CN116635402A - 用于代谢病症的融合多肽 - Google Patents

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Abstract

本申请提供了多肽的缀合物，所述多肽包含通过多肽接头连接的纳米抗体和FGF21。本申请进一步提供了多肽的缀合物，所述多肽包含通过两个多肽接头分别连接的GLP‑1、纳米抗体和FGF21。还提供了包含所述缀合物的药物组合物和治疗疾病的方法。

Description

用于代谢病症的融合多肽
技术领域
本发明涉及多肽和其生产方法、药物组合物以及使用所述多肽、所述药物组合物预防和/或治疗疾病，特别是代谢疾病的方法。
背景技术
成纤维细胞生长因子21(FGF21)(成纤维细胞生长因子(FGF)家族的成员)是多种代谢活性器官中合成的，调节葡萄糖和脂质稳态的激素。因FGF21在多个靶器官中多样的代谢功能，其生物学在本质上复杂。已报道FGF21在器官，如肝、脂肪细胞、胰腺、下丘脑和肌肉组织中起作用(Fisher FM,《生理学年度评论(Annu Rev Physiol)》,2016,78:223)。
胰高血糖素样肽-1(GLP-1)的主要生物活性片段是衍生自胰高血糖素原肽的翻译后加工的30或31个氨基酸的肽片段(GLP-1的氨基酸7-36或7-37)。最初的GLP-1产品GLP-1刺激胰岛素合成和分泌，并且已显示预防糖尿病，尤其2型糖尿病中的高血糖症。然而，内源性GLP-1仅具有大致2分钟的半衰期，这导致GLP-1的空腹血浆水平仅为0-15pmol/L。
代谢病症通常与胰岛素抵抗、内脏肥胖、致动脉粥样硬化血脂异常等相关，其在世界范围内构成重大且不断升级的公共卫生和临床挑战。然而，代谢疾病的现有治疗面临如半衰期短和/或功效低的问题。
因此，需要用于治疗代谢疾病的改进的治疗方案。
发明内容
在第一方面，本公开提供了一种多肽，其基本上是包含通过一个或两个接头连接的两个或三个功能结构域的融合多肽或融合蛋白。
具体地，在N末端到C末端的方向上，所述多肽包含第一片段和第二片段，所述第一片段和所述第二片段通过第一接头连接。所述第一片段包含能够与血清白蛋白(例如人血清白蛋白)结合的纳米抗体结构域，并且所述第二片段包含生物活性FGF21结构域。
在本文中，所述FGF21结构域包含与SEQ ID NO:1具有至少90％序列同一性，同时基本上保留其生物活性的氨基酸序列。因此，所述FGF21结构域可以相对于SEQ ID NO:1包含不多于12、11、10、9、8、7、6、5、4、3或2个氨基酸残基突变，只要这种含有突变的FGF21变体仍然保留FGF21的生物活性即可。在本文中，氨基酸残基突变可以是取代、插入或缺失。
根据所述多肽的一些实施方式，所述FGF21结构域可以包含一个或多个氨基酸残基突变，每个氨基酸残基突变位于选自以下的位置：相对于SEQ ID NO:1的位置121、168、171和180。任选地，所述FGF21结构域中的所述一个或多个氨基酸残基突变可以包含以下三个取代中的一个、两个、三个或四个取代：N121Q、M168L、P171G和A180E。
根据所述多肽的一些实施方式，所述FGF21结构域可以包含N121Q、M168L和A180E中的所有三个取代，并且所述FGF21结构域的所述氨基酸序列如SEQ ID NO:5中所示。所述FGF21结构域可以在所述三个突变的基础上有其它氨基酸残基的额外突变。在某些实施方式中，所述FGF21结构域进一步包含P171G取代。根据所述多肽的一些实施方式，所述FGF21结构域包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列。
根据所述多肽的一些实施方式，所述FGF21结构域进一步包含可缀合残基。在本文中，所述可缀合残基可以任选地位于C末端片段内相对于SEQ ID NO:1从位置169跨越到位置181的位置处。根据某些实施方式，所述可缀合残基位于选自下组的位置处：相对于SEQID NO:1的位置169、170、171、172、173、174、180和181。根据所述多肽的一些实施方式，除了可缀合残基的突变之外，所述FGF21结构域包含SEQ ID NO:2-5、89-91、14和102-105的氨基酸序列，所述可缀合残基可以任选地位于C末端片段内相对于SEQ ID NO:1从位置169跨越到位置181的位置处。
根据所述多肽的一些实施方式，所述FGF21结构域包含SEQ ID NO:6-13、16-19和92的氨基酸序列。
根据一些实施方式，所述多肽在含有FGF21结构域的第二片段中的所述可缀合残基处与功能部分缀合。
在本文中，与所述FGF2结构域缀合的所述功能部分可以任选地包含糖基部分或合成化学部分。
根据所述多肽的一些实施方式，所述功能部分包含糖基部分，并且所述可缀合残基可以是可糖基化的引入残基，如苏氨酸(T)或天冬酰胺(N)残基。更具体地，所述可缀合残基可以任选地是相对于SEQ ID NO:1在位置172或位置173处引入的T，或者可以是在位置170或位置174处引入的N残基。根据所述多肽的一些实施方式，所述FGF21结构域包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:16-19。
根据所述多肽的一些其它实施方式，所述功能部分包含合成化学部分。因此，所述可缀合残基可以任选地包含引入的半胱氨酸(C)，并且所述合成化学部分可以包含*-X-Y-Z的结构。在本文中，X、Y和Z通过键相互连接，并且X的*端连接到所述多肽上的所述可缀合残基。X可以是Y可以是/> 并且Z可以是/>其中位置α连接到位置α'，位置β连接到位置β'。在本文中，R1可以是氢或-COOH；d可以是1、2或3；a可以是1、2或3；b可以是1、2或3；c可以是1或2；d可以是1、2或3；并且e可以是1、2或3。
根据所述多肽的一些更具体的实施方式，所述合成化学部分具有以下结构：在本文中也称为Ac-2XADO-EDA-CO-CH2-*。
任选地，所述引入的半胱氨酸可以位于选自下组的位置处：相对于SEQ ID NO:1的169、170、171、172、173、174、180和181。根据某些实施方式，所述可缀合残基位于相对于SEQID NO:1的位置171或174处。根据所述多肽的实施方式一些实施方式，所述FGF21结构域包含SEQ ID NO:6-13和92的氨基酸序列。
在所述多肽的一些实施方式中，所述FGF21结构域包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列，其中所述引入的半胱氨酸位于位置171处，所述氨基酸序列在所述引入的半胱氨酸残基处与具有以下结构的合成化学部分缀合：(在本文中也称为Ac-2XADO-EDA-CO-CH2*)。
在所述多肽的一些实施方式中，所述FGF21结构域可以包含SEQ ID NO:92的氨基酸序列，其中所述引入的半胱氨酸位于位置174处，所述氨基酸序列在所述引入的半胱氨酸残基处与具有以下结构的合成化学部分缀合：(在本文中也称为Ac-2XADO-EDA-CO-CH2*)。
所述多肽的其它实施方式可以可替代地包含：
i)所述FGF21结构域包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列，并且所述引入的半胱氨酸位于位置169处；
ii)所述FGF21结构域包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列，并且所述引入的半胱氨酸位于位置170处；
iii)所述FGF21结构域包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列，并且所述引入的半胱氨酸位于位置171处；
iv)所述FGF21结构域包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列，并且所述引入的半胱氨酸位于位置172处；
v)所述FGF21结构域包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列，并且所述引入的半胱氨酸位于位置173处；
vi)所述FGF21结构域包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列，并且所述引入的半胱氨酸位于位置174处；
vii)所述FGF21结构域包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列，并且所述引入的半胱氨酸位于位置180处；或者
viii)所述FGF21结构域包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列，并且所述引入的半胱氨酸位于位置181处，
ix)所述FGF21结构域包含SEQ ID NO:92的氨基酸序列，并且所述引入的半胱氨酸位于位置174处，
并且任选地在所述引入的半胱氨酸残基处与具有以下结构的合成化学部分缀合：(在本文中也称为Ac-2XADO-EDA-CO-CH2*)。
另外和可替代地，在所述多肽的一些其它实施方式中，所述FGF21结构域进一步包含相对于SEQ ID NO:1的P171G的取代。在此类实施方式中，所述FGF21结构域包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:14和92。
在所述多肽的任何上述实施方式中，所述纳米抗体结构域可以任选地包含VHH结构域，任选地能够与人血清白蛋白(HSA)结合的VHH结构域。
进一步任选地，所述VHH结构域可以是人源化的。
根据一些实施方式，所述VHH结构域可以包含互补决定区1(CDR1)、互补决定区2(CDR2)和互补决定区3(CDR3)。在本文中，所述CDR1可以包含SEQ ID NO:20的序列或其具有至多3、2或1个氨基酸突变的变体；所述CDR2可以包含SEQ ID NO:21的序列或其具有至多3、2或1个氨基酸突变的变体；和/或所述CDR3可以包含SEQ ID NO:22的序列或其具有至多3个、2个或1个氨基酸突变的变体，并且所述VHH结构域基本上保留了与血清白蛋白，任选地人血清白蛋白的结合特异性。
在所述多肽的某些具体实施方式中，所述VHH结构域包含：互补决定区1(CDR1)，所述CDR1包含SEQ ID NO:20的序列；CDR2，所述CDR2包含SEQ ID NO:21的序列；以及CDR3，所述CDR3包含SEQ ID NO:22的序列。
在所述多肽的某些具体实施方式中，所述VHH结构域包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列或其变体，所述变体与SEQ ID NO:23具有至少70％(例如，至少75％、80％、85％、90％、95％、99％)同一性，并且所述变体基本上保留了与血清白蛋白的结合特异性和/或亲和力。
在本文中，任选地，SEQ ID NO:23的变体相对于SEQ ID NO:23可以具有至多10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸突变。
在任何上述实施方式中，所述纳米抗体结构域可以任选地进一步包含连接到所述VHH结构域的N末端的N末端延伸部，所述N末端延伸部可以任选地包含SG、AG、S或A的氨基酸残基。
根据所述多肽的一些具体实施方式，所述纳米抗体结构域包含选自SEQ ID NO:24-27的氨基酸序列。
在上述多肽的任何实施方式中，所述第一接头可以具有至少四个氨基酸残基的长度。
根据一些实施方式，所述第一接头可以不包含酸性氨基酸残基，并且更具体地，所述第一接头可以不包含D残基或E残基中的任一种。
任选地，所述第一接头可以包含第一重复序列的一个或多个单元，并且根据一些实施方式，所述第一重复序列可以由不多于4或6种选自下组的氨基酸残基组成：G、Q、A、P、T和S。
根据所述多肽的一些具体实施方式，所述第一重复序列可以包含选自下组的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成：GfSg(在本文中，f和g中的每一者独立地为选自1至5的整数)、SEQ ID NO:35(GAQP)、SEQ ID NO:36(GQAP)、SEQ ID NO:37(GPAQ)、SEQ ID NO:38(GPQA)、SEQ ID NO:39(GSQP)、SEQ ID NO:40(GASP)、SEQ ID NO:41(GPAS)、SEQ ID NO:42(GPSA)、SEQ ID NO:43(GGGS)、SEQ ID NO:44(GSGS)、SEQ ID NO:45(GGGGS)、SEQ ID NO:46(GSAPGSPAGSPTGSAPGSPA)和GS。
在某些实施方式中，所述第一重复序列可以具有SEQ ID NO:35(GAQP)中所示的氨基酸序列，并且单元的数量可以是介于1与10之间的整数。
根据所述多肽的某些具体实施方式，所述第一接头包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:35(GAQP)、SEQ ID NO:49((GAQP)2)、SEQ ID NO:50((GAQP)5)、SEQ ID NO:51((GAQP)10)和SEQ ID NO:48(GGGGSGGGS)。
在上述多肽的任何实施方式中，所述多肽可以通过所述第一片段的N末端进一步包含第三片段，所述第三片段包含另一功能结构域。在本文中，所述第一片段和所述第三片段通过第二接头连接。
在本文中，所述第三片段的所述另一功能结构域可以任选地包含选自下组之一的生物活性蛋白或其片段：胰高血糖素样肽-1(GLP-1)、胰岛素、瘦素、胰高血糖素、胃泌素、胃抑制多肽(GIP)、胰淀素、降钙素、胆囊收缩素、肽YY、神经肽Y、骨形态发生蛋白-6(BMP-6)、骨形态发生蛋白-9(BMP-9)、胃泌酸调节素、催产素、胰高血糖素样肽-2(GLP-2)、鸢尾素、含III型纤连蛋白结构域的蛋白5(FNDC5)、爱帕琳肽、脂联素、Clq和肿瘤坏死因子相关蛋白(CTRP家族)、抵抗素、内脂素、网膜素、视黄醇结合蛋白-4(RBP-4)、肠高血糖素(glicentin)、血管生成素、白细胞介素-22(IL-22)、艾塞那肽-4(exendin-4)和生长激素。
根据所述多肽的一些实施方式，所述第三片段的所述另一功能结构域包含GLP-1的生物活性肽或其片段，并且可以包含与SEQ ID NO:28具有至少70％序列同一性，同时保留其基本生物活性的氨基酸序列。
在本文中，任选地，所述另一功能结构域可以包含在相对于SEQ ID NO:28的位置8、22、26、34和36或其任何组合处的一个或多个突变。
根据所述多肽的一些实施方式，所述多肽的所述第三片段的所述另一功能结构域中的所述一个或多个突变可以包含A8G、G22E、K26R、K34R和R36G，或其任何组合。根据所述多肽的一些实施方式，所述多肽的所述第三片段的所述另一功能结构域中的所述一个或多个突变可以包含A8G、G22E和R36G，或其任何组合。
根据所述多肽的一些具体实施方式，所述第三片段的所述另一功能结构域包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:31-34。
在所述多肽的任何上述实施方式中，所述多肽包含第一片段，所述第一片段通过第二接头与第一片段的N末端连接。
在某些实施方式中，所述第二接头可以具有至少四个氨基酸残基的长度。在某些实施方式中，所述第二接头可以具有至少8、12、16或20个氨基酸残基的长度。
本文中，所述第二接头可以包含第二重复序列的一个或多个单元，并且所述第二重复序列可以由不多于4或6种选自下组的氨基酸残基组成：G、Q、A、E、P、T和S。
根据所述多肽的一些具体实施方式，所述第二重复序列可以包含选自下组的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成：GhSi(在本文中，h和i中的每一者独立地为选自1至5的整数)、SEQ ID NO:35(GAQP)、SEQ ID NO:55(GQEP)、SEQ ID NO:56(GEQP)、SEQ ID NO:57(GPQE)、SEQ ID NO:58(GPEQ)、SEQ ID NO:59(GSEP)、SEQ ID NO:60(GESP)、SEQ ID NO:61(GPSE)、SEQ ID NO:62(GPES)、SEQ ID NO:36(GQAP)、SEQ ID NO:37(GPAQ)、SEQ ID NO:38(GPQA)、SEQ ID NO:39(GSQP)、SEQ ID NO:40(GASP)、SEQ ID NO:41(GPAS)、SEQ ID NO:42(GPSA)、SEQ ID NO:43(GGGS)、SEQ ID NO:44(GSGS)、SEQ ID NO:45(GGGGS)、SEQ ID NO:46(GSAPGSPAGSPTGSAPGSPA)和GS。
进一步地，根据一些实施方式，所述第二重复序列可以具有SEQ ID NO:35(GAQP)中所示的氨基酸序列，并且所述一个或多个单元的数目可以为介于1与15之间的整数。
根据所述多肽的某些具体实施方式，所述第二接头包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:49((GAQP)2)、SEQ ID NO:50((GAQP)5)、SEQ ID NO:51((GAQP)10)和SEQ IDNO:52((GAQP)14)和SEQ ID NO:47((GGGGS)4)。
