MXPA05009940A - Compuestos de glp-1 de enlace de glicol polietilenico. - Google Patents

Compuestos de glp-1 de enlace de glicol polietilenico.

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Abstract

La invencion proporciona compuestos de GLP-1 acoplados a por lo menos una molecula de glicol polietilenico o su derivado, que dan como resultado un peptido biologicamente activo con una vida media extendida y una eliminacion mas lenta cuando se compara con aquel del peptido noPEGilado. Estos compuestos de GLP-1 PEGilados y composiciones son utiles para tratar diabetes, obesidad, sindrome de intestino irritable y otras condiciones que pudieran verse beneficiadas al reducir la glucosa en la sangre, inhibir motilidad gastrica y/o intestinal e inhibir el vaciado gastrico y/o intestinal, o inhibir el consumo de comida.

Description

COMPUESTOS GLP-1 UNIDOS A POLIETILENGLICOL CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a compuestos GLP-1 unidos covalentemente a una o más moléculas de polietilenglicol o un derivado del mismo, y composiciones relacionadas y procedimientos útiles para tratar afecciones o trastornos que se benefician de una disminución de glucosa en sangre, disminución de la ingesta de comida, disminución de vaciado gástrico o intestinal, o disminución de movilidad gástrica o intestinal. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El péptido-1 tipo glucagón (GLP-1) induce numerosos efectos biológicos tales como estimulación de secreción de insulina, inhibición de secreción de glucagón, inhibición de vaciado gástrico, inhibición de movilidad gástrica o movilidad intestinal, potenciamiento de utilización de glucosa, e inducción de pérdida de peso. GLP-1 puede funcionar adicionalmente para evitar el deterioro de células ß pancreáticas que sucede a medida que progresa la diabetes mellitus no insulino-dependiente (NIDDM). Una característica significativa de GLP-1 es su capacidad para estimular la secreción de insulina sin el riesgo asociado de hipoglucemia que se observa cuando se usa terapia de insulina o algunos tipos de terapias orales que funcionan aumentando la expresión de insulina. La utilidad de terapia que implica péptidos GLP-1 ha estado limitada por el hecho de que GLP-1 (1-37) es poco activo, y los dos péptidos truncados de origen natural, GLP-1 (7-37)OH y GLP-1 (7-36)NH2, se eliminan rápidamente in vivo y tienen vida medias extremadamente cortas in vivo. Se sabe que la dipeptidil-peptidasa IV (DPP-IV) producida de manera endógena inactiva péptidos GLP-1 en circulación retirando los restos de histidina y alanina N-terminales y es una razón principal de la vida media corta ¡n vivo. Se han emprendido diversos enfoques para prolongar la vida media de eliminación de un péptido GLP-1 o reducir la eliminación del péptido del cuerpo mientras se mantiene una actividad biológica. La Patente de EUA N° 5.705.483 describe análogos de péptido GLP-1 que se han hecho resistentes frente a la degradación por DPP-IV por la incorporación de modificaciones en el extremo N-terminal del péptido. Un enfoque alternativo para prolongar la vida media de péptidos GLP-1 es la derivatización, donde grandes grupos acilo que evitan que DPP-IV acceda al extremo N-terminal del péptido se unen a diversos aminoácidos de GLP-1 (Véase Solicitud Internacional N° PCT/DK97/00340, presentada el 22 de agosto de 1997, titulada "GLP-1 Derivatives", que reivindica el beneficio de las Solicitudes Provisionales DK N° 0931/96 presentada el 30 de agosto de 1996, N° 1259/96 presentada el 8 de noviembre de 1996 y N° 1470/96 presentada el 20 de diciembre de 1996). Se describen análogos de GLP-1 particulares en las Solicitudes de Patente de EUA N° de serie 60/346474 presentada el 8 de enero de 2002, y N° de serie 60/405.097 presentada el 21 de agosto de 2002, ahora Solicitud Internacional N° PCT/US03/058203 presentada el 3 de enero de 2003, todas tituladas "Extended Glucagon-Like Peptide-1 Analogs" y se incorporan en este documento en su totalidad. Estas solicitudes describen análogos de GLP-1 (7-37)OH donde diversos aminoácidos, cuando se añaden al extremo C-terminal, producen análogos de péptido GLP-1 con una vida media prolongada y una eliminación reducida en comparación con las de la molécula nativa. Además, los análogos de GLP-1 con potencia aumentada se describen en la Solicitud de Patente de EUA N° de serie 60/314.573 presentada el 23 de agosto de 2001 , ahora Solicitud Internacional N° PCT/US02/21325 presentada el 14 de agosto de 2002, titulada "Glucagon-Like Peptide-1 Analogs" (incorporada en este documento). La exendina-4 puede funcionar en el receptor de GLP-1 in vitro en ciertos tipos celulares incluyendo células secretoras de insulina [Goke, y col., J. Biol. Chem., (1993) 268:19650-19655]. Se describen moléculas agonistas de exendina y de exendina PEGiladas particulares en la Solicitud de Patente Internacional Número PCT/US00/ 1814 (incorporada en este documento en su totalidad). Aunque diversos enfoques han dado como resultado compuestos GLP-1 con una vida media más larga o mayor potencia que las de GLP-1 nativa, se necesitan enfoques adicionales que podrían usarse solos o en combinación con enfoques conocidos para disminuir adicionalmente la eliminación del compuesto GLP-1 y aumentar la vida media del compuesto GLP-1 optimizando de este modo su capacidad de ser útil como agente terapéutico que puede administrarse una cantidad mínima de veces durante un periodo prolongado de tiempo. La unión covalente de una o más moléculas de polietilenglicol a un péptido pequeño, biológicamente activo tal como GLP-1 o exendina-4 tiene el riesgo de introducir características adversas tales como inestabilidad a la molécula y reducción de la bioactividad de modo tan grave que la molécula se hace inapropiada para su uso como agente terapéutico. La presente invención; sin embargo, se basa en el descubrimiento de que la unión covalente de una o más moléculas de PEG a restos particulares de un compuesto GLP-1 da como resultado un compuesto GLP-1 PEGilado biológicamente activo con una vida media prolongada y eliminación reducida en comparación con las de GLP-1 nativo o Vals-GLP-1 (o exendina-4 nativa para péptidos de exendina-4 modificada de la invención).
Los compuestos GLP- PEGilados de la Invención tiene mayor utilidad como agente terapéutico así como mayor ventaja de uso que GLP-1 nativo porque mantienen toda o una porción de una actividad biológica de GLP-1 nativa pero tienen una vida media potenciada y/o eliminación reducida en comparación con las del compuesto GLP-1 nativo o las de Val8-GLP-1 (7-37)OH. GLP-1 (7-37) tiene una vida media en suero de sólo 3 a 5 minutos. GLP-1 (7-36) amida tiene un tiempo de acción de aproximadamente 50 minutos cuando se administra por vía subcutánea. Incluso los análogos de GLP-1 y derivados de los mismos que son resistentes a escisión por proteasa endógena, no tienen vida medias suficientemente largas para evitar las administraciones repetidas durante un periodo de 24 horas. Los compuestos GLP-1 PEGilados de la invención pueden tener una vida media en exceso de 24 horas permitiendo menos administraciones del compuesto GLP-1 PEGilado mientras que mantiene un alto nivel en sangre del compuesto durante un periodo prolongado de tiempo. Dichos compuestos GLP-1 PEGilados pueden usarse terapéuticamente para tratar a sujetos con trastornos que incluyen, aunque sin limitación, diabetes, obesidad, anormalidades de movilidad gástrica y/o intestinal, y anormalidades de vaciado gástrico y/o intestinal siendo una ventaja particular que los compuestos GLP-1 PEGilados de la invención requieren menos dosis durante un periodo de 24 horas, aumentado tanto la comodidad de un sujeto en necesidad de dicha terapia como la probabilidad de la conformidad del sujeto con los requisitos de dosificación. SUMARIO DE LA INVENCIÓN La invención descrita en este documento proporciona compuestos GLP-1 unidos covalentemente a una o más moléculas de polietilenglicol (PEG), o un derivado del mismo donde cada PEG está unido a un aminoácido Cys o Lys o al carboxi terminal del péptido, dando como resultado compuestos GLP-1 PEGilados con una vida media de eliminación de al menos una hora, preferiblemente al menos 3, 5, 7, 10, 15, 20 horas y más preferiblemente al menos 24 horas. Los compuestos GLP-1 PEGilados de la presente invención tienen preferiblemente un valor de eliminación de 200 ml/h/kg o menos, más preferiblemente 180, 150, 120, 100, 80, 60 ml/h/kg o menos y mucho más preferiblemente menos de 50, 40 o 20 ml/h/kg. Una modalidad de la invención es un compuesto GLP-1 PEGilado que comprende la secuencia de aminoácidos de GLP-1 (7-37)OH como se muestra en SEC.ID.N0 1 con una molécula de PEG unida covalentemente a 3, 2 ó 1 de los restos seleccionados entre el grupo constituido por Lys26, Lys34 y Gly37: 7His-Ala-Glu-10Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-15Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-20Leu-Glu- Gly-Gln-Ala-25Ala-Lys-Glu-Phe-lle-30Ala-Trp-Leu-Val-Lys-35Gly-Arg-37Gly (SEC.ID.N0 1). Otra modalidad de la invención es un compuesto GLP-1 PEGilado que comprende la secuencia de aminoácidos de GLP-1 (7-36)NH2 como se muestra en SEC.ID.N0 2 con una molécula de PEG unida covalentemente a 3, 2 ó 1 de los restos seleccionados entre el grupo constituido por Lys26> Lys34 y Arg36: 7His-Ala-Glu-10Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-15Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-20Leu-Glu- Gly-Gln-Ala-25Ala-Lys-Glu-Phe-lle-30Ala-Trp-Leu-Val-Lys-35Gly-Arg (SEC.ID.N0 2). Otra modalidad de la presente invención es un compuesto GLP-1 PEGilado que comprende la secuencia de aminoácidos de Fórmula I (SEC.ID.N0 3) XaaT-Xaae-Glu-Gly-Xaan-Xaa^-Thr-Ser-Asp-Xaaie-Ser-Xaais-Xaaig-Xaaao- Glu-Xaa22-Xaa23-Xaa24-Xaa25-Xaa26-Xaa27-Phe-lle-Xaa30-Trp-Leu-Xaa33- Xaa34- aa35-Xaa36- aa37 Fórmula I (SEC.ID.N0 3) en la que: Xaa7 es: