ES2868351T3 - Conjugados de análogos de insulina y usos de los mismos - Google Patents

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Abstract

Un conjugado de análogo de insulina, en el que (i) un análogo de insulina que tiene un título de insulina reducida en comparación con la forma nativa, en el que un aminoácido en la cadena B de insulina se modifica sustituyendo un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en el aminoácido 24 y el aminoácido 25 de la cadena B con alanina; está enlazado con (ii) un material biocompatible, en el que el material biocompatible es una región Fc de inmunoglobulina.

Description

DESCRIPCIÓN
Conjugados de análogos de insulina y usos de los mismos
[Campo técnico]
La presente divulgación se refiere a un análogo de insulina que tiene un título de insulina reducida y una afinidad de unión al receptor de insulina reducida en comparación con la forma nativa con el fin de aumentar la vida media en la sangre de la insulina, un conjugado preparado uniendo el análogo de insulina y un vehículo, una formulación de acción prolongada que incluye el conjugado y un procedimiento para preparar el conjugado.
[Técnica antecedente]
Se conoce que las proteínas in vivo se eliminan por diversas vías, como la degradación por enzimas proteolíticas en la sangre, la excreción a través del riñón o la eliminación por receptores. De este modo, se han realizado muchos esfuerzos para mejorar la eficacia terapéutica evitando los mecanismos de eliminación de proteínas y aumentando la vida media de las proteínas fisiológicamente activas.
Por otro lado, la insulina es una hormona secretada por el páncreas del cuerpo humano, que regula los niveles de la glucosa en la sangre y desempeña un papel en el mantenimiento de los niveles normales de la glucosa en la sangre mientras transporta el exceso de glucosa en la sangre a las células para proporcionar energía a las células. Sin embargo, en los pacientes diabéticos, la insulina no funciona correctamente debido a la falta de insulina, la resistencia a la insulina y la pérdida de la función de las células beta, y de este modo la glucosa en la sangre no puede utilizarse como fuente de energía y el nivel de la glucosa en la sangre es elevado, conduciendo a la hiperglucemia. Eventualmente, se produce la excreción urinaria, lo que contribuye al desarrollo de diversas complicaciones. Por lo tanto, la terapia con la insulina es esencial para los pacientes con secreción anormal de la insulina (Tipo I) o la resistencia a la insulina (Tipo II), y los niveles de la glucosa en la sangre pueden regularse normalmente mediante la administración de la insulina. Sin embargo, al igual que otras proteínas y hormonas peptídicas, la insulina tiene una vida media in vivo muy corta y, de este modo, tiene la desventaja de la administración repetida. Dicha administración frecuente causa dolor intenso y molestias a los pacientes. Por esta razón, para mejorar la calidad de vida aumentando la vida media in vivo de la proteína y reduciendo la frecuencia de administración, se han realizado muchos estudios sobre la formulación de las proteínas y la conjugación química (conjugado de ácido graso, conjugado de polímero de polietileno). La insulina de acción prolongada comercialmente disponible incluye la insulina glargina fabricada por Sanofi Aventis (lantus, que dura aproximadamente 20-22 horas), y la insulina detemir (levemir, que dura aproximadamente 18-22 horas) y tresiba (degludec, que dura aproximadamente 40 horas) fabricado por Novo Nordisk. Estas formulaciones de la insulina de acción prolongada no producen un pico en la concentración de la insulina en la sangre y, de este modo, son adecuadas como insulina basal. Sin embargo, debido a que estas formulaciones no tienen una vida media suficientemente larga, la desventaja de una o dos inyecciones por día aún permanece. Como consecuencia, existe una limitación para lograr el objetivo previsto de que la frecuencia de administración se reduzca notablemente para mejorar la comodidad de los pacientes diabéticos que necesitan una administración a largo plazo.
La investigación previa informó un procedimiento específico de eliminación de la insulina in vivo; el 50% o más de la insulina se elimina en el riñón y el resto se elimina a través un procedimiento de eliminación mediada por receptor (RMC) en sitios objetivo como el músculo, la grasa, el hígado, etc.
En este sentido, muchos estudios, incluidos J Pharmacol Exp Ther (1998) 286: 959, Diabetes Care (1990) 13: 923, Diabetes (1990) 39: 1033, han informado que la actividad in vitro se reduce para evitar la RMC de la insulina, aumentando de este modo el nivel en sangre. Sin embargo, estos análogos de insulina que tienen una afinidad de unión al receptor reducida no pueden evitar la eliminación renal, que es un mecanismo de eliminación principal, aunque la RMC se reduce. Como consecuencia, ha existido un límite para aumentar notablemente la vida media de la sangre.
Kristensen y otros, J. Biol. Chem., 272 (20), 12978 - 12983 (1997) se refiere a la "mutagénesis de análisis de la alanina de la insulina", y en particular al hallazgo de que "la insulina B20Ala retiene una unión de alta afinidad al receptor."
El documento WO 2011/122921 se refiere a "un conjugado de insulina que tiene una duración y estabilidad in vivo mejoradas, que se prepara uniendo covalentemente la insulina con una región Fc de inmunoglobulina a través de un polímero no peptidílico."
El documento KR10-2011-0134209 se refiere a "un complejo análogo de cadena simple de la insulina que usa un fragmento de la inmunoglobulina."
Hinds & Kim, Adv. Drug Delivery Reviews, 54, 505-530 (2002) se refiere a los "efectos de la conjugación de PEG sobre las propiedades de la insulina".
Thibaudeau y otros, Bioconjugate Chem., 16 (4), 1000-1008 (2005) se refiere a la "síntesis y evaluación de conjugados de insulina-albúmina de suero humano".
Baudys y otros, Bioconjugate Chem., 9 (2), 176-183 (1998) es una investigación sobre los medios para "extender la acción de la insulina in vivo por conjugación con carboximetil dextrano".
Con estos antecedentes, los autores actuales han hecho muchos esfuerzos para aumentar la vida media en la sangre de la insulina. Como resultado, descubrieron que un nuevo análogo de insulina que no tiene una secuencia de la insulina nativa pero una secuencia de la insulina no nativa, muestra un título reducido in vitro y una afinidad de unión al receptor de insulina reducida, y por lo tanto, su aclaramiento renal puede reducirse. Ellos descubrieron también que la vida media en sangre de la insulina puede aumentarse además al vincular el análogo de insulina con un fragmento Fc de inmunoglobulina como un vehículo representativo eficaz para mejorar la vida media.
[Divulgación]
[Problema técnico]
Un objeto de la presente divulgación es proporcionar un análogo de insulina que esté preparado para tener un título reducido in vitro con el fin de prolongar la vida media in vivo de la insulina, y un conjugado preparado uniendo un vehículo al mismo.
En concreto, un objetivo de la presente divulgación es proporcionar un análogo de insulina que tenga un título de insulina reducida, en comparación con la forma nativa.
Otro objetivo de la presente divulgación es proporcionar un conjugado del análogo de insulina que se prepara uniendo el análogo de insulina al vehículo.
Aún otro objetivo de la presente divulgación es proporcionar una formulación de insulina de acción prolongada que incluye el conjugado de análogo de insulina.
Aún otro objetivo de la presente divulgación es proporcionar un procedimiento para preparar el conjugado de análogo de insulina.
Aún otro objetivo de la presente divulgación es proporcionar un procedimiento para aumentar la vida media in vivo mediante el uso del análogo de insulina o del conjugado de análogo de insulina preparado uniendo el análogo de insulina al vehículo.
Un procedimiento divulgado además para tratar enfermedades relacionadas con la insulina, que incluye la etapa de administrar el análogo de insulina o el conjugado de análogo de insulina a un sujeto que necesite el mismo.
[Solución Técnica]
La presente invención se define en las reivindicaciones. La presente divulgación describe además materias relacionadas como se establece a continuación.
En un caso para lograr los objetivos anteriores, la presente divulgación proporciona un análogo de insulina que tiene un título de insulina reducida, en comparación con la forma nativa, en la que se modifica un aminoácido de cadena B o cadena A.
En un ejemplo específico, la presente divulgación proporciona un análogo de insulina que tiene una afinidad de unión al receptor de insulina reducida.