根据由所述第一片段和所述第二片段组成的所述多肽的某些具体实施方式，所述多肽包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:63-68、93、99、100、101和107。根据所述多肽的某些具体实施方式，所述多肽包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:63、68和100的氨基酸序列，并且在相对于SEQ ID NO:1的位置171处引入的半胱氨酸残基处与本文提供的合成化学部分缀合。根据所述多肽的某些具体实施方式，所述多肽包含SEQ ID NO:93的氨基酸序列，并且在相对于SEQ ID NO:1的位置174处引入的半胱氨酸残基处与本文提供的合成化学部分缀合。根据所述多肽的这些具体实施方式中的某些实施方式，所述合成化学部分具有以下结构：(在本文中也称为Ac-2XADO-EDA-CO-CH2*)。根据所述多肽的某些具体实施方式，所述多肽包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:64-67、93和107，并且不缀合。
根据由所述第一片段、所述第二片段和所述第三片段组成的所述多肽的某些具体实施方式，所述多肽包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:70、74、75、79-83、85、94-98和108-109。根据所述多肽的某些具体实施方式，所述多肽包含选自下组的氨基酸序列：SEQID NO:74、81-83、85和96-97，并且在相对于SEQ ID NO:1的位置171处引入的半胱氨酸残基处与本文提供的合成化学部分缀合。根据所述多肽的某些具体实施方式，所述多肽包含SEQID NO:94的氨基酸序列，并且在相对于SEQ ID NO:1的位置174处引入的半胱氨酸残基处与所述合成化学部分缀合。根据所述多肽的这些具体实施方式中的某些实施方式，所述合成化学部分具有以下结构：(在本文中也称为Ac-2XADO-EDA-CO-CH2*)。根据所述多肽的某些具体实施方式，所述多肽包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:70、75、79-80、85、94、95、98和108-109，并且不缀合。
在本公开的第二方面，进一步提供了一种药物组合物。所述药物组合物包含根据上述任何实施方式的多肽和药学上可接受的载体。
在本公开的第三方面，还提供了一种预防或治疗有需要的受试者的代谢病症的方法，所述方法包含施用治疗有效量的根据上述任何实施方式的多肽或上述药物组合物的步骤。
在本文中，所述代谢病症可以是糖尿病、肥胖、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、心血管样血脂异常、动脉硬化、酒精性脂肪性肝炎(ASH)、糖尿病性肾病、妊娠期糖尿病、代谢综合征如代谢综合征X等、非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)、终末期肝病、肝脂肪变性(脂肪肝)、肝硬化、原发性胆汁性肝硬化(PBC)或严重高甘油三酯血症(SHTG)。
在本公开的第四方面，进一步提供了一种多核苷酸，其编码根据上述任何实施方式定义的多肽。
在本公开的第五方面，进一步提供了一种载体，其包含如上所述的多核苷酸。
在本公开的第六方面，进一步提供了一种宿主细胞，其包含如上所述的载体。
在本公开的第七方面，进一步提供了一种用于产生上述多肽的方法。所述方法包括以下步骤：
S100：在允许如上所定义的多核苷酸或其进一步包含可去除标签的前体的表达的条件下培养如上所述的宿主细胞；以及
S200：从所述宿主细胞中收集和纯化所述多肽或其所述前体。
根据所述方法的一些实施方式，所述多肽在所述第二片段中的可缀合残基处与功能部分缀合，并且所述方法在从所述宿主细胞中收集和纯化所述多肽的步骤S200之后进一步包括以下步骤：
S300：将所述功能部分与所述多核苷酸缀合。
根据所述方法的一些实施方式，所述宿主细胞是大肠杆菌(E.coli)，所述载体包含大肠杆菌相容性载体，并且由所述载体中的所述多核苷酸编码的所述多肽经密码子优化以用于大肠杆菌表达。
根据所述方法的一些实施方式，从所述宿主细胞中收集和纯化所述多肽的步骤S200可以包括以下子步骤：
S210：收集所述多肽的前体；
S220：允许所述多肽的所述前体重折叠；
S230：处理所述多肽的经重折叠的前体以去除所述标签，从而获得所述多肽；以及
S240：纯化所述多肽。
根据所述多肽生产方法的一些实施方式，所述方法进一步包括将经纯化的多肽与所述功能部分缀合。在某些实施方式中，要与所述多肽缀合的所述功能部分是(Ac-2XADO-EDA-CO-CH2-*)。在整个本公开中，冠词“一(a/an)”和“所述”在本文中用于指一个(种)或多于一个(种)(即，至少一个(种))所述冠词的语法对象。举例来说，“多肽”是指一种多肽或多于一种多肽。
在本申请中出现一系列叙述的数值的所有情况下，应理解，任何叙述的数值可以是数值范围的上限或下限。应进一步理解，本发明涵盖所有此类数值范围，即，具有数值上限和数值下限的组合的范围，其中上限和下限中的每一者的数值可以是本文中叙述的任何数值。本文所提供的范围理解为包括范围内的所有值。例如，1-10理解为包括所有值1、2、3、4、5、6、7、8、9和10，以及适当时分数值。类似地，由“至少”限定的范围理解为包括提供的下限值和所有更高的数字。
如本文所用，术语“近似”、“约”、“大约”等理解为包括在平均值的三个标准差内或在具体技术中的标准公差范围内。在某些实施方式中，约理解为不超过0.5的变化。
除非上下文另外明确指示，否则术语“或”在本文中包括地使用以意指术语“和/或”且可与所述术语互换使用。
除非另有说明，否则如“包含/包括(comprise/comprising)”、“含有(contain/containing)”等术语应解释为开放式术语(即，意指“包括但不限于”)。
术语“包含/包括”在本文中用以意指短语“包括但不限于”且可与所述短语互换使用。类似地，“如”在本文中用以意指短语“如但不限于”且可与所述短语互换使用。
术语“基本上由……组成”暗示排除所有、大部分或全部但可忽略量的其它要素，或其允许未明确叙述的要素，但排除在现有技术中发现或影响基本或新颖特性的要素。当多肽称为“基本上由”氨基酸序列“组成”时，这意味着多肽主要由所述氨基酸序列构成，在多肽的一端或两端具有不超过10个(例如不超过6、5、4、3、2或1个)另外的氨基酸残基。
附图说明
图1A和1B展示了根据本公开的两个不同实施方式的多肽。
图2A和2B示出了分子MLC#9、MLC#10、MLC#14、对照#6和参比化合物YH双(YH-dual)的体外FGF21活性。
图3A和3B示出了分子对照#2、对照#6、MLC#9和MLC#10对DIO大鼠的体重减轻(图3A)和食物摄入抑制(图3B)的功效。
图4A至4L示出了分子MLC#9、MLC#14、MLC#16和MLC#17以及参比化合物索马鲁肽(semaglutide)、YH双和替西帕肽(Tirzepatide)对DIO小鼠的体重减轻(图4A)、血糖控制(图4B)、血浆中的甘油三酯(图4C)、LDL-C(图4D)、总胆固醇(图4E)和ALT(图4F)浓度降低和脂肪重量(图4G)和肝脏重量(图4H)降低，以及肝脏TG(图4I)、肝脏TC(图4J)和胰岛素敏感性(图4K)的改善和脂联素水平的升高(图4L)的功效。
图5A至5M示出了与参比化合物索马鲁肽、YH双和替西帕肽相比，分子MLC#14和MLC#16在不同剂量下对DIO小鼠的体重减轻(图5A)、血糖控制(图5B)、血浆中的甘油三酯(图5C)、LDL-C(图5D)、总胆固醇(图5E)、ALT(图5F)和AST(图5G)浓度降低和脂肪重量(图5H)和肝脏重量(图5I)降低，以及肝脏TG(图5J)、肝脏TC(图5K)和胰岛素敏感性(图5L)的改善和脂联素水平的升高(图5M)的功效。
图6A至6H示出了与参比化合物索马鲁肽相比，分子MLC#16、MLC#19、MLC#6和MLC#23在不同剂量下对血浆中的血清甘油三酯(图6C)、LDL-C(图6D)和总胆固醇(图6E)浓度和脂肪重量(图6F)和肝脏重量(图6G)的降低以及肝脏TG的改善(图6H)的功效。
图7示出了本公开中公开的所有氨基酸序列。
具体实施方式
以下对本发明的描述仅旨在说明本发明的各种实施方式。因此，所论述的具体修改不应被解释为对本发明范围的限制。对本领域的技术人员将显而易见的是，可以在不脱离本发明的范围的情况下作出各种等效物、变化和修改，并且应理解，此类等效实施方式将包括在本文中。本文引用的所有参考文献，包括出版物、专利和专利申请，均以全文引用的方式并入本文中。
定义
术语“蛋白质”、“肽”和“多肽”在本文中可互换使用，并且是指通过如肽键等共价键连接的氨基酸残基的聚合物。如本文所提供的蛋白质或多肽可以包含天然存在的氨基酸残基或非天然氨基酸残基，或两者。本文所提供的多肽、肽和蛋白质可以包含任何合适长度的氨基酸残基，例如长度为至少3、4、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000或更多个氨基酸残基。
如本文所用，术语“天然存在的”氨基酸残基是指在天然蛋白质或肽中发现的氨基酸残基，如果其结构允许D和L立体异构体形式，则均呈此类立体异构形式。天然存在的氨基酸残基的实例包括但不限于20种标准氨基酸，包括甘氨酸(Gly或G)、丙氨酸(Ala或A)、缬氨酸(Val或V)、亮氨酸(Leu或L)、异亮氨酸(Ile或I)、丝氨酸(Ser或S)、半胱氨酸(Cys或C)、苏氨酸(Thr或T)、蛋氨酸(Met或M)、脯氨酸(Pro或P)、苯丙氨酸(Phe或F)、酪氨酸(Tyr或Y)、色氨酸(Trp或W)、组氨酸(His或H)、赖氨酸(Lys或K)、精氨酸(Arg或R)、天冬氨酸(Asp或D)、谷氨酸(Glu或E)、天冬酰胺(Asn或N)和谷氨酰胺(Gln或Q)，以及其天然类似物，如刀豆氨酸、吡咯赖氨酸(PYL)、硒代半胱氨酸、吡咯啉-羧基-赖氨酸(PCL)、肌氨酸、β-丙氨酸、磷酸丝氨酸、γ-羧基谷氨酸和鸟氨酸。呈D立体异构体的天然存在的氨基酸残基的实例包括例如D-天冬氨酸、D-丝氨酸、D-半胱氨酸、D-丙氨酸、D-谷氨酸等。
“氨基酸类似物”是指具有与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构(即，与氢、羧基、氨基以及R基团结合的碳)的化合物，例如高丝氨酸、正亮氨酸、蛋氨酸亚砜、蛋氨酸甲基锍。此类类似物可以具有经修饰的R基团(例如，正亮氨酸)或经修饰的肽主链，但基本化学结构将保持与天然存在的氨基酸相同。
如本文所用，“非天然”氨基酸残基是指未在自然界中发现的任何氨基酸残基，包括但不限于经修饰的氨基酸残基和/或氨基酸模拟物，所述氨基酸模拟物不是已知天然存在的氨基酸中的一者，但以类似于天然存在的氨基酸的方式起作用。经修饰的氨基酸或模拟物可以通过添加化学实体(如碳水化合物基团、磷酸基、法呢基、异法呢基、脂肪酸基和用于缀合的接头)、官能化或其它修饰等来产生。非天然氨基酸也可以指代通过化学合成制造的氨基酸。示例性非天然氨基酸包括但不限于2-氨基异丁酸(Aib)、咪唑-4-乙酸盐(IA)、咪唑丙酸(IPA)、a-氨基丁酸(Abu)、叔丁基甘氨酸(Tle)、3-氨基甲基苯甲酸、邻氨基苯甲酸、去氨基-组氨酸(缩写为去氨基His，替代名称为咪唑丙酸，缩写为lmpr)、氨基酸的β类似物如β-丙氨酸、2-氨基-组氨酸、β-羟基-组氨酸、同型组氨酸、Nα-乙酰基-组氨酸、α-氟-甲基-组氨酸、a-甲基-组氨酸、α,α-二甲基-谷氨酸、m-CF3-苯丙氨酸、α,β-二氨基丙酸(缩写Dap)、3-吡啶基丙氨酸、2-吡啶基丙氨酸或4-吡啶基丙氨酸、(1-氨基环丙基)羧酸、(1-氨基环丁基)-羧酸、(1-氨基环戊基)羧酸、(1-氨基环己基)羧酸、(1-氨基环庚基)羧酸和(1-氨基环辛基)羧酸。将非天然氨基酸引入到融合多肽、多肽片段和/或多肽复合物中可以通过以下中描述的技术实现：Wang等人,《科学(Science)》292:498-500,2001；Deiters等人,《美国化学会志(J Am Chem Soc)》125:1 1782-1 1783,2003；Wang和Schultz,《科学》301:964-967,2003；Zhang等人,《科学》303:371-373,2004或美国专利第7,083,970号。简单来说，这些表达系统中的一些涉及定点诱变以将终止密码子(如琥珀(UAG)、赭石(UAA)和蛋白石(UGA)密码子)引入到编码本公开的融合多肽的开放阅读框中。其它密码子，如四碱基密码子(例如AGGA、AGGU、CGGU、CGCU、CGAU、CCCU、CUCU、CUAU和GGGU)、五碱基密码子、六碱基密码子等也可以引入非天然氨基酸的表达系统中。然后将此类表达载体引入到可利用对引入的终止密码子或其它密码子具特异性且携带所选非天然氨基酸的tRNA的宿主中。
当关于氨基酸序列(例如，肽、多肽或蛋白质)使用时，术语“融合”或“融合的”是指例如通过化学键合或重组手段将两个或更多个氨基酸序列组合成天然不存在的单一氨基酸序列。融合氨基酸序列可以通过两个编码多核苷酸序列的遗传重组产生，并且可以通过将含有重组多核苷酸的构建体引入到宿主细胞中的方法表达。
“序列同一性百分比(％)”定义为在比对序列并在必要时引入空位以实现最大数目的相同氨基酸(或核酸)之后，候选序列中的氨基酸(或核酸)残基与参比序列中的氨基酸(或核酸)残基相同的百分比。换句话说，氨基酸序列(或核酸序列)的序列同一性百分比(％)可以通过将相对于其比较的参考序列相同的氨基酸残基(或碱基)的数目除以候选序列或参比序列中氨基酸残基(或碱基)的总数(以较短者为准)来计算。氨基酸残基的保守取代不视为相同残基。可以例如使用公开可用的工具如BLASTN、BLASTp(可在美国国家生物技术信息中心(U.S.National Center for Biotechnology Information，NCBI)的网站上获得，还参见Altschul S.F.等人,《分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)》,215:403–410(1990)；Stephen F.等人,《核酸研究(Nucleic Acids Res.)》,25:3389–3402(1997))、ClustalW2(可在欧洲生物信息研究所(European Bioinformatics Institute)的网站上获得，还参见Higgins D.G.等人,《酶学方法(Methods inEnzymology)》,266:383-402(1996)；LarkinM.A.等人,《生物信息学(Bioinformatics)》(英国牛津(Oxford,England)),23(21):2947-8(2007))以及ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件来实现用于确定氨基酸(或核酸)序列同一性百分比的比对。本领域技术人员可以使用由所述工具提供的默认参数或可以根据比对的需要适当定制参数，例如通过挑选合适的算法。
在一个方面，本公开提供了一种多肽，其基本上是包含两个或三个功能结构域的融合多肽/蛋白，并且每两个相邻的功能结构域通过接头可操作地连接。任选地，融合多肽/蛋白可以被缀合。
图1A和图1B展示了本公开中提供的多肽的两个主要实施方式。如图1A所示，多肽001A的第一实施方式在N末端到C末端的方向上包含通过第一接头10连接的第一片段100和第二片段200。第一片段100基本上包含能够与如人血清白蛋白(HSA)等血清白蛋白结合的纳米抗体结构域。第二片段200包含生物活性FGF21结构域，所述结构域基本上包括FGF21的功能形式，并且根据本公开的某些具体实施方式，包含与SEQ ID NO:1具有至少90％序列同一性，同时基本上保留其生物活性的氨基酸序列。
任选地，除了第一片段100中的纳米抗体结构域和第二片段200中的FGF21结构域之外，所述多肽可以进一步包含又另一个功能结构域。如图1B所示，除了如图1A所示的第一实施方式中的第一片段100和第二片段200之外，多肽001B的该第二实施方式进一步通过第一片段100的N末端包含第三片段300。第三片段300包含另外的功能结构域，所述功能结构域可以发挥与第二片段200中的FGF21结构域相加或协同的生物活性。第一片段100和第三片段300通过第二接头20连接。根据本公开的一些实施方式，第三片段300中的该另外的功能结构域是生物活性胰高血糖素样肽-1(GLP-1)结构域，其基本上包括GLP-1的功能形式。根据一些实施方式，其包含与SEQ ID NO:28具有至少70％序列同一性，同时基本上保留其生物活性的氨基酸序列。
如本文所使用的，术语“功能形式”是指亲本分子的不同形式(如变体、片段/部分、融合体、衍生物和模拟物)，其尽管在氨基酸序列或化学结构中具有差异，但仍保留亲本分子的基本生物活性。如本文所使用的，“保留基本生物活性”的表述意指表现出亲本分子的生物活性的至少一部分(例如，不低于约20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％)或全部。亲本多肽的功能形式可以包括天然存在的变体形式和非天然存在的形式，如通过重组方法或化学合成获得的那些。功能形式可以含有非天然氨基酸残基。
