KR20170100908A

KR20170100908A - 지속형 fgf21 수용체 아고니스트 결합체 및 지속형 인슐린 분비 펩타이드 결합체를 포함하는 대사증후군 치료용 조성물

Info

Publication number: KR20170100908A
Application number: KR1020160023377A
Authority: KR
Inventors: 황상연; 최승호; 정의준; 최인영; 정성엽; 권세창
Original assignee: 한미약품 주식회사
Priority date: 2016-02-26
Filing date: 2016-02-26
Publication date: 2017-09-05

Abstract

본 발명은 지속형 FGF21 수용체 아고니스트 결합체 및 지속형 인슐린 분비 펩타이드 결합체를 포함하는 대사증후군 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 및 상기 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 대사증후군 질환의 치료 방법을 제공한다. 상기 조성물은 지속형 FGF21 수용체 아고니스트 결합체 또는 지속형 인슐린 분비 펩타이드 결합체 단독군에 비해 병용 투여에 의해 혈당 감소 효과가 향상된 것을 특징으로 하며, 체중 증가, 구토, 어지러움 등과 같은 부작용을 개선하여, 생체 지속성이 향상된 우수한 대사증후군 질환 예방 또는 치료제로 이용될 수 있다.

Description

지속형 FGF21 수용체 아고니스트 결합체 및 지속형 인슐린 분비 펩타이드 결합체를 포함하는 대사증후군 치료용 조성물 {Composition for treating metabolic syndrome comprising long-acting FGF21 receptor agonists and long-acting insulinotropic peptide conjugate}

본 발명은 지속형 FGF21 수용체 아고니스트 결합체 및 지속형 인슐린 분비 펩타이드 결합체를 포함하는 대사증후군 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 및 상기 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 대사증후군 질환의 치료 방법을 제공한다.

FGF21 (Fibroblast growth factor 21)은 주로 간에서 발현되는 것으로 보고되는 섬유아세포 성장인자로서, 허혈성 혈관 질환, 상처 치유, 및 폐, 기관지 또는 폐포 세포 기능의 손상과 관련된 질환 및 수많은 다른 장애들에 대한 치료제로서 사용될 수 있는 것으로 알려져 있다.

이외에도, FGF21은 인슐린의 존재 및 부재 하에 장시간의 치료 (72 시간) 후, 마우스 3T3-L1 지방세포에서 GLUT-1 전사작용을 촉진하여 글루코스 흡수를 촉진하고, ob/ob 및 db/db 마우스 및 8 주령의 ZDF 랫트에서 공복 및 식후 혈당(blood glucose), 트리글리세라이드(triglyceride) 및 글루카곤(glucagon)을 투여량 의존적인(dose-dependent) 방식으로 감소시키는 것으로 밝혀졌다. 이에 따라 FGF21가 당뇨병 및 비만의 치료를 위한 요법으로서 사용될 수 있는 효과를 증명하였다 (국제특허 공개 WO 2003/011213).

그러나, 이러한 우수한 효과에도 불구하고, 인간 FGF21은 짧은 생체 내 반감기로 인해 그 이용이 제한적이다. 구체적으로, 마우스 생체 내에서 인간 FGF21의 반감기는 1시간 내지 2시간에 불과하고, 필리핀 원숭이 (Cynomogus monkey)에서의 반감기는 2.5시간 내지 3시간 정도로 생체 내 반감기가 매우 짧다. 이에 따라, 2형 당뇨병의 치료에서 FGF21 단백질을 치료제로써 사용하기 위해, FGF21 단백질의 생체 내 반감기 증가가 반드시 필요하다. 반감기가 향상된 FGF21 단백질을 개발하는 것을 통해 환자의 단백질 주사제 투여 빈도를 낮추어 편의성을 증대시킬 수 있다. 최근 공개된 문헌에서는 이러한 FGF21의 반감기를 증가시키기 위하여 Fc 융합 (Fc Fusion) 또는 PEGylation을 이용하는 방법에 대해 기술하고 있다 (미국 등록 특허 US 7,576,190 B2, 국제특허 공개 WO 2010/042747 A2).

하지만, 반감기가 증가된 FGF21 단백질임에도 불구하고, 실제 2형 당뇨 환자에서 단일 치료제로서의 혈당 조절 및 체중감소 효과가 미비하여 개발이 중단된 사례가 보고되고 있다 (PLos One, 2013, 8(3), e58575). 이에 따라 FGF21 단백질 단일 치료제가 아닌 혈당 조절 및 체중감소에 시너지 효과를 줄 수 있는 복합 치료제가 필요한 실정이다.

인슐린 분비 펩타이드의 일종인, 엑센딘-4는 힐라 몬스터(Gila monster, Heloderma suspectum)의 침샘에 의해 생성되는 39개 아미노산 펩타이드이다. 엑센딘-4는 GLP-1 (glucagon like peptide-1)에서 관찰되는 혈당조절 작용의 대부분을 공유하면서도 GLP-1에 비해 엑센딘-4는 디펩티딜 펩티다아제 (Dipeptidyl peptidase-4, DPP4)에 대한 저항성을 나타내며, 생체내에서 조금 더 연장된 반감기와 작용시간을 나타낸다. 임상연구와 비임상연구는 엑센딘-4가 글루코오스 의존성 인슐린 합성 및 분비의 증진, 글루코오스 의존성 글루카곤 분비의 억제, 위 배출의 둔화, 식품섭취 및 체중 감량 등 여러 가지 유익한 항당뇨 성질을 나타낸다는 점을 보여준 바 있다.

더욱이 대한민국 공개특허 제10-2011-0092253호에서는 엑센딘-4의 N-말단의 아민 그룹을 제거한 데스-아미노-히스티딜 엑센딘-4, 엑센딘-4의 N-말단 아민 그룹을 하이드록실 그룹으로 치환한 베타- 히드록시-이미다조-프로피오닐 엑센딘-4, 엑센딘-4의 N-말단 아민 그룹을 두 개의 메틸 그룹으로 수식한 디메틸-히스티딜 엑센딘-4, 및 엑센딘-4의 첫 번째 아미노산인 히스티딘의 알파 탄소 및 알파 탄소에 결합된 N-말단 아민 그룹을 제거한 이미다조-아세틸-엑센딘-4등의 결합체의 생체 내 효력 지속효과가 획기적으로 증가되는 것으로 보고되었다.

이미다조-아세틸-엑센딘-4의 반감기를 보다 증가시킨 지속형 이미다조-아세틸-엑센딘-4 결합체 등의 결합체와 지속형 인슐린 결합체를 포함하는 조성물은 이미 단백질 치료제로서 db/db 마우스, DIO/STZ 랫드와 같은 동물 실험에서 당뇨에 탁월한 효능이 있음을 입증하였다. 이 복합제의 경우, 인슐린 단독 투여군에 의한 체중 증가가 저해되는 특징을 갖고 있지만, 여전히 체중은 비히클 (vehicle) 투여 대비 증가하는 문제점이 있어, 여전히 반감기 증가된 동시에, 당뇨 등과 같은 대사증후군의 우수한 치료 효과를 나타내면서도, 체중 증가와 같은 부작용이 개선된 치료제의 필요성이 대두되고 있다.

이러한 배경하에, 본 발명자들은 FGF21의 짧은 반감기, FGF21 단독 치료제로서의 한계 및 인슐린/인슐린 분비 펩타이드 복합제의 체중 증가 등과 같은 문제점 해결 및, 보다 효과적인 혈당 조절을 위한 기술을 확립하기 위해 예의 노력한 결과, FGF21 수용체 아고니스트인 FGF21 또는 이의 아날로그에 활성 지속 시간을 늘려줄 수 있는 생체적합성 물질인 면역글로불린 Fc영역을 비펩타이드성 중합체를 링커로 하여 상호 공유결합에 의해 연결시킨, 지속형 FGF21 단백질 결합체를 제안하고, 이 지속형 FGF21 단백질 결합체와 지속형 인슐린 분비 펩타이드 결합체를 함께 투여함으로서 대사증후군의 일종인 당뇨병 치료에 있어서 보다 우수한 효과를 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 FGF21 (Fibroblast growth factor 21) 수용체 아고니스트, 및 이의 활성 지속 시간을 늘려줄 수 있는 생체적합성 물질이 연결된, 지속형 FGF21 수용체 아고니스트 결합체; 및 인슐린 분비 펩타이드, 및 이의 활성 지속 시간을 늘려줄 수 있는 생체적합성 물질이 연결된, 지속형 인슐린 분비 펩타이드 결합체를 포함하는, 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 하나의 목적은 목적은 FGF21 (Fibroblast growth factor 21) 수용체 아고니스트, 및 이의 활성 지속 시간을 늘려줄 수 있는 생체적합성 물질이 연결된, 지속형 FGF21 수용체 아고니스트 결합체; 및 인슐린 분비 펩타이드, 및 이의 활성 지속 시간을 늘려줄 수 있는 생체적합성 물질이 연결된, 지속형 인슐린 분비 펩타이드 결합체를 포함하는, 대사증후군 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 하나의 목적은 상기 대사증후군 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 이를 필요로 하는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대사증후군 질환의 치료 방법을 제공하는 것이다.

본 발명을 구현하기 위한 하나의 양태는, FGF21 (Fibroblast growth factor 21) 수용체 아고니스트 및 이의 활성 지속 시간을 늘려줄 수 있는 생체적합성 물질이 연결된, 지속형 FGF21 수용체 아고니스트 결합체; 및 인슐린 분비 펩타이드 및 이의 활성 지속 시간을 늘려줄 수 있는 생체적합성 물질이 연결된, 지속형 인슐린 분비 펩타이드 결합체를 포함하는, 대사증후군 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

하나의 구체예로서, 상기 FGF21 수용체 아고니스트는 천연형 FGF21 또는 이의 아날로그인 것을 특징으로 한다.

또 하나의 구체예로서, 상기 지속형 FGF21 수용체 아고니스트 결합체의 FGF21 수용체 아고니스트 및 생체적합성 물질의 연결; 및 지속형 인슐린 분비 펩타이드 결합체의 인슐린 분비 펩타이드 및 생체적합성 물질의 연결은, 링커 또는 공유결합에 의해 연결된 것인 것을 특징으로 한다.

또 하나의 구체예로서, 상기 조성물은 각 단독군 (지속형 FGF21 수용체 아고니스트 결합체 또는 지속형 인슐린 분비 펩타이드 결합체)에 비해 혈당 조절 능력인 개선된 것을 특징으로 한다.

또 하나의 구체예로서, 상기 조성물은 각 단독군 (지속형 FGF21 수용체 아고니스트 결합체 또는 지속형 인슐린 분비 펩타이드 결합체)에 비해 체중 증가 부작용이 개선된 것이 특징으로 한다.

또 하나의 구체예로서, 상기 대사증후군 질환은 당뇨, 비만, 고질혈증, 고콜레스테롤증 또는 비알콜성 지방간염 (Nonalcoholic steatohepatitis, NASH)인 것을 특징으로 한다.

또 하나의 구체예로서, 상기 조성물은 투여된 대사증후군 질환 개체의 예후를 개선시키는 것을 특징으로 한다.

또 하나의 구체예로서, 상기 인슐린 분비 펩타이드는 GLP-1(Glucagon-like peptide-1), 엑센딘-3, 엑센딘-4, 이들의 아고니스트(agonist), 유도체(derivative), 단편(fragment), 변이체(variant) 및 이들의 조합으로부터 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 한다.

또 하나의 구체예로서, 상기 인슐린 분비 펩타이드는 인슐린 분비 펩타이드의 N-말단 히스티딘 잔기가 데스-아미노-히스티딜, 디메틸-히스티딜, 베타-히드록시 이미다조프로피오닐, 4-이미다조아세틸 및 베타-카르복시 이미다조프로피오닐로 구성되는 군에서 선택되는 물질로 치환된 인슐린 분비 펩타이드 유도체인 것을 특징으로 한다.

또 하나의 구체예로서, 상기 인슐린 분비 펩타이드는 천연형 엑센딘-4, 엑센딘-4의 N-말단 아민 그룹이 제거된 엑센딘-4 유도체, 엑센딘-4의 N-말단 아민 그룹이 하이드록실 그룹으로 치환된 엑센딘-4 유도체, 엑센딘-4의 N-말단 아민 그룹이 디메틸기로 수식된 엑센딘-4 유도체, 엑센딘-4의 첫 번째 아미노산(히스티딘)의 알파 탄소를 제거 (deletion)한 엑센딘-4 유도체, 엑센딘-4의 열두 번째 아미노산(라이신)이 세린으로 치환된 엑센딘-4 유도체, 및 엑센딘-4의 열두 번째 아미노산(라이신)이 알지닌으로 치환된 엑센딘-4 유도체로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 한다.

또 하나의 구체예로서, 상기 지속형 FGF21 결합체는, FGF21과 면역글로불린 Fc 영역이 링커인 비펩타이드성 중합체로 연결된 것이고, 상기 지속형 인슐린 분비 펩타이드 결합체는, 이미다조-아세틸 엑센딘-4인 인슐린 분비 펩타이드 및 면역글로불린 Fc 영역이 링커인 비펩타이드성 중합체로 연결된 것을 특징으로 한다.

또 하나의 구체예로서, 상기 FGF21 수용체 아고니스트 및 인슐린 분비 펩타이드 각각과 각각의 생체적합성 물질은 링커를 통하여 연결되어 있고 (예를 들어, FGF21 수용체 아고니스트 및 생체적합성 물질이 링커를 통해 연결된 지속형 FGF21 수용체 아고니스트 결합체, 및 인슐린 분비 펩타이드 및 생체적합성 물질이 링커를 통해 연결된 지속형 인슐린 분비 펩타이드 결합체의 형태임), 상기 생체적합성 물질은 FcRn 결합물질이며, 상기 링커는 펩타이드 링커, 또는 폴리에틸렌글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 에틸렌 글리콜-프로필렌 글리콜 공중합체, 폴리옥시에틸화폴리올, 폴리비닐알콜, 다당류, 덱스트란, 폴리비닐에틸에테르, 생분해성 고분자, 지질 중합체, 키틴류, 히아루론산 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 비펩타이드성 링커를 통해 연결됨을 특징으로 하는, 지속형 FGF21 수용체 아고니스트 결합체; 및 지속형 인슐린 분비 펩타이드 결합체를 포함하는, 대사증후군 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또 하나의 구체예로서, 상기 FcRn 결합물질은 면역글로불린 Fc 영역을 포함하는 것을 특징으로 한다.

