JP2021193089A - 新規なインスリンアナログ及びその用途 - Google Patents

Abstract

【課題】インスリンの血中半減期延長を目的として天然型に比べてインスリン力価が減少するだけでなく、インスリン受容体に対する結合力が減少したインスリンアナログ、及び前記インスリンアナログとキャリアが連結された結合体を提供する。【解決手段】天然型に比べてインスリン力価が減少しており、インスリンのＢ鎖又はＡ鎖のアミノ酸が、Ｂ鎖の８番目のアミノ酸、２３番目のアミノ酸、２４番目のアミノ酸、２５番目のアミノ酸、Ａ鎖の１番目のアミノ酸、２番目のアミノ酸及び１９番目のアミノ酸からなる群から選択されるいずれか１つのアミノ酸のアラニンへの置換によって変異されているインスリンアナログが、インスリンアナログの生体内半減期を延長するキャリアとしてのＦｃＲｎ結合物質に連結された、インスリンアナログ結合体。【選択図】図６

Description

本発明は、インスリンの血中半減期延長を目的として天然型に比べてインスリン力価が減少するだけでなく、インスリン受容体に対する結合力が減少したインスリンアナログ、前記インスリンアナログとキャリアが連結された結合体、前記結合体を含む持続性製剤、及び前記結合体を製造する方法に関する。

生体内タンパク質は、血中タンパク質分解酵素により分解されるか、腎臓を介して排泄されるか、受容体により除去されるなど様々な経路を介して除去されることが知られている。よって、このようなタンパク質除去機序を回避し、生理活性タンパク質の半減期を延長させることにより治療学的効能を向上させるための様々な試みがなされている。

一方、インスリンは、人体の膵臓から分泌される血糖調節ホルモンにより血液内の余剰ブドウ糖を細胞に送り、細胞にエネルギー源を供給すると共に、血糖を正常レベルに維持する役割を果たす。しかし、糖尿病患者においては、このようなインスリンの不足や、インスリン抵抗性及びβ細胞の機能喪失により、インスリンが正常な機能を果たせないので、血液内のブドウ糖をエネルギー源として用いることができず、血中ブドウ糖レベルが高くなる高血糖症状を起こし、結局は尿により糖を排出することになり、様々な合併症を引き起こすこともある。よって、インスリンの生成に異常がある糖尿患者（Ｔｙｐｅ Ｉ）や、インスリン耐性による糖尿患者（Ｔｙｐｅ ＩＩ）にはインスリン治療が必須であり、インスリンを投与すると正常レベルに血糖を調節することができる。しかし、インスリンにおいては、他のタンパク質やペプチドホルモンと同様に、体内の半減期が極めて短いので継続して繰り返し投与を行わなければならないという欠点がある。このような頻繁な投与は患者に多大な苦痛と不便をもたらす。そこで、タンパク質の生体内半減期を延長させて投与回数を減らすことにより患者の生活の質を向上させるために、様々なタンパク質の剤形化や化学的結合体（脂肪酸結合体，ポリエチレン重合体結合体）などに関する研究が行われてきた。現在市販中の持続型インスリンとしては、サノフィ・アベンティス社（Ｓａｎｏｆｉ−Ａｖｅｎｔｉｓ）のインスリングラルギン（ｉｎｓｕｌｉｎ ｇｌａｒｇｉｎｅ，ｌａｎｔｕｓ，持続時間約２０〜２２時間）、ノボノルディスク社（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ）のインスリンデテミル（ｉｎｓｕｌｉｎ ｄｅｔｅｍｉｒ，ｌｅｖｅｍｉｒ，持続時間約１８〜２２時間）、及びトレシーバ（ｄｅｇｌｕｄｅｃ，ｔｒｅｓｉｂａ，持続時間約４０時間）がある。これらの持続性インスリンは、血中インスリン濃度にピークがないので基底インスリンに適するが、これらも半減期が十分に長くないので、毎日１回又は２回投与しなければならないという不便さが依然として存在するので、長期間投与しなければならない糖尿病患者においては、投与頻度を画期的に低くして患者の利便性を高めるという目的達成には限界がある。

従来の研究結果報告によると、体内インスリンの除去過程は、具体的には５０％以上のインスリンは腎臓で除去され、残りのインスリンは筋肉、脂肪、肝臓などの標的部位（ｔａｒｇｅｔ ｓｉｔｅ）で受容体媒介クリアランス（ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃｌｅａｒａｎｃｅ，ＲＭＣ）工程で除去されることが知られている。

これに関して、非特許文献１、２、３などにおいて、インスリンのＲＭＣを避けるために、ｉｎ−ｖｉｔｒｏ活性を弱化させることにより血中濃度を増加させることができるという様々な報告がなされているが、これらの受容体結合力減少インスリンアナログにおいては、ＲＭＣを減少させても主な除去メカニズムである腎臓での除去が避けられないので、血中半減期を画期的に延長させるには限界があった。

国際公開第９７／０３４６３１号 国際公開第９６／０３２４７８号

Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｅｘｐ Ｔｈｅｒ（１９９８）２８６：９５９ Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｃａｒｅ（１９９０）１３：９２３ Ｄｉａｂｅｔｅｓ（１９９０）３９：１０３３ Ｈ．Ｎｅｕｒａｔｈ，Ｒ．Ｌ．Ｈｉｌｌ，Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９７９

本発明者らは、インスリンの血中半減期を延長させるために鋭意努力した結果、天然型インスリン配列でない非天然型インスリン配列により新規に製造したインスリンアナログにおいてｉｎ−ｖｉｔｒｏ力価が減少するだけなく、インスリン受容体との結合減少により腎臓での除去を減少させることを確認し、前記インスリンアナログに半減期延長に効果のある代表的なキャリアである免疫グロブリンＦｃフラグメントが結合されることによりインスリンの血中半減期がさらに延長することを確認し、本発明を完成するに至った。

本発明目的は、インスリンの体内半減期延長を目的としてｉｎ−ｖｉｔｒｏ力価が減少したインスリンアナログを製造し、キャリアとの結合体を提供することを目的とする。
具体的には、本発明は、天然型に比べてインスリン力価が減少したインスリンアナログを提供することを目的とする。

また、本発明は、インスリンアナログとキャリアが結合されたインスリンアナログ結合体を提供することを目的とする。
さらに、本発明は、前記インスリンアナログ結合体を含むインスリン持続性製剤を提供することを目的とする。

さらに、本発明は、前記インスリンアナログ結合体を製造する方法を提供することを目的とする。
さらに、本発明は、前記インスリンアナログ、又はインスリンアナログとキャリアが結合されたインスリンアナログ結合体を用いて生体内半減期を延長させる方法を提供することを目的とする。

さらに、本発明は、前記インスリンアナログ又はインスリンアナログ結合体を、それを必要とする個体に投与するステップを含むインスリン関連疾患治療方法を提供することを目的とする。

本発明の非天然型のインスリンアナログは、天然型に比べてインスリン力価が減少しただけなく、インスリン受容体に対する結合力減少により生体内除去メカニズムを回避して生体内血中半減期が延長したインスリンアナログを提供するだけでなく、それを用いたインスリンアナログ−免疫グロブリンＦｃ結合体は血中半減期を大幅に延長させることにより、インスリン投与を必要とする患者の利便性を向上させることができる。

