CN104995206B - 新颖的胰岛素类似物及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明以增加胰岛素在血液中的半衰期为目的，涉及一种不仅胰岛素效价低于天然胰岛素且对胰岛素受体的结合力减少的胰岛素类似物、所述胰岛素类似物与载体连接而成的复合物、包含所述复合物的长效制剂、及制造所述复合物的方法。

Description

新颖的胰岛素类似物及其用途
技术领域
本发明以增加胰岛素在血液中的半衰期为目的，涉及一种不仅胰岛素效价低于天然胰岛素且对胰岛素受体的结合力减少的胰岛素类似物、所述胰岛素类似物与载体连接而成的复合物、包含所述复合物的长效制剂、及制造所述复合物的方法。
背景技术
众所周知，生物体内的蛋白质是通过被血液中的蛋白质分解酶分解、或通过肾脏排泄或由受体清除等多种途径来清除。对此，不断进行规避如上所述的蛋白质清除机理而增加生物活性蛋白质的半衰期，提高治疗功效的多种尝试。
另一方面，胰岛素作为从人体的胰腺分泌的血糖调节激素，发挥向细胞移送血液内多余的葡萄糖来对细胞供给能源，并且使血糖保持正常水准的作用。但对于糖尿病患者而言，因这种胰岛素不足或胰岛素抵抗性及β细胞丧失功能而胰岛素无法发挥正常的功能，从而无法将血液内的葡萄糖用作能源，血液中的葡萄糖水准呈现出较高的高血糖症状，最终通过小便排出糖，并伴随着多种并发症。因此，对于胰岛素的生成存在异常(I型)或因胰岛素的耐性引起的(II型)糖尿病患者而言，胰岛素治疗是必不可少的，当投用胰岛素时，可将血糖调节在正常水准。然而，胰岛素与其他蛋白质及肽激素同样地存在因体内的半衰期极短而需持续地反复投用的缺点。这种频繁的投用会给患者带来非常大的痛苦和不便。因此，为了通过增加蛋白质在生物体内的半衰期来减少投用次数而提高患者的生活质量，不断进行多种蛋白质的剂型化研究和对化学复合物等(脂肪酸复合物、聚乙烯聚合物复合物)的研究。作为目前市售的长效胰岛素，有赛诺菲-安万特公司(Sanofi-Aventis)的甘精胰岛素(insulin glargine，lantus，药效持续时间为约20～22小时)、诺和诺德公司(NovoNordisk)的地特胰岛素(insulin detemir，levemir，药效持续时间为约18～22小时)、及tresiba(德谷(degludec)，药效持续时间为约40小时)。这些长效胰岛素因在血液中没有胰岛素浓度峰值而适合用作基础胰岛素，但它们的半衰期也不够长，因而仍存在每天需投用一次或两次的不便，这对于需要长期投用的糖尿病患者而言，在实现通过大幅减少投用频率而提高患者的便利性的目的方面有限。
根据现有的研究结果报告，已知体内胰岛素的清除过程具体如下：50％以上的胰岛素通过肾脏清除，剩余的胰岛素通过受体介导清除(receptor mediated clearance，RMC)步骤从肌肉、脂肪、肝脏等靶标部位(target site)清除。
与此相关，在J Pharmacol Exp Ther(1998)286:959、Diabetes Care(1990)13:923、Diabetes(1990)39:1033等多个报告中指出，为了规避胰岛素的RMC，可通过削弱in-vitro活性而增加血液中的浓度，但对于这些对受体的结合力减少的胰岛素类似物而言，即使减少RMC，也无法规避主要清除机制即从肾脏的清除，因而在大幅增加血液中的半衰期方面有限。
发明内容
[发明要解决的问题]
本发明人等为了增加胰岛素在血液中的半衰期而进行了锐意研究，结果确认到按照非天然胰岛素序列而并非天然胰岛素序列新颖地制造的胰岛素类似物不仅in-vitro效价减少，而且因与胰岛素受体的结合力减少而从肾脏的清除减少，并且确认到通过在所述胰岛素类似物结合可有效增加半衰期的代表性的载体即免疫球蛋白Fc片段而胰岛素在血液中的半衰期进一步增加，由此完成了本发明。
[解决问题的技术手段]
本发明的目的在于，以延长胰岛素在体内的半衰期为目的，制造in-vitro效价减少的胰岛素类似物，并提供一种其与载体形成的复合物。
具体而言，本发明的一目的在于提供一种胰岛素效价低于天然胰岛素的胰岛素类似物。
本发明的又一目的在于提供一种胰岛素类似物与载体结合而成的胰岛素类似物复合物。
本发明的另一目的在于提供一种包含所述胰岛素类似物复合物的胰岛素长效制剂。
本发明的又一目的在于提供一种制造所述胰岛素类似物复合物的方法。
本发明的又一目的在于提供一种利用所述胰岛素类似物、或胰岛素类似物与载体结合而成的胰岛素类似物复合物来增加在生物体内的半衰期的方法。
本发明的又一目的在于提供一种治疗与胰岛素相关的疾病的方法，所述方法包含将所述胰岛素类似物或胰岛素类似物复合物投用给需要其的个体的步骤。
[发明的效果]
本发明的非天然胰岛素类似物不仅提供胰岛素效价低于天然胰岛素且因对胰岛素受体的结合力减少而规避在生物体内的清除机制，增加在生物体内的血液中的半衰期的胰岛素类似物，而且利用这种胰岛素类似物的胰岛素类似物-免疫球蛋白Fc复合物可通过大幅增加在血液中的半衰期而提高需投用胰岛素的患者的便利性。
附图说明
图1是表示通过蛋白质电泳方式对胰岛素类似物的纯度进行分析的结果的图。其是对作为代表性的胰岛素类似物的第7号类似物进行分析的结果。第1色带：尺寸标记(sizemarker)，第2色带：天然胰岛素，第三色带：胰岛素类似物(第7号)。
图2是通过高压色谱法对胰岛素类似物的纯度进行分析的结果。其是对作为代表性的胰岛素类似物的第7号类似物进行分析的结果。图2(A)为RP-HPLC，图2(B)为SE-HPLC。
图3是对胰岛素类似物的肽图谱进行分析的结果。关于胰岛素类似物，对作为代表性的类似物的第7号类似物进行了分析。图3(A)为天然胰岛素，图3(B)为胰岛素类似物(第7号)。
图4是通过蛋白质电泳方式对胰岛素类似物-免疫球蛋白Fc复合物的纯度进行分析的结果。其是对作为代表性的胰岛素类似物的第7号类似物进行分析的结果。第1色带：尺寸标记(size marker)，第2色带：胰岛素类似物(第7号)-免疫球蛋白Fc复合物。
图5是通过高压色谱法对胰岛素类似物-免疫球蛋白Fc复合物的纯度进行分析的结果。其是对作为代表性的胰岛素类似物的第7号类似物进行分析的结果。图5(A)为RP-HPLC，图5(B)为SE-HPLC，图5(C)为IE-HPLC。
图6是表示天然胰岛素-免疫球蛋白Fc复合物及胰岛素类似物-免疫球蛋白Fc复合物在正常大鼠中的药代动力学分析的结果。其是对作为代表性的胰岛素类似物的第7号类似物进行分析的结果。○：天然胰岛素-免疫球蛋白Fc复合物(21.7nmol/kg)，●：天然胰岛素-免疫球蛋白Fc复合物(65.1nmol/kg)，□：胰岛素类似物-免疫球蛋白Fc复合物(21.7nmol/kg)，■：胰岛素类似物-免疫球蛋白Fc复合物(65.1nmol/kg)。图6(A)为天然胰岛素-免疫球蛋白Fc复合物及胰岛素类似物(第7号)-免疫球蛋白Fc复合物，图6(B)为天然胰岛素-免疫球蛋白Fc复合物及胰岛素类似物(第8号)-免疫球蛋白Fc复合物，图6(C)为天然胰岛素-免疫球蛋白Fc复合物及胰岛素类似物(第9号)-免疫球蛋白Fc复合物。
