ES2949553T3

ES2949553T3 - Composición para el tratamiento de la diabetes, que contiene conjugado de análogo de insulina de acción prolongada y conjugado de péptido de secreción de insulina de acción prolongada

Info

Publication number: ES2949553T3
Application number: ES15799334T
Authority: ES
Inventors: Jung Kuk Kim; Dae Jin Kim; Yong Ho Heo; In Young Choi; Sung Youb Jung; Se Chang Kwon
Original assignee: Hanmi Pharmaceutical Co Ltd; Hanmi Pharmaceutical Industries Co Ltd
Current assignee: Hanmi Pharmaceutical Co Ltd; Hanmi Pharmaceutical Industries Co Ltd
Priority date: 2014-05-29
Filing date: 2015-05-29
Publication date: 2023-09-29
Anticipated expiration: 2035-05-29
Also published as: AU2015268183B2; IL249246A0; SG11201609564TA; JP2020143155A; TN2016000500A1; MY181539A; NZ726959A; BR112016027469A2; JP7014515B2; TW201607553A; TW202235101A; AR100639A1; WO2015183038A1; PH12016502391A1; CL2016003075A1; TWI784914B; CA2950266A1; EP3156066A1; DK3156066T3; UA125847C2

Abstract

La presente invención se refiere a una composición para prevenir o tratar la diabetes, que contiene análogos de insulina de acción prolongada y conjugados de péptidos de secreción de insulina de acción prolongada, y a un método para tratar la diabetes. Más específicamente, la composición puede mejorar notablemente el cumplimiento al inhibir el aumento de peso causado por la administración de insulina, inhibir los fenómenos de emesis y náuseas causados por la administración de un péptido de secreción de insulina y reducir la dosis de insulina mediante la administración concomitante del análogo de acción prolongada. conjugado y el conjugado de péptido de secreción de insulina de acción prolongada. Además, la presente invención se refiere a: una composición farmacéutica para aliviar los efectos secundarios de las células beta pancreáticas en un paciente con diabetes, que contiene un conjugado de análogo de insulina de acción prolongada y un conjugado de péptido de secreción de insulina de acción prolongada; y un método para aliviar los efectos secundarios de las células beta pancreáticas en un paciente con diabetes, que comprende una etapa de administrar la composición, en donde los efectos secundarios, particularmente aquellos tales como disfunción de las células beta pancreáticas, reducción de las células beta pancreáticas, lipotoxicidad y glucotoxicidad, que son causados por la progresión de la diabetes, se alivian. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Composición para el tratamiento de la diabetes, que contiene conjugado de análogo de insulina de acción prolongada y conjugado de péptido de secreción de insulina de acción prolongada

[Campo técnico]

La presente descripción se refiere a una composición para la prevención o tratamiento de la diabetes que incluye un conjugado de insulina de acción prolongada y un conjugado de péptido insulinotrópico de acción prolongada, y un método para tratar la diabetes que incluye la etapa de administrar la composición.

Además, la presente descripción se refiere a una composición farmacéutica para reducir los efectos secundarios de las células beta pancreáticas en pacientes diabéticos, que incluye un conjugado de análogo de insulina de acción prolongada y un conjugado de péptido insulinotrópico de acción prolongada, y a un método para reducir los efectos secundarios de las células beta pancreáticas en pacientes diabéticos, que incluye la etapa de administrar la composición. Específicamente, la presente descripción se refiere a la reducción de efectos secundarios tales como la anormalidad en la función de las células beta pancreáticas asociada al desarrollo de la diabetes, a una reducción en las células beta pancreáticas y a una lipotoxicidad o glucotoxicidad.

[Técnica anterior]

La insulina es un péptido secretado por las células beta del páncreas, y desempeña un papel importante en el control del nivel de glucosa en sangre en el organismo. Una enfermedad metabólica asociada a un nivel elevado de glucosa en sangre debido a la falta de secreción de insulina o una anormalidad en la función de la insulina se denomina diabetes. Cuando el nivel elevado de glucosa en sangre se debe al fallo en la secreción de insulina por el páncreas se denomina diabetes de tipo 1, mientras que el nivel elevado de glucosa en sangre debido a la anormalidad en la secreción de insulina o a una función anormal de la insulina secretada en el organismo se denomina diabetes de tipo 2. Los pacientes con diabetes de tipo 2 se tratan habitualmente con un agente hipoglucémico oral que tiene una sustancia química como ingrediente principal, y en algunos casos, administrado con insulina, mientras que los pacientes con diabetes de tipo 1 requieren esencialmente tratamiento con insulina.

La terapia con insulina más común actualmente disponible es una inyección de insulina antes y/o después de las comidas. Actualmente, la insulina inyectable está disponible comercialmente y, en principio, se administra en una inyección subcutánea. El método de administración varía dependiendo de su curso de acción en el tiempo. La inyección de insulina muestra un efecto hipoglucémico más rápido que la administración oral, y puede utilizarse con seguridad cuando la administración oral no es posible. Además, no hay límite de dosis para el uso de insulina. Sin embargo, el uso a largo plazo de insulina tres veces al día puede dar lugar a desventajas tales como aversión a las agujas, dificultad en el manejo del dispositivo de inyección, hipoglucemia y aumento de peso debido al uso a largo plazo de insulina. El aumento de peso puede aumentar el riesgo de enfermedad cardiovascular y de un efecto secundario de resistencia a la insulina. Mientras tanto, se han hecho muchos esfuerzos para maximizar la eficacia manteniendo los niveles elevados a largo plazo de fármacos peptídicos de insulina después de la absorción por el organismo. Por ejemplo, se han desarrollado formulaciones de insulina de acción prolongada tales como Lantus (Insulina glargina; Sanofi Aventis) y Levemir (Insulin detemir; Novo Nordisk) y están disponibles comercialmente. A diferencia de la insulina NPH (Neutral Protamine Hagedorn), estos fármacos de acción prolongada reducen el riesgo de hipoglucemia durante el sueño y, en particular, Levemir se asoció a un aumento de peso algo menor. Sin embargo, estas formulaciones de fármacos también son desventajosas en que deben administrarse una o dos veces al día. Mientras tanto, un péptido insulinotrópico, el péptido similar al glucagón tipo 1 (GLP-1), es una hormona incretina secretada por las células L del íleon y el colon. El péptido similar al glucagón tipo 1 funciona para aumentar la liberación de insulina e induce la secreción dependiente de glucosa para prevenir episodios hipoglucémicos. Debido a esta propiedad, recibió atención como un tratamiento potencial para la diabetes tipo 2. Sin embargo, el principal obstáculo para el uso de GLP-1 como agente terapéutico es su semivida extremadamente corta inferior a 2 minutos en sangre. Actualmente, la exendina-4 está disponible comercialmente como un agonista del receptor del péptido similar al glucagón tipo 1, y es un análogo del péptido similar al glucagón tipo 1 purificado de la glándula salival de un monstruo de Gila. La exendina-4 tiene resistencia a la DPP IV (dipeptidil peptidasa-4), y una mayor actividad fisiológica que el péptido similar al glucagón tipo 1. Como resultado de ello, tenía una semivida in vivo de 2 a 4 horas, que es más larga que la del péptido similar al glucagón tipo 1 (US-5.424.286). Sin embargo, con el método para aumentar la resistencia a solo DPP IV, no puede esperarse que mantenga una actividad fisiológica suficiente, y por ejemplo, en el caso de la exendina-4 comercial (exenatida), sigue existiendo el problema de que debe administrarse a un paciente dos veces al día, y la administración provoca acontecimientos adversos tales como vómitos y náuseas que son una carga significativa para el paciente.

Estas enfermedades relacionadas con la diabetes, aunque hay una diferencia en el tiempo, generalmente inducen una reducción en la masa de células beta pancreáticas debido a una pérdida de función y apoptosis de células beta pancreáticas.

Cuando los niveles de glucosa en sangre aumentan continuamente, las células beta pancreáticas aumentan la secreción de insulina basándose en la potenciación de la función de las mismas y en un aumento en la masa de células beta para mantener los niveles de glucosa en sangre in vivo, pero dicha acción de aumento de la secreción es limitada. Es decir, si la cantidad de insulina requerida para mantener los niveles de glucosa en sangre in vivo normalmente es mayor que la de la insulina que pueden producir las células beta pancreáticas, los niveles de glucosa en sangre aumentan en última instancia y, por lo tanto, la progresión de la diabetes tipo 2 se vuelve grave. Desde el punto de vista clínico, la diabetes tipo 2 progresa en el orden de: una resistencia a la insulina, una disminución en la secreción de insulina y una anormalidad en la función de las células beta pancreáticas y una reducción en la masa de células beta pancreáticas. En particular, la anormalidad en la función de las células beta y la reducción en la masa de células beta pancreáticas se ve facilitada por el aumento de los lípidos y de la glucosa en sangre. La concentración de tales lípidos y de la glucosa en sangre inducirá lipotoxicidad y/o glucotoxicidad y por tanto debilitará tanto la función de las células beta como las acciones de la insulina, y en última instancia empeorará el pronóstico de la diabetes tipo 2. En consecuencia, la inhibición de la lipotoxicidad y la glucotoxicidad puede mitigar significativamente la progresión de la diabetes tipo 2 a través de la retención de la función y la masa de las células beta, así como a través de la mejora de la resistencia a la insulina.

La insulina es un péptido secretado por las células beta del páncreas, y desempeña un papel en el control de los niveles de glucosa en sangre en el organismo. En consecuencia, una anormalidad en la función de la insulina y una reducción en la masa de células beta están estrechamente asociadas con un aumento en los niveles de glucosa en sangre debido a una reducción en la cantidad de insulina en el organismo. Por lo tanto, los pacientes diabéticos con disminución de la secreción de insulina pueden recibir tratamiento utilizando una insulina extrínseca. Según estudios previos, se sabe que la administración de la insulina extrínseca no solo muestra excelentes efectos en la mejora de los niveles de glucosa en sangre, sino que también inhibe la aparición de estrés debido a la excesiva secreción de insulina de las células beta pancreáticas.

Sin embargo, la administración de la insulina extrínseca tiene un inconveniente importante de inducir un aumento de peso, y dicho aumento de peso implica un aumento en los niveles de lípidos en sangre. Por lo tanto, es probable que empeore la progénesis de la diabetes.

Se sabe que el agonista del receptor del péptido similar al glucagón tipo 1 (GLP-1), un tipo de péptido insulinotrópico que incluye la exendina-4, tiene los efectos de controlar los niveles de glucosa en sangre y reducir el peso corporal en pacientes con diabetes tipo 2. Además, el agonista del receptor de GLP-1 puede aumentar la masa de células beta controlando la neogénesis, proliferación y diferenciación de las células beta así como la apoptosis de las células beta. De hecho, en un modelo de roedor inducido por diabetes de tipo 2, se confirmó que la administración de GLP-1 o exendina-4 estimula el crecimiento y la diferenciación de las células beta, aumentando por tanto la masa de células beta. Sin embargo, el agonista del receptor de GLP-1 estimula continuamente la secreción de insulina en las células beta pancreáticas y, por lo tanto, implica la posibilidad de un mal funcionamiento degradado debido a un aumento en el estrés de las células beta.

