RU2773823C2

RU2773823C2 - Конъюгат физиологически активного вещества длительного действия и его применение

Info

Publication number: RU2773823C2
Application number: RU2019126074A
Authority: RU
Inventors: Юн Джин Пак; Чон-Су Ли; Ин Юнг ЧОЙ
Original assignee: Ханми Фарм. Ко., Лтд.
Priority date: 2017-02-03
Filing date: 2018-02-02
Publication date: 2022-06-10

Abstract

Изобретение относится к конъюгату формулы 1: X-L-F, где Х представляет собой физиологически активное вещество, представляющее собой природный человеческий инсулин или аналог человеческого инсулина, который имеет пониженную аффинность связывания в отношении инсулинового рецептора по сравнению с природным инсулином; L, будучи линкером, представляет собой полиэтиленгликоль, имеющий размер от более чем 0 кДа до менее чем 3,4 кДа; и F представляет собой область Fc иммуноглобулина, где конъюгат демонстрирует увеличенный период полувыведения in vivo по сравнению с конъюгатом, который имеет такой же Х и F, что и данный конъюгат, но имеет другой L в качестве линкера, который представляет собой полиэтиленгликоль, имеющий размер 3,4 кДа. Также предложен способ получения конъюгата и его композиции. 5 н. и 6 з.п. ф-лы, 6 ил., 6 пр.

Description

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к конъюгату, который включает физиологически активное вещество, линкер и вещество, способное увеличивать период полувыведения in vivo физиологически активного вещества; к способу его получения; и

его препарату.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

В общем, физиологически активные полипептиды легко денатурируют и подвергаются деградации протеазами in vivo из-за их плохой стабильности или относительно легко удаляются почками из-за их относительно малого размера. Соответственно, для поддержания их концентрации и титра в крови необходимо, чтобы белковые лекарственные средства, содержащие эти физиологически активные полипептиды в качестве фармацевтических ингредиентов, чаще вводились пациентам. Однако, в случае белковых лекарственных средств, главным образом вводимых пациентам в виде инъекций, требуется частое введение посредством инъекций для поддержания концентрации в крови физиологически активных полипептидов, что вызывает боль у пациентов и также влечет за собой высокие затраты на лечение. Для решения данных проблем предприняли много усилий для максимизации эффективности белковых лекарственных средств посредством увеличения их стабильности в крови при одновременном поддержании их концентрации в крови на высоком уровне в течение длительного периода времени.

Тем временем, инсулин представляет собой гормон, контролирующий уровень глюкозы в крови, секретируемый поджелудочной железой организма человека, и он служит для поддержания уровней глюкозы в крови в пределах нормального интервала при одновременной транспортировке избытка глюкозы в крови к клеткам, поставляя клеткам, посредством этого, источник энергии. Однако у пациентов с диабетом не могут поддерживаться нормальные функции инсулина из-за недостаточности инсулина, резистентности к инсулину или потери функции бета-клеток, и, таким образом, глюкоза в крови не может использоваться в качестве источника энергии. В результате пациенты с диабетом демонстрируют симптом высоких уровней глюкозы в крови, называемый гипергликемией, и, в конечном счете, выделяют глюкозу в мочу, что ассоциировано с несколькими осложнениями.

Соответственно, инсулиновая терапия является важной для диабетических пациентов с неспособностью продуцировать инсулин (тип I) или с резистентностью к инсулину (тип II), и уровни глюкозы в крови данных пациентов с диабетом могут поддерживаться на нормальных уровнях посредством введения инсулина. Однако, подобно другим белкам и пептидным гормонам, инсулин имеет крайне короткий период полувыведения in vivo и, таким образом, имеет недостаток в том, что его необходимо вводить неоднократно, а частое введение приводит к тяжелой боли и неудобству для пациентов. Соответственно, были проведены исследования для разработки разных типов белковых композиций, химических конъюгатов (конъюгаты жирных кислот и конъюгаты полиэтиленового полимера) и т.д. таким образом, чтобы улучшать качество жизни пациентов посредством уменьшения частоты введения за счет увеличения периода полувыведения in vivo данных белков. Примеры инсулиновых препаратов длительного действия, присутствующих в настоящее время на рынке, включают инсулин гларгин - Lantus^® (Sanofi-Aventis: продолжительность действия примерно 20-22 часа); инсулин детемир - Levemir^® (Novo Nordisk: продолжительность действия примерно 18-22 часа); и инсулин деглудек - Tresiba^® (продолжительность действия примерно 40 часов). Данные инсулиновые препараты длительного действия являются подходящими в качестве базового инсулина, так как отсутствует пик концентрации инсулина в крови, но они все еще имеют неудобство в том, что требуется введение один или два раза в сутки, так как их период полувыведения не является достаточно длительным. Соответственно, имеется предел в решении задачи, заключающейся в увеличении удобства для пациента посредством значительного уменьшения частоты введения у пациентов с диабетом, требующих долговременного введения.

В нескольких предыдущих статьях, таких как Authier F et al. (Biochem J. 1998 Jun 1; 332 (Pt 2): 421-430), Duckworth WC et al. (Endocr Rev. 1998 Oct; 19(5): 608-624.) и Valera Mora ME et al. (J Am Coll Nutr. 2003 Dec; 22(6): 487-493), описан способ удаления инсулина in vivo. При обзоре данных статей становится известно, что больше, чем 50% инсулина удаляется из почек, а остальной инсулин устраняется посредством опосредованного рецептором клиренса (RMC) в сайтах-мишенях, таких как мышцы, жировая ткань, печень и т.д.

Соответственно, имеется возрастающая потребность в разработке препаратов физиологически активного вещества, в частности инсулиновых препаратов, которые могут уменьшать частоту введения у пациентов из-за значительно повышенного периода полувыведения в крови, при одновременной способности избегать RMC.

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Задачей настоящего изобретения является предложение конъюгата физиологически активного вещества для продления периода полувыведения in vivo данного физиологически активного вещества.

В частности, задачей настоящего изобретения является предложение конъюгата физиологически активного вещества, в котором физиологически активное вещество и вещество, способное увеличивать период полувыведения in vivo физиологически активного вещества, связаны посредством полиэтиленгликоля, и указанный полиэтиленгликоль имеет размер от более чем 0 кДа до менее чем 3,4 кДа.

Другой задачей настоящего изобретения является предложение композиции, содержащей указанный конъюгат.

В частности, задачей настоящего изобретения является предложение препарата длительного действия, содержащего указанный конъюгат, с улучшенной продолжительностью действия in vivo и стабильностью.

Кроме того, задачей настоящего изобретения является предложение препарата, содержащего указанный конъюгат, для предупреждения или лечения диабета.

Еще одной задачей настоящего изобретения является предложение способа получения указанного конъюгата.

Еще одной задачей настоящего изобретения является предложение применения указанного конъюгата или композиции, содержащей указанный конъюгат, для применения в получении лекарственного средства.

Техническое решение

Для решения приведенных выше задач, согласно одному аспекту настоящего изобретения предложен конъюгат физиологически активного вещества для продления периода полувыведения in vivo физиологически активного вещества.

В конкретном воплощении настоящее изобретение относится к конъюгату физиологически активного вещества, в котором физиологически активное вещество и вещество, способное увеличивать период полувыведения in vivo физиологически активного вещества, связаны посредством полиэтиленгликоля, и данный полиэтиленгликоль имеет размер от более чем 0 кДа до менее чем 3,4 кДа.

В конъюгате по предыдущему конкретному воплощению данный конъюгат представлен Формулой 1, приведенной ниже:

[Формула 1]

X-L-F,

в которой:

Х представляет собой физиологически активное вещество;

L, будучи линкером, представляет собой полиэтиленгликоль, имеющий размер от более чем 0 кДа до менее чем 3,4 кДа; и

F представляет собой вещество, способное увеличивать период полувыведения in vivo физиологически активного вещества.

В конъюгате по любому из предшествующих конкретных воплощений данный конъюгат демонстрирует увеличенный период полувыведения in vivo по сравнению с конъюгатом, который отличается от данного конъюгата только тем, что L представляет собой полиэтиленгликоль, имеющий размер 3,4 кДа.

В конъюгате по любому из предшествующих конкретных воплощений L представляет собой полиэтиленгликоль, имеющий размер от более чем 0 кДа до 3 кДа или меньше.

В конъюгате по любому из предшествующих конкретных воплощений физиологически активное вещество представляет собой физиологически активный полипептид.

В конъюгате по любому из предшествующих конкретных воплощений физиологически активное вещество выбрано из группы, состоящей из следующих: токсины; агонисты рецептора глюкагоноподобного пептида-1 (GLP-1); агонисты рецептора глюкагона; агонисты рецептора желудочного ингибирующего полипептида (GIP); агонисты рецептора фактора роста фибробластов (FGF); агонисты рецептора холецистокинина; агонисты рецептора гастрина; агонисты рецептора меланокортина; вещества, связывающиеся с двумя или более чем двумя рецепторами среди рецептора GLP, рецептора глюкагона и рецептора GIP; соматостатин; пептид YY (PYY); нейропептид Y (NPY); оксинтомодулин; фактор роста фибробластов (FGF); брадикинин; эледоизин; окситоцин; вазопрессин; серморелин; пептиды, высвобождающие пролактин; орексин; тиролиберины; кальмодулин; мотилин; вазоактивные кишечные пептиды; предсердные натрийуретические пептиды (ANP); натрийуретические пептиды С-типа (CNP); нейрокинин А; нейромедин; ренин; эндотелин; сарафотоксиновые пептиды; карсоморфиновые пептиды; дерморфин; динорфин; эндорфин; энкефалин; рецепторы фактора некроза опухолей; рецепторы урокиназы; тимопоэтин; тимулин; тимопентин; тимозин; тимические гуморальные факторы; адреномодуллин; аллатостатин; фрагменты амилоидного β-белка; антибиотические пептиды; антиоксидантные пептиды; бомбезин; остеокальцин; пептиды CART; E-селектин; молекула межклеточной адгезии 1 (ICAM-1); молекула адгезии 1 клеток сосудов (VCAM-1); лейкокин; крингл-5; ламинин; ингибин; галанин; фибронектин; панкреастатин; фузеон; глюкагоноподобные пептиды (GLP-1 или GLP-2, и т.д.); рецепторы, связанные с G-белком; эритропоэтические факторы роста; лейкопоэтин; амилин; человеческий гормон роста; соматолиберин; пептиды, высвобождающие гормон роста; интерфероны; рецепторы интерферонов; колониестимулирующие факторы; интерлейкины; рецепторы интерлейкинов; ферменты; интерлейкинсвязывающие белки; цитокинсвязывающие белки; факторы, активирующие макрофаги; пептиды макрофагов; факторы В-клеток; факторы Т-клеток; белок А; факторы, ингибирующие аллергию; гликопротены некроза; иммунотоксины; лимфотоксины; факторы некроза опухоли; супрессоры опухолей; трансформирующие факторы роста; α-1 антитрипсин; альбумин; α-лактальбумин; аполипопротеин-Е; эритропоэтин; высокогликозилированный эритропоэтин; ангиопоэтины; гемоглобины; тромбин; пептиды, активирующие рецептор тромбина; тромбомодулин; фактор крови VII; фактор крови VIIa; фактор крови VIII; фактор крови IX; фактор крови XIII; активаторы плазминогена; фибринсвязывающие пептиды; урокиназа; стрептокиназа; гирудин; белок С; С-реактивный белок; ингибиторы ренина; ингибиторы коллагеназы; супероксиддисмутаза; лептин; фактор роста, выделенный из тромбоцитов; эпителиальный фактор роста; эпидермальный фактор роста; ангиостатин; ангиотензин; морфогенетический фактор роста кости; морфогенетический белок кости; кальцитонин; инсулин; атриопептин; хрящевой индуцирующий фактор; элкатонин; активирующий фактор соединительной ткани; ингибитор пути тканевого фактора; фолликулостимулирующий гормон; лютеинизирующий гормон; люлиберин; факторы роста нервов; фактор-1 аксогенеза; мозговой натрийуретический пептид; глиальный нейротрофический фактор; нетрин; фактор, ингибирующий нейтрофилы; нейротрофический фактор; нейртурин; паратироидный гормон; релаксин; секретин; соматомедин; инсулиноподобный фактор роста; адренокортикальный гормон; глюкагон; холецистокинин; полипептиды поджелудочной железы; гастрин- высвобождающие пептиды; пептиды, ингибирующие гастрин; кортиколиберин; тиреотропин; аутотаксин; лактоферрин; миостатин; зависимый от активности нейрозащитный белок (ADNP), β-секретаза 1 (ВАСЕ1), белок-предшественник амилоида (АРР), молекула адгезии нервной клетки (NCAM), амилоид β, тау, рецептор конечных продуктов усиленного гликирования (RAGE), α-синуклеин или его агонисты, или антагонисты; рецепторы, агонисты рецепторов; антигены клеточной поверхности; моноклональное антитело; поликлональное антитело; фрагменты антитела; антигены вакцины вирусного происхождения; гибридные полипептиды или химерные полипептиды, которые активируют по меньшей мере один агонист рецептора; и их аналоги.

В конъюгате по любому из предшествующих конкретных воплощений физиологически активное вещество одновременно активирует по меньшей мере два рецептора.