En otro ejemplo específico, la presente divulgación proporciona un análogo de insulina no nativo, en el que un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en el 8vo aminoácido, el 23er aminoácido, el 24to aminoácido y el 25to aminoácido de la cadena B y el 1eiaminoácido, 2do aminoácido y el 19no aminoácido de la cadena A, está sustituido con alanina, o en el que 14to aminoácido de la cadena A se sustituye con ácido glutámico o asparagina en el análogo de insulina de acuerdo con la presente divulgación.
Aún en otro ejemplo específico, la presente divulgación proporciona un análogo de insulina, en el que el análogo de insulina de acuerdo con la presente divulgación se selecciona del grupo que consiste en las SEQ ID NO. 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34 y 36.
En otro caso, la presente divulgación proporciona un conjugado de análogo de insulina que se prepara uniendo el análogo de insulina descrito anteriormente a un vehículo capaz de prolongar la vida media.
En un ejemplo específico, la presente divulgación proporciona un conjugado de análogo de insulina, en el que el conjugado de análogo de insulina se prepara uniendo (i) el análogo de insulina descrito anteriormente y (ii) una región Fc de inmunoglobulina a través de (iii) un enlazador peptídico o un enlazador no peptidil seleccionado del grupo que consiste de polietilenglicol, polipropilenglicol, copolímeros de etilenglicol propilenglicol, polioles polioxietilados, alcoholes polivinil, polisacáridos, dextrano, éter etil polivinilo, polímeros biodegradables, polímeros lipídicos, quitinas, ácido hialurónico y combinaciones de los mismos.
Aún en otro caso, la presente divulgación proporciona una formulación de insulina de acción prolongada que incluye el conjugado de análogo de insulina descrito anteriormente, en el que aumentan la duración y la estabilidad in vivo. En un ejemplo específico, la presente divulgación proporciona una formulación de acción prolongada que se usa para el tratamiento de la diabetes.
En otro ejemplo, la presente divulgación proporciona un procedimiento para preparar el conjugado de análogo de insulina descrito anteriormente.
Aún en otro ejemplo específico, la presente divulgación proporciona un procedimiento para aumentar la vida media in vivo mediante el uso del análogo de insulina o del conjugado de análogo de insulina que se prepara uniendo el análogo de insulina y el vehículo.
Un procedimiento divulgado además para tratar enfermedades relacionadas con la insulina, que incluye la etapa de administrar el análogo de insulina o el conjugado de análogo de insulina a un sujeto que necesite el mismo.
[Efectos ventajosos]
Un análogo de insulina no nativa de la presente divulgación tiene un título de insulina reducida y una afinidad de unión al receptor de insulina reducida, en comparación con la forma nativa, y de este modo evita mecanismos de eliminación in vivo. Por lo tanto, el análogo de insulina ha aumentado la vida media en sangre in vivo, y un conjugado de análogo de insulina-Fc de inmunoglobulina preparado mediante el uso del mismo se muestra una vida media en sangre notablemente aumentada, mejorando de este modo, la conveniencia de los pacientes que necesitan la administración de la insulina.
[Descripción de los Dibujos]
La Figura 1 muestra el resultado del análisis de la pureza de un análogo de insulina por electroforesis de proteínas, que es el resultado del análogo de insulina representativo, Análogo núm. 7 (Carril 1: marcador de tamaño, Carril 2: insulina nativa, Carril 3: análogo de insulina (núm. 7);
La Figura 2 muestra el resultado del análisis de la pureza de un análogo de insulina por cromatografía de alta presión, que es el resultado del análogo de insulina representativo, Análogo núm. 7 ((A) RP-HPLC, (B) SE-HPLC);
La Figura 3 muestra el resultado del mapeo peptídico de un análogo de insulina, que es el resultado del análogo de insulina representativo, Análogo núm. 7 ((A) insulina nativa, (B) análogo de insulina (núm. 7));
La Figura 4 muestra el resultado del análisis de la pureza de un conjugado de análogo de insulina-Fc de inmunoglobulina por electroforesis de proteínas, que es el resultado del análogo de insulina representativo, Análogo núm. 7 (Carril 1: marcador de tamaño, Carril 2: conjugado de análogo de insulina (núm. 7)-Fc de inmunoglobulina);
La Figura 5 muestra el resultado del análisis de la pureza de un conjugado de análogo de insulina-Fc de inmunoglobulina por cromatografía de alta presión, que es el resultado del análogo de insulina representativo, Análogo núm. 7 ((A) RP-HPLC, (B) SE-HPLC, (C) IE-HPLC); y
La Figura 6 muestra el resultado del análisis de la farmacocinética del conjugado de insulina nativa-Fc de inmunoglobulina y del conjugado de análogo de insulina-Fc de inmunoglobulina en ratas normales, que es el resultado del análogo de insulina representativo, Análogo núm. 7 (o: conjugado de insulina nativa-Fc de inmunoglobulina (21,7 nmol/kg), •: conjugado de insulina nativa-Fc de inmunoglobulina (65,1 nmol/kg), □: conjugado de análogo de insulina-Fc de inmunoglobulina (21,7 nmol/kg), ■: conjugado de análogo de insulina-Fc de inmunoglobulina (65,1 nmol/kg). (A) conjugado de insulina nativa-Fc de inmunoglobulina y conjugado de análogo de insulina (núm. 7)-Fc de inmunoglobulina, (B) conjugado de insulina nativa-Fc de inmunoglobulina y conjugado de análogo de insulina (núm. 8)-Fc de inmunoglobulina, (C) conjugado de insulina nativa-Fc de inmunoglobulina y conjugado de análogo de insulina (núm. 9)-Fc de inmunoglobulina.
[Mejor Modo]
La presente divulgación se refiere a un análogo de insulina que tiene un título in vitro reducido. Este análogo de insulina se caracteriza porque tiene la secuencia de la insulina no nativa y, por lo tanto, tiene una afinidad de unión al receptor de insulina reducida, en comparación con la insulina nativa, y en consecuencia, la eliminación mediada por el receptor se reduce notablemente por una constante de disociación aumentada, lo que resulta en una aumento de la vida media en sangre.
Como se usa en la presente memoria, el término "análogo de insulina" incluye diversos análogos que tienen un título de insulina reducida, en comparación con la forma nativa.
El análogo de insulina puede ser un análogo de insulina que tiene un título de insulina reducida, en comparación con la forma nativa, en la que se modifica un aminoácido de cadena B o de la cadena A de la insulina. Las secuencias de aminoácidos de la insulina nativa son las siguientes.
- cadena A:
Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn (SEQ ID NO. 37) - cadena B:
Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr (SEQ ID NO. 38)
El análogo de insulina usado en los ejemplos de la presente divulgación es un análogo de insulina preparado por una técnica de recombinación genética. Sin embargo, la presente divulgación no se limita a la misma, sino que incluye todas las insulinas que tienen un título in vitro reducido. Preferentemente, el análogo de insulina puede incluir insulinas invertidas, variantes de la insulina, fragmentos de insulina o similares, y el procedimiento de preparación puede incluir un procedimiento en fase sólida, así como una técnica de recombinación genética, pero no se limita a los mismos.
El análogo de insulina es un péptido que retiene una función de control de la glucosa en la sangre en el cuerpo, que es idéntico al de la insulina, y este péptido incluye agonistas de la insulina, derivados, fragmentos, variantes de los mismos o similares.
El agonista de la insulina de la presente divulgación se refiere a una sustancia que está unida al receptor de insulina in vivo para exhibir las mismas actividades biológicas que la insulina, independientemente de la estructura de la insulina.
El análogo de insulina de la presente divulgación indica un péptido que muestra una homología de secuencia de al menos 80% con una secuencia de aminoácidos en comparación con la cadena A o la cadena B de la insulina nativa, tiene algunos grupos de residuos de aminoácidos alterados en forma de sustitución química (por ejemplo, alfametilación, alfa-hidroxilación), eliminación (por ejemplo, desaminación) o modificación (por ejemplo, N-metilación), y tiene la función de controlar la glucosa en sangre en el cuerpo. Con respecto a los objetivos de la presente divulgación, el análogo de insulina es un análogo de insulina que tiene una afinidad de unión al receptor de insulina reducida, en comparación con la forma nativa, y los análogos de insulina que tienen un título de insulina reducida en comparación con la forma nativa se incluyen sin limitación.
Mientras el análogo de insulina sea capaz de exhibir baja internalización mediada por el receptor o eliminación mediada por el receptor, su tipo y tamaño no están particularmente limitados. Un análogo de insulina, cuyo mecanismo principal de eliminación in vivo es la internalización mediada por el receptor o la eliminación mediada por el receptor, es adecuado para los objetivos de la presente divulgación.