L-histidina, D-histidina, desamino-histidina, 2-amino-histidina, ß-hidroxi-histidina, homohistidina, a-fluorometil-histidina, o ot-metil-histidina; Xaa8 es: Ala, Gly, Val, Leu, lie, Ser, o Thr; Xaan es: Thr o Cys; Xaa-12 es: Phe, Trp, Tyr, o Cys; Xaa 5 es: Val, Trp, lie, Leu, Phe, Tyr, o Cys; Xaa-is es: Ser, Trp, Tyr, Phe, Lys, lie, Leu, Val; Xaa-19 es: Tyr, Trp, o Phe; Xaa2o es: Leu, Phe, Tyr, o Trp; Xaa22 es: Gly, Glu, Asp, Lys, o Cys; Xaa24 es: Ala o Cys; Xaa25 es: Ala, Val, lie, Leu, o Cys; Xaa26 es: Lys o Cys; Xaa27 es: Glu, lie, Ala, o Cys; Xaa30 es: Ala, Glu, o Cys; Xaa33 es: Val o lie; Xaa34 es: Lys o Cys; Xaa35 es: Gly o Cys; Xaa36 es: Arg o Cys; Xaa37 es: Gly, His, Cys, NH2, o está ausente; y en la que: 2 ó 1 de los restos de Cys están unidos covalentemente a una molécula de PEG, o 3, 2 ó 1 de los restos de Lys están unidos covalentemente a una molécula de PEG, o el aminoácido carboxi-terminal está unido covalentemente a una molécula de PEG; y a condición de que haya 2, 1 ó 0 Cys en la molécula. Otra modalidad de la presente invención es un compuesto GLP-1 PEGilado que comprende la secuencia de aminoácidos de Fórmula II (SEC.ID.N° 4): Xaa7-Xaa8-Glu-Gly-Xaan-Xaai2-Thr-Ser-Asp-Xaai6-Ser-Xaai8-Tyr-Leu-Glu- Xaa22-Xaa23-Xaa24-Xaa25-Xaa26-Xaa27-Phe-lle-Xaa30-Trp-Leu-Xaa33-Xaa34- Formula II (SEC.ID.N° 4) en la que: Xaa es: L-histldina, D-histidina, desamino-histidina, 2-amino-histidina, ß-hidroxi-histidina, homohistidina, -fluorometil-histidina, o a-metil-histidina; Xaa8 es: Gly, Ala, Val, Leu, lie, Ser, o Thr; Xaa-?-? es: Thr o Cys; Xaa16 es: Val, Phe, Tyr, Trp, o Cys; Xaa18 es: Ser, Tyr, Trp, Phe, Lys, lie, Leu, o Val; Xaa22 es: Gly, Glu, Asp, Lys, o Cys; Xaa23 es: Gln o Cys; Xaa25 es: Ala, Val, lie, Leu, o Cys; Xaa27 es: Glu o Cys; Xaa3o es: Ala o Cys; Xaa34 es: Lys o Cys; Xaa35 es: Gly o Cys; Xaa37 es: Gly, Cys, NH2, o está ausente, y en la que: 2 ó 1 de los restos de Cys están unidos covalentemente a una molécula de PEG, o 3, 2 ó 1 de los restos de Lys están unidos covalentemente a una molécula de PEG, o el aminoácido carboxi-terminal está unido covalentemente a una molécula de PEG; y a condición de que haya 2, 1 ó 0 Cys en la molécula. Otra modalidad de la presente invención es un compuesto GLP-1 PEGilado que comprende la secuencia de aminoácidos de Fórmula III (SEC.ID.N0 5) Xaa7-Xaa8-Glu-Gly-Xaaii-Xaa12-Thr-Ser-Asp-Xaai6-Ser-Xaai8-Xaa19-Xaa2o- Glu-Xaa22-Xaa23-Xaa24-Xaa25-Xaa26-Xaa27-Phe-lle-Xaa3D-Trp-Leu-Xaa33- Xaa34-Xaa35-Xaa36-Xaa37-Xaa38-Xaa39-Xaa4o-Xaa4i-Xaa42-Xaa43-Xaa 4- Xaa45-Xaa46-Xaa4 -Xaa48-Xaa 9-Xaa5o Formula III (SEC.ID.N0 5) en la que: Xaa7 es: L-histidina, D-histidina, desamino-histidina, 2-amino-histidina, ß-hidroxi-histidina, homohistidina, -fluorometil-histidina, o a-metil-histidina; Xaas es: Ala, Gly, Val, Leu, lie, Ser, o Thr; Xaan es: Thr o Cys; Xaai2 es: Phe, Trp, Tyr, o Cys; Xaa-16 es: Val, Trp, lie, Leu, Phe, Tyr, o Cys; Xaai8 es: Ser, Trp, Tyr, Phe, Lys, lie, Leu, o Val; Xaa-ig es: Tyr, Trp, o Phe; Xaa2o es: Leu, Phe, Tyr, o Trp; Xaa22 es: Gly, Glu, Asp, Lys, o Cys; Xaa24 es: Ala o Cys; Xaa25 es: Ala, Val, lie, Leu, o Cys; Xaa27 es: Glu, lie, Ala, o Cys; Xaa3o es: Ala, Glu, o Cys; Xaa33 es: Val o He; Xaa34 es: Lys, Asp, Arg, Glu, o Cys; Xaa35 es: Gly o Cys; Xaa36 es: Gly, Pro, Arg, o Cys; Xaa37 es: Gly, Pro, Ser, o Cys; Xaa3s es: Ser, Pro, His, o Cys; Xaa39 es: Ser, Arg, Thr, Trp, Lys, o Cys; Xaa40 es: Ser, Gly, o Cys; Xaa4i es: Ala, Asp, Arg, Glu, Lys, Gly, o Cys; Xaa42 es: Pro, Ala, Cys, o NH2l o está ausente; Xaa43 es: Pro, Ala, Cys, NH2, o está ausente; Xaa44 es: Pro, Ala, Arg, Lys, His, Cys, NH2, o está ausente; Xaa 5 es: Ser, His, Pro, Lys, Arg, Gly, Cys, NH2 o está ausente; Xaa46 es: His, Ser, Arg, Lys, Pro, Gly, Cys, NH2 o está ausente; y Xaa47 es: His, Ser, Arg, Lys, Cys, NH2 o está ausente; Xaa48 es: Gly, His, Cys, NH2, o está ausente; Xaa49 es: Pro, His, Cys, NH2, o está ausente; Xaa50 es: Ser, His, Cys, Ser-NH2, His-NH2, Cys-NH2, o está ausente; y en la que: 2 ó 1 de los restos de Cys están unidos covalentemente a una molécula de PEG, o 3, 2 ó 1 de los restos de Lys están unidos covalentemente a una molécula de PEG, o el aminoácido carboxi-terminal está unido covalentemente a una molécula de PEG; y a condición de que si Xaa42, Xaa43, Xaa4 , Xaa45, Xaa46, Xaa47, Xaa48 o Xaa4g está ausente, cada aminoácido cadena abajo esté ausente; y a condición de que haya 2, 1 ó 0 Cys en la molécula. Otra modalidad de la presente invención es un compuesto GLP-1 PEGilado que comprende la secuencia de aminoácidos de Fórmula IV (SEC.ID.N0 6) Xaa7-Xaa8-Glu-Gly-Xaan-Xaai2-Thr-Ser-Asp-Xaai6-Ser-Xaai8-Xaai9-Xaa2o- Glu-Xaa22-Xaa23-Xaa24-Xaa25-Xaa26-Xaa27-Phe-lle-Xaa3o-Trp-Leu-Xaa33- Xaa34-Xaa35-Xaa36-Xaa37-Xaa38-Xaa3g-Xaa4o-Xaa4i-Xaa42-Xaa43-Xaa4 - Formula IV (SEQ ID NO: 6) en la que: Xaa7 es: L-histidina, D-histidina, desamino-histidina, 2-amino-histidina, ß-hidroxi-histidina, homohistidina, a-fluorometil-histidina, o a-metil-histidina; Xaa8 es: Ala, Gly, Val, Leu, lie, Ser, o Thr; Xaan es: Thr o Cys Xaa<]2 es: Phe, Trp, Tyr, o Cys; Xaai6 es: Val, Trp, He, Leu, Phe, Tyr, o Cys; Xaa-is es: Ser, Trp, Tyr, Phe, Lys, lie, Leu, Val; Xaa-ig es: Tyr, Trp, o Phe; Xaa2o es: Leu, Phe, Tyr, o Trp; Xaa22 es: Gly, Glu, Asp, Lys o Cys; Xaa23 es: Gln o Cys; Xaa24 es: Ala o Cys; Xaa25 es: Ala, Val, lie, Leu, o Cys; Xaa26 es: Lys o Cys; Xaa27 es: Glu, lie, Ala, o Cys; Xaa30 es: Ala, Glu o Cys Xaa33 es: Val o lie; Xaa34 es: Lys, Asp, Arg, Glu o Cys; Xaa35 es: Gly o Cys; Xaa36 es: Gly, Pro, Arg o Cys; Xaa37 es: Gly, Pro, Ser o Cys; Xaa3s es: Ser, Pro, His o Cys; Xaa39 es: Ser, Arg, Thr, Trp, Lys o Cys; Xaa40 es: Ser, Gly, o Cys; Xaa41 es: Ala, Asp, Arg, Glu, Lys, Gly, o Cys; Xaa42 es: Pro, Ala, Cys, NH2, o está ausente; Xaa43 es: Pro, Ala, Cys, NH2, o está ausente; Xaa44 es: Pro, Ala, Arg, Lys, His, Cys, NH2, o está ausente; Xaa45 es: Ser, His, Pro, Lys, Arg, Cys, NH2 o está ausente; Xaa46 es: His, Ser, Arg, Lys, Cys, NH2 o está ausente; y Xaa47 es: His, Ser, Arg, Lys, Cys, NH2 o está ausente; y en la que: 2 ó 1 de los restos de Cys están unidos covalentemente a una molécula de PEG, o 3, 2 ó 1 de los restos de Lys están unidos covalentemente a una molécula de PEG, o el aminoácido carboxi-terminal está unido covalentemente a una molécula de PEG; y a condición de que si Xaa42, Xaa43, Xaa44, Xaa45 o Xaa46 está ausente cada aminoácido cadena abajo esté ausente; y a condición de que haya 2, 1 ó 0 Cys en la molécula. Otra modalidad de la presente invención es un compuesto GLP-1 PEGilado que comprende la secuencia de aminoácidos de Fórmula V (SEC.ID.N0 7) Xaa7-Xaa8-Glu-Gly-Xaan-Xaa12-Thr-Ser-Asp-Xaai6-Ser-Ser-Tyr-Lys-Glu- Xaa22-Xaa23-Xaa24-Xaa25-Xaa26-Xaa27-Phe-lle-Xaa3o-Trp-Leu-Xaa33-Xaa34- Xaa35-Xaa36-Xaa37-Xaa38-Xaa39-Xaa4o-Xaa4i-Xaa42-Xaa43-Xaa44-Xaa45- Formula V (SEC.ID.N0 7) en la que: Xaa7 es: L-histidina, D-histidina, desamino-histidina, 2-amino-histidina, ß-hidroxi-histidina, homohistidina, -fluorometil-histidina, o a-metil-histidina; Xaa8 es: Gly, Val, Leu, lie, Ser, o Thr; Xaa-n es: Thr o Cys; Xaa-i6 es: Val, Trp, lie, Leu, Phe, Tyr, o Cys; Xaa22 es: Gly, Glu, Asp, Lys, o Cys; Xaa23 es: Gln o Cys; Xaa24 es: Ala o Cys; Xaa25 es: Ala, Val, He, Leu, o Cys; Xaa27 es: Glu o Cys; Xaa3o es: Ala o Cys; Xaa33 es: Val o lie; Xaa3 es: Lys, Asp, Arg, Glu, o Cys; Xaa35 es: Gly o Cys; Xaa3S es: Gly, Pro, Arg, o Cys; Xaa37 es: Gly, Pro, Ser, o Cys; Xaa38 es: Ser, Pro, His, o Cys; Xaa39 es: Ser, Arg, Thr, Trp, Lys, o Cys; Xaa40 es: Ser, Gly, o Cys; Xaa4i es: Ala, Asp, Arg, Glu, Lys, Gly, o Cys; Xaa42 es: Pro, Ala, o Cys; Xaa43 es: Pro, Ala, o Cys; Xaa4 es: Pro, Ala, Arg, Lys, His, Cys, NH2, o está ausente; Xaa45 es: Ser, His, Pro, Lys, Arg, Cys, NH2 o está ausente; Xaa46 es: His, Ser, Arg, Lys, Cys, NH2 o está ausente; y Xaa 7 es: His, Ser, Arg, Lys, Cys, NH2 o está ausente; y en la que: 2 ó 1 de los restos de Cys están unidos covalentemente a una molécula de PEG, o 3, 2 ó 1 de los restos de Lys están unidos covalentemente a una molécula de PEG, o el aminoácido carboxi-terminal está unido covalentemente a una molécula de PEG; y a condición de que si Xaa44, Xaa45, Xaa46, o Xaa47 está ausente cada aminoácido cadena abajo esté ausente; y a condición de que haya 2, 1 ó 0 Cys en la molécula.
Otra modalidad de la presente invención es un compuesto GLP-1 PEGilado que comprende la secuencia de aminoácidos de Fórmula VI (SEC.ID.N0 8) Xaar-Xaas-Glu-Gly-Xaan-Xaa^-Thr-Ser-Asp-Xaaie-Ser-Ser-Tyr-Lys-Glu- Xaa22- aa23- aa24- aa25-Xaa26-Xaa27-Phe-lle-Xaa3o-Trp-Leu-Xaa33-Xaa3 - Xaa35-Xaa36-Xaa37-Xaa38-Xaa39-Xaa4o-Xaa4i~Xaa42-Xaa43-Xaa44-Xaa45- Formula VI (SEC.ID.N0 8) en la que: Xaa7 es: L-histidina, D-histidina, desamino-histidina, 2-amino-histidina, ß-hidroxi-histidina, homohistidina, -fluorometil-histidina, o a-metil-histidina; Xaa8 es: Gly, Val, Leu, lie, Ser, o Thr; Xaan es: Thr o Cys; Xaa22 es: Gly, Glu, Asp, Lys o Cys; Xaa23 es: Gln o Cys; Xaa24 es: Ala o Cys; Xaa25 es: Ala, Val, lie, Leu, o Cys; Xaa26 es: Lys o Cys; Xaa27 es: Glu o Cys; Xaa30 es: Ala o Cys; Xaa33 es: Val o lie; Xaa34 es: Lys o Cys; Xaa35 es: Gly o Cys; Xaa36 es: Gly o Cys; Xaa37 es: Pro o Cys; Xaa38 es: Ser, Pro, His, o Cys; Xaa39 es: Ser, Arg, Thr, Trp, Lys, o Cys; Xaa40 es: Ser, Gly, o Cys; Xaa4i es: Ala, Asp, Arg, Glu, Lys, Gly, o Cys; Xaa42 es: Pro, Ala, o Cys; Xaa43 es: Pro, Ala, o Cys; Xaa44 es: Pro, Ala, Arg, Lys, His, Cys, NH2, o está ausente; Xaa45 es: Ser, His, Pro, Lys, Arg, Cys, NH2 o está ausente; Xaa46 es: His, Ser, Arg, Lys, Cys, NH2 o está ausente; y Xaa 7 es: His, Ser, Arg, Lys, Cys, NH2 o está ausente; y en la que: 2 ó 1 de los restos de Cys están unidos covalentemente a una molécula de PEG, o 3, 2 ó 1 de los restos de Lys están unidos covalentemente a una molécula de PEG, o el aminoácido carboxi-terminal está unido covalentemente a una molécula de PEG; a condición de que si Xaa44, Xaa45, Xaa 6, o Xaa47 está ausente cada aminoácido cadena abajo esté ausente y a condición de que haya 2, 1 ó 0 Cys en la molécula.