В конъюгате по любому из предшествующих конкретных воплощений

токсин выбран из группы, состоящей из майтансина или его производного, ауристатина или его производного, дуокармицина или его производного, и пирролобензодиазепина (PBD) или его производного;

агонист рецептора глюкагоноподобного пептида-1 (GLP-1) выбран из группы, состоящей из природного глюкагоноподобного пептида-1 (GLP-1), природного

эксендина-3, природного эксендина-4 и их аналогов;

агонист рецептора FGF выбран из группы, состоящей из FGF1 или его аналога, FGF19 или его аналога, FGF21 или его аналога и FGF23 или его аналога;

интерферон выбран из группы, состоящей из интерферона-α, интерферона-β и интерферона-γ;

рецептор интерферона выбран из группы, состоящей из рецептора интерферона-α, рецептора интерферона-β, рецептора интерферона-γ и растворимых рецепторов интерферона типа I;

интерлейкин выбран из группы, состоящей из интерлейкина-1, интерлейкина-2, интерлейкина-3, интерлейкина-4, интерлейкина-5, интерлейкина-6, интерлейкина-7, интерлейкина-8, интерлейкина-9, интерлейкина-10, интерлейкина-11, интерлейкина-12, интерлейкина-13, интерлейкина-14, интерлейкина-15, интерлейкина-16, интерлейкина-17, интерлейкина-18, интерлейкина-19, интерлейкина-20, интерлейкина-21, интерлейкина-22, интерлейкина-23, интерлейкина-24, интерлейкина-25, интерлейкина-26, интерлейкина-27, интерлейкина-28, интерлейкина-29 и интерлейкина-30;

рецептор интерлейкина представляет собой рецептор интерлейкина-1 или рецептор интерлейкина-4;

фермент выбран из группы, состоящей из β-глюкозидазы, α-галактозидазы, β-галактозидазы, идуронидазы, идуронат-2-сульфатазы, галактозо-6-сульфатазы, кислой α-глюкозидазы, кислой церамидазы, кислой сфингомиелиназы, галактоцереброзидазы, арилсульфатазы А, арилсульфатазы В, β-гексозаминидазы А, β-гексозаминидазы В, гепарин-N-сульфатазы, α-D-маннозидазы, β-глюкуронидазы, N-ацетилгалактозамин-6-сульфатазы, лизосомальной кислой липазы, α-N-ацетил-глюкозаминидазы, глюкоцереброзидазы, бутирилхолинэстеразы, хитиназы, глутаматдекарбоксилазы, имиглюцеразы, липазы, уриказы, ацетилгидролазы фактора активации тромбоцитов, нейтральной эндопептидазы, миелопероксидазы, α-галактозидазы-А, агалсидазы α, агалсидазы β, α-L-идуронидазы, бутирилхолинэстеразы, хитиназы, глутаматдекарбоксилазы и имиглюцеразы;

интерлейкинсвязывающий белок представляет собой IL-18bp;

цитокинсвязывающий белок представляет собой белок, связывающий фактор некроза опухолей (TNF);

факторы роста нервов выбраны из группы, состоящей из фактора роста нервов, цилиарного нейротрофического фактора, фактора аксогенеза-1, мозгового натрийуретического пептида, глиального нейротрофического фактора, нетрина, фактора, ингибирующего нейтрофилы, нейротрофического фактора и нейртурина;

рецептор миостатина выбран из группы, состоящей из TNFR (P75), TNFR (P55), рецептора IL-1, рецептора VEGF (фактор роста эндотелия сосудов) и рецептора фактора, активирующего В-клетки;

антагонист рецептора миостатина представляет собой IL1-Ra;

антиген клеточной поверхности выбран из группы, состоящей из CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD11a, CD11b, CD18, CD19, CD20, CD23, CD25, CD33, CD38, CD40, CD45 и CD69; и

фрагменты антитела выбраны из группы, состоящей из scFv, Fab, Fab', F(ab')₂ и Fd.

В конъюгате по любому из предшествующих конкретных воплощений физиологически активное вещество представляет собой природный эксендин-3 или его аналог; природный эксендин-4 или его аналог; природный инсулин или его аналог; природный GLP-1 или его аналог; природный GLP-2 или его аналог; природный оксинтомодулин или его аналог; природный глюкагон или его аналог; природный фактор роста фибробластов или его аналог; природный грелин или его аналог; природный кальцитонин или его аналог; природный гранулоцитарный колониестимулирующий фактор или его аналог; или вещество, связывающееся с двумя или более чем двумя рецепторами среди рецептора GLP, рецептора глюкагона и рецептора GIP.

В конъюгате по любому из предшествующих конкретных воплощений физиологически активное вещество представляет собой природный инсулин или аналог инсулина, который имеет пониженную аффинность связывания в отношении инсулинового рецептора по сравнению с природным инсулином.

В конъюгате по любому из предшествующих конкретных воплощений аналог инсулина представляет собой двухцепочечную форму, включающую и цепь А, и цепь В.

В конъюгате по любому из предшествующих конкретных воплощений аналог инсулина имеет пониженную аффинность связывания в отношении инсулинового рецептора по сравнению с природным инсулином и включает по меньшей мере одну аминокислотную модификацию или делецию в цепи А или цепи В природного инсулина.

В конъюгате по любому из предшествующих конкретных воплощений аналог инсулина представляет собой аналог инсулина, в котором по меньшей мере одна аминокислота, выбранная из группы, состоящей из 1-й аминокислоты, 2-й аминокислоты, 3-й аминокислоты, 5-й аминокислоты, 8-й аминокислоты, 10-й аминокислоты, 12-й аминокислоты, 16-й аминокислоты, 23-й аминокислоты, 24-й аминокислоты, 25-й аминокислоты, 26-й аминокислоты, 27-й аминокислоты, 28-й аминокислоты, 29-й аминокислоты и 30-й аминокислоты цепи В инсулина, и 1-й аминокислоты, 2-й аминокислоты, 5-й аминокислоты, 8-й аминокислоты, 10-й аминокислоты, 12-й аминокислоты, 14-й аминокислоты, 16-й аминокислоты, 17-й аминокислоты, 18-й аминокислоты, 19-й аминокислоты и 21-й аминокислоты цепи А инсулина, заменена другой аминокислотой или делетирована.

В конъюгате по любому из предшествующих конкретных воплощений аналог инсулина представляет собой аналог инсулина, в котором по меньшей мере одна аминокислота, выбранная из группы, состоящей из 8-й аминокислоты, 23-й аминокислоты, 24-й аминокислоты и 25-й аминокислоты цепи В природного инсулина, и 1-й аминокислоты, 2-й аминокислоты, 14-й аминокислоты и 19-й аминокислоты цепи А природного инсулина, заменена другой аминокислотой.

В конъюгате по любому из предшествующих конкретных воплощений заменяющая другая аминокислота выбрана из группы, состоящей из аланина, глутаминовой кислоты, аспарагина, изолейцина, валина, глутамина, глицина, лизина, гистидина, цистеина, фенилаланина, триптофана, пролина, серина, треонина и аспарагиновой кислоты.

В конъюгате по любому из предшествующих конкретных воплощений аналог инсулина имеет пониженную аффинность связывания в отношении инсулинового рецептора из-за делеции по меньшей мере одной аминкислоты цепи А или цепи В природного инсулина.

В конъюгате по любому из предшествующих конкретных воплощений аналог инсулина включает цепь А с SEQ ID NO: 3, представленную Общей формулой 1, приведенной ниже, и цепь В с SEQ ID NO: 4, представленную Общей формулой 2, приведенной ниже (при условии, что среди приведенных выше аналогов инсулина те аналоги инсулина, в которых цепь А совпадает с SEQ ID NO: 1, и одновременно цепь В совпадает с SEQ ID NO: 2, исключаются):

[Общая формула 1]

Xaa1-Xaa2-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Xaa14-Gln-Leu-Glu-Asn-Xaa19-Cys-Asn (SEQ ID NO: 3),

в которой, в Общей формуле 1, приведенной выше,

Xaa1 представляет собой глицин или аланин;

Xaa2 представляет собой изолейцин или аланин;

Xaa14 представляет собой тирозин, глутаминовую кислоту или аспарагин; и

Xaa19 представляет собой тирозин или аланин; и

[Общая формула 2]

Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Xaa8-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Xaa23-Xaa24-Xaa25-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr (SEQ ID NO: 4)

в Общей формуле 2, приведенной выше,

Xaa8 представляет собой глицин или аланин;

Xaa23 представляет собой глицин или аланин;

Xaa24 представляет собой фенилаланин или аланин; и

Xaa25 представляет собой фенилаланин или аланин.

В конъюгате по любому из предшествующих конкретных воплощений аналог инсулина отличается тем, что он включает:

(i) цепь А Общей формулы 1, приведенной выше, в которой Xaa1 представляет собой аланин, Xaa2 представляет собой изолейцин, Xaa14 представляет собой тирозин, и Xaa19 представляет собой тирозин, и цепь B Общей формулы 2, в которой Xaa8 представляет собой глицин, Xaa23 представляет собой глицин, Xaa24 представляет собой фенилаланин, и Xaa25 представляет собой фенилаланин;

(ii) цепь А Общей формулы 1, в которой Xaa1 представляет собой глицин, Xaa2 представляет собой аланин, Xaa14 представляет собой тирозин, и Xaa19 представляет собой тирозин, и цепь B Общей формулы 2, в которой Xaa8 представляет собой глицин, Xaa23 представляет собой глицин, Xaa24 представляет собой фенилаланин, и Xaa25 представляет собой фенилаланин;

(iii) цепь А Общей формулы 1, в которой Xaa1 представляет собой глицин, Xaa2 представляет собой изолейцин, Xaa14 представляет собой глутаминовую кислоту или аспарагин, и Xaa19 представляет собой тирозин, и цепь B Общей формулы 2, в которой Xaa8 представляет собой глицин, Xaa23 представляет собой глицин, Xaa24 представляет собой фенилаланин, и Xaa25 представляет собой фенилаланин;

(iv) цепь А Общей формулы 1, в которой Xaa1 представляет собой глицин, Xaa2 представляет собой изолейцин, Xaa14 представляет собой тирозин, и Xaa19 представляет собой аланин, и цепь B Общей формулы 2, в которой Xaa8 представляет собой глицин, Xaa23 представляет собой глицин, Xaa24 представляет собой фенилаланин, и Xaa25 представляет собой фенилаланин;

(v) цепь А Общей формулы 1, в которой Xaa1 представляет собой глицин, Xaa2 представляет собой изолейцин, Xaa14 представляет собой тирозин, и Xaa19 представляет собой тирозин, и цепь B Общей формулы 2, в которой Xaa8 представляет собой аланин, Xaa23 представляет собой глицин, Xaa24 представляет собой фенилаланин, и Xaa25 представляет собой фенилаланин;

(vi) цепь А Общей формулы 1, в которой Xaa1 представляет собой глицин, Xaa2 представляет собой изолейцин, Xaa14 представляет собой тирозин, и Xaa19 представляет собой тирозин, и цепь B Общей формулы 2, в которой Xaa8 представляет собой глицин, Xaa23 представляет собой аланин, Xaa24 представляет собой фенилаланин, и Xaa25 представляет собой фенилаланин;

(vii) цепь А Общей формулы 1, в которой Xaa1 представляет собой глицин, Xaa2 представляет собой изолейцин, Xaa14 представляет собой тирозин, и Xaa19 представляет собой тирозин, и цепь B Общей формулы 2, в которой Xaa8 представляет собой глицин, Xaa23 представляет собой глицин, Xaa24 представляет собой аланин, и Xaa25 представляет собой фенилаланин; и

(viii) цепь А Общей формулы 1, в которой Xaa1 представляет собой глицин, Xaa2 представляет собой изолейцин, Xaa14 представляет собой тирозин, и Xaa19 представляет собой тирозин, и цепь B Общей формулы 2, в которой Xaa8 представляет собой глицин, Xaa23 представляет собой глицин, Xaa24 представляет собой фенилаланин, и Xaa25 представляет собой аланин.

В конъюгате по любому из предшествующих конкретных воплощений аналог инсулина отличается тем, что он включает цепь А SEQ ID NO: 5, представленную Общей формулой 3, приведенной ниже, и цепь В SEQ ID NO: 6, представленную Общей формулой 4, приведенной ниже (при условии, что среди приведенных выше аналогов инсулина те аналоги инсулина, в которых цепь А совпадает с SEQ ID NO: 1, и одновременно цепь В совпадает с SEQ ID NO: 2, исключаются):

[Общая формула 3]

Xaa1-Ile-Val-Glu-Xaa5-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Xaa12-Leu-Xaa14-Gln-Xaa16-Glu-Asn-Xaa19-Cys-Xaa21 (SEQ ID NO: 5),

в которой в Общей формуле 3, приведенной выше,

Хаа1 представляет собой аланин, глицин, глутамин, гистидин, глутаминовую кислоту или аспарагин,

Хаа5 представляет собой аланин, глутаминовую кислоту, глутамин, гистидин или аспарагин,

Хаа12 представляет собой аланин, серин, глутамин, глутаминовую кислоту, гистидин или аспарагин,

Хаа14 представляет собой аланин, тирозин, глутаминовую кислоту, гистидин, лизин, аспарагиновую кислоту или аспарагин,

Хаа16 представляет собой аланин, лейцин, тирозин, гистидин, глутаминовую кислоту или аспарагин,

Хаа19 представляет собой аланин, тирозин, серин, глутаминовую кислоту, гистидин, треонин или аспарагин,

и

Хаа21 представляет собой аспарагин, глицин, гистидин или аланин; и

[Общая формула 4]

Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Xaa16-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Xaa25-Tyr-Xaa27-Xaa28-Lys-Thr (SEQ ID NO: 6)

в Общей формуле 4, приведенной выше,

Хаа16 представляет собой тирозин, глутаминовую кислоту, серин, треонин или аспарагиновую кислоту, или отсутствует,

Хаа25 представляет собой фенилаланин, аспарагиновую кислоту или глутаминовую кислоту, или отсутствует,

Хаа27 представляет собой треонин или отсутствует, и

Хаа28 представляет собой пролин, глутаминовую кислоту или аспарагиновую кислоту, или отсутствует.

В конъюгате по любому из предшествующих конкретных воплощений аналог инсулина отличается тем, что:

в Общей формуле 3, приведенной выше, Хаа1 представляет собой глицин, Хаа5 представляет собой глутамин, Хаа12 представляет собой серин, Хаа14 представляет собой глутаминовую кислоту или аспарагин, Хаа16 представляет собой лейцин, Хаа19 представляет собой тирозин, и Хаа21 представляет собой аспарагин; и

в Общей формуле 4, приведенной выше, Хаа16 представляет собой тирозин, Хаа25 представляет собой фенилаланин или отсутствует, Хаа27 представляет собой треонин, Хаа28 представляет собой пролин, глутаминовую кислоту или аспарагиновую кислоту, или отсутствует, но аналог инсулина конкретно не ограничивается ими.

(1) в цепи A инсулина с SEQ ID NO: 5, Xaa1 представляет собой глицин, Xaa5 представляет собой глутамин, Xaa12 представляет собой серин, Xaa14 представляет собой глутаминовую кислоту, Xaa16 представляет собой лейцин, Xaa19 представляет собой тирозин, и Xaa21 представляет собой аспарагин; и

в цепи B инсулина с SEQ ID NO: 6, Xaa16 представляет собой тирозин, Xaa25 представляет собой фенилаланин, Xaa27 представляет собой треонин, Xaa28 представляет собой пролин, глутаминовую кислоту или аспарагиновую кислоту, или отсутствует;

(2) в цепи A инсулина с SEQ ID NO: 5, Xaa1 представляет собой глицин, Xaa5 представляет собой глутамин, Xaa12 представляет собой серин, Xaa14 представляет собой аспарагин, Xaa16 представляет собой лейцин, Xaa19 представляет собой тирозин, и Xaa21 представляет собой аспарагин; и

(3) в цепи A инсулина с SEQ ID NO: 5, Xaa1 представляет собой глицин, Xaa5 представляет собой глутамин, Xaa12 представляет собой серин, Xaa14 представляет собой глутаминовую кислоту, Xaa16 представляет собой лейцин, Xaa19 представляет собой тирозин, и Xaa21 представляет собой аспарагин; и,

в цепи B инсулина с SEQ ID NO: 6, Xaa16 представляет собой тирозин, Xaa25 отсутствует, Xaa27 представляет собой треонин, Xaa28 представляет собой пролин, глутаминовую кислоту, или аспарагиновую кислоту, или отсутствует; или

(4) в цепи A инсулина с SEQ ID NO: 5, Xaa1 представляет собой глицин, Xaa5 представляет собой глутамин, Xaa12 представляет собой серин, Xaa14 представляет собой аланин, Xaa16 представляет собой лейцин, Xaa19 представляет собой тирозин, Xaa21 представляет собой аспарагин; и,

в цепи B инсулина с SEQ ID NO: 6, Xaa16 представляет собой глутаминовую кислоту, Xaa25 отсутствует, Xaa27 представляет собой треонин, Xaa28 представляет собой пролин, глутаминовую кислоту или аспарагиновую кислоту, или отсутствует.

