BR112019016077A2 - Conjugado da fórmula 1, método para preparar o conjugado, preparação de atuação longa, preparação para prevenir ou tratar diabetes e método para tratar diabetes - Google Patents

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Abstract

a presente invenção se refere a um conjugado que inclui um material fisiologicamente ativo, um ligante e um material com capacidade de aumentar meia-vida in vivo do material fisiologicamente ativo, um método para preparar o mesmo e uma preparação do mesmo.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para “CONJUGADO DA FÓRMULA 1, MÉTODO PARA PREPARAR O CONJUGADO, PREPARAÇÃO DE ATUAÇÃO LONGA, PREPARAÇÃO PARA PREVENIR OU TRATAR DIABETES E MÉTODO PARA TRATAR DIABETES”
CAMPO DA TÉCNICA [001] A presente invenção refere-se a um conjugado que inclui um material fisiologicamente ativo, um ligante e um material com capacidade de aumentar a meiavida in vivo do material fisiologicamente ativo; um método para preparar o mesmo; e uma preparação do mesmo.
ANTECEDENTES DA TÉCNICA [002] Em geral, os polipeptídeos fisiologicamente ativos são facilmente desnaturados e degradados por proteases in vivo devido à sua estabilidade insatisfatória ou são removidos de modo relativamente fácil pelos rins devido a seu tamanho relativamente pequeno. Consequentemente, para manter sua concentração e titulação sanguíneas, é necessário que fármacos proteicos contendo esses polipeptídeos fisiologicamente ativos como ingredientes farmacêuticos sejam administrados mais frequentemente aos pacientes. Entretanto, no caso de fármacos proteicos normalmente administrados aos pacientes na forma de injeções, a administrada frequente por meio de injeções é necessária para manter a concentração sanguínea dos polipeptídeos fisiologicamente ativos, o que causa dor aos pacientes e também incorre altos custos de tratamento. Para solucionar esses problemas, muitos esforços têm sido realizados para maximizar a eficácia de fármacos proteicos aumentando-se sua estabilidade sanguínea enquanto é mantida sua concentração sanguínea em um alto nível por um longo período de tempo.
[003] Entretanto, a insulina é um hormônio de controle de nível de glicose no sanguínea secretado pelo pâncreas do corpo humano e serve para manter os níveis de glicose sanguínea dentro de uma faixa normal enquanto transporta a glicose em excesso no sangue para as células, fornecendo, assim, uma fonte de energia para as células. Entretanto, os pacientes diabéticos não podem manter funções de insulina normais devido à deficiência de insulina, resistência à insulina ou perda de função de célula beta,
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2/67 e, assim, a glicose no sangue não pode ser usada como uma fonte de energia. Como resultado, pacientes diabéticos mostram um sintoma de altos níveis de glicose sanguínea chamado hiperglicemia e, eventualmente, excretam glicose na urina, o que está associado a diversas complicações.
[004] Consequentemente, a terapia com insulina é essencial para pacientes diabéticos com incapacidade de produzir insulina (tipo I) ou com resistência à insulina (tipo II), e os níveis de glicose sanguínea desses pacientes diabéticos pode ser mantido em níveis normais por administração de insulina. Entretanto, como outras proteínas e hormônios peptídicos, a insulina tem uma meia-vida in vivo extremamente curta e, assim, tem uma desvantagem pelo fato de que precisa ser repetidamente administrada, e a administração frequente leva a dor intensa e inconveniência aos pacientes. Consequentemente, foram conduzidos estudos para desenvolver vários tipos de formulações de proteína, conjugados químicos (conjugados de ácido graxo e conjugados de polímero de polietileno), etc. de modo a melhorar a qualidade de vida dos pacientes reduzindo a frequência de administração por aumento da meia-vida in vivo dessas proteínas. Os exemplos de preparações de insulina de longa atuação atualmente no mercado incluem glargina, Lantus® (Sanofi-Aventis: cerca de 20 a 22 horas de duração); insulina detemir, Levemir® (Novo Nordisk: cerca de 18 a 22 horas de duração); e insulina degludeca, Tresiba® (cerca de 40 horas de duração). Essas preparações de insulina de longa duração são adequadas como insulina basal devido ao fato de que não há pico de concentração de insulina no sangue, mas ainda têm a inconveniência de exigir administração uma ou duas vezes ao dia devido ao fato de que sua meia-vida não é longa o suficiente. Consequentemente, há um limite para atingir o objetivo de aumentar a conveniência do paciente reduzindo-se significativamente a frequência de administração em pacientes diabéticos que exigem administração a longo prazo.
[005] Diversos trabalhos anteriores, tal como Authier F et al. (Biochem J. 1 de junho de 1998; 332 (Pt 2): 421 a 430), Duckworth WC et al. (Endocr Rev. outubro de 1998; 19(5): 608 a 624.) e Valera Mora ME et al. (J Am Coll Nutr. dezembro de 2003; 22(6): 487 a 93), descrevem o processo de remoção in vivo de insulina. Analisando esses trabalhos, sabe-se que mais de 50% da insulina é removido dos rins e a insulina restante
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3/67 é eliminada através de eliminação mediada por receptor (RMC) nos sítios alvo, tal como músculo, gordura, fígado, etc.
[006] Consequentemente, há uma necessidade crescente de desenvolvimento de preparações de material fisiologicamente ativo, em particular, preparações de insulina, que possam reduzir a frequência de administração em pacientes devido à meia-vida sanguínea significativamente aumentada enquanto ainda tem capacidade para evitar a RMC.
REVELAÇÃO
PROBLEMA DA TÉCNICA [007] Um objetivo da presente invenção é fornecer um conjugado de um material fisiologicamente ativo para o propósito de estender a meia-vida in vivo do material fisiologicamente ativo.
[008] Especificamente, a presente invenção destina-se a fornecer um conjugado de um material fisiologicamente ativo, em que um material fisiologicamente ativo e um material com capacidade de aumentar a meia-vida in vivo do material fisiologicamente ativo estão ligados através de polietilenoglicol, e o polietilenoglicol tem um tamanho maior que 0 kDa a menor que 3,4 kDa.
[009] Outro objetivo da presente invenção é fornecer uma composição que contém o conjugado.
[010] Especificamente, a presente invenção destina-se a fornecer uma preparação de longa atuação com duração in vivoe estabilidade aprimoradas contendo o conjugado. [011] Adicionalmente, a presente invenção destina-se a fornecer uma preparação para prevenir ou tratar diabetes contendo o conjugado.
[012] Ainda outro objetivo da presente invenção é fornecer um método para preparar o conjugado.
[013] Ainda outro objetivo da presente invenção é fornecer o uso do conjugado ou composição contendo o conjugado para uso na preparação de um medicamento.
SOLUÇÃO DA TÉCNICA [014] Para atingir os objetivos acima, um aspecto da presente invenção fornece um conjugado de um material fisiologicamente ativo para o propósito de estender a meia
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4/67 vida in vivo do material fisiologicamente ativo.
[015] E m uma modalidade específica, a presente invenção refere-se a um conjugado de um material fisiologicamente ativo, em que um material fisiologicamente ativo e um material com capacidade de aumentar a meia-vida in vivo do material fisiologicamente ativo estão ligados através de polietilenoglicol, e o polietilenoglicol tem um tamanho maior que 0 kDa a menor que 3,4 kDa.
[016] E m um conjugado de acordo com uma modalidade específica anterior, o conjugado é representado pela Fórmula 1 abaixo:
FÓRMULA 1
X-L-F em que:
X é um material fisiologicamente ativo;
L, que é um ligante, é polietilenoglicol que tem um tamanho maior que 0 kDa a menor que 3,4 kDa; e
F é um material com capacidade para aumentar a meia-vida in vivo do material fisiologicamente ativo.
[017] E m um conjugado de acordo com qualquer uma das modalidades específicas anteriores, o conjugado exibe uma meia-vida in vivo aumentada em comparação com um conjugado que apenas difere do conjugado pelo fato de que L é polietilenoglicol que tem um tamanho de 3,4 kDa.
[018] E m um conjugado de acordo com qualquer uma das modalidades específicas anteriores, L é polietilenoglicol que tem um tamanho maior que 0 kDa a 3 kDa ou menor. [019] E m um conjugado de acordo com qualquer uma das modalidades específicas anteriores, o material fisiologicamente ativo é um polipeptídeo fisiologicamente ativo.
[020] Em um conjugado de acordo com qualquer uma das modalidades específicas anteriores, o material fisiologicamente ativo selecionado a partir do grupo que consiste em toxinas; agonistas do receptor de peptídeo-1 semelhante a glucagon (GLP-1); agonistas do receptor de glucagon; agonistas do receptor de polipeptídeo inibidor gástrico (GIP); agonistas do receptor de fator de crescimento de fibroblasto (FGF); agonistas do receptor de colecistoquinina; agonistas do receptor de gastrina; agonistas
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5/67 do receptor de melanocortina; materiais que se ligam a dois ou mais receptores entre receptor de GLP, receptor de glucagon e receptor de GIP; somatostatina; peptídeo YY (PYY); neuropeptídeo Y (NPY); oxintomodulina; fator de crescimento de fibroblasto (FGF); bradiquinina; eledoisina; oxitocina; vasopressina; sermorelina; peptideos de eliminação de prolactina; orexina; peptideos de eliminação da tireoide; calmodulina; motilina; peptídeo intestinais vasoativos; peptideos natriuréticos atriais (ANP); peptideos natriuréticos do tipo C (CNP); neuroquinina A; neuromedina; renina; endotelina; peptideos de sarafotoxina; peptideos de carsomorfina; dermorfina; dinorfina; endorfina; encepalina; receptores do fator de necrose tumoral; receptores de uroquinase; timopoietina; timulina; timopentina; timosina; fatores humorais timicos; adrenomodulina; alatostatina; fragmentos de proteínas amiloides; peptideos antibióticos; peptideos antioxidantes; bombesina; osteocalcina; peptideos de CART; E-selectina; molécula de adesão intercelular 1 (ICAM-1); molécula de adesão de célula vascular 1 (VCAM-1); leucocina; kringle-5; laminina; inibina; galanina; fibronectina; pancreastatina; fuzeon; peptideos semelhantes a glucagon (GLP-1 ou GLP-2, etc.); receptores acoplados à proteína G; fatores de crescimento eritropoiéticos; leucopoietina; amilina; hormônio de crescimento humano; hormônio de eliminação de hormônio do crescimento; peptideos de eliminação de hormônio de crescimento; interferons; receptores de interferon; fatores estimulantes de colônias; interleucinas; receptores de interleucina; enzimas; proteínas de ligação de interleucina; proteínas de ligação de citocinas; fatores de ativação de macrófagos; peptideos de macrófagos; fatores de células B; fatores de células T; proteína A; fatores inibidores de alergia; glicoproteínas de necrose; imunotoxinas; linfotoxinas; fatores de necrose tumoral; supressores de tumor; fatores de crescimento de transformação; antitripsina a-1; albumina; a-lactalbumina; apolipoproteína-E; eritropoietina; eritropoietina com alto teor de glicosilato; angiopoietinas; hemoglobinas; trombina; peptideos de ativação de receptor de trombina; trombomodulina; fator sanguíneo VII; fator sanguíneo Vila; fator sanguíneo VIII; fator sanguíneo IX; fator sanguíneo XIII; ativadores de plasminogênio; peptideos de ligação de fibrina; uroquinase; estreptoquinase; hirudina; proteína C; proteína reativa a C; inibidores de renina; inibidores de colagenase; superóxido dismutase; leptina; fator de crescimento
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6/67 derivado de plaquetas; fator de crescimento epitelial; fator de crescimento epidérmico; angiostatina; angiotensina; fator de crescimento morfogenético ósseo; proteína morfogenética óssea; calcitonina; insulina; atriopeptina; fator de indução de cartilagem; elcatonina; fator de ativação de tecido conjuntivo; inibidor da via de fator de tecido; hormônio folículo-estimulante; hormônio luteinizante; hormônio de eliminação de hormônio luteinizante; fatores de crescimento de nervo; fator-1 de axogênese; peptídeo natriurético de cérebro; fator neurotrófico derivado de glial; netrina; fator inibidor de neutrófilo; fator neurotrófico; neurturina; hormônio da paratireoide; relaxina; secretina; somatomedina; fator de crescimento semelhante a insulina; hormônio adrenocortical; glucagon; colecistoquinina; polipeptídeos pancreáticos; peptídeos de eliminação de gastrina; peptídeos inibidores de gastrina; fator de eliminação de corticotropina; hormônio estimulante da tireoide; autotaxina; lactoferrina; miostatina; proteína neuroprotetora dependente de atividade (ADNP), β-secretasel (BACE1), proteína precursora amiloide (APP), molécula de adesão celular neural (NCAM), receptor amiloide β, tau, para produtos finais de glicação avançada (RAGE), α-sinucleína, ou agonistas ou antagonistas dos mesmos; receptores, agonistas de receptor; antígenos de superfície celular; anticorpo monoclonal; anticorpo policlonal; fragmentos de anticorpo; antígenos de vacina derivada de vírus; polipeptídeos híbridos ou polipeptídeos químicos que ativam pelo menos um agonista do receptor; e análogos dos mesmos.
[021] E m um conjugado de acordo com qualquer uma das modalidades específicas anteriores, o material fisiologicamente ativo ativa simultaneamente pelo menos dois receptores.
[022] Em um conjugado de acordo com qualquer uma das modalidades específicas anteriores, [023] a toxina é selecionada a partir do grupo que consiste em maitansina ou um derivado da mesma, auristatina ou um derivado da mesma, duocarmicina ou um derivado da mesma e pirrolobenzodiazepina (PBD) um derivado da mesma;
o agonista do receptor de peptídeo-1 semelhante ao glucagon (GLP-1) é selecionado a partir do grupo que consiste em peptídeo-1 semelhante ao glucagon nativo (GLP-1), exendina-3 nativa, exendina-4 nativa e análogos dos mesmos;
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7/67 o agonista do receptor de FGF é selecionado a partir do grupo que consiste em FGF1 ou um análogo da mesma, FGF19 ou um análogo da mesma, FGF21 ou um análogo da mesma e FGF23 ou um análogo da mesma;
o interferon é selecionado a partir do grupo que consiste em interferon-a, interferon-β e interferon-γ;
o receptor de interferon é selecionado a partir do grupo que consiste em receptor de interferon-α, receptor de interferon-β, receptor de interferon-γ e receptores de interferon do tipo I solúvel;
a interleucina é selecionada a partir do grupo que consiste em interleucina-1, interleucina-2, interleucina-3, interleucina-4, interleucina-5, interleucina-6, interleucina-7, interleucina-8, interleucina-13, interleucina-18, interleucina-23, interleucina-9, interleucina-14, interleucina-19, interleucina-24, interleucina-10, interleucina-15, interleucina-20, interleucina-25, interleucina-11, interleucina-16, interleucina-21, interleucina-26, interleucina-12 interleucina-17 interleucina-22 interleucina-27 interleucina-28, interleucina-29 e interleucina-30;
o receptor de interleucina é receptor de interleucina-1 ou receptor de interleucina-4;
a enzima é selecionada a partir do grupo que consiste em β-glicosidase, agalactosidase, β-galactosidase, iduronidase, iduronato-2-sulfatase, galactose-6sulfatase, α-glicosidase ácida, ceramidase ácida, esfingomielinase ácida, galactocerebrosidase, arilsulfatase A, arilsulfatase B, β-hexosaminidase A, βhexosaminidase B, heparina ΛΖ-sulfatase, a-D-manosidase, β-glucuronidase, Nacetilgalactosamina-6 sulfatase, lipase ácida lisossoma, a-A/-acetil-glucosaminidase, glucocerebrosidase, butirilcolinesterase, quitinase, glutamato descarboxilase, imiglucerase, lipase, uricase, acetil-hidrolase de fator de ativação de plaqueta, endopeptidase neutra, mieloperoxidase, α-galactosidase-A, agalsidase a, agalsidase β, α-L-iduronidase, butirilcolinesterase, quitinase, glutamato descarboxilase e imiglucerase;
a proteína de ligação de interleucina é IL-18bp;
a proteína de ligação de citocina é proteína de ligação de fator de necrose tumoral (TNF);
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8/67 os fatores de crescimento de nervo são selecionados a partir do grupo que consiste em fator de crescimento de nervo, fator neurotrófico ciliar, fator-1 de axogênese, peptídeo natriurético de cérebro, fator neurotrófico derivado de glial, netrina, fator inibidor de neutrófilo, fator neurotrófico e neurturina;
o receptor de miostatina é selecionado a partir do grupo que consiste em TNFR (P75), TNFR (P55), receptor de IL-1, receptor de VEGF e receptor de fator de ativação de célula B;
o antagonista do receptor de miostatina é IL1 -Ra;
o antígeno de superfície celular é selecionado a partir do grupo que consiste em CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD11a, CD11b, CD18, CD19, CD20, CD23, CD25, CD33, CD38, CD40, CD45 e CD69; e os fragmentos de anticorpo são selecionados a partir do grupo que consiste em scFv, Fab, Fab', F(ab')2 e Fd.
[024] Em um conjugado de acordo com qualquer uma das modalidades específicas anteriores, o material fisiologicamente ativo é exendina-3 nativa ou um análogo da mesma; exendina-4 nativa ou um análogo da mesma; insulina nativa ou um análogo da mesma; GLP-1 nativo ou um análogo do mesmo; GLP-2 nativo ou um análogo do mesmo; oxintomodulina nativa ou um análogo da mesma; glucagon nativo ou um análogo do mesmo; fator de crescimento de fibroblasto nativo ou um análogo do mesmo; grelina nativa ou um análogo da mesma; calcitonina nativa ou um análogo da mesma; fator de estimulação de colônia de granulócito nativo ou um análogo do mesmo; ou um material que se liga a dois ou mais receptores entre um receptor de GLP, um receptor de glucagon e um receptor de GIP.
[025] E m um conjugado de acordo com qualquer uma das modalidades específicas anteriores, o material fisiologicamente ativo é insulina nativa ou um análogo de insulina que tem uma afinidade de ligação reduzida para um receptor de insulina em comparação com insulina nativa.
[026] Em um conjugado de acordo com qualquer uma das modalidades específicas anteriores, o análogo de insulina está em uma forma de duas cadeias que inclui tanto a cadeia A quanto a cadeia B.
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9/67 [027] E m um conjugado de acordo com qualquer uma das modalidades específicas anteriores, o análogo de insulina tem uma afinidade de ligação reduzida para um receptor de insulina em comparação com insulina nativa e inclui pelo menos uma deleção ou modificação de aminoácido na cadeia A ou cadeia B de insulina nativa.
[028] Em um conjugado de acordo com qualquer uma das modalidades específicas anteriores, o análogo de insulina é um análogo de insulina em que pelo menos um aminoácido, selecionado a partir do grupo que consiste no 12 aminoácido, no 22 aminoácido, no 32 aminoácido, no 52 aminoácido, no 82 aminoácido, no 102 aminoácido, no 122 aminoácido, no 162 aminoácido, no 232 aminoácido, no 242 aminoácido, no 252 aminoácido, no 262 aminoácido, no 272 aminoácido, no 282 aminoácido, no 292 aminoácido e no 302 aminoácido da cadeia B de insulina e no 12 aminoácido, no 22 aminoácido, no 52 aminoácido, no 82 aminoácido, no 102 aminoácido, no 122aminoácido, no 142 aminoácido, no 162 aminoácido, no 172 aminoácido, no 182 aminoácido, no 192 aminoácido e no 212 aminoácido da cadeia A de insulina, é substituído por um aminoácido diferente ou deletado.
[029] Em um conjugado de acordo com qualquer uma das modalidades específicas anteriores, o análogo de insulina é um análogo de insulina, em que pelo menos um aminoácido, selecionado a partir do grupo que consiste no 82 aminoácido, no 232 aminoácido, no 242 aminoácido e no 252 aminoácido da cadeia B de insulina nativa e no 12 aminoácido, no 22 aminoácido, no 142 aminoácido e no 192 aminoácido da cadeia A de insulina nativa, é substituído por um aminoácido diferente.
[030] Em um conjugado de acordo com qualquer uma das modalidades específicas anteriores, o aminoácido diferente substituinte é selecionado a partir do grupo que consiste em alanina, ácido glutâmico, asparagina, isoleucina, valina, glutamina, glicina, lisina, histidina, cisteína, fenilalanina, triptofano, prolina, serina, treonina e ácido aspártico.
[031] E m um conjugado de acordo com qualquer uma das modalidades específicas anteriores, o análogo de insulina tem uma afinidade de ligação reduzida para um receptor de insulina devido a uma deleção em pelo menos um aminoácido da cadeia A ou cadeia B de insulina nativa.
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10/67 [032] Em um conjugado de acordo com qualquer uma das modalidades específicas anteriores, o análogo de insulina inclui a cadeia A de SEQ ID NO: 3 representada pela Fórmula Geral 1 abaixo e a cadeia B de SEQ ID NO: 4 representada pela Fórmula Geral 2 abaixo (com a condição de que, entre os análogos de insulina acima, aqueles análogos de insulina em que a cadeia A coincide com a SEQ ID NO: 1 e simultaneamente a cadeia B coincide com a SEQ ID NO: 2 são excluídos):
FÓRMULA GERAL 1 [033] Xaa1 -Xaa2-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-lle-Cys-Ser-Leu-Xaa14-Gln-LeuGlu-Asn-Xaa19-Cys-Asn (SEQ ID NO: 3).