Otra modalidad de la presente invención es un compuesto GLP-1 PEGilado que comprende la secuencia de aminoácidos de Fórmula VII (SEC.ID.N0 9) His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala- Ala-Lys-Glu-Phe-lle-Aia-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Gly-Pro-Xaa3s-Xaa39-Xaa4o- Xaa4i-Xaa42-Xaa43-Xaa44-Xaa45-Xaa46- aa47-Xaa48-Xaa49-Xaa50 Formula VII (SEC.ID.N0 9) en la que: Xaan es: Thr o Cys; Xaa-12 es: Phe o Cys; Xaa-i6 es: Val o Cys; Xaa24 es: Ala o Cys; Xaa2e es: Lys o Cys; Xaa27 es: Glu o Cys; Xaa30 es: Ala o Cys; Xaa34 es: Lys o Cys; Xaa35 es: Gly o Cys; Xaa36 es: Gly o Cys; Xaa37 es: Pro o Cys; Xaa38 es: Ser, Pro, His o Cys; Xaa39 es: Ser, Arg, Thr, Trp, Lys o Cys; Xaa40 es: Ser, Gly o Cys; Xaa4i es: Ala, Asp, Arg, Glu, Lys, Gly o Cys; Xaa42 es: Pro, Ala, Cys, NH2, o está ausente; Xaa43 es: Pro, Ala, Cys, NH2, o está ausente; Xaa44 es: Pro, Ala, Arg, Lys, His, Cys, NH2, o está ausente; Xaa45 es: Ser, His, Pro, Lys, Arg, Gly, Cys, NH2 o está ausente; Xaa46 es: His, Ser, Arg, Lys, Pro, Gly, Cys, NH2 o está ausente; y Xaa 7 es: His, Ser, Arg, Lys, Cys, NH2 o está ausente; Xaa48 es: Gly, His, Cys, NH2 o está ausente; Xaa49 es: Pro, His, Cys, NH2 o está ausente; y Xaa50 es: Ser, His, Cys, Ser-NH2, His-NH2, Cys-NH2, o está ausente; en la que dicho compuesto GLP-1 comprende de una a siete sustituciones adicionales y en la que: 2 ó 1 de los restos de Cys están unidos covalentemente a una molécula de PEG, o 3, 2 ó 1 de los restos de Lys están unidos covalentemente a una molécula de PEG, o el aminoácido carboxi-terminal está unido covalentemente a una molécula de PEG; a condición de que si Xaa44, Xaa45, Xaa46, o Xaa47 está ausente cada aminoácido cadena abajo esté ausente; y a condición de que haya 2, 1 ó 0 Cys en la molécula; y a condición de que si Xaa 2, Xaa43, Xaa44, Xaa45, Xaa46, Xaa 7i Xaa48, o Xaa4g está ausente cada aminoácido cadena abajo esté ausente. Las realizaciones preferidas de Fórmula l-VII incluyen compuestos GLP-1 que no difieren de GLP-1 (7-37)OH o GLP-1 (7-36)NH2 por más de 7 aminoácidos, por más de 6 aminoácidos, por más de 5 aminoácidos, por más de 4 aminoácidos, o por más de 3 aminoácidos. También es preferible que los compuestos GLP-1 de Fórmula l-VII tengan valina o glicina en la posición 8 y ácido glutámico en la posición 22. También es preferible que los compuestos GLP-1 de Fórmula l-VII tengan valina o glicina en la posición 8 y ácido glutámico en la posición 30. También es preferible que los compuestos GLP-1 de Fórmula l-VII tengan valina o glicina en la posición 8 e histidina o cisteína en la posición 37. También es preferible que los compuestos GLP-1 de Fórmula l-VII tengan 2 ó 1 ó 0 restos de cisteína. También es preferible que haya una molécula de PEG por compuesto GLP-1. Otra modalidad de la invención es un compuesto GLP-1 PEGilado que comprende la secuencia de aminoácidos de Fórmula VIH (SEC.ID.N0 10) Xaa7-Xaa8-Xaag-Xaaio-Xaai-|-Xaa-i2- aai3-Xaai4-Xaai5- aai6-Xaai7- aai8- Xaai9-Xaa20-Xaa2i-Xaa22-Xaa23-Xaa24~Xa¾5-Xa¾6"-Xaa27"Xaa28-Xaa29- Xaa30-Xaa3-|-Xaa32-Xaa33-Xaa34-Xaa35-Xaa36-Xaa37-Xaa38- aa39-Xaa40- Xaa4i-Xaa 2-Xaa43-Xaa4 -Xaa45 Formula VIII (SEC.ID.N0 10) en la que: Xaa7 es: L-histidina, D-histidina, desamino-histidina, 2-amino-histidina, ß-hidroxi-histidina, homohistidina, a-fluorometil-histidina, a-metil-histidina, Arg, Tyr, Ala o Val; Xaa8 es: Gly, Ser, Ala, o Thr; Xaa9 es: Glu, Ala o Asp; Xaa10 es: Gly, Ala o Val; Xaan es: Thr, Cys o Ala; Xaa-12 es: Phe, Cys, Ala, o Tyr; Xaa14 es: Ser, Ala, o Thr; Xaa15 es: Asp, o Glu; Xaa-|6 es: Leu, Cys, Ala, He, Val, o Met; Xaai7 es: Ser o Ala; Xaa-is es: Lys o Ala; Xaaig es: Gln o Ala; Xaa2o es: Met, Ala, Leu, lie, o Val; Xaa2i es: Glu o Ala; Xaa22 es: Glu, Cys, o Ala; Xaa23 es: Glu, Cys, o Ala; Xaa24 es: Ala o Cys; Xaa25 es: Val, Cys, o Ala; Xaa26 es: Arg, Cys, o Ala; Xaa27 es: Leu, Cys, o Ala; Xaa28 es: Phe, Ala, o Tyr; Xaa29 es: lie, Val, Leu, Gly, o Met; Xaa30 es: Glu, Cys, Ala, o Asp; Xaa31 es: Trp, Ala, Phe, o Tyr; Xaa32 es: Leu o Ala; Xaa33 es: Lys o Ala; Xaa34 es: Asn, Cys, o Ala; Xaa37 es: Pro o Cys; Xaa38 es: Ser, Cys, NH2, o ausente; Xaa39 es: Ser, Cys, NH2, o ausente; Xaa40 es: Gly, Cys, NH2 o ausente; Xaa41 es: Ala, Cys, NH2 o ausente; Xaa42 es: Pro, Cys, NH2 o ausente; Xaa43 es Pro, Cys, NH2 o ausente; Xaa44 es Pro, Cys, NH2 o ausente; y Xaa45 es Ser, Cys, NH2 o ausente; y en la que: 2 ó 1 de los restos de Cys están unidos covalentemente a una molécula de PEG; y a condición de que haya 2 ó 1 Cys en la molécula; a condición adicional de que no más de tres de Xaa9, Xaa10, Xaan , Xaa-i2, Xaa14, Xaa-|5l Xaa 5, Xaa17, Xaa18, Xaa^g, Xaa2o, aa2i , aa22, aa23, Xaa24, Xaa26> aa27, aa30l Xaa3i , Xaa32, sean Ala; y a condición también de que, si Xaai es His, Arg o Tyr, entonces al menos uno de Xaag, Xaa10 y Xaa-i6 sea Ala; y, a condición adicional de que si Xaa38, Xaa39, Xaa4o, Xaa4i, Xaa42, Xaa43 o Xaa44 está ausente cada aminoácido cadena abajo esté ausente. Las posiciones 7, 28, 29, 31 y 32 de la Fórmula VIII no pueden acomodar un aminoácido cisteína sin pérdida inaceptable de actividad resultante.
Los polímeros de polietilenglicol usados en la invención ("PEG") tienen preferiblemente pesos moleculares entre 500 y 100.000 dalton, más preferiblemente entre 20.000 y 60.000 dalton, más preferiblemente entre 20.000 y 40.000 dalton, pueden ser moléculas lineales o ramificadas, y pueden ser derivados de polietilenglicol como se describe en la técnica. La presente invención abarca un procedimiento para estimular el receptor de GLP-1 en un sujeto en necesidad de dicha estimulación, comprendiendo dicho procedimiento la etapa de administrar al sujeto una cantidad eficaz de un compuesto GLP-1 PEGilado descrito en este documento. La presente invención también abarca un procedimiento para estimular el receptor de GLP-1 en un sujeto en necesidad de dicha estimulación, comprendiendo dicho procedimiento la etapa de administrar al sujeto una cantidad eficaz de un compuesto GLP-1 no PEGilado con una secuencia como se muestra en SEC.ID.N0 3-10 a condición de que haya 2 ó 1 Cys en la molécula. Los sujetos en necesidad de estimulación del receptor de GLP- incluyen aquellos con diabetes no insulino-dependiente, hiperglucemia inducida por estrés, obesidad, trastornos de movilidad o vaciado gástrico y/o intestinal incluyendo, por ejemplo, síndrome del intestino irritable y dispepsia funcional. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN El Péptido 1 Tipo Glucagón (GLP-1) es un péptido de 37 aminoácidos secretado por las células L del intestino en respuesta a la ingestión de comida. Se han descrito numerosos análogos y derivados de GLP-1 en la técnica. La presente invención describe modificaciones a compuestos GLP-1 que dan como resultado vida media de eliminación prolongada y/o eliminación reducida. La incorporación de 1 ó 2 restos de Cys en sitios de aminoácidos particulares del péptido proporciona un grupo tiol al que puede unirse covalentemente un polietilenglicol (PEG) o derivado de PEG dando como resultado un compuesto GLP-1 PEGNado. Adicionalmente, los restos de lisina o el extremo carboxi-terminal de los péptidos, análogos o fragmentos de GLP-1 de la invención pueden unirse covalentemente a una o más moléculas de PEG o un derivado de PEG dando como resultado una molécula con vida media de eliminación prolongada y/o eliminación reducida. GLP-1 (7-37)OH tiene la secuencia de aminoácidos de SEC.ID.N0 1 : 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser- 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Gly-Phe- 29 3D 31 32 33 34 35 36 37 Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly (SEC. ID. N° 1) El término "polipéptido" o "péptido" como se usa en este documento, pretende indicar cualquier forma estructural (por ejemplo, forma primaria, secundaria o terciaria) de una secuencia de aminoácidos que comprende más de 5 restos de aminoácidos, que puede estar o no estar modificada adicionalmente (por ejemplo, acetilada, carboxilada, fosforilada, lipidada, o acilada). El término "nativo" se refiere a un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que es idéntica a una encontrada en la naturaleza. El término "nativo" pretende abarcar variantes alélicas del polipéptido en cuestión. El término "aminoácido" se usa en este documento en su sentido más amplio, e incluye aminoácidos de origen natural así como aminoácidos de origen no natural, incluyendo variantes y derivados de aminoácidos. Un especialista en la técnica reconocerá, en vista de esta amplia definición, que una referencia en este documento a un aminoácido incluye, por ejemplo, L-aminoácidos proteogénicos de origen natural; D-aminoácidos; aminoácidos modificados químicamente tales como variantes y derivados de aminoácidos; aminoácidos no proteogénicos de origen natural tales como norleucina, ß-alanina, ornitina, etc.; y compuestos sintetizados químicamente que tienen propiedades que se sabe en la técnica que son características de los aminoácidos. Los ejemplos de aminoácidos de origen no natural incluyen a-metil aminoácidos (por ejemplo, a-metil alanina), D-aminoácidos, aminoácidos tipo histidina (por ejemplo, 2-amino-histidina, ß-hidroxi-histidina, homohistidina, a-fluorometil-histidina y a-metil-histidina), aminoácidos que tienen un metileno extra en la cadena lateral ("homo" aminoácidos) y aminoácidos en los que se ha remplazado un grupo funcional de ácido carboxílico en la cadena lateral con un grupo ácido sulfónico (por ejemplo, ácido cisteico). Preferiblemente, sin embargo, los compuestos GLP-1 de la presente invención comprenden sólo aminoácidos de origen natural excepto cuando se proporcione específicamente de otra manera en este documento.
El término "compuesto GLP-1" como se usa en este documento, incluye GLP-1 nativo, [GLP-1 (7-37)OH o GLP-1 (7-36)NH2], análogos de GLP-1 , derivados de GLP-1 , fragmentos biológicamente activos de GLP-1 , GLP-1 prolongado o un análogo o fragmento de un péptido GLP-1 prolongado (véase, por ejemplo, las Solicitudes de Patente de EUA N° 60/346474 y N° 60/405.097), análogos de exendina-4 y derivados de exendina-4 que comprenden uno o dos restos de Cys en posiciones particulares del péptido como se describe en este documento. Por costumbre en la técnica, el extremo amino terminal de GLP-1 (7-37)OH nativo se ha denominado resto número 7 y el extremo carboxi-terminal, número 37. Los otros aminoácidos en el polipéptido se enumeran consecutivamente, como se muestra en SEC.ID.N0 1. Por ejemplo, la posición 12 es fenilalanina y la posición 22 es glicina en la molécula nativa. Un "fragmento de GLP-1 ", o "fragmento de un compuesto GLP-1" como se usa en este documento, es un polipéptido biológicamente activo obtenido después del truncado de uno o más aminoácidos desde el extremo A/-terminal y/o C-terminal de un compuesto GLP-1. La nomenclatura usada para describir GLP-1 (7-37)OH se aplica a fragmentos de GLP-1. Por ejemplo, GLP-1 (9-36)OH indica un fragmento de GLP-1 obtenido por truncado de dos aminoácidos del extremo N-terminal y un aminoácido del extremo C-terminal. Los aminoácidos en el fragmento se indican por el mismo número que el aminoácido correspondiente en GLP-1 (7-37)OH. Por ejemplo, el ácido glutámico /V-terminal en GLP-1 (9-36)OH está en la posición 9; la posición 12 está ocupada por fenilalanina; y la posición 22 está ocupada por glicina, como en GLP-1 (7-37)OH. Los compuestos GLP-1 incluyen análogos de GLP-1 y análogos de exendina-4. Para ser claros, los "análogos de exendina-4" como incluidos en "compuestos GLP-1 " siempre tienen uno o dos restos de Cys. Preferiblemente, un análogo de GLP-1 tiene la secuencia de aminoácidos de GLP-1 (7-37)OH o un péptido GLP-1 prolongado como se describe en las Solicitudes de Patente de EUA N° de serie 60/346474 presentada el 1 de agosto de 2002, o N° de serie 60/405.097 presentada el 21 de agosto de 2002, ambas tituladas "Extended Glucagon-Like Peptide-1 Analogs" o un fragmento de los mismos, modificado de tal modo que 1 , 2, 3, 4, 5 ó 6 aminoácidos difieren del aminoácido en la posición correspondiente de GLP-1 (7-37)OH o un fragmento de GLP-1 (7-37)OH o modificado de modo que 0, 1 , 2, 3, 4, 5 ó 6 aminoácidos difieren del aminoácido en la posición correspondiente de un péptido GLP-1 prolongado. Los análogos de GLP-1 más preferidos se describen en este documento en las Fórmulas I, II, III, IV, V, VI y VII. Los análogos de exendina-4 más preferidos se describen en este documento en la Fórmula VIII. El término "PEGilado" cuando se refiere a un compuesto GLP-1 de la presente invención se refiere a un compuesto GLP-1 que está modificado químicamente por unión covalente de una o más moléculas de polietilenglicol o un derivado del mismo. Además, se pretende que el término "PEG" se refiera a polietilenglicol o a un derivado del mismo como se conocen en la técnica (véanse, por ejemplo, las Patentes de EUA N° 5.445.090; N° 5.900.461 ; N° 5.932.462; N° 6.436.386; N° 6.448.369; N° 6.437.025; N° 6.448.369; N° 6.495.659; N° 6.515.100 y N° 6.514.491). Preferiblemente, en compuestos GLP-1 PEGilados de la presente invención, PEG (o un derivado del mismo) está unido covalentemente a uno o más restos de lisina o cisteína del compuesto GLP-1. Más preferiblemente, PEG está unido covalentemente a uno o más restos de cisteína del compuesto GLP-1. Para análogos de exendina-4 PEGilados de la presente invención, PEG está unido a uno o dos restos de cisteína introducidos en la exendina-4 o en un análogo de exendina-4 en las posiciones identificadas en la Fórmula VIII. Opcionalmente, las moléculas de PEG pueden estar unidas al compuesto GLP-1 mediante una molécula engarce o espadadora (véanse las moléculas espaciadoras ejemplares descritas en la Patente de EUA N° 6.268.343). En la nomenclatura usada en este documento para designar a los compuestos GLP-1 , el aminoácido sustituyente y su posición se indican seguidos por el nombre del péptido parental. Por ejemplo, Glu22-GLP-1 (7-37)OH denomina un compuesto GLP-1 en el que la glicina que habitualmente se encuentra en la posición 22 de GLP-1 (7-37)OH se ha remplazado con ácido glutámico; Val8GIU22-GLP-1 (7-37)OH (o V8E22-GLP-1 (7-37)OH) designa a un compuesto GLP-1 en el que la alanina que habitualmente se encuentra en la posición 8 y la glicina que habitualmente se encuentra en la posición 22 de GLP-1 (7-37)OH se han remplazado con valina y ácido glutámico, respectivamente. Vals-exendina-4 designa a un compuesto GLP-1 en el que la serina que habitualmente se encuentra en la posición 8 de la exendina-4 se ha remplazado con una valina. Preferiblemente, los compuestos GLP-1 de la invención tienen actividad insulinotrópica. "Actividad insulinotrópica" se refiere a la capacidad de estimular la secreción de insulina en respuesta a niveles elevados de glucosa, provocando de este modo la captación de glucosa por las células y la reducción de los niveles de glucosa en plasma. La actividad insulinotrópica puede evaluarse por procedimientos conocidos en la técnica, incluyendo el uso de experimentos in vivo y ensayos in vitro que miden la