インスリンアナログの純度をタンパク質電気泳動により分析した結果を示す図である。代表的なインスリンアナログである７番アナログの結果である。第１レーンはｓｉｚｅ ｍａｒｋｅｒであり、第２レーンは天然型インスリンであり、第３レーンはインスリンアナログ（７番）である。 インスリンアナログの純度を高圧クロマトグラフィーで分析した結果である。代表的なインスリンアナログである７番アナログの結果である。（Ａ）はＲＰ−ＨＰＬＣであり、（Ｂ）はＳＥ−ＨＰＬＣである。 インスリンアナログをペプチドマッピング分析した結果である。インスリンアナログは代表的なアナログである７番アナログを用いて分析した。（Ａ）は天然型インスリンであり、（Ｂ）はインスリンアナログ（７番）である。 インスリンアナログ−免疫グロブリンＦｃ結合体の純度をタンパク質電気泳動で分析した結果である。代表的なインスリンアナログである７番アナログの結果である。第１レーンはｓｉｚｅ ｍａｒｋｅｒであり、第２レーンはインスリンアナログ（７番）−免疫グロブリンＦｃ結合体である。 インスリンアナログ−免疫グロブリンＦｃ結合体の純度を高圧クロマトグラフィーで分析した結果である。代表的なインスリンアナログである７番アナログの結果である。（Ａ）はＲＰ−ＨＰＬＣであり、（Ｂ）はＳＥ−ＨＰＬＣであり、（Ｃ）はＩＥ−ＨＰＬＣである。 天然型インスリン−免疫グロブリンＦｃ結合体及びインスリンアナログ−免疫グロブリンＦｃ結合体の正常ラットにおける薬物動態分析を示す結果である。代表的なインスリンアナログである７番アナログの結果である。○は天然型インスリン−免疫グロブリンＦｃ結合体（２１．７ｎｍｏｌ／ｋｇ）であり、●は天然型インスリン−免疫グロブリンＦｃ結合体（６５．１ｎｍｏｌ／ｋｇ）であり、□はインスリンアナログ−免疫グロブリンＦｃ結合体（２１．７ｎｍｏｌ／ｋｇ）であり、■はインスリンアナログ−免疫グロブリンＦｃ結合体（６５．１ｎｍｏｌ／ｋｇ）である。（Ａ）は天然型インスリン−免疫グロブリンＦｃ結合体及びインスリンアナログ（７番）−免疫グロブリンＦｃ結合体であり、（Ｂ）は天然型インスリン−免疫グロブリンＦｃ結合体及びインスリンアナログ（８番）−免疫グロブリンＦｃ結合体であり、（Ｃ）は天然型インスリン−免疫グロブリンＦｃ結合体及びインスリンアナログ（９番）−免疫グロブリンＦｃ結合体である。

［発明を実施するための最良の形態］
一態様として、本発明は、天然型に比べてインスリン力価が減少した、Ｂ鎖又はＡ鎖のアミノ酸が変異したインスリンアナログを提供する。

一具体例として、本発明は、インスリン受容体に対する結合力が減少したインスリンアナログを提供する。
他の具体例として、本発明によるインスリンアナログは、Ｂ鎖の８番目のアミノ酸、２３番目のアミノ酸、２４番目のアミノ酸、２５番目のアミノ酸、Ａ鎖の１番目のアミノ酸、２番目のアミノ酸及び１９番目のアミノ酸からなる群から選択されるいずれか１つのアミノ酸がアラニンに置換されているか、或いはＡ鎖の１４番目のアミノ酸がグルタミン酸又はアスパラギンに置換されたものである非天然型のインスリンアナログを提供する。

さらに他の具体例として、本発明によるインスリンアナログは、配列番号２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４及び３６からなる群から選択されるものであるインスリンアナログを提供する。

他の態様として、本発明は、前述したインスリンアナログに半減期を延長させうるキャリアが連結されたインスリンアナログ結合体を提供する。
一具体例として、前記インスリンアナログ結合体は、（ｉ）前述したインスリンアナログ（ｉｉ）免疫グロブリンＦｃ領域が（ｉｉｉ）ペプチドリンカー、又はポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコール−プロピレングリコール共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコール、ポリサッカライド、デキストラン、ポリビニルエチルエーテル、生分解性高分子、脂質重合体、キチン類、ヒアルロン酸及びそれらの組み合わせからなる群から選択される非ペプチド性リンカーにより連結されるインスリンアナログ結合体を提供する。

さらに他の態様として、本発明は、前述したインスリンアナログ結合体を含む生体内持続性及び安定性が向上したインスリン持続性製剤を提供する。
一具体例として、前記インスリン持続性製剤は糖尿病治療用である持続性製剤を提供する。

さらに他の態様として、本発明は、前述したインスリンアナログ結合体の製造方法を提供する。
さらに他の態様として、本発明は、前記インスリンアナログ、又はインスリンアナログとキャリアが結合されたインスリンアナログ結合体を用いて生体内半減期を延長させる方法を提供する。

さらに他の態様として、本発明は、前記インスリンアナログ又はインスリンアナログ結合体を、それを必要とする個体に投与するステップを含むインスリン関連疾患治療方法を提供する。

［発明を実施するための形態］
本発明は、ｉｎ−ｖｉｔｒｏ力価が減少したインスリンアナログに関する。このようなインスリンアナログは、非天然型インスリン配列によりインスリン受容体に対する結合力が天然型インスリンより減少したものであり、解離定数の増加により受容体媒介クリアランスが著しく減少し、血中半減期が延長したことを特徴とする。

本発明における「インスリンアナログ」とは、天然型に比べてインスリン力価が減少した様々なアナログを含む。
前記インスリンアナログは、天然型に比べてインスリン力価が減少した、インスリンのＢ鎖又はＡ鎖のアミノ酸が変異したインスリンアナログであってもよい。天然型インスリンのアミノ酸配列は下記のとおりである。

Ａ鎖：Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ（配列番号３７）
Ｂ鎖：Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ（配列番号３８）
本発明の実施例で用いられたインスリンアナログは遺伝子組換え技術により作製したインスリンアナログであるが、本発明はこれに限定されるものではなく、ｉｎ−ｖｉｔｒｏ力価が減少したあらゆるインスリンが含まれる。逆方向のインスリン（ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｉｎｓｕｌｉｎ）、インスリン変異体（ｖａｒｉａｎｔｓ）、インスリンフラグメント（ｆｒａｇｍｅｎｔｓ）などが含まれることが好ましく、製造法としては、遺伝子組換えだけでなく、固相合成（ｓｏｌｉｄ ｐｈａｓｅ）法でも製造することができるが、これらに限定されるものではない。

インスリンアナログはインスリンと同じ生体内血糖調節機能を有するペプチドであり、このようなペプチドにはインスリンアゴニスト、誘導体、フラグメント、変異体などが含まれる。

本発明におけるインスリンアゴニストとは、インスリンの構造に関係なく、インスリンの生体内受容体に結合してインスリンと同じ生物学的活性を示す物質を意味する。
本発明におけるインスリンアナログとは、アミノ酸配列において天然型インスリンのＡ鎖、Ｂ鎖とそれぞれ８０％以上の相同性を示し、アミノ酸の一残基の一部グループが化学的に置換（例えば、αメチル化、α−ヒドロキシル化）、除去（例えば、脱アミノ化）又は修飾（例えば、Ｎ−メチル化）された形態であり、体内で血糖を調節する機能を有するペプチドを意味する。本発明の目的上、インスリン受容体に対する結合力が天然型より減少したインスリンアナログであり、インスリン力価が天然型に比べて減少したインスリンアナログが含まれるが、これらに限定されるものではない。

低い受容体媒介インターナリゼーション（ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）又は受容体媒介クリアランス（ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃｌｅａｒａｎｃｅ）を示すものであれば特にその種類や大きさが限定されるものではなく、受容体媒介インターナリゼーション又は受容体媒介クリアランスが生体内タンパク質除去の主要メカニズムとして作用するインスリンアナログが本発明の目的に適している。

本発明におけるインスリンフラグメントとは、インスリンに１つ又はそれ以上のアミノ酸が追加又は除去された形態を意味し、追加されるアミノ酸は天然に存在しないアミノ酸（例えば、Ｄ型アミノ酸）であってもよく、このようなインスリンフラグメントは体内で血糖調節機能を有する。

本発明におけるインスリン変異体とは、インスリンとアミノ酸配列が１つ以上異なるペプチドであって、体内で血糖調節機能を有するペプチドを意味する。
本発明のインスリンアゴニスト、誘導体、フラグメント及び変異体において用いる各製造方法は、単独で用いてもよく、組み合わせて用いてもよい。例えば、アミノ酸配列が１つ以上異なり、Ｎ末端アミノ酸残基に脱アミノ化された体内で血糖調節機能を有するペプチドも含まれる。

具体的には、前記インスリンアナログは、Ｂ鎖の８番目のアミノ酸、２３番目のアミノ酸、２４番目のアミノ酸、２５番目のアミノ酸、Ａ鎖の１番目のアミノ酸、２番目のアミノ酸、１４番目のアミノ酸及び１９番目のアミノ酸からなる群から選択される１つ又はそれ以上のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたものであってもよく、好ましくは、Ｂ鎖の８番目のアミノ酸、２３番目のアミノ酸、２４番目のアミノ酸、２５番目のアミノ酸、Ａ鎖の１番目のアミノ酸、２番目のアミノ酸及び１９番目のアミノ酸からなる群から選択される１つ又はそれ以上のアミノ酸がアラニンに置換されているか、或いはＡ鎖の１４番目のアミノ酸がグルタミン酸又はアスパラギンに置換されたものであってもよい。また、配列番号２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４及び３６からなる群から選択されたものであってもよいが、インスリン受容体の結合力が減少したインスリンアナログであれば制限なく含むことができる。