[034] em que, na Fórmula Geral 1 acima,
Xaa1 é glicina ou alanina;
Xaa2 é isoleucina ou alanina;
Xaa14 é tirosina, ácido glutâmico ou asparagina; e
Xaa19 é tirosina ou alanina; e
FÓRMULA GERAL 2
Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Xaa8-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-LeuVal-Cys-Gly-Glu-Arg-Xaa23-Xaa24-Xaa25-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr (SEQ ID NO: 4).
na Fórmula Geral 2 acima,
Xaa8 é glicina ou alanina;
Xaa23 é glicina ou alanina;
Xaa24 é fenilalanina ou alanina; e
Xaa25 é fenilalanina ou alanina.
[035] Em um conjugado de acordo com qualquer uma das modalidades específicas anteriores, [036] o análogo de insulina é caracterizado por incluir:
(i) a cadeia A de Fórmula Geral 1 acima em que Xaa1 é alanina, Xaa2 é isoleucina, Xaa14 é tirosina, e Xaa19 é tirosina, e a cadeia B de Fórmula Geral 2, em que Xaa8 é glicina, Xaa23 é glicina, Xaa24 é fenilalanina, e Xaa25 é fenilalanina;
(ii) a cadeia A de Fórmula Geral 1, em que Xaa1 é glicina, Xaa2 é alanina, Xaa14 é tirosina, e Xaa19 é tirosina, e a cadeia B de Fórmula Geral 2, em que Xaa8 é
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11/67 glicina, Xaa23 é glicina, Xaa24 é fenilalanina, e Xaa25 é fenilalanina;
(iii) a cadeia A de Fórmula Geral 1, em que Xaa1 é glicina, Xaa2 é isoleucina, Xaa14 é ácido glutâmico ou asparagina, e Xaa19 é tirosina, e a cadeia B de Fórmula Geral 2, em que Xaa8 é glicina, Xaa23 é glicina, Xaa24 é fenilalanina, e Xaa25 é fenilalanina;
(iv) a cadeia A de Fórmula Geral 1, em que Xaa1 é glicina, Xaa2 é isoleucina, Xaa14 é tirosina, e Xaa19 é alanina, e a cadeia B de Fórmula Geral 2, em que Xaa8 é glicina, Xaa23 é glicina, Xaa24 é fenilalanina, e Xaa25 é fenilalanina;
(v) a cadeia A de Fórmula Geral 1, em que Xaa1 é glicina, Xaa2 é isoleucina, Xaa14 é tirosina, e Xaa19 é tirosina, e a cadeia B de Fórmula Geral 2, em que Xaa8 é alanina, Xaa23 é glicina, Xaa24 é fenilalanina, e Xaa25 é fenilalanina;
(vi) a cadeia A de Fórmula Geral 1, em que Xaa1 é glicina, Xaa2 é isoleucina, Xaa14 é tirosina, e Xaa19 é tirosina, e a cadeia B de Fórmula Geral 2, em que Xaa8 é glicina, Xaa23 é alanina, Xaa24 é fenilalanina, e Xaa25 é fenilalanina;
(vii) a cadeia A de Fórmula Geral 1, em que Xaa1 é glicina, Xaa2 é isoleucina, Xaa14 é tirosina, e Xaa19 é tirosina, e a cadeia B de Fórmula Geral 2, em que Xaa8 é glicina, Xaa23 é glicina, Xaa24 é alanina, e Xaa25 é fenilalanina; e (viii) a cadeia A de Fórmula Geral 1, em que Xaa1 é glicina, Xaa2 é isoleucina, Xaa14 é tirosina, e Xaa19 é tirosina, e a cadeia B de Fórmula Geral 2, em que Xaa8 é glicina, Xaa23 é glicina, Xaa24 é fenilalanina, e Xaa25 é alanina.
[037] E m um conjugado de acordo com qualquer uma das modalidades específicas anteriores, o análogo de insulina é caracterizado por incluir a cadeia A de SEQ ID NO: 5 representada pela Fórmula Geral 3 abaixo e a cadeia B de SEQ ID NO: 6 representada pela Fórmula Geral 4 abaixo (com a condição de que, entre os análogos de insulina acima, aqueles análogos de insulina em que a cadeia A coincide com a SEQ ID NO: 1 e simultaneamente a cadeia B coincide com a SEQ ID NO: 2 são excluídos):
FÓRMULA GERAL 3
Xaa1 -Ile-Val-Glu-Xaa5-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Xaa12-Leu-Xaa14-GlnXaa16-Glu-Asn-Xaa19-Cys-Xaa21 (SEQ ID NO: 5).
em que, na Fórmula Geral 3 acima,
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12/67
Xaa1 é alanina, glicina, glutamina, histidina, ácido glutâmico ou asparagina,
Xaa5 é alanina, ácido glutâmico, glutamina, histidina ou asparagina,
Xaa12 é alanina, serina, glutamina, ácido glutâmico, histidina ou asparagina,
Xaa14 é alanina, tirosina, ácido glutâmico, histidina, lisina, ácido aspártico ou asparagina,
Xaa16 é alanina, leucina, tirosina, histidina, ácido glutâmico ou asparagina,
Xaa19 é alanina, tirosina, serina, ácido glutâmico, histidina, treonina ou asparagina, e
Xaa21 é asparagina, glicina, histidina ou alanina; e
FÓRMULA GERAL 4
Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Xaa16-LeuVal-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Xaa25-Tyr-Xaa27-Xaa28-Lys-Thr (SEQ ID NO: 6).
na Fórmula Geral 4 acima,
Xaa16 é tirosina, ácido glutâmico, serina, treonina ou ácido aspártico ou está ausente,
Xaa25 é fenilalanina, ácido aspártico ou ácido glutâmico ou está ausente,
Xaa27 é treonina ou está ausente, e
Xaa28 é prolina, ácido glutâmico ou ácido aspártico, ou está ausente.
[038] Em um conjugado de acordo com qualquer uma das modalidades específicas anteriores, o análogo de insulina é caracterizado pelo fato de que:
na Fórmula Geral 3 acima, Xaa1 é glicina, Xaa5 é glutamina, Xaa12 é serina, Xaa14 é ácido glutâmico ou asparagina, Xaa16 é leucina, Xaa19 é tirosina, e Xaa21 é asparagina; e na Fórmula Geral 4 acima, Xaa16 é tirosina, Xaa25 é fenilalanina ou está ausente, Xaa27 é treonina, Xaa28 é prolina, ácido glutâmico, ou ácido aspártico, ou está ausente, mas o análogo de insulina não é particularmente limitado ao mesmo.
[039] Em um conjugado de acordo com qualquer uma das modalidades específicas anteriores, o análogo de insulina é caracterizado pelo fato de que:
(1) na cadeia A de insulina de SEQ ID NO: 5, Xaa1 é glicina, Xaa5 é glutamina, Xaa12 é serina, Xaa14 é ácido glutâmico, Xaa16 é leucina, Xaa19 é tirosina, e Xaa21 é
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13/67 asparagina; e na cadeia B de insulina de SEQ ID NO: 6, Xaa16 é tirosina, Xaa25 é fenilalanina, Xaa27 é treonina, Xaa28 é prolina, ácido glutâmico ou ácido aspártico, ou está ausente;
(2) na cadeia A de insulina de SEQ ID NO: 5, Xaa1 é glicina, Xaa5 é glutamina, Xaa12 é serina, Xaa14 é asparagina, Xaa16 é leucina, Xaa19 é tirosina, e Xaa21 é asparagina; e na cadeia B de insulina de SEQ ID NO: 6, Xaa16 é tirosina, Xaa25 é fenilalanina, Xaa27 é treonina, Xaa28 é prolina, ácido glutâmico ou ácido aspártico, ou está ausente;
(3) na cadeia A de insulina de SEQ ID NO: 5, Xaa1 é glicina, Xaa5 é glutamina, Xaa12 é serina, Xaa14 é ácido glutâmico, Xaa16 é leucina, Xaa19 é tirosina, e Xaa21 é asparagina; e, na cadeia B de insulina de SEQ ID NO: 6, Xaa16 é tirosina, Xaa25 está ausente, Xaa27 é treonina, Xaa28 é prolina, ácido glutâmico ou ácido aspártico, ou está ausente; ou (4) na cadeia A de insulina de SEQ ID NO: 5, Xaa1 é glicina, Xaa5 é glutamina, Xaa12 é serina, Xaa14 é alanina, Xaa16 é leucina, Xaa19 é tirosina, Xaa21 é asparagina; e, na cadeia B de insulina de SEQ ID NO: 6, Xaa16 é ácido glutâmico, Xaa25 está ausente, Xaa27 é treonina, Xaa28 é prolina, ácido glutâmico ou ácido aspártico, ou está ausente.
[040] Em um conjugado de acordo com qualquer uma das modalidades específicas anteriores, o análogo de insulina é caracterizado pelo fato de que:
(1) na Fórmula Geral 3 acima, Xaa1 é glicina, Xaa5 é glutamina, Xaa12 é serina, Xaa14 é ácido glutâmico, Xaa16 é leucina, Xaa19 é tirosina, e Xaa21 é asparagina; e na Fórmula Geral 4 acima, Xaa16 é tirosina, Xaa25 está ausente, Xaa27 é treonina, e Xaa28 é prolina;
(2) na Fórmula Geral 3 acima, Xaa1 é glicina, Xaa5 é glutamina, Xaa12 é
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14/67 serina, Xaa14 é alanina, Xaa16 é leucina, Xaa19 é tirosina, e Xaa21 é asparagina; e na Fórmula Geral 4 acima, Xaa16 é ácido glutâmico, Xaa25 está ausente,
Xaa27 é treonina, e Xaa28 é prolina;
(3) na Fórmula Geral 3 acima, Xaa1 é glicina, Xaa5 é glutamina, Xaa12 é serina, Xaa14 é histidina, Xaa16 é leucina, Xaa19 é tirosina, e Xaa21 é asparagina; e na Fórmula Geral 4 acima, Xaa16 é tirosina, Xaa25 é fenilalanina, Xaa27 é treonina, e Xaa28 é prolina;
(4) na Fórmula Geral 3 acima, Xaa1 é glicina, Xaa5 é glutamina, Xaa12 é serina, Xaa14 é lisina, Xaa16 é leucina, Xaa19 é tirosina, e Xaa21 é asparagina; e na Fórmula Geral 4 acima, Xaa16 é tirosina, Xaa25 é fenilalanina, Xaa27 é treonina, e Xaa28 é prolina;
(5) na Fórmula Geral 3 acima, Xaa1 é glicina, Xaa5 é glutamina, Xaa12 é serina, Xaa14 é tirosina, Xaa16 é leucina, Xaa19 é ácido glutâmico, e Xaa21 é asparagina; e na Fórmula Geral 4 acima, Xaa16 é tirosina, Xaa25 é fenilalanina, Xaa27 é treonina, e Xaa28 é prolina;
(6) na Fórmula Geral 3 acima, Xaa1 é glicina, Xaa5 é glutamina, Xaa12 é serina, Xaa14 é tirosina, Xaa16 é leucina, Xaa19 é serina, e Xaa21 é asparagina; e na Fórmula Geral 4 acima, Xaa16 é tirosina, Xaa25 é fenilalanina, Xaa27 é treonina, e Xaa28 é prolina;
(7) na Fórmula Geral 3 acima, Xaa1 é glicina, Xaa5 é glutamina, Xaa12 é serina, Xaa14 é tirosina, Xaa16 é leucina, Xaa19 é treonina, e Xaa21 é asparagina; e na Fórmula Geral 4 acima, Xaa16 é tirosina, Xaa25 é fenilalanina, Xaa27 é treonina, e Xaa28 é prolina;
(8) na Fórmula Geral 3 acima, Xaa1 é glicina, Xaa5 é glutamina, Xaa12 é serina, Xaa14 é tirosina, Xaa16 é leucina, Xaa19 é tirosina, e Xaa21 é asparagina; e na Fórmula Geral 4 acima, Xaa16 é ácido glutâmico, Xaa25 é fenilalanina, Xaa27 é treonina, e Xaa28 é prolina;
(9) na Fórmula Geral 3 acima, Xaa1 é glicina, Xaa5 é glutamina, Xaa12 é serina, Xaa14 é tirosina, Xaa16 é leucina, Xaa19 é tirosina, e Xaa21 é asparagina; e
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15/67 na Fórmula Geral 4 acima, Xaa16 é serina, Xaa25 é fenilalanina, Xaa27 é treonina, e Xaa28 é prolina;
(10) na Fórmula Geral 3 acima, Xaa1 é glicina, Xaa5 é glutamina, Xaa12 é serina, Xaa14 é tirosina, Xaa16 é leucina, Xaa19 é tirosina, e Xaa21 é asparagina; e na Fórmula Geral 4 acima, Xaa16 é treonina, Xaa25 é fenilalanina, Xaa27 é treonina, e Xaa28 é prolina;
(11) na Fórmula Geral 3 acima, Xaa1 é glicina, Xaa5 é glutamina, Xaa12 é serina, Xaa14 é alanina, Xaa16 é leucina, Xaa19 é tirosina, e Xaa21 é asparagina; e na Fórmula Geral 4 acima, Xaa16 é tirosina, Xaa25 é fenilalanina, Xaa27 é treonina, e Xaa28 é prolina;
(12) na Fórmula Geral 3 acima, Xaa1 é glicina, Xaa5 é glutamina, Xaa12 é serina, Xaa14 é ácido aspártico, Xaa16 é leucina, Xaa19 é tirosina, e Xaa21 é asparagina; e na Fórmula Geral 4 acima, Xaa16 é tirosina, Xaa25 é fenilalanina, Xaa27 é treonina, e Xaa28 é prolina;
(13) na Fórmula Geral 3 acima, Xaa1 é glicina, Xaa5 é glutamina, Xaa12 é serina, Xaa14 é tirosina, Xaa16 é leucina, Xaa19 é tirosina, e Xaa21 é asparagina; e na Fórmula Geral 4 acima, Xaa16 é ácido aspártico, Xaa25 é fenilalanina, Xaa27 é treonina, e Xaa28 é prolina;
(14) na Fórmula Geral 3 acima, Xaa1 é glicina, Xaa5 é glutamina, Xaa12 é serina, Xaa14 é tirosina, Xaa16 é leucina, Xaa19 é tirosina, e Xaa21 é asparagina; e na Fórmula Geral 4 acima, Xaa16 é tirosina, Xaa25 é ácido aspártico, Xaa27 é treonina, e Xaa28 é prolina; ou (15) na Fórmula Geral 3 acima, Xaa1 é glicina, Xaa5 é glutamina, Xaa12 é serina, Xaa14 é tirosina, Xaa16 é leucina, Xaa19 é tirosina, e Xaa21 é asparagina; e na Fórmula Geral 4 acima, Xaa16 é tirosina, Xaa25 é ácido glutâmico, Xaa27 é treonina, e Xaa28 é prolina.
[041] E m um conjugado de acordo com qualquer uma das modalidades específicas anteriores, o conjugado é representado pela Fórmula 2 abaixo:
FÓRMULA 2
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16/67
X-L-F em que na Fórmula 2 acima,
X é insulina nativa ou um análogo de insulina com uma afinidade de ligação reduzida para um receptor de insulina em comparação com insulina nativa;
L, que é um ligante, é polietilenoglicol que tem um tamanho maior que 0 kDa a menor que 3,4 kDa; e
F é um material com capacidade para aumentar a meia vida in vivo de X.
[042] Em um conjugado de acordo com qualquer uma das modalidades específicas anteriores, o conjugado representado pela Fórmula 2 acima tem eliminação mediada por receptor reduzida (RMC).
[043] Em um conjugado de acordo com qualquer uma das modalidades específicas anteriores, na Fórmula 2 acima, L é ligado a uma região terminal amino de cadeia beta de X, que é insulina nativa ou um análogo da mesma.
[044] Em um conjugado de acordo com qualquer uma das modalidades específicas anteriores, X e F estão ligados um ao outro através de L por uma ligação química covalente, uma ligação química não covalente ou uma combinação dos mesmos.
[045] Em um conjugado de acordo com qualquer uma das modalidades específicas anteriores, o material com capacidade de aumentar a meia-vida in vivo do material fisiologicamente ativo é um material biocompatível.
[046] Em um conjugado, de acordo com qualquer uma das modalidades específicas anteriores, F é selecionado a partir do grupo que consiste em polímeros, ácidos graxos, colesterol, albumina e um fragmento dos mesmos, materiais de ligação a albumina, um polímero de unidades de repetição de uma sequência de aminoácido particular, anticorpos, fragmentos de anticorpo, materiais de ligação a FcRn, tecidos conectivos in vivo, nucleotídeos, fibronectina, transferina, sacarídeos, heparina e elastina.
[047] E m um conjugado de acordo com qualquer uma das modalidades específicas anteriores, o polímero ser selecionado a partir do grupo que consiste em polietileno glicol, polipropileno glicol, um copolimero de etileno glicol-propileno glicol, poliol polioxietilado, álcool polivinílico, um polissacarídeo, dextrano, éter polivinil etílico, um polímero biodegradável, um polímero de lipídio, quitinas, ácido hialurônico, um oligonucleotídeo e
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17/67 uma combinação dos mesmos.
[048] Em um conjugado de acordo com qualquer uma das modalidades específicas anteriores, o material de ligação a FcRn é um polipeptídeo que inclui uma região Fc de imunoglobulina.
[049] Em um conjugado de acordo com qualquer uma das modalidades específicas anteriores, F é uma região Fc de IgG.
[050] Em um conjugado de acordo com qualquer uma das modalidades específicas anteriores, na Fórmula 1 ou Fórmula 2 acima, F é uma região Fc de IgG, e L é ligado à região N-terminal de F.
[051] Outro aspecto da presente invenção fornece um método para preparar o conjugado.
[052] E m uma modalidade específica, a presente invenção refere-se a um método para preparar um conjugado, que inclui:
reagir polietilenoglicol, que tem um tamanho maior que 0 kDa a menor que 3,4 kDa e pelo menos dois grupos funcionais terminais, com qualquer um dentre um material fisiologicamente ativo ou um material com capacidade de aumentar a meia-vida in vivo do material fisiologicamente ativo para preparar polietilenoglicol, ao qual um dentre o material fisiologicamente ativo ou o material com capacidade de aumentar a meia-vida in vivo do material fisiologicamente ativo está covalentemente ligado e que tem pelo menos um grupo funcional terminal; e reativar o polietilenoglicol, ao qual um dentre o material fisiologicamente ativo ou o material com capacidade de aumentar a meia-vida in vivo do material fisiologicamente ativo está ligado covalentemente e que tem pelo menos um grupo funcional terminal, preparado na etapa (a) com o outro dentre um material fisiologicamente ativo ou um material com capacidade de aumentar a meia-vida in vivo do material fisiologicamente ativo para preparar um conjugado, em que o material fisiologicamente ativo e um material com capacidade de aumentar a meia-vida in vivo do material fisiologicamente ativo estão ligados covalentemente através de polietilenoglicol que tem um tamanho maior que 0 kDa a menor que 3,4 kDa.
[053] Em um método de acordo com a modalidade específica anterior, o material
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18/67 fisiologicamente ativo tem um grupo funcional que forma uma ligação covalente com um grupo funcional terminal de polietilenoglicol, e o grupo funcional é um grupo amina ou um grupo tiol.
[054] Em um método de acordo com qualquer uma das modalidades específicas anteriores, o material com capacidade de aumentar a meia-vida in vivo de um material fisiologicamente ativo tem um grupo funcional que forma uma ligação covalente por reação com um grupo funcional terminal de polietilenoglicol, e o grupo funcional é um grupo amina ou um grupo tiol.
[055] Em um método de acordo com qualquer uma das modalidades específicas anteriores, o grupo funcional terminal de polietilenoglicol é um grupo funcional reativo a amina ou um grupo funcional reativo a tiol.
[056] In a método de acordo com qualquer uma das modalidades específicas anteriores, o grupo funcional terminal de polietilenoglicol é selecionado a partir do grupo que consiste em aldeído, maleimida, succinimida, vinilsulfona, tiol, dissulfeto de C6-20 arila, dissulfeto de C5-20 heteroarila e acetamida halogenada.
[057] E m um método de acordo com qualquer uma das modalidades específicas anteriores, 0 grupo funcional terminal de polietilenoglicol é selecionado a partir do grupo que consiste em aldeído, maleimida, succinimida, vinilsulfona, tiol, dissulfeto de ortopiridila e iodoacetamida.
[058] Em um método de acordo com qualquer uma das modalidades específicas anteriores, a succinimida é valerato de succinimidila, metilbutanoato de succinimidila, metilpropionato de succinimidila, butanoato de succinimidila, propionato de succinimidila, /V-hidroxissuccinimida, succinimidil carboximetila ou carbonato de succinimidila.
[059] Ainda outro aspecto da presente invenção refere-se a uma preparação de insulina de atuação longa com duração in vivo e estabilidade contendo 0 conjugado.
[060] Ainda outro aspecto da presente invenção refere-se a uma preparação para prevenir ou tratar diabetes contendo 0 conjugado.
[061] Ainda outro aspecto da presente invenção refere-se a um método para tratar doenças relacionadas à insulina que inclui administrar 0 conjugado representado pela Fórmula 2 ou uma composição ou uma preparação contendo 0 conjugado a um indivíduo
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19/67 que precisa do mesmo.
EFEITOS VANTAJOSOS [062] O conjugado do material fisiologicamente ativo de acordo com a presente invenção pode ser eficazmente usado em campos em que a atividade fisiológica correspondente é necessária.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS [063] A Figura 1 mostra os resultados de SDS-PAGE em relação a um conjugado de insulina-PEG de 3,4 kDa-fragmento Fc de imunoglobulina.
[064] A Figura 2 mostra os resultados de SDS-PAGE em relação a um conjugado de insulina-PEG de 1 kDa-fragmento Fede imunoglobulina.