actividad de unión al receptor de GLP-1 o la activación del receptor, por ejemplo, ensayos que emplean células de los islotes pancreáticos o células de insulinoma, como se describe en el documento EP 619.322 para Gelfand, y col., y la Patente de EUA N° 5.120.712, respectivamente. La actividad insulinotrópica se mide de manera rutinaria en seres humanos midiendo los niveles de insulina o niveles de péptido C. Para los propósitos de la presente invención se usa un ensayo de señalización del receptor de GLP-1 in vitro para determinar si un compuesto GLP-1 PEGilado de la presente invención mostrará actividad insulinotrópica in vivo. La actividad insulinotrópica es una actividad que puede usarse para demostrar que el compuesto GLP-1 PEGilado es biológicamente activo. "Potencia in vitro" como se usa en este documento, es la medida de la capacidad de un péptido para activar el receptor de GLP-1 en un ensayo basado en células. La potencia in vitro se expresa como la "CE50" que es la concentración eficaz de compuesto que da como resultado una actividad del 50% en un experimento de respuesta a dosis única. Para los propósitos de la presente invención, la potencia in vitro se determina usando un ensayo de fluorescencia que emplea células HEK-293 que expresan de manera estable el receptor de GLP-1 humano. Estas células HEK-293 tienen integrado de manera estable un vector de ADN que tiene un elemento de respuesta AMPc (CRE) que dirige la expresión del gen de ß-lactamasa (BLAM). La interacción de un compuesto GLP-1 (o agonista) con el receptor inicia una señal que da como resultado la activación del elemento de respuesta AMPc y la expresión posterior de ß-lactamasa. El sustrato CCF2/AM de ß-lactamasa que emite fluorescencia cuando se escinde por ß-lactamasa (PanVera LLC) puede añadirse después a las células que se han expuesto a una cantidad específica de agonista de GLP-1 para proporcionar una medida de potencia de agonista de GLP-1. El ensayo se describe adicionalmente en Zlokarnik y col. (1998) Science 279:84-88. Los valores de CE50 para los compuestos enumerados en el Ejemplo 4 se determinaron usando el ensayo BLAM descrito anteriormente. Los valores de potencia in vitro relativos pueden establecerse procesando Val8-GLP-1 (7-37)OH o GLP-1 nativo como control y asignando al control un valor de referencia del 100%. El término "vida media en plasma" se refiere al tiempo en el que la mitad de las moléculas pertinentes circulan en el plasma antes de eliminarse. Un termino usado alternativamente es "vida media de eliminación". El término "prolongada" o "más larga" usado en el contexto de vida media en plasma o vida media de eliminación indica que hay un aumento estadísticamente significativo en la vida media de un compuesto GLP-1 PEGilado en relación con la de la molécula de referencia (por ejemplo, la forma no PEGilada del péptido o el péptido nativo) determinada en condiciones comparables. Preferiblemente, un compuesto GLP-1 PEGilado de la presente invención tiene una vida media de eliminación de al menos una hora, más preferiblemente al menos 3, 5, 7, 10, 15, 20 horas y más preferiblemente al menos 24 horas. La vida media de la que se informa en este documento en el Ejemplo 5 es la vida media de eliminación; es la que corresponde a la tasa de eliminación log-lineal terminal. Los especialistas en la técnica aprecian que la vida media es un parámetro derivado que cambia en función tanto de la eliminación como del volumen de distribución. La eliminación es la medida de la capacidad del cuerpo de eliminar un fármaco. Como la eliminación disminuye debido, por ejemplo, a modificaciones a un fármaco, se podría esperar que la vida media aumentara. Sin embargo, esta relación recíproca es exacta sólo cuando no hay cambio en el volumen de distribución. Una relación aproximada útil entre la vida media log-lineal terminal (t ½), eliminación (C), y volumen de distribución (V) viene dada por la ecuación: t ½ « 0,693 (V/C). La eliminación no indica cuánto fármaco se está retirando sino, en su lugar, el volumen de fluido biológico, tal como sangre o plasma, que tendría que quedar completamente liberado de fármaco para justificar la eliminación. La eliminación se expresa como un volumen por unidad de tiempo. Los compuestos GLP-1 PEGilados de la presente invención tienen preferiblemente un valor de eliminación de 200 ml/h/kg o menos, más preferiblemente 180, 150, 120, 100, 80, 60 ml/h/kg o menos y más preferiblemente 50, 40 ó 20 ml/h/kg o menos (Véase Ejemplo 5). En la presente invención, un aminoácido Cys no puede incorporarse en las posiciones 7, 28, 29, 31 ó 32 de GLP-1 o análogos de GLP-1 a causa de la pérdida de actividad del péptido resultante. Se contempla que todos los otros restos pueden remplazarse con una cisteína pero es preferible que dicha cisteína se incorpore en la posición o posiciones seleccionadas entre el grupo constituido por 1 1 , 12, 16, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 30, 34, 35, 36 y 37 de GLP-1 o péptidos análogos de GLP-1 , preferiblemente con no más de 2 ó 1 aminoácidos Cys por molécula. Cuando existen aminoácidos Cys en la molécula de GLP-1 , es incluso más preferido que estén localizados en la posición o posiciones seleccionadas entre el grupo constituido por 22, 26, 34, 35, 36 y 37 e incluso más preferido que existan en la posición 26 y/o 34. La molécula resultante puede estar PEGilada en los aminoácidos Cys dando como resultado una molécula modificada que mantiene toda o una porción de la actividad biológica mientras que tiene una vida media más larga que la de la molécula no modificada o que la de una molécula nativa. Como alternativa, en la invención, GLP-1 o péptidos análogos de GLP-1 pueden estar PEGilados en uno, dos o tres de los restos de lisina en las posiciones 18, 22 y 26; o en el aminoácido del extremo carboxi terminal del péptido. Otra modalidad de la invención son los compuestos GLP-1 no PEGilados con la secuencia como se muestra en SEC.ID.N0 3-10 a condición de que haya 2 ó 1 Cys en la molécula. Se descubrió que pueden sustituirse restos en una posición específica de los compuestos GLP-1 con Cys y aún mantienen actividad biológica. Estos compuestos GLP-1 no PEGilados pueden ser intermedios usados en el procedimiento para producir los compuestos GLP-1 PEGilados de la presente invención. Estos compuestos también pueden usarse como agentes terapéuticos para trastornos donde no se requiere una vida media prolongada, por ejemplo, síndrome del intestino irritable. Una vez está preparado y purificado un péptido para su uso en la invención, se modifica uniendo covalentemente al menos una molécula de PEG a restos de Cys o Lys o el aminoácido carboxi-terminal. Es difícil crear moléculas peptídicas o proteicas delicadas con nuevas propiedades apropiadas uniendo polímeros sin provocar pérdida de su funcionalidad. Se ha descrito una amplia diversidad de procedimientos en la técnica para producir conjugados covalentes a PEG y el procedimiento específico usado para la presente invención no pretende ser limitante (para artículo de revisión véase, Roberts, . y col. Advanced Drug Delivery Reviews, 54:459-476, 2002). La unión de PEG al extremo carboxi-terminal puede unirse mediante acoplamiento enzimático usando péptido GLP-1 recombinante como precursor o procedimientos alternativos conocidos en la técnica y descritos, por ejemplo, en la Patente de EUA N° 4.343.898 o Internacional Journal of Peptide & Protein Research. 43:127-38, 1994. La PEGilación de proteínas puede superar muchos de los problemas farmacológicos y toxicológicos/inmunológicos asociados al uso de péptidos o proteínas como agentes terapéuticos. Sin embargo, para cualquier péptido individual es incierto si la forma PEGilada del péptido tendrá pérdida significativa de la bioactividad en comparación con la forma no PEGilada del péptido. La bioactividad de las proteínas PEGiladas puede estar afectada por factores tales como: i) el tamaño de la molécula de PEG; ii) los sitios particulares de unión; iii) el grado de modificación; iv) condiciones de acoplamiento adversas; v) si se usa un engarce para la unión o si el polímero está unido directamente; vi) generación de co-productos dañinos; vii) lesión infligida por el polímero activado; o vüi) retención de carga. Dependiendo de la reacción de acoplamiento usada, la modificación polimérica de citoquinas, en particular, ha dado como resultado reducciones drásticas de la bioactividad. [Francis, G.E., y col., (1998) PEGylation of cytokines and other therapeutic proteins and peptides: the importante of biological optimization of coupling techniques, Intl. J. Hem. 68:1-18]. Los compuestos GLP-1 PEGilados de la presente invención tienen una actividad biológica in vitro que es al menos el 0,5% la de GLP-1 nativo o más preferiblemente la de Val8-GLP-1 (7-37)OH. Más preferiblemente, el compuesto GLP-1 PEGilado de la presente invención tiene una actividad biológica in vitro que al menos el 1 % o el 3% la de GLP-1 nativo o más preferiblemente la de Vals-GLP-1 (7-37)OH. Dicha actividad biológica puede determinarse por el ensayo de potencia in vitro como se describe en este documento (Ejemplo 4) o por otros ensayos de GLP-1 conocidos en la técnica. Aunque algunos compuestos GLP-1 PEGilados de la invención pueden tener actividad biológica menor que la de GLP-1 nativo o la de Vals-GLP- (7-37)OH medida en un ensayo particular; esta disminución de actividad se compensa por la vida media prolongada del compuesto y/o el valor de eliminación inferior del compuesto y puede incluso ser una característica favorable para un compuesto GLP-1 con una vida media de eliminación prolongada. Se contempla adicionalmente que las posiciones del péptido GLP-1 que se ha descubierto que acomodan un resto de cisteína sin la eliminación de la actividad biológica pueden sustituirse con una cisteína en la posición análoga de exendina-4 y dan como resultado un análogo de exendina-4 aún capaz de unirse al receptor de GLP- . Preferiblemente no hay más de 2 ó 1 aminoácidos Cys por análogo de exendina-4 de la invención. Preferiblemente, las Cys que existen en la molécula están en las posiciones seleccionadas entre el grupo constituido por 11 , 12, 16, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 30, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41 , 42, 43 y 44 (véase Fórmula VIII); preferiblemente las posiciones seleccionadas entre el grupo constituido por 22, 26, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41 , 42, 43 y 44; incluso más preferiblemente las posiciones 26 y/o 34. Los aminoácidos Cys presentes en la molécula están unidos covalentemente a una molécula de PEG dando como resultado un análogo de exendina-4 PEGilado con una vida media de eliminación más larga que la de exendina-4 nativa. Preferiblemente, un péptido análogo de exendina-4 PEGilado (como se describe en la Fórmula VIII) de la presente invención tiene una actividad biológica que es al menos el 0,5%, 1 ,0%, 3%, 10%, 30%, o 50% la del análogo de exendina-4 no PEGilado. La secuencia de la exendina-4 de tipo silvestre es: HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPS (SEC.ID.N0 11). En su forma típica, PEG es un polímero lineal con grupos hidroxilo terminales y tiene la fórmula HO-CH2CH2-(CH2CH20)n-CH2CH2-OH, en la que n es de aproximadamente 8 a aproximadamente 4000. El hidrógeno terminal puede estar sustituido por un grupo protector tal como un grupo alquilo o alcanol. Preferiblemente, PEG tiene al menos un grupo hidroxi, más preferiblemente es un grupo hidroxi terminal. Es este grupo hidroxi el que se activa preferiblemente para reaccionar con el péptido. Hay muchas formas de PEG útiles para la presente invención. Existen numerosos derivados de PEG en la técnica y son apropiados para su uso en la invención. (Véanse, por ejemplo, las Patentes de EUA N°: 5.445.090; 5.900.461 ; 5.932.462; 6.436.386; 6.448.369; 6.437.025; 6.448.369; 6.495.659; 6.515.100 y 6.514.491 y Zalipsky, S. Bioconjugate Chem. 6:150-165, 1995). La molécula de PEG unida covalentemente a los compuestos GLP-1 en la presente invención no pretende limitarse a un tipo particular. El peso molecular de PEG es preferiblemente de 500-100.000 dalton y más preferiblemente de 20.000-60.000 dalton y mucho más preferiblemente de 20.000-40.000 dalton. PEG puede ser lineal o ramificado y los compuestos GLP-1 PEGilados de la presente invención pueden tener 1 , 2, 3, 4, 5 ó 6 moléculas de PEG unidas al péptido. Es más preferiblemente que haya una molécula de PEG por molécula de compuesto GLP-1 PEGilado; sin embargo, cuando hay más de una molécula de PEG por molécula peptídica, se prefiere que no haya más de seis. Se contempla adicionalmente que ambos extremos de la molécula de PEG pueden estar homo-o hetero-funcionalizados para entrecruzar dos o más compuestos GLP-1 entre sí.
La presente invención proporciona compuestos GLP-1 con una o más moléculas de PEG unidas covalentemente a los mismos. Un procedimiento para preparar los compuestos GLP-1 PEGilados de la presente invención implica el uso de PEG-maleimida para unir directamente PEG a un grupo tiol del péptido. La introducción de una funcionalidad tiol puede conseguirse añadiendo o insertando un resto de Cys a o en el péptido en las posiciones descritas anteriormente. La funcionalidad tiol también puede introducirse en la cadena lateral del péptido (por ejemplo, acilación del grupo e-amino de lisina de un ácido que contiene tiol). Un procedimiento de PEGilación de la presente invención utiliza la adición de Michael para formar un engarce tioéter estable. La reacción es altamente específica y tiene lugar en condiciones moderadas en presencia de otros grupos funcionales. Se ha usado PEG-maleimida como polímero reactivo para preparar conjugados PEG-proteína bioactivos bien definidos. Es preferible que el procedimiento use un exceso molar de un compuesto GLP-1 que contiene tiol con relación a PEG-maleimida para dirigir la reacción hasta completarse. Las reacciones se realizan preferiblemente entre pH 4,0 y 9,0 a temperatura ambiente durante 15 a 40 horas. El exceso de péptido que contiene tiol no PEGilado se separa fácilmente del producto PEGilado por procedimientos de separación convencionales. Las condiciones ejemplares necesarias para la PEGilación de compuestos GLP-1 se exponen en el Ejemplo 1. La PEGilación de cisteína puede realizarse usando PEG-maleimida o PEG bifurcado-maleimida. Los compuestos GLP-1 tienen una diversidad de actividades biológicas. Por ejemplo, se ha descubierto que GLP-1 estimula la liberación de insulina, provocando de este modo la captación de glucosa por las células y niveles de glucosa en suero disminuidos [véase, por ejemplo, Mojsov, S., (1992) ¡nt. J. Peptide Protein Research, 40:333]. GLP-1 es particularmente prometedor como tratamiento para la diabetes mellitus no insulino-dependiente (NIDDM) ya que no presenta un riesgo de hipoglucemia como ocurre con los presentes tratamientos de NIDDM. También se contempla que GLP-1 es un tratamiento para obesidad, síndrome del intestino irritable y dispepsia funcional.