本発明の一実施例によれば、配列番号２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４及び３６のインスリンアナログがｉｎ ｖｉｔｒｏで天然型に比べてインスリン受容体結合力が減少することが確認され、特に代表的なものとしてインスリンアナログ７、８、９（配列番号３２，３４，３６）が確認された（表４）。

さらに他の態様として、本発明は、前記インスリンアナログとキャリアが結合されたインスリンアナログ結合体を提供する。
本発明における「キャリア」とは、結合されたインスリンアナログの生体内半減期を延長させうる物質を意味する。本発明によるインスリンアナログは、インスリン受容体に対する結合力が天然型より減少したものであり、受容体媒介クリアランス及び腎クリアランス機序を回避できることを特徴とするので、従来の公知の様々な生理活性ポリペプチドに結合して生体内半減期を延長させることが知られているキャリアを連結させると、生体内半減期が延長して持続性製剤として利用できることは言うまでもない。

例えば、半減期延長が最優先目的であるので、力価減少新規インスリンに結合されるキャリアは免疫グロブリンＦｃ領域に限定されるものではなく、腎クリアランス（ｒｅｎａｌ ｃｌｅａｒａｎｃｅ）を減少させることのできる様々な重合体（例えば、ポリエチレングリコール及び脂肪酸、アルブミン及びそのフラグメント、特定アミノ酸配列など）、アルブミン及びそのフラグメント、アルブミン結合物質、特定アミノ酸配列の繰り返し単位の重合体、抗体、抗体フラグメント、ＦｃＲｎ結合物質、生体内結合組織又はその誘導体、ヌクレオチド、フィブロネクチン、トランスフェリン（Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ）、サッカライド（ｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）、及び高分子重合体からなる群から選択されるいずれかの生体適合性物質などに結合されて生体内半減期を延長させる生体適合性物質を含むが、これらに限定されるものではない。また、力価が減少したインスリンアナログに生体内半減期を延長させうる生体適合性物質を連結する方法には、遺伝子組換え法やｉｎ ｖｉｔｒｏ結合などが含まれる。前記生体適合性物質は、例えばＦｃＲｎ結合物質、脂肪酸、ポリエチレングリコール、アミノ酸フラグメント又はアルブミンであってもよい。前記ＦｃＲｎ結合物質は免疫グロブリンＦｃ領域であってもよい。

前記インスリンアナログ及び生体適合性物質のキャリアは、リンカーであるペプチド又は非ペプチド性重合体により連結された形態であってもよい。
前記インスリン結合体は、（ｉ）インスリンアナログ（ｉｉ）免疫グロブリンＦｃ領域とが、（ｉｉｉ）ペプチドリンカー、又はポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコール−プロピレングリコール共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコール、ポリサッカライド、デキストラン、ポリビニルエチルエーテル、生分解性高分子、脂質重合体、キチン類、ヒアルロン酸及びそれらの組み合わせからなる群から選択される非ペプチド性リンカーにより連結されるインスリンアナログ結合体であってもよい。

本発明のインスリンアナログ結合体の具体的な一実施形態において、インスリンアナログはそのＢ鎖のＮ末端にリンカーである非ペプチド性重合体が連結される。他の具体的実施形態において、本発明の結合体はインスリンアナログのＢ鎖の残基にリンカーである非ペプチド性重合体が連結される。インスリンはＡ鎖を修飾すると活性や安全性が低下するので、このような実施形態においては、インスリンＢ鎖に非ペプチド性重合体をリンカーとして連結することにより、インスリンの活性を保持すると共に安全性を向上させることができる。

本発明における「活性」とは、インスリンがインスリンの受容体に結合する能力を意味し、インスリンがその受容体に結合してインスリンの作用を示すことを意味する。本発明のインスリンＢ鎖のＮ末端における非ペプチド性重合体の結合はｐＨ調節により引き起こされ、好ましいｐＨの範囲は４．５〜７．５である。

本発明における「Ｎ末端」は「Ｎ末端領域」と混用される。
具体的な一実施例として、本発明者は、免疫グロブリンＦｃ領域のＮ末端にＰＥＧを結合させ、さらにインスリンアナログＢ鎖のＮ末端に選択的にカップリングすることによりインスリンアナログ−ＰＥＧ−免疫グロブリンＦｃ結合体を作製した。このようなインスリンアナログ−ＰＥＧ−免疫グロブリンＦｃ結合体の血中半減期は非結合体より長くなり、疾患モデル動物においても血糖強化効果を示すので、生体内活性が維持される新たな持続型インスリン剤形を製造できることは自明である。

免疫グロブリンＦｃ領域は、生体内で代謝される生分解性ポリペプチドであるので、薬物のキャリアとして安全に使用できる。また、免疫グロブリンＦｃ領域は、免疫グロブリン分子全体に比べて相対的に分子量が小さいので、結合体の作製、精製及び収率の面で有利であるだけでなく、アミノ酸配列は抗体ごとに異なるため、高い非均質性を示すＦａｂ部分を除去することにより、物質の同質性が非常に高くなり、血中抗原性を誘発する可能性が低くなるという効果も期待することができる。

本発明における「免疫グロブリンＦｃ領域」とは、免疫グロブリンの重鎖と軽鎖の可変領域、重鎖定常領域１（ＣＨ１）及び軽鎖定常領域（ＣＬ１）を除いた、重鎖定常領域２（ＣＨ２）及び重鎖定常領域３（ＣＨ３）部分を意味し、重鎖定常領域にヒンジ（ｈｉｎｇｅ）部分を含むこともある。また、本発明の免疫グロブリンＦｃ領域は、天然型と実質的に同等又は向上した効果を有するものであれば、免疫グロブリンの重鎖と軽鎖の可変領域を除き、一部又は全部の重鎖定常領域１（ＣＨ１）及び／又は軽鎖定常領域１（ＣＬ１）を含む拡張されたＦｃ領域であってもよい。また、ＣＨ２及び／又はＣＨ３に相当する非常に長い一部のアミノ酸配列が除去された領域であってもよい。

すなわち、本発明の免疫グロブリンＦｃ領域は、１）ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン及びＣＨ４ドメイン、２）ＣＨ１ドメイン及びＣＨ２ドメイン、３）ＣＨ１ドメイン及びＣＨ３ドメイン、４）ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメイン、５）１つ又は２つ以上のドメインと免疫グロブリンヒンジ領域（又はヒンジ領域の一部）との組み合わせ、６）重鎖定常領域の各ドメインと軽鎖定常領域の二量体であってもよい。

また、本発明の免疫グロブリンＦｃ領域には、天然型アミノ酸配列だけでなく、その配列変異体（ｍｕｔａｎｔ）も含まれる。アミノ酸配列変異体とは、天然型アミノ酸配列中の１つ以上のアミノ酸残基が欠失、挿入、非保存的もしくは保存的置換、又はそれらの組み合わせにより異なる配列を有するものを意味する。例えば、ＩｇＧ Ｆｃの場合、結合に重要であることが知られている２１４〜２３８、２９７〜２９９、３１８〜３２２又は３２７〜３３１番目のアミノ酸残基が変異に適した部位として用いられる。

また、ジスルフィド結合を形成しうる部位が除去された変異体、天然型ＦｃからＮ末端のいくつかのアミノ酸が除去された変異体、天然型ＦｃのＮ末端にメチオニン残基が付加された変異体など、様々な種類の変異体が用いられる。また、エフェクター機能をなくすために、補体結合部位、例えばＣ１ｑ結合部位が除去されてもよく、抗体依存性細胞障害 （ａｎｔｉｂｏｄｙ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ、ＡＤＣＣ）部位が除去されてもよい。このような免疫グロブリンＦｃ領域の配列誘導体を作製する技術は、特許文献１、２などに開示されている。