Para resolver los problemas anteriores, los presentes inventores sugirieron una proteína conjugada de acción prolongada en la que un polipéptido fisiológicamente activo está unido a una región Fc de inmunoglobulina a través de un polímero no peptidílico como enlazador mediante un enlace covalente, manteniendo de este modo la actividad y mejorando la estabilidad del fármaco proteínico al mismo tiempo (patente coreana n.° 10-0725315). En particular, encontraron que cada uno del conjugado de insulina de acción prolongada y el conjugado de exendina-4 de acción prolongada ejerce una eficacia in vivo notablemente mayor (patentes coreanas n.° 10-1058209 y 10-1330868). Sin embargo, todavía existen los problemas de aumento de peso, o vómitos y náuseas, cuando se inyecta insulina o exendina-4 en una cantidad que mantenga un nivel de glucosa en sangre estable. Por lo tanto, existe una necesidad urgente de desarrollar un método terapéutico que muestre excelentes efectos terapéuticos sobre la diabetes con dosis más bajas y un uso menos frecuente del fármaco. Además, tales estudios se centraron en aumentar la semivida in vivo del polipéptido fisiológicamente activo, y los estudios sobre un método capaz de revertir una pérdida de función de las células beta pancreáticas y/o una reducción en la masa de células beta pancreáticas debido a una apoptosis de las células beta pancreáticas, que es un efecto secundario que da lugar a un mal pronóstico de diabetes en pacientes, son incompletos.

[Descripción]

[Problema técnico]

Los presentes inventores han realizado muchos estudios y experimentos para desarrollar un agente terapéutico para la diabetes que tenga una eficacia terapéutica duradera y reduzca los acontecimientos adversos tales como vómitos y náuseas al mismo tiempo, y un agente terapéutico para la diabetes que pueda mantener y aumentar una función de las células beta pancreáticas y la masa celular, y proporcionar seguridad contra el posible estrés de las células beta. Intentaron llevar a cabo la administración combinada de un conjugado de exendina-4 de acción prolongada y un conjugado de análogo de insulina de acción prolongada que estimulan un receptor de péptido similar al glucagón tipo 1 y un receptor de insulina al mismo tiempo. Como resultado de ello, descubrieron que la administración combinada del conjugado análogo de insulina de acción prolongada y el conjugado de exendina-4 de acción prolongada mejora la duración de la eficacia y la estabilidad, y reduce notablemente las dosis de los dos fármacos, llevando a un nivel estable de glucosa en sangre. También encontraron que mejora acontecimientos adversos tales como vómitos y náuseas inducidos por glucagón como agonista del péptido-1 y exendina-4 o derivados de la misma, y el uso de conjugado de exendina-4 de acción prolongada reduce la ganancia de peso causada por el uso de insulina. Además, descubrieron que puede reducir significativamente la lipotoxicidad y la glucotoxicidad, que son la principal causa de la disminución de la función y la masa de las células beta, y puede retrasar la progresión de la diabetes. La presente descripción se completó basándose en estos hallazgos.

[Solución técnica]

Un objetivo de la presente descripción es proporcionar una composición farmacéutica para la prevención o el tratamiento de la diabetes, que incluye un conjugado de análogo de insulina de acción prolongada y un conjugado de péptido insulinotrópico de acción prolongada.

Otro objetivo de la presente descripción es proporcionar un método para prevenir o tratar la diabetes, que incluye administrar la composición a un sujeto que tiene diabetes o que está en riesgo de tener diabetes.

Otro objetivo adicional de la presente descripción es proporcionar una composición farmacéutica para reducir uno o más efectos secundarios de las células beta pancreáticas seleccionados del grupo que consiste en lipotoxicidad, glucotoxicidad, anomalía en la función de las células beta pancreáticas y una reducción en las células beta pancreáticas en pacientes diabéticos, que incluye un conjugado de análogo de insulina de acción prolongada y un conjugado de péptido insulinotrópico de acción prolongada.

Otro objetivo adicional de la presente descripción es proporcionar un método para reducir uno o más efectos secundarios de las células beta pancreáticas seleccionados del grupo que consiste en lipotoxicidad, glucotoxicidad, anormalidad en la función de las células beta pancreáticas y reducción en la masa de células beta pancreáticas en un paciente diabético, que incluye una etapa de administrar la composición al paciente que padece diabetes o en riesgo de padecer diabetes.

[Efectos ventajosos]

Un conjugado de análogo de insulina de acción prolongada y un conjugado de exendina-4 de acción prolongada de la presente descripción muestran excelentes efectos terapéuticos sobre la diabetes y, en particular, la administración combinada de los mismos estimula al mismo tiempo a un receptor de insulina y a un receptor de péptido similar al glucagón tipo 1 para mejorar la duración in vivo de la eficacia y estabilidad de los mismos, y para reducir notablemente las dosis requeridas de los fármacos y controlar de forma estable la glucosa en sangre a un nivel estable, dando lugar a mejoras en la hipoglucemia y en el aumento de peso. Además, inhibe los vómitos y las náuseas y ha mejorado el cumplimiento de tratamiento como agente terapéutico para la diabetes. En particular, tiene una estabilidad notablemente mejorada en sangre y una duración de la eficacia in vivo que permite una reducción en la frecuencia de administración, lo que contribuye a la comodidad de uso del paciente.

Además, el conjugado de análogo de insulina de acción prolongada y el conjugado de péptido insulinotrópico de acción prolongada según la presente descripción presentan excelentes efectos de tratamiento de la diabetes, especialmente cuando se administran en combinación, y estimulan los receptores de insulina y los receptores de péptido similar al glucagón tipo 1 simultáneamente, mejorando por tanto la duración y la estabilidad in vivo, y mejoran adicionalmente la función de las células beta y aumentan la masa de las mismas a través de la reducción de la lipotoxicidad y la glucotoxicidad, que son efectos secundarios producidos debido al progreso de la diabetes. Además, la presente descripción puede proporcionar una composición en la que las desventajas de la preparación de insulina se han reducido aliviando los niveles bajos de glucosa en sangre y el aumento de peso.

[Descripción de los dibujos]

La Figura 1 es un gráfico que muestra los niveles de hemoglobina glicosilada (HbA1c), que se miden para examinar el control de la glucosa en sangre mediante la administración combinada de un conjugado de análogo de insulina de acción prolongada y un conjugado de exendina-4 de acción prolongada a ratones db/db (^∗P<0,05, ** P< 0,01, *** P<0,001 mediante la prueba de MC de Dunnet, frente al vehículo) (†P<0,05, †† P< 0,01, ††† P<0,001 mediante la prueba de MC de Dunnet, frente a la administración única del conjugado de análogo de insulina de acción prolongada). La Figura 2 es un gráfico que muestra los cambios en el peso corporal (BW) después de la administración combinada del conjugado de análogo de insulina de acción prolongada y el conjugado de exendina-4 de acción prolongada a ratones db/db (^∗P<0,05, ^∗∗P< 0,01, ^∗∗∗P<0,001 mediante la prueba de MC de Dunnet) (†P<0,05, †† P< 0,01, †††P<0,001 mediante la prueba de MC de Dunnet, frente a la administración única de análogo de insulina de acción prolongada.

La Figura 3 es un gráfico que muestra numéricamente el efecto de un aumento en la masa de células beta mediante la administración combinada de un conjugado de análogo de insulina de acción prolongada (un conjugado de derivado de insulina de acción prolongada) y un conjugado de exendina-4 de acción prolongada a db/db (^*P<0,05, ^*P< 0,01, ^***P<0,001 mediante la prueba ANOVA, frente al vehículo).

La Figura 4 es un gráfico que muestra el valor de los triglicéridos en suero mediante la administración combinada de 12 semanas de un conjugado de análogo de insulina de acción prolongada y un conjugado de exendina-4 de acción prolongada a db/db (* P<0,05, ** P< 0,01, *** P<0,001 mediante la prueba de ANOVA, frente al vehículo).

La Figura 5 es un gráfico que muestra los niveles de hemoglobina glucosilada (HbA1c), que se miden para examinar el control de la glucosa en sangre mediante la administración combinada de un conjugado de análogo de insulina de acción prolongada y un conjugado de exendina-4 de acción prolongada a un ratón db/db.

[Mejor modo]

La invención es como se define en las reivindicaciones.

En un aspecto, la presente descripción proporciona una composición farmacéutica para la prevención o el tratamiento de la diabetes, que incluye un conjugado de análogo de insulina de acción prolongada y un conjugado de péptido insulinotrópico de acción prolongada que son similares en la semivida in vivo. La composición de la presente descripción se caracteriza por la administración combinada del conjugado de análogo de insulina de acción prolongada y el conjugado de péptido insulinotrópico de acción prolongada.

En detalle, en una realización de la presente invención, la composición puede ser una composición farmacéutica para su uso en un método de prevención o tratamiento de la diabetes mellitus, que incluye el conjugado de análogo de insulina de acción prolongada en el que un análogo de insulina está unido a una región Fc de inmunoglobulina a través de un enlazador de polímero no peptidílico; y el conjugado de péptido insulinotrópico de acción prolongada en el que un péptido insulinotrópico está unido a una región Fc de inmunoglobulina a través de un enlazador de polímero no peptidílico, en el que el análogo de insulina se caracteriza por la sustitución del aminoácido en la posición 14 de la cadena A con otro ácido aminoglutámico, y en el que el péptido insulinotrópico es una imidazo-acetil exendina-4 (CA Exendina-4).

En otro aspecto, la descripción proporciona una composición farmacéutica para reducir uno o más efectos secundarios de las células beta pancreáticas seleccionados del grupo que consiste en lipotoxicidad, glucotoxicidad, anomalía en la función de las células beta pancreáticas y una reducción en la masa de células beta pancreáticas en pacientes diabéticos, que contiene un conjugado de análogo de insulina de acción prolongada y un conjugado de péptido insulinotrópico de acción prolongada, que tienen una semivida in vivo similar. La composición de la presente descripción se caracteriza por que un conjugado de análogo de insulina de acción prolongada y un conjugado de péptido insulinotrópico de acción prolongada se administran en combinación.

Específicamente, en otra realización de la presente invención, la composición puede ser una composición farmacéutica para reducir uno o más efectos secundarios de las células beta pancreáticas seleccionados del grupo que consiste en lipotoxicidad, glucotoxicidad, una anomalía en la función de las células beta pancreáticas y una reducción en la masa de células beta pancreáticas en pacientes diabéticos, que comprende:

un conjugado de análogo de insulina de acción prolongada en el que un análogo de insulina está unido a una región Fc de inmunoglobulina a través de un enlazador de polímero no peptidílico, y

un conjugado de péptido insulinotrópico de acción prolongada en el que un péptido insulinotrópico está unido a una región Fc de inmunoglobulina a través de un enlazador de polímero no peptidílico y opcionalmente en el que la composición inhibe la progresión de la diabetes; o donde la composición mejora el pronóstico diabético del sujeto que padece diabetes mellitus, donde el análogo de insulina se caracteriza por la sustitución del aminoácido en la posición 14 de la cadena A con otro aminoácido glutámico, y donde el péptido insulinotrópico es una imidazo-acetil exendina-4 (CA Exendina-4).

La composición de la presente descripción puede reducir la lipotoxicidad, glucotoxicidad, anomalía en la función de las células beta pancreáticas y reducción en la masa de células beta pancreáticas al mismo tiempo.

Dado que los péptidos insulinotrópicos, tales como el análogo de la insulina y el péptido 1 similar al glucagón, controlan los niveles de glucosa en sangre a través de diferentes mecanismos de acción, solo se han realizado estudios para su uso como agentes terapéuticos para controlar los niveles de glucosa en sangre basándose en el hallazgo de que su eficacia puede maximizarse tras la administración en combinación. Sin embargo, no ha habido estudios que verifiquen que la administración combinada mejore la función y la masa de las células beta a través de la reducción y la acción complementaria sobre la lipotoxicidad y la glucotoxicidad, reduciendo de este modo los efectos secundarios de las células beta pancreáticas, que pueden aparecer con una sola administración de insulina o péptido insulinotrópico. El uso novedoso como se ha descrito anteriormente fue desarrollado por primera vez por los presentes inventores.