(1) в Общей формуле 3, приведенной выше, Xaa1 представляет собой глицин, Xaa5 представляет собой глутамин, Xaa12 представляет собой серин, Xaa14 представляет собой глутаминовую кислоту, Xaa16 представляет собой лейцин, Xaa19 представляет собой тирозин, и Xaa21 представляет собой аспарагин; и

в Общей формуле 4, приведенной выше, Xaa16 представляет собой тирозин, Xaa25 отсутствует, Xaa27 представляет собой треонин, и Xaa28 представляет собой пролин;

(2) в Общей формуле 3, приведенной выше, Xaa1 представляет собой глицин, Xaa5 представляет собой глутамин, Xaa12 представляет собой серин, Xaa14 представляет собой аланин, Xaa16 представляет собой лейцин, Xaa19 представляет собой тирозин, и Xaa21 представляет собой аспарагин; и

в Общей формуле 4, приведенной выше, Xaa16 представляет собой глутаминовую кислоту, Xaa25 отсутствует, Xaa27 представляет собой треонин, и Xaa28 представляет собой пролин;

(3) в Общей формуле 3, приведенной выше, Xaa1 представляет собой глицин, Xaa5 представляет собой глутамин, Xaa12 представляет собой серин, Xaa14 представляет собой гистидин, Xaa16 представляет собой лейцин, Xaa19 представляет собой тирозин, и Xaa21 представляет собой аспарагин; и

в Общей формуле 4, приведенной выше, Xaa16 представляет собой тирозин, Xaa25 представляет собой фенилаланин, Xaa27 представляет собой треонин, и Xaa28 представляет собой пролин;

(4) в Общей формуле 3, приведенной выше, Xaa1 представляет собой глицин, Xaa5 представляет собой глутамин, Xaa12 представляет собой серин, Xaa14 представляет собой лизин, Xaa16 представляет собой лейцин, Xaa19 представляет собой тирозин, и Xaa21 представляет собой аспарагин; и

в Общей формуле 4, приведенной выше, Xaa16 представляет собой тирозин,

Xaa25 представляет собой фенилаланин, Xaa27 представляет собой треонин, и Xaa28 представляет собой пролин;

(5) в Общей формуле 3, приведенной выше, Xaa1 представляет собой глицин, Xaa5 представляет собой глутамин, Xaa12 представляет собой серин, Xaa14 представляет собой тирозин, Xaa16 представляет собой лейцин, Xaa19 представляет собой глутаминовую кислоту, и Xaa21 представляет собой аспарагин; и

(6) в Общей формуле 3, приведенной выше, Xaa1 представляет собой глицин, Xaa5 представляет собой глутамин, Xaa12 представляет собой серин, Xaa14 представляет собой тирозин, Xaa16 представляет собой лейцин, Xaa19 представляет собой серин, и Xaa21 представляет собой аспарагин; и

(7) в Общей формуле 3, приведенной выше, Xaa1 представляет собой глицин, Xaa5 представляет собой глутамин, Xaa12 представляет собой серин, Xaa14 представляет собой тирозин, Xaa16 представляет собой лейцин, Xaa19 представляет собой треонин, и Xaa21 представляет собой аспарагин; и

(8) в Общей формуле 3, приведенной выше, Xaa1 представляет собой глицин, Xaa5 представляет собой глутамин, Xaa12 представляет собой серин, Xaa14 представляет собой тирозин, Xaa16 представляет собой лейцин, Xaa19 представляет собой тирозин, и Xaa21 представляет собой аспарагин; и

в Общей формуле 4, приведенной выше, Xaa16 представляет собой глутаминовую кислоту, Xaa25 представляет собой фенилаланин, Xaa27 представляет собой треонин, и Xaa28 представляет собой пролин;

(9) в Общей формуле 3, приведенной выше, Xaa1 представляет собой глицин, Xaa5 представляет собой глутамин, Xaa12 представляет собой серин, Xaa14 представляет собой тирозин, Xaa16 представляет собой лейцин, Xaa19 представляет собой тирозин, и Xaa21 представляет собой аспарагин; и

в Общей формуле 4, приведенной выше, Xaa16 представляет собой серин, Xaa25 представляет собой фенилаланин, Xaa27 представляет собой треонин, и Xaa28 представляет собой пролин;

(10) в Общей формуле 3, приведенной выше, Xaa1 представляет собой глицин, Xaa5 представляет собой глутамин, Xaa12 представляет собой серин, Xaa14 представляет собой тирозин, Xaa16 представляет собой лейцин, Xaa19 представляет собой тирозин, и Xaa21 представляет собой аспарагин; и

в Общей формуле 4, приведенной выше, Xaa16 представляет собой треонин, Xaa25 представляет собой фенилаланин, Xaa27 представляет собой треонин, и Xaa28 представляет собой пролин;

(11) в Общей формуле 3, приведенной выше, Xaa1 представляет собой глицин, Xaa5 представляет собой глутамин, Xaa12 представляет собой серин, Xaa14 представляет собой аланин, Xaa16 представляет собой лейцин, Xaa19 представляет собой тирозин, и Xaa21 представляет собой аспарагин; и

(12) в Общей формуле 3, приведенной выше, Xaa1 представляет собой глицин, Xaa5 представляет собой глутамин, Xaa12 представляет собой серин, Xaa14 представляет собой аспарагиновую кислоту, Xaa16 представляет собой лейцин, Xaa19 представляет собой тирозин, и Xaa21 представляет собой аспарагин; и

(13) в Общей формуле 3, приведенной выше, Xaa1 представляет собой глицин, Xaa5 представляет собой глутамин, Xaa12 представляет собой серин, Xaa14 представляет собой тирозин, Xaa16 представляет собой лейцин, Xaa19 представляет собой тирозин, и Xaa21 представляет собой аспарагин; и

в Общей формуле 4, приведенной выше, Xaa16 представляет собой аспарагиновую кислоту, Xaa25 представляет собой фенилаланин, Xaa27 представляет собой треонин, и Xaa28 представляет собой пролин;

(14) в Общей формуле 3, приведенной выше, Xaa1 представляет собой глицин, Xaa5 представляет собой глутамин, Xaa12 представляет собой серин, Xaa14 представляет собой тирозин, Xaa16 представляет собой лейцин, Xaa19 представляет собой тирозин, и Xaa21 представляет собой аспарагин; и

в Общей формуле 4, приведенной выше, Xaa16 представляет собой тирозин, Xaa25 представляет собой аспарагиновую кислоту, Xaa27 представляет собой треонин, и Xaa28 представляет собой пролин; или

(15) в Общей формуле 3, приведенной выше, Xaa1 представляет собой глицин, Xaa5 представляет собой глутамин, Xaa12 представляет собой серин, Xaa14 представляет собой тирозин, Xaa16 представляет собой лейцин, Xaa19 представляет собой тирозин, и Xaa21 представляет собой аспарагин; и

в Общей формуле 4, приведенной выше, Xaa16 представляет собой тирозин, Xaa25 представляет собой глутаминовую кислоту, Xaa27 представляет собой треонин, и Xaa28 представляет собой пролин.

В конъюгате по любому из предшествующих конкретных воплощений данный конъюгат представлен Формулой 2, приведенной ниже:

[Формула 2]

X-L-F,

в которой в Формуле 2, приведенной выше:

Х представляет собой природный инсулин или аналог инсулина с пониженной аффинностью связывания в отношении инсулинового рецептора по сравнению с природным инсулином;

F представляет собой вещество, способное увеличивать период полувыведения

in vivo X.

В конъюгате по любому из предшествующих конкретных воплощений данный конъюгат, представленный Формулой 2, приведенной выше, имеет пониженный опосредованный рецептором клиренс (RMC).

В конъюгате по любому из предшествующих конкретных воплощений в Формуле 2, приведенной выше, L связывается с аминоконцевой областью бета цепи Х, который представляет собой природный инсулин или его аналог.

В конъюгате по любому из предшествующих конкретных воплощений Х и F связываются друг с другом через L посредством ковалентной химической связи, нековалентной химической связи или их комбинации.

В конъюгате по любому из предшествующих конкретных воплощений вещество, способное увеличивать период полувыведения in vivo физиологически активного вещества, представляет собой биосовместимое вещество.

В конъюгате по любому из предшествующих конкретных воплощений F выбран из группы, состоящей из полимеров, жирных кислот, холестерина, альбумина и его фрагмента, альбуминсвязывающих веществ, полимера из повторяющихся звеньев конкретной аминокислотной последовательности, антител, фрагментов антител, веществ, связывающихся с FcRn, соединительных тканей in vivo, нуклеотидов, фибронектина, трансферрина, сахаридов, гепарина и эластина.

В конъюгате по любому из предшествующих конкретных воплощений полимер выбран из группы, состоящей из полиэтиленгликоля, полипропиленгликоля, сополимера этиленгликоль-пропиленгликоль, полиоксиэтилированного полиола, поливинилового спирта, полисахарида, декстрана, простого поливинилэтилового эфира, биодеградируемого полимера, липидного полимера, хитинов, гиалуроновой кислоты, олигонуклеотида и их комбинации.

В конъюгате по любому из предшествующих конкретных воплощений вещество, связывающееся с FcRn, представляет собой полипептид, включающий область Fc иммуноглобулина.

В конъюгате по любому из предшествующих конкретных воплощений F представляет собой область Fc IgG.

В конъюгате по любому из предшествующих конкретных воплощений в Формуле 1 или Формуле 2, приведенных выше, F представляет собой область Fc IgG, и L связывается с N-концевой областью F.

В другом аспекте настоящего изобретения предложен способ получения конъюгата.

В конкретном воплощении настоящее изобретение относится к способу получения конъюгата, который включает:

(а) проведение взаимодействия полиэтиленгликоля, который имеет размер от более чем 0 кДа до менее чем 3,4 кДа и по меньшей мере две концевые функциональные группы, с любым одним физиологически активным веществом или веществом, способным увеличивать период полувыведения in vivo физиологически активного вещества, с получением полиэтиленгликоля, с которым ковалентно связано одно физиологически активное вещество или вещество, способное увеличивать период полувыведения in vivo физиологически активного вещества, и который имеет по меньшей мере одну концевую функциональную группу; и

(б) проведение взаимодействия полиэтиленгликоля, с которым ковалентно связано одно физиологически активное вещество или вещество, способное увеличивать период полувыведения in vivo физиологически активного вещества, и который имеет по меньшей мере одну концевую функциональную группу, полученного на стадии (а), с другим физиологически активным веществом или веществом, способным увеличивать период полувыведения in vivo физиологически активного вещества, с получением конъюгата, в котором физиологически активное вещество и вещество, способное увеличивать период полувыведения in vivo физиологически активного вещества, ковалентно связаны через полиэтиленгликоль, имеющий размер от более чем 0 кДа до менее чем 3,4 кДа.

В способе по предшествующему конкретному воплощению физиологически активное вещество имеет функциональную группу, которая образует ковалентную связь посредством взаимодействия с концевой функциональной группой полиэтиленгликоля, и данная функциональная группа представляет собой аминогруппу или тиольную группу.

В способе по любому из предшествующих конкретных воплощений вещество, способное увеличивать период полувыведения in vivo физиологически активного вещества, имеет функциональную группу, которая образует ковалентную связь посредством взаимодействия с концевой функциональной группой полиэтиленгликоля, и данная функциональная группа представляет собой аминогруппу или тиольную группу.

В способе по любому из предшествующих конкретных воплощений концевая функциональная группа полиэтиленгликоля представляет собой функциональную группу, реагирующую с аминогруппой, или функциональную группу, реагирующую с тиольной группой.

В способе по любому из предшествующих конкретных воплощений концевая функциональная группа полиэтиленгликоля выбрана из группы, состоящей из альдегида, малеимида, сукцинимида, винилсульфона, тиола, С_6-20арилдисульфида, С_5-20гетероарилдисульфида и галогенированного ацетамида.

В способе по любому из предшествующих конкретных воплощений концевая функциональная группа полиэтиленгликоля выбрана из группы, состоящей из альдегида, малеимида, сукцинимида, винилсульфона, тиола, орто-пиридилдисульфида и йодацетамида.

В способе по любому из предшествующих конкретных воплощений сукцинимид представляет собой сукцинимидилвалерат, сукцинимидилметилбутаноат, сукцинимидилметилпропионат, сукцинимидилбутаноат, сукцинимидилпропионат, N- гидроксисукцинимид, сукцинимидилкарбоксиметил или сукцинимидилкарбонат.

Еще один аспект настоящего изобретения относится к препарату инсулина длительного действия с длительностью действия in vivo и стабильностью, содержащему конъюгат.

Еще один аспект настоящего изобретения относится к препарату для предупреждения или лечения диабета, содержащему данный конъюгат.

Еще один аспект настоящего изобретения относится к способу лечения связанных с инсулином заболеваний, включающему введение конъюгата, представленного Формулой 2, или композиции, или препарата, содержащего данный конъюгат, субъекту, нуждающемуся в этом.

Полезные эффекты

Конъюгат физиологически активного вещества по настоящему изобретению можно эффективно использовать в областях, где необходима соответствующая физиологическая активность.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

На ФИГ. 1 показаны результаты SDS-PAGE (электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия) в отношении конъюгата инсулин-3,4 кДа PEG(полиэтиленгликоль)-фрагмент Fc иммуноглобулина.

На ФИГ. 2 показаны результаты SDS-PAGE в отношении конъюгата инсулин-1 кДа PEG-фрагмент Fc иммуноглобулина.

На ФИГ. 3 показаны результаты эксклюзионной высокоэффективной жидкостной хроматографии (SE-HPLC) в отношении каждого из конъюгатов инсулин-1; 2; 2,5; 3; 3,4 кДа PEG-фрагмент Fc иммуноглобулина.