分子の活性を全体的に変化させないタンパク質及びペプチドにおけるアミノ酸交換は当該分野において公知である（非特許文献４）。最も一般的な交換は、アミノ酸残基Ａｌａ／Ｓｅｒ、Ｖａｌ／Ｉｌｅ、Ａｓｐ／Ｇｌｕ、Ｔｈｒ／Ｓｅｒ、Ａｌａ／Ｇｌｙ、Ａｌａ／Ｔｈｒ、Ｓｅｒ／Ａｓｎ、Ａｌａ／Ｖａｌ、Ｓｅｒ／Ｇｌｙ、Ｔｈｙ／Ｐｈｅ、Ａｌａ／Ｐｒｏ、Ｌｙｓ／Ａｒｇ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ｌｅｕ／Ｉｌｅ、Ｌｅｕ／Ｖａｌ、Ａｌａ／Ｇｌｕ、Ａｓｐ／Ｇｌｙ間の交換である。

場合によっては、リン酸化（ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ）、硫酸化（ｓｕｌｆａｔｉｏｎ）、アクリル化（ａｃｒｙｌａｔｉｏｎ）、グリコシル化（ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）、メチル化（ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ）、ファルネシル化（ｆａｒｎｅｓｙｌａｔｉｏｎ）、アセチル化（ａｃｅｔｙｌａｔｉｏｎ）、アミド化（ａｍｉｄａｔｉｏｎ）などにより修飾されてもよい。

前述したＦｃ変異体は、本発明のＦｃ領域と同じ生物学的活性を示すが、Ｆｃ領域の熱、ｐＨなどに対する構造的安定性を向上させた変異体である。
また、このようなＦｃ領域は、ヒト、及びウシ、ヤギ、ブタ、マウス、ウサギ、ハムスター、ラット、モルモットなどの動物の生体内から分離した天然型から得てもよく、形質転換された動物細胞もしくは微生物から得られた組換型又はその誘導体であってもよい。ここで、天然型から得る方法は、全免疫グロブリンをヒト又は動物の生体から分離し、その後タンパク質分解酵素で処理して得ることができる。パパインで処理するとＦａｂ及びＦｃに切断され、ペプシンで処理するとｐＦ’ｃ及びＦ（ａｂ）２に切断される。これらは、サイズ排除クロマトグラフィー（ｓｉｚｅ−ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）などを用いてＦｃ又はｐＦ’ｃを分離することができる。

ヒト由来のＦｃ領域を微生物から得られた組換え免疫グロブリンＦｃ領域であることが好ましい。
また、免疫グロブリンＦｃ領域は、天然糖鎖、天然型に比べて増加した糖鎖、天然型に比べて減少した糖鎖、又は糖鎖が除去された形態であってもよい。このような免疫グロブリンＦｃ糖鎖の増減又は除去には、化学的方法、酵素学的方法及び微生物を用いた遺伝工学的方法などの通常の方法が用いられる。ここで、Ｆｃから糖鎖が除去された免疫グロブリンＦｃ領域は、補体（ｃ１ｑ）の結合力が著しく低下し、抗体依存性細胞毒性又は補体依存性細胞毒性が低減又は除去されるので、生体内で不要な免疫反応を誘発しない。このような点から、薬物のキャリアとして本発明の目的に適する形態は、糖鎖が除去されるか、非グリコシル化された免疫グロブリンＦｃ領域であると言えるであろう。

本発明における糖鎖の除去（Ｄｅｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）とは、酵素で糖を除去したＦｃ領域を意味し、非グリコシル化（Ａｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）とは、原核生物、好ましくは大腸菌で生産されてグリコシル化されていないＦｃ領域を意味する。

一方、免疫グロブリンＦｃ領域は、ヒト起源、又はウシ、ヤギ、ブタ、マウス、ウサギ、ハムスター、ラット、モルモットなどの動物起源であり、ヒト起源であることが好ましい。また、免疫グロブリンＦｃ領域は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭ由来であるか、又はそれらの組み合わせ（ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）もしくはそれらのハイブリッド（ｈｙｂｒｉｄ）によるＦｃ領域であってもよい。ヒト血液に最も豊富なＩｇＧ又はＩｇＭ由来であることが好ましく、リガンド結合タンパク質の半減期を向上させることが知られているＩｇＧ由来であることが最も好ましい。

一方、本発明における組み合わせ（ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）とは、二量体又は多量体を形成する際に、同一起源の単鎖免疫グロブリンＦｃ領域をコードするポリペプチドが異なる起源の単鎖ポリペプチドに結合することを意味する。すなわち、ＩｇＧ Ｆｃ、ＩｇＡ Ｆｃ、ＩｇＭ Ｆｃ、ＩｇＤ Ｆｃ及びＩｇＥ Ｆｃフラグメントからなる群から選択される２つ以上のフラグメントから二量体又は多量体を作製することができる。

本発明における「ハイブリッド（ｈｙｂｒｉｄ）」とは、単鎖の免疫グロブリンＦｃ領域内に、２つ以上の異なる起源の免疫グロブリンＦｃフラグメントに相当する配列が存在することを意味する。本発明においては、様々な形態のハイブリッドが可能である。すなわち、ＩｇＧ Ｆｃ、ＩｇＭ Ｆｃ、ＩｇＡ Ｆｃ、ＩｇＥ Ｆｃ及びＩｇＤ ＦｃのＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３及びＣＨ４からなる群から選択される１つ〜４つのドメインのハイブリッドが可能であり、ヒンジを含んでもよい。

一方、ＩｇＧもＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４のサブクラスに分けられ、本発明においては、それらの組み合わせ又はそれらのハイブリッド化も可能である。ＩｇＧ２及びＩｇＧ４サブクラスであることが好ましく、補体依存的毒性（ＣＤＣ， ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）などのエフェクター機能（ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎ）のほとんどないＩｇＧ４のＦｃ領域であることが最も好ましい。すなわち、本発明の薬物のキャリアとして最も好ましい免疫グロブリンＦｃ領域は、ヒトＩｇＧ４由来の非グリコシル化されたＦｃ領域である。ヒト由来のＦｃ領域は、ヒト生体において抗原として作用し、それに対する新規な抗体を生成するなどの好ましくない免疫反応を起こす非ヒト由来のＦｃ領域に比べて好ましい。

前記インスリンアナログ結合体の具体的実施形態においては、非ペプチド性重合体の各末端が、それぞれ免疫グロブリンＦｃ領域のＮ末端、及びインスリンアナログＢ鎖のＮ末端のアミノ基又はＢ鎖内部残基のリジンε−アミノ基やチオール（Ｔｈｉｏｌ）基に結合された形態であってもよい。

本発明のＦｃ領域−リンカー−インスリンアナログは、様々なモル比の結合が可能である。すなわち、１つのインスリンアナログに結合するＦｃ領域及び／又はリンカーの数は限定されない。

また、本発明のＦｃ領域、任意のリンカー及びインスリンアナログの結合には、遺伝子組換え法でＦｃ領域とインスリンアナログが融合タンパク質の形態で発現する場合、あらゆる共有結合と、水素結合、イオン結合、ファンデルワールス力、疎水性相互作用などのあらゆる種類の非共有結合とが含まれる。しかし、インスリンアナログの生理活性の面からは共有結合したものが好ましいが、これに限定されるものではない。

一方、本発明のＦｃ領域、任意のリンカー及びインスリンアナログの場合は、Ｎ末端、Ｃ末端の結合も可能であるが、遊離基に結合されることがより好ましく、特にこれらのＮ末端、リジンのアミノ酸残基、ヒスチジンのアミノ酸残基又は遊離システイン残基で共有結合を形成することができる。

また、本発明のＦｃ領域、任意のリンカー及びインスリンアナログの結合は、任意の方向に結合される。すなわち、リンカーと免疫グロブリンＦｃ領域のＮ末端、Ｃ末端及び遊離基の結合が可能であり、リンカーとインスリンアナログのＮ末端、Ｃ末端及び遊離基の結合が可能である。

非ペプチドリンカーと免疫グロブリンフラグメントの結合位置は、免疫グロブリンのＮ末端アミノ基であってもよく、免疫グロブリンフラグメント配列のリジン残基やシステイン残基など、いかなる位置にも限定されない。

また、前記インスリンアナログ結合体の具体的実施形態においては、非ペプチド性重合体の末端が、免疫グロブリンＦｃ領域のＮ末端以外にも、非ペプチド性重合体の末端の官能基に結合できる内部アミノ酸残基又はその遊離官能基に結合することができるが、これらに限定されるものではない。