또 하나의 구체예로서, 상기 FcRn 결합물질은 면역글로불린 Fc 영역인 것을 특징으로 한다.

또 하나의 구체예로서, 상기 비펩타이드성 링커의 각 말단이 각각 상기 생체적합성 물질과, FGF21 수용체 아고니스트 또는 인슐린 분비펩타이드의 아민기 또는 티올 기에 결합된 것을 특징으로 한다.

또 하나의 구체예로서, 상기 면역글로불린 Fc 영역은 비당쇄화된 면역글로불린 Fc 영역을 특징으로 한다.

또 하나의 구체예로서, 상기 면역글로불린 Fc 영역은 힌지영역을 추가로 포함하는 것을 특징으로 한다.

또 하나의 구체예로서, 상기 면역글로불린 Fc 영역은 CH1, CH2, CH3 및 CH4 도메인으로 이루어진 군으로부터 1개 내지 4개 선택되는 도메인으로 이루어진 것을 특징으로 한다.

또 하나의 구체예로서, 상기 면역글로불린 Fc 영역은 IgG, IgA, IgD, IgE 또는 IgM에서 유래된 Fc 영역인 것을 특징으로 한다.

또 하나의 구체예로서, 상기 면역글로불린 Fc 영역의 각각의 도메인은 IgG, IgA, IgD, IgE 및 IgM으로 이루어진 군으로부터 선택되는 상이한 기원을 가진 도메인의 하이브리드인 것을 특징으로 한다.

또 하나의 구체예로서, 상기 면역글로불린 Fc 영역은 동일한 기원의 도메인으로 이루어진 단쇄 면역글로불린으로 구성된 이량체 또는 다량체인 것을 특징으로 한다.

또 하나의 구체예로서, 상기 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함하는 것을 특징으로 한다.

또 하나의 구체예로서, 상기 조성물은 지속형 FGF21 수용체 아고니스트 결합체 및 지속형 인슐린 분비 펩타이드 결합체가 동시, 순차적 또는 역순으로 병용 투여되는 것을 특징으로 한다.

본 발명은 또 하나의 양태로서, 상기 조성물을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 대사증후군 질환의 치료 방법을 제공한다.

본 발명의 지속형 인슐린 분비 펩타이드 결합체와 지속형 FGF21 수용체 아고니스트 결합체는 우수한 당뇨병 치료 효능을 나타내며, 특히 병용 투여 시, GLP-1 수용체와 FGF21 수용체를 동시에 자극하여 생체 내 혈당 흡수율을 증가시켜 보다 효과적인 혈당 개선을 보이며, 또한 혈당의 안정적인 조절로 저혈당을 예방할 수 있다. 또한, GLP-1수용체와 FGF21 수용체의 동시 자극을 통해 체중 감소효과를 보여 기존 인슐린과 인슐린 분비 펩타이드의 병용투여에서 보이는 체중 증가 양상 완화보다 적극적인 비만, 혈당 치료효과를 기대할 수 있다. 아울러, 본 발명의 지속형 인슐린 분비 펩타이드 결합체 및 지속형 FGF21 결합체의 병용 투여는 천연형 펩타이드/단백질에 비해 생체 내 혈중 반감기를 증대시킬 뿐만 아니라, 당뇨, 비만, 고지혈증, 고콜레스테롤증, 비알콜성 지방간염 (NASH)을 포함하는 대사증후군의 치료제로서 쓰일 수 있다.

도 1은 db/db 마우스에서 지속형 엑센딘-4 결합체 및 지속형 FGF21 결합체의 병용 투여에 의한 공복혈당 조절 효력을 시간별로 나타낸 그래프이다.
도 2는 db/db 마우스에서 지속형 엑센딘-4 결합체 및 지속형 FGF21 결합체의 병용 투여에 의한 투여 전과 4주 투여 후 체중 변화를 나타낸 그래프이다.

본 발명을 구현하기 위한 하나의 양태는, 생체 내 반감기가 증가된 지속형 FGF21 수용체 아고니스트 결합체 및 지속형 인슐린 분비 펩타이드 결합체를 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명의 조성물은 지속형 FGF21 수용체 아고니스트 결합체 및 지속형 인슐린 분비 펩타이드 결합체가 병용 투여되는 것을 특징으로 한다.

구체적으로, 상기 조성물은 FGF21 수용체 아고니스트의 활성 지속 시간을 늘려줄 수 있는 생체적합성 물질이 링커 또는 공유결합에 의해 연결된, 지속형 FGF21 수용체 결합체; 및 인슐린 분비 펩타이드 및 이의 활성 지속 시간을 늘려줄 수 있는 생체적합성 물질이 링커 또는 공유결합에 의해 연결된, 지속형 인슐린 분비 펩타이드 결합체를 포함하는, 대사증후군 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다. 상기 약학적 조성물은 그 예로 당뇨병 환자의 혈당 개선 및 체중 증가 개선용 약학적 조성물일 수 있다.

또한, 상기 조성물은 혈당, 체중 감소, 혈중 지질 농도 등을 동시에 개선시킬 수 있다.

FGF21의 경우 반감기 증가를 위한 Fc 융합 또는 PEGylation 등의 노력이 있었으나, 여전히 단일 치료제로서의 혈당 조절 및 체중감소 효과가 미비하다고 보고되는 등 실질적인 대사증후군 치료제로서의 성과는 실질적으로 보고가 미비하였다. 한편, 놀랍게도 본 발명자들에 의해 개발된 지속형 FGF21 수용체 아고니스트 및 지속형 인슐린 분비 펩타이드 결합체를 모두 포함하는 조성물의 경우, 혈당 조절 및 체중 감소 효과가 우수한, 대사증후군 질환의 예방 또는 치료제로서의 가능성을 확인하였다. 이와 같은, 지속형 FGF21 수용체 아고니스트 결합체와 지속형 인슐린 분비 펩타이드 결합체의 병용 조성물에 대한 연구는 진행된 바가 없었으며, 상기와 같은 병용 투여 조성물의 새로운 용도는 본 발명자들에 의해 최초로 개발되었다.

본 발명에서 용어, "대사증후군 질환"이란 본 발명의 조성물의 구성성분인 지속형 FGF21 수용체 아고니스트 결합체 및 지속형 인슐린 분비 펩타이드 결합체의각각의 성분인 FGF21 수용체 아고니스트 및 인슐린 분비 펩타이드의 독립적, 복합적 작용에 의해 예방 또는 치료 효과를 나타내는 질환을 의미한다. 그 예로, 당뇨, 비만, 고지혈증, 고콜레스테롤증 또는 비알콜성 지방간염 (nonalcoholic steatohepatitis, NASH)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 용어, "당뇨(Diabetes)병"은 인슐린의 분비량이 부족하거나 정상적인 기능이 이루어지지 않는 등의 대사질환 (metabolic disease)를 의미한다. 그 예로 제 1형 당뇨병 및 제 2형 당뇨병을 모두 포함할 수 있다. 본 발명의 병용 조성물은 개체에 투여함으로써, 혈당을 조절하는 당뇨병 치료제로 제공될 수 있다.

상기 조성물은 혈당을 개선시킬 수 있을 뿐 아니라, 혈액 내 유리 지방산 (free fatty acid)의 농도를 감소시켜 지질독성을 감소시키며, 혈당기능을 조절하여 당독성을 감소시킬 수 있으며, 당뇨의 가장 기본적인 문제인 체중 증가를 억제할 뿐 아니라 감소시킨다는 것을 특징으로 한다. 이에, 선순환 구조로 당뇨 진행을 완화시킬 수 있다.

이에, 상기 조성물은 각 단독군에 비해 체중 증가 부작용이 개선된 것일 수 있으며, 각 단독군에 혈당 조절 능력이 개선된 것을 특징으로 할 수 있다.

아울러, 상기 조성물은 투여된 대사증후군 질환 개체의 예후를 개선시키는 것을 특징으로 할 수 있다.

상기 조성물은 지속형 인슐린 분비 펩타이드 결합체: 지속형 FGF21 수용체 아고니스트 결합체가 몰비로 1:0.01~1:50 범위일 수 있다. 인슐린 분비 펩타이드 결합체는 그 예로 엑센딘 결합체일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 용어, "지속형 FGF21 결합체" 또는 "지속형 FGF21 수용체 아고니스트 결합체"는 혼용된다.

본 발명에서 용어, "지속형 FGF21 수용체 아고니스트 결합체" 및 "지속형 인슐린 분비 펩타이드 결합체"는 FGF21 수용체 아고니스트와 인슐린 분비 펩타이드가 생체적합성 물질 혹은 캐리어와 링커, 공유결합 또는 비공유 결합을 통하여 연결된 결합체를 형성하는 것을 의미하는데 이렇게 결합체를 형성함으로써 해당 FGF21 수용체 아고니스트 나 인슐린 분비 펩타이드가 결합체를 형성하지 않은 경우와 비교하였을 때 활성을 나타내는 시간이 더 늘어날 수 있다.

본 발명에서 FGF21 수용체 아고니스트와 인슐린 분비 펩타이드의 반감기 증가 및 생체 이용율을 증가 혹은 지속적인 활성유지를 할 수 있는 생체적합성 물질이란 FGF21 수용체 아고니스트와 인슐린 분비 펩타이드에 링커에 의한 연결, 또는 직접 공유결합하는 캐리어 일 수 있으며, 직접 공유결합은 하지 않더라고 FGF21 수용체 아고니스트와 인슐린 분비 펩타이드의 생체 내 활성 유지를 높일 수 있는 물질을 제한없이 포함한다.

본 발명에서 용어, "생체적합성 물질" 또는 "캐리어"란 상기 지속형 FGF21 수용체 아고니스트 결합체 또는 지속형 인슐린 분비펩타이드 결합체의 모이어티(moiety)를 이루는 일 구성일 수 있는 것으로, FGF21 수용체 아고니스트와 인슐린 분비 펩타이드에 링커에 의한 연결, 공유 또는 비공유 결합으로 연결되어 결합체를 형성했을 때 해당 단백질 또는 펩타이드의 활성 지속 시간을 늘려줄 수 있는 물질이다. 예를 들어 결합체를 형성하였을 때 해당 단백질이나 펩타이드의 생체 내 반감기를 증가시킬 수 있는 물질은 본 발명에 따른 생체적합성 물질 또는 캐리어가 될 수 있다. FGF21 수용체 아고니스트와 인슐린 분비 펩타이드와 결합될 수 있는 것은 다양한 생체적합성 물질, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜, 지방산, 콜레스테롤, 알부민 및 이의 단편, 알부민 결합물질, 특정 아미노산 서열의 반복단위의 중합체, 항체, 항체단편, FcRn 결합물질, 생체내 결합조직, 뉴클레오 타이드, 파이브로넥틴, 트랜스페린 (Transferrin), 당류 (saccharide), 고분자 중합체 등과 공유 혹은 비공유 결합하여 생체 내 반감기를 연장하는 생체적합성 물질을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 또한 FGF21 수용체 아고니스트와 인슐린 분비 펩타이드와 생체 내 반감기를 연장할 수 있는 생체적합성 물질의 연결은 유전자 재조합 방법과 고분자 혹은 저분자 화학물질을 이용한 in vitro 결합 등을 포함하며 어느 결합방식에 한정되지 않는다. 상기 FcRn 결합물질은 면역글로불린 Fc 영역일 수 있다.

본 발명에서 용어, "FGF21 수용체 아고니스트"란 FGF21 수용체를 활성화시킬 수 있는 작용제를 의미하며, 그 예로 천연형 FGF21 또는 이의 아날로그일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 실시예에서 사용된 FGF21은 천연형 FGF21과 동일하지만, 본 발명은 이것에만 국한되는 것이 아니라, FGF21과 동일한 기전을 갖는 FGF21 아날로그 또는 FGF21단편이 포함된 펩타이드 모두를 포함한다.

본 발명에서 용어, "FGF21 아날로그"란 천연형 서열에서 하나 이상의 아미노산이 변형된 것을 의미하며, 특히 본 발명에서는 천연형에 비해 FGF21 수용체 또는 보조 수용체에 대한 결합력이 감소된, FGF21의 아미노산이 변이된 FGF21 아날로그일 수 있다.

상기 천연형 서열에서 하나 이상의 아미노산이 변형된 것이란 천연형 FGF21에서 적어도 하나 이상의 아미노산에 치환(substitution), 추가(addition), 제거(deletion), 수식(modification) 및 이들의 조합으로 이루어지는 군에서 선택된 변형이 일어난 것일 수 있다.

상기 아미노산의 치환 또는 추가 시에는 인간 단백질에서 통상적으로 관찰되는 20개의 아미노산뿐만 아니라 비정형 또는 비자연적 발생 아미노산 및 아미노산 유도체를 사용할 수 있다. 비정형 아미노산의 상업적 출처에는 Sigma-Aldrich, ChemPep, Genzyme Pharmaceuticals 등이 포함된다. 이러한 아미노산이 포함된 펩타이드와 정형적인 펩타이드 서열은 상업화된 펩타이드 합성 회사, 예를 들어 미국의 American Peptide Company나 Bachem, 또는 한국의 Anygen을 통해 합성 및 구매 가능하다. 아미노산 유도체도 마찬가지 방식으로 입수할 수 있는데, 그 예를 일부만 들자면 데스아미노-히스티딘(desamino-histidine), 베타-히드록시 이미다조프로피온산(beta-hydroxyimidazopropionic acid), 4-이미다조아세트산(4-imidazoacetic acid), 베타-카르복시 이미다조프로피온산(beta-carboxyimidazopropionic acid) 등을 사용할 수 있다.