La composición de la presente descripción se caracteriza por que no solo puede reducir los efectos secundarios de las células beta pancreáticas, sino también disminuir la concentración de triglicéridos en la sangre para reducir de este modo la toxicidad de los lípidos, controlar una función de la glucosa en sangre para reducir de este modo la glucotoxicidad y mantener y/o aumentar la masa de células beta pancreáticas para inhibir de este modo la progresión de la diabetes. En consecuencia, la composición de la presente descripción puede aliviar la progresión de la diabetes. La composición descrita anteriormente se caracteriza por que mejora el pronóstico de la diabetes en un sujeto diabético al que se ha administrado.

En la composición, una relación molar de conjugado de péptido insulinotrópico de acción prolongada frente a conjugado de análogo de insulina puede estar en el intervalo de 1:0,01~1:50. Un ejemplo del conjugado de péptido insulinotrópico puede ser un conjugado de exendina, pero no se limita al mismo.

[Modo de descripción]

Como se utiliza en la presente memoria, el término “conjugado de análogo de insulina de acción prolongada” o “conjugado de péptido insulinotrópico de acción prolongada” se refiere a un conjugado en el que el análogo de insulina o el péptido insulinotrópico está unido a un material biocompatible o a un vehículo a través de un enlace covalente o de un enlace no covalente, y la formación del conjugado prolonga la duración de la actividad del análogo de insulina o péptido insulinotrópico correspondiente, en comparación con el análogo no conjugado o péptido insulinotrópico. La administración del conjugado de análogo de insulina de acción prolongada reduce las dosis requeridas de los fármacos y también alivia los acontecimientos adversos tales como aumento de peso, vómitos y náuseas, en comparación con la insulina nativa.

En la presente descripción, el agente capaz de aumentar la semivida y la biodisponibilidad del análogo de insulina y el péptido insulinotrópico o mantener su actividad puede ser un vehículo que se una directamente al análogo de insulina y el péptido insulinotrópico a través de un enlace covalente, o se refiere a un agente capaz de aumentar la actividad in vivo del análogo de insulina aunque el enlace covalente no se forme directamente.

Como se utiliza en la presente memoria, el término “material o vehículo biocompatible” es un material capaz de prolongar la duración de la actividad del análogo de insulina o el péptido insulinotrópico cuando está unido al análogo o péptido correspondiente a través de un enlace covalente o no covalente para formar un conjugado. Por ejemplo, el material capaz de prolongar la semivida in vivo del análogo o péptido correspondiente mediante la formación del conjugado puede ser el material o vehículo biocompatible según la presente descripción. El material biocompatible capaz de unirse al análogo de insulina y al péptido insulinotrópico puede ejemplificarse mediante diversos materiales biocompatibles que incluyen polietilenglicol, ácido graso, colesterol, albúmina y fragmentos de los mismos, materiales de unión a albúmina, un polímero de unidades repetitivas de una secuencia de aminoácidos particular, un anticuerpo, fragmentos de anticuerpo, material de unión a FcRn, tejidos conectivos, nucleótidos, fibronectina, transferrina, sacáridos o polímeros, que forman un enlace covalente o no covalente para prolongar la semivida in vivo. Además, el enlace entre el análogo de insulina o el péptido insulinotrópico y el material biocompatible capaz de prolongar la semivida in vivo incluye la recombinación genética y la conjugación in vitro utilizando un compuesto de alto o bajo peso molecular, pero no se limita a ningún método de enlace. El material de unión a FcRn puede ser una región Fc de inmunoglobulina.

Como se utiliza en la presente memoria, el término “análogo de insulina” se refiere a un péptido que tiene una variante de uno o más aminoácidos de una secuencia nativa.

El análogo de insulina puede ser un análogo de insulina que tenga una variante de aminoácido en la cadena B o en la cadena A de insulina y que tenga un título de insulina reducido y/o una afinidad de unión al receptor de insulina reducida, en comparación con la insulina nativa. La secuencia de aminoácidos de la insulina nativa es la siguiente. Cadena A:

Cadena B:

La insulina utilizada en los Ejemplos de la presente descripción puede ser un análogo de insulina producido mediante una tecnología de recombinación genética, pero la presente descripción no se limita a la misma. La insulina incluye todas las insulinas que tienen un título in vitro reducido y/o una afinidad de unión al receptor de insulina reducida. Preferiblemente, la insulina incluye insulina invertida, variantes de insulina, fragmentos de insulina, etc., y puede prepararse mediante un método en fase sólida así como mediante un método de recombinación genética, pero sin estar limitado a los mismos.

El análogo de insulina es un péptido que conserva la función de controlar el nivel de glucosa en sangre en el organismo, que es igual al de la insulina, y dicho péptido incluye agonistas de insulina, derivados, fragmentos, variantes, etc. El agonista de insulina de la presente descripción se refiere a un compuesto que se une al receptor de insulina para mostrar la actividad biológica igual a la de la insulina, que es irrelevante para la estructura de la insulina.

El análogo de insulina de la presente descripción se refiere a un péptido que tiene homología con las secuencias de aminoácidos respectivas de la cadena A y la cadena B de la insulina nativa, que puede tener al menos un resto aminoácido cambiado por una alteración seleccionada del grupo que consiste en sustitución (por ejemplo, alfametilación, alfa-hidroxilación), eliminación (por ejemplo, desaminación), modificación (por ejemplo, N-metilación) y combinaciones de los mismos, y tiene la función de regular el nivel de glucosa en sangre en el organismo.

En la presente descripción, el análogo de insulina se refiere a un péptido mimético o un compuesto de bajo o alto peso molecular que se une al receptor de insulina para regular el nivel de glucosa en sangre, aunque su secuencia de aminoácidos no tenga homología con la de la insulina nativa.

El fragmento de insulina de la presente descripción se refiere a un fragmento que tiene uno o más aminoácidos añadidos o delecionados en la insulina, en el que los aminoácidos añadidos pueden ser aminoácidos de origen no natural (por ejemplo, aminoácido de tipo D), y este fragmento de insulina tiene la función de regular el nivel de glucosa en sangre en el organismo.

La variante de insulina de la presente descripción es un péptido que tiene una o más secuencias de aminoácidos distintas de las de la insulina, y se refiere a un péptido que conserva la función de regular el nivel de glucosa en sangre en el organismo.

Cada uno de los métodos de preparación para los agonistas, derivados, fragmentos y variantes de insulina de la presente descripción pueden utilizarse individualmente o en combinación. Por ejemplo, la presente descripción incluye un péptido que tiene uno o más aminoácidos diferentes y la desaminación del residuo de aminoácido N-terminal, y tiene la función de regular el nivel de glucosa en sangre en el organismo.

Específicamente, el análogo de insulina puede caracterizarse en sustitución de uno o más aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en aminoácidos en las posiciones 1, 2, 3, 5, 8, 10, 12, 16, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, y 30 de la cadena B y en las posiciones 1, 2, 5, 8, 10, 12, 14, 16, 17, 18, 19 y 21 de la cadena A por otros aminoácidos, específicamente alanina, ácido glutámico, asparagina, isoleucina, valina, glutamina, glicina, lisina, histidina, cisteína, fenilalanina, triptófano, prolina, serina, treonina, ácido aspártico. Además, también puede incluirse en el ámbito de la presente descripción un análogo de insulina que tenga deleción de uno o más aminoácidos, pero no hay limitación en el análogo de insulina.

El análogo de insulina puede ser un análogo de insulina que tenga una semivida mayor que la insulina nativa, cuando se une con el material biocompatible o el vehículo. El análogo de insulina puede ser los análogos de insulina descritos en las patentes coreanas n.° 2014-0022909 y 2014-0006938, aunque no se limita a los mismos.

Como se utiliza en la presente memoria, el término “conjugado de péptido insulinotrópico de acción prolongada” se refiere a un péptido insulinotrópico unido a una región Fc de inmunoglobulina a través de un enlazador no peptidílico. Como se utiliza en la presente memoria, el término “péptido insulinotrópico” se refiere a un péptido que conserva la función de liberar insulina, y estimula la síntesis o expresión de insulina en las células beta del páncreas. Específicamente, el péptido insulinotrópico es GLP (péptido similar al glucagón)-1, exendina-3 o exendina-4, pero no se limita a los mismos. El péptido insulinotrópico incluye péptidos insulinotrópicos nativos, precursores de los mismos, agonistas de los mismos, derivados de los mismos, fragmentos de los mismos y variantes de los mismos.

El derivado peptídico insulinotrópico de la presente descripción puede incluir un derivado desamino-histidilo donde se elimina el grupo amino N-terminal del péptido insulinotrópico, un derivado beta-hidroxi imidazopropionilo donde el grupo amino está sustituido con un grupo hidroxilo, un derivado dimetil-histidilo donde el grupo amino está modificado con dos grupos metilo, un derivado beta-carboxiimidazopropionilo donde el grupo amino N-terminal está sustituido con un grupo carboxilo, o un derivado imidazoacetilo donde se elimina el carbono alfa del residuo de histidina N-terminal para que quede únicamente el grupo imidazoacetilo y, por lo tanto, se elimina la carga positiva del grupo amino, etc. Otros derivados mutados del grupo amino N-terminal están incluidos dentro del ámbito de la presente descripción. En la presente descripción, el derivado peptídico insulinotrópico puede ser un derivado de exendina-4 que tenga un grupo amino o residuo de aminoácido N-terminal químicamente mutado, incluso más específicamente un derivado de exendina-4 que se prepara eliminando o sustituyendo el grupo alfa amino presente en el carbono alfa del residuo His1 N-terminal de exendina-4 o eliminando o sustituyendo el carbono alfa. Aún más específicamente, desamino-histidilexendina-4 (DA-Exendina-4) con eliminación del grupo amino N-terminal, beta-hidroxi imidazopropil-exendina-4 (HY-exendina-4) preparada por sustitución con un grupo hidroxilo, beta-carboxi imidazopropil-exendina-4 (CX-exendina-4) preparada por sustitución con un grupo carboxilo, dimetil-histidil-exendina-4 (DMexendina-4) preparada por modificación con dos residuos metilo, o imidazoacetil-exendina-4 (CA-exendina-4) con eliminación de carbono alfa del residuo histidina N-terminal, pero no se limitan a los mismos.

GLP-1 es una hormona secretada por el intestino delgado, y por lo general promueve la biosíntesis y la secreción de insulina, inhibe la secreción de glucagón, y promueve la captación de glucosa por las células. En el intestino delgado, un precursor de glucagón se descompone en tres péptidos, es decir, glucagón, GLP-1 y GLP-2. Aquí, el GLP-1 se refiere a GLP-1 (1-37), que está originalmente en la forma que no tiene función insulinotrópica, pero que después se procesa y convierte a una en las formas activadas de GLP-1 (7-37). La secuencia del aminoácido GLP-1 (7-37) es la siguiente:

GLP-1(7-37):

HAEGT FTSDV SSYLE GQAAK EFIAW LVKGR G (ID. DE SEC. N.º: 39)

El derivado de GLP-1 se refiere a un péptido que presenta una homología de secuencia de aminoácidos de al menos un 80 % con la de GLP-1, puede estar en la forma químicamente modificada, y presenta una función insulinotrópica al menos equivalente a, o mayor que, la de GLP-1.

El fragmento de GLP-1 se refiere a uno en la forma en la que se añaden o eliminan uno o más aminoácidos en un extremo N-terminal o un extremo C-terminal de un GLP-1 nativo, en el que el aminoácido añadido es posiblemente un aminoácido de origen no natural (por ejemplo, aminoácido de tipo D).

La variante de GLP-1 se refiere a un péptido que posee una función insulinotrópica, que tiene una o más secuencias de aminoácidos distintas a las de un GLP-1 nativo.