本発明における非ペプチド性重合体とは、繰り返し単位が２つ以上結合された生体適合性重合体を意味し、前記繰り返し単位はペプチド結合を除く任意の共有結合により互いに連結される。このような非ペプチド性重合体は両末端又は三末端を有する。

本発明に使用可能な非ペプチド性重合体は、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコールとプロピレングリコールの共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコール、ポリサッカライド、デキストラン、ポリビニルエチルエーテル、ＰＬＡ（ポリ乳酸，ｐｏｌｙｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ）及びＰＬＧＡ（ポリ乳酸−グリコール酸，ｐｏｌｙｌａｃｔｉｃ−ｇｌｙｃｏｌｉｃ ａｃｉｄ）などの生分解性高分子、脂質重合体、キチン類、ヒアルロン酸及びそれらの組み合わせからなる群から選択され、ポリエチレングリコールであることが好ましい。当該分野に既に知られているこれらの誘導体や当該分野の技術水準で容易に作製できる誘導体なども本発明に含まれる。

従来のインフレームフュージョン（ｉｎｆｒａｍｅ ｆｕｓｉｏｎ）方法で作製された融合タンパク質に用いられていたペプチド性リンカーにおいては、生体内でタンパク質分解酵素により容易に切断され、キャリアによる活性薬物の血中半減期の延長効果を期待したほど得られないこともあるので、本発明においては、ペプチドリンカーだけでなく、非ペプチドリンカーを用いて結合体を作製することができる。非ペプチドリンカーは、タンパク質分解酵素に抵抗性のある重合体を用いることにより、キャリアと同様にペプチドの血中半減期を維持することができる。よって、本発明に用いられる非ペプチド性重合体は、このような役割を果たすもの、すなわち生体内タンパク質分解酵素に抵抗性のある重合体であれば制限なく用いられる。非ペプチド性重合体は、分子量が１〜１００ｋＤａの範囲、好ましくは１〜２０ｋＤａの範囲である。

また、前記免疫グロブリンＦｃ領域に結合される本発明の非ペプチド性重合体は、１種類の重合体だけでなく、異なる種類の重合体の組み合わせが用いられてもよい。
本発明に用いられる非ペプチド性重合体は、免疫グロブリンＦｃ領域及びタンパク質薬物に結合される官能基を有する。

前記非ペプチド性重合体の両末端の官能基は、反応アルデヒド基、プロピオンアルデヒド基、ブチルアルデヒド基、マレイミド（ｍａｌｅｉｍｉｄｅ）基及びスクシンイミド（ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ）誘導体からなる群から選択されることが好ましい。ここで、スクシンイミド誘導体としては、スクシンイミジルプロピオネート、ヒドロキシスクシンイミジル、スクシンイミジルカルボキシメチル又はスクシンイミジルカーボネートが用いられる。特に、前記非ペプチド性重合体が両末端に反応アルデヒド基の官能基を有する場合、非特異的反応を最小限に抑え、非ペプチド性重合体の両末端に生理活性ポリペプチド及び免疫グロブリンがそれぞれ結合するのに効果的である。アルデヒド結合による還元性アルキル化で生成された最終産物は、アミド結合により連結されたものよりはるかに安定している。反応アルデヒド基は、低いｐＨではＮ末端に選択的に反応し、高いｐＨ、例えばｐＨ９．０の条件ではリジン残基と共有結合を形成することができる。

前記非ペプチド性重合体の両末端の官能基は、同じものであってもよく、異なるものであってもよい。例えば、一方の末端にはマレイミド基、他方の末端にはアルデヒド基、プロピオンアルデヒド基、又はブチルアルデヒド基を有してもよい。両末端に官能基のヒドロキシ基を有するポリエチレングリコールを非ペプチド性重合体として用いる場合、公知の化学反応により前記ヒドロキシ基を前述した様々な官能基として活性化するか、商業的に入手可能な変異した官能基を有するポリエチレングリコールを用いることにより、本発明の単鎖インスリンアナログ結合体を製造することができる。

このような本発明のインスリンアナログ結合体は、エネルギー代謝や糖代謝などの従来のインスリンの生体内活性が維持されるだけでなく、インスリンアナログの血中半減期及びそれによる前記ペプチドの生体内効力持続効果が画期的に向上するので、糖尿病の治療に有用である。

本発明の一実施例においては、このような生体内半減期を延長するキャリアなどと結合する際に、天然型インスリン結合体に比べてインスリン受容体結合力が減少したインスリンアナログにおいて、生体内半減期が大幅に延長されることが確認された（図６）。

さらに他の態様として、本発明は、インスリンアナログ結合体を含むインスリン持続性製剤を提供する。前記インスリン持続性製剤は、生体内持続性及び安定性が向上したインスリン持続性製剤であってもよい。前記持続性製剤は糖尿病治療用の薬学的組成物であってもよい。

本発明の結合体を含む薬学的組成物は、薬学的に許容される担体を含んでもよい。薬学的に許容される担体は、経口投与の場合は、結合剤、潤滑剤、崩壊剤、賦形剤、可溶化剤、分散剤、安定化剤、懸濁剤、色素、及び香料などを用いることができ、注射剤の場合は、緩衝剤、保存剤、鎮痛剤、可溶化剤、等張化剤及び安定化剤などを混合して用いることができ、局所投与用の場合は、基剤、賦形剤、潤滑剤、保存剤などを用いることができる。本発明の薬学的組成物の剤形は、前述したような薬学的に許容される担体と混合して様々な形態に製造することができる。例えば、経口投与の場合は、錠剤、トローチ剤、カプセル剤、エリキシル剤、懸濁剤、シロップ剤、ウエハー剤などの形態に製造することができ、注射剤の場合は、単回投与のアンプル又は複数回投与の形態に製造することができる。その他、溶液、懸濁液、錠剤、丸薬、カプセル剤、徐放性製剤などに剤形化することができる。

一方、製剤化に適した担体、賦形剤及び希釈剤としては、ラクトース、グルコース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリトリトール、マルチトール、澱粉、アカシア、アルギネート、ゼラチン、リン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、微晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、ステアリン酸マグネシウム、鉱物油などを用いてもよい。

また、充填剤、抗凝集剤、潤滑剤、湿潤剤、香料、防腐剤などをさらに含んでもよい。
さらに他の態様として、本発明は、前記インスリンアナログ又はインスリンアナログ結合体を、それを必要とする個体に投与するステップを含むインスリン関連疾患治療方法を提供する。

本発明による結合体は、糖尿治療に有用であるため、それを含む薬学的組成物を投与することにより、前記疾患の治療を図ることができる。
本発明における「投与」とは、任意の適切な方法で患者に所定の物質を導入することを意味し、前記結合体の投与経路は、薬物を標的組織に送達できるものであれば、一般的なあらゆる経路を介して投与することができる。腹腔内投与、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、皮内投与、経口投与、局所投与、鼻腔内投与、肺内投与及び直腸内投与などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。しかし、経口投与の場合はペプチドが消化されるので、経口投与用組成物は、活性薬剤をコーティングしたり、胃での分解から保護されるように剤形化することが好ましい。注射剤形態で投与することが好ましい。また、薬学的組成物は、活性物質を標的細胞に送達することのできる任意の装置により投与することができる。

また、本発明の薬学的組成物は、治療する疾患、投与経路、患者の年齢、性別及び体重、疾患の重症度などの様々な関連因子と共に、活性成分である薬物の種類により決定される。本発明の薬学的組成物は、生体内持続性及び力価に優れるので、本発明の薬学的製剤の投与回数及び頻度を大幅に減少させることができる。

さらに他の態様として、本発明は、インスリンアナログを準備するステップと、キャリアを準備するステップと、前記インスリンアナログとキャリアを連結するステップとを含む、インスリンアナログ結合体を製造する方法を提供する。

さらに他の態様として、本発明は、前記インスリンアナログ、又はインスリンアナログとキャリアが結合されたインスリンアナログ結合体を用いて生体内半減期を延長させる方法を提供する。

以下、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明する。しかし、下記実施例は本発明を例示するためのものであり、本発明の範囲がこれらに限定されるものではない。

実施例１：単鎖インスリンアナログ発現ベクターの作製
保有中の天然型インスリン発現ベクターを鋳型とし、Ａ鎖又はＢ鎖のアミノ酸を１つずつ変異させたインスリンアナログを作製するために、順方向及び逆方向オリゴヌクレオチドを合成し（表２）、その後ＰＣＲを行って各アナログ遺伝子を増幅した。

