらの系はヒドロゲルになる。このようなコポリマーの水溶性中央ブロックとしては、ポリ（エチレングリコール）を挙げることができ；その一方で、加水分解的に不安定な延長部はポリグリコール酸またはポリ乳酸などのポリ（□−ヒドロキシ酸）であることができる。ソーハニー（Ｓａｗｈｎｅｙ）ら、「Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ」２６：５８１〜５８７ページ（１９９３年）を参照のこと。

他の好ましい実施形態において、ゲルは、熱可逆性ゲルである。プルロニック、コラーゲン、ゼラチン、ヒアルロン酸、多糖類、ポリウレタンヒドロゲル、ポリウレタン−尿素ヒドロゲルおよびこれらの組み合わせなどの成分を含む熱可逆性ゲルが、本願において好ましい。

さらに他の例示的実施形態において、本発明の複合体はリポソームの成分を含む。リポソームは、例えば、エップスタイン（Ｅｐｐｓｔｅｉｎ）ら、米国特許第４，５２２，８１１号明細書に記載の当業者に公知の方法によって調製することができる。例えば、リポソーム配合物は、適切な脂質（ステアロイルホスファチジルエタノールアミン、ステアロイルホスファチジルコリン、アラカドイルホスファチジルコリン、およびコレステロールなどの）を無機溶剤に溶解し、次いでこれを蒸発させて、乾燥脂質の薄膜をコンテナの表面に残すことにより調製され得る。活性化合物またはその薬学的に許容可能な塩の水溶液が、次いでコンテナに導入される。コンテナは、次いで、手でかき混ぜられて脂質材料がコンテナの側辺から遊離されて、脂質凝集体を分散させ、これによりリポソーム性懸濁液が形成される。

上記に言及した微粒子および微粒子の調製方法は、例示のために提供されており、これらは、本発明において用いられる微粒子の範囲を定義することを意図するものではない。異なる方法によって製造された微粒子のアレイが本発明において用いられることは当業者に明らかであろう。

水溶性ポリマーのコンテクストにおいて上記で考察された構造的な型である、直鎖および分岐の両方は、水不溶性ポリマーに関しても一般に適用可能である。それ故、例えば、システイン、セリン、ジリシン、およびトリリシン分岐コアは、２つの水不溶性ポリマー部位で官能基化されることができる。これらの種の生成に用いられる方法は、一般に、水溶性ポリマーの生成に用いられるものと酷似している。

生体分子
他の好ましい実施形態において、変性糖質は生体分子を有する。さらに好ましい実施形態において、生体分子は、機能性タンパク質、酵素、抗原、抗体、ペプチド、核酸（例えば、単一ヌクレオチドまたはヌクレオシド、オレゴヌクレオチド、ポリヌクレオチドおよび一重−および高級−鎖核酸）、レクチン、受容体またはこれらの組み合わせである。

好ましい生体分子は、基本的に非蛍光性であるか、またはきわめて微量の蛍光を放射し、これらは、アッセイにおいて蛍光性マーカーとして使用するには不適当である。しかも、一般に、糖質ではない生体分子を用いることが好ましい。この好ましさの例外は、他の実体要素（例えば、ＰＥＧ、生体分子、治療的部位、診断上の部位等）の共有結合によって変性される、別の面では天然に生じる糖質の使用である。例示的実施形態において、生体分子である糖質部位は、リンカーアームに複合化され、および糖質−リンカーアームカセットが続いてペプチドに本発明の方法を介して複合化される。

本発明の実施において有用である生体分子は、いずれのソースに由来することもできる。生体分子は、天然ソースから単離されることができ、またはこれらは、合成方法によって産生されることができる。ペプチドは、天然ペプチドまたは変異されたペプチドであることができる。変異は、化学的変異誘発、サイト特異的変異誘発または当業者に公知である変異を誘導する他の手段によって、作用させることができる。本発明の実施において有用であるペプチドとしては、例えば酵素、抗原、抗体および受容体が挙げられる。抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナルのいずれ；無傷のまたは断片のいずれかであることができる。ペプチドは、任意により、指向進化のプログラムの産生物である。

天然由来のおよび合成ペプチドならびに核酸の両方が、併せて本発明において用いられ、これらの分子は、糖質残基成分または架橋剤にいずれかの利用可能な反応性基によって結合されることができる。例えば、ペプチドは、反応性アミン、カルボキシル、スルフヒドリル、またはヒドロキシル基を介して結合されることができる。反応性基は、ペプチド終端またはペプチド鎖の内部サイトに存在することができる。核酸は、反応性基を介して、塩基（例えば、環外アミン）または糖質部位上の利用可能なヒドロキシル基（例えば、３’−または５’−ヒドロキシル）上に結合されることができる。ペプチドおよび核酸鎖は、１つまたは複数のサイトでさらに誘導体化されて、鎖上の適切な反応性基への結合を許容することができる。クリセイ（Ｃｈｒｉｓｅｙ）ら、「Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．」、２４：３０３１〜３０３９ページ（１９９６年）を参照のこと。

さらに好ましい実施形態において、生体分子は、本発明の方法による変性されたペプチドを特異的な組織に指向させるように選択され、これによりペプチドのその組織に送達される非誘導体化ペプチドの量に比して、ペプチドのその組織への送達を増加させる。さらに好ましい実施形態において、特異的な組織に、選択された時間内に送達された誘導体化ペプチドの量が、誘導体化によって、少なくとも約２０％、より好ましくは少なくとも約４０％、およびさらにより好ましくは少なくとも約１００％で増強される。本願において、標的指向化用途についての好ましい生体分子としては、抗体、ホルモンおよび細胞−表面受容体についてのリガンドが挙げられる。

さらなる例示的実施形態において、ビオチンが結合した複合体として提供されている。それ故、例えば、選択的にビオチン化されたペプチドが、１つまたは複数の変性基を有するアビジンまたはストレプトアビジン部位の結合によって生成される。

方法
上記に考察された複合体に追加して、本発明は、これらのおよび他の複合体を調製する方法を提供する。それ故、さらなる態様において、本発明は、選択された部位およびペプチドの間に共有複合体を形成する方法を提供する。追加して、本発明は、本発明の複合体を、身体の特定の組織または領域に標的指向化させる方法を提供する。しかも、本発明は、本発明の複合体を疾病を発症させるリスクのある患者または疾病を有する患者に投与することにより、疾病状態を予防し、治癒させ、または改善させる方法を提供する。

例示的実施形態において、複合体は、水溶性ポリマー、治療的部位、標的指向化部位または生体分子、およびグリコシル化または非グリコシル化ペプチド間に形成される。ポリマー、治療的部位または生体分子は、間に挿入された、およびペプチドおよび変性基（例えば、水溶性ポリマー）の両方に共有結合的にリンクされた無傷のグリコシルリンキング基を介してペプチドに複合化される。

例示的実施形態において、複合体は、度々化学ペグ化として称される化学プロセスを介して形成される。合成化学ペグ化ペプチド複合体のさらなる考察は、その各々が本願明細書において参照によりそれらの全体が援用される、２００２年１０月９日出願の国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ０２／３２２６号明細書、および２００２年１１月５日出願の米国特許出願第１０／２８７，９９４号明細書に提供されている。

方法は、ペプチドと、変性糖質および変性糖質が基質であるグリコシルトランスフェラーゼを含有する混合物とを接触させるステップを含む。反応は、変性糖質およびペプチド間に共有結合を形成するに充分な状態下で行われる。変性糖質の糖質部位は、好ましくは、ヌクレオチド糖質、活性化糖質、およびヌクレオチドでも活性化でもない糖質から選択される。

受容体ペプチド（グリコシル化または非グリコシル化）は典型的には新たに合成され、または原核細胞（例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの細菌性細胞）あるいは、哺乳類細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）、イースト菌（例えば、サッカロミセス）、昆虫、または植物細胞などの真核細胞中に組換え的に発現される。ペプチドは、完全長タンパク質または断片のいずれであることもできる。しかも、ペプチドは、野生型または変異ペプチドであることができる。例示的実施形態において、ペプチドは、１つまたは複数のコンセンサスグリコシル化サイトがペプチド配列に付与された突然変異体を含む。

本発明の方法はまた、組換え的に産生される不完全グリコシル化ペプチドの変性を提供する。多数の組換え的に産生される糖タンパク質は、不完全にグリコシル化されており、例えば免疫原性、ＲＥＳによる認識といった望ましくない特性を有し得る炭水化物残基を露出させる。本発明の方法において変性糖質を用いることにより、ペプチドは、同時にさらに、例えば水溶性ポリマー、治療的剤等で誘導体化され、およびグリコシル化されることができる。変性糖質の糖質部位は、完全にグリコシル化されるペプチドとして受容体に適当に複合化されるであろう残基、または所望の特性を有する他の糖質部位であることができる。

本発明の方法によって変性されたペプチドは、合成または野生型ペプチドであることができ、またはこれらは、部位指向性変異誘発などの技術分野において公知である方法によって産生される変異されたペプチドであることができる。ペプチドのグリコシル化は、典型的にはＮ−結合またはＯ−結合である。例示的Ｎ−リンケージは、変性糖質の、アスパラギン残基の側鎖への結合である。Ｘがプロリン以外のいずれかのアミノ酸であるトリペプチド配列アスパラギン−Ｘ−セリンおよびアスパラギン−Ｘ−スレオニンは、炭水化物部位のアスパラギン側鎖への酵素的結合の認識配列である。それ故、これらのトリペプチド配列の一方の、ポリペプチド中での存在は、有望なグリコシル化サイトを形成する。Ｏ−結合グリコシル化は、１種の糖質（例えば、Ｎ−アシルガラクトサミン、ガラクトース、マンノース、ＧｌｃＮＡｃ、グルコース、フコースまたはキシロース）の、５−ヒドロキシプロリンまたは５−ヒドロキシリシンもまた用いられ得るが、ヒドロキシアミノ酸のヒドロキシ側鎖、好ましくはセリンまたはスレオニンへの結合を指す。

グリコシル化サイトのペプチドまたは他の構造への付加は、１つまたは複数のグリコシル化サイトを含有するようアミノ酸配列を変更させることにより簡便に達成される。付加はまた、ペプチド（Ｏ−結合グリコシル化サイトについて）の配列中での、好ましくはセリンまたはスレオニン残基である、−ＯＨ基を提示する１つまたは複数の種の組み込みによりなされ得る。付加は、突然変異により、またはペプチドの完全な化学合成によりなされ得る。ペプチドアミノ酸配列は、好ましくは、ＤＮＡレベルでの変化を介して、具体的には、所望のアミノ酸に転換されるであろうコドンが生成されるよう、ペプチドをコード化するＤＮＡを予め選択された塩基で変異させることにより変更される。ＤＮＡ変異は、好ましくは、技術分野において公知である方法を用いてなされる。

例示的実施形態において、グリコシル化サイトは、ポリヌクレオチドを混合することにより付加される。候補ペプチドをコード化するポリヌクレオチドは、ＤＮＡ混合プロトコルで調整されることができる。ＤＮＡ混合は、反復的な組換えおよび突然変異のプロセスであり、関連する遺伝子のプールの無作為な断片化、続いて、ポリメラーゼ鎖反応様プロセスによる断片の再構築によって実施される。例えば、ステマー（Ｓｔｅｍｍｅｒ）、「Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｄ．ＵＳＡ」９１：１０７４７〜１０７５１ページ（１９９４年）；ステマー（Ｓｔｅｍｍｅｒ）、「Ｎａｔｕｒｅ」３７０：３８９〜３９１ページ（１９９４年）；および米国特許第５，６０５，７９３号明細書、米国特許第５，８３７，４５８号明細書、米国特許第５，８３０，７２１号明細書および米国特許第５，８１１，２３８号明細書を参照のこと。

