KR100733940B1 - 폴리에틸렌 글리콜이 연결된 ｇｌｐ-1 화합물 - Google Patents

폴리에틸렌 글리콜이 연결된 ｇｌｐ-1 화합물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 PEG화되지 않은 펩티드에 비해 반감기가 연장되고 제거율이 감소된 생물학적으로 활성인 펩티드를 생성하는, 하나 이상의 폴리에틸렌 글리콜 분자와 커플링된 GLP-1 화합물 또는 그의 유도체를 제공한다. 상기 PEG화된 GLP-1 화합물 및 조성물은 당뇨병, 비만, 과민성 장 증후군, 및 혈장 글루코스 저하, 위 및(또는) 장 운동 억제 및 위 및(또는) 장 공복 억제, 또는 음식 섭취 억제에 의해 유리해지는 다른 증상의 치료에 유용하다.
폴리에틸렌 글리콜 화합물, GLP-1 수용체, PEG화, 인슐린 비-의존성 당뇨병, 비만

Description

폴리에틸렌 글리콜이 연결된 ＧＬＰ-1 화합물 {Polyethylene Glycol Link GLP-1 Compounds}
본 발명은 하나 이상의 폴리에틸렌 글리콜 분자에 공유 결합된 GLP-1 화합물 또는 그의 유도체, 및 혈당 저하, 음식 섭취 감소, 위 또는 장 공복 감소, 또는 위 또는 장 운동 감소에 의해 유리해지는 증상 또는 질병의 치료에 유용한 조성물 및 방법에 관한 것이다.
글루카곤-유사 펩티드-1 (GLP-1)은 인슐린 분비 자극, 글루카곤 분비 억제, 위 공복 억제, 위 운동 또는 장 운동 억제, 글루코스 사용 증진 및 체중 감량 유도와 같은 다양한 생물학적 효과를 유도한다. 또한, GLP-1은 인슐린 비-의존성 진성 당뇨병 (NIDDM)이 진행됨에 따라 유발되는 췌장 β-세포 퇴화를 예방하는 작용을 할 수 있다. GLP-1의 현저한 특성은 인슐린 요법, 또는 인슐린 발현 증가에 의해 작용하는 경구 요법 중 몇몇 유형을 이용하는 경우에 나타나는 저혈당증 관련 위험을 수반하지 않고 인슐린 분비를 자극하는 능력에 있다.
GLP-1(1-37)의 활성이 불충분하고, 2 가지의 절단된 자연 발생 펩티드인 GLP-1(7-37)OH 및 GLP-1(7-36)NH2가 생체내에서 빠르게 제거되어 생체내 반감기가 매우 짧다는 사실에 의해 GLP-1 펩티드가 관여하는 요법의 유용성이 제한되어 왔다. 내생적으로 생성된 디펩티딜-펩티다제 IV (DPP-IV)는 N-말단 히스티딘 및 알라닌 잔기를 제거함으로써 GLP-1 펩티드의 순환을 불활성화시키며, 이것이 짧은 생체내 반감기에 대한 주요 원인인 것으로 알려져 있다.
생물학적 활성을 유지하면서 GLP-1 펩티드의 소실 반감기를 연장시키거나 신체로부터의 펩티드 제거율을 감소시키기 위한 다양한 접근법이 시도되어 왔다. 미국 특허 제5,705,483호는 GLP-1 펩티드 유사체가 펩티드 N-말단에서의 변형 혼입에 의해 DPP-IV 분해에 내성을 갖게 된다고 교시하고 있다. GLP-1 펩티드의 반감기를 연장시키기 위한 또다른 접근법은 DPP-IV가 펩티드의 N-말단에 진입하는 것을 방해하는 거대 아실기를 GLP-1의 다양한 아미노산에 부착시키는 유도체화 방법이다 (국제 출원번호 PCT/DK97/00340 참조, 1997년 8월 22일에 "GLP-1 유도체"란 제목으로 출원됨, 우선권 주장: DK 가출원 제0931/96호 (1996년 8월 30일 출원), 제1259/96호 (1996년 11월 8일 출원) 및 제1470/96호 (1996년 12월 20일 출원)).
특정 GLP-1 유사체가 미국 특허출원 제60/346,474호 (2002년 1월 8일 출원) 및 제60/405,097호 (2002년 8월 21일 출원) (모두 현재 국제 출원번호 PCT/US03/058203으로서 2003년 1월 3일에 "연장된 글루카곤-유사 펩티드-1 유사체"란 제목으로 출원되었으며, 이들의 전문은 본원에 포함되는 것으로 간주함)에 기재되어 있다. 상기 출원에는, 다양한 아미노산이 C-말단에 첨가된 경우에 천연 분자에 비해 반감기가 연장되고 제거율이 감소된 GLP-1 펩티드 유사체를 생성하는, GLP-1(7-37)OH의 유사체가 기재되어 있다. 또한, 효능이 증대된 GLP-1 유사체가 미국 특허출원 제60/314,573호 (2001년 8월 23일 출원, 현재 국제 출원번호 PCT/US02/21325로서 2002년 8월 14일에 "글루카곤-유사 펩티드-1 유사체"란 제목으로 출원되었으며, 본원에 포함되는 것으로 간주함)에 기재되어 있다. 엑센딘-4 (Exendin-4)는 시험관내에서 인슐린-분비 세포를 비롯한 특정 세포 유형 상의 GLP-1 수용체에서 작용할 수 있다 (문헌 [Goke, et al., J. Biol. Chem., (1993) 268:19650-19655]). 특정 PEG화된 (PEGylated) 엑센딘 및 엑센딘 효능제 분자는 국제 출원번호 PCT/US00/11814 (그 전문이 본원에 포함되는 것으로 간주함)에 기재되어 있다.
다양한 접근법을 통해 천연 GLP-1에 비해 반감기가 연장되거나 효능이 증대된 GLP-1 화합물을 수득하였지만, 연장된 시간 동안 투여 횟수를 최소화할 수 있는 치료제로서 유용한 능력을 최적화시킴으로써 GLP-1 화합물의 제거율을 더 감소시키고 GLP-1 화합물의 반감기를 더 증가시키기 위해, 단독으로 또는 공지된 접근법과 함께 이용할 수 있는 부가적인 접근법이 요구되고 있다. 하나 이상의 폴리에틸렌 글리콜 분자가 생물학적으로 활성인 작은 펩티드, 예컨대 GLP-1 또는 엑센딘-4에 공유 결합되면, 분자를 치료제로 사용하기 부적합할 정도로 심각한 불리한 특성, 예컨대 분자에 대한 불안정성 및 생물학적 활성의 감소가 도입될 위험이 있다. 그러나, 본 발명은 하나 이상의 PEG 분자가 GLP-1 화합물의 특정 잔기에 공유 결합되면 천연 GLP-1 또는 Val8-GLP-1 (또는 본 발명의 변형된 엑센딘-4-펩티드에 대한 천연 엑센딘-4)에 비해 반감기가 연장되고 제거율이 감소된, 생물학적으로 활성인 PEG화된 GLP-1 화합물이 생성된다는 발견에 기초한다.
본 발명의 PEG화된 GLP-1 화합물은 천연 GLP-1 화합물 또는 Val8-GLP-1(7-37)OH에 비해 반감기가 증가하고(하거나) 제거율이 감소되면서도 천연 GLP-1의 생물학적 활성을 전부 또는 일부 유지하기 때문에, 천연 GLP-1보다 치료제로 사용하기에 훨씬 더 유용할 뿐만 아니라 사용하기 훨씬 더 편리하다. GLP-1(7-37)의 혈청내 반감기는 단지 3 내지 5분이다. GLP-1(7-36) 아미드의 작용 시간은 피하 투여된 경우에 약 50분이다. 내생 프로테아제 절단에 대해 내성을 갖는 GLP-1 유사체 및 유도체라도 24시간에 걸쳐 반복 투여하지 않아도 될 만큼 충분히 긴 반감기를 갖지는 못한다. 본 발명의 PEG화된 GLP-1 화합물의 반감기는 24시간을 초과할 수 있으며, 이러한 연장된 반감기로 인해 연장된 시간 동안 화합물의 혈중 농도를 높은 수준으로 유지하면서 PEG화된 GLP-1 화합물의 투여 횟수를 감소시킬 수 있다. 상기 PEG화된 GLP-1 화합물은 당뇨병, 비만, 위 및(또는) 장 운동 이상, 및 위 및(또는) 장 공복 이상 등을 비롯한 질병을 앓고 있는 대상체를 치료하기 위해 치료적으로 사용될 수 있으며, 이 때 본 발명의 PEG화된 GLP-1 화합물은 24시간 동안 요구되는 투여 횟수가 적고, 상기 치료를 필요로 하는 대상체를 위한 편리함 및 투여 요구량에 대한 대상체의 순응 가능성 둘 모두를 증가시키기 때문에 특히 유리하다.
<발명의 요약>
본원에 기재된 발명은 하나 이상의 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 분자에 공유 결합된 GLP-1 화합물 또는 그의 유도체를 제공하며, 여기서 각각의 PEG는 펩티드의 Cys 또는 Lys 아미노산, 또는 카르복시 말단에 결합하여 소실 반감기가 1시간 이상, 바람직하게는 3, 5, 7, 10, 15, 20시간 이상, 가장 바람직하게는 24시간 이상인 PEG화된 GLP-1 화합물을 생성한다. 본 발명의 PEG화된 GLP-1 화합물의 제거율 값은 바람직하게는 200 ml/h/kg 이하, 보다 바람직하게는 180, 150, 120, 100, 80, 60 ml/h/kg 이하, 가장 바람직하게는 50, 40 또는 20 ml/h/kg 미만이다.
본 발명의 한 실시양태는 서열 1에 나타낸 GLP-1(7-37)OH의 아미노산 서열 및 Lys26, Lys34 및 Gly37로 이루어진 군으로부터 선택된 1 내지 3개의 잔기에 공유 결합된 PEG 분자를 포함하는 PEG화된 GLP-1 화합물이다.
Figure 112005052020435-pct00001
본 발명의 다른 실시양태는 서열 2에 나타낸 GLP-1(7-36)NH2의 아미노산 서열 및 Lys26, Lys34 및 Arg36으로 이루어진 군으로부터 선택된 1 내지 3개의 잔기에 공유 결합된 PEG 분자를 포함하는 PEG화된 GLP-1 화합물이다.
Figure 112005052020435-pct00002
본 발명의 다른 실시양태는 식 I (서열 3)의 아미노산 서열을 포함하는 PEG 화된 GLP-1 화합물이다.
<식 I>
Figure 112005052020435-pct00003
상기 식에서,
Xaa7은 L-히스티딘, D-히스티딘, 데스아미노-히스티딘, 2-아미노-히스티딘, β-히드록시-히스티딘, 호모히스티딘, α-플루오로메틸-히스티딘 또는 α-메틸-히스티딘이고;
Xaa8은 Ala, Gly, Val, Leu, Ile, Ser 또는 Thr이고;
Xaa11은 Thr 또는 Cys이고;
Xaa12는 Phe, Trp, Tyr 또는 Cys이고;
Xaa16은 Val, Trp, Ile, Leu, Phe, Tyr 또는 Cys이고;
Xaa18은 Ser, Trp, Tyr, Phe, Lys, Ile, Leu 또는 Val이고;
Xaa19는 Tyr, Trp 또는 Phe이고;
Xaa20은 Leu, Phe, Tyr 또는 Trp이고;
Xaa22는 Gly, Glu, Asp, Lys 또는 Cys이고;
Xaa23은 Gln 또는 Cys이고;
Xaa24는 Ala 또는 Cys이고;
Xaa25는 Ala, Val, Ile, Leu 또는 Cys이고;
Xaa26은 Lys 또는 Cys이고;
Xaa27은 Glu, Ile, Ala 또는 Cys이고;
Xaa30은 Ala, Glu 또는 Cys이고;
Xaa33은 Val 또는 Ile이고;
Xaa34는 Lys 또는 Cys이고;
Xaa35는 Gly 또는 Cys이고;
Xaa36은 Arg 또는 Cys이고;
Xaa37은 Gly, His, Cys 또는 NH2이거나, 또는 존재하지 않고;
여기서, 1 또는 2개의 Cys 잔기가 PEG 분자에 공유 결합되거나, 1 내지 3개의 Lys 잔기가 PEG 분자에 공유 결합되거나, 또는 카르복시-말단 아미노산이 PEG 분자에 공유 결합되어 있으며;
단, 분자 내에 0 내지 2개의 Cys가 존재한다.