Se contempla que un uso de un compuesto GLP-1 PEGilado de la presente invención incluye su uso en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de diabetes no insulino-dependiente, obesidad, apoplejía, infarto de miocardio, síndrome del intestino irritable o dispepsia funcional. La PEGilación de un compuesto GLP-1 puede combinarse con otras modificaciones conocidas en la técnica para aumentar la vida media de GLP-1 (véase, por ejemplo, las Solicitudes de Patente de EUA N° de serie 60/346474 presentada el 1 de agosto de 2002, y N° de serie 60/405.097 presentada el 21 de agosto de 2002) y aumentar de este modo la vida media del compuesto incluso más que la PEGilación sola o el otro procedimiento de modificación solo. Como se usa en este documento, el término "compuesto GLP-1 " también incluye sales farmacéuticamente aceptables de los compuestos descritos en este documento. Un compuesto GLP-1 de esta invención puede tener un grupo funcional suficientemente ácido, uno suficientemente básico, o ambos grupos funcionales, y por consiguiente reacciona con cualquiera de varias bases inorgánicas, y ácidos inorgánicos y orgánicos, para formar una sal. Los ácidos habitualmente empleados para formar sales de adición de ácidos son ácidos inorgánicos tales como ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido yodhídrico, ácido sulfúrico, ácido fosfórico, y similares, y ácidos orgánicos tales como ácido p-toluenosulfónico, ácido metanosulfónico, ácido oxálico, ácido p-bromofenil-sulfónico, ácido carbónico, ácido succínico, ácido cítrico, ácido benzoico, ácido acético, y similares. Los ejemplos de dichas sales incluyen sulfato, pirosulfato, bisulfato, sulfito, bisulfito, fosfato, monohidrogenofosfato, dihidrogenofosfato, metafosfato, pirofosfato, cloruro, bromuro, yoduro, acetato, propionato, decanoato, caprilato, acrilato, formiato, isobutirato, caproato, heptanoato, propiolato, oxalato, malonato, succinato, suberato, sebacato, fumarato, maleato, butino-1,4-dioato, hexino-1 ,6-dioato, benzoato, clorobenzoato, metilbenzoato, dinitrobenzoato, hidroxibenzoato, metoxibenzoato, ftalato, sulfonato, xilenosulfonato, fenilacetato, fenilpropionato, fenilbutirato, citrato, lactato, gamma-hidroxibutirato, glicolato, tartrato, metanosulfonato, propanosulfonato, naftaleno-1 -sulfonato, naftaleno-2-sulfonato, mandelato, y similares. Las sales de adición de bases incluyen las obtenidas de bases inorgánicas, tales como hidróxidos, carbonatos, bicarbonatos de amonio o metales alcalinos o alcalino-térreos, y similares. Dichas bases útiles en la preparación de sales de esta invención incluyen, por tanto, hidróxido sódico, hidróxido potásico, hidróxido de amonio, carbonato potásico, y similares. Los compuestos GLP-1 PEGilados de la presente invención son particularmente apropiados para la administración parenteral, también pueden suministrarse por vía oral, por administración nasal, o por inhalación. La administración parenteral puede incluir, por ejemplo, administración sistémica, tal como por inyección intramuscular, intravenosa, subcutánea, o intraperitoneal. Los compuestos GLP-1 PEGilados pueden administrarse al sujeto junto con un vehículo, diiuyente o excipiente farmacéuticamente aceptable como parte de una composición farmacéutica para tratar las enfermedades analizadas anteriormente. La composición farmacéutica puede ser una solución o, si se administra por vía parenteral, una suspensión del compuesto GLP-1 o una suspensión del compuesto GLP-1 complejado con un catión de metal divalente tal como cinc. Los vehículos farmacéuticos apropiados pueden contener ingredientes inertes que no interaccionan con el péptido o derivado peptídico. Pueden emplearse técnicas de formulación farmacéutica convencionales tales como las descritas en Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA. Los vehículos farmacéuticos apropiados para administración parenteral incluyen, por ejemplo, agua estéril, solución salina fisiológica, solución salina bacteriostática (solución salina que contiene aproximadamente 0,9% mg/ml de alcohol bencílico), solución salina amortiguada con fosfato, solución de Hank, solución de Ringer-lactato y similares. Algunos ejemplos de excipientes apropiados incluyen lactosa, dextrosa, sacarosa, trehalosa, sorbitol, y manitol. Los compuestos GLP-1 PEGilados de la presente invención pueden formularse para administración de modo que los niveles en plasma sanguíneo se mantengan en el intervalo eficaz durante periodos de tiempo prolongados. La principal barrera para el suministro de fármaco peptídico oral eficaz es la pobre biodisponibilidad debido a la degradación de los péptidos por medio de ácidos y enzimas, mala absorción a través de las membranas epiteliales, y transición de los péptidos a una forma insoluble después de la exposición al medio de pH ácido en el tracto digestivo. Los sistemas de suministro oral para péptidos tales como los abarcados por la presente invención se conocen en la técnica. Por ejemplo, los compuestos GLP-1 PEGilados se pueden encapsular usando microesferas y después suministrarse por vía oral. Por ejemplo, los compuestos GLP-1 PEGilados se pueden encapsular en microesferas compuestas de un polímero biodegradable, biocompatible disponible en el mercado, poli(lactida-co-glicólido)-COOH y aceite de oliva como carga. Véase, Joseph, y col. (2000) Diabetologia 43:1319-1328. También están disponibles en el mercado otros tipos de tecnología de microesferas tales como los polímeros biodegradables Medisorb® y Prolease® de Alkermes. Los polímeros Medisorb® pueden producirse con cualquiera de los isómeros de lactida. Las proporciones lactida:glicólido pueden variarse entre 0:100 y 100:0 permitiendo un amplio intervalo de propiedades poliméricas. Esto permite el diseño de sistemas de suministro y dispositivos implantables con tiempos de resorción que varían de semanas a meses. Emisphere también ha publicado numerosos artículos que analizan la tecnología de suministro oral para péptidos y proteínas. Por ejemplo, véase el documento WO 9528838 por Leone-bay y col. que describe vehículos específicos comprendidos de aminoácidos modificados para facilitar la absorción. Los compuestos GLP-1 PEGilados descritos en este documento pueden usarse para tratar a sujetos con una amplia diversidad de enfermedades y afecciones. Los compuestos GLP-1 PEGilados abarcados por la presente invención ejercen sus efectos biológicos funcionando en el receptor mencionado como el "receptor de GLP-1" (véase, Dillon y col. (1993) Cloning and Functional Expression of the Human Glucagon-like Peptide-1 (GLP-1) Receptor, Endocrínology, 133:1907-1910). Los sujetos con enfermedades y/o afecciones que responden favorablemente a estimulación del receptor de GLP-1 o a la administración de compuestos GLP-1 pueden, por lo tanto, tratarse con los compuestos GLP-1 PEGilados de la presente invención. Se dice que estos sujetos "están en necesidad de tratamiento con compuestos GLP-1" o "en necesidad de estimulación del receptor de GLP-1". Se incluyen sujetos con diabetes no insulino-dependiente, diabetes insulino-dependiente, apoplejía (véase documento WO 00/16797 por Efendic), infarto de miocardio (véase documento WO 98/08531 por Efendic), obesidad (véase documento WO 98/19698 por Efendic), cambios catabólicos después de cirugía (véase Patente de EUA N° 6.006.753 para Efendic), dispepsia funcional y síndrome del intestino irritable (véase documento WO 99/64060 por Efendic).
También se incluyen sujetos que requieren tratamiento profiláctico con un compuesto GLP-1 , por ejemplo, sujetos en riesgo de desarrollar diabetes no insulino-dependiente (véase documento WO 00/07617). Los sujetos adicionales incluidos aquellos con tolerancia alterada a la glucosa o glucemia basal alterada, sujetos cuyo peso corporal es aproximadamente un 25% por encima de lo normal para la altura y constitución corporal del sujeto, sujetos con una pancreatectomía parcial, sujetos que tienen uno o más padres con diabetes no insulino-dependiente, sujetos que han tenido diabetes gestacional y sujetos que han tenido pancreatitis aguda o crónica están en riesgo de desarrollar diabetes no insulino-dependiente. Los compuestos GLP-1 PEGilados de la presente invención pueden usarse para normalizar los niveles de glucosa en sangre, evitar el deterioro de células ß pancreáticas, inducir la proliferación de células ß, estimular la transcripción del gen de la insulina, regular positivamente IDX-1/PDX-1 u otros factores de crecimiento, mejorar la función de las células ß, activar las células ß inactivas, diferenciar células en células ß, estimular la replicación de células ß, inhibir la apoptosis de células ß, regular el peso corporal e inducir la pérdida de peso. Una "cantidad eficaz" de un compuesto GLP-1 PEGilado es la cantidad que da como resultado un efecto terapéutico y/o profiláctico deseado sin provocar efectos secundarios inaceptables cuando se administra a un sujeto en necesidad de estimulación del receptor de GLP-1. Un "efecto terapéutico deseado" incluye uno o más de lo siguiente: 1) una mejora del síntoma o síntomas asociados a la enfermedad o afección; 2) un retraso en la aparición de los síntomas asociados a la enfermedad o afección; 3) longevidad aumentada en comparación con la ausencia del tratamiento; y 4) mayor calidad de vida en comparación con la ausencia del tratamiento. Por ejemplo, una "cantidad eficaz" de un compuesto GLP-1 PEGilado para el tratamiento de diabetes es la cantidad que daría como resultado un mayor control de la concentración de glucosa en sangre que en ausencia de tratamiento, dando como resultado de este modo, un retraso en la aparición de complicaciones diabéticas tales como retinopatía, neuropatía o enfermedad renal. Una "cantidad eficaz" de un compuesto GLP-1 PEGilado para la prevención de diabetes es la cantidad que retrasaría, en comparación con la ausencia de tratamiento, la aparición de niveles elevados de glucosa en sangre que requiere tratamiento con fármacos anti-hipoglucémicos tales como sulfonilureas, tiazolidindionas, insulina y/o bisguanidas. Una "cantidad eficaz" del compuesto GLP-1 PEGilado administrado a un sujeto también dependerá del tipo y gravedad de la enfermedad y de las características del sujeto, tal como salud general, edad, sexo, peso corporal y tolerancia a fármacos. Típicamente, los compuestos GLP-1 PEGilados de la presente invención se administrarán de modo que los niveles en plasma estén en el intervalo de aproximadamente 5 picomoles/litro y aproximadamente 200 picomoles/litro. Se determinó que los niveles óptimos en plasma para Vals-GLP-1 (7-37)OH están entre 30 picomoles/litro y aproximadamente 200 picomoles/litro. Un intervalo de dosis típico para los compuestos GLP-1 PEGilados de la presente invención variará de aproximadamente 0,01 mg por día a aproximadamente 1000 mg por día para un adulto. Preferiblemente, la dosificación varía de aproximadamente 0,1 mg por día a aproximadamente 100 mg por día, más preferiblemente de aproximadamente 1 ,0 mg/día a aproximadamente 10 mg/día. Un "sujeto" es un mamífero, preferiblemente un ser humano, pero también puede ser un animal, por ejemplo, animales de compañía (por ejemplo, perros, gatos, y similares), animales de granja (por ejemplo, vacas, ovejas, cerdos, caballos, y similares) y animales de laboratorio (por ejemplo, ratas, ratones, cobayas, y similares). Los péptidos usados para generar los compuestos GLP-1 PEGilados de la presente invención pueden prepararse usando procedimientos convencionales de técnicas de síntesis peptídica en fase de solución o en fase sólida. Los sintetizadores peptídicos están disponibles en el mercado de, por ejemplo, Applied Biosystems en Foster City CA. Los reactivos para la síntesis en fase sólida están disponibles en el mercado, por ejemplo, de Midwest Biotech (Fishers, IN). Los sintetizadores peptídicos en fase sólida pueden usarse de acuerdo con las instrucciones del fabricante para bloquear los grupos de interferencia, proteger los aminoácidos a someter a reacción, acoplar, desacoplar, y rematar los aminoácidos que no han reaccionado. Típicamente, se acoplan un aminoácido protegido con a-/V-carbamoílo y el aminoácido N-terminal de la cadena peptídica creciente sobre una resina a temperatura