PT1605897E - Compostos de glp-1 ligado a polietilenoglicol - Google Patents

Compostos de glp-1 ligado a polietilenoglicol Download PDF

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PT1605897E
PT1605897E PT04722142T PT04722142T PT1605897E PT 1605897 E PT1605897 E PT 1605897E PT 04722142 T PT04722142 T PT 04722142T PT 04722142 T PT04722142 T PT 04722142T PT 1605897 E PT1605897 E PT 1605897E
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Lianshan Zhang
Andrew Mark Vick
Richard Dennis Dimarchi
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Description

ΡΕ1605897 1
DESCRIÇÃO "COMPOSTOS DE GLP-1 LIGADO A POLIETILENOGLICOL"
CAMPO DO INVENTO 0 presente invento está relacionado com compostos de GLP-1 ligados covalentemente a uma ou mais moléculas de polietilenoglicol ou um seu derivado e composições relacionadas úteis no tratamento de condições ou distúrbios que beneficiem do abaixamento de glucose no sangue, decréscimo da ingestão de alimentos, decréscimo do esvaziamento gástrico ou intestinal ou decréscimo da motilidade gástrica ou intestinal.
FUNDAMENTO DO INVENTO 0 péptido tipo glucagon-1 (GLP-1) induz numerosos efeitos biológicos tais como estimulação da secreção de insulina, inibição da secreção de glucagon, inibição do esvaziamento gástrico, inibição da motilidade gástrica ou da motilidade intestinal, estimulação da utilização de glucose e indução da perda de peso. GLP-1 pode ainda actuar de forma a prevenir a deterioração das células pancreáticas β que ocorre à medida que progridem os diabetes mellitus não dependentes de insulina (NIDDM). Uma caracteristica importante de GLP-1 é a sua capacidade para estimular a 2 ΡΕ1605897 secreção de insulina sem o risco associado de hipoglicemia que se observa quando da utilização da terapia com insulina ou com alguns tipos de terapias orais que actuam através do aumento da expressão de insulina. A utilidade da terapia que envolve os péptidos GLP-1 tem sido limitada pelo facto de GLP-1(1-37) ser pouco activo e os dois péptidos naturalmente truncados, GLP-1(7-37) OH e GLP-1(7-36)NH2, serem rapidamente eliminados in vivo e terem semividas extremamente curtas in vivo. É conhecido que a dipeptidil-peptidase IV produzida endoge-namente (DPP-IV) inactiva os péptidos GLP-1 em circulação através da remoção dos resíduos de histidina e alanina N-terminais, sendo uma causa importante para a semivida curta in vivo.
Foram feitas várias abordagens para estender a semivida de eliminação de um péptido GLP-1 ou reduzir a eliminação do péptido do corpo mantendo ao mesmo tempo a sua actividade biológica. A Patente U.S. N° 5705483 descreve análogos dos péptidos GLP-1 tornados resistentes à degradação por DPP-IV através da incorporação de modificações no extremo N do péptido. Uma abordagem alternativa para o prolongamento da semivida dos péptidos GLP-1 é a derivatização, em que grandes grupos acilo a vários aminoácidos de GLP-1 impedem DPP-IV de aceder ao extremo N do péptido ligado (Ver o Pedido de Patente Internacional N° PCT/DK97/00340, apresentado em 22 de Agosto, 1997 intitulado "Derivados de GLP-1" publicado como WO98/08871, que 3 ΡΕ1605897 reivindica o benefício dos Pedidos de Patente Provisórios DK Nos 0931/96 apresentado em 30 de Agosto, 1996, 1259/96 apresentado em 8 de Novembro, 1996 e 1470/96 apresentado em 20 de Dezembro, 1996).
Análogos de GLP-1 particulares estão descritos nos Pedidos de Patente U.S. N° de Série 60/346474 apresentado em 8 de Janeiro, 2002 e 60/405097 apresentado em 21 de Agosto, 2002, agora Pedido de Patente Internacional N° PCT/US03/0001, apresentado em 3 de Janeiro, 2003, publicado como WO 03/058203, todos intitulados "Análogos prolongados de péptidos tipo glucagon-1". Estes pedidos de patente descrevem análogos de GLP-1(7-37)OH em que vários amino-ácidos, quando adicionados ao extremo C, deram análogos dos péptidos GLP-1 com uma semivida prolongada e eliminação reduzida relativamente à molécula nativa. Ainda, análogos de GLP-1 com potência melhorada estão descritos no Pedido de Patente U.S. N° de Série 60/314573 apresentado em 23 de Agosto, 2001, agora Pedido de Patente Internacional N° PCT/US02/21325, apresentado em 14 de Agosto, 2002, publicado como W003/018516, intitulado "Análogos do Péptido tipo glucagon 1". A exendina-4 pode actuar no receptor de GLP-1 in vitro em determinados tipos de células incluindo células secretoras de insulina [Goke, et al., J. Biol. Chem., (1993) 268:19650-19655]. Moléculas particulares de exendina PEGuilada e agonistas de exendina estão descritas no Pedido de Patente Internacional Número PCT/US00/11814, publicado como WOOO/6629. 4 ΡΕ1605897
Apesar de várias abordagens terem resultado em compostos de GLP-1 com uma semivida maior ou maior potência do que GLP-1 nativo, são necessárias abordagens novas que possam ser usadas por si sós ou em combinação com abordagens conhecidas para diminuir mais a eliminação dos compostos de GLP-1 e aumentar a semivida dos compostos de GLP-1, optimizando assim a sua capacidade para serem úteis como fármaco que possa ser administrado um número mínimo de vezes durante um período de tempo prolongado. A ligação covalente de uma ou mais moléculas de polietilenoglicol a um péptido pequeno biologicamente activo, como seja GLP-1 ou exendina-4, coloca o risco de introduzir caracteristicas adversas na molécula, tais como instabilidade e redução da bioactividade, tão graves que tornem a molécula inadequada para usar como fármaco. 0 presente invento, no entanto, baseia-se no facto de a ligação covalente de uma ou mais moléculas de PEG a resíduos particulares de um composto de GLP-1 resultar num composto GLP-1 PEGuilado biologicamente activo com uma semivida prolongada e eliminação reduzida quando comparado com GLP-1 nativo ou Vals-GLP-l (ou exendina-4 nativa relativamente a péptidos de exendina-4 modificada do invento).
Os compostos GLP-1 PEGuilados do invento possuem maior utilidade como fármaco assim como maior conveniência de utilização do que GLP-1 nativo, devido a reterem a totalidade ou uma porção de uma actividade biológica de GLP-1 nativo, possuindo ainda uma semivida aumentada e/ou eliminação reduzida quando comparadas com as do composto 5 ΡΕ1605897 GLP-1 nativo ou com as de Vals-GLP-l(7-37)OH. GLP-1 (7-37) possui uma semivida no soro de apenas 3 a 5 minutos. GLP-1 (7-36) amida tem um tempo de acção de cerca de 50 minutos quando a administrado subcutaneamente. Mesmo os análogos GLP-1 e os seus derivados que são resistentes à clivagem por protease endógena, não possuem semividas suficientemente longas para evitar administrações repetidas ao longo de um periodo de 24 horas. Os compostos de GLP-1 PEGguilados do invento podem ter uma semivida de 24 horas permitindo menos administrações do composto GLP-1 PEGuilado, mantendo ao mesmo tempo um nível elevado do composto no sangue ao longo de um período de tempo prolongado Tais compostos de GLP-1 PEGuilados podem ser usados terapeuticamente para tratar indivíduos com distúrbios incluindo, mas não estando limitado a diabetes, obesidade, anormalidades da motilidade gástrica e/ou intestinal e anormalidades do esvaziamento gástrico ou intestinal, sendo uma vantagem particular o facto dos compostos de GLP-1 PEGuilados requerem menos doses durante um período de 24 horas, aumentando a conveniência para um indivíduo necessitado de tal terapia e a probabilidade da cumplicidade do indivíduo com as necessidades de dosagem.
SUMÁRIO DO INVENTO O invento aqui descrito proporciona compostos de GLP-1 covalentemente ligados a uma ou mais moléculas de polietilenoglicol (PEG) ou um seu derivado em que cada PEG ligado a um aminoácido Cys, resultando nos compostos GLP-1 6 ΡΕ1605897 PEGuilados com uma semivida de eliminação de pelo menos uma hora, de preferência pelo menos 3, 5, 7, 10, 15, 20 horas e mais de preferência pelo menos 24 horas. Os compostos de GLP-1 PEGuilados do presente invento, de preferência, possuem um valor de eliminação de 200 ml/h/kg ou menos, mais de preferência 180, 150, 120, 100, 80, 60 ml/h/kg ou menos e mais de preferência menos de 50, 40 ou 20 ml/h/kg.
De acordo com o presente invento é proporcionado um composto GLP-1 PEGuilado compreendendo a sequência de aminoácidos da Fórmula IV (SEQ ID NO:6)
Xaa7-XaarG!u-Giy~Xaan~Xaai2-Thr“Ser-Asp~Xaai6-Ser-Xaai8-Xaa{*rXaa2<rCHu-Xaa22-Xaa23-Xaa24-Xaa25-XM2$-Xaa27~Phe-Iíe-Xaa30-Trp«LeU"Xaa33'Xaa34~Xaa35-Xaa3S“Xaa37-Xaa38“Xaa39-Xaa4e-Xaa41 *Xaa42"Xaa4 3 * X 3344-X s-Xaâ46"Xaa4? Fórmula IV (SEQ ID NO:6) em que:
Xaa7 é: L-histidina, D-histidina, desamino-histidina, 2-amino-histidina, β-hidroxi-histidina, homo-histidina, a-fluorometil-histidina ou a-metil-histidina;
Xaas é: Vai;
Xaan é: Thr;
Xaai2 é: Phe, Trp ou Tyr;
Xaai6 é: Vai, Trp, Ile, Leu, Phe, Tyr, ou Cys;
Xaais é: Ser, Trp, Tyr, Phe, Lys, Ile, Leu, Vai;
Xaaig é : Tyr, Trp ou Phe; 7 ΡΕ1605897
Xaa2o é: Leu, Phe, Tyr ou Trp; Xaa22 é: Gly, Glu, Asp ou Lys; Xaa23 é: Gin; Xââ24 é: Ala; Xaa25 é: Ala, Vai, Ile ou Leu; Xaa26 é: Lys; Xaa27 é: Glu, Ile ou Ala; Xaa3o é: Ala ou Glu; Xaa33 é: Vai ou Ile; Xaa34 é: Lys, Asp, Arg ou Glu; Xaa35 é: Gly; Xaa36 é: Gly, Pro ou Arg; Xaa37 é: Gly, Pro ou Ser; Xaa38 é: Ser, Pro, His ou Cys; Xaa39 é: Ser, Arg, Thr, Trp ou Lys; Xaa4o é: Ser ou Gly; Xaa4i é: Ala, Asp, Arg, Glu, Lys ou Gly; Xaa42 é: Pro, Ala, NH2 ou está ausente; Xaa43 é: Pro, Ala, NH2 ou está ausente; Xaa44 é: Pro, Ala, Arg, Lys, His, NH2 ou está ausente; Xaa45 é: Ser, His, Pro, Lys, Arg, Cys, NH2 ou está ausente; Xaa4 6 é: His, Ser, Arg, Lys, Cys, NH2 ou está ausente; Xaa47 é: His, Ser, Arg, Lys, NH2 ou está ausente; e em que: 2 ou 1 dos resíduos de Cys estão ligados covalentemente a uma molécula de PEG; e desde que se Xaa42, Xaa43, Xaa44, Xaa45 ou Xaa46 estiver ausente, cada um dos aminoácidos a ΡΕ1605897 jusante está ausente; e desde que existam 2 ou 1 Cys na molécula.
De preferência, o composto GLP-1 PEGuilado de acordo com o presente invento não difere de GLP-1(7-37)OH em mais de 3 aminoácidos dentro dos aminoácidos 7-37.
De acordo com um outro aspecto do presente invento é proporcionado cum composto GLP-1 PEGuilado de acordo com o presente invento para usar como medicamento.
De preferência, o composto GLP-1 PEGuilado é para usar no tratamento de diabetes não dependentes de insulina, obesidade, choque, enfarte do miocárdio, sindrome do intestino irritável ou dispepsia funcional e, mais de preferência, para usar no tratamento de diabetes não dependente de insulina ou obesidade.
Os polímeros de polietilenoglicol usados no invento ("PEG") de preferência possuem massas moleculares entre 500 e 100000 daltons, mais de preferência entre 20000 e 60000 daltons, mais de preferência entre 20000 e 40000 daltons, podem ser moléculas lineares ou ramificadas e podem ser derivados de polietilenoglicol como descrito noutros trabalhos. O presente invento descreve um método de estimulação do receptor de GLP-1 num indivíduo necessitado 9 ΡΕ1605897 de tal estimulação, o referido método compreendendo o passo de administração ao indivíduo de uma quantidade eficaz de um composto GLP-1 PEGuilado aqui descrito. Os indivíduos necessitados de estimulação dos receptores de GLP-1 incluem os que possuem diabetes não dependentes de insulina, hiperglicemia induzida por stress, obesidade, distúrbios de motilidade ou esvaziamento gástrico e/ou intestinal, por exemplo, sindrome do intestino irritável e dispepsia funcional.