본 발명의 다른 실시양태는 식 II (서열 4)의 아미노산 서열을 포함하는 PEG화된 GLP-1 화합물이다:
<식 II>
Figure 112005052020435-pct00004
식 중에서,
Xaa7은 L-히스티딘, D-히스티딘, 데스아미노-히스티딘, 2-아미노-히스티딘, β-히드록시-히스티딘, 호모히스티딘, α-플루오로메틸-히스티딘 또는 α-메틸-히스티딘이고;
Xaa8은 Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Ser 또는 Thr이고;
Xaa11은 Thr 또는 Cys이고;
Xaa12는 Phe 또는 Cys이고;
Xaa16은 Val, Phe, Tyr, Trp 또는 Cys이고;
Xaa18은 Ser, Tyr, Trp, Phe, Lys, Ile, Leu 또는 Val이고;
Xaa19는 Tyr 또는 Phe이고;
Xaa22는 Gly, Glu, Asp, Lys 또는 Cys이고;
Xaa23은 Gln 또는 Cys이고;
Xaa24는 Ala 또는 Cys이고;
Xaa25는 Ala, Val, Ile, Leu 또는 Cys이고;
Xaa26은 Lys 또는 Cys이고;
Xaa27은 Glu 또는 Cys이고;
Xaa30은 Ala 또는 Cys이고;
Xaa33은 Val 또는 Ile이고;
Xaa34는 Lys 또는 Cys이고;
Xaa35는 Gly 또는 Cys이고;
Xaa36은 Arg 또는 Cys이고;
Xaa37은 Gly, Cys 또는 NH2이거나, 또는 존재하지 않고;
여기서, 1 또는 2개의 Cys 잔기가 PEG 분자에 공유 결합되거나, 1 내지 3개의 Lys 잔기가 PEG 분자에 공유 결합되거나, 또는 카르복시-말단 아미노산이 PEG 분자에 공유 결합되어 있으며;
단, 분자 내에 0 내지 2개의 Cys가 존재한다.
본 발명의 다른 실시양태는 식 III (서열 5)의 아미노산 서열을 포함하는 PEG화된 GLP-1 화합물이다.
<식 III>
Figure 112005052020435-pct00005
상기 식에서,
Xaa7은 L-히스티딘, D-히스티딘, 데스아미노-히스티딘, 2-아미노-히스티딘, β-히드록시-히스티딘, 호모히스티딘, α-플루오로메틸-히스티딘 또는 α-메틸-히스티딘이고;
Xaa8은 Ala, Gly, Val, Leu, Ile, Ser 또는 Thr이고;
Xaa11은 Thr 또는 Cys이고;
Xaa12는 Phe, Trp, Tyr 또는 Cys이고;
Xaa16은 Val, Trp, Ile, Leu, Phe, Tyr 또는 Cys이고;
Xaa18은 Ser, Trp, Tyr, Phe, Lys, Ile, Leu 또는 Val이고;
Xaa19는 Tyr, Trp 또는 Phe이고;
Xaa20은 Leu, Phe, Tyr 또는 Trp;
Xaa22는 Gly, Glu, Asp, Lys 또는 Cys이고;
Xaa23은 Gln 또는 Cys이고;
Xaa24는 Ala 또는 Cys이고;
Xaa25는 Ala, Val, Ile, Leu 또는 Cys이고;
Xaa26은 Lys 또는 Cys이고;
Xaa27은 Glu, Ile, Ala 또는 Cys이고;
Xaa30은 Ala, Glu 또는 Cys이고;
Xaa33은 Val 또는 Ile이고;
Xaa34는 Lys, Asp, Arg, Glu 또는 Cys이고;
Xaa35는 Gly 또는 Cys이고;
Xaa36은 Gly, Pro, Arg 또는 Cys이고;
Xaa37은 Gly, Pro, Ser 또는 Cys이고;
Xaa38은 Ser, Pro, His 또는 Cys이고;
Xaa39는 Ser, Arg, Thr, Trp, Lys 또는 Cys이고;
Xaa40은 Ser, Gly 또는 Cys이고;
Xaa41은 Ala, Asp, Arg, Glu, Lys, Gly 또는 Cys이고;
Xaa42는 Pro, Ala, Cys 또는 NH2이거나, 또는 존재하지 않고;
Xaa43은 Pro, Ala, Cys 또는 NH2이거나, 또는 존재하지 않고;
Xaa44는 Pro, Ala, Arg, Lys, His, Cys 또는 NH2이거나, 또는 존재하지 않고;
Xaa45는 Ser, His, Pro, Lys, Arg, Gly, Cys 또는 NH2이거나, 또는 존재하지 않고;
Xaa46은 His, Ser, Arg, Lys, Pro, Gly, Cys 또는 NH2이거나, 또는 존재하지 않고;
Xaa47은 His, Ser, Arg, Lys, Cys 또는 NH2이거나, 또는 존재하지 않고;
Xaa48은 Gly, His, Cys 또는 NH2이거나, 또는 존재하지 않고;
Xaa49는 Pro, His, Cys 또는 NH2이거나, 또는 존재하지 않고;
Xaa50은 Ser, His, Cys, Ser-NH2, His-NH2, Cys-NH2이거나, 또는 존재하지 않고;
여기서, 1 또는 2개의 Cys 잔기가 PEG 분자에 공유 결합되거나, 1 내지 3개의 Lys 잔기가 PEG 분자에 공유 결합되거나, 또는 카르복시-말단 아미노산이 PEG 분자에 공유 결합되어 있으며;
단, Xaa42, Xaa43, Xaa44, Xaa45, Xaa46, Xaa47, Xaa48 또는 Xaa49가 존재하지 않으면 각 아미노산의 하류도 존재하지 않고, 분자 내에 0 내지 2개의 Cys가 존재한다.
본 발명의 다른 실시양태는 식 IV (서열 6)의 아미노산 서열을 포함하는 PEG 화된 GLP-1 화합물이다.
<식 IV>
Figure 112005052020435-pct00006
상기 식에서,
Xaa7은 L-히스티딘, D-히스티딘, 데스아미노-히스티딘, 2-아미노-히스티딘, β-히드록시-히스티딘, 호모히스티딘, α-플루오로메틸-히스티딘 또는 α-메틸-히스티딘이고;
Xaa8은 Ala, Gly, Val, Leu, Ile, Ser 또는 Thr이고;
Xaa11은 Thr 또는 Cys이고;
Xaa12는 Phe, Trp, Tyr 또는 Cys이고;
Xaa16은 Val, Trp, Ile, Leu, Phe, Tyr 또는 Cys이고;
Xaa18은 Ser, Trp, Tyr, Phe, Lys, Ile, Leu 또는 Val이고;
Xaa19는 Tyr, Trp 또는 Phe이고;
Xaa20은 Leu, Phe, Tyr 또는 Trp이고;
Xaa22는 Gly, Glu, Asp, Lys 또는 Cys이고;
Xaa23은 Gln 또는 Cys이고;
Xaa24는 Ala 또는 Cys이고;
Xaa25는 Ala, Val, Ile, Leu 또는 Cys이고;
Xaa26은 Lys 또는 Cys이고;
Xaa27은 Glu, Ile, Ala 또는 Cys이고;
Xaa30은 Ala, Glu 또는 Cys이고;
Xaa33은 Val 또는 Ile이고;
Xaa34는 Lys, Asp, Arg, Glu 또는 Cys이고;
Xaa35는 Gly 또는 Cys이고;
Xaa36은 Gly, Pro, Arg 또는 Cys이고;
Xaa37은 Gly, Pro, Ser 또는 Cys이고;
Xaa38은 Ser, Pro, His 또는 Cys이고;
Xaa39는 Ser, Arg, Thr, Trp, Lys 또는 Cys이고;
Xaa40은 Ser, Gly 또는 Cys이고;
Xaa41은 Ala, Asp, Arg, Glu, Lys, Gly 또는 Cys이고;
Xaa42는 Pro, Ala, Cys 또는 NH2이거나, 또는 존재하지 않고;
Xaa43은 Pro, Ala, Cys 또는 NH2이거나, 또는 존재하지 않고;
Xaa44는 Pro, Ala, Arg, Lys, His, Cys 또는 NH2이거나, 또는 존재하지 않고;
Xaa45는 Ser, His, Pro, Lys, Arg, Cys 또는 NH2이거나, 또는 존재하지 않고;
Xaa46은 His, Ser, Arg, Lys, Cys 또는 NH2이거나, 또는 존재하지 않고;
Xaa47은 His, Ser, Arg, Lys, Cys 또는 NH2이거나, 또는 존재하지 않고;
여기서, 1 또는 2개의 Cys 잔기가 PEG 분자에 공유 결합되거나, 1 내지 3개의 Lys 잔기가 PEG 분자에 공유 결합되거나, 또는 카르복시-말단 아미노산이 PEG 분자에 공유 결합되어 있으며;
단, Xaa42, Xaa43, Xaa44, Xaa45 또는 Xaa46이 존재하지 않으면 각 아미노산의 하류도 존재하지 않고, 분자 내에 0 내지 2개의 Cys가 존재한다.
본 발명의 다른 실시양태는 식 V (서열 7)의 아미노산 서열을 포함하는 PEG화된 GLP-1 화합물이다.
<식 V>
Figure 112005052020435-pct00007
상기 식에서,
Xaa7은 L-히스티딘, D-히스티딘, 데스아미노-히스티딘, 2-아미노-히스티딘, β-히드록시-히스티딘, 호모히스티딘, α-플루오로메틸-히스티딘 또는 α-메틸-히스티딘이고;
Xaa8은 Gly, Val, Leu, Ile, Ser 또는 Thr이고;
Xaa11은 Thr 또는 Cys이고;
Xaa12는 Phe 또는 Cys이고;
Xaa16은 Val, Trp, Ile, Leu, Phe, Tyr 또는 Cys이고;
Xaa22는 Gly, Glu, Asp, Lys 또는 Cys이고;
Xaa23은 Gln 또는 Cys이고;
Xaa24는 Ala 또는 Cys이고;
Xaa25는 Ala, Val, Ile, Leu 또는 Cys이고;
Xaa26은 Lys 또는 Cys이고;
Xaa27은 Glu 또는 Cys이고;
Xaa30은 Ala 또는 Cys이고;
Xaa33은 Val 또는 Ile이고;
Xaa34는 Lys, Asp, Arg, Glu 또는 Cys이고;
Xaa35는 Gly 또는 Cys이고;
Xaa36은 Gly, Pro, Arg 또는 Cys이고;
Xaa37은 Gly, Pro, Ser 또는 Cys이고;
Xaa38은 Ser, Pro, His 또는 Cys이고;
Xaa39는 Ser, Arg, Thr, Trp, Lys 또는 Cys이고;
Xaa40은 Ser, Gly 또는 Cys이고;
Xaa41은 Ala, Asp, Arg, Glu, Lys, Gly 또는 Cys이고;
Xaa42는 Pro, Ala 또는 Cys이고;
Xaa43은 Pro, Ala 또는 Cys이고;
Xaa44는 Pro, Ala, Arg, Lys, His, Cys 또는 NH2이거나, 또는 존재하지 않고;
Xaa45는 Ser, His, Pro, Lys, Arg, Cys 또는 NH2이거나, 또는 존재하지 않고;
Xaa46은 His, Ser, Arg, Lys, Cys 또는 NH2이거나, 또는 존재하지 않고;
Xaa47은 His, Ser, Arg, Lys, Cys 또는 NH2이거나, 또는 존재하지 않고;
여기서, 1 또는 2개의 Cys 잔기가 PEG 분자에 공유 결합되거나, 1 내지 3개의 Lys 잔기가 PEG 분자에 공유 결합되거나, 또는 카르복시-말단 아미노산이 PEG 분자에 공유 결합되어 있으며;
단, Xaa44, Xaa45, Xaa46 또는 Xaa47이 존재하지 않으면 각 아미노산의 하류도 존재하지 않고, 분자 내에 0 내지 2개의 Cys가 존재한다.
