KR20240034235A - 대사 장애를 위한 융합 폴리펩타이드 - Google Patents

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Abstract

폴리펩타이드 링커에 의해 연결된 나노바디 및 FGF21을 포함하는 폴리펩타이드의 접합체가 제공된다. 각각 2개의 폴리펩타이드 링커에 의해 연결된 GLP-1, 나노바디, 및 FGF21을 포함하는 폴리펩타이드의 접합체가 추가로 제공된다. 이를 포함하는 약학 조성물 및 질환을 치료하는 방법이 또한 제공된다.

Description

대사 장애를 위한 융합 폴리펩타이드
본 발명은 폴리펩타이드 및 이의 제조방법, 약학 조성물, 및 질환, 특히 대사 질환을 예방 및/또는 치료하기 위해 이를 사용하는 방법에 관한 것이다.
섬유아세포 성장 인자(FGF) 계열의 구성원인 섬유아세포 성장 인자 21(FGF 21)은 여러 대사 활성 기관에서 합성되는 호르몬이며, 글루코스 및 지질 항상성을 조절한다. FGF21의 생물학은 다수의 표적 기관에서의 그의 다양한 대사 기능으로 인해 본질적으로 복잡하다. FGF21은 간, 지방세포, 췌장, 시상하부 및 근육 조직과 같은 기관에서 기능하는 것으로 보고되었다(Fisher FM, Annu Rev Physiol, 2016, 78:223).
글루카곤 유사 펩타이드-1(GLP-1)의 주요 생물학적 활성 단편은 프로글루카곤 펩타이드의 번역후 가공으로부터 유래되는 30 또는 31개 아미노산 펩타이드 단편(GLP-1의 아미노산 7-36 또는 7-37)이다. 초기 GLP-1 생성물 GLP-1은 인슐린 합성 및 분비를 자극하고, 당뇨병, 특히 2형 당뇨병에서 고혈당을 예방하는 것으로 나타났다. 그러나, 내인성 GLP-1은 단지 대략 2분의 반감기를 가지며, 단지 0-15 pmol/L의 GLP-1의 공복 혈장 수준을 초래한다.
대사 장애는 일반적으로 인슐린 저항성, 내장 지방과다증, 죽상경화성 이상지질혈증 등과 관련이 있으며, 이는 전 세계적으로 심각하고 증가하는 공중 보건 및 임상적 문제를 내포하고 있다. 그러나, 기존의 대사 질환 치료는 짧은 반감기 및/또는 낮은 효능과 같은 문제에 직면해 있다.
따라서, 대사 질환을 치료하기 위한 개선된 치료 해결책이 필요하다.
제1 양태에서, 본 개시내용은 1개 또는 2개의 링커를 통해 연결된 2개 또는 3개의 기능적 도메인을 포함하는 실질적으로 융합 폴리펩타이드 또는 융합 단백질인 폴리펩타이드를 제공한다.
구체적으로, N-말단에서 C-말단 방향으로, 폴리펩타이드는 제1 링커를 통해 연결된 제1 단편 및 제2 단편을 포함한다. 제1 단편은 혈청 알부민(예컨대, 인간 혈청 알부민)에 결합할 수 있는 나노바디 도메인을 포함하고, 제2 단편은 생물학적 활성 FGF21 도메인을 포함한다.
본원에서, FGF21 도메인은 서열번호 1의 생물학적 활성을 실질적으로 유지하면서 서열번호 1에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 이와 같이, FGF21 도메인은, 이러한 돌연변이 함유 FGF21 변이체가 여전히 FGF21의 생물학적 활성을 유지하는 한, 서열번호 1에 대해 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 또는 2개 이하의 아미노산 잔기 돌연변이를 포함할 수 있다. 본원에서, 아미노산 잔기 돌연변이는 치환, 삽입, 또는 결실일 수 있다.
폴리펩타이드의 일부 구현예에 따르면, FGF21 도메인은 서열번호 1에 대해 각각 위치 121, 168, 171, 및 180으로부터 선택된 위치에 하나 이상의 아미노산 잔기 돌연변이를 포함할 수 있다. 선택적으로, FGF21 도메인 내의 하나 이상의 아미노산 잔기 돌연변이는 하기 3개의 치환 N121Q, M168L, P171G 및 A180E 중 1개, 2개, 3개 또는 4개를 포함할 수 있다.
폴리펩타이드의 일부 구현예에 따르면, FGF21 도메인은 N121Q, M168L, 및 A180E의 3개의 모든 치환을 포함할 수 있으며, FGF21 도메인의 아미노산 서열은 서열번호 5에 제시되어 있다. 3개의 돌연변이 외에, FGF21 도메인 내의 다른 아미노산 잔기가 추가적으로 돌연변이될 수 있다. 특정 구현예에서, FGF21 도메인은 치환 P171G를 추가로 포함한다. 폴리펩타이드의 일부 구현예에 따르면, FGF21 도메인은 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함한다.
폴리펩타이드의 일부 구현예에 따르면, FGF21 도메인은 접합가능한 잔기를 추가로 포함한다. 본원에서, 접합가능한 잔기는 선택적으로 서열번호 1에 대해 위치 169부터 위치 181에 이르는 C-말단 단편 내의 위치에 있을 수 있다. 특정 구현예에 따르면, 접합가능한 잔기는 서열번호 1에 대해 위치 169, 170, 171, 172, 173, 174, 180 및 181로 이루어진 군으로부터 선택된 위치에 있다. 폴리펩타이드의 일부 구현예에 따르면, FGF21 도메인은 서열번호 1에 대해 위치 169부터 위치 181에 이르는 C-말단 단편 내의 위치에 있는 접합가능한 잔기에 대한 돌연변이를 제외하고, 서열번호 2-5, 89-91, 14, 및 102-105의 아미노산 서열을 포함한다.
폴리펩타이드의 일부 구현예에 따르면, FGF21 도메인은 서열번호 6-13, 16-19, 및 92의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에 따르면, 폴리펩타이드는 FGF21 도메인을 함유하는 제2 단편 내의 접합가능한 잔기에서 기능적 모이어티와 접합된다.
본원에서, FGF2 도메인에 접합된 기능적 모이어티는 선택적으로 글리코실 모이어티 또는 합성 화학적 모이어티를 포함할 수 있다.
폴리펩타이드의 일부 구현예에 따르면, 기능적 모이어티는 글리코실 모이어티를 포함하고, 접합가능한 잔기는 트레오닌(T) 또는 아스파라긴(N) 잔기와 같은 글리코실화가능한 도입된 잔기일 수 있다. 보다 구체적으로, 접합가능한 잔기는 선택적으로 서열번호 1에 대해 위치 172 또는 위치 173에 있는 도입된 T일 수 있거나 위치 170 또는 위치 174에 있는 도입된 N 잔기일 수 있다. 폴리펩타이드의 일부 구현예에 따르면, FGF21 도메인은 서열번호 16-19로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다.
폴리펩타이드의 일부 다른 구현예에 따르면, 기능적 모이어티는 합성 화학적 모이어티를 포함한다. 이와 같이, 접합가능한 잔기는 선택적으로 도입된 시스테인(C)을 포함할 수 있고, 합성 화학적 모이어티는 *-X-Y-Z의 구조를 포함할 수 있다. 본원에서, X, Y, 및 Z는 결합을 통해 상호연결되며, X의 * 말단은 폴리펩타이드 상의 접합가능한 잔기에 연결된다. X는 일 수 있으며, Y는 , 또는 일 수 있고, Z는 일 수 있으며, 여기서 위치 α는 α'에 연결되고, 위치 β는 위치 β'에 연결된다. 본원에서, R1은 수소 또는 -COOH일 수 있고, d는 1, 2, 또는 3일 수 있으며, a는 1, 2 또는 3일 수 있고, b는 1, 2 또는 3일 수 있으며, c는 1 또는 2일 수 있고, d는 1, 2, 또는 3일 수 있으며, e는 1, 2, 또는 3일 수 있다.
폴리펩타이드의 일부 보다 구체적인 구현예에 따르면, 합성 화학적 모이어티는 본원에서 Ac-2XADO-EDA-CO-CH2-*로도 지칭된 하기 구조 를 갖는다.
선택적으로, 도입된 시스테인은 서열번호 1에 대해 169, 170, 171, 172, 173, 174, 180 및 181로 이루어진 군으로부터 선택된 위치에 있을 수 있다. 특정 구현예에 따르면, 접합가능한 잔기는 서열번호 1에 대해 위치 171 또는 174에 있다. 폴리펩타이드의 일부 이들 구현예에 따르면, FGF21 도메인은 서열번호 6-13 및 92의 아미노산 서열을 포함한다.
폴리펩타이드의 일부 구현예에서, FGF21 도메인은 도입된 시스테인 잔기에서 하기 구조 (본원에서 Ac-2XADO-EDA-CO-CH2*로도 지칭됨)를 갖는 합성 화학적 모이어티와 접합된, 위치 171에 도입된 시스테인을 갖는, 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함한다.
폴리펩타이드의 일부 구현예에서, FGF21 도메인은 도입된 시스테인 잔기에서 하기 구조 (본원에서 Ac-2XADO-EDA-CO-CH2*로도 지칭됨)를 갖는 합성 화학적 모이어티와 접합된, 위치 174에 도입된 시스테인을 갖는, 서열번호 92의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
폴리펩타이드의 다른 구현예는 대안적으로 하기를 포함할 수 있다:
i) FGF21 도메인은 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하고, 도입된 시스테인은 위치 169에 있거나;
ii) FGF21 도메인은 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하고, 도입된 시스테인은 위치 170에 있거나;
iii) FGF21 도메인은 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하고, 도입된 시스테인은 위치 171에 있거나;
iv) FGF21 도메인은 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하고, 도입된 시스테인은 위치 172에 있거나;
v) FGF21 도메인은 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하고, 도입된 시스테인은 위치 173에 있거나;
vi) FGF21 도메인은 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하고, 도입된 시스테인은 위치 174에 있거나;
vii) FGF21 도메인은 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하고, 도입된 시스테인은 위치 180에 있거나;
viii) FGF21 도메인은 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하고, 도입된 시스테인은 위치 181에 있거나,
ix) FGF21 도메인은 서열번호 92의 아미노산 서열을 포함하고, 도입된 시스테인은 위치 174에 있고,
선택적으로 도입된 시스테인 잔기에서 하기 구조 (본원에서 Ac-2XADO-EDA-CO-CH2*로도 지칭됨)를 갖는 합성 화학적 모이어티와 접합된다.
추가적으로 그리고 대안적으로, 폴리펩타이드의 일부 다른 구현예에서, FGF21 도메인은 서열번호 1에 대해 P171G의 치환을 추가로 포함한다. 이러한 구현예에서, FGF21 도메인은 서열번호 14 및 92로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다.
폴리펩타이드의 임의의 상기 구현예에서, 나노바디 도메인은 선택적으로 VHH 도메인, 선택적으로 인간 혈청 알부민(HSA)에 결합할 수 있는 VHH 도메인을 포함할 수 있다.
더 선택적으로, VHH 도메인은 인간화될 수 있다.
일부 구현예에 따르면, VHH 도메인은 상보성 결정 영역 1(CDR1), 상보성 결정 영역 2(CDR2), 및 상보성 결정 영역 3(CDR3)을 포함할 수 있다. 본원에서, CDR1은 서열번호 20의 서열 또는 최대 3개, 2개, 또는 1개의 아미노산 돌연변이를 갖는 이의 변이체를 포함할 수 있고, CDR2는 서열번호 21의 서열 또는 최대 3개, 2개, 또는 1개의 아미노산 돌연변이를 갖는 이의 변이체를 포함할 수 있고/거나, CDR3은 서열번호 22의 서열 또는 최대 3개, 2개, 또는 1개의 아미노산 돌연변이를 갖는 이의 변이체를 포함할 수 있고, VHH 도메인은 혈청 알부민, 선택적으로 인간 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 실질적으로 유지한다.
폴리펩타이드의 특정 구현예에서, VHH 도메인은 서열번호 20의 서열을 포함하는 상보성 결정 영역 1(CDR1), 서열번호 21의 서열을 포함하는 CDR2, 및 서열번호 22의 서열을 포함하는 CDR3을 포함한다.
폴리펩타이드의 특정한 구체적 구현예에서, VHH 도메인은 서열번호 23의 아미노산 서열, 또는 서열번호 23에 대해 적어도 70%(예컨대, 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%) 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하며, 변이체는 혈청 알부민에 대한 결합 특이성 및/또는 친화성을 실질적으로 유지한다.
본원에서, 선택적으로, 서열번호 23의 변이체는 서열번호 23에 대해 최대 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개의 아미노산 돌연변이를 가질 수 있다.
임의의 상기 구현예에서, 나노바디 도메인은 선택적으로 VHH 도메인의 N-말단에 부착된 N-말단 연장을 추가로 포함할 수 있고, N-말단 연장은 선택적으로 SG, AG, S 또는 A의 아미노산 잔기를 포함할 수 있다.
폴리펩타이드의 일부 특정 구현예에 따르면, 나노바디 도메인은 서열번호 24-27로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다.
상기 기재된 폴리펩타이드의 임의의 구현예에서, 제1 링커는 적어도 4개의 아미노산 잔기의 길이를 가질 수 있다.
일부 구현예에 따르면, 제1 링커는 산성 아미노산 잔기를 포함하지 않을 수 있으며, 보다 구체적으로, 제1 링커는 D 잔기 또는 E 잔기 중 어느 것도 포함하지 않을 수 있다.
선택적으로, 제1 링커는 제1 반복 서열의 하나 이상의 단위를 포함할 수 있으며, 일부 구현예에 따르면, 제1 반복 서열은 G, Q, A, P, T 및 S로 이루어진 군으로부터 선택된 4개 또는 6개 유형 이하의 아미노산 잔기로 구성될 수 있다.
폴리펩타이드의 일부 특정 구현예에 따르면, 제1 반복 서열은 GfSg(본원에서, f 및 g 각각은 독립적으로 1 내지 5로부터 선택된 정수임), 서열번호 35(GAQP), 서열번호 36(GQAP), 서열번호 37(GPAQ), 서열번호 38(GPQA), 서열번호 39(GSQP), 서열번호 40(GASP), 서열번호 41(GPAS), 서열번호 42(GPSA), 서열번호 43(GGGS), 서열번호 44(GSGS), 서열번호 45(GGGGS), 서열번호 46(GSAPGSPAGSPTGSAPGSPA), 및 GS로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성될 수 있다.
특정 구현예에서, 제1 반복 서열은 서열번호 35(GAQP)에 제시된 아미노산 서열을 가질 수 있고, 단위의 수는 1 내지 10의 정수일 수 있다.
폴리펩타이드의 특정한 구체적 구현예에 따르면, 제1 링커는 서열번호 35(GAQP), 서열번호 49((GAQP)2), 서열번호 50((GAQP)5), 서열번호 51((GAQP)10) 및 서열번호 48(GGGGSGGGS)로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다.
상기 기재된 폴리펩타이드의 임의의 구현예에서, 폴리펩타이드는 제1 단편의 N-말단을 넘어 또 다른 기능적 도메인을 포함하는 제3 단편을 추가로 포함할 수 있다. 본원에서, 제1 단편 및 제3 단편은 제2 링커를 통해 연결된다.
본원에서, 제3 단편의 또 다른 기능적 도메인은 선택적으로 글루카곤 유사 펩타이드-1(GLP-1), 인슐린, 렙틴, 글루카곤, 가스트린, 위 억제 폴리펩타이드(GIP), 아밀린, 칼시토닌, 콜레시스토키닌, 펩타이드 YY, 신경펩타이드 Y, 골형성 단백질-6(BMP-6), 골형성 단백질-9(BMP-9), 옥신토모둘린, 옥시토신, 글루카곤 유사 펩타이드-2(GLP-2), 이리신, 피브로넥틴 III형 도메인 함유 단백질 5(FNDC5), 아펠린, 아디포넥틴, Clq 및 종양 괴사 인자 관련 단백질(CTRP 계열), 레지스틴, 비스파틴, 오멘틴, 레티놀 결합 단백질-4(RBP-4), 글리센틴, 안지오포이에틴, 인터루킨-22(IL-22), 엑센딘-4, 및 성장 호르몬으로 이루어진 군으로부터 선택된 것의 생물학적 활성 단백질, 또는 이의 단편을 포함할 수 있다.
폴리펩타이드의 일부 구현예에 따르면, 제3 단편의 또 다른 기능적 도메인은 GLP-1의 생물학적 활성 펩타이드, 또는 이의 단편을 포함하며, 서열번호 28의 실질적인 생물학적 활성을 유지하면서 서열번호 28에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본원에서 선택적으로, 또 다른 기능적 도메인은 서열번호 28에 대해 위치 8, 22, 26, 34, 및 36에 하나 이상의 돌연변이, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
폴리펩타이드의 일부 구현예에 따르면, 폴리펩타이드의 제3 단편의 또 다른 기능적 도메인 내의 하나 이상의 돌연변이는 A8G, G22E, K26R, K34R, 및 R36G, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 폴리펩타이드의 일부 구현예에 따르면, 폴리펩타이드의 제3 단편의 또 다른 기능적 도메인 내의 하나 이상의 돌연변이는 A8G, G22E, 및 R36G, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
폴리펩타이드의 일부 특정 구현예에 따르면, 제3 단편의 또 다른 기능적 도메인은 서열번호 29, 및 서열번호 31-34로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다.
제2 링커를 통해 제1 단편의 N-말단과 연결되는 제1 단편을 포함하는 폴리펩타이드의 임의의 상기 언급된 구현예에서.
특정 구현예에서, 제2 링커는 적어도 4개의 아미노산 잔기의 길이를 가질 수 있다. 특정 구현예에서, 제2 링커는 적어도 8, 12, 16, 또는 20개의 아미노산 잔기의 길이를 가질 수 있다.
본원에서, 제2 링커는 제2 반복 서열의 하나 이상의 단위를 포함할 수 있으며, 제2 반복 서열은 G, Q, A, E, P, T 및 S로 이루어진 군으로부터 선택된 4개 또는 6개 유형 이하의 아미노산 잔기로 구성될 수 있다.
폴리펩타이드의 일부 특정 구현예에 따르면, 제2 반복 서열은 GhSi(본원에서, h 및 i 각각은 독립적으로 1 내지 5로부터 선택된 정수임), 서열번호 35(GAQP), 서열번호 55(GQEP), 서열번호 56(GEQP), 서열번호 57(GPQE), 서열번호 58(GPEQ), 서열번호 59(GSEP), 서열번호 60(GESP), 서열번호 61(GPSE), 서열번호 62(GPES), 서열번호 36(GQAP), 서열번호 37(GPAQ), 서열번호 38(GPQA), 서열번호 39(GSQP), 서열번호 40(GASP), 서열번호 41(GPAS), 서열번호 42(GPSA), 서열번호 43(GGGS), 서열번호 44(GSGS), 서열번호 45(GGGGS), 서열번호 46 (GSAPGSPAGSPTGSAPGSPA) 및 GS로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성될 수 있다.
또한, 일부 구현예에 따르면, 제2 반복 서열은 서열번호 35(GAQP)에 제시된 아미노산 서열을 가질 수 있고, 하나 이상의 단위의 수는 1 내지 15의 정수일 수 있다.
폴리펩타이드의 특정 구현예에 따르면, 제2 링커는 서열번호 49((GAQP)2), 서열번호 50((GAQP)5), 서열번호 51((GAQP)10), 및 서열번호 52((GAQP)14), 및 서열번호 47((GGGGS)4)로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다.
제1 및 제2 단편으로 구성된 폴리펩타이드의 특정한 구체적 구현예에 따르면, 폴리펩타이드는 서열번호 63-68, 93, 99, 100, 101 및 107로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 폴리펩타이드의 특정한 구체적 구현예에 따르면, 폴리펩타이드는 서열번호 63, 68, 및 100으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고, 서열번호 1에 대해 위치 171에 있는 도입된 시스테인 잔기에서 본원에 제공된 합성 화학적 모이어티와 접합된다. 폴리펩타이드의 특정한 구체적 구현예에 따르면, 폴리펩타이드는 서열번호 93의 아미노산 서열을 포함하고, 서열번호 1에 대해 위치 174에 있는 도입된 시스테인 잔기에서 본원에 제공된 합성 화학적 모이어티와 접합된다. 폴리펩타이드의 특정한 이들 구체적 구현예에 따르면, 합성 화학적 모이어티는 하기 구조 (본원에서 Ac-2XADO-EDA-CO-CH2*로도 지칭됨)를 갖는다. 폴리펩타이드의 특정한 구체적 구현예에 따르면, 폴리펩타이드는 서열번호 64-67, 93 및 107로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하며, 접합되지 않는다.
제1, 제2 및 제3 단편으로 구성된 폴리펩타이드의 특정한 구체적 구현예에 따르면, 폴리펩타이드는 서열번호 70, 74, 75, 79-83, 85, 94-98, 및 108-109로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 폴리펩타이드의 특정한 구체적 구현예에 따르면, 폴리펩타이드는 서열번호 74, 81-83, 85, 및 96-97로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고, 서열번호 1에 대해 위치 171에 있는 도입된 시스테인 잔기에서 본원에 제공된 합성 화학적 모이어티와 접합된다. 폴리펩타이드의 특정한 구체적 구현예에 따르면, 폴리펩타이드는 서열번호 94의 아미노산 서열을 포함하고, 서열번호 1에 대해 위치 174에 있는 도입된 시스테인 잔기에서 합성 화학적 모이어티와 접합된다. 폴리펩타이드의 특정한 이러한 구체적 구현예에 따르면, 합성 화학적 모이어티는 하기 구조 (본원에서 Ac-2XADO-EDA-CO-CH2*로도 지칭됨)를 갖는다. 폴리펩타이드의 특정한 구체적 구현예에 따르면, 폴리펩타이드는 서열번호 70, 75, 79-80, 85, 94, 95, 98 및 108-109로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하며, 접합되지 않는다.
본 개시내용의 제2 양태에서, 약학 조성물이 추가로 제공된다. 약학 조성물은 상기 기재된 바와 같은 임의의 구현예에 따른 폴리펩타이드, 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함한다.
