TWI708782B

TWI708782B - 新穎胰島素類似物及其用途

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Publication number: TWI708782B
Application number: TW106143717A
Authority: TW
Inventors: 權世昌; 金大振; 金承洙; 金眞英; 金賢煜; 張明賢; 鄭聖燁; 崔仁榮; 許容豪; 洪性熙; 黃祥淵
Original assignee: 南韓商韓美藥品股份有限公司
Priority date: 2013-02-26
Filing date: 2014-02-26
Publication date: 2020-11-01
Also published as: RU2676729C2; MX366400B; HK1211944A1; TWI621626B; ES2770776T3; CN104995206A; SA518400491B1; EP3616727B1; KR20140106452A; CN104995206B; EP2963056A4; ZA201507104B; NZ751062A; EP2963056B1; PH12015501814B1; PT2963056T; AU2018267648B2; PE20191481A1; WO2014133324A1; TW201920243A

Abstract

本發明係關於為了增加胰島素之血中半衰期而具有相較於天然型而言減少的胰島素效價及減少的胰島素受體結合親合性之胰島素類似物；藉由連結該胰島素類似物與載子而製備之共軛物；包含該共軛物之長效調配物；以及製備該共軛物之方法。

Description

新穎胰島素類似物及其用途

本發明係關於為了增加胰島素之血中半衰期而具有相較於天然型而言減少的胰島素效價及減少的胰島素受體結合親合性之胰島素類似物；藉由連結該胰島素類似物與載子(carrier)而製備之共軛物(conjugate)；包含該共軛物之長效調配物；以及製備該共軛物之方法。

已知活體內蛋白質係經由各種途徑被消除，諸如藉由血中蛋白分解酶之降解作用、通過腎臟之分泌作用、或藉由受體之清除作用。因而，已進行許多努力以藉由迴避蛋白質清除機制及增加生理活性蛋白質之半衰期而增進治療效用。

另一方面，胰島素係由人體胰臟所分泌之激素，其調節血中葡萄糖濃度，且扮演維持正常血中葡萄糖濃度之角色，同時將血中過剩的葡萄糖運載至細胞以對細胞提供能量。然而，在糖尿病患者中，由於胰島素之缺乏、對胰島素之耐受性、及β-細胞功能之喪失而使胰島素並未適當地發揮功能，因而無法將血中葡萄糖利用作為能量來源並使血中葡萄糖濃度上升，引起高血糖症。最後，發生尿液排泄，促成各種併發症之發展。因此，胰島素療法對於具有異常胰島素分泌(第I型)或胰島素耐受性(第II型)之患者而言係屬必要，且血中葡萄糖濃度可藉由胰島素投予而正常地調節。然而，如同其他蛋白質及胜肽激素，胰島素具有極短的活體內半衰期，因而具有重複投予之缺點。此種頻繁的投予對患者造成嚴重的疼痛及不適。針對此理由，為了藉由增加蛋白質之活體內半衰期及減少投予頻率而增進生活品質，已對蛋白質調配物及化學共軛(脂肪酸共軛物、聚乙烯聚合物共軛物)進行許多研究。市售可得的長效胰島素包含由Sanofi Aventis所製造之甘精胰島素(insulin glargine)(蘭德仕(lantus)，持續約20至22小時)、以及由Novo Nordisk所製造之地特胰島素(insulin detemir)(瑞和密爾(levemir)，持續約18至22小時)及德爾希巴(tresiba)(德谷胰島素(degludec)，持續約40小時)。此等長效胰島素調配物不會在血中胰島素濃度中產生峰值，因而該等係適合作為基礎胰島素。然而，由於此等調配物並不具有足夠長的半衰期，故仍保有每日一或二次注射之缺點。因此，就達成顯著減少投予頻率以增進需要長期投予之糖尿病患者的便利性之預期目標而言，有其限制。

先前的調查研究係報導特定的活體內胰島素清除程序；50%或更多胰島素係在腎臟中被去除，而其餘者則係經由受體媒介性清除(receptor mediated clearance,RMC)程序在目標部位(諸如肌肉、脂肪、肝臟等)被去除。

就此點而言，許多研究，包含J Pharmacol Exp Ther(1998)286：959、Diabetes Care(1990)13：923、Diabetes(1990)39：1033，已報導減少活體外活性以迴避胰島素之RMC，從而增加血中濃度。然而，儘管RMC減少，具有減少的受體結合親合性之此等胰島素類似物仍無法迴避屬於主要清除機制之腎臟清除作用。因此，就顯著增加血中半衰期而言，有其限制。

在此背景下，本發明人已進行許多努力來增加胰島素之血中半衰期。結果，本發明人發現一種不具有天然胰島素序列而是具有非天然胰島素序列之新穎胰島素類似物係顯示出減少的活體外效價及減少的胰島素受體結合親合性，且因此，可減少其腎臟清除作用。本發明人亦發現藉由將該胰島素類似物連結至作為對半衰期增進有效的代表性載子之免疫球蛋白Fc片段可進一步增加胰島素之血中半衰期，從而完成本發明。

本發明之目的係在於提供一種為了延長胰島素之活體內半衰期而製備成具有減少的活體外效價之胰島素類似物、以及一種藉由將載子連結至該胰島素類似物而製備之共軛物。

明確而言，本發明之一目的係在於提供一種具有相較於天然型而言減少的胰島素效價之胰島素類似物。

本發明之另一目的係在於提供一種藉由將該胰島素類似物連結至該載子而製備之胰島素類似物共軛物。

本發明之又一目的係在於提供一種包含該胰島素類似物共軛物之長效胰島素調配物。

本發明之又一目的係在於提供一種製備該胰島素類似物共軛物之方法。

本發明之又一目的係在於提供一種使用該胰島素類似物或藉由將該胰島素類似物連結至該載子而製備之該胰島素類似物共軛物來增加活體內半衰期之方法。

本發明之又一目的係在於提供一種治療胰島素相關疾病之方法，其包含將該胰島素類似物或該胰島素類似物共軛物投予至對此有需要的對象之步驟。

在用以達成上述目的之一態樣中，本發明係提供一種胰島素類似物，其具有相較於天然型而言減少的胰島素效價，其中，B鏈或A鏈之胺基酸係經修飾。

在一明確具體例中，本發明係提供一種胰島素類似物，其具有減少的胰島素受體結合親合性。

在另一明確具體例中，本發明係提供一種非天然胰島素類似物，其中，在根據本發明之胰島素類似物中，選自由B鏈之第8個胺基酸、第23個胺基酸、第24個胺基酸及第25個胺基酸、以及A鏈之第1個胺基酸、第2個胺基酸及第14個胺基酸所組成之群組之一個胺基酸係經丙胺酸取代。

在又一明確具體例中，本發明係提供一種胰島素類似物，其中，根據本發明之胰島素類似物係選自由SEQ ID NO.20、22、24、26、28、30、32、34及36所組成之群組。

在另一態樣中，本發明係提供一種胰島素類似物共軛物，其係藉由將上述胰島素類似物連結至能夠延長半衰期之載子而製備。

在一明確具體例中，本發明係提供一種胰島素類似物共軛物，其中，該胰島素類似物共軛物係藉由將下列(i)與(ii)經由(iii)進行連結而製備：(i)上述胰島素類似物；(ii)免疫球蛋白Fc區域；(iii)選自由聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇-丙二醇共聚物、聚氧乙基化多元醇、聚乙烯基醇、多醣、葡聚糖、聚乙烯基乙基醚、生物可降解性聚合物、脂肪聚合物、幾丁質、玻尿酸、及其組合所組成之群組之胜肽連結子或非肽基連結子。