本文使用的术语“变体”是指与亲本多肽具有至少70％序列同一性并保留亲本多肽的至少部分功能的多肽。变体与亲本多肽的不同之处可以在于一个或多个氨基酸残基。例如，变体可以具有亲本多肽的一个更多氨基酸残基的取代、添加、缺失、插入或截短。
如本文使用的术语“片段”或“部分”是指任何长度的亲本多肽的部分序列。片段仍然可以保留亲本多肽的至少部分功能。
如本文所用，术语“衍生物”是指化学修饰的多肽或融合多肽，其中一个或多个明确限定的取代基已共价连接到多肽或融合多肽的一个或多个特定氨基酸残基。示例性化学修饰可以是例如一个或多个氨基酸的烷基化、酰化、酯化、酰胺化、磷酸化、糖基化、标记、甲基化，或与一个或多个部分的缀合。
如本文所用，术语“模拟物”是指充当氨基酸、肽、多肽或融合多肽的替代物的分子结构。例如，如本文所用，氨基酸模拟物可以是合成结构(已知或未知)，其可以为或可以不为氨基酸，但保留亲本氨基酸的功能特征，同时氨基酸模拟物的结构不同于亲本氨基酸的结构。实例包括酰胺的甲基丙烯酰基或丙烯酰基衍生物、β-亚氨基酸、γ-亚氨基酸、δ-亚氨基酸(如哌啶-4-甲酸)等。
FGF21结构域
本文公开的多肽包含FGF21结构域。例如，本文公开并在图1A和1B中展示的多肽的第一实施方式和第二实施方式中的每一个实施方式包含FGF21结构域。
本文使用的术语“FGF21”指代“成纤维细胞生长因子21”并且是其简称，并且旨在广泛涵盖所有功能形式，包括天然人FGF21，以及其功能变体、片段、融合体、衍生物或模拟物。天然人FGF21由209个氨基酸残基组成(Uniprot数据库，访问号Q9NSA1)，其中氨基酸残基1-28是信号多肽，并且氨基酸残基29-209是181个残基的成熟多肽。本公开中提供的表达“生物活性FGF21结构域”是指FGF21的功能形式，所述功能形式可以是成熟多肽，或其功能变体、片段、融合体、衍生物或模拟物。人FGF21的成熟多肽以SEQ ID NO:1的形式包括在本文中。如本文所用，FGF21中残基的编号参考SEQ ID NO:1的序列，所述序列以位置1处的His和位置181处的Ser开始。
FGF21的成熟多肽的功能形式能够以与天然人FGF21的成熟多肽的水平相当或不小于所述水平的约20％(或不小于所述水平的30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％)的水平激活FGF21受体。FGF21受体的激活可以产生生物活性，例如，激活脂肪细胞中葡萄糖摄取的能力，降低血糖和甘油三酯水平的能力，或降低体重的能力(Tezze C等人,《生理学前沿(Front Physiol.)》2019,10:419)。FGF21的成熟多肽的许多功能形式在本领域中是已知的，例如但不限于在WO 2019043457A2、WO 2018088838A1、WO 2018039081A1、WO2017220706A1、WO 2017180988A2、WO 2017116207A1、WO 2017093465、WO 2017059371A1、WO2016102562A1、WO 2016065326A、WO 2013173158A1、WO 2013052311A1、WO 2013033452A2、WO 2012066075A1、WO 2012059873A2、WO 2012010553A1、WO 2011140086A2、WO2010084169A2、WO 2010065439A1、WO 2008121563A2、WO 2006028595A2、WO 2006028714A1、WO 2005113606A2、WO 2016102562A中公开的那些，所述文献的公开内容整体并入本文。
在某些实施方式中，本文提供的FGF21结构域包含与SEQ ID NO:1具有至少90％序列同一性，同时保留其基本生物活性的氨基酸序列。
在某些实施方式中，FGF21结构域包含相对于SEQ ID NO:1不多于12、11、10、9、8、7个氨基酸突变(例如取代、插入或缺失)，同时保留SEQ ID NO:1的基本生物活性。在某些实施方式中，FGF21结构域包含SEQ ID NO:2-14、16-19、89-92和102-105的氨基酸序列。
在某些实施方式中，FGF21包含一个或多个突变。在某些实施方式中，一个或多个突变包含保守取代。在某些实施方式中，一个或多个突变所位于的位置选自由以下组成的组的位置：相对于SEQ ID NO:1的121、168、171和180。
在某些实施方式中，FGF21结构域中的一个或多个突变选自N121Q、M168L、P171G和A180E，或其任何组合。例如，本文公开的多肽中的FGF21结构域可以任选地含有四个突变中的一个突变、四个突变中的两个突变、四个突变中的三个突变或这些突变中的四个突变。
在某些实施方式中，FGF21结构域包含相对于SEQ ID NO:1的突变的组合，所述突变选自下组：
1)N121Q；
2)M168L；
3)A180E；
4)N121Q和M168L；
5)N121Q和A180E；
6)M168L和A180E；
7)N121Q、P171G和A180E；
8)N121Q、M168L和P171G；
9)M168L、P171G和A180E；以及
10)N121Q、M168L、P171G和A180E。
在某些实施方式中，FGF21结构域可以包含以下中所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:2(N121Q)、SEQ ID NO:3(M168L)、SEQ ID NO:4(A180E)、SEQ ID NO:5(N121Q、M168L和A180E)、SEQ ID NO:89(N121Q和M168L)、SEQ ID NO:90(N121Q和A180E)、SEQ ID NO:91(M168L和A180E)或SEQ ID NO:14(N121Q、M168L、P171G和A180E)。
在某些实施方式中，所述多肽中的FGF21结构域进一步包含与功能部分缀合的可缀合残基或至多一个可缀合残基。
如本文所用，术语“可缀合残基”是指多肽内特定位置处的氨基酸残基，所述残基不仅具有能够与化学部分化学或酶促缀合的官能团，而且其在多肽中的位置允许其易于在所述特定官能团的缀合反应中进行此类缀合。如本文所用，“缀合”是指将两个分子接合在一起以形成一个物理实体的反应。例如，可以在缀合中形成连接两个分子的共价键。可缀合残基可以是天然氨基酸残基、非天然氨基酸残基、经修饰的氨基酸残基或氨基酸模拟物。可缀合残基的实例包括但不限于赖氨酸、半胱氨酸或非天然氨基酸残基。
技术人员将理解，残基是否为可缀合残基将取决于给定缀合反应和/或待缀合的官能团。例如，如果要缀合的官能团是硫醇基和/或缀合反应对硫醇基是特异性或选择性的，则赖氨酸(即在侧链中没有官能硫醇基)无论其位置如何都不会是可缀合残基，而不形成二硫键(无论是链内键还是链间键)的未配对半胱氨酸残基可以是可缀合残基。
在某些实施方式中，所述多肽包括对硫醇基具有特异性或选择性的缀合反应(例如顺丁烯二酰亚胺反应或用于二硫键形成的反应)的可缀合残基。当提及氨基酸残基时，表述“可缀合”旨在意指多肽中的特定位置处的残基对于缀合足够可接近。例如，作为二硫桥键的一部分的半胱氨酸残基在本公开中不是可缀合残基。
在某些实施方式中，可缀合残基是半胱氨酸残基，优选地不是二硫键的一部分的游离半胱氨酸残基。
在某些实施方式中，本文提供的多肽的FGF21结构域中的可缀合残基CR可以位于C末端片段内相对于SEQ ID NO:1从FGF21结构域的例如位置169跨越到位置181的位置处。进一步任选地，可缀合残基可以位于选自下组的位置处：相对于SEQ ID NO:1的位置169、170、171、172、173、174、180和181。在不希望受任何理论束缚的情况下，本发明人发现FGF21结构域的C末端片段处的缀合减少了FGF21结构域的C末端降解。
在某些实施方式中，所述多肽中的FGF21结构域具有以下突变的组合：1)N121Q和M168L，2)N121Q、M168L和P171G，3)N121Q、M168L和A180E，或4)N121Q、M168L、P171G和A180E，并且进一步包含在相对于SEQ ID NO:1的位置169、170、171、172、173、174或180、181处的可缀合残基(例如半胱氨酸残基)。
在某些实施方式中，所述多肽中的FGF21结构域具有N121Q和M168L的突变组合，或N121Q、M168L和P171G的组合突变，并且进一步包含在相对于SEQ ID NO:1的位置180处的可缀合残基(例如半胱氨酸残基)。
在某些实施方式中，所述多肽中的FGF21结构域具有N121Q、P171G和M168L的突变组合，或N121Q、M168L、P171G和A180E的组合突变，并且进一步包含在相对于SEQ ID NO:1的位置处的可缀合残基，所述可缀合残基列出如下：在位置169、位置170、位置172、位置173或位置174处引入的半胱氨酸残基(例如通过取代)。
在某些实施方式中，所述多肽中的FGF21结构域具有氨基酸序列，所述氨基酸序列包含具有在以下位置处引入的半胱氨酸残基：位置169(例如SEQ ID NO:6)、位置170(例如SEQ ID NO:7)、位置171(例如SEQ ID NO:8)、位置172(例如SEQ ID NO:9)、位置173(例如SEQ ID NO:10)、位置174(例如SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:92)、位置180(例如SEQ ID NO:12)或位置181(例如SEQ ID NO:13)。在某些实施方式中，除了一个或多个氨基酸残基突变之外，FGF21包含SEQ ID NO:2-5、89-91、14和102-105的氨基酸序列，每个氨基酸残基突变位于选自以下的位置：相对于SEQ ID NO:1的位置121、168、171和180。
在某些实施方式中，所述多肽中的FGF21结构域具有在位置171(例如SEQ ID NO:14)处引入的G。在不希望受任何理论束缚的情况下，本发明人发现在FGF21结构域中引入171G还可用于减少FGF21结构域的C末端降解。
在某些实施方式中，所述多肽中的FGF21结构域具有N121Q、P171G和M168L的突变组合，或N121Q、M168L、P171G和A180E的组合突变，并且进一步包含在相对于SEQ ID NO:1的位置处的可缀合残基，所述可缀合残基列出如下：在位置172、位置173、位置174处引入的T，其中所述位置是相对于SEQ ID NO:1的；或在位置170或位置174处引入的N，其中所述位置是相对于SEQ ID NO:1的。
在某些实施方式中，所述多肽中的FGF21结构域具有相对于SEQ ID NO:1在位置172(例如SEQ ID NO:16)或位置173(例如SEQ ID NO:17)处引入的T；或在位置170(例如SEQID NO:18)或位置174(例如SEQ ID NO:19)处引入的N。在某些实施方式中，所述多肽中的FGF21结构域具有选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:16-19。
FGF21结构域上的功能部分
在图1A和图1B所示的多肽的第一实施方式和第二实施方式中，多肽001A和001B中的任一种或两种多肽可以任选地在第二片段200(即FGF21结构域)中的可缀合残基CR(如两个图中的“*”所示)处与功能部分800缀合，从而形成多肽缀合物。在某些其它实施方式中，例如当所述多肽具有在位置171处引入的G时，所述多肽不与功能部分缀合。
如本文所用，术语“缀合物”是指两个或更多个分子接合在一起以形成一个物理实体导致的化合物。例如，根据某些实施方式，本公开的多肽可以形成多肽缀合物，所述多肽缀合物基本上是由多肽和功能部分接合在一起产生的化合物。分子(例如功能部分和多肽)可以通过共价键、非共价键、接头、化学修饰或蛋白融合或通过本领域技术人员已知的任何手段连接在一起。优选地，分子可通过共价键连接在一起。连接可以是永久性的或可逆的。在一些实施方式中，可以包含某些可切割或不可切割接头。
本文中使用的术语“功能部分”是指可以在功能上改变生物、药代动力学(PK)、药效学(PD)性质(例如，增强生物活性、增加体外稳定性、增加体内半衰期或增强与靶受体的结合等)的部分。与FGF2结构域缀合的功能部分可以任选地包含糖基部分或合成化学部分。
任选地，功能部分800可以包含合成化学部分，并且可缀合残基CR可以是可以与合成化学部分缀合的引入的残基。
根据一些实施方式，可缀合残基CR可以是在上述相对于SEQ ID NO:1的位置169、170、171、172、173、174、180和181中的任何位置中引入的半胱氨酸残基。在本文中，合成化学部分可以任选地包含*-X-Y-Z的结构，其中X、Y和Z通过键相互连接，并且X的*端连接到多肽上的可缀合残基。在本文中，X可以是Y可以是并且Z可以是/>其中位置α连接到位置α'，位置β连接到位置β'。在本文中，R1可以是氢或-COOH；d可以是1、2或3；a可以是1、2或3；b可以是1、2或3；c可以是1或2；并且d可以是1、2或3；并且e可以是1、2或3。
根据一些实施方式，合成化学部分可以是具有以下结构的Ac-2XADO-EDA-CO-CH2*，其中*端连接到多肽上的可缀合半胱氨酸残基：
在FGF21结构域的每一个上述实施方式中，所述结构域包含在如上指示的相应位置(所述位置的序列如SEQ ID NO:6-13和92中所示)处引入的半胱氨酸残基，如Ac-2XADO-EDA-CO-CH2-*等合成化学部分可以在引入的半胱氨酸残基处缀合(例如通过取代)，从而获得携带合成化学部分的多肽缀合物。
在携带缀合的功能部分的多肽中，功能部分800可以任选地包含糖基部分，并且对应地，可缀合残基CR可以是可糖基化的引入的残基(即可以被糖基化)，所述引入的残基可以是相对于SEQ ID NO:1在位置172或位置173处引入的T，或者在位置170或位置174处引入的N残基。
在FGF21结构域的每一个上述实施方式中，所述结构域包含在如上指示的相应位置(所述位置的序列如SEQ ID NO:16-19中所示)处引入的T或N，可以在引入的半胱氨酸残基处缀合糖基部分，从而获得携带糖基部分的多肽缀合物。
在某些实施方式中，FGF21结构域包含在相对于SEQ ID NO:1的位置171处引入的G，并且不与功能部分缀合。在某些实施方式中，此FGF21结构域可以包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列。
纳米抗体结构域
本文公开并在图1A和1B中展示的多肽的第一实施方式和第二实施方式中的每一个实施方式包含纳米抗体结构域。
本文使用的术语“纳米抗体”被认为可与“单结构域抗体”互换，所述“单结构域抗体”是指含有重链的单个可变结构域或轻链的单个可变结构域的抗体片段。纳米抗体含有三个互补决定区(CDR)。在某些实施方式中，纳米抗体能够与特异性抗原(例如血清白蛋白)结合。
本文使用的术语“血清白蛋白”是指在脊椎动物血液中发现的白蛋白(一种球状蛋白)。血清白蛋白由肝脏产生，溶解在血浆中，并且是哺乳动物中最丰富的血液蛋白。血清白蛋白的半衰期通常为约三周，其主要受新生儿Fc受体(FcRn)的调节。FcRn通过以高亲和力与血清白蛋白结合并将其从溶酶体途径转移，使其返回细胞外室，从而保护血清白蛋白免受细胞内降解。在一些实施方式中，血清白蛋白选自人血清白蛋白(HSA)、食蟹猴血清白蛋白和小鼠血清白蛋白。在一些实施方式中，本文提供的血清白蛋白是HSA。
本文使用的术语“抗体”包含与特定抗原结合的任何免疫球蛋白。常规抗体(例如，来自人或小鼠的抗体)包含两条重(H)链和两条轻(L)链。重链被分类为α、δ、ε、γ和μ，每条重链由可变结构域(VH结构域)和第一恒定区、第二恒定区、第三恒定区和任选的第四恒定区(分别为CH1、CH2、CH3、CH4)组成；轻链被分类为λ或κ，而每条轻链由可变结构域(VL结构域)和恒定结构域组成。抗体呈“Y”型，其中Y的茎部由通过二硫键结合在一起的两条重链的第二恒定结构域和第三恒定结构域组成。Y的每个臂包含与单条轻链的可变结构域和恒定结构域结合的单条重链的可变结构域和第一恒定结构域。轻链和重链的可变结构域负责与抗原结合。两条链中的可变结构域通常包含三个称为互补决定区(CDR，即轻链或重链的CDR1、CDR2和CDR3)的高变区。本文所公开的抗体和抗原结合片段的CDR边界可以通过Kabat、IMGT、Chothia或Al-Lazikani规则来定义或鉴定(Al-Lazikani,B.,Chothia,C.,Lesk,A.M.,《分子生物学杂志》,273(4),927(1997)；Chothia,C.等人,《分子生物学杂志》12月5日；186(3):651-63(1985)；Chothia,C.和Lesk,A.M.,《分子生物学杂志》,196,901(1987)；Chothia,C.等人,《自然》.12月21-28日；342(6252):877-83(1989)；Kabat E.A.等人,《具有免疫学意义的蛋白质的序列(Sequences of Proteins of immunologicalInterest)》,第5版马里兰州贝塞斯达的国立卫生研究院公共卫生局(Public HealthService,National Institutes ofHealth,Bethesda,Md.)(1991)；Marie-Paule Lefranc等人,《发育与比较免疫学(Developmental and Comparative Immunology)》,27:55-77(2003)；Marie-Paule Lefranc等人,《免疫组研究(Immunome Research)》,1(3),(2005)；Marie-Paule Lefranc,《B细胞分子生物学(Molecular Biology of B cells)》(第二版),第26章,481-514,(2015))。所述三个CDR插入被称为框架区(FR，即轻链或重链的FR1、FR2、FR3和FR4)的侧接段之间，所述框架区比CDR更高度保守，并形成支架以支撑高度可变环。重链和轻链的恒定结构域不参与抗原结合，但表现出各种效应子功能。常规抗体基于其重链的恒定结构域的氨基酸序列进行分类。
