UA119533C2 - Аналог інсуліну та його застосування - Google Patents

Аналог інсуліну та його застосування Download PDF

Info

Publication number
UA119533C2
UA119533C2 UAA201507940A UAA201507940A UA119533C2 UA 119533 C2 UA119533 C2 UA 119533C2 UA A201507940 A UAA201507940 A UA A201507940A UA A201507940 A UAA201507940 A UA A201507940A UA 119533 C2 UA119533 C2 UA 119533C2
Authority
UA
Ukraine
Prior art keywords
insulin
immunoglobulin
insulin analog
conjugate
group
Prior art date
Application number
UAA201507940A
Other languages
English (en)
Inventor
Сан Юн ХВАН
Йон Хо Хух
Чін Юн Кім
Чин Юн Ким
Сун Хі Хон
Сун Хи Хон
Ін Йон Чхой
Ин Йон Чхой
Сун Юб Чун
Се Чхан Квон
Сэ Чхан Квон
Те Чін Кім
Тэ Чин Ким
Х'юн Ук Кім
Хьюн Ук Ким
М'юн Х'юн Чан
Мьюн Хьюн Чан
Сен Су Кім
Сэн Су Ким
Original Assignee
Ханмі Фарм. Ко., Лтд.
Ханми Фарм. Ко., Лтд.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ханмі Фарм. Ко., Лтд., Ханми Фарм. Ко., Лтд. filed Critical Ханмі Фарм. Ко., Лтд.
Publication of UA119533C2 publication Critical patent/UA119533C2/uk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/62—Insulins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/22—Hormones
    • A61K38/28—Insulins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/48—Drugs for disorders of the endocrine system of the pancreatic hormones
    • A61P5/50—Drugs for disorders of the endocrine system of the pancreatic hormones for increasing or potentiating the activity of insulin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

Винахід стосується аналога інсуліну, де амінокислотну послідовність інсуліну модифіковано шляхом заміни 14-ої амінокислоти у ланцюзі А глутаміновою кислотою або аспарагіном. Винахід також стосується кон’югату аналога інсуліну, композиції інсуліну тривалої дії, яка має подовжений час життя, та способу отримання такого кон’югату.