具体实施方式
作为一实施方式，本发明提供一种胰岛素类似物，其胰岛素效价低于天然胰岛素类似物且B链或A链的氨基酸发生变异。
作为一具体例，本发明提供一种对胰岛素受体的结合力减少的胰岛素类似物。
作为又一具体例，本发明提供一种选自由B链的第8号氨基酸、B链的第23号氨基酸、B链的第24号氨基酸、B链的第25号氨基酸、A链的第1号氨基酸、A链的第2号氨基酸、及A链的第19号氨基酸所构成的群组中的一种氨基酸被丙氨酸取代，或者A链的第14号氨基酸被谷氨酸或天冬酰胺取代而成的非天然胰岛素类似物。
作为又一具体例，本发明提供一种选自由序列号20、序列号22、序列号24、序列号26、序列号28、序列号30、序列号32、序列号34、及序列号36所构成的的群组中的胰岛素类似物。
作为另一实施方式，本发明提供一种胰岛素类似物复合物，其是在如上所述的胰岛素类似物连接可延长半衰期的载体而成。
作为一具体例，提供一种利用(ⅲ)肽连接子或非肽连接子连接所述胰岛素类似物及(ⅱ)免疫球蛋白Fc区而成的胰岛素类似物复合物，所述非肽连接子选自由聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇-丙二醇共聚物、聚氧乙基化多元醇、聚乙烯醇、多糖、葡聚糖、聚乙烯乙醚、生物降解性高分子、脂质聚合物、甲壳素类、透明质酸及它们的组合所构成的群组。
作为另一实施方式，本发明提供一种胰岛素长效制剂，其包含所述胰岛素类似物复合物，且在生物体内的长效性及稳定性增加。
作为一具体例，提供一种用于治疗糖尿病的胰岛素长效制剂。
作为又一实施方式，本发明提供一种所述胰岛素类似物复合物的制造方法。
作为又一实施方式，本发明提供一种利用所述胰岛素类似物、或胰岛素类似物及载体结合而成的胰岛素类似物复合物来增加在生物体内的半衰期的方法。
作为又一实施方式，本发明提供一种治疗与胰岛素相关的疾病的方法，所述方法包含将所述胰岛素类似物或胰岛素类似物复合物投用给需要其的个体的步骤。
本发明涉及一种in-vitro效价减少的胰岛素类似物。这种胰岛素类似物的特征在于，因使用非天然胰岛素序列而对胰岛素受体的结合力低于天然胰岛素，因此因解离常数来减少借助受体介导的清除(receptor-mediated clearance)，并增加血液中的半衰期。
在本发明中，术语“胰岛素类似物”包含相比于天然型胰岛素类似物，胰岛素效价减少的多种类似物。
所述胰岛素类似物可以为相比于天然型胰岛素类似物，胰岛素效价减少的，胰岛素的B链或A链的氨基酸发生变异的胰岛素类似物。天然型胰岛素氨基酸序列如下。
-A链：
Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn(序列号37)
-B链：
Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr(序列号38)
在本发明的实施例中所使用的胰岛素类似物虽然是通过基因重组技术来制成的胰岛素类似物，但本发明并不局限于此，而是包含减少in-vitro效价的所有胰岛素。优选地，可以包含倒置胰岛素(inverted insulin)、胰岛素变异体(variants)、胰岛素片段(fragments)等，并且可以通过基因重组及固相(solid phase)等制造方法来制造，但并不局限于此。
胰岛素类似物作为拥有与胰岛素相同的生物体内的血糖调节功能的肽，这种肽包含胰岛素激动剂(agonist)、衍生物(derivatives)、片段(fragments)、变异体(variants)。
本发明的胰岛素激动剂意味着与胰岛素的结构无关地与胰岛素的生物体内的受体相结合来呈现出与胰岛素相同的生物学活性的物质。
本发明的胰岛素类似物可以意味着与天然型胰岛素的A链、B链至少在80％以上的氨基酸序列中分别呈现出同源性，氨基酸的一残基的一部分组以化学方式被取代(例如，α-甲基(alpha-methylation)、α-羟基(alpha-hydroxylation))，可以是被清除(例如，deamination)或被修饰(例如，N-甲基化(N-methylation))的形态，并拥有在体内调节血糖的功能的肽。本发明作为相比于天然型胰岛素类似物减少对胰岛素受体的结合力的胰岛素类似物，可以不受限制地包含相比于天然型胰岛素类似物，减少胰岛素效价的胰岛素类似物。
只要可以呈现出较低的受体-介导内在化(receptor-mediatedinternalization)或受体-介导清除(receptor-mediated clearance)，就不受其种类及大小的限制，但对于由受体-介导内在化或受体-介导清除在生物体内清除蛋白质方面起到主要机理作用的胰岛素类似物而言，适合用于本发明。
本发明的胰岛素片段意味着在胰岛素追加一种或一种以上的氨基酸，或者从胰岛素中删除一种或一种以上的氨基酸的形态，所追加的氨基酸也可以使用并不以天然方式存在的氨基酸(例如，D型氨基酸)，而这种胰岛素片段在体内拥有血糖调节功能。
本发明的胰岛素变异体作为与胰岛素有一种以上的氨基酸序列不同的肽，意味着在体内拥有血糖调节功能的肽。
本发明的分别使用于胰岛素激动剂、衍生物、片段及变异体的制造方法可以独立使用，也可以组合使用。例如，有一种以上的氨基酸序列不同，并在氨基末端的氨基酸残基中包含进行脱氨基作用(deamination)的，在体内拥有血糖调节功能的肽。
具体而言，所述胰岛素类似物可以为选自主要由B链的第8号氨基酸、B链的第23号氨基酸、B链的第24号氨基酸、B链的第25号氨基酸、A链的第1号氨基酸、A链的第2号氨基酸、A链的第14号氨基酸以及A链的第19号氨基酸组成的组中的一种或一种以上的氨基酸被其他氨基酸取代的氨基酸，优选地，为选自由B链的第8号氨基酸、B链的第23号氨基酸、B链的第24号氨基酸、B链的第25号氨基酸、A链的第1号氨基酸、A链的第2号氨基酸及A链的第19号氨基酸组成的组中的一种或一种以上的氨基酸被丙氨酸取代，或者A链的第14号氨基酸被谷氨酸或天冬酰胺取代的氨基酸。并且，可以选自主要由序列号20、序列号22、序列号24、序列号26、序列号28、序列号30、序列号32、序列号34及序列号36组成的组中，但可以不受限制地包含对胰岛素受体的结合力减少的胰岛素类似物。
根据本发明的一实施例，确认了所述序列号20、序列号22、序列号24、序列号26、序列号28、序列号30、序列号32、序列号34及序列号36的胰岛素类似物在in-vitro的胰岛素受体结合力相比于天然型胰岛素类似物减少，尤其具有代表性的是胰岛素类似物7、胰岛素类似物8、胰岛素类似物9(序列号32、序列号34、序列号36)(表4)。