在又一態樣中，本發明係提供一種長效胰島素調配物，其包含上述胰島素類似物共軛物，其中，活體內持續時間及安定性係增加。

在一明確具體例中，本發明係提供一種長效調配物，其係用於治療糖尿病。

在另一具體例中，本發明係提供一種製備上述胰島素類似物共軛物之方法。

在又一明確具體例中，本發明係提供一種使用該胰島素類似物或藉由將該胰島素類似物連結至該載子而製備之該胰島素類似物共軛物來增加活體內半衰期之方法。

在又一明確具體例中，本發明係提供一種治療胰島素相關疾病之方法，其包含將該胰島素類似物或該胰島素類似物共軛物投予至對此有需要的對象之步驟。

本發明之非天然胰島素類似物具有相較於天然型而言減少的胰島素效價及減少的胰島素受體結合親合性，因而迴避活體內清除機制。因此，該胰島素類似物在活體內具有增加的血中半衰期，且藉由使用該胰島素類似物而製備之胰島素類似物-免疫球蛋白Fc共軛物係顯示出顯著增加的血中半衰期，從而增進需要胰島素投予之患者的便利性。

第1圖係顯示藉由蛋白質電泳分析胰島素類似物之純度的結果，其係代表性胰島素類似物，類似物No.7的結果(第1泳道：尺寸標記物，第2泳道：天然胰島素，第3泳道：胰島素類似物(No.7))；第2圖(A)與(B)係顯示藉由高壓層析分析胰島素類似物之純度的結果，其係代表性胰島素類似物，類似物No.7的結果(第2圖(A)RP-HPLC，第2圖(B)SE-HPLC)；第3圖(A)與(B)係顯示胰島素類似物之胜肽圖譜的結果，其係代表性胰島素類似物，類似物No.7的結果(第3 圖(A)天然胰島素，第3圖(B)胰島素類似物(No.7))；第4圖係顯示藉由蛋白質電泳分析胰島素類似物-免疫球蛋白Fc共軛物之純度的結果，其係代表性胰島素類似物，類似物No.7的結果(第1泳道：尺寸標記物，第2泳道：胰島素類似物(No.7)-免疫球蛋白Fc共軛物)；第5圖(A)至(C)係顯示藉由高壓層析分析胰島素類似物-免疫球蛋白Fc共軛物之純度的結果，其係代表性胰島素類似物，類似物No.7的結果(第5圖(A)RP-HPLC，第5圖(B)SE-HPLC，第5圖(C)IE-HPLC)；以及第6圖(A)至(C)係顯示在正常大鼠中分析天然胰島素-免疫球蛋白Fc共軛物及胰島素類似物-免疫球蛋白Fc共軛物之藥物動力學的結果，其係代表性胰島素類似物，類似物No.7的結果(○：天然胰島素-免疫球蛋白Fc共軛物(21.7nmol/kg)，●：天然胰島素-免疫球蛋白Fc共軛物(65.1nmol/kg)，□：胰島素類似物-免疫球蛋白Fc共軛物(21.7nmol/kg)，■：胰島素類似物-免疫球蛋白Fc共軛物(65.1nmol/kg)。第6圖(A)天然胰島素-免疫球蛋白Fc共軛物及胰島素類似物(No.7)-免疫球蛋白Fc共軛物，第6圖(B)天然胰島素-免疫球蛋白Fc共軛物及胰島素類似物(No.8)-免疫球蛋白Fc共軛物，第6圖(C)天然胰島素-免疫球蛋白Fc共軛物及胰島素類似物(No.9)-免疫球蛋白Fc共軛物)。

本發明係關於一種胰島素類似物，其具有減少的活體外效價。此胰島素類似物之特徵係在於其具有非天然胰島素序列且因此具有相較於天然胰島素而言減少的胰島素受體結合親合性，結果，受體媒介性清除作用係由於增加的解離常數而顯著減少，導致血中半衰期之增加。

在本文中使用時，術語“胰島素類似物”包含具有相較於天然型而言減少的胰島素效價之各種類似物。

該胰島素類似物可為具有相較於天然型而言減少的胰島素效價之胰島素類似物，其中，胰島素之B鏈或A鏈之胺基酸係經修飾。天然胰島素之胺基酸序列係如下。

-A鏈：Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn(SEQ ID NO.37)

-B鏈：Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr(SEQ ID NO.38)

本發明之實施例中所使用之胰島素類似物係藉由基因重組技術而製備之胰島素類似物。然而，本發明並非侷限於此，而是包含所有具有減少的活體外效價之胰島素。較佳地，該胰島素類似物可包含經反轉胰島素、胰島素變體、胰島素片段或類似者，且製備方法可包含固相法以及基因重組技術，但並非侷限於此。

該胰島素類似物係保有調控體內血中葡萄糖的功能之胜肽，其與胰島素的功能完全相同，且此胜肽包含胰島素促效劑、其衍生物、片段、變體或類似者。

本發明之胰島素促效劑係指結合至胰島素之活體內受體而顯現出與胰島素相同的生物活性(無關於胰島素之結構)之物質。

本發明之胰島素類似物係表示相較於天然胰島素之A鏈或B鏈而言在胺基酸序列上顯示出至少80%序列同源性，具有以化學取代(例如α-甲基化、α-羥基化)、去除(例如去胺化)或修飾(例如N-甲基化)之形式被改變之某些胺基酸殘基群，且具有調控體內血中葡萄糖的功能之胜肽。就本發明之目的而言，該胰島素類似物為具有相較於天然型而言減少的胰島素受體結合親合性之胰島素類似物，且包含而不限於具有相較於天然型而言減少的胰島素效價之胰島素類似物。

只要該胰島素類似物能夠顯現出低的受體媒介性內化作用或受體媒介性清除作用，其類型及尺寸並未特別限定。其主要活體內清除機制為受體媒介性內化作用或受體媒介性清除作用之胰島素類似物係適合於本發明之目的。

本發明之胰島素片段係表示於其中添加或刪除一或多個胺基酸之胰島素類型，且所添加之胺基酸可為非天然胺基酸(例如D型胺基酸)。此種胰島素片段係保有調控體內血中葡萄糖的功能。

本發明之胰島素變體係表示在一或多個胺基酸序列上與胰島素不同，且保有調控體內血中葡萄糖的功能之胜肽。

分別用於製備本發明之胰島素促效劑、衍生物、片段及變體之方法可獨立使用或組合使用。舉例而言，其一或多個胺基酸序列與胰島素之胺基酸序列不同並且亦具有調控體內血中葡萄糖的功能之胜肽及其在胺基端胺基酸殘基具有去胺化作用並且亦具有調控體內血中葡萄糖的功能之胜肽係含括於本發明中。

明確而言，該胰島素類似物可為其中選自由B鏈之第8個胺基酸、第23個胺基酸、第24個胺基酸及第25個胺基酸、以及A鏈之第1個胺基酸、第2個胺基酸及第14個胺基酸所組成之群組之一或多個胺基酸係經其他胺基酸取代，較佳經丙胺酸取代之胰島素類似物。此外，該胰島素類似物可選自由SEQ ID NO.20、22、24、26、28、30、32、34及36所組成之群組，但可包含任何具有減少的胰島素受體結合親合性之胰島素類似物而不受到侷限。