본 발명의 다른 실시양태는 식 VI (서열 8)의 아미노산 서열을 포함하는 PEG화된 GLP-1 화합물이다.
<식 VI>
Figure 112005052020435-pct00008
상기 식에서,
Xaa7은 L-히스티딘, D-히스티딘, 데스아미노-히스티딘, 2-아미노-히스티딘, β-히드록시-히스티딘, 호모히스티딘, α-플루오로메틸-히스티딘 또는 α-메틸-히스티딘이고;
Xaa8은 Gly, Val, Leu, Ile, Ser 또는 Thr이고;
Xaa11은 Thr 또는 Cys이고;
Xaa12는 Phe 또는 Cys이고;
Xaa16은 Val 또는 Cys이고;
Xaa22는 Gly, Glu, Asp, Lys 또는 Cys이고;
Xaa23은 Gln 또는 Cys이고;
Xaa24는 Ala 또는 Cys이고;
Xaa25는 Ala, Val, Ile, Leu 또는 Cys이고;
Xaa26은 Lys 또는 Cys이고;
Xaa27은 Glu 또는 Cys이고;
Xaa30은 Ala 또는 Cys이고;
Xaa33은 Val 또는 Ile이고;
Xaa34는 Lys 또는 Cys이고;
Xaa35는 Gly 또는 Cys이고;
Xaa36은 Gly 또는 Cys이고;
Xaa37은 Pro 또는 Cys이고;
Xaa38은 Ser, Pro, His 또는 Cys이고;
Xaa39는 Ser, Arg, Thr, Trp, Lys 또는 Cys이고;
Xaa40은 Ser, Gly 또는 Cys이고;
Xaa41은 Ala, Asp, Arg, Glu, Lys, Gly 또는 Cys이고;
Xaa42는 Pro, Ala 또는 Cys이고;
Xaa43은 Pro, Ala 또는 Cys이고;
Xaa44는 Pro, Ala, Arg, Lys, His, Cys 또는 NH2이거나, 또는 존재하지 않고;
Xaa45는 Ser, His, Pro, Lys, Arg, Cys 또는 NH2이거나, 또는 존재하지 않고;
Xaa46은 His, Ser, Arg, Lys, Cys 또는 NH2이거나, 또는 존재하지 않고;
Xaa47은 His, Ser, Arg, Lys, Cys 또는 NH2이거나, 또는 존재하지 않고;
여기서, 1 또는 2개의 Cys 잔기가 PEG 분자에 공유 결합되거나, 1 내지 3개의 Lys 잔기가 PEG 분자에 공유 결합되거나, 또는 카르복시-말단 아미노산이 PEG 분자에 공유 결합되어 있으며;
단, Xaa44, Xaa45, Xaa46 또는 Xaa47이 존재하지 않으면 각 아미노산의 하류도 존재하지 않고, 분자 내에 0 내지 2개의 Cys가 존재한다.
본 발명의 다른 실시양태는 식 VII (서열 9)의 아미노산 서열을 포함하는 PEG화된 GLP-1 화합물이다.
<식 VII>
Figure 112005052020435-pct00009
상기 식에서,
Xaa11은 Thr 또는 Cys이고;
Xaa12는 Phe 또는 Cys이고;
Xaa16은 Val 또는 Cys이고;
Xaa22는 Gly 또는 Cys이고;
Xaa23은 Gln 또는 Cys이고;
Xaa24는 Ala 또는 Cys이고;
Xaa25는 Ala 또는 Cys이고;
Xaa26은 Lys 또는 Cys이고;
Xaa27은 Glu 또는 Cys이고;
Xaa30은 Ala 또는 Cys이고;
Xaa34는 Lys 또는 Cys이고;
Xaa35는 Gly 또는 Cys이고;
Xaa36은 Gly 또는 Cys이고;
Xaa37은 Pro 또는 Cys이고;
Xaa38은 Ser, Pro, His 또는 Cys이고;
Xaa39는 Ser, Arg, Thr, Trp, Lys 또는 Cys이고;
Xaa40은 Ser, Gly 또는 Cys이고;
Xaa41은 Ala, Asp, Arg, Glu, Lys, Gly 또는 Cys이고;
Xaa42는 Pro, Ala, Cys 또는 NH2이거나, 또는 존재하지 않고;
Xaa43은 Pro, Ala, Cys 또는 NH2이거나, 또는 존재하지 않고;
Xaa44는 Pro, Ala, Arg, Lys, His, Cys 또는 NH2이거나, 또는 존재하지 않고;
Xaa45는 Ser, His, Pro, Lys, Arg, Gly, Cys 또는 NH2이거나, 또는 존재하지 않고;
Xaa46은 His, Ser, Arg, Lys, Pro, Gly, Cys 또는 NH2이거나, 또는 존재하지 않고;
Xaa47은 His, Ser, Arg, Lys, Cys 또는 NH2이거나, 또는 존재하지 않고;
Xaa48은 Gly, His, Cys 또는 NH2이거나, 또는 존재하지 않고;
Xaa49는 Pro, His, Cys 또는 NH2이거나, 또는 존재하지 않고;
Xaa50은 Ser, His, Cys, Ser-NH2, His-NH2 , Cys-NH2이거나, 또는 존재하지 않고;
여기서,
상기 GLP-1 화합물은 1 내지 7개의 추가 치환을 포함하고;
1 또는 2개의 Cys 잔기가 PEG 분자에 공유 결합되거나, 1 내지 3개의 Lys 잔기가 PEG 분자에 공유 결합되거나, 또는 카르복시-말단 아미노산이 PEG 분자에 공유 결합되어 있고;
단, Xaa44, Xaa45, Xaa46 또는 Xaa47이 존재하지 않으면 각 아미노산의 하류도 존재하지 않고, 분자 내에 0 내지 2개의 Cys가 존재하며,
Xaa42, Xaa43, Xaa44, Xaa45, Xaa46, Xaa47, Xaa48 또는 Xaa49가 존재하지 않으면 각 아미노산의 하류도 존재하지 않는다.
식 I 내지 VII의 바람직한 실시양태는 7개 이하의 아미노산, 6개 이하의 아미노산, 5개 이하의 아미노산, 4개 이하의 아미노산 또는 3개 이하의 아미노산이 GLP-1(7-37)OH 또는 GLP-1(7-36)NH2와 상이한 GLP-1 화합물을 포함한다. 또한, 식 I 내지 VII의 GLP-1 화합물은 8번 위치에 발린 또는 글리신이 존재하고 22번 위치에 글루탐산이 존재하는 것이 바람직하다. 또한, 식 I 내지 VII의 GLP-1 화합물은 8번 위치에 발린 또는 글리신이 존재하고 30번 위치에 글루탐산이 존재하는 것이 바람직하다. 또한, 식 I 내지 VII의 GLP-1 화합물은 8번 위치에 발린 또는 글리신이 존재하고 37번 위치에 히스티딘 또는 시스테인이 존재하는 것이 바람직하다. 또한, 식 I 내지 VII의 GLP-1 화합물은 0 내지 2개의 시스테인 잔기를 갖는 것이 바람직하다. 또한, 하나의 GLP-1 화합물에 하나의 PEG 분자가 존재하는 것이 바람직하다.
본 발명의 다른 실시양태는 식 VIII (서열 10)의 아미노산 서열을 포함하는 PEG화된 GLP-1 화합물이다.
<식 VIII>
Figure 112005052020435-pct00010
상기 식에서,
Xaa7은 L-히스티딘, D-히스티딘, 데스아미노-히스티딘, 2-아미노-히스티딘, β-히드록시-히스티딘, 호모히스티딘, α-플루오로메틸-히스티딘, α-메틸-히스티딘, Arg, Tyr, Ala 또는 Val이고;
Xaa8은 Gly, Ser, Ala 또는 Thr이고;
Xaa9는 Glu, Ala 또는 Asp이고;
Xaa10은 Gly, Ala 또는 Val이고;
Xaa11은 Thr, Cys 또는 Ala이고;
Xaa12는 Phe, Cys, Ala 또는 Tyr이고;
Xaa13은 Thr 또는 Ser이고;
Xaa14는 Ser, Ala 또는 Thr이고;
Xaa15는 Asp 또는 Glu이고;
Xaa16은 Leu, Cys, Ala, Ile, Val 또는 Met이고;
Xaa17은 Ser 또는 Ala이고;
Xaa18은 Lys 또는 Ala이고;
Xaa19는 Gln 또는 Ala이고;
Xaa20은 Met, Ala, Leu, Ile 또는 Val이고;
Xaa21은 Glu 또는 Ala이고;
Xaa22는 Glu, Cys 또는 Ala이고;
Xaa23은 Glu, Cys 또는 Ala이고;
Xaa24는 Ala 또는 Cys이고;
Xaa25는 Val, Cys 또는 Ala이고;
Xaa26은 Arg, Cys 또는 Ala이고;
Xaa27은 Leu, Cys 또는 Ala이고;
Xaa28은 Phe, Ala 또는 Tyr이고;
Xaa29는 Ile, Val, Leu, Gly 또는 Met이고;
Xaa30은 Glu, Cys, Ala 또는 Asp이고;
Xaa31은 Trp, Ala, Phe 또는 Tyr이고;
Xaa32는 Leu 또는 Ala이고;
Xaa33은 Lys 또는 Ala이고;
Xaa34는 Asn, Cys 또는 Ala이고;
Xaa35는 Gly 또는 Cys이고;
Xaa36은 Gly 또는 Cys이고;
Xaa37은 Pro 또는 Cys이고;
Xaa38은 Ser, Cys 또는 NH2이거나, 또는 존재하지 않고;
Xaa39는 Ser, Cys 또는 NH2이거나, 또는 존재하지 않고;
Xaa40은 Gly, Cys 또는 NH2이거나, 또는 존재하지 않고;
Xaa41은 Ala, Cys 또는 NH2이거나, 또는 존재하지 않고;
Xaa42는 Pro, Cys 또는 NH2이거나, 또는 존재하지 않고;
Xaa43은 Pro, Cys 또는 NH2이거나, 또는 존재하지 않고;
Xaa44는 Pro, Cys 또는 NH2이거나, 또는 존재하지 않고;
Xaa45는 Ser, Cys 또는 NH2이거나, 또는 존재하지 않고;
여기서, 1 또는 2개의 Cys 잔기가 PEG 분자에 공유 결합되어 있고;
단, 분자 내에 1 또는 2개의 Cys가 존재하고,
Xaa9, Xaa10, Xaa11, Xaa12, Xaa14, Xaa15, Xaa16, Xaa17, Xaa18, Xaa19, Xaa20, Xaa21, Xaa22, Xaa23, Xaa24, Xaa26, Xaa27, Xaa30, Xaa31, Xaa32 중 3개 이하가 Ala이고,
Xaa1이 His, Arg 또는 Tyr이면 Xaa9, Xaa10 및 Xaa16 중 하나 이상이 Ala이며,
Xaa38, Xaa39, Xaa40, Xaa41, Xaa42, Xaa43 또는 Xaa44가 존재하지 않으면 각 아미노산의 하류도 존재하지 않는다. 식 VIII의 7, 28, 29, 31 및 32번 위치는 허용되지 않는 활성 손실을 수반하지 않고 시스테인 아미노산을 수용할 수 없다.