下記表１に、それぞれのＡ鎖又はＢ鎖のアミノ酸の変異した配列及びアナログ名を示す。すなわち、アナログ１はＡ鎖の１番目のグリシンがアラニンに置換された形態であり、アナログ４はＢ鎖の８番目のグリシンがアラニンに置換された形態である。

インスリンアナログ増幅のためのプライマーを下記表２に示す。

インスリンアナログ増幅のためのＰＣＲ条件は、９５℃で３０秒、５５℃で３０秒、６８℃で６分とし、この過程を１８回繰り返した。このような条件で得られたインスリンアナログフラグメントは、細胞内の封入体の形態で発現させるためにｐＥＴ２２ｂベクターに挿入されており、このようにして得られた発現ベクターをｐＥＴ２２ｂ−インスリンアナログ１〜９と命名した。前記発現ベクターは、Ｔ７プロモーターの制御下でインスリンアナログ１〜９のアミノ酸配列をコードする核酸を含み、宿主内でインスリンアナログタンパク質を封入体の形態で発現させた。

下記表３に各インスリンアナログ１〜９のＤＮＡ配列及びタンパク質配列を示す。

実施例２：組換えインスリンアナログ融合ペプチドの発現
Ｔ７プロモーター制御下で組換えインスリンアナログの発現を行った。それぞれの組換えインスリンアナログ発現ベクターにＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１−ＤＥ３（Ｅ． ｃｏｌｉ Ｂ Ｆ−ｄｃｍ ｏｍｐＴ ｈｓｄＳ（ｒＢ−ｍＢ−）ｇａｌ λ（ＤＥ３）；ノバジェン）を形質転換した。形質転換方法は、ノバジェン社が推奨する方法に従った。各組換え発現ベクターが形質転換されたそれぞれの単一コロニーを得て、アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）が含まれる２Ｘルリア（Ｌｕｒｉａ Ｂｒｏｔｈ，ＬＢ）培地に接種し、３７℃で１５時間培養した。組換え菌株培養液と３０％グリセリンとを含む２ＸＬＢ培地を１：１（ｖ／ｖ）の割合で混合して各１ｍｌずつクライオチューブに分注し、−１４０℃で保管した。これを組換え融合タンパク質の作製のための細胞ストック（ｃｅｌｌ ｓｔｏｃｋ）として用いた。

組換えインスリンアナログの発現のために、各細胞ストック１バイアルを溶解して５００ｍｌの２Ｘルリア培地に接種し、３７℃で１４〜１６時間振盪培養した。ＯＤ６００の値が５．０以上になったら培養を終了し、これを種培養液として用いた。５０Ｌ発酵槽（ＭＳＪ−Ｕ２，Ｂ．Ｅ．ＭＡＲＵＢＩＳＨＩ，日本）を用いて、種培養液を１７Ｌの発酵培地に接種して初期バス（ｂａｔｈ）発酵を始めた。培養条件は、温度３７℃、空気量２０Ｌ／分（１ｖｖｍ）、攪拌速度５００ｒｐｍとし、３０％アンモニア水を用いてｐＨ６．７０を維持した。発酵は、培養液中の栄養素が枯渇したら追加培地（ｆｅｅｄｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を添加することにより、流加培養を行った。菌株の成長はＯＤ値によりモニターし、ＯＤ値が１００以上において最終濃度５００μＭのＩＰＴＧを導入した。培養は導入後約２３〜２５時間までさらに続け、培養終了後、遠心分離器を用いて組換え菌株を得て、使用するまで−８０℃で保管した。

実施例３：組換えインスリンアナログの回収及びリフォールディング（ｒｅｆｏｌｄｉｎｇ）
実施例２で発現させた組換えインスリンアナログを可溶性形態に変えるために、細胞を破砕してリフォールディングした。細胞ペレット１００ｇ（ｗｅｔ ｗｅｉｇｈｔ）を１Ｌ溶解緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、０．２Ｍ ＮａＣｌ及び０．５％トリトンＸ−１００）に再浮遊させた。マイクロフルダイザー（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ）プロセッサＭ−１１０ＥＨ（ＡＣ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｐ．Ｍｏｄｅｌ Ｍ１４７５Ｃ）を用いて、１０３ＭＰａ（１５，０００ｐｓｉ）の圧力で細胞を破砕した。破砕された細胞溶解物を７，０００ｒｐｍで４℃にて２０分間遠心分離して上清を捨て、３Ｌ洗浄緩衝液（０．５％トリトンＸ−１００及び５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．２Ｍ ＮａＣｌ及び１ｍＭ ＥＤＴＡ）に再浮遊させた。７，０００ｒｐｍで４℃にて２０分間遠心分離してペレットを蒸留水に再浮遊させ、その後同様に遠心分離した。ペレットを得て、４００ｍｌの緩衝液（１Ｍ Ｇｌｙｃｉｎｅ，３．７８ｇ Ｃｙｓｔｅｉｎｅ−ＨＣｌ，ｐＨ１０．６）に再浮遊させて常温で１時間攪拌した。再浮遊させた組換えインスリンアナログの回収のために、４００ｍＬの８Ｍウレアを追加し、その後４０℃で１時間攪拌した。可溶化した組換えインスリンアナログのリフォールディングのために、７，０００ｒｐｍで４℃にて３０分間遠心分離して上清を得て、その後これに２Ｌの蒸留水を蠕動ポンプ（ｐｅｒｉｓｔａｌｔｉｃ ｐｕｍｐ）にて１０００ｍｌ／ｈｒの流速で加えて４℃で１６時間攪拌した。

実施例４：陽イオン結合クロマトグラフィー精製
４５％エタノールが含まれる２０ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ２．０）緩衝液で平衡化したＳｏｕｒｃｅ Ｓ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）カラムにリフォールディングした試料を結合させ、その後塩化カリウム０．５Ｍと４５％エタノールとを含む２０ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ２．０）緩衝液を用いて、濃度が０％から１００％になるように１０カラム容量の線形濃度勾配でインスリンアナログタンパク質を溶出した。

実施例５：トリプシン（Ｔｒｙｐｓｉｎ）及びカルボキシペプチダーゼＢ（Ｃａｒｂｏｘｙｐｅｐｔｉｄａｓｅ Ｂ）処理
脱塩カラム（Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ ｃｏｌｕｍｎ）を用いて、溶出した試料から塩を除去し、緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０）に交換した。得られた試料のタンパク量のモル比１０００に相当するトリプシンとモル比２０００に相当するカルボキシペプチダーゼＢを添加し、その後１６℃で１６時間攪拌した。反応を終了させるために、１Ｍクエン酸ナトリウム（ｐＨ２．０）を用いてｐＨを３．５に下げた。

実施例６：陽イオン結合クロマトグラフィー精製
反応が終了した試料を４５％エタノールが含まれる２０ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ２．０）緩衝液で平衡化したＳｏｕｒｃｅ Ｓ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）カラムに再び結合させ、その後塩化カリウム０．５Ｍと４５％エタノールとを含む２０ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ２．０）緩衝液を用いて、濃度が０％から１００％になるように１０カラム容量の線形濃度勾配でインスリンアナログタンパク質を溶出した。

実施例７：陰イオン結合クロマトグラフィー精製
脱塩カラムを用いて、溶出した試料から塩を除去し、緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５）に交換した。実施例６で得られた試料から純粋なインスリンアナログを純粋に分離するために、１０ｍＭトリス（ｐＨ７．５）緩衝液で平衡化した陰イオン交換カラム（Ｓｏｕｒｃｅ Ｑ：ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）に結合させ、その後０．５Ｍ塩化ナトリウムが含まれる１０ｍＭトリス（ｐＨ７．５）緩衝液を用いて、濃度が０％から１００％になるように１０カラム容量の線形濃度勾配でインスリンアナログタンパク質を溶出した。

精製されたインスリンアナログの純度はタンパク質電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ，図１）及び高圧クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて分析し（図２）、アミノ酸の変異はペプチドマッピング（図３）と各ピークの分子量分析により確認した。