La exendina-3 y la exendina-4 son péptidos insulinotrópicos que consisten en 39 aminoácidos, que tienen una homología de secuencia de aminoácidos del 53 % con GLP-1. Las secuencias de aminoácidos de la exendina-3 y la exendina-4 son las siguientes:

Exendina-3 :

HSDGT FTSDL SKQME EEAVR LFIEW LKNGG PSSGA PPPS (ID. DE SEC. N.º: 40)

Exendina-4:

HGEGT FTSDL SKQME EEAVR LFIEW LKNGG PSSGA PPPS (ID. DE SEC. N.º: 41)

El agonista de exendina se refiere a un compuesto que se une a los receptores de exendina in vivo y que tiene una actividad biológica equivalente a la de la exendina, que es irrelevante para la estructura de la exendina, y el derivado de exendina se refiere a un péptido que tiene al menos un 80 % de homología de secuencia aminoacídica con la exendina nativa, que puede tener algunos grupos en el resto aminoácido químicamente sustituidos (por ejemplo, alfametilación, alfa-hidroxilación), eliminados (por ejemplo, desaminación) o modificados (por ejemplo, N-metilación), y que tiene una función insulinotrópica.

El fragmento de exendina se refiere a un fragmento que tiene uno o más aminoácidos añadidos o eliminados en el extremo N-terminal o en el extremo C-terminal de la exendina nativa, en el que pueden añadirse aminoácidos de origen no natural (por ejemplo, aminoácido de tipo D), y que tiene una función insulinotrópica.

La variante de exendina se refiere a un péptido que tiene al menos una secuencia de aminoácidos distinta de la de la exendina nativa, que tiene una función insulinotrópica, y la variante de exendina incluye péptidos en los que la lisina en posición 12 de la exendina-4 está sustituida por serina o arginina.

Cada uno de los métodos de preparación para los agonistas, derivados, fragmentos y variantes de exendina puede utilizarse individualmente o en combinación. Por ejemplo, la presente descripción incluye un péptido insulinotrópico que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un aminoácido distinto, y que tiene el resto aminoácido que se desamina en el extremo N-terminal.

En un ejemplo, el péptido insulinotrópico nativo y el péptido insulinotrópico modificado utilizados en la presente descripción pueden sintetizarse utilizando un método de síntesis en fase sólida, y la mayoría de los péptidos nativos que incluyen un péptido insulinotrópico nativo pueden producirse mediante una tecnología de recombinación.

El conjugado de análogo de insulina y el conjugado de péptido insulinotrópico pueden representarse mediante la siguiente fórmula:

X-La-F

donde X es un análogo de insulina o un péptido insulinotrópico, en el que el análogo de insulina preparado por modificación de uno o más aminoácidos de la cadena B o la cadena A de insulina, L es un enlazador, a es 0 o un número natural (cuando a es 2 o mayor, cada L es independiente), F se selecciona de polietilenglicol, ácido graso, colesterol, albúmina y un fragmento de los mismos, una secuencia de aminoácidos particular, un anticuerpo y un fragmento de los mismos, un material de unión a FcRn, fibronectina, sacárido, etc.

La región Fc de inmunoglobulina es segura para su uso como vehículo de fármaco porque es un polipéptido biodegradable que se metaboliza en el organismo. Además, la región Fc de inmunoglobulina tiene un peso molecular relativamente bajo, en comparación con las moléculas de inmunoglobulina completas, y por lo tanto, es ventajosa en la preparación, purificación y rendimiento del conjugado. La región Fc de inmunoglobulina no contiene un fragmento Fab, que es muy no homogéneo debido a diferentes secuencias de aminoácidos según las subclases de anticuerpos y, por lo tanto, puede esperarse que la región Fc de inmunoglobulina pueda aumentar en gran medida la homogeneidad de las sustancias y sea menos antigénica.

El término “región Fc de inmunoglobulina” como se utiliza en la presente memoria, se refiere a una proteína que contiene la región constante de la cadena pesada 2 (CH2) y la región constante de la cadena pesada 3 (CH3) de una inmunoglobulina, excluyendo las regiones variables de las cadenas pesada y ligera, la región constante de la cadena pesada 1 (CH1) y la región constante de la cadena ligera 1 (CL1) de la inmunoglobulina. Puede incluir además una región bisagra en la región constante de cadena pesada. Además, la región Fc de inmunoglobulina de la presente descripción puede ser una región Fc extendida que comprende una parte o la totalidad de la región constante de cadena pesada 1 (CH1) y/o la región constante de cadena ligera 1 (CL1), excepto para las regiones variables de las cadenas pesada y ligera, siempre que tenga una función fisiológica sustancialmente similar o mejor que la inmunoglobulina nativa. Además, la región Fc de inmunoglobulina puede ser una región que tenga una deleción en una parte relativamente larga de la secuencia de aminoácidos de CH2 y/o CH3.

Es decir, la región Fc de inmunoglobulina de la presente descripción puede incluir 1) un dominio CH1, un dominio CH2, un dominio CH3 y un dominio CH4, 2) un dominio CH1 y un dominio CH2, 3) un dominio CH1 y un dominio CH3, 4) un dominio CH2 y un dominio CH3, 5) una combinación de uno o más dominios y una región bisagra de inmunoglobulina (o una parte de la región bisagra), y 6) un dímero de cada dominio de las regiones constantes de cadena pesada y la región constante de cadena ligera.

La región Fc de inmunoglobulina de la presente descripción incluye una secuencia de aminoácidos nativa y una variante de secuencia (mutante) de la misma. La variante de secuencia de aminoácidos es una secuencia que es distinta de la secuencia de aminoácidos nativa debido a una deleción, inserción, sustitución no conservativa o conservativa o combinaciones de las mismas de uno o más restos aminoácidos. Por ejemplo, en un Fc de IgG, los restos aminoácidos que se sabe son importantes en la unión, en las posiciones 214 a 238, 297 a 299, 318 a 322 o 327 a 331, pueden utilizarse como una diana adecuada para la modificación.

Además, son posibles otras diversas variantes, incluyendo una en la que se elimina una región capaz de formar un enlace disulfuro, o se eliminan ciertos restos aminoácidos en el extremo N-terminal-terminal de una forma Fc nativa o se añade a la misma un residuo de metionina. Además, para eliminar las funciones efectoras, puede producirse una deleción en un sitio de unión al complemento, tal como un sitio de unión a C1q y un sitio de ADCC (citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos). Las técnicas de preparación de tales derivados de secuencia de la región Fc de inmunoglobulina se describen en las publicaciones de patente internacional WO 97/34631 y WO 96/32478.

Se conocen en la técnica intercambios de aminoácidos en proteínas y péptidos, que generalmente no alteran la actividad molecular(H. Neurath, R. L. Hill, The Proteins, Academic Press, Nueva York, 1979). Los intercambios que se producen más comúnmente son Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu y Asp/Gly, en ambas direcciones.

Además, si se desea, la región Fc puede modificarse mediante fosforilación, sulfatación, acrilación, glicosilación, metilación, farnesilación, acetilación, amidación, etc.

Las variantes de Fc mencionadas anteriormente son variantes que tienen una actividad biológica idéntica a la región Fc de la presente descripción o una estabilidad estructural mejorada, por ejemplo, frente al calor, pH, etc.

Además, estas regiones Fc pueden obtenerse a partir de formas nativas aisladas de seres humanos y otros animales incluyendo bovinos, cabras, cerdos, ratones, conejos, hámsteres, ratas y cobayas, o pueden ser recombinantes o derivadas de las mismas, obtenidas a partir de células animales transformadas o de microorganismos. En la presente memoria, pueden obtenerse a partir de una inmunoglobulina nativa, aislando inmunoglobulinas completas de organismos humanos o animales y tratándolas con una enzima proteolítica. La papaína digiere la inmunoglobulina nativa en las regiones Fab y Fc, y el tratamiento con pepsina da lugar a la producción de pF'c y F(ab)₂. Estos fragmentos pueden someterse a cromatografía de exclusión por tamaño para aislar Fc o pF'c.

La región Fc de inmunoglobulina puede ser una región Fc de inmunoglobulina recombinante, que es una región Fc derivada de ser humano obtenida de un microorganismo.

Además, la región Fc de inmunoglobulina puede estar en forma de, o tener, cadenas de azúcar nativas, cadenas de azúcar aumentadas en comparación con una forma nativa, o cadenas de azúcar reducidas en comparación con la forma nativa, o puede estar en una forma desglicosilada. El aumento, reducción o eliminación de las cadenas de azúcar Fc de inmunoglobulina puede lograrse mediante métodos comunes en la técnica, tales como un método químico, un método enzimático y un método de ingeniería genética que utiliza un microorganismo. En este caso, la eliminación de las cadenas de azúcar de una región Fc da lugar a una fuerte reducción de la afinidad de unión al complemento (c1q) y una reducción o pérdida de la citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos o de la citotoxicidad dependiente de complemento, no induciendo de este modo respuestas inmunitarias innecesarias in vivo. En este sentido, una región Fc de inmunoglobulina en una forma desglicosilada o aglicosilada puede ser más adecuada para el objeto de la presente descripción como vehículo de fármaco.

Como se utiliza en la presente memoria, la desglicosilación se refiere a una eliminación enzimática de restos de azúcar de una región Fc, y la aglicosilación se refiere a una región Fc producida en una forma no glicosilada por un organismo procariota, específicamente E. coli.

Mientras tanto, la región Fc de inmunoglobulina puede obtenerse de seres humanos u otros animales, incluidos bovinos, cabras, cerdos, ratones, conejos, hámsteres, ratas y cobayas, y específicamente de seres humanos. Además, la región Fc de inmunoglobulina puede ser una región Fc que se deriva de IgG, IgA, IgD, IgE e IgM, o que se prepara mediante combinaciones de las mismas o híbridos de las mismas. Específicamente, se deriva de IgG o IgM, que están entre las proteínas más abundantes en la sangre humana, y más específicamente, se deriva de IgG, que se sabe que mejora las semividas de las proteínas de unión a ligando.

Por otra parte, la combinación, como se utiliza en la presente memoria, se refiere a un enlace entre un polipéptido que codifica una región Fc de inmunoglobulina monocatenaria del mismo origen y un polipéptido monocatenario de un origen distinto para formar un dímero o multímero. Es decir, puede formarse un dímero o multímero a partir de dos o más fragmentos seleccionados del grupo que consiste en fragmentos Fc de IgG, Fc de IgA, Fc de IgM, Fc de IgD y Fc de IgE.

El término “híbrido”, como se utiliza en la presente memoria, se refiere a una presencia de secuencias que codifican dos o más fragmentos Fc de inmunoglobulina de distinto origen en una región Fc de inmunoglobulina monocatenaria. En la presente descripción, son posibles varios tipos de híbridos. Es decir, los dominios híbridos pueden estar compuestos de uno a cuatro dominios seleccionados del grupo que consiste en CH1, CH2, CH3 y CH4 de Fc de IgG, Fc de IgM, Fc de IgA, Fc de IgE y Fc de IgD, y pueden incluir la región bisagra.

Por otro lado, la IgG se divide en las subclases IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4, y la presente descripción incluye combinaciones e híbridos de las mismas. Pueden utilizarse subclases de IgG2 e IgG4, y más específicamente, puede utilizarse la región Fc de IgG4 que rara vez tiene funciones de efector tales como citotoxicidad dependiente del complemento (CDC). Es decir, como vehículo de fármaco de la presente descripción, la región Fc no glicosilada derivada de IgG4 humana puede utilizarse como una región Fc de inmunoglobulina. Una región Fc obtenida de humanos es más preferible que una región Fc obtenida de especies no humanas, que puede actuar como un antígeno en el organismo humano y provocar respuestas inmunitarias indeseables tales como la producción de un nuevo anticuerpo contra el antígeno.