根據本發明之一具體例，SEQ ID NO.20、22、24、26、28、30、32、34及36之胰島素類似物，尤其是代表性胰島素類似物7、8及9(SEQ ID NO.32、34、及36)，被發現在活體外具有相較於天然型而言減少的胰島素受體結合親合性(表4)。

在另一態樣中，本發明係提供一種胰島素類似物共軛物，其係藉由連結該胰島素類似物與載子而製備。

在本文中使用時，術語“載子”係表示能夠增加所連結之胰島素類似物的活體內半衰期之物質。根據本發明之胰島素類似物之特徵係在於其具有相較於天然型而言顯著減少的胰島素受體結合親合性，且迴避受體媒介性清除作用或腎臟清除作用。因此，若將已知當連結至已知的各種生理活性多肽時會增加活體內半衰期之載子與該胰島素類似物進行連結，則顯然可增進活體內半衰期且可將所得共軛物使用作為長效調配物。

舉例而言，由於半衰期增進係首要優先事項，欲與具有減少的效價之新穎胰島素進行連結之載子並不限於免疫球蛋白Fc區域。載子包含能夠藉由將其與任何一種生物相容性材料進行連結而延長活體內半衰期，能夠減少腎臟清除作用，選自由各種聚合物(例如聚乙二醇及脂肪酸、白蛋白及其片段、特定胺基酸序列等)、白蛋白及其片段、白蛋白結合材料、及特定胺基酸序列重複單元之聚合物、抗體、抗體片段、FcRn結合材料、活體內結締組織或其衍生物、核苷酸、纖連蛋白、運鐵蛋白、醣、及聚合物所組成之群組之生物相容性材料，但並非侷限於此。此外，將能夠延長活體內半衰期之生物相容性材料連結至具有減少的效價之胰島素類似物之方法包含基因重組、活體外共軛或類似者。生物相容性材料之實例可包含FcRn結合材料、脂肪酸、聚乙二醇、胺基酸片段、或白蛋白。FcRn結合材料可為免疫球蛋白Fc區域。

該胰島素類似物及作為載子之生物相容性材料可經由作為連結子之胜肽或非肽基聚合物彼此連結。

該胰島素共軛物可為胰島素類似物共軛物，其係藉由將下列(i)與(ii)經由(iii)進行連結而製備：(i)該胰島素類似物；(ii)免疫球蛋白Fc區域；(iii)選自由聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇-丙二醇共聚物、聚氧乙基化多元醇、聚乙烯基醇、多醣、葡聚糖、聚乙烯基乙基醚、生物可降解性聚合物、脂肪聚合物、幾丁質、玻尿酸及其組合所組成之群組之胜肽連結子或非肽基連結子。

在本發明之胰島素類似物共軛物之一明確具體例中，作為連結子之非肽基聚合物係連結至該胰島素類似物之B鏈的胺基端。在本發明之共軛物之另一明確具體例中，作為連結子之非肽基聚合物係連結至該胰島素類似物之B鏈的殘基。在胰島素之A鏈的修飾會導致活性及安全性上的減少。因此，在此等具體例中，作為連結子之非肽基聚合物係連結至胰島素之B鏈，從而維持胰島素活性並增進安全性。

在本文中使用時，術語“活性”意指胰島素結合至胰島素受體之能力，且意指胰島素結合至其受體以顯現出其作用。此種非肽基聚合物對本發明之胰島素之B鏈的胺基端之結合可藉由pH值控制而達成，且較佳的pH值範圍為4.5至7.5。

在本文中使用時，術語“N-端”可與“N-端區域”交換使用。

在一明確實施例中，本發明人係藉由將PEG連結至免疫球蛋白Fc區域之N-端，並將胰島素之B鏈的 N-端選擇性地偶合到其上而製備胰島素類似物-PEG-免疫球蛋白Fc共軛物。此胰島素類似物-PEG-免疫球蛋白Fc共軛物之血清半衰期相較於非共軛物而言係增加，且其在疾病動物模型中顯示出降血糖功效。因此，顯然可製備新的維持活體內活性之長效胰島素調配物。

免疫球蛋白Fc區域係由於其為在活體內代謝之生物可降解性多肽，故對於使用作為藥物載子而言係安全的。又，相較於整個免疫球蛋白分子，免疫球蛋白Fc區域具有相對較低的分子量，因而就該共軛物之製備、純化及生產而言，其係有利的。免疫球蛋白Fc區域不含Fab片段(由於其根據抗體亞群係不同胺基酸序列而呈高度非同源)，因而可預期免疫球蛋白Fc區域可大為增加物質之同源性且在血中呈低抗原性。

在本文中使用時，術語“免疫球蛋白Fc區域”係指含有免疫球蛋白之重鏈恒定區域2(CH2)及重鏈恒定區域3(CH3)，且排除免疫球蛋白之重及輕鏈可變區域、重鏈恒定區域1(CH1)及輕鏈恒定區域1(CL1)之蛋白質。其可進一步包含在重鏈恒定區域之絞鏈區域(hinge region)。又，只要其具有相較於天然型而言實質上相似或更佳的功效，本發明之免疫球蛋白Fc區域可含有除了免疫球蛋白之重及輕鏈可變區域以外之包含重鏈恒定區域1(CH1)及/或輕鏈恒定區域1(CL1)之部分或所有Fc區域。又，其可為在CH2及/或CH3之胺基酸序列之相對較長部分中具有缺失之片段。

亦即，本發明之免疫球蛋白Fc區域可包含：1)CH1結構域、CH2結構域、CH3結構域及CH4結構域；2)CH1結構域及CH2結構域；3)CH1結構域及CH3結構域；4)CH2結構域及CH3結構域；5)一或多個結構域與免疫球蛋白絞鏈區域(或絞鏈區域之一部分)之組合；以及6)重鏈恒定區域及輕鏈恒定區域之各結構域的二聚體。

另外，本發明之免疫球蛋白Fc區域包含其序列衍生物(突變)以及天然胺基酸序列。胺基酸序列衍生物具有由於一或多個胺基酸殘基之缺失、插入、非保守性或保守性取代或其組合而與天然胺基酸序列不同的序列。舉例而言，在IgG Fc中，可使用已知在結合作用中重要的於位置214至238、297至299、318至322、或327至331之胺基酸殘基作為用於修飾之合適目標。

此外，其他各種衍生物皆可能適用，包含具有能夠形成二硫鍵之區域的缺失、在天然Fc型之N-端之數個胺基酸殘基的缺失、或添加甲硫胺酸殘基至天然Fc型之N-端之衍生物。再者，為了去除效應子功能，缺失可發生在補體結合位置，諸如C1q結合位置及ADCC(抗體依賴型細胞媒介性毒殺作用)位置。製備此種免疫球蛋白Fc區域之序列衍生物之技術係揭示於WO 97/34631及WO 96/32478中。

在蛋白質及胜肽中之胺基酸代換，其大體上不會改變分子活性，係該技術領域中已知者(H.Neurath,R.L.Hill,The Proteins,Academic Press,New York,1979)。最常發生的代換為在兩個方向上之Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Thy/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu、Asp/Gly。