Description

Винахід також стосується кон'югату аналога інсуліну, композиції інсуліну тривалої дії, яка має подовжений час життя, та способу отримання такого кон'югату.
Винахід стосується аналога інсуліну, який має зменшений титр інсуліну та зменшену, порівняно до природної форми, зв'язувальну спорідненість до інсулінового рецептора з метою подовження часу напівжиття інсуліну в крові, кон'югату, отриманого зв'язуванням цього аналога інсуліну та носія, а також композиції довготривалої дії, що містить цей кон'югат та способу отримання цього кон'югату.
Як відомо, усування білків іп мімо відбувається різними шляхами, як-то руйнуванням їх протеолітичними ферментами у крові, виведенням їх крізь нирки або з допомогою дії рецепторів. Внаслідок цього було здійснено багато зусиль, спрямованих до покращення терапевтичної ефективності уникненням механізмів виведення білків та подовження часу напівжиття фізіологічно активних білків.
З іншого боку, інсулін є гормоном підшлункової залози людського організму, який регулює рівень глюкози в крові та відіграє важливу роль у підтримці нормальних рівнів глюкози в крові при привнесенні надлишкової глюкози крові у клітини для забезпечення їх енергією. Проте у хворих на цукровий діабет цей фермент не функціонує належним чином через його відсутність, стійкість до нього та втрату функціональної активності бета-клітин, отже стає неможливим застосування глюкози в крові як джерела енергії, та рівень її зростає, що веде до гіперглікемії та зрештою відбувається її екскреція з сечею, що впливає на розвиток різних ускладнень. Отже, інсулінова терапія є важливою для пацієнтів з аномальною секрецією інсуліну (Тип І) або стійкістю до інсуліну (Тип Ії), та рівні глюкози у крові можна нормально регулювати введенням інсуліну. Однак, як і інші білкові та пептидні гормони, інсулін має дуже короткий час напівжиття іп мімо та таким чином має недолік, який полягає у потребі повторного введення, яке при частому застосуванні викликає у пацієнтів сильний біль та дискомфорт. З цією метою для покращення якості життя подовженням часу напівжиття білка іп мімо та зменшенням частоти введення було проведено багато досліджень білкової композиції та хімічної кон'югації (отримання кон'югату жирної кислоти, кон'югату полімерного поліетилену). Наявні у продажу препарати інсуліну тривалої дії охоплюють інсулін гларгін виробництва компанії Запої Амепії5 (препарат Лантус зі строком дії приблизно 20-22 год.), інсулін детемірг (препарат Левемір зі строком дії приблизно 18-22 год.) та трезиба (препарат деглудек зі строком дії приблизно 40 год.) виробництва компанії Момо Могаї5кК. Ці інсулінові композиції тривалої дії не призводять до
Зо появи пікових концентрацій інсуліну в крові, та таким чином, вони є прийнятними для застосування як базального інсуліну. Однак, оскільки ці композиції не мають достатньо тривалого часу напівжиття, зберігається незручність, яка полягає у потребі застосовувати одну або дві ін'єкції на добу. Також в досягненні поставленої мети обмежено тим, що частота застосування інсуліну значно мала, щоб покращити зручності пацієнтів, хворих на діабет та які потребують тривалого застосування інсуліну.
У попередніх дослідженнях було повідомлено про відкриття конкретного способу виведення інсуліну іп мімо, завдяки якому 50 95 або ще більшу кількість інсуліну виводять з нирки, та решту виводять із застосуванням опосередкованого рецептором процесу виведення (КМС) з цільового місця, як-то м'язи, жир, печінка тощо.
У зв'язку з цим, у багатьох дослідницьких роботах, в тому числі ) Рпаптасої Ехр Тег (1998) 286: 959, Оіареїех Саге (1990) 13: 923, Оіареїез (1990) 39: 1033 було повідомлено, що зменшення активності іп міго з метою уникнення КМС інсуліну призводить до збільшення його рівня в крові. Однак, навіть при зменшенні КМС ці інсулінові аналоги, які мають зменшену зв'язувальну спорідненість до рецептору не можуть уникнути виведення з організму через нирки та, відповідно, існує обмеження помітного подовження часу напівжиття таких сполук у крові.
Зважаючи на ці умови, винахідники здійснили багато зусиль, спрямованих до подовження часу напівжиття інсуліну у крові. В результаті вони відкрили новий аналог інсуліну, який не має природної інсулінової послідовності, але його штучна інсулінова послідовність демонструє зменшений титр іп міго та зменшену зв'язувальну спорідненість до інсулінового рецептору, отже може бути зменшено його виведення нирками. Цей винахід було завершено після відкриття того, що час напівжиття інсуліну у крові може бути додатково збільшено з допомогою зв'язування цього аналога інсуліну з Ес - фрагментом імуноглобуліну як характерного носія, ефективного для подовження часу напівжиття.
Метою за винаходом є отримання аналога інсуліну, який має зменшений титр іп міго з метою подовження часу напівжиття інсуліну іп мімо та кон'югату, отриманого зв'язуванням його з носієм.
Конкретно метою за винаходом є отримання аналога інсуліну, який має зменшений, у порівнянні з природною формою, титр інсуліну.
Іншим метою за винаходом є отримання аналога інсуліну, кон'югат якого отримано бо зв'язуванням цього аналога інсуліну з носієм.
Іншим метою за винаходом є отримання композиції інсуліну тривалої дії, в тому числі кон'югату аналога інсуліну.
Іншим предметом за винаходом є надання способу отримання кон'югату аналога інсуліну.
Іншим предметом за винаходом є надання способу подовження часу напівжиття іп мімо із застосуванням аналога інсуліну або кон'югату аналога інсуліну, отриманого зв'язуванням аналога інсуліну з носієм.
Іншим предметом за винаходом є надання способу лікування хвороб, пов'язаних з інсуліном, який зокрема полягає у введенні аналога інсуліну або кон'югату аналога інсуліну пацієнту, який того потребує.
У одному аспекті, для досягнення зазначених вище цілей, винаходом передбачено аналог інсуліну, який має зменшений, у порівнянні з природною формою, титр інсуліну та змінену амінокислоту В - ланцюга або А - ланцюга.
У одному особливому втіленні, винаходом передбачено аналог інсуліну, який має зменшену зв'язувальну спорідненість до інсулінового рецептору.
У іншому особливому втіленні, винаходом передбачено штучний аналог інсуліну, в якому одну амінокислоту, вибрану з групи, яка складається з амінокислоти В-ланцюга у 8, 23, 24 та 25 положеннях та амінокислоти А-ланцюга у 1, 2 та 19 положеннях, заміщено аланіном, або в якому амінокислоту А-ланцюга у 14 положенні заміщено глютаміновою кислотою або аспарагіном у аналогу інсуліну за винаходом.
У іншому особливому втіленні, винаходом передбачено аналог інсуліну, вибраний з групи, яка охоплює послідовності ЗЕО ІЮ МоМо 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34 та 36.
У іншому аспекті, винаходом передбачено кон'югат аналога інсуліну, отриманий зв'язуванням описаного вище аналога інсуліну з носієм, здатним до подовження часу напівжиття.
У одному особливому втіленні, винаходом передбачено кон'югат аналога інсуліну, який отримано зв'язуванням (ї) описаного вище аналога інсуліну та (її) Ес-ділянки імуноглобуліну через (її) пептидний лінкер або непептидильний лінкер, вибраний з групи, яка охоплює поліетиленгліколь, поліпропіленгліколь, сополімери етиленгліколю та пропіленгліколю, поліоксиетіловані поліоли, полівінілові спирти, полісахариди, декстран, полівініловий етиловий
Зо етер, біорозкладані полімери, ліпідні полімери, хітини, гіалуронову кислоту, а також їх комбінації.
У іншому аспекті, винаходом передбачено композицію інсуліну тривалої дії, яка містить описаний вище кон'югат аналога інсуліну, який відрізняється збільшеною тривалістю дії та стійкістю іп мімо.
У іншому особливому втіленні, винаходом передбачено композицію довготривалої дії, яку застосовують для лікування діабету.
У іншому втіленні, винаходом передбачено спосіб отримання описаного вище кон'югату аналога інсуліну.
У іншому особливому втіленні, винаходом передбачено спосіб подовження часу напівжиття іп о мімо із застосуванням аналога інсуліну або кон'югату аналога інсуліну, отриманого зв'язуванням аналога інсуліну та носія.
У іншому особливому втіленні, винаходом передбачено спосіб лікування хвороб, пов'язаних з інсуліном, який зокрема полягає у введенні аналога інсуліну або кон'югату аналога інсуліну пацієнту, який того потребує.
Штучний аналог інсуліну за винаходом має зменшений, порівняно до природної форми, титр інсуліну та зменшену зв'язувальну спорідненість до інсулінового рецептору, уникаючи тим самим дії механізмів виведення інсуліну іп мімо. Отже, цей аналог інсуліну має збільшений час напівжиття у крові іп мімо та кон'югат аналога інсуліну-Ес-ділянки імуноглобуліну отриманий із застосуванням такого аналога також виявляє помітно збільшений час напівжиття у крові, тим самим збільшуючи зручність для пацієнтів при необхідності введення інсуліну.
Опис Фігур.
На Фіг.1 наведено результат аналізу чистоти аналогу інсуліну електрофорезом білка, який є результатом дослідження характерного аналога інсуліну, який отримав назву Аналог Мо 7 (Лінія 1- маркер розміру; Лінія 2 - природний інсулін; Лінія З - аналог інсуліну (Мо 7);
На Фіг.2 наведено результат аналізу чистоти аналогу інсуліну ВЕРХ-хроматографією, який є результатом дослідження характерного аналога інсуліну, який отримав назву Аналог Мо 7 ((А)
ВЕРХ-хроматографія зі зворотною фазою, (В) ексклюзійна ВЕРХ-хроматографія);
На Фіг.3 наведено результат пептидного картування аналога інсуліну, який є результатом дослідження характерного аналога інсуліну, який отримав назву Аналог Мо 7 (А) природний бо інсулін, (В) аналог інсуліну (Мо 7));
На Фіг.4 наведено результат аналізу чистоти кон'югату аналога інсуліну з Ес-ділянкою імуноглобуліну електрофорезом білка, який є дослідженням характерного аналога інсуліну, який отримав назву Аналог Мо 7 (Лінія 1 - маркер розміру; Лінія 2 - кон'югат аналога інсуліну (Мо 7) та
Ес-ділянки імуноглобуліну);
На Фіг.5 наведено результат аналізу чистоти кон'югату аналога інсуліну з Ес-ділянкою імуноглобуліну ВЕРХ-хроматографією, який є дослідженням характерного аналога інсуліну, який отримав назву Аналог Мо 7 (А) ВЕРХ-хроматографія зі зворотною фазою, (В) ексклюзійна
ВЕРХ-хроматографія, (С) іонообмінна ВЕРХ-хроматографія);
На Фіг.б наведено результат аналізу фармакокінетичних характеристик кон'югату природного інсуліну з Ес-ділянкою імуноглобуліну та кон'югату аналога інсуліну з Ес-ділянкою імуноглобуліну у звичайних щурів, який є дослідженням характерного аналога інсуліну, який отримав назву Аналог Мо 7 (о - кон'югат природного інсуліну з Ес-ділянкою імуноглобуліну (21,7 нмоль/кг), е - кон'югат природного інсуліну з Ес-ділянкою імуноглобуліну (65,1 нмоль/кг), о - кон'югат аналога інсуліну з Ес-ділянкою імуноглобуліну (21,7 нмоль/кг), ш - кон'югат аналога інсуліну з Ес-ділянкою імуноглобуліну (65,1 нмоль/кг). (А) - кон'югат природного інсуліну з Ес- ділянкою імуноглобуліну та кон'югат аналога інсуліну (Мо 7) з Ес-ділянкою імуноглобуліну, (В) - кон'югат природного інсуліну з Ес-ділянкою імуноглобуліну та кон'югат аналога інсуліну (Мо 8) з
Ес-ділянкою імуноглобуліну, (С) - кон'югат природного інсуліну з Ес-ділянкою імуноглобуліну та кон'югат аналога інсуліну (Мо 9) з Ес-ділянкою імуноглобуліну.
Винахід стосується аналога інсуліну, який має зменшений титр іп міїго. Цей аналог інсуліну відрізняється тим, що він має штучну послідовність інсуліну, отже він має зменшену, порівняно до природного інсуліну, зв'язувальну спорідненість до інсулінового рецептору та, відповідно, опосередковане рецептором виведення цієї сполуки з організму помітно зменшується збільшенням константи дисоціації, що призводить до появи подовження часу напівжиття у крові.
Як тут застосовано, термін "аналог інсуліну" охоплює різні аналоги, які мають зменшений, порівняно до природної форми, титр інсуліну.
Цей аналог інсуліну може бути аналогом інсуліну, що має зменшений, порівняно до природної форми, титр інсуліну, в якому змінено амінокислоту у складі В- ланцюга або А- ланцюга інсуліну. Амінокислотні послідовності природного інсуліну наведено нижче.
Зо А-панцюг:
Спу-Пе-МаІ-Спіи-СтТп-Сув-Сув- Гиг-5ег-Пе-Сув-5ег-І еи- Гут-С1п-Ї ей-С1ПІи-Авп- Туг-Субз-Азп (ЗЕО І
Мо 37)
В-ланцюг:
Ріпе-МаІ-Азп-С1п-Нів-Ї еи-Сувз-Спу-5ег-Нів-І еи-МаІ-Спи-Аїа-Ї еи- Тук- еи-МаІ-Сув-Спту-сп1и-Ага- сСіу-Рпе-РНе-Туг- Тиг-Рго-І увз-Тиг (ЗЕО ІЮ Ме 38)
Хоча застосований у Прикладах винаходу аналог інсуліну отримано із застосуванням способу генетичної рекомбінації, заявлений винахід не обмежено лише цією сполукою, але й також стосується всіх інсулінів зі зменшеним титром іп міго. Переважно цей аналог інсуліну може охоплювати перевернуті інсуліни, варіанти чи фрагменти інсуліну тощо та спосіб отримання може полягати, але без обмеження, як у застосуванні генетичної рекомбінації, такі у застосуванні твердофазного способу.
Цей аналог інсуліну є пептидом, в якому збережено функцію контролювання глюкози у крові, яка є ідентичною до подібної функції інсуліну та цей пептид охоплює агоністи, похідні, фрагменти, варіанти інсуліну тощо.
Агоніст інсуліну за винаходом є речовиною, зв'язаною з інсуліновим рецептором іп мімо, отже, незважаючи на структуру інсуліну він виявляє однакові з ним біологічні активні властивості.
Аналог інсуліну за винаходом є пептидом, який має принаймні 80 95 гомологічність амінокислотної послідовності у порівнянні з А- або В-ланцюгом природного інсуліну, має певні групи амінокислотних залишків, змінених хімічним заміщенням (наприклад, альфа- метилуванням, альфа-гідроксилуванням), усуненням (наприклад, дезамінуванням) або модифікацією (наприклад, М-метилуванням) та має функцію контролювання глюкози у крові.
Відносно предмету за винаходом, цей аналог інсуліну має (але без обмеження) зменшену, у порівнянні з природною формою, зв'язувальну спорідненість до інсулінового рецептору та зменшений титр інсуліну.
Оскільки цей аналог інсуліну є здатним мати низький рівень опосередкованої рецептором інтерналізації або опосередкованого рецептором виведення, його тип та розмір особливо не є обмеженим. Для цілей за винаходом буде прийнятним такий аналог інсуліну, в якому головний механізм виведення іп омімо є опосередкованою рецептором інтерналізацією або 60 опосередкованим рецептором виведенням.
Фрагмент інсуліну за винаходом є ознакою типу інсуліну, в якому додано або видалено одну або декілька амінокислот та додані амінокислоти можуть бути штучними амінокислотами (наприклад амінокислотами Ю-типу). Такі інсулінові фрагменти зберігають функцію контролювання глюкози у крові.
Варіант інсуліну за винаходом є ознакою пептиду, якій відрізняється від інсуліну однією або кількома амінокислотними послідовностями та зберігає функцію контролювання глюкози у крові.
Відповідні способи отримання агоністів, похідних, фрагментів та варіантів інсуліну за винаходом можуть бути застосовані незалежно або у комбінації. Винахід, наприклад, стосується пептидів, в яких одна або декілька амінокислотних послідовностей відрізняються від амінокислотних послідовностей інсуліну та які мають дезамінування / М-кінцевого амінокислотного залишку та також здатні виконувати функцію контролювання глюкози у крові.