单个可变结构域可以衍生自骆驼科抗体的可变结构域(VHH结构域)或软骨鱼抗体的可变结构域(VNAR结构域)。骆驼科抗体和软骨鱼抗体都天然缺乏轻链而由一对重链组成。可替代地，单个可变结构域可以衍生自常规抗体(例如，来自人或小鼠)重链的可变结构域(VH结构域)或普通抗体轻链的可变结构域(VL结构域)。经考虑，单结构域抗体的大小相当小，例如，具有不超过25kD、不超过20kD、不超过15kD或不超过10kD的分子量。
应注意，术语“纳米抗体”或“单结构域抗体”在本文中以其最广泛的意义使用，并不限于特定的生物来源或特定的制备方法。例如，可以例如通过以下来获得单结构域抗体：(1)通过分离天然存在的重链抗体的VHH结构域或VNAR结构域；(2)通过编码天然存在的VHH结构域或VNAR结构域的核苷酸序列的表达；(3)通过天然存在的VHH结构域或VNAR结构域的“人源化”(如下所述)，或通过编码此类人源化VHH结构域或VNAR结构域的核酸的表达；(4)通过来自任何动物物种，特别是如人类等哺乳动物物种的天然存在的VH结构域的“骆驼化”，或通过编码此类骆驼化VH结构区的核酸的表达；5)使用合成或半合成技术来制备蛋白质、多肽或其它氨基酸序列；和/或(6)通过前述的任何组合。用于执行上述操作的合适方法和技术对于本领域技术人员来说是显而易见的。
在一些实施方式中，本文所述的单结构域抗体包含来源于在骆驼科物种(例如骆驼、单峰骆驼、羊驼和原驼)中培育的抗体的VHH结构域。包含VHH结构域的单结构域抗体是高度可溶性的并且对热、pH、蛋白酶和其它变性剂或条件是高度稳定的。
在一些实施方式中，第一多肽片段包含一种或多种能够与血清白蛋白特异性结合的单结构域抗体。
涉及结合分子(例如抗体)与其结合配偶体(例如抗原)的相互作用的术语“结合特异性”、“特异性结合”或“特异性结合”是指所述相互作用取决于结合配偶体上特定结构(例如抗原决定簇或表位)的存在。换句话说，即使当结合配偶体存在于其它分子或生物体的混合物中时，所述抗体也优先结合或识别所述结合配偶体。与抗原免疫特异性结合的抗体或其片段可以与携带相同表位的相关抗原具有交叉反应性。“结合特异性”通常是针对非特异性背景结合来测量的。通常，当抗体与靶抗原的结合为背景结合的至少10倍时，所述抗体被认为是特异性的。
本文所设想的血清结合单结构域抗体可以与血清白蛋白结合或以其它方式与血清白蛋白缔合，其方式使得不会(显著)减少或抑制所述血清白蛋白分子与FcRn的结合(即，与当单结构域抗体未与之结合时所述血清白蛋白分子与FcRn的结合相比)。在本发明的此方面，“不显著减少或抑制”是指血清白蛋白与FcRn的结合亲和力(如使用合适的测定，如SPR来测量的)降低不超过50％，优选地降低不超过30％，甚至更优选地降低不超过10％，如降低不超过5％，或基本上根本不降低。在此方面，“没有显著减少或抑制”也可以是指血清白蛋白分子的半衰期没有显著减少(例如，如使用本身已知的合适技术测量的，减少不超过50％，优选地减少不超过30％，甚至更优选地减少不超过10％，如减少不超过5％，或基本上根本不减少)。在一些实施方式中，单结构域抗体能够与血清白蛋白上的氨基酸残基结合，所述氨基酸残基不参与血清白蛋白与FcRn的结合。
在一些实施方式中，本文所述的单结构域抗体与选自HSA、食蟹猴血清白蛋白和小鼠血清白蛋白的血清白蛋白结合。在一些实施方式中，对小鼠血清白蛋白的结合亲和力约弱于对人或食蟹猴血清白蛋白的结合亲和力。在一些实施方式中，单结构域抗体与HSA特异性结合。
在一些实施方式中，本文所述的单结构域抗体以足够的结合亲和力与血清白蛋白结合。本文使用的术语“亲和力”是指免疫球蛋白分子(即，抗体)或其片段与抗原之间非共价相互作用的强度。亲和力可以使用“Kd”值用数字表示。通常，较低的Kd值对应于较强的结合。Kd可以通过使用本领域已知的任何常规方法来测定，包括但不限于放射免疫测定(RIA)、酶联免疫吸附测定(ELISA)、表面等离子体共振(SPR)法、微尺度热泳方法、HPLC-MS方法和流式细胞术(如FACS)方法。在一些实施方式中，此处公开的抗体与特定抗原的Kd值为≤10-6M(例如≤5×10-7M、≤2×10-7M、≤10-7M、≤5×10-8M、≤2×10-8M、≤10-8M、≤5×10-9M、≤4×10-9M、≤3×10-9M、≤2×10-9M或≤10-9M)。
在某些实施方式中，本文提供的单结构域抗体能够以10-5M至1×10-12M或更小、10-7M至1×10-12M或更小、或10-8M至1×10-12M或更小的Kd值与HSA结合。在一些实施方式中，Kd不大于1×10-7M(例如，不大于5×10-7M、不大于2×10-7M、不大于10-7M、不大于5×10-8M、不大于2×10-8M、不大于10-8M、不大于5×10-9M、不大于4×10-9M、不大于3×10-9M、不大于2×10-9M或不大于10-9M)。
在一些实施方式中，本文提供的单结构域抗体是人源化抗体。本文所用的术语“人源化”是指单结构域抗体包括来源于非人动物的CDR和来源于人的FR区。人源化抗体多肽在其于人中降低的免疫原性方面是期望的。人源化抗体多肽在其可变区中是嵌合的，因为非人CDR序列被移植到人或基本上人FR序列。抗体多肽的人源化基本上可以通过用非人(如骆驼)CDR基因取代人免疫球蛋白基因中的对应的人CDR基因来进行(参见例如Jones等人(1986)《自然(Nature)》321:522-525；Riechmann等人(1988)《自然》332:323-327；Verhoeyen等人(1988)《科学(Science)》239:1534-1536)。
本领域已知能够以高亲和力与HSA特异性结合的各种单结构域抗体，如使用噬菌体显示分离的全人类结构域抗体、从骆驼科开发的VHH抗体和从软骨鱼开发的VNAR抗体，参见Zorzi,A等人,《药物化学通讯(Med Chem Commun)》,2019,10,1068。在以下中公开了示例性HSA结合性单结构域抗体：US8188223B2；US9067991B2；US9321832B2；PCT申请WO2008028977A2、WO 2008043822A2、WO 2020099871A1；G.Winter等人,《免疫学年鉴(Annu.Rev.Immunol.)》,1994,12,433–455.；L.J.Holt等人,《蛋白质工程、设计与选择(Protein Eng.,Des.Sel.)》,2008,21(5),283–288；A.Walker等人,《蛋白质工程、设计与选择》,2010,23(4),271–278；L.J.Goodall等人,《公共科学图书馆·综合(PLoS One)》,2015,10(9),e0137065；R.L.O'Connor-Semmes等人,《临床药理学与治疗学(Clin.Pharmacol.Ther.)》,2014,96(6),704–712；C.Read等人,《基础与临床药理学与毒理学(Basic Clin.Pharmacol.Toxicol.)》,2019,1–8；R.Adams等人,《单克隆抗体(mAbs)》,2016,8(7),1336–1346；E.Dave等人,《单克隆抗体》,2016,8(7),1319–1335；S.Steeland等人,《今日药物发现(Drug Discovery Today)》,2016,21(7),1076–1113；K.Coppieters等人,《关节炎与风湿病(Arthritis Rheum.)》,2006,54(6),1856–1866；M.Van Roy等人,《关节炎研究和疗法(Arthritis Res.Ther.)》,2015,17,135；C.McMahon等人,《自然结构与分子生物学(Nat.Struct.Mol.Biol.)》,2018,25(3),289–296；M.R.Muller等人,《单克隆抗体》,2012,4(6),673–685，所有这些文献都被考虑在本公开的范围内并通过引用并入。
在一些实施方式中，单结构域抗体包含VHH结构域。在一些实施方式中，VHH结构域是人源化的。
在一些实施方式中，VHH结构域包含互补决定区1(CDR1)、CDR2和CDR3，其中CDR1包含SEQ ID NO:20(SFGMS)的序列或其具有至多3、2或1个氨基酸突变的变体，CDR2包含SEQID NO:21(SISGSGSDTLYADSVKG)的序列或其具有至多3、2或1个氨基酸突变的变体，和/或CDR3包含SEQ ID NO:22(GGSLSR)的序列或其具有至多3个、2个或1个氨基酸突变的变体，其中VHH结构域保留了与血清白蛋白，任选地人血清白蛋白的结合特异性。
在一些实施方式中，VHH结构域包含：互补决定区1(CDR1)，所述CDR1包含SEQ IDNO:20的序列；CDR2，所述CDR2包含SEQ ID NO:21的序列；以及CDR3，所述CDR3包含SEQ IDNO:22的序列。
在一些实施方式中，VHH结构域包含：互补决定区1(CDR1)，所述CDR1由SEQ ID NO:20的序列组成；CDR2，所述CDR2由SEQ ID NO:21的序列组成；以及CDR3，所述CDR3由SEQ IDNO:22的序列组成。
在一些实施方式中，VHH结构域包含SEQ ID NO:23的序列或其变体，所述变体与SEQ ID NO:23具有至少70％(例如，至少75％、80％、85％、90％、95％、99％)同一性，其中所述变体保留了与血清白蛋白的结合特异性和/或亲和力。
在一些实施方式中，SEQ ID NO:23的变体相对于SEQ ID NO:23具有至多10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸突变。
在图1A所示的多肽的某些实施方式中，与血清白蛋白结合的纳米抗体结构域进一步包含连接到VHH结构域的N末端延伸部。在某些实施方式中，N末端延伸部包含SG、AG、S或A的氨基酸残基，并且因此可以包含选自SEQ ID NO:24-27的氨基酸序列。
在某些实施方式中，N末端延伸部包含标签，任选地可切割标签。在不希望被任何理论束缚的情况下，据信某种N末端延伸部可以用于表达和翻译后加工。
在某些实施方式中，与血清白蛋白结合的纳米抗体结构域不包含连接到VHH结构域的N末端延伸部。例如，VHH结构域可以连接到可切割标签，所述可切割标签在切割后不再存在于最终产物中。
在一些实施方式中，第一片段可以包含一个或多个与血清白蛋白结合的纳米抗体结构域。
GLP-1结构域
除了第二片段200中的上述FGF21结构域和第一片段100中的与血清白蛋白结合的纳米抗体结构域外，本文公开并在图1B中展示的多肽的第二实施方式还包含第三片段300，所述第三片段包含另外的功能结构域。
根据一些实施方式，所述另外的功能结构域包含生物活性GLP-1结构域。
如本文所用，术语“胰高血糖素样肽-1”或“GLP-1”旨在广泛涵盖天然GLP-1肽和其所有功能形式，如其功能变体、片段、融合体、衍生物和模拟物。
本文使用的术语“天然GLP-1肽”是指天然人胰高血糖素样肽-1(GLP-1(7-37))，其序列如SEQ ID NO:28中所示。GLP-1中残基的编号参考SEQ ID NO:28的序列，所述序列以位置7处的H残基开始，并以位置37处的G残基结束。
天然GLP-1肽的功能形式能够以与天然GLP-1肽的水平相当或不低于所述水平的约20％(或不低于所述水平的30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％)的水平激活GLP-1受体。GLP-1受体的激活通常启动信号转导通路，产生促胰岛素作用或如本领域中已知的其它生理效应。GLP-1肽的许多功能形式是本领域中已知的，例如但不限于利拉鲁肽(liraglutide)、索马鲁肽、杜拉鲁肽(dulaglutide)、阿必鲁肽(albiglutide)，以及WO2000055203A1、WO 98/08871、WO 2006/097537、WO 2007139589A1、WO 1998019698A1、WO2001098331A2、WO 2003040309A2、WO 2005000892A2、WO 2015000942A1、WO 2016083499A1中所公开的那些，所述文献的公开内容整体并入本文中。
在某些实施方式中，本文提供的GLP-1结构域包含与SEQ ID NO:28具有至少70％(例如至少71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％)序列同一性，同时保留SEQ ID NO:28的基本生物活性的氨基酸序列。
在某些实施方式中，GLP-1结构域相对于SEQ ID NO:28包含不多于9、8、7、6、5、4、3或2个取代，同时保留SEQ ID NO:28的基本生物活性。在某些实施方式中，GLP-1结构域相对于SEQ ID NO:28包含至少2、3、4、5、6、7、8或9个取代，同时保留SEQ ID NO:28的基本生物活性。
在某些实施方式中，GLP-1结构域进一步包含一个或多个突变。本领域的普通技术人员应了解，可以在本文所描述的任何多肽的序列中进行各种氨基酸取代，例如保守氨基酸取代，而不必定降低其活性。氨基酸取代的实例包括用L-氨基酸取代其对应的D-氨基酸，用半胱氨酸取代高半胱氨酸或具有含硫醇侧链的其它非天然氨基酸，用赖氨酸取代高赖氨酸、二氨基丁酸、二氨基丙酸、鸟氨酸或具有含氨基侧链的其它非天然氨基酸，或用丙氨酸取代正缬氨酸等。
已将各种取代引入到天然GLP-1肽中，并且已显示所述取代能够保留或甚至改善其生物活性。在某些实施方式中，GLP-1包含在选自下组的位置处的一个或多个突变：相对于SEQ ID NO:28的A8、G22、K34、R36和H7和或其任何组合。例如，据信在A8处的取代可用于防止DPP4在残基处的酶切，在G22处的取代是期望的以提高活性和溶解度，并且在R36处的取代可用于降低免疫原性。在某些实施方式中，GLP-1包含在选自下组的位置处的一个或多个突变：相对于SEQ ID NO:28的A8、G22、K26、K34和R36和或其任何组合。在这些位置处的取代的实例包括但不限于A8G、A8S、A8V、A8Aib、A8T、A8I、A8L、G22E、K26R、K34R、R36G或其任何组合，以及美国专利第8,273,854号中描述的取代，所述美国专利整体并入本文。在某些实施方式中，一个或多个另外的取代包括保守取代。
在某些实施方式中，GLP-1结构域包含A8的取代，所述取代选自下组：A8G、A8S、A8V、A8Aib、A8T和A8L。在某些实施方式中，GLP-1结构域包含G22E的取代。在某些实施方式中，GLP-1结构域包含R36G的n个取代。在某些实施方式中，GLP-1结构域包含K26的取代，所述取代为K26R。在某些实施方式中，GLP-1结构域包含K34的取代，所述取代为K34R。
在某些实施方式中，GLP-1包含选自下组的一个或多个取代或由其组成：A8G、K26R、K34R、G22E和R36G。在某些实施方式中，GLP-1包含选自由以下组成的组的一个或多个取代或由其组成：A8G、G22E和R36G。
在本公开中，提供了图1B中的第三片段300中的生物活性GLP-1结构域的至少以下实施方式：
(1)SEQ ID NO:28，表示GLP-1的野生型功能形式；
(2)SEQ ID NO:29，表示GLP-1的三取代功能形式，包含取代A8G、G22E和R36G；
(3)SEQ ID NO:31，表示GLP-1的四取代功能形式，包含取代A8G、G22E、K34R和R36G；
(4)SEQ ID NO:32，表示GLP-1的五取代功能形式，包含取代A8G、G22E、K26R、K34R和R36G；
(4)SEQ ID NO:33，表示GLP-1的五取代功能形式，包含取代A8G、G22E、K26R、K34R和R36K；以及
(5)SEQ ID NO:34，表示GLP-1的四取代功能形式，包含取代A8G、G22E、K26R和R36G。