作为又一实施方式，本发明提供一种所述胰岛素类似物与载体结合而成的胰岛素类似物复合物。
在本发明中，术语“载体”意味着可以增加所结合的胰岛素类似物的生物体内的半衰期的物质。本发明的胰岛素类似物的特征在于，与天然型胰岛素类似物相比，减少对胰岛素受体的结合力，可以回避受体介导清除机制及肾脏清除，因此，可以明确的是，只要将以往被公认为与公知的多种生理活性多肽相结合来增加生物体内的半衰期的载体，就可以增加生物体内的半衰期，并利用为长效制剂。
作为其例，由于半衰期的增加是最优目的，因此，可以与减少效价的新胰岛素相结合的物质并不局限于免疫球蛋白Fc区，而是包含与选自由可以减少肾脏清除(renalclearance)的多种聚合物(例如，聚乙二醇及脂肪酸、白蛋白及其片段、指定氨基酸序列等)、白蛋白及其片段、白蛋白结合物质指定氨基酸序列的重复单元的聚合物、抗体、抗体片段、FcRn结合物质、生物体内的结合组织或其衍生物、核苷酸、纤维连接蛋白、转铁蛋白(Transferrin)、糖化物(saccharide)及高分子聚合物组成的组中的某一种生物相容性物质等相结合来延长生物体内的半衰期的生物相容性物质，但并不局限于此。并且，在减少效价的胰岛素类似物连接可以延长生物体内的半衰期的生物相容性物质的方法可以包括基因重组方法和in-vitro结合等。作为其例，所述生物相容性物质可以为FcRn结合物质、脂肪酸、聚乙二醇、氨基酸片段或白蛋白。所述FcRn结合物质可以为免疫球蛋白Fc区。
作为所述胰岛素类似物及生物相容性物质的载体，可以是借助作为连接子的肽聚合物或非肽聚合物来相连接的形态。
所述胰岛素复合物可以是由(i)胰岛素类似物；及(ⅱ)免疫球蛋白Fc区，借助(ⅲ)肽连接子或非肽连接子来相连接而成的，所述非肽连接子选自由聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇-丙二醇共聚物、聚氧乙基化多元醇、聚乙烯醇、多糖、葡聚糖、聚乙烯乙醚、生物降解性高分子、脂质聚合物、甲壳素类、透明质酸类及它们的组合组成的组中。
在本发明的胰岛素类似物复合物的一具体实施形态中，胰岛素类似物在其B链的氨基末端连接作为连接子的非肽聚合物。在其他具体实施方式中，本发明的复合物在胰岛素类似物的B链的残基连接作为连接子的非肽聚合物。在胰岛素的情况下，由于当进行A链修饰时，活性减少且稳定性降低，因此，这种实施方式可以通过在胰岛素B链连接非肽聚合物作为连接子来维持胰岛素的活性，并提高安全性。
在本发明中，术语“活性”意味着胰岛素与胰岛素的受体相结合的能力，并且意味着胰岛素与其受体相结合来起到胰岛素的作用。在本发明中，通过进行pH值调节来在胰岛素B链的氨基末端结合非肽聚合物，优选的pH值范围为4.5至7.5。
在本发明中，术语“N-末端”可以与“N-末端域”相混用。
作为具体的一实施例，本发明人通过在免疫球蛋白Fc区的N-末端结合聚乙二醇(PEG)，并将此选择性地与胰岛素类似物B链的N-末端偶联来制成胰岛素类似物-聚乙二醇-免疫球蛋白Fc复合物。很明显，这种胰岛素类似物-聚乙二醇-免疫球蛋白Fc复合物的血液中的半衰期相比于非复合物增加，并且在疾病模型动物中同样呈现出血糖强化效果，从而可以制造出维持生物体内的活性的新颖的长效胰岛素剂型。
由于免疫球蛋白Fc区为在生物体内代谢的生物降解性的多肽，因此，即使使用为药物的载体也很安全。并且，免疫球蛋白Fc区与免疫球蛋白的整个分子相比，分子量相对小，因此，不仅在复合物的制造、纯化及收益率方面有利，而且因每个抗体的氨基酸序列均不同而清除呈现出高的非均质性的Fab部分，因此，可以期待大大提高均质性，并降低血液中的抗原性的引发可能性的效果。
在本发明中，术语“免疫球蛋白Fc区”意味着除免疫球蛋白的重链和轻链的可变域、重链不变域1(CH1)、轻链(CL1)之外的重链域2(CH2)及重链域3(CH3)部分，还在重链域包括铰链(hinge)部分。并且，本发明的免疫球蛋白Fc区具有与天然型胰岛素类似物实质上相同或提高的效果，并且，仅仅除了免疫球蛋白的重链和轻链的可变域之外，可以是包括一部分或整个重链域1(CH1)和/或轻链不变域1(CL1)的扩张的Fc区。并且，可以是与CH2和/或CH相对应的相当长的一部分氨基酸序列被清除的域。
即，本发明的免疫球蛋白Fc区可以为1)CH1域、CH2域、CH3域及CH4域；2)CH1域及CH2域；3)CH1域及CH3域；4)CH2域及CH3域；5)与一个或两个以上的域和免疫球蛋白铰链域(或铰链域的一部分)之间的组合；以及6)重链域的各个域和轻链不变域的二聚物。
并且，本发明的免疫球蛋白Fc区不仅包含天然型氨基酸序列，而且还包含其序列变异体(mutant)。氨基酸序列变异体是指天然氨基酸序列中的一种以上的氨基酸残基通过缺失、插入、非保守取代或保守取代或它们的组合来具有不同的序列。例如，在IgG Fc的情况下，被视为在结合方面非常重要的214至238、297至299、318至322或327至33的第1号氨基酸残基可以为了变形而用作适当的部位。
并且，可以具有清除形成有二硫键的部位，或者在天然型F中清除N-末端的几个氨基酸，或者向天然型Fc的N-末端附加蛋氨酸残基等多种变异体。并且，为了消除效应物功能，可以清除补体结合部位，例如，C1q结合部位，也可以清除抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC，antibody dependent cell mediated cytotoxicity)部位。制造这种免疫球蛋白Fc区的序列衍生物的技术已公开于国际专利公开第WO97/34631号、国际专利公开第96/32478号等。
不会使分子的活性整体发生变更的蛋白质及肽中的氨基酸交换已公开于相关领域中(H.Neurath，R.L.Hill，The Proteins，Academic Press，New York，197 9)。最普遍发生的交换为氨基酸残基Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Thy/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu、Asp/Gly之间的交换。
根据情况，可以被修饰(modification)为磷酸化(phosphorylation)、硫酸化(sulfation)、丙烯酸酯化(acrylation)、糖化(glycosylation)、甲基化(methylation)、法尼基化(farnesylation)、乙酰化(acetylation)及酰胺化(amidation)等。