본 발명의 실시예에서 사용된 FGF21은 유전자 재조합 기술로 만든 FGF21 아날로그이지만, 본 발명은 이것에만 국한되는 것이 아니라 FGF21 수용체 또는 보조 수용체에 대한 결합력이 감소된 모든 FGF21을 포함한다. 바람직하게는 FGF21 변이체(variants), FGF21 단편(fragments) 등을 포함하며 제조법으로는 유전자 재조합 뿐만 아니라 고체상(solid phase) 방법으로도 제조할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

한편, 본 명세서 전반을 통하여, 천연적으로 존재하는 아미노산에 대한 통상의 1문자 및 3문자 코드가 사용될 뿐만 아니라 Aib(α-아미노이소부티르산), Sar(N-methylglycine), 알파-메틸-글루탐산(α-methyl-glutamic acid) 등과 같은 다른 아미노산에 대해 일반적으로 허용되는 3문자 코드가 사용된다.

또한 본 명세서에서 언급된 아미노산은 IUPAC-IUB 명명법에 따라 다음과 같이 약어로 기재하였다.

알라닌 A 아르기닌 R

아스파라긴 N 아스파르트산 D

시스테인 C 글루탐산 E

글루타민 Q 글리신 G

히스티딘 H 이소류신 I

류신 L 리신 K

메티오닌 M 페닐알라닌 F

프롤린 P 세린 S

트레오닌 T 트립토판 W

티로신 Y 발린 V

FGF21 아날로그는 FGF21과 동일한 생체 내의 대사 조절기능을 보유한 펩타이드로서, 이러한 펩타이드는 FGF21 아고니스트(agonist), 유도체(derivatives), 단편(fragments), 변이체(variants) 등을 포함한다. 본 발명에서 펩타이드는 폴리펩타이드, 프로틴 등 다수의 아미노산이 연결된 물질을 폭넓게 포함한다.

본 발명의 FGF21 아고니스트는 FGF21의 구조와 상관없이 FGF21의 생체 내 수용체에 결합하여 FGF21과 동일한 생물학적 활성을 나타내는 물질을 의미한다.

본 발명의 FGF21 단편은 FGF21에 하나 또는 그 이상 아미노산이 추가 또는 삭제된 형태를 의미하며 추가된 아미노산은 천연에 존재하지 않는 아미노산(예: D형 아미노산)도 가능할 수 있고, 이러한 FGF21 단편은 체내에서 대사 조절 기능을 보유한다.

본 발명의 FGF21 변이체는, FGF21과 아미노산 서열이 하나 이상 다른 펩타이드로서, 체내에서 대사 조절 기능을 보유한 펩타이드를 의미한다.

본 발명의 FGF21 아고니스트, 유도체, 단편 및 변이체에서 각각 사용된 제조방법은 독립적으로 사용될 수 있고 조합도 가능하다. 예를 들어 아미노산 서열이 하나 이상 다르고 N 말단의 아미노 잔기에 탈아미노화(deamination)된 체내에서 혈당 조절 기능을 보유한 펩타이드도 포함된다.

구체적으로, 상기 FGF21 아날로그는 천연형 FGF21 아미노산 서열을 기준으로 5번, 6번, 7번, 8번, 9번, 168번, 172번, 176번, 177번, 178번 아미노산으로 이루어진 군에서 선택된 하나 또는 그 이상의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환 또는 수식된 것일 수 있으며, 바람직하게는 알라닌으로 치환된 것일 수 있다. 또한, 하나 이상의 아미노산이 결실(deletion)되어 FGF21 수용체 또는 보조 수용체에 대한 결합력이 감소한 FGF21 아날로그도 본 발명의 범주에 속한다.

본 발명의 FGF21 아날로그는 천연형 FGF21의 N 말단 영역의 아미노산이 결실된 것일 수 있으며, 별도 또는 추가적으로 천연형 FGF21의 5번째 아미노산인 아스파르트산이 그 외의 아미노산으로 치환된 것일 수 있으며, 6번째 아미노산인 세린이 그 외의 아미노산으로 치환된 것일 수 있고, 7번째 아미노산인 세린이 그 외의 아미노산으로 치환된 것일 수 있으며, 8번째 아미노산인 프롤린이 그 외의 아미노산으로 치환된 것일 수 있고, 9번째 아미노산인 류신이 그 외의 아미노산으로 치환된 것일 수 있으며, 168번째 아미노산인 메티오닌이 그 외의 아미노산으로 치환된 것일 수 있고, 172번째 아미노산인 세린이 그 외의 아미노산으로 치환된 것일 수 있으며, 176번째 아미노산인 세린이 그 외의 아미노산으로 치환된 것일 수 있고, 177번째 아미노산인 프롤린이 그 외의 아미노산으로 치환된 것일 수 있으며, 178번째 아미노산인 세린이 그 외의 아미노산으로 치환된 것일 수 있으며, 이중 하나 이상을 포함하는 치환 조합을 가지는 것일 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 FGF21 아날로그는 천연형 FGF21의 5번째 아미노산인 아스파르트산과 168번째 아미노산인 메티오닌이 각각 그 외의 아미노산으로 치환된 것일 수 있고, 6번째 아미노산인 세린과 168번째 아미노산인 메티오닌이 각각 그 외의 아미노산으로 치환된 것일 수 있으며, 7번째 아미노산인 세린과 168번째 아미노산인 메티오닌이 각각 그 외의 아미노산으로 치환된 것일 수 있고, 8번째 아미노산인 프롤린과 168번째 아미노산인 메티오닌이 각각 그 외의 아미노산으로 치환된 것일 수 있으며, 9번째 아미노산인 류신과 168번째 아미노산인 메티오닌이 각각 그 외의 아미노산으로 치환된 것일 수 있고, 172번째 아미노산인 세린과 168번째 아미노산인 메티오닌이 각각 그 외의 아미노산으로 치환된 것일 수 있으며, 176번째 아미노산인 세린과 168번째 아미노산인 메티오닌이 각각 그 외의 아미노산으로 치환된 것일 수 있고, 177번째 아미노산인 프롤린과 168번째 아미노산인 메티오닌이 각각 그 외의 아미노산으로 치환된 것일 수 있으며, 178번째 아미노산인 세린과 168번째 아미노산인 메티오닌이 각각 그 외의 아미노산으로 치환된 것일 수 있다.

그 예로, 본 발명의 FGF21 아날로그는 천연형 FGF21의 5번째 아미노산인 아스파르트산이 알라닌으로 치환된 것일 수 있으며, 6번째 아미노산인 세린이 알라닌으로 치환된 것일 수 있고, 7번째 아미노산인 세린이 알라닌으로 치환된 것일 수 있으며, 8번째 아미노산인 프롤린이 알라닌으로 치환된 것일 수 있고, 9번째 아미노산인 류신이 알라닌으로 치환된 것일 수 있으며, 168번째 아미노산인 메티오닌이 알라닌으로 치환된 것일 수 있고, 172번째 아미노산인 세린이 알라닌으로 치환된 것일 수 있으며, 176번째 아미노산인 세린이 알라닌으로 치환된 것일 수 있고, 177번째 아미노산인 프롤린이 알라닌으로 치환된 것일 수 있으며, 178번째 아미노산인 세린이 알라닌으로 치환된 것일 수 있다. 또한, 본 발명의 FGF21 아날로그는 천연형 FGF21의 5번째 아미노산인 아스파르트산과 168번째 아미노산인 메티오닌이 각각 알라닌으로 치환된 것일 수 있고, 6번째 아미노산인 세린과 168번째 아미노산인 메티오닌이 각각 알라닌으로 치환된 것일 수 있으며, 7번째 아미노산인 세린과 168번째 아미노산인 메티오닌이 각각 알라닌으로 치환된 것일 수 있고, 8번째 아미노산인 프롤린과 168번째 아미노산인 메티오닌이 각각 알라닌으로 치환된 것일 수 있으며, 9번째 아미노산인 류신과 168번째 아미노산인 메티오닌이 각각 알라닌으로 치환된 것일 수 있고, 172번째 아미노산인 세린과 168번째 아미노산인 메티오닌이 각각 알라닌으로 치환된 것일 수 있으며, 176번째 아미노산인 세린과 168번째 아미노산인 메티오닌이 각각 알라닌으로 치환된 것일 수 있고, 177번째 아미노산인 프롤린과 168번째 아미노산인 메티오닌이 각각 알라닌으로 치환된 것일 수 있으며, 178번째 아미노산인 세린과 168번째 아미노산인 메티오닌이 각각 알라닌으로 치환된 것일 수 있다.

본 발명의 FGF21 아날로그는 천연형 FGF21의 5번째 아미노산, 6번째 아미노산, 7번째 아미노산, 8번째 아미노산, 9번째 아미노산, 168번째 아미노산, 172번째 아미노산, 176번째 아미노산, 177번째 아미노산, 및 178번째 아미노산 아미노산으로 이루어진 군에서 선택된 하나 또는 그 이상의 아미노산이 다른 아미노산, 특히 알라닌으로 치환된 것일 수 있다.

또한 본 발명의 FGF21 아날로그는 천연형 FGF21의 1번째 아미노산인 히스티딘(His)이 제거되고, 168번째 메티오닌(Met)이 다른 아미노산, 특히 알라닌으로 치환된 것일 수 있으며, 추가로 천연형 FGF21의 5번째 아미노산, 6번째 아미노산, 7번째 아미노산, 8번째 아미노산, 9번째 아미노산, 172번째 아미노산, 176번째 아미노산, 177번째 아미노산, 및 178번째 아미노산 아미노산으로 이루어진 군에서 선택된 하나 또는 그 이상의 아미노산이 다른 아미노산, 특히 알라닌으로 치환된 것일 수 있다.

그 예로, FGF21 아날로그는 서열번호 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 및 21 중 어느 하나의 아미노산 서열을 가지는 아날로그일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다 (표 1).