Наприклад, аналог інсуліну може бути таким, в якому одну або декілька амінокислот вибрано з групи, вибрану з групи, яка охоплює амінокислоти В-ланцюга у 8, 23, 24 та 25 положеннях та амінокислоти А-ланцюга у 1, 2, 14 та 19 положеннях, заміщено іншою амінокислотою, та переважно в якому одну або більше амінокислот, вибраних з групи, яка складається з амінокислот В-ланцюга у 8, 23, 24 та 25 положеннях та амінокислот А-ланцюга у 1,2 та 19 положеннях, заміщено аланіном, або в якому амінокислоту А-ланцюга у 14 положенні заміщено глютаміновою кислотою або аспарагіном. Окрім цього, аналог інсуліну може бути вибрано з групи, яка охоплює послідовності зХЕО ІЮ МоМо 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34 та 36, але може також охоплювати без обмеження будь-який аналог інсуліну, який має зменшену зв'язувальну спорідненість до інсулінового рецептору.
Відповідно до одного втілення за винаходом було відкрито, що аналоги інсуліну, як--то ЗЕО
ІО МоМо 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34 та 36 та, зокрема, характерні аналоги інсуліну МоМо 7, 8 та 9 (ЗЕБЕО ІО МоМо 32, 34 та 36) мають зменшену, порівняно з природною формою, зв'язувальну спорідненість до інсулінового рецептору іп міго (Таблиця 4).
У іншому аспекті, винаходом передбачено кон'югат аналога інсуліну, отриманий зв'язуванням аналога інсуліну та носія.
Як тут застосовано, термін "носій" стосується речовини, здатної збільшувати час напівжиття прикріпленого аналога інсуліну іп мімо. Аналог інсуліну за винаходом відрізняється тим, що він
Зо має помітно зменшену, порівняно з природною формою, зв'язувальну спорідненість до інсулінового рецептору та уникає опосередкованого рецептором виведення або виведення через нирки. Отже, якщо носій, який, як відомо, при прикріпленні до різних відомих фізіологічно активних поліпептидів збільшує час їх напівжиття іп мімо з'єднано з аналогом інсуліну, то стає очевидним, що може бути збільшено час напівжиття цього аналога іп мімо та отриманий кон'югат може бути застосовано як композиції тривалої дії.
Наприклад, оскільки головним пріоритетом є подовження часу напівжиття, то цей носій, який треба з'єднати з новим інсуліном зі зменшеним титром не буде обмежуватися Ес-ділянкою імуноглобуліну. Цей носій містить біосумісний матеріал, здатний подовжувати час напівжиття іп мімо зв'язуванням його з будь-яким біосумісним матеріалом, здатним зменшувати ниркове виведення та є вибраним з групи, яка складається, але без обмеження, з різних полімерів (наприклад поліетиленгліколь та жирна кислота, альбумін та його фрагменти, окрема амінокислотна послідовність тощо), альбуміну та його фрагментів, альбумін-зв'язуючих матеріалів та полімерів повторюючихся одиниць окремої амінокислотної послідовності, антитіл, фрагментів антитіл, зв'язуючих матеріалів неонатального Ес-рецептору (надалі, ЕсКп- зв'язуючих матеріалів), сполучної тканини іп мімо або її похідних, нуклеотиду, фибронектину, трансферину, сахариду та полімерів. Окрім цього, спосіб зв'язування біосумісного матеріалу, здатного збільшувати час напівжиття іп мімо аналога інсуліну зі зменшеним титром полягає у застосуванні генетичної рекомбінації, кон'югації іп мйго тощо. Приклади такого біосумісного матеріалу можуть охоплювати ЕсКп-зв'язуючий матеріал, жирну кислоту, поліетиленгліколь, амінокислотний фрагмент або альбумін. Цей РсКп-зв'язуючий матеріал може бути Ес-ділянкою імуноглобуліну.
Аналог інсуліну та біосумісний матеріал як носія можуть бути з'єднані між собою лінкером, як-то пептидом або непептидильним полімером.
Кон'югат інсуліну може бути кон'югатом аналога інсуліну, отриманим зв'язуванням (Її) аналога інсуліну та (ії) Ес-ділянки імуноглобуліну через (ії) пептидний лінкер або непептидильний лінкер, вибраний з групи, яка складається з полієтиленгліколю, поліпропіленгліколю, сополімерів етиленгліколю-пропіленгліколю, поліоксиетиованого полиолу, полівінілового спирту, полісахаридів, декстрану, полівінілового етилового етеру, биорозкладаного полімеру, ліпідних полімерів, хітинів, гіалуронової кислоти та їх комбінацій. бо У одному особливому втіленні кон'югату аналога інсуліну за винаходом непептидильний полімер приєднано до М-кінця В-ланцюга аналога інсуліну як лінкера. У іншому особливому втіленні кон'югату аналога інсуліну за винаходом непептидильний полімер приєднано до залишку В-ланцюга аналога інсуліну як лінкеру. Модифікація у А - ланцюзі інсуліну призводить до зменшення активності та безпечності. Отже, у цих втіленнях, непептидильний полімер приєднано до В - ланцюга інсуліну як лінкера, що тим самим зберігає активність інсуліну та збільшує рівень його безпечності.
Як тут застосовано, термін "активність" означає здатність інсуліну зв'язуватися з інсуліновим рецептор та означає, що інсулін проявляє свою дію, зв'язуючись зі своїм рецептором. Таке зв'язування непептідільного полімеру до М-кінця В-ланцюга інсуліну за винаходом може бути досягнуто контролюванням рН та бажаним діапазоном рн є 4,5-7,5.
Як тут застосовано, термін "М-кінець" може бути застосовано взаємозамінне з терміном "М- кінцева ділянка".
У одному особливому прикладі винахідники отримали кон'югат аналога інсуліну-ПЕГ- Ес - імуноглобуліну прикріпенням ПЕГ до М-кінця ЕРс-ділянки імуноглобуліну та вибіркового зв'язування з ним М-кінця В - ланцюга інсуліну. Сироватковий час напівжиття цього кон'югату аналога інсуліну-ПЕГ- Ес - імуноглобуліну у порівнянні з некон'югатом було збільшено та його застосування призвело до гіпоглікемічної дії у тваринних моделях захворювань. Таким чином, очевидно, що може бути отримано новий препарат інсуліну пролонгованої дії, здатний зберігати активність іп мімо.
Ес-ділянка імуноглобуліну є безпечною для застосування як носія для лікарського засобу, оскільки вона являє собою біорозкладаний поліпептид, здатний до метаболітичного перетворення іп мімо. Також Ес-ділянка імуноглобуліну має, порівняно 3 повними імуноглобуліновими молекулами, відносно низьку молекулярну масу, отже вона має перевагу з точки зору отримання, очищення та виходу кон'югату. Ес-ділянка імуноглобуліну не містить Еар- фрагмент, який є дуже негомогенним через наявність різних амінокислотних послідовностей в залежності від підкласів антитіл, отже можна очікувати, що Ес-ділянка імуноглобуліну може дуже збільшити гомогенність сполук та бути менш антигенною у крові.
Як тут застосовано, термін "Рс-ділянка імуноглобуліну" стосується білка, який містить важколанцюгову сталу ділянку 2 (СН2) та важколанцюгову сталу ділянку З (СНЗ) імуноглобуліну за виключенням змінних ділянок важкого та легкого ланцюгів, важколанцюгової сталої ділянки 1 (СНІ) та легколанцюгової сталої ділянки 1 (СІ 1) імуноглобуліну. Також він може додатково містити шарнірну ділянку біля важколанцюгової сталої ділянки. Також Ес-ділянка імуноглобуліну за винаходом може містити частину або всі Ес - ділянки, в тому числі важколанцюгову сталу ділянку 1 (СНІ) та / або легколанцюгову сталу ділянку 1 (СІ 1) за виключенням змінних ділянок важкого та легкого ланцюгів імуноглобуліну, оскільки вона має по суті подібну до природної форми або більш кращу дію. Також вона може бути фрагментом, який має делецію відносно великої частини амінокислотної послідовності ділянки СНІ та / або СНЗ.
Отже Ес-ділянка імуноглобуліну винаходу може містити 1) домен СНІ, домен СН2, домен
СНЗ та домен СНА, 2) домен СНІ та домен СНЕІ, 3) домен СНІ та домен СНЗ, 4) домен СНЕІ2 та домен СНЗ 5) комбінацію одного або кількох доменів та шарнірну ділянку (або частину шарнірної ділянки) імуноглобуліну та 6) димер з будь-якого домену важколанцюгових сталих ділянок та легколанцюгової сталої ділянки.
Також Ес-ділянка імуноглобуліну винаходу містить похідну амінокислотної послідовності (мутантну послідовність), а також природну амінокислотну послідовність. Похідна амінокислотної послідовності містить послідовність, яка відрізняється від природної амінокислотної послідовності завдяки делееції, вставці, неконсервативному або консервативному заміщенню або комбінації таких змінень одного або кількох амінокислотних залишків. Наприклад, у Ес-ділянці (дос, як можливої мішені для модифікації можуть бути вибрані амінокислотні залишки у положеннях 214-238, 297-299, 318-322 або 327 - 331, які, як відомо, є важливими у зв'язуванні.
Крім того, також можливо застосування інших різних похідних, в тому числі похідних, які мають делецію ділянки, здатної утворювати дисульфідний зв'язок, делецію деяких амінокислотних залишків біля М-кінця природної Ес-форми або додавання метіонінового залишку до М-кінця природної Ес-форми. Крім того, для усунення ефекторних функцій також може бути наявною делеція у ділянці зв'язування комплементу, як-то у ділянці зв'язування С14а та у ділянці АОСС (залежної від антитіл клітинно-опосередкованої цитотоксичності). Способи отримання таких похідних послідовностей Ес-ділянки імуноглобуліну наведено у УМО 97/34631 та УМО 96/32478.
Також у цій галузі відомі амінокислотні заміщення у складі білків та пептидів, які звичайно не 60 впливають на активність молекул (Н.Мешгаїйй, В.І.НІЇЇї, Тпе Ргоївіп5, Асадетіс Ргез5, Мем Моїк,
1979). Найбільш часто з них трапляються заміщення типу Аа / бег, Маї / Пе, Авр / СИМ, ТНг / Бе",
Аа / Су, Аа / ТНг, Зег / Авп, Аїа / Маї, 5ег / СІу, Ту / Ре, Аїа / Рго, Гуз / Ага, Авр / Авп, Г еи / Іе,
Ї еи / Маї, Аа / Сім, Ар / Су, які здійснюють у обох напрямках.
При бажанні Ес-ділянку може бути модифіковано фосфорилюванням, сульфатуванням, акрилуванням, глюкозилуванням, метилуванням, фарнезилуванням, ацетиуванням, амідуванням тощо.
Вищезгадані похідні Ес-ділянки є похідними, які мають біологічну активність, ідентичну з активністю Ес-ділянки сполуки за винаходом або покращену структурну стійкість проти нагрівання, рН тощо.
Крім того, ці Ес-ділянки можуть бути отриманими з природних форм, виділених з організму людини та інших тварин, в тому числі корів, кіз, свиней, мишей, кроликів, хом'яків, щурів та морських свинок або вони можуть бути рекомбінантами або їх похідними, отриманими з трансформованих тваринних клітин або мікроорганізмів. У цьому разі вони можуть бути отриманими з природного імуноглобуліну виділенням цілих імуноглобулінів з організму людини або тварини та наступної обробки їх протеолітичним ферментом. Папаїн розщеплює природний імуноглобулін у Раб- та Ес- ділянках та обробка пепсином призводить до отримання фрагментів рес та К(абр)», які можна піддати ексклюзійній хроматографії для виділення Ес або реЕ'с.
Ес-ділянка людського походження переважним чином є рекомбінантною Ес-ділянкою імуноглобуліну, отриманою з мікроорганізму.
Крім того, ЕРс-ділянка імуноглобуліну може існувати у формі, яка має природні цукрові ланцюги, збільшені, порівняно до природної форми, цукрові ланцюги або може бути у деглікозилованій формі. Збільшення, зменшення або усунення цукрових ланцюгів Ес-ділянки імуноглобуліну може бути досягнуто із застосуванням загальноприйнятних у цій галузі способів, як-то хімічного, ферментативного та генно-інженерного способу із застосуванням мікроорганізмів. У цьому разі усунення з Ес-ділянки цукрових ланцюгів призводить до різкого зниження зв'язувальної спорідненості до комплементу (сід) та до зниження або до втрати залежної від антитіл клітинно-опосередкованої цитотоксичності або залежної від комплементу цитотоксичності, отже воно не викликає небажаних імунних відповідей іп мімо. В зв'язку з цим, застосування Ес-ділянки імуноглобуліну у деглікозилованій або аглікозилованій формі може
Зо бути більш прийнятним для носія лікарського засобу як предмета за винаходом.
Термін "дегліколізування", як тут застосовано, означає ферментативне усунення з Ес- ділянки цукрових функціональних груп та термін "аглікозилування" означає, що Ес- ділянку отримано з прокаріотів, переважно Е. Соїї, у неглікозилованій формі.
З іншого боку, Ес-ділянку імуноглобуліну можна отримати від людини або інших тварин, в тому числі корів, кіз, свиней, мишей, кроликів, хом'яків, щурів та морських свинок та переважно від людини. Окрім цього, Ес-ділянка імуноглобуліну може бути Ес- ділянкою, отриманою з імуноглобулінів класу Ідс, ІдА, дО, ІДЕ та ІЗ9М або їх комбінацій або гібридів. Переважно її отримують з імуноглобулінів класу до або ІДдМ, які є одними з найбільш розповсюджених білків у крові людини. Ще переважніше її отримують з імуноглобулінів класу дос, які, як відомо, підвищують час напівжиття білків, які зв'язують ліганди.
З іншого боку, термін " комбінація ", як тут застосовано, означає, що поліпептиди, які кодують одноланцюгові Ес-ділянки імуноглобуліну однакового походження є з'єднаними з одноланцюговим поліпептидом іншого походження з отриманням димеру або мультимеру. Отже димер або мультимер може бути отримано із застосуванням двох або кількох фрагментів, вибраних з групи, яка складається з Ес-фрагментів Іде Ес, ІдА Ес, ЗМ Ес, ІдО Ес та ІДЧЗЕ Ес.
Термін "гібрид", як тут застосовано, означає, що у одноланцюговій Ес-ділянці імуноглобуліну присутні послідовності, які кодують дві або кілька Ес-ділянок імуноглобуліну різного походження та винаходом передбачено застосування різних типів гібридів. Отже доменні гібриди можуть складатися з 1-4 доменів, вибраних з групи, яка складається з ділянок СНІ, СН2, СНЗ та СНА
Ес-ділянок імуноглобулінів Іде, ІДМ, ІдА, ІДЕ та ІдО та може також містити шарнір.
З іншого боку, клас імуноглобулінів (дз можна також розділити на підкласи Ідс1, Ідса2, Ід та Ідс4 та винахід також стосується комбінацій та гібридів цих підкласів, з яких більш бажаними є підкласи Ідс2 та Ід04 та найбільш бажаною є Ес- ділянка Їд04, яка рідко має ефекторні функції, як-то СОС (залежної від комплементу цитотоксичності). Отже, як носія лікарського засобу за винаходом, найбільш бажаною Ес-ділянкою імуноглобуліну є неглікозилована Ес- ділянка, яка походить від ЇдД4 людини. Ес-ділянка людського походження є більш бажаною, ніж
Ес-ділянка іншого походження, яка може мати антигенну дію в організмі людини та викликати небажані імунні відповіді, як-то продукування нових антитіл проти антигену.
У особливому втіленні кон'югату аналога інсуліну, обидва кінці непептидильного полімеру бо можуть бути з'єднані з М-кінцем Ес-ділянки імуноглобуліну та аміногрупою М- кінця В-ланцюга аналога інсуліну або з є-аміногрупою або, відповідно, з тіоловою групою внутрішнього лізинового залишку В - ланцюга.
Конструкцію за винаходом типу "Ес-ділянка-лінкер-аналог інсуліну" отримують з різними молярними співвідношеннями. Отже, кількість Ес - фрагмента та / або лінкеру, з'єднаного з одиничним аналогом інсуліну є необмеженою.
Крім того, зв'язок Ес-ділянки, певного лінкеру та аналога інсуліну за винаходом може охоплювати всі типи ковалентних зв'язків та всі типи нековалентних зв'язків, як--о водневих зв'язків, іонних взаємодій, сил Ван-дер-Ваальса та гідрофобних взаємодій, із застосуванням яких Ес-ділянка та аналог інсуліну мають вигляд отриманого генетичною рекомбінацією злитого (гібридного) білка. Однак, беручи за увагу фізіологічну активність аналога інсуліну, цей зв'язок здебільшого є отриманим з допомогою ковалентних зв'язків, але не обмежуючись ними.
З іншого боку, Ес-ділянка за винаходом, специфічний лінкер та аналог інсуліну можуть бути з'єднаними між собою на М- або С-кінцях та переважно у вільній групі та головним чином, ковалентний зв'язок може утворюватися на М-кінці, на амінокислотному залишку лізину, амінокислотному залишку гістидину або на вільному цистеїновому залишку.
Крім того, зв'язок Ес-ділянки за винаходом, специфічного лінкеру та аналога інсуліну може бути отримано в певному напрямку. Отже, лінкер може бути приєднано до М-кінця, С-кінця або до вільної групи Ес-ділянки імуноглобуліну та також його можна приєднати до М-кінця, С-кінця або до вільної групи аналога інсуліну.