如上所述的Fc变异体为呈现出与本发明的Fc区相同的生物学活性，并且增加Fc区的列、pH值等的结构稳定性的变异体。
并且，这种Fc区可以从人类、牛、羊、猪、小鼠、兔、仓鼠、大鼠，豚鼠等动物的生物体内分离的天然型中获得，也可以为从形质转换的动物细胞或微生物中获得的重组型或除此之外的衍生物。其中，从天然型获得的方法可以通过从人类或动物的生物体分离整个免疫球蛋白之后，处理蛋白质分解酶来获得。在处理木瓜蛋白酶的情况下，利用Fab及Fc进行切割，在处理胃蛋白酶的情况下，利用pF'c及F(ab)2进行切割。对此，可以利用尺寸排阻色谱法(size-exclusion chromatography)等来分离Fc或pF'c。
优选为微生物中获取来自人类的Fc区的重组型免疫球蛋白Fc区。
并且，免疫球蛋白Fc区可以为天然型糖链形态、相比于天然型增加的糖链形态、相比于天然型减少的糖链形态或清除糖链的形态。这种免疫球蛋白Fc糖链的增减或清除可以使用化学方法、酶法及利用微生物的遗传工程方法等通常的方法。其中，在Fc中清除糖链的免疫球蛋白Fc区显著降低补体(c1q)的结合力，并且减少或清除抗体-依赖性细胞毒性或补体-依赖性细胞毒性，因此，不会在生物体内引起不必要的免疫反应。在这些方面，作为药物的载体的更加符合原有目的的形态可以是清除糖链或糖链实现非糖基化的免疫球蛋白Fc区。
在本发明中，糖链的清除(Deglycosylation)是指利用酶来清除糖的Fc区，“非糖基化(Aglycosylation)”意味着原核动物，优选地，意味着从大肠菌中生成并未实现糖链的Fc区。
另一方面，免疫球蛋白Fc区可以是人类或牛、羊、猪、小鼠、兔、仓鼠、大鼠，豚鼠等动物起源，优选为人类起源。并且，免疫球蛋白Fc区可以是来自IgG、IgA、IgD、IgE、IgM或它们的组合(combination)或基于它们的混合(hybrid)的Fc区。优选地，是来自人类血液中最丰富的IgG或IgM，最优选为被誉为提高配体结合蛋白质的半衰期的IgG衍生。
另一方面，在本发明中，组合(combination)意味着在形成二聚物或多聚物时，用于对相同起源的单链免疫球蛋白Fc区进行加密的多肽与不同起源的单链多肽形成键。即，可以利用选自由IgG Fc、IgA Fc、IgM Fc、IgD Fc及IgE的Fc片段组成的组中的两个以上的片段来制造二聚物或多聚物。
在本发明中，“混合物(hybrid)”是意味着在单链的免疫球蛋白Fc区内存在相当于两个以上的不同起源的免疫球蛋白Fc片段的序列的术语。在本发明的情况下，可以形成为多种形态的混合物。即，可以形成由选自由IgG Fc、IgM Fc、IgA Fc、IgE Fc及IgD Fc的CH1、CH2、CH3及CH4组成的组中的一个至4个域组成的域的混合物，并能包括铰链。
另一方面，IgG同样可以分为IgG1、IgG2、IgG3及IgG4的子类，在本发明中，可以实现它们的组合或它们的混合化。优选为IgG2及IgG4子类，最优选为几乎没有补体依赖细胞毒性(CDC，complementdependent cytotoxicity)之类的效应物功能(effector function)的IgG4的Fc区。即，最优选的本发明的药物的载体用免疫球蛋白Fc区是来自人类IgG4的非-糖链化的Fc区。与可以在人类生物体中起到抗原作用，并引起对此生成新颖的抗体等并不优选的免疫反应的非-人类衍生的Fc区相比，人类衍生的Fc区更为优选。
在所述胰岛素类似物复合物的具体实施方式中，可以采用非肽聚合物的各末端分别与免疫球蛋白Fc区的N-末端及胰岛素类似物B链的N-末端的胺基或B链的内部残基的赖氨酸ε-氨基或巯(Thiol)基相结合的形态。
本发明的Fc区-连接子-胰岛素类似物可以成为多种摩尔比的结合。即，与一个胰岛素类似物相结合的Fc区和/或连接子的数量不受限制。
并且，在Fc区和胰岛素类似物通过基因重组方法来表达为融合蛋白质形态的情况下，本发明的Fc区、任意的连接子及胰岛素类似物的结合可以包括所有共建结合及氢键、离子键、范德瓦耳斯亲和力，疏水性相互作用等种类的所有种类的非共建结合。但是，在胰岛素类似物的生理活性方面，优选为共建结合，但并不局限于此。
另一方面，在本发明的Fc区、任意的连接子及胰岛素类似物的情况下，可以进行N-末端、C-末端的结合，但更优选地，与游离基相结合，尤其，可以在它们的氨基末端、赖氨酸的氨基酸残基、组氨酸的氨基酸残基或游离半胱氨酸残基中形成共建结合。
并且，本发明的Fc区、任意的连接子及胰岛素类似物的结合可以向任意的方向结合。即，可以进行连接子与免疫球蛋白Fc区的N-末端、C-末端及游离基的结合，也可以进行连接子与胰岛素类似物的N-末端、C-末端及游离基相结合。
非肽连接子和免疫球蛋白片段的结合位置可以是免疫球蛋白的N-末端胺基，并且并不局限于免疫球蛋白片段序列的赖氨酸残基或半胱氨酸残基等某一位置。
并且，在所述胰岛素类似物复合物的具体实施形态中，除了与所述免疫球蛋白Fc区的N-末端相结合之外，非肽聚合物的末端可以与内部氨基酸残基或其游离反应基相结合，但并不局限于此，所述内部氨基酸残基或其游离反应基可以与非肽聚合物末端的反应基相结合。
在本发明中，非肽聚合物意味着由两个以上的重复单元相结合的生物相容性聚合物，所述重复单元通过并非肽键的任意的共建结合来相互连接。这种非肽聚合物可以具有两个末端或三个末端。
可以使用于本发明的非肽聚合物可以选自由聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇、丙二醇的共聚物、聚氧乙基化多元醇、聚乙烯醇、多糖、葡聚糖、聚乙烯乙醚、PLA(聚乳酸，polylactic acid)及PLGA(聚乳酸-羟基乙酸，polylactic-glycolic acid)之类的生物降解性高分子、脂质聚合物、甲壳素类、透明质酸及它们的组合组成的组中，优选为聚乙二醇。相关领域公知的它们的衍生物及可以在相关领域的技术水平上容易制造的衍生物也属于本发明的范围。
在通过现有的帧融合(inframe fusion)方法来制造的融合蛋白质中所使用的肽连接子的情况下，在生物体内容易地被蛋白质分解酶切割而无法获得所期待的基于载体的活性药物的血液中的半衰期的增加效果，而在本发明中，不仅可以利用肽连接子来制造复合物，而且可以利用非肽连接子来制造复合物。非肽连接子可以使用蛋白质分解酶中具有抵抗性的聚合物来与载体相似地维持肽的血液中的半衰期。因此，可以在本发明中使用的非肽聚合物只要是起到如上所述的作用，即，对生物体内的蛋白质分解酶具有抵抗性的聚合物，就可以不受限制地使用。非肽聚合物的分子量在1至100kDa范围，优选为1至20kDa范围。
并且，与所述免疫球蛋白Fc区相结合的本发明的非肽聚合物不仅可以使用一种聚合物，而且可以使用不同种类的聚合物的组合。