本発明はまた、１つまたは複数の選択されたグリコシル残基をペプチドに付加（または除去）する手段を提供し、これの後、変性糖質は、ペプチドの選択されたグリコシル残基の少なくとも１つに複合化される。本実施形態は、例えば、変性糖質を、ペプチド上に存在しないか、または所望の量で存在しない選択されたグリコシル残基に複合化することが所望される場合に有用である。それ故、変性糖質をペプチドにカップリングする前に、選択されたグリコシル残基がペプチドに、酵素的または化学的カップリングによって複合化される。他の実施形態において、グリコペプチドのグリコシル化パターンは、変性糖質の複合化の前に、グリコペプチドからの炭水化物残基の除去により変更される。例えば国際公開第９８／３１８２６号パンフレットを参照のこと。

グリコペプチド上に存在するいずれかの炭水化物部位の付加または除去は、化学的にまたは酵素的に達成される。化学的脱グリコシル化は、好ましくは、ポリペプチド変異体の化合物トリフルオロメタンスルホン酸、または均等化合物への露出によってもたらされる。この処理は、リンキング糖質（Ｎ−アセチルグルコースアミンまたはＮ−アセチルガラクトースアミン）以外のほとんどのまたはすべての糖質の開裂をもたらすが、ペプチドを無傷のまま残す。化学的脱グリコシル化が、ハキムジン（Ｈａｋｉｍｕｄｄｉｎ）ら、「Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．」２５９：５２（１９８７年）によって、およびエッジ（Ｅｄｇｅ）ら、「Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．」、１１８：１３１（１９８１年）によって記載されている。ポリペプチド変異体上の炭水化物部位の酵素的開裂は、トタクラ（Ｔｈｏｔａｋｕｒａ）ら、「Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．」、１３８：３５０（１９８７年）に記載のとおり、多様なエンド−およびエクソ−グリコシダーゼの使用によって達成されることができる。

グリコシル部位の化学的付加は、いずれかの技術分野で認識された方法によって行われる。糖質部位の酵素的付加は、好ましくは、原生グリコシル単位を本発明において用いられる変性糖質について置き換える本願明細書に規定の方法の変形を用いて達成される。糖質部位を付加する他の方法が、米国特許第５，８７６，９８０号明細書、米国特許第６，０３０，８１５号明細書、米国特許第５，７２８，５５４号明細書、および米国特許第５，９２２，５７７号明細書に開示されている。

選択されたグリコシル残基についての例証的な結合点としては、限定されないが：（ａ）Ｎ−結合グリコシル化およびＯ−結合グリコシル化についてのコンセンサスサイト；（ｂ）グリコシルトランスフェラーゼについての受容体である末端グリコシル部位；（ｃ）アルギニン、アスパラギンおよびヒスチジン；（ｄ）遊離カルボキシル基；（ｅ）システインのものなどの遊離スルフヒドリル基；（ｆ）セリン、スレオニン、またはヒドロキシプロリンのものなどの遊離ヒドロキシル基；（ｇ）フェニルアラニン、チロシン、またはトリプトファンのものなどの芳香族残基；または（ｈ）グルタミンのアミド基が挙げられる。本発明において用いられる例証的な方法は、１９８７年９月１１日発行の国際公開第８７／０５３３０号パンフレット、およびアプリン（Ａｐｌｉｎ）およびリストン（Ｗｒｉｓｔｏｎ）、「ＣＲＣ ＣＲＩＴ．ＲＥＶ．ＢＩＯＣＨＥＭ．」、２５９〜３０６ページ（１９８１年）に記載されている。

一実施形態においては、本発明は、第ＩＸ因子および１つまたは複数のペプチドを、リンキング基を介してリンクする方法を提供する。リンキング基は、いずれかの有用な構造のものであり、直鎖および分岐鎖構造から選択され得る。好ましくは、ペプチドに結合されたリンカーの各終端は、変性糖質を含む（すなわち、新生無傷グリコシルリンキング基）。

本発明の例示的方法において、２つのペプチドは、ＰＥＧリンカーを含むリンカー部位を介して共にリンクされている。構造は、上記の略画に規定の一般構造に合致する。本願明細書に記載のとおり、本発明の構造は、２つの無傷のグリコシルリンキング基を含む（すなわち、ｓ＋ｔ＝１）。２つのグリコシル基を含むＰＥＧリンカー上での焦点は、簡潔性の目的のためであり、本発明のこの実施形態において用いられるリンカーアームのアイデンティティを限定するとして解釈されるべきではない。

それ故、ＰＥＧ部位は、第１の終端において第１のグリコシル単位で、および第２の終端において、第２のグリコシル単位で官能基化される。第１および第２のグリコシル単位は、好ましくは、異なるトランスフェラーゼについての基質であり、第１のおよび第２のペプチドの、第１のおよび第２のグリコシル単位への、それぞれ直交する結合を許容する。実際には、（グリコシル）^１−ＰＥＧ−（グリコシル）^２リンカーが、第１のグリコシル単位が基質である第１のペプチドおよび第１のトランスフェラーゼと接触され、これにより（ペプチド）^１−（グリコシル）^１−ＰＥＧ−（グリコシル）^２が形成される。グリコシルトランスフェラーゼおよび／または未反応ペプチドが、次いで、任意により反応混合物から除去される。第２のグリコシル単位が基質である、第２のペプチドおよび第２のトランスフェラーゼが、（ペプチド）^１−（グリコシル）^１−ＰＥＧ−（グリコシル）^２複合体に付与されて、（ペプチド）^１−（グリコシル）^１−ＰＥＧ−（グリコシル）^２−（ペプチド）^２が形成される。上記に概要を述べた方法はまた、例えば分岐ＰＥＧ、デンドリマー、ポリ（アミノ酸）、ポリサッカライド等の使用による、２つを超えるペプチドの間の複合体の形成に適用可能であることを当業者は認識するであろう。

他の例示的実施形態がスキーム１に規定されている。スキーム１は、ポリマーを含む複合体の調製方法を示す。ポリマーは、第ＩＸ因子タンパク質の循環半減期を増加させる。

式中、ＳＡはシアル酸であり、およびポリマーはＰＥＧ、ｍＰＥＧ、ポリシアル酸、水溶性または水不溶性ポリマーである。第ＩＸ因子変異体を参照することにより方法が例示されているが、当業者は、これは、野生型第ＩＸ因子ペプチドに対しても同等に適用可能であることを認識するであろう。

ＰＥＧ（または他のリンカー）の反応性誘導体の、１つまたは複数ペプチド部位をリンカーに結合するための使用は、本発明の範囲内にある。本発明は、反応性ＰＥＧアナログのアイデンティティによって限定されない。ポリ（エチレングリコール）の多くの活性化誘導体は、商業的に、および文献中に入手可能である。適切な活性化ＰＥＧ誘導体を選択し、および必要であれば合成して、これで本発明において有用である基質を調製することは、十分に当業者の能力の範囲内である。アブショウスキー（Ａｂｕｃｈｏｗｓｋｉ）ら、「Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．」、７：１７５〜１８６ページ、（１９８４年）；アブショウスキー（Ａｂｕｃｈｏｗｓｋｉ）ら、「Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．」、２５２：３５８２〜３５８６ページ（１９７７年）；ジャクソン（Ｊａｃｋｓｏｎ）ら、「Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．」、１６５：１１４〜１２７ページ（１９８７年）；コイデ（Ｋｏｉｄｅ）ら、「Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．」、１１１：６５９〜６６７ページ（１９８３年））、トレシレート（ニルソン（Ｎｉｌｓｓｏｎ）ら、「Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．」、１０４：５６〜６９ページ（１９８４年）；デルガド（Ｄｅｌｇａｄｏ）ら、「Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ａｐｐｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．」、１２：１１９〜１２８ページ（１９９０年））；Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド由来活性エステル（バックマン（Ｂｕｃｋｍａｎｎ）ら、「Ｍａｋｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．」、１８２：１３７９〜１３８４ページ（１９８１年）；ジョピッチ（Ｊｏｐｐｉｃｈ）ら、「Ｍａｋｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．」、１８０：１３８１〜１３８４ページ（１９７９年）；アブショウスキー（Ａｂｕｃｈｏｗｓｋｉ）ら、「Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．」、７：１７５〜１８６ページ（１９８４年）；カトレ（Ｋａｔｒｅ）ら、「Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．」、８４：１４８７〜１４９１ページ（１９８７年）；キタムラ（Ｋｉｔａｍｕｒａ）ら、「Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．」、５１：４３１０〜４３１５ページ（１９９１年）；ボクー（Ｂｏｃｃｕ）ら、「Ｚ．Ｎａｔｕｒｆｏｒｓｃｋ」、３８Ｃ：９４〜９９ページ（１９８３年）、カーボネート（ザリプスキー（Ｚａｌｉｐｓｋｙ）ら、「ＰＯＬＹ（ＥＴＨＹＬＥＮＥ ＧＬＹＣＯＬ）ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ：ＢＩＯＴＥＣＨＮＩＣＡＬ ＡＮＤ ＢＩＯＭＥＤＩＣＡＬ ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ」、ハリス（Ｈａｒｒｉｓ）編、プレナムプレス（Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、１９９２年、３４７〜３７０ページ；ザリプスキー（Ｚａｌｉｐｓｋｙ）ら、「Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．」、１５：１００〜１１４ページ（１９９２年）；ベロネーゼ（Ｖｅｒｏｎｅｓｅ）ら、「Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．」、１１：１４１〜１５２ページ（１９８５年））、蟻酸イミダゾリル（ボーチャンプ（Ｂｅａｕｃｈａｍｐ）ら、「Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．」、１３１：２５〜３３ページ（１９８３年）；バーガー（Ｂｅｒｇｅｒ）ら、「Ｂｌｏｏｄ」、７１：１６４１〜１６４７ページ（１９８８年））、４−ジチオピリジン（ウォグヒレン（Ｗｏｇｈｉｒｅｎ）ら、「Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．」、４：３１４〜３１８ページ（１９９３年））、イソシアネート（ビウン（Ｂｙｕｎ）ら、「ＡＳＡＩＯ Ｊｏｕｒｎａｌ」、Ｍ６４９−Ｍ−６５３（１９９２年））およびエポキシド（ノイシキ（Ｎｏｉｓｈｉｋｉ）らに付与された米国特許第４，８０６，５９５号明細書（１９８９年））を参照のこと。他のリンキング基は、アミノ基および活性化ＰＥＧの間のウレタンリンクを含む。ベロネーゼ（Ｖｅｒｏｎｅｓｅ）、ら、「Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ」、１１：１４１〜１５２ページ（１９８５年）を参照のこと。

変性糖質の調製
普通、糖質部位および変性基は、反応性基の使用を介して共にリンクされており、これらは、典型的には、リンクプロセスによって、生理学的に関連する状態下で非反応性である新たな有機官能基または種に転換される。糖質反応性官能基は、糖質部位上のいずれかの位置に位置される。本発明の実施に有用である反応性基および反応のクラスは、生物複合化化学の技術分野において周知であるものである。今日好まれる反応性糖質部位と利用可能な反応のクラスは、比較的緩和な状態下で進行するものである。これらとしては、限定されないが、求核置換（例えばアミンおよびアルコールの、ハロゲン化アシル、活性エステルとの反応）、求電子置換（例えば、エナミン反応）および炭素−炭素および炭素−ヘテロ原子多重結合への付加（例えば、マイケル反応、ディールスアルダー付加）が挙げられる。これらのおよび他の有用な反応は、例えば、マーチ（Ｍａｒｃｈ）、「ＡＤＶＡＮＣＥＤ ＯＲＧＡＮＩＣ ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ」、第３版、ジョンウィリー＆サンズ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ）、ニューヨーク（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、１９８５年；ヘルマンソン（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ）、「ＢＩＯＣＯＮＪＵＧＡＴＥ ＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ」、アカデミックプレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）、サンディエゴ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）、１９９６年；およびフィーニー（Ｆｅｅｎｅｙ）ら、「ＭＯＤＩＦＩＣＡＴＩＯＮ ＯＦ ＰＲＯＴＥＩＮＳ」；「Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｓｅｒｉｅｓ」、第１９８巻、米国化学会（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ）、ワシントンＤ．Ｃ．（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．）、１９８２年に考察されている。