Непептидильний лінкер може бути приєднано до фрагменту М-кінцевої аміногрупи імуноглобуліну та цей зв'язок не є обмеженим будь-якими лізиновими або цистеїновими залишками послідовності фрагменту імуноглобуліну.
Крім того, у особливому втіленні кон'югату аналога інсуліну, кінець непептидильного полімеру може бути з'єднано зі внутрішнім амінокислотним залишком або з вільною хімічно активною групою, здатними зв'язуватися, але без обмеження, окрім зв'язування з М-кінцем Ес- ділянки імуноглобуліну, також з хімічно активною групою на кінці непептидильного полімеру.
Значення непептидильного полімеру за винаходом означає біосумісний полімер, який містить два або декілька повторюючихся елементів, з'єднаних між собою будь-яким ковалентним зв'язком за виключенням пептидного зв'язку. Такий непептидильний полімер може
Зо мати два або три кінці.
Непептидильний полімер, який може бути застосовано у винаході може бути вибрано з групи, яка складається з поліетиленгліколю, поліпропіленгліколю, сополімерів етиленгліколю та пропіленгліколю, поліоксиетилованих поліолів, полівінілового спирту, полісахаридів, декстрану, полівінілового етеру, полімерів, що розкладаються мікроорганізмами, як-то РІ А (полімолочна кислота)) та РІ СА (полімолочна-гліколева кислота), ліпідних полімерів, хітинів, гіалуронової кислоти та їх комбінацій та переважно з поліетиленгліколю. Також до предмету за винаходом включено похідні цих сполук, які є добре відомими у цій галузі та можуть бути легко отримані фахівцями.
Пептидний лінкер, який застосовують для отримання злитих білків із застосуванням загальноприйнятного способу злиття зі збереженням рамки зчитування має певні недоліки через те, що він легко розщеплюється протеолітичним ферментом іп мімо, отже з допомогою носія, в якому застосовано такий лінкер стає неможливим досягнути очікуваного суттєвого ефекту подовження часу напівжиття активного лікарського засобу у крові. Для отримання непептидильного лінкеру може бути застосовано полімер, який має стійкість до протеолітичного ферменту для підтримки часу напівжиття цього пептиду у крові, подібного до часу напівжиття носія. Отже, може бути застосовано без обмеження будь-який непептидильний полімер, оскільки він є полімером, якому притаманна вищезазначена функція, тобто він є полімером, який має стійкість до дії протеолітичного ферменту іп мімо. Цей непептидильний полімер має молекулярну масу у межах 1-100 кДа та переважно у межах 1-20 кДа.
Непептидильний полімер винаходу, з'єднаний з Ес-ділянкою імуноглобуліну може бути одним полімером або комбінацією різних типів полімерів.
Непептидильний полімер винаходу також має реактивну групу, здатну зв'язуватися з Ес- ділянкою імуноглобуліну та білковим лікарським засобом.
Цей непептидильний полімер на обох кінцях має реактивну групу, яка є переважно вибраною з групи, яка складається з хімічно активної альдегідної групи, пропіональдегідної групи, бутиральдегідної групи, малеїмідної групи та сукцинімідної похідної. Сукцинімідна похідна може бути сукцинімідил-пропіонатом, гідроксисукцинімідилом, сукцинімідил-карбоксиметилом або сукцинімідил-карбонатом. Зокрема, якщо непептидильний полімер має на обох кінцях реактивну альдегідну групу, то обидва його кінця ефективно зв'язують фізіологічно активний бо поліпептид та імуноглобулін з мінімальними неспецифічними реакціями. Отриманий відновлювальним алкілуванням по альдегідному зв'язку кінцевий продукт є набагато стійкішим, ніж продукт, з'єднаний з допомогою амідного зв'язку. Альдегідна хімічно активна група вибірково зв'язується з М-кінцем в умовах низького рН та зв'язується з лізиновим залишком з отриманням ковалентного зв'язку в умовах високого рнН, як-то рН 9,0.
Хімічно активні групи на обох кінцях непептидильного полімеру можуть бути однаковими або відрізнятися. Наприклад, непептидильний полімер може мати малеїмідну групу на одному кінці та альдегідну групу, пропіональдегідну групу або бутиральдегідну групу на іншому кінці. При застосуванні як непептидильного полімеру поліетиленгліколю 3 хімічно активною гідроксигрупою на обох кінцях, ця гідроксигрупа може бути активована різними хімічно активними групами із застосуванням відомих хімічних реакцій або для отримання одноланцюгового кон'юЮгату аналога інсуліну за винаходом може бути застосовано поліетиленгліколь, який має у своєму складі наявну у продажу модифіковану реактивну групу.
Кон'югат аналога інсуліну за винаходом зберігає активні властивості загальноприйнятного інсуліну іп мімо, як-то енергетичний та цукровий метаболізм, а також збільшує час напівжиття аналога інсуліну у крові та помітно збільшує тривалість ефективності пептиду іп мімо, отже, він є корисним у лікуванні діабету.
У одному прикладі винаходу було підтверджено, що при приєднанні до носія, здатного збільшувати час напівжиття іп мімо, аналог інсуліну, який має зменшену зв'язувальну спорідненість до інсулінового рецептору виявляє більш тривалий, ніж у природного кон'югату інсуліну час напівжиття іп мімо (Фіг. б).
У іншому аспекті, винаходом передбачено композицію інсуліну тривалої дії, яка містить кон'югат аналога інсуліну. Ця композиція інсуліну тривалої дії може бути композицією зі збільшеною тривалістю дії та стійкістю іп мімо. Композиція тривалої дії може бути фармацевтичною композицією для лікування діабету.
Фармацевтична композиція, яка містить кон'югат за винаходом може містити фармацевтично прийнятні носії. Фармацевтично прийнятний носій, призначений для перорального введення може містити зв'язуючий агент, мастило, розпушувач, наповнювач, солюбілізатор, диспергуючий агент, стабілізатор, суспендуючий агент, барвник, ароматизатор тощо. Фармацевтично прийнятний носій, призначений для введення ін'єкцією може містити
Зо буферизуючий агент, консервант, анальгетик, солюбілізатор, ізотонічний агент та стабілізатор.
Фармацевтично прийнятний носій, призначений для місцевого введення може містити основу, наповнювач, мастило, консервант тощо. Фармацевтична композиція за винаходом може бути отриманою у численних лікарських формах у комбінації з вищезгаданими фармацевтично прийнятними носіями. Наприклад, для перорального введення, фармацевтичну композицію може бути отримано у вигляді таблеток, пастилок, капсул, еліксирів, суспензій, сиропів або пластин. Для введення ін'єкцією, фармацевтичну композицію може бути отримано у вигляді ампул з одиничною дозою або мультидозового контейнера. Фармацевтичну композицію також може бути отримано у вигляді розчинів, суспензій, таблеток, пігулок, капсул та препаратів з уповільненим вивільненням.
З іншого боку, приклади прийнятних для композиції носіїв, наповнювачів та розчинників охоплюють лактозу, декстрозу, цукрозу, сорбіт, маніт, ксиліт, еритрит, мальтит, крохмаль, камедь, альгінат, желатин, фосфат кальцію, силікат кальцію, целюлозу, метилцелюлозу, мікрокристалічну целюлозу, полівінілпіролідон, воду, метилгідроксибензоат, пропілгідроксибензоат, тальк, стеарат магнію, мінеральні оливи тощо. Крім того, ці фармацевтичні композиції також можуть містити наповнювачі, антикоагулянти, мастила, зволожувачі, ароматизатори, антисептики тощо.
У іншому аспекті, винаходом передбачено спосіб лікування хвороб, пов'язаних з інсуліном, який полягає у введенні аналога інсуліну або кон'югату аналога інсуліну пацієнту, який того потребує.
Кон'югат винаходу є корисним у лікуванні діабету, отже цю хворобу можна буде лікувати введенням фармацевтичної композиції, в тому числі зазначеної вище.
Термін "введення", як тут застосовано, означає введення попередньо визначеної сполуки пацієнту з допомогою певного прийнятного способу. Кон'югат винаходу може бути введено будь-яким загальноприйнятним шляхом, оскільки він є здатним досягати бажаної тканини, включаючи, але без обмеження, внутрішньочеревне, внутрішньовенне, внутрішньом'язове, підшкірне, внутрішньошкірне, пероральне, місцеве, интраназальноеє, ректальне та внутрішньолегеневе введення. Однак, оскільки пептиди засвоюються при пероральному введенні, активні інгредієнти композиції для перорального введення повинні бути покриті або бути отримані у вигляді, прийнятному для захисту від деградації в шлунку. Переважно бо композицію за винаходом може бути введено у формі, прийнятній для застосування ін'єкцією.
Окрім цього, цю фармацевтичну композицію може бути введено із застосуванням певного обладнання, здатного до транспортування активних інгредієнтів до клітини-мішені.
Крім того, фармацевтична композиція за винаходом може бути визначеною кількома супутніми чинниками, як-то типи захворювань, які підлягають лікуванню, шляхи введення, вік, стать та маса тіла пацієнта, тяжкість хвороби, а також тип лікарського засобу як активного компонента. Оскільки фармацевтична композиція цього винаходу має чудову тривалість іп мімо та титр, вона має перевагу у вигляді значного зниження частоти введення фармацевтичної композиції винаходу.
У ще одному аспекті, винаходом передбачено спосіб отримання кон'югату аналога інсуліну, який полягає у отриманні аналога інсуліну; отриманні носія та зв'язуванні аналога інсуліну та носія.
У іншому аспекті, винаходом передбачено спосіб подовження часу напівжиття іп мімо із застосуванням аналога інсуліну або кон'югату аналога інсуліну, отриманого зв'язуванням аналога інсуліну та носія.
Здійснення винаходу.
Далі даний винахід буде описано більш докладно з посиланням на приклади. Однак ці приклади наведені тільки в ілюстративних цілях, та винахід не призначено бути обмеженим цими прикладами.
Приклад 1: Отримання вектора експресії одноланцюгового аналога інсуліну.
Для отримання аналогів інсуліну було синтезовано кожен з цих аналогів, які мали у складі модифіковану амінокислоту у А - або В - ланцюзі. Для цього було застосовано вектор експресії природного інсуліну як матриці, прямі та зворотні олігонуклеотиди (Таблиця 2) та потім для ампліфікації гена кожного аналога було здійснено реакцію ПЛР.
У наступній Таблиці 1 наведені амінокислотні послідовності, змінені у А - або В -ланцюзі та назви аналогів. Отже, Аналог 1 є випадком, коли перший гліцин А - ланцюга заміщено аланіном та Аналог 4 є випадком, коли восьмий гліцин В - ланцюга заміщено аланіном.
Таблиця 1.
Праймери для ампліфікації аналога інсуліну наведені у наступній Таблиці 2.
Зо
Таблиця 2
АСАССАТТаТТоСАСААТСЯСАСОСТТоТаСАсСа7ааАССс З ЗЕО ІЮ Мо.2 5 аатТАСАаСАТТаТТсСсАССОСОССАСОСТТотТасСАсаацаА з" ЗЕО ІЮ Мо.4 5 апАТССТСАаТТАСАсСОСсаеттттоСсАасСста7а,тАаАа з" ЗЕО ІЮ Мо.б
БАасТоСАССАсСОТатаАсСасСсАСАСААСаТа7аттасттТААС З ЗЕО ІЮ Мо.8 5 сттасататаТАСААаААсСа7сто,!тТоссСсасАСАСТАС З" ЗЕО І Мо.10 сатоттасатататТАсАдАас,асасстоа,;ттосссасАСАС З" ЗЕО І Мо.12 ссасатстоесатататаСсасаАддасстоаТсссСсСасА З! ЗЕО ІЮ Мо.14 5з-сдатлаттстосАасстатссасАа,сасаасАсАатастаа-з ЗЕО І Мо.16 з-атлатстосСАдестааттаадссаАасСсАаАТа|ста-з ЗЕО ІЮ Мо.18
Реакцію ПЛР для ампліфікації аналога інсуліну проводили у вигляді 18 циклів (30 сек. при 95 С, 30 сек. при 55 "С та 6 хв. при 68 "С). Фрагменти аналога інсуліну, отримані в цих умовах,
вставили у вектор рЕТ22Б для наступної експресії у вигляді внутрішньоклітинних тільцевих включень, та отримані вектори експресії було позначено, як рЕТ22р-аналоги інсуліну 1-9. Таким чином були отримані вектори експресії, які містили нуклеїнові кислоти, що кодують амінокислотні послідовності аналогів інсуліну 1-9 під контролем промотора 17, та отримано експресію білків аналога інсуліну у вигляді внутрішньоклітинних тільцевих включень у клітинах- хазяях.
Послідовності ДНК та білкові послідовності аналогів інсуліну 1-9 наведено у наступній
Таблиці 3.
Таблиця З
ТТО СТТ ААС САА САС ТтТОо тот вас ТСА САС Ста та вАА ОСТ
СТО ТАС СТА СТО ТОС бо БАА СОА СОС ТТ То ТАС АСА ССС днк Ада дсо Сассоа вда асСА пада ВАС Ста САа ато са Сас ато
Аналог 1 вда ста сяеасавсаасвсассстаатасАцвасдас ста сАа ССС то 19 асс ста вда сова то сто САа Ас Сат пса АТТ ста пАА САА тастатАссодас АТС Тас то сто ТАС САС Ста пАс ААС ТАС
ТОС ААС
Ре Маї Авп асп Нів І еи Суз Слу 5ег Ніз Гей Ма! Спи Аа Геи Туг І еи Маї
Суз Сіу Спи Агу Сіу Рпе Рпе Туг ТНг Рго Гуз Тиг Агу Агу Сім Аа Сім Азр
Ї ем СіІп Маї Счу Сп Ма! Спи Гей (у Счу Спу Рго Слу Аа Слу 5ег Ієи Сп Рго 20
Ї ем АЇа І еєи Си Слу бег І еи Си Гуз Аго Аа Пе Ма! Спи Сп Суз Суз Тиг бе
Пе Суз Зег І єи Туг Сп Гей С1и Азп Туг Суз Авп
ТТ ОТ ААС САА САС ТтТа тат вас ТСА САС Ста ста сАА асСтТ
СТО ТАС СТА СТО ТОС бо БАА СОА СОС ТТ То ТАС АСА ССС
Ада дсо Сассоа вда асСА пада ВАС Ста САа ато са Сас ато
Аналог 2 ДНК вда ста сяеасавсаасвсассстаатасАцвасдас ста сАа ССС то 21 асс ста вда сова то ста сда Аа Сат вас ссо ато ОАА САА
ТОСТОТАСС АОС АТС ТОС ТоС СТО ТАС САС СТО БАС ААС ТАС
ТОС ААС
Ре Маї Авп сп Ніз Гей Суз Су 5ег Ніз Геи Ма! Спи Аа І еи Туг І єи Маї
Суз Сіу Спи Агу Сіу Рпе Рне Туг Тиг Рго Гуз ТНиг Агу Аїд Сім Аа Сім Азр
Ї ем СіІп Маї Спу Сп Ма! Спи Гей Су Счу Спу Рго Слу Аа Су бег І еи Сп Рго 22
Геи Аа Геи Си слу зег ГГ еи Сп Гуз Агу Спу Аа Ма! Спи (зп Суз Суз Тиг зег Пе Суз Зег І еи Туг Сп Геи Си Авп Туг Суз Азп
ТТО СТ ААС САА САС ТТОо ТОТ ОС ТСА САС СТО СТО САА ОСТ
СТО ТАС СТА СТО ТОС бо БАА СОА СОС ТТ То ТАС АСА ССС
Ада дсо Сассоа пада асСА Сда АС Ста САС ата вас САС ато
Аналог З ДНК вда ста сяеасавсаасвсассстаатасАцвасдас ста сАа ССС то 23 асс ста вда соа то Ста сда дАс сат вас АТ ата пАА САА
ТОСТОТАСС АОС АТС ТОС ТоС СТО ТАС САС СТО БАС АС осо
ТОС ААС
Ре Маї Азп СіІп Ніз І еи Су СіІу Зег Ніз І еи Ма! Си Аа І еи Туг Г еи Маї
Суз Сіу Спи Аїд Счу Ре Ре Туг ТНг Рго Гуз Тиг Агу Агу Сім Аа Сіи А5р
Ї ем Сп Маї Счу Си Ма! Спи Гей Су Счу Спу Рго Слу Аа Су бег І еи Сп Рго 24
Геи Аа Геи Си Счу зег Геи Сп Гуз Агу Су Ме Ма! Спи (п Суз Суз Тиг зег Пе Сувз Зеї Г еи Туг СІп Геи Сім Азп Аа Суз Авзп
ТТ ОТ ААС САА САС ТтТа тат аа ТСА САС Ста ста сАА ССТ
СТО ТАС СТА СТО ТОС бо БАА СОА СОС ТТ То ТАС АСА ССС
Ада дсо Сассоа вда асСА пада ВАС Ста САа ато са Сас ато
Аналог 4 ДНК вда ста сяеасавсаасвсассстаатасАсасАасстасАа ссс то 25 асс ста вда соа то Ста сда дАс сат вас АТ ата пАА САА
ТОСТОТАСС АОС АТС ТОС ТоС СТО ТАС САС СТО БАС ААС ТАС
ТОС ААС
Ре Маї Авп асп Ніз І еи Суз Аа 5ег Ніз І еи Маї Сім Аа Г еи Туг І еи Маї
Суз Сіу Спи Агу Сіу Рпе Рпе Туг Тиг Рго Гуз Тиг Агу Агу Сім Аа Сіи А5р
Геи СіІп Маї Слу Сп Маї Си Гей Спу Сіу слу Ріо Слу Аа Слу 5ег І еи Сп Рго 26
Геи Аа Г еи Си слу зег Гей Сп Гуз Агу Слу йе Ма! Спи (п Суз Суз Тиг зег Пе Суз 5ег І єи Туг СІп Геи Сім Азп Туг Суз Авп
ТТ ОТ ААС САА САС ТтТа тат вас ТСА САС Ста ста сАА асСтТ
СТО ТАС СТА СТО ТОС бо БАА СОА СО ТТ То ТАС АСА ССС
Ада дсо Сассоа вда асСА пада ВАС Ста САа ато са Сас ато
Аналог 5 ДНК вда ста сяеасавсаасвсассстаатасАцвасдас ста сАа ССС то 27 асс ста вда соа тос Ста сда дАа сат пас АТ ата сАА САА
ТОСТОТАСС АОС АТС ТОС ТоС СТО ТАС САС СТО БАС ААС ТАС
ТОС ААС
Ре Маї Авп асп Нів І еи Суз Слу 5ег Ніз Гей Ма! Спи АІо Геи Туг І еи Маї
Суз Сіу Спи Аг Аа РНе Ре Туг Тиг Рго уз ТНиг Агу Агу Сім Аа Сіи Авр
Ї ем СіІп Маї Счу СіІп Ма! Спи Гей (у Счу Спу Рго Стиу Аа Су 5вї Гей Сп Рго 28
Геи Аа Геи Си слу зег Гей Сп Гуз Агу Слу Пе Ма! Спи (зп Суз Суз Тиг зег Пе Суз Зег І еи Туг СІп Геи Сп Азп Туг Сув Авп
Продовження таблиці З
ТО ат ААС САА САС ТтТа тат вас ТСА САС Ста ата аАА СТ
СТО ТАС СТА СТО ТОС СбО САА ССА СОС Осо ТТС ТАС АСА СОС
ААс АС Сас Сас алла асА па аАсС Ста сао сто асо СА, ата
Аналог 6 ДНК сода ста вас саа вас сс аатасА сис АОС ста са ссс та 29 асо ста бас аа То Ста Сас Ада Сат спас. АТ ста аАА САА
ТОС ТСТ АСС АОС АТС ТОС ТС СТ ТАС САС СТО САС ААС ТАС
ТасС АС