En la presente descripción, el polímero no peptidílico se refiere a un polímero biocompatible que incluye dos o más unidades repetitivas unidas entre sí por cualquier enlace covalente, excepto un enlace peptídico. Dicho polímero no peptidílico puede tener dos extremos o tres extremos.

El polímero no peptidílico útil en la presente descripción puede seleccionarse del grupo que consiste en un polímero biodegradable tal como polietilenglicol, polipropilenglicol, copolímero de etilenglicol-propilenglicol, poliol polioxietilado, alcohol polivinílico, polisacárido, dextrano, polivinil etil éter, ácido poliláctico (PLA) y ácido poliláctico-glicólico (PLGA), un polímero lipídico, quitina, ácido hialurónico y una combinación de los mismos, y específicamente, polietilenglicol.

Además, los derivados de los mismos conocidos en la técnica y los derivados preparados fácilmente mediante un método conocido en la técnica pueden incluirse en el ámbito de la presente descripción.

El enlazador peptidílico utilizado en la proteína de fusión obtenida por un método de fusión dentro del marco convencional tiene el inconveniente de que se escinde fácilmente in vivo por una enzima proteolítica, no pudiendo obtenerse por lo tanto un efecto suficiente de aumento de la semivida del fármaco activo por un vehículo como se esperaba. En la presente descripción, sin embargo, se puede utilizar un enlazador no peptidílico así como el enlazador peptidílico para preparar el conjugado. En el enlazador no peptidílico, puede utilizarse un polímero que tenga resistencia a la enzima proteolítica para mantener la semivida del péptido para que sea similar a la del vehículo. Por lo tanto, puede utilizarse cualquier polímero no peptidílico sin limitación, siempre que sea un polímero que tenga la función mencionada anteriormente, es decir, un polímero que tenga resistencia a la enzima proteolítica in vivo. El polímero no peptidílico tiene un peso molecular que varía de 1 a 100 kDa, y preferiblemente de 1 a 20 kDa.

El polímero no peptidílico de la presente descripción, unido a la región Fc de inmunoglobulina, puede ser un polímero o una combinación de distintos tipos de polímeros.

El polímero no peptidílico utilizado en la presente descripción tiene un grupo reactivo capaz de unirse a la región Fc de inmunoglobulina y al fármaco proteínico.

El polímero no peptidílico tiene un grupo reactivo en ambos extremos, que se selecciona preferiblemente del grupo que consiste en un grupo aldehído reactivo, un grupo propionaldehído, un grupo butiraldehído, un grupo maleimida y un derivado de succinimida. El derivado de succinimida puede ser propionato de succinimidilo, hidroxisuccinimidilo, succinimidilcarboximetilo, o carbonato de succinimidilo. En particular, cuando el polímero no peptidílico tiene un grupo aldehído reactivo en ambos extremos del mismo, es eficaz en la unión en ambos extremos con un polipéptido fisiológicamente activo y una inmunoglobulina con un mínimo de reacciones no específicas. Un producto final generado por alquilación reductora por un enlace aldehído es mucho más estable que el unido por un enlace amida. El grupo reactivo aldehído se une de forma selectiva a un extremo N-terminal a un pH bajo, y se une a un resto de lisina para formar un enlace covalente a un pH alto, tal como pH 9,0.

Los grupos reactivos en ambos extremos del polímero no peptidílico pueden ser iguales o distintos entre sí. Por ejemplo, el polímero no peptidilo puede poseer un grupo maleimida en un extremo, y un grupo aldehído, un grupo propionaldehído o un grupo butiraldehído en el otro extremo. Cuando se utiliza un polietilenglicol que tiene un grupo hidroxi reactivo en ambos extremos del mismo como polímero no peptidílico, el grupo hidroxi puede activarse para diversos grupos reactivos mediante reacciones químicas conocidas, o puede utilizarse un polietilenglicol comercial que tenga un grupo reactivo modificado para preparar el conjugado de la presente descripción.

El tipo y el método de preparación del conjugado de péptido secretor de acción prolongada se describen en detalle en las patentes coreanas n.° 10-1058290, 10-1231431 y 10-1058315.

En un ejemplo de la presente descripción, la lisina (Lys) de la imidazo-acetil exendina-4(CA exendina-4) se modificó con PEG, y la exendina-4 modificada con PEG se unió al Fc de inmunoglobulina, preparando de este modo un conjugado de exendina-4 de acción prolongada (Ejemplo 9).

Dicho conjugado de análogo de insulina de acción prolongada y el péptido insulinotrópico de acción prolongada de la presente descripción aumentan notablemente la duración in vivo de la eficacia y muestran una semivida in vivo similar. Por lo tanto, la administración combinada de los mismos es útil en el tratamiento de la diabetes.

La administración combinada del conjugado de análogo de insulina de acción prolongada y el conjugado de péptido insulinotrópico de acción prolongada de la presente descripción puede mostrar excelentes efectos de control del nivel de glucosa en sangre y mejorar el nivel de lípidos en sangre en comparación con una sola administración. En un ejemplo de la presente descripción, se confirmó que la administración combinada del conjugado de análogo de insulina de acción prolongada y el conjugado de péptido insulinotrópico de acción prolongada (es decir, exendina-4) puede mejorar la lipotoxicidad y la glucotoxicidad, manteniendo por tanto la masa de células beta e inhibiendo además la progresión de la diabetes. Tales resultados sugieren que una composición compuesta del conjugado de análogo de insulina de acción prolongada y el conjugado de péptido insulinotrópico de acción prolongada según la presente descripción, o la administración combinada de los conjugados, pueden reducir significativamente la lipotoxicidad asociada con un aumento en los niveles de lípidos en sangre y la glucotoxicidad asociada con un aumento en los niveles de glucosa en sangre debido a un control insuficiente de los niveles de glucosa en sangre, que son efectos secundarios que se producen en algunos pacientes diabéticos tras una única administración de insulina o péptido insulinotrópico, y además la progresión de la diabetes puede aliviarse significativamente mediante la prevención de anomalías en la formación de células beta pancreáticas y/o en el aumento en la masa de células beta pancreáticas, dando lugar a una mejora, al tratamiento y a la prevención de la diabetes y a la mejora del pronóstico de la diabetes. La composición de la presente descripción se caracteriza por la administración combinada del conjugado de análogo de insulina de acción prolongada y el conjugado de péptido insulinotrópico de acción prolongada.

Cuando se lleva a cabo la administración de la combinación del conjugado de análogo de insulina de acción prolongada y del conjugado de péptido insulinotrópico de acción prolongada de la presente descripción, el conjugado de análogo de insulina de acción prolongada actúa sobre el receptor de insulina y el conjugado de péptido insulinotrópico de acción prolongada actúa sobre el receptor de péptido similar al glucagón tipo 1 simultáneamente, de modo que el nivel de glucosa en sangre disminuye y se mantiene un nivel de glucosa en sangre estable, en comparación con la administración única de los mismos. La administración combinada de los conjugados tiene los efectos de reducir el riesgo de hipoglucemia y de aumento de peso que puede inducirse mediante la administración única de insulina, y también reduce la dosis de la insulina total debido a la acción del péptido insulinotrópico. Existe la ventaja de que la dosis del péptido insulinotrópico, tal como exendina-4, también puede reducirse para prevenir efectos adversos tales como náuseas y vómitos causados por la administración única de exendina-4. El uso del conjugado de análogo de insulina de acción prolongada y el conjugado de péptido insulinotrópico de acción prolongada aumenta notablemente la semivida en sangre y la duración in vivo de la eficacia, de modo que la frecuencia de tratamiento se reduce para mejorar la calidad de vida en pacientes crónicos que requieran inyecciones diarias. Por lo tanto, es muy útil para el tratamiento de la diabetes. Además, la composición farmacéutica de la presente descripción muestra una excelente duración de la eficacia in vivo y de los títulos, y la dosis puede reducirse en gran medida en la administración de la combinación.

Además, a diferencia de las formulaciones convencionales, la composición de la presente descripción se caracteriza por que puede aliviar una pérdida de función de las células beta pancreáticas y una disminución en la masa de células beta pancreáticas debido a una apoptosis de las células beta pancreáticas producida en pacientes diabéticos. Esto puede reducir la disminución de la función y la masa de las células beta mediante la reducción y la acción complementaria de la lipotoxicidad y la glucotoxicidad, inhibiendo así la progresión de la diabetes. Con ello, la composición de la presente descripción puede aliviar los efectos secundarios de las células pancreáticas en pacientes diabéticos.

El conjugado de análogo de insulina de acción prolongada y el conjugado de péptido insulinotrópico de acción prolongada pueden administrarse de forma simultánea, secuencial o inversa, y pueden administrarse de forma simultánea en una combinación adecuada de dosis eficaces. Específicamente, el conjugado de análogo de insulina de acción prolongada y el conjugado de péptido insulinotrópico de acción prolongada pueden almacenarse por separado en recipientes individuales, y a continuación administrarse de forma simultánea, secuencial o inversa.

Además, el conjugado de análogo de insulina de acción prolongada y el conjugado de péptido insulinotrópico de acción prolongada, como composición para administración combinada de la presente descripción, pueden estar en forma de kit terapéutico para la diabetes que incluye los conjugados en un solo recipiente o por separado en recipientes individuales. El kit puede incluir un vehículo farmacéuticamente aceptable y un manual de instrucciones para usar el kit.

Además, el conjugado de análogo de insulina de acción prolongada y el conjugado de péptido insulinotrópico de acción prolongada pueden administrarse junto con el péptido insulinotrópico y la insulina, respectivamente. El conjugado de análogo de insulina de acción prolongada puede administrarse en combinación con el péptido insulinotrópico, tal como agonistas de GLP-1 (por ejemplo, Exenatida, Liraglutida, Lixisenatida), y el conjugado de péptido insulinotrópico de acción prolongada puede administrarse en combinación con insulina y un análogo de insulina, la insulina basal.

Como se utiliza en la presente memoria, el término “diabetes” o “diabetes mellitus” se refiere a una enfermedad metabólica causada por una falta de secreción de insulina o anormalidad en la función de la insulina. La administración combinada de la composición de la presente descripción a un sujeto se lleva a cabo para controlar los niveles de glucosa en sangre, tratando de este modo la diabetes. Además, la composición de la presente descripción puede utilizarse como agente terapéutico para la diabetes, que puede mantener y aumentar la función y la masa celular de las células beta pancreáticas, y proporcionar seguridad contra efectos secundarios tales como estrés potencial de las células beta. Además, la composición de la presente descripción puede reducir significativamente la lipotoxicidad y la glucotoxicidad, que provocan la reducción en la función y de la masa de las células beta, pudiendo retrasar la progresión de la diabetes. Por lo tanto, la composición de la presente descripción puede mejorar notablemente los efectos secundarios de los fármacos convencionales.

Como se utiliza en la presente memoria, el término “prevención” se refiere a todas las acciones por las que la aparición de diabetes o efectos secundarios de las células beta pancreáticas se restringe o retrasa mediante la administración combinada de la composición de la presente descripción, y el término “tratamiento” se refiere a todas las acciones por las que los síntomas de la diabetes o los efectos secundarios de las células beta pancreáticas han mejorado o se han modificado favorablemente mediante la administración combinada de la composición de la presente descripción. El tratamiento de la diabetes y la prevención o tratamiento de los efectos secundarios de las células beta pancreáticas pueden aplicarse a cualquier mamífero que pueda tener diabetes, y ejemplos de los mismos incluyen seres humanos y primates, así como ganado tal como bovino, porcino, ovino, equino, perros y gatos sin limitación, y específicamente seres humanos.