DESCRIÇÃO DETALHADA DO INVENTO 0 péptido tipo glucagon 1 (GLP-1) é um péptido de 37 aminoácidos secretado pelas células L do intestino como resposta à ingestão de alimentos. Numerosos análogos e derivados de GLP-1 foram descritos em trabalhos anteriores. 0 presente invento descreve modificações dos compostos GLP- 1 que resultam em prolongamento da semivida de eliminação e/ou eliminação reduzida. A incorporação de 1 ou 2 residuos de Cys em posições particulares de aminoácidos do péptido proporciona um grupo tiol ao qual pode ser ligado covalentemente polietilenoglicol (PEG) ou derivado de PEG resultando num composto GLP-1 PEGuilado com semivida de eliminação prolongada e/ou eliminação reduzida. GLP-1(7-37)OH tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:1: 10 ΡΕ1605897 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Seria 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28
Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Gly-Phe- 29 30 31 32 33 34 35 36 37 IIe-Ala-Trp~Leu~Val-I*ys-Gly-Arg-Gly {SEQ ID NO:l) O termo "polipéptido" ou "péptido" como aqui usado, destina-se a indicar qualquer forma estrutural (e.g., primária, secundária ou terciária) de uma sequência de aminoácidos compreendendo mais de 5 resíduos de aminoácidos, os quais podem ou não ser ainda modificados (e.g., acetilados, carboxilados, fosforilados, lipidados ou acilados). 0 termo "nativo" refere-se a um polipéptido que tem uma sequência de aminoácidos que é idêntica a uma encontrada na natureza. O termo "nativo" destina-se a incluir variantes alélicas do polipéptido em questão. 0 termo "aminoácido" é aqui usado no seu sentido mais lato e inclui aminoácidos naturais assim como aminoácidos não naturais, incluindo variantes de aminoácidos e derivados. Os familiarizados com a área reconhecerão, face a esta definição lata, que aqui a referência a aminoácidos inclui, por exemplo, L-aminoácidos proteo-génicos naturais; D-aminoácidos; aminoácidos quimicamente modificados tais como variantes e derivados de aminoácidos; aminoácidos não proteogénicos não naturais tais como norleucina, β-alanina, ornitina, etc., e compostos obtidos por síntese química tendo propriedades conhecidas na área como sendo características de aminoácidos. Exemplos de 11 ΡΕ1605897 aminoácidos não naturais incluem cx-metil aminoácidos (e.g., cx-metil-alanina) , D-aminoácidos, aminoácidos do tipo histidina (e.g., 2-amino-histidina, β-hidroxi-histidina, homo-histidina, α-f luorometil-histidina e cx-metil-histi-dina), aminoácidos tendo um metileno extra na cadeia lateral (aminoácidos "homo") e aminoácidos em que um grupo funcional de ácido carboxilico na cadeia lateral é substituído por um grupo de ácido sulfónico (e.g., ácido císteico). De preferência, no entanto, os compostos de GLP-1 do presente invento compreendem apenas aminoácidos naturais excepto quando de outra forma seja especificado. 0 termo "composto GLP-1" como aqui usado, inclui GLP-1 nativo, [GLP-1(7-37)OH ou GLP-1(7-36)NH2] , análogos de GLP-1, derivados de GLP-1, fragmentos biologicamente activos de GLP-1, GLP-1 prolongado ou um análogo ou (ver, e.g., WO 03/058203), análogos de exendina-4 e derivados de exendina-4 compreendendo um ou dois resíduos de Cys em posições particulares do péptido como aqui descrito.
De forma convencional, ao extremo amina de GLP-1(7-37)OH nativo foi atribuído o número 7 dos resíduos e ao extremo carboxilo, o número 37. Os outros aminoácidos no polipéptido estão numerados consecutivamente, como se mostra em SEQ ID NO:l. Por exemplo, a posição 12 é fenilalanina e a posição 22 é glicina na molécula nativa.
Um "fragmento de GLP-1" ou "fragmento de um composto de GLP-1" como aqui usado, é um polipéptido 12 ΡΕ1605897 biologicamente activo obtido após truncagem de um ou mais aminoácidos do extremo N e/ou do extremo C de um composto de GLP-1. A nomenclatura usada para descrever GLP-1(7-37)OH aplica-se a fragmentos de GLP-1. Por exemplo, GLP-1(9-36)OH significa um fragmento de GLP-1 obtido através da truncagem de dois a aminoácidos do extremo N e de um aminoácido do extremo C. Os aminoácidos no fragmento estão designados com os mesmos números do aminoácido correspondente em GLP-1 (7-37)OH. Por exemplo, o ácido glutâmico N-terminal em GLP-l(9-36)OH está na posição 9; a posição 12 é ocupada por fenilalanina; e a posição 22 é ocupada por glicina, como em GLP-1(7-37)OH.
Os compostos de GLP-1 incluem análogos de GLP-1 e análogos de exendina-4. Para clarificar, os "análogos de exendina-4" conforme incluídos nos "compostos de GLP-1" possuem sempre um ou dois resíduos de Cys. De preferência, um análogo de GLP-1 tem a sequência de aminoácidos de GLP-1(7-37)OH ou um péptido GLP-1 prolongado como descrito nos Pedidos de Patente U.S. Nos de Série 60/346474 apresentado em 1 de Agosto, 2002 ou 60/405097 apresentado em 21 de Agosto, 2002, publicada como W003/058203, ambos intitulados "Análogos prolongados de péptidos tipo glucagon-1" ou um seu fragmento, modificado de forma que 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 aminoácidos diferem na posição correspondente de GLP-1(7-37) OH ou um fragmento de GLP-1(7-37)OH ou modificado de forma que 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 aminoácidos diferem na posição correspondente de um péptido GLP-1 prolongado. 13 ΡΕ1605897 0 termo "PEGuilado" quando se refere a um composto de GLP-1 do presente invento refere-se a um composto de GLP-1 que foi quimicamente modificado pela ligação covalente de uma ou mais moléculas de poli- etilenoglicol ou de um seu derivado. Ainda, pretende-se que o termo "PEG" se refira a polietilenoglicol ou a um seu derivado como conhecido na área (ver, e.g., Patentes U.S. Nos: 5445090; 5900461; 5932462; 6436386; 6448369; 6437025; 6448369; 6495659; 6515100 e 6514491). Nos compostos GLP-1 PEGuilados do presente invento, PEG (ou um seu derivado) é ligado covalentemente a um ou mais resíduos de cisteína do composto de GLP-1. Facultativamente, as moléculas de PEG podem ser ligadas a um composto de GLP-1 através de uma molécula de ligação ou espaçadora (ver exemplos de moléculas espaçadoras descritos na Patente U.S. 6268343).
Na nomenclatura aqui usada destinada a compostos de GLP-1, o aminoácido usado na substituição e a sua posição estão indicados seguindo-se o nome do péptido parental. Por exemplo, Glu22-GLP-1 (7-37) OH designa um composto de GLP-1 em que a glicina normalmente encontrada na posição 22 de GLP-1(7-37)OH foi substituída por ácido glutâmico; Val8Glu22-GLP-l (7-37) OH (ou V8E22-GLP-1 (7-37) OH) designa um composto de GLP-1 em que a alanina normalmente encontrada na posição 8 e a glicina normalmente encontrada na posição 22 de GLP-1(7-37)OH foram substituídas por valina e ácido glutâmico, respectivamente. Vals-exendina-4 designa um composto de GLP-1 em que a serina normalmente encontrada na posição 8 da exendina 4 foi substituída por 14 ΡΕ1605897 uma valina. De preferência, os compostos de GLP-1 do invento possuem actividade insulinotrópica. "Actividade insulinotrópica" refere-se à capacidade de estimular a secreção de insulina como resposta a niveis elevados de glucose, causando assim a tomada de glucose pelas células e um decréscimo dos níveis de glucose no plasma. A actividade insulinotrópica pode ser avaliada por métodos conhecidos na área, incluindo a utilização de experiências in vivo e ensaios in vitro que medem a actividade de ligação ao receptor de GLP-1 ou a activação de receptores, e.g., ensaios que empregam as células dos ilhéus pancreáticos ou células de insulinoma, como descrito em EP 619322 de Gelfand et al., e Patente U.S. N° 5120712, respectivamente. A actividade insulinotrópica é normalmente medida em seres humanos através da medição dos niveis de insulina ou dos niveis do péptido C.
Para fins do presente invento, um ensaio in vitro de sinalização de receptores de GLP-1 foi usado para determinar se um composto de GLP-1 PEGuilado do presente invento apresenta actividade insulinotrópica in vivo. A actividade insulinotrópica é uma actividade que pode ser usada para demonstrar que o composto de GLP-1 PEGuilado é biologicamente activo. A "potência in vitro" como aqui usada, é uma medida da capacidade de um péptido para activar o receptor de GLP-1 num ensaio baseado em células. A potência in vitro 15 ΡΕ1605897 é expressa como "EC50", a qual é a concentração efectiva de composto que resulta em 50% de actividade numa experiência de dose-resposta simples. Para fins do presente invento, a potência In vitro foi determinada usando um ensaio de fluorescência que emprega células HEK-293 que expressam estavelmente o receptor de GLP-1 humano. Estas células HEK293 possuem, estavelmente integrado, um vector de DNA tendo um elemento de resposta a cAMP (CRE) que dirige a expressão do gene da β-lactamase (BLAM). A interacção de um composto de GLP-1 (ou agonista) com o receptor inicia um sinal que resulta na activação do elemento de resposta a cAMP e subsequente expressão da β-lactamase. O substrato da β-lactamase CCF2/AM que emite fluorescência quando é cortado pela β-lactamase (Pan Vera LLC) pode ser adicionado às células que foram expostas a uma quantidade especifica de agonista de GLP-1 para proporcionar uma medida da potência do agonista de GLP-1. O ensaio está ainda descrito em Zlokarnik et al. (1998) Science 279:84-88. Os valores de EC5o para os compostos apresentados no Exemplo 4 foram determinados usando o ensaio BLAM descrito atrás. Os valores de potência relativa in vitro podem ser estabelecidos correndo Vals-GLP-l(7-37)OH ou GLP-1 nativo como controlos e atribuindo ao controlo um valor de referência de 100%. O termo "semivida no plasma" refere-se ao tempo em que metade das moléculas relevantes circula no plasma antes de serem eliminadas. Um termo usado em alternativa é "semivida de eliminação". O termo "prolongada" ou "mais 16 ΡΕ1605897 longa" usado no contexto da semivida ou eliminação no plasma indica que é um aumento estatisticamente significativo na semivida de um composto de GLP-1 PEGuilado relativamente à molécula de referência (e.g., a forma não PEGuilada do péptido ou da proteína nativa) conforme determinado em condições comparáveis. De preferência, um composto de GLP-1 PEGuilado do presente invento possui uma semivida de eliminação de pelo menos uma hora, mais de preferência pelo menos 3, 5, 7, 10 15, 20 horas e mais de preferência pelo menos 24 horas. A semivida aqui descrita no Exemplo 5 é a semivida de eliminação; é a que corresponde à velocidade de eliminação no final da fase linear logarítmica. Os familiarizados com a área saberão que a semivida é um parâmetro derivado que muda em função da eliminação e do volume de distribuição. A eliminação é a medida da capacidade do corpo para eliminar um fármaco. À medida que a eliminação diminui devido, por exemplo, a modificações de um fármaco, será de esperar que a semivida aumente. No entanto, esta relação inversa é exacta apenas quando não há alteração no volume de distribuição. Uma relação aproximada útil entre a semivida terminal da fase logarítmica linear (tH) , eliminação (C) e volume de distribuição (V) é dada pela equação: t1^ * 0, 693 (V/C) . A eliminação não indica quanto fármaco é removido mas antes, o volume de fluido biológico, como seja sangue ou plasma, que teria de ser totalmente liberto do fármaco para permitir a eliminação. A eliminação é expressa em volume por unidade de tempo. Os compostos de 17 ΡΕ1605897 GLP-1 PEGuilados do presente invento, de preferência, possuem um valor de eliminação de 200 ml/h/kg ou menos, mais de preferência 180, 150, 120, 100, 80, 60 ml/h/kg ou menos e, mais de preferência, 50, 40 ou 20 ml/h/kg ou menos (Ver Exemplo 5).
Uma vez preparado e purificado um péptido para uso no invento, é modificado através da ligação de pelo menos uma molécula PEG a resíduos Cys. É difícil planear moléculas de péptidos ou proteínas delicados, com novas propriedades adequadas sem causar perda da sua funcionalidade, através da ligação de polímeros. Foi descrita uma larga variedade de métodos na área para produzir conjugados ligados covalentemente a PEG e o método específico usado no presente invento não se destina a ser limitante (para um artigo de revisão ver, Roberts, M. et al., Advanced Drug Delibery Reviews, 54:459-476, 2002). A PEGuilação de proteínas pode ultrapassar muitos dos problemas farmacológicos e toxicológicos/imunológicos associados à utilização de péptidos ou proteínas como fármacos. No entanto, para qualquer péptido individual desconhece-se se a forma PEGui-lada do péptido terá perda significativa da bioactividade comparativamente com a forma não PEguilada do péptido. A bioactividade das proteínas PEGuiladas pode ser afectada por factores tais como: i) o tamanho da molécula de PEG; ii) os locais particulares de ligação; iii) o grau de modificação; iv) as condições adversas de acoplagem; v) se um elemento de ligação é usado na ligação ou se o 18 ΡΕ1605897 polímero é ligado directamente; vi) a geração de co-produtos prejudiciais; vii) os danos infligidos pelo polímero activado; ou viii) a retenção de carga. Dependendo da reacção de acoplagem usada, a modificação de citocinas com polímeros, em particular, tem resultado em reduções dramáticas da bioactividade. [Francis, G.E., et al., (1998) pEGylation of cytokines and other therapeutic proteins and peptides: the importance of biological optimization of coupling techniques, Intl. J. Hem. 68:1-18].
Os compostos de GLP-1 PEGuilados do presente invento possuem uma actividade biológica in vitro que é pelo menos 0,5% de GLP-1 nativo ou mais preferencialmente a de Vals-GLP-l(7-37) OH. Mais preferencialmente, o composto GLP-1 PEGuilado do presente invento possui uma actividade biológica in vitro que é pelo menos 1% ou 3% da de GLP-1 nativo ou mais de preferência a de Vals-GLP-l (7-37) OH. Tal actividade biológica pode ser determinada pelo ensaio de potência in vitro como aqui descrito (Exemplo 4) ou através de outros ensaios de GLP-1 conhecidos na área. Apesar de alguns compostos GLP-1 PEGuilados do invento puderem ter actividade biológica inferior à de GLP-1 nativo ou à de Vals-GLP-l(7-37)OH conforme medido num ensaio particular; esta actividade é compensada pela semivida prolongada e/ou valor de eliminação mais baixo e pode mesmo ser uma característica favorável para um composto de GLP-1 com uma semivida de eliminação prolongada. É ainda considerado que as posições do péptido 19 ΡΕ1605897 GLP-1 que se observou poderem acomodar um resíduo de cisterna sem eliminação da actividade biológica podem ser substituídas com uma cisteína na posição análoga da exendina-4 e resultar num análogo de exendina-4 ainda capaz de se ligar ao receptor de GLP-1. Não existem mais de 1 ou 2 aminoácidos Cys por análogo de exendina-4 do invento.