[065] A Figura 3 mostra os resultados de cromatografia líquida de alto desempenho de exclusão de tamanho (SE-HPLC) em relação a cada um dentre os conjugados de insulina-PEG de 1,2, 2,5, 3, 3,4 kDa-fragmento Fc de imunoglobulina.
[066] A Figura 4 mostra os resultados de cromatografia líquida de alto desempenho de fase reversa (RP-HPLC) em relação a cada um dentre os conjugados de insulinaPEG de 1,2, 2,5, 3, 3,4 kDa-fragmento Fc de imunoglobulina.
[067] A Figura 5 mostra o gráfico de sobreposição de cromatografia em relação aos conjugados de insulina-PEG de 1,2, 2,5, 3, 3,4 kDa-fragmento Fc de imunoglobulina.
[068] A Figura 6 mostra os resultados de comparação de duração de eficácia em relação a conjugados de insulina de linga atuação de acordo com o comprimento de um ligante de PEG.
MELHOR MODO [069] A seguir, a presente invenção será descrita em mais detalhes.
[070] Entretanto, cada uma das explicações e modalidades exemplificativas reveladas no presente documento pode ser aplicada a suas respectivas outras explicações e modalidades exemplificativas. Isto é, todas as combinações de vários fatores reveladas no presente documento pertencem ao escopo da presente invenção. Adicionalmente, o escopo da presente invenção não deve ser limitado pela revelação específica fornecida doravante. Adicionalmente, uma pessoa comum versada na técnica será capaz de reconhecer ou confirmar usando não mais do que experimentos de rotina
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20/67 em relação a diversos equivalentes às modalidades específicas da invenção descrita na presente invenção. Adicionalmente, tais equivalentes devem estar incluídos na presente invenção.
[071] Por todo o relatório descritivo, os códigos convencionais de uma letra e três letras para aminoácidos são usados. Adicionalmente, os aminoácidos mencionados no presente documento são abreviados de acordo com as regras de nomenclatura do IUPAC-IUB.
[072] Um aspecto da presente invenção fornece um conjugado de um material fisiologicamente ativo para o propósito de estender a meia-vida in vivo do material fisiologicamente ativo.
[073] Especificamente, a presente invenção fornece um conjugado de um material fisiologicamente ativo, em que um material fisiologicamente ativo e um material com capacidade de aumentar a meia-vida in vivo do material fisiologicamente ativo estão ligados através de polietilenoglicol, e o polietilenoglicol tem um tamanho maior que 0 kDa a menor que 3,4 kDa.
[074] E m uma modalidade mais específica, a presente invenção fornece um conjugado da Fórmula 1 abaixo:
FÓRMULA 1
X-L-F em que
X é um material fisiologicamente ativo;
L, que é um ligante, é polietilenoglicol que tem um tamanho maior que 0 kDa a menor que 3,4 kDa; e
F é um material com capacidade para aumentar a meia-vida in vivo do material fisiologicamente ativo.
[075] Conforme usado no presente documento, o termo “conjugado representado pela Fórmula 1 acima” é usado de forma intercambiável com “conjugado de longa atuação”.
[076] Conforme usado no presente documento, o termo “conjugado de longa atuação” refere-se a um material fisiologicamente ativo que está ligado a um material
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21/67 com capacidade para estender a meia-vida in vivo do material fisiologicamente ativo, por exemplo, um material biocompatível, através de um ligante.
[077] O conjugado pode exibir uma meia-vida in vivo aumentada em comparação com um conjugado que apenas difere do conjugado pelo fato de que L é polietilenoglicol que tem um tamanho de 3,4 kDa, mas o conjugado não é particularmente limitado ao mesmo.
[078] Mais especificamente, o conjugado pode exibir uma afinidade de ligação reduzida para um receptor do material fisiologicamente ativo em comparação com um conjugado que tem o mesmo X e F que o conjugado, mas tem um L diferente, que é polietilenoglicol que tem um tamanho de 3,4 kDa, e pode exibir uma meia-vida sanguínea aumentada devido ao enfraquecimento de eliminação mediada por receptor (RMC), mas o conjugado não é particularmente limitado ao mesmo.
[079] Adicionalmente, além dos efeitos acima ou independentemente dos mesmos, o conjugado pode exibir substancialmente a mesma atividade que ou atividade maior em relação à atividade fisiológica do próprio X ou a atividade do próprio F em comparação com um conjugado que tem o mesmo X e F que o conjugado, mas tem um L diferente, que é polietilenoglicol que tem um tamanho de 3,4 kDa, mesmo se X e F estiverem presentes em estreita proximidade devido ao polietilenoglicol que se liga entre X e F e tem um tamanho menor que 3,4 kDa, mas o conjugado não é particularmente limitado ao mesmo.
[080] Na presente invenção, L, que é um ligante e uma porção química que constitui o conjugado, refere-se a polietilenoglicol que tem um tamanho maior que 0 kDa a menor que 3,4 kDa, e o mesmo inclui todos os polietilenoglicóis que têm um tamanho maior que 0 kDa a menor que 3,4 kDa, maior que 0 kDa a 3,3 kDa ou menor, maior que 0 kDa a
3,2 kDa ou menor, maior que 0 kDa a 3,1 kDa ou menor, maior que 0 kDa a 3,0 kDa ou menor, maior que 0 kDa a 2,9 kDa ou menor, maior que 0 kDa a 2,8 kDa ou menor, maior que 0 kDa a 2,7 kDa ou menor, maior que 0 kDa a 2,6 kDa ou menor, maior que 0 kDa a 2,5 kDa ou menor, maior que 0 kDa a 2,4 kDa ou menor, maior que 0 kDa a 2,3 kDa ou menor, maior que 0 kDa a 2,2 kDa ou menor, maior que 0 kDa a 2,1 kDa ou menor, maior que 0 kDa a 2,0 kDa ou menor, maior que 0 kDa a 1,9 kDa ou menor, maior que 0
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22/67 kDa a 1,8 kDa ou menor, maior que 0 kDa a 1,7 kDa ou menor, maior que 0 kDa a 1,6 kDa ou menor, maior que 0 kDa a 1,5 kDa ou menor, maior que 0 kDa a 1,4 kDa ou menor, maior que 0 kDa a 1,3 kDa ou menor, maior que 0 kDa a 1,2 kDa ou menor, maior que 0 kDa a 1,1 kDa ou menor, maior que 0 kDa a 1,0 kDa ou menor, maior ou igual a 0,5 kDa a menor que 3,4 kDa, maior ou igual a 0,5 kDa a 3,3 kDa ou menor, maior ou igual a 0,5 kDa a 3,2 kDa ou menor, maior ou igual a 0,5 kDa a 3,1 kDa ou menor, maior ou igual a 0,5 kDa a 3 kDa ou menor, maior ou igual a 0,5 kDa a 2,9 kDa ou menor, maior ou igual a 0,5 kDa a 2,8 kDa ou menor, maior ou igual a 0,5 kDa a 2,7 kDa ou menor, maior ou igual a 0,5 kDa a 2,6 kDa ou menor, maior ou igual a 0,5 kDa a 2,5 kDa ou menor, maior ou igual a 0,5 kDa a 2,4 kDa ou menor, maior ou igual a 0,5 kDa a 2,3 kDa ou menor, maior ou igual a 0,5 kDa a 2,2 kDa ou menor, maior ou igual a 0,5 kDa a 2,1 kDa ou menor, maior ou igual a 0,5 kDa a 2 kDa ou menor, maior ou igual a 0,5 kDa a 1,9 kDa ou menor, maior ou igual a 0,5 kDa a 1,8 kDa ou menor, maior ou igual a 0,5 kDa a 1,7 kDa ou menor, maior ou igual a 0,5 kDa a 1,6 kDa ou menor, maior ou igual a 0,5 kDa a 1,5 kDa ou menor, maior ou igual a 0,5 kDa a 1,4 kDa ou menor, maior ou igual a 0,5 kDa a 1,3 kDa ou menor, maior ou igual a 0,5 kDa a 1,2 kDa ou menor, maior ou igual a 0,5 kDa a 1,1 kDa ou menor, maior ou igual a 0,5 kDa a 1 kDa ou menor, maior que 0,5 kDa a menor que 3,4 kDa, maior que 0,5 kDa a 3,3 kDa ou menor, maior que 0,5 kDa a 3,2 kDa ou menor, maior que 0,5 kDa a 3,1 kDa ou menor, maior que 0,5 kDa a 3 kDa ou menor, maior que 0,5 kDa a 2,9 kDa ou menor, maior que 0,5 kDa a 2,8 kDa ou menor, maior que 0,5 kDa a 2,7 kDa ou menor, maior que 0,5 kDa a 2,6 kDa ou menor, maior que 0,5 kDa a 2,5 kDa ou menor, maior que 0,5 kDa a 2,4 kDa ou menor, maior que 0,5 kDa a 2,3 kDa ou menor, maior que 0,5 kDa a 2,2 kDa ou menor, maior que 0,5 kDa a 2,1 kDa ou menor, maior que 0,5 kDa a 2 kDa ou menor, maior que 0,5 kDa a 1,9 kDa ou menor, maior que 0,5 kDa a 1,8 kDa ou menor, maior que 0,5 kDa a 1,7 kDa ou menor, maior que 0,5 kDa a 1,6 kDa ou menor, maior que 0,5 kDa a 1,5 kDa ou menor, maior que 0,5 kDa a 1,4 kDa ou menor, maior que 0,5 kDa a 1,3 kDa ou menor, maior que 0,5 kDa a 1,2 kDa ou menor, maior que 0,5 kDa a 1,1 kDa ou menor, maior que 0,5 kDa a 1,0 kDa ou menor, maior ou igual a 0,75 kDa a menor que 3,4 kDa, maior ou igual a 0,75 kDa a 3,3 kDa ou menor, maior ou igual a 0,75 kDa a 3,2 kDa ou menor, maior ou
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23/67 igual a 0,75 kDa a 3,1 kDa ou menor, maior ou igual a 0,75 kDa a 3 kDa ou menor, maior ou igual a 0,75 kDa a 2,9 kDa ou menor, maior ou igual a 0,75 kDa a 2,8 kDa ou menor, maior ou igual a 0,75 kDa a 2,7 kDa ou menor, maior ou igual a 0,75 kDa a 2,6 kDa ou menor, maior ou igual a 0,75 kDa a 2,5 kDa ou menor, maior ou igual a 0,75 kDa a 2,4 kDa ou menor, maior ou igual a 0,75 kDa a 2,3 kDa ou menor, maior ou igual a 0,75 kDa a 2.2 kDa ou menor, maior ou igual a 0,75 kDa a 2,1 kDa ou menor, maior ou igual a 0,75 kDa a 2 kDa ou menor, maior ou igual a 0,75 kDa a 1,9 kDa ou menor, maior ou igual a 0,75 kDa a 1,8 kDa ou menor, maior ou igual a 0,75 kDa a 1,7 kDa ou menor, maior ou igual a 0,75 kDa a 1,6 kDa ou menor, maior ou igual a 0,75 kDa a 1,5 kDa ou menor, maior ou igual a 0,75 kDa a 1,4 kDa ou menor, maior ou igual a 0,75 kDa a 1,3 kDa ou menor, maior ou igual a 0,75 kDa a 1,2 kDa ou menor, maior ou igual a 0,75 kDa a 1,1 kDa ou menor, maior ou igual a 0,75 kDa a 1 kDa ou menor, maior que 0,75 kDa a 2 kDa ou menor, maior que 0,75 kDa a menor que 2 kDa, maior que 0,75 kDa a 1,5 kDa ou menor, cerca de 1,0 kDa ou 1,0 kDa, mas o tamanho de polietilenoglicol não é limitado aos mesmos.
[081] Conforme usado no presente documento, o termo “cerca de” refere-se a uma faixa que inclui todos dentre ±0,5, ±0,4, ±0,3, ±0,2, ±0,1, etc. e inclui todos os valores que são equivalentes ou similares àqueles após os valores, mas a faixa não é limitada ao mesmo.
[082] Conforme usado no presente documento, o termo “X” refere-se a um material fisiologicamente ativo que é uma porção química que constitui o conjugado. O material fisiologicamente ativo refere-se a um material que tem qualquer atividade fisiológica in vivo.
[083] O material fisiologicamente ativo pode ser toxinas ou polipeptídeos fisiologicamente ativos e pode incluir vários tipos de polipeptídeos fisiologicamente ativos usados para o tratamento ou a prevenção de doenças humanas, tais como citocinas, interleucinas, proteína de ligação a interleucina, enzimas, anticorpos, fatores de crescimento, fatores de controle de transcrição, fatores de sangue, vacinas, proteínas estruturais, proteínas ou receptores ligantes, antígenos de superfície celular, antagonistas de receptor, peptídeos fisiologicamente ativos liberados no intestino
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24/67 delgado e pâncreas que têm efeitos terapêuticos no tratamento de diabetes e obesidade, G agonistas ou antagonistas de receptores acoplados a proteína (GPCR), etc., ou análogos dos mesmos, mas o material fisiologicamente ativo não é limitado aos mesmos. [084] Conforme usado no presente documento, o termo “análogo de X” refere-se a um material com capacidade para exibir o mesmo tipo de atividade que X, e o mesmo inclui todos os agonistas de X, derivados de X, fragmentos de X, variantes de X, etc. [085] Tal X pode ser um polipeptídeo fisiologicamente ativo nativo.
[086] Especificamente, o “derivado de um polipeptídeo fisiologicamente ativo nativo” inclui peptídeos que têm pelo menos uma diferença na sequência de aminoácidos em comparação com aquela de um polipeptídeo fisiologicamente ativo nativo; peptídeos modificados preparados por modificação da sequência de um polipeptídeo fisiologicamente ativo nativo; e miméticos que têm o mesmo tipo de atividade que um polipeptídeo fisiologicamente ativo nativo.
[087] Especificamente, o derivado de um polipeptídeo fisiologicamente ativo nativo pode ser preparado com o uso de qualquer método selecionado dentre substituição, adição, deleção, modificação e uma combinação dos mesmos em relação a uma parte dos aminoácidos de um polipeptídeo fisiologicamente ativo nativo, e peptídeos artificiais, que foram manipulados para ter uma afinidade de ligação para pelo menos dois receptores mutualmente diferentes preparados por tal método, também pertencem ao escopo do derivado acima.
[088] Adicionalmente, a modificação para a preparação do derivado de um polipeptídeo fisiologicamente ativo nativo inclui todos dentre uma modificação com o uso de um aminoácido tipo L ou tipo D e/ou um aminoácido não nativo; e/ou uma modificação de uma sequência nativa (por exemplo, modificação de grupo (ou grupos) funcional em uma cadeia lateral, uma ligação covalente intramolecular (por exemplo, formação de anel entre cadeias laterais, metilação, acilação, ubiquitinação, fosforilação, aminohexanação, biotinilação, etc.)).
[089] Adicionalmente, o derivado de um polipeptídeo fisiologicamente ativo nativo também inclui aqueles em que um ou mais aminoácidos são adicionados à terminação amino e/ou carbóxi de um polipeptídeo fisiologicamente ativo nativo.
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25/67 [090] Como os aminoácidos a serem substituídos ou adicionados, aminoácidos atípicos ou de ocorrência não natural assim como os 20 aminoácidos convencionalmente observados em proteínas humanas podem ser usados.
[091] Conforme usado no presente documento, o termo “fragmento de um polipeptídeo fisiologicamente ativo nativo ou fragmento de um derivado de um polipeptídeo fisiologicamente ativo nativo” refere-se a uma forma de um polipeptídeo fisiologicamente ativo nativo ou um derivado de um polipeptídeo fisiologicamente ativo nativo, em que um ou mais aminoácidos são deletados da terminação amino ou carbóxi de um polipeptídeo fisiologicamente ativo nativo ou um derivado de um polipeptídeo fisiologicamente ativo nativo.
[092] O material fisiologicamente ativo pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em toxinas; agonistas do receptor de peptídeo-1 semelhante a glucagon (GLP1); agonistas do receptor de glucagon; agonistas do receptor de polipeptídeo inibidor gástrico (GIP); agonistas do receptor de fator de crescimento de fibroblasto (FGF); agonistas do receptor de colecistoquinina; agonistas do receptor de gastrina (gastrina); agonistas do receptor de melanocortina; materiais que se ligam a dois ou mais receptores entre um receptor de GLP, um receptor de glucagon e um receptor de GIP; somatostatina; peptídeo YY (PYY); neuropeptídeo Y (NPY); oxintomodulina; fator de crescimento de fibroblasto (FGF); bradiquinina; eledoisina; oxitocina; vasopressina; sermorelina; peptídeos de eliminação de prolactina; orexina; peptídeos de eliminação da tireoide; calmodulina; motilina; peptídeo intestinais vasoativos; peptídeos natriuréticos atriais (ANP); peptídeos natriuréticos do tipo C (CNP); neuroquinina A; neuromedina; renina; endotelina; peptídeos de sarafotoxina; peptídeos de carsomorfina; dermorfina; dinorfina; endorfina; encepalina; receptores do fator de necrose tumoral; receptores de uroquinase; timopoietina; timulina; timopentina; timosina; fatores humorais tímicos; adrenomodulina; alatostatina; fragmentos de proteínas amiloides; peptídeos antibióticos; peptídeos antioxidantes; bombesina; osteocalcina; peptídeos de CART; E-selectina; molécula de adesão intercelular 1 (ICAM-1); molécula de adesão de célula vascular 1 (VCAM-1); leucocina; kringle-5; laminina; inibina; galanina; fibronectina; pancreastatina; fuzeon; peptídeos semelhantes a glucagon; receptores acoplados à proteína G; fatores
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26/67 de crescimento eritropoiéticos; leucopoietina; amilina; hormônio de crescimento humano; hormônio de eliminação de hormônio do crescimento; peptídeos de eliminação de hormônio de crescimento; interferons; receptores de interferon; fatores estimulantes de colônias; interleucinas; receptores de interleucina; enzimas; proteínas de ligação de interleucina; proteínas de ligação de citocinas; fatores de ativação de macrófagos; peptídeos de macrófagos; fatores de células B; fatores de células T; proteína A; fatores inibidores de alergia; glicoproteínas de necrose; imunotoxinas; linfotoxinas; fatores de necrose tumoral; supressores de tumor; fatores de crescimento de transformação; antitripsina a-1; albumina; a-lactalbumina; apolipoproteína-E; eritropoietina; eritropoietina com alto teor de glicosilato; angiopoietinas; hemoglobinas; trombina; peptídeos de ativação de receptor de trombina; trombomodulina; fator sanguíneo VII (fator de coagulação sanguínea VII); fator sanguíneo Vila (fator de coagulação sanguínea Vila); fator sanguíneo VIII (fator de coagulação sanguínea VIII); fator sanguíneo IX (fator de coagulação sanguínea IX); fator sanguíneo XIII (fator de coagulação sanguínea XIII); ativadores de plasminogênio; peptídeos de ligação de fibrina; uroquinase; estreptoquinase; hirudina; proteína C; proteína reativa a C; inibidores de renina; inibidores de colagenase; superóxido dismutase; leptina; fator de crescimento derivado de plaquetas; fator de crescimento epitelial; fator de crescimento epidérmico; angiostatina; angiotensina; fator de crescimento morfogenético ósseo; proteína morfogenética óssea; calcitonina; insulina; atriopeptina; fator de indução de cartilagem; elcatonina; fator de ativação de tecido conjuntivo; inibidor da via de fator de tecido; hormônio folículo-estimulante; hormônio luteinizante; hormônio de eliminação de hormônio luteinizante; fatores de crescimento de nervo; fator-1 de axogênese; peptídeo natriurético de cérebro; fator neurotrófico derivado de glial; netrina; fator inibidor de neutrófilo; fator neurotrófico; neurturina; hormônio da paratireoide; relaxina; secretina; somatomedina; fator de crescimento semelhante a insulina; hormônio adrenocortical; glucagon; colecistoquinina; polipeptídeos pancreáticos; peptídeos de eliminação de gastrina; peptídeos inibidores de gastrina; fator de eliminação de corticotropina; hormônio estimulante da tireoide; autotaxina; lactoferrina; miostatina; proteína neuroprotetora dependente de atividade (ADNP), β-secretasel (BACE1), proteína
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27/67 precursora amiloide (APP), molécula de adesão celular neural (NCAM), receptor amiloide β, tau, para produtos finais de glicação avançada (RAGE), α-sinucleína, ou agonistas ou antagonistas dos mesmos; receptores, agonistas de receptor; antígenos de superfície celular; anticorpo monoclonal; anticorpo policlonal; fragmentos de anticorpo; antígenos de vacina derivada de vírus; polipeptídeos híbridos ou polipeptídeos químicos que ativam pelo menos um agonista do receptor; e análogos dos mesmos.