若有必要，Fc區域可藉由磷酸化、硫酸化、醯基化、醣基化、甲基化、法尼基化(farnesylation)、乙醯基化、醯胺化或類似者進行修飾。

前述Fc衍生物為具有與本發明之Fc區域完全相同的生物活性或增進的耐受熱、耐pH值、或類似的結構安定性之衍生物。

此外，此等Fc區域可得自從人類及其他動物(包含牛、山羊、豬、小鼠、兔、倉鼠、大鼠及豚鼠)中單離出之天然型，或者可為得自經轉形動物細胞或微生物之其重組體或衍生物。此處，該等可藉由從人類或動物有機體中單離出整個免疫球蛋白並利用蛋白分解酶對其進行處理而自天然免疫球蛋白中獲得。木瓜酶將天然免疫球蛋白消化成Fab及Fc區域，而胃蛋白酶處理導致pF’c及F(ab)₂之產生。可使此等片段進行尺寸排除層析以單離Fc或pF’c。

較佳地，人類衍生之Fc區域為得自微生物之重組免疫球蛋白Fc區域。

此外，免疫球蛋白Fc區域可呈具有天然糖鏈、相較於天然型而言增加的糖鏈或相較於天然型而言減少的糖鏈之形式，或可呈去醣基化形式。免疫球蛋白Fc 糖鏈之增加、減少或去除可藉由該技術領域中慣用的方法，諸如化學方法、酶法及使用微生物之遺傳工程方法而達成。此處，糖鏈自Fc區域之去除導致對補體(c1q)的結合親合性之急遽減少以及抗體依賴型細胞媒介性毒殺作用或補體依賴型毒殺作用之減少或喪失，從而不會在活體內誘發不必要的免疫反應。就此點而言，呈去醣基化或無醣基化形式之免疫球蛋白Fc區域可能更適合於本發明之目的作為藥物載子。

在本文中使用時，術語“去醣基化”意指自Fc區域以酶去除糖部分，而術語“無醣基化”意指Fc區域係以未醣基化形式由原核生物(較佳為大腸桿菌(E.coli))產生。

另一方面，免疫球蛋白Fc區域可衍生自人類或其他動物，包含牛、山羊、豬、小鼠、兔、倉鼠、大鼠及豚鼠，且較佳為人類。此外，免疫球蛋白Fc區域可為衍生自IgG、IgA、IgD、IgE及IgM之Fc區域，或者由其組合物或其雜合物所製成之Fc區域。較佳地，免疫球蛋白Fc區域係衍生自IgG或IgM，其係在人類血液中最豐富的蛋白質，且最佳地，免疫球蛋白Fc區域係衍生自IgG，其係已知會提高配位體結合型蛋白質之半衰期。

另一方面，在本文中使用時，術語“組合物”意指編碼出相同起源的單鏈免疫球蛋白Fc區域之多肽係連結至不同起源的單鏈多肽以形成二聚體或多聚體。亦即，二聚體或多聚體可由選自由IgG Fc、IgA Fc、IgM Fc、IgD Fc及IgE Fc片段所組成之群組之二或更多個片段所形成。

在本文中使用時，術語“雜合物”意指在單鏈免疫球蛋白Fc區域中存在有編碼出不同起源的二或更多個免疫球蛋白Fc區域之序列。在本發明中，各種類型的雜合物皆可能適用。亦即，結構域雜合物可由選自由IgG Fc、IgM Fc、IgA Fc、IgE Fc及IgD Fc之CH1、CH2、CH3及CH4所組成之群組之一至四個結構域所構成，且可包含絞鏈區域。

另一方面，IgG係分成IgG1、IgG2、IgG3及IgG4亞群，而本發明包含其組合物及雜合物。較佳為IgG2及IgG4亞群，且最佳為IgG4之Fc區域，其極少具有效應子功能，諸如CDC(補體依賴型毒殺作用)。亦即，作為本發明之藥物載子，最佳的免疫球蛋白Fc區域為人類IgG4衍生之非醣基化Fc區域。人類衍生之Fc區域係較佳於非人類衍生之Fc區域，非人類衍生之Fc區域可能會在人體中作用為抗原且造成不欲的免疫反應，諸如抵抗該抗原的新抗體之產生。

在該胰島素類似物共軛物之明確具體例中，非肽基聚合物之兩末端可分別連結至免疫球蛋白Fc區域之N-端以及該胰島素類似物之B鏈的N-端胺基或B鏈內部離胺酸殘基之ε-胺基或硫醇基。

本發明之Fc區域-連結子-胰島素類似物係以各種莫耳比例製成。亦即，連結至單一胰島素類似物之Fc片段及/或連結子的數量並未限定。

此外，當Fc區域及該胰島素類似物係藉由基因重組而表現為融合蛋白質時，本發明之Fc區域、某種連結子、及胰島素類似物之連結可包含所有類型的共價鍵及所有類型的非共價鍵，諸如氫鍵、離子性交互作用、凡得瓦爾力(van der Waals force)及疏水性交互作用。然而，就該胰島素類似物之生理活性而言，連結較佳係由共價鍵所製成，但並非侷限於此。

另一方面，本發明之Fc區域、某種連結子及該胰島素類似物可在N-端或C-端(較佳在游離端)彼此連結，特別是可在胺基端末端、離胺酸之胺基酸殘基、組胺酸之胺基酸殘基、或游離半胱胺酸殘基形成共價鍵。

此外，本發明之Fc區域、某種連結子、及該胰島素類似物之連結可在某種方向上製成。亦即，可將連結子連結至免疫球蛋白Fc區域之N-端、C-端或游離基，亦可連結至該胰島素類似物之N-端、C-端或游離基。

可將非肽基連結子連結至免疫球蛋白片段之N-端胺基，且不限定於免疫球蛋白片段序列之任何離胺酸殘基或半胱胺酸殘基。

另外，在該胰島素類似物共軛物之明確具體例中，除了免疫球蛋白Fc區域之N-端以外，尚可將非肽基聚合物之末端連結至能夠結合至在非肽基聚合物末端的反應性基之內部胺基酸殘基或游離反應性基，但並非侷限於此。

在本發明中，非肽基聚合物意指包含彼此連結之二或更多個重複單元之生物相容性聚合物，其中，該重複單元係藉由排除胜肽鍵之任何共價鍵連結。此種非肽基聚合物可具有二個末端或三個末端。

可用於本發明中之非肽基聚合物可選自由聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇與丙二醇共聚物、聚氧乙基化多元醇、聚乙烯基醇、多醣、葡聚糖、聚乙烯基乙基醚、生物可降解性聚合物，諸如PLA(聚(乳酸))及PLGA(聚乳酸-乙醇酸)、脂肪聚合物、幾丁質、玻尿酸、及其組合所組成之群組，且較佳為聚乙二醇。該技術領域中所公知且該技術領域之具有通常知識者容易製備之其衍生物亦含括於本發明之範疇中。

使用於藉由習知框內融合(inframe fusion)方法所獲得之融合蛋白質的胜肽連結子具有其係容易在活體內由蛋白分解酶所裂解之缺點，因而無法如預期獲得藉由載子而增加活性藥物的血中半衰期之足夠功效。然而，在本發明中，可使用非肽基連結子以及胜肽連結子製備共軛物。在非肽基連結子中，可使用對蛋白分解酶具有耐受性之聚合物以將胜肽的血中半衰期維持類似於載子的血中半衰期。因此，只要其係具有前述功能之聚合物，亦即，對活體內蛋白分解酶具有耐受性之聚合物，則任何非肽基聚合物皆可使用而不受到侷限。非肽基聚合物具有範圍自1至100kDa，較佳地，範圍自1至20kDa之分子量。