糖質核の側鎖である有用な反応性官能基または変性基としては、限定されないが：
（ａ）特に限定されないが、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、Ｎ−ヒドロキシベンズトリアゾールエステル、酸ハロゲン化物、アシルイミダゾール、チオエステル、ｐ−ニトロフェニルエステル、アルキル、アルケニル、アルキニルおよび芳香族のエステルを含むカルボキシル基およびこれらの種々の誘導体；
（ｂ）例えば、エステル、エーテル、アルデヒド等に転化されることができるヒドロキシル基；
（ｃ）ハロゲン化物が、後に、例えばアミン、カルボン酸アニオン、チオールアニオン、カルバニオン、またはアルコキシドイオンなどの求核性基で置換されることができ、これにより新たな基の共有結合が、ハロゲン原子の官能基でもたらされる、ハロアルキル基；
（ｄ）ディールスアルダー反応に関与することが可能である、例えばマレイミド基などのジエノフィル基；
（ｅ）例えば、イミン、ヒドラゾン、セミカルバゾンまたはオキシムなどのカルボニル誘導体の形成を介して、またはグリニャール付加またはアルキルリチウム付加などのメカニズムを介してその後の誘導体化が可能であるようなアルデヒドまたはケトン基；
（ｆ）例えばスルホンアミドを形成するその後のアミンとの反応のためのスルホニルハロゲン化物基；
（ｇ）例えばジスルフィドに転化されることができるチオール基、またはハロゲン化アシルと反応されることができるチオール基；
（ｈ）例えば、アシル化、アルキル化または酸化されることができるアミンまたはスルフヒドリル基；
（ｉ）例えば、環化付加、アシル化、マイケル付加等を受けることができるアルケン；および
（ｊ）例えば、アミンおよびヒドロキシル化合物と反応することができるエポキシド
が挙げられる。

反応性官能基は、これらが、反応性糖質核または変性基を構築するために必要な反応に関与しない、または干渉しないよう選択されることができる。あるいは、反応性官能基は、保護基の存在によって反応への関与から保護されることができる。当業者は、特定の官能基を、選択された設定の反応状態に干渉しないようどのように保護するかを理解している。例えば、有用な保護基については、例えば、グリーン（Ｇｒｅｅｎｅ）ら、「ＰＲＯＴＥＣＴＩＶＥ ＧＲＯＵＰＳ ＩＮ ＯＲＧＡＮＩＣ ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ」、ジョンウィリー＆サンズ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ）、ニューヨーク（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、１９９１年を参照のこと。

以下の考察において、本発明の実施に有用である変性糖質の多数の特定の例が規定されている。例示的実施形態において、シアル酸誘導体が、変性基が結合される糖質核として用いられる。シアル酸誘導体の考察の焦点は、例示の簡潔性だけのためであり、本発明の範囲を限定すると解釈されるべきではない。多様な他の糖質部位は、例としてシアル酸を用いると既定されたものに類似の方策で、活性化および誘導体化されることができることを、当業者は認識するであろう。例えば、数多くの方法が、２〜３の糖基質の例を挙げると、ガラクトース、グルコース、Ｎ−アセチルガラクトースアミンおよびフコースを変性するために利用可能であり、技術分野で認識されている方法によって容易に変性される。例えば、エルハラビ（Ｅｌｈａｌａｂｉ）ら、「Ｃｕｒｒ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．」６：９３（１９９９年）；およびシャファー（Ｓｃｈａｆｅｒ）ら、「Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．」６５：２４（２０００年）を参照のこと。

例示的実施形態において、本発明の方法によって変性されるペプチドは、原核細胞（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））、イースト菌および哺乳類細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）を含む真核細胞、または遺伝子組換え動物中に産生されるグリコペプチドであり、それ故、不完全にシアリル化されたＮ−および／またはＯ−結合オリゴ糖鎖を含有する。シアル酸に欠けると共に末端ガラクトース残基を含有するグリコペプチドのオリゴ糖鎖は、ＰＥＧ化、ＰＰＧ化またはそうでなければ変性シアル酸で変性されることができる。

例証的なＰＥＧ−シアル酸誘導体は：

（式中、Ｌは、シアル酸部位およびＰＥＧ部位を接合する置換または非置換のアルキルまたは置換または非置換のヘテロアルキルリンカー部位であり、および「ｎ」は１以上である）；および

（式中、指数「ｓ」は０〜２０の整数を表し、および「ｎ」は１以上である）
を含む。

スキーム２においては、アミノグリコシド１が、保護されたアミノ酸（例えば、グリシン）誘導体の活性エステルで処理されて、糖質アミン残基を関連する保護されたアミノ酸アミド付加物に転換する。付加物はアルドラーゼで処理されて□−ヒドロキシカーボキシレート２が形成される。化合物２は、ＣＭＰ−ＳＡシンセターゼの作用によって関連するＣＭＰ誘導体に転化され、続いて、ＣＭＰ誘導体の接触水素化によって、化合物３が生成される。グリシン付加物の形成を介して導入されたアミンは、化合物３と活性化ＰＥＧまたはＰＰＧ誘導体（例えば、ＰＥＧ−Ｃ（Ｏ）ＮＨＳ、ＰＥＧ−ＯＣ（Ｏ）Ｏ−ｐ−ニトロフェニル）とを反応させることによりＰＥＧ結合の座位として用いられ、４または５などの種をそれぞれ生成する。

表１は、ＰＥＧまたはＰＰＧ部位などの変性基で誘導体化された糖質一リン酸の代表例を規定する。第ＩＸ因子ペプチドは、スキーム２の方法によって変性されることができる。他の誘導体は、技術分野で認識された方法によって調製される。例えば、ケップラー（Ｋｅｐｐｌｅｒ）ら、「Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ」１１：１１Ｒ（２００１年）；およびチャーター（Ｃｈａｒｔｅｒ）ら、「Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ」１０：１０４９（２０００年）を参照のこと。他のアミン反応性ＰＥＧおよびＰＰＧ類似体は市販されているか、またはこれらは、当業者に容易に利用可能な方法により調製されることができる。

ここで、Ｒは変性基、例えば、直鎖または分岐ＰＥＧまたは−Ｌ^ｘ−Ｒ^ｘを表し、ここで、Ｌ^ｘは、結合（ゼロオーダー）、置換または非置換のアルキルおよび置換または非置換のヘテロアルキルから選択されるリンカーであり、およびＲ^ｘは変性基である。

本発明の実施において用いられる変性糖質リン酸塩は、上記に規定されたものの他の位置において置換されることができる。本願において好ましいシアル酸の置換は、以下の式に規定されている。

式中、Ｘは、好ましくは、−Ｏ−、−Ｎ（Ｈ）−、−Ｓ、ＣＨ_２−、および−Ｎ（Ｒ）_２から選択されるリンキング基であり、ここで、各ＲはＲ^１〜Ｒ^５から独立に選択されるメンバーである。符号Ｙ、Ｚ、ＡおよびＢは、各々、Ｘのアイデンティティについて上記に規定された基から選択される基を表す。Ｘ、Ｙ、Ｚ、ＡおよびＢは、各々独立に選択され、従って、これらは同一または異なることができる。符号Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４およびＲ^５は、Ｈ、水溶性ポリマー、治療的部位、生体分子または他の部位を表す。あるいは、これらの符号は、水溶性ポリマー、治療的部位、生体分子または他の部位に結合されたリンカーを表す。

本願明細書において開示された複合体に結合された例証的な部位としては、限定されないが、ＰＥＧ誘導体（例えば、アルキル−ＰＥＧ、アシル−ＰＥＧ、アシル−アルキル−ＰＥＧ、アルキル−アシル−ＰＥＧカルバモイル−ＰＥＧ、アリール−ＰＥＧ）、ＰＰＧ誘導体（例えば、アルキル−ＰＰＧ、アシル−ＰＰＧ、アシル−アルキル−ＰＰＧ、アルキル−アシル−ＰＰＧカルバモイル−ＰＰＧ、アリール−ＰＰＧ）、治療的部位、診断上の部位、マンノース−６−リン酸、ヘパリン、ヘパラン、ＳＬｅ_ｘ、マンノース、マンノース−６−リン酸、シアリルルイスＸ、ＦＧＦ、ＶＦＧＦ、タンパク質、コンドロイチン、ケラタン、デルマタン、アルブミン、インテグリン、鎖状オリゴ糖、ペプチド等が挙げられる。種々の変性基をサッカライド部位に複合化させる方法は、当業者に容易に利用可能である（「ＰＯＬＹ （ＥＴＨＹＬＥＮＥ ＧＬＹＣＯＬ ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ：ＢＩＯＴＥＣＨＮＩＣＡＬ ＡＮＤ ＢＩＯＭＥＤＩＣＡＬ ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ」、Ｊ．ミルトンハリス（Ｊ．Ｍｉｌｔｏｎ Ｈａｒｒｉｓ）編、プレナム（Ｐｌｅｎｕｍ）Ｐｕｂ．Ｃｏｒｐ．、１９９２年；「ＰＯＬＹ （ＥＴＨＹＬＥＮＥ ＧＬＹＣＯＬ ＣＨＥＭＩＣＡＬ ＡＮＤ ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ）」、Ｊ．ミルトンハリス（Ｊ．Ｍｉｌｔｏｎ Ｈａｒｒｉｓ）編、ＡＣＳシンポジウムシリーズ第６８０番、米国化学会（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ）、１９９７年；ヘルマンソン（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ）、「ＢｌＯＣＯＮＪＵＧＡＴＥ ＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ」、アカデミックプレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）、サンディエゴ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）、１９９６年；およびダン（Ｄｕｎｎ）ら編、「ＰＯＬＹＭＥＲＩＣ ＤＲＵＧＳ ＡＮＤ ＤＲＵＧ ＤＥＬＩＶＥＲＹ ＳＹＳＴＥＭＳ」、ＡＣＳシンポジウムシリーズ第４６９巻、米国化学会（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ）、ワシントンＤ．Ｃ．（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．）１９９１年）。

架橋基
本発明の方法における使用のための変性糖質の調製は、変性基の糖質残基への結合およびグリコシルトランスフェラーゼについての基質である安定な付加物の形成を含む。糖質および変性基は、ゼロ−またはより高いオーダーの架橋剤によってカップリングすることができる。変性基の炭水化物部位への結合に用いられることができる例証的な二官能性化合物としては、限定されないが、二官能性ポリ（エチレングリコール）、ポリアミド、ポリエーテル、ポリエステル等が挙げられる。炭水化物を他の分子とリンクさせる一般的なアプローチは、文献において公知である。例えば、リー（Ｌｅｅ）ら、「Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」２８：１８５６（１９８９年）；バティア（Ｂｈａｔｉａ）ら、「Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．」１７８：４０８（１９８９年）；ジャンダ（Ｊａｎｄａ）ら、「Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．」１１２：８８８６（１９９０年）およびベドナルスキー（Ｂｅｄｎａｒｓｋｉ）ら、国際公開第９２／１８１３５号パンフレットを参照のこと。