Como se utiliza en la presente memoria, el término “administración” se refiere a la introducción de una cantidad predeterminada de una sustancia en un paciente mediante un cierto método adecuado. La composición puede administrarse a través de cualquiera de las vías comunes, siempre que pueda alcanzar un tejido deseado. Se contemplan una variedad de modos de administración, incluyendo intraperitoneal, intravenosa, intramuscular, subcutánea, intradérmica, oral, tópica, intranasal, intrapulmonar e intrarrectal, pero la presente descripción no está limitada a estos modos de administración ilustrativos. Sin embargo, dado que los péptidos se digieren tras la administración oral, los ingredientes activos de una composición para administración oral deberán estar recubiertos o formulados para la protección frente a la degradación en el estómago. Específicamente, la composición puede administrarse en una forma inyectable. Además, el agente de acción prolongada puede administrarse utilizando un cierto aparato capaz de transportar los ingredientes activos a una célula diana.

Además, la composición farmacéutica de la presente descripción puede venir determinada por varios factores relacionados que incluyen los tipos de enfermedades a tratar, las vías de administración, la edad, el sexo, el peso y la gravedad de la enfermedad del paciente, así como por los tipos de fármaco utilizado como componente activo. Además, la composición farmacéutica de la presente descripción puede incluir un vehículo farmacéuticamente aceptable. Como se utiliza en la presente memoria, el término “vehículo farmacéuticamente aceptable” se refiere a un vehículo o diluyente que no causa irritación significativa a un organismo y no anula la actividad biológica y las propiedades del compuesto administrado. Para la administración oral, el vehículo farmacéuticamente aceptable puede incluir un aglutinante, un lubricante, un disgregante, un excipiente, un solubilizante, un agente dispersante, un estabilizante, un agente de suspensión, un agente colorante o un sabor. Para preparaciones inyectables, el vehículo farmacéuticamente aceptable puede incluir un agente tamponador, un agente conservante, un analgésico, un solubilizante, un agente isotónico y un estabilizante. Para preparaciones para administración tópica, el vehículo farmacéuticamente aceptable puede incluir una base, un excipiente, un lubricante y un agente conservante. La composición farmacéutica de la presente descripción puede formularse en una variedad de formas de dosificación en combinación con los vehículos farmacéuticamente aceptables mencionados anteriormente. Por ejemplo, para la administración oral, la composición farmacéutica puede formularse en comprimidos, píldoras, cápsulas, elixires, suspensiones, jarabes u obleas. Para preparaciones inyectables, la composición farmacéutica puede formularse en una ampolla como una forma de dosificación de dosis única o como un recipiente de múltiples dosis. La composición farmacéutica puede formularse también en soluciones, suspensiones, comprimidos, píldoras, cápsulas y preparaciones de acción prolongada.

Por otra parte, ejemplos del vehículo, excipiente y diluyente adecuados para formulaciones incluyen lactosa, dextrosa, sacarosa, sorbitol, manitol, xilitol, eritritol, maltitol, almidón, goma arábiga, alginato, gelatina, fosfato de calcio, silicato de calcio, celulosa, metilcelulosa, celulosa microcristalina, polivinilpirrolidona, agua, metilhidroxibenzoato, propilhidroxibenzoato, talco, estearato de magnesio y aceites minerales. Además, las formulaciones farmacéuticas pueden incluir además cargas, agentes anticoagulantes, lubricantes, humectantes, aromatizantes y antisépticos. En otro aspecto, la presente descripción proporciona un método para prevenir o tratar la diabetes, que incluye la etapa de administrar la composición que incluye el conjugado de análogo de insulina de acción prolongada y el conjugado de péptido insulinotrópico de acción prolongada a un paciente que tiene diabetes o que presenta riesgo de tener diabetes.

En un ejemplo, la presente descripción proporciona un método para reducir uno o más de los efectos secundarios de las células beta pancreáticas seleccionados del grupo que consiste en lipotoxicidad, glucotoxicidad, anormalidad en la función de las células beta pancreáticas y reducción en la masa de células beta pancreáticas en pacientes diabéticos, que incluye una etapa de administrar la composición que contiene el conjugado de análogo de insulina de acción prolongada y el conjugado de péptido insulinotrópico de acción prolongada a los pacientes que padecen diabetes.

La etapa de administración puede realizarse mediante la administración combinada del conjugado de análogo de insulina de acción prolongada y del conjugado de péptido insulinotrópico de acción prolongada, aunque no de forma limitativa, de forma simultánea, secuencial o inversa, y los conjugados pueden administrarse de forma simultánea en una combinación adecuada de dosis eficaces.

Aunque se administra solo una vez a la semana, la composición que incluye tanto el conjugado de análogo de insulina de acción prolongada como el conjugado de péptido insulinotrópico de acción prolongada de la presente descripción puede mostrar una excelente mejora en los niveles de glucosa en sangre y no causa ningún efecto secundario de aumento de peso y, por lo tanto, la composición puede utilizarse para la prevención o el tratamiento de la diabetes. En un ejemplo, la presente descripción proporciona un método para mejorar y/o reducir la lipotoxicidad y/o glucotoxicidad en pacientes diabéticos, que incluye una etapa de administrar dicha composición que contiene el conjugado de análogo de insulina de acción prolongada y el conjugado de péptido insulinotrópico de acción prolongada al paciente que padece diabetes.

En un ejemplo, la presente descripción proporciona un método para mejorar una función de las células beta pancreáticas y/o preservar y/o aumentar una masa de células beta pancreáticas, que incluye una etapa de administrar dicha composición que contiene el conjugado de análogo de insulina de acción prolongada y el conjugado de péptido insulinotrópico de acción prolongada a pacientes que padecen diabetes.

De aquí en adelante, la presente descripción se describirá con más detalle con referencia a los ejemplos. Sin embargo, estos ejemplos son solo para fines ilustrativos, y no se pretende que la descripción esté limitada por estos ejemplos. Ejemplo 1: Preparación de vector monocatenario de expresión de análogo de insulina

Para preparar análogos de insulina (análogo), cada análogo que tiene una variante de un aminoácido en la cadena A o cadena B, utilizando el vector de expresión de insulina nativo disponible como molde, se sintetizaron oligonucleótidos directos e inversos (Tabla 2), y se llevó a cabo una PCR para amplificar los genes análogos respectivos.

En la Tabla 1 que sigue se dan cada una de las secuencias de aminoácidos modificadas en la cadena A o la cadena B y cada nombre de los análogos. Es decir, el análogo 1 tiene una sustitución de alanina por glicina en la posición 1 de la cadena A, y el análogo 4 tiene una sustitución de alanina por glicina en la posición 8 de la cadena B.

[Tabla 1]

Los cebadores para la amplificación de análogos de insulina se dan en la siguiente Tabla 2.

[Tabla 2]

La PCR para la amplificación de análogos de insulina se realizó en condiciones de 95 °C durante 30 segundos, a 55 °C durante 30 segundos y a 68 °C durante 6 minutos durante 18 ciclos. Para expresar los fragmentos de análogo de insulina obtenidos en condiciones como cuerpos de inclusión intracelulares, cada uno de ellos se insertó en el vector pET22b, y los vectores de expresión así obtenidos se designaron como pET22b-análogos de insulina 1 a 9, respectivamente. Los vectores de expresión respectivos incluían ácidos nucleicos que codificaban secuencias aminoacídicas de los análogos de insulina 1 a 9 bajo el control del promotor de T7, y expresaban análogos de insulina como cuerpos de inclusión en células huésped, respectivamente.

Las secuencias de ADN y las secuencias de proteínas de los análogos de insulina 1 a 9 se dan en la siguiente Tabla 3.

[Tabla 3]

Ejemplo 2: Expresión de péptidos de fusión de análogos de insulina recombinantes

Los análogos de insulina recombinantes se expresaron bajo el control del promotor T7. E. coli BL21-DE3 (E. coli B F-dcm ompT hsdS(rB-mB-) gal DE3); Novagen) se transformaron con cada uno de los vectores de expresión de análogos de insulina recombinante. La transformación se hizo según los procedimientos recomendados por Novagen. Las colonias individuales transformadas con los vectores de expresión recombinantes respectivos se inocularon en medio de caldo de Luria (LB) 2X que contenía ampicilina (50 /ml) y se cultivaron a 37 °C durante 15 horas. Cada caldo de cultivo de la cepa recombinante y medio LB 2X que contenía glicerol al 30 % se mezclaron en una relación de 1:1 (v/v), y cada 1 ml del mismo se dispensó a un criotubo, y se almacenó a -140 °C. Estas muestras se utilizaron como materias primas celulares para la producción de las proteínas de fusión recombinantes.

Para expresar análogos de insulina recombinante, cada vial de las materias primas celulares se descongeló y se inoculó en 500 ml de LB 2X, y se cultivó con agitación a 37 °C durante 14~16 horas. Cuando el valor de DO600 alcanzó 5,0 o más, el cultivo se terminó y el caldo de cultivo se usó como cultivo de siembra. El cultivo de siembra se inoculó en un fermentador de 50 l (MSJ-U2, B. E.MARUBISHI, Japón) que contenía 17 l de medio de fermentación para comenzar la fermentación inicial en baño. Las condiciones de cultivo se mantuvieron a 37 °C, un caudal de aire de 20 l/min (1 vvm) y una velocidad de agitación de 500 rpm con un pH ajustado a 6,70 con amoniaco. La fermentación se llevó a cabo en un modo de alimentación discontinua añadiendo adicionalmente una solución de alimentación cuando se agotaron los nutrientes en el caldo de cultivo. El crecimiento celular se controló mediante la medición de la DO. A un valor de DO superior a 100 o mayor, se introdujo IPTG a una concentración final de 500 M. Después de la introducción, el cultivo se dejó crecer adicionalmente durante aproximadamente 23-25 horas. Después de terminar el cultivo, se recogieron cepas recombinantes utilizando una centrífuga, y se almacenaron a -80 °C hasta su uso. Ejemplo 3: Recuperación y replegamiento de análogos de insulina recombinante

Para convertir los análogos de insulina recombinantes expresados en el Ejemplo 2 en formas solubles, se rompieron las células, seguido del replegamiento. Se resuspendieron 100 g (peso en húmedo) del sedimento celular en 1 l de tampón de lisis (Tris-HCl 50 mM (pH 9,0), EDTA 1 mM (pH 8,0), NaCl 0,2 M y Triton X-100 al 0,5 %). Las células se rompieron utilizando un procesador de microfluidizador M-110EH (AC Technology Corp. Modelo M1475C) a una presión de funcionamiento de 15.000 psi. El lisado celular así obtenido se centrifugó a 7.000 rpm y 4 °C durante 20 minutos. El sobrenadante se desechó y el sedimento se resuspendió en 3 l de tampón de lavado (Triton X-100 al 0,5 % y Tris-HCl 50 mM (pH 8,0), NaCl 0,2 M, EDTA 1 mM). Después de la centrifugación a 7.000 rpm y 4 °C durante 20 minutos, el sedimento celular se resuspendió en agua destilada, seguido de centrifugación de la misma forma. El sedimento así obtenido se resuspendió en 400 ml de tampón (glicina 1 M, 3,78 g de cisteína-HCl, pH 10,6) y se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora. Para recuperar el análogo de insulina recombinante así resuspendido, se añadieron 400 ml de urea 8 M y se agitó a 40 °C durante 1 hora. Para el replegamiento de los análogos de insulina recombinantes solubilizados, se llevó a cabo la centrifugación a 7.000 rpm y 4 °C durante 30 minutos, y se recogió el sobrenadante. Se añadieron 2 l de agua destilada a la misma utilizando una bomba peristáltica a un caudal de 1000 ml/h mientras se agitaba a 4 °C durante 16 horas.