Ре Маї Авп ап Ніз І еи Сувз Сіу 5ег Ніз І еи Маї Сім Аа Г еи Туг Геи Маї
Суз С1Іу Сім Агу Су Аа Ре Туг Тпг Рго Гуз Тиг Агу Агу Сім Аа Сі Ав5р
Геи СіІп Маї Сіу Сп Ма! Си Гей СЧу Сіу Су Рго Су Аа Слу 5ег І еи Сп Рго 30
Геи Аа Геи Си слу зег ГГ еи Сп Гуз Агу Спу Ме Ма! Спи Сп Сув Суз ТИг зег Пе Суз Зег Геи Туг Сп Геи Сім Азп Туг Суз Авп
ТО ат ААС САА САС ТтТа тат вас ТСА САС Ста ата пАА СТ
СТО ТАС СТА СТО ТОС СбО САА ССА СОС То СО ТАС АСА СОС
ААС АСС СОС ССО САС ОСА САС САС СТО САС сто со САС сто
Аналог 7 ДНК сода ста вас саа вас сс аатасА сис АОС ста са ссс та 31 асо ста вас ацса То Ста бда Аа Сат пас АТТ ста БАА САА
ТОС ТСТ АСС АОС АТС ТОС То СТ ТАС САС СТО САС ААС ТАС
ТаС ААС
Ре Маї Авп асп Ніз Геи Суз Слму 5ег Ніз І еи Маї Сіи Аа Геи Туг І еи Маї
Суз Сіу Сп Агу Сіу Ре Аа Туг Тиг Рго Гуз Тиг Агу Агу Сіли Айїа сі Авр
Ї ем СіІп Маї Спу Сп Ма! Спи Гей Су Счу Счу Рго Слу Аа Сіу 5ег І еи Сп Рго 32
Геи Аа Геи Си Счу зег Геи Сп Гуз Агу Су Ме Ма! Спи (и Суб Суз ТИг зег Пе Суз Зег І еи Туг Сп Геи Си Авп Туг Суз Азп
ТО ат ААС САА САС ТтТа тат вас ТСА САС Ста ата аАА СТ
СТО ТАС СТА СТО ТОС ССО САА ССА ССС ТТС ТТ ТАС АСА Со
ААс АС Сас Сас алла асА па аАсС Ста сао сто асо СА, ата
Аналог 8 ДНК сода ста вас саа вас сс аатасА сис АОС ста са ссс та 33 асо ста вас ацса То Ста бда Аа Сат пас АТТ ста БАА САА
ТОС ТСТ АСС АОС АТС ТОС ТС СТО САА САС СТО САС АС ТАС тас ААС ТОаА
Ре Маї Авп сп Ніз Гей Суз Су 5ег Ніз Геи Ма! Спи Аа І еи Туг І єи Маї
Суз Сіу Спи Агу Су Рпе Рпе Туг Тиг Рго Гуз Тиг Агу Агу Сім Аа Сіи А5р
Ї ем СіІп Маї Спу Сп Ма! Спи Гей Су Счу Счу Рго Слу Аа Сіу 5ег І еи Сп Рго 34
Геи Аа Геи Си слу зег ГГ еи Сп Гуз Агу Су Ме Ма! Спи Сп Сув Суз ТИг зег Пе Суз ЗегГеи Спи (4п Гей Си Авзп Туг Суб Авп
ТТ СТТ ААС САА САС ТТОо ТОСТ СОС ТСА САС СТО СТО САА ОСТ
СТО ТАС СТА СТО ТОС ССО САА ССА ОСС ТТ ТТ ТАС АСА Со
ААс АС Сас Сас сла асА сла пАС Ста Сас сто асо СА, ата
Аналог 9 ДНК сода ста вас саа вас сс аатасА сис АОС ста са ссс та 35 асо ста вас ацса То Ста бда Аа Сат пас АТТ ста БАА САА
ТОС ТСТ АСС АОС АТС ТОС ТС СТО ААС САС СТО САС дАС ТАС тас ААС ТОаА
Ре Маї Авп сп Ніз Геи Суз Счіу 5ег Ніз Геи Ма! Спи Аа Геи Туг І еи Маї
Суз Сіу Спи Агу Су Рпе Ре Туг Тиг Рго Гуз Тиг Агу Агу Сім Аа Сіи А5р
Геи СіІп Маї Сіу Сп Ма! Си Гей Су Сіу Су Рго Сіу Аіа Слу Зег І еи Сп Рго 36
Геи Аа Геи Си слу зег Геи Сп Гуз Агу Спу Пе Ма! Спи Сп Сув Суз ТИг зег Пе Су Зег Геи Азп Сп Геи Си Авп Туг Суз Азп
Приклад 2: Експресія рекомбінантного злитого пептиду аналога інсуліну.
Експресія рекомбінантних аналогів інсуліну відбувалася під контролем промотора 17.
Бактерії Е.соїї ВІ21-0ЕЗ (ЕБ. сої В Б-дст отр Нзаз(В-тВ-) да! АОЕЗ); Момадеп) трансформували кожним з векторів експресії рекомбінантних аналогів інсуліну. Трансформацію здійснювали згідно з рекомендованим протоколом (Момадеп). Одиничні колонії, трансформовані кожним з рекомбінантних векторів експресії зібрали та інокулювали у 2Х середовищі І В, яке містило ампіцилін (50 мкг/мл) з наступним 15-ти годинним культивуванням при 37 "С. Потім культуральне середовище з рекомбінантним штамом змішали з 2Х середовищем ІВ, яке містило 30 95 гліцерин у об'ємному відношенні 1:1 (м/м). Кожен 1 мл суміші, яку потім було застосовано як клітинного запасу для отримання рекомбінантного злитого білка помістили у кріопробірку та зберігали при -140 С.
Для отримання експресії рекомбінантних аналогів інсуліну по одній пробірці з кожного клітинного запасу піддали відтаванню та інокулювали у 500 мл 2Х середовища ІВ та культивували зі струшуванням при 37 "С протягом 14-16 год. до досягнення оптичної густини (00600) у 5,0 або вище. Отримане культуральне середовище було застосовано, як культуральне середовище для посіву, яким було інокульовано 50 л ферментер. (М5.)-О2,
В.Е.МАКИВІЗНІ, Ударап), що містив 17 л середовища для ферментації та ферментацію головної партії було розпочато. Умови культивування (температура 37 "С, швидкість потоку повітря 20 л./хв. (1 у об'ємному відношенні у хв.), швидкість струшування 500 об/хв. та рн 6,70) підтримували із застосуванням 30 95 розчину аміаку. Ферментацію здійснювали періодичним культивуванням з підживлюванням додаванням живильного розчину при зменшенні поживних речовин у культуральному середовищі. Ріст штаму було піддано моніторингу вимірюванням значення оптичної густини. Коли значення оптичної густини перевищило 100, у середовище додали ІПТ" до кінцевої концентрації 500 мкмоль та культивування тривало після введення ще приблизно 23-25 год. Після закінчення культивування, рекомбінантні штами зібрали центрифугуванням та зберігали до застосування при -80 "С.
Приклад 3: Відновлення та рефолдинг рекомбінантного аналога інсуліну.
Для перетворення рекомбінантного аналога інсуліну, експресію якого було досягнуто у
Прикладі 2 на розчинні форми, клітини були піддані руйнуванню з наступним рефолдингом. 100 г. (вологої маси) клітинного осаду ресуспендували у 1 л. лізуючого буферу (50 мМ Тті5-НОСЇ (рн 9,0), 1 мМ ЕОТА (рн 8,0), 002 М Масі та 0,5 95 Тийоп Х-100). Клітини піддали руйнуванню із застосуванням обладнання для отримання наночастинок М-110ЕН Місгойцшіаігегке Ргосеззог (АС
Тесппоїоду Согр. Моде! М1475С) з робочим тиском 103,4 МПа (15000 фунтів на квадратний дюйм). Зруйнований таким чином клітинний лізат центрифугували протягом 20 хв при 7,000 об/хв. та 4 "С, супернатант вилучили та осад ресуспендували у 3 л. промивочного буферу (0,5 ую ТИйоп Х-100 та 50 мМ Ттгі5з-НСІ (рН 8,0), 0,2 М Масі, 1 мм ЕОТА). Після 20-хвилинного центрифугування при 7,000 об/хв. та 4 "С, клітинний осад ресуспендували у дистильованій воді з наступним центрифугуванням у подібних умовах. Отриманий осад ресуспендували у 400 мл буферу (1 М гліцин, 3,78 г. цистеїну-НСІ, рН 10,6) та перемішували при кімнатній температурі протягом години. Для відновлення рекомбінантний аналог інсуліну потім ресуспендували, додали 400 мл 8М сечовини та суміш перемішували при 40 "С протягом години. Для рефолдингу солюбілізованих рекомбінантних аналогів інсуліну їх піддали 30 - хвилинному центрифугуванню при 7000 об/хв. з температурою 4 "С з отриманням супернатанту, до якого з допомогою перистальтичної помпи зі швидкістю потоку у 1000 мл / год. з 16-годинним перемішуванням при 4 "С додали 2 л дистильованої води.
Приклад 4: Хроматографічна очистка катіонним зв'язуванням.
Зо Підданий рефолдингу зразок завантажили на колонку Боцгсе 5 (СЕ Пеайсаге), врівноважену 20 мМ буфером цитрату натрію (рН 2,0), який містив 45 95 етанолу та потім білки аналога інсуліну елюювали у 10 об'ємах колонки з лінійним градієнтом 0 95 - 10095 20 мМ буфера цитрату натрію (рН 2,0), який містив 0,5 М хлориду калію та 45 95 етанол.
Приклад 5: Обробка трипсином та карбоксипептидазою В.
Для усунення солей з елюйованих зразків було застосовано із застосуванням колонки для знесолювання та існуючий буфер замінили новим (10 мМ Ттгі5-НСЇ, рН 8,0). Потім у відповідності до отриманого зразка білка, до нього додали трипсин відповідно до 1000-разового молярного співвідношення та карбоксипептидазу В відповідно до 2000-разового молярного співвідношення та реакційну суміш перемішували при 16 "С протягом 16 год. Для зупинення реакції, для зниження рН до 3,5 до суміші було додано 1 М цитрат натрію (рН 2,0).
Приклад 6: Хроматографічна очистка катіонним зв'язуванням.
Отриманий реакцією зразок завантажили на колонку Зошигсе 5 (СЕ ПеайВсаге), врівноважену 20 мМ буфером цитрату натрію (рН 2,0), який містив 45 95 етанолу та потім білки аналога інсуліну елюювали у 10 об'ємах колонки з лінійним градієнтом 0 95 - 100 95 20 мМ буфера цитрату натрію (рН 2,0), який містив 0,5 М хлориду калію та 45 95 етанол.
Приклад 7: Хроматографічна очистка аніонним зв'язуванням.
Для усунення солей з елюйованих зразків було застосовано із застосуванням колонки для знесолювання та існуючий буфер замінили новим (10 мМ Тгіб-НСІ, рН 7,5). Для виділення чистого аналога аналогу інсуліну з отриманого у Прикладі 6 зразка, цей зразок завантажили на аніонообмінну колонку (Зоигсе 0: СЕ Ппеаййсаге), врівноважену 10 мМ буфером Ттгі5 (рН 7,5) та білок аналога інсуліну елюювали у 10 об'ємах колонки з лінійним градієнтом 0 925 - 100 95 10 мМ буфером Ттгів (рН 7,5), який містив 0,5 М хлориду натрію.
Аналіз чистоти отриманого таким чином аналога інсуліну було здійснено з допомогою білкового електрофорезу (злектрофорез в полиакриламидному гелі в присутності додецилсульфату натрію, Фіг. 1) та ВЕРХ-хроматографії (Фіг. 2) та модифікації амінокислот були визначені пептидним картуванняи (Фіг. 3) та аналізу молекулярної маси кожного піку.
В результаті було виявлено наявність бажаної модифікації амінокислотної послідовності кожного аналога інсуліну.
Приклад 8: Отримання кон'югату аналога інсуліну (Мо 7) з Ес-ділянкою імуноглобуліну. бо Для ПЕГілування М-кінця бета-ланцюга аналога інсуліну із застосуванням 3,4К АГО02 ПЕГ
(МОРЕ, дарап) було здійснено реакцію між аналогом інсуліну (5 мг/мл) та ПЕГ з молярним співвідношенням 1:4, яка тривала приблизно 2 год. з температурою 4 "С. На цьому етапі реакцію здійснювали у 50 мМ хлориді натрію, рН 6,0 з 45 95 ізопропанолом. Як відновника до суміші додали 3,0 мМ ціаноборгідрид натрію та реакція тривала далі. Потім реакційний розчин очистили на колонці ЗР-НР (СЕ Неайсаге, О5А) із застосуванням буферу, який містив цитрат натрію (рН 3,0) та 45 95 етанол та градієнту концентрації КСІ.
Для отримання кон'югату аналога інсуліну з Ес-фрагментом імуноглобуліну було здійснено реакцію між очищеним моно-ПЕГілованим аналогом інсуліну та Ес-фрагментом імуноглобуліну з молярним співвідношенням 1:1-1:2, яка тривала 13 год. з температурою 25 "С та з загальною концентрацією білка приблизно у 20 мг/мл. На цьому етапі реакційний буфер містив 100 мМ
НЕРЕХ5, рН 8,2 та як відновника до суміші додали 20 мМ ціаноборгідрид натрію. Таким чином було здійснено зв'язування ПЕГ з М-кінцем Ес-фрагменту.
Після закінчення реакції, реакційний розчин завантажили на колонку О НР (СЕ Неаїсаге,
ОБА) з буфером Ттгі5-НСІ (рн 7,5) та градієнтом концентрації МасСі для відокремлення та очищення Ес-фрагменту імуноглобуліну та моно-ПЕГілованого аналога інсуліну, які не приймали участі у реакції.
Після цього, для відокремлення позосталого Ес-фрагменту імуноглобуліну та кон'югату дослідники застосували допоміжну колонку Зоцгсе 15 ІБО (СЕ Неакрсаге, О5А), в якій відбувалося з'єднання двох або кількох аналогів інсуліну з Ес-фрагментом імуноглобуліну з отриманням таким чином кон'югату аналога інсуліну з Ес-фрагментом імуноглобуліну. На цьому етапі було здійснено елюювання із застосуванням градієнту концентрації сульфату амонію, який містив Тгіб5-НСЇІ (рН 7,5). Отриманий в результаті такого елюювання кон'югат аналога інсуліну з
Ес-ділянкою імуноглобуліну було піддано аналізу із застосуванням білкового електрофорезу (злектрофорез в полиакриламидному гелі в присутності додецилсульфату натрію, Фіг. 4) та
ВЕРХ-хроматографії (Фіг. 5). Було визначено, що отриманий кон'югат мав майже 99 90 чистоту.
Приклад 9: Порівняння зв'язувальної спорідненості до інсулінового рецептора між природним інсуліном, аналогом інсуліну, кон'югатом природного інсуліну з Ес-ділянкою імуноглобуліну та кон'югатом аналога інсуліну з Ес-ділянкою імуноглобуліну.
Для вимірювання та аналізу зв'язувальної спорідненості кон'югату аналога інсуліну з Ес-
Зо ділянкою імуноглобуліну до інсулінового рецептору було застосовано систему для поверхневого плазмонного резонансу (ЗРК, ВІАСОКЕ 3000, СЕ пеайсаге). Інсулінові рецептори імобілізували на чіпі СМ5 амінним зв'язуванням з наступним незалежним застосуванням до них природного інсуліну, аналога інсуліну, кон'югату природного інсуліну з Ес-ділянкою імуноглобуліну та кон'югату аналога інсуліну з Ес-ділянкою імуноглобуліну, які було розведено у 5 або більше разів та перевіркою зв'язувальної спорідненості кожної досліджуваної сполуки до інсулінового рецептору, яку обчислено із застосуванням програмного забезпечення
ВІіАемаїІчайоп зоймаге. На цьому етапі було застосовано 1:1 модель зв'язування Лангмюра зі зміщенням нульової лінії.
В результаті, у порівнянні з інсуліном людини, аналог інсуліну (Мо 6) виявив 14,8 95 зв'язувальної спорідненості до рецептору, аналог інсуліну (Ме 7) виявив 9,9 95 зв'язувальної спорідненості до рецептору, аналог інсуліну (Мо 8) виявив 57,1 95 зв'язувальної спорідненості до рецептору, аналог інсуліну (Мо 9) виявив 78,8 905 зв'язувальної спорідненості до рецептору, кон'югат природного інсуліну з Ес-ділянкою імуноглобуліну мав 3,7-5,995 зв'язувальної спорідненості до рецептору в залежності від ходу експерименту, кон'югат аналога інсуліну (Мо 6) з Ес -ділянкою імуноглобуліну мав 0,9 95 або менше зв'язувальної спорідненості до рецептору, кон'югат аналога інсуліну (Мо 7) з Ес-ділянкою імуноглобуліну мав 1,995 зв'язувальної спорідненості до рецептору, кон'югат аналога інсуліну (Ме 8) з Ес-ділянкою імуноглобуліну виявив 1,8 95 зв'язувальної спорідненості до рецептору та кон'югат аналога інсуліну (Мо 9) з Ес- ділянкою імуноглобуліну мав 3,3 95 зв'язувальної спорідненості до рецептору (Таблиця 4).
Таким чином було виявлено, що аналоги інсуліну за винаходом мали зменшену, у порівнянні з природним інсуліном, зв'язувальну спорідненість до інсулінового рецептору та кон'югат аналога інсуліну з Ес-ділянкою імуноглобуліну також мав помітно зменшену зв'язувальну спорідненість до інсулінового рецептору.
Таблиця 4
Порівняння зв'язувальної спорідненості до інсулінового рецептора.
Ка(Т/мс, х 1057) | Кке(1/с, х 103 Ко (НМ) - Я 2,21 7,47 35,05
Природний інсулін людини 100 9 100 95 100 95
Тест 1 . . 0,28 6,60 237,0
Аналог інсуліну (Мо 6) 12,6 95 88,4 95 14,8 95 - Я 2,293 10,1 46,1
Природний ІнСУЛІН ЛЮДИНИ 100 95 100 95 100 95
Тест? Кон'югат природного інсуліну з 0,09 7,8 781,3
Ес-ділянкою імуноглобуліну 3,9 до 77,2 о 5,9 до кон'югат аналога інсуліну (Мо 6) з 5260,0
Ес-ділянкою імуноглобулін 0,9 оо 100 95 0,9 оо
Природний інсулін людини 100 10,73 (100 Об) оо,
Я Я 0,14 8,34 642,0
Кон'югат природного інсуліну з 1236,67
Ес-ділянкою імуноглобулін 2,7 9 54,5 95 5,1 96 кон'югат аналога інсуліну (Мо 7) з 0,02 7,20 3270,0
Ес-ділянкою імуноглобуліну 1,9 96 67,1 90 1,9 96
Що . 2,9 12,4 42,0
Природний інсулін людини 100 9 100 95 100 95
Аналог інсуліну (Мо 8) во 12,9 (104,6 95) БТ
Тест 4 Кон'югат природного інсуліну з 0,06 6,9 1140,0
Ес-ділянкою імуноглобуліну 2,1 96 56,1 95 3,7 бо кон'югат аналога інсуліну (Мо 8) з 0,03 6,4 2320,0
Ес-ділянкою імуноглобуліну 0,9 бо 51,6 96 1,8 90
Щі . 2,0 9,7 50,4
Природний інсулін людини 100 9 100 95 100 95 тест 5 Аналог інсуліну (Мо 9) 92,5 95 11,9 (122,5 96) 78,8 95
Кон'югат природного інсуліну з 0,09 7,4 862,0
Ес-ділянкою імуноглобуліну 4,3 до 76,5 90 5,9 до кон'югат аналога інсуліну (Мо 9) з 1536,7
Ес-ділянкою імуноглобулін 2,4 95 75,0 90 3,3 бо
Ка - константа швидкості асоціації, Кс- спорідненість імобілізованого ліганда.
Приклад 10: Порівняння ефективності іп міго кон'югату природного інсуліну з Ес-ділянкою імуноглобуліну та кон'югату аналога інсуліну з Ес-ділянкою імуноглобуліну.
Для оцінки ефективності іп міго кон'югату аналога інсуліну з Ес-ділянкою імуноглобуліну, для перевірки поглинання глюкози або синтезу ліпідів було застосовано диференційовані адипоцити