应注意，除了GLP-1之外，如图1B所示的第三片段300的另外的功能结构域也可以可替代地包括以下的生物活性形式(即功能形式)：胰岛素、C肽、瘦素、胰高血糖素、胃泌素、胃抑制多肽(GIP)、胰淀素、降钙素、胆囊收缩素、肽YY、神经肽Y、骨形态发生蛋白-6(BMP-6)、骨形态发生蛋白-9(BMP-9)、胃泌酸调节素、催产素、胰高血糖素样肽-2(GLP-2)、鸢尾素、含III型纤连蛋白结构域的蛋白5(FNDC5)、爱帕琳肽、脂联素、Clq和肿瘤坏死因子相关蛋白(CTRP家族)、抵抗素、内脂素、网膜素、视黄醇结合蛋白-4(RBP-4)、肠高血糖素、血管生成素、白细胞介素-22(IL-22)、艾塞那肽-4或生长激素。
第一接头和/或第二接头
本文公开并在图1A和1B中展示的多肽的第一实施方式和第二实施方式中的每一个实施方式利用第一接头10连接第一片段100(包含能够与血清白蛋白结合的纳米抗体结构域)和第二片段200(包含生物活性FGF21结构域)，并且图1B中展示的多肽的第二实施方式利用第二接头20连接第一片段100和第三片段300(包含对FGF21结构域具有相加或协同作用的另外的生物活性功能结构域；例如GLP-1结构域)。
本文中使用的术语“接头”，如第一接头10和/或第二接头20，通常指“多肽接头”，所述“多肽接头”可以是任何合适的多肽，所述多肽能够与两个实体结合，从而形成一个分子，或者保持两个实体足够紧密地缔合，但基本上不干扰所述两个实体的相应的生物活性。
接头可以整合在所得的连接分子或结构中。在本文中，第一接头10可操作地分离纳米抗体结构域100和FGF21结构域200，而基本上不干扰所述两个功能结构域的相应的生物活性，并且第二接头20可操作地分离GLP-1结构域和纳米抗体结构域100，而基本上不干扰所述两个功能结构域的相应的生物活性。接头可以由通过肽键连接在一起的氨基酸残基构成，还可以任选地进一步包含一个或多个非天然氨基酸。
通常，第一接头10和第二接头20中的每个接头具有至少四个氨基酸残基的长度。因此，在某些实施方式中，每个接头具有至少4、8、10、20、24、28、30、40、48、50、60、70、80、90、100、110、120个或更多个氨基酸居住的长度。在不希望被任何理论束缚的情况下，据信合适长度的接头可以进一步改善整个多肽分子中的由此连接的两个功能结构域中的每个功能结构域的生物活性、稳定性或药代动力学参数。
任何合适的多肽都可以用作接头。例如，多肽接头可以包含选自以下氨基酸的氨基酸残基或由其组成：甘氨酸(G)、丝氨酸(S)、丙氨酸(A)、甲硫氨酸(M)、天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)、半胱氨酸(C)、脯氨酸(P)、谷氨酸(E)、苏氨酸(T)和赖氨酸(K)。在一些实施方式中，多肽接头可以由大部分非空间位阻的氨基酸，如甘氨酸和丙氨酸构成。在一些实施方式中，接头是聚甘氨酸、聚丙氨酸、甘氨酸和丙氨酸的组合(如聚(Gly-Ala))或甘氨酸和丝氨酸的组合(如聚(Gly-Ser))。
在某些实施方式中，第一接头和第二接头中的每个接头包含重复序列的一个或多个重复或由其组成。在某些实施方式中，多肽接头包含以下或由以下组成：重复序列的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个重复，或在由以上所列的任何两个数字限定的任何数值范围内。
在本文中，基于以下实施例中所示的实验数据，提供了以下配置，尽管如此，所述配置在范围上是任选的和非限制性的。
关于第一接头，根据一些实施方式，其可以不包含酸性氨基酸残基(例如D或E)。第一接头可以任选地包含第一重复序列的一个或多个单元，并且第一重复序列可以由不多于4或6种可以选自下组的氨基酸残基组成：G、Q、A、P、T和S。根据所述多肽的一些实施方式，第一重复序列包含选自下组的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成：GfSg(f和g中的每一者独立地为选自1至5的整数)、SEQ ID NO:35(GAQP)、SEQ ID NO:36(GQAP)、SEQ ID NO:37(GPAQ)、SEQ ID NO:38(GPQA)、SEQ ID NO:39(GSQP)、SEQ ID NO:40(GASP)、SEQ ID NO:41(GPAS)、SEQ ID NO:42(GPSA)、SEQ ID NO:43(GGGS)、SEQ ID NO:44(GSGS)、SEQ ID NO:45(GGGGS)、SEQ ID NO:46(GSAPGSPAGSPTGSAPGSPA)和GS。在所述多肽的某些实施方式中，第一重复序列具有SEQ ID NO:35(GAQP)中所示的氨基酸序列，并且所述一个或多个单元的数目为介于1与10之间的整数。在某些实施方式中，第一接头包含选自下组的氨基酸序列：SEQID NO:35(GAQP)、SEQ ID NO:49((GAQP)2)、SEQ ID NO:50((GAQP)5)、SEQ ID NO:51((GAQP)10)和SEQ ID NO:48(GGGGSGGGS)。
关于第二接头，其可以类似地包含第二重复序列的一个或多个单元，并且第二重复序列可以由不多于4或6种选自下组的氨基酸残基组成：G、Q、A、E、P、T和S。根据所述多肽的某些实施方式，第二重复序列包含选自下组的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成：GhSi(h和i中的每一者独立地为选自1至5的整数)、SEQ ID NO:35(GAQP)、SEQ ID NO:55(GQEP)、SEQ ID NO:56(GEQP)、SEQ ID NO:57(GPQE)、SEQ ID NO:58(GPEQ)、SEQ ID NO:59(GSEP)、SEQ ID NO:60(GESP)、SEQ ID NO:61(GPSE)、SEQ ID NO:62(GPES)、SEQ ID NO:36(GQAP)、SEQ ID NO:37(GPAQ)、SEQ ID NO:38(GPQA)、SEQ ID NO:39(GSQP)、SEQ ID NO:40(GASP)、SEQ ID NO:41(GPAS)、SEQ ID NO:42(GPSA)、SEQ ID NO:43(GGGS)、SEQ ID NO:44(GSGS)、SEQ ID NO:45(GGGGS)、SEQ ID NO:46(GSAPGSPAGSPTGSAPGSPA)和GS。在某些实施方案中，第二重复序列具有SEQ ID NO:35(GAQP)中所示的氨基酸序列，并且所述一个或多个单元的数目为介于1和15之间的整数，任选地是1、2、5、10或14。在某些实施方式中，第二接头包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:49((GAQP)2)、SEQ ID NO:50((GAQP)5)、SEQ ID NO:51((GAQP)10)和SEQ ID NO:52((GAQP)14)和SEQ ID NO:47((GGGGS)4)。
在某些实施方式中，第一接头和第二接头中的每个接头可以包含多于一个重复序列或由其组成。例如，一个此类接头可以包含2个、3个或4个不同的重复序列或由其组成。在某些实施方式中，一种此类接头可以包含不同重复序列的连续或串联重复或由其组成。每个重复序列的重复数可以独立地选自下组：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或更多。
其它说明
以下对如上所述的FGF21结构域、纳米抗体结构域、GLP-1结构域和第一接头/第二接头中的每一者进行了说明。本领域的普通技术人员应了解，可以在本文所描述的任何多肽片段的序列中进行各种氨基酸取代，例如保守氨基酸取代，而不必定降低其活性。氨基酸取代的实例包括用L-氨基酸取代其对应的D-氨基酸，用半胱氨酸取代高半胱氨酸或具有含硫醇侧链的其它非天然氨基酸，用赖氨酸取代高赖氨酸、二氨基丁酸、二氨基丙酸、鸟氨酸或具有含氨基侧链的其它非天然氨基酸，或用丙氨酸取代正缬氨酸等。
关于氨基酸序列的“保守取代”是指将氨基酸残基用不同的具有类似理化特性的侧链的氨基酸残基替代。例如，可以在具有疏水侧链的氨基酸残基(例如，Met、Ala、Val、Leu和Ile)之间、具有中性亲水侧链的残基(例如，Cys、Ser、Thr、Asn和Gln)之间、具有酸性侧链的残基(例如，Asp、Glu)之间、具有碱性侧链的氨基酸(例如，His、Lys和Arg)之间或具有芳香族侧链的残基(例如，Trp、Tyr和Phe)之间进行保守取代。如本领域中已知，保守取代通常不会引起蛋白质构象结构的显著变化，并且因此可以保留蛋白质的生物活性。
为第一实施方式(在图1A中展示)和第二实施方式(在图1B中展示)的某些实施方式提供了以下全长序列。
所述多肽的某些实施方式基本上是与血清白蛋白结合的纳米抗体结构域和FGF21结构域之间在N末端到C末端方向上的融合多肽，并且可以具有选自SEQ ID NO:63-68、93、99-101和107的氨基酸序列。在这些实施方式中的某些实施方式中，所述多肽与本文提供的合成化学部分缀合(参见，例如基于图1A)。例如，对于具有某一序列的多肽，合成化学部分可以是Ac-2XADO-EDA-CO-CH2-*，其与在相对于SEQ ID NO:1的位置171或位置174处引入的半胱氨酸残基缀合，所述序列选自由以下组成的组：SEQ ID NO:63、68、93和100。在替代实施方式中的某些实施方式中，所述多肽包含选自由SEQ ID NO:64-67、69、99和108组成的组的氨基酸序列，并且不缀合。
下表1A示出了示例性融合多肽序列的SEQ ID NO，以及融合多肽中含有的纳米抗体、FGF21、第一多肽接头和第二多肽接头的SEQ ID NO。
表1A：示例性融合多肽序列
#：突变位置相对于SEQ ID NO:1。
##部分A是指具有以下结构的Ac-2XADO-EDA-CO-CH2*，其中*端连接到多肽上的可缀合半胱氨酸残基：
所述多肽的某些实施方式基本上是GLP-1结构域、与血清白蛋白结合的纳米抗体结构域和FGF21结构域之间在N末端到C末端方向上的融合多肽，所述融合多肽可以具有选自SEQ ID NO:70、74、75、79-83、85、94-98和108-109的氨基酸序列。在这些实施方式中的某些实施方式中，所述多肽与如本文提供的合成化学部分缀合(参见，例如基于图1B)。例如，对于氨基酸序列，合成化学部分可以是Ac-2XADO-EDA-CO-CH2-*，其与在相对于SEQ ID NO:1的位置171或位置174处引入的半胱氨酸残基缀合，所述氨基酸序列选自下组：SEQ ID NO:74、81-83、85、94、96和97。在替代实施方式中的某些实施方式中，所述多肽包含选自SEQ IDNO:70、75、79、80、95、98和108-109的氨基酸序列，并且不缀合。
下表1B示出了示例性融合多肽序列的SEQ ID NO，以及融合多肽中含有的GLP-1结构域、第一多肽接头、纳米抗体、FGF21结构域以及第一多肽接头和第二多肽接头的SEQ IDNO。
表1B：示例性融合多肽序列
/>
&：突变位置相对于SEQ ID NO:28。
#：突变位置相对于SEQ ID NO:1。
##部分A是指具有以下结构的Ac-2XADO-EDA-CO-CH2*，其中*端连接到多肽上的可缀合半胱氨酸残基：
药物组合物
在另一方面，本公开进一步提供了一种药物组合物，其包含根据如上所述的任何实施方式的多肽和药学上可接受的载体。
术语“药学上可接受的”表示指定的载体、媒剂、稀释剂、赋形剂和/或盐通常与构成调配物的其它成分在化学和/或物理上相容，并且与其接受者在生理上相容。
“药学上可接受的载体”是指药物调配物中除了活性成分以外的生物活性可接受且对受试者无毒的成分。用于本文公开的药物组合物的药学上可接受的载体可以包括例如药学上可接受的液体、凝胶或固体载体、水性媒剂、非水性媒剂、抗微生物剂、等渗剂、缓冲剂、抗氧化剂、麻醉剂、悬浮剂/分配剂、多价螯合剂或螯合剂、稀释剂、佐剂、赋形剂或无毒辅助物质、本领域已知的其它组分或其各种组合。
合适的组分可以包括例如抗氧化剂、填料、粘结剂、崩解剂、缓冲液、防腐剂、润滑剂、调味剂、增稠剂、着色剂、乳化剂或稳定剂，如糖和环糊精。合适的抗氧化剂可以包括例如甲硫氨酸、抗坏血酸、EDTA、硫代硫酸钠、铂、过氧化氢酶、柠檬酸、半胱氨酸、硫代甘油、巯基乙酸、硫代山梨糖醇、丁基化羟基茴香醚(butylated hydroxanisol)、丁基化羟基甲苯和/或没食子酸丙酯。如本文所公开，在本文所提供的药物组合物中包含一种或多种抗氧化剂(如蛋氨酸)减少多肽复合物或双特异性多肽复合物的氧化。这种氧化的减少防止或减少了结合亲和力的损失，从而提高了蛋白质的稳定性并最大限度地延长了保存期。因此，在某些实施方式中，提供了包含本文所公开的多肽、多肽复合物或缀合物以及一种或多种抗氧化剂(如蛋氨酸)的组合物。
为了进一步说明，药学上可接受的载体可以包括例如：水性媒剂，如氯化钠注射液、林格氏注射液(Ringer's injection)、等渗右旋糖注射液、无菌水注射液或右旋糖和乳酸林格氏注射液；非水性媒剂，如植物来源的固定油、棉籽油、玉米油、芝麻油或花生油；细菌抑制或真菌抑制浓度下的抗微生物剂；等渗剂，如氯化钠或右旋糖；缓冲剂，如磷酸盐或柠檬酸盐缓冲剂；抗氧化剂，如硫酸氢钠；局部麻醉剂，如盐酸普鲁卡因；悬浮和分散剂，如羧甲基纤维素钠、羟丙基甲基纤维素或聚乙烯吡咯烷酮；乳化剂，如聚山梨醇酯80(TWEEN-80)；多价螯合剂或螯合剂，如EDTA(乙二胺四乙酸)或EGTA(乙二醇四乙酸)；乙醇；聚乙二醇；丙二醇；氢氧化钠；盐酸；柠檬酸或乳酸。可以将用作载体的抗微生物剂添加到多剂量容器中的药物组合物中，所述抗微生物剂包括苯酚或甲酚、汞剂、苯甲醇、氯丁醇、对羟基苯甲酸甲酯和丙酯、硫柳汞、苯扎氯铵和苄索氯铵。合适的赋形剂可以包括例如水、盐水、右旋糖、甘油或乙醇。合适的无毒辅助物质可以包括例如润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂、稳定剂、溶解度增强剂或如乙酸钠、脱水山梨糖醇单月桂酸酯、三乙醇胺油酸盐或环糊精等药剂。
药物组合物可以是液体溶液、悬浮液、乳液、丸剂、胶囊、片剂、缓释调配物或粉末。口服调配物可以包括标准载体，如医药级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。
在实施方式中，将药物组合物调配成可注射组合物。可注射药物组合物可以以任何常规形式制备，所述常规形式例如液体溶液、悬浮液、乳液或适用于产生液体溶液、悬浮液或乳液的固体形式。注射制剂可以包括准备注射的无菌和/或无热原溶液、准备在使用前与溶剂组合的无菌干燥可溶性产品(如冻干粉末，包括皮下注射片剂)、准备注射的无菌悬浮液、准备在使用前与媒剂组合的无菌干燥的不溶性产品以及无菌和/或无热原乳液。溶液可以是水性的或非水性的。
在某些实施方式中，单位剂量肠胃外制剂被包装在安瓿、小瓶或带有针头的注射器中。正如本领域已知和实践的那样，所有用于肠胃外施用的制剂都应该是无菌且无热原的。
在某些实施方式中，无菌冻干粉末通过将如本文所公开的多肽、多肽复合物或缀合物溶解于合适的溶剂中来制备。所述溶剂可以含有赋形剂，所述赋形剂可改善粉末或由粉末制备的重构溶液的稳定性或其它药理学组分。可以使用的赋形剂包括但不限于水、右旋糖、山梨糖醇、果糖、玉米糖浆、木糖醇、甘油、葡萄糖、蔗糖或其它合适的药剂。在一个实施方式中，溶剂可以含有为约中性pH的缓冲液，如柠檬酸盐、磷酸钠或磷酸钾或本领域技术人员已知的其它此类缓冲液。随后对溶液进行无菌过滤、随后在本领域技术人员已知的标准条件下冻干提供了令人期望的调配物。在一个实施方式中，将所得溶液分配到小瓶中以供冻干。每个小瓶可以含有单剂量或多剂量的本文所提供的多肽、多肽复合物或缀合物或其组合物。以高于一定剂量或一组剂量所需的量的少量(例如，约10％)过填充小瓶是可接受的，以便于进行准确的样品取出和准确的给药。可以在适当的条件下如在约4℃到室温下储存冻干粉末。
用注射用水重构冻干粉末提供了用于在肠胃外施用的调配物。在一个实施方式中，为了重构，将无菌和/或无热原水或其它合适的液体载体添加到冻干粉末中。精确的量取决于给予的所选疗法并且可以根据经验确定。
如本文所描述的药物组合物的施用可以通过普通技术医师已知有效的任何途径进行。一个实施例为通过无菌注射器或某一其它机械装置(如输注泵)进行外周肠胃外施用。在某些实施方式中，外周肠胃外途径为静脉内、肌肉内、皮下或腹膜内施用途径。
在某些实施方式中，本文所描述的多肽、多肽复合物或缀合物以适用于非肠胃外途径施用，如口服、直肠、鼻或下呼吸道途径施用的形式调配。
在某些实施方式中，本文所描述的多肽、多肽复合物或缀合物被调配于固体调配物中，如冻干或喷雾干燥，然后将其在施用之前在合适的稀释剂溶液中重构。可以采用标准的药物调配技术，如在以下中描述的那些技术：《雷明顿：药学的科学与实践(Remington:The Science and Practice of Pharmacy)》(D.B.Troy编辑,第21版,利平科特·威廉斯和威尔金斯出版公司(Lippincott,Williams&Wilkins),2006)。可替代地，本文所描述的多肽、多肽复合物或缀合物可以被调配成用于通过以下施用：舌、舌下、颊内、口中、口腔、胃和肠中、鼻、肺(例如通过细支气管和肺泡或其组合)、表皮、真皮、经皮、阴道、直肠、眼(例如通过结膜)、输尿管、经皮或肺途径。作为又另一选项，本文所描述的多肽、多肽复合物或缀合物可以被调配成用于通过经皮施用来施用，例如通过无针注射或从贴剂，任选地离子电渗贴剂或经粘膜，例如颊内施用。
治疗方法