その結果、それぞれのインスリンアナログにおいて目的とするアミノ酸配列が変異したことが確認された。
実施例８：インスリンアナログ（７番）−免疫グロブリンＦｃ結合体の作製
インスリンアナログβ鎖のＮ末端を３．４Ｋ ＡＬＤ２ ＰＥＧ（ＮＯＦ，日本）でペグ化するために、インスリンアナログ：ＰＥＧのモル比を１：４とし、インスリンアナログ濃度を５ｍｇ／ｍｌとして４℃で約２時間反応させた。ここで、反応はｐＨ６．０の５０ｍＭクエン酸ナトリウム（Ｓｏｄｉｕｍ Ｃｉｔｒａｔｅ）、４５％イソプロパノールで行われ、３．０ｍＭの濃度のシアノ水素化ホウ素ナトリウム還元剤を添加して反応させた。反応液はクエン酸ナトリウム（ｐＨ３．０）、４５％エタノールが含まれる緩衝液とＫＣｌ濃度勾配を用いたＳＰ−ＨＰ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，米国）カラムを用いて精製した。

インスリンアナログ−免疫グロブリンＦｃフラグメント結合体を作製するために、上で精製されたモノペグ化された（ｍｏｎｏ−ＰＥＧｙｌａｔｅｄ）インスリンアナログと免疫グロブリンＦｃフラグメントのモル比が１：１〜１：２になるようにし、総タンパク質濃度を約２０ｍｇ／ｍｌとして２５℃で１３時間反応させた。ここで、反応緩衝液条件は１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ８．２であり、還元剤として２０ｍＭシアノ水素化ホウ素ナトリウムを添加した。こうすることにより、ＦｃフラグメントのＮ末端にＰＥＧが結合した。

反応終了後、Ｑ ＨＰ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，米国）カラムにおいて、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）緩衝液とＮａＣｌ濃度勾配を用いて、反応液から反応していない免疫グロブリンＦｃフラグメント、モノペグ化されたインスリンアナログを分離精製した。

その後、Ｓｏｕｒｃｅ １５ＩＳＯ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，米国）を２次カラムとして用いて、残留している免疫グロブリンＦｃフラグメント及びインスリンアナログが免疫グロブリンＦｃフラグメントに２つ以上結合された結合体を除去し、インスリンアナログ−免疫グロブリンＦｃフラグメント結合体を得た。ここで、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）が含まれる硫酸アンモニウムの濃度勾配を用いて溶出し、溶出したインスリンアナログ−免疫グロブリンＦｃ結合体は、タンパク質電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ，図４）及び高圧クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて分析した（図５）。その結果、約９９％の純度に精製されたことが確認された。

実施例９：天然型インスリン、インスリンアナログ、天然型インスリン−免疫グロブリンＦｃ結合体及びインスリンアナログ−免疫グロブリンＦｃ結合体のインスリン受容体結合力の比較
インスリンアナログ−免疫グロブリンＦｃ結合体のインスリン受容体結合力を測定するために、Ｓｕｒｆａｃｅ ｐｌａｓｍｏｎ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ（ＳＰＲ，ＢＩＡＣＯＲＥ ３０００，ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて分析した。ＣＭ５チップにインスリン受容体をアミンカップリング法で固定化し、５種類以上の濃度で希釈した天然型インスリン、インスリンアナログ、天然型インスリン−免疫グロブリンＦｃ結合体、インスリンアナログ−免疫グロブリンＦｃ結合体を独立して分注し、それぞれの物質のインスリン受容体に対する結合力を確認した。各物質の結合力はＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアを用いて算出した。ここで用いられるモデルは１：１ Ｌａｎｇｍｕｉｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｗｉｔｈ ｂａｓｅｌｉｎｅ ｄｒｉｆｔであった。

その結果、ヒトインスリンに対して、インスリンアナログ（６番）は１４．８％、インスリンアナログ（７番）は９．９％、インスリンアナログ（８番）は５７．１％、インスリンアナログ（９番）は７８．８％、天然型インスリン−免疫グロブリンＦｃ結合体は実験ｒｕｎによって３．７〜５．９％の間、インスリンアナログ（６番）−免疫グロブリンＦｃ結合体は０．９％以下、インスリンアナログ（７番）−免疫グロブリンＦｃ結合体は１．９％、インスリンアナログ（８番）−免疫グロブリンＦｃ結合体は１．８％、インスリンアナログ（９番）−免疫グロブリンＦｃ結合体は３．３％の受容体結合力が確認された（表４）。このように、本発明のインスリンアナログは天然型インスリンに比べてインスリン受容体結合力が減少し、それだけでなくインスリンアナログ−免疫グロブリンＦｃ結合体もインスリン受容体結合力が大幅に減少することが観察された。

実施例１０：天然型インスリン−免疫グロブリンＦｃ結合体とインスリンアナログ−免疫グロブリンＦｃ結合体のｉｎ−ｖｉｔｒｏ効力の比較
インスリンアナログ−免疫グロブリンＦｃ結合体のｉｎ ｖｉｔｒｏ効力を測定するために、脂肪細胞に分化させたマウス由来の３Ｔ３−Ｌ１細胞株を用いたグルコース吸収能（ｇｌｕｃｏｓｅ ｕｐｔａｋｅ，又は脂質合成能）試験を行った。３Ｔ３−Ｌ１細胞を、１０％ＮＢＣＳ（新生仔ウシ血清）を含むＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ，Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｔ．Ｎｏ，１２４３０）培地を用いて、週２〜３回継代培養して維持した。３Ｔ３−Ｌ１細胞を分化用培地（１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ）で懸濁し、その後４８ウェル皿に１ウェル当たり５×１０^４個となるように接種して４８時間培養した。脂肪細胞への分化のために、分化用培地に１μｇ／ｍＬヒトインスリン（Ｓｉｇｍａ，Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｉ９２７８）、０．５ｍＭ ＩＢＭＸ（３−ｉｓｏｂｕｔｙｌ−１−ｍｅｔｈｙｌｘａｎｔｈｉｎｅ，Ｓｉｇｍａ，Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｉ５８７９）、１μＭ Ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ（Ｓｉｇｍａ，Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｄ４９０２）を混合し、従来の培地を除去してから１ウェル当たり２５０μｌずつ加えた。４８時間後、分化用培地に１μｇ／ｍＬのヒトインスリンのみ添加した培地に再び交換した。その後、４８時間毎に１μｇ／ｍＬのヒトインスリンを添加した分化用培地に交換し、７〜９日間脂肪細胞への分化が誘導されることを確認した。グルコース吸収能試験のために、分化済みの細胞を無血清ＤＭＥＭ培地で１回水洗し、その後２５０μｌずつ加えることにより４時間にわたって血清枯渇を誘導した。ヒトインスリンは２μＭから０．０１μＭまで、天然型インスリン−免疫グロブリンＦｃ結合体とインスリンアナログ−免疫グロブリンＦｃ結合体はそれぞれ２０μＭから０．０２μＭまで、無血清ＤＭＥＭ培地で１０倍ずつ順次希釈して準備した。準備した試料を細胞にそれぞれ２５０μｌずつ添加し、その後２４時間にわたって３７℃にて５％ＣＯ_２培養器で培養した。培養済みの培地のグルコース残量を測定するために、２００μｌの培地を採取し、Ｄ−ＰＢＳでそれぞれ５倍に希釈してＧＯＰＯＤ（ＧＯＰＯＤ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ，Ｍｅｇａｚｙｍｅ，Ｃａｔ．Ｎｏ． Ｋ−ＧＬＵＣ）分析を行った。グルコース標準溶液の吸光度に基づいて培地の残余グルコース濃度を換算し、天然型インスリン−免疫グロブリンＦｃ結合体、インスリンアナログ−免疫グロブリンＦｃ結合体のグルコース吸収能に対するＥＣ５０をそれぞれ算出した。

その結果、ヒトインスリンと比較して、天然型インスリン−免疫グロブリンＦｃ結合体は１１．６％、インスリンアナログ（６番）−免疫グロブリンＦｃ結合体は０．４３％、インスリンアナログ（７番）−免疫グロブリンＦｃ結合体は１．８４％、インスリンアナログ（８番）−免疫グロブリンＦｃ結合体は１６．０％、インスリンアナログ（９番）−免疫グロブリンＦｃ結合体は１５．１％のグルコース吸収能を示した（表５）。このように、本発明のインスリンアナログ（６番）−免疫グロブリンＦｃ結合体とインスリンアナログ（７番）−免疫グロブリンＦｃ結合体のｉｎ ｖｉｔｒｏ力価は天然型インスリン−免疫グロブリンＦｃ結合体と比較して画期的に減少し、インスリンアナログ（８番）−免疫グロブリンＦｃ結合体とインスリンアナログ（９番）−免疫グロブリンＦｃ結合体のｉｎ ｖｉｔｒｏ力価は天然型インスリン−免疫グロブリンＦｃ結合体と同程度であることが観察された。