Ejemplo 4: Purificación por cromatografía de unión a cationes

La muestra replegada se cargó en una columna Source S (GE healthcare) equilibrada con tampón de citrato de sodio 20 mM (pH 2,0) que contenía etanol al 45 %, y a continuación se eluyeron las proteínas análogas a la insulina en 10 volúmenes de columna con un gradiente lineal de tampón de citrato de sodio 20 mM (pH 2,0) de 0 % a 100 % que contenía cloruro de potasio 0,5 M y etanol al 45 %.

Ejemplo 5: Tratamiento con tripsina y carboxipeptidasa B

Las sales se eliminaron de las muestras eluidas utilizando una columna de desalación, y el tampón se intercambió con un tampón (Tris-HCl 10 mM, pH 8,0). Con respecto a la proteína de muestra obtenida, se añadieron tripsina, correspondiente a una relación molar de 1000, y carboxipeptidasa B, correspondiente a una relación molar de 2000, y después se agitó a 16 °C durante 16 horas. Para finalizar la reacción, se utilizó citrato de sodio 1 M (pH 2,0) para bajar el pH a 3,5.

Ejemplo 6: Purificación por cromatografía de unión a cationes

La muestra así sometida a reacción se cargó en una columna Source S (GE healthcare) equilibrada con tampón de citrato de sodio 20 mM (pH 2,0) que contenía etanol al 45 %, y s continuación se eluyeron las proteínas análogas a la insulina en 10 volúmenes de columna con un gradiente lineal de tampón de citrato de sodio 20 mM (pH 2,0) de 0 % a 100 % que contenía cloruro de potasio 0,5 M y etanol al 45 %.

Ejemplo 7: Purificación por cromatografía de unión a aniones

Las sales se eliminaron de la muestra eluida utilizando una columna de desalación, y el tampón se intercambió con un tampón (Tris-HCl 10 mM, pH 7,5). Para aislar los análogos de insulina pura de la muestra obtenida en el Ejemplo 6, la muestra se cargó en una columna de intercambio aniónico (Source Q: GE Healthcare) equilibrada con tampón Tris 10 mM (pH 7,5), y la proteína análoga a la insulina se eluyó en 10 volúmenes de columna con un gradiente lineal de tampón Tris 10 mM (pH 7,5) de 0 % a 100 % que contenía cloruro de sodio 0,5 M.

La pureza del análogo de insulina así purificado se analizó mediante electroforesis de proteínas (SDS-PAGE) y cromatografía a alta presión (HPLC), y se identificaron modificaciones de aminoácidos mediante mapeo de péptidos y análisis del peso molecular de cada pico.

Como resultado de ello, se encontró que cada análogo de insulina tenía el cambio deseado en su secuencia aminoacídica.

Ejemplo 8: Preparación de análogo de insulina de acción prolongada

En este Ejemplo, se preparó un conjugado de acción prolongada de un análogo de secuencia (Glu en la posición 14 de la cadena A) de insulina nativa como análogo de insulina representativo.

Para pegilar el extremo N-terminal de la cadena beta del análogo de insulina utilizando PEG ALD23,4K (NOF, Japón), el análogo de insulina y el PEG se hicieron reaccionar a una relación molar de 1:4 con una concentración de análogo de insulina de 5 mg/ml a 4~8 °C durante aproximadamente 2 horas. En este sentido, la reacción se realizó en citrato de sodio 50 mM a pH 6,0 e isopropanol al 40-60 %. Se añadió cianoborohidruro de sodio 3,0 ~ 20,0 mM como agente reductor y se dejó reaccionar. La solución de reacción se purificó con columna SP-HP (GE Healthcare, EE. UU.) utilizando un tampón que contenía citrato de sodio (pH 3,0) y etanol, y un gradiente de concentración de KCl.

Para preparar un conjugado de análogo de insulina-fragmento Fc de inmunoglobulina, el análogo de insulina mono-PEGilado purificado y el fragmento Fc de inmunoglobulina se hicieron reaccionar en una relación molar de 1: 1 a 1:2 y a 25 °C durante 12 ~16 horas, con una concentración total de proteína de aproximadamente 20 mg/ml. En este sentido, las condiciones del tampón de reacción fueron HEPES 100 mM a pH 8,2, y se añadió al mismo cianoborohidruro de sodio 20 mM como agente reductor. Por lo tanto, se preparó un conjugado de análogo de insulina PEGilado en el extremo N-terminal del fragmento Fc.

Tras la finalización de la reacción, la solución de reacción se cargó en la columna Q HP (GE Healthcare, EE. UU.) con tampón Tris-HCl (pH 7,5) y con el gradiente de concentración de NaCl para realizar la purificación primaria del conjugado de análogo de insulina-fragmento Fc de inmunoglobulina.

A continuación se utilizó Source 15ISO (GE Healthcare, EE. UU.) como columna secundaria para obtener el conjugado de análogo de insulina-fragmento Fc de inmunoglobulina. En este sentido, el conjugado de análogo de insulinafragmento Fc de inmunoglobulina se eluyó utilizando un gradiente de concentración de sulfato de amonio que contenía Tris-HCl (pH 7,5).

Ejemplo 9: Preparación de conjugado de exendina-4 de acción prolongada

Se hizo reaccionar 3,4k PropionALD (2) PEG con la lisina (Lys) de CA exendina-4 utilizando imidazo-acetil exendina-4 (CA exendina-4, AP, EE.UU.). Entre los dos picos de isómeros de Lys, se utilizó el último pico de isómero (isómero posicional de Lys27), que tiene más reacción y que es fácilmente distinguible de los picos del isómero N-terminal, para la reacción de acoplamiento.

La reacción se llevó a cabo a una relación molar de péptido:Fc de inmunoglobulina de 1:8, y una concentración total de proteínas de 60 / a 4 °C durante 20 horas. La reacción se llevó a cabo en una solución de K-P 100 mM (pH 6,0), y se añadió SCB 20 mM como agente reductor. La solución de reacción de acoplamiento se purificó mediante dos columnas de purificación. En primer lugar, se usó la SOURCE Q (XK 16 ml, Amersham Biosciences) para eliminar una gran cantidad de Fc de inmunoglobulina que no había participado en la reacción de acoplamiento. Utilizando Tris 20 mM (pH 7,5) y NaCl 1 M con gradientes de sal, se eluyó primero el Fc de inmunoglobulina que tenía una fuerza de unión relativamente débil, y luego se eluyó la Fc de exendina-4-inmunoglobulina inmediatamente a continuación. A través de este primer proceso de purificación, la Fc de inmunoglobulina se eliminó hasta cierto punto, pero dado que la Fc de inmunoglobulina y la Fc de exendina-4-inmunoglobulina tienen un poder de unión similar entre sí en la columna de intercambio iónico, no pudieron separarse completamente entre sí. En consecuencia, la purificación secundaria se realizó basándose en la diferencia de hidrofobicidad entre los dos materiales. Utilizando Tris 20 mM (pH 7,5) y sulfato de amonio 1,5 M en SOURCE ISO (HR 16 ml, Amersham Biosciences), se acoplaron las primeras muestras purificadas, y la mezcla de muestra se eluyó mientras se reducía gradualmente la concentración de sulfato de amonio. En la columna HIC, la Fc de inmunoglobulina con poder de unión débil se eluyó primero, y después la muestra de Fc de exendina-4-inmunoglobulina con fuerte poder de unión se eluyó más tarde. Dado que tienen una hidrofobicidad prominentemente diferente, pueden separarse más fácilmente entre sí que en la columna de intercambio iónico. Columna: SOURCE Q (XK 16, Amersham Biosciences)

Caudal: 2,0 /min

Gradiente: A0 ->25 % 70 min B (A: Tris 20 mM pH 7,5, B: A+ NaCl 1 M )

Columna: SOURCE ISO (HR 16, Amersham Biosciences)

Caudal: 7,0 / min

Gradiente: B 100→0 % 60 min B (A: Tris 20 mM pH 7,5, B: A sulfato amónico 1,5 M)

Ejemplo 10: Eficacia de control de la glucosa en sangre y cambios en el peso corporal (Δpeso corporal) en ratones con diabetes tipo 2 mediante administración combinada de un conjugado análogo de insulina de acción prolongada y conjugado de exendina-4 de acción prolongada

Para probar la eficacia in vivo mediante administración de las composiciones que incluyen el conjugado de análogo de insulina de acción prolongada y el conjugado de exendina-4 de acción prolongada preparados en los Ejemplos 8 y 9, o la administración combinada del conjugado de análogo de insulina de acción prolongada y el conjugado de exendina-4 de acción prolongada, se utilizaron ratones db/db con diabetes tipo 2. Dado que los ratones db/db (BKS,Cg-+Lepr^db/+ Lepr^db/OlaHsd) muestran síntomas de diabetes similares a los del ser humano por la eliminación del receptor de leptina, se utilizaron estos en este ejemplo.

Se tomaron 1-2 gotas de sangre de la vena caudal de un ratón db/db de 8 semanas de edad utilizando una jeringa de 26 G, y se midió el nivel de glucosa en sangre utilizando un glucómetro (OneTouch Ultra, LifeScan, Inc., EE. La inducción de la diabetes se determinó por la glucosa en sangre medida (350-600 /). Los ratones con diabetes inducida se dividieron en cinco grupos G1, G2, G3, G4 y G5, teniendo cada grupo cinco o seis ratones.

Los grupos se dividieron en un grupo control no tratado (vehículo), un grupo tratado con conjugado de análogo de insulina de acción prolongada (8,8 nmol/kg), un grupo tratado con conjugado de exendina-4 de acción prolongada (0,36 nmol/kg), un grupo tratado con conjugado de análogo de insulina de acción prolongada (2,2 nmol/kg) y conjugado de exendina-4 de acción prolongada (0,36 nmol/kg), y un grupo tratado con conjugado de análogo de insulina de acción prolongada (8,8 nmol/kg) y conjugado de exendina-4 de acción prolongada (0,36 nmol/kg). Tras la administración repetida de los materiales de ensayo anteriores durante 5 semanas, se midieron los niveles de hemoglobina glicosilada (HbA1c) en cada grupo. La hemoglobina glicosilada se forma normalmente en los eritrocitos por la reacción de la glucosa con la hemoglobina. Cuando los niveles de glucosa en sangre se mantienen altos, los niveles de hemoglobina glicosilada también aumentan. El nivel de hemoglobina glicosilada de ratón refleja un nivel medio de glucosa en sangre durante 4~5 semanas, y por lo tanto es útil en la medición de la capacidad para controlar el nivel de glucosa en sangre del material de ensayo. Además, se calcularon los cambios en peso corporal (△BW) del animal de ensayo antes del tratamiento con el fármaco y en el último día del experimento.

Como resultado de ello, la administración combinada del conjugado de análogo de insulina de acción prolongada y del conjugado de exendina-4 de acción prolongada mostró una reducción en el nivel de hemoglobina glicosilada (Figura 1), que es una mejora notable, en comparación con la administración única del conjugado de análogo de insulina de acción prolongada o del conjugado de exendina-4 de acción prolongada. Además, aunque la dosis de administración del conjugado de análogo de insulina se redujo a 1/4, se mantuvo el efecto de la administración de combinación.

Los resultados de medición de Δpeso corporal mostraron que la administración combinada del conjugado de análogo de insulina de acción prolongada y el conjugado de exendina-4 de acción prolongada mostró un efecto de alivio del aumento de peso, en comparación con la administración única de conjugado de análogo de insulina de acción prolongada (Figura 2). Además, cuando la dosis de administración del conjugado de análogo de insulina de acción prolongada se redujo a 1/4, el efecto de alivio del aumento de peso se incrementó notablemente.