본 개시내용의 제3 양태에서, 상기 기재된 임의의 구현예에 따른 폴리펩타이드의 치료적 유효량, 또는 상기 기재된 약학 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체에서 대사 장애를 예방 또는 치료하는 방법이 또한 제공된다.
본원에서, 대사 장애는 당뇨병, 비만, 비알코올성 지방간염(NASH), 심혈관 유사 이상지질혈증, 동맥경화증, 알코올성 지방간염(ASH), 당뇨병신증, 임신성 당뇨병, 대사 증후군, 예컨대 대사 증후군 X, 비알콜성 지방간 질환(NAFLD), 말기 간 질환, 간 지방증(지방간), 간경변, 원발성 담즙성 간경변증(PBC) 또는 중증 고중성지방혈증(SHTG)일 수 있다.
본 개시내용의 제4 양태에서, 상기 기재된 바와 같은 임의의 구현예에 따라 정의된 바와 같은 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드가 추가로 제공된다.
본 개시내용의 제5 양태에서, 상기 기재된 바와 같은 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터가 추가로 제공된다.
본 개시내용의 제6 양태에서, 상기 기재된 바와 같은 벡터를 포함하는 숙주 세포가 추가로 제공된다.
본 개시내용의 제7 양태에서, 상기 기재된 바와 같은 폴리펩타이드를 생산하기 위한 방법이 추가로 제공된다. 상기 방법은
S100: 상기 정의된 바와 같은 폴리뉴클레오타이드 또는 제거가능한 태그를 추가로 포함하는 이의 전구체의 발현을 허용하는 조건 하에서 상기 기재된 바와 같은 숙주 세포를 배양하는 단계; 및
S200: 숙주 세포로부터 폴리펩타이드 또는 이의 전구체를 수집 및 정제하는 단계
를 포함한다.
방법의 일부 구현예에 따르면, 폴리펩타이드는 제2 단편 내의 접합가능한 잔기에서 기능적 모이어티와 접합되고, 방법은 숙주 세포로부터 폴리펩타이드를 수집 및 정제하는 단계(S200) 이후에
S300: 기능적 모이어티를 폴리뉴클레오타이드에 접합하는 단계
를 추가로 포함한다.
방법의 일부 구현예에 따르면, 숙주 세포는 E. coli이고, 벡터는 E. coli 양립가능한 벡터를 포함하며, 벡터 내의 폴리뉴클레오타이드에 의해 코딩된 폴리펩타이드는 E. coli 발현을 위해 코돈 최적화된다.
방법의 일부 구현예에 따르면, 숙주 세포로부터 폴리펩타이드를 수집 및 정제하는 단계(S200)는 하기 하위단계
S210: 폴리펩타이드의 전구체를 수집하는 단계;
S220: 폴리펩타이드의 전구체가 리폴딩(refold)되도록 하는 단계;
S230: 폴리펩타이드의 리폴딩된 전구체를 처리하여 태그를 제거함으로써 폴리펩타이드를 얻는 단계; 및
S240: 폴리펩타이드를 정제하는 단계
를 포함할 수 있다
폴리펩타이드 생산 방법의 일부 구현예에 따르면, 방법은 정제된 폴리펩타이드를 기능적 모이어티와 접합하는 단계를 추가로 포함한다. 특정 구현예에서, 폴리펩타이드에 접합되는 기능적 모이어티는 (Ac-2XADO-EDA-CO-CH2-*)이다. 본 개시내용 전반에 걸쳐, 관사 "a", "an," 및 "the"는 본원에서 관사의 문법적 목적어 중 하나 또는 둘 이상(즉, 적어도 하나)을 지칭하기 위해 사용된다. 예로서, "폴리펩타이드"는 하나의 폴리펩타이드 또는 둘 이상의 폴리펩타이드를 의미한다.
일련의 언급된 수치가 있는 본 출원의 모든 경우에, 언급된 수치 중 어느 것은 숫자 범위의 상한 또는 하한일 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명은 이러한 모든 숫자 범위, 즉 상한 숫자와 하한 숫자의 조합을 갖는 범위를 포괄하는 것으로 추가적으로 이해되어야 하며, 여기서 상한과 하한 각각에 대한 수치는 본원에 언급된 임의의 수치일 수 있다. 본원에 제공된 범위는 범위 내의 모든 값을 포함하는 것으로 이해된다. 예를 들어, 1-10은 값 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 및 10 및 적절한 분수 값을 모두 포함하는 것으로 이해된다. 유사하게, "적어도"에 의해 한계가 정해진 범위는 제공된 더 낮은 값 및 모든 더 높은 숫자를 포함하는 것으로 이해된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "대략", "약" 등은 특정 분야에서 평균의 3 표준 편차 이내 또는 표준 허용 범위 이내를 포함하는 것으로 이해된다. 특정 구현예에서, 약은 0.5 이하의 변화로 이해된다.
용어 "또는"은 문맥이 달리 나타내지 않는 한 용어 "및/또는"을 의미하기 위해서 본원에서 포괄적으로 사용되며, 이와 상호교환적으로 사용된다.
"포함하다", "포함하는", "함유하다", "함유하는" 등과 같은 용어는 달리 나타내지 않는 한 개방형 용어(즉, "비제한적으로 포함하는"을 의미함)로서 해석되어야 한다.
용어 "포함하는"은 문구 "비제한적으로 포함하는"을 의미하기 위해 본원에서 사용되며, 이와 상호교환적으로 사용된다. 유사하게, "예컨대"는 문구 "예컨대, 그러나 이에 제한되지 않는"을 의미하기 위해 본원에서 사용되며, 이와 상호교환적으로 사용된다.
용어 "본질적으로 구성된다"는 모든, 대부분 또는 거의 무시할 수 있는 양의 다른 요소를 제외하는 것을 의미하거나, 명시적으로 언급되지 않은 요소는 허용하지만 선행 기술에서 발견되거나 기본적이거나 신규한 특성에 영향을 미치는 요소는 제외한다. 폴리펩타이드가 아미노산 서열로 "본질적으로 구성된다"고 하는 경우, 이는 폴리펩타이드가 폴리펩타이드의 한쪽 말단 또는 양쪽 말단에 10개 이하(예를 들어, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개 이하)의 추가적인 아미노산 잔기를 갖는 아미노산 서열로 대부분 구성된다는 것을 의미한다.
도 1a 및 도 1b는 본 개시내용의 2개의 상이한 구현예에 따른 폴리펩타이드를 예시한다.
도 2a 및 2b는 분자 MLC#9, MLC#10, MLC#14, 대조군 #6 및 참조 화합물 YH-dual의 시험관내 FGF21 활성을 보여준다.
도 3a 및 3b는 DIO 랫트에서 체중 감소(도 3a) 및 음식 섭취 억제(도 3b)에 대한 분자 대조군#2, 대조군#6, MLC#9 및 MLC#10의 효능을 보여준다.
도 4a 내지 4l은 DIO 마우스에서 체중 감소(도 4a), 글루코스 제어(도 4b), 혈장 내 중성지방(도 4c), LDL-C(도 4d), 총 콜레스테롤(도 4e) 및 ALT(도 4f) 농도의 감소 및 지방 중량(도 4g) 및 간 중량(도 4h)의 감소와 함께, 간 TG(도 4i), 간 TC(도 4j) 및 인슐린 감수성(도 4k)의 개선, 및 아디포넥틴 수준의 증가(도 4l)에 대한 분자 MLC#9, MLC#14, MLC#16 및 MLC#17, 및 참조 화합물 세마글루타이드, YH-dual, 및 티르제파타이드의 효능을 보여준다.
도 5a 내지 5m은 DIO 마우스에서 체중 감소(도 5a), 글루코스 제어(도 5b), 혈장 내 중성지방(도 5c), LDL-C(도 5d), 총 콜레스테롤(도 5e), ALT(도 5f) 및 AST(도 5g) 농도의 감소 및 지방 중량(도 5h) 및 간 중량(도 5i)의 감소와 함께, 간 TG(도 5j), 간 TC(도 5k) 및 인슐린 감수성(도 5l)의 개선, 및 아디포넥틴 수준의 증가(도 5m)에 대한, 참조 화합물 세마글루타이드, YH-dual, 및 티르제파타이드와 비교하여, 상이한 투여량의 분자 MLC#14 및 MLC#16의 효능을 보여준다.
도 6a 내지 6h는 혈장 내 혈청 중성지방(도 6c), LDL-C(도 6d) 및 총 콜레스테롤(도 6e) 농도 및 지방 중량(도 6f) 및 간 중량(도 6g)의 감소와 함께, 간 TG의 개선(도 6h)에 대한, 참조 화합물 세마글루타이드와 비교하여, 상이한 투여량의 분자 MLC#16, MLC#19, MLC#6, 및 MLC#23의 효능을 보여준다.
도 7은 본 개시내용에 개시된 모든 아미노산 서열을 보여준다.
본 개시내용의 하기 설명은 단지 본 발명의 다양한 구현예를 예시하기 위한 것으로 의도된다. 이와 같이, 논의된 특정 변형은 본 발명의 범위에 대한 제한으로서 해석되지 않아야 한다. 다양한 균등물, 변화, 및 변형이 본 발명의 범위를 벗어나지 않고 이루어질 수 있음이 당업자에게 명백할 것이며, 이러한 균등한 구현예가 본원에 포함되어야 하는 것으로 이해된다. 간행물, 특허 및 특허 출원을 포함하는 본원에 인용된 모든 참고문헌은 그 전체가 참고로 본원에 포함된다.
정의
용어 "단백질", "펩타이드" 및 "폴리펩타이드"는 본원에서 상호교환적으로 사용되며, 펩타이드 결합과 같은 공유 결합에 의해 연결된 아미노산 잔기의 중합체를 지칭한다. 본원에 제공된 바와 같은 단백질 또는 폴리펩타이드는 자연 발생 또는 비자연 아미노산 잔기, 또는 둘 모두를 포함할 수 있다. 본원에 제공된 폴리펩타이드, 펩타이드 및 단백질은 임의의 적합한 길이의 아미노산 잔기, 예를 들어, 적어도 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000개 이상의 아미노산 잔기 길이를 포함할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "자연 발생" 아미노산 잔기는 천연 단백질 또는 펩타이드에서 발견되는 아미노산 잔기를 지칭하며, 이들의 구조가 입체이성질체 형태를 허용하는 경우 모두 D 및 L 입체이성질체이다. 자연 발생 아미노산 잔기의 예는, 비제한적으로 글리신(Gly 또는 G), 알라닌(Ala 또는 A), 발린(Val 또는 V), 류신(Leu 또는 L), 이소류신(Ile 또는 I), 세린(Ser 또는 S), 시스테인(Cys 또는 C), 트레오닌(Thr 또는 T), 메티오닌(Met 또는 M), 프롤린(Pro 또는 P), 페닐알라닌(Phe 또는 F), 티로신(Tyr 또는 Y), 트립토판(Trp 또는 W), 히스티딘(His 또는 H), 리신(Lys 또는 K), 아르기닌(Arg 또는 R), 아스파르테이트(Asp 또는 D), 글루타메이트(Glu 또는 E), 아스파라긴(Asn 또는 N), 및 글루타민(Gln 또는 Q)을 포함한 20개의 표준 아미노산, 및 이들의 천연 유사체, 예컨대 카나바닌, 피롤리신(PYL), 셀레노시스테인, 피롤린-카르복시-리신(PCL), 사르코신, 베타-알라닌, 포스포세린, γ-카르복시글루타메이트, 및 오르니틴을 포함한다. D 입체이성질체인 자연 발생 아미노산 잔기의 예는, 예를 들어 D-아스파르테이트, D-세린, D-시스테인, D-알라닌, D-글루타메이트 등을 포함한다.
"아미노산 유사체"는 자연 발생 아미노산과 동일한 기본 화학 구조, 즉 수소, 카르복실기, 아미노기, 및 R기에 결합된 탄소를 갖는 화합물, 예컨대 호모세린, 노르류신, 메티오닌 설폭사이드, 메티오닌 메틸 설포늄이다. 이러한 유사체는 변형된 R기(예컨대, 노르류신) 또는 변형된 펩타이드 백본을 가질 수 있지만, 자연 발생 아미노산과 동일한 기본 화학적 구조를 보유할 것이다.
본원에 사용된 바와 같이, "비자연" 아미노산 잔기는, 알려진 자연 발생 아미노산 중 하나는 아니지만 자연 발생 아미노산과 유사한 방식으로 기능하는, 비제한적으로 변형된 아미노산 잔기, 및/또는 아미노산 모방체를 포함하는, 자연에서 발견되지 않는 임의의 아미노산 잔기를 지칭한다. 변형된 아미노산 또는 모방체는 탄수화물기, 인산기, 파르네실기, 이소파메실기, 지방산기, 접합, 기능화, 또는 기타 변형을 위한 링커 등과 같은 화학적 엔티티의 첨가에 의해 생성될 수 있다. 비자연 아미노산은 또한 화학적 합성에 의해 제조된 아미노산을 지칭할 수 있다. 예시적인 비자연 아미노산은, 비제한적으로 2-아미노이소부티르산(Aib), 이미다졸-4-아세테이트(IA), 이미다졸프로피온산(IPA), a-아미노부티르산(Abu), tert-부틸글리신(Tle), 3-아미노메틸 벤조산, 안트라닐산, 데스-아미노-히스티딘(약칭 데스아미노히스, 대체명 이미다조프로피온산, 약칭 lmpr), 아미노산의 베타 유사체, 예컨대 β-알라닌, 2-아미노-히스티딘, β-하이드록시-히스티딘, 호모히스티딘, Nα-아세틸-히스티딘, α-플루오로-메틸-히스티딘, α-메틸-히스티딘, α,α-디메틸-글루탐산, m-CF3-페닐알라닌, α,β-디아미노프로피온산(약칭 Dap), 3-피리딜알라닌, 2-피리딜알라닌 또는 4-피리딜알라닌, (1-아미노사이클로프로필)카르복실산, (1-아미노사이클로부틸)-카르복실산, (1-아미노사이클로펜틸)카르복실산, (1-아미노사이클로헥실)카르복실산, (1-아미노사이클로헵틸)카르복실산, 및 (1-아미노사이클로옥틸)카르복실산을 포함한다. 융합 폴리펩타이드, 폴리펩타이드 단편, 및/또는 폴리펩타이드 복합체에 비자연 아미노산을 도입하는 것은 문헌[Wang et al., Science 292:498-500, 2001; Deiters et al., J Am Chem Soc 125:1 1782-1 1783, 2003; Wang and Schultz, Science 301 :964- 967, 2003; Zhang et al., Science 303:371-373, 2004 또는 미국 특허 7,083,970]에 기재된 기술에 의해 실현될 수 있다. 간략하게, 이러한 발현 시스템 중 일부는 본 개시내용의 융합 폴리펩타이드를 코딩하는 오픈 리딩 프레임에 정지 코돈, 예컨대, 앰버(UAG), 오커(UAA), 및 오팔(UGA) 코돈을 도입하기 위한 부위 지향 돌연변이유발을 포함한다. 4-염기 코돈(예컨대, AGGA, AGGU, CGGU, CGCU, CGAU, CCCU, CUCU, CUAU, 및 GGGU), 5-염기 코돈, 6-염기 코돈 등과 같은 다른 코돈이 또한 비자연 아미노산을 위한 발현 시스템에 도입될 수 있다. 그 다음, 이러한 발현 벡터는 도입된 정지 코돈 또는 다른 코돈에 특이적인 tRNA를 활용할 수 있는 숙주에 도입되고 선택되는 비자연 아미노산을 운반한다.
용어 "융합" 또는 "융합된"은 아미노산 서열(예컨대, 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질)과 관련하여 사용될 때 2개 이상의 아미노산 서열이, 예를 들어 화학적 결합 또는 재조합 수단에 의해, 자연적으로 존재하지 않는 단일 아미노산 서열로 조합되는 것을 지칭한다. 융합 아미노산 서열은 2개의 코딩 폴리뉴클레오타이드 서열의 유전적 재조합에 의해 생성될 수 있으며, 재조합 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 작제물을 숙주 세포에 도입하는 방법에 의해 발현될 수 있다.
"퍼센트(%) 서열 동일성"은, 서열을 정렬하고, 필요한 경우 동일한 아미노산(또는 핵산)의 최대 개수를 얻기 위해 필요한 경우 갭을 도입한 후, 참조 서열 내의 아미노산(또는 핵산) 잔기와 동일한 후보 서열 내의 아미노산(또는 핵산) 잔기의 백분율로서 정의된다. 다시 말해서, 아미노산 서열(또는 핵산 서열)의 퍼센트(%) 서열 동일성은 비교되고 있는 참조 서열 대비 동일한 아미노산 잔기(또는 염기)의 수를 후보 서열 또는 참조 서열 내의 아미노산 잔기(또는 염기)의 총 수로 나누어 계산될 수 있다. 아미노산 잔기의 보존적 치환은 동일한 잔기로서 고려되지 않는다. 퍼센트 아미노산(또는 핵산) 서열 동일성을 결정하기 위한 정렬은, 예를 들어 BLASTN, BLASTp(미국 국립생물공학정보센터(NCBI)의 웹사이트에서 이용가능함, 또한 Altschul S.F. et al, J. Mol. Biol., 215:403-410 (1990); Stephen F. et al, Nucleic Acids Res., 25:3389-3402 (1997) 참조), ClustalW2(유럽 생물정보학 연구소의 웹사이트에서 이용가능함, 또한 Higgins D.G. et al, Methods in Enzymology, 266:383-402 (1996); Larkin M.A. et al, Bioinformatics (Oxford, England), 23(21): 2947-8 (2007) 참조), ALIGN 또는 Megalign(DNASTAR) 소프트웨어와 같은 공개적으로 이용가능한 도구를 사용하여 달성될 수 있다. 당업자는 도구에 의해 제공된 기본 파라미터를 사용할 수 있거나, 또는 예를 들어, 적합한 알고리즘을 선택함으로써 파라미터를 정렬에 적절하게 맞출 수 있다.
일 양태에서, 본 개시내용은 2개 또는 3개의 기능적 도메인을 포함하는 실질적으로 융합 폴리펩타이드/단백질인 폴리펩타이드를 제공하며, 2개의 인접한 모든 기능적 도메인은 링커를 통해 작동가능하게 연결된다. 선택적으로, 융합 폴리펩타이드/단백질은 접합될 수 있다.
도 1a 및 도 1b는 본 개시내용에서 제공되는 폴리펩타이드의 2개의 주요 구현예를 예시한다. 도 1a에 나타낸 바와 같이, 폴리펩타이드(001A)의 제1 구현예는 N-말단에서 C-말단 방향으로 제1 단편(100) 및 제2 단편(200)을 포함하며, 이들은 제1 링커(10)를 통해 연결된다. 제1 단편(100)은 실질적으로 혈청 알부민, 예컨대 인간 혈청 알부민(HSA)에 결합할 수 있는 나노바디 도메인을 포함한다. 제2 단편(200)은 생물학적 활성 FGF21 도메인을 포함하며, 이는 실질적으로 FGF21의 기능적 형태를 포함하고, 본 개시내용의 특정 구현예에 따르면, 서열번호 1의 생물학적 활성을 실질적으로 유지하면서 서열번호 1에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
선택적으로, 폴리펩타이드는 제1 단편(100) 내의 나노바디 도메인 및 제2 단편(200) 내의 FGF21 도메인 외에 또 하나의 추가적인 기능적 도메인을 추가로 포함할 수 있다. 도 1b에 나타낸 바와 같이, 도 1a에 예시된 제1 구현예에서와 같은 제1 단편(100) 및 제2 단편(200) 외에도, 폴리펩타이드(001B)의 이러한 제2 구현예는 제1 단편(100)의 N-말단을 넘어 제3 단편(300)을 추가로 포함한다. 제3 단편(300)은 제2 단편(200) 내의 FGF21 도메인에 부가적이거나 이와 시너지 효과를 내는 생물학적 활성을 나타낼 수 있는 추가적인 기능적 도메인을 포함한다. 제1 단편(100) 및 제3 단편(300)은 제2 링커(20)를 통해 연결된다. 본 개시내용의 일부 구현예에 따르면, 제3 단편(300) 내의 이러한 추가적인 기능적 도메인은 생물학적 활성 글루카곤 유사 펩타이드-1(GLP-1) 도메인이며, 이는 실질적으로 GLP-1의 기능적 형태를 포함한다. 일부 구현예에 따르면, 서열번호 28의 생물학적 활성을 실질적으로 유지하면서 서열번호 28에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "기능적 형태"는 아미노산 서열 또는 화학 구조에 차이를 가짐에도 불구하고 모 분자의 실질적인 생물학적 활성을 여전히 유지하는 모 분자의 상이한 형태(예컨대, 변이체, 단편/부분, 융합, 유도체 및 모방체)를 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같이, 표현 "실질적인 생물학적 활성을 유지한다"는 모 분자의 생물학적 활성의 적어도 일부(예를 들어, 약 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90% 이상) 또는 전부를 나타내는 것을 의미한다. 모 폴리펩타이드의 기능적 형태는 자연 발생 변이체 형태 및 비자연 발생 형태, 예컨대 재조합 방법 또는 화학적 합성에 의해 수득된 것 모두를 포함할 수 있다. 기능적 형태는 비자연 아미노산 잔기를 함유할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "변이체"는 모 폴리펩타이드에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖고 모 폴리펩타이드의 적어도 부분적인 기능을 유지하는 폴리펩타이드를 지칭한다. 변이체는 모 폴리펩타이드와 하나 이상의 아미노산 잔기가 상이할 수 있다. 예를 들어, 변이체는 모 폴리펩타이드의 하나 이상의 아미노산 잔기의 치환, 추가, 결실, 삽입, 또는 절단을 가질 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "단편" 또는 "부분"은 임의의 길이의 모 폴리펩타이드의 부분적 서열을 지칭한다. 단편은 모 폴리펩타이드의 적어도 부분적인 기능을 여전히 유지할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "유도체"는 하나 이상의 잘 정의된 치환기가 폴리펩타이드 또는 융합 폴리펩타이드의 하나 이상의 특정 아미노산 잔기에 공유 결합된, 화학적으로 변형된 폴리펩타이드 또는 융합 폴리펩타이드를 지칭한다. 예시적인 화학적 변형은, 예컨대 하나 이상의 아미노산의 알킬화, 아실화, 에스테르화, 아미드화, 인산화, 글리코실화, 표지화, 메틸화, 또는 하나 이상의 모이어티와의 접합일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "모방체"는 아미노산, 펩타이드, 폴리펩타이드, 또는 융합 폴리펩타이드의 대체물로서 작용하는 분자 구조를 지칭한다. 예를 들어, 본원에 사용된 바와 같은 아미노산 모방체는 아미노산일 수도 있고 아닐 수도 있는 합성 구조(알려져 있거나 아직 알려져 있지 않음)일 수 있지만, 모 아미노산의 기능적 특징을 유지하는 한편, 아미노산 모방체의 구조는 모 아미노산의 구조와 상이하다. 예는 아미드의 메타크릴로일 또는 아크릴로일 유도체, β-, γ-, δ-이미노산(예컨대, 피페리딘-4-카르복실산) 등을 포함한다.