変性糖質の成分を分子内化学的架橋で変性させるために多様な試薬が用いられる（架橋試薬および架橋手順の概要については：ウォルドＦ．（Ｗｏｌｄ，Ｆ．）、「Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．」２５：６２３〜６５１ページ、１９７２年；ウィートールＨ．Ｈ．（Ｗｅｅｔａｌｌ，Ｈ．Ｈ．）およびクーニーＤ．Ａ．（Ｃｏｏｎｅｙ，Ｄ．Ａ．）、「Ｉｎ：ＥＮＺＹＭＥＳ ＡＳ ＤＲＵＧＳ」（ホルセンバーグ（Ｈｏｌｃｅｎｂｅｒｇ）、およびロバート（Ｒｏｂｅｒｔｓ）編）３９５〜４４２ページ、ウィリー（Ｗｉｌｅｙ）、ニューヨーク（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、１９８１年；ジＴ．Ｈ．（Ｊｉ，Ｔ．Ｈ．）、「Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．」９１：５８０〜６０９ページ、１９８３年；マットソン（Ｍａｔｔｓｏｎ）ら、「Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．」１７：１６７〜１８３ページ、１９９３年（これらのすべては参照により本願明細書において援用される）を参照のこと）。好ましい架橋試薬は、種々のゼロ−長さ、ホモ−二官能性、およびヘテロ−二官能性架橋試薬から誘導される。ゼロ−長さ架橋試薬は、外因性材料を導入しない、２つの内因性化学的基の直接的複合化を含む。ジスルフィド結合の形成を触媒する剤がこのカテゴリーに属する。他の例は、カルボキシルおよび第１級アミノ基を縮合を誘引して、カルボジイミド、エチルクロロホルメート、ウッドワード試薬Ｋ（２−エチル−５−フェニルイソキサゾリウム−３’−スルホネート）、およびカルボニルジイミダゾールなどのアミド結合を形成する試薬である。これらの化学的試薬に追加して、酵素トランスグルタミナーゼ（グルタミル−ペプチドγ−グルタミルトランスフェラーゼ；ＥＣ２．３．２．１３）が、ゼロ−長さ架橋試薬として用いられ得る。この酵素は、タンパク質−結合グルタミニル残基のカルボキサミド基における、通常は基質としての第１級アミノ基とのアシル転移反応を触媒する。好ましいホモ−およびヘテロ−二官能性試薬は、２つの同等のまたは２つの異種サイトを、それぞれ含有し、これらは、アミノ、スルフヒドリル、グアニジノ、インドール、または非特異的な基に対して反応性であり得る。

さらなる他の実施形態において、本発明は、例えば、ジアゾピルベートから選択される基といった光活性性基を用いる。例えば、ｐ−ニトロフェニルジアゾピルビン酸のｐ−ニトロフェニルエステルは脂肪族アミンと反応して、アルデヒドを形成する紫外光光分解を受けるジアゾピルビン酸アミドが得られる。光分解されたジアゾピルベート−変性親和性成分は、架橋を形成する、ホルムアルデヒドまたはグルタルアルデヒドのように反応するであろう。

開裂性リンカー基
さらなる実施形態において、リンカー基は、開裂して、糖質残基から変性基を放出することができる基と共に提供される。多くの開裂性基が技術分野において公知である。例えば、ジュング（Ｊｕｎｇ）ら、「Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ」、７６１：１５２〜１６２ページ（１９８３年）；ジョシ（Ｊｏｓｈｉ）ら、「Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．」２６５：１４５１８〜１４５２５ページ（１９９０年）；ザーリング（Ｚａｒｌｉｎｇ）ら、「Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．」、１２４：９１３〜９２０ページ（１９８０年）；ボイザール（Ｂｏｕｉｚａｒ）ら、「Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．」１５５：１４１〜１４７ページ（１９８６年）；パーク（Ｐａｒｋ）ら、「Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．」２６１：２０５〜２１０ページ（１９８６年）；ブラウニング（Ｂｒｏｗｎｉｎｇ）ら、「Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ」、１４３：１８５９〜１８６７ページ（１９８９年）を参照のこと。しかも、幅広い範囲の開裂性、二官能性（ホモ−およびヘテロ−二官能性の両方の）リンカー基が、ピアース（Ｐｉｅｒｃｅ）などの供給者から市販されている。

例証的な開裂性部位は、光、熱またはチオール、ヒドロキシルアミン、塩基、過ヨウ素酸等などの試薬を用いて開裂されることができる。しかも、一定の好ましい基は、エンドサイトーシスされた応答でインビボで開裂される（例えば、シス−アコニチル；シェン（Ｓｈｅｎ）ら、「Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．」１０２：１０４８（１９９１年）を参照のこと）。好ましい開裂性基は、ジスルフィド、エステル、イミド、カーボネート、ニトロベンジル、フェナシルおよびベンゾイン基からなる群から選択されるメンバーである開裂性部位を含む。

変性糖質のペプチドへの複合化
変性糖質は、複合化を媒介する適切な酵素を用いて、グリコシル化または非グリコシル化ペプチドに複合化される。好ましくは、変性供与体糖質、酵素および受容体ペプチドの濃度は、グリコシル化が受容体が消費されるまで進行するよう選択される。シアリルトランスフェラーゼのコンテクストにおいて規定されているが、以下に考察される用件は、一般に、他のグリコシルトランスフェラーゼ反応に適用可能である。

グリコシルトランスフェラーゼ用いて所望のオリゴ糖構造を生成する多数の方法が公知であり、一般に、本発明に適用可能である。例証的な方法が、例えば、国際公開第９６／３２４９１号パンフレット、イトウ（Ｉｔｏ）ら、「Ｐｕｒｅ Ａｐｐｌ．Ｃｈｅｍ．」６５：７５３（１９９３年）、および米国特許第５，３５２，６７０号明細書、米国特許第５，３７４，５４１号明細書、および米国特許第５，５４５，５５３号明細書に記載されている。

本発明は、単一のグリコシルトランスフェラーゼまたはグリコシルトランスフェラーゼの組み合わせを用いて実施される。例えば、シアリルトランスフェラーゼおよびガラクトシルトランスフェラーゼの組み合わせが用いられることができる。２つ以上の酵素を用いるこれらの実施形態において、酵素および基質は、好ましくは、初期反応混合物中で組合され、または第２の酵素反応用の酵素および試薬は、一旦、第１の酵素反応が完了しまたはほとんど完了したら反応媒体に添加される。２つの酵素反応を順番に単一の容器内で実行することにより、全体の収率が、中間体種が単離される手順を超えて向上する。しかも、余剰溶剤および副産生物の清掃および廃棄が低減される。

好ましい実施形態において、第１のおよび第２の酵素の各々は、グリコシルトランスフェラーゼである。他の好ましい実施形態において、１種の酵素は、エンドグリコシダーゼである。追加の好ましい実施形態において、２種を超える酵素が、本発明の変性糖タンパク質を構築するために用いられる。酵素は、ペプチド上のサッカライド構造を、変性糖質のペプチドへの付加の前または後のいずれかの時点で変更するために用いられる。

他の実施形態において、方法は、１種または複数のエキソ−またはエンドグリコシダーゼを利用する。グリコシダーゼは典型的には変異体であり、これが操作されて、開裂するのではなくグリコシル結合を形成する。変異グリカナーゼは、典型的には、アミノ酸残基の、活性サイト酸性アミノ酸残基についての置換物を含む。例えば、エンドグリカナーゼがエンド−Ｈであるとき、置換活性サイト残基は、典型的には、１３０番目でのＡｓｐ、１３２番目でのＧｌｕまたはこれらの組み合わせであろう。アミノ酸は、一般に、セリン、アラニン、アスパラギン、またはグルタミンで置き換えられる。

変異酵素は、通常は、エンドグリカナーゼ加水分解ステップの逆反応に類似する合成ステップによって反応を触媒する。これらの実施形態において、グリコシル供与体分子（例えば、所望のオリゴ−またはモノ−サッカライド構造）は、脱離基を含有し、および反応は、供与体分子のタンパク質上のＧｌｃＮＡｃ残基への付加で進行する。例えば、脱離基はフッ化物などのハロゲンであることができる。他の実施形態において、脱離基はＡｓｎ、またはＡｓｎ−ペプチド部位である。さらなる実施形態において、グリコシル供与体分子上のＧｌｃＮＡｃ残基は変性されている。例えば、ＧｌｃＮＡｃ残基は、１，２オキサゾリン部位を含み得る。

好ましい実施形態において、本発明の複合体の生成に利用された酵素の各々は、触媒量で存在する。特定の酵素の触媒量は、その酵素の基質の濃度ならびに温度、時間およびｐＨ値などの反応状態に応じて異なる。所与の酵素についての予め選択された基質濃度および反応状態下での触媒量を決定する手段は当業者に周知である。

上記のプロセスが行われる温度は、凝固点の直ぐ上から最も敏感な酵素が変性する温度の範囲であることができる。好ましい温度は、約０℃〜約５５℃、およびより好ましくは約２０℃〜約３０℃の範囲である。他の例示的実施形態において、本願の方法の１つまたは複数の成分は、好熱性酵素を用いて高い温度で行われる。

反応混合物は、受容体がグリコシル化されるために十分な時間の間維持され、これにより、所望の複合体が形成される。いくらかの複合体が数時間後に検出されることができ、回収可能な量は、通常は、２４時間以内に得られる。当業者は、反応速度は、選択された系について最適化される多数の異なる要素（例えば酵素濃度、供与体濃度、受容体濃度、温度、溶剤体積）に依存することを理解する。

本発明はまた、変性ペプチドの産業規模での製造を提供する。本願明細書において用いられるところ、産業規模は、一般に、少なくとも約２５０ｍｇ、好ましくは少なくとも約５００ｍｇ、およびより好ましくは少なくとも約１グラムの最終精製された複合体を、好ましくは単一の反応サイクル（すなわち、複合体は、同等の、継続的に反復された合成サイクルからの反応生成物の組み合わせではない）の後に生成する。

以下の考察において、本発明は、変性シアル酸部位のグリコシル化ペプチドへの複合化によって例示されている。例示的変性シアル酸は、ｍ−ＰＥＧで標識化されている。ＰＥＧ−変性シアル酸およびグリコシル化ペプチドの使用への以下の考察の焦点は例示の簡潔性のためであり、本発明がこれらの２つのパートナーの複合体に限定されることを示唆することは意図しない。当業者は、考察は、一般に、シアル酸以外の変性グリコシル部位の付加に対しても適用可能であることを理解する。しかも、考察は、グリコシル単位の、他の水溶性ポリマー、治療的部位、および生体分子を含むｍ−ＰＥＧ以外の剤での変性に同等に適用可能である。

酵素的アプローチが、ペグ化またはＰＰＧ化炭水化物の、ペプチドまたはグリコペプチドへの選択的導入に用いられることができる。方法は、ＰＥＧ、ＰＰＧ、またはマスクされた反応性官能基を含有する変性糖質を用い、適切なグリコシルトランスフェラーゼまたはグリコシンターゼと組み合わされる。所望の炭水化物リンケージを形成するであろうグリコシルトランスフェラーゼを選択し、および変性糖質を供与体基質として用いることにより、ＰＥＧまたはＰＰＧは、ペプチド主鎖上に、グリコペプチドの既存の糖質残基上にまたはペプチドに付加された糖質残基上に直接的に導入されうる。