본 발명에 사용되는 폴리에틸렌 글리콜 중합체 ("PEG")의 분자량은, 바람직하게는 500 내지 100,000 달톤, 보다 바람직하게는 20,000 내지 60,000 달톤, 가장 바람직하게는 20,000 내지 40,000 달톤이며, 상기 PEG는 직쇄 또는 분지쇄형 분자일 수 있고, 당업계에 기재된 폴리에틸렌 글리콜 유도체일 수도 있다.
본 발명은 GLP-1 수용체 자극이 필요한 대상체에게 본원에 기재된 유효량의 PEG화된 GLP-1 화합물을 투여하는 단계를 포함하는, 상기 대상체에서 GLP-1 수용체를 자극시키는 방법을 포함한다. 또한, 본 발명은 GLP-1 수용체 자극이 필요한 대상체에게 서열 3 내지 10에 나타낸 서열을 가지며, 단 분자 내에 1 또는 2개의 Cys가 존재하는 PEG화되지 않은 GLP-1 화합물을 유효량으로 투여하는 단계를 포함하 는, 상기 대상체에서 GLP-1 수용체를 자극시키는 방법을 포함한다. GLP-1 수용체 자극이 필요한 대상체로는 인슐린 비-의존성 당뇨병, 스트레스-유도된 저혈당증, 비만, 예를 들어 과민성 장 증후군 및 기능성 소화불량을 비롯한 위 및(또는) 장 운동 또는 공복 질병을 앓고 있는 대상체가 있다.
글루카곤-유사 펩티드 1 (GLP-1)은 음식 섭취에 대한 반응에서 장의 L-세포에 의해 분비되는 37개의 아미노산으로 이루어진 펩티드이다. 다수의 GLP-1 유사체 및 유도체가 당업계에 기재되어 있다. 본 발명은 소실 반감기를 연장시키고(시키거나) 제거율을 감소시키는 GLP-1 화합물의 변형을 기재하고 있다. 펩티드의 특정 아미노산 부위에 1 또는 2개의 Cys 잔기를 혼입시키면 티올기가 제공되고, 이 티올기에 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 또는 PEG 유도체가 공유 결합되어 PEG화된 GLP-1 화합물을 생성할 수 있다. 또한, 본 발명의 GLP-1 펩티드, 그의 유사체 또는 단편의 리신 잔기 또는 카르복시-말단이 하나 이상의 PEG 분자 또는 PEG 유도체에 공유 결합되어 소실 반감기가 연장되고(되거나) 제거율이 감소된 분자를 생성할 수 있다.
GLP-1(7-37)OH는 서열 1의 아미노산 서열을 갖는다:
Figure 112005052020435-pct00011
본원에 사용된 용어 "폴리펩티드" 또는 "펩티드"는 추가로 변형 (예를 들어, 아세틸화, 카르복실화, 인산화, 지질화 또는 아실화)되거나 변형되지 않을 수 있는, 5개 초과의 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 서열의 임의의 구조 형태 (예를 들어, 1차, 2차 또는 3차 형태)를 지칭하는 것으로 간주한다. 용어 "천연"은 자연에서 발견되는 폴리펩티드와 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 나타낸다. 용어 "천연"은 해당 폴리펩티드의 대립유전자 변이체를 포함하는 것으로 간주한다.
용어 "아미노산"은 본원에서 가장 넓은 의미로 사용되며, 아미노산 변이체 및 유도체를 비롯하여 자연 발생 아미노산 뿐만 아니라 자연 발생이 아닌 아미노산을 포함한다. 이러한 넓은 정의의 관점에서, 당업자는 본원에서 아미노산으로 언급된 용어가 예를 들어, 자연 발생 단백질생성 L-아미노산; D-아미노산; 화학적으로 변형된 아미노산, 예컨대 아미노산 변이체 및 유도체; 자연 발생 비-단백질생성 아미노산, 예컨대 노르류신, β-알라닌, 오르니틴 등; 및 당업계에서 아미노산의 특성인 것으로 공지된 특성을 갖는 화학적으로 합성된 화합물을 포함한다는 것을 인정할 것이다. 자연 발생이 아닌 아미노산의 예로는 α-메틸 아미노산 (예를 들어, α-메틸 알라닌), D-아미노산, 히스티딘-유사 아미노산 (예를 들어, 2-아미노-히스티딘, β-히드록시-히스티딘, 호모히스티딘, α-플루오로메틸-히스티딘 및 α-메틸-히스티딘), 측쇄에 별도의 메틸렌을 갖는 아미노산 ("호모" 아미노산) 및 측쇄에서 카르복실산 관능기가 술폰산기로 대체된 아미노산 (예를 들어, 시스테인산)이 있다. 그러나, 바람직하게는, 본 발명의 GLP-1 화합물은 본원에서 달리 구체적으로 제공되지 않는 한 자연 발생 아미노산만을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "GLP-1 화합물"은 천연 GLP-1, [GLP-1(7-37)OH 또는 GLP-1(7-36)NH2], GLP-1 유사체, GLP-1 유도체, GLP-1의 생물학적으로 활성인 단편, 연장된 GLP-1, 또는 연장된 GLP-1 펩티드의 유사체 또는 단편 (예를 들어, 미국 특허출원 제60/346,474호 및 제60/405,097호 참조), 본원에 기재된 펩티드의 특정 위치에 1 또는 2개의 Cys 잔기를 포함하는 엑센딘-4 유사체 및 엑센딘-4 유도체를 포함한다.
당업계의 관습에 의해, 천연 GLP-1(7-37)OH의 아미노 말단은 7번 잔기로, 카르복시-말단은 37번 잔기로 지정된다. 폴리펩티드 내의 다른 아미노산은 서열 1에 나타낸 바와 같이 연속적으로 번호를 매긴다. 예를 들어, 천연 분자 내에서 12번 위치는 페닐알라닌이고, 22번 위치는 글리신이다.
본원에 사용된 "GLP-1 단편" 또는 "GLP-1 화합물의 단편"은 GLP-1 화합물의 N-말단 및(또는) C-말단으로부터 하나 이상의 아미노산이 절단된 후에 얻어지는 생물학적으로 활성인 폴리펩티드이다. GLP-1(7-37)OH를 기재하는 데 사용된 명명법이 GLP-1 단편에도 적용된다. 예를 들어, GLP-1(9-36)OH는 N-말단으로부터 2개의 아미노산을 절단하고 C-말단으로부터 1개의 아미노산을 절단함으로써 얻어지는 GLP-1 단편을 나타낸다. 단편 내의 아미노산은 GLP-1(7-37)OH 내의 상응하는 아미노산과 동일한 번호로 나타낸다. 예를 들어, GLP-1(7-37)OH에서와 같이, GLP-1(9-36)OH 내의 N-말단 글루탐산은 9번 위치에 존재하고, 12번 위치에는 페닐알라닌이 존재하고, 22번 위치에는 글리신이 존재한다.
GLP-1 화합물은 GLP-1 유사체 및 엑센딘-4 유사체를 포함한다. 명확하게 하기 위해, "GLP-1 화합물"에 포함되는 "엑센딘-4 유사체"는 항상 1 또는 2개의 Cys 잔기를 갖는다. 바람직하게는, GLP-1 유사체는 GLP-1(7-37)OH의 아미노산 서열, 미국 특허출원 제60/346,474호 (2002년 8월 1일 출원) 또는 제60/405,097호 (2002년 8월 21일 출원) (둘 모두 "연장된 글루카곤-유사 펩티드-1 유사체"란 제목으로 출원됨)에 기재된 연장된 GLP-1 펩티드 또는 그의 단편의 아미노산 서열, 또는 1 내지 6개의 아미노산이 GLP-1(7-37)OH 또는 그의 단편의 상응하는 위치의 아미노산과 상이하도록 변형되거나, 또는 0 내지 6개의 아미노산이 연장된 GLP-1 펩티드의 상응하는 위치의 아미노산과 상이하도록 변형된 아미노산 서열을 갖는다. 가장 바람직한 GLP-1 유사체는 식 I 내지 VII에 기재되어 있다. 가장 바람직한 엑센딘-4 유사체는 식 VIII에 기재되어 있다.
본 발명의 GLP-1 화합물을 언급하는 경우, 용어 "PEG화"는 하나 이상의 폴리에틸렌 글리콜 분자 또는 그의 유도체의 공유 결합에 의해 화학적으로 변형된 GLP-1 화합물이다. 또한, 용어 "PEG"는 당업계에 공지된 폴리에틸렌 글리콜 또는 그의 유도체를 나타낸다 (예를 들어, 미국 특허 제5,445,090호, 제5,900,461호, 제5,932,462호, 제6,436,386호, 제6,448,369호, 제6,437,025호, 제6,448,369호, 제6,495,659호, 제6,515,100호 및 제6,514,491호 참조). 바람직하게는, 본 발명의 PEG화된 GLP-1 화합물에서, PEG (또는 그의 유도체)는 GLP-1 화합물의 하나 이상의 리신 또는 시스테인 잔기에 공유 결합된다. 가장 바람직하게는, PEG는 GLP-1 화합물의 하나 이상의 시스테인 잔기에 공유 결합된다. 본 발명의 PEG화된 엑센딘-4 유사체의 경우, PEG는 식 VIII의 지정된 위치에서 엑센딘-4 또는 엑센딘-4 유사체에 도입된 1 또는 2개의 시스테인 잔기에 부착된다. 임의로는, PEG 분자는 링커 또는 스페이서 분자를 통해 GLP-1 화합물에 부착될 수 있다 (미국 특허 제268,343호에 기재된 스페이서 분자의 예 참조).
본원에서 GLP-1 화합물을 지칭하는데 사용된 명명법에서, 아미노산 치환 및 그의 위치는 모 펩티드의 명칭 뒤에 나타낸다. 예를 들어, Glu22-GLP-1(7-37)OH는 통상적으로 GLP-1(7-37)OH의 22번 위치에서 발견되는 글리신이 글루탐산으로 대체된 GLP-1 화합물을 지칭하고, Val8Glu22-GLP-1(7-37)OH (또는, V8E22-GLP-1(7-37)OH)는 통상적으로 GLP-1(7-37)OH의 8번 위치에서 발견되는 알라닌과 22번 위치에서 발견되는 글리신이 각각 발린과 글루탐산으로 대체된 GLP-1 화합물을 지칭한다. Val8-엑센딘-4는 통상적으로 엑센딘-4의 8번 위치에서 발견되는 세린이 발린으로 대체된 GLP-1 화합물을 지칭한다. 바람직하게는, 본 발명의 GLP-1 화합물은 인슐린 분비 활성을 갖는다.
"인슐린 분비 활성"은 글루코스 수준 상승에 대한 반응으로 인슐린 분비를 자극하여 세포에 의해 글루코스를 흡수시키고 혈장 글루코스 수준을 감소시키는 능력을 나타낸다. 인슐린 분비 활성은 GLP-1 수용체 결합 활성 또는 수용체 활성화를 측정하는 생체내 실험 및 시험관내 분석을 이용하는 방법을 비롯하여 당업계에 공지된 방법, 예를 들어 각각 겔판드 (Gelfand) 등의 EP 619,322 및 미국 특허 제5,120,712호에 기재된 췌장도 세포 또는 인슐린종 세포를 사용하는 분석법에 의해 평가될 수 있다. 인슐린 분비 활성은 통상적으로 인슐린 수준 또는 C-펩티드 수준을 측정함으로써 인간에서 측정된다.
본 발명의 목적을 위해, 시험관내 GLP-1 수용체 신호전달 분석법을 이용하여 본 발명의 PEG화된 GLP-1 화합물이 생체내에서 인슐린 분비 활성을 나타낼지 여부를 결정한다. 인슐린 분비 활성은 PEG화된 GLP-1 화합물이 생물학적으로 활성이 있음을 입증하는 데 사용될 수 있는 활성이다.