本发明所使用的非肽聚合物具有可以与免疫球蛋白Fc区及蛋白质药物相结合的反应基。
优选地，所述非肽聚合物的两个末端反应基选自由反应醛基、丙醛基、丁醛基、马来酰亚胺(maleimide)基及琥珀酰亚胺(succinimide)衍生物组成的组中。在所述物质中，琥珀酰亚胺衍生物可以使用琥珀酰亚胺丙酸酯、羟基琥珀酰亚胺、琥珀酰亚胺羧基甲基、或琥珀酰亚胺碳酸酯。尤其，所述非肽聚合物在两个末端具有反应醛基的反应基的情况下，在将非特异性反应最小化，并在非肽聚合物的两个末端分别与生理活性多肽及免疫球蛋白相结合方面非常有效。通过基于醛偶联的还原性烷基化来生成的最终产物相比于通过酰胺键相连接的最终产物更加稳定。醛反应基可以在低的pH值中与N-末端选择性地发生反应，而在高的pH值，例如，在pH9.0的条件下，可以与赖氨酸残基形成共建结合。
所述非肽聚合物的两个末端反应基可以相同或不同。例如，可以在一侧末端具有马来酰亚胺基，在另一侧末端具有醛基、丙醛基或丁醛基。在将具有羟基反应基的聚乙二醇作为非肽聚合物利用于两侧末端的情况下，可通过公知的化学反应来将所述羟基基活性化为所述多种反应基，或者利用可以在商业领域获得的具有发生变形的反应基的聚乙二醇来制造本发明的单链胰岛素类似物复合物。
这种本发明的胰岛素类似物复合物不仅可以维持能量代谢及糖代谢之类的现有的胰岛素的生物体内活性，而且进一步增加胰岛素类似物的血液中的半衰期及由此引起的所述肽的生物体内功效的持续效果，因此，有利于糖尿病的治疗。
在本发明的一实施例中，确认了当与延长这种生物体内半衰期的载体等相结合时，在胰岛素受体结合力相比于天然型胰岛素复合物减少的胰岛素类似物中呈现出显著增加的生物体内半衰期(图6)。
作为另一实施方式，本发明提供包含胰岛素类似物复合物的胰岛素长效制剂。所述胰岛素长效制剂可以是生物体内的长效及稳定性增加的胰岛素长效制剂。所述长效制剂可以是糖尿病治疗投用剂学组合物。
本发明的包含复合物的药剂学组合物可包含药剂学上可允许的载体。在口服投用的情况下，药剂学上可允许的载体可使用结合剂、滑剂、崩解剂、赋形剂、增溶剂、分散剂、稳定剂、悬浮剂、色素、香料等，在注射剂的情况下，药剂学上可允许的载体可混合使用缓冲剂、保鲜剂、无痛剂、增溶剂、等张化剂、稳定剂等，而在局部投用的情况下，药剂学上可允许的载体可使用基剂、赋形剂、润滑剂、保鲜剂等。本发明的药剂学组合物的剂型可以与如上所述的药剂学上允许的载体一同混合来以多种方式制造。例如，在口服投用的情况下，可以制成片剂、锭剂、胶囊、酏剂、悬浮液、糖浆、糯米纸等形态，在注射剂的情况下，可以制成单元投用安瓶或多次投用形态。本发明还能以其他溶液、悬浮液、片剂、丸药、胶囊、缓释剂等方式实现剂型化。
另一方面，作为适合进行制剂化的载体、赋形剂及稀释剂的例，可以使用糖，葡萄糖，蔗糖，山梨糖醇、甘露醇、木糖醇、赤藓醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯胶、藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁或矿物油等。
并且，还可以包含填充剂、抗凝聚剂、润滑剂、湿润剂、香料、防腐剂等。
作为又一实施方式，本发明提供治疗与胰岛素相关的疾病的方法，所述治疗与胰岛素相关的疾病的方法包括向需要所述胰岛素类似物或胰岛素类似物复合物的个体投用所述胰岛素类似物或胰岛素类似物复合物的步骤。
本发明的复合物在治疗糖尿病方面有用，而通过投用包含所述复合物的药剂学组合物，可以谋求治疗所述疾病的效果。
在本发明中，术语“投用”意味着通过任意适当的方法来向患者导入规定的物质，只要可以到达靶组织，所述复合物的投用路径就可以通过任何普通的路径来投用。可以包括腹腔内投用、静脉投用、皮下投用、皮内投用、口服投用、局部投用、鼻内投用、肺内投用、直肠内投用等，但并不局限于此。但当进行口服投用时，由于肽会被消化，因此，优选地，口服用组合物应涂敷活性药剂或以从所述分解中得到保护的方式实现制剂化。优选地，可以以注射剂形态投用。并且，药剂学组合物可通过使活性物质向靶细胞移动的任意的装置来投用。
本发明的药剂学组合物根据所要治疗的疾病、投用途径、患者的年龄、性别、体重、疾病的严重程度等多个相关因子及作为活性成分的药物的种类来决定。本发明的药剂学组合物因在生物体内的长效及效价优秀，因此可以显著降低本发明的药剂学制剂的投用次数及频率。
作为其他实施方式，本发明提供制造胰岛素类似物复合物的方法，所述制造胰岛素类似物复合物的方法包括：准备胰岛素类似物的步骤；准备载体的步骤；以及将所述胰岛素类似物与载体连接的步骤。
作为其他实施方式，本发明提供一种利用所述胰岛素类似物、或胰岛素类似物与载体结合而成的胰岛素类似物复合物来增加生物体内的半衰期的方法。
以下，通过下述实施例来更加详细地说明本发明。但是，以下实施仅用于例示本发明，本发明的范围不会因这些实施例而受到限制。
实施例1：单链胰岛素类似物表达向量的制造
为了制造以所拥有的天然型胰岛素表达向量作为模型来使A链或B链的氨基酸逐一发生变形胰岛素类似物，对正向寡核苷酸和反向寡核苷酸进行合成之后(表2)，进行聚合酶链式反应(PCR)来使各个类似物基因增幅。
在以下表1中示出各个A链或B链的氨基酸的变化序列及类似物的名称。即，在类似物1的情况下，为A链的第1号甘氨酸被丙氨酸取代的形态，而类似物4的情况下，为B链的第8号甘氨酸被被丙氨酸取代的形态。
表1
Figure GDA0001724021300000131
用于使胰岛素类似物增幅的引物呈现于以下表2中。
表2
Figure GDA0001724021300000141
用于增幅胰岛素类似物的聚合酶链式反应(PCR)条件为，在95℃温度下30秒钟，在55℃温度下30秒钟，在68℃温度下6分钟，而这一过程反复实施了18次。在这种条件下获得的胰岛素类似物片段为了表达为细胞内的包涵体形态而插入于pET22b向量，而将以这种方式获得的表达向量命名为pET22b-胰岛素类似物1至9。所述表达向量包含在T7启动子的调节下对胰岛素类似物1至9的氨基酸序列进行涂敷的核酸，并且在宿主内将胰岛素类似物蛋白质表达为包涵体形态。
在以下表3中分别示出了胰岛素类似物1至9的DNA序列及蛋白质序列。
表3
Figure GDA0001724021300000151
Figure GDA0001724021300000161
Figure GDA0001724021300000171
实施例2：重组胰岛素类似物融合肽的表达