[093] Adicionalmente, a toxina pode ser selecionada a partir do grupo que consiste em maitansina ou um derivado da mesma, auristatina ou um derivado da mesma, duocarmicina ou um derivado da mesma e pirrolobenzodiazepina (PBD) um derivado da mesma;
[094] o agonista do receptor de peptídeo-1 semelhante ao glucagon (GLP-1) pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em peptídeo-1 semelhante ao glucagon nativo (GLP-1), GLP-2 nativo, exendina-3 nativa, exendina-4 nativa e análogos dos mesmos;
o agonista do receptor de FGF pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em FGF1 ou um análogo da mesma, FGF19 ou um análogo da mesma, FGF21 ou um análogo da mesma e FGF23 ou um análogo da mesma;
o interferon pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em interferona, interferon-β e interferon-γ;
o receptor de interferon pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em receptor de interferon-α, receptor de interferon-β, receptor de interferon-γ e receptores de interferon do tipo I solúvel;
a interleucina é selecionada a partir do grupo que consiste em interleucina-1, interleucina-2, interleucina-3, interleucina-4, interleucina-5, interleucina-6, interleucina-7, interleucina-8, interleucina-13, interleucina-18, interleucina-23, interleucina-9, interleucina-14, interleucina-19, interleucina-24, interleucina-10, interleucina-15, interleucina-20, interleucina-25, interleucina-11, interleucina-16, interleucina-21, interleucina-26, interleucina-12 interleucina-17 interleucina-22 interleucina-27 interleucina-28, interleucina-29 e interleucina-30;
o receptor de interleucina pode ser receptor de interleucina-1 ou receptor de
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28/67 interleucina-4;
a enzima pode ser selecionada a partir do grupo que consiste em βglicosidase, a-galactosidase, β-galactosidase, iduronidase, iduronato-2-sulfatase, galactose-6-sulfatase, α-glicosidase ácida, ceramidase ácida, esfingomielinase ácida, galactocerebrosidase, arilsulfatase A, arilsulfatase B, β-hexosaminidase A, βhexosaminidase B, heparina ΛΖ-sulfatase, a-D-manosidase, β-glucuronidase, Nacetilgalactosamina-6 sulfatase, lipase ácida lisossoma, a-A/-acetil-glucosaminidase, glucocerebrosidase, butirilcolinesterase, quitinase, glutamato descarboxilase, imiglucerase, lipase, uricase, acetil-hidrolase de fator de ativação de plaqueta, endopeptidase neutra, mieloperoxidase, α-galactosidase-A, agalsidase a, agalsidase β, α-L-iduronidase, butirilcolinesterase, quitinase, glutamato descarboxilase e imiglucerase;
a proteína de ligação de interleucina pode ser IL-18bp;
a proteína de ligação de citocina pode ser uma proteína de ligação a TNF;
os fatores de crescimento de nervo podem ser selecionados a partir do grupo que consiste em fator de crescimento de nervo, fator neurotrófico ciliar, fator-1 de axogênese, peptídeo natriurético de cérebro, fator neurotrófico derivado de glial, netrina, fator inibidor de neutrófilo, fator neurotrófico e neurturina;
o receptor de miostatina pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em TNFR (P75), TNFR (P55), receptor de IL-1, receptor de VEGF e receptor de fator de ativação de célula B;
o antagonista do receptor de miostatina pode ser IL1 -Ra;
o antígeno de superfície celular pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD11a, CD11b, CD18, CD19, CD20, CD23, CD25, CD33, CD38, CD40, CD45 e CD69; e os fragmentos de anticorpo podem ser selecionados a partir do grupo que consiste em scFv, Fab, Fab, F(ab)2 e Fd, mas esses materiais fisiologicamente ativos não são particularmente limitados aos mesmos.
[095] Adicionalmente, o material fisiologicamente ativo pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em exendina-3 nativa ou um análogo da mesma; exendina-4 nativa ou um análogo da mesma; insulina nativa ou um análogo da mesma; GLP-1 nativo
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29/67 ou um análogo do mesmo; GLP-2 nativo ou um análogo do mesmo; oxintomodulina nativa ou um análogo da mesma; glucagon nativo ou um análogo do mesmo; fator de crescimento de fibroblasto nativo ou um análogo do mesmo; grelina nativa ou um análogo da mesma; calcitonina nativa ou um análogo da mesma; e fator de estimulação de colônia de granulócito nativo ou um análogo do mesmo, mas o material fisiologicamente ativo não é particularmente limitado aos mesmos.
[096] Especificamente, como o material fisiologicamente ativo, o análogo de exendina-3 nativa pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em exendina-3 em que o grupo amina N-terminal é deletado da exendina-3 nativa; exendin-3 em que o grupo amina N-terminal de exendina-3 nativa é substituído por um grupo hidroxila; exendina-3 em que o grupo amina N-terminal de exendina-3 nativa é modificado com um grupo dimetila; exendina-3 em que o grupo amina N-terminal de exendina-3 nativa é substituído por um grupo carboxila; e exendina-3 em que o carbono α do 12 aminoácido de exendina-3 nativa (isto é, histidina) é deletado da exendina-3 nativa; e exendina-3 em que ο 122 aminoácido da exendina-3 (isto é, lisina) é substituído por serina; e exendina3 em que ο 122 aminoácido da exendina-3 (isto é, lisina) é substituído por arginina; e [097] como o material fisiologicamente ativo, o análogo de exendina-4 nativa pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em exendina-4 em que o grupo amina Nterminal é deletado da exendina-4 nativa; exendin-4 em que o grupo amina N-terminal de exendina-4 nativa é substituído por um grupo hidroxila; exendina-4 em que o grupo amina N-terminal de exendina-4 nativa é modificado com um grupo dimetila; exendina-4 em que o grupo amina N-terminal de exendina-4 nativa é substituído por um grupo carboxila; e exendina-4 em que o carbono α do 12 aminoácido de exendina-4 nativa (isto é, histidina) é deletado da exendina-4 nativa; e exendina-4 em que ο 122 aminoácido da exendina-4 (isto é, lisina) é substituído por serina; e exendina-4 em que o 122 aminoácido da exendina-4 (isto é, lisina) é substituído por arginina, mas o análogo de exendina-3 nativa e o análogo de exendina-4 nativa não são particularmente limitados aos mesmos. [098] Mais especificamente, o análogo de exendina-4 nativa pode ser um selecionado a partir do grupo que consiste em des-amino-histidil(DA)-exendina-4, βhidroxi-imidazo-propionil(HY)-exendina-4, imidazo-acetil(CA)-exendina-4 e dimetil
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30/67 histidil(DM)-exendina-4, mas o análogo de exendina-4 nativa não é particularmente limitado aos mesmos.
[099] Os derivados de exendina nativa que pertencem ao escopo das extendinas acima são descritos em detalhes na Publicação de Pedido de Patente Coreana n2 102009-0008151 (Publicação de Patente Internacional n2 WO 2009/011544 A2). Adicionalmente, o relatório descritivo inteiro da Publicação de Pedido de Patente Coreana (Publicação de Patente Internacional) está incorporado ao presente documento a título de referência.
[0100] Adicionalmente, o material fisiologicamente ativo pode ser oxintomodulina ativa ou um derivado da mesma. Os derivados de oxintomodulina nativa que pertencem ao escopo da oxintomodulina são descritos em detalhes na Publicação de Pedido de Patente Coreana n2 10-2012-0139579 (Publicação de Patente Internacional n2 WO 2012/173422 A9) e Publicação de Pedido de Patente Coreana n2 10-2012-0137271 (Publicação de Patente Internacional n2 WO 2012/169798 A2). Adicionalmente, os relatórios descritivos inteiros das Publicações de Pedido de Patente Coreana (Publicações de Patente Internacional) estão incorporados ao presente documento a título de referência.
[0101] Adicionalmente, o material fisiologicamente ativo pode ser um fator de estimulação de colônia de granulócito nativo ou um derivado do mesmo.
[0102] Especificamente, o material fisiologicamente ativo pode ser um derivado de fator de estimulação de colônia de granulócito humano nativo, em que qualquer um dentre ο 12, o 22, o 32 e ο 172 aminoácidos de fator de estimulação de colônia de granulócito humano nativo é substituído por um aminoácido diferente, e o 652 resíduo de aminoácido (isto é, prolina) é, ainda, substituído por serina. Mais especificamente, o material fisiologicamente ativo pode ser um derivado de fator de estimulação de colônia de granulócito humano nativo que inclui aqueles em que ο 172 resíduo de aminoácido (isto é, cisteína), o 652 resíduo de aminoácido (isto é, prolina) e ambos esses resíduos de aminoácido são substituídos por serina, mas o material fisiologicamente ativo não é particularmente limitado ao mesmo.
[0103] Os derivados de fator de estimulação de colônia de granulócito nativo que
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31/67 pertencem ao escopo do fator de estimulação de colônia de granulócito são descritos em detalhes na Publicação de Pedido de Patente Coreana n2 10-2001-0009171 (Publicação de Patente Internacional n2 WO 2001/004329 A1). Adicionalmente, o relatório descritivo inteiro da Publicação de Pedido de Patente Coreana (Publicação de Patente Internacional) está incorporado ao presente documento a título de referência.
[0104] Adicionalmente, o material fisiologicamente ativo pode ser um material que pode se ligar a dois ou mais receptores entre um receptor de GLP, um receptor de glucagon e um receptor de GIP. O material pode ter uma atividade para dois ou mais receptores entre o receptor de GLP, o receptor de glucagon e o receptor de GIP. Ou seja, uma vez que um material se ligue a um receptor em questão, o receptor pode exibir atividade.
[0105] Especificamente, o material fisiologicamente ativo pode ser um material que pode se ligar a dois ou mais receptores entre um receptor de glucagon, um receptor de GLP-1 e um receptor de GIP e, mais especificamente, um material que pode se ligar a um receptor de glucagon e um receptor de GLP-1; um material que pode se ligar a um receptor de GLP-1 e um receptor de GIP; um material que pode se ligar a um receptor de GLP-1 e um receptor de glucagon; ou um material que pode se ligar a todos dentre um receptor de glucagon, um receptor de GLP-1 e um receptor de GIP, mas o material fisiologicamente ativo não é particularmente limitado ao mesmo. O material que pode se ligar a três receptores pode ser denominado um agonista triplo (ou um ativador triplo), e o material que pode se ligar a dois receptores pode ser denominado um agonista duplo. [0106] Os exemplos dos peptídeos que têm uma atividade para um receptor de glucagon, um receptor de GLP-1 e um receptor de GIP são descritos dos documentos nos wo 2017/116205 A1 e WO 2017/116204 A1, que são pedidos anteriormente depositados pelo depositante da presente invenção, e a totalidade desses pedidos está incorporada ao presente documento a título de referência.
[0107] Adicionalmente, os exemplos do agonista duplo de glucagon/GLP-1 são descritos nos documentos n22 WO 2015/183054, WO 2016/043533, etc. e os relatórios descritivos inteiros desses pedidos estão incorporados ao presente documento a título de referência.
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32/67 [0108] Adicionalmente, o material fisiologicamente ativo pode ser um derivado de glucagon nativo.
[0109] Os exemplos do derivado de glucagon são descritos nos documentos n22 WO 2016/108586, WO 2017/003191, etc. e os relatórios descritivos inteiros desses pedidos estão incorporados ao presente documento a título de referência.
[0110] Adicionalmente, o material fisiologicamente ativo pode ser insulina nativa ou um análogo da mesma. Mais especificamente, o material fisiologicamente ativo pode ser insulina nativa ou um análogo de insulina com uma afinidade de ligação reduzida para um receptor de insulina em comparação com insulina nativa.
[0111] Conforme usado no presente documento, o termo “análogo de insulina” referese a insulina não nativa que é diferente de insulina nativa. O análogo de insulina inclui insulina humana não nativa que é diferente de insulina humana nativa.
[0112] Tal análogo de insulina inclui aqueles análogos de insulina em que parte dos aminoácidos de insulina nativa é modificada na forma de adição e/ou deleção e/ou substituição.
[0113] Especificamente, o análogo de insulina da presente invenção pode ter uma homologia de sequência à sequência de insulina nativa de pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94% ou pelo menos 95% ao comparar a identidade de sequência. Adicionalmente, o análogo de insulina da presente invenção pode ser aquele que tem uma afinidade de ligação a receptor reduzida em comparação com insulina nativa enquanto tem a homologia de sequência acima àquela de insulina nativa. Adicionalmente, o análogo de insulina pode ser aquele que tem capacidade de absorção de glicose e/ou tem capacidade de redução de glicose sanguínea in vivo como em insulina nativa.
[0114] Mais especificamente, o análogo de insulina da presente invenção pode exibir afinidade de ligação para um receptor de insulina de cerca de 99% ou menos, cerca de 95% ou menos, cerca de 90% ou menos, cerca de 85% ou menos, cerca de 80% ou menos, cerca de 75% ou menos, cerca de 70% ou menos, cerca de 65% ou menos, cerca de 60% ou menos, cerca de 55% ou menos, cerca de 50% ou menos, cerca de
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45% ou menos, cerca de 40% ou menos, cerca de 35% ou menos, cerca de 30% ou menos, cerca de 25% ou menos, cerca de 20% ou menos, cerca de 15% ou menos, cerca de 10% ou menos, cerca de 9% ou menos, cerca de 8% ou menos, cerca de 7% ou menos, cerca de 6% ou menos, cerca de 5% ou menos, cerca de 4% ou menos, cerca de 3% ou menos, cerca de 2% ou menos, cerca de 1% ou menos, ou cerca de 0,1% ou menos, em comparação com a afinidade de ligação (100%) de insulina nativa (mas a afinidade de ligação do análogo de insulina da presente invenção para um receptor de insulina não corresponde a 0%). A afinidade de ligação do análogo de insulina pode ser avaliada com o uso do Ensaio de Proximidade de Cintilação (SPA) que utiliza a reação competitiva entre análogos de insulina e insulina ligada a I125 em uma membrana celular que superexpressa receptores de insulina humana recombinante.
[0115] Adicionalmente, o análogo de insulina pode ser aquele que tem uma meiavida aumentada em pelo menos 10% em comparação com insulina nativa devido à diminuição de afinidade de ligação para um receptor de insulina, mas o análogo de insulina não é limitado ao mesmo.
[0116] Adicionalmente, o análogo de insulina da presente invenção pode ter capacidade de absorção de glicose como em insulina nativa.
[0117] Especificamente, o análogo de insulina da presente invenção pode ser aquele que tem capacidade de absorção de glicose de pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 55%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 65%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 100%, pelo menos cerca menos cerca de 130%, pelo menos cerca menos cerca de 160%, pelo menos cerca menos cerca de 190%, ou pelo menos de 110%, pelo menos cerca de 120%, pelo de 140%, pelo menos cerca de 150%, pelo de 170%, pelo menos cerca de 180%, pelo cerca de 200%, em comparação com a capacidade de absorção de glicose (100%) de insulina nativa.
[0118] A medição de capacidade de absorção de glicose pode ser atingida com o uso de vários métodos para medir a capacidade de absorção de glicose conhecidos na
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34/67 técnica.
[0119] O análogo de insulina que pertence ao escopo do análogo de insulina acima é descrito em detalhes na Publicação de Pedido de Patente Coreana n2 10-20150087130 (Publicação de Patente Internacional n2 WO 2015/108398 A1) e Publicação de Pedido de Patente Coreana n2 10-2017-0026284 (Publicação de Patente Internacional n° WO 2017/039267 A1). Adicionalmente, os relatórios descritivos inteiros das Publicações de Pedido de Patente Coreana (Publicações de Patente Internacional) estão incorporados ao presente documento a título de referência, mas o análogo de insulina não é limitado ao mesmo. Adicionalmente, o análogo de insulina da presente invenção também inclui todos aqueles análogos de insulina revelados na Publicação de Pedido de Patente Coreana n2 10-2014-0106452, mas o análogo de insulina não é limitado ao mesmo. Todas os relatórios descritivos de patente acima estão incorporados ao presente documento a título de referência.
[0120] Especificamente, o análogo de insulina pode estar na forma de uma cadeia de polipeptídeo única ou duas cadeias de polipeptídeo e, mais preferencialmente, duas cadeias de polipeptídeo, mas o análogo de insulina não é particularmente limitado ao mesmo.
[0121] O análogo de insulina na forma de duas cadeias de polipeptídeo pode ser aquele que consiste em um polipeptídeo correspondente à cadeia A de insulina nativa e um polipeptídeo correspondente à cadeia B de insulina nativa. Em particular, “correspondente à cadeia A ou cadeia B de insulina nativa” pode se referir a casos em que qualquer uma das duas cadeias de polipeptídeo tem identidade de sequência de pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94% ou pelo menos 95%, em comparação com a cadeia A ou cadeia B de insulina nativa, mas não é particularmente limitado ao mesmo, e uma pessoa comum versada na técnica pode facilmente entender comparando a sequência que consiste em duas cadeias de polipeptídeo com aquela da cadeia A ou cadeia B de insulina nativa.
[0122] A insulina nativa é um hormônio secretado pelo pâncreas para promover de modo geral a absorção de glicose e inibir a quebra de gordura e, assim, funciona para
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35/67 controlar os níveis de glicose sanguínea. A insulina é gerada a partir do processamento de seu precursor, pró-insulina, que não tem a função de controlar os níveis de glicose sanguínea. A insulina consiste em duas cadeias de polipeptídeo, ou seja, a cadeia A e a cadeia B que têm 21 e 30 aminoácidos, respectivamente, e estão interligadas por duas pontes de dissulfeto. A cadeia A e a cadeia B de insulina nativa incluem sequências de aminoácidos representadas pelas SEQ ID NOS: 1 e 2 abaixo, respectivamente.
[0123] cadeia A:
Gly-lle-Val-Glu-GIn-Cys-Cys-Thr-Ser-lle-Cys-Ser-Leu-Tyr-GIn-Leu-Glu-AsnTyr-Cys-Asn (SEQ ID NO: 1).
[0124] cadeia B:
Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-ValCys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr (SEQ ID NO: 2).
[0125] De acordo com uma modalidade exemplificativa da presente invenção, o análogo de insulina descrito na presente invenção pode ser aquele que tem uma afinidade de ligação reduzida para receptores enquanto tem uma função de controle de nível de glicose sanguínea in vivo como em insulina nativa. Mais especificamente, o análogo de insulina pode ter uma capacidade de redução de nível de glicose sanguínea in vivo.
[0126] O tipo e o tamanho do análogo de insulina não são particularmente limitados contanto que o análogo de insulina possa exibir baixa internacional mediada por receptor e/ou eliminação mediada por receptor. Consequentemente, o análogo de insulina da presente invenção pode exibir uma meia-vida sanguínea significativamente aumentada em comparação com insulina nativa.
[0127] O análogo de insulina da presente invenção inclui insulina invertida, derivados de insulina nativa, fragmentos de insulina nativa, etc. O análogo de insulina pode ser preparado pelo método de fase sólida assim como métodos de recombinação genética, mas o método para preparar o análogo de insulina não é limitado ao mesmo. Entretanto, o análogo de insulina da presente invenção não inclui apenas aqueles análogos de insulina preparados por métodos de recombinação genética, mas também inclui todos os análogos de insulina com uma afinidade de ligação reduzida para um receptor de
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36/67 insulina.
[0128] Conforme usado no presente documento, o termo “derivado de insulina nativa” refere-se a peptídeos que têm pelo menos uma diferença na sequência de aminoácidos em comparação com insulina nativa; peptídeos modificados preparados por modificação da sequência de insulina nativa; e miméticos de insulina nativa com capacidade para regular os níveis de glicose sanguínea in vivo como em insulina nativa. Esses derivados de insulina nativa podem ser aqueles que têm a função de regular os níveis de glicose sanguínea in vivo.
[0129] Especificamente, os derivados de insulina nativa podem ser preparados com o uso de qualquer método selecionado dentre substituição, adição, deleção, modificação e uma combinação dos mesmos em relação a uma parte dos aminoácidos de insulina nativa.
[0130] Especificamente, os derivados de insulina nativa podem ser aqueles que mostram uma homologia de sequência de pelo menos 80% na sequência de aminoácidos em comparação com cada uma dentre a cadeia A e a cadeia B de insulina nativa e/ou estão na forma em que alguns grupos de um resíduo de aminoácido de insulina são alterados por substituição química (por exemplo, a/fa-metilação, alfahidroxilação), deleção (por exemplo, desaminação) ou modificação (por exemplo, Nmetilação), mas a homologia de sequência e as formas dos derivados de insulina nativa não são limitados aos mesmos.
[0131] Os derivados de insulina nativa que podem ser aplicados à presente invenção podem ser preparados por uma combinação de vários métodos usados para a preparação de derivados.
[0132] Adicionalmente, a modificação para a preparação dos derivados de insulina nativa inclui todos dentre uma modificação com o uso de um aminoácido tipo L ou tipo D e/ou um aminoácido não nativo; e/ou alteração ou modificação pós-traducional de uma sequência nativa (por exemplo, metilação, acilação, ubiquitinação, ligação covalente intramolecular, etc.).
[0133] Adicionalmente, os derivados de insulina nativa também incluem aqueles em que um ou mais aminoácidos são adicionados à terminação amino e/ou carbóxi de
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37/67 insulina nativa.
[0134] Como os aminoácidos a serem substituídos ou adicionados, aminoácidos atípicos ou de ocorrência não natural assim como os 20 aminoácidos convencionalmente observados em proteínas humanas podem ser usados. As fontes comerciais de aminoácidos atípicos incluem Sigma-Aldrich, ChemPep Inc., Genzyme Pharmaceuticals, etc. As sequências de peptideos que incluem esses aminoácidos e sequências de peptideos atípicas podem ser sintetizadas por ou adquiridas junto a fornecedores comerciais, por exemplo, American Peptide Company, Bachem (USA) ou Anygen (Korea), mas os métodos para obter essas sequências de peptideos não são particularmente limitadas às mesmas.
[0135] Conforme usado no presente documento, o termo “fragmento de insulina nativa ou fragmento de um derivado de insulina nativa” refere-se a uma forma de insulina nativa ou um derivado de insulina nativa em que um ou mais aminoácidos são deletados da terminação amino ou carbóxi de insulina nativa ou um derivado de insulina nativa. Tal fragmento de insulina nativa ou um derivado de insulina nativa pode ter a função de regular os níveis de glicose sanguínea in vivo.
[0136] Adicionalmente, o análogo de insulina da presente invenção pode incluir aqueles que são preparados com o uso de cada um dos métodos usados para a preparação dos derivados e fragmentos de insulina nativa descritos acima independentemente ou preparados com o uso de um método combinado dos mesmos.