Na sua forma típica, PEG é um polímero linear com grupos hidroxilo terminais e possui a fórmula ΗΟ-ΟΗ2-ΟΗ2-(CH2CH20) n-CH2CH2-OH, em que n é entre aproximadamente 8 e aproximadamente 4000. O hidrogénio terminal pode ser substituído com um grupo protector como seja um grupo alquilo ou alcanol. Preferencialmente, PEG tem pelo menos um grupo hidroxilo, mais de preferência é um grupo hidroxilo terminal. É este grupo hidroxilo que é preferencialmente activado para reagir com o péptido. Existem muitas formas de PEG úteis no presente invento. Estão descritos numerosos derivados de PEG e que são úteis no invento. (Ver, e.g., Patentes U.S. Nos: 5445090; 5900461; 5932462; 6436386; 6448369; 6437025; 6448369; 6495659; 6515100 e 6514491 e Zalipsky, S. Bioconjugate Chem. 6:150-165, 1995) . A molécula de PEG ligada covalentemente aos compostos de GLP-1 no presente invento não pretende estar limitada a qualquer tipo particular. A massa molecular do PEG tem, de preferência, 500-100000 daltons e mais de preferência entre 20000 e 40000 daltons. PEG pode ser linear ou ramificado e os compostos de GLP-1 PEGuilados do invento podem ter 1 ou 2 moléculas de PEG por molécula PEGuilada de composto de GLP-1. É ainda considerado que 20 ΡΕ1605897 ambos os extremos da molécula de PEG podem ser funcio-nalizados para ligação cruzada de dois ou mais compostos de GLP-1 uns aos outros. O presente invento proporciona compostos de GLP-1 com uma ou mais moléculas de PEG ligadas covalentemente. Um método para a preparação de compostos de GLP-1 PEGuilados do presente invento envolve a utilização de PEG-maleimida para ligar directamente PEG a um grupo tiol do péptido. A introdução de uma função tiol pode ser conseguida através da adição ou inserção de um residuo Cys no péptido nas posições atrás descritas. Um grupo funcional tiol pode também ser introduzido na cadeia lateral do péptido (e.g., acilação do grupo ε da lisina de um ácido contendo tiol). Um processo de PEGuilação do presente invento utiliza a adição de Michael para formar um elemento de ligação estável tioéter. A reacção é altamente especifica e decorre em condições suaves na presença de outros grupos funcionais. PEG-maleimida tem sido usado como um polimero reactivo para a preparação de conjugados bem definidos, bioactivos, de PEG-proteinas. Prefere-se que o processo use um excesso molar de um composto de GLP-1 contendo tiol relativamente a PEG-maleimida para conduzir a reacção até ao fim. As reacções são, de preferência, realizadas entre pH 4,0 e 9,0, à temperatura ambiente, durante 15 a 40 horas. 0 excesso de péptido não PEGuilado contendo tiol é facilmente separado do produto PEGuilado através de meios de separação convencionais. Exemplos de condições necessárias para a PEGuilação dos compostos de GLP-1 estão 21 ΡΕ1605897 descritas no Exemplo 1. A PEGuilação de cisteína pode ser realizada usando PEG-maleimida ou PEG-maleimida bifurcado.
Os compostos de GLP-1 possuem uma variedade de actividades biológicas. Por exemplo, encontrou-se que GLP-1 estimula a libertação de insulina, causando assim a tomada de glucose pelas células e baixando os niveis de glucose no soro [ver, e.g., Mojsov, S., (1992) Int. J. Peptide Protein Research, 40:333]. GLP-1 é particularmente promissor no tratamento de diabetes melittus não dependente de insulina (NIDDM) uma vez que apresenta um risco de hipoglicemia semelhante ao dos actuais tratamentos de NIDDM. GLP-1 é igualmente considerado no tratamento da obesidade, sindrome do intestino irritável e dispepsia funcional.
Considera-se que uma utilização de um composto de GLP-1 PEGuilado do presente invento inclui a utilização na produção de um medicamento para o tratamento de diabetes não dependentes de insulina, obesidade choque, enfarte do miocárdio, sindrome do intestino irritável ou dispepsia funcional. A PEGuilação de um composto de GLP-1 pode ser combinada com outras modificações conhecidas na área para aumentar a semivida de GLP-1 (ver, e.g. WO 03/058203) e assim aumentar a semivida do composto ainda mais que a PEGuilação sozinha ou outro método de metilação sozinho.
Como aqui usado, o termo "composto de GLP-1" também inclui sais farmaceuticamente aceitáveis dos compostos aqui descritos. Um composto de GLP-1 deste invento podem 22 ΡΕ1605897 possuir um grupo suficientemente ácido ou suficientemente básico, ou ambos os grupos funcionais, e assim reagir com qualquer uma de uma série de bases inorgânicas e ácidos inorgânicos e orgânicos, para formar um sal. Os ácidos normalmente empregues para formar sais de adição de ácido são ácidos inorgânicos, tais como ácido clorídrico, ácido bromidrico, ácido iódico, ácido sulfúrico, ácido fosfórico e similares, e ácidos orgânicos, tais como ácido p-toluenossulfónico, ácido metanossulfónico, ácido oxálico, ácido p-bromofenil-sulfónico, ácido carbónico, ácido sucinico, ácido cítrico, ácido benzóico, ácido acético e similares.
Exemplos de tais sais incluem sulfato, piros-sulfato, bissulfato, sulfito, bissulfito, fosfato, mono-hidrogenofosfato, di-hidrogenofosfato, metafosfato, piro-fosfato, cloreto, brometo, iodeto, acetato, propionato, decanoato, caprilado, acrilato, formato, isobutirato, caproato, heptanoato, propiolato, oxalato, malonato, sucinato, suberato, fumarato, maleato, butino.1,4.dioato, hexino-1,6-dioato, benzoato, clorobenzoato, metilbenzoato, dinitrobenzoato, hidroxibenzoato, metoxibenzoato, ftalato, sulfonato, xilenossulfonato, fenilacetato, fenilpropionato, fenilbutirato, citrato, gama-hidroxibutirato, glicolato, tartrato, metanossulfonato, propanossulfonato, naftaleno-1-sulfonato, naftaleno-2-sulfonato, mandelato e similares.
Os sais de adição de bases incluem os derivados de bases inorgânicas, tais como hidróxidos de amónio ou de 23 ΡΕ1605897 metais alcalinos ou alcalinos terrosos, carbonatos, bicarbonatos e similares. Tais bases úteis na preparação de sais deste invento incluem assim hidróxido de sódio, hidróxido de potássio, hidróxido de amónio, carbonato de potássio e similares.
Os compostos de GLP-1 PEGuilados do presente invento são particularmente adequados para administração parentérica, podem ser também administrados oralmente, por administração nasal ou por inalação. A administração parentérica pode incluir, por exemplo, administração sistémica, como seja injecção intramuscular, intravenosa, subcutânea ou intraperitoneal. Os compostos de GLP-1 PEGuilados podem ser administrados ao indivíduo conjuntamente com um veículo, diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitável, para o tratamento das doenças atrás discutidas. A composição farmacêutica pode ser uma solução ou, se administrada parentericamente, uma suspensão do composto de GLP-1 ou uma suspensão do composto de GLP-1 complexado com um catião metálico divalente, como seja zinco. Veículos farmacêuticos adequados podem conter ingredientes inertes, os quais não interagem com o péptido ou derivado do pépti-do. Podem ser empregues técnicas convencionais de formulação farmacêutica tais como as descritas em Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack publishing Company, Easton, PA. Veículos farmacêuticos adequados para administração parentérica incluem, por exemplo, água estéril, soro fisiológico, soro fisiológico bacteriostático (soro fisiológico contendo cerca de 0,9% mg/ml de álcool benzílico), soro 24 ΡΕ1605897 fisiológico tamponado com fosfatos, solução de Hank, lactato de Ringer e similares. Alguns exemplos de excipientes adequados incluem lactose, dextrose, sucrose, tre-halose, sorbitol e manitol.
Os compostos de GLP-1 PEGuilados do invento podem ser formulados para administração de forma que os niveis no plasma sejam mantidos na gama eficaz durante periodos de tempo prolongados. A principal barreira à administração oral eficaz de fármacos peptídicos é a fraca biodispo-nibilidade devido à degradação dos péptidos pelos ácidos e enzimas, fraca absorção através das membranas epiteliais e transição de péptidos para uma forma insolúvel após exposição ao ambiente de pH ácido do tubo digestivo. Os sistemas de administração oral para péptidos tais como incluidos no presente invento são conhecidos na área. Por exemplo, os compostos de GLP-1 PEGuilados podem ser encapsulados usando microsferas e depois administrados oralmente. Por exemplo, os compostos de GLP-1 PEGuilados podem ser encapsulados em microsferas compostas por um polimero comercial biodegradável e biocompativel, ácido poli (láctico-co-glicólico) e azeite como agente de enchimento. Ver, Joseph, et al. (2000) Diabetologia 43:1319-1328. Outros tipos de tecnologia de microsferas podem ser adquiridos comercialmente, como sejam os polímeros biodegradáveis Medisorb® e Prolease® da Alkermes. Os polimeros Medisorb® podem ser produzidos com qualquer um dos isómeros de ácido láctico. As proporções de ácido láctico:glicólico podem variar entre 0:100 e 100:0 25 ΡΕ1605897 permitindo uma larga gama de propriedades dos polimeros. Isto permite o desenho de sistemas de entrega e dispositivos implantáveis com tempos de absorção variando entre semanas e meses. A Emisphere também publicou numerosos artigos que discutem a tecnologia de administração oral para péptidos e proteínas. Por exemplo, ver WO 9528838 de Leone-bay et ai. que descrevem veículos específicos constituídos por aminoácidos modificados para facilitar a absorção.
Os compostos de GLP-1 PEGuilados aqui descritos podem ser usados para tratar indivíduos com uma larga variedade de doenças e condições. Os compostos de GLP-1 PEGuilados abrangidos pelo presente invento exercem os seus efeitos biológicos ao actuarem num receptor referido como "receptor de GLP-1" (ver Dillon et al. (1993) Cloning and functional Expression of the Human Glucagon-like Peptide-1 (GLP-1) Receptor, Endocrinology, 133:1907-1910). Os indivíduos com doenças e/ou condições que respondem favoravelmente à estimulação do receptor de GLP-1 ou à administração de compostos de GLP-1 podem assim ser tratados com compostos de GLP-1 PEGuilados do presente invento. Estes indivíduos são referidos como "estando necessitados de tratamento com compostos de GLP-1" ou "necessitados da estimulação do receptor de DLP-1".
Estão incluídos indivíduos com diabetes dependentes de insulina, choque (ver WO 00/16797 de Efendic), enfarte do miocárdio (ver WO 98/08531 de Efendic), obesi- 26 ΡΕ1605897 dade (ver WO 98/19698 de Efendic), alterações catabólicas após cirurgia (ver Patente U.S. N° 6006753 de Efendic), dispepsia funcional e sindrome do intestino irritável (ver WO 99/64060 de Efendic). Estão igualmente incluídos os indivíduos que requerem tratamento profiláctico com um composto de GLP-1, e.g., indivíduos em risco de desenvolverem diabetes não dependentes de insulina (ver WO 00/07617). Outros indivíduos incluem aqueles sem tolerância à glucose ou com glucose em jejum alterada, indivíduos cujo peso do corpo é cerca de 25% acima do peso normal do corpo para a altura do indivíduo e massa corporal, indivíduos com pancreatectomia parcial, indivíduos tendo um ou mais pais com diabetes não dependentes de insulina, indivíduos que tiveram diabetes gestacionais e indivíduos que tiveram pancreatite aguda ou crónica estão em risco de desenvolverem diabetes não dependentes de insulina.
Os compostos de GLP-1 PEGuilados do presente invento podem ser usados para normalizar os níveis de glucose no sangue, evitar a deterioração das células β pancreáticas, induzir a proliferação das células β, estimular a transcrição de genes estimulada pela insulina, regular positivamente IDX-l/PDX-1 ou outros factores de crescimento, melhorar a função das células β, activar células β dormentes, diferenciar células em células β, estimular a replicação de células β, inibir a apoptose de células β, regular o peso do corpo e induzir a perda de peso. 27 ΡΕ1605897
Uma "quantidade eficaz" de um composto de GLP-1 PEGuilado é a quantidade que resulta num efeito terapêutico e/ou profiláctico pretendido sem causar efeitos secundários inaceitáveis quando administrado a um indivíduo necessitado de estimulação do receptor de GLP-1. Um "efeito terapêutico pretendido" inclui um ou mais dos seguintes: 1) melhoria dos sintomas associados à doença ou condição; 2) um retardamento no estabelecimento dos sintomas associados à doença ou condição; 3) aumento da longevidade comparado com a ausência do tratamento; e 4) maior qualidade de vida comparado com a ausência do tratamento. Por exemplo, uma "quantidade eficaz" de um composto de GLP-1 PEGuilado para o tratamento de diabetes é a quantidade que resultaria num maior controlo da concentração de glucose no sangue do que na ausência de tratamento, resultando assim num retardamento no estabelecimento de complicações diabéticas tais como retinopatia, neuropatia ou doença renal. Uma "quantidade eficaz" de um composto de GLP-1 PEGuilado para a prevenção de diabetes é a quantidade que retardará, comparativamente com a ausência de tratamento, o estabelecimento de niveis elevados de glucose no sangue que requerem tratamento com fármacos anti-hipoglicémicos tais como sulfonilureias, tiazolidinedionas, insulina e/ou bis-guanidinas.