在由T7启动子调节的情况下，执行了重组胰岛素类似物的表达。利用各个重组胰岛素类似物表达向量来对E.coli BL21-DE3(E.coli B F-dcm ompT hsdS(rB-mB-)galλDE3)；Novagen公司)进行了形质转换。形质转换方法使用了Novagen公司推荐的方法。采用各重组表达向量发生形质转换的各个单一菌落来接种于包含氨苄西林(50μg/ml)的2X溶菌肉汤(Luria Broth，LB)培养基，并在37℃温度下培养15小时。按1:1(v/v)的比率混合重组菌株培养液和包含30％的甘油的2X溶菌肉汤培养基，并分别以1ml分株于冷冻管，之后在-140℃条件下进行保管。将此作为用于生产重组融合蛋白质的细胞库存(cell stock)来使用。
为了重组胰岛素类似物的表达，分别溶解1小瓶细胞库存，并接种于500ml的2X溶菌肉汤，之后在37℃温度下进行14～16小时的振荡培养。若OD600的值呈现出5.0以上，则结束培养，并将此使用为种培养液。利用50L发酵机(MSJ-U2，B.E.MARUBISHI，日本)，将种培养液接种于17L的发酵培养基，并开始实施初期的浴(bath)发酵。培养条件利用37℃的温度、20L/分钟(1vvm)的空气量、500rpm的搅拌速度及30％的氨水来维持pH6.70。在进行发酵方面，当培养液内的营养素受到限制时，添加追加性的培养基(feeding solution)来进行补料分批培养。通过OD值来监测菌株的成长，在OD值为100以上的情况下，向最终浓度为500μM的异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)导入。在进行导入之后，继续进行约23～25小时的培养，在结束培养之后，使用离心分离器来收获重组菌株，并在-80℃环境下进行保管，直到使用为止。
实施例3：重组胰岛素类似物的回收及重折叠(refolding)
为了将在所述实施例2中表达的重组胰岛素类似物改变为可溶性形态，对细胞进行破碎，并进行重折叠。将100g(wet weight)的细胞颗粒再悬浮于1L的溶解缓冲液(50mM的Tris-HCl(pH9.0)、1mM的乙二胺四乙酸(EDTA)(pH8.0)、0.2的M NaCl及0.5％的曲通X-100)。利用微射流(microfluidizer)处理器M-110EH(AC技术公司(Technology Corp)，模型(Model)M1475C)以15000psi的压力对细胞进行破碎。以7000rpm的速度在4℃条件下对破碎的细胞溶解物进行20分钟的离心分离，并清除上层液，然后再悬浮于3L的清洗缓冲液(0.5％的曲通X-100及50mM的Tris-HCl(pH8.0)、0.2M的NaCl、1mM的乙二胺四乙酸(EDTA))。以7000rpm的速度在4℃条件下进行20分钟的离心分离，并将颗粒再悬浮于蒸馏水之后，利用相同的方法进行离心分离。采取颗粒来再悬浮于400ml的缓冲液(1M的甘氨酸(Glycine)、3.78g的半胱氨酸(半胱氨酸(Cysteine))-HCl，pH10.6)，并在常温下搅拌1小时。为了回收再悬浮的重组胰岛素类似物，在添加400mL的8M尿素之后，在40℃条件下搅拌1小时。为了对增溶的重组胰岛素类似物进行重折叠(refolding)，以7000rpm的速度在4℃条件下进行30分钟的离心分离之后，采取上层液，并在此利用蠕动泵(peristaltic pump)以1000ml/hr的流速放入2L的蒸馏水，在4℃条件下搅拌16小时。
实施例4：阳离子结合色谱法纯化
在利用包含45％的乙醇的20mM的柠檬酸钠(pH2.0)缓冲液来实现平衡化的SourceS(通用电气医疗(GE healthcare)公司)柱结合结束重新结合的试样之后，使用包含氯化钾0.5M和45％的乙醇的20mM柠檬酸钠(pH2.0)缓冲液来以使浓度成为0％至100％的方式以10柱容量的线性浓度梯度对胰岛素类似物蛋白质进行溶出。
实施例5：胰蛋白酶(Trypsin)和羧肽酶B(Carboxypeptidase B)的处理
在利用脱盐柱(Desalting column)来溶出的试样中清除碱，并利用缓冲溶液(10mM的Tris-HCl，pH8.0)进行更换。在添加相当于所获得的试样蛋白量的1000摩尔比的胰蛋白酶和相当于2000摩尔比的羧肽酶B之后，在16℃中搅拌16小时。为了结束反应，利用1M的柠檬酸钠(pH2.0)将pH值降低至3.5。
实施例6：阳离子结合色谱法纯化
在利用包含45％的乙醇的20mM的柠檬酸钠(pH2.0)缓冲液来实现平衡化的SourceS(通用电气医疗(GE healthcare)公司)柱重新结合结束反应的试样之后，使用包含0.5M的氯化钾和45％的乙醇的20mM柠檬酸钠(pH2.0)缓冲液来以使浓度成为0％至100％的方式以10柱容量的线性浓度梯度对胰岛素类似物蛋白质进行溶出。
实施例7：阴离子结合色谱法纯化
在利用脱盐柱(Desalting column)来溶出的试样中清除碱，并利用缓冲溶液(10mM的Tris-HCl，pH7.5)进行更换。为了从在所述实施例6中获得的试样中纯化出纯的胰岛素类似物，与利用10mM的三羟甲基氨基甲烷(pH7.5)缓冲液来实现平衡化的阴离子交换柱(Source Q：通用电气医疗(GE healthcare)公司)相结合之后，使用包含0.5M的氯化钠的10mM的三羟甲基氨基甲烷(pH7.5)缓冲液来以使浓度成为0％至100％的方式以10柱容量的线性浓度梯度对胰岛素类似物蛋白质进行溶出。
使用蛋白质电泳(SDS-PAGE，图1)及高压色谱法(HPLC)来对纯化后的胰岛素类似物的纯度进行分析(图2)，并通过分析肽图谱(图3)和各峰值的分子量来确认了氨基酸的变更。
结果，确认了氨基酸序列根据各个胰岛素类似物的需要而发生了变更。
实施例8：胰岛素类似物(第7号)-免疫球蛋白Fc复合物的制造
为了使3.4K的ALD2聚乙二醇(NOF，日本)在胰岛素类似物β链的N-末端实现聚乙二醇化，将胰岛素类似物:聚乙二醇的摩尔比设为1:4，将胰岛素类似物的浓度设为5mg/ml，并在4℃条件下实施约2小时的反应。此时，在50mM的柠檬酸钠(Sodium Citrate)、pH6.0、45％的异丙醇条件下实施反应，并添加3.0mM浓度的氰基硼氢化钠还原剂进行反应。使用包含柠檬酸钠(pH3.0)、45％的乙醇的缓冲液和利用KCl浓度梯度的SP-HP(通用电气医疗(GEhealthcare)公司，美国)柱来对反应液进行纯化。
为了制造胰岛素类似物-免疫球蛋白Fc片段复合物，使得在以上得到纯化的单聚乙二醇化(mono-PEGylated)的胰岛素类似物和免疫球蛋白Fc片段的摩尔比成为1:1至1:2，使总蛋白质浓度成为约20mg/ml，并在25℃温度下实施13小时的反应。此时，反应缓冲液条件为100mM的4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)，pH8.2，并添加20mM的氰基硼氢化钠作为还原剂。由此，在Fc片段的N-末端结合聚乙二醇。