[0137] Especificamente, o análogo de insulina de acordo com a presente invenção pode incluir uma modificação em um resíduo de aminoácido particular na cadeia A e na cadeia B de insulina nativa e, especificamente, esses análogos de insulina podem ser aqueles em que resíduos de aminoácido particulares da cadeia A de insulina nativa são modificados e/ou resíduos de aminoácido particulares da cadeia B de insulina nativa são modificados.
[0138] Especificamente, o análogo de insulina de acordo com a presente invenção pode ser um análogo de insulina que tem uma afinidade de ligação reduzida para um receptor de insulina em comparação com insulina nativa e inclui modificação e/ou deleção em pelo menos um aminoácido da cadeia A ou da cadeia B de insulina nativa.
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Por exemplo, o análogo de insulina pode ser aquele em que uma parte dos aminoácidos em insulina nativa é modificado na forma de adição, deleção, substituição e uma combinação dos mesmos e, assim, sua afinidade de ligação para um receptor de insulina é reduzida em comparação com insulina nativa.
[0139] Especificamente, o análogo de insulina pode ser um análogo de insulina, em que pelo menos um aminoácido, selecionado a partir do grupo que consiste no 12 aminoácido, no 22 aminoácido, no 32 aminoácido, no 52 aminoácido, no 82 aminoácido, no 102 aminoácido, no 122 aminoácido, no 162 aminoácido, no 232 aminoácido, no 242 aminoácido, no 252 aminoácido, no 262 aminoácido, no 272 aminoácido, no 282 aminoácido, no 292 aminoácido e no 302 aminoácido da cadeia B de insulina, e no 12 aminoácido, no 22 aminoácido, no 52 aminoácido, no 82 aminoácido, no 102 aminoácido, no 122 aminoácido, no 142 aminoácido, no 162 aminoácido, no 172 aminoácido, no 182 aminoácido, no 192 aminoácido e no 212 aminoácido da cadeia A de insulina, é substituído por um aminoácido diferente; ou, mais especificamente, um análogo de insulina, em que pelo menos um aminoácido, selecionado a partir do grupo que consiste no 82 aminoácido, no 232 aminoácido, no 242 aminoácido e no 252 aminoácido da cadeia B de insulina, e no 12 aminoácido, no 22 aminoácido, no 142 aminoácido e no 192 aminoácido da cadeia A de insulina é substituído por um aminoácido diferente.
[0140] Especificamente, o análogo de insulina pode ser aquele em que pelo menos 1 aminoácido, pelo menos 2 aminoácidos, pelo menos 3 aminoácidos, pelo menos 4 aminoácidos, pelo menos 5 aminoácidos, pelo menos 6 aminoácidos, pelo menos 7 aminoácidos, pelo menos 8 aminoácidos, pelo menos 9 aminoácidos, pelo menos 10 aminoácidos, pelo menos 11 aminoácidos, pelo menos 12 aminoácidos, pelo menos 13 aminoácidos, pelo menos 14 aminoácidos, pelo menos 15 aminoácidos, pelo menos 16 aminoácidos, pelo menos 17 aminoácidos, pelo menos 18 aminoácidos, pelo menos 19 aminoácidos, pelo menos 20 aminoácidos, pelo menos 21 aminoácidos, pelo menos 22 aminoácidos, pelo menos 23 aminoácidos, pelo menos 24 aminoácidos, pelo menos 25 aminoácidos, pelo menos 26 aminoácidos ou pelo menos 27 aminoácidos nos aminoácidos descritos acima são substituídos por um aminoácido diferente, mas o análogo de insulina não é limitado ao mesmo.
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39/67 [0141] Os resíduos de aminoácido nas posições descritas acima podem ser substituídos por alanina, ácido glutâmico, asparagina, isoleucina, valina, glutamina, glicina, lisina, histidina, cisteína, fenilalanina, triptofano, prolina, serina, treonina e/ou ácido aspártico. Adicionalmente, aqueles análogos de insulina que têm uma afinidade de ligação reduzida para um receptor de insulina devido á deleção em pelo menos um aminoácido na cadeia A ou na cadeia B de insulina nativa podem pertencer ao escopo da presente invenção, mas qualquer análogo de insulina com uma afinidade de ligação reduzida para um receptor de insulina pode ser incluído sem limitação.
[0142] Mais especificamente, o análogo de insulina pode ser aquele que inclui a cadeia A de SEQ ID NO: 3 representada pela Fórmula Geral 1 abaixo e a cadeia B de SEQ ID NO: 4 representada pela Fórmula Geral 2 abaixo. Adicionalmente, o análogo de insulina pode estar em uma forma em que as sequências da cadeia A e da cadeia B estão interligadas por uma ligação de dissulfeto, mas a forma do análogo de insulina não é limitada ao mesmo.
FÓRMULA GERAL 1
Xaa1-Xaa2-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-lle-Cys-Ser-Leu-Xaa14-Gln-LeuGlu-Asn-Xaa19-Cys-Asn (SEQ ID NO: 3).
Na Fórmula Geral 1 acima,
Xaa1 é glicina ou alanina,
Xaa2 é isoleucina ou alanina,
Xaa14 é tirosina, ácido glutâmico ou asparagina, e
Xaa19 é tirosina ou alanina.
FÓRMULA GERAL 2
Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Xaa8-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-LeuVal-Cys-Gly-Glu-Arg-Xaa23-Xaa24-Xaa25-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr (SEQ ID NO: 4).
Na Fórmula Geral 2 acima,
Xaa8 é glicina ou alanina,
Xaa23 é glicina ou alanina,
Xaa24 é fenilalanina ou alanina, e
Xaa25 é fenilalanina ou alanina.
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40/67 [0143] Mais especificamente, o análogo de insulina pode incluir:
(i) a cadeia A de Fórmula Geral 1 acima em que Xaa1 é alanina, Xaa2 é isoleucina, Xaa14 é tirosina, e Xaa19 é tirosina, e a cadeia B de Fórmula Geral 2, em que Xaa8 é glicina, Xaa23 é glicina, Xaa24 é fenilalanina, e Xaa25 é fenilalanina;
(ii) a cadeia A de Fórmula Geral 1, em que Xaa1 é glicina, Xaa2 é alanina, Xaa14 é tirosina, e Xaa19 é tirosina, e a cadeia B de Fórmula Geral 2, em que Xaa8 é glicina, Xaa23 é glicina, Xaa24 é fenilalanina, e Xaa25 é fenilalanina;
(iii) a cadeia A de Fórmula Geral 1, em que Xaa1 é glicina, Xaa2 é isoleucina, Xaa14 é ácido glutâmico ou asparagina, e Xaa19 é tirosina, e a cadeia B de Fórmula Geral 2, em que Xaa8 é glicina, Xaa23 é glicina, Xaa24 é fenilalanina, e Xaa25 é fenilalanina;
(iv) a cadeia A de Fórmula Geral 1, em que Xaa1 é glicina, Xaa2 é isoleucina, Xaa14 é tirosina, Xaa19 é alanina na Fórmula Geral 1 acima, e a cadeia B de Fórmula Geral 2, em que Xaa8 é glicina, Xaa23 é glicina, Xaa24 é fenilalanina, e Xaa25 é fenilalanina;
(v) a cadeia A de Fórmula Geral 1, em que Xaa1 é glicina, Xaa2 é isoleucina, Xaa14 é tirosina, e Xaa19 é tirosina, e a cadeia B de Fórmula Geral 2, em que Xaa8 é alanina, Xaa23 é glicina, Xaa24 é fenilalanina, e Xaa25 é fenilalanina;
(vi) a cadeia A de Fórmula Geral 1, em que Xaa1 é glicina, Xaa2 é isoleucina, Xaa14 é tirosina, e Xaa19 é tirosina, e a cadeia B de Fórmula Geral 2, em que Xaa8 é glicina, Xaa23 é alanina, Xaa24 é fenilalanina, e Xaa25 é fenilalanina;
(vii) a cadeia A de Fórmula Geral 1, em que Xaa1 é glicina, Xaa2 é isoleucina, Xaa14 é tirosina, e Xaa19 é tirosina, e a cadeia B de Fórmula Geral 2, em que Xaa8 é glicina, Xaa23 é glicina, Xaa24 é alanina, e Xaa25 é fenilalanina; e (viii) a cadeia A de Fórmula Geral 1, em que Xaa1 é glicina, Xaa2 é isoleucina, Xaa14 é tirosina, e Xaa19 é tirosina, e a cadeia B de Fórmula Geral 2, em que Xaa8 é glicina, Xaa23 é glicina, Xaa24 é fenilalanina, e Xaa25 é alanina.
[0144] Adicionalmente, o análogo de insulina pode ser aquele que inclui a cadeia A de SEQ ID NO: 5 representada pela Fórmula Geral 3 abaixo e a cadeia B de SEQ ID NO: 6 representada pela Fórmula Geral 4 abaixo. Adicionalmente, o análogo de insulina pode
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41/67 estar em uma forma em que as sequências da cadeia A e da cadeia B estão interligadas por uma ligação de dissulfeto, mas a forma do análogo de insulina não é limitada ao mesmo.
FÓRMULA GERAL 3
Xaa1 -Ile-Val-Glu-Xaa5-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Xaa12-Leu-Xaa14-GlnXaa16-Glu-Asn-Xaa19-Cys-Xaa21 (SEQ ID NO: 5).
Na Fórmula Geral 3 acima,
Xaa1 é alanina, glicina, glutamina, histidina, ácido glutâmico ou asparagina,
Xaa5 é alanina, ácido glutâmico, glutamina, histidina ou asparagina,
Xaa12 é alanina, serina, glutamina, ácido glutâmico, histidina ou asparagina,
Xaa14 é alanina, tirosina, ácido glutâmico, histidina, lisina, ácido aspártico ou asparagina,
Xaa16 é alanina, leucina, tirosina, histidina, ácido glutâmico ou asparagina,
Xaa19 é alanina, tirosina, serina, ácido glutâmico, histidina, treonina ou asparagina, e
Xaa21 é asparagina, glicina, histidina ou alanina.
FÓRMULA GERAL 4
Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Xaa16-LeuVal-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Xaa25-Tyr-Xaa27-Xaa28-Lys-Thr (SEQ ID NO: 6).
Na Fórmula Geral 4 acima,
Xaa16 é tirosina, ácido glutâmico, serina, treonina ou ácido aspártico ou está ausente,
Xaa25 é fenilalanina, ácido aspártico ou ácido glutâmico ou está ausente,
Xaa27 é treonina ou está ausente, e
Xaa28 é prolina, ácido glutâmico ou ácido aspártico, ou está ausente.
[0145] Mais especificamente, o análogo de insulina pode ser aquele, em que:
na Fórmula Geral 3 acima, Xaa1 é glicina, Xaa5 é glutamina, Xaa12 é serina, Xaa14 é ácido glutâmico ou asparagina, Xaa16 é leucina, Xaa19 é tirosina, Xaa21 é asparagina, na Fórmula Geral 4 acima, Xaa16 é tirosina, Xaa25 é fenilalanina ou está
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42/67 ausente, Xaa27 é treonina, Xaa28 é prolina, ácido glutâmico, ou ácido aspártico, ou está ausente, mas o análogo de insulina não é particularmente limitado ao mesmo.
[0146] Mais especificamente, o análogo de insulina pode ser aquele, em que:
(1) na cadeia A de insulina de SEQ ID NO: 5, Xaa1 é glicina, Xaa5 é glutamina, Xaa12 é serina, Xaa14 é ácido glutâmico, Xaa16 é leucina, Xaa19 é tirosina, e Xaa21 é asparagina; e na cadeia B de insulina de SEQ ID NO: 6, Xaa16 é tirosina, Xaa25 é fenilalanina, Xaa27 é treonina, Xaa28 é prolina, ácido glutâmico ou ácido aspártico, ou está ausente;
(2) na cadeia A de insulina de SEQ ID NO: 5, Xaa1 é glicina, Xaa5 é glutamina, Xaa12 é serina, Xaa14 é asparagina, Xaa16 é leucina, Xaa19 é tirosina, e Xaa21 é asparagina; e na cadeia B de insulina de SEQ ID NO: 6, Xaa16 é tirosina, Xaa25 é fenilalanina, Xaa27 é treonina, Xaa28 é prolina, ácido glutâmico ou ácido aspártico, ou está ausente;
(3) na cadeia A de insulina de SEQ ID NO: 5, Xaa1 é glicina, Xaa5 é glutamina, Xaa12 é serina, Xaa14 é ácido glutâmico, Xaa16 é leucina, Xaa19 é tirosina, e Xaa21 é asparagina; e, na cadeia B de insulina de SEQ ID NO: 6, Xaa16 é tirosina, Xaa25 está ausente, Xaa27 é treonina, Xaa28 é prolina, ácido glutâmico ou ácido aspártico, ou está ausente; ou (4) na cadeia A de insulina de SEQ ID NO: 5, Xaa1 é glicina, Xaa5 é glutamina, Xaa12 é serina, Xaa14 é alanina, Xaa16 é leucina, Xaa19 é tirosina, Xaa21 é asparagina; θ, na cadeia B de insulina de SEQ ID NO: 6, Xaa16 é ácido glutâmico, Xaa25 está ausente, Xaa27 é treonina, Xaa28 é prolina, ácido glutâmico ou ácido aspártico, ou está ausente, mas o análogo de insulina não é particularmente limitado ao mesmo. [0147] Mais especificamente, o análogo de insulina pode ser aquele, em que:
(1) na Fórmula Geral 3 acima, Xaa1 é glicina, Xaa5 é glutamina, Xaa12 é serina, Xaa14 é ácido glutâmico, Xaa16 é leucina, Xaa19 é tirosina, e Xaa21 é
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43/67 asparagina; e na Fórmula Geral 4 acima, Xaa16 é tirosina, Xaa25 está ausente, Xaa27 é treonina, e Xaa28 é prolina;
(2) na Fórmula Geral 3 acima, Xaa1 é glicina, Xaa5 é glutamina, Xaa12 é serina, Xaa14 é alanina, Xaa16 é leucina, Xaa19 é tirosina, e Xaa21 é asparagina; e na Fórmula Geral 4 acima, Xaa16 é ácido glutâmico, Xaa25 está ausente, Xaa27 é treonina, e Xaa28 é prolina;
(3) na Fórmula Geral 3 acima, Xaa1 é glicina, Xaa5 é glutamina, Xaa12 é serina, Xaa14 é histidina, Xaa16 é leucina, Xaa19 é tirosina, e Xaa21 é asparagina; e na Fórmula Geral 4 acima, Xaa16 é tirosina, Xaa25 é fenilalanina, Xaa27 é treonina, e Xaa28 é prolina;
(4) na Fórmula Geral 3 acima, Xaa1 é glicina, Xaa5 é glutamina, Xaa12 é serina, Xaa14 é lisina, Xaa16 é leucina, Xaa19 é tirosina, e Xaa21 é asparagina; e na Fórmula Geral 4 acima, Xaa16 é tirosina, Xaa25 é fenilalanina, Xaa27 é treonina, e Xaa28 é prolina;
(5) na Fórmula Geral 3 acima, Xaa1 é glicina, Xaa5 é glutamina, Xaa12 é serina, Xaa14 é tirosina, Xaa16 é leucina, Xaa19 é ácido glutâmico, e Xaa21 é asparagina; e na Fórmula Geral 4 acima, Xaa16 é tirosina, Xaa25 é fenilalanina, Xaa27 é treonina, e Xaa28 é prolina;
(6) na Fórmula Geral 3 acima, Xaa1 é glicina, Xaa5 é glutamina, Xaa12 é serina, Xaa14 é tirosina, Xaa16 é leucina, Xaa19 é serina, e Xaa21 é asparagina; e na Fórmula Geral 4 acima, Xaa16 é tirosina, Xaa25 é fenilalanina, Xaa27 é treonina, e Xaa28 é prolina;
(7) na Fórmula Geral 3 acima, Xaa1 é glicina, Xaa5 é glutamina, Xaa12 é serina, Xaa14 é tirosina, Xaa16 é leucina, Xaa19 é treonina, e Xaa21 é asparagina; e na Fórmula Geral 4 acima, Xaa16 é tirosina, Xaa25 é fenilalanina, Xaa27 é treonina, e Xaa28 é prolina;
(8) na Fórmula Geral 3 acima, Xaa1 é glicina, Xaa5 é glutamina, Xaa12 é serina, Xaa14 é tirosina, Xaa16 é leucina, Xaa19 é tirosina, e Xaa21 é asparagina; e
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44/67 na Fórmula Geral 4 acima, Xaa16 é ácido glutâmico, Xaa25 é fenilalanina, Xaa27 é treonina, e Xaa28 é prolina;
(9) na Fórmula Geral 3 acima, Xaa1 é glicina, Xaa5 é glutamina, Xaa12 é serina, Xaa14 é tirosina, Xaa16 é leucina, Xaa19 é tirosina, e Xaa21 é asparagina; e na Fórmula Geral 4 acima, Xaa16 é serina, Xaa25 é fenilalanina, Xaa27 é treonina, e Xaa28 é prolina;
(10) na Fórmula Geral 3 acima, Xaa1 é glicina, Xaa5 é glutamina, Xaa12 é serina, Xaa14 é tirosina, Xaa16 é leucina, Xaa19 é tirosina, e Xaa21 é asparagina; e na Fórmula Geral 4 acima, Xaa16 é treonina, Xaa25 é fenilalanina, Xaa27 é treonina, e Xaa28 é prolina;
(11) na Fórmula Geral 3 acima, Xaa1 é glicina, Xaa5 é glutamina, Xaa12 é serina, Xaa14 é alanina, Xaa16 é leucina, Xaa19 é tirosina, e Xaa21 é asparagina; e na Fórmula Geral 4 acima, Xaa16 é tirosina, Xaa25 é fenilalanina, Xaa27 é treonina, e Xaa28 é prolina;
(12) na Fórmula Geral 3 acima, Xaa1 é glicina, Xaa5 é glutamina, Xaa12 é serina, Xaa14 é ácido aspártico, Xaa16 é leucina, Xaa19 é tirosina, e Xaa21 é asparagina; e na Fórmula Geral 4 acima, Xaa16 é tirosina, Xaa25 é fenilalanina, Xaa27 é treonina, e Xaa28 é prolina;
(13) na Fórmula Geral 3 acima, Xaa1 é glicina, Xaa5 é glutamina, Xaa12 é serina, Xaa14 é tirosina, Xaa16 é leucina, Xaa19 é tirosina, e Xaa21 é asparagina; e na Fórmula Geral 4 acima, Xaa16 é ácido aspártico, Xaa25 é fenilalanina, Xaa27 é treonina, e Xaa28 é prolina;
(14) na Fórmula Geral 3 acima, Xaa1 é glicina, Xaa5 é glutamina, Xaa12 é serina, Xaa14 é tirosina, Xaa16 é leucina, Xaa19 é tirosina, e Xaa21 é asparagina; e na Fórmula Geral 4 acima, Xaa16 é tirosina, Xaa25 é ácido aspártico, Xaa27 é treonina, e Xaa28 é prolina; ou (15) na Fórmula Geral 3 acima, Xaa1 é glicina, Xaa5 é glutamina, Xaa12 é serina, Xaa14 é tirosina, Xaa16 é leucina, Xaa19 é tirosina, e Xaa21 é asparagina; e na Fórmula Geral 4 acima, Xaa16 é tirosina, Xaa25 é ácido glutâmico, Xaa27
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45/67 é treonina, e Xaa28 é prolina, mas o análogo de insulina não é particularmente limitado ao mesmo.
[0148] Entretanto, o análogo de insulina não é limitado às modalidades acima. Por exemplo, aqueles peptídeos que têm uma afinidade de ligação reduzida para um receptor de insulina em comparação com insulina nativa, enquanto contêm os resíduos de aminoácido característicos descritos acima e que têm uma homologia àqueles do análogo de insulina em questão de pelo menos 70%, especificamente, pelo menos 80%, mais especificamente, pelo menos 90% e, ainda mais especificamente, pelo menos 95% estão também incluídos no escopo da presente invenção presente invenção.
[0149] Conforme usado no presente documento, o termo “homologia” refere-se ao grau de similaridade de sequência a uma sequência de aminoácidos de uma proteína nativa (tipo selvagem) ou uma sequência de polinucleotídeos que codifica a mesma e inclui aquelas sequências que têm a identidade de sequência das porcentagens descritas acima ou mais altas com a sequência de aminoácidos ou a sequências de polinucleotídeos da presente invenção. Essas homologias podem ser determinadas comparando-se duas sequências ao olho nu ou, alternativamente, podem ser determinadas com o uso de um algoritmo de bioinformática que alinha as sequências a serem comparadas e analisa o grau de homologia. A homologia entre as duas sequências de aminoácidos pode ser expressa como uma porcentagem. Os algoritmos automatizados úteis estão disponíveis nos módulos de software de computador GAP, BESTFIT, FASTA e TFASTA do Pacote de Software de Genética de Wisconsin (Genetics Computer Group, Madison, Wl, EUA). Os algoritmos de arranjo automatizados nesse módulo incluem algoritmos de alinhamento de sequências de Needleman & Wunsch, Pearson & Lipman e Smith & Waterman. A determinação de homologia e algoritmo para outros arranjos úteis são automatizados no software, incluindo FASTP, BLAST, BLAST2, PSIBLAST e CLUSTAL W.