連結至免疫球蛋白Fc區域之本發明之非肽基聚合物可為一種聚合物或不同類型的聚合物之組合。

用於本發明中之非肽基聚合物具有能夠結合至免疫球蛋白Fc區域及蛋白質藥物之反應性基。

非肽基聚合物在兩末端具有反應性基，其較佳係選自由反應性乙醛基、丙醛基、丁醛基、順丁烯二醯亞胺基及琥珀醯亞胺衍生物所組成之群組。琥珀醯亞胺衍生物可為琥珀醯亞胺丙酸酯、羥基琥珀醯亞胺基、琥珀醯亞胺基羧甲基、或琥珀醯亞胺碳酸酯。尤其當非肽基聚合物在其兩末端具有反應性醛基時，其係有效於在兩末端與生理活性多肽及免疫球蛋白進行連結，而具有最小的非特異性反應。藉由醛鍵之還原性烷化所生成之最終產物相較於藉由醯胺鍵所連結者而言係更加安定。醛反應性基係在低pH值中選擇性地結合至N-端，且在高pH值(諸如pH 9.0)中結合至離胺酸殘基以形成共價鍵。

在非肽基聚合物之兩末端之反應性基可彼此相同或不同。舉例而言，非肽基聚合物可在一末端擁有順丁烯二醯亞胺基，且在另一末端擁有乙醛基、丙醛基或丁醛基。當使用在其兩末端具有反應性羥基之聚乙二醇作為非肽基聚合物時，可將該羥基藉由已知的化學反應活化成各種反應性基，或者可使用具有市售可得的經修飾反應性基之聚乙二醇，以便製備本發明之單鏈胰島素類似物共軛物。

本發明之胰島素類似物共軛物係維持習知胰島素之活體內活性，諸如能量代謝及糖代謝，且亦增加該胰島素類似物之血中半衰期並顯著增加該胜肽之活體內效用的持續時間，因此，該共軛物係有用於治療糖尿病。

在本發明之一實施例中，證實當連結至能夠延長活體內半衰期之載子時，具有減少的胰島素受體結合親合性之胰島素類似物係顯現出相較於天然胰島素共軛物而言更高的活體內半衰期(第6圖)。

在另一態樣中，本發明係提供一種長效胰島素調配物，其包含該胰島素類似物共軛物。該長效胰島素調配物可為具有增加的活體內持續時間及安定性之長效胰島素調配物。該長效調配物可為用於治療糖尿病之醫藥組成物。

包含本發明之共軛物之醫藥組成物可包含醫藥上可接受之載劑。針對經口投予，醫藥上可接受之載劑可包含黏結劑、潤滑劑、崩解劑、賦形劑、增溶劑、分散劑、安定劑、懸浮劑、著色劑、香料或類似者。針對可注射製劑，醫藥上可接受之載劑可包含緩衝劑、防腐劑、鎮痛劑、增溶劑、等張劑、及安定劑。針對用於局部投予之製劑，醫藥上可接受之載劑可包含基劑、賦形劑、潤滑劑、防腐劑或類似者。可將本發明之醫藥組成物與前述醫藥上可接受之載劑進行組合而調配成多種劑型。舉例而言，針對經口投予，可將該醫藥組成物調配成錠劑、口含片、膠囊、酏劑、懸浮液、糖漿或薄片。針對可注射製劑，可將該醫藥組成物調配成單劑量安瓿或多劑量容器。亦可將該醫藥組成物調配成溶液、懸浮液、錠劑、丸劑、膠囊及持續釋放製劑。

另一方面，適合用於調配之載劑、賦形劑及稀釋劑之實例包含乳糖、右旋葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、木糖醇、赤藻糖醇、麥芽糖醇、澱粉、阿拉伯膠、藻酸鹽、明膠、磷酸鈣、矽酸鈣、纖維素、甲基纖維素、微晶纖維素、聚乙烯吡咯啶酮、水、羥基苯甲酸甲酯、羥基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸鎂、礦物油或類似者。

此外，該醫藥調配物可進一步包含填充劑、抗凝劑、潤滑劑、保濕劑、香料、抗菌劑或類似者。

在又一態樣中，本發明係提供一種治療胰島素相關疾病之方法，其包含將該胰島素類似物或該胰島素類似物共軛物投予至對此有需要的對象。

根據本發明之共軛物係有用於治療糖尿病，因此，可藉由投予包含該共軛物之醫藥組成物而治療此疾病。

在本文中使用時，術語“投予”意指藉由某種合適方法將預定的物質引進至患者。只要其能夠到達所欲的組織，本發明之共軛物可經由任何慣用途徑進行投予。可實施腹膜內、靜脈內、肌肉內、皮下、皮內、經口、局部、鼻內、肺內及直腸內投予，但本發明並非侷限於此。然而，由於胜肽在經口投予時會被消化，應包覆或調配用於經口投予之組成物的活性成分以保護其免於在胃中降解。較佳地，本發明之組成物可呈可注射形式進行投予。此外，該醫藥組成物可使用能夠將活性成分運送至目標細胞之某種裝置進行投予。

另外，本發明之醫藥組成物可由數種相關因子，包含所欲治療疾病之類型、投予途徑、患者之年齡、性別、體重及患病嚴重度，以及由作為活性組分的藥物之類型來決定。由於本發明之醫藥組成物具有優異的活體內持續時間及效價，其具有大為減少本發明之醫藥調配物的投予頻率之優點。

在又一態樣中，本發明係提供一種製備該胰島素類似物共軛物之方法，其包含製備該胰島素類似物；製備該載子；以及連結該胰島素類似物與該載子。

在又一態樣中，本發明係提供一種使用該胰島素類似物或藉由連結該胰島素類似物與該載子而製備之該胰島素類似物共軛物來增加活體內半衰期之方法。

[發明模式]

下文中，將參照實施例更詳細地說明本發明。然而，此等實施例僅用於例示性目的，本發明並非意圖受到此等實施例所侷限。

實施例1：單鏈胰島素類似物之表現載體之製備

為了製備胰島素類似物(其各者在A鏈或B鏈具有經修飾胺基酸)，使用天然胰島素之表現載體作為模板，合成正向及反向寡核苷酸(表2)，然後施行PCR以擴增各類似物基因。

在下表1中，係出示在A鏈或B鏈經修飾之胺基酸序列及類似物名稱。亦即，類似物1代表A鏈之第1個甘胺酸係經丙胺酸取代，而類似物4則代表B鏈之第8個甘胺酸係經丙胺酸取代。

用於胰島素類似物擴增之引子係示於下表2。

在95℃，30秒、55℃，30秒、68℃，6分鐘，共18次循環之條件下，施行用於胰島素類似物擴增之PCR。將在該條件下所獲得之胰島素類似物片段插入至pET22b載體中以表現為細胞內包涵體(inclusion body)，並將所得表現載體標示為pET22b-胰島素類似物1至9。該表現載體含有在T7啟動子之調控下編碼出胰島素類似物1至9的胺基酸序列之核酸，且胰島素類似物蛋白質係在宿主細胞中表現為包涵體。