Uma "quantidade eficaz" do composto de GLP-1 PEGuilado administrado a um indivíduo também dependerá do tipo e gravidade da doença e das características do indivíduo, tais como estado geral de saúde, idade, género, 28 ΡΕ1605897 peso do corpo e tolerância a fármacos. Tipicamente, os compostos de GLP-1 PEGuilados do presente invento serão administrados de forma que os niveis no plasma estejam dentro da gama de aproximadamente 5 picomoles/litro e cerca de 200 picomoles/litro. Os niveis óptimos no plasma para Val8-GLP-1(7-37)OH foram determinados como sendo entre 30 picomoles/litro e cerca de 200 picomoles/litro.
Uma gama de doses típica para os compostos de GLP-1 PEGuilados do presente invento variará entre cerca de 0,01 mg por dia e cerca de 1000 mg por dia para um adulto. De preferência, a dosagem varia entre cerca de 0,1 mg por dia e cerca de 100 mg por dia, mais de preferência entre cerca de 1,0 mg/dia e cerca de 10 mg/dia.
Um "indivíduo" é um mamífero, de preferência um ser humano, mas pode também ser um animal, e.g., animais de companhia (e.g., cães, gatos e similares), animais de quinta (e.g., vacas, carneiros, porcos, cavalos e similares) e animais de laboratório (e.g., ratos, murganhos, cobaios, e similares).
Os péptidos usados para gerar os compostos de GLP-1 PEGuilados do presente invento podem ser preparados usando métodos convencionais de técnicas de síntese de péptidos em fase líquida ou em fase sólida. Os sinte-tizadores de péptidos são comercializados, por exemplo, pela Applied Biosystems em Foster City CA. Os reagentes para a síntese em fase sólida podem ser comprados, por 29 ΡΕ1605897 exemplo, à Midwest Biotech (Fishers, IN). Os sintetizadores de péptidos em fase sólida podem ser usados de acordo com as instruções dos fabricantes para o bloqueio de grupos interferentes, protecção do aminoácido que entra na reacção, acoplagem, desacoplagem e bloqueio dos aminoácidos que não reagiram.
Tipicamente, numa resina, um aminoácido protegido com α-Ν-carbamoílo e o aminoácido N-terminal na cadeia peptidica em crescimento são acoplados à temperatura ambiente num solvente inerte como seja dimetilformamida, N-metilpirrolidona ou cloreto de metileno na presença de agentes de acoplagem tais como diciclo-hexilcarbodiimida e 1-hidroxibenzotriazole e de uma base como seja diisopropiletilamina. 0 grupo protector N-carbamoilo é removido da resina com o péptido resultante usando um reagente como seja o ácido trifuloroacético ou piperidina, e a reacção de acoplagem repetida com o aminoácido seguinte pretendido, protegido em N, a ser adicionado à cadeia peptidica. Os grupos protectores amina adequados são conhecidos na área e estão descritos, por exemplo, em Green e Wuts, "Protecting Groups in Organic Synthesis", John Wiley and Sons, 1991. Exemplos incluem t-butiloxicarbonilo (tBoc) e fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc).
Os péptidos são igualmente sintetizados usando protocolos convencionais de síntese automática em fase sólida usando t-butoxicarbonil- ou fluorenilmetoxicarbonil-alfa-aminoácidos com a protecção adequada das cadeias 30 ΡΕ1605897 laterais. Após completada a síntese, os péptidos são cortados do suporte de fase sólida, com desprotecção simultânea da cadeia lateral, usando métodos convencionais com fluoreto de hidrogénio. Os péptidos brutos são ainda purificados usando cromatografia de fase inversa em colunas Vydac C18 usando gradientes de acetonitrilo em 0,1% de ácido trifluoroacético (TFA). Para remover o acetonitrilo, os péptidos são liofilizados a partir de uma solução contendo 0,1% TFA, acetonitrilo e água. A pureza pode ser verificada por cromatografia de fase inversa analítica. A identidade dos péptidos pode ser verificada por espectrometria de massa. Os péptidos podem ser solubilizados em tampões aquosos a pH neutro. 0 invento é ilustrado pelos exemplos que se seguem, os quais não se destinam a ser de alguma forma limitantes.
EXEMPLOS
Exemplo 1 - PEGuilação de análogos relacionados com GLP-1:
As reacções de PEGuilação são corridas em condições que permitem a formação de uma ligação tioéter. Especificamente, o pH da solução varia entre cerca de 4 e 9 e as concentrações de péptidos contendo tiol variam entre 1 e 10 de excesso molar da concentração de metoxi-PEG2-MAL. As reacções de PEGuilação são normalmente corridas à 31 ΡΕ1605897 temperatura ambiente. O péptido GLP-1 PEGuilado é então isolado usando HPLC de fase inversa ou cromatografia de exclusão pelo tamanho (SEC). Os análogos de GLP-1 PEGui-lados são caracterizados usando RP-HPLC analítica, HPLC-SEC, SDS-PAGE e/ou espectrometria de massa MALDI.
Os péptidos GLP-1 contendo tiol são reagidos com polietilenoglicol 40 kDa-maleimida (PEG-maleimida) para produzir derivados com PEG ligado covalentemente através de uma ligação tioéter. Por exemplo, o péptido Cex-51-C (V8E22I33C45 GLP-1, 45 aa de comprimento; 7,5 mg, 1,8 ymol) foi dissolvido em 2 ml de tampão de fosfatos 200 mM contendo EDTA 20 mM, pH 7,4. A solução foi então aspergida com árgon. A esta solução foi adicionado 40 mg de metoxi-PEG2-MAL, um PEG-maleimida bifurcado (Lote# PT-02B-10, Shearwater Polymers, Inc., Huntsville, Alabama) (proporção mole/mole 0,55:1 mole de PEG para péptido). A reacção foi realizada durante 2 horas. Em seguida 25 mg de péptido PEGuilado foi purificado por RP-HPLC, caracterizado por HPLC de exclusão por tamanho e testado relativamente à actividade in vitro.
Exemplo 2 - Reacção de 40kDa-PEG-maleimida com
análogos de GLP
Análogos de GLP tais como Ci6E22V8GLP e V8C38 GLP foram selectivamente PEGuilados no residuo de cisterna introduzido usando mPEG de 40 kDa bifurcado activado com maleimida (Shearwater Polymers, Inc.). Para a reacção de 32 ΡΕ1605897 PEGuilação, o péptido a ser PEGuilado foi dissolvido em tampão Tris 100 mM a pH 8,0 e adicionado um excesso molar de 1,25 vezes de 40 kDa-mPEG. A reacção ficou em agitação à temperatura ambiente durante 2-3 horas e depois foi dialisada durante a noite (membrana de 7 kDa) contra citrato 10 mM, fosfato 10 mM, pH 7,4 a aproximadamente 5°C. As moléculas de GLP- PEGuilado foram purificadas por cromatografia de permuta aniónica numa coluna Mono-Q (Amersham Biosciences Corp, Piscataway, NJ) usando um gradiente de NaCl a pH neutro.
Exemplo 3 - Reacção de DSPE-3,4 kDa-PEG-maleimida com análogos de GLP-1
Análogos de GLP tais como C16E22V8GLP e VsC38 GLP foram selectivamente PEGuilados no resíduo de cisteína introduzido usando mPEG de 3,4 kDa terminado com um lípido, distearoilfosfatidiletanolamina (DSPE) (Shearwater Poly-mers, Inc.) e activado com maleimida. Para a reacção de PEGuilação, o péptido foi dissolvido em tampão Tris 100 mM a pH 8,0 e adicionado um excesso molar de 1,25 vezes de DSPE-3,4 kDa-PEG-maleimida. A reacção ficou em agitação à temperatura ambiente durante 2-3 horas e depois foi dialisada durante a noite (membrana de 7 kDa) contra citrato 10 mM, fosfato 10 mM, pH 7,4 a aproximadamente 5°C. O péptido PEGuilado foi purificado por cromatografia de permuta aniónica numa coluna Mono-Q (Amersham Biosciences Corp, Piscataway, NJ) usando um gradiente de NaCl a pH neutro. 33 ΡΕ1605897
Exemplo 4 - Ensaio de actividade in vitro Células HEK-293 expressando o receptor de GLP-1 humano, usando o sistema Pan Vera LLC CRE-BLAM, foram semeadas entre 20000 e 40000 células/alvéolo/100 μΐ meio DMEM com 10% FBS numa placa de 96 alvéolos, preta, de fundo transparente revestida com poli-d-lisina. No dia seguinte à sementeira, o meio foi removido e adicionado 80 μΐ de meio DMEM sem plasma. No terceiro dia após sementeira, adicionou-se a cada alvéolo 20 μΐ de meio DMEM sem plasma com 0,5% BSA contendo diferentes concentrações do composto GLP-1 PEGuilado para gerar uma curva de dose-resposta. De um modo geral, foram usadas catorze diluições contendo entre 3 nanomolar e 30 nanomolar do péptido PEGuilado para gerar uma curva de dose resposta a partir da qual puderam ser determinados os valores de EC5o. Após 5 horas de incubação com o péptido PEGuilado, adicionou-se 20 μΐ do substrato β-lactamase (CCF2/AM, Pan Vera LLC) e a incubação continuou durante 1 hora, altura em que a fluorescência foi determinada num citofluorimetro. O ensaio foi ainda descrito em Zlokarnik, et al. (1998), Science, 278:84-88.
Os péptidos de GLP-1 PEGuilados que se seguem foram testados como descrito e originaram os valores de EC50 descritos abaixo (com V8GLP-1 igual a 100%): V8Ci6-3,4kDa DPSE-PEG 4% V8-3,4kDa PEG-FMOC 87% V8C38-3, 4kDa DPSE-PEG 18% 34 ΡΕ1605897 V8C38-40kDa PEG 3% V8E22Ci6-40kDa PEG 0,7% V8E22l33C45-3,4kDa PEG (CEX-51) 9,4 + 1,5% [n=5]
Exemplo 5 - Análise farmacocinética do péptido GLP-1 derivatizado
Um análogo de GLP-1 PEGuilado (V8E22I33C45-40 kDa PEG (CEX-51 PEGuilado, modificado em C45)) foi administrado pela via intravenosa (IV) ou subcutânea (SC), numa dose de 0,1 mg/kg a ratos SD machos. Os animais (2 ratos por ponto para IV, 3 ratos por ponto para SC) foram sangrados em vários tempos entre 0 e 336 horas após dosagem. Colheu-se o plasma de cada amostra e analisou-se por radio-imunoensaio. Os parâmetros farmacocinéticos foram calculados usando métodos dependentes de modelo (dados IV) e independentes de modelo (dados SC) (WinNonlin Pro) . Uma representação dos parâmetros farmacocinéticos está descrita na Tabela 1 abaixo. Através da administração IV, o análogo de GLP-1 PEGuilado tinha uma semivida de eliminação de aproxi-madamente 1,5 dias, enquanto através da administração SC, o análogo de GLP-1 PEGuilado tinha uma semivida de eliminação de aproximadamente 1,3 dias. Não foram associadas observações clinicas adversas com administração IV ou SC de 0,1 mg/kg de V8E22I33C45-40kDaPEG. Para o composto foram observadas semivida de eliminação prolongada, eliminação lenta e biodisponibilidade subcutânea relativamente elevada (aproximadamente 60%) para o composto. ΡΕ1605897 35
Tabela 1
Composto Via QbO m b -*-max AUCoJ3 m d -1-1/2 CL/E* Vss/E^ (ng/ml) (d) (ng*h/ml) (d) (ml/h/kg) (ml/kg) V8E22I33C45- IV 1135 0,003 30293 1,5 3,3 161 40kDa EEG SC 187 1-2 18128 1,3 5,5 256 60 a Concentração máxima observada no plasma. b Tempo de concentração máxima observada no plasma. c Área scb a curva de concentração no plasma-tempo medida entre 0 e infinito. d semivida de eliminação em dias. e Eliminação total do corpo em função da biodispombilidade. f Volume de distribuição no estado de equilíbrio em função da biodispombilidade. 9 Biodispombilidade em percentagem._
Quando V8-GLP(7-37)OH foi, de modo semelhante, administrado IV a ratos Fischer 344 numa dose de 10 pg/kg foram obtidos valores de eliminação e de semivida de eliminação profundamente diferentes conforme apresentado abaixo.
Eliminação: 1449 ml/hr/kg TI/2 (hr): 0,05
Um análogo de GLP-1 PEGuilado (V8E22I33C45-4O kDa PEG (CEX-51 PEGuilado, modificado em C45) ) foi administrado pela via intravenosa (IV) ou subcutânea (SC) numa dose de 0,1 mg/kg a macacos cinomólogos. Os animais foram sangrados em vários tempos entre 0 e 336 horas após dosagem. Colheu-se o plasma de cada amostra e analisou-se por radio-imuno-ensaio. Os parâmetros farmacocinéticos foram calculados usando métodos dependentes de modelo (dados IV) e indepen- 36 ΡΕ1605897 dentes de modelo (dados SC) (WinNonlin Pro) . Uma representação dos parâmetros farmacocinéticos está descrita na Tabela 2 abaixo. Através da administração IV, o análogo de GLP-1 PEGuilado tinha uma semivida de eliminação de apro-ximadamente 59,5 horas, enquanto através da administração SC, o análogo de GLP-1 PEGuilado tinha uma semivida de eliminação de aproximadamente 61,6 horas.