본원에 사용된 "시험관내 효능"은 세포-기재 분석법에서 GLP-1 수용체를 활성화시키는 펩티드의 능력을 측정한 값이다. 시험관내 효능을 "EC50"으로 나타내며, 이는 단일 투여량-반응 실험에서 50％ 활성을 나타내는 화합물의 유효 농도이다. 본 발명의 목적에 있어서, 시험관내 효능은 인간 GLP-1 수용체를 안정하게 발현시키는 HEK-293 세포를 사용하는 형광 분석법을 이용하여 결정한다. 이러한 HEK-293 세포는 β-락타마제 (BLAM) 유전자의 발현을 유도하는 cAMP 반응 요소 (CRE)를 갖는 DNA 벡터를 안정하게 통합시킨다. GLP-1 화합물 (또는 효능제)이 수용체와 상호작용하면 신호가 개시되어 cAMP 반응 요소를 활성화시킨 후에 β-락타마제를 발현시킨다. 이어서, β-락타마제 (판베라 LLC; PanVera LLC)에 의해 절단되는 경우에 형광을 방사하는 β-락타마제 CCF2/AM 기질을 특정량의 GLP-1 효능제에 노출시킨 세포에 첨가하여 GLP-1 효능제 효능의 측정값을 제공할 수 있다. 분석법은 또한 문헌 [Zlokarnik et al. (1998) Science 279:84-88]에 기재되어 있다. 실시예 4에 나열된 화합물에 대한 EC50값은 상기 기재된 BLAM 분석법을 이용하여 결정된다. 상대적인 시험관내 효능 값은 Val8-GLP-1(7-37)OH 또는 천연 GLP-1을 대조군으로 사용하고, 대조군을 100％ 기준값으로 지정하여 확립될 수 있다.
용어 "혈장 반감기"는 해당 분자의 절반이 제거되기 전 혈장을 순환하는 데 소요되는 시간을 나타낸다. 별법으로, "소실 반감기"라는 용어가 사용된다. 혈장 반감기 또는 소실 반감기의 문맥에 사용된 용어 "연장된" 또는 "연장"은 비교가능한 조건 하에 결정시 기준 분자 (예를 들어, 펩티드의 PEG화되지 않은 형태 또는 천연 펩티드)에 비해 PEG화된 GLP-1 화합물의 반감기가 통계학적으로 유의하게 증가된 것을 나타낸다. 바람직하게는, 본 발명 PEG화된 GLP-1 화합물의 소실 반감기는 바람직하게는 1시간 이상, 보다 바람직하게는 3, 5, 7, 10, 15, 20시간 이상, 가장 바람직하게는 24시간 이상이다. 본원의 실시예 5에 기록된 반감기는 소실 반감기로서, 일정 기간의 log-선형 소실율에 상응한다. 당업자는 반감기가 제거율 및 분포 부피 둘 모두에 대한 함수로서 변하는 유도 파라미터임을 이해할 것이다.
제거율은 약물을 제거하는 신체 능력을 측정한 값이다. 예를 들어, 약물에 대한 변형에 의해 제거율이 감소하면, 반감기는 증가할 것으로 예상된다. 그러나, 이러한 상반적인 관계는 분포 부피에 변화가 없는 경우에만 정확하다. 일정 기간의 log-선형 반감기 (t ), 제거율 (C) 및 분포 부피 (V)사이의 유용한 근사식이 식 t1/2
Figure 112005052020435-pct00012
0.693 (V/C)로 주어져 있다. 제거율은 제거된 약물의 양을 나타내기 보다는 약물이 완전하게 제거되어 소실되어야 할 생물학적 유체, 예컨대 혈액 또는 혈장의 부피를 나타낸다. 제거율은 시간 단위 당 부피로 표현한다. 본 발명의 PEG화된 GLP-1 화합물의 제거율 값은 바람직하게는 200 ml/h/kg 이하, 보다 바람직하게는 180, 150, 120, 100, 80, 60 ml/h/kg 이하, 가장 바람직하게는 50, 40 또는 20 ml/h/kg 이하이다 (실시예 5 참조).
본 발명에서, Cys 아미노산은 생성된 펩티드의 활성이 손실되기 때문에 GLP-1 또는 GLP-1 유사체 펩티드의 7, 28, 29, 31 또는 32번 위치에 혼입될 수 없다. 다른 모든 잔기는 시스테인으로 대체될 수 있지만, 상기 시스테인은 바람직하게는 분자 내에 1 또는 2개 이하의 Cys 아미노산 분자가 존재하는 GLP-1 또는 GLP-1 유사체 펩티드의 11, 12, 16, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 30, 34, 35, 36 및 37번으로 이루어진 군으로부터 선택되는 위치(들)에 혼입되는 것이 바람직한 것으로 생각된다. Cys 아미노산이 GLP-1 분자 내에 존재하는 경우, 이들은 바람직하게는 22, 26, 34, 35, 36 및 37번으로 이루어진 군으로부터 선택되는 위치, 보다 더 바람직하게는 26 및(또는) 34번 위치에 존재한다. 생성된 분자는 Cys 아미노산 위치에서 PEG화되어 변형되지 않은 분자 또는 천연 분자에 비해 반감기가 연장되면서 생물학적 활성을 전부 또는 일부 유지하고 있는 변형된 분자를 생성할 수 있다. 별법으로, 본 발명에서 GLP-1 또는 GLP-1 유사체 펩티드는 18, 22 및 26번 위치의 1 내지 3개의 리신 잔기, 또는 펩티드의 카르복시 말단 아미노산에서 PEG화될 수 있다.
본 발명의 다른 실시양태는 서열 3 내지 10에 나타낸 서열을 가지며, 단 분자 내에 1 또는 2개의 Cys가 존재하는 PEG화되지 않은 GLP-1 화합물이다. 본 발명자들은 GLP-1 화합물의 특정 위치에 존재하는 잔기가 Cys로 치환될 수 있으며, 여전히 생물학적 활성을 유지하고 있음을 발견하였다. 이러한 PEG화되지 않은 GLP-1 화합물은 본 발명의 PEG화된 GLP-1 화합물의 제조 방법에 사용되는 중간체일 수 있다. 이러한 화합물은 반감기 연장이 필요하지 않은 질병, 예를 들어 과민성 장 증후군에 대한 치료제로서 사용될 수도 있다.
본 발명에 사용하기 위한 펩티드가 제조되어 정제되면, 하나 이상의 PEG 분자를 Cys 또는 Lys 잔기, 또는 카르복시-말단 아미노산에 공유 결합에 의해 연결시킴으로써 변형시킨다. 이들의 관능성을 손실시키지 않으면서 중합체를 부착시킴으로써 새로운 적합한 특성을 갖는 정교한 펩티드 또는 단백질 분자를 제공하는 것은 어렵다. 공유 결합에 의해 PEG에 접합시키는 매우 다양한 방법이 당업계에 기재되어 있으며, 본 발명에 사용되는 특정 방법으로 한정되지는 않는다 (문헌 [Roberts, M. et al. Advanced Drug Delivery Reviews, 54:459-476, 2002] 참조). PEG가 카르복시-말단에 부착되는 것은 전구체로서 재조합 GLP-1 펩티드를 사용하는 효소에 의한 커플링 반응, 또는 당업계에 공지된 다른 방법, 예를 들어 미국 특허 제4,343,898호 또는 문헌 [International Journal of Peptide ＆ Protein Research. 43:127-38, 1994]에 기재된 방법을 통해 부착될 수 있다. 단백질의 PEG화는 치료제로서 펩티드 또는 단백질을 사용하는 것과 관련된 다수의 약리학적 및 독성학적/면역학적 문제를 극복할 수 있다. 그러나, 임의의 각 펩티드의 경우, 펩티드의 PEG화된 형태의 생물학적 활성이 펩티드의 PEG화되지 않은 형태에 비해 유의하게 손실될 것인지는 확실하지 않다.
PEG화된 단백질의 생물학적 활성은 i) PEG 분자의 크기, ii) 부착되는 특정 부위, iii) 변형 정도, iv) 불리한 커플링 조건, v) 부착 과정에 링커가 사용되었는지 또는 중합체가 직접 부착되었는지 여부, vi) 유해한 부산물 생성, vii) 활성화된 중합체에 의해 부과되는 손상, 또는 viii) 전하 보유량과 같은 인자들에 의해 영향을 받을 수 있다. 이용되는 커플링 반응에 따라, 사이토킨의 중합체 변형은 특히 생물학적 활성이 현저하게 감소시킨다 (문헌 [Francis, G.E., et al., (1998) PEGylation of cytokines and other therapeutic proteins and peptides: the importance of biological optimization of coupling techniques, Intl. J. Hem. 68:1-18] 참조).
본 발명의 PEG화된 GLP-1 화합물은 0.5％ 이상의 천연 GLP-1 또는 보다 바람직하게는 Val8-GLP-1(7-37)OH의 시험관내 생물학적 활성을 갖는다. 보다 바람직하게는, 본 발명의 PEG화된 GLP-1 화합물은 1％ 또는 3％ 이상의 천연 GLP-1 또는 보다 바람직하게는 Val8-GLP-1(7-37)OH의 시험관내 생물학적 활성을 갖는다. 상기 생물학적 활성은 본원 (실시예 4)에 기재된 시험관내 효능 분석 또는 당업계에 공지된 다른 GLP-1 분석에 의해 결정될 수 있다. 본 발명의 몇몇 PEG화된 GLP-1 화합물의 생물학적 활성은 특정 분석법에서 측정된 천연 GLP-1 또는 Val8-GLP-1(7-37)OH보다 낮을 수 있지만, 이러한 활성 감소는 화합물의 연장된 반감기 및(또는) 제거율 감소에 의해 보완되며, 소실 반감기가 연장된 GLP-1 화합물의 경우에는 유리한 특성이 될 수도 있다.
생물학적 활성을 소실하지 않고 시스테인 잔기를 수용하는 것으로 밝혀진 GLP-1 펩티드의 위치가 엑센딘-4의 유사한 위치에서 시스테인으로 치환될 수 있으며, 이에 따라 GLP-1 수용체와 결합할 수 있는 능력을 가진 엑센딘-4 유사체가 생성되는 것으로 생각되고 있다. 바람직하게는, 하나의 본 발명의 엑센딘-4 유사체에는 1 또는 2개 이하의 Cys 아미노산이 존재한다. 바람직하게는, 분자 내에 존재하는 Cys는 11, 12, 16, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 30, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43 및 44번으로 이루어진 군으로부터 선택되는 위치 (식 VIII 참조), 바람직하게는 22, 26, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43 및 44번으로 이루어진 군으로부터 선택되는 위치, 보다 더 바람직하게는 26 및(또는) 34번 위치에 존재한다. 상기 분자에 존재하는 Cys 아미노산은 PEG 분자에 공유 결합되어 천연 엑센딘-4보다 소실 반감기가 연장된 PEG화된 엑센딘-4 유사체를 생성한다. 바람직하게는, 본 발명의 PEG화된 엑센딘-4 유사체 펩티드 (식 VIII에 기재되어 있음)는 0.5％, 1.0％, 3％, 10％, 30％ 또는 50％ 이상의 PEG화되지 않은 엑센딘-4 유사체의 생물학적 활성을 갖는다. 야생형 엑센딘-4의 서열은 HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPS (서열　11)이다.