胰島素類似物1至9之DNA序列及蛋白質序列係示於下表3。

實施例2：重組胰島素類似物融合胜肽之表現

在T7啟動子之調控下施行重組胰島素類似物之表現。利用各重組胰島素類似物之表現載體對大腸桿菌BL21-DE3 (大腸桿菌B F-dcm ompT hsdS(rB-mB-)gal λDE3)；Novagen)進行轉形。轉形係依據建議流程指南(Novagen)實施。收集轉形有各重組表現載體之單一群落並接種於含有胺苄青黴素(ampicillin)(50μg/ml)之2X Luria培養液(Luria Broth，LB)中且在37℃培養15小時。將重組菌株培養液與含有30%甘油之2X LB培養基以1：1(體積/體積)之比例進行混合。將各1ml分注至凍存管中並儲存在-140℃，其係使用作為用於產生重組融合蛋白質之細胞原液。

為了表現重組胰島素類似物，將1小瓶各細胞原液解凍並接種於500ml之2X Luria培養液中，且在37℃搖晃培養14至16小時。當OD600到達5.0或更高時，終止培養。將該培養液使用作為種子培養液。將此種子培養液接種至含有17L之發酵培養基之50L發酵槽(MSJ-U2，B.E.MARUBISHI，日本)中，並開始初始批次發酵。培養條件係維持在溫度37℃，空氣流動速率20L/分鐘(1vvm)，攪拌速度500rpm，且藉由使用30%氨水溶液使pH為6.70。當培養液中之營養物質耗盡時，添加饋料溶液，藉此以饋料批次模式施行發酵。藉由OD值監控菌株之生長。當OD值高於100時，以500μM之最終濃度引進IPTG。引進後，進一步施行培養約23至25小時。終止培養後，藉由離心收取重組菌株並儲存在-80℃直至使用前。

實施例3：重組胰島素類似物之回收及再摺疊

為了將實施例2中所表現之重組胰島素類似物改變成可溶形式，便將細胞打破，隨後進行再摺疊。將100g(濕重)之細胞團塊再懸浮於1L裂解緩衝液(50mM Tris-HCl(pH 9.0)、1mM EDTA(pH 8.0)、0.2M NaCl及0.5% Triton X-100)中。使用微流(microfluidizer)處理器M-110EH(AC Technology Corp.型號M1475C)在操作壓力15,000psi中打破該細胞。將如此被打破之細胞裂解液以7,000rpm及4℃離心20分鐘。丟棄上清液並將團塊再懸浮於3L洗滌緩衝液(0.5% Triton X-100及50mM Tris-HCl(pH 8.0)、0.2M NaCl、1mM EDTA)中。以7,000rpm及4℃離心20分鐘後，將細胞團塊再懸浮於蒸餾水中，隨後以相同方式進行離心。將如此獲得之團塊再懸浮於400ml之緩衝液(1M甘胺酸、3.78g半胱胺酸-HCl，pH 10.6)中並在室溫攪拌1小時。為了回收如此經再懸浮之重組胰島素類似物，添加400mL之8M尿素並在40℃攪拌1小時。為了進行已溶解重組胰島素類似物之再摺疊，以7,000rpm及4℃施行離心30分鐘，並獲得上清液。使用蠕動泵以1000ml/小時之流動速率對其添加2L之蒸餾水，同時在4℃攪拌16小時。

實施例4：陽離子結合型層析純化

將經再摺疊之試樣載入至經含有45%乙醇之20mM檸檬酸鈉(pH 2.0)緩衝液平衡的Source S(GE healthcare)管柱，然後利用線性梯度自0%至100%的含有0.5M氯化鉀及45%乙醇之20mM檸檬酸鈉(pH 2.0)緩衝液以10個管柱容積洗提該胰島素類似物蛋白質。

實施例5：胰蛋白酶及羧基胜肽酶B處理

使用脫鹽管柱自經洗提之試樣去除鹽，並將緩衝液利用緩衝液(10mM Tris-HCl，pH 8.0)進行更換。就所獲得之試樣蛋白質而言，添加相應於1000莫耳比率之胰蛋白酶及相應於2000莫耳比率之羧基胜肽酶B，然後在16℃攪拌16小時。為了終止反應，使用1M檸檬酸鈉(pH 2.0)以降低pH值至3.5。

實施例6：陽離子結合型層析純化

將如此經反應之試樣載入至經含有45%乙醇之20mM檸檬酸鈉(pH 2.0)緩衝液平衡的Source S(GE healthcare)管柱，然後利用線性梯度自0%至100%的含有0.5M氯化鉀及45%乙醇之20mM檸檬酸鈉(pH 2.0)緩衝液以10個管柱容積洗提該胰島素類似物蛋白質。

實施例7：陰離子結合型層析純化

使用脫鹽管柱自經洗提之試樣去除鹽，並將緩衝液利用緩衝液(10mM Tris-HCl，pH 7.5)進行更換。為了自實施例6所獲得之試樣中單離純的胰島素類似物，將該試樣載入至經10mM Tris(pH 7.5)緩衝液平衡的陰離子交換管柱(Source Q：GE healthcare)，並利用線性梯度自0%至100%的含有0.5M氯化鈉之10mM Tris(pH 7.5)緩衝液以10個管柱容積洗提該胰島素類似物蛋白質。

藉由蛋白質電泳(SDS-PAGE，第1圖)及高壓層析(HPLC)(第2圖)分析如此經純化之胰島素類似物之純度，並藉由胜肽圖譜(第3圖)及各峰值之分子量分析鑑定胺基酸之修飾。

結果，發現各胰島素類似物在其胺基酸序列中具有所欲的修飾。

實施例8：胰島素類似物(No.7)-免疫球蛋白Fc共軛物之製備

為了使用3.4K ALD2 PEG(NOF，日本)將該胰島素類似物之β鏈的N-端聚乙二醇化，在胰島素類似物濃度5mg/ml之情況下使該胰島素類似物與PEG以1：4之莫耳比在4℃進行反應約2小時。在此時，於pH 6.0之50mM檸檬酸鈉及45%異丙醇中實施該反應。添加3.0mM氰基硼氫化鈉作為還原劑並使其進行反應。以使用含有檸檬酸鈉(pH 3.0)及45%乙醇之緩衝液、以及KCl濃度梯度之SP-HP(GE Healthcare，美國)管柱純化反應溶液。

為了製備胰島素類似物-免疫球蛋白Fc片段共軛物，在總蛋白質濃度約20mg/ml之情況下使經純化之單聚乙二醇化胰島素類似物與免疫球蛋白Fc片段以1：1至1：2之莫耳比在25℃進行反應13小時。在此時，反應緩衝液條件為於pH 8.2之100mM HEPES，並對其添加20mM氰基硼氫化鈉作為還原劑。因此，PEG係結合至Fc片段之N-端。

終止反應後，將反應溶液載入至含有Tris-HCl(pH 7.5)緩衝液及NaCl濃度梯度之Q HP(GE Healthcare，美國)管柱以分離及純化未反應之免疫球蛋白Fc片段與單聚乙二醇化胰島素類似物。