Tabela 2 IV Dose Animal# CW1 m b -•-ΠΒΧ ADCb-.c m d -*-1/2 CL (ml/h/kg) Vss (mg/kg) (ng/ml) (d) (ng*h/ml) (d) (ml/kg) 0,1 100473 1662 1,0 149279 59,5 0.,67 57,5 100474 2282 4,0 130341 42,1 0,77 46,6 100477 2672 0,0 215992 76,8 0,46 51,3 Média 2205 1,7 165204 59,5 0,63 51,8 DP 509 2,1 1244991 17,4 0,16 5,5 SC Dose Animal# Qibx m b -*-rrax AUCpc m d -1-1/2 CL/E^ Vss/E^ (mg/kg) (ng/ml) (d) (ng*h/ml) (d) (ml/h/kg) (ml/kg) 0,1 100478 657 72,0 113518 64,4 0,88 81,8 100480 976 48,0 138306 58,8 0,72 61,3 NÉdia 817 60,0 125912 61,6 0,80 71,6 a Concentração máxima observada no plasma. b Tempo de concentração máxima observada no plasma. c Área scb a curva de concentração no plasma-tempo medida entre 0 e infinito. d semivida de eliminação em dias • e Eliminação total do corpo em função da biodisponibilidade. f Volume de distribuição no estado de equilíbrio em função da biodisponibilidade. DP = desvio padrão 37 ΡΕ1605897
Exemplo 6 - Análise farmacodinâmica do péptido GLP-1 derivatizado
Um análogo de GLP-1 PEGuilado (V8E22I33C45-40 kDa PEG (CEX-51 PEGuilado, modificado em C45) ) foi administrado pela via subcutânea (SC) em doses de 3 nmol/kg (12,33 mg/kg = 0,62 yg (micrograma)/50 g de murganho) ou 10 nmol/kg (41 mg/kg = 2 yg (micrograma)/50 g de murganho) a murganhos machos C57BL/601aHsd-Lepob versus um controlo de apenas veiculo. Os animais (6 murganhos por ponto de tempo) foram doseados com uma única injecção do análogo de GLP-1 PEGuilado ou de veiculo às 11:00 am. Os murganhos jejuaram durante a noite e foi realizada uma IPTGG (1 g de dextrose/kg i.p.). Amostras repetidas para glucose e insulina foram colhidas antes e após a injecção de glucose aos 15, 30, 60, 90 e 120 minutos. Uma representação dos parâmetros farmacodinâmicos está descrita nas Tabelas abaixo. AOS glucose veiculo 3 nmol PEG 10 nM PEG 85965,75 28206 29765,25 58198,5 34884 22603,5 60381 33291 48125,25 73320,75 55793,25 54038,25 71703 48422,25 25024,5 72067,5 46707,75 24808,5 Média 70272,75 41217,38 34060,88 Desvio padrão 4100,657 4346,437 5519,325 Valor de p 0,000659 0,000365 38 ΡΕ1605897
Veiculo Estirpe ID murganho GRP Dia 0 Dia 0 Dia 0 Peso Glucose Glucose real ob/ob MR A 49,7 231,4 462,8 ob/ob MS A 46,9 260,5 521 ob/ob MZ A 48,5 206,3 412,6 ob/ob NA A 47,1 209,6 419,2 ob/ob NI A 46,8 180,3 360,6 ob/ob NK A 48,7 222 444 Media 47,95 436,7 Desvio padrão 0,48563 21,99944 GLP-1 EEG 3 nrrol Estirpe ID murganho GRP Dia 0 Dia 0 Dia 0 Peso Glucose Glucose real ob/ob MD C 49,4 187,1 374,2 ob/ob MP C 45,7 212,8 425,6 ob/ob MT C 53,3 253,5 507 ob/ob NC C 49,9 226 452 ob/ob NE C 50,3 247 494 ob/ob NG C 49,5 207,7 415,4 Media 49,6833 444,7 Desvio padrão 0,99144 20,46022 GLP-1 PEG 10 nmol Estirpe ID murganho GRP Dia 0 Dia 0 Dia 0 Peso Glucose Glucose real ob/ob MJ D 49,3 259 518 ob/ob ML D 47,4 221,9 443,8 ob/ob MU D 46,4 232,6 465,2 ob/ob NY D 48,2 227,6 455,2 ob/ob NB D 51,5 185,7 371,4 ob/ob ND D 42,6 196,5 393 Media 47,5667 441,1 Desvio padrão 1,22384 21,50366 39 ΡΕ1605897
Veículo ID Dose Tempo 0 Tempo 15 Tempo 30 Tempo 60 Tempo 90 Tempo 120 murganho Glucose Glucose Glucose Glucose Glucose Glucose real real real real real real MR 0,0994 124,8 566,7 771,9 869,1 668,4 MS 0,0938 83,4 299,1 568,8 759,3 204 MZ 0,097 130,5 468,6 597,9 609,3 383,4 NA 0,0942 247,2 577,2 612,3 623,4 528,9 699,3 NI 0,0936 174,6 469,2 628,2 635,4 506,1 687,6 NK 0,0974 267 563,4 649,8 662,7 495 572,4 Media 171,25 490,7 638,15 693,2 510 535,85 Desvio 29,71165596 43,2838538 28,99511166 41,42960294 9,978476838 82,0598981 padrão GTiP-1 EEG 3 nmol MD 0,0988 70,2 206,4 325,2 240,9 214,2 MP 0,0914 96,6 386,7 408 295,2 196,5 MT 0,1066 84 308,7 369,6 273,3 247,2 NC 0,0998 156 481,2 521,7 532,8 449,1 389,7 NE 0,1006 158,7 453,6 531 287,1 258 518,7 NG 0,099 83,7 433,5 461,4 378,6 310,5 405,3 Média 108,2 378,35 436,15 334,65 339,2 328,6 Desvio 15,91596683 42,33590084 33,90384197 43,80457168 57,00166664 52,57307296 padrão Valor 0,074622229 0,127534361 0,012940369 0,004544365 0,073533898 0,021860517 de p GLP-1 PEG 10 nmol MJ 0,0986 91,2 164,4 312,3 290,1 217,8 ML 0,0948 68,1 318,6 285,3 152,1 135 MU 0,0928 114,6 384,6 489,3 420,3 385,8 MY 0,0964 186 531,6 606,3 447,3 347,1 363,3 NB 0,103 92,4 354 261,6 151,5 117 210,6 ND 0,0852 90,3 277,5 272,7 209,4 147,6 147 Media 107,1 338,45 371,25 278,45 203,9 243,25 Desvio padrão 16,88549674 49,69268055 58,24718448 53,42159208 72,14284441 43,7524685 Valor de p 0,049860093 0,06660094 0,013403998 0,002986998 0,040209038 0,018193438 40 ΡΕ1605897 0 15 30 60 90 120 Veículo Media 171,25 490,7 638,15 693,2 510 535,85 3 nmol Media 108,2 378,35 436,15 334,65 339,2 328,6 10 nmol Media 107,1 338,45 371,25 278,45 203,9 243,25
Veículo ID Dose Tempo 0 Tempo 15 Tempo 30 Tempo 60 Tempo 90 Tempo 120 murganho insulina insulina insulina insulina insulina insulina real real real real real real MR 0,0994 2,7 2,7 2,7 2,7 3,3 MS 0,0938 12,3 3,6 2,7 2,7 6,9 MZ 0,097 2,7 2,7 2,7 2,7 5,1 NA 0,0942 6,3 2,7 2,7 2,7 3,3 3,6 NI 0,0936 3,3 2,7 2,7 2,7 2,7 3,3 NK 0,0974 5,4 2,7 2,7 2,7 3 4,2 Média 5,45 2,85 2,7 2,7 3 4,4 Desvio 1,498832879 0,15 0 0 0,173205081 0,572712843 padrão GLP-1 PEG 3 nmol MO 0,0988 4,8 3,6 5,7 4,8 2,7 MP 0,0914 5,7 16,5 12,6 8,7 9,6 MT 0,1066 5,4 4,5 4,8 8,4 2,7 NC 0,0998 70,8 59,4 69,9 24,6 32,7 30 NE 0,1006 27,9 14,7 24,6 11,4 12,9 25,2 NG 0,099 12,6 13,8 10,8 12 12,6 19,5 Média 21,2 18,75 21,4 11,65 19,4 14,95 Desvio 10,54808039 8,42807807 10,1231418 2,793295545 6,650563886 4,764504171 padrão Valor 0,198202864 0,11819731 0,123985904 0,023885517 0,127758283 0,089610323 de p 41 ΡΕ1605897 GLP-1 PBG 10 nmol MJ 0,0986 39,3 16,5 13,5 31,2 13,5 ML 0,0948 13,5 36,9 48 19,2 14,4 MU 0,0928 32,4 13,8 15,6 12 12,3 MY 0,0964 121,2 122,7 95,1 85,8 56,1 48,3 NB 0,103 35,7 50,7 56,4 34,8 13,2 16,5 ND 0,0852 70,5 56,7 63,9 21,3 10,8 7,5 Média 52,1 49,55 48,75 34,05 26,7 18,75 Desvio padrão 15,73130637 16,2621801 12,62063786 10,88735505 14,71631747 6,035768385 Valor de p 0,03003008 0,03509872 0,014767024 0,034608806 0,24535686 0,069087455 0 15 30 60 90 120 Veiculo Media 5,45 2,85 2,7 2,7 3 4,4 3 nmol Media 21,2 18,75 21,4 11,65 19,4 14,95 10 nmol Media 52,1 49,55 48,75 34,05 26,7 18,75
Veiculo ID Dose Tempo 0 Tempo 15 Tempo 30 Tempo 60 Tempo 90 Tempo 120 murganho Péptido C Péptido C Péptido C Péptido C Péptido C Péptido C real real real real real real MR 0,0994 2127 1188 1167 1182 2736 MS 0,0938 3243 1875 1992 2709 5643 MZ 0,097 1857 1266 1392 1533 2916 NA. 0,0942 3666 2571 2322 2082 1932 3051 NI 0,0936 2391 2178 1776 2181 2469 3777 NK 0,0974 2580 2517 2115 2577 2910 4695 Media 2644 1932,5 1794 2044 2437 3803 Desvio 280,3597689 245,7235235 180,3779366 241,5706936 282,7772975 471,6178538 padrão 42 ΡΕ1605897 GLP-1 PEG 3 nmol MD 0,0988 2130 3492 2613 1989 MP 0,0914 2472 5445 4632 4326 4248 MT 0,1066 2577 2919 2802 4149 3049 NC 0,0998 9663 10278 6759 7197 9849 NE 0,1006 6726 5349 6747 3843 9855 NG 0,099 5010 4812 3975 5675 6390 8337 Média 5289,6 5155,5 4329,6 4703,4 5810 6217,5 Desvio 1234,320279 1163,8275 615,6346725 644,8310244 1010,714104 1447,410464 padrão Valor 0,104283454 0,021669546 0,012956014 0,095491566 0,095491566 0,15910403 de p GLP-1 PEG 10 nmol MJ 0,0986 7200 3501 4296 10332 5901 ML 0,0948 3687 8049 9627 4821 MU 0,0928 5955 6300 7278 MY 0,0964 16212 17643 13266 12423 11124 11943 NB 0,103 8139 9174 11262 7170 4362 6954 ND 0,0852 12162 8478 10785 4947 3867 4506 Média 8892,5 9369 9256 8718 6451 6900,5 Desvio 1856,727996 2096,294409 1365,273526 1352,954914 2340,865438 1104,975497 padrão Valor 0,015654599 0,025508262 0,001556618 0,035883718 0,263009115 0,082555028 de p 0 15 30 60 90 120 Veículo Media 2644 1932,5 1794 2044 2437 3803 3 nmol Média 5289,6 5155,5 4329,6 4703,4 5810 6217,5 10 nmol Média 8892,5 9369 9256 8718 6451 6900,5 LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> Eli Lilly and Company <120> Compostos de GLP-1 ligados a polietilenoglicol <130> X-1602 43 ΡΕ1605897 Λ O ^r1 \—1 V 60/456081 <141> 2003-03-19 <160> 10 <17 0> Patentln version 3.2 <210> 1 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 HÍS Ala Glu Gly Thr Phe Thr ser Asp vai Ser ser Tyr teu Glu Gly 1 5 10 is
Gin Ala Ala Lys Glu Phe lie Ala Trp teu vai Lys Gly Arg Gly 20 25 30
<210> 2 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2
Mis Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Vai Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15
Gin Ala Ala Lys Glu Phe ile Ala Trp Leu vai Lys Gly Arg 20 25 30 <210> 3 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Construção sintética <22 0>
<221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa na posição 1 é L-histidina, D-histidina, desamino-histidina 2-amino-histidina, beta-hidroxi-histidina, homo-histidina, alfa fluorometil-histidina ou alfa metil-histidina <220> <221> MIS_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa na posição 2 é Ala, Gly, Vai, Leu, He, Ser ou Thr <220> 44 ΡΕ1605897 <221> MIS FEATURE <222> (5) . (5) <223> Xaa na posição 5 é Thr ou Cys <22 0> <221> MIS FEATURE <222> (6) . (6) <223> Xaa na posição 6 é Phe, Trp, Tyr ou Cys <22 0> <221> MIS FEATURE <222> (10) · (10) <223> Xaa na posição 10 é Vai, Trp, Ile, Leu, Phe, Tyr ou Cys <22 0> <221> MIS FEATURE <222> (12) "· · (12) <223> Xaa na posição 12 é Ser, Trp, Tyr, Phe, Lys, Ile, Leu ou Vai <22 0> <221> MIS FEATURE <222> (13) · (13) <223> Xaa na posição 13 é Tyr, Trp ou Phe <22 0> <221> MIS FEATURE <222> (14) · (14) <223> Xaa na posição 14 é Leu, Phe, Tyr ou Trp <22 0> <221> MIS FEATURE <222> (16) · (16) <223> Xaa na posição 16 é Gly, Glu, Asp, Lys ou Cys <22 0> <221> MIS FEATURE <222> (17) · (17) <223> Xaa na posição 17 é Gin ou Cys <22 0> <221> MIS FEATURE <222> (18) · (18) <223> Xaa na posição 18 é Ala ou Cys <22 0> <221> MIS FEATURE <222> (19) · (19) <223> Xaa na posição 19 é Ala, Vai, Ile, Leu ou Cys <22 0> <221> MIS FEATURE <222> (20) · (20) <223> Xaa na posição 20 é Lys ou Cys <22 0> 45 ΡΕ1605897 <221> MIS FEATURE <222> (21) . (21) <223> Xaa na posição <22 0> <221> MIS FEATURE <222> (24) · (24) <223> Xaa na posição <220> <221> MIS FEATURE <222> (27) "· . (27) <223> Xaa na posição <220> <221> MIS FEATURE <222> (28) "· · (28) <223> Xaa na posição <220> <221> MIS FEATURE <222> (29) · (29) <223> Xaa na posição <22 0> <221> MIS FEATURE <222> (30) · (30) <223> Xaa na posição <22 0> <221> MIS FEATURE <222> (31) · (31) <223> Xaa na posição modificado <220> <221> MOD RES <222> (31) · (31) <223> Amidação <400> 3 24 é Ala, Glu ou Cys 27 é Vai ou Ile 28 é Lys ou Cys 29 é Gly ou Cys 30 é Arg ou Cys 21 é Glu, Ile, Ala ou Cys 31 é Gly, His, Cys, não existe ou é um resíduo xaa xaa Glu Gly xaa xaa Thr ser Asp xaa ser xaa xaa xaa Glu xaa 1 5 10 15