FGF21 도메인
본원에 개시된 폴리펩타이드는 FGF21 도메인을 포함한다. 예를 들어, 본원에 개시되고 도 1a 및 1b에 예시된 폴리펩타이드의 제1 및 제2 구현예 각각은 FGF21 도메인을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "FGF21"은 "섬유아세포 성장 인자 21"을 지칭하며 이의 줄임말로서, 천연 인간 FGF21뿐만 아니라 이의 기능적 변이체, 단편, 융합, 유도체 또는 모방체를 포함한 모든 기능적 형태를 광범위하게 포괄하는 것으로 의도된다. 천연 인간 FGF21은 209개의 아미노산 잔기(등록 번호 Q9NSA1을 갖는 Uniprot 데이터베이스)로 구성되며, 아미노산 잔기 1-28은 신호 폴리펩타이드이고, 아미노산 잔기 29-209는 181개의 잔기의 성숙한 폴리펩타이드이다. 본 개시내용에 제공된 바와 같이, 표현 "생물학적 활성 FGF21 도메인"은 성숙한 폴리펩타이드, 또는 이의 기능적 변이체, 단편, 융합, 유도체 또는 모방체일 수 있는 FGF21의 기능적 형태를 지칭한다. 인간 FGF21의 성숙한 폴리펩타이드는 본원에서 서열번호 1로서 포함된다. 본원에 사용된 바와 같이, FGF21에서의 잔기의 넘버링은 위치 1에서의 His 및 위치 181에서의 Ser로 시작하는 서열번호 1의 서열을 참조한다.
FGF21의 성숙한 폴리펩타이드의 기능적 형태는 천연 인간 FGF21의 성숙한 폴리펩타이드와 유사하거나, 또는 약 20% 이상(또는 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 이상)의 수준으로 FGF21 수용체를 활성화할 수 있다. FGF21 수용체의 활성화는, 예를 들어 지방세포에서 글루코스 흡수를 활성화하는 능력, 혈당 및 중성지방 수준을 낮추는 능력, 또는 체중을 낮추는 능력과 같은 생물학적 활성으로 이어질 수 있다(Tezze C etl al, Front Physiol. 2019, 10:419). FGF21의 성숙한 폴리펩타이드의 많은 기능적 형태, 예를 들어, 비제한적으로 WO2019043457A2, WO2018088838A1, WO2018039081A1, WO2017220706A1, WO2017180988A2, WO2017116207A1, WO2017093465, WO2017059371A1, WO2016102562A1, WO2016065326A, WO2013173158A1, WO2013052311A1, WO2013033452A2, WO2012066075A1, WO2012059873A2, WO2012010553A1, WO2011140086A2, WO2010084169A2, WO2010065439A1, WO2008121563A2, WO2006028595A2, WO2006028714A1, WO2005113606A2, WO2016102562A에 개시된 것이 당업계에 알려져 있으며, 이의 개시내용은 그 전체가 본원에 포함되어 있다.
특정 구현예에서, 본원에 제공된 FGF21 도메인은 서열번호 1의 실질적인 생물학적 활성을 유지하면서 서열번호 1에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, FGF21 도메인은 서열번호 1의 실질적인 생물학적 활성을 유지하면서 서열번호 1에 대해 12, 11, 10, 9, 8, 7개 이하의 아미노산 돌연변이(예컨대, 치환, 삽입, 또는 결실)를 포함한다. 특정 구현예에서, FGF21 도메인은 서열번호 2-14, 16-19, 89-92, 및 102-105의 아미노산 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, FGF21은 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 돌연변이는 보존적 치환을 포함한다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 돌연변이는 서열번호 1에 대해 121, 168, 171 및 180으로 이루어진 위치로부터 선택된 위치에 있다.
특정 구현예에서, FGF21 도메인 내의 하나 이상의 돌연변이는 N121Q, M168L, P171G 및 A180E, 또는 이들의 임의의 조합으로부터 선택된다. 예를 들어, 본원에 개시된 폴리펩타이드 내의 FGF21 도메인은 선택적으로 4개의 돌연변이 중 1개, 4개의 돌연변이 중 2개, 4개의 돌연변이 중 3개 또는 돌연변이 중 4개를 함유할 수 있다.
특정 구현예에서, FGF21 도메인은
1) N121Q,
2) M168L;
3) A180E;
4) N121Q 및 M168L;
5) N121Q 및 A180E;
6) M168L 및 A180E;
7) N121Q, P171G 및 A180E;
8) N121Q, M168L, 및 P171G;
9) M168L, P171G 및 A180E; 및
10) N121Q, M168L, P171G 및 A180E
로 이루어진 군으로부터 선택된 서열번호 1에 대한 돌연변이의 조합을 포함한다
특정 구현예에서, FGF21 도메인은 서열번호 2(N121Q), 서열번호 3(M168L), 서열번호 4(A180E), 서열번호 5(N121Q, M168L, 및 A180E), 서열번호 89(N121Q 및 M168L), 서열번호 90(N121Q 및 A180E), 서열번호 91(M168L 및 A180E), 또는 서열번호 14(N121Q, M168L, P171G 및 A180E)에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다,
특정 구현예에서, 폴리펩타이드 내의 FGF21 도메인은 기능적 모이어티가 접합되는 접합가능한 잔기 또는 최대 하나의 접합가능한 잔기를 추가로 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "접합가능한 잔기"는 폴리펩타이드 내의 특정 위치에 있는 아미노산 잔기를 지칭하며, 이는 화학적 또는 효소적으로 화학적 모이어티에 접합될 수 있는 작용기를 가질 뿐만 아니라 폴리펩타이드 내의 그 위치는 해당 특정 작용기에 대한 접합 반응에서 이를 이러한 접합에 취약하게 만든다. 본원에 사용된 바와 같이, "접합"은 2개의 분자를 결합하여 하나의 물리적 엔티티를 형성하는 반응을 지칭한다. 예를 들어, 2개의 분자를 연결하는 공유 결합은 접합으로 형성될 수 있다. 접합가능한 잔기는 자연 아미노산 잔기, 비자연 아미노산 잔기, 변형된 아미노산 잔기 또는 아미노산 모방체일 수 있다. 접합가능한 잔기의 예는, 비제한적으로 리신, 시스테인, 또는 비자연 아미노산 잔기를 포함한다.
당업자는 잔기가 접합가능한 잔기인지 여부가 주어진 접합 반응, 및/또는 접합될 작용기에 따라 달라질 것임을 이해할 것이다. 예를 들어, 접합될 작용기가 티올기이고/거나 접합 반응이 티올기에 대해 특이적이거나 선택적이면, 리신(즉, 그의 측쇄에 작용성 티올기가 없음)은 그의 위치에 관계없이 접합가능한 잔기가 아닌 반면, 이황화 결합(사슬내 결합 또는 사슬간 결합이든 간에)을 형성하지 않는 쌍을 형성하지 않은 시스테인 잔기는 접합가능한 잔기일 수 있다.
특정 구현예에서, 폴리펩타이드는 티올기에 특이적 또는 선택적인 접합 반응(예를 들어, 말레이미드 반응, 또는 이황화 결합 형성을 위한 반응)을 위한 접합가능한 잔기를 포함한다. 아미노산 잔기를 언급할 때 표현 "접합가능한"은 폴리펩타이드 내의 특정 위치에 있는 잔기가 접합을 위해 충분히 접근가능하다는 것을 의미하는 것으로 의도된다. 예를 들어, 이황화 브릿지의 일부로서 시스테인 잔기는 본 개시내용에서 접합가능한 잔기가 아니다.
특정 구현예에서, 접합가능한 잔기는 시스테인 잔기이며, 바람직하게는 이황화 브릿지의 일부가 아닌 유리 시스테인 잔기이다.
특정 구현예에서, 본원에 제공된 폴리펩타이드의 FGF21 도메인 내의 접합가능한 잔기(CR)는 FGF21 도메인에 걸쳐 있는 C-말단 단편, 예컨대 서열번호 1에 대해 위치 169 내지 위치 181 내의 위치에 있을 수 있다. 추가로 선택적으로, 접합가능한 잔기는 서열번호 1에 대해 위치 169, 170, 171, 172, 173, 174, 180 및 181로 이루어진 군으로부터 선택된 위치에 있을 수 있다. 임의의 이론에 구속되길 바라지 않지만, FGF21 도메인의 C-말단 단편에서의 접합이 FGF21 도메인의 C-말단 분해를 감소시킨다는 것이 본 발명자들에 의해 확인된다.
특정 구현예에서, 폴리펩타이드 내의 FGF21 도메인은 1) N121Q 및 M168L, 2) N121Q, M168L 및 P171G, 3) N121Q, M168L 및 A180E, 또는 4) N121Q, M168L, P171G 및 A180E의 돌연변이의 조합을 가지며, 서열번호 1에 대해 위치 169, 170, 171, 172, 173, 174, 또는 180, 181에 접합가능한 잔기(예컨대, 시스테인 잔기)를 추가로 포함한다.
특정 구현예에서, 폴리펩타이드 내의 FGF21 도메인은 N121Q 및 M168L의 돌연변이의 조합, 또는 N121Q, M168L 및 P171G의 조합 돌연변이를 가지며, 서열번호 1에 대해 위치 180에 접합가능한 잔기(예컨대, 시스테인 잔기)를 추가로 포함한다.
특정 구현예에서, 폴리펩타이드 내의 FGF21 도메인은 N121Q, P171G 및 M168L의 돌연변이의 조합, 또는 N121Q, M168L, P171G 및 A180E의 조합 돌연변이를 가지며, 하기와 같이 열거된, 서열번호 1에 대한 위치에 접합가능한 잔기를 추가로 포함한다: 위치 169, 위치 170, 위치 172, 위치 173, 또는 위치 174에 있는 도입된 시스테인 잔기(예컨대, 치환을 통해).
특정 구현예에서, 폴리펩타이드 내의 FGF21 도메인은 위치 169(예컨대, 서열번호 6), 위치 170(예컨대, 서열번호 7), 위치 171(예컨대, 서열번호 8), 위치 172(예컨대, 서열번호 9), 위치 173(예컨대, 서열번호 10), 위치 174(예컨대, 서열번호 11, 또는 서열번호 92), 위치 180(예컨대, 서열번호 12), 또는 위치 181(예컨대, 서열번호 13)에 도입된 시스테인 잔기를 갖는다. 특정 구현예에서, FGF21은 서열번호 1에 대해 각각 위치 121, 168, 171, 및 180으로부터 선택된 위치에, 하나 이상의 아미노산 잔기 돌연변이를 제외하고, 서열번호 2-5, 89-91, 14, 및 102-105의 아미노산 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, 폴리펩타이드 내의 FGF21 도메인은 위치 171(예컨대, 서열번호 14)에 도입된 G를 갖는다. 임의의 이론에 얽매이길 바라지 않지만, FGF21 도메인 내에 171G를 도입하는 것이 또한 FGF21 도메인의 C-말단 분해를 감소시키는 데 유용할 수 있음이 본 발명자들에 의해 확인된다.
특정 구현예에서, 폴리펩타이드 내의 FGF21 도메인은 N121Q, P171G 및 M168L의 돌연변이의 조합, 또는 N121Q, M168L, P171G 및 A180E의 조합 돌연변이를 가지며, 하기에 열거된 바와 같이, 서열번호 1에 대한 위치에 접합가능한 잔기를 추가로 포함한다: 위치 172, 위치 173, 위치 174에 도입된 T로서, 여기서 위치는 서열번호 1에 대한 것이며; 또는 위치 170 또는 위치 174에 도입된 N으로서, 여기서 위치는 서열번호 1에 대한 것이다.
특정 구현예에서, 폴리펩타이드 내의 FGF21 도메인은 서열번호 1에 대해 위치 172(예컨대, 서열번호 16) 또는 위치 173(예컨대, 서열번호 17)에 도입된 T; 또는 위치 170(예컨대, 서열번호 18) 또는 위치 174(예컨대, 서열번호 19)에 도입된 N을 갖는다. 특정 구현예에서, 폴리펩타이드 내의 FGF21 도메인은 서열번호 16-19로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는다.
FGF21 도메인 상의 기능적 모이어티
도 1a 및 도 1b에 나타낸 폴리펩타이드의 제1 및 제2 구현예에서. 폴리펩타이드(001A 및 001B) 중 하나 또는 둘 모두는 선택적으로 제2 단편(200)(즉, FGF21 도메인) 내의 접합가능한 잔기(CR)(두 도면에서 "*"로 예시된 바와 같음)에 있는 기능적 모이어티(800)와 접합되어 폴리펩타이드 접합체를 형성할 수 있다. 특정 다른 구현예에서, 폴리펩타이드는, 예를 들어 폴리펩타이드가 위치 171에 도입된 G를 갖는 경우, 기능적 모이어티와 접합되지 않는다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "접합체"는 하나의 물리적 엔티티를 형성하기 위해 함께 결합된 2개 이상의 분자의 결과로서의 화합물을 지칭한다. 예를 들어, 본 개시내용의 폴리펩타이드는, 특정 구현예에 따르면, 폴리펩타이드 접합체를 형성할 수 있으며, 이는 실질적으로 폴리펩타이드와 기능적 모이어티가 함께 결합되어 생성되는 화합물이다. 분자(예컨대, 기능적 모이어티 및 폴리펩타이드)는 공유 결합, 비공유 결합, 링커, 화학적 변형, 또는 단백질 융합에 의해, 또는 당업자에게 공지된 임의의 수단에 의해 함께 부착될 수 있다. 바람직하게는, 분자는 공유 결합에 의해 함께 부착될 수 있다. 부착은 영구적이거나 가역적일 수 있다. 일부 구현예에서, 특정한 절단가능한 또는 비절단가능한 링커가 포함될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "기능적 모이어티"는 생물학적, 약동학(PK), 약력학(PD) 특성을 기능적으로 변경할 수 있는(예컨대, 생물학적 활성을 향상시키거나, 시험관내 안정성을 증가시키거나, 생체내 반감기 증가시키거나, 또는 표적 수용체에의 결합을 향상시키는 등) 모이어티를 지칭한다. FGF2 도메인에 접합된 기능적 모이어티는 선택적으로 글리코실 모이어티 또는 합성 화학적 모이어티를 포함할 수 있다.
선택적으로, 기능적 모이어티(800)는 합성 화학적 모이어티를 포함할 수 있고, 접합가능한 잔기(CR)는 합성 화학적 모이어티와 접합될 수 있는 도입된 잔기일 수 있다.
일부 구현예에 따르면, 접합가능한 잔기(CR)는 서열번호 1에 대해 상기 언급된 위치 169, 170, 171, 172, 173, 174, 180 및 181 중 어느 것에 도입된 시스테인 잔기일 수 있다. 본원에서, 합성 화학적 모이어티는 선택적으로 *-X-Y-Z의 구조를 포함할 수 있고, 여기서 X, Y, 및 Z는 결합을 통해 상호연결되며, X의 * 말단은 폴리펩타이드 상의 접합가능한 잔기에 연결된다. 본원에서, X는 일 수 있으며, Y는 , 또는 일 수 있고, Z는 일 수 있으며, 여기서 위치 α는 α'에 연결되고, 위치 β는 위치 β'에 연결된다. 본원에서, R1은 수소 또는 -COOH일 수 있고, d는 1, 2, 또는 3일 수 있으며, a는 1, 2 또는 3일 수 있고, b는 1, 2 또는 3일 수 있으며, c는 1 또는 2일 수 있고, d는 1, 2, 또는 3일 수 있으며, e는 1, 2, 또는 3일 수 있다.
일부 구현예에 따르면, 합성 화학적 모이어티는 Ac-2XADO-EDA-CO-CH2*일 수 있으며, 여기서 * 말단은 하기 구조를 갖는 폴리펩타이드 상의 접합가능한 시스테인 잔기에 연결된다:
.
서열이 서열번호 6-13 및 92에 제시된 상기 표시된 바와 같이 이들의 각각의 위치에 도입된 시스테인 잔기를 포함하는 FGF21 도메인의 상기 구현예 각각에서, 합성 화학적 모이어티, 예컨대 Ac-2XADO-EDA-CO-CH2-*는 도입된 시스테인 잔기에서 접합되어(예컨대, 치환을 통해) 합성 화학적 모이어티를 갖는 폴리펩타이드 접합체를 얻을 수 있다.
접합된 기능적 모이어티를 갖는 폴리펩타이드에서, 기능적 모이어티(800)는 선택적으로 글리코실 모이어티를 포함할 수 있고, 그에 따라 접합가능한 잔기(CR)는 서열번호 1에 대해 위치 172 또는 위치 173에 도입된 T, 또는 위치 170 또는 위치 174에 도입된 N 잔기일 수 있는 글리코실화가능한(즉, 글리코실화될 수 있는) 도입된 잔기일 수 있다.
서열이 서열번호 16-19에 제시된 상기 표시된 바와 같이 이들의 각각의 위치에 도입된 T 또는 N을 포함하는 FGF21 도메인의 상기 구현예 각각에서, 글리코실 모이어티는 도입된 시스테인 잔기에서 접합되어 글리코실 모이어티를 갖는 폴리펩타이드 접합체를 얻을 수 있다.
특정 구현예에서, FGF21 도메인은 서열번호 1에 대해 위치 171에 도입된 G를 포함하며, 기능적 모이어티와 접합되지 않는다. 특정 구현예에서, 이러한 FGF21 도메인은 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
나노바디 도메인
본원에 개시되고 도 1a 및 1b에 예시된 폴리펩타이드의 제1 및 제2 구현예 각각은 나노바디 도메인을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "나노바디"는 "단일 도메인 항체"와 상호교환적인 것으로 고려되며, 이는 중쇄의 단일 가변 도메인 또는 경쇄의 단일 가변 도메인을 함유하는 항체 단편을 지칭한다. 나노바디는 3개의 상보성 결정 영역(CDR)을 함유한다. 특정 구현예에서, 나노바디는 특정 항원(예컨대, 혈청 알부민)에 결합할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "혈청 알부민"은 척추동물 혈액에서 발견되는 알부민(구상 단백질의 유형)을 지칭한다. 혈청 알부민은 간에 의해 생성되며, 혈장에 용해되어 존재하며, 포유동물에서 가장 풍부한 혈액 단백질이다. 혈청 알부민은 전형적으로 약 3주의 반감기를 가지며, 이는 주로 신생아 Fc 수용체(FcRn)에 의해 조절된다. FcRn은 혈청 알부민과 높은 친화성으로 결합하고 이를 리소좀 경로로부터 우회시켜 이를 세포외 구획으로 돌려보냄으로써 혈청 알부민을 세포내 분해로부터 보호한다. 일부 구현예에서, 혈청 알부민은 인간 혈청 알부민(HSA), 시노몰구스 원숭이 혈청 알부민 및 마우스 혈청 알부민으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 혈청 알부민은 HSA이다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "항체"는 특정 항원에 결합하는 임의의 면역글로불린을 포함한다. 기존 항체(예컨대, 인간 또는 마우스로부터의 항체)는 2개의 중쇄(H) 및 2개의 경쇄(L)를 포함한다. 중쇄는 α, δ, ε, γ, 및 μ로 분류되며, 각 중쇄는 가변 도메인(VH 도메인) 및 제1, 제2, 제3, 및 선택적으로 제4 불변 영역(각각 CH1, CH2, CH3, CH4)으로 구성된다. 경쇄는 λ 또는 κ로 분류되며, 각 경쇄는 가변 도메인(VL 도메인) 및 불변 도메인으로 구성된다. 항체는 "Y" 모양을 가지며, Y의 줄기는 이황화 결합을 통해 함께 결합된 2개의 중쇄의 제2 및 제3 불변 도메인으로 구성된다. Y의 각각의 팔은 단일 경쇄의 가변 및 불변 도메인에 결합된 단일 중쇄의 가변 도메인 및 제1 불변 도메인을 포함한다. 경쇄 및 중쇄의 가변 도메인은 항원 결합을 담당한다. 두 사슬 내의 가변 도메인은 일반적으로 상보성 결정 영역(CDR, 즉 경쇄 또는 중쇄의 CDR1, CDR2, 및 CDR3)으로 불리는 3개의 초가변 영역을 함유한다. 본원에 개시된 항체 및 항원 결합 단편에 대한 CDR 경계는 카바트(Kabat), IMGT, 초티아(Chothia), 또는 알-라지카니(Al-Lazikani)의 관례에 의해 정의되거나 식별될 수 있다(Al-Lazikani, B., Chothia, C., Lesk, A. M., J. Mol. Biol., 273(4), 927 (1997); Chothia, C. et al., J Mol Biol. Dec 5;186(3):651-63 (1985); Chothia, C. and Lesk, A.M., J. Mol. Biol., 196,901 (1987); Chothia, C. et al., Nature. Dec 21-28;342(6252):877-83 (1989); Kabat E.A. et al., Sequences of Proteins of immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991); Marie-Paule Lefranc et al., Developmental and Comparative Immunology, 27: 55-77 (2003); Marie-Paule Lefranc et al., Immunome Research, 1(3), (2005); Marie-Paule Lefranc, Molecular Biology of B cells (second edition), chapter 26, 481-514, (2015)). 3개의 CDR은 프레임워크 영역(FR, 즉 경쇄 또는 중쇄의 FR1, FR2, FR3 및 FR4)으로 알려진 측접 스트레치 사이에 개재되며, 이는 CDR보다 더 고도로 보존되고 고도로 가변적인 루프를 지원하는 스캐폴드를 형성한다. 중쇄 및 경쇄의 불변 도메인은 항원 결합에 관여하지 않지만, 다양한 효과기 기능을 나타낸다. 기존 항체는 그들의 중쇄의 불변 영역의 아미노산 서열에 기초하여 부류에 할당된다.