実施例１１：インスリンアナログ−免疫グロブリンＦｃ結合体の薬物動態（ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ）の確認
インスリンアナログ−免疫グロブリンＦｃ結合体の薬物動態を確認するために、５日間実験室に馴化させた正常ラット（ＳＤ ｒａｔ，雄，６週齢）において経過時間による血中濃度比較試験を行った。天然型インスリン−免疫グロブリンＦｃ結合体とインスリンアナログ−免疫グロブリンＦｃ結合体に２１．７ｎｍｏｌ／ｋｇと６５．１ｎｍｏｌ／ｋｇをそれぞれ皮下投与し、０、１、４、８、２４、４８、７２、９６、１２０、１４４、１６８、１９２、２１６時間後に採血した。各時間における天然型インスリン−免疫グロブリンＦｃ結合体及びインスリンアナログ−免疫グロブリンＦｃ結合体の血中濃度は酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ，ｅｎｚｙｍｅ ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ）を用いて測定し、キットとしてＩｎｓｕｌｉｎ ＥＬＩＳＡ（ＡＬＰＣＯ，米国）を用いた。しかし、検出抗体（ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ）としては、ｍｏｕｓｅ ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ ＩｇＧ４ ＨＲＰ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（Ａｌｐｈａ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｉｎｔｌ， Ｉｎｃ， 米国）を用いた。

天然型インスリン−免疫グロブリンＦｃ結合体とインスリンアナログ−免疫グロブリンＦｃ結合体の薬物動態について検討した結果、両物質共に投与濃度に比例して血中濃度が増加することが分かり、インスリン受容体に対する低い結合力を示すインスリンアナログ−免疫グロブリンＦｃ結合体が天然型インスリン−Ｆｃ結合体に比べて大幅に延長された半減期を示すことが分かった（図６）。

これらの結果は、インスリン受容体結合力が減少するように変異した本発明のインスリンアナログは、免疫グロブリンＦｃ領域に結合された結合体を形成すると、実際の生体内で血中半減期が画期的に延長して安定したインスリン製剤として提供することができ、糖尿病治療剤として効果的に使用できることを示唆するものである。また、本発明によるインスリンアナログ自体もインスリン受容体との結合力及び力価が減少するので、様々なキャリアなどに結合してもやはり同じ効果を発揮することを示唆するものである。

以上の説明から、本発明の属する技術分野の当業者であれば、本発明がその技術的思想や必須の特徴を変更することなく、他の具体的な形態で実施できることを理解するであろう。なお、上記実施例はあくまで例示的なものであり、限定的なものでないことを理解すべきである。本発明の範囲は、明細書ではなく特許請求の範囲の意味及び範囲とその等価概念から導かれるあらゆる変更や変形された形態を含むものであると解釈すべきである。

Claims (21)

1. インスリンアナログ結合体であって、インスリンアナログは天然型に比べてインスリン力価が減少しており、インスリンのＢ鎖又はＡ鎖のアミノ酸が、Ｂ鎖の８番目のアミノ酸、２３番目のアミノ酸、２４番目のアミノ酸、２５番目のアミノ酸、Ａ鎖の１番目のアミノ酸、２番目のアミノ酸及び１９番目のアミノ酸からなる群から選択されるいずれか１つのアミノ酸のアラニンへの置換によって変異されており、
   インスリンアナログは、インスリンアナログの生体内半減期を延長するキャリアとしてのＦｃＲｎ結合物質に連結されており、
   前記インスリンのＡ鎖のアミノ酸配列は配列番号３７からなり、前記インスリンのＢ鎖のアミノ酸配列は配列番号３８からなる、インスリンアナログ結合体。
2. 前記インスリンアナログは、配列番号２０、２２、２４、２６、２８、３０、及び３２からなる群から選択される、請求項１に記載のインスリンアナログ結合体。
3. 前記インスリンアナログと前記ＦｃＲｎ結合物質が、リンカーであるペプチド又は非ペプチド性重合体により連結されるものである、請求項１に記載のインスリンアナログ結合体。
4. 前記ＦｃＲｎ結合物質が免疫グロブリンＦｃ領域である、請求項１に記載のインスリンアナログ結合体。
5. （ｉ）前記インスリンアナログが、
   （ｉｉ）免疫グロブリンＦｃ領域と
   （ｉｉｉ）ペプチドリンカー、又はポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコール−プロピレングリコール共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコール、ポリサッカライド、デキストラン、ポリビニルエチルエーテル、生分解性高分子、脂質重合体、キチン類、ヒアルロン酸及びそれらの組み合わせからなる群から選択される非ペプチド性リンカーを介して連結されたものである、請求項１に記載のインスリンアナログ結合体。
6. 前記インスリンアナログのＢ鎖のＮ末端に前記非ペプチド性リンカーが結合された、請求項５に記載のインスリンアナログ結合体。
7. 非ペプチド性重合体の各末端が、それぞれ免疫グロブリンＦｃ領域のＮ末端、及びインスリンアナログＮ末端のアミノ基又はＢ鎖内部残基のリジンε−アミノ基又はＢ鎖のチオール基に結合された、請求項５に記載のインスリンアナログ結合体。
8. 免疫グロブリンＦｃ領域が非グリコシル化されたことを特徴とする、請求項５に記載のインスリンアナログ結合体。
9. 免疫グロブリンＦｃ領域が、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３及びＣＨ４ドメインからなる群から選択される１つ〜４つのドメインからなる、請求項５に記載のインスリンアナログ結合体。
10. 免疫グロブリンＦｃ領域が、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ又はＩｇＭに由来するＦｃ領域である、請求項５に記載のインスリンアナログ結合体。
11. 免疫グロブリンＦｃ領域のそれぞれのドメインが、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ及びＩｇＭからなる群から選択される免疫グロブリンに由来する異なる起源を有するドメインのハイブリッドである、請求項１０に記載のインスリンアナログ結合体。
12. 免疫グロブリンＦｃ領域がヒンジ領域をさらに含む、請求項５に記載のインスリンアナログ結合体。
13. 免疫グロブリンＦｃ領域が、同一起源のドメインからなる単鎖免疫グロブリンで構成された二量体又は多量体である、請求項１０に記載のインスリンアナログ結合体。
14. 免疫グロブリンＦｃ領域がＩｇＧ４ Ｆｃ領域である、請求項１０に記載のインスリンアナログ結合体。
15. 免疫グロブリンＦｃ領域がヒト非グリコシル化ＩｇＧ４ Ｆｃ領域である、請求項１４に記載のインスリンアナログ結合体。
16. 非ペプチド性リンカーの官能基が、アルデヒド基、プロピオンアルデヒド基、ブチルアルデヒド基、マレイミド基及びスクシンイミド誘導体からなる群から選択される、請求項５に記載のインスリンアナログ結合体。
17. スクシンイミド誘導体が、スクシンイミジルプロピオネート、スクシンイミジルカルボキシメチル、ヒドロキシスクシンイミジル又はスクシンイミジルカーボネートである、請求項１６に記載のインスリンアナログ結合体。
18. 非ペプチド性リンカーが両末端に反応アルデヒド基の官能基を有する、請求項５に記載のインスリンアナログ結合体。
19. 請求項１〜１８のいずれか一項に記載のインスリンアナログ結合体を含む、生体内持続性及び安定性が向上したインスリン持続性製剤。
20. 前記製剤が糖尿病治療用である、請求項１９に記載の持続性製剤。
21. 請求項１〜１８のいずれか一項に記載のインスリンアナログ結合体を製造する方法であって、
    天然型に比べてインスリン力価が減少しており、インスリンのＢ鎖又はＡ鎖のアミノ酸が、Ｂ鎖の８番目のアミノ酸、２３番目のアミノ酸、２４番目のアミノ酸、２５番目のアミノ酸、Ａ鎖の１番目のアミノ酸、２番目のアミノ酸及び１９番目のアミノ酸からなる群から選択されるいずれか１つのアミノ酸のアラニンへの置換によって変異されているインスリンアナログを、ＦｃＲｎ結合物質に連結することを含み、
    前記インスリンのＡ鎖のアミノ酸配列が配列番号３７からなり、前記インスリンのＢ鎖のアミノ酸配列が配列番号３８からなる方法。

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