통상적인 형태에서, PEG는 말단 히드록실기를 갖는 직쇄형 중합체이며, 식 HO-CH2CH2-(CH2CH2O)n-CH2CH2-OH (식 중, n은 약 8 내지 약 4000임)를 갖는다. 말단 수소는 보호기, 예컨대 알킬기 또는 알칸올기로 치환될 수 있다. 바람직하게는 PEG는 1개 이상의 히드록시기를 갖고, 보다 바람직하게는 상기 히드록시기는 말단 히드록시기이다. 상기 히드록시기는 바람직하게는 활성화되어 펩티드와 반응한다. 본 발명에 유용한 다양한 형태의 PEG가 존재한다. PEG의 다양한 유도체가 당업계에 존재하며 본 발명에 사용하기 적합하다 (예를 들어, 미국 특허 제5,445,090호; 제5,900,461호; 제5,932,462호; 제6,436,386호; 제6,448,369호; 제6,437,025호; 제6,448,369호; 제6,495,659호; 제6,515,100호 및 제6,514,491호, 및 문헌 [Zalipsky, S. Bioconjugate Chem. 6:150-165, 1995] 참조). 본 발명에서 GLP-1 화합물에 공유 결합된 PEG 분자는 특정 유형으로 한정되지는 않는다. PEG의 분자량은, 바람직하게는 500 내지 100,000 달톤, 보다 바람직하게는 20,000 내지 60,000 달톤, 및 가장 바람직하게는 20,000 내지 40,000 달톤이다. PEG는 직쇄 또는 분지쇄형일 수 있으며, 본 발명의 PEG화된 GLP-1 화합물은 펩티드에 부착된 1 내지 6개의 PEG 분자를 가질 수 있다. 하나의 PEG화된 GLP-1 화합물 분자 내에 1개의 PEG 분자가 존재하는 것이 가장 바람직하지만, 하나의 펩티드 분자 내에 1개 초과의 PEG 분자가 존재하는 경우에는 6개 이하인 것이 바람직하다. 또한, PEG 분자의 양 말단 모두가 2종 이상의 GLP-1 화합물과 함께 가교연결되기 위해 호모- 또는 헤롤리(heroly)-관능화될 수 있는 것으로 생각되고 있다.
본 발명은 하나 이상의 PEG 분자가 공유 결합되어 있는 GLP-1 화합물을 제공한다. 본 발명의 PEG화된 GLP-1 화합물을 제조하는 한 가지 방법은 PEG-말레이미드를 사용하여 펩티드의 티올기에 PEG를 직접 부착시키는 것과 관련이 있다. 티올 관능기의 도입은 상기 기재된 위치에서 펩티드 상에 또는 펩티드 내에 Cys 잔기를 첨가하거나 삽입함으로써 달성될 수 있다. 또한, 티올 관능기는 펩티드의 측쇄 상에 도입될 수 있다 (예를 들어, 티올-함유 산의 리신 ε-아미노기를 아실화시킴). 본 발명의 PEG화 방법은 미첼 (Michael) 첨가 반응을 이용하여 안정한 티오에테르 링커를 형성한다. 이 반응은 매우 특이적이며, 다른 관능기의 존재 및 온화한 조건 하에서 수행된다. PEG 말레이미드는 잘 정의된 생물학적으로 활성인 PEG-단백질 접합체 제조시 반응 중합체로서 사용된다. 상기 절차는 PEG 말레이미드에 비해 1 몰 과량의 티올-함유 GLP-1 화합물을 사용하여 반응 완결을 유도하는 것이 바람직하다. 반응은 4.0 내지 9.0의 pH 및 실온에서 15 내지 40시간 동안 수행하는 것이 바람직하다. 잉여량의 PEG화되지 않은 티올-함유 펩티드는 통상적인 분리 방법에 의해 PEG화된 생성물로부터 용이하게 분리한다. GLP-1 화합물의 PEG화에 필요한 조건의 예는 실시예 1에 나열되어 있다. 시스테인 PEG화는 PEG 말레이미드 또는 이관능화된 PEG 말레이미드를 사용하여 수행할 수 있다.
GLP-1 화합물은 다양한 생물학적 활성을 갖는다. 예를 들어, GLP-1은 인슐린 방출을 자극함으로써 세포에 의해 글루코스를 흡수하고 혈청 글루코스 수준을 감소시키는 것으로 밝혀졌다 (예를 들어, 문헌 [Mojsov, S., (1992) Int. J. Peptide Protein Research, 40:333] 참조). 특히, NIDDM 치료시 저혈당증이 발병할 위험이 있기 때문에 GLP-1을 인슐린 비-의존성 진성 당뇨병 (NIDDM)에 대한 치료에 사용하는 방안이 제시되고 있다. 또한, GLP-1은 비만, 과민성 장 증후군 및 기능성 소화불량에 대한 치료제로 고려되고 있다.
본 발명의 PEG화된 GLP-1 화합물의 용도는 인슐린 비-의존성 당뇨병, 비만, 졸중, 심근 경색, 과민성 장 증후군 또는 기능성 소화불량을 치료하기 위한 의약 제조에 있어서의 용도를 포함하는 것으로 생각되고 있다. GLP-1 화합물의 PEG화는 당업계에 공지된 다른 변형법과 함께 사용되어 GLP-1 반감기를 증가시키고 (예를 들어, 2002년 8월 1일에 출원된 미국 특허출원 제60/346,474호, 및 2002년 8월 21일에 출원된 제60/405,097호 참조), 이에 따라 PEG화 또는 다른 변형법을 단독으로 사용하는 경우보다 훨씬 더 화합물의 반감기를 증가시킬 수 있다.
본원에 사용된 용어 "GLP-1 화합물"은 또한 본원에 기재된 화합물의 제약상 허용되는 염을 포함한다. 본 발명의 GLP-1 화합물은 충분히 산성이거나, 충분히 염기성이거나, 또는 둘 다인 관능기를 함유할 수 있으며, 이로 인해 임의의 수의 무기 염기, 및 무기 및 유기산과 반응하여 염을 형성할 수 있다. 산 부가 염을 형성하는 데 공통적으로 사용되는 산은 무기산 (예컨대, 염산, 브롬화수소산, 요오드화수소산, 황산, 인산 등), 및 유기산 (예컨대, p-톨루엔술폰산, 메탄술폰산, 옥살산, p-브로모페닐-술폰산, 카르본산, 숙신산, 시트르산, 벤조산, 아세트산 등)이다. 상기 염의 예로는 술페이트, 피로술페이트, 비술페이트, 술피트, 비술피트, 포스페이트, 모노수소포스페이트, 디수소포스페이트, 메타포스페이트, 피로포스페이트, 클로라이드, 브로마이드, 요오다이드, 아세테이트, 프로피오네이트, 데카노에이트, 카프릴레이트, 아크릴레이트, 포르메이트, 이소부티레이트, 카프로에이트, 헵타노에이트, 프로피올레이트, 옥살레이트, 말로네이트, 숙시네이트, 수베레이트, 세바케이트, 푸마레이트, 말레에이트, 부틴-1,4-디오에이트, 헥신-1,6-디오에이트, 벤조에이트, 클로로벤조에이트, 메틸벤조에이트, 디니트로벤조에이트, 히드록시벤조에이트, 메톡시벤조에이트, 프탈레이트, 술포네이트, 크실렌술포네이트, 페닐아세테이트, 페닐프로피오네이트, 페닐부티레이트, 시트레이트, 락테이트, γ-히드록시부티레이트, 글리콜레이트, 타르트레이트, 메탄술포네이트, 프로판술포네이트, 나프탈렌-1-술포네이트, 나프탈렌-2-술포네이트, 만델레이트 등의 염이 있다.
염기 부가 염으로는 무기 염기, 예컨대 암모늄 또는 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 수산화물, 탄산화물, 중탄산화물 등으로부터 유래된 염이 있다. 따라서, 본 발명의 염을 제조하는 데 유용한 상기 염기로는 수산화나트륨, 수산화칼륨, 수산화암모늄, 탄산칼륨 등이 있다.
본 발명의 PEG화된 GLP-1 화합물은 특히 비경구 투여에 사용하기 적합하며, 이들은 경구, 비강 투여, 또는 흡입에 의해 전달될 수도 있다. 비경구 투여는, 예를 들어 근육내, 정맥내, 피하 또는 복막내 주사와 같은 전신 투여를 포함할 수 있다. PEG화된 GLP-1 화합물은 상기 논의된 질환을 치료하기 위한 제약 조성물의 일부로서 허용되는 제약 담체, 희석제 또는 부형제와 함께 대상체에게 투여할 수 있다. 제약 조성물은 용액제일 수 있거나, 또는 비경구 투여되는 경우에는 GLP-1 화합물의 현탁액제 또는 2가 금속 양이온, 예컨대 아연과 착화된 GLP-1 화합물의 현탁액제일 수 있다. 적합한 제약 담체는 펩티드 또는 펩티드 유도체와 상호작용하지 않는 비활성 성분을 함유할 수 있다. 표준 제약 제제 기술은, 예컨대 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA.]에 기재된 기술을 이용할 수 있다. 비경구 투여에 사용하기 적합한 제약 담체로는, 예를 들어 멸균수, 생리학적 염수, 항균성 염수 (약 0.9％ mg/ml 벤질 알콜을 함유하는 염수), 포스페이트-완충된 염수, 행크 용액 (Hank's solution), 링거-락테이트 (Ringer's-lactate) 등이 있다. 적합한 부형제의 몇몇 예로는 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 트레할로스, 소르비톨 및 만니톨이 있다.
본 발명의 PEG화된 GLP-1 화합물은 투여용으로 제제화되어 연장된 기간 동안 혈액 혈장 수준을 유효한 범위 내로 유지할 수 있다. 효과적인 경구 펩티드 약물 전달의 주요 장벽은 산 및 효소에 의한 펩티드 분해에 기인하는 낮은 생체이용가능성, 상피막을 통한 흡수능이 불충분함, 소화관에서 산성 pH 환경에 노출된 후 펩티드기 불용성 형태로 전이되는 현상이다. 펩티드, 예컨대 본 발명에 포함되는 펩티드용 경구 전달 시스템은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, PEG화된 GLP-1 화합물은 미소구체(microsphere)를 사용하여 캡슐화시킨 후에 경구 경로로 전달할 수 있다. 예를 들어, PEG화된 GLP-1 화합물은 상업적으로 입수가능한, 생체 상용가능하고 생분해성 중합체 폴리(락티드-co-글리콜리드)-COOH 및 충전제로서의 올리브 오일로 이루어진 미소구체로 캡슐화시킬 수 있다 (문헌 [Joseph, et al. (2000) Diabetologia 43:1319-1328] 참조). 다른 유형의 미소구체 기술은 예컨대 알케르메스 (Alkermes)로부터 시판되는 메디소르브 (Medisorb; 등록상표) 및 프롤레아제 (Prolease; 등록상표) 생분해성 중합체를 사용할 수 있다. 메디소르브 (등록상표) 중합체는 임의의 락티드 이성질체를 사용하여 제조될 수 있다. 락티드:글리콜리드 비는 넓은 범위의 중합체 특성이 허용되도록 0:100 내지 100:0의 범위에서 달라질 수 있다. 이에 따라 재흡수 시간이 몇 주 내지 몇 개월 범위인 전달 시스템 및 매몰식 장치의 고안이 가능해진다. 또한, 에미스피어(Emisphere)는 펩티드 및 단백질에 이용되는 경구 전달 기술에 대해 논의하고 있는 다양한 논문에 공개되어 있다. 예를 들어, 변형된 아미노산을 포함하여 흡수를 용이하게 하는 특정 담체가 개시된 레온-베이 (Leone-bay) 등의 WO 9528838을 참조한다.
본원에 기재된 PEG화된 GLP-1 화합물은 매우 다양한 질환 및 증상을 앓고 있는 대상체를 치료하는 데 사용될 수 있다. 본 발명의 의해 포함되는 PEG화된 GLP-1 화합물은 "GLP-1 수용체"로 언급되는 수용체에서 작용함으로써 생물학적 효과를 발휘한다 (문헌 [Dillon et al. (1993) Cloning and Functional Expression of the Human Glucagon-like Peptide-1 (GLP-1) Receptor, Endocrinology, 133:1907-1910] 참조). 따라서, GLP-1 수용체 자극 또는 GLP-1 화합물 투여에 대해 유리하게 반응하는 질환 및(또는) 증상을 앓고 있는 대상체는 본 발명의 PEG화된 GLP-1 화합물로 치료할 수 있다. 이들 대상체는 "GLP-1 화합물의 처치를 필요료 하는" 또는 "GLP-1 수용체 자극을 필요로 하는" 대상체로 언급된다.