Estos resultados muestran que la administración combinada del conjugado de análogo de insulina de acción prolongada y el conjugado de exendina-4 de acción prolongada de la presente descripción presenta un excelente efecto de control del nivel de glucosa en sangre, en comparación con la administración única del mismo. Además, se mantuvo el efecto de controlar el nivel de glucosa en sangre mediante la administración combinada de los mismos, aunque se redujo la dosis de administración del conjugado de análogo de insulina. Además, a medida que la dosis de administración del conjugado de análogo de insulina de acción prolongada se redujo a 1/4, el aumento de peso se redujo notablemente, indicando que la administración combinada del conjugado de análogo de insulina de acción prolongada y el conjugado de exendina-4 de acción prolongada reduce notablemente el riesgo de hipoglucemia, así como el aumento de peso, debido a la reducción en la dosis de insulina.

Ejemplo 11: Eficacia de mantener la masa de células beta en ratones con diabetes tipo 2 por administración combinada de conjugado de análogo de insulina de acción prolongada y conjugado de exendina-4 de acción prolongada Para probar la eficacia in vivo mediante la administración de la composición que incluye el conjugado de análogo de insulina de acción prolongada (conjugado de derivado de insulina de acción prolongada) y el conjugado de exendina-4 de acción prolongada (un ejemplo del insulinotrópico de acción prolongada) o mediante la administración combinada del conjugado de análogo de insulina de acción prolongada y el conjugado de exendina-4 de acción prolongada, se utilizaron ratones db/db con diabetes tipo 2.

Como análogo de insulina del conjugado derivado de insulina de acción prolongada utilizado en este ejemplo, se utilizó el análogo 8(A¹⁴Y → E) de la Tabla 1 y como péptido insulinotrópico de acción prolongada se utilizó el conjugado de exendina-4 de acción prolongada que incluye la imidazo-acetil exendina-4 (CA Exendina-4). La lisina de la exendina-4 se modificó con PEG, y la exendina-4 modificada con PEG se unió a una Fc de inmunoglobulina para producir un conjugado de exendina-4 de acción prolongada. En particular, la CA exendina-4 y el análogo de insulina 8 se hicieron reaccionar en una relación molar de 1,01 a 1: 50 para producir un conjugado del mismo.

Dado que el ratón db/db (ratón BKS.Cg-+Lepr^db/+ Lepr^db/OlaHsd) muestra síntomas de diabetes similares a los de los seres humanos por la eliminación del receptor de leptina, se utilizó el ratón en este ejemplo.

Se tomaron 1-2 gotas de sangre de la vena de la cola de un ratón db/db de 12 semanas de edad utilizando una jeringa 26G, y se midió el nivel de glucosa en sangre utilizando un glucómetro (OneTouch Ultra, LifeScan, Inc., EE.UU.) La inducción de la diabetes se determinó por la glucosa en sangre medida (el intervalo normal en un no diabético era de aproximadamente 100~150 mg/dl, y se seleccionaron ratones con un nivel de glucosa en sangre de más de 350 mg/dl y se utilizaron para la precisión del Ejemplo). Los ratones inducidos por diabetes se dividieron en siete grupos G1, G2, G3, G4, G5, G6 y G7, teniendo cada grupo siete u ocho ratones.

Los grupos se dividieron en un grupo de control no tratado (vehículo), conjugados de análogo de insulina de acción prolongada tratados con dos grupos por dosis (4,2 nmol/kg, 8,4 nmol/kg), un grupo tratado con conjugado de exendina-4 de acción prolongada (0,36 nmol/kg), un grupo de administración de combinación de un conjugado de análogo de insulina de acción prolongada (4,2 nmol/kg) y conjugado de exendina-4 de acción prolongada (0,36 nmol/kg), y un grupo de administración de combinación de conjugado de análogo de insulina de acción prolongada (8,4 nmol/kg) y un grupo tratado con conjugado de exendina-4 de acción prolongada (0,36 nmol/kg).

Tras la administración repetida de los materiales de ensayo anteriores a una dosis descrita anteriormente a intervalos de dos días durante 12 semanas, se midieron los niveles de hemoglobina glicosilada (HbA1c) en cada grupo. La hemoglobina glicosilada es una forma de hemoglobina, que normalmente está presente en los eritrocitos, a la que se une una glucosa. Cuando los niveles de glucosa en sangre se mantienen altos, los niveles de hemoglobina glicosilada también aumentan. El nivel de hemoglobina glicosilada de ratón refleja un nivel medio de glucosa en sangre durante 4~5 semanas, y por lo tanto es útil en la medición de la capacidad para controlar el nivel de glucosa en sangre de los materiales de ensayo. Después de 12 semanas de administración repetida del fármaco, se recogió sangre de la vena orbital de los ratones y se midió la concentración de triglicéridos en suero del suero recogido. Después de la autopsia de cada sujeto, se tomó el páncreas para medir la masa de células beta.

Como resultado de ello, la administración combinada del conjugado de análogo de insulina de acción prolongada y el conjugado de exendina-4 de acción prolongada mostró una reducción en el nivel de hemoglobina glicosilada (Figura 5), que es una mejora notable, en comparación con la administración única de un conjugado de análogo de insulina de acción prolongada o un conjugado de exendina-4 de acción prolongada.

Se midió la concentración de triglicérido en suero, y los resultados mostraron que, en un grupo de administración de combinación de un conjugado de análogo de insulina de acción prolongada y un conjugado de exendina-4 de acción prolongada, la concentración de triglicérido se redujo de forma dependiente de dosis (Figura 4).

El resultado de una comparación de la masa de células beta de cada grupo tratado con fármaco confirmó que un grupo con un solo tratamiento de un conjugado de análogo de insulina de acción prolongada, un grupo tratado único de un conjugado de exendina-4 de acción prolongada y un grupo de administración de combinación de los dos conjugados, mostraron una mayor masa de células beta en comparación con el grupo de control (Figura 3). Además, en comparación con un grupo con un solo tratamiento de un conjugado de análogo de insulina de acción prolongada o un conjugado de exendina-4 de acción prolongada, el grupo de administración combinada de los dos fármacos mostró efectos sinérgicos. A tenor de estos resultados, la lipotoxicidad y la glucotoxicidad se redujeron mediante la administración combinada de un conjugado de análogo de insulina de acción prolongada y un conjugado de exendina-4 de acción prolongada.

Estos resultados muestran que la administración combinada del conjugado de análogo de insulina de acción prolongada y el conjugado de exendina-4 de acción prolongada de la presente descripción presenta un excelente efecto de control del nivel de glucosa en sangre y de mejora de los lípidos en sangre, en comparación con la administración única de los mismos. Los resultados sugieren que la administración combinada del conjugado de análogo de insulina de acción prolongada y el conjugado de exendina-4, que es un péptido insulinotrópico de acción prolongada, puede retener la masa de células beta e inhibir la progresión de la diabetes basándose en la mejora de la lipotoxicidad y glucotoxicidad. Además, los resultados sugieren que una composición compuesta del conjugado de análogo de insulina de acción prolongada y el conjugado de péptido insulinotrópico de acción prolongada según la presente descripción, o la administración combinada de los dos conjugados puede reducir significativamente la lipotoxicidad asociada a un aumento en los niveles de lípidos, y la glucotoxicidad asociada a un aumento en los niveles de glucosa en sangre debido a un control insuficiente de la glucosa en sangre, que son efectos secundarios que se producen en algunos pacientes diabéticos con una sola administración de insulina o péptido insulinotrópico, y además la progresión de la diabetes puede retrasarse drásticamente a través de la prevención de la anormalidad en la función de las células beta pancreáticas y/o el aumento en la masa de células beta pancreáticas, llevando por tanto a la mejora, tratamiento, prevención de la diabetes y mejora del pronóstico de diabetes.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una composición farmacéutica para su uso en un método de prevención o tratamiento de la diabetes mellitus, que comprende:

un conjugado de análogo de insulina de acción prolongada en el que un análogo de insulina está unido a una región Fc de inmunoglobulina a través de un enlazador polimérico no peptidílico; y un conjugado de péptido insulinotrópico de acción prolongada en el que un péptido insulinotrópico está unido a una región Fc de inmunoglobulina a través de un enlazador polimérico no peptidílico, en donde el análogo de insulina está caracterizado por la sustitución del aminoácido en la posición 14 de la cadena A por ácido glutámico, y

en donde el péptido insulinotrópico es una imidazo-acetil exendina-4 (CA Exdina-4).

2. Una composición farmacéutica para su uso en la reducción de uno o más efectos secundarios de las células beta pancreáticas seleccionados del grupo que consiste en lipotoxicidad, glucotoxicidad, anormalidad en la función de las células beta pancreáticas y reducción de la masa de células beta pancreáticas en pacientes diabéticos, que comprende:

en donde el péptido insulinotrópico es una imidazo-acetil exendina-4 (CA Exdina-4), y en donde opcionalmente la composición inhibe la progresión de la diabetes o en donde la composición mejora el pronóstico de diabetes de un paciente que padezca diabetes mellitus.

3. La composición para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en donde el conjugado de análogo de insulina de acción prolongada está caracterizado por que el análogo de insulina está unido al extremo N-terminal de la región Fc de inmunoglobulina a través de un enlazador de polímero no peptidílico.

4. La composición para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el enlazador polimérico no peptidílico es un polietilenglicol.

5. La composición para su uso según la reivindicación 1 a 3, en donde el conjugado análogo de insulina de acción prolongada está unido a una región Fc de inmunoglobulina a través de un polietilenglicol como un enlazador polimérico no peptidílico, y el péptido insulinotrópico de acción prolongada está unido al extremo N-terminal de una región Fc de inmunoglobulina a través de un polietilenglicol como un enlazador polimérico no peptidílico.

6. La composición para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el análogo de insulina o el péptido insulinotrópico está unido a la región Fc de inmunoglobulina a través de un enlazador de polímero no peptidílico, en donde el enlazador de polímero no peptidílico se selecciona del grupo que consiste en polietilenglicol, polipropilenglicol, copolímero de etilenglicol-propilenglicol, poliol polioxietilado, alcohol polivinílico, polisacárido, dextrano, polivinil etil éter, un polímero biodegradable, un polímero lipídico, quitina, ácido hialurónico y combinaciones de los mismos, y opcionalmente, en donde (a) la región Fc de inmunoglobulina está aglicosilada;

en donde la región Fc de inmunoglobulina está compuesta de uno a cuatro dominios seleccionados del grupo que consiste en los dominios CH1, CH2, CH3 y CH4;

en donde la región Fc de inmunoglobulina incluye una región bisagra;

en donde la región Fc de inmunoglobulina es una región Fc derivada de IgG, IgA, IgD, IgE o IgM; en donde la región Fc de inmunoglobulina es híbrida de dominios de distintos orígenes seleccionados del grupo que consiste en IgG, IgA, IgD, IgE e IgM; o

en donde la región Fc de inmunoglobulina es un dímero o un multímero compuesto por inmunoglobulinas de cadena sencilla que consisten en dominios del mismo origen; o (b) cada extremo del enlazador de polímero no peptídico se une respectivamente a la región Fc de inmunoglobulina y a un grupo amina o tiol del análogo de insulina o del péptido insulinotrópico.

7. La composición para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que comprende además un vehículo farmacéuticamente aceptable.

8. La composición para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde el conjugado de insulina de acción prolongada y el conjugado de péptido insulinotrópico de acción prolongada se administran de forma simultánea, secuencial o inversa.

9. Un método para preparar una composición para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, que comprende formular el conjugado análogo de insulina de acción prolongada y el conjugado de péptido insulinotrópico de acción prolongada con un vehículo farmacéuticamente aceptable.