ambiente en un disolvente inerte tal como dimetilformamida, N-metilpirrolidona o cloruro de metileno en presencia de agentes de acoplamiento tales como diciciohexilcarbodümida y 1-hidroxibenzotriazol y una base tal como diisopropiletilamina. El grupo protector a-/V-carbamoílo se retira de la resina del péptido resultante usando un reactivo tal como ácido trifuoroacético o piperidína, y la reacción de acoplamiento se repite con el siguiente aminoácido A/-protegido a añadir a la cadena peptídica. Los grupos protectores de amina apropiados son bien conocidos en la técnica y se describen, por ejemplo, en Green y Wuts, "Protecting Groups in Organic Synthesis", John Wiley and Sons, 1991 , cuyos contenidos completos se incorporan como referencia. Los ejemplos incluyen t-butiloxicarbonilo (fBoc) y fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc). Los péptidos también se sintetizan usando protocolos de síntesis en fase sólida automatizada convencionales usando í-butoxicarbonil- o fluorenilmetoxicarbonil-alfa-aminoácidos con protección de cadena lateral apropiada. Después de completarse la síntesis, los péptidos se escinden del soporte en fase sólida con desprotección de cadena lateral simultánea usando procedimientos con fluoruro de hidrógeno convencionales. Los péptidos en bruto después se purifican adicionalmente usando Cromatografía en Fase Inversa en columnas Vydac C18 usando gradientes de acetonitrilo en ácido trifluoroacético (TFA) al 0,1 %. Para retirar el acetonitrilo, los péptidos se liofilizan en una solución que contiene TFA al 0,1%, acetonitrilo y agua. La pureza puede verificarse por cromatografía en fase inversa analítica. La identidad de los péptidos puede verificarse por espectrometría de masas. Los péptidos pueden solubilizarse en tampones acuosos a pH neutro. La invención se ilustra por los siguientes ejemplos que no pretenden limitar de ningún modo. EJEMPLOS Ejemplo 1 - PEGilación de análogos relacionados con GLP- : Las reacciones de PEGilación se realizan en condiciones que permiten la formación de un enlace tioéter. Específicamente, el pH de la solución varía de aproximadamente 4 a 9 y las concentraciones de péptido que contiene tiol varían de un exceso molar de 1 a 10 de la concentración de metoxi-PEG2-MAL. Las reacciones de PEGilación habitualmente se realizan a temperatura ambiente. El péptido GLP-1 PEGilado después se aisla usando HPLC en fase inversa o cromatografía de exclusión por tamaño (CET). Los análogos de GLP-1 PEGilados se caracterizan usando HPLC-FI analítica, HPLC-CET, SDS-PAGE, y/o Espectrometría de Masas MALDI. Los péptidos GLP-1 que contienen tiol se hacen reaccionar con polietilenglicol de 40 kDa-maleimida (PEG-maleimida) para producir derivados con PEG unido covalentemente mediante un enlace tioéter. Por ejemplo, el péptido Cex-51-C (V8E22I33C45GLP-1 , 45aa de longitud; 7,5 mg, 1 ,8 µ?t???) se disuelve en 2 mi de amortiguador de fosfato 200 mM que contiene EDTA 20 mM, pH 7,4. La solución luego se purga con argón. A esta solución se le añade 40 mg de metoxi-PEG2-MAL, un PEG bifurcado-maleimida (N° de lote PT-02B-10, Shearwater Poiymers, Inc., Huntsville, Alabama) (proporción 0,55:1 mol/mol de PEG a péptido). La reacción se realiza durante 2 horas. Después se purifican 25 mg del péptido PEGilado por HPLC-FI, se caracterizan por HPLC de exclusión por tamaño, y se ensayan respecto a la actividad in vitro. Ejemplo 2 - reacción de PEG de 40 kDa-maleimida con análogos de GLP Los análogos de GLP-1 tales como C16E22V8GLP y V8C38GLP se PEGilan selectivamente en el resto de cisteína introducido usando mPEG de 40 kDa bifurcado activado con maleimida (Shearwater Poiymers, Inc.). Para la reacción de PEGilación, el péptido a PEGilar se disuelve en amortiguador TRIS 100 mM a pH 8,0 y se añade un exceso molar de 1 ,25 veces de mPEG de 40 kDa a granel. La reacción se deja agitar a temperatura ambiente durante 2-3 horas y después se dializa durante una noche (membrana de 7 kDa) frente a citrato 0 mM, fosfato 10 mM, pH 7,4 a aproximadamente 5°C. Las moléculas de GLP PEGiladas se purifican por cromatografía de intercambio aniónico en una columna Mono-Q (Amersham Biosciences Corp, Piscataway, NJ) usando un gradiente de NaCI a pH neutro. Ejemplo 3 - reacción de DSPE-PEG de 3,4 kDa-maleimida con análogos de GLP- Los análogos de GLP-1 tales como Ci6E22V8GLP-1 y V8C38GLP-1 se PEGilan selectivamente en el resto de cisteína introducido usando mPEG de 3,4 kDa activado con maleimida terminado con un lípido, diestearoil fosfatidil etanolamina (DSPE) (Shearwater Polymers, Inc.). Para la reacción de PEGilación, el péptido se disuelve en amortiguador TRIS 100 mM a pH 8,0 y se añade un exceso molar de 1 ,25 veces de DSPE-PEG de 3,4 kDa-maleimida a granel. Se añade etanol absoluto a aproximadamente el 17% para ayudar a solubilizar DSPE-PEG de 3,4 kDa-maleimida. La reacción se deja agitar a temperatura ambiente durante 2-3 horas y después se dializa durante una noche (membrana de 7 kDa) frente a citrato 10 mM, fosfato 10 mM, pH 7,4 a aproximadamente 5°C. El péptido PEGilado se purifica por cromatografía de intercambio aniónico en una columna Mono-Q (Amersham Biosciences Corp, Piscataway, NJ) usando un gradiente de NaCI a pH neutro. Ejemplo 4 - Ensayo de actividad in vitro Se siembran células HEK-293 que expresan el receptor humano de GLP-1 , usando el sistema CRE-BLAM de PanVera LLC, a de 20.000 a 40.000 células/pocillo/100 µ? de medio DMEM con FBS al 10% en una placa de fondo transparente, negra, de 96 pocilios recubierta con poli-d-lisina. El día después de la siembra, el medio se retira y se añaden 80 µ? de medio DMEM libre de plasma. En el tercer día después de la siembra, se añaden a cada pocilio 20 µ? de medio DMEM libre de plasma con BSA al 0,5% que contiene diferentes concentraciones del compuesto GLP-1 PEGilado para generar una curva de respuesta a dosis. Generalmente, se usan catorce diluciones que contienen péptido PEGilado de 3 nanomolar a 30 nanomolar para generar una curva de respuesta a dosis a partir de la que pueden determinarse los valores de CE50. Después de 5 horas de incubación con el péptido PEGilado, se añaden 20 µ? de sustrato de ß-lactamasa (CCF2/AM, PanVera LLC) y se continúa la incubación durante 1 hora, momento en el que se determina la fluorescencia en un dispositivo cytofluor. El ensayo se describe adicionalmente en Zlokarnik, y col. (1998), Science, 278:84-88. Los siguientes péptidos GLP-1 PEGilados se ensayaron como se describe y tuvieron valores de CE50 expuestos a continuación (con V8GLP-1 igual al 100%): V8C16-DPSE-PEG de 3,4 kDa 4% V8-PEG de 3,4 kDa -FMOC 87% V8C38-DPSE-PEG de 3,4 kDa 18% V8C38-PEG de 40 kDa . 3% V8E22C 6-PEG de 40 kDa 0,7% V8E22l33C45-PEG de 40 kDa (CEX-51) 9,4 +/- 1,5 % [n=5] Ejemplo 5 - Análisis farmacocinético de péptido GLP-1 derivatizado Se administra un análogo GLP-1 PEGilado (V8E22l33C45-PEG de 40 kDa (PEGilado, CEX-51 modificado en C45)) por vías intravenosa (IV) o subcutánea (SC) a una dosis de 0,1 mg/kg a ratas SD macho. Se extraen muestras de sangre de los animales (dos ratas por tiempo puntual para IV, 3 ratas por tiempo puntual para SC) a diversos tiempos entre 0 y 336 horas después de la dosificación. Se recoge el plasma de cada muestra y se analiza por radioinmunoensayo. Los parámetros farmacocinéticos se calculan usando procedimientos dependientes (datos IV) e independientes (datos SC) de modelo (WinNonlin Pro). Se presenta una representación de los parámetros farmacocinéticos en la Tabla 1 a continuación. Por administración IV, el análogo _de GLP-1 PEGilado tiene una vida media de eliminación de aproximadamente 1 ,5 días mientras que por administración SC el análogo de GLP-1 PEGilado tiene una vida media de eliminación de aproximadamente 1 ,3 días. No se asocian observaciones clínicas adversas con la administración IV o SC de 0,1 mg/kg de V8E22l33C45- EG de 40 kDa. Se observa vida media de eliminación prolongada, eliminación lenta y biodisponibilidad subcutánea relativamente alta (aproximadamente el 60%) para el compuesto. Tabla 1 r ^max a T 1 max b AUC0-rac izd CL/Fe Vss/Ff Compuesto Vía %Fg (ng/ml) (d) (ng*h/ml) (d) (ml/h/kg) (ml/kg) V8E22I33C45- IV 1135 0,003 30293 1 ,5 3,3 161 PEG 40 kDa SC 187 1-2 18128 1 ,3 5,5 256 60 a Concentración en plasma máxima observada. b Tiempo de concentración en plasma máxima observada. c Área bajo la curva concentración en plasma-tiempo medida de 0 a infinito. d Vida media de eliminación en días. e Eliminación corporal total como función de biodisponibilidad. Volumen de distribución en el estado estacionario como función de biodisponibilidad. 9 Porcentaje de biodisponibilidad. Cuando se administra IV de manera similar V8-GLP (7-37)OH a ratas Fischer 344 a una dosis de 10 µg/kg1 se obtienen valores de eliminación y vida medía de eliminación profundamente diferentes como se enumera a continuación. Eliminación: 1449 ml/h/kg t1/2 (h): 0,05 Se administra un análogo de GLP-1 PEGilado (V8E22l33C45-PEG de 40 kDa (PEGilado, CEX-51 modificado en C4g)) por vías intravenosa (IV) o subcutánea (SC) a una dosis de 0,1 mg/kg a monos cynomolgus macho. Se extraen muestras de sangre de los animales a diversos tiempos entre 0 y 336 horas después de la dosificación. Se recoge el plasma de cada muestra y se analiza por radioinmunoensayo. Los parámetros farmacocinéticos se calculan usando procedimientos dependientes (datos IV) e independientes (datos SC) de modelo (WinNonlin Pro). Se presenta una representación de los parámetros farmacocinéticos en la Tabla 2 a continuación. Por administración IV, el análogo de GLP-1 PEGilado tiene una vida media de eliminación de aproximadamente 59,5 horas mientras que por administración SC el análogo de GLP-1 PEGilado tiene una vida media de eliminación de aproximadamente 61 ,6 horas.
Tabla 2 IV Dosis N° G a T i max b AUCo.8° t 11/2 d CL Vss (mg/kg) animal (ng/ml) (h) (ng*h/ml) (h) (ml/h/kg) (ml/kg) 0,1 I00473 1662 1 ,0 149279 59,5 0,67 57,5 I00474 2282 4,0 130341 42,1 0,77 46,6 I00477 2672 0,0 215992 76,8 0,46 51 ,3 Media 2205 1 ,7 165204 59,5 0,63 51,8 SD 509 2,1 1244991 17,4 0,16 5,5 SC Dosis N° T 1 max b AUCo-K1c l/2d CL/Fe Vss/Ff (mg/kg) animal (ng/ml) (h) (ng*h/ml) (h) (ml/h/kg) (ml/kg) 0,1 I00478 657 72,0 113518 64,4 0,88 81 ,8 I00480 976 48,0 138306 58,8 0,72 61 ,3 Media 817 60,0 125912 61 ,6 0,80 71 ,6 a Concentración en plasma máxima observada. b Tiempo de concentración en plasma máxima observada. c Área bajo la curva concentración en plasma-tiempo medida de 0 a infinito. d Vida media de eliminación. e Eliminación corporal total como función de biodisponibilidad. fVolumen de distribución como función de biodisponibilidad. SD = Desviación estándar. Ejemplo 6 - Análisis farmacodinámico de péptido GLP-1 derivatizado Se administra un análogo de GLP-1 PEGilado (V8E22I33C45-PEG de 40 kDa (PEGilado, CEX-51 modificado en C45)) por vía subcutánea (SC) a una dosis de 3 nmol/kg (12,33 mg/kg = 0,62 µg (microgramo)/50 g ratón) o 10 nmol/kg (41 mg/kg = 2 µg (microgramo)/50 g ratón) a ratones C57BL/60laHsd-Lepob macho frente a un control con sólo vehículo. Los animales (6 ratones por tiempo puntual) se dosifican con una única inyección de análogo GLP-1 PEGilado o vehículo a las 11 :00 am. Después los ratones se mantienen en ayunas durante una noche y se realiza un IPTGG (1 g dextrosa/kg i.p.). Se toman muestras repetidas para la glucosa e insulina antes y después de la inyección de glucosa a 15, 30, 60, 90, y 120 minutos. Se presenta una representación de los parámetros farmacodinámicos en las Tablas a continuación. glucosa AUC vehículo 3 nmol PEG 10 nmol PEG 85965,75 28206 29765,25 58198,5 34884 22603,5 60381 33291 48125,25 73320,75 55793,25 54038,25 71703 48422,25 25024,5 72067,5 46707,75 24808,5 Media 70272,75 41217,38 34060,88 Error estándar 4100,657 4346,437 5519,325 Valor p 0,000659 0,000365 Vehículo Día 0 Día O Día O Cepa Ratón ID GRP Peso Glucosa Glucosa Real ob/ob MR Á 49,7 231 ,4 462,8 ob/ob MS A 46,9 260,5 521 ob/ob MZ A 48,5 206,3 412,6 ob/ob NA A 47,1 209,6 419,2 ob/ob NI A 46,8 180,3 360,6 ob/ob NK A 48,7 222 444 Media 47,95 436,7 Error estándar 0,48563 21 ,99944 3 nmol GLP-1 PEG ob/ob MO C 49,4 187,1 374,2 ob/ob MP C 45,7 212,8 425,6 ob/ob MT C 53,3 253,5 507 ob/ob NC C 49,9 226 452 ob/ob NE C 50,3 247 494 ob/ob NG C 49,5 207,7 415,4 Media 