シアリルトランスフェラーゼについての受容体は、本発明の方法によって変性されるペプチド上に、天然に生じる構造または組換え的に、酵素的にまたは化学的にそこに置かれたものとして存在する。好適な受容体としては、例えば、Ｇａｌ□１，４ＧｌｃＮ Ａｃ、Ｇａｌ□１、４ＧａｌＮＡｃ、Ｇａｌ□１、３ＧａｌＮＡｃ、ラクト−Ｎ−テトラオース、Ｇａｌ□１、３ＧｌｃＮＡｃ、ＧａｌＮＡｃ、Ｇａｌ□１、３ＧａｌＮＡｃ、Ｇａｌ□１、６ＧｌｃＮＡｃ、Ｇａｌ□１、４Ｇｌｃ（ラクトース）などのガラクトシル受容体、および当業者に公知である他の受容体（を参照のこと、例えば、ポールソン（Ｐａｕｌｓｏｎ）ら、「Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．」２５３：５６１７〜５６２４ページ（１９７８年））が挙げられる。

一実施形態においては、シアリルトランスフェラーゼについての受容体は、グリコペプチドのインビボ合成で変性されるグリコペプチド上に存在する。このようなグリコペプチドは、特許請求の範囲の方法を用いて、グリコペプチドのグリコシル化パターンの事前の変性なくシアリル化されることができる。あるいは、本発明の方法は、好適な受容体を含まないペプチドをシアリル化するために用いられることができる；ペプチドは、先ず、受容体を含むよう当業者に公知である方法によって変性される。例示的実施形態において、ＧａｌＮＡｃ残基が、ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼの作用によって付加される。

例示的実施形態において、ガラクトシル受容体は、ガラクトース残基を、例えばＧａｌＮＡｃといった、ペプチドにリンクされた適切な受容体に結合させることにより構築される。方法は、変性されるペプチドを、好適の量でガラクトシルトランスフェラーゼ（例えば、Ｇａｌβ１，３またはＧａｌβ１，４）、および好適なガラクトシル供与体（例えば、ＵＤＰ−ガラクトース）を含有する反応混合物と共にインキュベートするステップを含む。反応は、実質的に完了するまで進行させられ、または、その代わりに、反応は、予め選択された量のガラクトース残基が添加されたら停止される。選択されたサッカライド受容体を構築する他の方法は、当業者には明らかであろう。

他の実施形態において、グリコペプチド−結合オリゴ糖は、先ず、全体がまたは部分的に「トリムされ」て、シアリルトランスフェラーゼのための受容体、または１つまたは複数の適切な残基が付加されて好適な受容体を得ることができる部位の一方が露出される。グリコシルトランスフェラーゼおよびエンドグリコシダーゼなどの酵素（例えば米国特許第５，７１６，８１２号明細書を参照のこと）が、結合およびトリミング反応に有用である。

以下の考察において、本発明の方法が、これに結合された水溶性ポリマーを有する変性糖質の使用によって例示されている。考察の焦点は、例示の簡潔性のためである。考察は、変性糖質が治療的部位、生体分子等を有するこれらの実施形態に同等に関連することを、当業者は認識するであろう。

例示的実施形態において、Ｏ−結合炭水化物残基は、変性糖質の付加の前に「トリム」される。例えばＧａｌＮＡｃ−Ｇａｌ残基は、トリムされてＧａｌＮＡｃに戻される。水溶性ポリマーを有する変性糖質が、「トリミング」によって露出された１つまたは複数の糖質残基に複合化される。１つの例において、グリコペプチドが、「トリム」され、および水溶性ポリマーが、もたらされたＯ−側鎖アミノ酸またはグリコペプチドグリカンに、水溶性ポリマーに複合化された糖部位、例えば、Ｓｉａ、Ｇａｌ、またはＧａｌＮＡｃ部位を介して付加される。変性糖部位は、「トリムされた」グリコペプチド上の受容体サイトに結合されている。あるいは、非変性糖部位、例えば、Ｇａｌが、Ｏ−結合グリカンの終端に付加されることができる。

他の例示的実施形態において、水溶性ポリマーは、ＧａｌＮＡｃ残基に、ガラクトース残基を有する変性糖質を介して付加される。あるいは、非変性Ｇａｌは、末端ＧａｌＮＡｃ残基に付加されることができる。

さらなる例において、水溶性ポリマーは、Ｇａｌ残基に、変性シアル酸を用いて付加される。

他の例示的実施形態において、Ｏ−結合グリコシル残基は、アミノ酸に結合されたＧａｌＮＡｃに「トリムされて、戻される」。一例において、水溶性ポリマーは、ポリマーで変性されたＧａｌを介して付加される。あるいは、非変性ＧａｌがＧａｌＮＡｃに付加され、続いて、結合された水溶性ポリマーを有するＧａｌが付加される。他の実施形態において、１つまたは複数の非変性Ｇａｌ残基がＧａｌＮＡｃに付加され、続いて水溶性ポリマーを有するシアル酸部位変性が付加される。

本発明の方法を用いて、実質的にいずれかの所望の構造の炭水化物残基を「トリムし戻す」こと、および構築するが可能である。変性糖質は、上記に規定されるとおり、炭水化物部位の終端に付加されることができ、またはこれは、ペプチドコアおよび炭水化物の終端の間の中間体であることができる。

例示的実施形態において、水溶性ポリマーは、末端Ｇａｌ残基に、ポリマー変性シアル酸を用いて付加される。適切なシアリルトランスフェラーゼが、変性シアル酸を付加するために用いられる。アプローチは、スキーム３にまとめられている。

スキーム４にまとめられているさらなるアプローチにおいては、マスク化反応性官能基が、シアル酸上に存在している。マスク化反応性基は、好ましくは、変性シアル酸をペプチドに結合させるために用いられる条件によって影響されない。変性シアル酸のペプチドへの共有結合の後、マスクが除去され、およびペプチドが、ＰＥＧ、ＰＰＧ、治療的部位、生体分子または他の剤などの剤と複合化される。剤は、変性糖質残基上の非マスク化反応性基とのその反応によって、特定の方策でペプチドに複合化される。

いずれの変性糖質も、グリコペプチドのオリゴ糖側鎖の末端糖質（表２）に応じて、その適切なグリコシルトランスフェラーゼと、用いられることができる。上記に考察されているとおり、ＰＥＧ化またはＰＰＧ化構造の導入に必要とされるグリコペプチドの末端糖質は、自然に発現中に導入されることができ、または発現後に、適切なグリコシダーゼ、グリコシルトランスフェラーゼまたはグリコシダーゼとグリコシルトランスフェラーゼとの混合物を用いて産生されることができる。

さらなる例示的実施形態において、ＵＤＰ−ガラクトース−ＰＥＧは牛乳□１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼと反応され、これにより変性ガラクトースが適切な末端Ｎ−アセチルグルコースアミン構造に転移される。グリコペプチド上の末端ＧｌｃＮＡｃ残基は、哺乳類、昆虫、植物または真菌類などの発現系において生じ得るとおり発現中に産生され得るが、グリコペプチドを、必要に応じて、シアリダーゼおよび／またはグリコシダーゼおよび／またはグリコシルトランスフェラーゼで処理することにより産生することもできる。

他の例示的実施形態において、ＧＮＴ１−５などのＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼは、ペグ化−ＧｌｃＮをグリコペプチド上の末端マンノース残基に転移させるために用いられる。さらなる例示的実施形態においては、Ｎ−および／またはＯ−結合グリカン構造がグリコペプチドから酵素的に除去されて、その後に変性糖質で複合化されるアミノ酸または末端グリコシル残基を露出させる。例えば、エンドグリカナーゼが、グリコペプチドのＮ−結合構造を除去してグリコペプチド上のＧｌｃＮＡｃ−結合−Ａｓｎとしての末端ＧｌｃＮＡｃを露出させるために用いられる。ＵＤＰ−Ｇａｌ−ＰＥＧおよび適切なガラクトシルトランスフェラーゼが、ＰＥＧ−またはＰＰＧ−ガラクトース官能基を、露出されたＧｌｃＮＡｃ上に導入するために用いられる。

代替的実施形態において、変性糖質は、ペプチド主鎖に、糖質残基をペプチド主鎖に転移させると知られているグリコシルトランスフェラーゼを用いて直接的に付加される。この例示的実施形態は、スキーム５に規定されている。本発明の実施に有用である例証的なグリコシルトランスフェラーゼとしては、限定されないが、ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼ（ＧａｌＮＡｃ Ｔ１−２０）、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼ、フコシルトランスフェラーゼ、グルコシルトランスフェラーゼ、キシロシルトランスフェラーゼ、マンノシルトランスフェラーゼ等が挙げられる。このアプローチの使用は、変性糖質の、いずれかの炭水化物を欠くペプチド上への、または、代わりに、既存のグリコペプチド上への直接的な付加を許容する。両方の場合において、変性糖質の付加は、グリコシルトランスフェラーゼ基質特異性に定義されるとおりペプチド主鎖上の特異的な位置で生じ、化学的方法を用いるタンパク質のペプチド主鎖の変性中に生じるように無作為の方策では生じない。剤のアレイが、適切なアミノ酸配列をポリペプチド鎖中に操作することによりグリコシルトランスフェラーゼ基質ペプチド配列に欠けるタンパク質またはグリコペプチドに導入されることができる。

上記に規定された例示的実施形態の各々において、１つまたは複数の追加の化学的または酵素的変性ステップが、変性糖質のペプチドへの複合化に続いて用いられることができる。例示的実施形態において、酵素（例えば、フコシルトランスフェラーゼ）が、グリコシル単位（例えば、フコース）をペプチドに結合された末端変性糖質に付加させるために用いられる。他の例において、酵素反応は、変性糖質が複合化し損なった（例えば、シアリル化）サイトを「キャップ」するために用いられる。あるいは、化学的反応が、複合化変性糖質の構造を変更するために用いられる。例えば、複合化変性糖質は、変性糖質が結合されたペプチド成分を有する、そのリンケージを安定化または不安定化させる剤と反応される。他の例において、変性糖質の成分は、そのペプチドへの複合化に続いて脱保護下される。当業者は、本発明の方法において変性糖質がペプチドに複合化された後のステージにおいて有用である酵素的および化学的手順のアレイがあることを認識するであろう。変性糖質−ペプチド複合体のさらなる生成が本発明の範囲内にある。

第ＩＸ因子複合体の精製
上記プロセスによって産生される産生物は、精製せずに用いられることができる。しかしながら、通常は、産生物および１種または複数の中間体、例えば、ヌクレオチド糖質、分岐および直鎖ＰＥＧ種、変性糖質および変性ヌクレオチド糖質を回収することが好ましい。薄膜または厚膜クロマトグラフィ、カラムクロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィ、または膜ろ過などの、グリコシル化サッカライドの回収のための標準の、周知の技術を用いられることができる。膜ろ過を用いることが好ましく、本願明細書中以下に考察されるとおり、および本願明細書において援用される文献にあるとおり、逆浸透膜、または回収するための１つまたは複数のカラムクロマトグラフィ技術を利用することがより好ましい。例えば、膜が約３０００〜約１０，０００の分子量カットオフを有する膜ろ過は、グリコシルトランスフェラーゼなどのタンパク質を除去するために用いられることができる。