之後，使用Source 15ISO(GE Healthcare，美國)作為第二管柱以去除剩餘的免疫球蛋白Fc片段以及其中二或更多個胰島素類似物係連結至免疫球蛋白Fc片段之共軛物，從而獲得該胰島素類似物-免疫球蛋白Fc片段共軛物。在此時，使用含有Tris-HCl(pH 7.5)之硫酸銨濃度梯度施行洗提，並將如此經洗提之該胰島素類似物-免疫球蛋白Fc共軛物藉由蛋白質電泳(SDS-PAGE，第4圖)及高壓層析(HPLC)(第5圖)進行分析。結果，發現該共軛物具有幾乎99%純度。

實施例9：天然胰島素、胰島素類似物、天然胰島素-免疫球蛋白Fc共軛物、及胰島素類似物-免疫球蛋白Fc共軛物之間的胰島素受體結合親合性之比較

為了測定該胰島素類似物-免疫球蛋白Fc共軛物之胰島素受體結合親合性，係使用表面電漿共振(SPR，BIACORE 3000，GE healthcare)進行分析。胰島素受體係藉由胺偶合而固定在CM5晶片上，並獨立對其施加5個或更多個天然胰島素、胰島素類似物、天然胰島素-免疫球蛋白Fc共軛物、及胰島素類似物-免疫球蛋白Fc共軛物之稀釋物。然後，檢測各物質之胰島素受體結合親合性。使用BIAevaluation軟體計算出各物質之結合親合性。在此時，所使用之模型為具有基線漂移之1：1朗繆爾結合(Langmuir binding)。

結果，相較於人類胰島素而言，胰島素類似物(No.6)係顯示出14.8%之受體結合親合性、胰島素類似物(No.7)係顯示出9.9%之受體結合親合性、胰島素類似物(No.8)係顯示出57.1%之受體結合親合性、胰島素類似物(No.9) 係顯示出78.8%之受體結合親合性、天然胰島素-免疫球蛋白Fc共軛物係依實驗回合顯示出3.7至5.9%之受體結合親合性、胰島素類似物(No.6)-免疫球蛋白Fc共軛物係顯示出0.9%或更低之受體結合親合性、胰島素類似物(No.7)-免疫球蛋白Fc共軛物係顯示出1.9%之受體結合親合性、胰島素類似物(No.8)-免疫球蛋白Fc共軛物係顯示出1.8%之受體結合親合性、以及胰島素類似物(No.9)-免疫球蛋白Fc共軛物係顯示出3.3%之受體結合親合性(表4)。就此而言，觀察到本發明之胰島素類似物具有相較於天然胰島素而言減少的胰島素受體結合親合性，且該胰島素類似物-免疫球蛋白Fc共軛物亦具有顯著減少的胰島素受體結合親合性。

實施例10：天然胰島素-免疫球蛋白Fc共軛物及胰島素類似物-免疫球蛋白Fc共軛物之間的活體外效用之比較

為了評估該胰島素類似物-免疫球蛋白Fc共軛物之活體外效用，使用小鼠衍生之經分化3T3-L1脂肪細胞來測試葡萄糖攝取或脂肪合成。將3T3-L1細胞於含有10% NBCS(新生牛血清)之DMEM(Dulbeco之經改良Eagle培養基，Gibco，型號12430)中一週繼代培養兩次或三次，並持續維持。將3T3-L1細胞懸浮於分化培養基(含有10% FBS之DMEM)中，然後以每孔5×10⁴個之密度接種於48孔盤中，並培養48小時。為了進行脂肪細胞分化，將1μg/mL人類胰島素(Sigma，型號19278)、0.5mM IBMX(3-異丁基-1-甲基黃嘌呤，Sigma，型號15879)、及1μM地塞米松(Dexamethasone)(Sigma，型號D4902)與分化培養基進行混合，並在去除先前的培養基後將250μl之該混合物添加至各孔中。48小時後，將培養基利用僅補充有1μg/mL之人類胰島素之分化培養基進行更換。之後，在每48小時將培養基利用補充有1μg/mL之人類胰島素之分化培養基進行更換之同時，檢測脂肪細胞分化之誘發共7至9日。為了測試葡萄糖攝取，將經分化細胞以不含血清之DMEM培養基洗滌一次，然後添加250μl以誘發血清耗竭4小時。使用不含血清之DMEM培養基施行人類胰島素自2μM至0.01μM之10倍連續稀釋，以及天然胰島素-免疫球蛋白Fc共軛物及胰島素類似物-免疫球蛋白Fc共軛物自20μM至0.02μM之10倍連續稀釋。將各250μl之如此製備之試樣添加至細胞中，並於5% CO₂保溫箱中在37℃培養24小時。為了測定在培養後於培養基中之葡萄糖殘餘量，取200μl之培養基並以D-PBS稀釋5倍，隨後進行GOPOD(GOPOD試驗套組，Megazyme，型號K-GLUC)試驗。基於葡萄糖標準溶液之吸光度，轉換培養基中剩餘的葡萄糖之濃度，而分別計算出天然胰島素-免疫球蛋白Fc共軛物及胰島素類似物-免疫球蛋白Fc共軛物之葡萄糖攝取之EC50值。

結果，相較於人類胰島素而言，天然胰島素-免疫球蛋白Fc共軛物係顯示出11.6%之葡萄糖攝取、胰島素類似物(No.6)-免疫球蛋白Fc共軛物係顯示出0.43%之葡萄糖攝取、胰島素類似物(No.7)-免疫球蛋白Fc共軛物係顯示出1.84%之葡萄糖攝取、胰島素類似物(No.8)-免疫球蛋白Fc共軛物係顯示出16.0%之葡萄糖攝取、胰島素類似物(No.9)-免疫球蛋白Fc共軛物係顯示出15.1%之葡萄糖攝取(表5)。就此而言，觀察到本發明之胰島素類似物(No.6)-免疫球蛋白Fc共軛物及胰島素類似物(No.7)-免疫球蛋白Fc共軛物具有相較於天然胰島素-免疫球蛋白Fc共軛物而言顯著減少的活體外效價，且胰島素類似物(No.8)-免疫球蛋白Fc共軛物及胰島素類似物(No.9)-免疫球蛋白Fc共軛物具有類似於天然胰島素-免疫球蛋白Fc共軛物之活體外效價。

實施例11：胰島素類似物-免疫球蛋白Fc共軛物之藥物動力學

為了檢測該胰島素類似物-免疫球蛋白Fc共軛物之藥物動力學，在已適應實驗室5日之正常大鼠(SD大鼠，雄性，6週大)中比較其經時血中濃度。分別皮下注射21.7nmol/kg之天然胰島素-免疫球蛋白Fc共軛物及65.1nmol/kg之胰島素類似物-免疫球蛋白Fc共軛物。在0、1、4、8、24、48、72、96、120、144、168、192、及216小時收集血液。在各時間點，藉由酶連結免疫吸附試驗(ELISA)測定天然胰島素-免疫球蛋白Fc共軛物及胰島素類似物-免疫球蛋白Fc共軛物之血中濃度，並使用胰島素ELISA(ALPCO，美國)作為試劑套組。然而，作為偵測抗體，係使用小鼠抗人類IgG4 HRP共軛物(Alpha Diagnostic Intl,Inc，美國)。

檢測天然胰島素-免疫球蛋白Fc共軛物及該胰島素類似物-免疫球蛋白Fc共軛物之藥物動力學之結果顯示其血中濃度係與其投予濃度成比例地增加，且具有低胰島素受體結合親合性之該胰島素類似物-免疫球蛋白Fc共軛物係顯示出相較於天然胰島素-Fc共軛物而言高度增加的半衰期(第6圖)。