Xaa xaa xaa xaa xaa Fhe ile xaa Trp Leu xaa xaa xaa xaa xaa 20 2S 30 <210> 4 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Construção sintética 46 ΡΕ1605897 <22 0>
<221> ΜΙSC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa na posição 1 é L-histidina, D-histidina, desamino-histidina, 2-amino-histidina, beta-hidroxi-histidina, homo-histidina, alfa-fluorometil-histidina ou alfa metil-histidina <22 0> <221> MIS FEATURE <222> (2) . (2) <223> Xaa na posição 2 é Gly, Ala, Vai, Leu, Ile :, Ser ou Thr <22 0> <221> MIS FEATURE <222> (5) . (5) <223> Xaa na posição 5 é Thr ou Cys <22 0> <221> MIS FEATURE <222> (6) . (6) <223> Xaa na posição 6 é Phe ou Cys <22 0> <221> MIS FEATURE <222> (10) · (10) <223> Xaa na posição 10 é Vai, Phe, Tyr, Trp ou Cys <22 0> <221> MIS FEATURE <222> (12) · (12) <223> Xaa na posição 12 é Ser, Trp, Tyr, Phe, Lys, Ile, Leu ou <22 0> <221> MIS FEATURE <222> (13) · (13) <223> Xaa na posição 13 é Tyr ou Phe <22 0> <221> MIS FEATURE <222> (16) · (16) <223> Xaa na posição 16 é Gly, Glu, Asp, Lys OU Cys <22 0> <221> MIS FEATURE <222> (17) · (17) <223> Xaa na posição 17 é Gin ou Cys <22 0> <221> MIS FEATURE <222> (18) · (18) <223> Xaa na posição 18 é Ala ou Cys <22 0> <221> MIS FEATURE <222> (19) · (19) <223> Xaa na posição 19 é Ala, Vai, Ile, Leu ou Cys <22 0> ΡΕ1605897 47 <221> MIS_FEATURE <222> (20)..(20) <223> Xaa na posição 20 é Lys ou Cys <22 0> <221> MIS_FEATURE <222> (21)..(21) <223> Xaa na posição 21 é Glu ou Cys <22 0> <221> MIS_FEATURE <222> (24)..(24) <223> Xaa na posição 24 é Ala ou Cys <22 0> <221> MIS_FEATURE <222> (27)..(27) <223> Xaa na posição 27 é Vai ou Ile <22 0> <221> MIS_FEATURE <222> (28)..(28) <223> Xaa na posição 28 é Lys ou Cys <22 0> <221> MIS_FEATURE <222> (29)..(29) <223> Xaa na posição 29 é Gly ou Cys <22 0> <221> MIS_FEATURE <222> (30)..(30) <223> Xaa na posição 30 é Arg ou Cys <22 0> <221> MIS_FEATURE <222> (31)..(31) <223> Xaa na posição 31 é Gly, His, Cys, não existe ou modificado é um resíduo <22 0> <221> MOD_RES <222> (31)..(31) <223> Amidação <400> 4 xaa xaa Glu Gly xaa xaa Thr ser Asp xaa ser xaa Tyr 15 10 teu Glu xaa 15 xaa xaa Xaa xaa Xaa Phe Ile xaa Trp teu xaa Xaa xaa 20 25 xaa xaa 30 <210> 5 48 ΡΕ1605897 <211> 44
<212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Construção sintética <22 0>
<221> ΜΙSC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa na posição 1 é L-histidina, D-histidina, desamino-histidina, 2-amino-histidina, beta-hidroxi-histidina, homo-histidina, alfa-fluorometil-histidina ou alfa metil-histidina <22 0>
<221> MIS_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa na posição 2 é Ala, Gly, Vai, Leu, Ile, Ser ou Thr <22 0> <221> MIS_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa na posição 5 é Thr ou Cys <22 0> <221> MIS_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Xaa na posição 6 é Phe, Trp, Tyr ou Cys <22 0> <221> MIS_FEATURE <222> (10)..(10) <223> Xaa na posição 10 é Vai, Trp, Ile, Leu, Phe, Tyr ou Cys <22 0> <221> MIS_FEATURE <222> (12) . . (12) <223> Xaa na posição 12 é Ser, Trp, Tyr, Phe, Lys, Ile, Leu ou Vai <22 0> <221> MIS_FEATURE <222> (13)..(13) <223> Xaa na posição 13 é Tyr, Trp ou Phe <22 0> <221> MIS_FEATURE <222> (14)..(14) <223> Xaa na posição 14 é leu, Phe, Tyr ou Trp <22 0> <221> MIS_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Xaa na posição 16 é Gly, Glu, Asp, Lys ou Cys <22 0> 49 ΡΕ1605897 <221> MIS FEATURE <222> (17) · (17) <223> Xaa na posição 17 é Gin ou Cys <22 0> <221> MIS FEATURE <222> (18) · (18) <223> Xaa na posição 18 é Ala ou Cys <22 0> <221> MIS FEATURE <222> (19) · (19) <223> Xaa na posição 19 é Ala, Vai, Ile, Leu ou <22 0> <221> MIS FEATURE <222> (20) "· · (20) <223> Xaa na posição 20 é Lys ou Cys <22 0> <221> MIS FEATURE <222> (21) · (21) <223> Xaa na posição 21 é Glu, Ile, Ala ou Cys <22 0> <221> MIS FEATURE <222> (24) · (24) <223> Xaa na posição 24 é Ala, Glu ou Cys <22 0> <221> MIS FEATURE <222> (27) · (27) <223> Xaa na posição 27 é Vai ou Ile <22 0> <221> MIS FEATURE <222> (28) · (28) <223> Xaa na posição 28 é Lys, Asp, Arg, Glu ou <22 0> <221> MIS FEATURE <222> (29) · (29) <223> Xaa na posição 29 é Gly ou Cys <22 0> <221> MIS FEATURE <222> (30) . (30) <223> Xaa na posição 30 é Gly, Pro, Arg ou Cys <22 0> <221> MIS FEATURE <222> (31) · (31) <223> Xaa na posição 31 é Gly, Pro, Ser ou Cys <22 0> ΡΕ1605897 50 <221> MIS_FEATURE <222> (32) . . (32) <223> Xaa na posição 32 é Ser, Pro, His ou Cys <22 0> <221> MIS_FEATURE <222> (33)..(33) <223> Xaa na posição 33 é Ser, Arg, Thr, Pro, Trp, Lys ou Cys <22 0> <221> MIS_FEATURE <222> (34) . . (34) <223> Xaa na posição 34 é Ser, Gly ou Cys <22 0> <221> MIS_FEATURE <222> (35)..(35) <223> Xaa na posição 35 é Ala, Asp, <22 0> <221> MIS_FEATURE <222> (36)..(36) <223> Xaa na posição 36 é Pro, Ala modificado <22 0> <221> MOD_RES <222> (36)..(36) <223> Amidação <22 0> <221> MIS_FEATURE <222> (37) . . (37) <223> Xaa na posição 37 é Pro, Ala modificado <22 0> <221> MOD_RES <222> (37) . . (37) <223> Amidação <22 0> <221> MIS_FEATURE <222> (38)..(38) <223> Xaa na posição 38 é Pro, Ala, é um resíduo modificado <22 0> <221> MOD_RES <222> (38)..(38) <223> Amidação <22 0> <221> MIS_FEATURE <222> (39)..(39)
Arg, Glu, Lys, Gly ou Cys ou Cys, não existe ou é um resíduo ou Cys, não existe ou é um resíduo
Arg, Lys, Hys, Cys, não existe ou ΡΕ1605897 51 <223> Xaa na posição 39 é Ser, His, Pro, Lys, Gly, Cys, não é um resíduo modificado <22 0> <221> M0D_RES <222> (39)..(39) <223> Amidação <220> <221> MIS_FEATURE <222> (40)..(40) <223> Xaa na posição 40 é Hys, Ser, Arg, Lys, Pro, Gly, existe ou é um resíduo modificado <22 0> <221> MOD_RES <222> (40)..(40) <223> Amidação <22 0> <221> MIS_FEATURE <222> (41)..(41) <223> Xaa na posição 41 é Hys, Ser, Arg, Lys, Gly, Cys, não é um resíduo modificado <22 0> <221> MOD_RES <222> (41)..(41) <223> Amidação <22 0> <221> MIS_FEATURE <222> (42)..(42) <223> Xaa na posição 42 é Gly, Hys, Cys, não existe ou é modificado <22 0> <221> MOD_RES <222> (42)..(42) <223> Amidação <22 0> <221> MIS_FEATURE <222> (43)..(43) <223> Xaa na posição 43 é Pro, Hys, Cys, não existe ou é modificado <22 0> <221> MOD_RES <222> (43)..(43) <223> Amidação <22 0> <221> MIS_FEATURE <222> (44)..(44) existe ou
Cys, não existe ou um resíduo um resíduo 52 ΡΕ1605897 <223> Xaa na posição 44 é Ser, Hys, Cys, não existe ou é um resíduo modificado <220> <221> MOD_RES <222> (44)..(44) <223> Amidação <400> 5 xaa xaa Glu Gly xaa xaa Thr ser Asp xaa ser xaa xaa xaa Glu xaa 1 5 10 15 xaa xaa xaa xaa xaa Phe xle xaa Trp Leu xaa xaa xaa xaa xaa xaa 20 25 30 xaa xaa Xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa Xaa xaa xaa 3S 40 <210> 6 <211> 41 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Construção sintética <22 0> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa na posição 1 é L-histidina, D-histidina, desamino-histidina, 2-amino-histidina, beta-hidroxi-histidina, homo-histidina, alfa-fluorometil-histidina ou alfa metil-histidina <220> <221> MIS FEATURE <222> (2) . (2) <223> Xaa na posição 2 e Ala, Gly, Vai, Leu, Ile, Ser ou Thr <220> <221> MIS FEATURE <222> (5) . '· (5) <223> Xaa na posição 5 é Thr ou Cys <220> <221> MIS FEATURE <222> (6) . (6) <223> Xaa na posição 6 é Phe, Trp, Tyr ou Cys <220> <221> MIS FEATURE <222> (10) . (10) <223> Xaa na posição 10 é Vai , Trp, Ile, Leu, Phe, Tyr ou Cys 53 ΡΕ1605897 <22 0> <221> MIS FEATURE <222> (12) · (12) <223> Xaa na posição 12 é Ser, Trp, Tyr, Phe, Lys, Ile, <22 0> <221> MIS FEATURE <222> (13) · (13) <223> Xaa na posição 13 é Tyr, Trp ou Phe <22 0> <221> MIS FEATURE <222> (14) · (14) <223> Xaa na posição 14 é Leu, Phe, Tyr ou Trp <22 0> <221> MIS FEATURE <222> (16) · (16) <223> Xaa na posição 16 é Gly, Glu, Asp, Lys ou Cys <22 0> <221> MIS FEATURE <222> (17) · (17) <223> Xaa na posição 17 é Gin ou Cys <22 0> <221> MIS FEATURE <222> (18) · (18) <223> Xaa na posição 18 é Ala ou Cys <22 0> <221> MIS FEATURE <222> (19) · (19) <223> Xaa na posição 19 é Ala, Vai, Ile, Leu ou Cys <22 0> <221> MIS FEATURE <222> (20) · (20) <223> Xaa na posição 20 é Lys ou Cys <22 0> <221> MIS FEATURE <222> (21) "· · (21) <223> Xaa na posição 21 é Glu, Ile, Ala ou Cys <22 0> <221> MIS FEATURE <222> (24) · (24) <223> Xaa na posição 24 é Ala, Glu ou Cys <22 0> <221> MIS FEATURE <222> (27) · (27) <223> Xaa na posição 27 é Vai ou Ile 54 28 é Lys, Asp, Arg, Glu ou Cys ΡΕ1605897 <22 0> <221> MIS_FEATURE <222> (28)..(28) <223> Xaa na posição <22 0> <221> MIS_FEATURE <222> (29)..(29) é Gly ou Cys <223> Xaa na posição 29 <22 0> <221> MIS_FEATURE <222> (30)..(30) <223> Xaa na posição 30 é Gly, Pro, Arg ou Cys <22 0> <221> MIS_FEATURE <222> (31)..(31) <223> Xaa na posição 31 é Gly, Pro, Ser ou Cys <22 0> <221> MIS_FEATURE <222> (32) .. (32) <223> Xaa na posição 32 é Ser, Pro, His ou Cys <22 0> <221> MIS_FEATURE <222> (33)..(33) <223> Xaa na posição 33 é Ser, Arg, Thr, Pro, Trp, Lys ou Cys <22 0> <221> MIS_FEATURE <222> (34) . . (34) <223> Xaa na posição 34 é Ser, Gly ou Cys <22 0> <221> MIS_FEATURE <222> (35)..(35) <223> Xaa na posição 35 é Ala, Asp, Arg, Glu, Lys, Gly ou Cys <22 0> <221> MIS_FEATURE <222> (36)..(36) <223> Xaa na posição 36 é Pro, Ala, Cys, não existe ou é um resíduo modificado <22 0> <221> MOD_RES <222> (36)..(36) <223> Amidação <22 0> <221> MIS_FEATURE <222> (37) .. (37) ΡΕ1605897 55 <223> Xaa na posição 37 é Pro, Ala, Cys, não exi: modificado <22 0> <221> M0D_RES <222> (37) . . (37) <223> Amidação <22 0> <221> MIS_FEATURE <222> (38)..(38) <223> Xaa na posição 38 é Pro, Ala, Arg, Lys, Hys, é um resíduo modificado <22 0> <221> M0D_RES <222> (38)..(38) <223> Amidação <22 0> <221> MIS_FEATURE <222> (39)..(39) <223> Xaa na posição 39 é Ser, His, Pro, Lys, Arg, é um resíduo modificado <22 0> <221> M0D_RES <222> (39)..(39) <223> Amidação <22 0> <221> MIS_FEATURE <222> (40)..(40) <223> Xaa na posição 40 é Hys, Ser, Arg, Lys, Cys, resíduo modificado <22 0> <221> M0D_RES <222> (40)..(40) <223> Amidação <22 0> <221> MIS_FEATURE <222> (41)..(41) <223> Xaa na posição 41 é Hys, Ser, Arg, Lys, Cys, resíduo modificado <22 0> <221> MOD_RES <222> (41)..(41) <223> Amidação te ou é um resíduo