ペプチドが細胞内で産生される場合、第１のステップとして、粒状のデブリ、宿主細胞または溶解された断片のいずれかが除去される。グリコペグ化に続いて、ペグ化ペプチドは、技術分野で認識された方法、例えば遠心分離または限外ろ過によって精製され；任意により、タンパク質が市販されているタンパク質濃度フィルタで濃縮され得、続いて、免疫親和性クロマトグラフィ、イオン交換カラム分別（例えば、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）または、カルボキシメチルまたはスルホプロピル基を含有するマトリックス上での）；ブルーセファロース（Ｂｌｕｅ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）、ＣＭブルーセファロース（Ｂｌｕｅ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）、ＭＯＮＯ−Ｑ、ＭＯＮＯ−Ｓ、レンチルレクチン−セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）、ＷＧＡ−セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）、Ｃｏｎ Ａ−セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）、エーテルトヨパール（Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ）、ブチルトヨパール（Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ）、フェニルトヨパール（Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ）、またはタンパク質Ａセファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）でのクロマトグラフィ；ＳＤＳ−ＰＡＧＥクロマトグラフィ、シリカクロマトグラフィ、クロマトフォーカシング、逆相ＨＰＬＣ（例えば、添付の脂肪族基を有するシリカゲル）、例えば、セファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）分子ふるいを用いるゲルろ過またはサイズ排除クロマトグラフィ、ポリペプチドを選択的に結合させるカラムでのクロマトフラフィ、およびエタノールまたは硫酸アンモニウム沈殿から選択される１つまたは複数のステップによってポリペプチド変異体を他の不純物から分離させる。

培養において産生される変性グリコペプチドは、通常は、細胞、酵素等からの初期抽出によって単離され、濃度、塩析、水性イオン交換、またはサイズ排除クロマトグラフィステップの１つまたは複数が続く。追加して、変性糖タンパク質は、親和性クロマトグラフィによって精製され得る。最後に、ＨＰＬＣが、最終精製ステップに利用され得る。

プロテアーゼ抑制因子、例えば、メチルスルホニルフロリド（ＰＭＳＦ）が、タンパク質分解を阻害するために前述のステップのいずれかに含まれ得、および抗生物質または防腐剤が、外来性汚染物の増殖を予防するために含まれ得る。例示的実施形態において、プロテアーゼ抑制因子はアンチパインである。

他の実施形態において、本発明の変性グリコペプチドを産生するシステムからの上澄は、先ず、市販されているタンパク質濃度フィルタ、例えばアミコン（Ａｍｉｃｏｎ）またはミリポアペリコン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｐｅｌｌｉｃｏｎ）限外ろ過ユニットを用いて濃縮される。濃縮ステップに続いて、濃縮物は好適な精製マトリックスに適用され得る。例えば、好適な親和性マトリックスは、好適な担体に結合されたペプチドについてのリガンド、レクチンまたは抗体分子を含み得る。あるいは、例えば、側鎖ＤＥＡＥ基を有するマトリックスまたは基質といったアニオン−交換樹脂が用いられ得る。好適なマトリックスとしては、タンパク質の精製において通例用いられるアクリルアミド、アガロース、デキストラン、セルロース、または他のタイプが挙げられる。あるいは、カチオン−交換ステップが用いられ得る。好適なカチオン交換体としては、スルホプロピルまたはカルボキシメチル基を含む種々の不溶性マトリックスが挙げられる。スルホプロピル基が特に好ましい。

精製において用いられる他の方法としては、サイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィ、疎水性相互作用クロマトグラフィおよびブルーセファロース（Ｂｌｕｅ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）でのクロマトグラフィが挙げられる。

疎水性ＲＰ−ＨＰＬＣ媒体、例えば側鎖メチルまたは他の脂肪族基を有するシリカゲルを用いる１つまたは複数のＲＰ−ＨＰＬＣステップが、ポリペプチド複合体組成物をさらに精製するために用いられ得る。前述の精製ステップのいくつかまたはすべてもまた、種々の組み合わせで、均質なまたは基本的に均質な変性糖タンパク質を提供するために用いられることができる。

大規模発酵からもたらされる本発明の変性グリコペプチドは、ウルダル（Ｕｒｄａｌ）ら、「Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇ．」２９６：１７１（１９８４年）に開示のものと類似の方法によって精製され得る。この文献は、調製用ＨＰＬＣカラムでの組み換え型ヒトＩＬ−２の精製についての、２つの順次の、ＲＰ−ＨＰＬＣステップを記載する。あるいは、親和性クロマトグラフィなどの技術が、変性糖タンパク質を精製するために用いられ得る。

医薬品組成物
本発明における使用の医薬品組成物の記載は、２００５年５月２５日出願の米国仮特許出願第６０／６８４，７２９号明細書（代理人整理番号：０４０８５３−０１−５１４４Ｐ１）および２００４年９月１３日出願の米国仮特許出願第６０／５２７，０８９号明細書（代理人整理番号：０４０８５３−０１−５１４４ＰＲ）にさらに記載されており、これらの両方は、本願明細書において参照により援用されている。

以下の実施例は、本発明の複合体および方法を例示するために提供されており、特許請求された発明を限定するためにではない。

実施例１
システイン−ＰＥＧ_２（２）の調製

１．１（１）の合成
水酸化カリウム（８４．２ｍｇ、１．５ｍｍｏｌ、粉末として）を、Ｌ−システイン（９３．７ｍｇ、０．７５ｍｍｏｌ）の無水メタノール（２０ｍＬ）溶液に、アルゴン下で添加した。混合物を、室温で３０分攪拌し、次いで分子質量２０キロダルトン（Ｔｓ；１．０ｇ、０．０５ｍｍｏｌ）のｍＰＥＧ−Ｏ−トシレートを数々の分量で２時間かけて添加した。混合物を室温で５日間攪拌し、およびロータリー蒸発により濃縮した。残渣を水（３０ｍＬ）で希釈し、および室温で２時間攪拌して、いずれかの過剰量の２０キロダルトンｍＰＥＧ−Ｏ−トシレートを破壊した。溶液を、次いで酢酸で中和して、ｐＨをｐＨ５．０に調整し、および逆相クロマトグラフィ（Ｃ−１８シリカ）カラムに装填した。カラムをメタノール／水（産生物は約７０％メタノールで溶離される）の勾配で溶離し、産生物の溶離は蒸発光散乱によってモニターし、および適切な分画を回収すると共に水（５００ｍＬ）で希釈した。この溶液をクロマトグラフィに供し（イオン交換、ＸＫ５０Ｑ、ＢＩＧビーズ、３００ｍＬ、水酸化物形態；水対水／酢酸−０．７５Ｎ勾配）、および適切な分画のｐＨを酢酸で６．０に低下させた。この溶液を、次いで、逆相カラム（Ｃ−１８シリカ）上に捕獲し、および上記のメタノール／水の勾配で溶離した。産生物分画をプールし、濃縮し、水中に再溶解させ、および凍結乾燥して、４５３ｍｇ（４４％）の白色の固体（１）を得た。化合物についての構造データは以下のとおりである：^１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ；Ｄ_２Ｏ）δ２．８３（ｔ，２Ｈ，Ｏ−Ｃ−ＣＨ _２−Ｓ）、３．０５（ｑ，１Ｈ，Ｓ−ＣＨＨ−ＣＨＮ）、３．１８（ｑ，１Ｈ、（ｑ，１Ｈ，Ｓ−ＣＨＨ−ＣＨＮ）、３．３８（ｓ，３Ｈ，ＣＨ _３Ｏ）、３．７（ｔ，ＯＣＨ _２ＣＨ _２Ｏ）、３．９５（ｑ，１Ｈ，ＣＨＮ）。産生物の純度は、ＳＤＳ ＰＡＧＥで確認した。

１．２（２）の合成
トリエチルアミン（約０．５ｍＬ）を、無水ＣＨ_２Ｃｌ_２（３０ｍＬ）中に溶解した溶液１（４４０ｍｇ、２２μｍｏｌ）に、溶液が塩基性になるまで滴下した。２０キロダルトンｍＰＥＧ−Ｏ−ｐ−ニトロフェニルカーボネート（６６０ｍｇ、３３μｍｏｌ）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（３．６ｍｇ、３０．８μｍｏｌ）のＣＨ_２Ｃｌ_２（２０ｍＬ）中の溶液を、数々の分量で１時間かけて室温で添加した。反応混合物を、室温で２４時間攪拌した。溶剤を、次いでロータリー蒸発によって除去し、残渣を水（１００ｍＬ）中に溶解し、およびｐＨを１．０Ｎ ＮａＯＨで９．５に調整した。塩基性溶液を、室温で２時間攪拌し、次いで酢酸で、ｐＨ７．０に中和した。溶液を、次いで、逆相クロマトグラフィ（Ｃ−１８シリカ）カラムに装填した。カラムを、メタノール／水（産生物は、約７０％メタノールで溶離される）の勾配で溶離し、産生物の溶離は蒸発光散乱によってモニターし、および適切な分画を回収すると共に水（５００ｍＬ）で希釈した。この溶液をクロマトグラフィに供し（イオン交換、ＸＫ５０Ｑ、ＢＩＧビーズ、３００ｍＬ、水酸化物形態；水対水／酢酸−０．７５Ｎ勾配）、および適切な分画のｐＨを酢酸で６．０に低下させた。この溶液を、次いで、逆相カラム（Ｃ−１８シリカ）上に捕獲し、および上記のメタノール／水の勾配で溶離した。産生物分画をプールし、濃縮し、水中に再溶解させ、および凍結乾燥して、５７５ｍｇ（７０％）の白色の固体（２）を得た。化合物についての構造データは以下のとおりである：^１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ；Ｄ_２Ｏ）δ２．８３（ｔ，２Ｈ，０−Ｃ−ＣＨ _２−Ｓ）、２．９５（ｔ，２Ｈ，Ｏ−Ｃ−ＣＨ _２−Ｓ）、３．１２（ｑ，１Ｈ，Ｓ−ＣＨＨ−ＣＨＮ）、３．３９（ｓ，３Ｈ ＣＨ _３Ｏ）、３．７１（ｔ，ＯＣＨ _２ＣＨ _２Ｏ）。産生物の純度は、ＳＤＳ ＰＡＧＥで確認した。

実施例２
ＣＨＯ細胞において産生された第ＩＸ因子のグリコペグ化
この実施例は、実施例は、アシアロ第ＩＸ因子の調製およびＣＭＰ−シアル酸−ＰＥＧでのそのシアリル化を規定する。