FGF21 아날로그 1 내지 9의 DNA 및 단백질 서열

	서열		서열번호
아날로그 1	DNA	ATGAAAAAGA CAGCTATCGC GATTGCAGTG GCACTGGCTG GTTTCGCTAC CGTTGCGCAA GCTCCCATCC CTGCATCCAG TCCTCTCCTG CAATTCGGGG GCCAAGTCCG GCAGCGGTAC CTCTACACAG ATGATGCCCA GCAGACAGAA GCCCACCTGG AGATCAGGGA GGATGGGACG GTGGGGGGCG CTGCTGACCA GAGCCCCGAA AGTCTCCTGC AGCTGAAAGC CTTGAAGCCG GGAGTTATTC AAATCTTGGG AGTCAAGACA TCCAGGTTCC TGTGCCAGCG GCCAGATGGG GCCCTGTATG GATCGCTCCA CTTTGACCCT GAGGCCTGCA GCTTCCGGGA GCTGCTTCTT GAGGACGGAT ACAATGTTTA CCAGTCCGAA GCCCACGGCC TCCCGCTGCA CCTGCCAGGG AACAAGTCCC CACACCGGGA CCCTGCACCC CGAGGACCAG CTCGCTTCCT GCCACTACCA GGCCTGCCCC CCGCACTCCC GGAGCCACCC GGAATCCTGG CCCCCCAGCC CCCCGATGTG GGCTCCTCGG ACCCTCTGAG CGCGGTGGGA CCTTCCCAGG GCCGAAGCCC CAGCTACGCT TCCTGA	4
아날로그 1	단백질	PIPASSPLL QFGGQVRQRY LYTDDAQQTE AHLEIREDGT VGGAADQSPE SLLQLKALKP GVIQILGVKT SRFLCQRPDG ALYGSLHFDP EACSFRELLL EDGYNVYQSE AHGLPLHLPG NKSPHRDPAP RGPARFLPLP GLPPALPEPP GILAPQPPDV GSSDPLSAVG PSQGRSPSYA S	5
아날로그 2	DNA	ATGAAAAAGA CAGCTATCGC GATTGCAGTG GCACTGGCTG GTTTCGCTAC CGTTGCGCAA GCTCCCATCC CTGACGCCAG TCCTCTCCTG CAATTCGGGG GCCAAGTCCG GCAGCGGTAC CTCTACACAG ATGATGCCCA GCAGACAGAA GCCCACCTGG AGATCAGGGA GGATGGGACG GTGGGGGGCG CTGCTGACCA GAGCCCCGAA AGTCTCCTGC AGCTGAAAGC CTTGAAGCCG GGAGTTATTC AAATCTTGGG AGTCAAGACA TCCAGGTTCC TGTGCCAGCG GCCAGATGGG GCCCTGTATG GATCGCTCCA CTTTGACCCT GAGGCCTGCA GCTTCCGGGA GCTGCTTCTT GAGGACGGAT ACAATGTTTA CCAGTCCGAA GCCCACGGCC TCCCGCTGCA CCTGCCAGGG AACAAGTCCC CACACCGGGA CCCTGCACCC CGAGGACCAG CTCGCTTCCT GCCACTACCA GGCCTGCCCC CCGCACTCCC GGAGCCACCC GGAATCCTGG CCCCCCAGCC CCCCGATGTG GGCTCCTCGG ACCCTCTGAG CGCGGTGGGA CCTTCCCAGG GCCGAAGCCC CAGCTACGCT TCCTGA	6
아날로그 2	단백질	PIPDASPLL QFGGQVRQRY LYTDDAQQTE AHLEIREDGT VGGAADQSPE SLLQLKALKP GVIQILGVKT SRFLCQRPDG ALYGSLHFDP EACSFRELLL EDGYNVYQSE AHGLPLHLPG NKSPHRDPAP RGPARFLPLP GLPPALPEPP GILAPQPPDV GSSDPLSAVG PSQGRSPSYA S	7
아날로그 3	DNA	ATGAAAAAGA CAGCTATCGC GATTGCAGTG GCACTGGCTG GTTTCGCTAC CGTTGCGCAA GCTCCCATCC CTGACTCCGC TCCTCTCCTG CAATTCGGGG GCCAAGTCCG GCAGCGGTAC CTCTACACAG ATGATGCCCA GCAGACAGAA GCCCACCTGG AGATCAGGGA GGATGGGACG GTGGGGGGCG CTGCTGACCA GAGCCCCGAA AGTCTCCTGC AGCTGAAAGC CTTGAAGCCG GGAGTTATTC AAATCTTGGG AGTCAAGACA TCCAGGTTCC TGTGCCAGCG GCCAGATGGG GCCCTGTATG GATCGCTCCA CTTTGACCCT GAGGCCTGCA GCTTCCGGGA GCTGCTTCTT GAGGACGGAT ACAATGTTTA CCAGTCCGAA GCCCACGGCC TCCCGCTGCA CCTGCCAGGG AACAAGTCCC CACACCGGGA CCCTGCACCC CGAGGACCAG CTCGCTTCCT GCCACTACCA GGCCTGCCCC CCGCACTCCC GGAGCCACCC GGAATCCTGG CCCCCCAGCC CCCCGATGTG GGCTCCTCGG ACCCTCTGAG CGCGGTGGGA CCTTCCCAGG GCCGAAGCCC CAGCTACGCT TCCTGA	8
아날로그 3	단백질	PIPDSAPLL QFGGQVRQRY LYTDDAQQTE AHLEIREDGT VGGAADQSPE SLLQLKALKP GVIQILGVKT SRFLCQRPDG ALYGSLHFDP EACSFRELLL EDGYNVYQSE AHGLPLHLPG NKSPHRDPAP RGPARFLPLP GLPPALPEPP GILAPQPPDV GSSDPLSAVG PSQGRSPSYA S	9
아날로그 4	DNA	ATGAAAAAGA CAGCTATCGC GATTGCAGTG GCACTGGCTG GTTTCGCTAC CGTTGCGCAA GCTCCCATCC CTGACTCCAG TGCTCTCCTG CAATTCGGGG GCCAAGTCCG GCAGCGGTAC CTCTACACAG ATGATGCCCA GCAGACAGAA GCCCACCTGG AGATCAGGGA GGATGGGACG GTGGGGGGCG CTGCTGACCA GAGCCCCGAA AGTCTCCTGC AGCTGAAAGC CTTGAAGCCG GGAGTTATTC AAATCTTGGG AGTCAAGACA TCCAGGTTCC TGTGCCAGCG GCCAGATGGG GCCCTGTATG GATCGCTCCA CTTTGACCCT GAGGCCTGCA GCTTCCGGGA GCTGCTTCTT GAGGACGGAT ACAATGTTTA CCAGTCCGAA GCCCACGGCC TCCCGCTGCA CCTGCCAGGG AACAAGTCCC CACACCGGGA CCCTGCACCC CGAGGACCAG CTCGCTTCCT GCCACTACCA GGCCTGCCCC CCGCACTCCC GGAGCCACCC GGAATCCTGG CCCCCCAGCC CCCCGATGTG GGCTCCTCGG ACCCTCTGAG CGCGGTGGGA CCTTCCCAGG GCCGAAGCCC CAGCTACGCT TCCTGA	10
아날로그 4	단백질	PIPDSSALL QFGGQVRQRY LYTDDAQQTE AHLEIREDGT VGGAADQSPE SLLQLKALKP GVIQILGVKT SRFLCQRPDG ALYGSLHFDP EACSFRELLL EDGYNVYQSE AHGLPLHLPG NKSPHRDPAP RGPARFLPLP GLPPALPEPP GILAPQPPDV GSSDPLSAVG PSQGRSPSYA S	11
아날로그 5	DNA	ATGAAAAAGA CAGCTATCGC GATTGCAGTG GCACTGGCTG GTTTCGCTAC CGTTGCGCAA GCTCCCATCC CTGACTCCAG TCCTGCTCTG CAATTCGGGG GCCAAGTCCG GCAGCGGTAC CTCTACACAG ATGATGCCCA GCAGACAGAA GCCCACCTGG AGATCAGGGA GGATGGGACG GTGGGGGGCG CTGCTGACCA GAGCCCCGAA AGTCTCCTGC AGCTGAAAGC CTTGAAGCCG GGAGTTATTC AAATCTTGGG AGTCAAGACA TCCAGGTTCC TGTGCCAGCG GCCAGATGGG GCCCTGTATG GATCGCTCCA CTTTGACCCT GAGGCCTGCA GCTTCCGGGA GCTGCTTCTT GAGGACGGAT ACAATGTTTA CCAGTCCGAA GCCCACGGCC TCCCGCTGCA CCTGCCAGGG AACAAGTCCC CACACCGGGA CCCTGCACCC CGAGGACCAG CTCGCTTCCT GCCACTACCA GGCCTGCCCC CCGCACTCCC GGAGCCACCC GGAATCCTGG CCCCCCAGCC CCCCGATGTG GGCTCCTCGG ACCCTCTGAG CGCGGTGGGA CCTTCCCAGG GCCGAAGCCC CAGCTACGCT TCCTGA	12
아날로그 5	단백질	PIPDSSPAL QFGGQVRQRY LYTDDAQQTE AHLEIREDGT VGGAADQSPE SLLQLKALKP GVIQILGVKT SRFLCQRPDG ALYGSLHFDP EACSFRELLL EDGYNVYQSE AHGLPLHLPG NKSPHRDPAP RGPARFLPLP GLPPALPEPP GILAPQPPDV GSSDPLSAVG PSQGRSPSYA S	13
아날로그 6	DNA	ATGAAAAAGA CAGCTATCGC GATTGCAGTG GCACTGGCTG GTTTCGCTAC CGTTGCGCAA GCTCCCATCC CTGACTCCAG TCCTCTCCTG CAATTCGGGG GCCAAGTCCG GCAGCGGTAC CTCTACACAG ATGATGCCCA GCAGACAGAA GCCCACCTGG AGATCAGGGA GGATGGGACG GTGGGGGGCG CTGCTGACCA GAGCCCCGAA AGTCTCCTGC AGCTGAAAGC CTTGAAGCCG GGAGTTATTC AAATCTTGGG AGTCAAGACA TCCAGGTTCC TGTGCCAGCG GCCAGATGGG GCCCTGTATG GATCGCTCCA CTTTGACCCT GAGGCCTGCA GCTTCCGGGA GCTGCTTCTT GAGGACGGAT ACAATGTTTA CCAGTCCGAA GCCCACGGCC TCCCGCTGCA CCTGCCAGGG AACAAGTCCC CACACCGGGA CCCTGCACCC CGAGGACCAG CTCGCTTCCT GCCACTACCA GGCCTGCCCC CCGCACTCCC GGAGCCACCC GGAATCCTGG CCCCCCAGCC CCCCGATGTG GGCTCCTCGG ACCCTCTGAG CGCGGTGGGA CCTGCCCAGG GCCGAAGCCC CAGCTACGCT TCCTGA	14
아날로그 6	단백질	PIPDSSPLL QFGGQVRQRY LYTDDAQQTE AHLEIREDGT VGGAADQSPE SLLQLKALKP GVIQILGVKT SRFLCQRPDG ALYGSLHFDP EACSFRELLL EDGYNVYQSE AHGLPLHLPG NKSPHRDPAP RGPARFLPLP GLPPALPEPP GILAPQPPDV GSSDPLSAVG PAQGRSPSYA S	15
아날로그 7	DNA	ATGAAAAAGA CAGCTATCGC GATTGCAGTG GCACTGGCTG GTTTCGCTAC CGTTGCGCAA GCTCCCATCC CTGACTCCAG TCCTCTCCTG CAATTCGGGG GCCAAGTCCG GCAGCGGTAC CTCTACACAG ATGATGCCCA GCAGACAGAA GCCCACCTGG AGATCAGGGA GGATGGGACG GTGGGGGGCG CTGCTGACCA GAGCCCCGAA AGTCTCCTGC AGCTGAAAGC CTTGAAGCCG GGAGTTATTC AAATCTTGGG AGTCAAGACA TCCAGGTTCC TGTGCCAGCG GCCAGATGGG GCCCTGTATG GATCGCTCCA CTTTGACCCT GAGGCCTGCA GCTTCCGGGA GCTGCTTCTT GAGGACGGAT ACAATGTTTA CCAGTCCGAA GCCCACGGCC TCCCGCTGCA CCTGCCAGGG AACAAGTCCC CACACCGGGA CCCTGCACCC CGAGGACCAG CTCGCTTCCT GCCACTACCA GGCCTGCCCC CCGCACTCCC GGAGCCACCC GGAATCCTGG CCCCCCAGCC CCCCGATGTG GGCTCCTCGG ACCCTCTGAG CGCGGTGGGA CCTTCCCAGG GCCGAGCACC CAGCTACGCT TCCTGA	16
아날로그 7	단백질	PIPDSSPLL QFGGQVRQRY LYTDDAQQTE AHLEIREDGT VGGAADQSPE SLLQLKALKP GVIQILGVKT SRFLCQRPDG ALYGSLHFDP EACSFRELLL EDGYNVYQSE AHGLPLHLPG NKSPHRDPAP RGPARFLPLP GLPPALPEPP GILAPQPPDV GSSDPLSAVG PSQGRAPSYA S	17
아날로그 8	DNA	ATGAAAAAGA CAGCTATCGC GATTGCAGTG GCACTGGCTG GTTTCGCTAC CGTTGCGCAA GCTCCCATCC CTGACTCCAG TCCTCTCCTG CAATTCGGGG GCCAAGTCCG GCAGCGGTAC CTCTACACAG ATGATGCCCA GCAGACAGAA GCCCACCTGG AGATCAGGGA GGATGGGACG GTGGGGGGCG CTGCTGACCA GAGCCCCGAA AGTCTCCTGC AGCTGAAAGC CTTGAAGCCG GGAGTTATTC AAATCTTGGG AGTCAAGACA TCCAGGTTCC TGTGCCAGCG GCCAGATGGG GCCCTGTATG GATCGCTCCA CTTTGACCCT GAGGCCTGCA GCTTCCGGGA GCTGCTTCTT GAGGACGGAT ACAATGTTTA CCAGTCCGAA GCCCACGGCC TCCCGCTGCA CCTGCCAGGG AACAAGTCCC CACACCGGGA CCCTGCACCC CGAGGACCAG CTCGCTTCCT GCCACTACCA GGCCTGCCCC CCGCACTCCC GGAGCCACCC GGAATCCTGG CCCCCCAGCC CCCCGATGTG GGCTCCTCGG ACCCTCTGAG CGCGGTGGGA CCTTCCCAGG GCCGAAGCGC CAGCTACGCT TCCTGA	18
아날로그 8	단백질	PIPDSSPLL QFGGQVRQRY LYTDDAQQTE AHLEIREDGT VGGAADQSPE SLLQLKALKP GVIQILGVKT SRFLCQRPDG ALYGSLHFDP EACSFRELLL EDGYNVYQSE AHGLPLHLPG NKSPHRDPAP RGPARFLPLP GLPPALPEPP GILAPQPPDV GSSDPLSAVG PSQGRSASYA S	19
아날로그 9	DNA	ATGAAAAAGA CAGCTATCGC GATTGCAGTG GCACTGGCTG GTTTCGCTAC CGTTGCGCAA GCTCCCATCC CTGACTCCAG TCCTCTCCTG CAATTCGGGG GCCAAGTCCG GCAGCGGTAC CTCTACACAG ATGATGCCCA GCAGACAGAA GCCCACCTGG AGATCAGGGA GGATGGGACG GTGGGGGGCG CTGCTGACCA GAGCCCCGAA AGTCTCCTGC AGCTGAAAGC CTTGAAGCCG GGAGTTATTC AAATCTTGGG AGTCAAGACA TCCAGGTTCC TGTGCCAGCG GCCAGATGGG GCCCTGTATG GATCGCTCCA CTTTGACCCT GAGGCCTGCA GCTTCCGGGA GCTGCTTCTT GAGGACGGAT ACAATGTTTA CCAGTCCGAA GCCCACGGCC TCCCGCTGCA CCTGCCAGGG AACAAGTCCC CACACCGGGA CCCTGCACCC CGAGGACCAG CTCGCTTCCT GCCACTACCA GGCCTGCCCC CCGCACTCCC GGAGCCACCC GGAATCCTGG CCCCCCAGCC CCCCGATGTG GGCTCCTCGG ACCCTCTGAG CGCGGTGGGA CCTTCCCAGG GCCGAAGCCC CGCATACGCT TCCTGA	20
아날로그 9	단백질	PIPDSSPLL QFGGQVRQRY LYTDDAQQTE AHLEIREDGT VGGAADQSPE SLLQLKALKP GVIQILGVKT SRFLCQRPDG ALYGSLHFDP EACSFRELLL EDGYNVYQSE AHGLPLHLPG NKSPHRDPAP RGPARFLPLP GLPPALPEPP GILAPQPPDV GSSDPLSAVG PSQGRSPAYA S	21

상기 아미노산 서열에서 볼드로 표시된 부분은 각각의 FGF21 아날로그에서 천연형 FGF21을 바탕으로 특이적으로 변이를 준 아미노산 위치를 표시한 것이다.

본 발명에서 용어, "지속형 인슐린 분비 펩타이드 결합체"는 인슐린 분비 펩타이드가 이의 활성 지속 시간을 늘려줄 수 있는 생체적합성 물질이 연결된 결합체를 의미한다.