На ФИГ. 4 показаны результаты высокоэффективной жидкостной хроматографии с обращенной фазой (RP-HPLC) в отношении каждого из конъюгатов инсулин-1; 2; 2,5; 3; 3,4 кДа PEG-фрагмент Fc иммуноглобулина.

На ФИГ. 5 показан график наложения хроматограмм в отношении конъюгатов инсулин-1; 2; 2,5; 3; 3,4 кДа PEG-фрагмент Fc иммуноглобулина.

На ФИГ. 6 показаны результаты сравнения продолжительности эффективности в отношении конъюгатов инсулина длительного действия в соответствии с длиной линкера PEG.

Наилучший способ

Далее настоящее изобретение будет описано более подробно.

Тем временем, каждое из раскрытых здесь объяснений и типичных воплощений может применяться к соответствующим им другим объяснениям и типичным воплощениям. То есть, все комбинации раскрытых здесь разных факторов принадлежат к объему настоящего изобретения. Кроме того, объем настоящего изобретения не должен ограничиваться конкретным раскрытием, предложенным ниже. Кроме того, обычный специалист в данной области сможет узнать или подтвердить с использованием не более чем рутинного экспериментирования в отношении целого ряда эквивалентов конкретных воплощений изобретения, описанных в настоящем изобретении. Кроме того, подразумевается, что такие эквиваленты включены в настоящее изобретение.

Во всем данном описании изобретения используются традиционные однобуквенные и трехбуквенные коды аминокислот. Кроме того, упомянутые здесь аминокислоты сокращаются согласно правилам номенклатуры IUPAC-IUB (Международный союз теоретической и прикладной химии - Международный биохимический союз).

Согласно одному аспекту настоящего изобретения предложен конъюгат физиологически активного вещества для увеличения периода полувыведения in vivo физиологически активного вещества.

В частности, согласно настоящему изобретению предложен конъюгат физиологически активного вещества, в котором физиологически активное вещество и вещество, способное увеличивать период полувыведения in vivo физиологически активного вещества, связаны через полиэтиленгликоль, и данный полиэтиленгликоль имеет размер от более чем 0 кДа до менее чем 3,4 кДа.

В более конкретном воплощении согласно настоящему изобретению предложен конъюгат Формулы 1, приведенной ниже:

[Формула 1]

X-L-F,

в которой

Термин «конъюгат, представленный Формулой 1, приведенной выше» в том виде, в котором он здесь используется, используется взаимозаменяемо с термином «конъюгат длительного действия».

Термин «конъюгат длительного действия» в том виде, в котором он здесь используется, относится к физиологически активному веществу, которое связывается с веществом, которое способно увеличивать период полувыведения in vivo физиологически активного вещества, например с биосовместимым веществом, через линкер.

Данный конъюгат может демонстрировать увеличенный период полувыведения in vivo по сравнению с конъюгатом, который отличается от данного конъюгата тем, что L представляет собой полиэтиленгликоль, имеющий размер 3,4 кДа, но данный конъюгат конкретно не ограничивается им.

Более конкретно данный конъюгат может демонстрировать пониженную аффинность связывания в отношении рецептора физиологически активного вещества по сравнению с конъюгатом, который имеет такие же Х и F, что и данный конъюгат, но имеет другой L, который представляет собой полиэтиленгликоль, имеющий размер 3,4 кДа, и может демонстрировать увеличенный период полувыведения в крови из-за ослабления опосредованного рецептором клиренса (RMC), но данный конъюгат конкретно не ограничивается им.

Кроме того, в дополнение к вышеописанным эффектам или независимо от них, данный конъюгат может демонстрировать по существу такую же активность или большую активность относительно физиологической активности самого Х или активности самого F по сравнению с конъюгатом, который имеет такой же Х и F, что и данный конъюгат, но имеет другой L, который представляет собой полиэтиленгликоль, имеющий размер 3,4 кДа, даже если Х и F присутствуют в тесной близости из-за полиэтиленгликоля, который образует связь между Х и F, и имеет размер меньше, чем 3,4 кДа, но данный конъюгат конкретно не ограничивается им.

В настоящем изобретении L, представляющий собой линкер и группировку, составляющую конъюгат, относится к полиэтиленгликолю, имеющему размер от более чем 0 кДа до менее чем 3,4 кДа, и он включает все полиэтиленгликоли, имеющие размер от более чем 0 кДа до менее чем 3,4 кДа, от более чем 0 кДа до 3,3 кДа или меньше, от более чем 0 кДа до 3,2 кДа или меньше, от более чем 0 кДа до 3,1 кДа или меньше, от более чем 0 кДа до 3,0 кДа или меньше, от более чем 0 кДа до 2,9 кДа или меньше, от более чем 0 кДа до 2,8 кДа или меньше, от более чем 0 кДа до 2,7 кДа или меньше, от более чем 0 кДа до 2,6 кДа или меньше, от более чем 0 кДа до 2,5 кДа или меньше, от более чем 0 кДа до 2,4 кДа или меньше, от более чем 0 кДа до 2,3 кДа или меньше, от более чем 0 кДа до 2,2 кДа или меньше, от более чем 0 кДа до 2,1 кДа или меньше, от более чем 0 кДа до 2,0 кДа или меньше, от более чем 0 кДа до 1,9 кДа или меньше, от более чем 0 кДа до 1,8 кДа или меньше, от более чем 0 кДа до 1,7 кДа или меньше, от более чем 0 кДа до 1,6 кДа или меньше, от более чем 0 кДа до 1,5 кДа или меньше, от более чем 0 кДа до 1,4 кДа или меньше, от более чем 0 кДа до 1,3 кДа или меньше, от более чем 0 кДа до 1,2 кДа или меньше, от более чем 0 кДа до 1,1 кДа или меньше, от более чем 0 кДа до 1,0 кДа или меньше, от равного или большего, чем 0,5 кДа до менее чем 3,4 кДа, от равного или большего, чем 0,5 кДа до 3,3 кДа или меньше, от равного или большего, чем 0,5 кДа до 3,2 кДа или меньше, от равного или большего, чем 0,5 кДа до 3,1 кДа или меньше, от равного или большего, чем 0,5 кДа до 3 кДа или меньше, от равного или большего, чем 0,5 кДа до 2,9 кДа или меньше, от равного или большего, чем 0,5 кДа до 2,8 кДа или меньше, от равного или большего, чем 0,5 кДа до 2,7 кДа или меньше, от равного или большего, чем 0,5 кДа до 2,6 кДа или меньше, от равного или большего, чем 0,5 кДа до 2,5 кДа или меньше, от равного или большего, чем 0,5 кДа до 2,4 кДа или меньше, от равного или большего, чем 0,5 кДа до 2,3 кДа или меньше, от равного или большего, чем 0,5 кДа до 2,2 кДа или меньше, от равного или большего, чем 0,5 кДа до 2,1 кДа или меньше, от равного или большего, чем 0,5 кДа до 2 кДа или меньше, от равного или большего, чем 0,5 кДа до 1,9 кДа или меньше, от равного или большего, чем 0,5 кДа до 1,8 кДа или меньше, от равного или большего, чем 0,5 кДа до 1,7 кДа или меньше, от равного или большего, чем 0,5 кДа до 1,6 кДа или меньше, от равного или большего, чем 0,5 кДа до 1,5 кДа или меньше, от равного или большего, чем 0,5 кДа до 1,4 кДа или меньше, от равного или большего, чем 0,5 кДа до 1,3 кДа или меньше, от равного или большего, чем 0,5 кДа до 1,2 кДа или меньше, от равного или большего, чем 0,5 кДа до 1,1 кДа или меньше, от равного или большего, чем 0,5 кДа до 1 кДа или меньше, от более чем 0,5 кДа до менее чем 3,4 кДа, от более чем 0,5 кДа до 3,3 кДа или меньше, от более чем 0,5 кДа до 3,2 кДа или меньше, от более чем 0,5 кДа до 3,1 кДа или меньше, от более чем 0,5 кДа до 3 кДа или меньше, от более чем 0,5 кДа до 2,9 кДа или меньше, от более чем 0,5 кДа до 2,8 кДа или меньше, от более чем 0,5 кДа до 2,7 кДа или меньше, от более чем 0,5 кДа до 2,6 кДа или меньше, от более чем 0,5 кДа до 2,5 кДа или меньше, от более чем 0,5 кДа до 2,4 кДа или меньше, от более чем 0,5 кДа до 2,3 кДа или меньше, от более чем 0,5 кДа до 2,2 кДа или меньше, от более чем 0,5 кДа до 2,1 кДа или меньше, от более чем 0,5 кДа до 2 кДа или меньше, от более чем 0,5 кДа до 1,9 кДа или меньше, от более чем 0,5 кДа до 1,8 кДа или меньше, от более чем 0,5 кДа до 1,7 кДа или меньше, от более чем 0,5 кДа до 1,6 кДа или меньше, от более чем 0,5 кДа до 1,5 кДа или меньше, от более чем 0,5 кДа до 1,4 кДа или меньше, от более чем 0,5 кДа до 1,3 кДа или меньше, от более чем 0,5 кДа до 1,2 кДа или меньше, от более чем 0,5 кДа до 1,1 кДа или меньше, от более чем 0,5 кДа до 1,0 кДа или меньше, от равного или большего, чем 0,75 кДа до менее чем 3,4 кДа, от равного или большего, чем 0,75 кДа до 3,3 кДа или меньше, от равного или большего, чем 0,75 кДа до 3,2 кДа или меньше, от равного или большего, чем 0,75 кДа до 3,1 кДа или меньше, от равного или большего, чем 0,75 кДа до 3 кДа или меньше, от равного или большего, чем 0,75 кДа до 2,9 кДа или меньше, от равного или большего, чем 0,75 кДа до 2,8 кДа или меньше, от равного или большего, чем 0,75 кДа до 2,7 кДа или меньше, от равного или большего, чем 0,75 кДа до 2,6 кДа или меньше, от равного или большего, чем 0,75 кДа до 2,5 кДа или меньше, от равного или большего, чем 0,75 кДа до 2,4 кДа или меньше, от равного или большего, чем 0,75 кДа до 2,3 кДа или меньше, от равного или большего, чем 0,75 кДа до 2,2 кДа или меньше, от равного или большего, чем 0,75 кДа до 2,1 кДа или меньше, от равного или большего, чем 0,75 кДа до 2 кДа или меньше, от равного или большего, чем 0,75 кДа до 1,9 кДа или меньше, от равного или большего, чем 0,75 кДа до 1,8 кДа или меньше, от равного или большего, чем 0,75 кДа до 1,7 кДа или меньше, от равного или большего, чем 0,75 кДа до 1,6 кДа или меньше, от равного или большего, чем 0,75 кДа до 1,5 кДа или меньше, от равного или большего, чем 0,75 кДа до 1,4 кДа или меньше, от равного или большего, чем 0,75 кДа до 1,3 кДа или меньше, от равного или большего, чем 0,75 кДа до 1,2 кДа или меньше, от равного или большего, чем 0,75 кДа до 1,1 кДа или меньше, от равного или большего, чем 0,75 кДа до 1 кДа или меньше, от более чем 0,75 кДа до 2 кДа или меньше, от более чем 0,75 кДа до менее чем 2 кДа, от более чем 0,75 кДа до 1,5 кДа или меньше, примерно 1,0 кДа или 1,0 кДа, но размер полиэтиленгликоля не ограничивается ими.

Термин «примерно» в том виде, в котором он здесь используется, относится к интервалу, который включает все из плюс/минус 0,5; плюс/минус 0,4; плюс/минус 0,3; плюс/минус 0,2; плюс/минус 0,1 и т.д., и включает все значения, которые являются эквивалентными или аналогичными тем следующим значениям, но интервал не ограничивается ими.

Термин «Х» в том виде, в котором он здесь используется, относится к физиологически активному веществу, которое представляет собой группировку, составляющую конъюгат. Термин «физиологически активное вещество» относится к веществу, которое имеет любую физиологическую активность in vivo.

Физиологически активное вещество может представлять собой токсины или физиологически активные полипептиды и может включать разные виды физиологически активных полипептидов, используемые для лечения или предупреждения человеческих заболеваний, такие как цитокины, интерлейкины, интерлейкинсвязывающие белки, ферменты, антитела, факторы роста, факторы контроля транскрипции, факторы крови, вакцины, структурные белки, белки-лиганды или рецепторы, антигены клеточной поверхности, антагонисты рецепторов, физиологически активные пептиды, высвобождаемые в тонкий кишечник и поджелудочную железу, имеющие терапевтическое влияние на лечение диабета и ожирения, агонисты или антагонисты рецепторов, связанных с G-белком (GPCR) и т.д. или их аналоги, но физиологически активное вещество не ограничивается ими.

Термин «аналог Х» в том виде, в котором он здесь используется, относится к веществу, способному демонстрировать такой же вид активности, что и Х, и он включает все из агонистов Х, производных Х, фрагментов Х, вариантов Х и т.д.

Такой Х может представлять собой природный физиологически активный полипептид.

В частности, термин «производное природного физиологически активного полипептида» включает пептиды, которые имеют по меньшей одно отличие в аминокислотной последовательности по сравнению с аминокислотной последовательностью природного физиологически активного полипептида; модифицированные пептиды, полученные посредством модификации последовательности природного физиологически активного полипептида; и миметики, имеющие такой же вид активности, что и природный физиологически активный полипептид.

В частности, производное природного физиологически активного полипептида может быть получено с использованием любого способа, выбранного из замены, присоединения, делеции, модификации и их комбинации в отношении части аминокислот природного физиологически активного полипептида, и искусственные пептиды, которые были подвергнуты манипуляции для того, чтобы иметь аффинность связывания в отношении по меньшей мере двух взаимно отличающихся рецепторов, полученные таким способом, также принадлежат к объему вышеописаного производного.

Кроме того, модификация для получения производного природного физиологически активного полипептида включает все из модификаций с использованием аминокислоты L-типа или D-типа, и/или неприродной аминокислоты; и/или модификацию природной последовательности (например, модификацию функциональной(ых) групп(ы) в боковой цепи, внутримолекулярное ковалентное связывание (например, образование кольца между боковыми цепями, метилирование, ацилирование, убиквитинирование, фосфорилирование, амино-гексанирование, биотинилирование и т.д.).

Кроме того, производное природного физиологически активного полипептида также включает производные, в которых одна или более чем одна аминокислота добавляется на амино- и/или карбокси-конец природного физиологически активного полипептида.

В качестве аминокислот, подлежащих замене или присоединению, можно использовать нетипичные или не встречающиеся в природе аминокислоты, а также 20 аминокислот, традиционно наблюдающихся в человеческих белках.