인슐린 비-의존성 당뇨병, 인슐린 의존성 당뇨병, 졸중 (에펜딕 (Efendic)의 WO 00/16797 참조), 심근 경색 (에펜딕의 WO 98/08531 참조), 비만 (에펜딕의 WO 98/19698 참조), 수술 후 이화 작용 변화 (에펜딕의 미국 특허 제6,006,753호 참조), 기능성 소화불량 및 과민성 장 증후군 (에펜딕의 WO 99/64060 참조)을 앓고 있는 대상체도 포함된다. 또한, GLP-1 화합물로 예방 처치할 필요가 있는 대상체, 예를 들어 인슐린 비-의존성 당뇨병 (WO 00/07617 참조)이 발병할 위험이 있는 대상체도 포함된다. 추가의 대상체로는 글루코스 내성 또는 글루코스 차단이 손상된 대상체가 있으며, 체중이 대상체의 신장 및 신체 골격에 대한 정상 체중의 약 25％를 초과하는 대상체, 부분적으로 췌장을 절제한 대상체, 부모 중 1명 이상이 인슐린 비-의존성 당뇨병을 앓고 있는 대상체, 임신 중 당뇨병을 앓고 있는 대상체, 및 급성 및 만성 췌장염을 앓고 있는 대상체는 인슐린 비-의존성 당뇨병이 발생할 위험이 있다.
본 발명의 PEG화된 GLP-1 화합물은 혈당 수준의 정상화, 췌장 β-세포 퇴화 방지, β-세포 증식 유도, 인슐린 유전자 전사 자극, IDX-1/PDX-1 또는 다른 증식 인자의 상향-조절, β-세포 기능 개선, 잠복기의 β-세포 활성화, 세포의 β-세포로의 분화, β-세포 복제 자극, β-세포 아팝토시스 (apoptosis) 억제, 체중 조절 및 체중 감량 유도에 사용될 수 있다.
PEG화된 GLP-1 화합물의 "유효량"은 GLP-1 수용체 자극을 필요로 하는 대상체에게 투여하였을 때 허용되는 않는 부작용을 유발하지 않고 원하는 치료 및(또는) 예방 효과를 나타내는 양이다. "원하는 치료 효과"는 1) 질환 또는 증상과 관련된 징후(들)의 개선, 2) 질환 또는 증상과 관련된 징후의 개시 지연, 3) 처치하지 않은 경우에 비해 연장된 수명, 및 4) 처치하지 않은 경우에 비해 향상된 삶의 질 중 하나 이상을 포함한다. 예를 들어, 당뇨병 치료에 사용되는 PEG화된 GLP-1 화합물의 "유효량"은 처치하지 않는 경우보다 혈당 농도 조절 기능이 향상되어 당뇨병 합병증, 예컨대 망막증, 신경병 또는 신장병의 개시를 지연시키는 양이다. 당뇨병 예방에 사용되는 PEG화된 GLP-1 화합물의 "유효량"은 처치하는 않은 경우에 비해 항-저혈당증 약물, 예컨대 술포닐 우레아, 티아졸리딘디온, 인슐린 및(또는) 비스구아니딘으로 처치할 필요가 있는 혈당 수준 상승의 개시를 지연시키는 양이다.
대상체에게 투여되는 PEG화된 GLP-1 화합물의 "유효량"은 질환의 유형 및 중증도, 및 대상체의 특성, 예컨대 일반적인 건강 상태, 연령, 성별, 체중 및 약물에 대한 내성에 따라 달라질 것이다. 통상적으로, 본 발명의 PEG화된 GLP-1 화합물은 혈장 수준이 약 5 pmole/L 및 약 200 pmole/L의 범위 내에 속하도록 투여될 것이다. Val8-GLP-1(7-37)OH에 대한 최적의 혈장 수준은 30 pmole/L 내지 약 200 pmole/L의 범위인 것으로 결정되었다.
본 발명의 PEG화된 GLP-1 화합물에 대한 통상적인 투여량 범위는 성인의 경우 약 0.01 mg/일 내지 약 1000 mg/일의 범위일 것이다. 바람직하게, 투여량 범위는 약 0.1 mg/일 내지 약 100 mg/일의 범위이며, 보다 바람직하게는 약 1.0 mg/일 내지 약 10 mg/일의 범위이다.
"대상체"는 포유동물, 바람직하게는 인간이며, 동물, 예를 들어 애완동물 (예를 들어, 개, 고양이 등), 가금 동물 (예를 들어, 소, 양, 돼지, 말 등), 및 실험 동물 (예를 들어, 래트, 마우스, 기니아 피그 등)일 수도 있다.
본 발명의 PEG화된 GLP-1 화합물을 생성하는 데 사용되는 펩티드는 용액 상 또는 고상 펩티드 합성 기술의 표준 방법을 이용함으로써 제조될 수 있다. 펩티드 합성기는 상업적으로 입수가능하며, 예를 들어 캘리포니아주 포스터시 소재의 어플라이드 바이오시스템즈 (Applied Biosystems)로부터 입수가능하다. 고상 합성법에 사용되는 시약은 상업적으로 입수가능하며, 예를 들어 인디애나주 피셔 소재의 미드웨스트 바이오텍 (Midwest Biotech)으로부터 입수가능하다. 고상 펩티드 합성기는 개재되는 기를 차단하고, 반응시킬 아미노산을 보호하고, 커플링시키고, 탈커플링시키고, 반응하지 않은 아미노산을 캡핑하는 제조 지침에 따라 이용될 수 있다.
통상적으로, 수지 상에서 생성되는 펩티드 쇄 상의 α-N-카르바모일 보호된 아미노산 및 N-말단 아미노산은 비활성 용매, 예컨대 디메틸포름아미드, N-메틸피롤리돈 또는 메틸렌 클로라이드 중에서 커플링제, 예컨대 디시클로헥실카르보디이미드 및 1-히드록시벤조트리아졸 및 염기, 예컨대 디이소프로필에틸아민의 존재하에 실온에서 커플링시킨다. 시약 (예컨대, 트리플루오로아세트산 또는 피페리딘), 및 펩티드 쇄에 첨가될 그 다음의 바람직한 N-보호된 아미노산을 사용하여 반복하는 커플링 반응을 이용하여 생성된 펩티드 수지로부터 α-N-카르바모일 보호기를 제거한다. 적합한 아민 보호기는 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 문헌 [Green and Wuts, "Protecting Groups in Organic Synthesis", John Wiley and Sons, 1991] (모든 교시 내용이 본원에 참고로 포함된 것으로 간주함)에 기재되어 있다. 그의 예로는 t-부톡시카르보닐 (tBoc) 및 플루오레닐메톡시카르보닐 (Fmoc)이 있다.
또한, 펩티드는 t-부톡시카르보닐- 또는 플루오레닐메톡시카르보닐-알파-아미노산을 사용하고 적절한 측쇄 보호 반응을 이용하는 표준 자동화 고상 합성 프로토콜을 이용하여 합성된다. 합성이 완료된 후에, 표준 수소 플루오르화 방법을 이용하여 동시에 측쇄를 탈보호시킴으로써 펩티드를 고상 지지체로부터 분리한다. 이어서, 조 펩티드를 비닥 C18 (Vydac C18) 컬럼 상에서 0.1 ％ 트리플루오로아세트산 (TFA) 중 아세토니트릴 구배를 이용하는 역상 크로마토그래피를 이용하여 추가로 정제한다. 아세토니트릴을 제거하기 위해, 펩티드를 0.1 ％ TFA, 아세토니트릴 및 물을 함유하는 용액으로부터 동결건조시킨다. 순도는 분석용 역상 크로마토그래피에 의해 검증될 수 있다. 펩티드는 질량 분광계에 의한 검증으로 식별할 수 있다. 펩티드는 중성 pH의 수성 완충액에 용해될 수 있다.
본 발명을 하기 실시예에 의해 설명하지만, 어떠한 식으로도 본 발명을 한정하지는 않는다.
실시예 1 - GLP-1 관련 유사체의 PEG화 반응:
PEG화 반응을 티오에테르 결합 형성을 허용하는 조건 하에서 수행하였다. 구체적으로, 용액의 pH 범위는 약 4 내지 9였으며, 티올-함유 펩티드 농도는 메톡시-PEG2-MAL 농도보다 1 내지 10 몰 과량이었다. 통상적으로, PEG화 반응은 실온에서 수행한다. 이어서, 역상 HPLC 또는 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)를 이용하여 PEG화된 GLP-1 펩티드를 단리한다. PEG화된 GLP-1 유사체는 분석용 RP-HPLC, HPLC-SEC, SDS-PAGE 및(또는) MALDI 질량 분광계를 이용하여 특성화하였다.
티올-함유 GLP-1 펩티드를 40 kDa의 폴리에틸렌 글리콜-말레이미드 (PEG-말레이미드)와 반응시켜 티오에테르 결합을 통해 PEG에 공유 결합된 유도체를 생성하였다. 예를 들어, 펩티드 Cex-51-C (V8E22I33C40 GLP-1, 45aa 길이; 7.5 mg, 1.8 μmol)를 20 mM EDTA (pH 7.4)를 함유하는 200 mM 포스페이트 완충액 2 ml에 용해시켰다. 이어서, 용액을 아르곤으로 퍼징하였다. 이 용액에 메톡시-PEG2-MAL 40 mg, 이관능화된 PEG 말레이미드 (Lot# PT-02B-10, 알라바마주 헌츠빌 소재의 쉐어워터 폴리머스 인크. (Shearwater Polymers, Inc.)) (PEG 대 펩티드의 비 = 0.55:1 몰/몰)를 첨가하였다. 반응을 2시간 동안 수행하였다. 이어서, PEG화된 펩티드 25 mg을 RP-HPLC에 의해 정제하고, 크기 배제 HPLC에 의해 특성화하고, 시험관내 활성에 대해 시험하였다.
실시예 2 - GLP 유사체와 40 kDa PEG-말레이미드의 반응
GLP-1 유사체, 예컨대 C16E22V8GLP 및 V8C38GLP를 40 kDa의 말레이미드-활성화된 이관능화된 mPEG (쉐어워터 폴리머스 인크.)를 사용하여 도입된 시스테인 잔기에서 선택적으로 PEG화시켰다. PEG화 반응에 있어서, PEG화될 펩티드를 100 mM TRIS 완충액 (pH 8.0)에 용해시키고, 1.25 배 몰 과량의 벌크 40 kDa-mPEG를 첨가하였다. 반응물을 실온에서 2 내지 3시간 동안 교반한 후에, 밤새 10 mM 시트레이트, 10 mM 포스페이트 (H 7.4) 대해 대략 5 ℃에서 투석 (7 kDa 막)하였다. PEG화된-GLP 분자를 중성 pH에서 NaCl 구배를 이용하여 Mono-Q 컬럼 (뉴저지주 피스카타웨이 소재의 아머샴 바이오사이언시즈 코포레이션 (Amersharm Biosciences Corp.)) 상에서 음이온 교환 크로마토그래피에 의해 정제하였다.