El fragmento de la insulina de la presente divulgación indica el tipo de insulina en la que se añaden o eliminan uno o más aminoácidos, y los aminoácidos añadidos pueden ser aminoácidos no nativos (por ejemplo, aminoácidos de tipo D). Dichos fragmentos de la insulina conservan la función de controlar la glucosa en sangre en el cuerpo.
La variante de la insulina de la presente divulgación indica un péptido que difiere de la insulina en una o más secuencias de aminoácidos, y conserva la función de controlar la glucosa en sangre en el cuerpo.
Los procedimientos respectivos para la preparación de agonistas de la insulina, derivados, fragmentos y variantes de la presente divulgación pueden usarse independientemente o en combinación. En la presente divulgación se incluyen, por ejemplo, los péptidos de los cuales una o más secuencias de aminoácidos difieren de las de la insulina y que tienen desaminación en el residuo de aminoácido amino terminal y tienen además la función de controlar la glucosa en sangre en el cuerpo.
En concreto, el análogo de insulina puede ser un análogo de insulina en el que uno o más aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en el 8vo aminoácido, 23er aminoácido, 24to aminoácido y el 25to aminoácido de la cadena B y el 1er aminoácido, 2do aminoácido, 14to aminoácido y el 19no aminoácido de la cadena A están sustituidos con otros aminoácidos, y preferentemente, en el que uno o más aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en el 8vo aminoácido, 23er aminoácido, 24to aminoácido y el 25to aminoácido de la cadena B y el 1er aminoácido, 2do aminoácido y el 19no aminoácido de la cadena A están sustituidos con alanina o en los que 14to aminoácido de la cadena A está sustituido con ácido glutámico o asparagina. Además, el análogo de insulina puede seleccionarse del grupo que consiste en la SEQ ID NO. 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34 y 36, pero puede incluir cualquier análogo de insulina que tenga una afinidad de unión al receptor de insulina reducida sin limitación.
De acuerdo con un ejemplo de la presente divulgación, los análogos de insulina de las SEQ ID NO. 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34 y 36, particularmente, se encontró que los análogos de insulina representativos, 7, 8 y 9 (SEQ ID NO.
32, 34 y 36) tienen una afinidad de unión al receptor de insulina reducida in vitro, en comparación con la forma nativa (Tabla 4).
En otro caso, la presente divulgación proporciona un conjugado de análogo de insulina que se prepara uniendo el análogo de insulina y un vehículo.
Como se usa en la presente memoria, el término "vehículo" indica una sustancia capaz de aumentar la vida media in vivo del análogo de insulina unido. El análogo de insulina de acuerdo con la presente divulgación se caracteriza porque tiene una afinidad de unión al receptor de insulina notablemente reducida, en comparación con la forma nativa, y evita la eliminación mediada por el receptor o la eliminación renal. Por lo tanto, si un vehículo que se conoce que aumenta la vida media in vivo cuando se une a los diversos polipéptidos fisiológicamente activos conocidos se une con el análogo de insulina, es evidente que la vida media in vivo puede mejorarse y el conjugado resultante puede usarse como una formulación de acción prolongada.
Por ejemplo, debido a que la mejora de la vida media es la primera prioridad, el vehículo a unir con la nueva insulina que tiene un título reducido no está limitada a la región Fc de inmunoglobulina. El vehículo incluye un material biocompatible que puede prolongar la vida media in vivo al unirlo con cualquier material biocompatible, capaz de reducir la eliminación renal, seleccionado del grupo que consiste de diversos polímeros (por ejemplo, polietilenglicol y ácido graso, albúmina y fragmentos de la misma, secuencia de aminoácidos particular, etc.), albúmina y fragmentos de la misma, materiales de unión a la albúmina y polímeros de unidades repetidas de secuencias de aminoácidos particulares, anticuerpo, fragmentos de anticuerpos, materiales de unión al FcRn, tejido conectivo in vivo o derivados de los mismos, nucleótidos, fibronectina, transferrina, sacárido y polímeros, pero no se limita a los mismos. Además, el procedimiento para unir el material biocompatible capaz de prolongar la vida media in vivo al análogo de insulina que tiene un título reducido incluye la recombinación genética, la conjugación in vitro o similares. Los ejemplos del material biocompatible pueden incluir un material de unión al FcRn, ácido graso, polietilenglicol, un fragmento de aminoácido, o albúmina. El material de unión al FcRn puede ser una región Fc de inmunoglobulina. El análogo de insulina y el material biocompatible como vehículo pueden estar unidos entre sí a través de un péptido o un polímero no peptidílico como un enlazador.
El conjugado de insulina puede ser un conjugado de análogo de insulina que se prepara uniendo (i) el análogo de insulina y (ii) una región Fc de inmunoglobulina a través de (iii) un enlazador peptídico o un enlazador no peptidil seleccionado del grupo que consiste en polietilenglicol, polipropilenglicol, copolímeros de etilenglicol—propilenglicol, polioles polioxietilados, alcoholes polivinilos, polisacáridos, dextrano, éter etil polivinilo, polímeros biodegradables, polímeros lipídicos, quitinas, ácido hialurónico y combinaciones del mismo.
En un ejemplo específico del conjugado de análogo de insulina de la presente divulgación, un polímero no peptidílico como enlazador está unido al extremo amino de la cadena B del análogo de insulina. En otro ejemplo específico del conjugado de la presente divulgación, un polímero no peptidílico como enlazador está unido al residuo de la cadena B del análogo de insulina. La modificación en la cadena A de la insulina conduce a una reducción en la actividad y a la seguridad. En estos ejemplos, por lo tanto, el polímero no peptidílico como enlazador está unido a la cadena B de la insulina, manteniendo de este modo la actividad de la insulina y mejorando la seguridad.
Como se usa en la presente memoria, el término "actividad" significa la capacidad de la insulina para unirse al receptor de insulina, y significa que la insulina se une a su receptor para exhibir su acción. Tal unión del polímero no peptidílico al extremo amino de la cadena B de la insulina de la presente divulgación puede lograrse mediante control del pH, y el intervalo de pH preferido es de 4,5 a 7,5.
Como se usa en la presente memoria, el término "extremo N" puede usarse indistintamente como "región N terminal".
En un ejemplo específico, los presentes autores prepararon un conjugado de análogo de insulina-PEG-Fc de inmunoglobulina uniendo el PEG al extremo N de una región Fc de inmunoglobulina, y acoplando selectivamente el extremo N de la cadena B de insulina a la misma. La vida media en suero de este conjugado de análogo de insulina-PEG-Fc de inmunoglobulina aumentó, en comparación con el no conjugado, y mostró un efecto hipoglucémico en los modelos animales con enfermedades. Por lo tanto, es evidente que puede prepararse una nueva formulación de insulina de acción prolongada que mantenga la actividad in vivo.
La región Fc de inmunoglobulina es segura para su uso como vehículo de fármacos porque es un polipéptido biodegradable que se metaboliza in vivo. Además, la región Fc de inmunoglobulina tiene un peso molecular relativamente bajo, en comparación con las moléculas de inmunoglobulina completas, y de este modo, es ventajoso en términos de preparación, purificación y rendimiento del conjugado. La región Fc de inmunoglobulina no contiene un fragmento Fab, que es altamente no homogéneo debido a las diferentes secuencias de aminoácidos de acuerdo con las subclases de anticuerpos, y de este modo puede esperarse que la región Fc de inmunoglobulina pueda aumentar considerablemente la homogeneidad de las sustancias y ser menos antigénico en la sangre.
Como se usa en la presente memoria, el término "región Fc de inmunoglobulina" se refiere a una proteína que contiene la región constante de la cadena pesada 2 (CH2) y la región constante de la cadena pesada 3 (CH3) de una inmunoglobulina, excluyendo las regiones variables de la cadena pesada y las cadenas ligeras, la región constante de la cadena pesada 1 (CH1) y la región constante de la cadena ligera 1 (CL1) de la inmunoglobulina. Puede incluir además una región de bisagra en la región constante de la cadena pesada. La región Fc de inmunoglobulina de la presente divulgación puede contener además una parte o toda la región Fc que incluye la región constante de la cadena pesada 1 (CH1) y/o la región constante de la cadena ligera 1 (CL1), excepto las regiones variables de las cadenas pesadas y ligeras de la inmunoglobulina, siempre que tenga un efecto sustancialmente similar o mejor que el de la forma nativa. Puede ser además un fragmento que tiene una deleción en una porción relativamente larga de la secuencia de aminoácidos de CH2 y/o CH3.