在又另一方面，本公开进一步提供了一种预防或治疗有需要的受试者的代谢病症的方法和试剂盒。
所述方法基本上包括：向所述受试者施用治疗有效量的上述多肽或药物组合物。
如本文所使用的，病状的“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”包括预防或缓解病状、减缓病状的发作或发展速率、降低罹患病状的风险、预防或延缓与病状相关的症状的发展、减轻或结束与病状相关的症状、产生病状的完全或部分消退、治愈病状或其某种组合。
如本文所使用的，术语“受试者”或“个体”或“动物”或“患者”是指需要诊断、预后、减轻、预防和/或治疗疾病或病症的人或非人动物，包括哺乳动物或灵长类动物。哺乳动物受试者包括人、家畜、农畜，以及动物园、体育或玩赏动物，如狗、猫、豚鼠、兔、大鼠、小鼠、马、猪、牛、熊等。
在某些实施方式中，受试者已鉴定为患有可能对本文所提供的多肽或药物组合物具有应答的病症或病状。
在某些实施方式中，代谢病症是糖尿病、肥胖、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、心血管样血脂异常、动脉硬化、酒精性脂肪性肝炎(ASH)、糖尿病性肾病、妊娠期糖尿病、如代谢综合征X等代谢综合征、非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)、终末期肝病、肝脂肪变性(脂肪肝)、肝硬化、原发性胆汁性肝硬化(PBC)或严重高甘油三酯血症(SHTG)。
例如，可以使用本文所提供的多肽或药物组合物治疗或改善的代谢病状或病症包括人受试者的空腹血糖水平为125mg/dL或更大，例如130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200或大于200mg/dL的病状。可以在进食或禁食状态下或随机确定血糖水平。代谢病状或病症还可以包括受试者罹患代谢病状的风险增加的病状。对于人受试者，此类病状包括100mg/dL的空腹血糖水平。
本文所提供的多肽或药物组合物的治疗有效量将取决于本领域中已知的各种因素，例如受试者的体重、年龄、既往病史、目前的药物治疗、健康状况和交叉反应的可能性、过敏、敏感性和不良副作用，以及施用途径和疾病发展的程度。如由这些和其它情况或要求所指示的，本领域的普通技术人员(例如，医师或兽医)可以按比例减少或增加剂量。治疗有效量可以为本文所提供的多肽缀合物或药物组合物引发研究人员、医生或其它临床医师寻求的组织系统、动物或人的生物或医学应答的量，所述应答包括减轻或改善所治疗的疾病或病症的症状，即，支持可观察水平的一种或多种所需生物或医学应答，例如降低血糖、胰岛素、甘油三酯或胆固醇水平；减轻体重；或改善葡萄糖耐量、能量消耗或胰岛素敏感性的量。
在某些实施方式中，本文所提供的多肽或药物组合物可以以约0.01mg/kg至约100mg/kg(例如约0.01mg/kg、约0.5mg/kg、约1mg/kg、约2mg/kg、约5mg/kg、约10mg/kg、约15mg/kg、约20mg/kg、约25mg/kg、约30mg/kg、约35mg/kg、约40mg/kg、约45mg/kg、约50mg/kg、约55mg/kg、约60mg/kg、约65mg/kg、约70mg/kg、约75mg/kg、约80mg/kg、约85mg/kg、约90mg/kg、约95mg/kg或约100mg/kg)的治疗有效剂量施用。在这些实施方式中的某些实施方式中，本文所提供的多肽或药物组合物以约50mg/kg或更低的剂量施用，并且在这些实施方式中的某些实施方式中，剂量是10mg/kg或更低、5mg/kg或更低、1mg/kg或更低、0.5mg/kg或更低或0.1mg/kg或更低。在某些实施方式中，施用剂量可以在治疗过程中改变。例如，在某些实施方式中，初始施用剂量可以高于随后的施用剂量。在某些实施方式中，施用剂量可以在治疗过程中根据受试者的反应而变化。
可以调整剂量方案以提供最佳的期望应答(例如，治疗应答)。例如，可以施用单剂量，或可以随时间推移施用若干分次剂量。
本文所提供的多肽或药物组合物可以通过本领域中已知的任何途径施用，例如肠胃外(例如皮下、腹膜内、静脉内(包括静脉内输注)、肌肉内或皮内注射)或非肠胃外(例如口服、鼻内、眼内、舌下、直肠或局部)途径。
多肽或药物组合物可以单独或与一种或多种另外的治疗手段或药剂组合施用。
在某些实施方式中，当用于治疗代谢疾病时，本文所提供的多肽或药物组合物可以与用于治疗代谢疾病或相关的任何医学病症的任何其它治疗剂组合施用。如本文所用，“组合施用”包括作为相同药物组合物的部分同时施用、作为独立组合物同时施用或作为独立组合物在不同时间施用。如短语“组合”在本文中所用，在另一药剂之前或之后施用的组合物视为与所述药剂“组合”施用，即使组合物和第二药剂通过不同途径使用。在可能的情况下，与本文提供的融合多肽、多肽复合物或缀合物组合施用的另外的治疗剂根据所述另外的治疗剂的产品信息表中列出的时间表施用，或根据《医生桌上参考手册(Physicians'Desk Reference)》(《医生桌上参考手册》,第70版(2016))或本领域熟知的方案施用。
试剂盒
还提供了一种用于实践用于施用上述药物组合物的方法的试剂盒。此类试剂盒可以包括如本文所描述的药物组合物，所述药物组合物可以提供在无菌容器中。任选地，还可以包括关于如何使用所提供的药物组合物治疗代谢病症的说明书，或使患者或医疗服务提供者可获得所述说明书。
此类试剂盒可以包括：(a)药物组合物，所述药物组合物包含治疗有效量的融合多肽缀合物；和(b)用于所述药物组合物的一个或多个容器。此类试剂盒还可以包括用于其使用的说明书；说明书可以针对正在治疗的精确代谢病症进行定制。说明书可以描述试剂盒中所提供的材料的用途和性质。在某些实施方式中，试剂盒包括用于患者进行施用以治疗代谢病症的说明书，所述代谢病症如葡萄糖水平升高、胰岛素水平升高、糖尿病、肥胖、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、心血管样血脂异常、动脉硬化、酒精性脂肪性肝炎(ASH)、糖尿病性肾病、如代谢综合征X等代谢综合征、非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)、终末期肝病、肝脂肪变性(脂肪肝)、肝硬化、原发性胆汁性肝硬化(PBC)或严重高甘油三酯血症(SHTG)。
说明书可以印刷在如纸或塑料等基材上，并且可以作为包装插页存在于试剂盒中，存在于试剂盒的容器或其组件(例如与包装或分包装有关)的标签中等。在其它实施方式中，说明书作为存在于合适的计算机可读存储介质(例如，CD-ROM、软盘等)上的电子存储数据文件存在。在又其它实施方式中，试剂盒中不存在实际说明书，但是提供了用于如通过因特网从远程源获得说明书的手段。此实施方式的实施例是包括网址的试剂盒，其中可以查看说明书和/或可以从其下载说明书。通常希望将试剂盒的一些或所有组件包装在合适的包装中以维持无菌。试剂盒的组件可以被包装在试剂盒容纳元件中，以形成单个易于处理的单元，其中试剂盒容纳元件，例如盒子或类似结构，可以是或可以不是气密容器，例如，以进一步保持试剂盒的一些或全部组件的无菌性。
编码多肽的多核苷酸
在又其它方面，本公开进一步提供了用于制备如上所述的多肽(或任选地多肽缀合物)的方法。为此，在本公开中提供了以下内容。
首先，本公开提供了编码本文所述的融合多肽的分离的核酸或多核苷酸。
如本文所使用的，术语“核酸”或“多核苷酸”是指呈单链或双链形式的脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)和其聚合物。除非特别限制，否则所述术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的多核苷酸，所述已知类似物具有与参比核酸类似的结合性质并且以类似于天然存在的核苷酸的方式代谢。除非另外指示，否则特定多核苷酸序列还隐含地涵盖其保守修饰变体(例如，简并密码子取代)、等位基因、直系同源物、SNP和互补序列以及明确指出的序列。具体地，简并密码子取代可以通过生成序列来实现，其中一个或多个所选的(或全部)密码子的第三位被混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代(参见Batzer等人,《核酸研究(Nucleic Acid Res.)》19:5081(1991)；Ohtsuka等人,《生物化学杂志(J.Biol.Chem.)》260:2605-2608(1985)；以及Rossolini等人,《分子与细胞探测(Mol.Cell.Probes)》8:91-98(1994))。
编码本文所描述的融合多肽的核酸或多核苷酸可以使用重组技术构建。为此，可以获得编码与血清白蛋白结合的纳米抗体的DNA、编码FGF21结构域的DNA以及任选地编码GLP-1结构域的DNA，并将所述DNA可操作地连接以允许在宿主细胞中转录和表达以产生多肽。还可操作地连接编码多肽接头的多核苷酸序列以允许表达所需产物。
编码多核苷酸序列可以进一步可操作地连接到一个或多个调控序列，任选地在表达载体中，使得融合多肽的表达或产生可行并且在适当控制下。
可以使用本领域中已知的重组技术将编码多核苷酸序列插入到载体中以用于进一步克隆(DNA扩增)或表达。许多载体是可用的。载体组件通常包括但不限于以下中的一种或多种：信号序列、复制起点、一个或多个标记基因、增强子元件、启动子(例如原核启动子，如T7、T7lac、Sp6、araBAD、trp、lac、tac、pLm、A3、lac、lpp、npr、pac、syn、trc和T3，或真核启动子，如SV40、CMV和EF-1α)和转录终止序列。
载体和宿主细胞
第二和第三，本公开进一步提供了包括以上提供的多核苷酸的载体和包含本文所述的载体的宿主细胞。
如本文所使用的，术语“载体”是指可以将编码蛋白质的多核苷酸可操作地插入其中以便引起所述蛋白质的表达的媒剂。载体可以用于转化、转导或转染宿主细胞，以使其携带的遗传元件在宿主细胞内产生表达。载体的非限制性实例包括质粒、噬菌粒、粘粒、如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或源自P1的人工染色体(PAC)等人工染色体、如λ噬菌体或M13噬菌体等噬菌体和动物病毒。用作载体的动物病毒的类别包括逆转录病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(例如，单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒和乳多空病毒(例如，SV40)。载体可以包括多种用于控制表达的元件，包括启动子序列、转录起始序列、增强子序列、可选择元件和报告基因。另外，载体可以包括复制起点。载体还可以包括辅助其进入细胞的材料，包括但不限于病毒颗粒、脂质体或蛋白质包衣。载体可以是表达载体或克隆载体。本公开提供的载体(例如，表达载体)含有本文所提供的编码融合多肽的核酸序列、可操作地连接到所述核酸序列的至少一个启动子(例如，SV40、CMV、EF-1α)和至少一个选择标志物。载体的实例包括但不限于逆转录病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(例如，单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳多空病毒(例如，SV40)、λ噬菌体和M13噬菌体、质粒pcDNA3.3、pMD18-T、pOptivec、pCMV、pEGFP、pIRES、pQD-Hyg-GSeu、pALTER、pBAD、pcDNA、pCal、pL、pET、pGEMEX、pGEX、pCI、pEGFT、pSV2、pFUSE、pVITRO、pVIVO、pMAL、pMONO、pSELECT、pUNO、pDUO、Psg5L、pBABE、pWPXL、pBI、p15TV-L、pPro18、pTD、pRS10、pLexA、pACT2.2、pCMV-SCRIPT.RTM.、pCDM8、pCDNA1.1/amp、pcDNA3.1、pRc/RSV、PCR 2.1、pEF-1、pFB、pSG5、pXT1、pCDEF3、pSVSPORT、pEF-Bos等。
如本文所使用的，短语“宿主细胞”是指其中已经引入有外源多核苷酸和/或载体的细胞。
可以将包括本文所提供的多核苷酸序列的载体引入到宿主细胞中进行克隆或基因表达。如本文所使用的，短语“宿主细胞”是指其中已引入有外源性多核苷酸和/或载体的细胞。在其它实施方式中，载体是染色体外的。如果需要，可以分离宿主细胞。在某些实施方式中，宿主细胞是原核细胞，并且在一些其它实施方式中，宿主细胞是真核细胞。
适用于克隆或表达本文载体中的DNA的宿主细胞主要是原核生物。用于此目的的合适的原核生物包括真细菌，如革兰氏阴性或革兰氏阳性生物体，例如肠杆菌科(Enterobacteriaceae)，如埃希氏杆菌属(Escherichia)(例如，大肠杆菌(E.coli))、肠杆菌属(Enterobacter)、欧文氏菌属(Erwinia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、变形杆菌属(Proteus)、沙门氏菌属(Salmonella)(例如，鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium))、沙雷氏菌属(Serratia)(例如，粘质沙雷氏菌(Serratia marcescans))和志贺氏菌属(Shigella)；以及芽孢杆菌属(Bacilli)，如枯草芽孢杆菌(B.subtilis)和地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)；假单胞菌属(Pseudomonas)，如铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)和链霉菌属(Streptomyces)。在一些实施方式中，宿主细胞为真核生物，如酵母和哺乳动物细胞(例如永生化哺乳动物细胞)。
可以使用本领域的技术人员已知的任何合适方法，例如转化、转染或转导，将包括本文所提供的多核苷酸序列的载体引入到宿主细胞中。在一个实施例中，可以将编码融合多肽的多核苷酸序列亚克隆到表达载体中，其在宿主细胞中表达为包涵体。载体可以为病毒载体，并且在这一能力中可以使用任何合适病毒载体。
在本文中，宿主细胞可以是原核细胞或真核细胞。可以在常规营养培养基中培养用上述表达或克隆载体转化的宿主细胞，所述培养基视需要进行修饰以诱导启动子、选择转化体或扩增克隆载体。
在另一方面，本公开提供一种产生如本文所描述的融合多肽的方法，所述方法包括在允许如本文所描述的融合多肽表达的条件下培养本文所提供的宿主细胞。
为了产生如本文所描述的融合多肽，可以在多种培养基中培养用表达载体转化的宿主细胞。可商购获得的细菌生长培养基(如Terrific肉汤、LB肉汤、LB琼脂、M9基本培养基、MagiaMedia培养基以及ImMedia培养基(赛默飞世尔公司(ThermoFisher))适用于培养细菌宿主细胞。可商购获得的培养基(如Ham's F10(西格马公司(Sigma))、最低必需培养基(Minimal Essential Medium，MEM)(西格马公司)、RPMI-1640(西格马公司)和杜氏改良伊氏培养基(Dulbecco's Modified Eagle's Medium，DMEM)(西格马公司))适用于培养真核宿主细胞。任何这些培养基都可以根据需要补充激素和/或其它生长因子(如胰岛素、转铁蛋白或表皮生长因子)、盐(如氯化钠、钙、镁和磷酸盐)、缓冲液(如HEPES)、核苷酸(如腺苷和胸苷)、抗生素(如GENTAMYCINTM药物)、微量元素(定义为最终浓度通常在微摩尔范围内的无机化合物)和葡萄糖或等效能量源。也可以以本领域技术人员已知的适当浓度包括任何其它必要的补充物。培养条件(如温度、pH等)是先前与所选的用于表达的宿主细胞一起使用的那些条件，并且对于普通技术人员而言将是显而易见的。
用于产生多肽的方法
在一个方面，本公开提供了一种表达如本文所描述的融合多肽的方法，所述方法包括在表达如本文所描述的融合多肽的条件下培养本文所提供的宿主细胞。
在某些实施方式中，融合多肽表达为包涵体。在某些实施方式中，所述方法进一步包括从包涵体复性融合多肽。
当使用重组技术时，如本文所描述的融合多肽可以在细胞内、周质空间中产生，或直接分泌到培养基中。如果在胞内产生产物，那么作为第一步骤，可以例如通过离心或超滤来去除宿主细胞或溶解的片段的微粒状碎片。Carter等人,《生物技术(Bio/Technology)》10:163-167(1992)描述了一种用于分离分泌到大肠杆菌的周质空间的蛋白质的程序。简而言之，将细胞糊剂在存在乙酸钠(pH 3.5)、EDTA和苯甲基磺酰氟(PMSF)的情况下经约30分钟解冻。细胞碎片可以通过离心去除。当产物被分泌到培养基中时，通常首先使用可商购获得的蛋白质浓缩过滤器(例如，Amicon或Millipore Pellicon超滤单元)对来自此类表达系统的上清液进行浓缩。如PMSF等蛋白酶抑制剂可以包括在任何前述步骤中以抑制蛋白水解，并且可以包括抗生素以防止外来污染物的生长。
在某些实施方式中，所述方法进一步包括分离融合多肽。
由细胞制备的本文描述的融合多肽可以使用例如羟基磷灰石色谱法、凝胶电泳、透析、DEAE-纤维素离子交换色谱法、硫酸铵沉淀、盐析和亲和色谱法来纯化。