실시예 3 - GLP-1 유사체와 DSPE -3.4 kDa -PEG- 말레이미드의 반응
GLP-1 유사체, 예컨대 C16E22V8GLP 및 V8C38GLP-1을 지질, 디스테아로일 포스파티딜 에탄올아민으로 말단 처리한 3.4 kDa의 말레이미드-활성화된 mPEG (쉐어워터 폴리머스 인크.)를 사용하여 도입된 시스테인 잔기에서 선택적으로 PEG화시켰다. PEG화 반응에서, 펩티드를 100 mM TRIS 완충액 (pH 8.0)에 용해시키고, 1.25 배 몰 과량의 벌크 3.4 kDa-PEG-말레이미드를 첨가하였다. 순수 에탄올을 대략 17％까지 첨가하여 DSPE-3.4 kDa-PEG-말레이미드의 용해를 보조하였다. 반응물을 실온에서 2 내지 3시간 동안 교반한 후에, 밤새 10 mM 시트레이트, 10 mM 포스페이트 (pH 7.4)에 대해 대략 5 ℃에서 투석 (7 kDa 막)하였다. PEG화된 펩티드를 중성 pH에서 NaCl 구배를 이용하여 Mono-Q 컬럼 (뉴저지주 피스카타웨이 소재의 아머샴 바이오사이언시즈 코포레이션) 상에서 음이온 교환 크로마토그래피에 의해 정제하였다.
실시예 4 - 시험관내 활성 분석
판베라 (Pan Vera) LLC CRE-BLAM 시스템을 이용하여 인간 GLP-1 수용체를 발현시키는HEK-293 세포를 10％ FBS와 함께 폴리-d-리신 코팅된 96 웰 흑색 투명-바닥 플레이트에 20,000 내지 40,000개 세포/웰/DMEM 배지 100 ml의 농도로 시딩하였다. 시딩한 다음날, 플레이트를 가볍게 두드려 배지를 제거하고, 혈장-무함유 DMEM 배지 80 ㎕를 첨가하였다. 시딩하고 3일 후에, 혈장-무함유 DMEM 배지 20 ㎕를 상이한 농도의 PEG화된 GLP-1 화합물을 함유하는 0.5％ BSA와 함께 각각의 웰에 첨가하여 투여량 반응 곡선을 작성하였다. 일반적으로, 3 내지 30 nmole의 PEG화된 펩티드를 함유하는 14개의 희석액을 사용하여 투여량 반응 곡선을 작성하고, 이로부터 EC50 값을 결정할 수 있다. PEG화된 펩티드와 함께 5시간 동안 인큐베이션한 후에, β-락타마제 기질 (CCF2/AM, 판베라 LLC) 20 ㎕를 첨가하고, 세포형광제 (cytofluor) 상에서 형광이 결정되는 시점에서 1시간 동안 계속 인큐베이션하였다. 분석법은 문헌 [Zlokarnik, et al. (1998), Science, 278:84-88]에도 기재되어 있다. 하기 PEG화된 GLP-1 펩티드를 기재된 바와 같이 시험하였으며, 이들은 하기 언급한 EC50 값을 나타내었다 (V8GLP-1 = 100％).
Figure 112005052020435-pct00013
실시예 5 - 유도체화된 GLP-1 펩티드의 약동학 분석
PEG화된 GLP-1 유사체 (V8E22I33C45-40 kDa PEG (PEG화된 C45-변형된 CEX-51))를 수컷 SD 래트에게 0.1 mg/kg의 투여량으로 정맥내 (IV) 또는 피하 (SC) 경로에 의해 투여하였다. 동물 (IV 투여 시점 당 2마리의 래트, SC 투여 시점 당 3마리의 래트)을 투여 후 0 내지 336시간 동안 여러 시점에서 채혈하였다. 각각의 샘플로부터 혈장을 수집하고, 방사선 면역분석법에 의해 분석하였다. 약동학 파라미터를 모델-의존성 (IV 데이터) 및 비의존성 (SC 데이터) 방법 (윈놀린 프로; WinNonlin Pro)을 이용하여 산출하였다. 약동학 파라미터에 대한 설명을 하기 표 1에 기록하였다. IV 투여된 PEG화된 GLP-1 유사체의 소실 반감기는 대략 1.5일인 반면, SC 투여된 PEG화된 GLP-1 유사체의 소실 반감기는 대략 1.3일이었다. 0.1 mg/kg의 V8E22I33C45-40 kDa PEG의 IV 또는 SC 투여와 연관된 임상적 부작용은 관찰되지 않는다. 화합물에 대해 연장된 소실 반감기, 낮은 제거율 및 상대적으로 높은 피하 생 체이용가능성 (대략 60％)이 관찰되었다.
Figure 112005052020435-pct00014
V8-GLP(7-37)OH를 10 ㎍/kg의 투여량으로 피셔(Fischer) 344 래트에게 유사하게 IV 투여하는 경우, 하기 나열한 바와 같이 매우 상이한 제거율과 반감기 값을 수득하였다.
제거율: 1449 ml/hr/kg
t1 /2 (시간): 0.05
PEG화된 GLP-1 유사체 (V8E22I33C45-40 kDa PEG (PEG화된 C45-변형된 CEX-51))를 수컷 게잡이 (cynomolgus) 원숭이에게 0.1 mg/kg의 투여량으로 정맥내 (IV) 또는 피하 (SC) 경로에 의해 투여하였다. 동물을 투여 후 0 내지 336시간 동안 여러 시점에서 채혈하였다. 각각의 샘플로부터 혈장을 수집하고, 방사선 면역분석법에 의해 분석하였다. 약동학 파라미터를 모델-의존성 (IV 데이터) 및 비의존성 (SC 데이터) 방법 (윈놀린 프로)을 이용하여 산출하였다. 약동학 파라미터에 대한 설명을 하기 표 2에 기록하였다. IV 투여된 PEG화된 GLP-1 유사체의 소실 반감기는 대략 59.5시간인 반면, SC 투여된 PEG화된 GLP-1 유사체의 소실 반감기는 대략 61.6시간이었다.
Figure 112005052020435-pct00015
실시예 6 - 유도체화된 GLP-1 펩티드의 약력학 분석
PEG 화된 GLP-1 유사체 (V8E22I33C45-40 kDa PEG (PEG화된 C45-변형된 CEX-51))를 수컷 C57BL/6OlaHsd-Lepob 마우스에게 3 nmol/kg (12.33 mg/kg = 0.62 ㎍/50g 마우스) 또는 10 nmol/kg (41 mg/kg = 2 ㎍/50g 마우스)의 투여량으로 피하 (SC) 경로에 의해 투여하고, 대조군에게는 비히클만을 투여하였다. 동물 (투여 시점마다 6마리의 마우스)에게 PEG화된 GLP-1 유사체 또는 비히클을 오전 11시에 주사를 이용하여 한번에 투여하였다. 이어서, 마우스를 밤새 금식시키고, IPTGG (1 g 덱스트로스/kg, 복강내 투여)를 수행하였다. 글루코스와 인슐린에 대한 샘플을 글루코스 주사 전후 15, 30, 60, 90 및 120분에 반복하여 채취하였다. 약력학 파라미터에 대한 설명을 하기 표에 기록하였다.
Figure 112005052020435-pct00016
Figure 112005052020435-pct00017
Figure 112005052020435-pct00018
Figure 112005052020435-pct00019
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  21. 식 IV (서열 6)의 아미노산 서열을 갖는 PEG화된 (PEGylated) GLP-1 화합물.
    <식 IV>
    Figure 112006098090006-pct00028
    (상기 식에서,
    Xaa7은 L-히스티딘, D-히스티딘, 데스아미노-히스티딘, 2-아미노-히스티딘, β-히드록시-히스티딘, 호모히스티딘, α-플루오로메틸-히스티딘 또는 α-메틸-히스티딘이고;
    Xaa8은 Ala, Gly, Val, Leu, Ile, Ser 또는 Thr이고;
    Xaa11은 Thr 또는 Cys이고;
    Xaa12는 Phe, Trp, Tyr 또는 Cys이고;
    Xaa16은 Val, Trp, Ile, Leu, Phe, Tyr 또는 Cys이고;
    Xaa18은 Ser, Trp, Tyr, Phe, Lys, Ile, Leu 또는 Val이고;
    Xaa19는 Tyr, Trp 또는 Phe이고;
    Xaa20은 Leu, Phe, Tyr 또는 Trp이고;
    Xaa22는 Gly, Glu, Asp, Lys 또는 Cys이고;
    Xaa23은 Gln 또는 Cys이고;
    Xaa24는 Ala 또는 Cys이고;
    Xaa25는 Ala, Val, Ile, Leu 또는 Cys이고;
    Xaa26은 Lys 또는 Cys이고;
    Xaa27은 Glu, Ile, Ala 또는 Cys이고;
    Xaa30은 Ala, Glu 또는 Cys이고;
    Xaa33은 Val 또는 Ile이고;
    Xaa34는 Lys, Asp, Arg, Glu 또는 Cys이고;
    Xaa35는 Gly 또는 Cys이고;
    Xaa36은 Gly, Pro, Arg 또는 Cys이고;
    Xaa37은 Gly, Pro, Ser 또는 Cys이고;
    Xaa38은 Ser, Pro, His 또는 Cys이고;
    Xaa39는 Ser, Arg, Thr, Trp, Lys 또는 Cys이고;
    Xaa40은 Ser, Gly 또는 Cys이고;
    Xaa41은 Ala, Asp, Arg, Glu, Lys, Gly 또는 Cys이고;
    Xaa42는 Pro, Ala, Cys 또는 NH2이거나, 또는 존재하지 않고;
    Xaa43은 Pro, Ala, Cys 또는 NH2이거나, 또는 존재하지 않고;
    Xaa44는 Pro, Ala, Arg, Lys, His, Cys 또는 NH2이거나, 또는 존재하지 않고;
    Xaa45는 Ser, His, Pro, Lys, Arg, Cys 또는 NH2이거나, 또는 존재하지 않고;
    Xaa46은 His, Ser, Arg, Lys, Cys 또는 NH2이거나, 또는 존재하지 않고;
    Xaa47은 His, Ser, Arg, Lys, Cys 또는 NH2이거나, 또는 존재하지 않고;
    여기서, 2개의 Cys 잔기가 PEG 분자에 공유 결합되었으되;
    단, Xaa42, Xaa43, Xaa44, Xaa45 또는 Xaa46이 존재하지 않으면 각 아미노산의 하류도 존재하지 않음).
  22. 제21항에 있어서, 7 내지 37번 아미노산 중 1개 내지 7개의 아미노산이 GLP-1(7-37)OH 또는 GLP-1(7-36)NH2와 상이한, PEG화된 GLP-1 화합물.
  23. 제21항에 있어서, 7 내지 37번 아미노산 중 1개 내지 6개의 아미노산이 GLP-1(7-37)OH 또는 GLP-1(7-36)NH2와 상이한, PEG화된 GLP-1 화합물.
  24. 제21항에 있어서, 7 내지 37번 아미노산 중 1개 내지 5개의 아미노산이 GLP-1(7-37)OH 또는 GLP-1(7-36)NH2와 상이한, PEG화된 GLP-1 화합물.
  25. 제21항에 있어서, 7 내지 37번 아미노산 중 1개 내지 4개의 아미노산이 GLP-1(7-37)OH 또는 GLP-1(7-36)NH2와 상이한, PEG화된 GLP-1 화합물.
  26. 제21항에 있어서, 7 내지 37번 아미노산 중 1개 내지 3개의 아미노산이 GLP-1(7-37)OH 또는 GLP-1(7-36)NH2와 상이한, PEG화된 GLP-1 화합물.
  27. 제21항 내지 제26항 중 어느 한 항의 PEG화된 GLP-1 화합물을 제약상 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제와 함께 포함하는, 당뇨병, 비만, 졸중, 심근 경색, 과민성 장 증후군 또는 기능성 소화불량을 치료하기 위한 제약 조성물.
  28. 제27항에 있어서, 당뇨병을 치료하기 위한 제약 조성물.
  29. 제27항에 있어서, 비만을 치료하기 위한 제약 조성물.
  30. 제28항에 있어서, 인슐린 비-의존성 당뇨병을 치료하기 위한 제약 조성물.
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