49,6833 444,7 Error estándar 0,99144 20,46022 10 nmol GLP-1 PEG ob/ob MJ D 49,3 259 518 ob/ob ML D 47,4 221 ,9 443,8 ob/ob MU D 46,4 232,6 465,2 ob/ob MY D 48,2 227,6 455,2 ob/ob NB D 51 ,5 185,7 371 ,4 ob/ob ND D 42,6 196,5 393 Media 47,5667 441 ,1 Error estándar 1 ,22384 21 ,50366 Tiempo 0 Tiempo 15 Tiempo 30 Tiempo 60 Tiempo 90 Tiempo 120 Vehículo Glucosa Real Glucosa Glucosa Real Glucosa Real Glucosa Real Glucosa Real Ratón ID Dosis Real MR 0,0994 124,8 566,7 771 ,9 869,1 668,4 MS 0,0938 83,4 299,1 568,8 759,3 204 MZ 0,097 130,5 468,6 597,9 609,3 383,4 NA 0,0942 247,2 577,2 612,3 623,4 528,9 699,3 NI 0,0936 174,6 469,2 628,2 635,4 506,1 687,6 NK 0,0974 267 563,4 649,8 662,7 495 572,4 Media 171 ,25 490,7 638,15 693,2 510 535,85 Error Estándar 29,71165596 43,2838538 28,99511166 41 ,42960294 9 ,978476838 82,05989581 3 nmol GLP-1 PEG MO 0,0988 70,2 206,4 325,2 240,9 214,2 MP 0,0914 96,6 386,7 408 295,2 196,5 MT 0,1066 84 308,7 369,6 273,3 247,2 NC 0,0998 156 481 ,2 521,7 532,8 449,1 389,7 NE 0,1006 158,7 453,6 531 287,1 258 518,7 NG 0,099 83,7 433,5 461,4 378,6 310,5 405,3 Media 108,2 378,35 436,15 334,65 339,2 328,6 Error Estándar 15,91596683 42,33590084 33,90384197 43,80457168 57,00166664 52,57307296 Valor p 0,074622229 0,127534361 0,012940369 0,004544365 0,073533898 0,021860517 10 nmol GLP-1 PEG J 0,0986 91,2 164,4 312,3 290,1 217,8 MI- 0,0948 68,1 318,6 285,3 152,1 135 MU 0,0928 114,6 384,6 489,3 420,3 385,8 MY 0,0964 186 531 ,6 606,3 447,3 347,1 363,3 NB 0,103 92,4 354 261 ,6 151 ,5 117 210,6 ND 0,0852 90,3 277,5 272,7 209,4 147,6 147 Media 107,1 338,45 371 ,25 278,45 203,9 243,25 Error Estándar 16,88549674 49,69268055 58,24718448 53,42159208 72,14284441 43,7524685 Valor p 0,049860093 0,06660094 0,013403998 0,002986998 0,040209038 0,018193438 0 15 30 60 90 120 Vehículo Media 171,25 490,7 638,15 693,2 510 535,85 3 nmol Media 108,2 378,35 436,15 334,65 339,2 328,6 10 nmol Media 107,1 338,45 371 ,25 278,45 203,9 243,25 Tiempo 0 Tiempo 15 Tiempo 30 Tiempo 60 Tiempo 90 Tiempo 120 Vehículo Insulina Insulina Insulina Insulina Insulina Insulina Ratón ID Dosis Real Real Real Real Real Real MR 0,0994 2,7 2,7 2,7 2,7 3,3 S 0,0938 12,3 3,6 2,7 2,7 6,9 MZ 0,097 2,7 2,7 2,7 2,7 5,1 NA 0,0942 6,3 2,7 2,7 2,7 3,3 3,6 NI 0,0936 3,3 2,7 2,7 2,7 2,7 3,3 N 0,0974 5,4 2,7 2,7 2,7 3 4,2 Media 5,45 2,85 2,7 2,7 3 4,4 Error Estándar 1 ,498832879 0,15 0 0 0,173205081 0,572712843 3 nmol GLP-1 PEG MO 0,0988 4,8 3,6 5,7 4,8 2,7 MP 0,0914 5,7 16,5 12,6 8,7 9,6 MT 0,1066 5,4 4,5 4,8 8,4 2,7 NC 0,0998 70,8 59,4 69,9 24,6 32,7 30 NE 0,1006 27,9 14,7 24,6 11,4 12,9 25,2 NG 0,099 12,6 13,8 10,8 12 12,6 19,5 Medía 21,2 18,75 21 ,4 11 ,55 19,4 14,95 Error Estándar 0,54808039 8,42807807 10,1231418 2,793295545 6,650563886 4,764504171 Valor p 0,198202864 0,11819731 0,123985904 0,023885517 0,127758283 0,089610323 10 nmol GLP-1 PEG J 0,0986 39,3 16,5 13,5 31,2 13,5 ML 0,0948 13,5 36,9 48 19,2 14,4 U 0,0928 32,4 13,8 15,6 12 12,3 MY 0,0964 121 ,2 122,7 95,1 85,8 56,1 48,3 NB 0,103 35,7 50,7 56,4 34,8 13,2 16,5 ND 0,0852 70,5 56,7 63,9 21,3 10,8 7,5 Media 52,1 49,55 48,75 34,05 26,7 18,75 Error Estándar 15,73130637 16,2621801 12,62063786 10,88735505 14,71631747 6,035768385 Valor p 0,033003008 0,03509872 0,014767024 0,034608806 0,24535686 0,069087455 0 15 30 60 90 120 Vehículo Media 5,45 2,85 2,7 2,7 3 4,4 3 nmol Media 21 ,2 18,75 21 ,4 11 ,65 19,4 14,95 10 nmol Media 52,1 49,55 48,75 34,05 26,7 18,75 Tiempo 0 Tiempo 15 Tiempo 30 Tiempo 60 Tiempo 90 Tiempo 120 Vehículo Péptido C Péptido C Péptido C Péptido C Péptido C Péptido C Ratón ID Dosis Real Real Real Real Real Real MR 0,0994 2127 1188 1167 1182 2736 MS 0,0938 3243 1875 1992 2709 5643 MZ 0,097 1857 1266 1392 1533 2916 NA 0,0942 3666 2571 2322 2082 1932 3051 NI 0,0936 2391 2178 1776 2181 2469 3777 NK 0,0974 2580 2517 2115 2577 2910 4695 Media 2644 1932,5 1794 2044 2437 3803 Error Estándar 280,3597689 245,7235235 180,3779366 241 ,5706936 282,7772975 471 ,6178538 3 nmol GLP-1 PEG MO 0,0988 2130 3492 2613 1989 MP 0,0914 2472 5445 4632 4326 4248 MT 0,1066 2577 2919 2802 4149 3027 NC 0,0998 9663 10278 6759 7197 9849 NE 0,1006 6726 5349 6747 3843 9855 NG 0,099 5010 4812 3975 5670 6390 8337 Media 5289,6 5155,5 4329,6 4703,4 5810 6217,5 Error Estándar 1234,320279 1163,8275 615,6346725 644,8310244 1010,714104 1447,410464 Valor p 0,104283454 0,021669546 0,012956014 0,010105544 0,095491566 0,15910403 10 nmol GLP-1 PEG J 0,0986 7200 3501 4296 10332 5901 L 0,0948 3687 8049 9627 4821 MU 0,0928 5955 6300 7278 Y 0,0964 16212 17643 13266 12423 11124 11943 NB 0,103 8139 9174 11262 7170 4362 6954 ND 0,0852 12162 8478 10785 4947 3867 4506 Media 8892,5 9369 9256 8718 6451 6900,5 Error Estándar 1856,727996 2096,294409 1365,273526 1352,954914 2340,865438 104,975497 Valor p 0,015654599 0,025508262 0,001556618 0,035883718 0,263009115 0,082555028 0 15 30 60 90 120 Vehículo Media 2644 1932,5 1794 2044 2437 3803 3 nmol Media 5289,6 5155,5 4329,6 4703,4 5810 6217,5 10 nmol Media 8892,5 9369 9256 8718 6451 6900,5

Claims (20)

REIVINDICACIONES
1. Un compuesto GLP-1 PEGilado que comprende un compuesto GLP-1 unido covalentemente a al menos una molécula de PEG, en el que cada PEG está unido al compuesto por un aminoácido Cys o Lys o al aminoácido carboxi terminal y en el que el compuesto GLP-1 PEGilado tiene una vida media de eliminación de al menos una hora. 2. Un compuesto GLP-1 PEGilado que comprende la secuencia de aminoácidos de GLP-1 (7-37)OH como se muestra en SEC.ID.N0 1 unido covalentemente a una molécula de PEG por 3, 2, ó 1 de los restos seleccionados entre el grupo constituido por Lys en la posición 26 y Lys en la posición 34 y Gly en la posición 37. 3. Un compuesto GLP-1 PEGilado que comprende la secuencia de aminoácidos de GLP-1 (7-36)OH como se muestra en SEC.ID.N0 2 unido covalentemente a una molécula de PEG por 3, 2 ó 1 de los restos seleccionados entre el grupo constituido por Lys en la posición 26 y Lys en la posición 34 y Arg en la posición 36. 4. Un compuesto GLP-1 PEGilado que comprende la secuencia de aminoácidos de Fórmula I (SEC.ID.N0 3) Xaa7-Xaa8-Glu-Gly-Xaaii-Xaai2-Thr-Ser-Asp-Xaai6-Ser-Xaa18-Xaa 9-Xaa2o- Glu-Xaa22-Xaa23-Xaa24-Xaa25-Xaa26-Xaa27-Phe-lle-Xaa30-Trp-Leu-Xaa33- Xaa34-Xaa35-Xaa36-Xaa37 Fórmula I (SEC.ID.N0 3) en la que: Xaa7 es: L-histidina, D-histidina, desamino-histidina, 2-amino-histid¡na, ß-hidroxi- histidina, homohistidina, a-fluorometil-histidina, o cc-metil-histidina; Xaa8 es: Ala, Gly, Val, Leu, lie, Ser, o Thr; Xaa es: Thr o Cys; Xaa-¡2 es: Phe, Trp, Tyr, o Cys; Xaa16 es: Val, Trp, lie, Leu, Phe, Tyr, o Cys; Xaaie es: Ser, Trp, Tyr, Phe, Lys, lie, Leu, Val; Xaaig es: Tyr, Trp, o Phe; Xaa2o es: Leu, Phe, Tyr, o Trp; Xaa22 es: Gly, Glu, Asp, Lys, o Cys;
Xaa24 es: Ala o Cys; Xaa25 es: Ala, Val, lie, Leu, o Cys;
Xaa27 es: Glu, lie, Ala, o Cys; Xaa3o es: Ala, Glu, o Cys Xaa33 es: Val o lie; Xaa34 es: Lys o Cys;
Xaa36 es: Arg o Cys; Xaa37 es: Gly, His, Cys, NH2, o está ausente; y en la que: 2 ó 1 de los restos de Cys están unidos covalentemente a una molécula de PEG, o 3, 2 ó 1 de los restos de Lys están unidos covalentemente a una molécula de PEG, y a condición de que haya 2, 1 ó 0 Cys en la molécula.
5. Un compuesto GLP-1 PEGilado que comprende la secuencia de aminoácidos de Fórmula II (SEC.ID.N0 4): Xaay-Xaas-Glu-Gly-Xaan-Xaa^-Thr-Ser-Asp-Xaaie-Ser-Xaais-Tyr-Leu-Glu- Xaa22- aa23- aa24-Xaa25-Xaa26-Xaa27- he-lle-Xaa30- rp-Leu-Xaa33-Xaa34- Formula II (SEC.ID.N0 4) en la que: Xaa7 es: L-histidina, D-histidina, desamino-histidina, 2-amino-histidina, ß-hidroxi-histidina, homohistidina, a-fluorometil-histidina; o a-metil-histidina; Xaa8 es: Gly, Ala, Val, Leu, lie, Ser, o Thr; Xaan es: Thr o Cys; Xaa 2 es: Phe, o Cys Xaa16 es: Val, Phe, Tyr, Trp, o Cys; Xaa-is es: Ser, Tyr, Trp, Phe, Lys, lie, Leu, o Val; Xaa 9 es: Tyr o Phe; Xaa22 es: Gly, Glu, Asp, Lys, o Cys; Xaa23 es: Gln o Cys; Xaa24 es: Ala o Cys; Xaa25 es: Ala, Val, lie, Leu, o Cys; Xaa27 es: Glu o Cys; Xaa33 es: Val o lie; Xaa34 es: Lys o Cys; Xaa35 es: Gly o Cys; Xaa36 es: Arg o Cys; y Xaa37 es: Gly, Cys, NH2, o está ausente, y en la que: 2 ó 1 de los restos de Cys están unidos covalentemente a una molécula de PEG, o 3, 2 ó 1 de los restos de Lys están unidos covalentemente a una molécula de PEG; y a condición de que haya 2, 1 ó 0 Cys en la molécula.
6. Un compuesto GLP-1 PEGilado que comprende la secuencia de aminoácidos de Fórmula III (SEC.ID.N0 5) Xaa7-Xaa8-Glu-Gly-Xaaii-Xaai2-Thr-Ser-Asp-Xaai6-Ser-Xaai8-Xaai9-Xaa2o- Glu-Xaa22-Xaa23-Xaa24-Xaa25-Xaa26- aa27-Phe-lle-Xaa30-Trp-Leu-Xaa33- Xaa34-Xaa35-Xaa36-Xaa37-Xaa38-Xaa39-Xaa4o-Xaa4i-Xaa42-Xaa43-Xaa44- Xaa45-Xaa46-Xaa47-Xaa48-Xaa4g-Xaa5o Formula III (SEC.ID.N0 5) en la que: Xaa7 es: L-histidina, D-histidina, desamino-histidina, 2-amino-histidina, ß-hidroxi-histidina, homohistidina, a-fluorometil-histid'ina, o a-metil-histidina; Xaa8 es: Ala, Gly, Val, Leu, lie, Ser, o Thr; Xaa es: Thr o Cys; Xaai2 es: Phe, Trp, Tyr, o Cys; Xaa-16 es: Val, Trp, lie, Leu, Phe, Tyr, o Cys; Xaais es: Ser, Trp, Tyr, Phe, Lys, lie, Leu, o Val; Xaaig es: Tyr, Trp, o Phe; Xaa2o es: Leu, Phe, Tyr, o Trp; Xaa22 es: Gly, Glu, Asp, Lys, o Cys; Xaa24 es: Ala o Cys; Xaa25 es: Ala, Val, lie, Leu, o Cys; Xaa26 es: Lys o Cys; Xaa27 es: Glu, lie, Ala, o Cys; Xaa30 es: Ala, Glu, o Cys; Xaa33 es: Val o lie; Xaa34 es: Lys, Asp, Arg, Glu, o Cys; Xaa35 es: Gly o Cys; Xaa36 es: Gly, Pro, Arg, o Cys; Xaa37 es: Gly, Pro, Ser, o Cys; Xaa38 es: Ser, Pro, His, o Cys; Xaa39 es: Ser, Arg, Thr, Trp, Lys, o Cys; Xaa40 es: Ser, Gly, o Cys; Xaa41 es: Ala, Asp, Arg, Glu, Lys, Gly, o Cys; Xaa42 es: Pro, Ala, Cys, o NH2, o está ausente; Xaa 3 es: Pro, Ala, Cys, NH2, o está ausente; Xaa44 es: Pro, Ala, Arg, Lys, His, Cys, NH2, o está ausente; Xaa45 es: Ser, His, Pro, Lys, Arg, Gly, Cys, NH2 o está ausente; Xaa46 es: His, Ser, Arg, Lys, Pro, Gly, Cys, NH2 o está ausente; y Xaa47 es: His, Ser, Arg, Lys, Cys, NH2 o está ausente; Xaa48 es: Gly, His, Cys, NH2, o está ausente; Xaa49 es: Pro, His, Cys, NH2, o está ausente; Xaa50 es: Ser, His, Cys, Ser-NH2, His-NH2, Cys-NH2, o está ausente; y en la que: 2 ó 1 de los restos de Cys están unidos covalentemente a una molécula de PEG, o 3, 2 ó 1 de los restos de Lys están unidos covalentemente a una molécula de PEG; y a condición de que si Xaa42l Xaa43, Xaa 4, Xaa45, Xaa4e, Xaa47, Xaa48 o Xaa49 está ausente, cada aminoácido cadena abajo esté ausente; y con la condición de que haya 2, 1 ó 0 Cys en la molécula.
7. Un compuesto GLP-1 PEGilado que comprende la secuencia de aminoácidos de Fórmula IV (SEC.ID.N0 6) Xaa -Xaa8-Glu-Gly-Xaa11-Xaai2-Thr-Ser-Asp-Xaai6-Ser-Xaai8-Xaai9-Xaa2o- Glu-Xaa22-Xaa23-Xaa24-Xaa25-Xaa26-Xaa27-Phe-lle-Xaa30-Trp-Leu-Xaa33- Xaa3 -Xaa35-Xaa36-Xaa37-Xaa38-Xaa39-Xaa4o-Xaa i-Xaa 2-Xaa43-Xaa44- Formula IV (SEQ ID NO: 6) en la que: Xaa7 es: L-histidina, D-histidina, desamino-histidina, 2-amino-histidina, ß-hidroxi-histidina, homohistidina, a-fluorometil-histidina, o a-metil-histidina; Xaa8 es: Ala, Gly, Val, Leu, lie, Ser, o Thr; Xaa es: Thr o Cys Xaai2 es: Phe, Trp, Tyr, o Cys; Xaa16 es: Val, Trp, lie, Leu, Phe, Tyr, o Cys; Xaa18 es: Ser, Trp, Tyr, Phe, Lys, He, Leu, Val; Xaa19 es: Tyr, Trp, o Phe; Xaa20 es: Leu, Phe, Tyr, o Trp; Xaa22 es: Gly, Glu, Asp, Lys o Cys; Xaa24 es: Ala o Cys; Xaa25 es: Ala, Val, lie, Leu, o Cys; Xaa26 es: Lys o Cys; Xaa27 es: Glu, lie, Ala, o Cys; Xaa30 es: Ala, Glu o Cys Xaa33 es: Val o lie; Xaa34 es: Lys, Asp, Arg, Glu o Cys; Xaa35 es: Gly o Cys; Xaa36 es: Gly, Pro, Arg o Cys; Xaa37 es: Gly, Pro, Ser o Cys; Xaa38 es: Ser, Pro, His o Cys; Xaa39 es: Ser, Arg, Thr, Trp, Lys o Cys; Xaa40 es: Ser, Gly, o Cys; Xaa41 es: Ala, Asp, Arg, Glu, Lys, Gly, o Cys; Xaa42 es: Pro, Ala, Cys, NH2, o está ausente; Xaa43 es: Pro, Ala, Cys, NH2, o está ausente; Xaa es: Pro, Ala, Arg, Lys, His, Cys, NH2, o está ausente; Xaa45 es: Ser, His, Pro, Lys, Arg, Cys, NH2 o está ausente; Xaa4e es: His, Ser, Arg, Lys, Cys, NH2 o está ausente; y Xaa47 es: His, Ser, Arg, Lys, Cys, NH2 o está ausente; y en la que: 2 ó 1 de los restos de Cys están unidos oovalentemente a una molécula de PEG, o 3, 2 ó 1 de los restos de Lys están unidos oovalentemente a una molécula de PEG; y a condición de que si Xaa42, Xaa43, Xaa44, Xaa45 o Xaa46 está ausente cada aminoácido cadena abajo esté ausente; y a condición de que haya 2, 1 ó 0 Cys en la molécula.