根据待回收的蛋白质，用于蛋白质纯化的其它技术也是可用的，如在离子交换柱上进行分级、乙醇沉淀、反相HPLC、在二氧化硅上进行色谱法、在肝素SEPHAROSETM上进行色谱法、在阴离子或阳离子交换树脂(如聚天冬氨酸柱)上进行色谱法、色谱聚焦、SDS-PAGE以及硫酸铵沉淀。
本公开还提供了一种用于产生上述多肽的方法或工艺，所述方法或工艺基本上包括以下两个步骤：
S100：在允许如上所定义的多核苷酸或其进一步包括可去除标签的前体的表达的条件下培养如上所述的宿主细胞；以及
S200：从所述宿主细胞中收集和纯化所述多肽或其所述前体。
在某些实施方式中，所述多肽表达为包涵体。在某些实施方式中，所述方法进一步包括从所述包涵体中复性所述多肽以允许其重折叠。进一步根据一些实施方式，宿主细胞是大肠杆菌，载体包括大肠杆菌相容性载体，并且由载体中的多核苷酸编码的多肽经密码子优化以用于大肠杆菌表达。
当使用重组技术时，如本文所描述的多肽可以在细胞内、周质空间中产生，或直接分泌到培养基中。如果在胞内产生产物，那么作为第一步骤，可以例如通过离心或超滤来去除宿主细胞或溶解的片段的微粒状碎片。
根据一些实施方式，从所述宿主细胞中收集和纯化所述多肽的步骤S200可以包括以下子步骤：
S210：收集所述多肽的前体；
S220：允许所述多肽的所述前体重折叠；
S230：处理所述多肽的经重折叠的前体以去除所述标签，并且由此获得所述多肽；以及
S240：纯化所述多肽。
在某些实施方式中，裂解所述宿主细胞，并从含有所述多肽或所述多肽的前体的不溶性级分中获得所述多肽或所述多肽的前体。
根据所述多肽生产方法的一些实施方式，所述方法进一步包括将经纯化的多肽与所述功能部分缀合。在某些实施方式中，要与所述多肽缀合的所述功能部分是(Ac-2XADO-EDA-CO-CH2-*)。
实施例
实施例1：纳米抗体-FGF21蛋白和GLP-1-纳米抗体-FGF21的重组表达
表1A和1B以及表1C中列出的GLP-1-纳米抗体-FGF21蛋白或纳米抗体-FGF21融合蛋白是使用BL21(DE3)衍生菌株从细菌大肠杆菌表达系统中产生的。编码GLP-1-纳米抗体-FGF21融合前体或纳米抗体-FGF21融合蛋白的DNA经密码子优化以用于大肠杆菌表达，从头合成并亚克隆到PET衍生表达载体(Novagen)中。氨基酸取代通过修饰对应的遗传密码实现。当细胞密度在极品肉汤(Terrific Broth，TB)培养基中达到2.0的OD600时，用0.5mM异丙基b-d-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导GLP-1-纳米抗体-FGF21融合前体或纳米抗体-FGF21融合蛋白的过表达。在37℃下进行蛋白质诱导20-22小时后收获细胞。
表1C：GLP-1/FGF21蛋白的对照分子
实施例2：纳米抗体-FGF21蛋白的纯化
收获细胞，并将所述细胞通过细胞粉碎机(900巴，两次)在20mM Tris pH 8.0、0.15M NaCl缓冲液中裂解。通过离心(8,000X g，持续30分钟)收集含有纳米抗体-FGF21融合蛋白的不溶性级分。在重折叠后，通过阴离子交换色谱法对融合蛋白进行纯化。每个步骤中的样品通过LC/MS表征以确认正确分子量。
实施例3：GLP-1-纳米抗体-FGF21的纯化
收获细胞，并将所述细胞通过细胞粉碎机(900巴，两次)在20mM Tris pH 8.0、0.15M NaCl缓冲液中裂解。通过离心(8,000X g，持续30分钟)收集含有GLP-1-纳米抗体-FGF21融合前体的不溶性级分。在重折叠后，通过阴离子交换色谱法捕获融合蛋白前体。在用蛋白酶去除标签后，通过疏水相互作用色谱法对蛋白质进行纯化。每个步骤中的样品通过LC/MS表征以确认正确分子量。
实施例4：纳米抗体-FGF21和GLP-1-纳米抗体-FGF21融合蛋白缀合物的制备
将含Ac-2XADO-EDA-CO-CH2-Br的有机溶剂逐滴添加到纳米抗体-FGF21或GLP-1-纳米抗体-FGF21融合蛋白于Tris缓冲液中的溶液中。将反应在室温下搅拌1小时。然后将产物应用于阴离子交换色谱法。这提供如上文所示的表1中列出的化合物。
遵循供应商手册，使用针对不同缀合物优化的条件，用沃特世(Waters)BioAccordLC-MS系统通过LC-MS方法，或用沃特世Acquity UPLC系统通过UPLC检测并表征缀合的融合蛋白。
实施例5：体外活性
方法：使用过表达人GLP-1受体和CRE萤光素酶报告基因的BHK细胞系在含有或不含有1％人血清白蛋白(HSA)的情况下测量融合蛋白的体外GLP-1活性。在1％ HSA存在下，用3倍系列稀释液以100nM作为最高浓度测量测试的融合蛋白。在用分子处理细胞4小时后，通过Steadylite plus试剂盒(珀金埃尔默(Perkin Elmer)，6066751)测量萤光素酶活性。
每种融合蛋白的活性由来源于非线性回归分析的EC50表示。
使用过表达人β-Klotho的HEK293细胞系评估融合蛋白的体外FGF21活性。在1％HSA存在下，用4倍系列稀释液在400nM最高浓度下测量测试的融合蛋白缀合物。在用融合蛋白缀合物处理细胞12分钟后，通过p-ERK试剂盒(Cisbio，64ERKPEH)测量p-ERK水平。
每种融合蛋白的活性由来源于非线性回归分析的EC50表示。
结论：如表2和3所示，所有融合蛋白都显示出与天然FGF21相当的效力。然而，融合分子(MLC#9、MLC#10、MLC#12、MLC#13、MLC#14、MLC#15、MLC#16、MLC#17、MLC#19和MLC#21)表现出不同的GLP-1活性。分子MLC#14、MLC#16、MLC#17、MLC#19和MLC#21显示出显著高于MLC#9、MLC#12、MLC#13和MLC#15的GLP1活性。与测试的其它融合分子相比，MLC#15具有相对较短的第二接头，并且GLP-1活性也较低。总之，这可能表明具有较长第二接头的融合分子可以具有较高的GLP1活性。如图2A和2B所示，融合分子(MLC#9、MLC#10、对照#6和MLC#14)显示出的FGF21功效显著高于YH双分子(即WO 2017/074123中以SEQ ID NO.66公开的分子)。
表2：GLP-1-纳米抗体-FGF21融合蛋白缀合物的体外GLP1活性和FGF21活性。
NA：不可用。
表3：纳米抗体-FGF21融合蛋白缀合物的体外FGF21活性。
分子代码. 第一接头 FGF21结构域上的缀合 FGF21活性(EC50，nM)
MLC#5 (GAQP) 无 7.65
MLC#6 (GAQP) 171C 6.65
MLC#25 G4S 无 7.45
MLC#23 G4S 171C 5.83
实施例6：在疾病模型中的功效研究
在疾病动物模型(如db/db小鼠、饮食诱导肥胖(DIO)小鼠)中评估所选分子，以确定慢性研究中的体重、食物摄入、葡萄糖功效和剂量应答。还测量了一些生物标志物，包括血浆胰岛素、血浆甘油三酯、血浆胆固醇、血浆LDL-c、血浆脂联素、肝甘油三酯、肝胆固醇和肝功能指数(ALT、AST)。
A)食物摄入和体重减少
方法：
向22周龄DIO雄性C57BL/6小鼠(～50g)每隔一天一次(Q2D)皮下注射指定的GLP-1多肽缀合物(即分子012)，持续25天。一周测量食物摄入和体重两次，并且一周测量空腹血糖一次。每个处理组使用五只动物。针对每只个别动物监测体重和空腹血糖，但在一起测量每组动物的食物摄入。第1天和第25天是分子给药的第一天和最后一天。数据指示为平均值和标准误差(SEM)或合并值。通过单因素方差分析(One-way ANOVA)进行统计分析。第25天的体重减少通过-1*(BW损失％-媒剂组的BW损失％)来计算；累计食物摄入减少通过-100*(累计食物摄入-媒剂的累计食物摄入)/媒剂的累计食物摄入来计算。
结论：在DIO研究中，如图3A、3B和表8所示，分子对照#2、对照#6、MLC#9和MLC#10对体重减少和食物摄入抑制有显著作用。
表8：第11天DIO小鼠的食物摄入和体重减少
B)DIO动物模型中的代谢参数
方法：
向16周龄DIO雄性C57BL/6小鼠(35～40g)每天一次(QD)皮下注射指定的GLP-1/FGF21缀合物(即MLC#9、MLC#14、MLC#16和MLC#17)，持续21天。每天测量一次食物摄入和体重，并且每三天测量一次非空腹血糖。每个处理组使用五只动物。针对每只个别动物监测体重和血糖，但在一起测量每组动物的食物摄入。第1天和第21天分别是处理的第一天和最后一天。收集末梢血，并且制备EDTA-K3血浆，并将所述血浆在-80℃下冷冻，用于生物标志物测量(LDL-C、TC、TG、ALT、胰岛素、脂联素)。还收集肝脏和脂肪组织，并将其在液氮中冷冻，并在-80℃下储存。数据指示为平均值和标准误差(SEM)或合并值。通过单因素方差分析进行统计分析。第21天的体重减少通过-1*(BW损失％-媒剂组的BW损失％)来计算；累计食物摄入减少通过-100*(累计食物摄入-媒剂的累计食物摄入)/媒剂的累计食物摄入来计算。
结论：
在DIO小鼠研究中，如图4A所示，与索马鲁肽、替西帕肽和YH双(WO2017/074123中的SEQ ID 66)相比，分子MLC#9、MLC#14、MLC#16和MLC#17对体重减少显示出好得多的功效。在研究中，MLC#9、MLC#14、MLC#16和MLC#17诱导体重减少约30％-35％。相比之下，索马鲁肽、替西帕肽和YH双诱导体重减少约20％至25％。
在图4B中，MLC#9、MLC#14、MLC#16和MLC#17组显示出的血糖控制优于索马鲁肽、替西帕肽和YH双。MLC#9、MLC#14、MLC#16和MLC#17将非空腹血糖水平降至低于7mmol/L。相比之下，索马鲁肽将非空腹血糖降低至约7.5-10mmol/L。
MLC#9、MLC#14、MLC#16和MLC#17还诱导血浆中甘油三酯(图4C)、LDL-C(图4D)、总胆固醇(图4E)和ALT(图4F)浓度降低和脂肪重量(图4G)和肝脏重量(图4H)降低，同时改善肝脏TG(图4I)、肝脏TC(图4J)和胰岛素敏感性(图4K)。
在体内，FGF21可以诱导脂联素的分泌，据报道脂联素是一种胰岛素增敏剂。与YH双相比，融合分子MLC#9、MLC#14、MLC#16和MLC#17对脂联素水平的增加表现出更好的效果，表明FGF21活性更好(图4L)。
C)不同剂量下ob/ob动物模型中的代谢参数
方法：向10周龄ob/ob雄性小鼠(42～55g)每天一次(QD)皮下注射指定的GLP-1/FGF21缀合物(即MLC#14和MLC#16)，持续14天。每天测量一次食物摄入和体重。每三天测量一次非空腹血糖。每周测量一次血浆甘油三酯(TG)水平。每个处理组使用五或六只动物。针对每只个别动物监测体重和血糖，但在一起测量每组动物的食物摄入。第1天和第14天是分子给药的第一天和最后一天。在处理后的第14天，在麻醉下通过心脏穿刺处死小鼠。收集末梢血，并将所述末梢血在-80℃下冷冻，用于生物标志物测量(LDL-C、TC、TG、ALT/AST、胰岛素、脂联素)。还收集肝脏和脂肪组织，并将其在液氮中冷冻，并在-80℃下储存。数据指示为平均值和标准误差(SEM)或合并值。通过单因素方差分析进行统计分析。第14天的体重减少通过-1*(BW损失％-媒剂组的BW损失％)来计算；累计食物摄入减少通过-100*(累计食物摄入-媒剂的累计食物摄入)/媒剂的累计食物摄入来计算。
结论：在ob/ob小鼠研究中，如图5A-5M所示，融合分子MLC#14和MLC#16对体重减轻(图5A)、血糖降低和生物标志物变化表现出剂量依赖性功效。在图5A中，与索马鲁肽、替西帕肽和YH双(WO2017/074123中的SEQ ID 66)相比，分子MLC#14和MLC#16在相同剂量下对体重较轻显示出好得多的功效。在图5B中，MLC#14和MLC#16组在相同剂量下对血糖控制的效果与索马鲁肽相似。如图5C所示，与索马鲁肽、替西帕肽和YH双相比，MLC#14和MLC#16在相同剂量下诱导更佳地降低血浆甘油三酯。MLC#14和MLC#16还降低了血浆中的LDL-C(图5D)、总胆固醇(图5E)、ALT(图5F)和AST(图5G)浓度水平，并且降低了脂肪重量(图5H)和肝脏重量(图5I)，同时改善了肝脏TG(图5J)、肝脏TC(图5K)和胰岛素敏感性(图5L)。与YH双相比，融合分子MLC#14和MLC#16在相同剂量下对脂联素水平的增加表现出明显更好的效果，表明FGF21活性更好(图5M)。
D)DIO动物模型中的代谢参数
方法：向16周龄DIO雄性C57BL/6小鼠(35～50g)每天一次(QD)皮下注射指定的GLP-1/FGF21缀合物和FGF21缀合物(即MLC#16、MLC#19、MLC#6和MLC#23)，持续22天。每三天测量一次食物摄入和体重，并且每周测量一次空腹血糖。每个处理组使用五只动物。针对每只个别动物监测体重和血糖，但在一起测量每组动物的食物摄入。第1天和第22天分别是处理的第一天和最后一天。收集末梢血，并且制备EDTA-K3血浆，并将所述血浆在-80℃下冷冻，用于生物标志物测量(LDL-C、TC、TG)。还收集肝脏和脂肪组织，并将其在液氮中冷冻，并在-80℃下储存。数据指示为平均值和标准误差(SEM)或合并值。通过单因素方差分析进行统计分析。
结论
在DIO小鼠研究中，如图6A所示，GLP-1-纳米抗体-FGF21融合蛋白缀合物(MLC#16和MLC#19)和纳米抗体-FGF21融合缀合物(MLC#6和MLC#23)对体重减少显示出良好的功效。在图6B中，MLC#16、MLC#19、MLC#6和MLC#23组显示出比索马鲁肽更好的血糖控制，并且还诱导血浆中血清甘油三酯(图6C)、LDL-C(图6D)和总胆固醇(图6E)浓度的降低和脂肪重量(图6F)和肝脏重量(图6G)的降低，以及肝脏TG的改善(图6H)。
实施例7：在大鼠中的药代动力学研究
方法：向6-8周雄性SD大鼠以15nmol/kg的单次皮下剂量施用蛋白MLC#9(缀合)或MLC#10(非缀合)(n＝3/组)。在给药前(-5分钟)、在皮下施用后0.5小时、1小时、2小时、4小时、6小时、8小时、12小时、24小时、32小时、48小时、72小时、96小时收集血浆样品。通过ELISA方法测量血浆中的多肽缀合物的浓度。基于显示每种多肽缀合物的血浆浓度与皮下注射后时间的图，通过WinNonlin计算药代动力学参数。
结论：MLC#9在大鼠体内的半衰期T1/2为14.3小时，这显示出比MLC#10的9.5小时的半衰期T1/2更长的半衰期。
实施例8：在小型猪中的PK研究。
在小型猪中评估所选分子的药代动力学。执行皮下和静脉内注射两者。
实施例9：在非人灵长类动物中的PK研究。
在猴中评估所选分子的药代动力学。执行皮下和静脉内注射两者。
方法：向4～5岁雄性食蟹猴以5mg/kg(123nmol/kg)的单次皮下剂量施用MLC#16(n＝2/组)。在给药前(-5分钟)、在皮下施用后0.5小时、1小时、2小时、4小时、6小时、8小时、12小时、24小时、36小时、48小时、72小时、96小时、120小时、144小时和168小时收集血浆样品。通过LC-MS/MS方法测量血浆中MLC#16的浓度。基于显示MLC#16的血浆浓度与皮下注射后时间的图，通过WinNonlin计算药代动力学参数。
结论：MLC#16在猴体内的半衰期为54.3小时，这潜在地支持人类每周一次的剂量频率(表9)。
表9：MLC#16在猴体内的药代动力学参数。通过WinNonlin软件分析药代动力学数据。计算Tmax、Cmax、T1/2、AUC。
PK参数 单位 MLC#16
Tmax 小时 12
Cmax nmol/L 671
终末t1/2 小时 54.3
AUC0-t 小时*纳摩尔/升 47851(t＝168小时)
实施例10：免疫原性评估。
还通过计算机模拟(iTope和TCED方法)和离体(EpiScreen)方法评估所选GLP-1多肽缀合物的免疫原性。
实施例11：稳定性评估。
为了测试稳定性，将不同的GLP-1多肽缀合物调配在具有不同组成(pH 6、7、7.4和8.0)的缓冲液中，并在不同温度(如4℃和25℃)下储存2-4周。通过尺寸排阻色谱法(SEC)-HPLC分析％HMWP和％LMW。通过反相(RP)-UPLC和LC/MS分析浓度和修饰。
实施例12：人血清白蛋白结合
方法：在Biacore 8K仪器中通过表面等离子体共振表征分子与血清白蛋白的结合。将人血清白蛋白共价结合到CM5传感器芯片表面，直到达到4000RU。用流速为10微升/分钟的1M乙醇胺将芯片封闭420秒。将每种分子样品稀释并且以30微升/分钟的流速注射，以允许与芯片结合的白蛋白结合120秒并且解离300秒。将不含分子的结合缓冲液以20秒的流速在芯片上传送，以允许结合的分子自发解离30秒。
结论：所有融合分子(MLC#9、MLC#10、对照#4、对照#5、对照#6、MLC#12和MLC#16)显示出相似的与人血清白蛋白的结合亲和力(参见表10)。
表10：人血清白蛋白结合亲和力
分子 KD(μM) Rmax(RU)
MLC#9(缀合) 0.28 1507.8
MLC#10(非缀合) 0.28 1391.0
对照#4 0.27 1252.0
对照#5 0.22 1604.0
对照#6 0.22 1289.8
MLC#12(非缀合) 0.25 1248.6
MLC#13(缀合) 0.27 1393.3