Es decir, la región Fc de inmunoglobulina de la presente divulgación puede incluir 1) un dominio CH1, un dominio CH2, un dominio CH3 y un dominio CH4, 2) un dominio CH1 y un dominio CH2, 3) un dominio CH1 y un dominio CH3, 4) un dominio CH2 y un dominio CH3, 5) una combinación de uno o más dominios y una región bisagra de inmunoglobulina (o una porción de la región bisagra), y 6) un dímero de cada dominio de las regiones constantes de la cadena pesada y la región constante de la cadena ligera.
Además, la región Fc de inmunoglobulina de la presente divulgación incluye una secuencia derivada (mutante) de la misma, así como una secuencia de aminoácidos nativa. Un derivado de secuencia de aminoácidos tiene una secuencia que es diferente de la secuencia de aminoácidos nativa debido a una deleción, una inserción, una sustitución no conservativa o conservativa o combinaciones de las mismas de uno o más residuos de aminoácidos. Por ejemplo, en una Fc de IgG, los residuos de aminoácidos que se conoce que son importantes en la unión, en las posiciones 214 a 238, 297 a 299, 318 a 322, o 327 a 331, pueden usarse como un objetivo adecuado para la modificación.
Además, son posibles otros derivados diversos, que incluyen los derivados que tienen una deleción de una región capaz de formar un enlace disulfuro, una deleción de varios residuos de aminoácidos en el extremo N de una forma Fc nativa, o una adición de residuo de metionina al extremo N de una forma Fc nativa. Además, para eliminar las funciones efectoras, puede producirse una deleción en un sitio de unión al complemento, tal como un sitio de unión a C1q y un sitio ADCC (citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpos). Las técnicas para preparar tales derivados de secuencia de la región Fc de inmunoglobulina se divulgan en los documentos WO 97/34631 y WO 96/32478.
Los intercambios de aminoácidos en proteínas y péptidos, que generalmente no alteran la actividad de las moléculas, son conocidos en la técnica (H. Neurath, RLHill, The Proteins, Academic Press, Nueva York, 1979). Los intercambios más comunes son Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly, en ambas direcciones.
La región Fc, si se desea, puede modificarse por fosforilación, sulfatación, acrilación, glicosilación, metilación, farnesilación, acetilación, amidación o similares.
Los derivados de Fc mencionados anteriormente son derivados que tienen una actividad biológica idéntica a la de la región Fc de la presente divulgación o la estabilidad estructural mejorada contra el calor, el pH o similares.
Además, estas regiones Fc pueden obtenerse de formas nativas aisladas de seres humanos y otros animales, que incluyen vacas, cabras, cerdos, ratones, conejos, hámsteres, ratas y cobayas, o pueden ser recombinantes o derivados de los mismos, obtenidos de las células animales transformadas o de microorganismos. Aquí, pueden obtenerse de una inmunoglobulina nativa aislando las inmunoglobulinas completas de seres humanos o animales y tratándolas con una enzima proteolítica. La papaína digiere la inmunoglobulina nativa en las regiones Fab y Fc, y el tratamiento con pepsina produce la producción de pF'c y F (ab)2. Estos fragmentos pueden someterse a cromatografía de exclusión por tamaño para aislar el Fc o el pF'c.
Preferentemente, una región Fc de origen humano es una región Fc de inmunoglobulina recombinante que se obtiene de un microorganismo.
Además, la región Fc de inmunoglobulina puede estar en forma de cadenas de azúcar nativas, cadenas de azúcar aumentadas en comparación con una forma nativa o cadenas de azúcar disminuidas en comparación con la forma nativa, o tal vez en una forma desglicosilada. El aumento, disminución o eliminación de las cadenas de azúcar Fc de inmunoglobulina puede lograrse mediante procedimientos comunes en la técnica, como un procedimiento químico, un procedimiento enzimático y un procedimiento de ingeniería genética mediante el uso de un microorganismo. Aquí, la eliminación de las cadenas de azúcar de una región Fc da como resultado una fuerte disminución en la afinidad de unión al complemento (c1q) y una disminución o pérdida en la citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos o la citotoxicidad dependiente del complemento, lo que no induce de este modo las respuestas inmunes innecesarias en vivo. En este sentido, una región Fc de inmunoglobulina en una forma desglicosilada o aglicosilada puede ser más adecuada para el objetivo de la presente divulgación como un vehículo del fármaco.
El término "desglicosilación", como se utiliza en la presente memoria, significa eliminar enzimáticamente restos de azúcar de una región Fc, y el término "aglicosilación" significa que una región Fc se produce en una forma no glicosilada por un procariota, preferentemente E. coli.
Por otro lado, la región Fc de inmunoglobulina puede derivarse de seres humanos u otros animales, que incluyen vacas, cabras, cerdos, ratones, conejos, hámsteres, ratas y cobayas, y preferentemente los seres humanos. La región Fc de inmunoglobulina puede ser además una región Fc que se deriva de IgG, IgA, IgD, IgE e IgM, o que se forma mediante combinaciones de las mismas o híbridos de las mismas. Preferentemente, se deriva de IgG o IgM, que se encuentra entre las proteínas más abundantes en la sangre humana, y con máxima preferencia, de IgG que se conoce que mejora la vida media de las proteínas de unión al ligando.
Por otro lado, el término "combinación", como se utiliza en la presente memoria, significa que los polipéptidos que codifican regiones Fc de inmunoglobulina de cadena simple del mismo origen están unidos a un polipéptido de cadena simple de un origen diferente para formar un dímero o multímero. Es decir, puede formarse un dímero o multímero a partir de dos o más fragmentos seleccionados del grupo que consiste en fragmentos Fc de IgG, Fc de IgA, Fc de IgM, Fc de IgD y Fc de IgE.
El término "híbrido", como se utiliza en la presente memoria, significa que las secuencias que codifican dos o más regiones Fc de inmunoglobulina de diferente origen están presentes en una región Fc de inmunoglobulina de cadena sencilla. En la presente divulgación, son posibles diversos tipos de híbridos. Es decir, los híbridos de dominio pueden estar compuestos de uno a cuatro dominios seleccionados del grupo que consiste en CH1, CH2, CH3 y CH4 de Fc de IgG, Fc de IgM, Fc de IgA, Fc de IgE y Fc de IgD, y pueden incluir la región bisagra.
Por otro lado, la IgG se divide en las subclases IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4, y la presente divulgación incluye combinaciones e híbridos de las mismas. Se prefieren las subclases IgG2 e IgG4, y con la máxima preferencia la región Fc de la IgG4 que rara vez tiene la función efectora, tal como la CDC (citotoxicidad dependiente del complemento). Es decir, como el vehículo del fármaco de la presente divulgación, con máxima preferencia la región Fc de inmunoglobulina es una región Fc no glucosilada derivada de la IgG4 humana. La región Fc de origen humano es con mayor preferencia que una región Fc no de origen humano, que puede actuar como un antígeno en el cuerpo humano y causar respuestas inmunes inconvenientes, tal como la producción de un nuevo anticuerpo contra el antígeno.
En el ejemplo específico del conjugado de análogo de insulina, ambos extremos del polímero no peptidílico pueden unirse al extremo N de la región Fc de inmunoglobulina y al grupo amina del extremo N de la cadena B del análogo de insulina o el grupo £-amino o el grupo tiol del residuo interno de lisina de la cadena B, respectivamente.
El análogo de la región Fc-enlazador-insulina de la presente divulgación se realiza en diversas relaciones molares. Es decir, el número del fragmento Fc y/o enlazador unido a un solo análogo de insulina no está limitado.
Además, el enlace de la región Fc, un cierto enlazador y el análogo de insulina de la presente divulgación puede incluir todos los tipos de enlaces covalentes y todos los tipos de enlaces no covalentes, tales como enlaces de hidrógeno, interacciones iónicas, fuerzas de Van der Waals e interacciones hidrófobas cuando la región Fc y el análogo de insulina se expresan como una proteína de fusión por la recombinación genética. Sin embargo, con respecto a la actividad fisiológica del análogo de insulina, el enlace se realiza preferentemente mediante enlaces covalentes, pero no está limitado a los mismos.