8. Un compuesto GLP- PEGilado que comprende la secuencia de aminoácidos de Fórmula V (SEC.ID.N0 7) Xaa7-Xaa8-Glu-Gly-Xaan-Xaai2-Thr-Ser-Asp-Xaai6-Ser-Ser-Tyr-Lys-Glu- Xaa22-Xaa23-Xaa24-Xaa25-Xaa26-Xaa27-Phe-lle-Xaa3o-Trp-Leu-Xaa33-Xaa34- Xaa35-Xaa36-Xaa37-Xaa38-Xaa39-Xaa4o-Xaa4i-Xaa42-Xaa43-Xaa44-Xaa45- Formula V (SEC.ID.N° 7) en la que: Xaa7 es: L-histidina, D-histidina, desamino-histidina, 2-amino-histidina, ß-hidroxi-histidina, homohistidina, a-fluorometil-histidina, o a-metil-histidina; Xaas es: Gly, Val, Leu, lie, Ser, o Thr; Xaa-11 es: Thr o Cys; Xaa-12 es: Phe o Cys; Xaa-i6 es: Val, Trp, lie, Leu, Phe, Tyr, o Cys; Xaa22 es: Gly, Glu, Asp, Lys, o Cys; Xaa25 es: Ala, Val, lie, Leu, o Cys; Xaa27 es: Glu o Cys; Xaa30 es: Ala o Cys; Xaa33 es: Val o lie; Xaa34 es: Lys, Asp, Arg, Glu, o Cys; Xaa35 es: Gly o Cys; Xaa36 es: Gly, Pro, Arg, o Cys; Xaa37 es: Gly, Pro, Ser, o Cys; Xaa38 es: Ser, Pro, His, o Cys; Xaa39 es: Ser, Arg, Thr, Trp, Lys, o Cys; Xaa40 es: Ser, Gly, o Cys; Xaa4i es: Ala, Asp, Arg, Glu, Lys, Gly, o Cys; Xaa42 es: Pro, Ala, o Cys; Xaa43 es: Pro, Ala, o Cys; Xaa4 es: Pro, Ala, Arg, Lys, His, Cys, NH2, o está ausente; Xaa45 es: Ser, His, Pro, Lys, Arg, Cys, NH2 o está ausente; Xaa46 es: His, Ser, Arg, Lys, Cys, NH2 o está ausente; y Xaa47 es: His, Ser, Arg, Lys, Cys, NH2 o está ausente; y en la que: 2 ó 1 de los restos de Cys están unidos covalentemente a una molécula de PEG, o 3, 2 ó 1 de los restos de Lys están unidos covalentemente a una molécula de PEG; y a condición de que si Xaa44, Xaa45, Xaa46, o Xaa 7 está ausente cada aminoácido cadena abajo esté ausente; y a condición de que haya 2, 1 ó 0 Cys en la molécula.
9. Un compuesto GLP-1 PEGilado que comprende la secuencia de aminoácidos de Fórmula VI (SEC.ID.N0 8) XaarXaaa-Glu-Gly-Xaan-Xaa^-Thr-Ser-Asp-Xaaie-Ser-Ser-Tyr-Lys-Glu- Xaa22-Xaa23-Xaa2 -Xaa25-Xaa26-Xaa27-Phe-lle-Xaa30-Trp-Leu-Xaa33-Xaa34- Xaa35-Xaa36-Xaa37-Xaa38-Xaa39-Xaa o-Xaa i-Xaa 2-Xaa43-Xaa44-Xaa45- Formula VI (SEC.ID.N0 8) en la que: Xaa7 es: L-histidina, D-histidina, desamino-histidina, 2-amino-h¡stidina, ß-hidroxi-histidina, homohistidína, a-fluorometil-histidina, o a-metil-histidina; Xaa8 es: Gly, Val, Leu, lie, Ser, o Thr; Xaa^ es: Thr o Cys; Xaa12 es: Phe o Cys; Xaa22 es: Gly, Glu, Asp, Lys o Cys; Xaa24 es: Ala o Cys; Xaa25 es: Ala, Val, lie, Leu, o Cys; Xaa27 es: Glu o Cys; Xaa3o es: Ala o Cys; Xaa34 es: Lys o Cys; Xaa35 es: Gly o Cys; Xaa36 es: Gly o Cys; Xaa37 es: Pro o Cys; Xaa38 es: Ser, Pro, His, o Cys; Xaa39 es: Ser, Arg, Thr, Trp, Lys, o Cys; Xaa40 es: Ser, Gly, o Cys; Xaa 1 es: Ala, Asp, Arg, Glu, Lys, Gly, o Cys; Xaa42 es: Pro, Ala, o Cys; Xaa43 es: Pro, Ala, o Cys; Xaa44 es: Pro, Ala, Arg, Lys, His, Cys, NH2, o está ausente; Xaa45 es: Ser, His, Pro, Lys, Arg, Cys, NH2 o está ausente; Xaa46 es: His, Ser, Arg, Lys, Cys, NH2 o está ausente; y Xaa47 es: His, Ser, Arg, Lys, Cys, NH2 o está ausente; y en la que: 2 ó 1 de los restos de Cys están unidos covalentemente a una molécula de PEG, o 3, 2 ó 1 de los restos de Lys están unidos covalentemente a una molécula de PEG; a condición de que si Xaa44, Xaa45l Xaa46, o Xaa47 está ausente cada aminoácido cadena abajo esté ausente y a condición de que haya 2, 1 ó 0 Cys en la molécula.
10. Un compuesto GLP-1 PEGilado que comprende una secuencia de aminoácidos de Fórmula VII (SEC.ID.N0 9) His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala- Ala-Lys-Glu-Phe-lle-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Gly-Pro-Xaa38-Xaa39-Xaa4o- Xaa4i-Xaa42-Xaa43-Xaa44-Xaa45-Xaa46-Xaa47-Xaa48-Xaa49-Xaa50 Formula VII (SEC.ID.N0 9) en la que: Xaan es: Thr o Cys; Xaa-12 es: Phe o Cys; Xaa 6 es: Val o Cys; Xaa22 es: Gly o Cys; Xaa24 es: Ala o Cys; Xaa26 es: Lys o Cys; Xaa27 es: Glu o Cys; Xaa30 es: Ala o Cys; Xaa34 es: Lys o Cys; Xaa37 es: Pro o Cys; Xaa38 es: Ser, Pro, His o Cys; Xaa39 es: Ser, Arg, Thr, Trp, Lys o Cys; Xaa40 es: Ser, Gly o Cys; Xaa4i es: Ala, Asp, Arg, Glu, Lys, Gly o Cys; Xaa42 es: Pro, Ala, Cys, NH2, o está ausente; Xaa43 es: Pro, Ala, Cys, NH2, o está ausente; Xaa44 es: Pro, Ala, Arg, Lys, His, Cys, NH2, o está ausente; Xaa45 es: Ser, His, Pro, Lys, Arg, Gly, Cys, NH2 o está ausente; Xaa46 es: His, Ser, Arg, Lys, Pro, Gly, Cys, NH2 o está ausente; y Xaa47 es: His, Ser, Arg, Lys, Cys, NH2 o está ausente; Xaa48 es: Gly, His, Cys, NH2 o está ausente; Xaa49 es: Pro, His, Cys, NH2 o está ausente; y Xaa5o es: Ser, His, Cys, Ser-NH2, His-NH2> Cys-NH2, o está ausente; en la que dicho péptido GLP-1 comprende de una a seis sustituciones adicionales y en la que: 2 ó 1 de los restos de Cys están unidos covalentemente a una molécula de PEG, o 3, 2 ó 1 de los restos de Lys están unidos covalentemente a una molécula de PEG; a condición de que si Xaa44, Xaa45, Xaa 6, o Xaa47 está ausente cada aminoácido cadena abajo esté ausente; y a condición de que haya 2, 1 ó 0 Cys en la molécula; y a condición de que si Xaa42, Xaa43, Xaa44, Xaa45, Xaa46, Xaa47, Xaa48i o Xaa49 está ausente cada aminoácido cadena abajo esté ausente.
11. El compuesto GLP-1 PEGilado de la reivindicación 10, en el que la sustitución adicional se selecciona entre el grupo constituido por al menos una de las siguientes sustituciones: a. His en la posición 7 está sustituida por D-histidina, desamino-histidina, 2-amino-histidina, ß-hidroxi-histidina, homohistidina, a-fluorometil-histidina, o a-metil-histidina; b. Ala en la posición 8 está sustituida por Gly, Val, Leu, lie, Ser, o Thr; c. Phe en la posición 12 está sustituida por Trp o Tyr; d. Val en la posición 16 está sustituida por Trp, lie, Leu, Phe, o Tyr; e. Ser en la posición 18 está sustituida por Trp, Tyr, Phe, Lys, lie, Leu, o Val; f. Tyr en la posición 19 está sustituida por Trp o Phe; g. Leu en la posición 20 está sustituida por Phe, Tyr, o Trp; h. Gly en la posición 22 está sustituida por Glu, Asp, o Lys; i. Ala en la posición 25 está sustituida por Val, lie, o Leu; j. Glu en la posición 27 está sustituida por lie o Ala; k. Ala en la posición 30 está sustituida por Glu; I. Val en la posición 33 está sustituida por lie; y m. Lys en la posición 34 está sustituida por Asp, Arg o Glu.
12. El compuesto GLP-1 PEGilado que comprende la secuencia de aminoácidos de Fórmula VIII (SEC.ID.N0 10) Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaa1o-Xaaii-Xaai2-Xaai3-Xaa 4-Xaai5-Xaa16-Xaai7-Xaai8- Xaai9-Xaa2o-Xaa2i-Xaa22-Xaa23-Xaa24-Xaa25-Xaa26-Xaa27-Xaa28-Xaa29- Xaa3o-Xaa3i- aa32-Xaa33-Xaa34-Xaa35-Xaa36-Xaa37-Xaa38-Xaa3g-Xaa4o- Xaa4i-Xaa42-Xaa43-Xaa44-Xaa45 Formula VIII (SEC.ID.N0 10) en la que: Xaa7 es: L-histidina, D-histidina, desamino-histidina, 2-amino-histidina, ß-hidroxi-histidina, homohistidina, a-fluorometil-histidina, a-metil-histidina, Arg, Tyr, Ala o Val; Xaa8 es: Gly, Ser, Ala, o Thr; Xaa-? ? es: Gly, Ala o Val; Xaa-11 es: Thr, Cys o Ala; Xaa-12 es: Phe, Cys, Ala, o Tyr; Xaa 4 es: Ser, Ala, o Thr; Xaa 5 es: Asp, o Glu; Xaa-16 es: Leu, Cys, Ala, lie, Val, o Met; Xaa 7 es: Ser o Ala; Xaa-is es: Lys o Ala; Xaaig es: Gln o Ala; Xaa2o es: Met, Ala, Leu, lie, o Val; Xaa2i es: Glu o Ala; Xaa22 es: Glu, Cys, o Ala; Xaa23 es: Glu, Cys, o Ala; Xaa24 es: Ala o Cys; Xaa25 es: Val, Cys, o Ala; Xaa26 es: Arg, Cys, o Ala Xaa27 es: Leu, Cys, o Ala; Xaa28 es: Phe, Ala, o Tyr; Xaa29 es: lie, Val, Leu, Gly, o Met; Xaa3o es: Glu, Cys, Ala, o Asp; Xaa31 es: Trp, Ala, Phe, o Tyr; Xaa32 es: Leu o Ala; Xaa33 es: Lys o Ala; Xaa34 es: Asn, Cys, o Ala; Xaa35 es: Gly o Cys; Xaa36 es: Gly o Cys; Xaa37 es: Pro o Cys Xaa38 es: Ser, Cys, NH2, o ausente; Xaa39 es: Ser, Cys, NH2, o ausente; Xaa40 es: Gly, Cys, NH2 o ausente; Xaa es: Ala, Cys, NH2 o ausente; Xaa42 es: Pro, Cys, NH2 o ausente; Xaa 3 es Pro, Cys, NH2 o ausente; Xaa44 es Pro, Cys, NH2 o ausente; y Xaa45 es Ser, Cys, NH2 o ausente; y en la que: 2 ó 1 de los restos de Cys están unidos covalentemente a una molécula de PEG; a condición de que haya 2 ó 1 Cys en la molécula; a condición adicional de que no más de tres de Xaag, Xaa-m, Xaan, Xaai2, Xaa-|4, Xaa-15, Xaai6, Xaai7, Xaa-is, Xaa-19, Xaa2o, Xaa2i, Xaa22, Xaa23, Xaa24l Xaa26, Xaa27, Xaa30, Xaa3i, Xaa32, sean Ala; y a condición también de que, si Xaai es His, Arg o Tyr, entonces al menos uno de Xaa9, Xaa 0 y Xaa-i 6 sea Ala; y, a condición adicional de que si Xaa38, Xaa3g, Xaa 0, Xaa4i, Xaa42, Xaa43 o Xaa44 está ausente cada aminoácido cadena abajo esté ausente.
13. Un procedimiento para estimular el receptor de GLP-1 en un sujeto en necesidad de dicha estimulación, comprendiendo dicho procedimiento la etapa de administrar al sujeto una cantidad eficaz del compuesto GLP-1 PEGilado de una cualquiera de las reivindicaciones 1-12.
14. El procedimiento de la reivindicación 13, en el que el sujeto se está tratando para diabetes no insulino-dependiente.
15. El procedimiento de la reivindicación 13, en el que el sujeto se está tratando de manera profiláctica para diabetes no insulino-dependiente.
16. El procedimiento de la reivindicación 13, en el que el sujeto se está tratando para obesidad, apoplejía, infarto de miocardio, apoplejía, síndrome del intestino irritable o dispepsia funcional.
17. El uso del compuesto GLP-1 PEGilado de una cualquiera de las reivindicaciones 1-13 en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de diabetes no insulino-dependiente, obesidad, apoplejía, infarto de miocardio, síndrome del intestino irritable o dispepsia funcional.
18. El uso de la reivindicación 17, en el que el medicamento se usa para tratar diabetes no insulino-dependiente.
19. El uso de la reivindicación 17, en el que el medicamento se usa para tratar obesidad.
20. El uso de la reivindicación 17, en el que el medicamento se usa para tratar síndrome del intestino irritable o dispepsia funcional. RES U M E N La invención proporciona compuestos GLP-1 acoplados a por lo menos una molécula de polietilenglicol o su derivado, que dan como resultado un péptido biológicamente activo con una vida media extendida y una eliminación más lenta cuando se compara con aquélla del péptido noPeGilado. Estos compuestos GLP-1 PEGilados y composiciones son útiles para tratar diabetes, obesidad, síndrome de intestino irritable y otras condiciones que pudieran verse beneficiadas al reducir la glucosa en la sangre, inhibir la motilidad gástrica y/o intestinal e inhibir el vaciado gástrico y/o intestinal, o inhibir el consumo de comida.
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