[0150] Os polinucleotídeos que codificam o análogo de insulina podem ser isolados ou preparados com o uso de técnicas de biologia molecular padrão. Por exemplo, os polinucleotídeos que codificam o análogo de insulina podem ser amplificados por reação em cadeia de polimerase (PCR) a partir da sequência de genes de insulina nativa
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46/67 (NM_000207.2, NCBI) com o uso de sequências iniciadoras adequadas ou podem ser preparados com o uso de técnicas sintéticas padrão com o uso de um sintetizador de DNA automatizado. O polinucleotídeo pode ser usado de forma intercambiável com ácido nucleico na presente invenção.
[0151] O polinucleotídeo que codifica o análogo de insulina pode incluir aqueles polinucleotídeos que codificam as sequências de aminoácidos das cadeias A e B descritas acima, mas o polinucleotídeo não é limitado ao mesmo. Por exemplo, aqueles polinucleotídeos que codificam os peptídeos que têm uma homologia às sequências acima de pelo menos 70%, especificamente, pelo menos 80%, mais especificamente, pelo menos 90% e, ainda mais especificamente, pelo menos 95% e têm uma afinidade de ligação reduzida para um receptor de insulina em comparação com insulina nativa estão também incluídos no escopo da presente invenção, adicionalmente às sequências de polinucleotídeos descritas acima.
[0152] Entretanto, um conjugado em relação à insulina nativa ou um análogo da mesma pode ser aquele representado pela Fórmula 2 abaixo:
FÓRMULA 2
X-L-F em que, na Fórmula 2 acima,
X é insulina nativa ou um análogo de insulina com uma afinidade de ligação reduzida para um receptor de insulina em comparação com insulina nativa,
L, que é um ligante, é polietilenoglicol que tem um tamanho maior que 0 kDa a menor que 3,4 kDa, e
F é um material com capacidade para aumentar a meia vida in vivo de X.
[0153] O conjugado representado pela Fórmula 2 acima pode ser aquele em que a eliminação mediada por receptor (RMC) é reduzida, mas o conjugado não é particularmente limitado ao mesmo.
[0154] No conjugado representado pela Fórmula 2 acima, L pode estar ligado à região amino-terminal da cadeia beta de insulina nativa ou um análogo da mesma (isto é, X), mas o conjugado não é particularmente limitado ao mesmo.
[0155] Na presente invenção, o termo “região N-terminal ou região amino-terminal”
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47/67 refere-se à região amino-terminal de um peptídeo ou proteína. Por exemplo, a “região Nterminal” pode incluir não apenas o resíduo de aminoácido mais terminal da região Nterminal, mas também os resíduos de aminoácido adjacentes ao resíduo de aminoácido N-terminal e, especificamente, o 12 resíduo de aminoácido ao 202 resíduo de aminoácido do mais terminal, mas a região N-terminal não é particularmente limitada ao mesmo. [0156] Entretanto, no conjugado de acordo com a presente invenção, X e F podem estar ligados um ao outro através de L por uma ligação química covalente, uma ligação química não covalente ou uma combinação das mesmas e, especificamente, X e F podem estar ligados um ao outro através de L por uma ligação química covalente. [0157] Na Fórmula 1 ou 2 acima, pode denotar uma ligação química covalente ou uma ligação química não covalente e, mais especificamente, uma ligação química covalente, mas não é particularmente limitado ao mesmo.
[0158] O conjugado da Fórmula 1 ou 2 acima tem uma estrutura em que X, L e F estão ligados nessa ordem.
[0159] Em uma modalidade específica, ambas as extremidades de L são, respectivamente, ligadas a um grupo amina ou um grupo tiol de F (por exemplo, uma região Fc de imunoglobulina) e um grupo amina ou um grupo tiol de X para preparar o conjugado. O grupo amina pode ser amina primária ou amina secundária.
[0160] O grupo amina pode estar localizado na terminação N ou em uma cadeia lateral de uma resíduo de lisina de um polipeptídeo, tal como um polipeptídeo fisiologicamente ativo ou uma região Fc de imunoglobulina; e o grupo tiol pode estar localizado em um resíduo de cisteína de um polipeptídeo, tal como um polipeptídeo fisiologicamente ativo ou uma região Fc de imunoglobulina [0161] O grupo amina de um polipeptídeo, tal como um polipeptídeo fisiologicamente ativo ou uma região Fc de imunoglobulina, pode formar uma ligação covalente por reação com um aldeído ou éster de /V-hidroxissuccinimida.
[0162] O grupo tiol de um polipeptídeo, tal como um polipeptídeo fisiologicamente ativo ou uma região Fc de imunoglobulina, pode formar uma ligação covalente por reação com maleimida, iodoacetamida, vinilsulfona, dissulfeto de piridila ou um grupo tiol. [0163] Especificamente, antes de formar um conjugado, L pode incluir um grupo que
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48/67 pode se ligar a F e X em ambas as extremidades do mesmo, respectivamente, de modo específico, um grupo reativo que pode se ligar a um grupo amina localizado na terminação N ou um resíduo de lisina ou um grupo tiol em um resíduo de cisteína de X; ou um grupo amina localizado na terminação N ou um resíduo de lisina ou um grupo tiol em um resíduo de cisteína de F, mas o grupo reativo não é limitado ao mesmo.
[0164] L, antes de ser ligado tanto a X quanto a F, pode ter pelo menos dois grupos funcionais terminais, especificamente dois ou três grupos funcionais terminais e, mais especificamente, dois grupos funcionais terminais.
[0165] Especificamente, L pode ser um PEG homofuncional em que os tipos de todos os pelo menos dois grupos funcionais são iguais, ou um PEG heterofuncional em que o tipo de pelo menos um grupo funcional difere daquele (daqueles) do outro grupo (ou grupos) funcional. Por exemplo, o PEG pode estar em uma forma com duas extremidades, em que uma extremidade do PEG é aldeído enquanto a outra extremidade é maleimida.
[0166] Adicionalmente, L pode ser um PEG homofuncional, em que ambas as extremidades ou todas as três extremidades são aldeídos.
[0167] Por exemplo, L pode ser um PEG que tem um grupo propionaldeído ou um grupo butiraldeído em ambas as extremidades, mas não é particularmente limitado ao mesmo.
[0168] Quando L tem um grupo funcional de aldeído reativo em ambas as extremidades, é eficaz que L seja ligado a um polipeptídeo fisiologicamente ativo e uma região Fc de imunoglobulina em ambas as extremidades, respectivamente, enquanto minimiza a ocorrência de reações não específicas. O produto final formado através de aminação redutora por uma ligação de aldeído é significativamente mais estável em comparação com aqueles por uma ligação de amida. O grupo funcional aldeído reage seletivamente na terminação N em baixo pH e pode formar uma ligação covalente com um resíduo de lisina em alto pH (por exemplo, pH 9,0).
[0169] O grupo funcional terminal de L descrito acima pode ser um grupo funcional reativo a amina ou um grupo funcional reativo a tiol.
[0170] Mais especificamente, o pelo menos um grupo funcional terminal de L pode
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49/67 ser, cada um, independentemente selecionado a partir do grupo que consiste em aldeído, maleimida, succinimida, vinilsulfona, tiol, dissulfeto de C6-20 arila, dissulfeto de C5-20 heteroarila e acetamida halogenada e, ainda mais especificamente, pode ser, cada um, independentemente selecionado a partir do grupo que consiste em aldeído, maleimida, succinimida, vinilsulfona, tiol, dissulfeto de orto-piridila e iodoacetamida, mas 0 grupo funcional terminal não é particularmente limitado ao mesmo.
[0171] Como os grupos de L, os derivados conhecidos na técnica e os derivados que podem ser facilmente preparados no nível técnica da arte assim como aqueles tipos descritos acima estão também incluídos no escopo da presente invenção.
[0172] O grupo aldeído pode ser um alquil aldeído (por exemplo, C2-6 alquil aldeído) e, especificamente, um grupo propionaldeído, um grupo butiraldeído, etc., mas 0 grupo aldeído não é particularmente limitado ao mesmo.
[0173] O grupo succinimida pode ser valerato de succinimidila, metilbutanoato de succinimidila, metilpropionato de succinimidila, butanoato de succinimidila, propionato de succinimidila, hidróxi succinimidila (especificamente, /V-hidroxissuccinimidila), succinimidil carboximetila ou carbonato de succinimidila. O grupo succinimida pode ter uma forma adequada de modo que seja ligado a um grupo funcional alvo localizado em um polipeptídeo fisiologicamente ativo ou uma região Fc de imunoglobulina. Por exemplo, 0 grupo succinimida pode ser um éster /V-hidroxissuccinimidílico.
[0174] Adicionalmente, quando um PEG que tem um grupo funcional hidróxi em ambas as extremidades é usado, 0 grupo hidróxi pode ser ativado em vários grupos reativos descritos acima por reações químicas conhecidas.
[0175] No caso de um ligante peptídico usado em uma proteína de fusão obtida por um método de fusão in-frame convencional, 0 ligante peptídico pode ser facilmente clivado por protease in vivo e, assim, um efeito suficiente de aumentar a meia-vida sérica de um fármaco ativo por um carreador não pode ser obtido conforme esperado. Portanto, na presente invenção, um conjugado pode ser preparado com 0 uso de polietilenoglicol, que é um ligante não peptídico. PEG que tem resistência a protease pode ser usado como um ligante não peptídico para manter a meia-vida sanguínea de um dado peptídeo similar a um carreador. O peso molecular de polietilenoglicol está na faixa de menos de
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3,4 kDa, mas seu peso molecular não é limitado ao mesmo.
[0176] Entretanto, em relação ao peso molecular de polietilenoglicol usado na presente invenção, todos aqueles explicados anteriormente serão aplicados àqueles descritos acima e àqueles a serem descritos posteriormente.
[0177] E m um conjugado de acordo com a presente invenção, “F” refere-se a um material que pode aumentar a meia-vida in vivo de um material fisiologicamente ativo. Na presente invenção, o termo “F” pode ser usado de forma intercambiável com “material biocompatível” ou carreador.
[0178] Na presente invenção, o “material biocompatível ou um material com capacidade de aumentar a meia-vida in vivo é uma porção química que constitui o conjugado.
[0179] O tipo do material biocompatível ou carreador não é limitado contanto que seja um material que está ligado a um material fisiologicamente ativo alvo e tem, assim, capacidade de estender a meia-vida in vivo do mesmo. Como exemplos não limitantes, o carreador ou material biocompatível pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em polímeros, ácidos graxos, colesterol, albumina e um fragmento dos mesmos, materiais de ligação a albumina, um polímero de unidades de repetição de uma sequência de aminoácido particular, anticorpos, fragmentos de anticorpo, materiais de ligação a FcRn, tecidos conectivos in vivo, nucleotídeos, fibronectina, transferina, sacarídeos, heparina e elastina.
[0180] O polímero podem ser selecionado a partir do grupo que consiste em polietileno glicol, polipropileno glicol, um copolímero de etileno glicol-propileno glicol, poliol polioxietilado, álcool polivinílico, um polissacarídeo, dextrano, éter polivinil etílico, um polímero biodegradável, um polímero de lipídio, quitinas, ácido hialurônico, um oligonucleotídeo, e uma combinação dos mesmos, mas o polímero não é particularmente limitado aos mesmos.
[0181] O material biocompatível ou carreador pode ser ligado covalentemente ou não covalentemente a X. Adicionalmente, o material de ligação a FcRn pode ser um polipeptídeo que inclui uma região Fc de imunoglobulina e, especificamente, uma região Fc de imunoglobulina (por exemplo, uma Fc de IgG).
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51/67 [0182] Quando albumina é usada como um carreador, tecnologias que podem ligar de modo diretamente covalente albumina ou um fragmento da mesma a um material fisiologicamente ativo através de um ligante, aumentado, assim, a estabilidade in vivo do material fisiologicamente ativo, podem ser usadas. Adicionalmente, tecnologias que, embora não possam ligar diretamente albumina a um material fisiologicamente ativo, podem ligar um material de ligação a albumina, tal como um anticorpo de ligação específica a albumina ou um fragmento de anticorpo do mesmo a um material fisiologicamente ativo para, assim, ligar o material fisiologicamente ativo a albumina e tecnologias que podem ligar um peptídeo/proteína particular que tem uma afinidade de ligação para albumina (por exemplo, o peptídeo de ligação a albumina produzido com o uso da tecnologia Albumod da Affibody Company) a um material fisiologicamente ativo podem ser usadas, e tecnologias que podem ligar ácidos graxos, etc. que têm uma afinidade de ligação para albumina podem ser usados, mas as tecnologias não são limitadas às mesmas, mas qualquer tecnologia, métodos de ligação, etc. que possam aumentar a estabilidade in vivo de um material fisiologicamente ativo com o uso de albumina pode ser incluída.
[0183] Para aumentar a meia-vida in vivo de um material fisiologicamente ativo, tecnologias que podem ligar um anticorpo ou um fragmento de anticorpo, como um carreador, a um material fisiologicamente ativo podem ser também incluídas. O anticorpo ou fragmento de anticorpo pode ser um anticorpo ou fragmento de anticorpo que tem uma região de ligação a FcRn e pode ser qualquer fragmento de anticorpo que não incluam uma região de ligação a FcRn, tal como Fab, etc. A tecnologia CovX-body pela empresa CovX com o uso de anticorpo catalítico pode ser incluída, e tecnologias que podem amentar a meia-vida in vivo de um material fisiologicamente ativo com o uso de uma região Fc de imunoglobulina podem ser incluídas na presente invenção.
[0184] Adicionalmente, tecnologias que podem ligar um fragmento de um peptídeo ou proteína, como um carreador, a um material fisiologicamente ativo de modo a aumentar a meia-vida in vivo podem também ser incluídas na presente invenção. O fragmento de um peptídeo ou proteína a ser usado pode ser um polipeptídeo semelhante a elastina (ELP) que consiste em um polímero de unidades de repetição de uma
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52/67 combinação de sequências de aminoácidos particulares, e a tecnologia Xten que emprega um polipeptídeo artificial PEG pela Versartis Inc. Adicionalmente, a tecnologia de sonda de indução de estrutura (SIP) pela empresa Zealand que pode aumentar a meia-vida in vivo de um material fisiologicamente ativo com o uso de multilisina e a tecnologia de fusão de CTP pela Prolor Biotech Inc. estão também incluídas na presente invenção, e transferrina, que é conhecida por ter alta estabilidade in vivo, ou fibronectina (um componente constituinte de tecido conjuntivo) ou um derivado da mesma, etc. pode também estar incluída. O peptídeo ou proteína a ser ligado a um material fisiologicamente ativo não é limitado àqueles descritos acima, mas qualquer peptídeo ou proteína que possa aumentar a meia-vida in vivo de um material fisiologicamente ativo está incluída no escopo da presente invenção.
[0185] Adicionalmente, o carreador a ser usado de modo a aumentar a meia-vida in vivo pode ser um material não peptídico, tal como um polissacarídeo ou ácidos graxos, etc.
[0186] Quando uma imunoglobulina é usada, o ligante para ligar uma região Fc a um material fisiologicamente ativo e o método de ligação podem ser uma ligação não peptídica com o uso de polietilenoglicol. A região Fc e o material fisiologicamente ativo podem estar ligados a uma razão de 1:1 ou 1:2, mas a razão não é limitada ao mesmo. Especificamente, a região Fc pode estar na forma de um dímero e em uma forma em que uma molécula de um material fisiologicamente ativo pode ser ligada a uma cadeia única de uma região Fc de imunoglobulina em uma forma dimérica, ou em uma forma em que uma molécula de um material fisiologicamente ativo pode estar ligada a cada uma das duas cadeias de uma região Fc de imunoglobulina em uma forma dimérica, respectivamente, mas a forma de ligação não é particularmente limitada ao mesmo. [0187] Adicionalmente, no conjugado, em relação à Fórmula 1 ou Fórmula 2 acima, quando F é uma região Fc de imunoglobulina, L pode estar ligado à região N-terminal de F, mas não é particularmente limitado ao mesmo.
[0188] Visto que uma região Fc de imunoglobulina é um polipeptídeo biodegradável que pode ser metabolizado in vivo, a mesma é segura para uso como um carreador de fármaco. Adicionalmente, a região Fc de imunoglobulina tem um peso molecular
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53/67 relativamente baixo em comparação com a molécula inteira de imunoglobulina, isso é vantajoso em termos de preparação, purificação e rendimento de um conjugado. Adicionalmente, como a região Fab, que exibe alta heterogeneidade devido à diferença em sequências de aminoácidos de anticorpo para anticorpo, é removida, espera-se que a homogeneidade de materiais possa ser grandemente aumentada e o risco de induzir antigenicidade sanguínea possa ser também reduzido.
[0189] Conforme usado no presente documento, o termo “região Fc de imunoglobulina” refere-se a uma proteína que inclui a região constante de cadeia pesada 2 (CH2) e a região constante de cadeia pesada 3 (CH3) de uma imunoglobulina, excluindo as regiões variáveis de cadeia pesada e de cadeia leve da imunoglobulina.
[0190] A região Fc de imunoglobulina pode incluir uma região de dobradiça nas regiões constantes de cadeia pesada. Adicionalmente, a região Fc de imunoglobulina da presente invenção pode ser uma região Fc estendida que inclui uma parte ou a totalidade da região constante de cadeia pesada 1 (CH1) e/ou a região constante de cadeia leve 1 (CL1), excluindo as regiões variáveis de cadeia pesada e leve da imunoglobulina, enquanto a região Fc de imunoglobulina tiver um efeito substancialmente igual ou mais aprimorado em comparação com aquele de Fc nativo. Adicionalmente, a região Fc de imunoglobulina da presente invenção pode ser uma região na qual uma sequência de aminoácidos parcial significativamente longa correspondente a CH2 e/ou CH3 é removida.
[0191] Especificamente, a região Fc de imunoglobulina da presente invenção pode ser 1) um domínio CH1, um domínio CH2, um domínio CH3 e um domínio CH4, 2) um domínio CH1 e um domínio CH2, 3) um domínio CH1 e um domínio CH3, 4) um domínio CH2 e um domínio CH3 e 5) uma combinação entre um ou dois ou mais domínios selecionados dentre um domínio CH1, um domínio CH2, um domínio CH3 e um domínio CH4 e uma região de dobradiça (ou parte de uma região de dobradiça) de uma imunoglobulina (por exemplo, uma combinação entre um domínio CH2 e um domínio CH3 e uma região de dobradiça ou parte da região de dobradiça; e um dímero de dois polipeptídeos com a combinação descrita acima) e 6) um dímero entre cada domínio da região constante de cadeia pesada e a região constante de cadeia leve.
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54/67 [0192] Adicionalmente, a região Fc de imunoglobulina não apenas inclui sua sequência de aminoácidos nativa, mas também uma variante de sequência (mutante) da mesma. Conforme usado no presente documento, o termo “mutante de sequência de aminoácidos” refere-se a uma sequência que é diferente da sequência de aminoácidos nativa devido à deleção, à inserção, à substituição não conservative ou conservative ou uma combinação dos mesmos de um ou mais resíduos de aminoácido da sequência de aminoácidos nativa. Por exemplo, no caso de uma Fc de IgG, os resíduos de aminoácido nas posições 214 a 238, 297 a 299, 318 a 322 ou 327 a 331, que são conhecidos por serem importantes na ligação, podem ser usados como sítios adequados para modificação.
[0193] Adicionalmente, outros vários tipos de mutantes são possíveis, incluindo um que tenha uma deleção de uma região com capacidade para formar uma ligação de dissulfeto, ou uma deleção de alguns resíduos de aminoácido na terminação N de Fc nativa ou uma adição de resíduo de metionina na terminação N de Fc nativa, etc. Além disso, para remover funções efetoras, uma deleção pode ocorrer em um sítio de ligação a complemento, tal como um sítio de ligação a C1q e um sítio de citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpo (ADCC). As técnicas para preparar tais derivados de sequência da região Fc de imunoglobulina são reveladas nas Publicações de Patente Internacional n2 WO 97/34631, WO 96/32478, etc.
[0194] As trocas de aminoácidos nas proteínas e peptídeos, que não alteram de modo geral a atividade das proteínas ou peptídeos, são conhecidas na técnica (H. Neurath, R. L. Hill, The Proteins, Academic Press, Nova Iorque, 1979). As trocas de ocorrência mais comum são Ala/Ser, Val/lle, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/lle, Leu/Val, Ala/Glu e Asp/Gly. [0195] Em alguns casos, a região Fc pode ser modificada por fosforilação, sulfação, acrilação, glicosilação, metilação, farnesilação, acetilação, amidação, etc.
[0196] Os mutantes Fc descritos acima podem ser aqueles que mostram atividade biológica idêntica àquela da região Fc da presente invenção, mas têm estabilidade estrutural aprimorada contra calor, pH, etc.
[0197] Adicionalmente, a região Fc pode ser obtida a partir de formas nativas isoladas
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55/67 in vivo de seres humanos ou animais, como vacas, cabras, porcos, camundongo, coelhos, hamsteres, ratos, porquinhos-da-índia, etc., ou podem ser recombinantes ou derivados da mesma, obtida a partir de células animais transformadas ou microorganismos. No presente documento, a região Fc pode ser obtida a partir de uma imunoglobulina nativa isolando-se uma imunoglobulina total de um corpo humano ou animal vivo e tratando a imunoglobulina isolada com protease. Quando a imunoglobulina total é tratada com papaína, a mesma é clivada em regiões Fab e Fc, enquanto quando a imunoglobulina total é tratada com pepsina, a mesma é clivada em fragmentos pF'c e F(ab)2. Esses fragmentos podem ser isolados com o uso de cromatografia de exclusão de tamanho, etc.
[0198] Em uma modalidade mais específica, a região Fc pode ser uma região Fc de imunoglobulina recombinante obtida a partir de um micro-organismo em relação a uma região Fc derivada de ser humano.