본 발명에서 "인슐린 분비 펩타이드"는 지속형 인슐린 분비 펩타이드 결합체의 모이어티(moiety)를 이루는 일 구성일 수 있는 것으로, 인슐린 분비 기능을 보유한 펩타이드를 의미하며, 췌장 베타세포의 인슐린의 합성 또는 발현을 자극할 수 있다. 상기 인슐린 분비 펩타이드는 그 예로, GLP-1 (Glucagon like peptide-1), 엑센딘-3 (exendin-3) 또는 엑센딘-4 (exendin-4)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 인슐린 분비 펩타이드에는 천연형 인슐린 분비 펩타이드뿐만 아니라, 그의 전구물질 (precursors), 아고니스트 (agonist), 유도체 (derivatives), 단편 (fragments) 및 변이체 (variants) 등을 포함한다.

본 발명의 인슐린 분비 펩타이드 유도체는 인슐린 분비 펩타이드의 N-말단 아미노 그룹이 제거된 유도체 (Desamino-histidyl 유도체), 아미노 그룹을 하이드록실 그룹으로 치환한 유도체 (beta-hydroxy imidazopropionyl-유도체), 아미노 그룹에 2개의 메틸 (methyl) 잔기로 수식된 유도체 (Dimethyl-histidyl-유도체), 아미노 말단의 아미노 그룹을 카복실 그룹으로 치환한 유도체 (beta-carboxyimidazopropionyl-유도체) 또는 아미노 말단 히스티딘 잔기의 알파 카본을 삭제하여 이미다졸아세틸(imidazoacetyl) 그룹만을 남겨두어 아미노 그룹의 양전하(positive charge)를 제거한 유도체(Imidazoacetyl-유도체), 4-이미다조아세틸 등이 포함될 수 있으며, 또한 기타 다른 형태의 아미노-말단 아미노 그룹 변이 유도체가 본 발명의 범주에 속한다.

본 발명에서 인슐린분비 펩타이드 유도체는 그 예로 엑센딘-4의 N-말단 아미노 그룹 또는 아미노산 잔기를 화학적으로 변이시킨 유도체일 수 있으며, 엑센딘-4의 아미노 말단의 첫 번째 아미노산인 히스티딘 잔기의 알파 카본에 존재하는 알파 아미노 그룹 또는 알파 카본을 치환 또는 제거한 엑센딘-4 유도체, N-말단 아미노 그룹을 제거한 데스아미노-히스티딜-엑센딘-4 (Desamino-histidylexendin-4, DA-엑센딘-4), 하이드록실 그룹 또는 카복실 그룹으로 치환한 베타-히드록시 이미다조프로피오닐-엑센딘-4(beta-hydroxy imidazopropionyl-exendin-4, HY-엑센딘-4), 베타-카르복시 이미다조프로필-엑센딘-4 (beta-carboxyimidazopropionyl-exendin-4, CX-엑센딘-4), 2개의 메틸 잔기로 수식한 디메틸-히스티딜-엑센딘-4 (Dimethyl-histidyl-exendin-4, DM-엑센딘-4), 또는 아미노 말단 히스티딘 잔기의 알파 탄소를 제거한 이미다조아세틸-엑센딘-4(Imidazoacetyl-exendin-4, CA-엑센딘-4), 엑센딘-4의 열두 번째 아미노산(라이신)이 세린으로 치환된 엑센딘-4 유도체, 또는 엑센딘-4의 열두 번째 아미노산(라이신)이 알지닌으로 치환된 엑센딘-4 유도체일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

GLP-1은 소장에서 분비되는 호르몬으로서 일반적으로 인슐린 생합성 및 분비를 촉진하고 글루카곤 분비를 억제하며 세포 내 글루코스 흡수를 촉진한다. 소장에서 글루카곤 전구체는 3개의 펩타이드로 분해되는데, 글루카곤, GLP-1, GLP-2이다. 여기서 GLP-1 은 GLP-1(1-37) 을 의미하며 인슐린 분비기능이 없는 형태이고, GLP-1(7-37) 형태로 프로세싱되어 활성형 GLP-1(7-37)이 된다. GLP-1(7-37) 아미노산 서열은 아래와 같다:

GLP-1(7-37):

HAEGT FTSDV SSYLE GQAAK EFIAW LVKGR G (서열번호 1)

GLP-1 유도체는, GLP-1과 비교 시 최소한 80% 이상 아미노산 서열에서 상동성을 보이며, 화학적으로 수식된 형태일 수도 있고, 인슐린 분비기능도 최소한 동등 또는 그 이상을 나타내는 펩타이드를 의미한다.

GLP-1 단편은, 천연형 GLP-1 의 N-말단 또는 C-말단에 하나 또는 그 이상의 아미노산이 추가 또는 삭제된 형태를 의미하며 추가된 아미노산은 천연에 존재하지 않는 아미노산 (예; D형 아미노산)도 가능하다.

GLP-1 변이체는, 천연형 GLP-1 과 아미노산서열이 하나 이상 다른 펩타이드로 인슐린 분비기능을 보유한 펩타이드를 의미한다.

엑센딘-3 와 엑센딘-4는, GLP-1 과 53%의 아미노산 서열 유사성을 보이는 39 개 아미노산으로 이루어진 인슐린분비 펩타이드이며, 엑센딘-3와 엑센딘-4의 아미노산서열은 아래와 같다.

엑센딘-3:

HSDGT FTSDL SKQME EEAVR LFIEW LKNGG PSSGA PPPS (서열번호 2)

엑센딘-4:

HGEGT FTSDL SKQME EEAVR LFIEW LKNGG PSSGA PPPS (서열번호 3)

엑센딘 아고니스트는 엑센딘의 구조와 상관없이 엑센딘의 생체 내 수용체에 결합하여 엑센딘과 동일한 생물학적 활성을 나타내는 물질을 의미하며, 엑센딘 유도체는, 천연형 엑센딘과 비교시 최소한 80% 이상 아미노산 서열에서 상동성을 보 이며, 아미노산 잔기의 일부 그룹이 화학적으로 치환 (예; alpha-methylation, alpha-hydroxylation), 제거 (예; deamination) 또는 수식 (예; N-methylation)된 형태일수 있고, 인슐린 분비기능을 보유한 펩타이드를 의미한다.

엑센딘 단편은, 천연형 엑센딘의 N-말단 또는 C-말단에 하나 또는 그 이상 아미노산이 추가 또는 삭제된 형태를 의미하며 천연에 존재하지 않는 아미노산(예: D-형 아미노산)의 추가도 가능할 수 있고, 이러한 엑센딘 단편은 인슐린 분비기능을 보유한다.

엑센딘 변이체는, 천연형 엑센딘과 아미노산서열이 하나 이상 다른 펩타이드로서, 인슐린 분비기능을 보유한 펩타이드를 의미하며, 상기 엑센딘 변이체는 엑센딘-4의 열두 번째 아미노산인 라이신이 세린 (serine) 또는 알지닌 (arginine)으로 치환된 펩타이드를 포함한다.

엑센딘 아고니스트, 유도체, 단편 및 변이체에서 각각 사용된 제조방법은 독립적으로 사용될 수 있고 조합도 가능하다. 예를 들어 아미노산 서열이 하나 이상 다르고 N-말단 아미노산 잔기에 탈아미노화 (deamination)된 인슐린분비 펩타이드도 포함한다.

구체적인 일 실시예로서 본 발명에서 사용한 천연형 인슐린 분비 펩타이드와 변형된 인슐린 분비 펩타이드는 Solid phase 합성법을 통하여 합성될 수 있으며, 천연형 인슐린분비 펩타이드를 포함한 대부분의 천연형 펩타이드는 재조합 방법으로도 생산 가능하다.

면역글로불린 Fc 영역은 생체 내에서 대사되는 생분해성의 폴리펩타이드이기 때문에, 약물의 캐리어로 사용하기에 안전하다. 또한, 면역글로불린 Fc 영역은 면역글로불린 전체 분자에 비해 상대적으로 분자량이 적기 때문에 결합체의 제조, 정제 및 수율 면에서 유리할 뿐만 아니라, 아미노산 서열이 항체마다 다르기 때문에 높은 비균질성을 나타내는 Fab 부분이 제거되기 때문에 물질의 동질성이 크게 증가되고 혈중 항원성의 유발 가능성도 낮아지게 되는 효과도 기대할 수 있다.

본 발명에서, "면역글로불린 Fc 영역"은, 상기 지속형 결합체의 모이어티를 이루는 일 구성일 수 있는 것으로, 면역글로불린의 중쇄와 경쇄 가변영역, 중쇄 불변영역 1(CH1)과 경쇄 불변영역(CL1)을 제외한, 중쇄 불변영역 2(CH2) 및 중쇄 불변영역 3(CH3) 부분을 의미하며, 중쇄 불변영역에 힌지(hinge) 부분을 포함하기도 한다. 또한 본 발명의 면역글로불린 Fc 영역은 천연형과 실질적으로 동등하거나 향상된 효과를 갖는 한, 면역 글로불린의 중쇄와 경쇄 가변영역만을 제외하고, 일부 또는 전체 중쇄 불변영역 1(CH1) 및/또는 경쇄불변영역 1(CL1)을 포함하는 확장된 Fc영역일 수 있다. 또한, CH2및/또는 CH3에 해당하는 상당히 긴 일부 아미노산 서열이 제거된 영역일 수도 있다.

즉, 본 발명의 면역글로불린 Fc 영역은 1) CH1 도메인, CH2 도메인, CH3 도메인 및 CH4 도메인, 2)CH1 도메인 및 CH2 도메인, 3)CH1 도메인 및 CH3 도메인, 4)CH2 도메인 및 CH3 도메인, 5)1개 또는 2개의 이상의 도메인과 면역글로불린 힌지 영역(또는 힌지 영역의 일부)와의 조합, 6)중쇄 불변영역 각 도메인과 경쇄 불변영역의 이량체일 수 있다.

또한, 본 발명의 면역글로불린 Fc 영역은 천연형 아미노산 서열뿐만 아니라 이의 서열 변이체(mutant)를 포함한다. 아미노산 서열 변이체란 천연 아미노산 서열 중의 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합에 의하여 상이한 서열을 가지는 것을 의미한다. 예를 들면, IgG Fc의 경우 결합에 중요하다고 알려진 214 내지 238, 297 내지 299, 318 내지 322 또는 327 내지 331번 아미노산 잔기들이 변형을 위해 적당한 부위로서 이용될 수 있다.

또한, 이황화 결합을 형성할 수 있는 부위가 제거되거나, 천연형 Fc에서 N-말단의 몇몇 아미노산이 제거되거나 또는 천연형 Fc의 N-말단에 메티오닌 잔기가 부가될 수도 있는 등 다양한 종류의 변이체가 가능하다. 또한, 이펙터 기능을 없애기 위해 보체결합부위, 예로 C1q 결합부위가 제거될 수도 있고, ADCC(antibody dependent cell mediated cytotoxicity) 부위가 제거될 수도 있다. 이러한 면역글로불린 Fc 영역의 서열 유도체를 제조하는 기술은 국제특허 공개 제WO 97/34631호, 국제특허 공개 제WO 96/32478호 등에 개시되어 있다.

분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 및 펩타이드에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다 (H.Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 197 9). 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이다.

경우에 따라서는 인산화(phosphorylation), 황화(sulfation), 아크릴화 (acrylation), 당화(glycosylation), 메틸화(methylation), 파네실화(farnesylation), 아세틸화(acetylation) 및 아밀화(amidation) 등으로 수식(modification)될 수도 있다.

상기 기술한 Fc 변이체는 본 발명의 Fc 영역과 동일한 생물학적 활성을 나타내나 Fc 영역의 열, pH 등에 대한 구조적 안정성을 증대시킨 변이체다.

또한, 이러한 Fc 영역은 인간 및 소, 염소, 돼지, 마우스, 래빗, 햄스터, 랫트, 기니아 픽 등의 동물의 생체 내에서 분리한 천연형으로부터 얻어질 수도 있고, 형질전환된 동물세포 또는 미생물로부터 얻어진 재조합형 또는 이의 유도체 일 수 있다. 여기서, 천연형으로부터 획득하는 방법은 전체 면역글로불린을 인간 또는 동물의 생체로부터 분리한 후, 단백질 분해효소를 처리하여 얻을 수 있다. 파파인을 처리할 경우에는 Fab 및 Fc로 절단되고, 펩신을 처리할 경우에는 pF'c 및 F(ab)2로 절단된다. 이를 크기 배제 크로마토그래피(size-exclusion chromatography) 등을 이용하여 Fc 또는 pF'c를 분리할 수 있다.

그 예로 인간 유래의 Fc 영역을 미생물로부터 수득한 재조합형 면역글로불린 Fc 영역일 수 있다.

또한, 면역글로불린 Fc 영역은 천연형 당쇄, 천연형에 비해 증가된 당쇄, 천연형에 비해 감소한 당쇄 또는 당쇄가 제거된 형태일 수 있다. 이러한 면역글로불린 Fc 당쇄의 증감 또는 제거에는 화학적 방법, 효소학적 방법 및 미생물을 이용한 유전 공학적 방법과 같은 통상적인 방법이 이용될 수 있다. 여기서, Fc에서 당쇄가 제거된 면역글로불린 Fc 영역은 보체(c1q)의 결합력이 현저히 저하되고, 항체-의존성 세포독성 또는 보체-의존성 세포독성이 감소 또는 제거되므로, 생체 내에서 불필요한 면역반응을 유발하지 않는다. 이런 점에서 약물의 캐리어로서의 본래의 목적에 보다 부합하는 형태는 당쇄가 제거되거나 비당쇄화된 면역글로불린 Fc 영역이라 할 것이다.

본 발명에서 당쇄의 제거(Deglycosylation)는 효소로 당을 제거한 Fc 영역을 말하며, "비당쇄화(Aglycosylation)"는 원핵동물, 그 예로 대장균에서 생산하여 당쇄화되지 않은 Fc 영역일 수 있다.