Por otro lado, la región Fc de la presente divulgación, un cierto enlazador y el análogo de insulina pueden unirse entre sí en un extremo N o en el extremo C, y preferentemente en un grupo libre, y especialmente, un enlace covalente puede formarse en un extremo amino terminal, un residuo de aminoácido de lisina, un residuo de aminoácido de histidina o un residuo de cisteína libre.
Además, el enlace de la región Fc de la presente divulgación, un cierto enlazador y el análogo de insulina puede hacerse en una determinada dirección. Es decir, el enlazador puede unirse al extremo N, al extremo C o a un grupo libre de la región Fc de inmunoglobulina, y puede unirse además al extremo N, al extremo C o a un grupo libre del análogo de insulina.
El enlazador no peptidílico puede unirse al grupo amina N-terminal del fragmento de inmunoglobulina, y no está limitado a ninguno de los residuos de lisina o residuo de cisteína de la secuencia del fragmento de inmunoglobulina. Además, en el ejemplo específico del conjugado de análogo de insulina, el extremo del polímero no peptidílico puede unirse al residuo de aminoácido interno o al grupo reactivo libre capaz de unirse al grupo reactivo al final del polímero no peptidílico, además del extremo N de la región Fc de inmunoglobulina, pero no está limitado al mismo. En la presente divulgación, el polímero no peptidílico significa un polímero biocompatible que incluye dos o más unidades repetitivas unidas entre sí, en las que las unidades repetitivas están unidas por cualquier enlace covalente que excluye el enlace peptídico. Tal polímero no peptidílico puede tener dos extremos o tres extremos.
El polímero no peptidílico que puede usarse en la presente divulgación puede seleccionarse del grupo que consiste en polietilenglicol, polipropilenglicol, copolímeros de etilenglicol y propilenglicol, polioles polioxietilados, alcohol de polivinilo, polisacáridos, dextrano, éter etil polivinilo, polímeros biodegradables tales como PLA (poli(ácido láctico) y PLGA (poli ácido láctico-glicólico), polímeros lipídicos, quitinas, ácido hialurónico o la combinación de los mismos y preferentemente polietilenglicol. Los derivados de los mismos bien conocidos en la técnica y que se preparan fácilmente dentro del conocimiento de la técnica se incluyen además en el ámbito de la presente divulgación.
El enlazador peptídico que se usa en la proteína de fusión obtenida por un procedimiento convencional de fusión inframem tiene inconvenientes, que fácilmente se escinde in vivo por una enzima proteolítica, y de este modo un efecto suficiente de aumentar la vida media en sangre del fármaco activo por un vehículo no puede obtenerse como se esperaba. En la presente divulgación, sin embargo, el conjugado puede prepararse mediante el uso del enlazador no peptidílico, así como el enlazador peptídico. En el enlazador no peptidílico, el polímero que tiene resistencia a la enzima proteolítica puede usarse para mantener la vida media en sangre del péptido que es similar a la del vehículo. Por lo tanto, cualquier polímero no peptidílico puede usarse sin limitación, siempre que sea un polímero que tenga la función mencionada anteriormente, es decir, un polímero que tenga resistencia a la enzima proteolítica in vivo. El polímero no peptidílico tiene un peso molecular que varía de 1 a 100 kDa, y preferentemente, que varía de 1 a 20 kDa.
El polímero no peptidílico de la presente divulgación, unido a la región Fc de inmunoglobulina, puede ser un polímero o una combinación de diferentes tipos de polímeros.
El polímero no peptidílico usado en la presente divulgación tiene un grupo reactivo capaz de unirse a la región Fc de inmunoglobulina y al fármaco proteico.
El polímero no peptidílico tiene un grupo reactivo en ambos extremos, que se selecciona preferentemente del grupo que consiste en un grupo aldehído reactivo, un grupo propionaldehído, un grupo butiraldehído, un grupo maleimida y un derivado de succinimida. El derivado de succinimida puede ser propionato de succinimidilo, hidroxi succinimidilo, succinimidil carboximetilo, o carbonato de succinimidilo. Particularmente, cuando el polímero no peptidílico tiene un grupo aldehído reactivo en ambos extremos del mismo, es efectivo en la unión en ambos extremos con un polipéptido fisiológicamente activo y una inmunoglobulina con mínimas reacciones inespecíficas. Un producto final generado por alquilación reductora por un enlace aldehído es mucho más estable que el unido por un enlace amida. El grupo reactivo aldehído se une selectivamente a un extremo N a un pH bajo, y se une a un residuo de lisina para formar un enlace covalente a un pH alto, como pH 9,0.
Los grupos reactivos en ambos extremos del polímero no peptidílico pueden ser iguales o diferentes entre sí. Por ejemplo, el polímero no peptídico puede poseer un grupo maleimida en un extremo y un grupo aldehído, un grupo propionaldehído o un grupo butiraldehído en el otro extremo. Cuando se usa un polietilenglicol que tiene un grupo hidroxilo reactivo en ambos extremos del mismo como polímero no peptidílico, el grupo hidroxilo puede activarse a diversos grupos reactivos mediante reacciones químicas conocidas, o un polietilenglicol que tiene un grupo reactivo modificado disponible comercialmente puede usarse para preparar el conjugado de análogo de insulina de cadena simple de la presente divulgación.
El conjugado de análogo de insulina de la presente divulgación mantiene actividades in vivo de la insulina convencional, tales como el metabolismo energético y el metabolismo del azúcar, y aumenta además la vida media en sangre del análogo de insulina y aumenta notablemente la duración de la eficacia in vivo del péptido, y por lo tanto, el conjugado es útil en el tratamiento de la diabetes.
En un ejemplo de la presente divulgación, se confirmó que el análogo de insulina que tiene una afinidad de unión al receptor de insulina reducida exhibe una vida media in vivo mucho más alta que el conjugado de insulina nativo, cuando se une al vehículo capaz de prolongar la vida media in vivo (Figura 6).
En otro caso, la presente divulgación proporciona una formulación de insulina de acción prolongada que incluye el conjugado de análogo de insulina. La formulación de insulina de acción prolongada puede ser una formulación de insulina de acción prolongada que tenga mayor duración y estabilidad in vivo. La formulación de acción prolongada puede ser una composición farmacéutica para el tratamiento de la diabetes.
La composición farmacéutica que incluye el conjugado de la presente divulgación puede incluir vehículos farmacéuticamente aceptables. Para la administración oral, el vehículo farmacéuticamente aceptable puede incluir un aglutinante, un lubricante, un desintegrador, un excipiente, un solubilizante, un agente dispersante, un estabilizador, un agente de suspensión, un agente colorante, un perfume o similar. Para preparaciones inyectables, el vehículo farmacéuticamente aceptable puede incluir un agente tamponado, un agente conservante, un analgésico, un solubilizante, un agente isotónico y un estabilizador. Para preparaciones para administración tópica, el vehículo farmacéuticamente aceptable puede incluir una base, un excipiente, un lubricante, un agente conservante o similares. La composición farmacéutica de la presente divulgación puede formularse en una variedad de formas de dosificación en combinación con los vehículos farmacéuticamente aceptables mencionados anteriormente. Por ejemplo, para la administración oral, la composición farmacéutica puede formularse en comprimidos, grageas, cápsulas, elixires, suspensiones, jarabes u obleas. Para preparaciones inyectables, la composición farmacéutica puede formularse en ampollas de dosis única o en un recipiente multidosis. La composición farmacéutica puede formularse además en soluciones, suspensiones, comprimidos, píldoras, cápsulas y preparaciones de liberación sostenida.
Por otro lado, los ejemplos de vehículos, excipientes y diluyentes adecuados para la formulación incluyen lactosa, dextrosa, sacarosa, sorbitol, manitol, xilitol, eritritol, maltitol, almidón, acacia, alginato, gelatina, fosfato de calcio, silicato de calcio, celulosa, metilcelulosa, celulosa microcristalina, polivinilpirrolidona, agua, metilhidroxibenzoato, propilhidroxibenzoato, talco, estearato de magnesio, aceites minerales o similares.
Además, las formulaciones farmacéuticas pueden incluir además rellenos, agentes anticoagulantes, lubricantes, humectantes, perfumes, antisépticos o similares.
Se divulga además en la presente memoria un procedimiento para tratar enfermedades relacionadas con la insulina, que incluye administrar el análogo de insulina o el conjugado de análogo de insulina a un sujeto que necesite el mismo.