Термин «фрагмент природного физиологически активного полипептида или фрагмент прозводного природного физиологически активного полипептида» в том виде, в котором он здесь используется, относится к форме природного физиологически активного полипептида или прозводного природного физиологически активного полипептида, в которой делетирована одна или более чем одна аминокислота из амино- или карбоксиконца природного физиологически активного полипептида или прозводного природного физиологически активного полипептида.

Физиологически активное вещество может быть выбрано из группы, состоящей из следующих: токсины; агонисты рецептора глюкагоноподобного пептида-1 (GLP-1); агонисты рецептора глюкагона; агонисты рецептора желудочного ингибирующего полипептида (GIP); агонисты рецептора фактора роста фибробластов (FGF); агонисты рецептора холецистокинина; агонисты рецептора гастрина (гастрин); агонисты рецептора меланокортина; вещества, связывающиеся с двумя или более чем двумя рецепторами среди рецептора GLP, рецептора глюкагона и рецептора GIP; соматостатин; пептид YY (PYY); нейропептид Y (NPY); оксинтомодулин; фактор роста фибробластов (FGF); брадикинин; эледоизин; окситоцин; вазопрессин; серморелин; пептиды, высвобождающие пролактин; орексин; тиролиберины; кальмодулин; мотилин; вазоактивные кишечные пептиды; атриальные натрийуретические пептиды (ANP); натрийуретические пептиды С-типа (CNP); нейрокинин А; нейромедин; ренин; эндотелин; пептиды сарафотоксина; пептиды карсоморфина; дерморфин; динорфин; эндорфин; энкефалин; рецепторы фактора некроза опухолей; рецепторы урокиназы; тимопоэтин; тимулин; тимопентин; тимозин; тимические гуморальные факторы; адреномодуллин; аллатостатин; фрагменты β-белка амилоида; антибиотические пептиды; антиоксидантные пептиды; бомбезин; остеокальцин; пептиды CART; E- селектин; межклеточная молекула адгезии 1 (ICAM-1); молекула адгезии клеток сосудов 1 (VCAM-1); лейкокин; крингл-5; ламинин; ингибин; галанин; фибронектин; панкреастатин; фузеон; глюкагоноподобные пептиды; рецепторы, связанные с G-белком; эритропоэтические факторы роста; лейкопоэтин; амилин; человеческий гормон роста; соматолиберин; пептиды, высвобождающие гормон роста; интерфероны; рецепторы интерферонов; колониестимулирующие факторы; интерлейкины; рецепторы интерлейкинов; ферменты; интерлейкин-связывающие белки; цитокин-связывающие белки; факторы, активирующие макрофаги; пептиды макрофагов; факторы В-клеток; факторы Т-клеток; белок А; факторы, ингибирующие аллергию; гликопротеины некроза; иммунотоксины; лимфотоксины; факторы некроза опухоли; супрессоры опухолей; трансформирующие факторы роста; α-1 антитрипсин; альбумин; α-лактальбумин; аполипопротеин-Е; эритропоэтин; высокогликозилированный эритропоэтин; ангиопоэтины; гемоглобины; тромбин; пептиды, активирующие рецептор тромбина; тромбомодулин; фактор крови VII (фактор свертывания крови VII); фактор крови VIIa (фактор свертывания крови VIIa); фактор крови VIII (фактор свертывания крови VIII); фактор крови IX (фактор свертывания крови IX); фактор крови XIII (фактор свертывания XIII); активаторы плазминогена; фибрин-связывающие пептиды; урокиназа; стрептокиназа; гирудин; белок С; С-реактивный белок; ингибиторы ренина; ингибиторы коллагеназы; супероксиддисмутаза; лептин; фактор роста тромбоцитов; эпителиальный фактор роста; эпидермальный фактор роста; ангиостатин; ангиотензин; морфогенетический фактор роста кости; морфогенетический белок кости; кальцитонин; инсулин; атриопептин; хрящевой индуцирующий фактор; элкатонин; фактор активации соединительной ткани; ингибитор пути тканевого фактора; фолликулостимулирующий гормон; лютеинизирующий гормон; люлиберин; факторы роста нервов; фактор аксогенеза-1; мозговой натрийуретический пептид; глиальный нейротрофический фактор; нетрин; ингибитор миграции нейтрофилов; нейротрофический фактор, нейртурин; паратироидный гормон; релаксин; секретин; соматомедин; инсулиноподобный фактор роста; адренокортикальный гормон; глюкагон; холецистокинин; полипептиды поджелудочной железы; пептиды, высвобождающие гастрин; пептиды, ингибирующие гастрин; кортиколиберин; тиреотропин; аутотаксин; лактоферрин; миостатин; зависимый от активности нейрозащитный белок (ADNP), β-секретаза 1 (ВАСЕ1), белок-предшественник амилоида (АРР), молекула адгезии нейронов (NCAM), амилоид β, тау, рецептор конечных продуктов усиленого гликирования (RAGE), α-синуклеин или их агонисты или антагонисты; рецепторы, агонисты рецепторов; антигены клеточной поверхности; моноклональное антитело; поликлональное антитело; фрагменты антитела; антигены вакцины вирусного происхождения; гибридные полипептиды или химерные полипептиды, которые активируют по меньшей мере один агонист рецептора; и их аналоги.

Кроме того, токсин может быть выбран из группы, состоящей из майтансина или его производного, ауристатина или его производного, дуокармицина или его производного и пирролобензодиазепина (PBD) или его производного;

агонист рецептора глюкагоноподобного пептида-1 (GLP-1) может быть выбран из группы, состоящей из природного глюкагоноподобного пептида-1 (GLP-1), природного GLP-2, природного эксендина-3, природного эксендина-4 и их аналогов;

агонист рецептора FGF может быть выбран из группы, состоящей из FGF1 или его аналога, FGF19 или его аналога, FGF21 или его аналога и FGF23 или его аналога;

интерферон может быть выбран из группы, состоящей из интерферона-α, интерферона-β и интерферона-γ;

рецептор интерферона может быть выбран из группы, состоящей из рецептора интерферона-α, рецептора интерферона-β, рецептора интерферона-γ и растворимых рецепторов интерферона типа I;

рецептор интерлейкина может представлять собой рецептор интерлейкина-1 или рецептор интерлейкина-4;

фермент может быть выбран из группы, состоящей из β-глюкозидазы, α-галактозидазы, β-галактозидазы, идуронидазы, идуронат-2-сульфатазы, галактозо-6- сульфатазы, кислой α-глюкозидазы, кислой церамидазы, кислой сфингомиелиназы, галактоцереброзидазы, арилсульфатазы А, арилсульфатазы В, β-гексозаминидазы А, β-гексозаминидазы В, гепарин-N-сульфатазы, α-D-маннозидазы, β-глюкуронидазы, N-ацетилгалактозамин-6-сульфатазы, лизосомальной кислой липазы, α-N-ацетил-глюкозаминидазы, глюкоцереброзидазы, бутирилхолинэстеразы, хитиназы, глутаматдекарбоксилазы, имиглюцеразы, липазы, уриказы, ацетилгидролазы фактора активации тромбоцитов, нейтральной эндопептидазы, миелопероксидазы, α-галактозидазы-А, агалсидазы α, агалсидазы β, α-L-идуронидазы, бутирилхолинэстеразы, хитиназы, глутаматдекарбоксилазы и имиглюцеразы;

интерлейкин-связывающий белок может представлять собой IL-18bp;

цитокинсвязывающий белок может представлять собой TNF-связывающий белок;

факторы роста нервов могут быть выбраны из группы, состоящей из фактора роста нервов, цилиарного нейротрофического фактора, фактора аксогенеза-1, мозгового натрийуретического пептида, глиального нейротрофического фактора, нетрина, фактора, ингибирующего нейтрофилы, нейротрофического фактора и нейртурина;

рецептор миостатина может быть выбран из группы, состоящей из TNFR (P75), TNFR (P55), рецептора IL-1, рецептора VEGF и рецептора фактора, активирующего В-клетки;

антагонист рецептора миостатина может представлять собой IL1-Ra;

антиген клеточной поверхности может быть выбран из группы, состоящей из CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD11a, CD11b, CD18, CD19, CD20, CD23, CD25, CD33, CD38, CD40, CD45 и CD69; и

фрагменты антитела могут быть выбраны из группы, состоящей из scFv, Fab, Fab', F(ab')₂ и Fd, но данные физиологически активные вещества конкретно не ограничиваются ими.

Кроме того, физиологически активное вещество может быть выбрано из группы, состоящей из природного эксендина-3 или его аналога; природного эксендина-4 или его аналога; природного инсулина или его аналога; природного GLP-1 или его аналога; природного GLP-2 или его аналога; природного оксинтомодулина или его аналога; природного глюкагона или его аналога; природного фактора роста фибробластов или его аналога; природного грелина или его аналога; природного кальцитонина или его аналога и природного гранулоцитарного колониестимулирующего фактора роста или его аналога, но физиологически активное вещество конкретно не ограничивается ими.

В частности, в качестве физиологически активного вещества аналог природного эксендина-3 может быть выбран из группы, состоящей из эксендина-3, в котором делетирована N-концевая аминогруппа из природного эксендина-3; эксендина-3, в котором N-концевая аминогруппа природного эксендина-3 заменена гидроксильной группой; эксендина-3, в котором N-концевая аминогруппа природного эксендина-3 модифицирована диметильной группой; эксендина-3, в котором N-концевая аминогруппа природного эксендина-3 заменена карбоксильной группой; и эксендина-3, в котором из природного эксендина-3 подвергнут делеции α-углерод 1-ой аминокислоты природного эксендина-3 (то есть гистидина); и эксендина-3, в котором 12-ая аминокислота эксендина-3 (то есть лизин) заменена серином; и эксендина-3, в котором 12-ая аминокислота эксендина-3 (то есть лизин) заменена аргинином; и

в качестве физиологически активного вещества аналог природного эксендина-4 может быть выбран из группы, состоящей из эксендина-4, в котором делетирована N-концевая аминогруппа из природного эксендина-4; эксендина-4, в котором N-концевая аминогруппа природного эксендина-4 заменена гидроксильной группой; эксендина-4, в котором N-концевая аминогруппа природного эксендина-4 модифицирована диметильной группой; эксендина-4, в котором N-концевая аминогруппа природного эксендина-4 заменена карбоксильной группой; и эксендина-4, в котором из природного эксендина-4 подвергнут делеции α-углерод 1-ой аминокислоты природного эксендина-4 (то есть гистидина); и эксендина-4, в котором 12-ая аминокислота эксендина-4 (то есть лизин) заменена серином; и эксендина-4, в котором 12-ая аминокислота эксендина-4 (то есть лизин) заменена аргинином, но аналог природного эксендина-3 и аналог природного эксендина-4 конкретно не ограничиваются ими.

Более конкретно, аналог природного эксендина-4 может представлять собой аналог, выбранный из группы, состоящей из дез-амино-гистидил(DA)-эксендина-4, β-гидрокси-имидазо-пропионил(HY)-эксендина-4, имидазо-ацетил(СА)-эксендина-4 и диметил-гистидил(DM)-эксендина-4, но аналог природного эксендина-4 конкретно не ограничивается ими.

Производные природного эксендина, которые принадлежат к объему приведенных выше эксендинов, подробно описаны в публикации корейской патентной заявки №10-2009-0008151 (международная публикация патента № WO 2009/011544 A2). Кроме того, все описание данной публикации корейской патентной заявки (международной публикации патента) включено сюда посредством ссылки.

Кроме того, физиологически активное вещество может представлять собой природный оксинтомодулин или его производное. Производные природного оксинтомодулина, которые принадлежат к объему оксинтомодулина, подробно описаны в публикации корейской патентной заявки №10-2012-0139579 (международная публикация патента № WO 2012/173422 A9) и в публикации корейской патентной заявки №10-2012-0137271 (международная публикация патента № WO 2012/169798 A2). Кроме того, все описания данных публикаций корейских патентных заявок (международных публикаций патентов) включены сюда посредством ссылки.

Кроме того, физиологически активное вещество может представлять собой природный гранулоцитарный колониестимулирующий фактор или его производное.

В частности, физиологически активное вещество может представлять собой производное природного человеческого гранулоцитарного колониестимулирующего фактора, в которой любая одна из 1-ой, 2-ой, 3-ей и 17-ой аминокислоты природного человеческого гранулоцитарного колониестимулирующего фактора заменена другой аминокислотой, и 65-ый аминокислотный остаток (то есть пролин) дополнительно заменен серином. Более конкретно, физиологически активное вещество может представлять собой производное природного человеческого гранулоцитарного колониестимулирующего фактора, которое включает производные, где 17-ый аминокислотный остаток (то есть цистеин), 65-ый аминокислотный остаток (то есть пролин) и оба из данных аминокислотных остатков заменены серином, но физиологически активное вещество конкретно не ограничивается ими.

Производные природного гранулоцитарного колониестимулирующего фактора, которые принадлежат к объему гранулоцитарного колониестимулирующего фактора, подробно описаны в публикации корейской патентной заявки №10-2001-0009171 (международная публикация патента № WO 2001/004329 A1). Кроме того, все описание данной публикации корейской патентной заявки (международной публикации патента) включено сюда посредством ссылки.

Кроме того, физиологически активное вещество может представлять собой вещество, которое может связываться с двумя или более чем двумя рецепторами среди рецептора GLP, рецептора глюкагона и рецептора GIP. Данное вещество может иметь активность в отношении двух или более чем двух рецепторов среди рецептора GLP, рецептора глюкагона и рецептора GIP. То есть, как только вещество связывается с целевым рецептором, данный рецептор может демонстрировать активность.

В частности, физиологически активное вещество может представлять собой вещество, которое может связываться с двумя или более чем двумя рецепторами среди рецептора глюкагона, рецептора GLP-1 и рецептора GIP, и, более конкретно, вещество, которое может связываться с рецептором глюкагона и рецептором GLP-1; вещество, которое может связываться с рецептором GLP-1 и рецептором GIP, вещество, которое может связываться с рецептором GLP-1 и рецепторами глюкагона; или вещество, которое может связываться со всеми из рецептора глюкагона, рецептора GLP-1 и рецептора GIP, но физиологически активное вещество конкретно не ограничивается ими. Вещество, которое может связываться с тремя рецепторами, может быть названо тройным агонистом (или тройным активатором), и вещество, которое может связываться с двумя рецепторами, может быть названо двойным агонистом.

Примеры пептидов, имеющих активность в отношении рецептора глюкагона, рецептора GLP-1 и рецептора GIP, описаны в WO 2017/116205 A1 и WO 2017/116204 A1, которые представляют собой заявки, поданные ранее заявителем по настоящей заявке, и данные заявки целиком включены сюда посредством ссылок.

Кроме того, примеры двойного агониста глюкагона/GLP-1 описаны в WO 2015/183054, WO 2016/043533 и т.д., и полные описания изобретения данных заявок включены сюда посредством ссылки.