한편, 면역글로불린 Fc 영역은 인간 또는 소, 염소, 돼지, 마우스, 래빗, 햄스터, 랫트, 기니아 픽 등의 동물기원일 수 있으며, 바람직하게는 인간기원이다. 또한, 면역글로불린 Fc 영역은 IgG, IgA, IgD, IgE, IgM 유래 또는 이들의 조합(combination) 또는 이들의 혼성(hybrid)에 의한 Fc 영역일 수 있다. 구체적으로는 인간 혈액에 가장 풍부한 IgG 또는 IgM 유래이며, 그 예로 리간드 결합 단백질의 반감기를 향상시키는 것으로 공지된 IgG 유래이다.

한편, 본 발명에서 조합(combination)이란 이량체 또는 다량체를 형성할 때, 동일 기원 단쇄 면역글로불린 Fc 영역을 암호화하는 폴리펩타이드가 상이한 기원의 단쇄 폴리펩타이드와 결합을 형성하는 것을 의미한다. 즉, IgG Fc, IgA Fc, IgM Fc, IgD Fc 및 IgE의 Fc 단편으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 2개 이상의 단편으로부터 이량체 또는 다량체의 제조가 가능하다.

본 발명에서 "하이브리드(hybrid)"란 단쇄의 면역글로불린 Fc 영역 내에 2개 이상의 상이한 기원의 면역글로불린 Fc 단편에 해당하는 서열이 존재함을 의미하는 용어이다. 본 발명의 경우 여러 형태의 하이브리드가 가능하다. 즉, IgG Fc, IgM Fc, IgA Fc, IgE Fc 및 IgD Fc의 CH1, CH2, CH3 및 CH4로 이루어진 그룹으로부터 1개 내지 4개 도메인으로 이루어진 도메인의 하이브리드가 가능하며, 힌지를 포함할 수 있다.

한편, IgG 역시 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4의 서브클래스로 나눌 수 있고 본 발명에서는 이들의 조합 또는 이들의 혼성화도 가능하다. 그 예로 IgG2 및 IgG4 서브클래스이며, 보체 의존적 독성(CDC, complementdependent cytotoxicity)과 같은 이펙터 기능(effector function)이 거의 없는 IgG4의 Fc 영역일 수 있다. 본 발명의 약물의 캐리어용 면역글로불린 Fc 영역은, 인간 IgG4 유래의 비-당쇄화된 Fc 영역을 사용할 수 있다. 인간 유래의 Fc 영역은 인간 생체에서 항원으로 작용하여 이에 대한 새로운 항체를 생성하는 등의 바람직하지 않은 면역 반응을 일으킬 수 있는 비-인간 유래의 Fc 영역에 비하여 바람직하다.

본 발명에서 비펩타이드성 중합체는 상기 지속형 결합체의 모이어티를 이루는 일 구성일 수 있는 것으로, 생체적합성 물질과 FGF21 수용체 아고니스트 또는 인슐린 분비 펩타이드를 연결하는 링커로 이용되는 반복 단위가 2개 이상 결합된 생체 적합성 중합체를 의미한다. 상기 반복 단위들은 펩타이드 결합이 아닌 임의의 공유결합을 통해 서로 연결된다. 이와 같은 비펩타이드성 중합체는 양 말단 또는 세 말단을 가질 수 있다.

본 발명에 사용가능한 비펩타이드성 중합체는 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 에틸렌 글리콜과 프로필렌 글리콜의 공중합체, 폴리옥시 에틸화 폴리올, 폴리비닐 알콜, 폴리사카라이드, 덱스트란, 폴리비닐 에틸 에테르, PLA(폴리락트산, polylactic acid) 및 PLGA(폴리락틱-글리콜산, polylactic-glycolic acid)와 같은 생분해성 고분자, 지질 중합체, 키틴류, 히아루론산, 올리고뉴클에오타이드 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있으며, 그 예로 폴리에틸렌글리콜일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 당해 분야에 이미 알려진 이들의 유도체 및 당해 분야의 기술 수준에서 용이하게 제조할 수 있는 유도체들도 본 발명의 범위에 포함된다.

기존 인프레임 퓨전(inframe fusion) 방법으로 제조된 융합 단백질에서 사용된 펩타이드성 링커의 경우, 생체 내에서 단백질분해효소에 의해 쉽게 절단되어 캐리어에 의한 활성 약물의 혈중반감기 증가 효과를 기대만큼 얻을 수 없을 수도 있으므로, 본 발명에서는 펩타이드 링커 뿐 아니라 비펩타이드 링커를 이용하여 결합체를 제조할 수 있다. 비펩타이드 링커는 단백질분해효소에 저항성 있는 중합체를 사용하여 캐리어와 유사하게 펩타이드의 혈중반감기를 유지할 수 있다. 그러므로, 본 발명에서 사용될 수 있는 비펩타이드성 중합체는 상기와 같은 역할, 즉 생체 내 단백질분해효소에 저항성 있는 중합체이면 제한없이 사용될 수 있다. 비펩타이드성 중합체의 분자량은 1 내지 100 kDa 범위, 또는 1 내지 20 kDa 범위이다.

또한, 상기 면역글로불린 Fc 영역과 결합되는 본 발명의 비펩타이드성 중합체는 한 종류의 중합체 뿐만 아니라 상이한 종류의 중합체들의 조합이 사용될 수도 있다.

본 발명에 사용되는 비펩타이드성 중합체는 면역글로불린 Fc 영역 및 FGF21 수용체 아고니스트 또는 인슐린 분비 펩타이드와 결합될 수 있는 반응기를 가진다.

상기 비 펩타이드성 중합체의 양 말단 반응기는 반응 알데히드 그룹, 프로피온 알테히드 그룹, 부틸 알테히드 그룹, 말레이미드(maleimide) 그룹 및 석시니미드(succinimide) 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다. 상기에서, 석시니미드 유도체로는 석시니미딜 프로피오네이트, 히드록시 석시니미딜, 석시니미딜 카르복시메틸 또는 석시니미딜 카보네이트가 이용될 수 있다. 특히, 상기 비펩타이드성 중합체가 양 말단에 반응 알데히드 그룹의 반응기를 갖는 경우, 비특이적 반응을 최소화하고, 비펩타이드성 중합체의 양 말단에서 생리활성 폴리펩타이드 (FGF21 수용체 아고니스트 또는 인슐린 분비 펩타이드) 및 면역글로불린과 각각 결합하는데 효과적이다. 알데히드 결합에 의한 환원성 알킬화로 생성된 최종 산물은 아미드 결합으로 연결된 것보다 훨씬 안정적이다. 알데히드 반응기는 낮은 pH에서 N-말단에 선택적으로 반응하며, 높은 pH, 예를 들어 pH 9.0 조건에서는 라이신 잔기와 공유결합을 형성할 수 있다.

상기 비펩타이드성 중합체의 양 말단 반응기는 서로 같거나 다를 수 있다. 예를 들어, 한쪽 말단에는 말레이미드 그룹을, 다른 쪽 말단에는 알데히드 그룹, 프로피온 알데히드 그룹, 또는 부틸 알데히드 그룹을 가질 수 있다. 양쪽 말단에 히드록시 반응기를 갖는 폴리에틸렌 글리콜을 비펩타이드성 중합체로 이용하는 경우에는 공지의 화학반응에 의해 상기 히드록시기를 상기 다양한 반응기로 활성화하거나, 상업적으로 입수 가능한 변형된 반응기를 갖는 폴리에틸렌 글리콜을 이용하여 본 발명의 결합체를 제조할 수 있다.

지속형 인슐린 분비 펩타이드 결합체의 종류 및 제조방법은 대한민국 등록특허 제10-1058290호, 제10-1231431호와 제10-1058315호에 자세히 기술되어 있으며, 상기 특허는 모두 본 발명의 참조로 포함된다.

본 발명의 일 실시예에서는 이미다조-아세틸 엑센딘-4(CA 엑센딘-4)의 라이신(lysine, Lys)에 PEG로 수식시켰으며, PEG 수식된 엑센딘-4를 면역글로불린 Fc에 연결하여 지속형 엑센딘-4 결합체를 제조하였다.

이러한 본 발명의 지속형 FGF21 수용체 아고니스트 결합체와 지속형 인슐린 분비 펩타이 결합체는 단독투여 대비, 우수한 혈당조절 및 체중 증가 개선 효력를 나타낼 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 지속형 FGF21 수용체 아고니스트 결합체와 지속형 인슐린 분비 펩타이드인 엑센딘-4 결합체를 병용투여하면 혈당개선과 체중 감소 효과가 있음을 확인하였다 (도 1 및 2). 이와 같은 결과들은 본 발명의 지속형 FGF21 수용체 아고니스트 결합체 및 지속형 인슐린 분비 펩타이드 결합체의 복합 조성물, 또는 각 결합체의 병용 투여는 FGF21 수용체 아고니스트, 또는 인슐린 분비 펩타이드 단독 투여시 나타날 수 있는 효력 대비, 시너지 효과 (synergistic effect)인, 혈당 조절 효과를 보이며, 더불어 유리 지방산 (free fatty acid)를 감소시킴으로서 지질 독성을 개선할 수 있고, 또한 체중 증가에 대해 인슐린 분비 펩타이드와 조합을 이뤄 대사증후군 질환, 그 예인 당뇨 치료제로서 사용되는 인슐린과 인슐린 분비 펩타이드 조성물보다 적극적으로 체중을 감소시킬 수 있다. 이에 따라 지속형 FGF21 수용체 인슐린 결합체와 지속형 인슐린 분비 펩타이드 결합체의 혼합 조성물은 당뇨병 개선, 치료에 보다 능동적인 치료가 가능하다는 것을 시사하는 것이다.

본 발명의 상기 조성물은 지속형 FGF21 수용체 아고니스트 결합체 및 지속형 인슐린 분비 펩타이드 결합체를 병용 투여하는 것을 특징으로 한다.

이러한 본 발명의 상기 지속형 FGF21 수용체 아고니스트 결합체 및 지속형 인슐린 분비 펩타이드 결합체를 병용 투여하면 상기 지속형 FGF21 수용체 아고니스트 결합체는 FGF21 수용체에, 지속형 인슐린 분비 펩타이드 결합체는 글루카곤 유사 펩타이드-1 수용체에 동시에 작용하여 각각의 투여시보다 혈중 당의 농도를 감소시키고, 안정적인 변화추이를 보인다. 또한 상기 결합체를 병용 투여하는 경우, FGF21 수용체 아고니스트 단독투여 시 나타날 수 있는 낮은 효력을 극복할 수 있으며, 인슐린 분비 펩타이드 단독 보다 체중을 보다 더 감소시키는 효과가 있다. 또한 엑센딘-4와 같은 인슐린 분비 펩타이드의 용량을 낮출 수 있어 엑센딘-4 단독 치료시 나타날 수 있는 메스꺼움, 구토 등의 부작용을 낮출 수 있는 장점이 있다. 지속형 FGF21 수용체 아고니스트 결합체 및 지속형 인슐린 분비 펩타이드 결합체의 사용은 혈중 반감기 및 생체 내 효력 지속 효과의 획기적인 증가로 인해 매일 투여되야 하는 만성환자에게 투여 횟수를 감소시켜 환자의 삶의 질을 향상시킬 수 있는 큰 장점이 있어 당뇨병의 치료에 큰 도움을 준다.

지속형 FGF21 수용체 아고니스트 결합체 및 지속형 인슐린 분비 펩타이드 결합체는 각각 동시, 순차적, 또는 역순으로 투여될 수 있으며, 적절한 유효량의 조합으로 동시에 투여될 수 있다. 또한 지속형 FGF21 수용체 아고니스트 결합체 및 지속형 인슐린 분비 펩타이드 결합체가 각각 별도의 용기에 보관된 후 동시, 순차적 또는 역순으로 병용 투여될 수 있다.

또한, 본 발명의 병용 투여용 조성물인 지속형 FGF21 수용체 아고니스트 결합체 및 지속형 인슐린 분비 펩타이드 결합체는 하나의 용기에 포함된 대사증후군 질환, 그 예로 당뇨병 치료용 키트, 각각 별도의 용기에 보관된 것인 대사증후군 질환, 그 예로 당뇨병 치료용 키트의 형태일 수 있다. 이와 같은 키트는 약학적으로 허용 가능한 담체, 키트의 사용을 위한 설명서를 포함할 수 있다.

또한, 지속형 FGF21 수용체 아고니스트 결합체는 인슐린 분비 펩타이드인 GLP-1 agonist들(예를 들어 Exenatide, Liraglutide, lixisenatide)와 병용투여가 가능할 수 있다.

본 발명에서 "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며, 상기 조성물들의 투여 경로는 약물이 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비강내 투여, 폐내 투여, 직장 내 투여 등이 될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 그러나 경구 투여 시, 펩타이드는 소화가 되기 때문에 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화하는 것이 바람직하다. 바람직하게는 주사제 형태로 투여될 수 있다. 또한, 지속성 제제는 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.

또한, 본 발명의 약학적 조성물은 치료할 질환, 투여 경로, 환자의 연령, 성별 및 체중 및 질환의 중증도 등의 여러 관련 인자와 함께, 활성성분인 약물의 종류에 따라 결정된다.

또한 본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있다. 본 발명에서 용어, "약학적으로 허용가능한 담체"란 생물체를 자극하지 않고 투여 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 말한다. 경구투여시에는 결합제, 활택제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소 및 향료 등을 사용할 수 있으며, 주사제의 경우에는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장화제 및 안정화제 등을 혼합하여 사용할 수 있으며, 국소투여용의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제 및 보존제 등을 사용할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물의 제형은 상술한 바와 같은 약학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 다양하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여시에는 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭서, 서스펜션, 시럽 및 웨이퍼 등의 형태로 제조할 수 있으며, 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 형태로 제조할 수 있다. 기타, 용액, 현탁액, 정제, 환약, 캡슐 및 서방형 제제 등으로 제형화 할 수 있다.