El conjugado de acuerdo con la presente divulgación es útil en el tratamiento de la diabetes y, por lo tanto, esta enfermedad puede tratarse administrando la composición farmacéutica que incluye la misma.
El término "administración", como se utiliza en la presente memoria, significa la introducción de una sustancia predeterminada en un paciente mediante un cierto procedimiento adecuado. El conjugado de la presente divulgación puede administrarse a través de cualquiera de las rutas comunes, siempre que sea capaz de hacer reaccionar un tejido deseado. Puede realizarse la administración intraperitoneal, intravenosa, intramuscular, subcutánea, intradérmica, oral, tópica, intranasal, intrapulmonar e intrarrectal, pero la presente divulgación no se limita a los mismos. Sin embargo, dado que los péptidos se digieren tras la administración oral, los ingredientes activos de una composición para administración oral deben recubrirse o formularse para protegerlos contra la degradación en el estómago. Preferentemente, la presente composición puede administrarse en una forma inyectable. Además, la composición farmacéutica puede administrarse mediante el uso de un cierto aparato capaz de transportar los ingredientes activos a una célula objetivo.
Además, la composición farmacéutica de la presente divulgación puede determinarse por varios factores relacionados, que incluyen los tipos de enfermedades a tratar, las rutas de administración, la edad, el sexo, el peso y la gravedad de la enfermedad del paciente, así como por los tipos del fármaco como componente activo. Dado que la composición farmacéutica de la presente divulgación tiene una duración y un título in vivo excelentes, tiene la ventaja de reducir en gran medida la frecuencia de la administración de la formulación farmacéutica de la presente divulgación.
Aún en otro caso, la presente divulgación proporciona un procedimiento para preparar el conjugado de análogo de insulina, que incluye preparar el análogo de insulina; preparar el vehículo; y unir el análogo de insulina y el vehículo. Aún en otro caso, la presente divulgación proporciona un procedimiento para aumentar la vida media in vivo mediante el uso del análogo de insulina o el conjugado de análogo de insulina que se prepara uniendo el análogo de insulina y el vehículo.
[Modo]
De aquí en adelante, la presente divulgación se describirá en más detalles con referencia a los ejemplos. Sin embargo, estos ejemplos son sólo con fines ilustrativos, y la divulgación no pretende estar limitada por estos ejemplos.
Ejemplo 1: Preparación del vector de expresión del análogo de insulina de cadena sencilla
Para preparar los análogos de insulina, cada uno de ellos con un aminoácido modificado en la cadena A o en la cadena B, mediante el uso del vector de expresión de la insulina nativa como patrón, se sintetizaron los oligonucleótidos directo y reverso (Tabla 2), y después se llevó a cabo la PCR para amplificar cada gen análogo. En la siguiente Tabla 1, se proporcionan las secuencias de aminoácidos modificadas en la cadena A o en la cadena B y los nombres de los análogos. Es decir, el Análogo 1 representa que la 1ra glicina de la cadena A se sustituye con alanina, y el Análogo 4 representa que la 8va glicina de la cadena B se sustituye con alanina.
T l 1
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Los cebadores para la amplificación del análogo de insulina se proporcionan en la siguiente Tabla 2.
T l 2
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La PCR para la amplificación del análogo de insulina se realizó bajo condiciones de 95 °C durante 30 segundos, 55 °C durante 30 segundos, 68 °C durante 6 minutos durante 18 ciclos. Los fragmentos de los análogos de insulina obtenidos en las condiciones se insertaron en el vector pET22b para expresarse como cuerpos de inclusión intracelular, y los vectores de expresión resultantes se designaron como análogos de insulina pET22b 1 al 9. Los vectores de expresión que contienen ácidos nucleicos que codifican secuencias de aminoácidos de los análogos de insulina 1 al 9 bajo el control del promotor T7, y las proteínas análogas a la insulina se expresaron como cuerpos de inclusión en las células huésped.
Las secuencias de ADN y las secuencias de proteínas de los análogos de insulina 1 al 9 se proponen en la siguiente Tabla 3.
T l
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Ejemplo 2: Expresión del péptido de fusión análogo de insulina recombinante
Las expresiones de análogos de insulina recombinantes se llevaron a cabo bajo el control del promotor T7. La E. coli BL21-DE3 (E. coli B F-dcm ompT hsdS (rB-mB-) gal ADE3); Novagen) se transformó con cada uno de los vectores que expresan análogos de insulina recombinante. La transformación se realizó de acuerdo con el protocolo recomendado (Novagen). Las colonias individuales transformadas con cada vector de expresión recombinante se recogieron e inocularon en 2X Luria Broth (LB) que contenía ampicilina (50 pg/ml) y se cultivaron a 37 °C durante 15 horas. El caldo de cultivo de la cepa recombinante y el medio 2X LB que contenía 30% de glicerol se mezclaron en una proporción de 1:1 (v/v). Cada 1 ml se dispensó a un criotubo y se almacenó a -140 °C, que se usó como una reserva celular de producción de la proteína de fusión recombinante.
Para expresar los análogos de insulina recombinante, se descongeló 1 vial de cada reserva celular y se inoculó en 500 ml de caldo Luria 2X, y se cultivó con agitación a 37 °C durante 14~16 horas. El cultivo finalizó, cuando la DO600 alcanzó 5,0 o más. El caldo de cultivo se usó como caldo de cultivo de semillas. Este caldo de cultivo de semillas se inoculó en un fermentador de 50 L (MSJ-U2, B.E.MARUBISHI, Japón) que contenía 17 L de medio de fermentación, y se inició la fermentación inicial en el baño. Las condiciones de cultivo se mantuvieron a una temperatura de 37 °C, un caudal de aire de 20 L/min (1 vvm), una velocidad de agitación de 500 rpm y un pH de 6,70 mediante el uso de una solución de amoníaco al 30%. La fermentación se llevó a cabo en modo de alimentación por lotes agregando una solución de alimentación, cuando los nutrientes se agotaron en el caldo de cultivo. El crecimiento de la cepa se controló por valor de DO. El IPTG se introdujo en una concentración final de 500 pM, cuando el valor de DO fue superior a 100. Después de la introducción, el cultivo se llevó a cabo durante aproximadamente 23~25 horas. Después de terminar el cultivo, las cepas recombinantes se cosecharon por centrifugación y se almacenaron a -80 °C hasta su uso.
Ejemplo 3: Recuperación y renaturalización del análogo de insulina recombinante
Para cambiar los análogos de insulina recombinante expresados en el ejemplo 2 en formas solubles, seguido de la renaturalización las células se rompieron. Se resuspendieron 100 g (peso húmedo) del sedimento celular en 1 L del tampón de lisis (Tris-HCl 50 mM (pH 9,0), EDTA 1 mM (pH 8,0), NaCl 0,2 M y Tritón X-100 al 0,5%). Las células se rompieron mediante el uso de un procesador de microfluidificador M-110EH (AC Technology Corporation Modelo M1475C) a una presión de funcionamiento de 15,000 psi. De este modo el lisado celular se rompió, se centrifugó a 7,000 rpm y 4 °C durante 20 minutos. El sobrenadante se desechó y el sedimento se resuspendió en 3 L de tampón de lavado (Triton X-100 al 0,5% y Tris-HCl 50 mM (pH 8,0), NaCl 0,2 M, EDTA 1 mM). Después de la centrifugación a 7,000 rpm y 4 °C durante 20 minutos, el sedimento celular se resuspendió en agua destilada, seguido de centrifugación de la misma manera. De este modo el sedimento obtenido se resuspendió en 400 ml de tampón (glicina 1 M, 3,78 g de cisteína-HCl, pH 10,6) y se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora. De este modo para recuperar el análogo de insulina recombinante resuspendido, se añadieron 400 ml de urea 8 M y se agitó a 40 °C durante 1 hora. Para la renaturalización de los análogos de insulina recombinante solubilizada, la centrifugación se llevó a cabo a 7,000 rpm y 4 °C durante 30 minutos, y se obtuvo el sobrenadante. Se añadieron 2 L de agua destilada a la misma mediante el uso de una bomba peristáltica a un caudal de 1000 ml/h mientras se agitaba a 4 °C durante 16 horas.
Ejemplo 4: Purificación por cromatografía de unión de cationes
La muestra renaturalizada se cargó en una columna Source S (GE healthcare) equilibrada con tampón de citrato de sodio 20 mM (pH 2,0) que contenía etanol al 45%, y después las proteínas análogas de la insulina se eluyeron en 10 volúmenes de columna con un gradiente lineal de 0% a tampón de citrato de sodio al 100% 20 mM (pH 2,0) que contenía cloruro de potasio 0,5 M y etanol al 45%.