Кроме того, физиологически активное вещество может быть производным природного глюкагона.

Примеры производного глюкагона описаны в WO 2016/108586, WO 2017/003191 и т.д., и полные описания изобретения данных заявок включены сюда посредством ссылки.

Кроме того, физиологически активное вещество может быть природным инсулином или его аналогом. Более конкретно, физиологически активное вещество может быть природным инсулином или аналогом инсулина с пониженной аффинностью связывания в отношении инсулинового рецептора по сравнению с природным инсулином.

Термин «аналог инсулина» в том виде, в котором он здесь используется, относится к неприродному инсулину, который отличается от природного инсулина. Данный аналог инсулина включает неприродный человеческий инсулин, который отличается от природного человеческого инсулина.

Такой аналог инсулина включает те аналоги инсулина, в которых часть аминокислот природного инсулина модифицируется в виде присоединения и/или делеции, и/или замены.

В частности, аналог инсулина по настоящему изобретению может иметь гомологию последовательности с последовательностью природного инсулина по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94% или по меньшей мере 95% по сравнению с идентичностью последовательности. Кроме того, аналог инсулина по настоящему изобретению может представлять собой аналоги инсулина, имеющие пониженную аффинность связывания с рецептором по сравнению с природным инсулином, при наличии вышеописанной гомологии последователности с последовательностью природного инсулина. Кроме того, аналог инсулина может представлять собой аналоги инсулина, которые имеют способность к поглощению глюкозы и/или имеют способность к понижению уровня глюкозы в крови in vivo, как и у природного инсулина.

Более конкретно, аналог инсулина по настоящему изобретению может демонстрировать аффинность связывания в отношении инсулинового рецептора примерно 99% или меньше, примерно 95% или меньше, примерно 90% или меньше, примерно 85% или меньше, примерно 80% или меньше, примерно 75% или меньше, примерно 70% или меньше, примерно 65% или меньше, примерно 60% или меньше, примерно 55% или меньше, примерно 50% или меньше, примерно 45% или меньше, примерно 40% или меньше, примерно 35% или меньше, примерно 30% или меньше, примерно 25% или меньше, примерно 20% или меньше, примерно 15% или меньше, примерно 10% или меньше, примерно 9% или меньше, примерно 8% или меньше, примерно 7% или меньше, примерно 6% или меньше, примерно 5% или меньше, примерно 4% или меньше, примерно 3% или меньше, примерно 2% или меньше, примерно 1% или меньше, или примерно 0,1% или меньше по сравнению с аффинностью связывания (100%) природного инсулина (но аффинность связывания аналога инсулина по настоящему изобретению в отношении инсулинового рецептора не соответствует 0%). Аффинность связывания аналога инсулина можно оценивать с использованием сцинтилляционного анализа сближения (SPA), в котором используется конкурентная реакция между аналогами инсулина и инсулином, связанным с I¹²⁵, в клеточной мембране, в которой сверхэкспрессируются рекомбинантные рецепторы человеческого инсулина.

Кроме того, аналог инсулина может представлять собой аналоги инсулина, которые имеют период полувыведения, увеличенный по меньшей мере на 10% по сравнению с природным инсулином из-за уменьшения аффинности связывания в отношении инсулинового рецептора, но аналог инсулина не ограничивается ими.

Кроме того, аналог инсулина по настоящему изобретению может иметь такую же способность к поглощению глюкозы, как и у природного инсулина.

В частности, аналог инсулина по настоящему изобретению может представлять собой аналоги инсулина, которые имеют способность к поглощению глюкозы по меньшей мере примерно 10%, по меньшей мере примерно 20%, по меньшей мере примерно 30%, по меньшей мере примерно 40%, по меньшей мере примерно 50%, по меньшей мере примерно 55%, по меньшей мере примерно 60%, по меньшей мере примерно 65%, по меньшей мере примерно 70%, по меньшей мере примерно 75%, по меньшей мере примерно 80%, по меньшей мере примерно 85%, по меньшей мере примерно 90%, по меньшей мере примерно 95%, по меньшей мере примерно 100%, по меньшей мере примерно 110%, по меньшей мере примерно 120%, по меньшей мере примерно 130%, по меньшей мере примерно 140%, по меньшей мере примерно 150%, по меньшей мере примерно 160%, по меньшей мере примерно 170%, по меньшей мере примерно 180%, по меньшей мере примерно 190% или по меньшей мере примерно 200% по сравнению со способностью к поглощению глюкозы (100%) природного инсулина.

Измерение способности к поглощению глюкозы может достигаться с использованием разных способов измерения способности к поглощению глюкозы, известных в данной области.

Аналог инсулина, который принадлежит к объему вышеописанного аналога инсулина, подробно описан в публикации корейской патентной заявки №10-2015-0087130 (международная публикация патента № WO 2015/108398 A1) и в публикации корейской патентной заявки №10-2017-0026284 (международная публикация патента № WO 2017/039267 A1). Кроме того, все описания данных публикаций корейских патентных заявок (международных публикаций патентов) включены сюда посредством ссылки, но аналог инсулина не ограничивается ими. Кроме того, аналог инсулина по настоящему изобретению также включает все те аналоги инсулина, которые раскрыты в публикации корейской патентной заявки №10-2014-0106452, но аналог инсулина не ограничивается ими. Все вышеописанные описания изобретений патентов включены сюда посредством ссылки.

В частности, аналог инсулина может находиться в виде одной полипептидной цепи или двух полипептидных цепей и, более предпочтительно, двух полипептидных цепей, но аналог инсулина конкретно не ограничивается ими.

Аналог инсулина в виде двух полипептидных цепей может представлять собой аналоги, которые состоят из полипептида, соответствующего цепи А природного инсулина, и полипептида, соответствующего цепи В природного инсулина. В частности, фраза «соответствующий цепи А или цепи В природного инсулина» может относиться к случаям, в которых любая одна из двух полипептидных цепей имеет идентичность последовательности по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94% или по меньшей мере 95% по сравнению с цепью А или цепью В природного инсулина, но конкретно не ограничивается ими, и обычный специалист в данной области может легко это определить сравнением последовательности, состоящей из двух полипептидных цепей, с последовательностью цепи А или цепи В природного инсулина.

Природный инсулин представляет собой гормон, секретируемый поджелудочной железой, для общей стимуляции поглощения глюкозы и ингибирования распада жиров, и, таким образом, функционирует для контроля уровней глюкозы в крови. Инсулин образуется в результате процессинга его предшественника - проинсулина - который не имеет функции контроля уровней глюкозы в крови. Инсулин состоит из двух полипептидных цепей, то есть, цепи А и цепи В, которые содержат 21 и 30 аминокислот, соответственно, и они взаимосвязаны двумя дисульфидными мостиками. Цепь А и цепь В природного инсулина включают аминокислотные последовательности, представленные ниже SEQ ID NO: 1 или 2 соответственно.

Цепь А:

Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn (SEQ ID NO: 1)

Цепь В:

Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr (SEQ ID NO: 2)

Согласно типичному воплощению настоящего изобретения аналог инсулина, описанный в настоящем изобретении, может представлять собой аналоги, которые имеют пониженную аффинность связывания в отношении рецепторов, при наличии функции контроля уровня глюкозы в крови in vivo, как и природный инсулин. Более конкретно, аналог инсулина может иметь способность снижения уровня глюкозы в крови in vivo.

Тип и размер аналога инсулина конкретно не ограничиваются, при условии, что аналог инсулина может демонстрировать опосредованную рецептором интернализацию и/или опосредованный рецептором клиренс. Соответственно, аналог инсулина по настоящему изобретению может демонстрировать значительно повышенный период полувыведения в крови по сравнению с природным инсулином.

Аналог инсулина по настоящему изобретению включает инвертированный инсулин, производные природного инсулина, фрагменты природного инсулина и т.д. Аналог инсулина может быть получен твердофазным способом, а также способами генной инженерии, но способ получения аналога инсулина не ограничивается ими. Тем временем, аналог инсулина по настоящему изобретению не только включает те аналоги инсулина, которые получены способами генной инженерии, но также включает все аналоги инсулина с пониженной аффинностью связывания в отношении инсулинового рецептора.

Термин «производное природного инсулина» в том виде, в котором он здесь используется, относится к пептидам, которые имеют по меньшей мере одно отличие в аминокислотной последовательности по сравнению с природным инсулином; модифицированным пептидам, полученным модификацией последовательности природного инсулина; и миметикам природного инсулина, способным регулировать уровни глюкозы в крови in vivo, как и в случае природного инсулина. Данными производными природного инсулина могут быть производные, которые имеют функцию регулирования уровней глюкозы в крови in vivo.

В частности, производные природного инсулина могут быть получены с использованием любого способа, выбранного из замены, присоединения, делеции, модификации и их комбинации по отношению к части аминокислотной последовательнсти природного инсулина.

В частности, производные природного инсулина могут представлять собой производные, которые демонстрируют гомологию последовательности в аминокислотной последовательности по меньшей мере 80% по сравнению с каждой из цепи А и цепи В природного инсулина, и/или находятся в форме, где некоторые группы аминокислотного остатка инсулина изменены посредством химической замены (например, альфа-метилирование, альфа-гидроксилирование), делеции (например, дезаминирование) или модификации (например, N-метилирование), но гомология последовательности и формы производных природного инсулина не ограничиваются ими.

Производные природного инсулина, которые можно применять согласно настоящему изобретению, можно получать комбинацией разных способов, используемых для получения производных.

Кроме того, модификация для получения производных природного инсулина включает все из модификации с использованием аминокислоты L-типа или D-типа, и/или неприродной аминокислоты; и/или изменения или посттрансляционной модификации природной последовательности (например, метилирование, ацилирование, убиквитинирование, внутримолекулярное ковалентное связывания и т.д.).

Кроме того, производные природного инсулина также включают производные, в которых одну или более чем одну аминокислоту добавляют на амино- и/или карбоксиконец природного инсулина.

В качестве аминокислот, подлежащих замене или присоединению, можно использовать нетипичные или не встречающиеся в природе аминокислоты, а также 20 аминокислот, традиционно наблюдаемых в человеческих белках. Коммерческие источники нетипичных аминокислот включают Sigma-Aldrich, ChemPep Inc., Genzyme Pharmaceuticals и т.д. Пептидные последовательности, включающие данные аминокислоты, и нетипичные пептидные последовательности могут быть синтезированы или приобретены у коммерческих поставщиков, например American Peptide Company, Bachem (США) или Anygen (Корея), но способы получения данных пептидных последовательностей конкретно не ограничиваются ими.

Термин «фрагмент природного инсулина или фрагмент производного природного инсулина» относится к форме природного инсулина или производного природного инсулина, в которой одна или более чем одна аминокислота делетирована из амино- или карбоксиконца природного инсулина или производного природного инсулина. Такой фрагмент природного инсулина или производного природного инсулина может иметь функцию регулирования уровней глюкозы в крови in vivo.

Кроме того, аналог инсулина по настоящему изобретению может включать аналоги, которые получают с использованием каждого из способов, используемых для получения производных и фрагментов природного инсулина, описанных выше, независимо, или полученных с использованием способа, представляющего собой их комбинацию.

В частности, аналог инсулина по настоящему изобретению может включать модификацию в конкретном аминокислотном остатке в цепи А и цепи В природного инсулина, и, в частности, данные аналоги инсулина могут представлять собой аналоги, в которых модифицированы конкретные аминокислотные остатки цепи А природного инсулина и/или модифицированы конкретные аминокислотные остатки цепи В природного инсулина.

В частности, аналог инсулина по настоящему изобретению может представлять собой аналог инсулина, который имеет пониженную аффинность связывания в отношении инсулинового рецептора по сравнению с природным инсулином, и включает модификацию и/или делецию в по меньшей мере одной аминокислоте цепи А или цепи В природного инсулина. Например, аналог инсулина может представлять собой аналог, в котором часть аминокислот в природном инсулине модифицирована в виде присоединения, делеции, замены и их комбинации, и, посредством этого, его аффинность связывания в отношении инсулинового рецептора уменьшается по сравнению с природным инсулином.

В частности, аналог инсулина может представлять собой аналог инсулина, в котором по меньшей мере одна аминокислота, выбранная из группы, состоящей из 1-й аминокислоты, 2-й аминокислоты, 3-й аминокислоты, 5-й аминокислоты, 8-й аминокислоты, 10-й аминокислоты, 12-й аминокислоты, 16-й аминокислоты, 23-й аминокислоты, 24-й аминокислоты, 25-й аминокислоты, 26-й аминокислоты, 27-й аминокислоты, 28-й аминокислоты, 29-й аминокислоты и 30-й аминокислоты цепи В инсулина, и 1-й аминокислоты, 2-й аминокислоты, 5-й аминокислоты, 8-й аминокислоты, 10-й аминокислоты, 12-й аминокислоты, 14-й аминокислоты, 16-й аминокислоты, 17-й аминокислоты, 18-й аминокислоты, 19-й аминокислоты и 21-й аминокислоты цепи А инсулина, заменена другой аминокислотой; или, более конкретно, аналог инсулина, в котором по меньшей мере одна аминокислота, выбранная из группы, состоящей из 8-й аминокислоты, 23-й аминокислоты, 24-й аминокислоты и 25-й аминокислоты цепи В инсулина, и 1-й аминокислоты, 2-й аминокислоты, 14-й аминокислоты и 19-й аминокислоты цепи А инсулина, заменена другой аминокислотой.

В частности, аналог инсулина может представлять собой аналог, в котором по меньшей мере 1 аминокислота, по меньшей мере 2 аминокислоты, по меньшей мере 3 аминокислоты, по меньшей мере 4 аминокислоты, по меньшей мере 5 аминокислот, по меньшей мере 6 аминокислот, по меньшей мере 7 аминокислот, по меньшей мере 8 аминокислот, по меньшей мере 9 аминокислот, по меньшей мере 10 аминокислот, по меньшей мере 11 аминокислот, по меньшей мере 12 аминокислот, по меньшей мере 13 аминокислот, по меньшей мере 14 аминокислот, по меньшей мере 15 аминокислот, по меньшей мере 16 аминокислот, по меньшей мере 17 аминокислот, по меньшей мере 18 аминокислот, по меньшей мере 19 аминокислот, по меньшей мере 20 аминокислот, по меньшей мере 21 аминокислота, по меньшей мере 22 аминокислоты, по меньшей мере 23 аминокислоты, по меньшей мере 24 аминокислоты, по меньшей мере 25 аминокислот, по меньшей мере 26 аминокислот или по меньшей мере 27 аминокислот в аминокислотах, описанных выше, заменены другой аминокислотой, но аналог инсулина, не ограничивается ими.