단일 가변 도메인은 낙타과 항체의 가변 도메인(VHH 도메인), 또는 연골 어류 항체의 가변 도메인(VNAR 도메인)으로부터 유래될 수 있다. 낙타과 항체 및 연골 어류 항체 모두는 자연적으로 경쇄가 부족하고, 한 쌍의 중쇄로 구성된다. 대안적으로, 단일 가변 도메인은 기존 항체(예컨대, 인간 또는 마우스로부터의) 중쇄의 가변 도메인(VH 도메인) 또는 일반 항체 경쇄의 가변 도메인(VL 도메인)으로부터 유래될 수 있다. 단일 도메인 항체는 크기가 상당히 작으며, 예를 들어 25 kD 이하, 20 kD 이하, 15 kD 이하, 또는 10 kD 이하의 분자량을 갖는 것으로 생각된다.
용어 "나노바디" 또는 "단일 도메인 항체"는 본원에서 최광의 의미로 사용되며, 특정 생물학적 공급원 또는 특정 제조 방법에 제한되지 않는다는 점에 유의해야 한다. 예를 들어, 단일 도메인 항체는, 예를 들어 (1) 자연 발생 중쇄 항체의 VHH 도메인 또는 VNAR 도메인을 단리함으로써, (2) 자연 발생 VHH 도메인 또는 VNAR 도메인을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 발현에 의해, (3) 자연 발생 VHH 도메인 또는 VNAR 도메인의 "인간화"(하기 기재된 바와 같음)에 의해 또는 이러한 인간화된 VHH 도메인 또는 VNAR 도메인을 코딩하는 핵산의 발현에 의해, (4) 임의의 동물 종, 특히 포유동물의 종으로부터의, 예컨대 인간으로부터의 자연 발생 VH 도메인의 "카멜화", 또는 이러한 낙타화된 VH 도메인을 코딩하는 핵산의 발현에 의해, (5) 단백질, 폴리펩타이드 또는 다른 아미노산 서열을 제조하기 위한 합성 또는 반합성 기술을 사용하여, 및/또는 (6) 전술한 것의 임의의 조합에 의해 수득될 수 있다. 전술한 것을 수행하기 위한 적합한 방법 및 기술은 숙련자에게 명확할 것이다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 단일 도메인 항체는 낙타과 종, 예를 들어 낙타, 단봉 낙타, 알파카 및 과나코에서 자란 항체로부터 유래된 VHH 도메인을 포함한다. VHH 도메인을 포함하는 단일 도메인 항체는 매우 가용성이며, 열, pH, 프로테아제 및 기타 변성제 또는 조건에 매우 안정적이다.
일부 구현예에서, 제1 폴리펩타이드 단편은 혈청 알부민에 특이적으로 결합할 수 있는 하나 이상의 단일 도메인 항체를 포함한다.
결합 분자, 예컨대, 항체, 및 그의 결합 파트너, 예컨대, 항원의 상호작용과 관련하여 용어 "결합 특이성", "특이적 결합" 또는 "특이적으로 결합한다"는 상호작용이 결합 파트너 상의 특정 구조, 예컨대, 항원 결정인자 또는 에피토프의 존재에 따라 달라진다는 것을 의미한다. 다시 말해서, 항체는 결합 파트너가 다른 분자 또는 유기체의 혼합물에 존재하는 경우에도 결합 파트너와 우선적으로 결합하거나 이를 인식한다. 항원에 면역특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 단편은 동일한 에피토프를 가지는 관련 항원과 교차 반응할 수 있다. "결합 특이성"은 일반적으로 비특이적 백그라운드 결합과 비교하여 측정된다. 전형적으로, 항체는 백그라운드 결합보다 적어도 10배 초과로 타겟 항원에 결합하는 경우 특이적인 것으로 고려된다.
본원에서 고려되는 혈청 결합 단일 도메인 항체는 FcRn에 대한 상기 혈청 알부민 분자의 결합이 (유의하게) 감소되거나 억제되지 않는 방식으로(즉, 단일 도메인 항체가 이에 결합되지 않은 경우 FcRn에 대한 상기 혈청 알부민 분자의 결합과 비교하여) 혈청 알부민에 결합하거나 회합할 수 있다. 본 발명의 본 양태에서, "유의하게 감소되거나 억제되지 않는다"는 것은 FcRn에 대한 혈청 알부민의 결합 친화성(SPR과 같은 적합한 분석을 사용하여 측정된 바와 같음)이 50% 넘게 감소되지 않거나, 바람직하게는 30% 넘게 감소되지 않거나, 더욱 바람직하게는 10% 넘게 감소되지 않거나, 예컨대 5% 넘게 감소되지 않거나, 또는 본질적으로 전혀 감소되지 않는 것을 의미한다. 이 양태에서, "유의하게 감소되거나 억제되지 않는다"는 것은 또한 혈청 알부민 분자의 반감기가 유의하게 감소되지 않는(예컨대, 그 자체로 공지된 적합한 기술을 사용하여 측정될 때, 50% 넘게 감소되지 않거나, 바람직하게는 30% 넘게 감소되지 않거나, 더욱 바람직하게는 10% 넘게 감소되지 않거나, 예컨대 5% 넘게 감소되지 않거나, 또는 본질적으로 전혀 감소되지 않는) 것을 의미할 수도 있다. 일부 구현예에서, 단일 도메인 항체는 FcRn에 대한 혈청 알부민의 결합에 관여하지 않는 혈청 알부민 상의 아미노산 잔기에 결합할 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 단일 도메인 항체는 HSA, 시노몰구스 원숭이 혈청 알부민 및 마우스 혈청 알부민으로부터 선택된 혈청 알부민에 결합한다. 일부 구현예에서, 마우스 혈청 알부민에 대한 결합 친화성은 인간 또는 시노몰구스 혈청 알부민에 대한 결합 친화성보다 약간 약하다. 일부 구현예에서, 단일 도메인 항체는 HSA에 특이적으로 결합한다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 단일 도메인 항체는 충분한 결합 친화성으로 혈청 알부민에 결합한다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "친화성"은 면역글로불린 분자(즉, 항체) 또는 이의 단편 및 항원 간의 비공유 상호작용의 세기를 지칭한다. 친화성은 "Kd" 값을 사용하여 수치적으로 표현될 수 있다. 일반적으로, 낮은 Kd 값은 강한 결합에 해당한다. Kd는, 비제한적으로 방사면역분석(RIA), 효소 결합 면역흡착 분석(ELISA), 표면 플라즈몬 공명(SPR) 방법, 현미경 열영동 방법, HPLC-MS 방법 및 유세포분석법(예컨대, FACS)을 포함하는, 당업자에 알려진 임의의 기존 방법을 사용하여 결정될 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 항체는 특정 항원과 ≤10-6 M(예컨대, ≤ 5x10-7 M, ≤ 2x10-7 M, ≤ 10-7 M, ≤ 5x10-8 M, ≤ 2x10-8 M, ≤ 10-8 M, ≤ 5x10-9 M, ≤ 4x10-9 M, ≤ 3x10-9 M, ≤ 2x10-9 M 또는 ≤ 10-9 M)의 Kd 값을 가진다.
특정 구현예에서, 본원에 제공된 단일 도메인 항체는 10-5 M 내지 1x10-12 M 이하, 10-7 M 내지 1x10-12 M 이하, 또는 10-8 M 내지 1x10-12 M 이하의 Kd 값으로 HSA에 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, Kd는 1x10-7 M 이하(예컨대, 5x10-7 M 이하, 2x10-7 M 이하, 10-7 M 이하, 5x10-8 M 이하, 2x10-8 M 이하, 10-8 M 이하, 5x10-9 M 이하, 4x10-9 M 이하, 3x10-9 M 이하, 2x10-9 M 이하, 또는 10-9 M 이하)이다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 단일 도메인 항체는 인간화 항체이다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "인간화"는 단일 도메인 항체가 비인간 동물로부터 유래된 CDR, 및 인간으로부터 유래된 FR 영역을 포함한다는 것을 의미한다. 인간화 항체 폴리펩타이드는 인간에서의 그의 감소된 면역원성에서 바람직하다. 인간화 항체 폴리펩타이드는 비인간 CDR 서열이 인간 또는 실질적으로 인간 FR 서열에 이식되기 때문에 그의 가변 영역에서 키메라성이다. 항체 폴리펩타이드의 인간화는 본질적으로 비인간(예컨대, 낙타과) CDR 유전자를 인간 면역글로불린 유전자 내의 상응하는 인간 CDR 유전자로 치환함으로써 수행될 수 있다(예를 들어, Jones et al. (1986) Nature 321:522-525; Riechmann et al. (1988) Nature 332:323-327; Verhoeyen et al. (1988) Science 239:1534-1536 참조).
상 디스플레이를 사용하여 단리된 완전 인간 도메인 항체, 낙타과로부터 개발된 VHH 항체, 및 연골 어류로부터 개발된 VNAR 항체 등과 같이, 높은 친화성으로 HSA에 특이적으로 결합할 수 있는 다양한 단일 도메인 항체가 당업계에 알려져 있으며, 문헌[Zorzi, A et al, Med Chem Commun, 2019,10, 1068]을 참조한다. 예시적인 HSA 결합 단일 도메인 항체는 문헌[US8188223B2, US9067991B2, US9321832B2, PCT application WO2008028977A2, WO2008043822A2, WO2020099871A1, G. Winter, et al, Annu. Rev. Immunol., 1994, 12, 433-455., L. J. Holt, et al., Protein Eng., Des. Sel., 2008, 21(5), 283-288, A. Walker, et al., Protein Eng., Des. Sel., 2010, 23(4),271-278, L. J. Goodall, et al.,PLoS One, 2015, 10(9), e0137065, R. L. O'Connor-Semmes, et al., Clin. Pharmacol. Ther., 2014, 96(6), 704-712, C. Read, et al., Basic Clin. Pharmacol.Toxicol., 2019, 1-8, R. Adams, et al., mAbs, 2016, 8(7),1336-1346, E. Dave, et al., mAbs, 2016, 8(7), 1319-1335, S. Steeland, et al., Drug Discovery Today, 2016, 21(7), 1076-1113, K. Coppieters, et al., Arthritis Rheum., 2006, 54(6), 1856-1866, M. Van Roy, , et al., Arthritis Res. Ther., 2015, 17, 135, C. McMahon, et al., Nat. Struct. Mol. Biol., 2018, 25(3), 289-296, M. R. Muller, et al., mAbs, 2012, 4(6), 673-685]에 개시되어 있으며, 이들 모두는 본 개시내용의 범위 내에서 고려되며 참조로 포함된다.
일부 구현예에서, 단일 도메인 항체는 VHH 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, VHH 도메인은 인간화된다.
일부 구현예에서, VHH 도메인은 상보성 결정 영역 1(CDR1), CDR2 및 CDR3을 포함하며, 여기서 CDR1은 서열번호 20(SFGMS)의 서열 또는 최대 3, 2, 또는 1개의 아미노산 돌연변이를 갖는 이의 변이체를 포함하고, CDR2는 서열번호 21(SISGSGSDTLYADSVKG)의 서열 또는 최대 3, 2, 또는 1개의 아미노산 돌연변이를 갖는 이의 변이체를 포함하고/거나, CDR3은 서열번호 22(GGSLSR)의 서열 또는 최대 3, 2, 또는 1개의 아미노산 돌연변이를 갖는 이의 변이체를 포함하고, 여기서 VHH 도메인은 혈청 알부민, 선택적으로 인간 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 유지한다.
일부 구현예에서, VHH 도메인은 서열번호 20의 서열을 포함하는 상보성 결정 영역 1(CDR1), 서열번호 21의 서열을 포함하는 CDR2, 및 서열번호 22의 서열을 포함하는 CDR3을 포함한다.
일부 구현예에서, VHH 도메인은 서열번호 20의 서열로 구성되는 상보성 결정 영역 1(CDR1), 서열번호 21의 서열로 구성되는 CDR2, 및 서열번호 22의 서열로 구성되는 CDR3을 포함한다.
일부 구현예에서, VHH 도메인은 서열번호 23의 서열, 또는 서열번호 23에 대해 적어도 70%(예컨대, 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%) 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하며, 여기서 변이체는 혈청 알부민에 대한 결합 특이성 및/또는 친화성을 유지한다.
일부 구현예에서, 서열번호 23의 변이체는 서열번호 23에 대해 최대 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개의 아미노산 돌연변이를 갖는다.
도 1a에 예시된 폴리펩타이드의 특정 구현예에서, 혈청 알부민 결합 나노바디 도메인은 VHH 도메인에 부착된 N-말단 연장을 추가로 포함한다. 특정 구현예에서, N-말단 연장은 SG, AG, S 또는 A의 아미노산 잔기를 포함하며, 따라서 서열번호 24-27로부터 선택된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
특정 구현예에서, N-말단 연장은 태그, 선택적으로 절단가능한 태그를 포함한다. 임의의 이론에 구속되길 바라지 않지만, 특정 N-말단 연장은 발현 및 번역후 가공에 유용할 수 있는 것으로 여겨진다.
특정 구현예에서, 혈청 알부민 결합 나노바디 도메인은 VHH 도메인에 부착된 N-말단 연장을 포함하지 않는다. 예를 들어, VHH 도메인은 절단가능한 태그에 부착될 수 있으며, 이는 절단 후에 최종 생성물에 더 이상 존재하지 않는다.
일부 구현예에서, 제1 단편은 하나 이상의 혈청 알부민 결합 나노바디 도메인을 포함할 수 있다.
GLP-1 도메인
본원에 개시되고 도 1b에 예시된 폴리펩타이드의 제2 구현예는, 제2 단편(200) 내의 상기 기재된 FGF21 도메인 및 제1 단편(100) 내의 혈청 알부민 결합 나노바디 도메인 외에도, 추가적인 기능적 도메인을 포함하는 제3 단편(300)을 추가로 포함한다.
일부 구현예에 따르면, 추가적인 기능적 도메인은 생물학적 활성 GLP-1 도메인을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "글루카곤 유사 펩타이드-1" 또는 "GLP-1"은 천연 GLP-1 펩타이드 및 그의 모든 기능적 형태, 예컨대 그의 기능적 변이체, 단편, 융합, 유도체 및 모방체를 광범위하게 포괄하는 것으로 의도된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "천연 GLP-1 펩타이드"는 천연 인간 글루카곤 유사 펩타이드-1(GLP-1(7-37))을 지칭하며, 그 서열은 서열번호 28에 제시되어 있다. GLP-1 내의 잔기의 넘버링은 위치 7에서의 H 잔기로 시작하여 위치 37에서의 G 잔기로 끝나는 서열번호 28의 서열을 참조한다.
천연 GLP-1 펩타이드의 기능적 형태는 천연 GLP-1 펩타이드와 유사하거나 약 20% 이상(또는 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 이상)의 수준으로 GLP-1 수용체를 활성화할 수 있다. GLP-1 수용체의 활성화는 전형적으로 당업계에 공지된 바와 같이 인슐린분비 작용 또는 다른 생리학적 효과를 초래하는 신호 전달 경로를 개시한다. 예를 들어, 비제한적으로 리라글루타이드, 세마글루타이드, 둘라글루타이드, 알비글루타이드, 및 WO2000055203A1, WO 98/08871, WO2006/097537, WO2007139589A1, WO1998019698A1, WO2001098331A2, WO2003040309A2, WO2005000892A2, WO2015000942A1, WO2016083499A1에 개시된 것을 포함하는, GLP-1 펩타이드의 많은 기능적 형태가 당업계에 공지되어 있으며, 이의 개시내용은 그 전체가 본원에 포함되어 있다.
특정 구현예에서, 본원에 제공된 GLP-1은 서열번호 28의 실질적인 생물학적 활성을 유지하면서 서열번호 28에 대해 적어도 70%(예컨대, 적어도 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%) 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, GLP-1 도메인은 서열번호 28의 실질적인 생물학적 활성을 유지하면서 서열번호 28에 대해 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 또는 2개 이하의 치환을 포함한다. 특정 구현예에서, GLP-1 도메인은 서열번호 28의 실질적인 생물학적 활성을 유지하면서 서열번호 28에 대해 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 또는 9개의 치환을 포함한다.
특정 구현예에서, GLP-1 도메인은 하나 이상의 돌연변이를 추가로 포함한다. 당업자는 다양한 아미노산 치환, 예컨대, 보존적 아미노산 치환이 그의 활성을 반드시 감소시키지 않으면서 본원에 기재된 임의의 폴리펩타이드의 서열에서 이루어질 수 있음을 이해할 것이다. 아미노산 치환의 예는 L-아미노산을 그의 상응하는 D-아미노산으로 치환하는 것, 시스테인을 호모시스테인 또는 티올 함유 측쇄를 갖는 다른 비자연 아미노산으로 치환하는 것, 리신을 호모리신, 디아미노부티르산, 디아미노프로피온산, 오르니틴 또는 아미노 함유 측쇄를 갖는 다른 비자연 아미노산으로 치환하는 것, 또는 알라닌을 노르발린으로 대체하는 것 등을 포함한다.
다양한 치환이 천연 GLP-1 펩타이드에 도입되었고, 이는 그의 생물학적 활성을 유지하거나 심지어 개선할 수 있는 것으로 나타났다. 특정 구현예에서, GLP-1은 서열번호 28에 대해 A8, G22, K34, R36, 및 H7, 및 또는 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 위치에 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 예를 들어, A8에서의 치환은 잔기에서 DPP4 효소 절단을 방지하는 데 유용하고, G22에서의 치환은 활성 및 용해도를 개선하는 데 바람직하며, R36에서의 치환은 면역원성을 감소시키는 데 유용한 것으로 여겨진다. 특정 구현예에서, GLP-1은 서열번호 28에 대해 A8, G22, K26, K34, 및 R36, 및 또는 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 위치에 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 이들 위치에서의 치환의 예는, 비제한적으로 A8G, A8S, A8V, A8Aib, A8T, A8I, A8L, G22E, K26R, K34R, R36G, 또는 이들의 임의의 조합뿐만 아니라 그 전체가 본원에 포함된 미국 특허 8,273,854에 기재된 치환을 포함한다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 추가적인 치환은 보존적 치환을 포함한다.
특정 구현예에서, GLP-1 도메인은 A8G, A8S, A8V, A8Aib, A8T, 및 A8L로 이루어진 군으로부터 선택된 A8의 치환을 포함한다. 특정 구현예에서, GLP-1 도메인은 G22E의 치환을 포함한다. 특정 구현예에서, GLP-1 도메인은 R36G의 치환을 포함한다. 특정 구현예에서, GLP-1 도메인은 K26R인 K26의 치환을 포함한다. 특정 구현예에서, GLP-1 도메인은 K34R인 K34의 치환을 포함한다.
특정 구현예에서, GLP-1은 A8G, K26R, K34R, G22E, 및 R36G로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 치환을 포함하거나 이로 구성된다. 특정 구현예에서, GLP-1은 A8G, G22E, 및 R36G로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 치환을 포함하거나 이로 구성된다.
본 개시내용에서, 도 1b에서의 제3 단편(300) 내의 생물학적 활성 GLP-1 도메인의 적어도 하기 구현예가 제공된다:
(1) GLP-1의 야생형 기능적 형태를 대표하는, 서열번호 28;
(2) 치환 A8G, G22E, 및 R36G을 포함하는 GLP-1의 3치환 기능적 형태를 대표하는, 서열번호 29;
(3) 치환 A8G, G22E, K34R, 및 R36G를 포함하는 GLP-1의 4치환 기능적 형태를 대표하는, 서열번호 31;
(4) 치환 A8G, G22E, K26R, K34R, 및 R36G를 포함하는 GLP-1의 5치환 기능적 형태를 대표하는, 서열번호 32;
(4) 치환 A8G, G22E, K26R, K34R, 및 R36K를 포함하는 GLP-1의 5치환 기능적 형태를 대표하는, 서열번호 33; 및
(5) 치환 A8G, G22E, K26R, 및 R36G를 포함하는 GLP-1의 4치환 기능적 형태를 대표하는, 서열번호 34.
GLP-1 외에도, 도 1b에 예시된 바와 같은 제3 단편(300)의 추가적인 기능적 도메인은 대안적으로 인슐린, C-펩타이드, 렙틴, 글루카곤, 가스트린, 위 억제 폴리펩타이드(GIP), 아밀린, 칼시토닌, 콜레시스토키닌, 펩타이드 YY, 신경펩타이드 Y, 골 형성 단백질-6(BMP-6), 골 형성 단백질-9(BMP-9), 옥신토모둘린, 옥시토신, 글루카곤 유사 펩타이드-2(GLP-2), 이리신, 피브로넥틴 III형 도메인 함유 단백질 5(FNDC5), 아펠린, 아디포넥틴, Clq 및 종양 괴사 인자 관련 단백질(CTRP 계열), 레지스틴, 비스파틴, 오멘틴, 레티놀 결합 단백질-4(RBP-4), 글리센틴, 안지오포이에틴, 인터루킨-22(IL-22), 엑센딘-4, 또는 성장 호르몬의 생물학적 활성 형태(즉, 기능적 형태)를 포함할 수 있다.