此等結果表明當將經修飾成具有減少的胰島素受體結合親合性之本發明之胰島素類似物連結至免疫球蛋白Fc區域而製備共軛物時，該共軛物係由於顯著增加的活體內血中半衰期而可提供作為安定的胰島素調配物，因而有效地使用作為糖尿病之治療劑。再者，由於根據本發明之胰島素類似物本身亦具有減少的胰島素受體結合親合性及減少的效價，故儘管將其連結至其他各種載子，該胰島素類似物亦顯現出相同的功效。

基於上述說明，技術領域具有通常知識者將清楚瞭解在不悖離本發明之範疇及精神下可進行各種修改及變更。因此，應瞭解在所有態樣中，上述具體例並非為限制性，而是例示性。本發明之範疇係由所附申請專利範圍所界定，而並非由申請專利範圍之前的說明所界定，故而，落入申請專利範圍之界線及範圍內之所有變更及修改、或此種界線及範圍之等價物皆因而意圖為申請專利範圍所涵蓋。

<110> 韓美藥品股份有限公司(HANMI PHARM.CO.,LTD.)

<120> 新穎胰島素類似物及其用途(Novel insulin analog and use thereof)

<130> OPA14031

<150> KR 10-2013-0020703

<151> 2013-02-26

<150> KR 10-2013-0082511

<151> 2013-07-12

<150> KR 10-2014-0006937

<151> 2014-01-20

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<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 8

<210> 9

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 9

<210> 10

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 10

<210> 11

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 11

<210> 12

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 12

<210> 13

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 13

<210> 14

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 14

<210> 15

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 15

<210> 16

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 16

<210> 17

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 17

<210> 18

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 18

<210> 19

<211> 258

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 類似物1

<400> 19

<210> 20

<211> 86

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 類似物1

<400> 20

<210> 21

<211> 258

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 類似物2

<400> 21

<210> 22

<211> 86

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 類似物2

<400> 22

<210> 23

<211> 258

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 類似物3

<400> 23

<210> 24

<211> 86

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 類似物3

<400> 24

<210> 25

<211> 258

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 類似物4

<400> 25

<210> 26

<211> 86

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 類似物4

<400> 26

<210> 27

<211> 258

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 類似物5

<400> 27

<210> 28

<211> 86

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 類似物5

<400> 28

<210> 29

<211> 258

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 類似物6

<400> 29

<210> 30

<211> 86

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 類似物6

<400> 30

<210> 31

<211> 258

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 類似物7

<400> 31

<210> 32

<211> 86

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 類似物7

<400> 32

<210> 33

<211> 261

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 類似物8

<400> 33

<210> 34

<211> 86

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 類似物8

<400> 34

<210> 35

<211> 261

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 類似物9

<400> 35

<210> 36

<211> 86

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 類似物9

<400> 36

<210> 37

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 胰島素之A鏈

<400> 37

<210> 38

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 胰島素之B鏈

<400> 38

本案因所有圖皆為結果數據，故不指定代表圖。

Claims

一種胰島素類似物共軛物，其中，(i)該胰島素類似物具有相較於天然型而言減少的胰島素效價，其中，胰島素之B鏈中之胺基酸係藉由以丙胺酸取代B鏈之第25個胺基酸而進行修飾；(i)該胰島素類似物係經由(iii)非肽基連結子連結至(ii)免疫球蛋白Fc區域，其中，該非肽基連結子之兩末端分別連接至該胰島素類似物之B鏈之N-端和該免疫球蛋白Fc區域之N-端。
如申請專利範圍第1項所述之胰島素類似物共軛物，其中，該胰島素類似物係由SEQ ID NO.32所組成之群組。
如申請專利範圍第1項所述之胰島素類似物共軛物，其中，該非肽基連結子係選自由聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇-丙二醇共聚物、聚氧乙基化多元醇、聚乙烯醇、多醣、葡聚糖、聚乙烯基乙基醚、生物可降解性聚合物、脂肪聚合物、幾丁質、玻尿酸及其組合所組成之群組。
如申請專利範圍第3項所述之胰島素類似物共軛物，其中，該非肽基聚合物之兩末端係分別連結至該免疫球蛋白Fc區域之N-端胺基以及該胰島素類似物之B鏈之N-端胺基。
如申請專利範圍第3項所述之胰島素類似物共軛物，其中，該免疫球蛋白Fc區域係無醣基化。
如申請專利範圍第3項所述之胰島素類似物共軛物，其中，該免疫球蛋白Fc區域係由選自由CH1、CH2、CH3及CH4結構域所組成之群組之1個結構域至4個結構域所構成。
如申請專利範圍第3項所述之胰島素類似物共軛物，其中，該免疫球蛋白Fc區域係衍生自IgG、IgA、IgD、IgE或IgM之Fc區域。
如申請專利範圍第7項所述之胰島素類似物共軛物，其中，該免疫球蛋白Fc區域之各結構域為具有不同起源且衍生自選自由IgG、IgA、IgD、IgE及IgM所組成之群組之免疫球蛋白的結構域之雜合物。
如申請專利範圍第3項所述之胰島素類似物共軛物，其中，該免疫球蛋白Fc區域係進一步包含絞鏈區域(hinge region)。
如申請專利範圍第7項所述之胰島素類似物共軛物，其中，該免疫球蛋白Fc區域為由單鏈免疫球蛋白所組成之二聚體或多聚體，該單鏈免疫球蛋白係由相同起源的結構域所構成。
如申請專利範圍第7項所述之胰島素類似物共軛物，其中，該免疫球蛋白Fc區域為IgG4 Fc區域。
如申請專利範圍第11項所述之胰島素類似物共軛物，其中，該免疫球蛋白Fc區域為人類IgG4衍生之無醣基化Fc區域。
如申請專利範圍第3項所述之胰島素類似物共軛物，其中，該非肽基連結子之反應性基係選自由乙醛基、丙醛基、丁醛基、順丁烯二醯亞胺基及琥珀醯亞胺衍生物所組成之群組。
如申請專利範圍第13項所述之胰島素類似物共軛物，其中，該琥珀醯亞胺衍生物為琥珀醯亞胺丙酸酯、琥珀醯亞胺基羧甲基、羥基琥珀醯亞胺基、或琥珀醯亞胺碳酸酯。
如申請專利範圍第3項所述之胰島素類似物共軛物，其中，該非肽基連結子在其兩末端具有反應性醛基。
一種長效胰島素調配物，係具有增進的活體內持續時間及安定性，其包括如申請專利範圍第1項所述之胰島素類似物共軛物。
如申請專利範圍第16項所述之長效胰島素調配物，其中，該調配物為糖尿病之治療劑。
一種製備如申請專利範圍第1項所述之胰島素類似物共軛物之方法，包括：將該具有相較於天然型而言減少的胰島素效價之胰島素類似物經由非肽基連接子連結至免疫球蛋白Fc區域，其中，該胰島素之B鏈中之胺基酸係藉由以丙胺酸取代B鏈之第25個胺基酸而進行修飾，該非肽基連結子之兩末端分別連接至該胰島素類似物之B鏈之N-端和該免疫球蛋白Fc區域之N-端。