З3Т13-Ї1 мишачого походження. Клітини 3173-11 спочатку підтримували у середовищі ОМЕМ (середовище Ігла, модифіковане по способу Дульбекко, сірсо, Саї.Мо, 12430), збагаченому 95 МВСОЗ (сироваткою з новонароджених телят) з пасивуванням двічі або тричі на тиждень. 10 Клітини 3713-11 суспендували у середовищі для диференціації (середовище ОМЕМ, збагачене 10 95 ЕВ5) та потім нанесли їх на 48-луночний планшет зі щільністю у 5 х 107 клітин на лунку з наступним 48 - годинним культивуванням. Для диференціації адипоцитів, середовище для диференціації змішали з 1 мкг / мл інсуліну людини (Зідта, Саї. Мо 19278), 0,5 мм ІВМХ (3- ізобутил-1-метилксантин, Зідта, Саї. МеІ5879) та 1 мкмоль дексаметазону (бідта, Саї. Мо 0р4902) та по 250 мкл отриманої суміші додали до кожної лунки після усунення попереднього середовища. Через 48 год. це середовище замінили на середовище для диференціації, доповненим лише інсуліном людини (1 мкг/мл). Перевірку індукування диференціювання адипоцитів здійснювали на 7-9 день після інкубування клітин, з заміною кожні 48 год. існуючого середовища середовищем для диференціації, доповненим інсуліном людини (1 мкг/мл). Для перевірки зворотнього поглинання глюкози, диференційовані клітини один раз промили безсироватковим середовищем ЮМЕМ та потім впродовж 4 год. додали ще 250 мкл для започаткування спустошенням сироватки. Для здійснення 10-разових серійних розведень було застосовано безсироваткове середовище ОМЕМ з концентрацією 2-0,01 мкмоль для інсуліну людини та 20-0,02 мкмоль для кон'югатів природного інсуліну з Ес-ділянкою імуноглобуліну. По 250 мкл кожного з отриманих таким чином зразків додали до клітин та культивували у інкубаторі з 595 СО протягом 24 год. при 37 "С. Для вимірювання залишкової кількості глюкози. у середовищі після інкубування було вилучено 200 мкл цього середовища, яке потім розвели у 5 разів буфером О-РВ5 та піддали аналізу з застосуванням набору СОРОЮ (СОРООЮ Аззау Кії,
Медагуте, Саї. Мо К-СІ ОС). Перетворення концентрації позосталої у середовищі глюкози було здійснено на основі результатів поглинання стандартного розчину глюкози з обчисленням, відповідно, значень ЕС5О для поглинання глюкози кон'югату природного інсуліну з Ес-ділянкою імуноглобуліну та кон'югатів аналога інсуліну з Ес-ділянкою.
В результаті, порівняно до інсуліну людини, кон'югат природного інсуліну з Ес-ділянкою імуноглобуліну мав 11,6 95 поглинання глюкози, кон'югат аналога інсуліну (Мо б) з Ес-ділянкою імуноглобуліну мав 0,43 95 поглинання глюкози, кон'югат аналога інсуліну (Мо 7) з Ес-ділянкою імуноглобуліну мав 1,84 95 поглинання глюкози, кон'югат аналога інсуліну (Мо 8) з Ес-ділянкою імуноглобуліну мав 16,0 95 поглинання глюкози та кон'югат аналога інсуліну (Мо 9) з Ес-ділянкою імуноглобуліну мав 15,1 95 поглинання глюкози (Таблиця 5). Таким чином було виявлено, що кон'югат аналога інсуліну (Мо б) з Ес-ділянкою імуноглобуліну та кон'югат аналога інсуліну (Мо 7) з Ес-ділянкою імуноглобуліну за винаходом мав помітно зменшений титр іп міго у порівнянні з кон'югатом природного інсуліну з Ес-ділянкою імуноглобуліну. Також було виявлено, що кон'югат аналога інсуліну (Мо 8) з Ес-ділянкою імуноглобуліну та кон'югат аналога інсуліну (Мо 9) з Ес-ділянкою імуноглобуліну мали титр іп міго, подібний до титру іп міго кон'югату природного інсуліну з Ес-ділянкою імуноглобуліну.
Таблиця 5
Поглинання глюкози інсуліну)
ШИ о попе
Тест 1 : я я я я я
Приклад 11: Фармакокінетичні характеристики кон'югату аналога інсуліну з Ес-ділянкою імуноглобуліну.
Для перевірки фармакокінетичних характеристик кон'югатів аналога інсуліну з Ес-ділянкою імуноглобуліну було здійснено порівняння їх концентрацій у крові протягом часу у нормальних щурів (б-тижневі щури 50 чоловічої статі), які пройшли 5-денний адаптаційний період до перебування у лабораторних умовах. Піддослідним тваринам було підшкірно введено,
Зо відповідно, 21,7 нмоль/кг кон'югату природного інсуліну з Ес-ділянкою імуноглобуліну та 65,1 нмоль/кг кон'югату аналога інсуліну з Ес-ділянкою імуноглобуліну з відбором зразків крові у 0, 1, 4, 8, 24, 48, 72, 96, 120, 144, 168, 192 та 216 годину досліджень. Вимірювання концентрацій кон'югату природного інсуліну з Рс-ділянкою імуноглобуліну та кон'югату аналога інсуліну з Ес- ділянкою імуноглобуліну в крові у кожну точку часу було здійснено з допомогою ферментного імуносорбентного аналізу (ІФА) із застосуванням набору Іпзицйїп ЕГІЗА (А РСО, ОА). При цьому як детекторного антитіла було застосовано мишаче антитіло до ЇдДб4 людини, кон'юговане з пероксидазою хрону (АїІрпа Оіадповіїс Іпії, пс, ОА).
Результати перевірки фармакокінетичних характеристик кон'югату природного інсуліну з Ес- ділянкою імуноглобуліну та кон'югату аналога інсуліну з Рс-ділянкою імуноглобуліну виявили збільшення їх концентрацій в крові, які збільшувалися пропорційно їх концентраціям введення.
Також було виявлено, що кон'югати аналога інсуліну з Ес-ділянкою імуноглобуліну, які мали низьку зв'язувальну спорідненість до інсулінового рецептору мали дуже збільшений, порівняно до кон'югату природного інсуліну з Ес-ділянкою, час напівжиття (Фіг. 6).
Ці результати наводять на думку, що при з'єднанні змінених для отримання зниженої зв'язувальної спорідненості до інсулінового рецептору аналогів інсуліну за винаходом з Ес- ділянкою імуноглобуліну для отримання кон'югатів можна передбачити застосування цих кон'югатів як стійких інсулінових композицій завдяки їх помітно збільшеному часу напівжиття іп мімо у крові, отже можна передбачити їх ефективне застосування як терапевтичних агентів у лікуванні діабету. Крім того, оскільки аналоги інсуліну за винаходом самі по собі також мають зменшену зв'язувальну спорідненість до інсулінового рецептору та зменшений титр, вони також виявляють подібний ефект, хоча і є приєднаними до інших різних носіїв.
На підставі наведеного вище опису, фахівцям у цій галузі техніки має бути очевидною можливість здійснення різних модифікацій та змінень без відходу від обсягу та суті цього винаходу. Таким чином, слід розуміти, що наведене вище втілення є не обмежуючим, а лише ілюстративним у всіх аспектах. Обсяг винаходу визначено скоріше доданою до нього Формулою
Винаходу, а не попереднім його описом, отже, всі зміни і модифікації, які охоплюються межами
Формули Винаходу або еквівалентами цих меж призначені бути охопленими Формулою
Винаходу.
«РН» ХАН АВМ КО.
ЛТД «10» Мовий внаелюг інсуліму та мого застосування «1305 ОРАЗТЯО33-СТ «10» КВ ОНКеО БК ОгОЗ «15ї» 015 яВ «Тіз ДНА «Ве КОН еОТ4- 0008937 «15 Ота «180: 38 «08 Кораватіпт х. чЖ1їх За «вії» ДНК єв виучна послідавнет» «ве праиМеюЮ сх соціо ззавосоідс запцідеа сенос З ка я «вії ЗО «ій» ДНК «1» утуЧчЧНО ПОСЛІДОВНІСТЬ шви «вий» праймер «а й є сажі Ку фокуса уйитиж єиви юю Кв во пече ую ше: всавцсаної свои) своею задав З «ЯН Я «ЕТ» ЗВ «13» штучна послідовність «ую
Са Усій кВ «ре» прЕиМер «АК» З ісесїдевов васощосоє яціоцансва а оє Б «Нр а «іі» 5 «ЖІ3» штучна гпесгндовність «ве»
ДК су, євичлкух з ее МИ ЙйМЕО «ах й здуївсавасві шнесвосо сассвоцесВ сіщоводов 39
М ух Ж
ЗЕД НЕ в З «ії» ЗО хіх» ДНЕ ху т сема УФК «1 шт Учна пОоспьВнІсть ке «ше» праншер «ЗО» 5 сійеосвоє щозавасцеє сідіяасієв дев ЗО «вій» б кі ЗВ «ее 0 МштТуЧНІ ПОСЛІДОВНІСТЬ м «ди ПОВИ) «о В оуукхукеев ти Зкедуохаотчеичї БЕК усохов чіт зу з зцанеєво Посесосо Шесвосту дівовое За «0 «ії» ЗО «іє ДНК «вії» втучна послідовність «ее» «ее пранмав кУїд» В хе1їх З «кій ДНК «ей» штучна послідовність «иЖ» кукі» ВЕщИиМер «800 В у УЖЕ лук оку ув сви ВЕУ В г вусносасє восйнозоЗ сзововацію поза В «Не 9 «їв «вії» ДНК «12 штучна востдовніть «ее» «ей пранмер
Б Не х к ГУ жа» я реє жу ск ак ан Кк су ри ЗЕ х свонносо соозасовоє онопстає всясссаВо З9 «НЕ і «кії» ВО «її» ДНК «Їх штучна поспідовність «ее» «гії» пОдИМее
«ох В сосною ізозааавоз сеонесос девеасіва за «вій» «шій» ДНК «ЖІ» штучна зеслідовнють «вк» «им поаМве «400» спкносооцча засозовецс очсівсвсв сссзаовоє за «а їх «її» ЗВ «вій штучна послідовність ве «ей прармер «а 15 звісно дідіацавез сдссіююмне ссодовю за «ве 13 «Тіз ЗВ «вій» ДНК «кій» штучна послідовність «ВУД
«ей» праймер «а ізсоозозас зо сос асавсвоме задаКесцо З
ТИХ во із З з» «Ов 14 «Вії» 35 «сів» ДНК «1 вщитучна посгідовність «ак Мх ха» поаимер «ав Я х кет а и м ан а у Ех зЗсасцюва сота сова осо са З «я 15 «1» З «Її» ДНК «ій» штучна послідовність «их «ех пІанеерв «Не: 15 окуня ее) Резерви ВЕ Я пеовасвію серошева свавіюоцаоз все З хе 15 «ів хек ДНК
«1» штучна пестидовниів хе» праймер «ка» В «ації ссзоасіюне звачавево вщед чу
НИ ч-ій» штучна послідовність
Уч «юс» пюВИМмер «ЯН дн зіва ех зе зас її ща ща ей ДЕ зі ще Не с ЕЕ КЗ: ще мех ЗКЯКИ МеККЯха - «ід» ЇВ «Ріїз З «шій» ДиК «ії отучма послІдОоВвнть «аа» праймер «Я 18 сацНееє восіоонов поза сс и кед» В «ій» ДНК «ее штучна поспідеевнеть «ках «вах вналпог і «Ох о кадру тич ож сич Вчені усу ск иа чех вивих хай Ох
Мена звасаспоею шасісвосме сно сс ос вро Ссо о во
ЕЗУ МАУ ЗЕ КК «а ши Ух січе воє осо сссосюює часадеюиє аосссивоє косо ооце їво їшосіцсвов восаююває Кисдансяв сбнассв зевеюеє осютассва ЩО сооазавої асісаае В «їз 80 «ій» штучна поспіовнюшть вну КлсУК ак тех Ві 3 ут як: Ж дк Мфіш В сах й Ж. ді дохо
Ре ув Ап сн мів і ен Су СМУ ЕК Мі і во Уві СЯ АВ ен гу:
Ге сув СИУ СНО Ага іх ре ве Ту ТвгЕ Рез ув нг Аа Аг
Зо АВ СН Ар бен ЄМНИ Уві СМу СНИ Уві о бе Су СМУ Сну то
СПУ Ага сну Бег ів сі кто ее Аз бе со СМу нн гео Сни ув ву 5 вт Аа Не маги Сни сСув ую Тв Зег Це Су БЕН Сен Тк А це т 75 БО ви З Аа Тут був дай
Ве «а У «ії» 5 «ія» ДК «ках антучна посвудовніть кю «ки» ВН Я «а» 8 пезнавос васвемев есювсве сзоінмнаво сс азс оо щ- азодвосс Ккшнснево воосавовос сосоцоповоо своводассї дев оза 15 на ака нн і п по у і НИ вх сацуоцаоє шосе сссцса сосвосое воссспоце сосна у тво ссюсвов восомесоє пооавсва енивесв асзісюео ссісівесва ше сюсозазнеї зебсває 8 «1 в хе Ва «еїже білюк «й1й» штучна послІДОВНІсСТЬ «ех «ее вВнапог є не уаі Ав Со Ні ви Су МУ Ват Мів ви ма! Зо лів жи Ту їгч Уві Суз ЗУ бів Аа у Ре ве Тут Тв го уз ТЕ Ато АКме
СЯ Ав бін Аве беи Со Уві СЛУ бів ма бі бео су Сіу СЯу Бгто
Сну Ага у бег ів біз Ро беи Ав би Єйн су бегіео С ув
БО 55 ЩО
Аг слу А У ВІ с Су тв гг Бог Не сук кет еу тую сни ем см Ав Ту Ссуя Ави «1» ДНК «Кі» штучна послань
«МУ а незйаасс авсвейці ідзасісвсво сбомаво сієчвесі вомвсвов БИ
Чазозаваоо ннезесво воссваднсоо сао свозозасс зевоціюцов 120 своціцавоє щоосодоцо сосошесв зЗсвоусоізе восени сс оа іно москсвая вес виоззасВа сизеса вовиаєє ссіоєво я жк сук Кир ки т сода савкаве «5 «Від» 88 «а штучна пОослІДеВНЕ В «ве: внапої З «НЮ» т не Уві Ав Сни МНів б ец уз СНУ Заг Б Бе Уві СПЬ Аів бе Тег і 5 те 15
Кен ма Сув Су СН Ачо КМУ Бе Ре Тег Пе Рез ТЕ Аг А о За Км
С Аз СО Ав беи СНО Ма су М МВС сову СНУ СНУ СНУ Кто
За БІ 45
Сб Ав СНУ ех бео Са бо бе АВ Се сну СПУ Бек ви Сп ув
За 5О0
Ага Сіу Пе уві о Са Сух Су ТЕ Бен йе Суб Зе беюо Тук СМ ще 7 75 ще іео см Ап Ага Сув Ав
«ій» их
«іі я
«вій» ДНК
«її» ітучна ПОСЛІДОВНІ
«ее
«Яий» аналог Я
«щи» 85 нкесонавос засасневя вицісвове соціо сіасої вус що чавсзазас кчЧезсає асосвазасс соссодовоЗ своводассії садоюоао ЧИ своцшовоає вншсдоЗою се цідев досвосоює зосссновс се ою 1О зссідсвов осмос оо васаа шщеиаосв ові ссіасоу КЕ смшвозас! всізсваає ко «ії» ВВ «1 штучна песлідовність «их аналога
«НК до пе ві Абе си На ее Суб ів Веб Ніші ма Смь дів ім Туг
Е 5 т ї8
Гец уві Су НУ ШІ Аг СНУ ве не Тук Ту Бтго ух Ті Ага Аг о Ка Зо кв АВ ОВ Авр ем ємо Ма! СМу Сів Уа сів ам СНУ СУ СНУ Бо
З ЯМ 45
Су АВ МУ Бег а МА Кто бе АЧа мен СНО СУ Се Бе СИЛ уз що 55 що
Аг МУ ев ма! сни ЗЕ Су Су Тв жбег Не був Бег іа Тує СН
Бенц о Ав Тук Сув Ап йо «ії о «кі» ДНК ке дтечна пеослідсаниуть «ух «ке» вна З «ще 7 пеню межею юсоссасово скннудаво сісівосї ватосоою що пазсозвоєс шнсвсво всссавовеос сзссездовов санкюасої песо 1258 саццюваазе шерсзуцча сосщвиюв подсвоссює здоссизає ссдавооою 189 ісссюсвоа восцаюєвВі іодавсма ебиаюєсв пес ссісбюсву КО сідсазавосї вощеває ОВ «Вій -й ке штучна поси вВніТь «жк ВМагЮ З «а» МИ те Уві Ази Са ів ем був Се Зег Мі ес Уві о АМа ем Тут
Кен ма Сув Су Сі Апо Айва ле Ме Тут Тв Бо ув ТАРІ Аг сш си Аве ес У зе Мп Уві СНО бе Сну МУ СМу Ето
КИу Ав спу Яна бе сна Кто Кеш Але ме Со СУ Зег ів СМ ух
Ба що
Аа СУ Пе Уві Он із Суз був Те Заг йе Су Бег ец ТУє бів що т т Бо
Каші Ава Тут Сук Авп я «іх 85 «и» ФБВ зо
«кі ДНК «вій» штучна посліДОВНЕТЬ ки «иа» вен В «а ЗВ
Чцепівасс засвсіно росісвсвс снкнодана сс войоїюоца ща звасозазсоа спсзвово воссаВуВоє сосоооза свовооае воза о Щи; свазічаае шко оцює сссююоса зесвоссіє васссноде сс 150 ісессвов засошесаї шіодзасов еевосв осебнцес соніаосво ж «їі 85 «Віа» бізок каі1йх штучна послідовність «вай» «ви» вналог В пре Уа Ав сМи Ніби Су СПУ беж Мі Ге УВЕ СТО Ав бе Тут
І 5 то 15 сова ма Су СЯНУ Ми Ат СНУ Ав не тую ПР те уз Тут Аку Аг 8 я о
Сн Аа З дарів У Сму Си У З во сну Су СНУ то
ЗВ о Б
СМу Аа Су бег і ем СН Ріо ви Аа ез єма Му Бех ес ув щі 55 що ага ск Не Уві СНО сп був був Тр баг бе су Заг Ка у СИВА дЕ 7 75 во
Мем ОМ АВ Туг був Ав «я З карі й «ВІ» ДНК «13» штучна поспьдовніть «як» «ее вна ка ХМ ; З з соте оксид ту ІЗ устеучио М
Чеубзанос звовейі усівове сцЗзава сс загс цо ЩО стуку оте Кр оси ри луечуєтч су сур уко одер Ехо свист Ух Ух У УКВ свекор ЕТ пваозаазе мосоне; восовадвою оссооозацо свое осезсосою тай саводчеаує ючдсчочОю сесідєа ддсаоссює воасосноце ссідчацоцо тво дж Кука М ко уч м ек кн к чу учився Келумй ик кино Кч тиву пуф ва та
Мосіцювца азс сіквавовна насіціасся повела оскиеассвоу я сідоЗоВасі восблевнає БА «а» ВВ «шах білок
«КІЗ» тучна послідевмсте
Бен: ешейе ваВнаВлОгу «ВПО» За
Вре ма АвВА Сн Бі сн ув КМУ Заг МЕ бе уві Сб А ім Туг ї 5 1 16 іец Уа су СНУ СНО А СНУ Не а Ту ТЕ Бо ув ТП Аго КО
СЮ Ав Си Аво ен и ма У а маг Сни беи СМУ У ЄМУ РТ
За аа 5
Су Аів КМУ Баг Гео СУ Ре бе Ах без ів СЯуУ Бек ви Зп ув зга сну Ме УВС СМа Сув був Те Бег Пе Су Заг ей ук СИМ сен ів Авп Тут Сув Ар
Во «10 З «иіів 50 «в» здтучна поспідевнить «ав сиве» дНалег А «чо З йезбазвос аасеонеаб зассвове сао соісовосі во щоцу о ВО завозазас існезвовс зосовацасс сасосдозацо сао позов оо 15 сучки туди фур три уки Ву и ку гг кух тези фе пюре ки хи фе м аа «аа асо ссснниса поса ест дос сс 18 коосацча есеї киссолесва сіна зеаичесі ссіссаваєво аа сова зеовас в КО «Не Я «Арі» В
Я ах чи ц и пері кока «хай» штучна пестидевністі «ее «ей аналог й «НК За
Вне Уві Авп 3 ів еи Сбуз СМу Заг ів ем узі Сто ів бен Туг 1 х 1 їй сік ня МУу ЗБ ве ча КМ Ту Ку ру Зк ве ее їво ву СЗіЖ СНО Аг ЗУ Ба ре Ту Те Рез був ТП Ага Ага
См Ада Сб Авр бе а ма Су СМ Маг см бе Мму МУ СУ Ро
Се 45
Я їх Ку Кі х іх хх КІ гії хо: Її її Ск ху жк так
Су Ав Су Баг бе й го бе Ав бе Сів МУ Бебі ви і Ух
Агро Не У Ме Сни Су Суб ТЕ ЗЕ Не сСув заг бе Ян сна
Се Ну АВА Тут Сув А «яті» Ж «ій штучна пасгидовнть ках кеша ВНІ З «Оз 35 пеооіззсс взсвено шоісваеве сно аво сс дощі со сю ЕК пававодаае мозово весовацаоє суссооцаца сацасовосї денна то ще ас крос О сосіоюв соозассоє вдос согвазада 1
Мосіщевоз засув иерваева сис чено ссісзаосво ке сідувуааої все ве в КІ «й ЗЕ «ії» ВВ «ке штучна песлиовВеноть «Ох
ЗДАМ
«КЕ ЗВ
Ве УВІ Ав С НІВ бе ув СЛУ Бак Ні Кави Узі Че Ав бе Тут ї 5 за ї5
Мем мВ Су СНУ СУА Ам Му Ве ре ту ТВ его уз їг Ача 2 а ка ЗО
СУ Аз ін девріви Са Уві сму Си Ма СМ ев сну СИУ СНУ Бо
Зо віє Я
СНУ Ав Су ке уво бів Без ву Ав бен сни Су Бек ау Мп ув
Атеа у Ме Уві Св СН Су був ТР бек Не Сув Бек ем Ав СВ о У й В ва ви в Ав бут Су дви «її» я «іш лок «ій штучна послідевність «аа А » ланцют інсуліну сю З
Сму Не Уві Со Суп Сув Сув Те Не уз Бегбівн Буг Сп бе
Е м г Кк, і а 15 15 гі. жк Кз хе ско
ОВАВп тує Су Аді зо «ех З
Зб
«вії «ій» (ЛОК «вій» (Штучна леслідовність «ек м» «З» В « панцює нСурнну «ме ЗО ве Уві Аза ве нів бе був сну Маг візи Уа СЯ Аве Туг і 5 10 15
Мец ма! Су СЇЖ НН Ага Му Бе ве тує Те то Був Тв