２．１ｒ第ＩＸ因子の脱シアリル化
凝固第ＩＸ因子の組み換え型形態（ｒ第ＩＸ因子）を、ＣＨＯ細胞中に形成した。６０００ＩＵのｒ第ＩＸ因子を、合計で１２ｍＬ ＵＳＰ Ｈ_２Ｏに溶解した。この溶液を、セントリコンプラス（Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ Ｐｌｕｓ）２０、ＰＬ−１０遠心フィルタに、さらなる６ｍＬ ＵＳＰ Ｈ_２Ｏと共に移した。溶液を、２ｍＬに濃縮し、次いで、１５ｍＬ５０ｍＭトリス−ＨＣｌ ｐＨ７．４、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＣａＣｌ_２、０．０５％ＮａＮ_３で希釈し、次いで再濃縮した。希釈／濃縮を４回反復して、有効に緩衝剤を３．０ｍＬの最終体積に変化させた。この溶液の、２．９ｍＬ（約２９ｍｇのｒ第ＩＸ因子）を小さいプラスチックチューブに移し、およびこれに、５３０ｍＵ α２−３，６，８−ノイラミニダーゼ−アガロース複合体（コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）、カルビオケム（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）、４５０μＬ）を添加した。反応混合物を穏やかに、２６．５時間、３２℃で回転させた。混合物を２分間１０，０００ｒｐｍで遠心分離し、および上澄みを回収した。（ノイラミダーゼを含有する）アガロースビーズを６回、０．５ｍＬ５０ｍＭトリス−ＨＣｌ ｐＨ７．１２、１Ｍ ＮａＣｌ、０．０５％ＮａＮ_３で洗浄した。プールした洗液および上澄を再度、２分間、１０，０００ｒｐｍで遠心分離して、いずれかの残存アガロース樹脂を除去した。プールした、脱シアリル化タンパク質溶液を、１９ｍＬに同一の緩衝剤で希釈し、および約２ｍＬに、セントリコンプラス（Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ Ｐｌｕｓ）２０ＰＬ−１０遠心フィルタ中に濃縮した。溶液を２回、１５ｍＬの５０ｍＭトリス−ＨＣｌ ｐＨ７．４、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０５％ＮａＮ_３で希釈し、および２ｍＬに再濃縮した。最終脱シアル化ｒ第ＩＸ因子溶液を、３ｍＬの最終体積（約１０ｍｇ／ｍＬ）に、トリス緩衝剤で希釈した。原生および脱シアリル化ｒ第ＩＸ因子サンプルを、ＩＥＦ−電気泳動によって分析した。等電点電気泳動ゲル（ｐＨ３〜７）を、先ず、１０μＬトリス緩衝剤で希釈し、１２μＬサンプル添加緩衝剤と混合した１．５μＬ（１５μｇ）サンプルを用いて実行した。標準手順を用いてゲルを装填し、実行し、および固定した。ゲルを、コロイダルブルーステイン（Ｃｏｌｌｏｉｄａｌ Ｂｌｕｅ Ｓｔａｉｎ）（図１５４）を用いて染色し、脱シアリル化第ＩＸ因子についてのバンドを示した。

実施例３
ＰＥＧ（１ｋＤａおよび１０ｋＤａ）−ＳＡ−第ＩＸ因子の調製
脱シアリル化ｒ第ＩＸ因子（２９ｍｇ、３ｍＬ）を、２つの１５ｍＬ遠心分離チューブ中に、２つの１．５ｍＬ（１４．５ｍｇ）サンプルに分けた。各溶液を、１２．６７ｍＬ５０ｍＭトリス−ＨＣｌ ｐＨ７．４、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０５％ＮａＮ_３で希釈し、およびＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ−１ｋまたは１０ｋ（７．２５μｍｏｌ）の一方を添加した。チューブを穏やかに逆さにして混合し、および２．９Ｕ ＳＴ３Ｇａｌ３（３２６μＬ）を添加した（総体積１４．５ｍＬ）。チューブを再度逆さにすると共に、６５時間３２℃で穏やかに回転させた。反応を、−２０℃で凍結させることにより停止させた。反応の１０μｇサンプルを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。ペグ化タンパク質を、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水を伴うトーソーハースバイオセップ（Ｔｏｓｏ Ｈａａｓ Ｂｉｏｓｅｐ）Ｇ３０００ＳＷ（２１．５×３０ｃｍ、１３ｕｍ）ＨＰＬＣカラム、ｐＨ７．１（Ｇｉｂｃｏ）、６ｍＬ／分で精製した。反応および精製をＳＤＳページ（Ｐａｇｅ）およびＩＥＦゲルを用いてモニターした。ノべックス（Ｎｏｖｅｘ）トリス−グリシン４−２０％１ｍｍゲルを、１０μＬ（１０μｇ）のサンプルと共に、２μＬの５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％ＮａＮ_３緩衝剤での希釈で希釈し、および１２μＬサンプル添加緩衝剤および１μＬ０．５Ｍ ＤＴＴと混合した後に装填し、および６分間８５℃で加熱した。ゲルを、コロイダルブルーステイン（Ｃｏｌｌｏｉｄａｌ Ｂｌｕｅ Ｓｔａｉｎ）（図１５５）で染色して、ＰＥＧ（１ｋＤａおよび１０ｋＤａ）−ＳＡ−第ＩＸ因子についてのバンドを示した。

実施例４
第ＩＸ因子の直接的シアリル−グリコペグ化
この実施例は、事前のシアリダーゼ処置無しでの第ＩＸ因子のシアリル−ペグ化の調製を規定する。

４．１第ＩＸ因子のＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ−（１０ＫＤａ）でのシアリル−ペグ化
ＣＨＯ細胞中に発現されると共に完全にシアリル化された第ＩＸ因子（１１００ＩＵ）を、５ｍＬの２０ｍＭヒスチジン、５２０ｍＭグリシン、２％スクロース、０．０５％ＮａＮ_３および０．０１％ポリソルベート８０、ｐＨ５．０に溶解した。ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ−（１０ｋＤａ）（２７ｍｇ、２．５μｍｏｌ）を、次いで、溶液中に溶解し、および１ＵのＳＴ３Ｇａｌ３を添加した。反応を、２８時間、３２℃で穏やかに混合した後に完了させた。反応を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって説明されたとおり分析した。産生物タンパク質を、リン酸緩衝生理食塩水を伴うアメルシャムスーパーデックス（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ）２００（１０×３００ｍｍ、１３μｍ）ＨＰＬＣカラム、ｐＨ７．０（ＰＢＳ）、１ｍＬ／分、Ｒ_ｔ＝９．５分で精製した。

実施例５
第ＩＸ因子の、ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ−（２０ｋＤａ）でのシアリル−ペグ化
ＣＨＯ細胞中に発現されると共に完全にシアリル化された第ＩＸ因子（１１００ＩＵ）を、５ｍＬの２０ｍＭヒスチジン、５２０ｍＭグリシン、２％スクロース、０．０５％ＮａＮ_３および０．０１％ポリソルベート８０、ｐＨ５．０に溶解した。ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ−（２０ｋＤａ）（５０ｍｇ、２．３μｍｏｌ）を、次いで、溶液中に溶解し、およびＣＳＴ−ＩＩを添加した。反応混合物を、４２時間、３２℃で穏やかに混合した後に完成させた。反応を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって説明されたとおり分析した。

産生物タンパク質を、リン酸緩衝生理食塩水を伴うアメルシャムスーパーデックス（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ）２００（１０×３００ｍｍ、１３μｍ）ＨＰＬＣカラム、ｐＨ７．０（Ｆｉｓｈｅｒ）、１ｍＬ／分、Ｒ_ｔ＝８．６分で精製した。

実施例６
グリコペグ化第ＩＸ因子のシアル酸封止
この実施例は、シアリル−グリコペグ化第ＩＸ因子のシアル酸封止についての手順を規定する。

６．１第ＩＸ因子−ＳＡ−ＰＥＧ（１０ｋＤａ）のＮ−結合およびＯ−結合グリカンのシアル酸封止
精製したｒ−第ＩＸ因子−ＰＥＧ（１０ｋＤａ）（２．４ｍｇ）を、セントリコン（Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ（登録商標））プラス（Ｐｌｕｓ）２０ＰＬ−１０（マサチューセッツ州ベッドフォードのミリポア社（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐ．，Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ））遠心ろ過機において濃縮し、および緩衝剤が５０ｍＭトリス−ＨＣｌ ｐＨ７．２、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０５％ＮａＮ_３に変更されて１．８５ｍＬの最終体積とした。タンパク質溶液を、３７２μＬの同一のトリス緩衝剤で希釈し、７．４ｍｇ ＣＭＰ−ＳＡ（１２μｍｏｌ）を固体として添加した。溶液を穏やかに逆さまにして混合し、および０．１Ｕ ＳＴ３Ｇａｌ１および０．１Ｕ ＳＴ３Ｇａｌ３を添加した。反応混合物を、４２時間３２℃で穏やかに回転させた。

１０μｇサンプルの反応をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。ノベックス（Ｎｏｖｅｘ）トリス−グリシン４〜１２％１ｍｍゲルを実施し、およびコロイダルブルー（Ｃｏｌｌｏｉｄａｌ Ｂｌｕｅ）を用いて、インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって説明されているとおり染色した。簡潔には、サンプル、１０μＬ（１０μｇ）を１２μＬサンプル添加液および１μＬ０．５Ｍ ＤＴＴと混合し、６分間８５℃で加熱した。

実施例７
グリコペグ化第ＩＸ因子薬物動態学的試験
４種のグリコペグ化ＦＩＸ変異体（ＰＥＧ−９変異体）を、正常なマウスにおけるＰＫ試験においてテストした。４種の化合物の活性は、凝固、内因性トロンビン産生能（ＥＴＰ）、およびトロンボエラストグラフィ（ＴＥＧ）アッセイによって既にインビトロで確立されていた。活性結果が表Ｉにまとめられている。

４種のＰＥＧ−９化合物の循環における活性の延長を評価するために、ＰＫ試験を設計し、実施した。非血友病マウスを用いた（２動物／時点、３サンプル／動物）。抜き取り時間点は、化合物の投与後０、０．０８、０．１７、０．３３、１、３、５、８、１６、２４、３０、４８、６４、７２、および９６時間とした。血液サンプルを遠心分離し、２つのアリコートで保管した（一方は凝固分析のために、および他方はＥＬＩＳＡのために）。材料の限定のために、ＰＥＧ−９化合物を異なる量で投与した：ｒｈＦＩＸ２５０Ｕ／ｋｇ；２Ｋ（低置換：「ＬＳ」（１〜２ＰＥＧ置換／ペプチド分子）２００Ｕ／ｋｇ；２Ｋ（高置換：「ＨＳ」（３〜４ＰＥＧ置換／ペプチド分子）２００Ｕ／ｋｇ；１０Ｋ１００Ｕ／ｋｇ；３０Ｋ１００Ｕ／ｋｇ。すべての投与量は、計測された凝固アッセイ単位に基づいていた。

結果が表ＩＩに要約されている。

結果は、すべてのＰＥＧ−９化合物について延長化に向かう傾向を示している。ＡＵＣおよびＣｍａｘの値は直接的には比較しなかった。しかしながら、クリアランス（ＣＬ）を比較したところ、ＣＬは、ＰＥＧ−９化合物については、ｒｈＦＩＸと比して低く、マウスにおけるより長い滞留時間を示していた。最終検出可能凝固活性についての時間は、ＰＥＧ−９化合物については、ｒｈＦＩＸは最高の投与量で投与されていたにもかかわらずｒｈＦＩＸと比して増加していた。

実施例８
ＬＳおよびＨＳグリコペグ化第ＩＸ因子の調製
ＰＥＧとの低度の置換のグリコペグ化第ＩＸ因子を、ＳＴ３Ｇａｌ−ＩＩＩによって触媒された交換反応によって、原生第ＩＸ因子から調製した。反応を、１０ｍＭヒスチジン、２６０ｍＭグリシン、１％スクロースおよび０．０２％トゥイーン（Ｔｗｅｅｎ）８０、ｐＨ７．２の緩衝剤において実施した。ＣＭＰＳＡ−ＰＥＧ（２ｋＤおよび１０ｋＤ）とのペグ化について、第ＩＸ因子（０．５ｍｇ／ｍＬ）を、ＳＴ３ＧａｌＩＩＩ（５０ｍＵ／ｍＬ）およびＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ（０．５ｍＭ）と、１６時間、３２℃でインキュベートした。ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ３０ｋＤとのペグ化について、第ＩＸ因子の濃度を１．０ｍｇ／ｍＬに増加し、およびＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧの濃度を０．１７ｍＭに減少させた。これらの条件下で、９０％を超える第ＩＸ因子分子を、少なくとも１種のＰＥＧ部位で置換した。