한편, 제제화에 적합한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 또는 광물유 등이 사용될 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.

지속형 FGF21 수용체 아고니스트 결합체 및 지속형 인슐린 분비 펩타이드를 모두 포함하는 본 발명의 조성물은 주1회의 투여로도 혈당을 우수하게 낮추면서 체중 증가, 구토 등의 부작용을 개선함으로써 대사증후군 질환, 그 예인 당뇨 진행을 억제하는 등 당뇨병 치료에 사용될 수 있다.

본 발명은 또 하나의 양태로서, 상기 FGF21 (Fibroblast growth factor 21) 수용체 아고니스트, 및 이의 활성 지속 시간을 늘려줄 수 있는 생체적합성 물질이 연결된, 지속형 FGF21 수용체 아고니스트 결합체; 및 인슐린 분비 펩타이드, 및 이의 활성 지속 시간을 늘려줄 수 있는 생체적합성물질이 연결된, 지속형 인슐린 분비 펩타이드 결합체를 포함하는, 대사증후군 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 대사증후군 질환의 치료 방법을 제공한다.

상기 대사증후군 질환, 지속형 결합체, 조성물, 투여방법, 투여량은 상기에서 설명한 바와 같다.

이하, 하기 실시예에 의하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위가 이들로 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. FGF21과 면역글로불린 Fc를 비펩티드성 중합체에 의해 연결한 지속형 FGF21 수용체 아고니스트 결합체의 제조

FGF21과 면역글로불린 Fc 영역을 비페티드성 중합체에 의해 연결한 지속형 FGF21 수용체 아고니스트 결합체 (지속형 FGF21 결합체)를 제조하기 위해, 대표적인 FGF21인 천연형 FGF21을 선정하였다.

3.4K PropionALD(2) PEG(프로피온알데히드기를 2개 가지고 있는 PEG, NOF,일본)를 천연형 FGF21의 B 쇄의 N-말단에 페길화시키기 위하여, 천연형 FGF21과 3.4K PropionALD(2) PEG의 몰비를 1:3, 단백질의 농도를 5 ㎎/㎖로 하여 4°C 에서 2시간 동안 반응시켰다. 이때, 반응은 100 mM 인산 칼륨 (photassium phosphate) 완충액(pH 6.0)에 환원제인 20 mM 소디움 시아노보로하이드라이드 (sodium cyanoborohydride(NaCNBH3))가 첨가된 환경하에서 수행하였다. 반응이 종료된 후, 상기 반응액은 10 mM 트리스(Tris)(pH 7.0)이 포함된 버퍼와 0.25 M 염화나트륨(sodium chloride) 농도 구배를 이용하여 Source15Q(GE, 미국)에 적용하여 모노-페길화된 (Monopegylated) 천연형 FGF21을 정제하였다.

다음으로, 상기 정제된 모노-페길화된 천연형 FGF21과 면역글로불린 Fc의 몰비가 1:3, 단백질의 농도를 50 ㎎/㎖로 하여 4°C에서 16시간 동안 반응시켰다. 반응액은 100 mM 인산 칼륨(potassium phosphate) 완충액(pH6.0)에 환원제인 20 mM 소디움 시아노보로하이드라이드(sodium cyanoborohydride(NaCNBH3))가 첨가된 환경하에서 수행되었다. 반응이 종료된 후, 상기 반응액은 20 mM 비스 트리스 (Bis Tris)(pH 6.0)와 0.25 M 염화나트륨(sodium chloride) 농도 구배를 이용하여 Source15Q(GE, 미국)에 적용하고, 1.2 M 황산암모늄(ammonium sulfate)와 20 mM 트리스(Tris)(pH7.5)의 농도 구배를 이용하여 SourceISO(GE, 미국)에 적용하여 면역글로불린 Fc에 천연형 FGF21이 PEG에 의해 공유결합으로 연결된 결합체를 정제하였다. 구체적으로 상기 결합체는 링커인 PEG가 면역글로불린 Fc의 N-말단 위치 및 천연형 FGF21의 N-말단위치에 결합하여, 지속형 FGF21 수용체 아고니스트 결합체를 형성한다.

정제된 상기 결합체는 2% D-만니톨(D-mannitol), 100 mM 염화나트륨(sodium chloride), 0.02% 폴리솔베이트20(polysorbate 20), 10 mM 소디움 아세테이트(sodium acetate) 완충액(pH 6.0)으로 버퍼교환 되었다.

실시예 2: 지속형 엑센딘 -4 결합체 및 지속형 FGF21 수용체 아고니스트 결합체의 병용투여에 따른 제 2형 당뇨 모델 마우스에서의 혈당 조절 및 체중 조절 효과

지속형 인슐린 분비 펩타이드의 대표적 예인 지속형 엑센딘-4 결합체와 지속형 FGF21 수용체 아고니스트 결합체를 포함하는 조성물의 투여 또는 병용투여에 따른 인 비보 (in vivo) 효력을 확인하기 위하여 2형 당뇨 모델인 db/db 마우스를 이용하였다.

지속형 엑센딘-4 결합체는 대표적인 인슐린분비 펩타이드의 예로 이미다조-아세틸 엑센딘-4(CA 엑센딘-4, AP, 미국)을 이용하여 제조하였다. 구체적으로, 이미다조-아세틸 엑센딘-4(CA 엑센딘-4, AP, 미국)를 이용하여 3.4k PropionALD (2) PEG를 CA 엑센딘-4의 Lys 과 반응시킨 후, 두개의 Lys 이성질체 피크 중 반응이 많이 가고 N-말단 이성질체와 확연히 구분되는 가장 뒤쪽의 이성질체 피크 (Lys27 위치이성체)를 이용하여 커플링을 진행하였다.

펩타이드와 면역글로불린 Fc 몰비를 1:8, 전체단백질 농도를 60 mg/ml로 하여 4℃에서 20시간 반응하였다. 반응액은 100 mM K-P pH6.0이며 환원제인 20mM SCB를 첨가하였다. 커플링 반응액은 두 개의 정제 컬럼을 거쳐 정제되었다. 먼저 커플링 반응에 참여하지 않은 다량의 면역글로불린 Fc를 제거하기 위해여 SOURCE Q (XK-16mL, 아머샴 바이오사이언스)을 이용하였다. 20 mM Tris (pH7.5)에서 1M NaCl을 사용하여 Salt gradient를 주면 상대적으로 결합력이 약한 면역글로불린 Fc가 먼저 용출되고 바로 뒤이어 엑센딘-4-면역글로불린 Fc 가 용출된다. 일차정제를 통하여 어느 정도 면역글로불린 Fc가 제거되지만 이온교환컬럼에서 면역글로불린 Fc와 엑센딘-4-면역글로불린 Fc의 결합력 차이가 크지 않아 완전히 분리되지는 않았다. 따라서 두 물질의 소수성 (Hydrophobicity)을 이용하여 이차 정제를 하였다. SOURCE ISO (HR16 , 아머샴 바이오사이언스)에 20mM Tris(pH7.5) 및 1.5M 황산암모늄을 이용하여 일차 정제된 시료를 결합시킨 후 차츰 황산암모늄 농도를 낮추면서 시료를 용출시켰다. HIC 컬럼에 결합력이 약한 면역글로불린 Fc가 먼저 용출되고 결합력이 강한 엑센딘-4-면역글로불린 Fc 시료가 뒤쪽으로 용출되었다. 이들의 소수성 차이가 커 이온교환 컬럼보다 훨씬 분리가 용이하였다.

9주령의 db/db 마우스 혈당을 미정맥 부분에 26 G 주사기로 찔러서 얻은 1-2 방울의 혈액을 사용하여 투여 전 혈당분석기(OneTouch Ultra, LifeScan, Inc., USA)로 혈당을 측정하여 당뇨 유발 정도를 확인하였다. 측정된 혈당을 이용하여 각 군당 6마리씩 8군(G1-G8)으로 분리하였다.

상기 군들은 지속형 FGF21 수용체 아고니스트 결합체의 제형 버퍼만을 투여한 대조군(vehicle), 지속형 FGF21 수용체 아고니스트 결합체 만을 농도 별로 투여한 3개의 군 (2.4, 4.8, 그리고 9.4 nmol/kg), 지속형 엑센딘-4 결합체 (0.36 nmol/kg)를 단독으로 투여한 1개의 군, 지속형 엑센딘-4 결합체 및 지속형 FGF21 수용체 아고니스트 결합체를 병용으로 투여한 3개의 군 (0.36 nmol/kg + 2.4 nmol/kg, 0.36 nmol/kg + 4.8 nmol/kg, 0.36 nmol/kg + 9.4 nmol/kg)으로 나누었다. 그리고 상기 시험물질을 4주간 이틀에 한번 씩 반복 투여하면서 일주일에 2회 또는 3회에 공복 혈당 (4시간 절식)을 측정하였다. 또한, 매 회 투여 전 체중을 측정하여 기록하였다.

그 결과, 지속형 FGF21 결합체 및 지속형 엑센딘-4 결합체를 병용으로 투여한 3개의 군은 모두 지속형 FGF21 결합체 단독 또는 지속형 엑센딘-4 결합체 단독에 비해 상승 효과를 보임을 확인하였다 (도 1). 이는 지속형 FGF21 결합체 만을 투여한 3개의 군은 대조군 대비 모두 혈당 감소 효과가 미비하였음을 감안할 때 병용으로 투여함으로서 얻을 수 있는, 혈당 감소 능력이 증가한 혈당 개선 효과를 나타내는 것이었다.

또한, 지속형 FGF21 결합체 및 지속형 엑센딘-4 결합체를 병용으로 4주간 투여한 경우, 병용 투여군은 지속형 FGF21 결합체 단독 또는 지속형 엑센딘-4 결합체 단독군에 비해 체중 감소 효과가 탁월하였다 (도 2).

이와 같은 결과는 본 발명의 지속형 FGF21 수용체 아고니스트 결합체와 지속형 엑센딘-4 결합체를 병용 투여하면 단독 투여 대비, 우수한 혈당 조절 및 체중 증가 개선 효력를 나타낼 수 있음을 의미하는 것이다. 즉, 지속형 FGF21 수용체 아고니스트 결합체 및 지속형 엑센딘-4 결합체의 병용 투여의 시너지 효과 (synergestic effect)를 나타내는 것이다. 이는 지속형 FGF21 결합체 단독군에서 보이는 미비한 효력을 개선 시킬 뿐 아니라, 지속형 엑센딘-4 결합체 단독군에서 보일 수 있는 구토, 매스꺼움 등의 부작용을 감소시킬 수 있는 개연성을 시사하는 것이다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