Claims (23)

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ
1. Аналог інсуліну, де амінокислотну послідовність інсуліну модифіковано шляхом заміни 14-ої амінокислоти у ланцюзі А глутаміновою кислотою або аспарагіном, та де амінокислотні послідовності В та А ланцюгів інсуліну складаються з 5ЕО ІЮ МО: 38 та 37, відповідно.
2. Аналог інсуліну за п. 17, в якому зменшений титр інсуліну асоційований зі зменшеною зв'язувальною спорідненістю до інсулінового рецептора.
3. Аналог інсуліну за п. 1, який вибрано з групи, що складається з послідовності ЗЕО ІЮ МО: 34 та 36.
4. Кон'югат аналога інсуліну, в якому (ї) аналог інсуліну за будь-яким з пп. 1-3 є зв'язаним з (ії) одним біосумісним матеріалом, вибраним з групи, яка складається з поліетиленгліколю, жирної кислоти, холестерину, альбуміну та його фрагментів, альбумін-зв'язуючих матеріалів, полімерів, які складаються з повторюваних одиниць окремої амінокислотної послідовності, антитіл, фрагментів антитіл, ЕсКп-зв'язувальних матеріалів, фібронектину, трансферину, сахариду та полімерів, як носієм, здатним подовжувати час напівжиття аналога інсуліну /л мімо.
5. Кон'югат аналога інсуліну за п. 4, в якому аналог інсуліну та біосумісний матеріал з'єднано один з одним пептидним або непептидильним полімером як лінкером.
б. Кон'югат аналога інсуліну за п. 4, в якому ЕсоКп-зв'язуючий матеріал є Ес-ділянкою імуноглобуліну.
1. Кон'югат аналога інсуліну за п. 5, в якому (ї) аналог інсуліну за будь-яким з пп. 1-3 є зв'язаним з (ії) ЕРо-ділянкою імуноглобуліну (ії) пептидним лінкером або непептидильним лінкером, вибраним з групи, що складається з поліетиленгліколю, поліпропіленгліколю, співполімерів етиленгліколю - пропіленгліколю, поліоксіетилованих поліолів, полівінілового спирту, полівінілового етилового етеру та їх комбінації.
8. Кон'югат аналога інсуліну за п. 7, в якому непептидильний лінкер приєднано до М-кінця В- ланцюга аналогу інсуліну.
9. Кон'югат аналога інсуліну за п. 7, в якому обидва кінці непептидильного полімеру приєднано Зо відповідно до М-кінця Ес-ділянки імуноглобуліну та до М-кінцевої аміногрупи аналога інсуліну або до є-аміногрупи або тіолової групи внутрішнього лізинового залишку В - ланцюга.
10. Кон'югат аналога інсуліну за п. 7, в якому Ес-ділянка імуноглобуліну є неглікозилованою.
11. Кон'югат аналога інсуліну за п. 7, в якому Ес-ділянка імуноглобуліну складається з 1-4 доменів, вибраних з групи, яка складається з доменів СНІ, СН2, СНЗ та СНЯА.
12. Кон'югат аналога інсуліну за п. 7, в якому Ес-ділянка імуноглобуліну є Ес-ділянкою, отриманою з Ідс, ІдА, дО, ЧЕ або І9ДМ.
13. Кон'югат аналога інсуліну за п. 12, в якому кожен домен Ес-ділянки імуноглобуліну є гібридом доменів різного походження та отриманим з імуноглобуліну, вибраного з групи, яка складається з до, ІдДА, дО, ЧЕ та І9ЗМ.
14. Кон'югат аналога інсуліну за п. 7, в якому Ес-ділянка імуноглобуліну додатково містить шарнірну ділянку.
15. Кон'югат аналога інсуліну за п. 12, в якому Ес-ділянка імуноглобуліну є димером або мультимером, який складається з одноланцюгових імуноглобулінів, які складаються з доменів однакового походження.
16. Кон'югат аналога інсуліну за п. 12, в якому Ес-ділянка імуноглобуліну є Ес-ділянкою Ідсі.
17. Кон'югат аналога інсуліну за п. 16, в якому Ес-ділянка імуноглобуліну є неглікозилованою Ес- ділянкою, отриманою від Їдс4 людини.
18. Кон'югат аналога інсуліну за п. 7, в якому реакційну групу непептидильного лінкера вибрано з групи, яка складається з альдегідної групи, пропіональдегідної групи, бутиральдегідної групи, малеїмідної групи та сукцинімідної похідної.
19. Кон'югат аналога інсуліну за п. 18, в якому сукцинімідною похідною є сукцинімідил-пропіонат, сукцинімідил-карбоксиметил, гідроксисукцинімідил або сукцинімідил-карбонат.
20. Кон'югат аналога інсуліну за п. 7, в якому непептидильний лінкер має реакційні альдегідні групи на своїх обох кінцях.
21. Композиція інсуліну тривалої дії, яка має подовжений строк життя /л міо та стійкість та містить кон'югат аналога інсуліну за п. 4.
22. Композиція інсуліну тривалої дії за п. 21, яка є терапевтичним засобом проти діабету.
23. Спосіб отримання кон'югату аналога інсуліну за п. 4, який полягає в: () отриманні аналога інсуліну; (і) отриманні біосумісного матеріалу, вибраного з групи, яка складається з поліетиленгліколю, жирної кислоти, холестерину, альбуміну та їх фрагментів, альбумін- зв'язуючих матеріалів, полімерів повторюваних одиниць певної амінокислотної послідовності, антитіла, фрагментів антитіла, ЕсКп-зв'язуючих матеріалів, фібронектину, трансферину, сахариду та полімерів; та (ії) зв'язуванні аналога інсуліну з біосумісним матеріалом.
С з о х Х . ; Є не о хх Ох ще. З дк Ме: х у о МК ОО х КОХ хх З ОККО ОО КВ ОХ ще ОК В КК КК КО еВ ОО ОКХ х ОКХ ОО З Х А СХ у ще С: ож ОКХ З ЗА ОВ жк є Я КК КК КК КК КК З Я КК КК КК КК КК З З З ЕВ ОККО С МК й .. ОКХ В ОК КК ОХ Я о х В ВО ку ОО СХ х Е с З ОО КК т ОО
А 5. З ЩО. Є Ж п в а : ї п че пи і; і п і я х я ! Є ОО я ОО й 0 . днк: ОО а КОХ с В В В ї пен ОХ КК В ОК ОХ є 3 ! п З ПОН ОК ОМ ОО кожи С
1 в. я шо.» С п ПКД ОО а а КК о о у п х КК я Хе с Я М У В ЕК 5 Е о и ОО ОО я М М ОО КК Ї М МОХ ХХХ п Ох с о: В І по М Сх о еВ о о са о В ХК а ОЗ КО ОК ЕЕ хх с ОС я СО ОМАН я ОК ОК В а М М п а же цик . ФГ,
середня Й 2. ; вд ям впощина ВЕРХ-краматогранбія зізворотною фазою 85155 І ре шко т СІЯ хо) об то же вв з
" Е. зно що ж квВОЖ 5 М дю не - - евчегеемемрюч ого фест о боро фо оо сосок со ххх й 5 НН 15 жо В КУ 5 «0 45 чабіхв) передня й ше І ппошина піку, ЕКСКЛЮЗІЙНа ВЕРХ -хроматограєя пен по - й Шк ! - НЕ їі ск й і ше Не т ЩЕ В ; ; : пи ни шин
Що. гі | уфонеететттетенттвстчя оотенсоюносссесюнсенсюютннтнннннт КЕ г Е БЕ Е | х ШІ Е А с:
в. ев хорів І і нини, Н Зо, хкдпнук кА аа А КОРОК ого о о ооо осес сов, ення Гай
ФІ.
Ах рагмент возиепнення СіШ-Є природної послідовності інсуліну 3 ше ре: А ланцюг : СІК ОС уубтовионе у З ланцюг КУМеНнССОВнНЬУВ АБУСУСОЄ ВОКЕУТеКТ щі ВІ ВЗ ш шк АЖВгВІ невідновні ще м | АВ5-віВ2 | умови нини: нини Е і В о відновні ІЗ З КУ сх КЕ Ук ї ше А ; ВО да умови ше | В кі і ! ГО о Фрагмент розщенлення Вій послідовності аналога веуліну (І А панцюг щу ЕССТЦОСБОТЬЕ МУ ій ! ж В ланцюг с вуменСОоВнЬУК ДЬТЬУСОЕ ВОБАУТеКТ ЩЕ ДЕ щі ; З н І ! ; ї Е ще НН ШИ | умови ; ! пжААААТВ СХ МАЛА КАК жить Канни З. нпплакллллллнння Яке попстсот стече З НН дя ї о шо р відневні ШЕ д3 хх ї БЖ дз Умови ше і й ШІ шк. і чи Е фопелилчнятнттся Кубсеєесетесетттюннннс о дттсканннчньн ні нн і и ша Фа ді т ща 1 2 Ка сов КЕ Кос х о КЕ КК ЗК же . щк с Фіг Я середня 0 ВЕК Ж храматевра писемна пеки ЗВОТУТНОКа ВЗ НО Я Кут рт су т: У їх - ВВ - ЩЕ ке ! 4 й як її пі м З ще ск Ії ЕМО дм тт КЕ ой ї 3 рення ! Уч 4 . Ми а ! ІЗ ї | с 103 жі В : Ір о0ж й й нини СК НИ НН 7 маг У і анна повна нки вн в ви и и и ни нки зе ЩО, Х не їх у се В ЕН то ЗО Б во «ередяя у площина піку шк МИ Кі по « Екоклюзвна БЕР. - Рі ІВ зе пох дод з ЩЕ НЕ ВО хроматографія За їз НІ ЕН ! ! шо І: ГО і іі РОК Й ЩЕ ГЕ - х ! : ї; іі і Е МУЛ с р М й КУ ї ; Е І Оу Ве жом
! п. : фе пи ВСІ Ми 1 - й ; ; нн а и но п а а в то 2а зо « фо п 7 квредна 23 площина КК, ща Кові ВЕЖ ж нн пн пон і юЮносоміинна БЕХ» з ї і х, ! Я: хроматографія 9825 Н і х А т і Ех я ах чи Н і З ре пи і Н Н КО ВІ і СЛ й І Зк ї їх 3 1 ЩЕ В не - їж М а ЗК «е Її що 2 ї же о Зк Н кое пе пен о в ХХ Х й «кр ннюнчжюттюю фосню струми нання ря нд нн нон нан ори вдос Я Е суу х з ч го їв 2 ЗО з 5 50 оочасіхвд
Фр. 5
Ід) Зах о Жан вприроднего іновну з Кохання - З 7 ВеуногнжАу ДК ммс й З К що і де свв о Жан'юта! природного інсульту з Бо діпамкона х ча жо В 7" імузогзойувіну 85,5 ямок КА СОС Я» Ше . . зах 2 ж 35 о Шо з хом'яка ними днено імеуліму ВТ Кох З Я - зв З ооо ЯХ цінчнкою імуноувобутіну 21.7 нмольще Ге І. зх о Ше Жов ак кан'чюгат прирсднсго інсуліну (МУ Ка х і х Б те цу» діпанком неувогловуліну БВ, нмольке х ; і.
ШЕ Б ї й В й КІ «вс іднів) -» Канкняї природно інесулу з Ко дічннко ох нумо утмну ЗВУ нмсмкг З З м г 2. й І ще Ж 0-6 о -к щшН'ЮТВУ природнаго веуліну 3 бдоділамкох З 4 в ма: ИЙ імунегтвабуліну Б) наоль Я схссч в ние новій. й - . гака ХЕ ве Ще. ев ша «у кОч На пригодного меупіну (МБО 5 Ке- Х г ше чес діенкоюжішжунотпловуну 83, науч з я Б, з Е; УГИВ Ж ще хи сл "ка « . . зх: щ Ко т м к в Ше «ек ВОнкнВу природо о МеулнНу ВІЗ Ре- іі з) ОХ Ж дійянком імувоглевуніку ЗБ нмольке в в ще в Кз що М х х т с Бо щ час днів) ОО зо З вена природня інсулічу З Реділаняое Е імунстловуліве 3. наль В Е ко кан'южах природного імсуліну з ення нкою 2 І ов. імуно: побу вВіму ВО кмольКг м Кк Х "5 . м "ж Ку БК - в бо Я кожна врирадного інсуліну ЧР а Ес- Ж й ор. й ц с ЧЦ діннихокУ і яувог ун ж, ВмОлчеу «вка З ех "З Й г Ка й Ж ше "В воОиженх природного інсуліну МеВІ З Бе» в з Баш чу ділянкою івумсгловувіму ЗХ мамо щ Е о мис з х з то Кс ї жі ча Я офосуєея ; ин и НК вс іднв
UAA201507940A 2013-02-26 2014-02-26 Аналог інсуліну та його застосування UA119533C2 (uk)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR20130020703 2013-02-26
KR20130082511 2013-07-12
KR20140006937 2014-01-20
PCT/KR2014/001593 WO2014133324A1 (ko) 2013-02-26 2014-02-26 신규한 인슐린 아날로그 및 이의 용도