在反应结束之后，反应液利在Q HP(通用电气医疗(GE healthcare)公司，美国)柱中利用Tris-HCl(pH7.5)缓冲液和NaCl浓度梯度来对未发生反应的免疫球蛋白Fc片段、实现单聚乙二醇化的胰岛素类似物进行分离和纯化。
之后，使用Source 15ISO(通用电气医疗(GE healthcare)公司，美国)作为二次柱来清除两个以上的所残留的免疫球蛋白Fc片段及胰岛素类似物与免疫球蛋白Fc片段相结合的复合物，从而获得了胰岛素类似物-免疫球蛋白Fc片段复合物。此时，利用包含Tris-HCl(pH7.5)的硫酸铵(Ammonium sulfate)的浓度梯度来进行溶出，并使用蛋白质电泳(SDS-PAGE，图4)及高压色谱法(HPLC)来对溶出后的胰岛素类似物-免疫球蛋白Fc复合物进行分析(图5)。结果，可以确认几乎以99％的纯度得到了纯化。
实施例9：天然型胰岛素、胰岛素类似物、天然型胰岛素-免疫球蛋白Fc复合物和胰岛素类似物-免疫球蛋白Fc复合物的胰岛素受体结合力的比较
为了测定胰岛素类似物-免疫球蛋白Fc复合物的胰岛素受体结合力，利用表面等离子体共振(Surface plasmon resonance，SPR，BIACORE 3000，通用电气医疗(GEhealthcare)公司)来进行分析。通过胺偶联方法使胰岛素受体固定于CM5芯，并以独立方式滴入以5个以上的浓度进行稀释的天然型胰岛素、胰岛素类似物、天然型胰岛素-免疫球蛋白Fc复合物、胰岛素类似物-免疫球蛋白Fc复合物，从而确认了对各个物质的胰岛素受体的结合力。利用BIAevaluation软件来计算出了各物质的结合力，而此时所使用的模型利用了1:1朗缪尔与基线漂移结合(Langmuir binding with baseline drift)。
结果，与人类胰岛素相比，胰岛素类似物(第6号)呈现出14.8％，胰岛素类似物(第7号)呈现出9.9％，胰岛素类似物(第8号)呈现出57.1％，胰岛素类似物(第9号)呈现出78.8％，天然型胰岛素-免疫球蛋白Fc复合物根据走行(run)来呈现出3.7-5.9％之间，而胰岛素类似物(第6号)-免疫球蛋白Fc复合物确认了0.9％以下的受体结合力，胰岛素类似物(第7号)-免疫球蛋白Fc复合物确认了1.9％的受体结合力，胰岛素类似物(第8号)-免疫球蛋白Fc复合物确认了1.8％的受体结合力，胰岛素类似物(第9号)-免疫球蛋白Fc复合物确认了3.3％的受体结合力(表4)。像这样，观察到与天然型胰岛素相比，本发明的胰岛素类似物的胰岛素受体结合力减少，并且胰岛素类似物-免疫球蛋白Fc复合物的胰岛素受体结合力也同样显著减少。
表4
对胰岛素受体的结合力的比较
Figure GDA0001724021300000211
实施例10：天然型胰岛素-免疫球蛋白Fc复合物和胰岛素类似物-免疫球蛋白Fc复合物的in-vitro功效的比较
为了测定胰岛素类似物-免疫球蛋白Fc复合物的in-vitro功效，实施利用由脂肪细胞分化的来自小鼠的3T3-L1细胞株的葡萄糖摄取能力(glucose uptake，或脂质合成能力)试验。利用包含10％NBCS(新生牛血清)的达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM，Dulbeco'sModified Eagle's Medium，Gibco公司，Cat.No，12430)培养基对3T3-L1细胞进行每周2～3次的继代培养，并进行维持。利用分化用培养基(包含10％FBS的DMEM)来对3T3-L1细胞进行悬浮之后，以每孔成为5×104个的方式在48孔板进行接种，并培养48小时。为了利用脂肪细胞进行分化，在分化用培养基中混合1μg/mL的人类胰岛素(西格玛(Sigma)公司，Cat.No.I9278)、0.5mM的3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX，3-isobutyl-1-methylxanthine，西格玛(Sigma)公司，Cat.No.I5879)、1μM的地塞米松(Dexamethasone)(西格玛(Sigma)公司，Cat.No.D4902)，并在清除现有的培养基清除之后，每孔分别放入250μl。在经过48小时之后，利用在分化用培养基中仅添加1μg/mL的人类胰岛素的培养基重新实施交换。之后，每隔48小时利用添加有1μg/mL的人类胰岛素的分化用培养基进行交换，并确认了利用脂肪细胞的分化引导7-9天。为了葡萄糖摄取能力试验，利用无血清DMEM培养基对结束分化的细胞水洗一次之后，分别放入250μl来在4小时内引导血清的枯竭。利用无血清DMEM培养基，以使人类胰岛素从2μM成为0.01μM，使天然型胰岛素-免疫球蛋白Fc复合物和胰岛素类似物-免疫球蛋白Fc复合物分别从20μM成为0.02μM的方式分别依次稀释10倍来准备。将所准备的试样分别向细胞添加250μl之后，在24小时内在37℃、5％的CO2培养基中进行培养。为了测定结束培养的培养基的葡萄糖剩余量，并采用200μl的培养基来，利用杜氏磷酸盐缓冲液(D-PBS)分别稀释5倍，并进行酶试剂(GOPOD，GOPOD检测试剂盒(Assay Kit)，Megazyme公司，Cat.No.K-GLUC)分析。以葡萄糖标准溶液的吸光度为基准换算出培养基的剩余葡萄糖浓度，并分别计算出天然型胰岛素-免疫球蛋白Fc复合物、胰岛素类似物-免疫球蛋白Fc复合物对葡萄糖吸收能力的EC50。
结果，与人类胰岛素相比，天然型胰岛素-免疫球蛋白Fc复合物呈现出11.6％的葡萄糖摄取能力，胰岛素类似物(第6号)-免疫球蛋白Fc复合物呈现出0.43％的葡萄糖摄取能力，胰岛素类似物(第7号)-免疫球蛋白Fc复合物呈现出1.84％的葡萄糖摄取能力，胰岛素类似物(第8号)-免疫球蛋白Fc复合物呈现出16.0％的葡萄糖摄取能力，胰岛素类似物(第9号)-免疫球蛋白Fc复合物呈现出15.1％的葡萄糖摄取能力(表5)。像这样，观察出与天然型胰岛素-免疫球蛋白Fc复合物相比，本发明的胰岛素类似物(第6号)-免疫球蛋白Fc复合物和胰岛素类似物(第7号)-免疫球蛋白Fc复合物的in-vitro效价进一步减少，而胰岛素类似物(第8号)-免疫球蛋白Fc复合物和胰岛素类似物(第9号)-免疫球蛋白Fc复合物的体外in-vitro效价与天然型胰岛素-免疫球蛋白Fc复合物类似。
表5
Figure GDA0001724021300000231
实施例11：确认胰岛素类似物-免疫球蛋白Fc复合物的药代动力学(pharmacokinetics)