[0199] Adicionalmente, a região Fc de imunoglobulina pode estar na forma de glicano nativo, glicanos aumentados ou diminuídos em comparação com seu tipo nativo, ou em uma forma desglicosilada. O aumento, a diminuição ou a remoção das glicanos Fc de imunoglobulina pode ser alcançada por métodos convencionais, como um método químico, um método enzimático e um método de engenharia genética com o uso de um micro-organismo. A região Fc de imunoglobulina obtida por remoção de glicanos da região Fc mostra uma diminuição significante em afinidade de ligação com o complemento (parte C1q) e uma diminuição ou perda em citotoxicidade dependente de anticorpo ou citotoxicidade dependente de complemento e, desse modo, não induz respostas imunes desnecessárias in vivo. Em relação a isso, uma região Fc de imunoglobulina em uma região Fc de imunoglobulina desglicosilada ou aglicosilada pode ser uma forma mais adequada para satisfazer o objetivo original da presente invenção como um carreador de fármaco.
[0200] Conforme usado no presente documento, o termo “desglicosilação” se refere a remover enzimaticamente porções químicas de açúcar a partir de uma região Fc, e o termo “aglicosilação” se refere a uma região Fc não glicosilada produzida em procariotas, mais especificamente, E. coli.
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56/67 [0201] Enquanto isso, a região Fc de imunoglobulina pode ser derivada de seres humanos ou animais, incluindo vacas, cabras, porcos, camundongos, coelhos, hamsteres, ratos e porquinhos-da-índia, e, de preferência, é derivada de seres humanos. Adicionalmente, a região Fc de imunoglobulina (Ig) pode ser uma região Fc derivada de IgG, IgA, IgD, IgE, IgM, ou uma combinação ou híbrido dos mesmos. De preferência, a mesma pode ser derivada de IgG ou IgM, que estão entre as proteínas mais abundantes em sangue humano e, com a máxima preferência, pode ser derivada de IgG, que é conhecida por aumentar as meias-vidas de proteínas de ligação a ligante.
[0202] Entretanto, conforme usado no presente documento, o termo “combinação” significa que polipeptídeos que codificam regiões Fc de imunoglobulina de cadeia simples da mesma origem são ligados a um polipeptídeo de cadeia única de uma origem diferente para formar um dímero ou multímero. Isto é, um dímero ou multímero pode ser preparado a partir de dois ou mais fragmentos selecionados a partir do grupo que consiste em fragmentos Fc de IgG, Fc de IgA, Fc de IgM, Fc de IgD e Fc de IgE.
[0203] Conforme usado no presente documento, o termo “híbrido” significa que as sequências correspondentes a dois ou mais fragmentos Fc de imunoglobulina de diferentes origens estão presentes em uma cadeia única de uma região Fc de imunoglobulina. Na presente invenção, várias formas híbridas são possíveis. Ou seja, o domínio híbrido pode ser composto de um a quatro domínios selecionados a partir do grupo que consiste em CH1, CH2, CH3 e CH4 de IgG Fc, IgM Fc, IgA Fc, IgE Fc e IgD Fc e pode incluir uma região de dobradiça.
[0204] Entretanto, a IgG pode ser também dividida nas subclasses IgG 1, lgG2, lgG3 e lgG4, e a presente invenção pode incluir combinações ou híbridos das mesmas, de preferência, as subclasses lgG2 e lgG4e, com máxima preferência, a região Fc da lgG4 que têm raramente uma função efetora, tal como citotoxicidade dependente de complemento (CDC). Ou seja, a região Fc de imunoglobulina da presente invenção a ser usada como um carreador de fármaco pode ser uma região Fc aglicosilada derivada de lgG4 humana. A região Fc derivada de lgG4 humana é preferencial em relação a regiões Fc derivadas de não humano, que podem causar respostas imunológicas indesejáveis, tal como atuação como antígenos no corpo humano, produzindo, assim, novos
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57/67 anticorpos contra o antígeno, etc.
[0205] Em uma modalidade específica, o material fisiologicamente ativo (por exemplo, insulina nativa ou um análogo de insulina) e um material biocompatível estão ligados através de polietilenoglicol, que é um ligante que tem um tamanho maior que 0 kDa a menor que 3,4 kDa e é interposto entre os mesmos, e o material biocompatível pode ser um material de ligação a FcRn. O material de ligação a FcRn pode ser, por exemplo, uma região Fc de imunoglobulina e, especificamente, uma região Fc de IgG.
[0206] Ainda outro aspecto da presente invenção fornece um método para preparar o conjugado.
[0207] O conjugado e os componentes que constituem o conjugado são iguais, conforme explicado acima.
[0208] Em uma modalidade específica, a presente invenção fornece um método para preparar o conjugado, que inclui:
(a) reagir polietilenoglicol, que tem um tamanho maior que 0 kDa a menor que
3,4 kDa e pelo menos dois grupos funcionais terminais, com qualquer um dentre um material fisiologicamente ativo ou um material com capacidade de aumentar a meia-vida in vivo do material fisiologicamente ativo para preparar polietilenoglicol, ao qual um dentre o material fisiologicamente ativo ou o material com capacidade de aumentar a meia-vida in vivo do material fisiologicamente ativo está covalentemente ligado e que tem pelo menos um grupo funcional terminal; e (b) reativar o polietilenoglicol, ao qual um dentre o material fisiologicamente ativo ou o material com capacidade de aumentar a meia-vida in vivo do material fisiologicamente ativo está ligado covalentemente e que tem pelo menos um grupo funcional terminal, preparado na etapa (a) com o outro dentre um material fisiologicamente ativo ou um material com capacidade de aumentar a meia-vida in vivo do material fisiologicamente ativo para preparar um conjugado, em que o material fisiologicamente ativo e um material com capacidade de aumentar a meia-vida in vivo do material fisiologicamente ativo estão ligados covalentemente através de polietilenoglicol que tem um tamanho maior que 0 kDa a menor que 3,4 kDa.
[0209] No presente documento, a etapa (a) é denominada uma etapa de reação
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58/67 primária, e a etapa (b) é denominada uma etapa de reação secundária, respectivamente. [0210] O material fisiologicamente ativo e o tamanho do polietilenoglicol usados na preparação do conjugado e a constituição em relação à ligação do conjugado que inclui grupos funcionais terminais são iguais, conforme explicado acima.
[0211] No método de preparação acima, o material fisiologicamente ativo tem um grupo funcional que reage com o grupo funcional terminal de polietilenoglicol e, assim, forma uma ligação covalente, e o grupo funcional pode ser um grupo amina ou um grupo tiol.
[0212] Adicionalmente, no método de preparação acima, o material que pode aumentar a meia-vida do material fisiologicamente ativo tem um grupo funcional que reage com o grupo funcional terminal e, assim, forma uma ligação covalente, e o grupo funcional pode ser um grupo amina ou um grupo tiol.
[0213] No método de preparação acima, o grupo funcional terminal do polietilenoglicol pode ser um grupo funcional reativo a amina ou um grupo funcional reativo a tiol.
[0214] No método de preparação acima, o grupo funcional terminal de polietilenoglicol pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em aldeído, maleimida, succinimida, vinilsulfona, tiol, dissulfeto de C6-20 arila, dissulfeto de C5-20 heteroarila e acetamida halogenada. Mais especificamente, 0 grupo funcional terminal de polietilenoglicol pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em aldeído, maleimida, succinimida, vinilsulfona, tiol, dissulfeto de orto-piridila e iodoacetamida.
[0215] A succinimida pode ser valerato de succinimidila, metilbutanoato de succinimidila, metilpropionato de succinimidila, butanoato de succinimidila, propionato de succinimidila, /V-hidroxissuccinimidila, succinimidil carboximetila ou carbonato de succinimidila, mas a succinimida não é limitada aos mesmos.
[0216] Na etapa de reação primária ou na etapa de reação secundária da presente invenção, quando 0 grupo funcional terminal de PEG é aldeído, uma ligação covalente pode ser formada entre um grupo amina de X ou um grupo amina de F e 0 grupo aldeído de PEG por aminação redutora. Por exemplo, ο ‘-NH2’ localizado na terminação N de F e 0 grupo aldeído de PEG podem reagir e formar uma ligação covalente.
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59/67 [0217] A aminação redutora pode ser realizada na presença de um agente redutor. O agente redutor pode estar contido a uma concentração final de 1 mM a 20 mM na etapa de reação primária e a uma concentração final de 1 mM a 100 mM na etapa de reação secundária, mas as concentrações não são particularmente limitadas às mesmas.
[0218] Na presente invenção, o agente redutor refere-se a todos os agentes redutores conhecidos na técnica com capacidade para formar uma ligação covalente reduzindo uma ligação dupla de imina reversível, que é formada por ligação do grupo aldeído (isto é, um grupo funcional de PEG) e do grupo amina de um polipeptídeo (um polipeptídeo fisiologicamente ativo ou uma região Fc de imunoglobulina). Para os propósitos da presente invenção, o agente redutor pode estar contido em uma solução de reação para mediar uma ligação covalente entre PEG e um polipeptídeo fisiologicamente ativo ou uma região Fc de imunoglobulina.
[0219] Na presente invenção, todos os agentes redutores convencionalmente usados na técnica podem ser usados como o agente redutor. Especificamente, o agente redutor pode ser cianoboroidreto de sódio (SCB), complexo borano-piridina, boroidreto de sódio, complexo borano-dimetilamina, complexo borano-trimetilamina ou triacetoxiboroidreto de sódio, mas o agente redutor não é limitado aos mesmos. O agente redutor adequado pode ser livremente selecionado de acordo com os tipos de X ou F e solvente de reação. [0220] Entretanto, na etapa de reação primária ou na etapa de reação secundária da presente invenção, quando o grupo funcional terminal de PEG é um grupo maleimida, o grupo tiol em um resíduo de cisteína de X ou o grupo tiol em um resíduo de cisteína de F (isto é, uma porção química sulfidrila) pode reagir com o grupo maleimida de PEG para formar uma ligação covalente (uma ligação de tioéter).
[0221] Ainda outro aspecto da presente invenção fornece uma preparação de insulina de atuação longa com duração in vivo e estabilidade aprimoradas.
[0222] O conjugado é o mesmo que o explicado acima.
[0223] Entretanto, como formulações que podem aumentar a biodisponibilidade ou manter a atividade prolongada, formulações de liberação prolongada por micropartículas, nanopartículas, etc. com o uso de PLGA, ácido hialurônico, quitosano, etc. podem estar
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60/67 contidas na preparação.
[0224] Adicionalmente, outros tipos de preparações que podem aumentar a biodisponibilidade e manter a atividade prolongada podem incluir preparações na forma de implante, inalação, nasal e emplastros.
[0225] A preparação de longa atuação pode ser uma preparação de insulina de longa atuação com duração in vivo e estabilidade aprimoradas em comparação com aquelas de seu material fisiologicamente ativo nativo.
[0226] Quando o material fisiologicamente ativo é insulina nativa ou um análogo da mesma, a preparação de longa atuação pode ser uma composição farmacêutica para prevenir ou tratar doenças relacionadas à insulina (por exemplo, diabetes), mas o material fisiologicamente ativo não é limitado ao mesmo.
[0227] Conforme usado no presente documento, o termo “doença relacionada à insulina” refere-se a uma doença que ocorre ou progride devido à atividade fisiológica baixa ou nula de insulina e pode incluir, por exemplo, diabetes, mas a doença relacionada à insulina não é particularmente limitada à mesma.
[0228] A composição farmacêutica que contém um conjugado da presente invenção pode conter um carreador farmaceuticamente aceitável. Os exemplos do carreador farmaceuticamente aceitável podem incluir um aglutinante, um agente antiaderente, um desintegrador, um excipiente, um solubilizante, um dispersante, um estabilizante, um agente de suspensão, um agente corante, uma fragrância, etc. para administração oral; um tampão, um conservante, um analgésico, um solubilizante, um agente isotônico e um estabilizante, etc. podem ser misturados para serem usados para injeções; e uma base, um excipiente, um lubrificante, um conservante, etc. para administração tópica.
[0229] O tipo de formulação da composição farmacêutica da presente invenção pode ser preparado de modo variável por combinação com carreadores farmaceuticamente aceitáveis descritos acima. Por exemplo, para administração oral, a composição pode ser formulada em tabletes, trociscos, cápsulas, elixires, suspensões, xaropes, pastilhas etc. Para injeções, a composição pode ser formulada em ampolas de dose unitária ou formas de múltiplas doses. A composição farmacêutica também pode ser formulada em outras formas, tais como soluções, suspensões, tabletes, pílulas, cápsulas, preparações
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61/67 de liberação sustentada, etc.
[0230] Entretanto, os exemplos de um carreador, um excipiente e um diluente adequados podem incluir lactose, dextrose, sacarose, sorbitol, manitol, xilitol, eritritol, maltitol, amido, borracha de acácia, alginato, gelatina, fosfato de cálcio, silicato de cálcio, celulose, metil celulose, celulose microcristalina, polivinilpirrolidona, água, hidroxibenzoato de metila, hidroxibenzoato de propila, talco, estearato de magnésio, óleo mineral, etc.
[0231] Adicionalmente, a composição farmacêutica pode conter, ainda, uma carga, um anticoagulante, um lubrificante, um umectante, uma fragrância, um conservante, etc. [0232] Adicionalmente, o conjugado da presente invenção pode estar contido em uma quantidade de 0,001% em peso a 10% em peso em relação à quantidade total da composição da presente invenção, mas a quantidade não é particularmente limitada à mesma.
[0233] Ainda outro aspecto da presente invenção fornece um método para tratar doenças relacionadas à insulina que inclui administrar um conjugado representado pela Fórmula 2 acima ou uma preparação contendo o conjugado a um indivíduo que precisa do mesmo.
[0234] O conjugado de acordo com a presente invenção é eficaz para o tratamento de diabetes e, assim, o tratamento das doenças relacionadas à insulina pode ser promovido administrando-se uma composição farmacêutica que contém o conjugado.
[0235] Conforme usado no presente documento, o termo “administração” se refere à introdução de um material particular a um paciente por uma maneira apropriada, e o conjugado pode ser administrado por meio de qualquer uma dentre as rotas comuns desde que o fármaco possa chegar a um tecido-alvo por meio de qualquer via geral. Por exemplo, a administração pode ser realizada por via intraperitoneal, por via intravenosa, por via intramuscular, por via subcutânea, por via intradérmica, por via oral, por via tópica, por via intranasal, por via intrapulmonar, por via intrarretal, etc., mas a administração não é limitada às mesmas. Entretanto, visto que os peptídeos são digeridos mediante administração oral, os ingredientes ativos de uma composição para administração oral precisam ser revestidos ou formulados para proteção contra degradação no estômago.
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De preferência, a composição farmacêutica pode ser administrada em uma forma injetável. Adicionalmente, a composição farmacêutica pode ser administrada com o uso de qualquer aparelho com capacidade para transportar os ingredientes ativos para uma célula alvo.
[0236] Adicionalmente, o conjugado ou a composição farmacêutica da presente invenção contendo o conjugado pode ser determinada por diversos fatores relacionados, incluindo os tipos de doenças a serem tratados, as vias de administração, a idade, o sexo e o peso de um paciente e a gravidade da enfermidade, assim como pelos tipos do fármaco como um ingrediente ativo. Visto que a composição farmacêutica da presente invenção tem excelente duração e titulação in vivo, a mesma pode reduzir consideravelmente a frequência de administração a dose da preparação farmacêutica da presente invenção.
[0237] Doravante, a presente invenção será descrita em mais detalhes com referência aos Exemplos a seguir. No entanto, esses Exemplos são apenas para propósitos ilustrativos, e a invenção não é limitada por esses Exemplos.
EXEMPLO 1: PREPARAÇÃO DE CONJUGADO DE INSULINA-PEG DE 3,4 KDA-FC DE IMUNOGLOBULINA [0238] Após dissolver insulina em pó (Biocon, índia) em HCI 10 mM, para a peguilação de PEG 3.4 K propion-ALD(2) (PEG que tem um grupo propionaldeído, respectivamente, em ambas as extremidades, NOF, EUA) à terminação N de cadeia beta de insulina, insulina (5 mg/ml) e PEG foram misturados a uma razão molar de 1:4 e reagidos a 4 °C por cerca de 2 horas. Em particular, a reação foi realizada em um solvente misto de tampão citrato de sódio 50 mM (pH 5,0) e 45% de isopropanol adicionando-se cianoboroidreto de sódio (NaCNBHa) como um agente redutor. A solução de reação foi purificada com o uso da coluna SP-HP (GE Healthcare), que utiliza um tampão contendo citrato de sódio (pH 3,0) e 45% de EtOH e um gradiente de concentração de KCI.
[0239] Então, a insulina monopeguilada purificada e um fragmento Fc de imunoglobulina foram misturados a uma razão molar de 1:1,2, e a concentração total de proteína foi ajustada em 20 mg/ml, e reagidos a 25 °C por 15 horas. Em particular, a
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63/67 solução de reação foi preparada misturando-se tampão HEPES 100 mM (pH 8,2) e cloreto de sódio e adicionando-se cianoboroidreto de sódio 20 mM (NaCNBHa) como um agente redutor à mesma.
[0240] Mediante conclusão da reação, a solução de reação foi aplicada à coluna QHP (GE, EUA) com o uso de tampão Tris-HCI (pH 7,5) e um gradiente de concentração de NaCI, aplicada novamente à coluna Source 15ISO (GE, EUA) com o uso de sulfato de amônio e um gradiente de concentração de Tris-HCI (pH 7,5) e, assim, o conjugado de insulina-PEG de 3,4 kDa-Fc de imunoglobulina foi purificado.
[0241] Na presente invenção, o conjugado de insulina-PEG de 3,4 kDa-Fc de imunoglobulina é usado de forma intercambiável com um conjugado de insulina de longa atuação em que um ligante PEG de 3,4 kDa está ligado.
[0242] O conjugado de insulina-PEG de 3,4 kDa-Fc de imunoglobulina eluído foi analisado por SE-HPLC e RP-HPLC e, assim, sua pureza foi confirmada como sendo 98,5% e 97,4%, respectivamente (Figuras 3 e 4). Os resultados da análise de pureza por SDS-PAGE são mostrados na Figura 1.
EXEMPLO 2: PREPARAÇÃO DE CONJUGADO DE INSULINA-PEG DE 3,0 KDA-FC DE IMUNOGLOBULINA [0243] Após dissolver insulina em pó (Biocon, índia) em HCI 10 mM, para a peguilação de PEG 3 K butyr-ALD(2) (PEG que tem um grupo butiraldeído, respectivamente, em ambas as extremidades, Hanmi Fine Chemical, Coréia) à terminação N de cadeia beta de insulina e Fc de imunoglobulina, o conjugado de insulina-PEG de 3 kDa-Fc de imunoglobulina foi preparado e purificado de acordo com as condições de reação de peguilação e purificação do mesmo e as condições da reação com o fragmento Fc de imunoglobulina do mesmo da mesma maneira que no Exemplo
1.
[0244] Na presente invenção, o conjugado de insulina-PEG de 3 kDa-Fc de imunoglobulina é usado de forma intercambiável com um conjugado de insulina de longa atuação em que um ligante PEG de 3 kDa está ligado.
[0245] O conjugado de insulina-PEG de 3 kDa-Fc de imunoglobulina eluído foi analisado por SE-HPLC e IE-HPLC e, assim, sua pureza foi confirmada como sendo
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99,7% e 97,9%, respectivamente (Figuras 3 e 4).
EXEMPLO 3: PREPARAÇÃO DE CONJUGADO DE INSULINA-PEG DE 2,5 KDA-FC DE IMUNOGLOBULINA [0246] Após dissolver insulina em pó (Biocon, índia) em HCI 10 mM, para a peguilação de PEG 2,5 K butyr-ALD(2) (PEG que tem um grupo butiraldeído, respectivamente, em ambas as extremidades, Hanmi Fine Chemical, Coréia) à terminação N de cadeia beta de insulina e Fc de imunoglobulina, o conjugado de insulina-PEG de 2,5 kDa-Fc de imunoglobulina foi preparado e purificado de acordo com as condições de reação de peguilação e purificação do mesmo e as condições da reação com o fragmento Fc de imunoglobulina do mesmo da mesma maneira que no Exemplo 1.
[0247] Na presente invenção, o conjugado de insulina-PEG de 2,5 kDa-Fc de imunoglobulina é usado de forma intercambiável com um conjugado de insulina de longa atuação em que um ligante PEG de 2,5 kDa está ligado.
[0248] O conjugado de insulina-PEG de 2,5 kDa-Fc de imunoglobulina eluído foi analisado por SE-HPLC e RP-HPLC e, assim, sua pureza foi confirmada como sendo 99,4% e 99,4%, respectivamente (Figuras 3 e 4).
EXEMPLO 4: PREPARAÇÃO DE CONJUGADO DE INSULINA-PEG DE 2 KDA-FC DE IMUNOGLOBULINA [0249] Após dissolver insulina em pó (Biocon, índia) em HCI 10 mM, para a peguilação de PEG 2 K butyr-ALD(2) (PEG que tem um grupo butiraldeído, respectivamente, em ambas as extremidades, LAYSAN BIO, EUA) à terminação N de cadeia beta de insulina e Fc de imunoglobulina, o conjugado de insulina-PEG de 2 kDaFc de imunoglobulina foi preparado e purificado de acordo com as condições de reação de peguilação e purificação do mesmo e as condições da reação com o fragmento Fc de imunoglobulina do mesmo da mesma maneira que no Exemplo 1. Entretanto, mediante conclusão da reação, a solução de reação foi aplicada à coluna Source 15Q (GE, EUA) com o uso de tampão Tris-HCI (pH 7,5) e um gradiente de concentração de NaCI, aplicada novamente à coluna Source 15ISO (GE, EUA) com o uso de sulfato de amônio e um gradiente de concentração de Tris-HCI (pH 7,5) e, assim, o conjugado de insulina
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PEG de 2 kDa-Fc de imunoglobulina foi purificado.