MLC#14(缀合) 0.22 1513.5
MLC#15(缀合) 0.31 1341.8
MLC#16(缀合) 0.27 1625.6
MLC#19(缀合) 0.22 450.0
实施例13：融合蛋白上的FAP酶切割
方法：成纤维细胞激活蛋白(FAP)是一种丝氨酸蛋白酶。据报道，该酶可调节FGF21的降解。为了测试FAP酶对融合蛋白的C末端的降解，将融合蛋白(MLC#23、MLC#25)和FAP酶以200:1的配给量在37℃下温育20小时。执行LC-MS以分析融合蛋白的降解百分比。
结论：未缀合的融合蛋白(MLC#25、MLC#18和MLC#21)当在37℃下与FAP酶一起温育20小时时，显示出50.6％-65.2％的C末端降解。然而，融合蛋白缀合物(MLC#23、MLC#16和MLC#19)和具有171G取代的融合蛋白(MLC#10)显示出对FAP酶的抗性。
表11：FAP酶切割融合蛋白的结果
分子 C末端降解
MLC#23(缀合) 未检测到
MLC#25(非缀合，171P) 58.9％
MLC#16(缀合) 未检测到
MLC#18(非缀合，171P) 65.2％
MLC#19(缀合) 未检测到
MLC#21(非缀合，171P) 50.6％
MLC#10(非缀合，171G) 未检测到

Claims (61)

1.一种多肽，其在从N末端到C末端的方向上包含：
第一片段，所述第一片段包含能够结合血清白蛋白的纳米抗体结构域；以及
第二片段，所述第二片段包含生物活性FGF21结构域；
其中：
所述第一片段和所述第二片段通过第一接头连接。
2.根据权利要求1所述的多肽，其中所述FGF21结构域包含一个或多个氨基酸残基突变，每个氨基酸残基突变位置所选自的位置选自下组的位置处：相对于SEQ ID NO:1的位置121、168、171和180。
3.根据权利要求2所述的多肽，其中所述FGF21结构域中的所述一个或多个氨基酸残基突变包含N121Q、M168L、P171G和A180E，或其任意组合。
4.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其中所述FGF21结构域进一步包含可缀合残基。
5.根据权利要求4所述的多肽，其中：
所述可缀合残基位于C末端片段内从相对于SEQ ID NO:1的位置169跨越到位置181的位置处；并且任选地
所述可缀合残基位于选自下组的位置处：相对于SEQ ID NO:1的位置169、170、171、172、173、174、180和181。
6.根据权利要求4或5所述的多肽，其中所述FGF21结构域包含SEQ ID NO:6-13、16-19和92的氨基酸序列。
7.根据权利要求4至6中任一项所述的多肽，其中所述多肽在所述第二片段中的所述可缀合残基处与功能部分缀合。
8.根据权利要求7所述的多肽，其中所述功能部分包含糖基部分或合成化学部分。
9.根据权利要求7至8中任一项所述的多肽，其中所述功能部分包含糖基部分，并且所述可缀合残基是可糖基化的引入残基。
10.根据权利要求9所述的多肽，其中所述可缀合残基包含在相对于SEQ ID NO:1的位置172或位置173处引入的T，或在位置170或位置174处引入的N残基。
11.根据权利要求7至8中任一项所述的多肽，其中所述功能部分包含合成化学部分。
12.根据权利要求11所述的多肽，其中所述可缀合残基包含引入的半胱氨酸残基。
13.根据权利要求12所述的多肽，其中所述合成化学部分包含*-X-Y-Z的结构，其中X、Y和Z通过键相互连接，并且X的*端连接到所述多肽上的所述可缀合残基，其中：
X可以是Y可以是/> 并且Z可以是/>
其中：
位置α连接到位置α'，位置β连接到位置β'，R1是氢或-COOH；d是1、2或3；
a是1、2或3；b是1、2或3；c是1或2；并且d是1、2或3，并且e是1、2或3。
14.根据权利要求13所述的多肽，其中所述合成化学部分具有以下结构：
15.根据权利要求12至14中任一项所述的多肽，其中所述引入的半胱氨酸位于选自下组的位置处：相对于SEQ ID NO:1的169、170、171、172、173、174、180和181。
16.根据权利要求15所述的多肽，其中所述引入的半胱氨酸位于位置171处，并且所述合成化学部分具有以下结构：
17.根据权利要求16所述的多肽，其中所述FGF21结构域包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列，并且任选地所述引入的半胱氨酸位于位置171处。
18.根据权利要求15所述的多肽，其中：
i)所述FGF21结构域包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列，并且所述引入的半胱氨酸位于位置169处；
ii)所述FGF21结构域包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列，并且所述引入的半胱氨酸位于位置170处；
iii)所述FGF21结构域包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列，并且所述引入的半胱氨酸位于位置172处；
iv)所述FGF21结构域包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列，并且所述引入的半胱氨酸位于位置173处；
v)所述FGF21结构域包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列，并且所述引入的半胱氨酸位于位置174处；
vi)所述FGF21结构域包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列，并且所述引入的半胱氨酸位于位置180处；
vii)所述FGF21结构域包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列，并且所述引入的半胱氨酸位于位置181处；或者
viii)所述FGF21结构域包含SEQ ID NO:92的氨基酸序列，并且所述引入的半胱氨酸位于位置174处。
19.根据权利要求1至15中任一项所述的多肽，其中所述FGF21结构域进一步包含相对于SEQ ID NO:1的P171G取代。
20.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其中所述纳米抗体结构域包含VHH结构域。
21.根据权利要求20所述的多肽，其中所述VHH结构域是人源化的。
22.根据权利要求20或21所述的多肽，其中所述VHH结构域包含互补决定区1(CDR1)、互补决定区2(CDR2)和互补决定区3(CDR3)，其中：
所述CDR1包含SEQ ID NO:20的序列或其具有至多3、2或1个氨基酸突变的变体；
所述CDR2包含SEQ ID NO:21的序列或其具有至多3、2或1个氨基酸突变的变体；和/或
所述CDR3包含SEQ ID NO:22的序列或其具有至多3、2或1个氨基酸突变的变体；
其中：
所述VHH结构域基本上保留了与血清白蛋白，任选地与人血清白蛋白的结合特异性。
23.根据权利要求22所述的多肽，其中所述VHH结构域包含：互补决定区1(CDR1)，所述CDR1包含SEQ ID NO:20的序列；CDR2，所述CDR2包含SEQ ID NO:21的序列；以及CDR3，所述CDR3包含SEQ ID NO:22的序列。
24.根据权利要求20至23中任一项所述的多肽，其中所述VHH结构域包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列或其变体，所述变体与SEQ ID NO:23具有至少70％(例如，至少75％、80％、85％、90％、95％、99％)同一性，其中所述变体基本上保留了与血清白蛋白的结合特异性和/或亲和力。
25.根据权利要求24所述的多肽，其中所述SEQ ID NO:23的变体相对于SEQ ID NO:23具有至多10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸突变。
26.根据权利要求20至25中任一项所述的多肽，其中所述纳米抗体结构域进一步包含附接到所述VHH结构域N末端的N末端延长序列。
27.根据权利要求26所述的多肽，其中所述N末端延长序列包含SG、AG、S或A的氨基酸残基。
28.根据权利要求27所述的多肽，其中所述纳米抗体结构域包含选自SEQ ID NO:24-27的氨基酸序列。
29.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其中所述第一接头具有至少四个氨基酸残基的长度。
30.根据权利要求29所述的多肽，其中所述第一接头不包含酸性氨基酸残基。
31.根据权利要求30所述的多肽，其中所述第一接头不包含D残基或E残基中的任一种。
32.根据权利要求29所述的多肽，其中所述第一接头包含第一重复序列的一个或多个单元。
33.根据权利要求32所述的多肽，其中所述第一重复序列由不多于4或6种选自下组的氨基酸残基组成：G、Q、A、P、T和S。
34.根据权利要求33所述的多肽，其中所述第一重复序列包含选自下组的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成：GfSg、SEQ ID NO:35(GAQP)、SEQ ID NO:36(GQAP)、SEQ ID NO:37(GPAQ)、SEQ ID NO:38(GPQA)、SEQ ID NO:39(GSQP)、SEQ ID NO:40(GASP)、SEQ ID NO:41(GPAS)、SEQ ID NO:42(GPSA)、SEQ ID NO:43(GGGS)、SEQ ID NO:44(GSGS)、SEQ ID NO:45(GGGGS)、SEQ ID NO:46(GSAPGSPAGSPTGSAPGSPA)和GS，其中f和g中的每一者独立地为选自1至5的整数。
35.根据权利要求34所述的多肽，其中所述第一重复序列具有如SEQ ID NO:35(GAQP)所示的氨基酸序列，并且所述一个或多个单元的数目为介于1与10之间的整数。
36.根据权利要求35所述的多肽，其中所述第一接头包含选自下组的氨基酸序列：SEQID NO:35(GAQP)、SEQ ID NO:49((GAQP)2)、SEQ ID NO:50((GAQP)5)、SEQ ID NO:51((GAQP)10)和SEQ ID NO:48(GGGGSGGGS)。
37.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其通过所述第一片段的N末端进一步包含第三片段，所述第三片段包含另一功能结构域，其中：
所述第一片段和所述第三片段通过第二接头连接。
38.根据权利要求37所述的多肽，其中所述第三片段的所述另一功能结构域包含选自下组之一的生物活性蛋白或其片段：胰高血糖素样肽-1(GLP-1)、胰岛素、瘦素、胰高血糖素、胃泌素、胃抑制多肽(GIP)、胰淀素、降钙素、胆囊收缩素、肽YY、神经肽Y、骨形态发生蛋白-6(BMP-6)、骨形态发生蛋白-9(BMP-9)、胃泌酸调节素、催产素、胰高血糖素样肽-2(GLP-2)、鸢尾素、含III型纤连蛋白结构域的蛋白5(FNDC5)、爱帕琳肽、脂联素、Clq和肿瘤坏死因子相关蛋白(CTRP家族)、抵抗素、内脂素、网膜素、视黄醇结合蛋白-4(RBP-4)、肠高血糖素、血管生成素、白细胞介素-22(IL-22)、艾塞那肽-4和生长激素。
39.根据权利要求38所述的多肽，其中所述第三片段的所述另一功能结构域包含GLP-1的生物活性肽或其片段，其中所述另一功能结构域包含与SEQ ID NO:28具有至少70％序列同一性，同时保留SEQ ID NO:28的基本生物活性的氨基酸序列。
40.根据权利要求39所述的多肽，其中所述另一功能结构域包含一个或多个突变，所述一个或多个突变在相对于SEQ ID NO:28的位置8、22、26、34和36或其任何组合处的一个或多个突变。
41.根据权利要求40所述的多肽，其中所述一个或多个突变包含A8G、G22E、K26R、K34R、R36G或其任意组合。
42.根据权利要求41所述的多肽，其中所述另一功能结构域包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:31-34。
43.根据权利要求37至42中任一项所述的多肽，其中所述第二接头具有至少八个氨基酸残基(例如至少12、16或20个氨基酸残基)的长度。
44.根据权利要求43所述的多肽，其中所述第二接头包含第二重复序列的一个或多个单元。
45.根据权利要求41所述的多肽，其中所述第二重复序列由不多于4或6种选自下组的氨基酸残基组成：G、Q、A、E、P、T和S。
46.根据权利要求45所述的多肽，其中所述第二重复序列包含选自下组的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成：GhSi、SEQ ID NO:35(GAQP)、SEQ ID NO:55(GQEP)、SEQ ID NO:56(GEQP)、SEQ ID NO:57(GPQE)、SEQ ID NO:58(GPEQ)、SEQ ID NO:59(GSEP)、SEQ ID NO:60(GESP)、SEQ ID NO:61(GPSE)、SEQ ID NO:62(GPES)、SEQ ID NO:36(GQAP)、SEQ ID NO:37(GPAQ)、SEQ ID NO:38(GPQA)、SEQ ID NO:39(GSQP)、SEQ ID NO:40(GASP)、SEQ ID NO:41(GPAS)、SEQ ID NO:42(GPSA)、SEQ ID NO:43(GGGS)、SEQ ID NO:44(GSGS)、SEQ ID NO:45(GGGGS)、SEQ ID NO:46(GSAPGSPAGSPTGSAPGSPA)和GS，其中h和i中的每一者独立地为选自1至5的整数。
47.根据权利要求46所述的多肽，其中所述第二重复序列具有如SEQ ID NO:35(GAQP)所示的氨基酸序列，并且所述一个或多个单元的数目为介于1与15之间的整数。
48.根据权利要求43所述的多肽，其中所述第二接头包含选自下组的氨基酸序列：SEQID NO:49((GAQP)2)、SEQ ID NO:50((GAQP)5)、SEQ ID NO:51((GAQP)10)和SEQ ID NO:52((GAQP)14)和SEQ ID NO:47((GGGGS)4)。
49.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其包含选自SEQ ID NO:63-68、93、99、100、101和107的氨基酸序列。
50.根据权利要求37至48中任一项所述的多肽，其包含选自SEQ ID NO:70、74、75、79-83、85、94-98和108-109的氨基酸序列。
51.一种药物组合物，其包含根据前述权利要求中任一项所述的多肽和药学上可接受的载体。
52.一种预防或治疗有需要的受试者的代谢病症的方法，所述方法包含：
施用治疗有效量的根据权利要求1至50中任一项所述的多肽或根据权利要求51所述的药物组合物。
53.根据权利要求52所述的方法，其中所述代谢病症是糖尿病、肥胖、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、心血管样血脂异常、动脉硬化、酒精性脂肪性肝炎(ASH)、糖尿病性肾病、妊娠期糖尿病、代谢综合征如代谢综合征X等、非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)、终末期肝病、肝脂肪变性(脂肪肝)、肝硬化、原发性胆汁性肝硬化(PBC)或严重高甘油三酯血症(SHTG)。
54.一种多核苷酸，其编码根据权利要求1至50中任一项所述的多肽。
55.一种载体，其包含根据权利要求54所述的多核苷酸。
56.一种宿主细胞，其包含根据权利要求55所述的载体。
57.一种用于产生根据权利要求1至50中任一项所述的多肽的方法，所述方法包括：
在允许根据权利要求54所述的多核苷酸或其进一步包含可去除标签的前体的表达的条件下培养根据权利要求56所述的宿主细胞；以及
从所述宿主细胞中收集和纯化所述多肽或其所述前体。
58.根据权利要求57所述的方法，其中所述多肽在所述第二片段中的可缀合残基处与功能部分缀合，其中所述方法进一步包括在所述从所述宿主细胞中收集和纯化所述多肽之后：
将所述功能部分缀合到所述多核苷酸。
59.根据权利要求57或权利要求58所述的方法，其中所述宿主细胞是大肠杆菌，所述载体包含大肠杆菌相容性载体，并且由所述载体中的所述多核苷酸编码的所述多肽经密码子优化以用于大肠杆菌表达。
60.根据权利要求57至59中任一项所述的方法，其中所述从所述宿主细胞中收集和纯化所述多肽包含：
从中收集所述多肽的所述前体；
允许所述多肽的所述前体重折叠；
处理所述多肽的经重折叠的前体以去除所述标签，并且由此获得所述多肽；以及
纯化所述多肽。
61.根据权利要求58至60中任一项所述的方法，其进一步包括将经纯化的多肽与所述功能部分缀合。
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