Аминокислотные остатки в положениях, описанных выше, могут быть заменены аланином, глутаминовой кислотой, аспарагином, изолейцином, валином, глутамином, глицином, лизином, гистидином, цистеином, фенилаланином, триптофаном, пролином, серином, треонином и/или аспарагиновой кислотой. Кроме того, объему настоящего изобретения могут принадлежать те аналоги инсулина, которые имеют пониженную аффинность связывания в отношении инсулинового рецептора из-за делеции по меньшей мере одной аминокислоты в цепи А или цепи В природного инсулина, но любой аналог инсулина с пониженной аффинностью связывания в отношении инсулинового рецептора может быть включен без ограничения.

Более конкретно, аналог инсулина может представлять собой аналог, который включает цепь А SEQ ID NO: 3, представленную Общей формулой 1, приведенной ниже, и цепь В SEQ ID NO: 4, представленную Общей формулой 2, приведенной ниже. Кроме того, аналог инсулина может находиться в форме, где последовательности цепи А и цепи В взаимосвязаны дисульфидной связью, но форма аналога инсулина не ограничивается ими.

[Общая формула 1]

Xaa1-Xaa2-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Xaa14-Gln-Leu-Glu-Asn-Xaa19-Cys-Asn (SEQ ID NO: 3)

В Общей формуле 1, приведенной выше,

Xaa1 представляет собой глицин или аланин,

Хаа2 представляет собой изолейцин или аланин,

Хаа14 представляет собой тирозин, глутаминовую кислоту или аспарагин, и

Хаа19 представляет собой тирозин или аланин.

[Общая формула 2]

В Общей формуле 2, приведенной выше,

Xaa8 представляет собой глицин или аланин,

Xaa23 представляет собой глицин или аланин,

Хаа24 представляет собой фенилаланин или аланин, и

Хаа25 представляет собой фенилаланин или аланин.

Более конкретно, аналог инсулина может включать:

(i) цепь А Общей формулы 1, приведенной выше, в которой Хаа1 представляет собой аланин, Хаа2 представляет собой изолейцин, Xaa14 представляет собой тирозин, и Xaa19 представляет собой тирозин, и цепь B Общей формулы 2, в которой Xaa8 представляет собой глицин, Xaa23 представляет собой глицин, Xaa24 представляет собой фенилаланин, и Xaa25 представляет собой фенилаланин;

(iii) цепь А Общей формулы 1, в которой Xaa1 представляет собой глицин, Xaa2 представляет собой изолейцин, Xaa14 представляет собой глутаминовую кислоту или аспарагин, и Xaa19 представляет собой тирозин, и цепь В Общей формулы 2, в которой Xaa8 представляет собой глицин, Xaa23 представляет собой глицин, Xaa24 представляет собой фенилаланин, и Xaa25 представляет собой фенилаланин;

(iv) цепь А Общей формулы 1, в которой Xaa1 представляет собой глицин, Xaa2 представляет собой изолейцин, Xaa14 представляет собой тирозин, Xaa19 представляет собой аланин в Общей формуле 1, приведенной выше, и цепь В Общей формулы 2, в которой Xaa8 представляет собой глицин, Xaa23 представляет собой глицин, Xaa24 представляет собой фенилаланин, и Xaa25 представляет собой фенилаланин;

(v) цепь А Общей формулы 1, в которой Xaa1 представляет собой глицин, Xaa2 представляет собой изолейцин, Xaa14 представляет собой тирозин, и Xaa19 представляет собой тирозин, и цепь В Общей формулы 2, в которой Xaa8 представляет собой аланин, Xaa23 представляет собой глицин, Xaa24 представляет собой фенилаланин, и Xaa25 представляет собой фенилаланин;

(vi) цепь А Общей формулы 1, в которой Xaa1 представляет собой глицин, Xaa2 представляет собой изолейцин, Xaa14 представляет собой тирозин, и Xaa19 представляет собой тирозин, и цепь В Общей формулы 2, в которой Xaa8 представляет собой глицин, Xaa23 представляет собой аланин, Xaa24 представляет собой фенилаланин, и Xaa25 представляет собой фенилаланин;

(vii) цепь А Общей формулы 1, в которой Xaa1 представляет собой глицин, Xaa2 представляет собой изолейцин, Xaa14 представляет собой тирозин, и Xaa19 представляет собой тирозин, и цепь В Общей формулы 2, в которой Xaa8 представляет собой глицин, Xaa23 представляет собой глицин, Xaa24 представляет собой аланин, и Xaa25 представляет собой фенилаланин; и

(viii) цепь А Общей формулы 1, в которой Xaa1 представляет собой глицин, Xaa2 представляет собой изолейцин, Xaa14 представляет собой тирозин, и Xaa19 представляет собой тирозин, и цепь В Общей формулы 2, в которой Xaa8 представляет собой глицин, Xaa23 представляет собой глицин, Xaa24 представляет собой фенилаланин, и Xaa25 представляет собой аланин.

Кроме того, аналог инсулина может представлять собой аналог инсулина, который включает цепь А SEQ ID NO: 5, представленную Общей формулой 3, приведенной ниже, и цепь В SEQ ID NO: 6, представленную Общей формулой 4, приведенной ниже. Кроме того, аналог инсулина может находиться в форме, где последовательности цепи А и цепи В взаимосвязаны дисульфидной связью, но форма аналога инсулина не ограничивается ими.

[Общая формула 3]

В Общей формуле 3, приведенной выше,

и

Хаа21 представляет собой аспарагин, глицин, гистидин или аланин.

[Общая формула 4]

В Общей формуле 4, приведенной выше,

Более конкретно, аналог инсулина может представлять собой аналог инсулина, в котором:

в Общей формуле 3, приведенной выше, Хаа1 представляет собой глицин, Хаа5 представляет собой глутамин, Хаа12 представляет собой серин, Хаа14 представляет собой глутаминовую кислоту или аспарагин, Хаа16 представляет собой лейцин, Хаа19 представляет собой тирозин, и Хаа21 представляет собой аспарагин;

(1) в цепи A инсулина SEQ ID NO: 5, Xaa1 представляет собой глицин, Xaa5 представляет собой глутамин, Xaa12 представляет собой серин, Xaa14 представляет собой глутаминовую кислоту, Xaa16 представляет собой лейцин, Xaa19 представляет собой тирозин, и Xaa21 представляет собой аспарагин; и

в цепи B инсулина SEQ ID NO: 6, Xaa16 представляет собой тирозин, Xaa25 представляет собой фенилаланин, Xaa27 представляет собой треонин, Xaa28 представляет собой пролин, глутаминовую кислоту или аспарагиновую кислоту, или отсутствует;

(2) в цепи A инсулина SEQ ID NO: 5, Xaa1 представляет собой глицин, Xaa5 представляет собой глутамин, Xaa12 представляет собой серин, Xaa14 представляет собой аспарагин, Xaa16 представляет собой лейцин, Xaa19 представляет собой тирозин, и Xaa21 представляет собой аспарагин; и

(3) в цепи A инсулина SEQ ID NO: 5, Xaa1 представляет собой глицин, Xaa5 представляет собой глутамин, Xaa12 представляет собой серин, Xaa14 представляет собой глутаминовую кислоту, Xaa16 представляет собой лейцин, Xaa19 представляет собой тирозин, и Xaa21 представляет собой аспарагин; и,

в цепи B инсулина SEQ ID NO: 6, Xaa16 представляет собой тирозин, Xaa25 отсутствует, Xaa27 представляет собой треонин, Xaa28 представляет собой пролин, глутаминовую кислоту, или аспарагиновую кислоту, или отсутствует; или

(4) в цепи A инсулина SEQ ID NO: 5, Xaa1 представляет собой глицин, Xaa5 представляет собой глутамин, Xaa12 представляет собой серин, Xaa14 представляет собой аланин, Xaa16 представляет собой лейцин, Xaa19 представляет собой тирозин, Xaa21 представляет собой аспарагин; и,

в цепи B инсулина SEQ ID NO: 6, Xaa16 представляет собой глутаминовую кислоту, Xaa25 отсутствует, Xaa27 представляет собой треонин, Xaa28 представляет собой пролин, глутаминовую кислоту или аспарагиновую кислоту, или отсутствует, но аналог инсулина конкретно не ограничивается ими.

в Общей формуле 4, приведенной выше, Xaa16 представляет собой тирозин, Xaa25 представляет собой глутаминовую кислоту, Xaa27 представляет собой треонин, и Xaa28 представляет собой пролин, но аналог инсулина конкретно не ограничивается ими.

Однако аналог инсулина не ограничивается приведенными выше воплощениями. Например, в объем настоящего изобретения также включены те пептиды, которые имеют пониженную аффинность связывания в отношении инсулинового рецептора по сравнению с природным инсулином, при содержании характерных аминокислотных остатков, описанных выше, и наличии гомологии с полипептидом целевого аналога инсулина по меньшей мере 70%, в частности, по меньшей мере 80%, более конкретно по меньшей мере 90% и даже более конкретно по меньшей мере 95%.

Термин «гомология» в том виде, в котором он здесь используется, относится к степени сходства последовательности с аминокислотной последовательностью природного белка (дикого типа) или кодирующей ее полинуклеотидной последовательностью, и он включает те последовательности, которые имеют процентные доли идентичности последовательности, описанные выше, или более высокие, с аминокислотной последовательностью или полинуклеотидной последовательностью по настоящему изобретению. Данные гомологии можно определять сравнением двух последовательностей невооруженным глазом или, в качестве альтернативы, их можно определять с использованием алгоритма биоинформатики, который выравнивает последовательности, подлежащие сравнению, и анализирует степень гомологии. Гомология между двумя аминокислотными последовательностями может быть выражена в виде процентной доли. Полезные автоматизированные алгоритмы доступны в компьютерных программных модулях GAP, BESTFIT, FASTA и TFASTA пакета программ Wisconsin Genetics (Genetics Computer Group, Madison, WI, США). Автоматизированные матричные алгоритмы в данном модуле включают алгоритмы выравнивания последовательностей Needleman & Wunsch, Pearson & Lipman и Smith & Waterman. Алгоритм и определение гомологии для других полезных матриц автоматизируются в программе, включающей FASTP, BLAST, BLAST2, PSIBLAST и CLUSTAL W.

Полинуклеотиды, кодирующие аналог инсулина, могут быть выделены или получены с использованием стандартных методик молекулярной биологии. Например, полинуклеотиды, кодирующие аналог инсулина, могут быть амплифицированы посредством полимеразной цепной реакции (ПЦР) от последовательности гена природного инсулина (NM_000207.2, NCBI) с использованием подходящих последовательностей праймеров или могут быть получены с использованием стандартных методик синтеза с использованием автоматизированного синтезатора ДНК. В настоящем изобретении термин «полинуклеотид» может использоваться взаимозаменяемо с термином «нуклеиновая кислота».

Полинуклеотид, кодирующий аналог инсулина, может включать те полинуклеотиды, которые кодируют аминокислотные последовательности цепей А и В, описанных выше, но полинуклеотид не ограничивается ими. Например, помимо последовательностей полинуклеотидов, описанных выше, в объем настоящего изобретения также включены те полинуклеотиды, которые кодируют пептиды, имеющие гомологию с приведенными выше последовательностями, составляющую по меньшей мере 70%, в частности, по меньшей мере 80%, более конкретно по меньшей мере 90% и даже более конкретно по меньшей мере 95%, и имеют пониженную аффинность связывания в отношении инсулинового рецептора по сравнению с природным инсулином.

Тем временем конъюгат по отношению к природному инсулину или его аналогу может представлять собой конъюгат, представленный Формулой 2 ниже:

[Формула 2]

X-L-F,

в которой в Формуле 2, приведенной выше,

F представляет собой вещество, способное увеличивать период полувыведения Х in vivo.

Конъюгат, представленный Формулой 2 выше, может представлять собой конъюгат, у которого уменьшается опосредованный рецептором клиренс (RMC), но данный конъюгат конкретно им не ограничивается.

В конъюгате, представленном Формулой 2 выше, L может быть связан с аминоконцевой областью бета-цепи природного инсулина или его аналога (то есть Х), но данный конъюгат конкретно им не ограничивается.

В настоящем изобретении термин «N-концевая область или аминоконцевая область» относится к аминоконцевой области пептида или белка. Например, «N-концевая область» может включать не только самый концевой аминокислотный остаток N-концевой области, но также смежные аминокислотные остатки с N-концевым аминокислотным остатком, и, в частности, от 1-го аминокислотного остатка до 20-го аминокислотного остатка от самого конца, но N-концевая область конкретно не ограничивается ими.

Тем временем, в конъюгате по настоящему изобретению Х и F могут быть связаны друг с другом через L ковалентной химической связью, нековалентной химической связью или их комбинацией, и, в частности, Х и F могут быть связаны друг с другом через L ковалентной химической связью.

В Формуле 1 или 2, приведенной выше, «-» может обозначать ковалентную химическую связь или нековалентную химическую связь и, более конкретно, ковалентную химическую связь, но конкретно не ограничивается ими.

Конъюгат Формулы 1 или 2, приведенной выше, имеет структуру, в которой Х, L и F связаны в данном порядке.

В конкретном воплощении оба конца L, соответственно, связаны с аминогруппой или тиольной группой F (например, область Fc иммуноглобулина) и аминогруппой или тиольной группой Х с получением конъюгата. Данная аминогруппа может представлять собой первичный амин или вторичный амин.

Аминогруппа может располагаться на N-конце или боковой цепи остатка лизина полипептида, такого как физиологически активный полипептид или область Fc иммуноглобулина; и тиольная группа может располагаться на остатке цистеина полипептида, такого как физиологически активный полипептид или область Fc иммуноглобулина.

Аминогруппа полипептида, такого как физиологически активный полипептид или область Fc иммуноглобулина, может образовать ковалентную связь посредством взаимодействия с альдегидом или со сложным N-гидроксисукцинимидиловым эфиром.

Тиольная группа полипептида, такого как физиологически активный полипептид или область Fc иммуноглобулина, может образовать ковалентную связь посредством взаимодействия с малеимидом, йодацетамидом, винилсульфоном, пиридилдисульфидом или тиольной группой.

В частности, перед образованием конъюгата, L может включать реакционноспособную группу, которая может связываться с F и X на его обоих концах, соответственно, в частности, реакционноспособную группу, которая может связываться с аминогруппой, расположенной на N-конце или остатке лизина, или с тиольной группой в остатке цистеина Х; или с аминогруппой, расположенной на N-конце или остатке лизина, или с тиольной группой в остатке цистеина F, но реакционноспособная группа не ограничивается ими.

L, перед связыванием и с Х, и с F, может иметь по меньшей мере две концевые функциональные группы, в частности, две или три концевые функциональные группы, и, более конкретно, две концевые функциональные группы.