ＰＥＧとの高度の置換のグリコペグ化第ＩＸ因子を、原生第ＩＸ因子の酵素的脱シアリル化によって調製した。第ＩＸ因子ペプチドをＰＤ１０カラムを用いて、５０ｍＭ ｍＥＳ、ｐＨ６．０に、１６時間、３２℃で緩衝剤交換し、０．６６ｍｇ／ｍＬの濃度に調整し、ＡＵＳシアリダーゼ（５ｍＵ／ｍＬ）で処理した。脱シアリル化を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＨＰＬＣおよびＭＡＬＤＩグリカン分析によって確認した。アシアロ第ＩＸ因子を、Ｑセファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）ＦＦで精製して、シアリダーゼを除去した。ＣａＣｌ_２断片を、Ｕｌｔｒａ１５濃縮器で濃縮し、およびＭＥＳ、ｐＨ６．０に、ＰＤ１０カラムを用いて緩衝剤交換した。

アシアロ−第ＩＸ因子の２ｋＤおよび１０ｋＤペグ化（０．５ｍｇ／ｍＬ）を、ＳＴ３Ｇａｌ−ＩＩＩ（５０ｍＵ／ｍＬ）およびＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ（０．５ｍＭ）との、３２℃で１６時間のインキュベーションによって行った。ＣＭＰＳＡ−ＰＥＧ−３０ｋＤとのペグ化について、第ＩＸ因子の濃度を１．０ｍｇ／ｍＬに増加し、およびＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧの濃度を０．１７ｍＭに減少させた。１６時間のペグ化後、末端ガラクトースを有するグリカンを、１ｍＭ ＣＭＰ−ＳＡを添加すると共に、インキュベーションを追加の８時間、３２℃で継続することにより、シアル酸で封止した。これらの条件下で、９０％を超える第ＩＸ因子分子が、少なくとも１種のＰＥＧ部位で置換された。この方法で産生された第ＩＸ因子は、より高い見かけ分子量をＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて有する。

実施例９
Ｏ−グリコペグ化第ＩＸ因子の調製
Ｏ−グリカン鎖を、ペプチドの、ＧａｌＮＡｃＴ−ＩＩ（２５ｍＵ／ｍＬ）および１ｍＭＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃとの、３２℃でのインキュベーションにより、原生第ＩＸ因子（１ｍｇ／ｍＬ）に新たに導入した。４時間のインキュベーション後、ペグ化反応を、ＣＭＰＳＡ−ＰＥＧ（０．５ｍＭで２Ｋｄあるいは１０Ｋｄ、または０．１７ｍＭで３０ｋＤｄ）およびＳＴ６ＧａｌＮＡｃ−Ｉ（２５ｍＵ／ｍＬ）を添加し、および追加で２０時間インキュベーションすることにより、開始させた。

実施例１０
ＦＩＸ−欠乏ノックアウトマウスにおける化合物Ａ（ＰＥＧ３０Ｋ ＦＩＸ）、化合物Ｂ（ＰＥＧ２Ｋ ＦＩＸ）、およびＦＩＸ（ｒｈＦＩＸ）のａＰＴＴアッセイ
１０．１材料および方法
実験において用いたすべてのマウスは、Ｃ５７Ｂ１／６系背景に交雑させたＦＩＸノックアウトマウス（リン（Ｌｉｎ）ら、「血液（Ｂｌｏｏｄ）」、１９９７年）であった。マウスは、薬物動態学的試験の時点で９〜１９週齢であった。雄および雌マウスの両方を試験した。マウスを、各群について類似する平均体重をもたらし、および群の各々における体重の分散をもたらすよう、群の間に分散させた。追加のマウスを維持して定期的に瀉血して、サンプルおよび標準の希釈のためのＦＩＸ欠乏血清を提供した。テスト動物を、アベルチン（Ａｖｅｒｔｉｎ）またはドミトル（Ｄｏｍｉｔｏｒ）で麻酔した。右および左首を剪毛し、および無菌方法で調製した。小さい切開部を右首に形成して、外頚静脈を露出させた。第ＩＸ因子を、（１５０Ｕ／ｋｇ）およそ１００〜１２０マイクロリットルの総体積で送達させた。針を抜き、およびゲルフォーム／サージフォーム（ｓｕｒｇｉｆｏａｍ）を、局所的な止血を補助するために、押圧しながら適用した。首切開部を縫合閉鎖した。マウスを加温ランプ下に置き、および全血を、９つの容量に採取した：以下の時間での１容量クエン酸ナトリウム：出血前（投与２４時間または４８時間前または７２時間後）；１５分；１時間；４時間；２４時間；４８時間；７２時間（交差群について、または出血前の代わりに）。各アリコートからのプラズマを、スタート４コアギュレーションアナライザー（Ｓｔａｒｔ ４ Ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ Ａｎａｌｙｚｅｒ）およびダプッチン（Ｄａｐｔｔｉｎ）Ｔｃ−試薬を用いるａＰＴＴ分析のために用いた。

化合物Ａは、Ｓ原子でのＰＥＧおよびＮＨでのＰＥＧを有するシステインに基づくシアル酸分岐ＰＥＧ（３０ｋＤ）でグリコペグ化されたＦＩＸであった。化合物Ｂは、ＮＨ部位でのＰＥＧと構成されるシアル酸直鎖ＰＥＧ（２ｋＤ）グリシンでグリコペグ化されたＦＩＸであった。

１０．２結果

複合化および非複合化ＦＩＸのこれらのマウスにおける末端相半減期を、各時点（末端相について６０分間、２４時間、４８時間、７２時間）での平均値をプロットして、降下線形曲線を形成し、および次いで、その線の傾きを以下の式において用いて判定した。
Ｔ_１／２＝ｌｏｇ_ｅ（２）／ｂ_２

ここで、ｂ_２は傾きである。（エブンスタイン（Ｅｗｅｎｓｔｅｉｎ）ら、「輸血（Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ）」、２００２年）。マウスにおける非複合化ＦＩＸ Ｔ_１／２は１２．８時間であった。

すべての値がａＰＴＴ標準についての線形範囲内にあったため、非複合化ＦＩＸサンプルについての値を未希釈（１：１）サンプルから測定した。１５分間サンプルは、実際には、１：１および１：２で実施し、および各々は、１５分間で７４％の一貫した結果をもたらした。１５０Ｕ／ｋｇの投与量は、プラズマ−由来ＦＩＸのヒトへの投与の後、１５０％の予期した回収(リカバリー)をもたらすであろう。非複合化ＦＩＸは、ヒトにおけるＰＤ ＦＩＸと比したとき、低下した回収（予期値の約５５〜８０％）を有することが知られている。これは、マウスにおいてはさらに低い可能性があり、これらの動物において見られた予期値の約５０％のＦＩＸ回収（観察値７４％／予期値１５０％）の原因となっている。

ネオーセ（Ｎｅｏｓｅ）Ａサンプルについての値の測定は、１：２および１：４に希釈したときであっても最高標準（２００％）を超えて上がる予想外に高い初期値を考慮しなければならない。最初の１時間における回収は、１５０Ｕ／ｋｇの投与量後の予期した回収の約５００％となる７００〜８００％範囲であると考えられる。末端半減期は上記のとおり算出して、２３時間である。

ネオーセ（Ｎｅｏｓｅ）Ｂサンプルについての値は、注入後最初の１時間において３２５〜３５０％の範囲であり、予期値の＞２００％の回収を示している。末端相Ｔ_１／２は１４．４時間であった。

本願明細書に記載の例および実施形態は、例示的目的だけのためであり、およびその点における種々の改良または変更が当業者に提示されることとなり、この出願の思想および範囲および添付の特許請求の範囲の範囲内に包含されることが理解される。本願明細書において引用したすべての刊行物、特許、および特許出願は、本願明細書において、すべての目的について、参照によりそれらの全体が援用される。

Ａｓｎ１５７、Ａｓｎ１６７；Ｓｅｒ５３、Ｓｅｒ６１、Ｔｈｒ１５９、Ｔｈｒ１６９、およびＴｈｒ１７２での有望なグリコシル化サイトの存在および位置を示す第ＩＸ因子の構造である。 第ＩＸ因子ペプチド上の炭水化物残基が再構築されグリコペグ化される本発明の例示的実施形態を示すスキームである：（Ａ）シアル酸部位がシアリダーゼによって除去され、および得られるガラクトース残基が図５のシアル酸誘導体でグリコペグ化される；（Ｂ）マンノース残基がシアル酸ＰＥＧでグリコペグ化される；（Ｃ）Ｎ−グリカンのシアル酸部位がシアル酸ＰＥＧでグリコペグ化される；（Ｄ）Ｏ−グリカンのシアル酸部位がシアル酸ＰＥＧでグリコペグ化される；（Ｅ）２（Ａ）からの第ＩＸ因子のＳＤＳ ＰＡＧＥゲル；（Ｆ）ゲル２（Ｃ）および２（Ｄ）を生成する反応からの第ＩＸ因子のＳＤＳ ＰＡＧＥゲル。 非グリコシル化第ＩＸ因子および酵素性グリコペグ化第ＩＸ因子のインビボ滞留寿命を比較するプロットである。 図３に示した種の活性を比較する表である。 第ＩＸ因子のアミノ酸配列である。 種々のグリコペグ化第ＩＸ因子分子の、非ペグ化第ＩＸ因子と比較した薬物動態学的特性の図表表示である。 本発明において使用される代表的な変性糖質種の表である。 本発明において使用される代表的な変性糖質種の表である。 本願明細書において規定されているものなどの受容体上への変性および／または変性シアル酸部位の転移に用いられるシアリルトランスフェラーゼの表である。 ３０ｋＤ ＰＥＧ（ネオース（Ｎｅｏｓｅ）Ａ）を有する第ＩＸ因子複合糖質、２ｋＤ ＰＥＧ（ネオース（Ｎｅｏｓｅ）Ｂ）を有する第ＩＸ因子複合糖質および非複合化第ＩＸ因子のインビボ活性を比較する時間経過プロットである。 ＥＬＩＳＡアッセイによって計測された、ｒｈＦＩＸ、グリコペグ化ＦＩＸ（３０ｋＤシアル酸；化合物Ａ）、グリコペグ化ＦＩＸ（２ｋＤシアル酸；化合物Ｂ）のインビボ濃度のプロットである。

Claims (3)

1. 第ＩＸ因子ペプチド配列と、式：
   

   

   （式中、
   Ｌ^ａは、−（ＣＨ_２）_ｊＣ（Ｏ）ＮＨ（ＣＨ_２）_ｈＣ（Ｏ）ＮＨ−であり、式中、指数ｈおよびｊは、０〜１０から独立に選択される整数であり、
   指数ｍおよびｎは、０〜５０００から独立に選択される整数であり、
   Ａ^１ およびＡ ^２ は、各々−ＯＣＨ _３ 又はＨであり、
   Ｒ^２はＨ、ＣＨ_２ＯＲ^７、ＣＯＯＲ^７またはＯＲ^７であり、ここで、Ｒ^７は、Ｈ、置換または非置換のアルキルまたは置換または非置換のヘテロアルキルを表し、ＣＯＯＲ^７がカルボン酸またはカーボキシレートである場合、両方の形態は、単一構造ＣＯＯ⁻またはＣＯＯＨの指名によって表され、
   Ｒ^３およびＲ^４は、Ｈ、置換または非置換のアルキル、ＯＲ^８、ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ^９を独立して表し、ここで、Ｒ^８およびＲ^９は、Ｈ、置換または非置換のアルキル、置換または非置換のヘテロアルキル、シアル酸またはポリシアル酸を独立して表す。）
   を有する少なくとも１つの複合化部位とを含む第ＩＸ因子ペプチド複合体。
2. 血友病を治療するための、請求項１に記載の第ＩＸ因子ペプチド複合体。
3. 請求項１に記載の第ＩＸ因子ペプチド複合体および薬学的に許容可能なキャリアを含む医薬品配合物。

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