제1 및/또는 제2 링커
본원에 개시되고 도 1a 및 1b에 예시된 폴리펩타이드의 제1 및 제2 구현예 각각은 제1 링커(10)를 활용하여 제1 단편(100)(혈청 알부민에 결합할 수 있는 나노바디 도메인 포함) 및 제2 단편(200)(생물학적 활성 FGF21 도메인 포함)을 연결하고, 도 1b에 예시된 폴리펩타이드의 제2 구현예는 제2 링커(20)를 활용하여 제1 단편(100) 및 제3 단편(300)(FGF21 도메인에 부가적 또는 시너지 효과를 갖는 생물학적 활성 추가적인 기능적 도메인, 예컨대 GLP-1 도메인 포함)을 연결한다.
제1 링커(10) 및/또는 제2 링커(20)와 같이 본원에 사용된 바와 같은 용어 "링커"는 일반적으로 "폴리펩타이드 링커"를 지칭하며, 이는 2개의 엔티티를 결합하여 하나의 분자를 형성할 수 있거나, 또는 2개의 엔티티의 각각의 생물학적 활성을 실질적으로 간섭하지 않으면서, 2개의 엔티티의 회합을 충분히 근접하게 유지할 수 있는 임의의 적합한 폴리펩타이드일 수 있다.
링커는 생성되는 연결된 분자 또는 구조에 통합될 수 있다. 본원에서, 제1 링커(10)는 2개의 기능적 도메인의 각각의 생물학적 활성에 실질적인 간섭 없이 나노바디 도메인(100) 및 FGF21 도메인(200)을 작동가능하게 분리하고, 제2 링커(20)는 2개의 기능적 도메인의 각각의 생물학적 활성에 실질적인 간섭 없이 GLP-1 도메인 및 나노바디 도메인(100)을 작동가능하게 분리한다. 링커는 펩타이드 결합에 의해 함께 연결된 아미노산 잔기로 구성될 수 있지만, 선택적으로 하나 이상의 비자연 아미노산을 추가로 포함할 수 있다.
일반적으로, 제1 링커(10) 및 제2 링커(20) 각각은 적어도 4개의 아미노산 잔기의 길이를 갖는다. 이와 같이, 특정 구현예에서, 각 링커는 적어도 4, 8, 10, 20, 24, 28, 30, 40, 40, 48, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120개 이상의 아미노산 잔기의 길이를 갖는다. 임의의 이론에 구속되길 바라지 않지만, 적합한 길이의 링커는 전체 폴리펩타이드 분자 내의 이렇게 연결된 2개의 기능적 도메인 각각의 생물학적 활성, 안정성, 또는 약동학 파라미터를 추가로 개선할 있다고 여겨진다.
임의의 적합한 폴리펩타이드가 링커로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 폴리펩타이드 링커는 아미노산 글리신(G), 세린(S), 알라닌(A), 메티오닌(M), 아스파라긴(N), 글루타민(Q), 시스테인(C), 프롤린(P), 글루타메이트(E), 트레오닌(T) 및 리신(K)으로부터 선택된 아미노산 잔기를 포함하거나 이로 구성될 수 있다. 일부 구현예에서, 폴리펩타이드 링커는 입체적으로 방해받지 않는 대다수의 아미노산, 예컨대 글리신 및 알라닌으로 구성될 수 있다. 일부 구현예에서, 링커는 폴리글리신, 폴리알라닌, 글리신 및 알라닌의 조합(예컨대, 폴리(Gly-Ala)), 또는 글리신 및 세린의 조합(예컨대, 폴리(Gly-Ser))이다.
특정 구현예에서, 제1 링커 및 제2 링커 각각은 반복되는 서열의 하나 이상의 반복을 포함하거나 이로 구성된다. 특정 구현예에서, 폴리펩타이드 링커는 반복 서열의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30개의 반복, 또는 상기 열거된 임의의 2개의 숫자에 의해 정의된 임의의 수치 범위 내의 반복을 포함하거나 이로 구성된다.
본원에서, 하기 실시예에 나타낸 실험 데이터를 기초로, 하기 구성이 제공되며, 이는 그럼에도 불구하고 선택적이며 범위를 제한하지 않는다.
제1 링커와 관련하여, 그것은 일부 구현예에 따르면 산성 아미노산 잔기(예컨대, D 또는 E)를 포함하지 않을 수 있다. 제1 링커는 선택적으로 제1 반복 서열의 하나 이상의 단위를 포함할 수 있으며, 제1 반복 서열은 G, Q, A, P, T 및 S로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있는 4개 또는 6개 유형 이하의 아미노산 잔기로 구성될 수 있다. 폴리펩타이드의 일부 특정 구현예에 따르면, 제1 반복 서열은 GfSg(f 및 g 각각은 독립적으로 1 내지 5로부터 선택된 정수임), 서열번호 35(GAQP), 서열번호 36(GQAP), 서열번호 37(GPAQ), 서열번호 38(GPQA), 서열번호 39(GSQP), 서열번호 40(GASP), 서열번호 41(GPAS), 서열번호 42(GPSA), 서열번호 43(GGGS), 서열번호 44(GSGS), 서열번호 45(GGGGS), 서열번호 46(GSAPGSPAGSPTGSAPGSPA) 및 GS로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된다. 폴리펩타이드의 특정 구현예에서, 제1 반복 서열은 서열번호 35(GAQP)에 제시된 아미노산 서열을 가지며, 하나 이상의 단위의 수는 1 내지 10의 정수이다. 특정 구현예에서, 제1 링커는 서열번호 35(GAQP), 서열번호 49((GAQP)2), 서열번호 50((GAQP)5), 서열번호 51((GAQP)10) 및 서열번호 48(GGGGSGGGS)로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다.
제2 링커와 관련하여, 그것은 유사하게 제2 반복 서열의 하나 이상의 단위를 포함할 수 있으며, 제2 반복 서열은 G, Q, A, E, P, T 및 S로 이루어진 군으로부터 선택된 4개 또는 6개 유형 이하의 아미노산 잔기로 구성될 수 있다. 폴리펩타이드의 특정 구현예에서, 제2 반복 서열은 GhSi(h 및 i 각각은 독립적으로 1 내지 5로부터 선택된 정수임), 서열번호 35(GAQP), 서열번호 55(GQEP), 서열번호 56(GEQP), 서열번호 57(GPQE), 서열번호 58(GPEQ), 서열번호 59(GSEP), 서열번호 60(GESP), 서열번호 61(GPSE), 서열번호 62(GPES), 서열번호 36(GQAP), 서열번호 37(GPAQ), 서열번호 38(GPQA), 서열번호 39(GSQP), 서열번호 40(GASP), 서열번호 41(GPAS), 서열번호 42(GPSA), 서열번호 43(GGGS), 서열번호 44(GSGS), 서열번호 45(GGGGS), 서열번호 46(GSAPGSPAGSPTGSAPGSPA) 및 GS로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된다. 특정 구현예에서, 제2 반복 서열은 서열번호 35(GAQP)에 제시된 아미노산 서열을 가지며, 하나 이상의 단위의 수는 1 내지 15의 정수, 선택적으로 1, 2, 5, 10, 또는 14이다. 특정 구현예에서, 제2 링커는 서열번호 49((GAQP)2), 서열번호 50((GAQP)5), 서열번호 51((GAQP)10) 및 서열번호 52((GAQP)14), 및 서열번호 47((GGGGS)4)로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, 제1 링커 및 제2 링커 각각은 둘 이상의 반복 서열을 포함하거나 이로 구성될 수 있다. 예를 들어, 하나의 이러한 링커는 2개, 3개, 또는 4개의 상이한 반복 서열을 포함하거나 이로 구성될 수 있다. 특정 구현예에서, 하나의 이러한 링커는 상이한 반복 서열의 순차적 또는 탠덤 반복을 포함하거나 이로 구성될 수 있다. 각 반복 서열의 반복의 수는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 이상으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택될 수 있다.
기타 참고 사항
상기 기재된 바와 같은 FGF21 도메인, 나노바디 도메인, GLP-1 도메인, 및 제1/제2 링커 각각에 대해 다음을 참고한다. 당업자는 다양한 아미노산 치환, 예컨대, 보존적 아미노산 치환이 그의 활성을 반드시 감소시키지 않으면서 본원에 기재된 임의의 폴리펩타이드 단편의 서열에서 이루어질 수 있음을 이해할 것이다. 아미노산 치환의 예는 L-아미노산을 그의 상응하는 D-아미노산으로 치환하는 것, 시스테인을 호모시스테인 또는 티올 함유 측쇄를 갖는 다른 비자연 아미노산으로 치환하는 것, 리신을 호모리신, 디아미노부티르산, 디아미노프로피온산, 오르니틴 또는 아미노 함유 측쇄를 갖는 다른 비자연 아미노산으로 치환하는 것, 또는 알라닌을 노르발린으로 대체하는 것 등을 포함한다.
아미노산 서열과 관련된 "보존적 치환"은 아미노산 잔기를 유사한 물리화학적 특성을 갖는 측쇄를 갖는 상이한 아미노산 잔기로 대체하는 것을 지칭한다. 예를 들어, 보존적 치환은 소수성 측쇄를 갖는 아미노산 잔기(예컨대, Met, Ala, Val, Leu, 및 Ile) 중에서, 중성 친수성 측쇄를 갖는 잔기(예컨대, Cys, Ser, Thr, Asn 및 Gln) 중에서, 산성 측쇄를 갖는 잔기(예컨대, Asp, Glu) 중에서, 염기성 측쇄를 갖는 아미노산(예컨대, His, Lys, 및 Arg) 중에서, 또는 방향족 측쇄를 갖는 잔기(예컨대, Trp, Tyr 및 Phe) 중에서 이루어 질 수 있다. 당업계에 공지된 바와 같이, 보존적 치환은 일반적으로 단백질 입체 구조에 유의한 변화를 유발하지 않으므로, 단백질의 생물학적 활성을 유지할 수 있다.
하기 전장 서열이 제1 구현예(도 1a에 예시됨) 및 제2 구현예(도 1b에 예시됨)의 특정 구현예에 대해 제공된다.
폴리펩타이드의 특정 구현예는 실질적으로 N-말단에서 C-말단 방향으로 혈청 알부민 결합 나노바디 도메인 및 FGF21 도메인 사이의 융합 폴리펩타이드이며, 서열번호 63-68, 93, 99-101 및 107로부터 선택된 아미노산 서열을 가질 수 있다. 특정 이들 구현예에서, 폴리펩타이드는 본원에 제공된 합성 화학적 모이어티에 접합된다(예컨대, 도 1a에 기초하여). 합성 화학적 모이어티는, 예를 들어 서열번호 63, 68, 93 및 100으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 갖는 폴리펩타이드에 대해 서열번호 1에 대해 위치 171 또는 위치 174에서 도입된 시스테인 잔기와 접합된 Ac-2XADO-EDA-CO-CH2-*일 수 있다. 특정 대안적인 구현예에서, 폴리펩타이드는 서열번호 64-67, 69, 99 및 108로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하며, 접합되지 않는다.
하기 표 1A는 예시적인 융합 폴리펩타이드 서열의 서열번호, 및 융합 폴리펩타이드에 함유된 나노바디, FGF21, 및 제1 폴리펩타이드 링커 및 제2 폴리펩타이드 링커에 대한 서열번호를 보여준다.
표 1A. 예시적인 융합 폴리펩타이드 서열
폴리펩타이드의 특정 구현예는 N-말단에서 C-말단 방향으로 GLP-1 도메인, 혈청 알부민 결합 나노바디 도메인, 및 FGF21 도메인 사이의 실질적으로 융합 폴리펩타이드이며, 이는 서열번호 70, 74, 75, 79-83, 85, 94-98 및 108-109로부터 선택된 아미노산 서열을 가질 수 있다. 특정 이들 구현예에서, 폴리펩타이드는 본원에 제공된 바와 같이 합성 화학적 모이어티에 접합된다(예컨대, 도 1b에 기초하여). 합성 화학적 모이어티는, 예를 들어 서열번호 74, 81-83, 85, 94, 96 및 97로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 서열번호 1에 대해 위치 171 또는 위치 174에서 도입된 시스테인 잔기와 접합된 Ac-2XADO-EDA-CO-CH2-*일 수 있다. 특정 대안적인 구현예에서, 폴리펩타이드는 서열번호 70, 75, 79, 80, 95, 98, 및 108-109로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하며, 접합되지 않는다.
하기 표 1B는 예시적인 융합 폴리펩타이드 서열의 서열번호, 및 융합 폴리펩타이드에 함유된 GLP-1 도메인, 제1 폴리펩타이드 링커, 나노바디, FGF21 도메인, 및 제1 폴리펩타이드 링커 및 제2 폴리펩타이드 링커에 대한 서열번호를 보여준다.
표 1B. 예시적인 융합 폴리펩타이드 서열
약학 조성물
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 상기 기재된 바와 같은 임의의 구현예에 따른 폴리펩타이드, 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물을 추가로 제공한다.
용어 "약학적으로 허용가능한"은 지정된 담체, 비히클, 희석제, 부형제(들), 및/또는 염이 일반적으로 제제를 포함하는 다른 성분과 화학적 및/또는 물리적으로 양립가능하고, 이의 수용자와 생리학적으로 양립가능하다는 것을 나타낸다.
"약학적으로 허용가능한 담체"는 대상체에게 생체활성 허용가능하고 비독성인 활성 성분 이외의 약학적 제제 내의 성분을 지칭한다. 본원에 개시된 약학 조성물에 사용하기 위한 약학적으로 허용가능한 담체는, 예를 들어, 약학적으로 허용가능한 액체, 겔, 또는 고체 담체, 수성 비히클, 비수성 비히클, 항미생물제, 등장화제, 완충제, 항산화제, 마취제, 현탁/분산제, 금속이온봉쇄제 또는 킬레이트화제, 희석제, 보조제, 부형제, 또는 비독성 보조 물질, 당업계에 공지된 다른 구성요소, 또는 이들의 다양한 조합을 포함할 수 있다.
적합한 구성요소는, 예를 들어 항산화제, 충전제, 결합제, 붕해제, 완충제, 보존제, 윤활제, 방향제, 증점제, 착색제, 유화제 또는 안정화제, 예컨대 당 및 사이클로덱스트린을 포함할 수 있다. 적합한 항산화제는, 예를 들어 메티오닌, 아스코르브산, EDTA, 나트륨 티오설페이트, 백금, 카탈라제, 시트르산, 시스테인, 티오글리세롤, 티오글리콜산, 티오소르비톨, 부틸화된 하이드록시아니솔, 부틸화된 하이드록시톨루엔, 및/또는 프로필 갈레이트를 포함할 수 있다. 본원에 개시된 바와 같이, 본원에 제공된 약학 조성물에 메티오닌과 같은 하나 이상의 항산화제를 포함시키는 것은 폴리펩타이드 복합체 또는 이중특이적 폴리펩타이드 복합체의 산화를 감소시킨다. 이러한 산화의 감소는 결합 친화성의 손실을 방지하거나 감소시켜, 단백질 안정성을 개선하고 저장 수명을 극대화시킨다. 따라서, 특정 구현예에서, 본원에 개시된 폴리펩타이드, 폴리펩타이드 복합체 또는 접합체 및 하나 이상의 항산화제, 예컨대 메티오닌을 포함하는 조성물이 제공된다.
추가로 예시하기 위해, 약학적 허용가능한 담체는, 예를 들어 수성 비히클, 예컨대 염화나트륨 주사, 링거 주사, 등장성 덱스트로스 주사, 멸균수 주사, 또는 덱스트로스 및 락테이티드 링거 주사, 비수성 비히클, 예컨대 식물성 기원의 고정 오일, 면실유, 옥수수유, 참깨유, 또는 땅콩유, 정균 또는 진균 농도의 항미생물제, 등장화제, 예컨대 염화나트륨 또는 덱스트로스, 완충제, 예컨대 포스페이트 또는 시트레이트 완충제, 항산화제, 예컨대 나트륨 바이설페이트, 국소 마취제, 예컨대 프로카인 하이드로클로라이드, 현탁 및 분산제, 예컨대 나트륨 카르복시메틸셀룰로오스, 하이드록시프로필 메틸셀룰로오스, 또는 폴리비닐피롤리돈, 유화제, 예컨대 폴리소르베이트 80(TWEEN-80), 금속이온봉쇄제 또는 킬레이트화제, 예컨대 EDTA(에틸렌디아민테트라아세트산) 또는 EGTA(에틸렌 글리콜 테트라아세트산), 에틸 알코올, 폴리에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 수산화나트륨, 염산, 시트르산, 또는 락트산을 포함할 수 있다. 페놀 또는 크레졸, 수은, 벤질 알코올, 클로로부탄올, 메틸 및 프로필 p-하이드록시벤조산 에스테르, 티메로살, 벤즈알코늄 클로라이드 및 벤제토늄 클로라이드를 포함하는 담체로서 이용되는 항미생물제가 다중 용량 용기 내의 약학 조성물에 첨가될 수 있다. 적합한 부형제는, 예를 들어 물, 식염수, 덱스트로스, 글리세롤, 또는 에탄올을 포함할 수 있다. 적합한 비독성 보조 물질은, 예를 들어 습윤제 또는 유화제, pH 완충제, 안정화제, 용해도 향상제, 또는 제제, 예컨대 아세트산 나트륨, 소르비탄 모노라우레이트, 트리에탄올아민 올레에이트, 또는 사이클로덱스트린을 포함할 수 있다.
약학 조성물은 액체 용액, 현탁액, 유화액, 환제, 캡슐, 정제, 서방형 제제, 또는 분말일 수 있다. 경구 제제는 표준 담체, 예컨대 약학적 등급의 만니톨, 락토스, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 폴리비닐 피롤리돈, 나트륨 사카린, 셀룰로오스, 마그네슘 카르보네이트 등을 포함할 수 있다.
특정 구현예에서, 약학 조성물은 주사가능한 조성물로 제제화된다. 주사가능한 약학 조성물은 임의의 통상적인 형태, 예를 들어 액체 용액, 현탁액, 유화액, 또는 액체 용액, 현탁액, 또는 유화액을 생성하기에 적합한 고체 형태로 제조될 수 있다. 주사용 제제는 주사를 위한 준비가 된 멸균 및/또는 비열성 용액, 멸균 건조 용해성 제품, 예컨대 피하 정제를 포함하여 사용 직전에 용매와 조합될 준비가 된 동결 건조 분말, 주사를 위한 준비가 된 멸균 현탁액, 사용 직전에 비히클과 조합할 준비가 된 멸균 건조 불용성 제품, 및 멸균 및/또는 비열성 유화액을 포함할 수 있다. 용액은 수성 또는 비수성일 수 있다.
특정 구현예에서, 단위 용량 비경구 제제는 앰플, 바이알 또는 바늘이 있는 주사기에 포장된다. 비경구 투여를 위한 모든 제제는 당업계에 공지되어 있고 실시되는 바와 같이 무균이고 해열성이 아니어야 한다.
특정 구현예에서, 멸균 동결건조 분말은 본원에 개시된 바와 같은 폴리펩타이드, 폴리펩타이드 복합체 또는 접합체를 적합한 용매에 용해시킴으로써 제조된다. 용매는 안정성을 개선시키는 부형제 또는 분말 또는 분말로부터 제조된 재구성된 용액의 다른 약리학적 구성요소를 함유할 수 있다. 사용될 수 있는 부형제는, 비제한적으로 물, 덱스트로스, 소르비톨, 프럭토스, 옥수수 시럽, 자일리톨, 글리세린, 글루코스, 수크로스 또는 다른 적합한 제제를 포함한다. 용매는 완충제, 예컨대 시트레이트, 나트륨 또는 칼륨 포스페이트 또는 일 구현예에서, 약 중성 pH의 당업자에게 공지된 다른 이러한 완충제를 함유할 수 있다. 용액의 후속 멸균 여과 후 당업자에게 공지된 표준 조건 하에서의 동결건조는 바람직한 제제를 제공한다. 일 구현예에서, 생성된 용액은 동결건조를 위해 바이알에 분배될 것이다. 각각의 바이알은 본원에 제공된 폴리펩타이드, 폴리펩타이드 복합체, 또는 접합체 또는 이들의 조성물의 단일 투여량 또는 다중 투여량을 함유할 수 있다. 용량 또는 용량 세트에 필요한 것(예컨대, 약 10%)을 초과하는 소량을 갖는 과충전 바이알이 정확한 샘플 인출 및 정확한 투약을 용이하게 하기 위해 허용가능하다. 동결건조 분말은 약 4℃ 내지 실온과 같은 적절한 조건 하에서 보관될 수 있다.
동결건조 분말을 주사용 물로 재구성하는 것은 비경구 투여에 사용하기 위한 제제를 제공한다. 일 구현예에서, 재구성을 위해 멸균 및/또는 비열수 또는 다른 액체 적합한 담체가 동결건조 분말에 첨가된다. 정확한 양은 주어지는 선택된 요법에 따라 달라지며, 경험적으로 결정될 수 있다.
본원에 기재된 바와 같은 약학 조성물의 투여는 통상의 기술을 가진 의사에 의해 효과적인 것으로 알려진 임의의 경로를 통해 이루어질 수 있다. 일 예는 멸균 주사기 또는 일부 다른 기계 장치, 예컨대 주입 펌프에 의한 말초 비경구 투여이다. 특정 구현예에서, 말초 비경구 경로는 정맥내, 근육내, 피하, 또는 복강내 투여 경로이다.
특정 구현예에서, 본원에 기재된 폴리펩타이드, 폴리펩타이드 복합체, 또는 접합체는 비경구 경로 투여, 예컨대 경구, 직장, 비강, 또는 하부 호흡기 경로 투여에 적합한 형태로 제제화된다.