Ejemplo 5: Tratamiento con tripsina y carboxipeptidasa B
Las sales se eliminaron de las muestras eluidas mediante el uso de una columna de desalación, y el tampón se intercambió con un tampón (Tris-HCl 10 mM, pH 8,0). Con respecto a la proteína de la muestra obtenida, se añadieron tripsina correspondiente a una relación molar de 1000 y carboxipeptidasa B correspondiente a una relación molar de 2000, y después se agitó a 16 °C durante 16 horas. Para terminar la reacción, se usó citrato de sodio 1 M (pH 2,0) para reducir el pH a 3,5.
Ejemplo 6: Purificación por cromatografía de unión de cationes
De este modo la muestra reaccionada se cargó en una columna Source S (GE healthcare) equilibrada con tampón de citrato de sodio 20 mM (pH 2,0) que contenía etanol al 45%, y después las proteínas análogas de la insulina se eluyeron en 10 volúmenes de columna con un gradiente lineal del 0% al 100% de tampón de citrato de sodio 20 mM (pH 2,0) que contenía cloruro de potasio 0,5 M y etanol al 45%.
Ejemplo 7: Purificación por cromatografía de unión a aniones
Las sales se eliminaron de las muestras eluidas mediante el uso de una columna de desalación, y el tampón se intercambió con un tampón (Tris-HCl 10 mM, pH 7,5). Para aislar un análogo de insulina puro de la muestra obtenida en el ejemplo 6, la muestra se cargó en una columna de intercambio aniónico (Source Q: GE healthcare) equilibrada con tampón Tris 10 mM (pH 7,5), y se eluyó la proteína análoga de la insulina en 10 volúmenes de columna con un gradiente lineal de 0% a 100% de tampón Tris 10 mM (pH 7,5) que contenía cloruro de sodio 0,5 M. De este modo la pureza del análogo de insulina purificado se analizó mediante electroforesis de proteínas (SDS-PAGE, Figura 1) y cromatografía de alta presión (HPLC) (Figura 2), y se identificaron las modificaciones de los aminoácidos mediante mapeo de péptidos (Figura 3) y análisis de peso molecular de cada pico.
Como resultado, se encontró que cada análogo de insulina tenía la modificación deseada en su secuencia de aminoácidos.
Ejemplo 8: Preparación del conjugado de análogo de insulina (núm. 7)-Fc de inmunoglobulina
Para pegilar el extremo N de la cadena beta del análogo de insulina mediante el uso de 3,4K ALD2 PEG (NOF, Japón), el análogo de insulina y el PEG se hicieron reaccionar en una relación molar de 1:4 con una concentración del análogo de insulina de 5 mg/ml a 4 °C durante aproximadamente 2 horas. En este momento, la reacción se realizó en citrato de sodio 50 mM a pH 6,0 e isopropanol al 45%. Se añadió cianoborohidruro de sodio 3,0 mM como agente reductor y se dejó hacer reaccionar. La solución de reacción se purificó con columna SP-HP (GE Healthcare, Estados Unidos) mediante el uso de un tampón que contenía citrato de sodio (pH 3,0) y etanol al 45%, y gradiente de concentración de KCl.
Para preparar un conjugado del fragmento análogo de insulina-Fc de inmunoglobulina, el análogo de insulina mono-PEGilado purificado y el fragmento Fc de inmunoglobulina se hicieron reaccionar en una relación molar de 1:1 a 1:2 y a 25 °C durante 13 horas, con una concentración de la proteína total de aproximadamente 20 mg/ml. En este momento, las condiciones del tampón de reacción fueron HEPES 100 mM a pH 8,2, y se añadió cianoborohidruro de sodio 20 mM como agente reductor a las mismas. Por lo tanto, el PEG se unió al extremo N del fragmento Fc.
Después de que se terminó la reacción, la solución de reacción se cargó en la columna Q HP (GE Healthcare, Estados Unidos) con tampón Tris-HCl (pH 7,5) y gradiente de concentración de NaCl para separar y purificar el fragmento Fc de inmunoglobulina sin reaccionar y el análogo de insulina mono-PEGilada.
Posteriormente, se usó Source 15ISO (GE Healthcare, Estados Unidos) como una columna secundaria para eliminar el fragmento Fc de inmunoglobulina restante y el conjugado, en el que dos o más análogos de insulina se unieron al fragmento de inmunoglobulina Fc, obteniendo así el conjugado de análogo de insulina-fragmento Fc de inmunoglobulina. En este momento, la elución se llevó a cabo mediante el uso de un gradiente de concentración de sulfato de amonio que contenía Tris-HCl (pH 7,5), y el conjugado de análogo de insulina-Fc de inmunoglobulina de este modo eluido, se analizó por electroforesis de proteínas (SDS-PAGE, Figura 4) y cromatografía de alta presión (HPLC) (Figura 5). Como resultado, se encontró que el conjugado tuvo casi un 99% de pureza.
Ejemplo 9: Comparación de la afinidad de unión del receptor de insulina entre la insulina nativa, el análogo de insulina, el conjugado de insulina nativa-Fc de inmunoglobulina y el conjugado de análogo de insulina-Fc de inmunoglobulina
Para medir la afinidad de unión al receptor de insulina del conjugado de análogo de insulina-Fc de inmunoglobulina, se usó la resonancia de plasmón superficial (SPR, BIACORE 3000, GE healthcare) para el análisis. Los receptores de la insulina se inmovilizaron en un chip CM5 mediante acoplamiento de la amina, y se aplicaron 5 diluciones o más de la insulina nativa, análogo de insulina, conjugado de insulina nativa-Fc de inmunoglobulina, y conjugado de análogo de insulina-Fc de inmunoglobulina, independientemente. Después, se examinó la afinidad de unión al receptor de insulina de cada sustancia. La afinidad de unión de cada sustancia se calculó mediante el uso del software de evaluación BIA. En este momento, el modelo que se usó fue la unión Langmuir 1:1 con deriva de referencia.
Como resultado, en comparación con la insulina humana, el análogo de insulina (núm. 6) mostró una afinidad de unión al receptor del 14,8%, el análogo de insulina (núm. 7) mostró una afinidad de unión al receptor del 9,9%, el análogo de insulina (núm. 8) mostró una afinidad de unión al receptor del 57,1%, el análogo de insulina (núm. 9) mostró una afinidad de unión al receptor del 78,8%, el conjugado de insulina nativa-Fc de inmunoglobulina mostró una afinidad de unión al receptor del 3,7-5,9% en dependencia de los análisis experimentales, el conjugado de análogo de insulina (núm. 6)-Fc de inmunoglobulina mostró una afinidad de unión al receptor del 0,9% o menos, el conjugado de análogo de insulina (núm. 7)-Fc de inmunoglobulina mostró una afinidad de unión de receptor del 1,9%, el conjugado de análogo de insulina (núm. 8)-Fc de inmunoglobulina de mostró una afinidad de unión de receptor de 1.8% y el conjugado de análogo de insulina (núm. 9)-Fc de inmunoglobulina mostró una afinidad de unión al receptor del 3,3% (Tabla 4). Como tal, se observó que los análogos de insulina de la presente divulgación tuvieron la afinidad de unión al receptor de insulina reducida, en comparación con la insulina nativa, y los conjugados de análogos de insulina-Fc de inmunoglobulina tuvieron además la afinidad de unión al receptor de insulina reducida notablemente.