为了确认胰岛素类似物-免疫球蛋白Fc复合物的药代动力学，在已经在实验室适应5天的正常大鼠(SD大鼠(rat)，雄性，6周龄)中进行基于时间的血液中的浓度比较试验。将21.7nmol/kg和65.1nmol/kg的天然型胰岛素-免疫球蛋白Fc复合物和胰岛素类似物-免疫球蛋白Fc复合物分别皮下投用之后，分别在0小时、1小时、4小时、8小时、24小时、48小时、72小时、96小时、120小时、144小时、168小时、192小时、216小时进行采血。利用酶联免疫吸附试验(ELISA，enzyme linked immunosorbent assay)来测定了各小时内的天然型胰岛素-免疫球蛋白Fc复合物及胰岛素类似物-免疫球蛋白Fc复合物的血液中的剩余浓度，并使用Insulin ELISA(ALPCO公司，美国)作为所使用的试剂盒。但是，使用mouse anti-humanIgG4HRP conjugate(Alpha Diagnostic Intl，Inc，美国)作为测定抗体(detectionantibody)。
对天然型胰岛素-免疫球蛋白Fc复合物和胰岛素类似物-免疫球蛋白Fc复合物的药代动力学进行观察，结果可知两种物质在血液中的浓度相对于投用浓度均增加，而对胰岛素受体呈现出较低的结合力的胰岛素类似物-免疫球蛋白Fc复合物与天然型胰岛素-Fc复合物相比，呈现出增加很多的半衰期(图6)。
这种结果启示，在形成与免疫球蛋白Fc区相结合的复合物的情况下，以减少胰岛素受体结合力的方式发生变形的本发明的胰岛素类似物在实际生物体内的血液中的半衰期进一步增加，从而可以提供为稳定的胰岛素制剂
Figure GDA0001724021300000232
并且可以有效地使用为糖尿病治疗剂。并且，这种结果启示本发明的胰岛素类似物本身同样减少与胰岛素受体之间的结合力，并减少效价，因此，即使与多种载体等相结合，也可以呈现出相同的效果。
从以上的说明中，本发明所属技术领域的普通技术人员可以理解在不变更本发明的技术思想或必要的特征的情况下，以其他具体形态实施。与此相关地，应理解如上所述的实施例在所有方面均为例示，并非限定。比起所述的详细说明，本发明的范围更应通过保护范围的意义、范围及从等同的技术方案中导出的所有变更或变形的形态来解释。
Figure IDA0000772132680000011
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Claims (23)

1.一种胰岛素类似物，其胰岛素效价低于天然胰岛素，其中胰岛素中的氨基酸发生变异，所述变异通过用天冬酰胺取代A链的第14号氨基酸进行，并且其中胰岛素的B链和A链的氨基酸序列分别由SEQ ID NO:38和37组成。
2.根据权利要求1所述的胰岛素类似物，其中所述胰岛素效价的减少是因对胰岛素受体的结合力的减少而引起。
3.根据权利要求1所述的胰岛素类似物，其中所述胰岛素类似物是序列号36。
4.一种胰岛素类似物复合物，其中(ⅰ)根据权利要求1至3中任一项所述的胰岛素类似物与(ⅱ)能够延长胰岛素类似物在生物体内的半衰期的载体连接，所述载体是选自由聚乙二醇、脂肪酸、胆固醇、白蛋白及其片段、白蛋白结合物质、指定氨基酸序列的重复单元的聚合物、抗体、抗体片段、FcRn结合物质、生物体内的结合组织或其衍生物、核苷酸、纤维连接蛋白、转铁蛋白(Transferrin)、糖化物(saccharide)、及高分子聚合物所构成的群组中的任一种生物相容性物质。
5.根据权利要求4所述的胰岛素类似物复合物，其中所述胰岛素类似物及生物相容性物质通过作为连接子的肽或非肽聚合物连接。
6.根据权利要求4所述的胰岛素类似物复合物，其中所述FcRn结合物质为免疫球蛋白Fc区。
7.根据权利要求5所述的胰岛素类似物复合物，其中(ⅰ)根据权利要求1至3中任一项所述的胰岛素类似物与(ⅱ)免疫球蛋白Fc区通过(ⅲ)肽连接子或非肽连接子连接，所述非肽连接子选自由聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇-丙二醇共聚物、聚氧乙基化多元醇、聚乙烯醇、多糖、聚乙烯乙醚、生物降解性高分子、脂质聚合物、甲壳素类、透明质酸及它们的组合所构成的群组。
8.根据权利要求7所述的胰岛素类似物复合物，其中在所述胰岛素类似物的B链的N-末端结合有所述非肽连接子。
9.根据权利要求7所述的胰岛素类似物复合物，其中非肽聚合物的各末端分别结合在免疫球蛋白Fc区的N-末端、及胰岛素类似物N-末端的胺基或B链内部残基的赖氨酸ε-氨基或巯基。
10.根据权利要求7所述的胰岛素类似物复合物，其中免疫球蛋白Fc区被非糖基化。
11.根据权利要求7所述的胰岛素类似物复合物，其中免疫球蛋白Fc区由选自由CH1、CH2、CH3及CH4域所构成的群组中的一个至四个域所构成。
12.根据权利要求7所述的胰岛素类似物复合物，其中免疫球蛋白Fc区为源自IgG、IgA、IgD、IgE或IgM的Fc区。
13.根据权利要求12所述的胰岛素类似物复合物，其中免疫球蛋白Fc区的各个域为源自选自由IgG、IgA、IgD、IgE及IgM所构成的群组中的免疫球蛋白的具有不同起源的域的混合物。
14.根据权利要求7所述的胰岛素类似物复合物，其中免疫球蛋白Fc区还包括铰链区。
15.根据权利要求12所述的胰岛素类似物复合物，其中免疫球蛋白Fc区为由单链免疫球蛋白构成的二聚物或多聚物，所述单链免疫球蛋白由相同起源的域构成。
16.根据权利要求12所述的胰岛素类似物复合物，其中免疫球蛋白Fc区为IgG4Fc区。
17.根据权利要求16所述的胰岛素类似物复合物，其中免疫球蛋白Fc区为人类非糖基化IgG4 Fc区。
18.根据权利要求7所述的胰岛素类似物复合物，其中非肽连接子的反应基选自由醛基、丙醛基、丁醛基、马来酰亚胺基、及琥珀酰亚胺衍生物所构成的群组。
19.根据权利要求18所述的胰岛素类似物复合物，其中琥珀酰亚胺衍生物为琥珀酰亚胺丙酸酯、琥珀酰亚胺羧基甲基、羟基琥珀酰亚胺或琥珀酰亚胺碳酸酯。
20.根据权利要求7所述的胰岛素类似物复合物，其中非肽连接子在两个末端具有反应性醛基。
21.一种胰岛素长效制剂，其包含根据权利要求4所述的胰岛素类似物复合物，且在生物体内的长效性及稳定性增加。
22.根据权利要求21所述的胰岛素长效制剂，其中所述胰岛素长效制剂是用于治疗糖尿病的制剂。
23.一种制造胰岛素类似物复合物的方法，所述胰岛素类似物为根据权利要求4所述的胰岛素类似物复合物，
所述制造胰岛素类似物复合物的方法包含如下步骤：
(i)准备胰岛素类似物的步骤；
(ⅱ)准备选自由聚乙二醇、脂肪酸、胆固醇、白蛋白及其片段、白蛋白结合物质、指定氨基酸序列的重复单元的聚合物、抗体、抗体片段、FcRn结合物质、生物体内的结合组织或其衍生物、核苷酸、纤维连接蛋白、转铁蛋白、糖化物、及高分子聚合物所构成的群组中的生物相容性物质的步骤；及
(ⅲ)将所述胰岛素类似物与生物相容性物质连接的步骤。
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