특정 구현예에서, 본원에 기재된 폴리펩타이드, 폴리펩타이드 복합체, 또는 접합체는 동결건조 또는 분무 건조와 같은 고체 제제로 제제화된 다음, 투여 전에 적합한 희석제 용액에서 재구성된다. 문헌[Remington: The Science and Practice of Pharmacy (D.B. Troy, Editor, 21st Edition, Lippincott, Williams & Wilkins, 2006)]에 기재된 것과 같은 표준 약학적 제제가 사용될 수 있다. 대안적으로, 본원에 기재된 폴리펩타이드, 폴리펩타이드 복합체, 또는 접합체는 혀, 설하, 협측, 구내, 경구, 위 및 장내, 비강, 폐, 예를 들어 세기관지 및 폐포 또는 이들의 조합을 통해, 표피, 진피, 경피, 질, 직장, 안구, 예를 들어 결막, 요도, 경피, 또는 폐 경로를 통해 투여하기 위해 제제화될 수 있다. 추가 선택사항으로서, 본원에 기재된 폴리펩타이드, 폴리펩타이드 복합체, 또는 접합체는 경피 투여를 통한 투여, 예를 들어 무바늘 주사에 의해 또는 패치, 선택적으로 이온영동 패치로부터의 투여, 또는 경점막, 예를 들어 협측 투여를 위해 제제화될 수 있다.
치료 방법
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 이를 필요로 하는 대상체에서 대사 장애를 예방 또는 치료하는 방법 및 키트를 추가로 제공한다.
방법은 실질적으로 상기 기재된 바와 같은 폴리펩타이드 또는 약학 조성물의 치료적 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 병태의 "치료하는 것" 또는 "치료"는 병태를 예방 또는 완화시키는 것, 병태의 발달의 시작 또는 속도를 늦추는 것, 병태를 발달시킬 위험을 감소시키는 것, 병태와 관련된 증상의 발달을 예방 또는 지연시키는 것, 병태와 관련된 증상을 감소 또는 종료시키는 것, 병태의 완전한 또는 부분적인 퇴행을 생성시키는 것, 병태를 치유하는 것, 또는 이들의 일부 조합을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "대상체" 또는 "개체" 또는 "동물" 또는 "환자"는 질환 또는 장애의 진단, 예후, 개선, 예방 및/또는 치료를 필요로 하는 포유동물 또는 영장류를 포함하는 인간 또는 비인간 동물을 지칭한다. 포유동물 대상체는 인간, 가축, 농장 동물, 및 동물원, 스포츠, 또는 애완용 동물, 예컨대 개, 고양이, 기니아 피그, 토끼, 래트, 마우스, 말, 돼지, 소, 곰 등을 포함한다.
특정 구현예에서, 대상체는 본원에 제공된 폴리펩타이드 또는 약학 조성물에 반응할 가능성이 있는 장애 또는 병태를 갖는 것으로 확인되었다.
특정 구현예에서, 대사 장애는 당뇨병, 비만, 비알코올성 지방간염(NASH), 심혈관 유사 이상지질혈증, 동맥경화증, 알코올성 지방간염(ASH), 당뇨병신증, 임신성 당뇨병, 대사 증후군, 예컨대 대사 증후군 X, 비알콜성 지방간 질환(NAFLD), 말기 간 질환, 간 지방증(지방간), 간경변, 원발성 담즙성 간경변증(PBC), 또는 중증 고중성지방혈증(SHTG)이다.
예를 들어, 본원에 제공된 폴리펩타이드 또는 약학 조성물을 사용하여 치료 또는 개선될 수 있는 대사 병태 또는 장애는 인간 대상체가 125 mg/dL 이상, 예를 들어 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200 또는 200 mg/dL 초과의 공복 혈당 수준을 갖는 병태를 포함한다. 혈당 수준은 섭식 또는 공복 상태에서 또는 무작위로 결정될 수 있다. 대사 병태 또는 장애는 또한 대상체가 대사 병태를 발생할 위험이 증가된 병태를 포함할 수 있다. 인간 대상체의 경우, 이러한 병태는 100 mg/dL의 공복 혈당 수준을 포함한다.
본원에 제공된 폴리펩타이드 또는 약학 조성물의 치료적 유효량은, 예를 들어 대상체의 체중, 연령, 과거 병력, 현재 약물, 건강 상태 및 교차 반응, 알레르기, 민감성 및 부작용 가능성뿐만 아니라 투여 경로 및 질환 발병 정도와 같은 당업계에 공지된 다양한 인자에 따라 달라질 것이다. 투여량은 이들 및 다른 상황 또는 요건에 의해 지시된 바와 같이 당업자(예컨대, 의사 또는 수의사)에 의해 비례적으로 감소 또는 증가될 수 있다. 치료적 유효량은 치료되는 질환 또는 장애의 증상의 개선 또는 완화를 포함하는, 연구자, 의사, 또는 다른 임상의가 추구하는 조직계, 동물, 또는 인간에서의 생물학적 또는 의약 반응을 유도하는 본원에 제공된 폴리펩타이드 접합체 또는 약학 조성물의 양, 즉 하나 이상의 원하는 생물학적 또는 의약 반응의 관찰가능한 수준을 지지하는 양, 예를 들어 혈당, 인슐린, 중성지방, 또는 콜레스테롤 수준을 낮추거나, 체중을 감소시키거나, 또는 글루코스 저항성, 에너지 소비, 또는 인슐린 감수성을 개선하는 양일 수 있다.
특정 구현예에서, 본원에 제공된 폴리펩타이드 또는 약학 조성물은 약 0.01 mg/kg 내지 약 100 mg/kg(예컨대, 약 0.01 mg/kg, 약 0.5 mg/kg, 약 1 mg/kg, 약 2 mg/kg, 약 5 mg/kg, 약 10 mg/kg, 약 15 mg/kg, 약 20 mg/kg, 약 25 mg/kg, 약 30 mg/kg, 약 35 mg/kg, 약 40 mg/kg, 약 45 mg/kg, 약 50 mg/kg, 약 55 mg/kg, 약 60 mg/kg, 약 65 mg/kg, 약 70 mg/kg, 약 75 mg/kg, 약 80 mg/kg, 약 85 mg/kg, 약 90 mg/kg, 약 95 mg/kg, 또는 약 100 mg/kg)의 치료적 유효 투여량으로 투여될 수 있다. 특정 이들 구현예에서, 본원에 제공된 폴리펩타이드 또는 약학 조성물은 약 50 mg/kg 이하의 투여량으로 투여되고, 특정 이들 구현예예에서, 투여량은 10 mg/kg 이하, 5 mg/kg 이하, 1 mg/kg 이하, 0.5 mg/kg 이하, 또는 0.1 mg/kg 이하이다. 특정 구현예에서, 투여량은 치료 과정 동안 변할 수 있다. 예를 들어, 특정 구현예에서, 초기 투여량은 후속 투여량보다 높을 수 있다. 특정 구현예에서, 투여량은 대상체의 반응에 따라 치료 과정 동안 달라질 수 있다.
투여 요법은 최적의 원하는 반응(예컨대, 치료 반응)을 제공하기 위해 조절될 수 있다. 예를 들어, 단일 용량이 투여될 수 있거나, 또는 몇 개의 분할 용량이 시간이 경과함에 따라 투여될 수 있다.
본원에 제공된 폴리펩타이드 또는 약학 조성물은, 예를 들어 비경구(예컨대, 피하, 복강내, 정맥내 주입을 포함하는 정맥내, 근육내, 또는 피내 주사) 또는 비경구(예컨대, 경구, 비강내, 안구내, 설하, 직장, 또는 국소) 경로와 같은 당업계에 공지된 임의의 경로에 의해 투여될 수 있다.
폴리펩타이드 또는 약학 조성물은 단독으로 또는 하나 이상의 추가적인 치료 수단 또는 제제와 조합하여 투여될 수 있다.
특정 구현예에서, 대사 질환을 치료하기 위해 사용될 때, 본원에 제공된 폴리펩타이드 또는 약학 조성물은 대사 질환 또는 관련된 임의의 의학적 장애의 치료에 사용하기 위해 임의의 다른 치료제와 조합하여 투여될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, "조합하여 투여된"은 동일한 약학 조성물의 일부로서 동시에 투여하거나, 별도의 조성물로서 동시에 투여하거나, 또는 별도의 조성물로서 상이한 시기에 투여하는 것을 포함한다. 또 다른 제제의 전 또는 후에 투여된 조성물은, 조성물 및 제2 제제가 상이한 경로를 통해 투여되는 경우에도, 문구가 본원에 사용되는 바와 같이 상기 제제와 "조합하여" 투여되는 것으로 간주된다. 가능한 경우, 본원에 제공된 융합 폴리펩타이드, 폴리펩타이드 복합체 또는 접합체와 조합하여 투여되는 추가적인 치료제는 추가적인 치료제의 제품 정보 시트에 열거된 일정에 따라 또는 의사의 데스크 레퍼런스(Physicians' Desk Reference, 70th Ed (2016)) 또는 당업자에게 잘 알려진 프로토콜에 따라 투여된다.
키트
상기 기재된 바와 같은 약학 조성물을 투여하기 위한 방법을 실행하기 위한 키트가 또한 제공된다. 이러한 키트는 본원에 기재된 것과 같은 약학 조성물을 포함할 수 있으며, 이는 멸균 용기에 제공될 수 있다. 선택적으로, 제공된 약학 조성물을 대사 장애의 치료에 사용하는 방법에 대한 지침이 또한 포함될 수 있거나 환자 또는 의료 서비스 제공자에게 이용가능하게 될 수 있다.
이러한 키트는 (a) 융합 폴리펩타이드 접합체의 치료적 유효량을 포함하는 약학 조성물; 및 (b) 약학 조성물을 위한 하나 이상의 용기를 포함할 수 있다. 이러한 키트는 또한 이의 사용을 위한 지침을 포함할 수 있고; 지침은 치료되는 정확한 대사 장애에 맞게 조정될 수 있다. 지침은 키트에 제공된 물질의 사용 및 성질을 설명할 수 있다. 특정 구현예에서, 키트는 대사 장애, 예컨대 상승된 글루코스 수준, 상승된 인슐린 수준, 당뇨병, 비만, 비알코올성 지방간염(NASH), 심혈관 유사 이상지질혈증. 동맥경화증, 알코올성 지방간염(ASH), 당뇨병신증, 대사 증후군, 예컨대 대사 증후군 X, 비알콜성 지방간 질환(NAFLD), 말기 간 질환, 간 지방증(지방간), 간경변, 원발성 담즙성 간경변증(PBC) 또는 중증 고중성지방혈증(SHTG)을 치료하기 위해 투여를 수행하는 환자를 위한 지침을 포함한다.
지침은 종이 또는 플라스틱 등과 같은 기판 상에 인쇄될 수 있고, 패키지 삽입물로서 키트 내에, 키트의 용기 또는 이의 구성요소(예컨대, 포장과 관련됨)의 라벨링 등에 존재할 수 있다. 다른 구현예에서, 지침은 적합한 컴퓨터 판독가능한 저장 매체, 예컨대 CD-ROM, 디스켓 등에 존재하는 전자 저장 데이터 파일로서 존재한다. 또 다른 구현예에서, 실제 지침은 키트에 존재하지 않지만, 원격 소스로부터, 예컨대 인터넷을 통해, 지침을 획득하기 위한 수단이 제공된다. 이러한 구현예의 예는 지침이 보여질 수 있고/거나 지침이 다운로드될 수 있는 웹 주소를 포함하는 키트이다. 종종 키트의 일부 또는 모든 구성요소가 무균을 유지하기 위해 적합한 포장에 포장되는 것이 바람직할 것이다. 키트의 구성요소는 단일의 취급이 용이한 유닛을 만들기 위해 키트 봉쇄 요소에 포장될 수 있으며, 여기서 키트 봉쇄 요소, 예컨대, 상자 또는 유사한 구조물은, 예컨대 키트의 구성요소의 일부 또는 모두의 멸균을 더 보존하기 위해 밀폐 용기일 수 있거나 아닐 수 있다.
폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 상기 기재된 바와 같은 폴리펩타이드(또는 선택적으로 폴리펩타이드 접합체)를 제조하는 방법을 추가로 제공한다. 이를 위해, 하기가 본 개시내용에 제공된다.
첫째, 본 개시내용은 본원에 기재된 바와 같은 융합 폴리펩타이드를 코딩하는 단리된 핵산 또는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "핵산" 또는 "폴리뉴클레오타이드"는 단일 또는 이중 가닥 형태의 데옥시리보핵산(DNA) 또는 리보핵산(RNA) 및 이의 중합체를 지칭한다. 명시적으로 제한되지 않는 한, 상기 용어는 참조 핵산과 유사한 결합 특성을 갖고 자연 발생 뉴클레오타이드와 유사한 방식으로 대사되는 자연 뉴클레오타이드의 공지된 유사체를 함유하는 폴리뉴클레오타이드를 포괄한다. 달리 나타내지 않는 한, 특정 폴리뉴클레오타이드 서열은 또한 명시적으로 나타낸 서열뿐만 아니라 이의 보존적으로 변형된 변이체(예컨대, 축퇴성 코돈 치환), 대립유전자, 오르토로그, SNP, 및 상보적 서열을 암시적으로 포괄한다. 구체적으로, 축퇴성 코돈 치환은 하나 이상의 선택된(또는 모든) 코돈의 제3 위치가 혼합 염기 및/또는 데옥시이노신 잔기로 치환된 서열을 생성함으로써 달성될 수 있다(Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985); and Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994) 참조).
본원에 기재된 융합 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산 또는 폴리뉴클레오타이드는 재조합 기술을 사용하여 제작될 수 있다. 이를 위해, 혈청 알부민 결합 나노바디를 코딩하는 DNA, FGF21 도메인을 코딩하는 DNA, 및 선택적으로 GLP-1 도메인을 코딩하는 DNA가 수득될 수 있고, 숙주 세포에서 전사 및 발현을 허용하기 위해 작동가능하게 연결되어 폴리펩타이드를 생산할 수 있다. 폴리펩타이드 링커를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열이 또한 원하는 생성물의 발현을 허용하기 위해 작동가능하게 연결된다.
코딩 폴리뉴클레오타이드 서열은, 융합 폴리펩타이드의 발현 또는 생산이 실현가능하고 적절한 제어 하에 있도록, 선택적으로 발현 벡터에서, 하나 이상의 조절 서열에 추가로 작동가능하게 연결될 수 있다.
코딩 폴리뉴클레오타이드 서열(들)은 당업계에 공지된 재조합 기술을 사용하여, 추가 클로닝(DNA의 증폭) 또는 발현을 위해 벡터 내로 삽입될 수 있다. 많은 벡터가 이용가능하다. 벡터 구성요소는 일반적으로, 비제한적으로 하기 신호 서열, 복제 원점, 하나 이상의 마커 유전자, 인핸서 요소, 프로모터(예컨대, 원핵생물 프로모터, 예컨대 T7, T7lac, Sp6, araBAD, trp, lac, tac, pLm, A3, lac, lpp, npr, pac, syn, trc 및 T3, 또는 진핵생물 프로모터, 예컨대 SV40, CMV, 및 EF-1α), 및 전사 종결 서열 중 하나 이상을 포함한다.
벡터 및 숙주 세포
둘째 및 셋째, 본 개시내용은 상기 제공된 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터, 및 본원에 기재된 벡터를 포함하는 숙주 세포를 추가로 제공한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "벡터"는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드가 해당 단백질의 발현을 유발하도록 작동가능하게 삽입될 수 있는 비히클을 지칭한다. 벡터는 숙주 세포 내에서 그것이 운반하는 유전 요소의 발현을 유발하도록 숙주 세포를 형질전환, 형질도입, 또는 형질감염시키는 데 사용될 수 있다. 벡터의 비제한적인 예는 플라스미드, 파지미드, 코스미드, 인공 염색체, 예컨대 효모 인공 염색체(YAC), 박테리아 인공 염색체(BAC), 또는 P1 유래 인공 염색체(PAC), 박테리오파지, 예컨대 람다 파지 또는 M13 파지, 및 동물 바이러스를 포함한다. 벡터로서 사용되는 동물 바이러스의 카테고리는 레트로바이러스(렌티바이러스 포함), 아데노바이러스, 아데노 관련 바이러스, 헤르페스바이러스(예컨대, 헤르페스 심플렉스 바이러스), 폭스바이러스, 바큘로바이러스, 파필로마바이러스, 및 파포바바이러스(예컨대, SV40)를 포함한다. 벡터는, 프로모터 서열, 전사 개시 서열, 인핸서 서열, 선택가능한 요소, 및 리포터 유전자를 포함하는, 발현을 제어하기 위한 다양한 요소를 함유할 수 있다. 또한, 벡터는 복제 원점을 함유할 수 있다. 벡터는 또한, 비제한적으로 바이러스 입자, 리포솜, 또는 단백질 코팅을 포함하여, 세포 내로의 그의 진입을 돕는 물질을 포함할 수 있다. 벡터는 발현 벡터 또는 클로닝 벡터일 수 있다. 본 개시내용은 융합 폴리펩타이드를 코딩하는 본원에 제공된 핵산 서열, 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 적어도 하나의 프로모터(예컨대, SV40, CMV, EF-1α), 및 적어도 하나의 선택 마커를 함유하는 벡터(예컨대, 발현 벡터)를 제공한다. 벡터의 예는, 비제한적으로 레트로바이러스(렌티바이러스 포함), 아데노바이러스, 아데노 관련 바이러스, 헤르페스바이러스(예컨대, 헤르페스 심플렉스 바이러스), 폭스바이러스, 바큘로바이러스, 파필로마바이러스, 파포바바이러스(예컨대, SV40), 람다 파지, 및 M13 파지, 플라스미드 pcDNA3.3, pMD18-T, pOptivec, pCMV, pEGFP, pIRES, pQD-Hyg-GSeu, pALTER, pBAD, pcDNA, pCal, pL, pET, pGEMEX, pGEX, pCI, pEGFT, pSV2, pFUSE, pVITRO, pVIVO, pMAL, pMONO, pSELECT, pUNO, pDUO, Psg5L, pBABE, pWPXL, pBI, p15TV-L, pPro18, pTD, pRS10, pLexA, pACT2.2, pCMV-SCRIPT.RTM., pCDM8, pCDNA1.1/amp, pcDNA3.1, pRc/RSV, PCR 2.1, pEF-1, pFB, pSG5, pXT1, pCDEF3, pSVSPORT, pEF-Bos 등을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 문구 "숙주 세포"는 외인성 폴리뉴클레오타이드 및/또는 벡터가 도입된 세포를 지칭한다.
본원에 제공된 폴리뉴클레오타이드 서열(들)을 포함하는 벡터는 클로닝 또는 유전자 발현을 위해 숙주 세포에 도입될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 문구 "숙주 세포"는 외인성 폴리뉴클레오타이드 및/또는 벡터가 도입된 세포를 지칭한다. 다른 구현예에서, 벡터는 염색체외이다. 숙주 세포는 원하는 경우 단리될 수 있다. 특정 구현예에서, 숙주 세포는 원핵 세포이고, 일부 다른 구현예에서, 숙주 세포는 진핵 세포이다.
본원에서 벡터 내의 DNA를 클로닝 또는 발현하기에 적합한 숙주 세포는 주로 원핵생물이다. 이러한 목적에 적합한 원핵생물은 진정세균, 예컨대 그람 음성 또는 그람 양성 유기체, 예를 들어, 장내세균, 예컨대 에스케리치아, 예컨대, E. coli, 엔테로박터, 에르위니아, 클렙시엘라, 프로테우스, 살모넬라, 예컨대, 살모넬라 티피무리움, 세라티아, 예컨대, 세라티아 마르세스칸스, 및 시겔라, 뿐만 아니라 바실리, 예컨대 B. 서브틸리스 및 B. 리케니포르미스, 슈도모나스, 예컨대 P. 애루지노사, 및 스트렙토마이세스를 포함한다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 진핵생물, 예컨대 효모 및 포유동물 세포(예컨대, 불멸화된 포유동물 세포)이다.
본원에 제공된 폴리뉴클레오타이드 서열(들)을 포함하는 벡터는 당업자에게 공지된 임의의 적합한 방법, 예컨대, 형질전환, 형질감염 또는 형질도입을 사용하여 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. 일 예에서, 융합 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열은 발현 벡터 내로 서브클로닝될 수 있고, 이는 숙주 세포에서 봉입체로서 발현된다. 벡터는 바이러스 벡터일 수 있으며, 임의의 적합한 바이러스 벡터가 이 능력으로 사용될 수 있다.
본원에서, 숙주 세포는 원핵 세포 또는 진핵 세포일 수 있다. 상기 기재된 발현 또는 클로닝 벡터로 형질전환된 숙주 세포는 프로모터를 유도하거나, 형질전환체를 선택하거나, 또는 클로닝 벡터를 증폭하기 위해 적절하게 변형된 통상적인 영양 배지에서 배양될 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 바와 같은 융합 폴리펩타이드의 발현을 허용하는 조건 하에서 본원에 제공된 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 본원에 기재된 바와 같은 융합 폴리펩타이드를 생산하는 방법을 제공한다.
본원에 기재된 바와 같은 융합 폴리펩타이드의 생산을 위해, 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포는 다양한 배지에서 배양될 수 있다. 상업적으로 이용가능한 박테리아 성장 배지, 예컨대 테리픽 브로쓰(Terrific Broth), LB 브로쓰, LB 아가, M9 최소 배지, MagiaMedia 배지, 및 ImMedia 배지(ThermoFisher)가 박테리아 숙주 세포를 배양하는 데 적합하다. 상업적으로 이용가능한 배지, 예컨대 Ham's F10(Sigma), 최소 필수 배지(MEM)(Sigma), RPMI-1640(Sigma), 및 둘베코 변형 이글스 배지(DMEM, Sigma)가 진핵 숙주 세포를 배양하는 데 적합하다. 이러한 임의의 배지는 필요에 따라 호르몬 및/또는 다른 성장 인자(예컨대, 인슐린, 트랜스페린, 또는 표피 성장 인자), 염(예컨대, 염화나트륨, 칼슘, 마그네슘, 및 포스페이트), 완충제(예컨대, HEPES), 뉴클레오타이드(예컨대, 아데노신 및 티미딘), 항생제(예컨대, 젠타마이신™ 약물), 미량 원소(일반적으로 마이크로몰 범위의 최종 농도로 존재하는 무기 화합물로서 정의됨), 및 글루코스 또는 동등한 에너지원으로 보충될 수 있다. 임의의 다른 필요한 보충제가 또한 당업자에게 공지될 적절한 농도로 포함될 수 있다. 온도, pH 등과 같은 배양 조건은 발현을 위해 선택된 숙주 세포에 이전에 사용된 것이며, 당업자에게 명백할 것이다.