<110> HANMI PHARM. CO., LTD. <120> Composition for treating metabolic syndrome comprising long-acting FGF21 receptor agonists and long-acting insulinotropic peptide conjugate <130> KPA160127-KR <160> 21 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GLP-1(7-37) <400> 1 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 2 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Exendin-3 <400> 2 His Ser Asp Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu 1 5 10 15 Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser 35 <210> 3 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Exendin-4 <400> 3 His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu 1 5 10 15 Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser 35 <210> 4 <211> 606 <212> DNA <213> Artificial 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Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser Pro 35 40 45 Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln Ile 50 55 60 Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly Ala 65 70 75 80 Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg Glu 85 90 95 Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His Gly 100 105 110 Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro Ala 115 120 125 Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala 130 135 140 Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val Gly 145 150 155 160 Ser Ser Asp Pro Leu Ser Ala Val Gly Pro Ser Gln Gly Arg Ser Pro 165 170 175 Ser Tyr Ala Ser 180 <210> 6 <211> 606 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FGF21 analog 2 <400> 6 atgaaaaaga cagctatcgc gattgcagtg gcactggctg gtttcgctac cgttgcgcaa 60 gctcccatcc ctgacgccag tcctctcctg caattcgggg gccaagtccg gcagcggtac 120 ctctacacag atgatgccca gcagacagaa gcccacctgg agatcaggga ggatgggacg 180 gtggggggcg ctgctgacca gagccccgaa agtctcctgc agctgaaagc cttgaagccg 240 ggagttattc aaatcttggg agtcaagaca tccaggttcc tgtgccagcg gccagatggg 300 gccctgtatg gatcgctcca ctttgaccct gaggcctgca gcttccggga gctgcttctt 360 gaggacggat acaatgttta ccagtccgaa gcccacggcc tcccgctgca cctgccaggg 420 aacaagtccc cacaccggga ccctgcaccc cgaggaccag ctcgcttcct gccactacca 480 ggcctgcccc ccgcactccc ggagccaccc ggaatcctgg ccccccagcc ccccgatgtg 540 ggctcctcgg accctctgag cgcggtggga ccttcccagg gccgaagccc cagctacgct 600 tcctga 606 <210> 7 <211> 180 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FGF21 analog 2 <400> 7 Pro Ile Pro Asp Ala Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val Arg 1 5 10 15 Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His Leu 20 25 30 Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser Pro 35 40 45 Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln Ile 50 55 60 Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly Ala 65 70 75 80 Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser 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Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val Gly 145 150 155 160 Ser Ser Asp Pro Leu Ser Ala Val Gly Pro Ser Gln Gly Arg Ser Pro 165 170 175 Ser Tyr Ala Ser 180 <210> 10 <211> 606 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FGF21 analog 4 <400> 10 atgaaaaaga cagctatcgc gattgcagtg gcactggctg gtttcgctac cgttgcgcaa 60 gctcccatcc ctgactccag tgctctcctg caattcgggg gccaagtccg gcagcggtac 120 ctctacacag atgatgccca gcagacagaa gcccacctgg agatcaggga ggatgggacg 180 gtggggggcg ctgctgacca gagccccgaa agtctcctgc agctgaaagc cttgaagccg 240 ggagttattc aaatcttggg agtcaagaca tccaggttcc tgtgccagcg gccagatggg 300 gccctgtatg gatcgctcca ctttgaccct gaggcctgca gcttccggga gctgcttctt 360 gaggacggat acaatgttta ccagtccgaa gcccacggcc tcccgctgca cctgccaggg 420 aacaagtccc cacaccggga ccctgcaccc cgaggaccag ctcgcttcct gccactacca 480 ggcctgcccc ccgcactccc ggagccaccc ggaatcctgg ccccccagcc ccccgatgtg 540 ggctcctcgg accctctgag cgcggtggga ccttcccagg gccgaagccc cagctacgct 600 tcctga 606 <210> 11 <211> 180 <212> PRT <213> 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atgaaaaaga cagctatcgc gattgcagtg gcactggctg gtttcgctac cgttgcgcaa 60 gctcccatcc ctgactccag tcctgctctg caattcgggg gccaagtccg gcagcggtac 120 ctctacacag atgatgccca gcagacagaa gcccacctgg agatcaggga ggatgggacg 180 gtggggggcg ctgctgacca gagccccgaa agtctcctgc agctgaaagc cttgaagccg 240 ggagttattc aaatcttggg agtcaagaca tccaggttcc tgtgccagcg gccagatggg 300 gccctgtatg gatcgctcca ctttgaccct gaggcctgca gcttccggga gctgcttctt 360 gaggacggat acaatgttta ccagtccgaa gcccacggcc tcccgctgca cctgccaggg 420 aacaagtccc cacaccggga ccctgcaccc cgaggaccag ctcgcttcct gccactacca 480 ggcctgcccc ccgcactccc ggagccaccc ggaatcctgg ccccccagcc ccccgatgtg 540 ggctcctcgg accctctgag cgcggtggga ccttcccagg gccgaagccc cagctacgct 600 tcctga 606 <210> 13 <211> 180 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FGF21 analog 5 <400> 13 Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Ala Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val Arg 1 5 10 15 Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His Leu 20 25 30 Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser Pro 35 40 45 Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln Ile 50 55 60 Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly Ala 65 70 75 80 Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg Glu 85 90 95 Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His Gly 100 105 110 Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro Ala 115 120 125 Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala 130 135 140 Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val Gly 145 150 155 160 Ser Ser Asp Pro Leu Ser Ala Val Gly Pro Ser Gln Gly Arg Ser Pro 165 170 175 Ser Tyr Ala Ser 180 <210> 14 <211> 606 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FGF21 analog 6 <400> 14 atgaaaaaga cagctatcgc gattgcagtg gcactggctg gtttcgctac cgttgcgcaa 60 gctcccatcc ctgactccag tcctctcctg caattcgggg gccaagtccg gcagcggtac 120 ctctacacag atgatgccca gcagacagaa gcccacctgg agatcaggga ggatgggacg 180 gtggggggcg ctgctgacca gagccccgaa agtctcctgc agctgaaagc cttgaagccg 240 ggagttattc aaatcttggg agtcaagaca tccaggttcc tgtgccagcg gccagatggg 300 gccctgtatg gatcgctcca ctttgaccct gaggcctgca gcttccggga gctgcttctt 360 gaggacggat acaatgttta ccagtccgaa gcccacggcc tcccgctgca cctgccaggg 420 aacaagtccc cacaccggga ccctgcaccc cgaggaccag ctcgcttcct gccactacca 480 ggcctgcccc ccgcactccc ggagccaccc ggaatcctgg ccccccagcc ccccgatgtg 540 ggctcctcgg accctctgag cgcggtggga cctgcccagg gccgaagccc cagctacgct 600 tcctga 606 <210> 15 <211> 180 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FGF21 analog 6 <400> 15 Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val Arg 1 5 10 15 Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His Leu 20 25 30 Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser Pro 35 40 45 Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln Ile 50 55 60 Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly Ala 65 70 75 80 Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg Glu 85 90 95 Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His Gly 100 105 110 Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro Ala 115 120 125 Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala 130 135 140 Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val Gly 145 150 155 160 Ser Ser Asp Pro Leu Ser Ala Val Gly Pro Ala Gln Gly Arg Ser Pro 165 170 175 Ser Tyr Ala Ser 180 <210> 16 <211> 606 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FGF21 analog 7 <400> 16 atgaaaaaga cagctatcgc gattgcagtg gcactggctg gtttcgctac cgttgcgcaa 60 gctcccatcc ctgactccag tcctctcctg caattcgggg gccaagtccg gcagcggtac 120 ctctacacag atgatgccca gcagacagaa gcccacctgg agatcaggga ggatgggacg 180 gtggggggcg ctgctgacca gagccccgaa agtctcctgc agctgaaagc cttgaagccg 240 ggagttattc aaatcttggg agtcaagaca tccaggttcc tgtgccagcg gccagatggg 300 gccctgtatg gatcgctcca ctttgaccct gaggcctgca gcttccggga gctgcttctt 360 gaggacggat acaatgttta ccagtccgaa gcccacggcc tcccgctgca cctgccaggg 420 aacaagtccc cacaccggga ccctgcaccc cgaggaccag ctcgcttcct gccactacca 480 ggcctgcccc ccgcactccc ggagccaccc ggaatcctgg ccccccagcc ccccgatgtg 540 ggctcctcgg accctctgag cgcggtggga ccttcccagg gccgagcacc cagctacgct 600 tcctga 606 <210> 17 <211> 180 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FGF21 analog 7 <400> 17 Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val Arg 1 5 10 15 Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His Leu 20 25 30 Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser Pro 35 40 45 Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln Ile 50 55 60 Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly Ala 65 70 75 80 Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg Glu 85 90 95 Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His Gly 100 105 110 Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro Ala 115 120 125 Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala 130 135 140 Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val Gly 145 150 155 160 Ser Ser Asp Pro Leu Ser Ala Val Gly Pro Ser Gln Gly Arg Ala Pro 165 170 175 Ser Tyr Ala Ser 180 <210> 18 <211> 606 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FGF21 analog 8 <400> 18 atgaaaaaga cagctatcgc gattgcagtg gcactggctg gtttcgctac cgttgcgcaa 60 gctcccatcc ctgactccag tcctctcctg caattcgggg gccaagtccg gcagcggtac 120 ctctacacag atgatgccca gcagacagaa gcccacctgg agatcaggga ggatgggacg 180 gtggggggcg ctgctgacca gagccccgaa agtctcctgc agctgaaagc cttgaagccg 240 ggagttattc aaatcttggg agtcaagaca tccaggttcc tgtgccagcg gccagatggg 300 gccctgtatg gatcgctcca ctttgaccct gaggcctgca gcttccggga gctgcttctt 360 gaggacggat acaatgttta ccagtccgaa gcccacggcc tcccgctgca cctgccaggg 420 aacaagtccc cacaccggga ccctgcaccc cgaggaccag ctcgcttcct gccactacca 480 ggcctgcccc ccgcactccc ggagccaccc ggaatcctgg ccccccagcc ccccgatgtg 540 ggctcctcgg accctctgag cgcggtggga ccttcccagg gccgaagcgc cagctacgct 600 tcctga 606 <210> 19 <211> 180 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FGF21 analog 8 <400> 19 Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val Arg 1 5 10 15 Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His Leu 20 25 30 Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser Pro 35 40 45 Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln Ile 50 55 60 Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly Ala 65 70 75 80 Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg Glu 85 90 95 Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His Gly 100 105 110 Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro Ala 115 120 125 Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala 130 135 140 Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val Gly 145 150 155 160 Ser Ser Asp Pro Leu Ser Ala Val Gly Pro Ser Gln Gly Arg Ser Ala 165 170 175 Ser Tyr Ala Ser 180 <210> 20 <211> 606 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FGF21 analog 9 <400> 20 atgaaaaaga cagctatcgc gattgcagtg 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Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln Ile 50 55 60 Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly Ala 65 70 75 80 Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg Glu 85 90 95 Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His Gly 100 105 110 Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro Ala 115 120 125 Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala 130 135 140 Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val Gly 145 150 155 160 Ser Ser Asp Pro Leu Ser Ala Val Gly Pro Ser Gln Gly Arg Ser Pro 165 170 175 Ala Tyr Ala Ser 180

Claims

FGF21 (Fibroblast growth factor 21) 수용체 아고니스트, 및 이의 활성 지속 시간을 늘려줄 수 있는 생체적합성 물질이 연결된, 지속형 FGF21 수용체 아고니스트 결합체; 및
인슐린 분비 펩타이드, 및 이의 활성 지속 시간을 늘려줄 수 있는 생체적합성물질이 연결된, 지속형 인슐린 분비 펩타이드 결합체를 포함하는, 대사증후군 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 FGF21 수용체 아고니스트는 천연형 FGF21 또는 이의 아날로그인, 약학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 지속형 FGF21 수용체 아고니스트 결합체의 FGF21 수용체 아고니스트 및 생체적합성 물질의 연결; 및
지속형 인슐린 분비 펩타이드 결합체의 인슐린 분비 펩타이드 및 생체적합성 물질의 연결은, 링커 또는 공유결합에 의해 연결된 것인, 약학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물은 각 단독군에 비해 혈당 조절 능력인 개선된 것이 특징인, 약학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물은 각 단독군에 비해 체중 증가 부작용이 개선된 것이 특징인, 약학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 대사증후군 질환은 당뇨, 비만, 고질혈증, 고콜레스테롤증 또는 비알콜성 지방간염 (Nonalcoholic steatohepatitis, NASH)인, 약학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물은 투여된 대사증후군 질환 개체의 예후를 개선시키는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 인슐린 분비 펩타이드는 GLP-1(Glucagon-like peptide-1), 엑센딘-3, 엑센딘-4, 이들의 아고니스트(agonist), 유도체(derivative), 단편(fragment), 변이체(variant) 및 이들의 조합으로부터 구성되는 군으로부터 선택되는 것인 약학적 조성물.
제8항에 있어서, 상기 인슐린 분비 펩타이드는 인슐린 분비 펩타이드의 N-말단 히스티딘 잔기가 데스-아미노-히스티딜, 디메틸-히스티딜, 베타-히드록시 이미다조프로피오닐, 4-이미다조아세틸 및 베타-카르복시 이미다조프로피오닐로 구성되는 군에서 선택되는 물질로 치환된 인슐린 분비 펩타이드 유도체인 것인, 약학적 조성물.
제8항에 있어서, 상기 인슐린 분비 펩타이드는 천연형 엑센딘-4, 엑센딘-4의 N-말단 아민 그룹이 제거된 엑센딘-4 유도체, 엑센딘-4의 N-말단 아민 그룹이 하이드록실 그룹으로 치환된 엑센딘-4 유도체, 엑센딘-4의 N-말단 아민 그룹이 디메틸기로 수식된 엑센딘-4 유도체, 엑센딘-4의 첫 번째 아미노산(히스티딘)의 알파 탄소를 제거 (deletion)한 엑센딘-4 유도체, 엑센딘-4의 열두 번째 아미노산(라이신)이 세린으로 치환된 엑센딘-4 유도체, 및 엑센딘-4의 열두 번째 아미노산(라이신)이 알지닌으로 치환된 엑센딘-4 유도체로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 약학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 지속형 FGF21 결합체는, FGF21과 면역글로불린 Fc 영역이 링커인 비펩타이드성 중합체로 연결된 것이고, 상기 지속형 인슐린 분비 펩타이드 결합체는, 이미다조-아세틸 엑센딘-4인 인슐린 분비 펩타이드 및 면역글로불린 Fc 영역이 링커인 비펩타이드성 중합체로 연결된 것인, 약학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 FGF21 수용체 아고니스트 및 인슐린 분비펩타이드 각각과 각각의 생체적합성 물질은 링커를 통하여 연결되어 있고, 상기 생체적합성 물질은 FcRn 결합물질이며,
상기 링커는 펩타이드 링커, 또는 폴리에틸렌글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 에틸렌 글리콜-프로필렌 글리콜 공중합체, 폴리옥시에틸화폴리올, 폴리비닐알콜, 다당류, 덱스트란, 폴리비닐에틸에테르, 생분해성 고분자, 지질 중합체, 키틴류, 히아루론산 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 비펩타이드성 링커를 통해 연결됨을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
제12항에 있어서, 상기 FcRn 결합물질은 면역글로불린 Fc 영역을 포함하는 것인, 약학적 조성물.
제12항에 있어서, 상기 비펩타이드성 링커의 각 말단이 각각 상기 생체적합성 물질과, FGF21 수용체 아고니스트 또는 인슐린 분비펩타이드의 아민기 또는 티올 기에 결합된 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
제13항에 있어서, 상기 면역글로불린 Fc 영역이 비당쇄화된 것인 약학적 조성물.
제13항에 있어서, 상기 면역글로불린 Fc 영역이 힌지영역을 추가로 포함하는 것인 약학적 조성물.
제13항에 있어서, 상기 면역글로불린 Fc 영역이 CH1, CH2, CH3 및 CH4 도메인으로 이루어진 군으로부터 1개 내지 4개 선택되는 도메인으로 이루어진 것인 약학적 조성물.
제13항에 있어서, 상기 면역글로불린 Fc 영역은 IgG, IgA, IgD, IgE 또는 IgM에서 유래된 Fc 영역인 것인 약학적 조성물.
제13항에 있어서, 상기 면역글로불린 Fc 영역의 각각의 도메인은 IgG, IgA, IgD, IgE 및 IgM으로 이루어진 군으로부터 선택되는 상이한 기원을 가진 도메인의 하이브리드인 것인 약학적 조성물.
제13항에 있어서, 상기 면역글로불린 Fc 영역은 동일한 기원의 도메인으로 이루어진 단쇄 면역글로불린으로 구성된 이량체 또는 다량체인 것인 약학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함하는 것인 약학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물은 지속형 FGF21 수용체 아고니스트 결합체 및 지속형 인슐린 분비 펩타이드 결합체가 동시, 순차적 또는 역순으로 병용 투여되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제1항 내지 제22항 중 어느 한 항의 조성물을 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 대사증후군 질환의 치료 방법.