Cys, não existe ou
Cys, não existe ou não existe ou é um não existe ou é um <400> 6 56 ΡΕ1605897 xaa xaa Glu Gly xaa xaa Thr ser Asp Xaa Ser xaa xaa xaa Glu xaa 1 $ 10 15 xaa xaa xaa xaa xaa Phe ile xaa Trp Leu Xaa xaa Xaa Xaa Xaa xaa 20 25 30 xaa Xaa Xaa Xaa xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 35 40 <210> 7 <211> 41 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Construção sintética <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa na posição 1 é L-histidina, D-histidina, desamino-histidina 2-amino-histidina, beta-hidroxi-histidina, homo-histidina, alfa fluorometil-histidina ou alfa metil-histidina <22 0> <221> MIS FEATURE <222> (2) . (2) <223> Xaa na posição 2 é Gly, Vai, Leu, Ile, Ser ou Thr <22 0> <221> MIS FEATURE <222> (5) . (5) <223> Xaa na posição 5 é Thr ou Cys <22 0> <221> MIS FEATURE <222> (6) . (6) <223> Xaa na posição 6 é Phe ou Cys <22 0> <221> MIS FEATURE <222> (10) · (10) <223> Xaa na posição 10 é Vai, Trp, Ile, Leu, Phe, Tyr ou <220> <221> MIS FEATURE <222> (16) · (16) <223> Xaa na posição 16 é Gly, Glu, Asp, Lys ou Cys <220> <221> MIS FEATURE <222> (17) . (17) <223> Xaa na posição 17 é Gin ou Cys 57 ΡΕ1605897 <22 0> <221> MIS FEATURE <222> (18) · (18) <223> Xaa na posição 18 é Ala ou Cys <22 0> <221> MIS FEATURE <222> (19) · (19) <223> Xaa na posição 19 é Ala, Vai, Ile, Leu ou Cys <220> <221> MIS FEATURE <222> (20) · (20) <223> Xaa na posição 20 é Lys ou Cys <22 0> <221> MIS FEATURE <222> (21) · (21) <223> Xaa na posição 21 é Glu ou Cys <22 0> <221> MIS FEATURE <222> (24) . (24) <223> Xaa na posição 24 é Ala ou Cys <22 0> <221> MIS FEATURE <222> (27) . (27) <223> Xaa na posição 27 é Vai ou Ile <22 0> <221> MIS FEATURE <222> (28) . (28) <223> Xaa na posição 28 é Lys, Asp, Arg, Glu ou Cys <22 0> <221> MIS FEATURE <222> (29) . (29) <223> Xaa na posição 29 é Gly ou Cys <22 0> <221> MIS FEATURE <222> (30) . (30) <223> Xaa na posição 30 é Gly, Pro, Arg OU Cys <22 0> <221> MIS FEATURE <222> (31) . (31) <223> Xaa na posição 31 é Gly, Pro, Ser ou Cys <22 0> <221> MIS FEATURE <222> (32) . (32) <223> Xaa na posição 32 é Ser, Pro, His ou Cys 58 ΡΕ1605897 <22 0> <221> MIS_FEATURE <222> (33)..(33) <223> Xaa na posição 33 é Ser, Arg, Thr, Trp, Lys ou Cys <22 0> <221> MIS_FEATURE <222> (34) . . (34) <223> Xaa na posição 34 é Ser, Gly ou Cys <22 0> <221> MIS_FEATURE <222> (35)..(35) <223> Xaa na posição 35 é Ala, Asp, Arg, Glu, Lys, Gly ou Cys <22 0> <221> MIS_FEATURE <222> (36)..(36) <223> Xaa na posição 36 é Pro, Ala ou Cys <22 0> <221> MIS_FEATURE <222> (37) . . (37) <223> Xaa na posição 37 é Pro, Ala ou Cys <22 0> <221> MIS_FEATURE <222> (38)..(38) <223> Xaa na posição 38 é Pro, Ala, Arg, Lys, Hys, Cys, não existe ou é um resíduo modificado <22 0> <221> M0D_RES <222> (38)..(38) <223> Amidação <22 0> <221> MIS_FEATURE <222> (39)..(39) <223> Xaa na posição 39 é Ser, His, Pro, Lys, Arg, Cys, não existe ou é um resíduo modificado <22 0> <221> M0D_RES <222> (39)..(39) <223> Amidação <22 0> <221> MIS_FEATURE <222> (40)..(40) <223> Xaa na posição 40 é Hys, Ser, Arg, Lys, Cys, não existe ou é um resíduo modificado 59 ΡΕ1605897 <22 0> <221> MOD_RES <222> (40)..(40) <223> Amidação <22 0> <221> MIS_FEATURE <222> (41)..(41) <223> Xaa na posição 41 é Hys, Ser, Arg, Lys, Cys, não existe ou é um resíduo modificado <22 0> <221> MOD_RES <222> (41)..(41) <223> Amidação <400> 7 xaa xaa «31 u Gly xaa xaa Thr Ser Asp xaa ser Ser Tyr tys Glu xaa 15 10 15 xaa xaa xaa xaa xaa Phe ile xaa Trp teu xaa xaa xaa xaa xaa xaa 20 25 30 xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa 35 40 <210> 8 <211> 41 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Construção sintética <22 0> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa na posição 1 é L-histidina, D-histidina, desamino-histidina, 2-amino-histidina, beta-hidroxi-histidina, homo-histidina, alfa-fluorometil-histidina ou alfa metil-histidina <220> <221> MIS_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa na posição 2 é Gly, Vai, Leu, Ile, Ser ou Thr <220> <221> MIS_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa na posição 5 é Thr ou Cys <22 0> <221> MIS_FEATURE <222> (6)..(6) ΡΕ1605897 60 <223> Xaa na posição <22 0> <221> MIS FEATURE <222> (10) · (10) <223> Xaa na posição <22 0> <221> MIS FEATURE <222> (16) · (16) <223> Xaa na posição <22 0> <221> MIS FEATURE <222> (17) · (17) <223> Xaa na posição <22 0> <221> MIS FEATURE <222> (18) · (18) <223> Xaa na posição <22 0> <221> MIS FEATURE <222> (19) · (19) <223> Xaa na posição <22 0> <221> MIS FEATURE <222> (20) · (20) <223> Xaa na posição <22 0> <221> MIS FEATURE <222> (21) · (21) <223> Xaa na posição <22 0> <221> MIS FEATURE <222> (24) · (24) <223> Xaa na posição <22 0> <221> MIS FEATURE <222> (27) · (27) <223> Xaa na posição <22 0> <221> MIS FEATURE <222> (28) · (28) <223> Xaa na posição <22 0> <221> MIS FEATURE <222> (29) · (29) é Gly, Glu, Asp, Lys ou Cys é Ala, Vai, Ile, Leu ou Cys
Phe ou Cys é Vai ou Cys é Gin ou Cys é Ala ou Cys é Lys ou Cys é Glu ou Cys é Ala ou Cys é Vai ou Ile é Lys ou Cys 61 ΡΕ1605897 <223> Xaa na posição 29 é Gly ou Cys <22 0> <221> MIS FEATURE <222> (30) . (30) <223> Xaa na posição 30 é Gly ou Cys <22 0> <221> MIS FEATURE <222> (31) . (31) <223> Xaa na posição 31 é Pro ou Cys <22 0> <221> MIS FEATURE <222> (32) · (32) <223> Xaa na posição 32 é Ser, Pro, His ou Cys <22 0> <221> MIS FEATURE <222> (33) . (33) <223> Xaa na posição 33 é Ser, Arg, Thr, Trp, Lys ou Cys <22 0> <221> MIS FEATURE <222> (34) · (34) <223> Xaa na posição 34 é Ser, Gly ou Cys <22 0> <221> MIS FEATURE <222> (35) . (35) <223> Xaa na posição 35 é Ala, Asp, Arg, Glu, Lys, Gly ou <22 0> <221> MIS FEATURE <222> (36) . (36) <223> Xaa na posição 36 é Pro, Ala ou Cys <22 0> <221> MIS FEATURE <222> (37) · (37) <223> Xaa na posição 37 é Pro, Ala ou Cys <22 0> <221> MIS_FEATURE <222> (38)..(38) <223> Xaa na posição 38 é Pro, Ala, Arg, Lys, Hys, Cys, não existe ou é um resíduo modificado <22 0> <221> M0D_RES <222> (38)..(38) <223> Amidação <22 0> 62 ΡΕ1605897 <221> ΜΙS_FEATURE <222> (39)..(39) <223> Xaa na posição 39 é Ser, His, Pro, Lys, Arg, Cys, não existe ou é um resíduo modificado <22 0> <221> M0D_RES <222> (39)..(39) <223> Amidação <22 0> <221> MIS_FEATURE <222> (40)..(40) <223> Xaa na posição 40 é Hys, Ser, Arg, Lys, Cys, não existe ou é um resíduo modificado <22 0> <221> MOD_RES <222> (40)..(40) <223> Amidação <22 0> <221> MIS_FEATURE <222> (41)..(41) <223> Xaa na posição 41 é Hys, Ser, Arg, Lys, Cys, não existe ou é resíduo modificado <22 0> <221> MOD_RES <222> (41)..(41) <223> Amidação <400> 8 xaa xaa <s1u Gly xaa xaa Thr Ser Asp xaa ser ser Tyr tys clu 15 10 xaa xaa xaa xaa xaa Phe líe xaa Trp teu xaa xaa xaa xaa v 20 25 Bo Aaa x»a xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa 35 40 <210> 9 <211> 44 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Construção sintética <22 0> <221> MIS_FEATURE <222> (5)..(5) 63 ΡΕ1605897 <223> Xaa na posição 5 0 Thr i OU 1 Gys <22 0> <221> MIS FEATURE <222> (6) . (6) <223> Xaa na posição 6 0 Phe i OU 1 Gys <22 0> <221> MIS FEATURE <222> (10) . (10) <223> Xaa na posição 10 é Vai ou Cys <22 0> <221> MIS FEATURE <222> (16) · (16) <223> Xaa na posição 16 é Gly ou Cys <22 0> <221> MIS FEATURE <222> (17) · (17) <223> Xaa na posição 17 é Gin ou Cys <22 0> <221> MIS FEATURE <222> (18) · (18) <223> Xaa na posição 18 é Ala ou Cys <22 0> <221> MIS FEATURE <222> (19) · (19) <223> Xaa na posição 19 é Ala ou Cys <22 0> <221> MIS FEATURE <222> (20) · (20) <223> Xaa na posição 20 é Lys ou Cys <22 0> <221> MIS FEATURE <222> (21) · (21) <223> Xaa na posição 21 é Glu ou Cys <22 0> <221> MIS FEATURE <222> (24) · (24) <223> Xaa na posição 24 é Ala ou Cys <22 0> <221> MIS FEATURE <222> (28) · (28) <223> Xaa na posição 28 é Lys ou Cys <22 0> <221> MIS FEATURE <222> (29) · (29) 64 ΡΕ1605897 <223> Xaa na posição 29 é Gly ou Cys <22 0> <221> MIS_FEATURE <222> (30)..(30) <223> Xaa na posição 30 é Gly ou Cys <22 0> <221> MIS_FEATURE <222> (31)..(31) <223> Xaa na posição 31 é Pro ou Cys <22 0> <221> MIS_FEATURE <222> (32) .. (32) <223> Xaa na posição 32 é Ser, Pro, His ou Cys <22 0> <221> MIS_FEATURE <222> (33)..(33) <223> Xaa na posição 33 é Ser, Arg, Thr, Trp, Lys ou Cys <22 0> <221> MIS_FEATURE <222> (34) . . (34) <223> Xaa na posição 34 é Ser, Gly ou Cys <22 0> <221> MIS_FEATURE <222> (35)..(35) <223> Xaa na posição 35 é Ala, Asp, Arg, Glu, Lys, Gly ou Cys <22 0> <221> MIS_FEATURE <222> (36)..(36) <223> Xaa na posição 36 é Pro, Ala, Cys, está ausente ou é um resíduo modificado <22 0> <221> MOD_RES <222> (36)..(36) <223> Amidação <22 0> <221> MIS_FEATURE <222> (37) . . (37) <223> Xaa na posição 37 é Pro, Ala, Cys, está ausente ou é um resíduo modificado <22 0> <221> MOD_RES <222> (37) . . (37) <223> Amidação <22 0> 65 ΡΕ1605897 <221> MIS_FEATURE <222> (38)..(38) <223> Xaa na posição 38 é Pro, Ala, Arg, Lys, Hys, Cys, não existe ou é um resíduo modificado <22 0> <221> M0D_RES <222> (38)..(38) <223> Amidação <22 0> <221> MIS_FEATURE <222> (39)..(39) <223> Xaa na posição 39 é Ser, His, Pro, Lys, Arg, Gly, Cys, não existe ou é um resíduo modificado <22 0> <221> M0D_RES <222> (39)..(39) <223> Amidação <22 0> <221> MIS_FEATURE <222> (40)..(40) <223> Xaa na posição 40 é Hys, Ser, Arg, Lys,Pro, Gly, Cys, não existe ou é um resíduo modificado <22 0> <221> M0D_RES <222> (40)..(40) <223> Amidação <220> <221> MIS_FEATURE <222> (41)..(41) <223> Xaa na posição 41 é Hys, Ser, Arg, Lys, Cys, não existe ou é um resíduo modificado <220> <221> MOD_RES <222> (41)..(41) <223> Amidação <220> <221> MIS_FEATURE <222> (42)..(42) <223> Xaa na posição 42 é Gly, Hys, Cys, não existe ou é um resíduo modificado <220> <221> MOD_RES <222> (42)..(42) <223> Amidação <220> 66 ΡΕ1605897 <221> MIS_FEATURE <222> (43)..(43) <223> Xaa na posição 43 é Pro, Hys, Cys, não existe ou é um resíduo modificado <22 0> <221> MOD_RES <222> (43)..(43) <223> Amidação <220> <221> MIS_FEATURE <222> (44)..(44) <223> Xaa na posição 44 é Ser, Hys, Cys, não existe ou é um resíduo modificado <220> <221> M0D_RES <222> (44)..(44) <223> Amidação <400> 9