Publications (1)

Publication Number Publication Date
UA119533C2 true UA119533C2 (uk) 2019-07-10

Family

ID=51428522

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
UAA201507940A UA119533C2 (uk) 2013-02-26 2014-02-26 Аналог інсуліну та його застосування

Country Status (25)

Country Link
US (2) US20160008483A1 (uk)
EP (2) EP2963056B1 (uk)
JP (3) JP6552968B2 (uk)
KR (2) KR20140106452A (uk)
CN (2) CN104995206B (uk)
AU (2) AU2014221531B2 (uk)
BR (1) BR112015019985A2 (uk)
CA (1) CA2901873C (uk)
CL (1) CL2015002330A1 (uk)
DK (1) DK2963056T3 (uk)
ES (2) ES2770776T3 (uk)
HK (1) HK1211944A1 (uk)
IL (1) IL240717B (uk)
MX (1) MX366400B (uk)
MY (1) MY186990A (uk)
PE (2) PE20151409A1 (uk)
PH (1) PH12015501814A1 (uk)
PT (1) PT2963056T (uk)
RU (1) RU2676729C2 (uk)
SA (2) SA515360933B1 (uk)
SG (2) SG11201506095TA (uk)
TW (3) TWI755579B (uk)
UA (1) UA119533C2 (uk)
WO (1) WO2014133324A1 (uk)
ZA (1) ZA201507104B (uk)

Families Citing this family (35)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20130049671A (ko) 2011-11-04 2013-05-14 한미사이언스 주식회사 생리활성 폴리펩타이드 결합체 제조 방법
AR090281A1 (es) * 2012-03-08 2014-10-29 Hanmi Science Co Ltd Proceso mejorado para la preparacion de un complejo polipeptidico fisiologicamente activo
PT2963056T (pt) * 2013-02-26 2020-02-19 Hanmi Pharm Ind Co Ltd Análogo de insulina e utilização do mesmo
MA46146A1 (fr) * 2014-01-20 2020-12-31 Hanmi Pharm Ind Co Ltd Insuline a action prolongée et utilisation associée
AR100639A1 (es) 2014-05-29 2016-10-19 Hanmi Pharm Ind Co Ltd Composición para tratar diabetes que comprende conjugados de análogos de insulina de acción prolongada y conjugados de péptidos insulinotrópicos de acción prolongada
AR100695A1 (es) 2014-05-30 2016-10-26 Hanmi Pharm Ind Co Ltd Composición para el tratamiento de diabetes mellitus que comprende insulina y un agonista dual glp-1 / glucagón
KR20150140177A (ko) 2014-06-05 2015-12-15 한미약품 주식회사 단백질 및 펩타이드의 면역원성을 감소시키는 방법
CN107810202A (zh) * 2015-02-17 2018-03-16 韩美药品株式会社 长效胰岛素或胰岛素类似物复合物
CN108026143B (zh) 2015-07-24 2022-05-27 韩美药品株式会社 制备生理活性多肽缀合物的方法
UY36870A (es) * 2015-08-28 2017-03-31 Hanmi Pharm Ind Co Ltd Análogos de insulina novedosos
JP2018531007A (ja) * 2015-09-24 2018-10-25 ハンミ ファーマシューティカル カンパニー リミテッド インスリンの製造方法
JP7158378B2 (ja) * 2016-09-23 2022-10-21 ハンミ ファーマシューティカル カンパニー リミテッド インスリン受容体との結合力が減少された、インスリンアナログ及びその用途
WO2018105988A1 (ko) 2016-12-05 2018-06-14 한미약품 주식회사 면역반응이 약화된 결합체
JP7170332B2 (ja) 2016-12-09 2022-11-14 アクストン バイオサイエンシズ コーポレーション インスリンとｆｃの融合物および使用方法
BR112019016077A2 (pt) 2017-02-03 2020-03-31 Hanmi Pharm. Co., Ltd. Conjugado da fórmula 1, método para preparar o conjugado, preparação de atuação longa, preparação para prevenir ou tratar diabetes e método para tratar diabetes
KR20180091773A (ko) 2017-02-07 2018-08-16 한미약품 주식회사 비펩티드성 중합체 링커 화합물, 그 링커 화합물을 포함하는 결합체, 및 이들의 제조방법
KR101941975B1 (ko) 2017-03-17 2019-01-25 고려대학교 산학협력단 Atpif1을 함유하는 당뇨 치료용 약학조성물
US11752216B2 (en) * 2017-03-23 2023-09-12 Hanmi Pharm. Co., Ltd. Insulin analog complex with reduced affinity for insulin receptor and use thereof
JP7377195B2 (ja) 2017-09-29 2023-11-09 ハンミ ファーマシューティカル カンパニー リミテッド リンカーとして非ペプチド性重合体結合脂肪酸誘導体化合物を含むタンパク質結合体及びその製造方法
CN111406073A (zh) * 2017-09-29 2020-07-10 韩美药品株式会社 具有提高功效的持久性蛋白质缀合物
US11267862B2 (en) 2018-06-29 2022-03-08 Akston Biosciences Corporation Ultra-long acting insulin-Fc fusion proteins and methods of use
AU2019291945A1 (en) 2018-06-29 2021-01-14 Akston Biosciences Corporation Ultra-long acting insulin-Fc fusion proteins and methods of use
AU2019398402A1 (en) 2018-12-11 2021-07-29 Sanofi Insulin analogs having reduced insulin receptor binding affinity
JP2022514835A (ja) 2018-12-21 2022-02-16 ハンミ ファーマシューティカル カンパニー リミテッド インスリン及びグルカゴンを含む薬学組成物
EP3900735A4 (en) 2018-12-21 2022-09-07 Hanmi Pharm. Co., Ltd. PHARMACEUTICAL COMPOSITION WITH INSULIN AND TRIPLE AGONOISTS WITH ACTIVITY AGAINST ALL GLUCAGON AND GLP-1 AND GIP RECEPTORS
TW202120536A (zh) * 2019-07-31 2021-06-01 美商美國禮來大藥廠 鬆弛素(relaxin)類似物及其使用方法
CN114846025A (zh) 2019-12-19 2022-08-02 阿卡斯通生物科学公司 超长效胰岛素-Fc融合蛋白及其使用方法
US11186623B2 (en) 2019-12-24 2021-11-30 Akston Bioscience Corporation Ultra-long acting insulin-Fc fusion proteins and methods of use
AR121713A1 (es) 2020-03-31 2022-06-29 Hanmi Pharm Ind Co Ltd Nuevos análogos de il-2 inmunoestimulantes
US11192930B2 (en) 2020-04-10 2021-12-07 Askton Bioscences Corporation Ultra-long acting insulin-Fc fusion protein and methods of use
DK3972987T3 (da) 2020-04-10 2023-07-31 Akston Biosciences Corp Antigenspecifik immunterapi til COVID-19-fusionsproteiner og fremgangsmåder til anvendelse deraf
WO2022017309A1 (zh) * 2020-07-24 2022-01-27 江苏晟斯生物制药有限公司 胰岛素-Fc融合蛋白及其应用
WO2023004406A2 (en) 2021-07-23 2023-01-26 Akston Biosciences Corporation Insulin-fc fusion proteins and methods of use to treat cancer
WO2023013638A1 (ja) * 2021-08-02 2023-02-09 Ｓｐｉｂｅｒ株式会社 合成皮革及びその製造方法
CN117881691A (zh) * 2021-08-02 2024-04-12 丝芭博株式会社 多孔质体及其制造方法

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6096871A (en) 1995-04-14 2000-08-01 Genentech, Inc. Polypeptides altered to contain an epitope from the Fc region of an IgG molecule for increased half-life
WO1997034631A1 (en) 1996-03-18 1997-09-25 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobin-like domains with increased half lives
DE19735711C2 (de) * 1997-08-18 2001-04-26 Aventis Pharma Gmbh Verfahren zur Herstellung eines Vorläufers von Insulin oder Insulinderivaten mit korrekt verbundenen Cystinbrücken
US6660843B1 (en) * 1998-10-23 2003-12-09 Amgen Inc. Modified peptides as therapeutic agents
JP2008169195A (ja) * 2007-01-05 2008-07-24 Hanmi Pharmaceutical Co Ltd キャリア物質を用いたインスリン分泌ペプチド薬物結合体
CN101743252A (zh) * 2007-07-16 2010-06-16 诺沃-诺迪斯克有限公司 蛋白酶稳定化的、peg化的胰岛素类似物
CA2747490C (en) * 2008-12-19 2017-02-14 Indiana University Research And Technology Corporation Insulin analogs
US20120184488A1 (en) * 2009-09-01 2012-07-19 Case Western Reserve University Insulin analogues of enhanced receptor-binding specificity
AR081066A1 (es) * 2010-04-02 2012-06-06 Hanmi Holdings Co Ltd Conjugado de insulina donde se usa un fragmento de inmunoglobulina
KR101324828B1 (ko) * 2010-06-08 2013-11-01 한미사이언스 주식회사 면역글로불린 단편을 이용한 단쇄 인슐린 아날로그 약물 결합체
AU2011282988A1 (en) * 2010-07-28 2013-01-31 Smartcells, Inc. Recombinantly expressed insulin polypeptides and uses thereof
UA113626C2 (xx) * 2011-06-02 2017-02-27 Композиція для лікування діабету, що містить кон'югат інсуліну тривалої дії та кон'югат інсулінотропного пептиду тривалої дії
PT2963056T (pt) * 2013-02-26 2020-02-19 Hanmi Pharm Ind Co Ltd Análogo de insulina e utilização do mesmo

Also Published As

Publication number Publication date
RU2676729C2 (ru) 2019-01-10
MX366400B (es) 2019-07-08
HK1211944A1 (en) 2016-06-03
TWI621626B (zh) 2018-04-21
TWI708782B (zh) 2020-11-01
ES2770776T3 (es) 2020-07-03
CN104995206A (zh) 2015-10-21
SA518400491B1 (ar) 2022-04-07
EP3616727B1 (en) 2021-03-31
KR20140106452A (ko) 2014-09-03
CN104995206B (zh) 2022-04-12
EP2963056A4 (en) 2017-06-07
ZA201507104B (en) 2019-04-24
NZ751062A (en) 2021-04-30
EP2963056B1 (en) 2019-11-13
PH12015501814B1 (en) 2015-12-07
PT2963056T (pt) 2020-02-19
AU2018267648B2 (en) 2020-04-16
PE20191481A1 (es) 2019-10-18
WO2014133324A1 (ko) 2014-09-04
TW201920243A (zh) 2019-06-01
JP6552968B2 (ja) 2019-07-31
BR112015019985A2 (pt) 2017-08-29
SA515360933B1 (ar) 2018-12-23
JP2021193089A (ja) 2021-12-23
AU2014221531A1 (en) 2015-08-27
TW201817741A (zh) 2018-05-16
CA2901873C (en) 2022-05-03
US20180256731A1 (en) 2018-09-13
CN114989289A (zh) 2022-09-02
JP2019187440A (ja) 2019-10-31
KR102413691B1 (ko) 2022-06-28
PE20151409A1 (es) 2015-10-07
AU2018267648A1 (en) 2018-12-13
SG10201907106VA (en) 2019-09-27
MX2015010471A (es) 2016-04-25
KR20210109491A (ko) 2021-09-06
EP3616727A1 (en) 2020-03-04
NZ710882A (en) 2021-01-29
RU2015138536A (ru) 2017-04-03
ES2868351T3 (es) 2021-10-21
SG11201506095TA (en) 2015-09-29
TW201520224A (zh) 2015-06-01
CL2015002330A1 (es) 2015-12-28
IL240717B (en) 2020-05-31
IL240717A0 (en) 2015-10-29
DK2963056T3 (da) 2020-02-17
US20160008483A1 (en) 2016-01-14
EP2963056A1 (en) 2016-01-06
TWI755579B (zh) 2022-02-21
AU2014221531B2 (en) 2018-08-23
PH12015501814A1 (en) 2015-12-07
MY186990A (en) 2021-08-26
JP2016510003A (ja) 2016-04-04
CA2901873A1 (en) 2014-09-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
UA119533C2 (uk) Аналог інсуліну та його застосування
AU2020277290A1 (en) Composition for treating diabetes mellitus comprising insulin and a GLP-1/glucagon dual agonist
JP6131490B2 (ja) 免疫グロブリンフラグメントを用いた部位特異的ｇｌｐ−２薬物結合体
US20170143802A1 (en) Composition for treating diabetes comprising long-acting insulin analogue conjugate and long-acting insulinotropic peptide conjugate
TWI795443B (zh) Ｇｌｐ-２衍生物之長效接合物
CN105229025B (zh) 位点特异性胰岛素缀合物
TWI798209B (zh) 對胰島素受體有降低親和性之胰島素類似物之接合物及其用途
KR20230004135A (ko) 글루카곤, glp-1 및 gip 수용체 모두에 활성을 갖는 삼중 활성체를 포함하는 조합물의 치료학적 용도
JP2023526550A (ja) Ｇｌｐ－２の持続型結合体の液状製剤
NZ751062B2 (en) Novel insulin analog and use thereof
NZ710882B2 (en) Novel insulin analog and use thereof