T l 4
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Ejemplo 10: Comparación de la eficacia in vitro entre el conjugado de insulina nativa-Fc de inmunoalobulina y el conjugado de análogo de insulina-Fc de inmunoglobulina
Para evaluar la eficacia in vitro del conjugado de análogo de insulina-Fc de inmunoglobulina, se usaron adipocitos 3T3-L1 diferenciados derivados de ratón para evaluar la absorción de la glucosa o la síntesis de los lípidos. Las células 3T3-L1 se subcultivaron en DMEM que contenía 10% de NBCS (suero de ternero recién nacido) (Medio Eagle modificado de Dulbeco, Gibco, Cat. núm, 12430) dos veces o tres veces por semana, y se mantuvieron. Las células 3T3-L1 se suspendieron en un medio de diferenciación (DMEM que contuvo FBS al 10%) y luego se inocularon a una densidad de 5 x 104 por pocillo en un placa de 48 pocillos y se cultivaron durante 48 horas. Para la diferenciación de adipocitos, se mezclaron insulina humana de 1 pg/ml (Sigma, Cat. núm. 19278), IBMX 0,5 mM (3-isobutil-1-metilxantina, Sigma, Cat. núm. I5879) y Dexametasona 1 pM (Sigma, Cat. núm. D4902) con el medio de diferenciación, y se añadieron 250 pl de la mezcla a cada pocillo, después de eliminar el medio anterior. Después de 48 horas, el medio se intercambió con el medio de diferenciación suplementado con solo 1 pg/ml de insulina humana. Después de eso, mientras el medio se intercambió con el medio de diferenciación suplementado con 1 pg/ml de insulina humana cada 48 horas, se examinó la inducción de la diferenciación de adipocitos durante 7-9 días. Para evaluar la absorción de la glucosa, las células diferenciadas se lavaron con medio DMEM sin suero una vez, y luego se añadieron 250 pl para inducir la reducción del suero durante 4 horas. Se usó medio DMEM sin suero para llevar a cabo diluciones seriadas 10 veces para la insulina humana de 2 pM a 0,01 pM, y para el conjugado de insulina nativa-Fc de inmunoglobulina y conjugados de análogos de insulina-Fc de inmunoglobulina de 20 pM a 0,02 pM. Cada 250 pl de las muestras preparadas de este modo, se añadieron a las células y se cultivaron en una incubadora al 5% de CO237 °C durante 24 horas. Para medir la cantidad residual de la glucosa en el medio después de la incubación, se tomaron 200 pl del medio y se diluyeron 5 veces con D-PBS, seguido del ensayo GOPOD (estuche de ensayo GOPOD, Megazyme, Cat. núm. K-GLUC). La concentración de la glucosa que quedaba en el medio se convirtió sobre la base de la absorbancia de la solución estándar de la glucosa, y se calcularon los valores de CE50 para la absorción de la glucosa del conjugado de insulina nativa-Fc de inmunoglobulina y los conjugados de análogos de insulina-Fc de inmunoglobulina, respectivamente.
Como resultado, el conjugado de insulina nativa-Fc de inmunoglobulina mostró una absorción de la glucosa del 11,6%, el conjugado de análogo de insulina (núm.6)-Fc de inmunoglobulina mostró una absorción de la glucosa del 0,43%, el conjugado de análogo de insulina (núm.7)-Fc de inmunoglobulina mostró una absorción de la glucosa del 1,84%, el conjugado de análogo de insulina (núm.8)-Fc de inmunoglobulina mostró una absorción de la glucosa del 16,0%, el conjugado de análogo de insulina (núm. 9)-Fc de inmunoglobulina mostró una absorción de glucosa del 15,1% (Tabla 5) en comparación con la insulina humana. Como tal, se observó que el conjugado de análogo de insulina (núm. 6)-Fc de inmunoglobulina y el conjugado de análogo de insulina (núm. 7)-Fc de inmunoglobulina de la presente divulgación habían reducido notablemente el título in vitro, en comparación con el conjugado de insulina nativa-Fc de inmunoglobulina, y el conjugado de análogo de insulina (núm. 8)-Fc de inmunoglobulina y el conjugado de análogo de insulina (núm. 9)-Fc de inmunoglobulina tuvieron un título in vitro similar al del conjugado de insulina nativa-Fc de inmunoglobulina.
T l
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Ejemplo 11: Farmacocinética del conjugado de análogo de insulina-Fc de inmunoglobulina
Para examinar la farmacocinética de los conjugados de análogos de insulina-Fc de inmunoglobulina, se comparó su concentración en sangre en el tiempo en ratas normales (SD, rata, macho, 6 semanas de edad) adaptadas durante 5 días al laboratorio. Se inyectaron subcutáneamente 21,7 nmol/kg del conjugado de insulina nativa-Fc de

Claims (13)

REIVINDICACIONES
1. Un conjugado de análogo de insulina, en el que (i) un análogo de insulina que tiene un título de insulina reducida en comparación con la forma nativa, en el que un aminoácido en la cadena B de insulina se modifica sustituyendo un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en el aminoácido 24 y el aminoácido 25 de la cadena B con alanina;
está enlazado con (ii) un material biocompatible, en el que el material biocompatible es una región Fc de inmunoglobulina.
2. El conjugado de análogo de insulina de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el análogo de insulina se selecciona del grupo que consiste en las SEQ ID NO. 30 y 32.
3. El conjugado de análogo de insulina de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el análogo de insulina y el material biocompatible están enlazados entre sí a través de un péptido o un polímero no peptidílico como un enlazador.
4. El conjugado de análogo de insulina de acuerdo con la reivindicación 1, en el que (i) el análogo de insulina está enlazado con (ii) la región Fc de inmunoglobulina a través de (iii) un enlazador peptídico o un enlazador no peptidílico seleccionado del grupo que consiste en polietilenglicol, polipropilenglicol, copolímeros de etilenglicol-propilenglicol, polioles polioxietilados, alcoholes polivinilos, polisacáridos, dextrano, éter etil polivinilo, polímeros biodegradables, polímeros lipídicos, quitinas, ácido hialurónico y combinaciones de los mismos.
5. El conjugado de análogo de insulina de acuerdo con la reivindicación 4, en el que el enlazador no peptidílico está enlazado al extremo N de la cadena B del análogo de insulina.
6. El conjugado de análogo de insulina de acuerdo con la reivindicación 4, en el que ambos extremos del polímero no peptidílico están unidos al extremo N de la región Fc de inmunoglobulina y al grupo amina N-terminal del análogo de insulina o el grupo £-amino del residuo interno de lisina o el grupo tiol de la cadena B, respectivamente.
7. El conjugado de análogo de insulina de acuerdo con la reivindicación 4, en el que la región Fc de inmunoglobulina está aglicosilada, opcionalmente en el que:
(i) la región Fc de inmunoglobulina está compuesta de 1 a 4 dominios seleccionados del grupo que consiste en los dominios CH1, CH2, CH3 y CH4; o
(iii) la región Fc de inmunoglobulina además incluye una región bisagra.
8. El análogo de insulina de acuerdo con la reivindicación 4, en el que la región Fc de inmunoglobulina es una región Fc derivada de IgG, IgA, IgD, IgE o IgM.
9. El conjugado de análogo de insulina de acuerdo con la reivindicación 8, en el que:
(i) cada dominio de la región Fc de inmunoglobulina es un híbrido de dominios que tienen orígenes diferentes y que se derivan de una inmunoglobulina seleccionada del grupo que consiste en IgG, IgA, IgD, IgE e IgM;
(ii) la región Fc de inmunoglobulina es un dímero o un multímero que consiste en inmunoglobulinas de cadena simple compuestas de dominios del mismo origen; o
(iii) la región Fc de inmunoglobulina es una región Fc de IgG4, opcionalmente en el que la región Fc de inmunoglobulina es una región Fc aglicosilada derivada de IgG4 humana.
10. El conjugado de análogo de insulina de acuerdo con la reivindicación 4, en el que el grupo reactivo del enlazador no peptidílico se selecciona del grupo que consiste en un grupo aldehído, un grupo propionaldehído, un grupo butiraldehído, un grupo maleimida y un derivado de succinimida,
opcionalmente en el que:
(i) el grupo reactivo del enlazador no peptidílico es propionato de succinimidilo, succinimidil carboximetilo, hidroxi succinimidilo o carbonato de succinimidilo; o
(ii) el enlazador no peptidílico tiene grupos aldehído reactivos en ambos extremos del mismo.
11. Una formulación de insulina de acción prolongada que tiene una duración y estabilidad in vivo mejoradas, que comprende el conjugado de análogo de insulina de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.
12. La formulación de insulina de acción prolongada de acuerdo con la reivindicación 11, en la que la formulación es un agente terapéutico para la diabetes.
13. Un procedimiento para la preparación del conjugado de análogo de insulina de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, que comprende:
enlazar un análogo de insulina que tiene un título de insulina reducida en comparación con la forma nativa, en el que un aminoácido en la cadena B de insulina se modifica sustituyendo un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en el aminoácido 24 y el aminoácido 25 de la cadena B con alanina; con un material biocompatible, en el que el material biocompatible es una región Fc de inmunoglobulina.
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