Nis Ala Glu Gly Thr phe Thr ser Asp vai Ser ser Tyr Leu Glu Gly 1 S 10 15
Gin Ala Ala Lys Glu Phe ile Ala Trp Leu vai Lys Gly Gly Pro xaa 20 25 30 xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa 35 40 <210> 10 <211> 41 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Construção sintética <22 0> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa na posição 1 é L-histidina, D-histidina, desamino-histidina, 2-amino-histidina, beta-hidroxi-histidina, homo-histidina, alfa-fluorometil-histidina ou alfa metil-histidina <220> <221> MIS_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa na posição 2 é Gly, Ser, Ala ou Thr <220>
<221> MIS FEATURE 67 ΡΕ1605897 <222> (3)..(3) <223> Xaa na posição 3 é Glu, Ala ou Asp <22 0> <221> MIS FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa na posição 4 é Gly, Ala ou Vai <22 0> <221> MIS_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa na posição 5 é Thr, Cys ou Ala <22 0> <221> MIS FEATURE <222> (6)..(6) <223> Xaa na posição 6 é Phe, Cys, Ala ou Tyr <22 0> <221> MIS FEATURE <222> (7)..(7) <223> Xaa na posição 7 é Thr ou Ser <22 0> <221> MIS FEATURE <222> (8)..(8) <223> Xaa na posição 8 é Ser, Ala ou Thr <22 0> <221> MIS FEATURE <222> (9)..(9) <223> Xaa na posição 9 é Asp ou Glu <22 0> <221> MIS FEATURE <222> (10)..(10) <223> Xaa na posição 10 é Leu, Cys, Ala, Ile, Vai ou Met <22 0> <221> MIS FEATURE <222> (11)..(11) <223> Xaa na posição 11 é Ser ou Ala <22 0> <221> MIS FEATURE <222> (12) . . (12) <223> Xaa na posição 12 é Lys ou Ala <22 0> <221> MIS FEATURE <222> (13)..(13) <223> Xaa na posição <22 0> <221> MIS FEATURE 13 é Gin ou Ala 68 ΡΕ1605897 <222> (14) .·(14) <223> Xaa na posição 14 é Met, Ala, Leu, Ile ou Vai <22 0> <221> MIS FEATURE <222> (15) · (15) <223> Xaa na posição 15 é Glu ou Ala <22 0> <221> MIS FEATURE <222> (16) · (16) <223> Xaa na posição 16 é Glu, Cys ou Ala <22 0> <221> MIS FEATURE <222> (17) · (17) <223> Xaa na posição 17 é Glu, Cys ou Ala <22 0> <221> MIS FEATURE <222> (18) · (18) <223> Xaa na posição 18 é Ala ou Cys <22 0> <221> MIS FEATURE <222> (19) · (19) <223> Xaa na posição 19 é Vai, Cys ou Ala <22 0> <221> MIS FEATURE <222> (20) · (20) <223> Xaa na posição 20 é Arg, Cys ou Ala <22 0> <221> MIS FEATURE <222> (21) . (21) <223> Xaa na posição 21 é Leu, Cys ou Ala <22 0> <221> MIS FEATURE <222> (22) · (22) <223> Xaa na posição 22 é Phe, Ala ou Tyr <22 0> <221> MIS FEATURE <222> (23) · (23) <223> Xaa na posição 23 é Ile, Vai, Leu, Gly ou Met <22 0> <221> MIS FEATURE <222> (24) · (24) <223> Xaa na posição 24 é Glu, Cys, Ala ou Asp <22 0> <221> MIS FEATURE <222> (25) · (25) ΡΕ1605897 69 <223> Xaa na posição 25 é Trp, Ala, Phe ou Tyr <22 0> <221> MIS FEATURE <222> (26) . . (26) <223> Xaa na posição 26 é Leu ou Ala <22 0> <221> MIS FEATURE <222> (27) . . (27) <223> Xaa na posição 27 é Lys ou Ala <22 0> <221> MIS FEATURE <222> (28)..(28) <223> Xaa na posição 28 é Asn, Cys ou Ala <22 0> <221> MIS FEATURE <222> (29)..(29) <223> Xaa na posição 29 é Gly ou Cys <22 0> <221> MIS FEATURE <222> (30)..(30) <223> Xaa na posição 30 é Gly ou Cys <22 0> <221> MIS FEATURE <222> (31)..(31) <223> Xaa na posição 31 é Pro ou Cys <22 0> <221> MIS FEATURE <222> (32)..(32) <223> Xaa na posição 32 é Ser, Cys, não existe modificado <22 0> <221> MOD RES <222> (32)..(32) <223> Amidação <22 0> <221> MIS FEATURE <222> (33)..(33) <223> Xaa na posição 33 é Ser, Cys, não existe modificado <22 0> <221> MOD RES <222> (33)..(33) <223> Amidação ou é um ou e um <22 0> resíduo resíduo 70 ΡΕ1605897 <221> MIS_FEATURE <222> (34) . . (34) resíduo <223> Xaa na posição 34 é Gly, Cys, não existe ou é um modificado <22 0> <221> MOD_RES <222> (34) .. (34) <223> Amidação <22 0> <221> MIS_FEATURE <222> (35)..(35) resíduo <223> Xaa na posição 35 é Ala, Cys, não existe ou é um modificado <22 0> <221> MOD_RES <222> (35)..(35) <223> Amidação <22 0> <221> MIS_FEATURE <222> (36)..(36) resíduo <223> Xaa na posição 36 é Pro, Cys, não existe ou é um modificado <22 0> <221> MOD_RES <222> (36)..(36) <223> Amidação <22 0> <221> MIS_FEATURE <222> (37) .. (37) resíduo <223> Xaa na posição 37 é Pro, Cys, não existe ou é um modificado <22 0> <221> M0D_RES <222> (37) . . (37) <223> Amidação <22 0> <221> MIS_FEATURE <222> (38)..(38) resíduo <223> Xaa na posição 38 é Pro, Cys, não existe ou é um modificado <22 0> <221> MOD_RES <222> (38)..(38) <223> Amidação 71 ΡΕ1605897 <22 0> <221> MIS_FEATURE <222> (39)..(39) <223> Xaa na posição 39 é Ser, Cys, não existe ou é um resíduo modificado <22 0> <221> M0D_RES <222> (39)..(39) <223> Amidação <400> 10
Xaa xaa xaa xaa xaa xaa Xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa I 5 10 15
Xaa Xaa xaa xaa xaa xaa xaa Xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa xaa 20 25 30 xaa Xaa Xaa xaa Xaa Xaa xaa 35
Lisboa, 4 de Setembro de 2012

Claims (6)

  1. ΡΕ1605897 1 REIVINDICAÇÕES 1. Um composto de GLP-1 PEGuilado compreendendo a sequência de aminoácidos da Fórmula IV (SEQ ID NO:6) Xaa7“Xaa$~Giu-Gly-Xaaii-Xaai2“Thr-Ser“Asp“Xaai6“Ser“Xaai8-XââiQ-Xaa20-C>Iu- Xaa22-Xãa23-Xaa24-Xaa25-Xaa26“Xaa27-Phe-Ile-Xaa30-Trp“Leu-Xaa33~Xaa34-Xaa3S“ X&&36~X&&3 7-Xaa3 8“ Xa&3 9 “Xaa40"Xâã4 j-Xaa42~Xaa43 ~Xa.a44~ Xaa4S"Xaã4g~Xaa47 Fórmula IV (SEQ ID NO:6) em que: Xaa7 é: L-histidina, D-histidina, desamino-histidina, 2-amino-histidina, β-hidroxi-histidina, homo-histidina, a-fluorometil-histidina ou a-metil-histidina; Xaa8 é: Vai; Xaan é: Thr ; Xaai2 é: Phe, Trp ou Tyr; Xaai6 é: Vai, Trp, Ile, Leu, Phe, Tyr, ou Cys; Xaais é: Ser, Trp, Tyr, Phe, Lys, Ile, Leu, Vai; Xaaig é: Tyr, Trp ou Phe; Xaa2o é: Leu, Phe, Tyr ou Trp; Xaa22 é: Gly, Glu, Asp ou Lys; Xaa23 é: Gin; Xaa24 é: Ala; Xaa25 é: AI a, Vai, Ile ou Leu; Xaa26 é: Lys; 2 ΡΕ1605897 Xaa27 é: Glu, Ile ou Ala; Xaa3o é: AI a ou Glu; Xaa33 é: Vai ou Ile; Xaa34 é: Lys, Asp, Arg ou Glu; Xaa35 é: Gly; Xaa36 é: Gly, Pro ou Arg; Xaa37 é: Gly, Pro ou Ser; Xaa38 é: Ser, Pro, His ou Cys; Xaa39 é: Ser, Arg, Thr, Trp ou Lys; Xaa4o é: Ser ou Gly; Xaa4i é: Ala, Asp, Arg, Glu, Lys ou Gly; Xââ42 é: Pro, Ala, nh2 ou está ausente; Xaa43 é: Pro, Ala, nh2 ou está ausente; Xaa44 é: Pro, Ala, Arg, Lys, His, NH2 ou está ausente; Xaa45 é: Ser, His, Pro, Lys, Arg, Cys, NH2 ou está ausente; Xaa4 6 é: His, Ser, Arg, Lys, Cys, NH2 ou está ausente; Xaa47 é: His, Ser, Arg, Lys, NH2 ou está ausente; e em que: 2 ou 1 dos resíduos de Cys estão ligados covalentemente a uma molécula de PEG; e desde que se Xaa42 , Xaa43, Xaa44, Xaa45 ou Xaa46 estiver ausente, cada um dos aminoácidos a jusante está ausente; e desde que existam 2 ou 1 Cys na molécula.
  2. 2. Um composto de GLP-1 PEGuilado de acordo com a reivindicação 1, desde que o composto de GLP-1 PEGuilado não difira de GLP-1(7-37)OH em mais de 3 aminoácidos dentro dos aminoácidos 7 a 37. 3 ΡΕ1605897
  3. 3. Um composto de GLP-1 PEGuilado de acordo com a reivindicação 1 ou reivindicação 2 para usar como medicamento.
  4. 4. Um composto de GLP-1 PEGuilado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3 para usar no tratamento de diabetes não dependentes de insulina, obesidade, choque, enfarte do miocárdio, sindrome do intestino irritável ou dispepsia funcional.
  5. 5. Um composto de GLP-1 PEGuilado para usar de acordo com a reivindicação 3 ou reivindicação 4, em que o medicamento é usado para tratar diabetes não dependentes de insulina.
  6. 6. Um composto de GLP-1 PEGuilado para usar de acordo com a reivindicação 5, em que o medicamento é usado para tratar obesidade. Lisboa, 4 de Setembro de 2012 1 ΡΕ1605897 REFERÊNCIAS CITADAS NA DESCRIÇÃO Esta lista de referências citadas pelo requerente é apenas para conveniência do leitor. A mesma não faz parte do documento da patente Europeia. Ainda que tenha sido tomado o devido cuidado ao compilar as referências, podem não estar excluídos erros ou omissões e o IEP declina quaisquer responsabilidades a esse respeito. Documentos de patentes citadas na Descrição m5705483 A » US 6436-398 Â DK 3706340 vV « US 8448309 A m> SS08871 A. * US 6437¾¾ A vVO 126-398 A * US 8435659 Â WO 147038 A * US SS1S-198 A US34847402 P * us m*m a US 69405097 P * US S288343 B US -3399801 W * EP 613322 A, Gsfsfsd WG 03958293 A ♦ US S12S712A OS 31457301 P * WO §52853® A, Lssfss-bay US. 0221328 -W * m> 0046797 A, EfesKKc M) 03018516 A K WQ 9808531 A US 0911:814 W * WO 3819898 A, EfcsKfic WO 0086629 A s US 6606753 A, Efsnsfc US 5445930 A * WO 3S64ÔS0 A, Eíendio US £989461 A * wooso?ei?A US 5933482 À ♦ WO 69466081 A Literatura que não é de patentes citada na Descrição * GOKE et «t, J. SM Cfcero., 1333, «*. 288, 136SS-18855 « ZLOXARNIK M sL Sd&KS, 1998, 279, 84-88 * RGSEKTS, 8S, st ai. Admxseé Dwgt Deíwefy Re-vkms, 2002. voí. 54, 459-476 * FRAÍSOS, G.E. st st PEGy&Bet* of cytsfeirses má QÈm ítefspsaSc proíssf® sod pepftdes: ífis srspsr-tasse of Pfetogjcs? ep&mzsioa of eaaplirig tec&-rssqifes. ínát. JL Hem. f 1336, voi. 68,1-18 * ZÁlffSXY, S. 8&scem®aÍe Chsm,, W, 6, 15S-16S « KOJSOV, 8. M d Pepttée FMem Rssesmh, 1S32, «*. 40, 338 « JQSEPM «t aL D&beÈoktgto. 2-380, vot 43, 1319-132® * DtLLON et ai Ctanfog and FuacBmsi Espíesssaí of 8se Hsístisíi G&scsgsrs-iís Pep9Se-1 i.GLP-t} Recep-tor. Entíscm-ctmt 1993. vol 133,1307-1910 * GREEH; WUTSv PfPtscSpg Qmm 'm ©pgswfc Syo-Ihests, Jefea WSeg Som, 1991 « ZLÕKÂRSIÍK et aS, Sc«aís, 1338, vd. 278, 84-88
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