[0250] Na presente invenção, o conjugado de insulina-PEG de 2 kDa-Fc de imunoglobulina é usado de forma intercambiável com um conjugado de insulina de longa atuação em que um ligante PEG de 2 kDa está ligado.
[0251] O conjugado de insulina-PEG de 2 kDa-Fc de imunoglobulina eluído foi analisado por SE-HPLC e RP-HPLC e, assim, sua pureza foi confirmada como sendo 99,9% e 99,4%, respectivamente (Figuras 3 e 4).
EXEMPLO 5: PREPARAÇÃO DE CONJUGADO DE INSULINA-PEG DE 1 KDA-FC DE IMUNOGLOBULINA [0252] Após dissolver insulina em pó (Biocon, índia) em HCI 10 mM, para a peguilação de PEG 1 K butyr-ALD(2) (PEG que tem um grupo butiraldeído, respectivamente, em ambas as extremidades, NEKTAR, EUA) à terminação N de cadeia beta de insulina, o conjugado de insulina-PEG de 1 kDa-Fc de imunoglobulina foi preparado e purificado de acordo com as condições de reação de peguilação e purificação do mesmo e as condições da reação com o fragmento Fc de imunoglobulina do mesmo da mesma maneira que no Exemplo 1.
[0253] Na presente invenção, o conjugado de insulina-PEG de 1 kDa-Fc de imunoglobulina é usado de forma intercambiável com um conjugado de insulina de longa atuação em que um ligante PEG de 1 kDa está ligado.
[0254] O conjugado de insulina-PEG de 1 kDa-Fc de imunoglobulina eluído foi analisado por SE-HPLC e RP-HPLC e, assim, sua pureza foi confirmada como sendo 99,8% e 99,2%, respectivamente (Figuras 3 e 4). Os resultados da análise de pureza por SDS-PAGE são mostrados na Figura de 2.
EXEMPLO 6: ANÁLISE DE EFEITO DE DURAÇÃO DE EFEITO DE FÁRMACO DE CONJUGADO DE INSULINA DE LONGA ATUAÇÃO EM RATO NORMAL DE ACORDO COM O COMPRIMENTO DO LIGANTE PEG [0255] A diferença em duração de efeitos de fármaco de acordo com o comprimento do ligante PEG de conjugados de insulina de longa atuação foi confirmada em ratos normais administrando-se os conjugados de insulina de longa atuação preparados acima, aos quais cada um dentre um ligante PEG de 1 kDa, 2 kDa, 2,5 kDa, 3 kDa ou
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3,4 kDa é ligado.
[0256] Ratos normais com oito semanas de vida foram subdivididos em um grupo de controle (veículo), um grupo administrado com um conjugado de insulina de longa duração em que um ligante PEG de 1 kDa é ligado (65,1 nmol/kg), um grupo administrado com um conjugado de insulina de longa duração em que um ligante PEG de 2 kDa é ligado (65,1 nmol/kg), um grupo administrado com um conjugado de insulina de longa duração em que um ligante PEG de 2,5 kDa PEG é ligado (65,1 nmol/kg), um grupo administrado com um conjugado de insulina de longa duração em que um ligante PEG de 3 kDa é ligado (65,1 nmol/kg) e um grupo administrado com um conjugado de insulina de longa duração em que um ligante PEG de 3,4 kDa é ligado (65,1 nmol/kg), respectivamente. Os ratos normais receberam por via subcutânea uma vez os materiais de teste para 3 ratos em cada grupo, e suas amostras de sangue total foram coletadas através de suas veias caudais em 1, 4, 8, 24, 48 e 72 horas, respectivamente, adicionadas em cada um dos microtubos de 1,5 ml, centrifugadas a 5.000 rpm por 10 minutos à temperatura ambiente, e cada soro foi separado e armazenado a -20 °C, respectivamente. Cada concentração dos conjugados de insulina contidos nos soros para cada grupo foi quantificada por ensaio ELISA. O ensaio ELISA foi realizado de tal maneira que os soros coletados a cada tempo e lgG4-HPR anti-humana (Alpha Diagnosis, η2 10124) fossem simultaneamente adicionados a cada placa revestida com anticorpo monoclonal de insulina (ALPCO, n2 80-INSHU-E10.1), reagidos à temperatura ambiente por 1 hora, deixados desenvolver cores com o reagente TMB e sua absorbância fosse medida a 450 nm, respectivamente.
[0257] Como resultado, em comparação com o grupo que recebeu conjugado de insulina de longa atuação em que um ligante PEG de 3,4 kDa é ligado, o grupo que recebeu conjugado de insulina de longa atuação em que um ligante PEG de 1 kDa PEG é ligado mostrou um aumento de 1,84 vez em AUC; o grupo que recebeu conjugado de insulina de longa atuação em que um ligante PEG de 2 kDa é ligado mostrou um aumento de 1,80 vez em AUC; o grupo que recebeu conjugado de insulina de longa atuação em que um ligante PEG de 2,5 kDa é ligado mostrou um aumento de 1,41 vez em AUC; e o grupo que recebeu conjugado de insulina de longa atuação em que um ligante PEG de
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67/67 kDa é ligado mostrou um aumento de 1,43 vez em AUC, respectivamente (Figura 6). [0258] Esses resultados sugerem que, surpreendentemente, conforme o tamanho do polietilenoglicol usado como o ligante se torna menor, a meia-vida in vivo do conjugado de insulina aumenta significativamente e, assim, pode ser fornecido como uma preparação de insulina estável e usado eficazmente para o tratamento de diabetes.
[0259] Adicionalmente, conforme o tamanho do polietilenoglicol usado como o ligante se torna menor, a meia-vida in vivo de um conjugado em que um polipeptídeo fisiologicamente ativo está ligado pode ser aumentada significativamente, permitindo, assim, que o mesmo seja fornecido como uma preparação estável.
[0260] A partir do supracitado, uma pessoa versada na técnica à qual a presente invenção pertence poderá entender que a presente invenção pode ser incorporada em outras formas específicas sem modificar os conceitos técnicos ou características essenciais da presente invenção. Em relação a isso, as modalidades exemplificativas reveladas no presente documento têm apenas propósitos ilustrativos e não devem ser interpretadas como limitantes do escopo da presente invenção. Pelo contrário, a presente invenção é destinada a cobrir não apenas as modalidades exemplificativas, como também várias alternativas, modificações, equivalentes e outras modalidades que podem ser incluídas no espírito e escopo da presente invenção, conforme definido pelas reivindicações anexas.

Claims (19)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Conjugado da Fórmula 1 abaixo:
    Fórmula 1
    X-L-F caracterizado por:
    X ser um material fisiologicamente ativo;
    L, que é um ligante, ser polietilenoglicol que tem um tamanho maior que 0 kDa a menor que 3,4 kDa; e
    F ser um material com capacidade de aumentar meia-vida in vivo do material fisiologicamente ativo.
  2. 2. Conjugado, de acordo com a reivindicação 1, em que o conjugado é caracterizado por exibir uma meia-vida in vivo aumentada em comparação com um conjugado que tem o mesmo X e F que o conjugado, mas tem um L diferente, como um ligante, que é polietilenoglicol que tem um tamanho de 3,4 kDa.
  3. 3. Conjugado, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por L ser polietilenoglicol que tem um tamanho maior que 0 kDa a 3 kDa ou menor.
  4. 4. Conjugado, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o material fisiologicamente ativo ser selecionado a partir do grupo que consiste em toxinas; agonistas de receptor de peptídeo-1 semelhante a glucagon (GLP-1); agonistas de receptor de glucagon; agonistas de receptor de polipeptídeo inibidor gástrico (GIP); agonistas de receptor de fator de crescimento de fibroblastos (FGF); agonistas de receptor de colecistocinina; agonistas de receptor de gastrina; agonistas de receptor de melanocortina; materiais que se ligam a dois ou mais receptores dentre receptor de GLP, receptor de glucagon e receptor de GIP; somatostatina; peptídeo YY (PYY); neuropeptídeo Y (NPY); oxintomodulina; fator de crescimento de fibroblastos (FGF); bradicinina; eledoisina; oxitocina; vasopressina; sermorelina; peptideos de liberação de prolactina; orexina; peptídeo de liberação de tiroide; calmodulina; motilina; peptideos intestinais vasoativos; peptideos natriuréticos atriais (ANP); peptideos natriuréticos do tipo C (CNP); neurocinina A; neuromedina; renina;
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    2/7 endotelina; peptídeos de sarafotoxina; peptídeos de carsomorfina; dermorfina; dinorfina; endorfina; encefalinas; receptores de fator de necrose tumoral; receptores de uroquinase; timopetina; timulina; timopentina; timosina; fatores humorais timicos; adrenomodulina; alatostatina; fragmentos de proteínas amiloides β; peptídeos antibióticos; peptídeos antioxidantes; bombesina; osteocalcina; peptídeos de CART; E-seletina; molécula de adesão intercelular 1 (ICAM-1); molécula de adesão celular vascular 1 (VCAM-1); leucocina; kringle-5; laminina; inibina; galanina; fibronectina; pancreastatina; fuzeon; peptídeos semelhantes a glucagon; receptores acoplados à proteína G; fatores de crescimento eritropoiéticos; leucopoietina; amilina; hormônio de crescimento humano; hormônio de liberação de hormônio do crescimento; peptídeos de liberação de hormônio de crescimento; interferões; receptores de interferon; fatores estimulantes de colônias; interleucinas; receptores de interleucina; enzimas; proteínas de ligação de interleucina; proteínas de ligação de citocinas; fatores de ativação de macrófagos; peptídeos de macrófagos; fatores de células B; fatores de células T; proteína A; fatores inibidores de alergia; glicoproteínas de necrose; imunotoxinas; linfotoxinas; fatores de necrose tumoral; supressores de tumor; fatores de crescimento de transformação; antitripsina a-1; albumina; a-lactalbumina; apolipoproteína-E; eritropoietina; eritropoietina com alto teor de glicosilato; angiopoietinas; hemoglobinas; trombina; peptídeos de ativação de receptor de trombina; trombomodulina; fator de coagulação sanguínea VII; fator de coagulação sanguínea Vila; fator de coagulação sanguínea VIII; fator de coagulação sanguínea IX; fator de coagulação sanguínea XIII; ativadores do plasminogênio; peptídeos de ligação de fibrina; uroquinase; estreptoquinase; hirudina; proteína C; proteína reativa a C; inibidores de renina; inibidores de colagenase; superóxido dismutação; leptina; fator de crescimento derivado de plaquetas; fator de crescimento epitelial; fator de crescimento epidérmico; angiostatina; angiotensina; fator de crescimento morfogenético ósseo; proteína morfogenética óssea; calcitonina; insulina; atriopeptina; fator indutor de cartilagem; elcatonina; fator de ativação do tecido conjuntivo; inibidor da via de fator de tecido; hormônio folículo-estimulante; hormônio luteinizante; hormônio de liberação de
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    3/7 hormônio luteinizante; fatores de crescimento de nervo; fator de axogênese-1; peptídeo cérebro-natriurético; fator neurotrófico derivado da glial; netrina; fator inibitório de neutrófilos; fator neurotrófico; neurturina; hormônio da paratireoide; relaxina; secretina; somatomedina; fator de crescimento semelhante à insulina; hormônio adrenocortical; glucagon; colecistocinina; polipeptídeos pancreáticos; peptídeos de liberação de gastrina; peptídeos inibidores da gastrina; fator de liberação de corticotropina; hormônio estimulante da tireoide; autotaxina; lactoferrina; miostatina; proteína neuroprotetora dependente de atividade (ADNP), β-secretasel (BACE1), proteína precursora amiloide (APP), molécula de adesão celular neural (NCAM), receptor amiloide β, tau, para produtos finais de glicação avançada (RAGE), α-sinucleína, ou agonistas ou antagonistas dos mesmos; receptores, agonistas de receptor; antígenos de superfície celular; anticorpo monoclonal; anticorpo policlonal; fragmentos de anticorpo; antígenos de vacina derivada de vírus; polipeptídeos híbridos ou polipeptídeos químicos que ativam pelo menos um agonista do receptor; e análogos dos mesmos.
  5. 5. Conjugado, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por:
    a toxina ser selecionada a partir do grupo que consiste em maitansina ou um derivado da mesma, auristatina ou um derivado da mesma, duocarmicina ou um derivado da mesma, e pirrolobenzodiazepina (PBD) ou um derivado da mesma;
    o agonista de receptor de peptídeo-1 semelhante a glucagon (GLP-1) ser selecionado a partir do grupo que consiste em peptídeo-1 semelhante a glucagon (GLP-1) nativo, exendina-3 nativa, exendina-4 nativa e análogos dos mesmos;
    o agonista de receptor de FGF ser selecionado a partir do grupo que consiste em FGF1 ou um análogo do mesmo, FGF19 ou um análogo do mesmo, FGF21 ou um análogo do mesmo, e FGF23 ou um análogo do mesmo;
    o interferon ser selecionado a partir do grupo que consiste em interferon-a, interferon-β, e interferon-γ;
    o receptor de interferon ser selecionado a partir do grupo que consiste em receptor de interferon-α, receptor de interferon-β, receptor de interferon-γ e receptores
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    4/7 de interferon tipo I solúveis;
    a interleucina ser selecionada a partir do grupo que consiste em interleucina-1, interleucina-6, interleucina-11, interleucina-16, interleucina-21, interleucina-2, interleucina-7, interleucina-12, interleucina-17, interleucina-22, interleucina-3, interleucina-8, interleucina-13, interleucina-18, interleucina-23, interleucina-4, interleucina-9, interleucina-14, interleucina-19, interleucina-24, interleucina-5, interleucina-10, interleucina-15, interleucina-20, interleucina-25, interleucina-26, interleucina-27, interleucina-28, interleucina-29, e interleucina-30;
    o receptor de interleucina ser receptor de interleucina-1 ou receptor de interleucina-4;
    a enzima ser selecionada a partir do grupo que consiste em β-glicosidase, a-galactosidase, β-galactosidase, iduronidase, iduronate-2-sulfatase, galactose-6sulfatase, α-glicosidase ácida, ceramidase ácoda, esfingomielinase ácida, galactocerebrosidase, arilssulfatase A, arilssulfatase B, β-hexosaminidase A, βhexosaminidase B, heparina ΛΖ-sulfatase, a-D-mannosidase, β-glicuronidase, Nacetilgalactosamina-6 sulfatase, lipase ácida lisossomal, a-AZ-acetil-glicosaminidase, glicocerebrosidase, butirilcolinesterase, quitinase, glutamato descarboxilase, imiglucerase, lipase, uricase, acetil-hidrolase de fator de ativação de plaqueta, endopeptidase neutral, mieloperoxidase, α-galactosidase-A, agalsidase a, agalsidase β, α-L-iduronidase, butirilcolinesterase, qutinase, glutamato descarboxilase, e imiglucerase;
    a proteína de ligação de interleucina ser IL-18bp;
    a proteína de ligação de citocina ser proteína de ligação de fator de necrose tumoral (TNF);
    os fatores de crescimento de nervo serem selecionados a partir do grupo que consiste em fator de crescimento de nervo, fator neurotrófico ciliar, fator-1 de axogênese, peptídeo natriurético de cérebro, fator neurotrófico derivado de glial, netrina, fator inibidor de neutrófilo, fator neurotrófico, e neurturina;
    o receptor de miostatina ser selecionado a partir do grupo que consiste em
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    5/7 TNFR (P75), TNFR (P55), receptor de IL-1, receptor de VEGF, e receptor de fato de ativação de célula B;
    o antagonista de receptor de miostatina ser IL1 -Ra;
    o antígeno de superfície de célula ser selecionado a partir do grupo que consiste em CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD11 a, CD11 b, CD18, CD19, CD20, CD23, CD25, CD33, CD38, CD40, CD45, e CD69; e os fragmentos de anticorpo serem selecionados a partir do grupo que consiste em scFv, Fab, Fab', F(ab')2, e Fd.
  6. 6. Conjugado, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por ο material fisiologicamente ativo ser exendina-3 inativa ou um análogo da mesma; exendina-4 nativa ou um análogo da mesma; insulina nativa ou um análogo da mesma; GLP-1 nativo ou um análogo do mesmo; GLP-2 nativo ou um análogo do mesmo; oxintomodulina nativa ou um análogo da mesma; glucagon nativo ou um análogo do mesmo; fator de crescimento de fibroblasto nativo ou um análogo do mesmo; grelina nativa ou um análogo da mesma; calcitonina nativa ou um análogo da mesma; fator de estimulação de colônia de granulócito nativo ou um análogo do mesmo; ou um material que se liga a dois ou mais receptores dentre receptor de GLP, receptor de glucagon e receptor de GIP.
  7. 7. Conjugado, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o material fisiologicamente ativo ser insulina nativa ou um análogo de insulina que tem uma afinidade de ligação reduzida para um receptor de insulina em comparação com insulina nativa.
  8. 8. Conjugado, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por o análogo de insulina ter uma afinidade de ligação reduzida para um receptor de insulina em comparação com insulina nativa e compreende pelo menos uma deleção ou modificação de aminoácido na cadeia A ou cadeia B de insulina nativa.
  9. 9. Conjugado, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por o análogo de insulina ser um análogo de insulina no qual pelo menos um aminoácido, selecionado a partir do grupo que consiste no 1s aminoácido, no 2S aminoácido, no 3S
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    6/7 aminoácido, no 5s aminoácido, no 8s aminoácido, no 10s aminoácido, no12 aminoácido, no 16s aminoácido, no 23s aminoácido, no 24s aminoácido, no25 aminoácido, no 26s aminoácido, no 27s aminoácido, no 28s aminoácido, no29 aminoácido, e no 30s aminoácido da cadeia B de insulina, e no 1s aminoácido, no 2s aminoácido, no 5s aminoácido, no 8s aminoácido, no 10s aminoácido, no12 aminoácido, no 14s aminoácido, no 16s aminoácido, no 17s aminoácido, no18 aminoácido, no 19s aminoácido, e no 21s aminoácido da cadeia A de insulina, é substituído por um aminoácido diferente ou deletado.
  10. 10. Conjugado, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por o análogo de insulina ser um análogo de insulina no qual pelo menos um aminoácido, selecionado a partir do grupo que consiste no 8S aminoácido, no 23s aminoácido, no 24s aminoácido, e no 25s aminoácido da cadeia B de insulina nativa, e no 1s aminoácido, no 2S aminoácido, no 14s aminoácido, e no 19s aminoácido da cadeia A de insulina nativa, é substituído por um aminoácido diferente.
  11. 11. Conjugado, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado por o aminoácido de substituição diferente ser selecionado a partir do grupo que consiste em alanina, ácido glutamínico, asparagina, isoleucina, valina, glutamina, glicina, lisina, histidina, cisteína, fenilalanina, triptofano, prolina, serina, treonina e ácido aspártico.
  12. 12. Conjugado, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por F ser selecionado a partir do grupo que consiste em polímeros, ácidos graxos, colesterol, albumina e um fragmento dos mesmos, materiais de ligação de albumina, um polímero de unidades de repetição de uma sequência de aminoácidos particular, anticorpos, fragmentos de anticorpo, materiais de ligação de FcRn, tecidos conectivos in vivo, nucleotídeos, fibronectina, transferrina, sacarídeos, heparina e elastina.
  13. 13. Conjugado, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado por o polímero ser selecionado a partir do grupo que consiste em polietileno glicol, polipropileno glicol, um copolímero de etileno glicol-propileno glicol, poliol polioxietilado, álcool polivinílico, um polissacarídeo, dextrano, éter polivinil etílico, um polímero biodegradável, um polímero de lipídio, quitinas, ácido hialurônico, um
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    7/7 oligonucleotídeo e uma combinação dos mesmos.
  14. 14. Conjugado, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por F estar em uma região Fc de imunoglobulina.
  15. 15. Conjugado, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por F estar em uma região Fc de IgG.
  16. 16. Método para preparar o conjugado, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender:
    reagir polietilenoglicol, que tem um tamanho maior que 0 kDa a menor que
    3,4 kDa e pelo menos dois grupos funcionais terminais, com qualquer um dentre um material fisiologicamente ativo ou um material com capacidade de aumentar meia-vida in vivo do material fisiologicamente ativo para preparar polietilenoglicol, ao qual um dentre o material fisiologicamente ativo ou o material com capacidade de aumentar meia-vida in vivo do material fisiologicamente ativo é ligado de modo covalente e tem pelo menos um grupo funcional terminal; e reagir o polietilenoglicol preparado na etapa (a) com o outro dentre um material fisiologicamente ativo ou um material com capacidade de aumentar meia-vida in vivo do material fisiologicamente ativo para preparar um conjugado no qual o material fisiologicamente ativo e um material com capacidade de aumentar meia-vida in vivo do material fisiologicamente ativo são ligados de modo covalente através de polietilenoglicol que tem um tamanho maior que 0 kDa a menor que 3,4 kDa.
  17. 17. Preparação de atuação longa com duração e estabilidade in vivo aprimoradas caracterizada por compreender o conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15.
  18. 18. Preparação para prevenir ou tratar diabetes caracterizada por compreender conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 11.
  19. 19. Método para tratar diabetes caracterizado por compreender administrar a preparação para prevenir ou tratar diabetes, como definido na reivindicação 18, a um indivíduo que necessitada mesma.
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