폴리펩타이드를 생산하는 방법
일 양태에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 바와 같은 융합 폴리펩타이드가 발현되는 조건 하에서 본원에 제공된 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 본원에 기재된 바와 같은 융합 폴리펩타이드를 발현하는 방법을 제공한다.
특정 구현예에서, 융합 폴리펩타이드는 봉입체로서 발현된다. 특정 구현예에서, 방법은 봉입체로부터 융합 폴리펩타이드를 재생시키는 단계를 추가로 포함한다.
재조합 기술을 사용하는 경우, 본원에 기재된 바와 같은 융합 폴리펩타이드는 세포내에서, 주변세포질 공간에서 생산될 수 있거나, 또는 배지 내로 직접 분비될 수 있다. 생성물이 세포내에서 생산되는 경우, 1단계로서, 숙주 세포 또는 용해된 단편 중 하나인 미립자 파편은, 예를 들어 원심분리 또는 한외여과에 의해 제거된다. 문헌[Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)]은 E. coli의 주변세포질 공간으로 분비되는 단백질을 단리하는 절차를 기술한다. 간략하게, 세포 페이스트는 약 30분에 걸쳐 아세트산나트륨(pH 3.5), EDTA, 및 페닐메틸설포닐플루오라이드(PMSF)의 존재 하에 해동된다. 세포 파편은 원심분리에 의해 제거될 수 있다. 생성물이 배지 내로 분비되는 경우, 이러한 발현 시스템으로부터의 상청액은 일반적으로 먼저 상업적으로 이용가능한 단백질 농축 필터, 예를 들어 Amicon 또는 Millipore Pellicon 한외여과 유닛을 사용하여 농축된다. PMSF와 같은 프로테아제 억제제는 단백질분해를 억제하기 위해 임의의 전술한 단계에 포함될 수 있으며, 항생제는 우발적인 오염물질의 성장을 방지하기 위해 포함될 수 있다.
특정 구현예에서, 방법은 융합 폴리펩타이드를 단리하는 단계를 추가로 포함한다.
세포로부터 제조된 본원에서 기재된 바와 같은 융합 폴리펩타이드는, 예를 들어 하이드록실아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석, DEAE-셀룰로오스 이온 교환 크로마토그래피, 암모늄 설페이트 침전, 염석, 및 친화성 크로마토그래피를 사용하여 정제될 수 있다.
단백질 정제를 위한 다른 기술, 예컨대 이온 교환 컬럼 상의 분별, 에탄올 침전, 역상 HPLC, 실리카 상의 크로마토그래피, 음이온 또는 양이온 교환 수지(예컨대, 폴리아스파르트산 컬럼) 상의 헤파린 SEPHAROSE™ 크로마토그래피, 크로마토포커싱, SDS-PAGE, 및 황산암모늄 침전이 또한 회수될 단백질에 따라 이용가능하다.
상기 기재된 바와 같은 폴리펩타이드를 생산하는 방법이 본 개시내용에서 제공되며, 이는 실질적으로 하기 2단계
S100: 상기 정의된 바와 같은 폴리뉴클레오타이드 또는 제거가능한 태그를 추가로 포함하는 이의 전구체의 발현을 허용하는 조건 하에서 상기 기재된 바와 같은 숙주 세포를 배양하는 단계; 및
S200: 숙주 세포로부터 폴리펩타이드 또는 이의 전구체를 수집하고 정제하는 단계
를 포함한다.
특정 구현예에서, 폴리펩타이드는 봉입체로서 발현된다. 특정 구현예에서, 방법은 봉입체로부터 폴리펩타이드를 재생하여 이의 리폴딩을 허용하는 단계를 추가로 포함한다. 또한, 일부 구현예에 따르면, 숙주 세포는 E. coli이고, 벡터는 E. coli 양립가능한 벡터를 포함하며, 벡터 내의 폴리뉴클레오타이드에 의해 코딩된 폴리펩타이드는 E. coli 발현을 위해 코돈 최적화된다.
재조합 기술을 사용하는 경우, 본원에 기재된 바와 같은 폴리펩타이드는 세포내에서, 주변세포질 공간에서 생산될 수 있거나, 또는 배지 내로 직접 분비될 수 있다. 생성물이 세포내에서 생산되는 경우, 1단계로서, 숙주 세포 또는 용해된 단편 중 하나인 미립자 파편은, 예를 들어 원심분리 또는 한외여과에 의해 제거된다.
일부 구현예에 따르면, 숙주 세포로부터 폴리펩타이드를 수집 및 정제하는 단계(S200)는 하기의 하위단계
S210: 폴리펩타이드의 전구체를 수집하는 단계;
S220: 폴리펩타이드의 전구체가 리폴딩되도록 하는 단계;
S230: 폴리펩타이드의 리폴딩된 전구체를 처리하여 태그를 제거함으로써 폴리펩타이드를 수득하는 단계; 및
S240: 폴리펩타이드를 정제하는 단계
를 포함할 수 있다.
특정 구현예에서, 숙주 세포는 용해되고, 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드의 전구체는 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드의 전구체를 함유하는 불용성 분획으로부터 수득된다.
폴리펩타이드 생산 방법의 일부 구현예에 따르면, 방법은 정제된 폴리펩타이드를 기능적 모이어티와 접합하는 단계를 추가로 포함한다. 특정 구현예에서, 폴리펩타이드에 접합되는 기능적 모이어티는
(Ac-2XADO-EDA-CO-CH2-*)이다.
실시예
실시예 1: 나노바디-FGF21 단백질 및 GLP-1-나노바디-FGF21의 재조합 발현
표 1A 및 1B, 및 표 1C에 열거된 GLP-1-나노바디-FGF21 단백질 또는 나노바디-FGF21 융합 단백질을 BL21(DE3) 유도체 균주를 사용하여 박테리아 E. coli 발현 시스템으로부터 생산하였다. GLP-1-나노바디-FGF21 융합 전구체 또는 나노바디-FGF21 융합 단백질을 코딩하는 DNA를 E. coli 발현을 위해 코돈 최적화하고, 드노보 합성하고, PET 유도체 발현 벡터(Novagen) 내로 서브클로닝하였다. 아미노산 치환을 상응하는 유전자 코드의 변형에 의해 달성하였다. 세포 밀도가 테리픽 브로쓰(TB) 배지에서 2.0의 OD600에 도달했을 때, 0.5 mM 이소프로필 b-d-티오갈락토사이드(IPTG)를 사용하여 GLP-1-나노체-FGF21 융합 전구체 또는 나노체-FGF21 융합 단백질의 과발현을 유도하였다. 37℃에서 20-22시간 동안 단백질 유도 후 세포를 채취하였다.
표 1C GLP-1/FGF21 단백질의 대조군 분자
실시예 2: 나노바디-FGF21 단백질의 정제
세포를 채취하고, 세포 파쇄기(900 bar, 2회)에 의해 20 mM Tris pH8.0, 0.15 M NaCl 완충액에서 용해시켰다. 나노바디-FGF21 융합 단백질을 함유하는 불용성 분획을 원심분리(8,000 X g, 30분 동안)에 의해 수집하였다. 리폴딩 후, 융합 단백질을 음이온 교환 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 각 단계에서의 샘플을 LC/MS에 의해 특성화하여 정확한 분자량을 확인하였다.
실시예 3: GLP-1 나노바디-FGF21의 정제
세포를 채취하고, 세포 파쇄기(900 bar, 2회)에 의해 20 mM Tris pH8.0, 0.15 M NaCl 완충액에서 용해시켰다. GLP-1-나노바디-FGF21 융합 전구체를 함유하는 불용성 분획을 원심분리(8,000 X g, 30분 동안)에 의해 수집하였다. 리폴딩 후, 융합 단백질 전구체를 음이온 교환 크로마토그래피에 의해 포획하였다. 프로테아제에 의해 태그를 제거한 후, 단백질을 소수성 상호작용 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 각 단계에서의 샘플을 LC/MS에 의해 특성화하여 정확한 분자량을 확인하였다.
실시예 4: 나노바디-FGF21 및 GLP-1-나노바디-FGF21 융합단백질 접합체의 제조
Tris 완충액 중의 나노바디-FGF21 또는 GLP-1-나노바디-FGF21 융합 단백질의 용액에 유기 용매 중의 Ac-2XADO-EDA-CO-CH2-Br을 적가하였다. 반응을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 그 다음, 생성물을 음이온 교환 크로마토그래피에 적용하였다. 이는 상기 나타낸 바와 같이 표 1에 열거된 화합물을 제공하였다.
접합된 융합 단백질을 공급업체의 매뉴얼에 따라 상이한 접합체에 대해 최적화된 조건을 사용하여, Waters BioAccord LC-MS 시스템을 갖는 LC-MS 방법에 의해, 또는 Waters Acquity UPLC 시스템을 갖는 UPLC에 의해 검출하고 특성화하였다.
실시예 5: 시험관내 활성
방법: 융합 단백질의 시험관내 GLP-1 활성을 1% 인간 혈청 알부민(HSA)을 갖거나 갖지 않는 인간 GLP-1 수용체 및 CRE 루시퍼라제 리포터를 과발현하는 BHK 세포주를 사용하여 측정하였다. 시험된 융합 단백질을 3배 연속 희석으로 1% HSA의 존재 하에 최고 농도로서 100 nM에서 측정하였다. 세포를 4시간 동안 분자로 처리한 후, 루시퍼라아제 활성을 스테디라이트 플러스 키트(Steadylite plus kit, Perkin Elmer, 6066751)에 의해 측정하였다.
각 융합 단백질의 활성을 비선형 회귀 분석으로부터 파생된 EC50으로 나타내었다.
융합 단백질의 시험관내 FGF21 활성을 인간 베타-클로토(beta-Klotho)를 과발현하는 HEK293 세포주를 사용하여 평가하였다. 시험된 융합 단백질 접합체를 1% HSA의 존재 하에 4배 연속 희석으로 400 nM 최고 농도에서 측정하였다. 세포를 융합 단백질 접합체로 12분 동안 처리한 후, p-ERK 수준을 p-ERK 키트(Cisbio, 64ERKPEH)에 의해 측정하였다.
각 융합 단백질의 활성을 비선형 회귀 분석으로부터 파생된 EC50으로 나타내었다.
결론: 표 2 및 3에 나타낸 바와 같이, 모든 융합 단백질은 천연 FGF21과 비슷한 효능을 나타내었다. 그러나, 융합 분자(MLC#9, MLC#10, MLC#12, MLC#13, MLC#14, MLC#15, MLC#16, MLC#17, MLC#19 및 MLC#21)는 상이한 GLP-1 활성을 나타내었다. 분자 MLC#14, MLC#16, MLC#17, MLC#19 및 MLC#21은 MLC#9, MLC#12, MLC#13 및 MLC#15보다 유의하게 더 높은 GLP1 활성을 나타내었다. 시험된 다른 융합 분자와 비교했을 때, MLC#15는 상대적으로 더 짧은 제2 링커를 가지며, GLP-1 활성 역시 더 낮다. 종합하면, 이는 더 긴 제2 링커를 갖는 융합 분자가 더 높은 GLP1 활성을 가질 수 있음을 나타낼 수 있다. 도 2a 및 2b에 나타낸 바와 같이, 융합 분자(MLC#9, MLC#10, 대조군#6 및 MLC#14)는 YH-dual 분자(즉, WO 2017/074123에서 서열번호 66으로서 개시된 분자)보다 유의하게 더 높은 FGF21 효능을 나타내었다.
표 2. GLP-1-나노바디-FGF21 융합 단백질 접합체의 시험관내 GLP1 활성 및 FGF21 활성.
표 3. 나노바디-FGF21 융합 단백질 접합체의 시험관내 FGF21 활성.
실시예 6: 질환 모델에서의 효능 연구
선택된 분자를 질환 동물 모델(예컨대, db/db 마우스, 식이 유도 비만(DIO) 마우스)에서 평가하여 만성 연구에서 용량 반응에 따른 체중, 음식 섭취, 글루코스 효능을 결정한다. 혈장 인슐린, 혈장 중성지방, 혈장 콜레스테롤, 혈장 LDL-c, 혈장 아디포넥틴, 간 중성지방, 간 콜레스테롤 및 간 기능 지수(ALT, AST)를 포함하는 일부 바이오마커를 또한 측정한다.
A) 음식 섭취 및 체중 감소
방법:
22주령 DIO 수컷 C57BL/6 마우스(~50 g)에게 25일 동안 지정된 GLP-1 폴리펩타이드 접합체(즉, 분자 012)를 격일마다 1회(Q2D) 피하 주사하였다. 음식 섭취 및 체중을 매주 2회 측정하고, 공복 혈당을 매주 1회 측정하였다. 각 처리 그룹당 5마리의 동물을 사용하였다. 체중 및 공복 혈당은 각 개별 동물에 대해 모니터링하였지만, 각 그룹 동물에 대한 음식 섭취는 함께 측정하였다. 1일 및 25일은 분자 투여의 첫째 날 및 마지막 날이다. 데이터를 평균값 및 표준 오차(SEM) 또는 모은 값으로서 표시한다. 통계 분석을 일원 ANOVA에 의해 수행하였다. 25일째의 체중 감소를 -1*(%BW 손실 - 비히클 그룹의 %BW 손실)에 의해 계산하고, 누적 음식 섭취 감소를 -100*(누적 음식 섭취 - 비히클의 누적 음식 섭취)/비히클의 누적 음식 섭취에 의해 계산한다.
결론: DIO 연구에서, 도 3a, 3b 및 표 8에서 나타낸 바와 같이, 분자 대조군#2, 대조군#6, MLC#9 및 MLC#10은 체중 감소 및 음식 섭취 억제에 유의한 영향을 미친다.
표 8 11일에 DIO 마우스에서 음식 섭취 및 체중 감소
B) DIO 동물 모델에서의 대사 매개변수
방법:
16주령 DIO 수컷 C57BL/6 마우스(35~40 g)에게 21일 동안 지정된 GLP-1/FGF21 접합체(즉, MLC#9, MLC#14, MLC#16 및 MLC#17)를 매일 1회(QD) 피하 주사하였다. 음식 섭취 및 체중을 매일 1회 측정하였고, 비공복 혈당을 3일마다 1회 측정하였다. 각 처리 그룹당 5마리의 동물을 사용하였다. 체중 및 혈당은 각 개별 동물에 대해 모니터링하였지만, 동물의 각 그룹에 대한 음식 섭취는 함께 측정하였다. 1일 및 21일은 각각 처리의 첫째 날 및 마지막 날이다. 말기 혈액을 수집하고, EDTA-K3 혈장을 준비하고, 바이오마커 측정(LDL-C, TC, TG, ALT, 인슐린, 아디포넥틴)을 위해 -80℃에서 동결하였다. 간 및 지방 조직을 또한 수집하고 액체 질소에서 동결하고 -80℃에서 보관하였다. 데이터를 평균값 및 표준 오차(SEM) 또는 모은 값으로서 표시한다. 통계 분석을 일원 ANOVA에 의해 수행하였다. 21일째의 체중 감소를 -1*(%BW 손실 - 비히클 그룹의 %BW 손실)에 의해 계산하고, 누적 음식 섭취 감소를 -100*(누적 음식 섭취 - 비히클의 누적 음식 섭취)/비히클의 누적 음식 섭취에 의해 계산한다.
결론:
DIO 마우스 연구에서, 도 4a에 나타낸 바와 같이, 분자 MLC#9, MLC#14, MLC#16 및 MLC#17은 세마글루타이드, 티르제파타이드, YH-dual(WO2017/074123에서의 서열번호 66)과 비교하여 체중 감소에 대해 훨씬 더 우수한 효능을 나타내었다. MLC#9, MLC#14, MLC#16 및 MLC#17은 연구에서 약 30-35%의 체중 감소를 유도하였다. 대조적으로, 세마글루타이드, 티르제파타이드 및 YH-dual은 약 20% 내지 25%의 체중 감소를 유도하였다.
도 4b에서, MLC#9, MLC#14, MLC#16 및 MLC#17 그룹은 세마글루타이드, 티르제파타이드 및 YH-dual보다 우수한 글루코스 제어를 나타내었다. MLC#9, MLC#14, MLC#16 및 MLC#17은 비공복 글루코스 수준을 7 mmol/L 미만으로 감소시켰다. 대조적으로, 세마글루타이드는 비공복 글루코스를 약 7.5-10 mmol/L로 감소시켰다.
MLC#9, MLC#14, MLC#16 및 MLC#17은 또한 혈장 내 중성지방(도 4c), LDL-C(도 4d), 총 콜레스테롤(도 4e) 및 ALT(도 4f) 농도의 감소 및 지방 중량(도 4g) 및 간 중량(도 4h)의 감소와 함께, 간 TG(도 4i), 간 TC(도 4j) 및 인슐린 감수성(도 4k)의 개선을 유도하였다.
생체내에서, FGF21은 인슐린 감작제로 보고된 아디포넥틴의 분비를 유도할 수 있다. 융합 분자 MLC#9, MLC#14, MLC#16 및 MLC#17은 YH-dual보다 아디포넥틴 수준의 증가에 대해 더 우수한 효과를 나타내었고, 이는 더 우수한 FGF21 활성을 나타낸다(도 4l).
C) 상이한 용량에서 ob/ob 동물 모델에서의 대사 매개변수
방법: 10주령 ob/ob 수컷 마우스(42~55 g)에게 14일 동안 지정된 GLP-1/FGF21 접합체(즉, MLC#14 및 MLC#16)를 매일 1회(QD) 피하 주사하였다. 음식 섭취 및 체중을 매일 1회 측정하였다. 비공복 혈당을 3일마다 1회 측정하였다. 혈장 중성지방(TG) 수준을 매주 1회 측정하였다. 각 처리 그룹당 5 또는 6마리의 동물을 사용하였다. 체중 및 혈당은 각 개별 동물에 대해 모니터링하였지만, 각 그룹 동물에 대한 음식 섭취는 함께 측정하였다. 1일 및 14일은 분자 투여의 첫째 날 및 마지막 날이다. 처리 후 14일에, 마우스를 마취 하에 심장 천자를 통해 희생시켰다. 말기 혈액을 수집하고, 바이오마커 측정(LDL-C, TC, TG, ALT/AST, 인슐린, 아디포넥틴)을 위해 -80℃에서 동결하였다. 간 및 지방 조직을 또한 수집하고, 액체 질소에서 동결하고, -80℃에서 보관하였다. 데이터를 평균값 및 표준 오차(SEM) 또는 모은 값으로서 표시한다. 통계 분석을 일원 ANOVA에 의해 수행하였다. 14일째의 체중 감소를 -1*(%BW 손실 - 비히클 그룹의 %BW 손실)에 의해 계산하고, 누적 음식 섭취 감소를 -100*(누적 음식 섭취 - 비히클의 누적 음식 섭취)/비히클의 누적 음식 섭취에 의해 계산한다.
결론: ob/ob 마우스 연구에서, 도 5a-5m에 나타낸 바와 같이, 융합 분자 MLC#14 및 MLC#16은 체중 감소(도 5a), 글루코스 저하 및 바이오마커 변화에 대해 용량 의존적 효능을 나타내었다. 도 5a에서, 분자 MLC#14 및 MLC#16은 동일한 투여량에서 세마글루타이드, 티르제파타이드, YH-dual(WO2017/074123에서의 서열번호 66)과 비교하여 체중 감소에 대해 훨씬 더 우수한 효능을 나타내었다. 도 5b에서, MLC#14 및 MLC#16 그룹은 동일한 투여량에서 세마글루타이드와 유사한 글루코스 제어 효과에 도달하였다. 도 5c에 나타낸 바와 같이, MLC#14 및 MLC#16은 동일한 용량에서 세마글루타이드, 티르제파타이드 및 YH-dual과 비교하여 혈장 중성지방의 감소를 더 잘 유도하였다. MLC#14 및 MLC#16은 또한 혈장 내 LDL-C(도 5d), 총 콜레스테롤(도 5e), ALT(도 5f) 및 AST(도 5g) 농도의 수준을 감소시켰고, 지방 중량(도 5h) 및 간 중량(도 5i)의 감소와 함께 간 TG(도 5j), 간 TC(도 5k) 및 인슐린 감수성(도 5l)의 개선을 유도하였다. 융합 분자 MLC#14 및 MLC#16은 동일한 투여량에서 YH-dual보다 아디포넥틴 수준 증가에 유의미하게 더 우수한 효과를 나타냈으며, 이는 더 우수한 FGF21 활성을 나타낸다(도 5m).
D) DIO 동물 모델에서의 대사 매개변수
방법: 16주령 DIO 수컷 C57BL/6 마우스(35~50 g)에게 22일 동안 지정된 GLP-1/FGF21 접합체 및 FGF21 접합체(즉, MLC#16, MLC#19, MLC#6 및 MLC#23)를 매일 1회(QD) 피하 주사하였다. 음식 섭취 및 체중을 3일마다 1회 측정하였고, 공복 혈당을 매주 측정하였다. 각 처리 그룹당 5마리의 동물을 사용하였다. 체중 및 혈당은 각 개별 동물에 대해 모니터링하였지만, 각 동물 그룹에 대한 음식 섭취는 함께 측정하였다. 1일 및 22일은 각각 처리의 첫째 날 및 마지막 날이다. 말기 혈액을 수집하고, EDTA-K3 혈장을 준비하고, 바이오마커 측정(LDL-C, TC, TG)을 위해 -80℃에서 동결시켰다. 간 및 지방 조직을 또한 수집하고, 액체 질소에서 동결하고, -80℃에서 보관하였다. 데이터를 평균값 및 표준 오차(SEM) 또는 모은 값으로서 표시한다. 통계 분석을 일원 ANOVA에 의해 수행하였다.
결론
DIO 마우스 연구에서, 도 6a에 나타낸 바와 같이, GLP-1-나노바디-FGF21 융합 단백질 접합체(MLC#16 및 MLC#19) 및 나노바디-FGF21 융합 접합체(MLC#6 및 MLC#23)는 체중 감소에 대해 양호한 효능을 나타내었다. 도 6b에서, MLC#16, MLC#19, MLC#6 및 MLC#23 그룹은 세마글루타이드보다 우수한 글루코스 제어를 나타내었고, 또한 혈장 내 혈청 중성지방(도 6c), LDL-C(도 6d) 및 총 콜레스테롤(도 6e) 농도의 감소 및 지방 중량(도 6f) 및 간 중량(도 6g)의 감소와 함께 간 TG(도 6h)의 개선을 유도하였다.
실시예 7: 래트에서 약동학 연구
방법: 6-8주령 수컷 SD 래트에게 15 nmol/kg 단백질 MLC#9(접합됨) 또는 MLC#10(비접합됨)의 단일 피하 용량을 투여하였다(n=3/그룹). 혈장 샘플을 투여전(-5분), 피하 투여 후 0.5시간, 1시간, 2시간, 4시간, 6시간, 8시간, 12시간, 24시간, 48시간, 72시간, 96시간에 수집하였다. 혈장 내 폴리펩타이드 접합체의 농도를 ELISA 방법에 의해 측정하였다. 각 폴리펩타이드 접합체의 혈장 농도 대 피하 주사 후 시간을 나타내는 그래프에 기초하여, 약동학 파라미터를 WinNonlin에 의해 계산하였다.
결론: MLC#9는 래트에서 14.3시간의 반감기 T1/2를 가지며, 이는 9.5시간의 반감기 T1/2를 갖는 MLC#10보다 더 긴 반감기를 나타낸다.
실시예 8: 미니피그에서의 PK 연구.
선택된 분자의 약동학을 미니피그에서 평가한다. 피하 및 정맥내 주사 모두를 수행한다.
실시예 9: 비인간 영장류에서의 PK 연구.
선택된 분자의 약동학을 원숭이에서 평가한다. 피하 및 정맥내 주사 모두를 수행한다.
방법: 4-5년령 수컷 시노몰구스 원숭이에게 5 mg/kg(123 nmol/kg) MLC#16(n=2/그룹)의 단일 피하 용량을 투여하였다. 혈장 샘플을 투여전(-5분), 피하 투여 후 0.5시간, 1시간, 2시간, 4시간, 6시간, 8시간, 12시간, 24시간, 36시간, 48시간, 72시간, 96시간, 120시간, 144시간 및 168시간에 수집하였다. 혈장 내 MLC#16의 농도를 LC-MS/MS 방법에 의해 측정하였다. MLC#16의 혈장 농도 대 피하 주사 후 시간을 나타내는 그래프에 기초하여, 약동학 파라미터를 WinNonlin에 의해 계산하였다.
결론: MLC#16은 원숭이에서 54.3시간의 반감기를 나타내었고, 이는 인간에서의 매주 1회 용량 빈도를 잠재적으로 지지한다(표 9).
표 9. 원숭이에서의 MLC#16의 약동학 매개변수. 약동학 데이터를 WinNonlin 소프트웨어에 의해 분석하였다. Tmax, Cmax, T1/2, AUC를 계산하였다.
실시예 10: 면역원성 평가.
선택된 GLP-1 폴리펩타이드 접합체를 또한 인실리코(iTope 및 TCED 방법) 및 생체외(EpiScreen) 방법에 의해 면역원성에 대해 평가한다.
실시예 11: 안정성 평가.
안정성을 시험하기 위해, 상이한 GLP-1 폴리펩타이드 접합체를 상이한 조성(pH6, 7, 7.4 및 8.0)을 갖는 완충액에서 제제화하고, 2-4주 동안 상이한 온도(예컨대, 4℃ 및 25℃)에서 보관한다. %HMWP 및 %LMW를 크기 배제 크로마토그래피(SEC)-HPLC에 의해 분석한다. 농도 및 변형을 역상(RP)-UPLC 및 LC/MS에 의해 분석하였다.
실시예 12: 인간 혈청 알부민 결합
방법: 혈청 알부민에 대한 분자의 결합을 Biacore 8K 기기에서 표면 플라즈몬 공명에 의해 특성화하였다. 인간 혈청 알부민을 4000 RU에 도달할 때까지 CM5 센서 칩 표면에 공유 결합시켰다. 칩을 420초 동안 10 μL/분의 유속으로 1 M 에탄올아민에 의해 차단시켰다. 각 분자 샘플을 희석하고, 30 μL/분의 유속으로 주입하여 120초 동안 칩 결합된 알부민에 결합시키고 300초 동안 해리시켰다. 분자가 없는 결합 완충액을 20초의 유속으로 칩 위로 보내어 30초 동안 결합된 분자의 자발적인 해리를 허용하였다.
결론: 모든 융합 분자(MLC#9, MLC#10, 대조군#4, 대조군#5, 대조군#6, MLC#12 및 MLC#16)는 인간 혈청 알부민과 유사한 결합 친화성을 나타낸다(표 10 참조).
표 10: 인간 혈청 알부민 결합 친화성
실시예 13: 융합 단백질에서의 FAP 효소 절단
방법: 섬유아세포 활성화 단백질(FAP)은 세린 프로테아제이다. 이 효소는 FGF21의 분해를 조절하는 것으로 보고되었다. FAP 효소에 의한 융합 단백질의 C 말단 분해를 시험하기 위해, 융합 단백질(MLC#23, MLC#25) 및 FAP 효소를 200:1 비율로 37℃에서 20시간 동안 인큐베이션하였다. LC-MS를 수행하여 융합 단백질의 분해 백분율을 분석하였다.
결론: 접합이 없는 융합 단백질(MLC#25, MLC#18 및 MLC#21)은 37℃에서 20시간 동안 FAP 효소와 함께 인큐베이션되는 경우 50.6-65.2% C-말단 분해를 나타내었다. 그러나, 융합 단백질 접합체(MLC#23, MLC#16 및 MLC#19) 및 171G 치환을 갖는 융합 단백질(MLC#10)은 FAP 효소에 대한 저항성을 나타내었다.
표 11: FAP 효소 절단에 의한 융합 단백질의 결과

Claims (61)

  1. N-말단에서 C-말단 방향으로,
    혈청 알부민에 결합할 수 있는 나노바디 도메인을 포함하는 제1 단편; 및
    생물학적 활성 FGF21 도메인을 포함하는 제2 단편
    을 포함하고,
    제1 단편 및 제2 단편은 제1 링커를 통해 연결된 것인 폴리펩타이드.
  2. 제1항에 있어서, FGF21 도메인은 서열번호 1에 대해 각각 위치 121, 168, 171, 및 180으로 이루어진 군으로부터 선택된 위치들로부터 선택된 위치에 하나 이상의 아미노산 잔기 돌연변이를 포함하는 것인 폴리펩타이드.
  3. 제2항에 있어서, FGF21 도메인 내의 하나 이상의 아미노산 잔기 돌연변이는 N121Q, M168L, P171G 및 A180E, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 것인 폴리펩타이드.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, FGF21 도메인은 접합가능한 잔기를 추가로 포함하는 것인 폴리펩타이드.
  5. 제4항에 있어서,
    접합가능한 잔기는 서열번호 1에 대해 위치 169부터 위치 181에 이르는 C-말단 단편 내의 위치에 있으며; 선택적으로
    접합가능한 잔기는 서열번호 1에 대해 위치 169, 170, 171, 172, 173, 174, 180 및 181로 이루어진 군으로부터 선택된 위치에 있는 것인 폴리펩타이드.
  6. 제4항 또는 제5항에 있어서, FGF21 도메인은 서열번호 6-13, 16-19, 및 92의 아미노산 서열을 포함하는 것인 폴리펩타이드.
  7. 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩타이드는 제2 단편 내의 접합가능한 잔기에서 기능적 모이어티와 접합되는 것인 폴리펩타이드.
  8. 제7항에 있어서, 기능적 모이어티는 글리코실 모이어티 또는 합성 화학적 모이어티를 포함하는 것인 폴리펩타이드.
  9. 제7항 또는 제8항에 있어서, 기능적 모이어티는 글리코실 모이어티를 포함하고, 접합가능한 잔기는 글리코실화가능한 도입된 잔기인 폴리펩타이드.
  10. 제9항에 있어서, 접합가능한 잔기는 서열번호 1에 대해 위치 172 또는 위치 173에 도입된 T, 또는 위치 170 또는 위치 174에 도입된 N 잔기를 포함하는 것인 폴리펩타이드.
  11. 제7항 또는 제8항에 있어서, 기능적 모이어티는 합성 화학 모이어티를 포함하는 것인 폴리펩타이드.
  12. 제11항에 있어서, 접합가능한 잔기는 도입된 시스테인 잔기를 포함하는 것인 폴리펩타이드.
  13. 제12항에 있어서, 합성 화학적 모이어티는 *-X-Y-Z의 구조를 포함하고, 여기서 X, Y, 및 Z는 결합을 통해 상호연결되며, X의 * 말단은 폴리펩타이드 상의 접합가능한 잔기에 연결되고, 여기서
    X는 일 수 있으며, Y는 , 또는 일 수 있고, Z는 일 수 있으며,
    여기서
    위치 α는 α'에 연결되고, 위치 β는 위치 β'에 연결되며, R1은 수소 또는 -COOH이고, d는 1, 2, 또는 3이며, a는 1, 2 또는 3이고, b는 1, 2 또는 3이며, c는 1 또는 2이고, d는 1, 2, 또는 3이며, e는 1, 2, 또는 3인 폴리펩타이드.
  14. 제13항에 있어서, 합성 화학적 모이어티는 하기 구조:

    를 갖는 것인 폴리펩타이드.
  15. 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 도입된 시스테인은 서열번호 1에 대해 169, 170, 171, 172, 173, 174, 180 및 181로 이루어진 군으로부터 선택된 위치에 있는 것인 폴리펩타이드.
  16. 제15항에 있어서, 도입된 시스테인 잔기는 위치 171에 있고, 합성 화학적 모이어티는 하기 구조

    를 갖는 것인 폴리펩타이드.
  17. 제16항에 있어서, FGF21 도메인은 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하며, 선택적으로 도입된 시스테인은 위치 171에 있는 것인 폴리펩타이드.
  18. 제15항에 있어서,
    i) FGF21 도메인은 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하고, 도입된 시스테인은 위치 169에 있거나;
    ii) FGF21 도메인은 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하고, 도입된 시스테인은 위치 170에 있거나;
    iii) FGF21 도메인은 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하고, 도입된 시스테인은 위치 172에 있거나;
    iv) FGF21 도메인은 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하고, 도입된 시스테인은 위치 173에 있거나;
    v) FGF21 도메인은 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하고, 도입된 시스테인은 위치 174에 있거나;
    vi) FGF21 도메인은 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하고, 도입된 시스테인은 위치 180에 있거나;
    vii) FGF21 도메인은 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하고, 도입된 시스테인은 위치 181에 있거나,
    viii) FGF21 도메인은 서열번호 92의 아미노산 서열을 포함하고, 도입된 시스테인은 위치 174에 있는 것인 폴리펩타이드.
  19. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, FGF21 도메인은 서열번호 1에 대해 치환 P171G를 추가로 포함하는 것인 폴리펩타이드.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 나노바디 도메인은 VHH 도메인을 포함하는 것인 폴리펩타이드.
  21. 제20항에 있어서, VHH 도메인은 인간화된 것인 폴리펩타이드.
  22. 제20항 또는 제21항에 있어서, VHH 도메인은 상보성 결정 영역 1(CDR1), 상보성 결정 영역 2(CDR2) 및 상보성 결정 영역 3(CDR3)을 포함하며,
    CDR1은 서열번호 20의 서열 또는 최대 3개, 2개, 또는 1개의 아미노산 돌연변이를 갖는 이의 변이체를 포함하고;
    CDR2는 서열번호 21의 서열 또는 최대 3개, 2개, 또는 1개의 아미노산 돌연변이를 갖는 이의 변이체를 포함하며/거나;
    CDR3은 서열번호 22의 서열 또는 최대 3개, 2개, 또는 1개의 아미노산 돌연변이를 갖는 이의 변이체를 포함하고;
    VHH 도메인은 혈청 알부민, 선택적으로 인간 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 실질적으로 유지하는 것인 폴리펩타이드.
  23. 제22항에 있어서, VHH 도메인은 서열번호 20의 서열을 포함하는 상보성 결정 영역 1(CDR1), 서열번호 21의 서열을 포함하는 CDR2, 및 서열번호 22의 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 것인 폴리펩타이드.
  24. 제20항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, VHH 도메인은 서열번호 23의 아미노산 서열, 또는 서열번호 23에 대해 적어도 70%(예컨대, 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%) 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하며, 변이체는 혈청 알부민에 대한 결합 특이성 및/또는 친화성을 실질적으로 유지하는 것인 폴리펩타이드.
  25. 제24항에 있어서, 서열번호 23의 변이체는 서열번호 23에 대해 최대 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개의 아미노산 돌연변이를 갖는 것인 폴리펩타이드.
  26. 제20항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 나노바디 도메인은 VHH 도메인의 N-말단에 부착된 N-말단 연장을 추가로 포함하는 것인 폴리펩타이드.
  27. 제26항에 있어서, N-말단 연장은 SG, AG, S 또는 A의 아미노산 잔기를 포함하는 것인 폴리펩타이드.
  28. 제27항에 있어서, 나노바디 도메인은 서열번호 24-27로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것인 폴리펩타이드.
  29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 링커는 적어도 4개의 아미노산 잔기의 길이를 갖는 것인 폴리펩타이드.
  30. 제29항에 있어서, 제1 링커는 산성 아미노산 잔기를 포함하지 않는 것인 폴리펩타이드.
  31. 제30항에 있어서, 제1 링커는 D 잔기 또는 E 잔기 중 어느 것도 포함하지 않는 것인 폴리펩타이드.
  32. 제29항에 있어서, 제1 링커는 제1 반복 서열의 하나 이상의 단위를 포함하는 것인 폴리펩타이드.
  33. 제32항에 있어서, 제1 반복 서열은 G, Q, A, P, T 및 S로 이루어진 군으로부터 선택된 4개 또는 6개 유형 이하의 아미노산 잔기로 구성되는 것인 폴리펩타이드.
  34. 제33항에 있어서, 제1 반복 서열은 GfSg, 서열번호 35(GAQP), 서열번호 36(GQAP), 서열번호 37(GPAQ), 서열번호 38(GPQA), 서열번호 39(GSQP), 서열번호 40(GASP), 서열번호 41(GPAS), 서열번호 42(GPSA), 서열번호 43(GGGS), 서열번호 44(GSGS), 서열번호 45(GGGGS), 서열번호 46(GSAPGSPAGSPTGSAPGSPA), 및 GS로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되며, 여기서 f 및 g 각각은 독립적으로 1 내지 5로부터 선택된 정수인 폴리펩타이드.
  35. 제34항에 있어서, 제1 반복 서열은 서열번호 35(GAQP)에 제시된 아미노산 서열을 가지며, 하나 이상의 단위의 수는 1 내지 10의 정수인 폴리펩타이드.
  36. 제35항에 있어서, 제1 링커는 서열번호 35(GAQP), 서열번호 49((GAQP)2), 서열번호 50((GAQP)5), 서열번호 51((GAQP)10), 및 서열번호 48(GGGGSGGGS)로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것인 폴리펩타이드.
  37. 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 단편의 N-말단을 넘어, 또 다른 기능적 도메인을 포함하는 제3 단편을 추가로 포함하며,
    제1 단편 및 제3 단편은 제2 링커를 통해 연결되는 것인 폴리펩타이드.
  38. 제37항에 있어서, 제3 단편의 또 다른 기능적 도메인은 글루카곤 유사 펩타이드-1(GLP-1), 인슐린, 렙틴, 글루카곤, 가스트린, 위 억제 폴리펩타이드(GIP), 아밀린, 칼시토닌, 콜레시스토키닌, 펩타이드 YY, 신경펩타이드 Y, 골형성 단백질-6(BMP-6), 골형성 단백질-9(BMP-9), 옥신토모둘린, 옥시토신, 글루카곤 유사 펩타이드-2(GLP-2), 이리신, 피브로넥틴 III형 도메인 함유 단백질 5(FNDC5), 아펠린, 아디포넥틴, Clq 및 종양 괴사 인자 관련 단백질(CTRP 계열), 레지스틴, 비스파틴, 오멘틴, 레티놀 결합 단백질-4(RBP-4), 글리센틴, 안지오포이에틴, 인터루킨-22(IL-22), 엑센딘-4, 및 성장 호르몬으로 이루어진 군으로부터 선택된 것의 생물학적 활성 단백질, 또는 이의 단편을 포함하는 것인 폴리펩타이드.
  39. 제38항에 있어서, 제3 단편의 또 다른 기능적 도메인은 GLP-1의 생물학적 활성 펩타이드, 또는 이의 단편을 포함하며, 여기서 또 다른 기능적 도메인은 서열번호 28의 실질적인 생물학적 활성을 유지하면서 서열번호 28에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 폴리펩타이드.
  40. 제39항에 있어서, 또 다른 기능적 도메인은 서열번호 28에 대해 위치 8, 22, 26, 34, 및 36에 하나 이상의 돌연변이, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 것인 폴리펩타이드.
  41. 제40항에 있어서, 하나 이상의 돌연변이는 A8G, G22E, K26R, K34R, R36G, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 것인 폴리펩타이드.
  42. 제41항에 있어서, 또 다른 기능적 도메인은 서열번호 29, 및 서열번호 31-34로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것인 폴리펩타이드.
  43. 제37항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 링커는 적어도 8개의 아미노산 잔기(예컨대, 적어도 12개, 16개, 또는 20개의 아미노산 잔기)의 길이를 갖는 것인 폴리펩타이드.
  44. 제43항에 있어서, 제2 링커는 제2 반복 서열의 하나 이상의 단위를 포함하는 것인 폴리펩타이드.
  45. 제41항에 있어서, 제2 반복 서열은 G, Q, A, E, P, T 및 S로 이루어진 군으로부터 선택된 4개 또는 6개 이하 유형의 아미노산 잔기로 구성되는 것인 폴리펩타이드.
  46. 제45항에 있어서, 제2 반복 서열은 GhSi, 서열번호 35(GAQP), 서열번호 55(GQEP), 서열번호 56(GEQP), 서열번호 57(GPQE), 서열번호 58(GPEQ), 서열번호 59(GSEP), 서열번호 60(GESP), 서열번호 61(GPSE), 서열번호 62(GPES), 서열번호 36(GQAP), 서열번호 37(GPAQ), 서열번호 38(GPQA), 서열번호 39(GSQP), 서열번호 40(GASP), 서열번호 41(GPAS), 서열번호 42(GPSA), 서열번호 43(GGGS), 서열번호 44(GSGS), 서열번호 45(GGGGS), 서열번호 46 (GSAPGSPAGSPTGSAPGSPA) 및 GS로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되며, h 및 i 각각은 독립적으로 1 내지 5로부터 선택된 정수인 것인 폴리펩타이드.
  47. 제46항에 있어서, 제2 반복 서열은 서열번호 35(GAQP)에 제시된 아미노산 서열을 가지며, 하나 이상의 단위의 수는 1 내지 15의 정수인 폴리펩타이드.
  48. 제43항에 있어서, 제2 링커는 서열번호 49((GAQP)2), 서열번호 50((GAQP)5), 서열번호 51((GAQP)10), 및 서열번호 52((GAQP)14), 및 서열번호 47((GGGGS)4)로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것인 폴리펩타이드.
  49. 제1항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 63-68, 93, 99, 100, 101 및 107로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드.
  50. 제37항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 70, 74, 75, 79-83, 85, 94-98, 및 108-109로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드.
  51. 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩타이드 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물.
  52. 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩타이드 또는 제51항에 따른 약학 조성물의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 대사 장애의 예방 또는 치료가 필요한 대상체에서 대사 장애를 예방 또는 치료하는 방법.
  53. 제52항에 있어서, 대사 장애는 당뇨병, 비만, 비알코올성 지방간염(NASH), 심혈관 유사 이상지질혈증, 동맥경화증, 알코올성 지방간염(ASH), 당뇨병신증, 임신성 당뇨병, 대사 증후군, 예컨대 대사 증후군 X, 비알콜성 지방간 질환(NAFLD), 말기 간 질환, 간 지방증(지방간), 간경변, 원발성 담즙성 간경변증(PBC) 또는 중증 고중성지방혈증(SHTG)인 방법.
  54. 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드.
  55. 제54항에 따른 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터.
  56. 제55항에 따른 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  57. 제54항의 폴리뉴클레오타이드 또는 제거가능한 태그를 추가로 포함하는 이의 전구체의 발현을 허용하는 조건 하에서 제56항의 숙주 세포를 배양하는 단계; 및
    숙주 세포로부터 폴리펩타이드 또는 이의 전구체를 수집 및 정제하는 단계
    를 포함하는, 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 폴리펩타이드를 생산하는 방법.
  58. 제57항에 있어서, 폴리펩타이드는 제2 단편 내의 접합가능한 잔기에서 기능적 모이어티와 접합되고, 방법은 숙주 세포로부터 폴리펩타이드를 수집 및 정제하는 단계 이후에 기능적 모이어티를 폴리뉴클레오타이드에 접합하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
  59. 제57항 또는 제58항에 있어서, 숙주 세포는 E. coli이고, 벡터는 E. coli 양립가능한 벡터를 포함하며, 벡터 내의 폴리뉴클레오타이드에 의해 코딩된 폴리펩타이드는 E. coli 발현을 위해 코돈 최적화되는 것인 방법.
  60. 제57항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 숙주 세포로부터 폴리펩타이드를 수집 및 정제하는 단계는
    폴리펩타이드의 전구체를 이로부터 수집하는 단계;
    폴리펩타이드의 전구체가 리폴딩(refold)되도록 하는 단계;
    폴리펩타이드의 리폴딩된 전구체를 처리하여 태그를 제거함으로써 폴리펩타이드를 얻는 단계; 및
    폴리펩타이드를 정제하는 단계
    를 포함하는 것인 방법.
  61. 제58항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 정제된 폴리펩타이드를 기능적 모이어티와 접합하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
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