В частности L может представлять собой гомофункциональный PEG, в котором типы всех из по меньшей мере двух функциональных групп являются одинаковыми, или гетерофункциональный PEG, в котором тип по меньшей мере одной функциональной группы отличается от типа(ов) другой(их) функциональной(ых) групп(ы). Например, PEG может находиться в форме с двумя концами, где один конец PEG представляет собой альдегид, тогда как другой конец представляет собой малеимид.

Кроме того, L может представлять собой гомофункциональный PEG, в котором оба конца или все из трех концов представляют собой альдегид.

Например, L может представлять собой PEG, имеющий пропиональдегидную группу или бутиральдегидную группу на обоих концах, но конкретно не ограничивается ими.

Когда L имеет функциональную группу реакционноспособного альдегида на обоих концах, он является эффективным для связывания L с физиологически активным полипептидом и областью Fc иммуноглобулина на обоих концах, соответственно, при минимизации проявления неспецифичных реакций. Конечный продукт, образованный через восстановительное аминирование посредством альдегидной связи, является значительно более стабильным по сравнению с конечными продуктами, образованными амидной связью. Альдегидная функциональная группа селективно реагирует на N-конце при низком рН и может образовать ковалентную связь с остатком лизина при высоком рН (например, рН 9,0).

Концевая функциональная группа L, описанная выше, может представлять собой функциональную группу, реагирующую с амином, или функциональную группу, реагирующую с тиолом.

Более конкретно, каждая по меньшей мере одна концевая функциональная группа L может быть независимо выбрана из группы, состоящей из альдегида, малеимида, сукцинимида, винилсульфона, тиола, С_6-20арилдисульфида, С_5-20гетероарилдисульфида и галогенированного ацетамида, и даже более конкретно каждая может быть независимо выбрана из группы, состоящей из альдегида, малеимида, сукцинимида, винилсульфона, тиола, орто-пиридилдисульфида и йодацетамида, но концевая функциональная группа конкретно не ограничивается ими.

В качестве функциональных групп L в данной области известны производные, и данные производные могут быть легко получены на техническом уровне данной области, и они, также как и типы производных, описанные выше, также включены в объем настоящего изобретения.

Альдегидная группа может представлять собой алкилальдегидную (например, C_2-6алкилальдегидную) и, в частности, пропиональдегидную группу, бутиральдегидную группу и т.д., но альдегидная группа конкретно не ограничивается ими.

Сукцинимидная группа может представлять собой сукцинимидилвалерат, сукцинимидилметилбутаноат, сукцинимидилметилпропионат, сукцинимидилбутаноат, сукцинимидилпропионат, гидроксисукцинимидил (в частности, N-гидроксисукцинимидил), сукцинимидилкарбоксиметил или сукцинимидилкарбонат. Сукцинимидная группа может иметь подходящую форму таким образом, чтобы она была связана с целевой функциональной группой, расположенной на физиологически активном полипептиде или области Fc иммуноглобулина. Например, сукцинимидная группа может представлять собой сложный N-гидроксисукцинимидиловый эфир.

Кроме того, при использовании PEG, имеющего на обоих концах гидроксильную функциональную группу, данная гидроксильная группа может быть активирована до разных реакционноспособных групп, описаных выше, известными химическими реакциями.

В случае пептидного линкера, использованного в слитом белке, полученном традиционным способом слияния в рамке считывания, данный пептидный линкер может легко расщепляться протеазой in vivo, и, таким образом, не может быть получен, как ожидалось, достаточный эффект увеличения периода полувыведения активного лекарственного средства в сыворотке посредством носителя. Следовательно, в настоящем изобретении конъюгат может быть получен с использованием полиэтиленгликоля, который является непептидным линкером. PEG, имеющий устойчивость к протеазе, может использоваться в качестве непептидного линкера для поддержания периода полувыведения данного пептида в крови, аналогично носителю. Молекулярная масса полиэтиленгликоля находится в интервале меньше, чем 3,4 кДа, но его молекулярная масса не ограничивается ей.

Тем временем, в отношении молекулярной массы полиэтиленгликоля, используемого в настоящем изобретении, все из тех, которые были описаны ранее, будут применяться к молекулярным массам, описанным выше, и к тем, которые будут описаны позднее.

В конъюгате по настоящему изобретению «F» относится к веществу, которое может увеличивать период полувыведения in vivo физиологически активного вещества. В настоящем изобретении термин «F» может использоваться взаимозаменяемо с «биосовместимым веществом» или носителем.

В настоящем изобретении «биосовместимое вещество или вещество, способное увеличивать период полувыведения in vivo» представляет собой одну группировку, которая составляет конъюгат.

Тип биосовместимого вещества или носителя не ограничивается при условии, что оно представляет собой вещество, которое связывается с целевым физиологически активным веществом и, посредством этого, способно продлевать его период полувыведения in vivo. В качестве неограничивающих примеров, данное биосовместимое вещество или носитель может быть выбрано из группы, состоящей из полимеров, жирных кислот, холестерина, альбумина и его фрагмента, альбуминсвязывающих веществ, полимера из повторяющихся звеньев определенной аминокислотной поседовательности, антител, фрагментов антител, веществ, связывающихся с FcRn, соединительных тканей in vivo, нуклеотидов, фибронектина, трансферрина, сахаридов, гепарина и эластина.

Полимер может быть выбран из группы, состоящей из полиэтиленгликоля, полипропиленгликоля, сополимера этиленгликоль-пропиленгликоль, полиоксиэтилированного полиола, поливинилового спирта, полисахарида, декстрана, простого поливинилэтилового эфира, биодеградируемого полимера, липидного полимера, хитинов, гиалуроновой кислоты, олигонуклеотида и их комбинации, но данный полимер конкретно не ограничивается ими.

Биосовместимое вещество или носитель может быть ковалентно или нековалентно связан с Х. Кроме того, вещество, связывающееся с FcRn, может представлять собой полипептид, включающий область Fc иммуноглобулина, и, в частности, область Fc иммуноглобулина (например, Fc IgG).

При использовании альбумина в качестве носителя можно использовать методики, которые могут непосредственно ковалентно связывать альбумин или его фрагмент с физиологически активным веществом через линкер, увеличивая, посредством этого, стабильность физиологически активного вещества in vivo. Кроме того, можно использовать методики, которые, хотя и не способны непосредственно связывать альбумин с физиологически активным веществом, могут связывать альбуминсвязывающее вещество, такое как альбуминспецифичное связывающее антитело или его фрагмент, с физиологически активным веществом, для связывания, посредством этого, физиологически активного вещества с альбумином, и методики, которые могут связывать конкретный пептид/белок, имеющий аффинность связывания в отношении альбумина (например, альбуминсвязывающий пептид, продуцируемый с использованием технологии Albumod компании Affibody), с физиологически активным веществом, и можно использовать методики, которые могут связывать жирные кислоты и т.д., имеющие аффинность связывания в отношении альбумина, но методики не ограничиваются ими, и может быть включена любая методика, способы связывания и т.д., которые могут увеличивать стабильность физиологически активного вещества in vivo с использованием альбумина.

Для увеличения периода полувыведения in vivo физиологически активного вещества также могут быть включены методики, которые могут связывать антитело или фрагмент антитела, в качестве носителя, с физиологически активным веществом. Данное антитело или фрагмент антитела может представлять собой антитело или фрагмент антитела, имеющий FcRn-связывающую область, и он может представлять собой любой фрагмент антитела, который не включает FcRn-связывающую область, такой как Fab и т.д. Может быть включена технология CovX-body компании CovX с использованием каталитического антитела, и в настоящее изобретение могут быть включены технологии, которые могут увеличивать период полувыведения in vivo физиологически активного вещества с использованием области Fc иммуноглобулина.

Кроме того, в настоящее изобретение также могут быть включены технологии, которые могут связывать фрагмент пептида или белка, в качестве носителя, с физиологически активным веществом таким образом, чтобы увеличивать период полувыведения in vivo. Фрагмент пептида или белка, подлежащий применению, может представлять собой эластиноподобный полипептид (ELP), состоящий из полимера из повторяющихся звеньев комбинации конкретных аминокислотных последовательностей, и в технологии Xten используется искусственный полипептид PEG от Versartis Inc. Кроме того, в настоящее изобретение также включаются технология зонда, индуцирующего структуру (SIP) от компании Zealand, которая может увеличивать период полувыведения in vivo физиологически активного вещества с использованием мультилизина, и технология слияния СТР от Prolor Biotech Inc., и также могут быть включены трансферрин, который, как известно, имеет высокую стабильность in vivo, или фибронектин (составляющий компонент соединительной ткани) или его производное и т.д. Пептид или белок, подлежащий связыванию с физиологически активным веществом, не ограничивается пептидами или белками, описанными выше, но в объем настоящего изобретения включается любой пептид или белок, который может увеличивать период полувыведения in vivo физиологически активного вещества.

Кроме того, носитель, подлежащий применению для увеличения периода полувыведения in vivo, может представлять собой непептидное вещество, такое как полисахарид или жирные кислоты и т.д.

При использовании иммуноглобулина линкер для связывания области Fc с физиологически активным веществом и способ связывания могут включать непептидную связь с использованием полиэтиленгликоля. Область Fc и физиологически активное вещество можно связывать в соотношении 1:1 или 1:2, но данное соотношение не ограничивается ими. В частности, область Fc может находиться в форме димера и в форме, где одна молекула физиологически активного вещества может быть связана с одной цепью области Fc иммуноглобулина в димерной форме, или в форме, где одна молекула физиологически активного вещества может быть связана с каждой из двух цепей области Fc иммуноглобулина в димерной форме, соответственно, но форма связывания конкретно не ограничивается ими.

Кроме того, в конъюгате по отношению к Формуле 1 или Формуле 2, приведенным выше, когда F представляет собой область Fc иммуноглобулина, L может быть связан с N-концевой областью F, но конкретно не ограничивается этим.

Поскольку область Fc иммуноглобулина представляет собой биодеградиуемый полипептид, который может быть метаболизирован in vivo, она является безопасной для применения в качестве носителя лекарственного средства. Кроме того, область Fc иммуноглобулина имеет относительно низкую молекулярную массу по сравнению с целой молекулой иммуноглобулина, она имеет преимущества в показателях получения, очистки и выхода конъюгата. Кроме того, по мере удаления области Fab, которая демонстрирует высокую гетерогенность из-за различия аминокислотных последовательностей от антитела к антителу, ожидается, что гомогенность веществ может быть значительно увеличена, и риск индуцирования антигенности крови также может быть снижен.

Термин «область Fc иммуноглобулина» в том виде, в котором он здесь используется, относится к белку, который включает константную область 2 тяжелой цепи (СН2) и константную область 3 тяжелой цепи (СН3) иммуноглобулина, исключая вариабельные области тяжелой цепи и легкой цепи иммуноглобулина.

Область Fc иммуноглобулина может включать шарнирную область в константных областях тяжелой цепи. Кроме того, область Fc иммуноглобулина по настоящему изобретению может быть удлиненной областью Fc, которая включает часть или всю константную область 1 тяжелой цепи (СН1) и/или константную область

1 легкой цепи (CL1), исключая вариабельные области тяжелой и легкой цепи иммуноглобулина, при условии, что область Fc иммуноглобулина имеет по существу такой же или улучшенный эффект по сравнению с эффектом природной Fc. Кроме того, область Fc иммуноглобулина по настоящему изобретению может представлять собой область, в которой удалена существенно длинная частичная аминокислотная последовательность, соответствующая СН2 и/или СН3.

В частности, область Fc иммуноглобулина по настоящему изобретению может представлять собой: 1) домен СН1, домен СН2, домен СН3 и домен СН4, 2) домен СН1 и домен СН2, 3) домен СН1 и домен СН3, 4) домен СН2 и домен СН3, и 5) комбинацию между одним или двумя, или более чем двумя доменами, выбранными из домена СН1, домена СН2, домена СН3, домена СН4 и шарнирной области (или части шарнирной области) иммуноглобулина (например, комбинацию между доменом СН2, доменом СН3 и шарнирной областью или частью шарнирной области; и димер двух полипептидов с комбинацией, описанной выше), и 6) димер между каждым доменом константной области тяжелой цепи и константной области легкой цепи.

Кроме того, область Fc иммуноглобулина не только включает его природную аминокислотную последовательность, но также вариант (мутант) его последовательности. Термин «мутант аминокислотной последовательности» в том виде, в котором он здесь используется, относится к последовательности, которая отличается от природной аминокислотной последовательности из-за делеции, вставки, неконсервативной или консервативной замены, или их комбинации в отношении одного или более чем одного аминокислотного остатка природной аминокислотной последовательности. Например, в случае Fc IgG, в качестве подходящих сайтов для модификации можно использовать аминокислотные остатки в положениях 214-238, 297-299, 318-322 или 327-331, которые, как известно, являются важными для связывания.

Кроме того, возможны другие разные виды мутантов, включающие мутанта, который имеет делецию области, способной образовать дисульфидную связь, или делецию некоторых аминокислотных остатков на N-конце природного Fc, или присоединение остатка метионина на N-конце природного Fc и т.д. Кроме того, для устранения эффекторных функций, делеция может происходить в сайте связывания с комплементом, таком как сайт связывания с C1q, и в сайте антителозависимой клеточной цитотоксичности (ADCC). Методики получения таких производных последовательности области Fc иммуноглобулина раскрыты в международных публикациях патентов №WO 97/34631, WO 96/32478 и т.д.

В данной области известны аминокислотные замены в белках и пептидах, которые обычно не изменяют активность белков или пептидов (H. Neurath, R. L. Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). Чаще всего встречающимися заменами являются Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu и Asp/Gly.

В некоторых случаях область Fc может быть модифицирована фосфорилированием, сульфатированием, акрилированием, гликозилированием, метилированием, фарнезилированием, ацетилированием, амидированием и т.д.

Вышеописанными мутантами Fc могут быть мутанты, которые демонстрируют идентичную биологическую активность с областью Fc по настоящему изобретению, но имеют улучшенную структурную стабильность против нагревания, рН и т.д.

Кроме того, область Fc может быть получена из природных форм, выделенных in vivo из человека и животных, таких как коровы, козы, свиньи, мыши, кролики, хомяки, крысы, морские свинки и т.д., или может представлять собой рекомбинанты или их производные, полученные из трансформированных животных клеток или микроорганизмов. Здесь область Fc может быть получена из природного иммуноглобулина посредством выделения целого иммуноглобулина из живого человеческого или животного организма и обработки выделенного иммуноглобулина протеазой. При обработке целого иммуноглобулина папаином, он расщепляется на области Fab и Fc, тогда как при обработке целого иммуноглобулина пепсином он расщепляется на фрагменты pF'c и F(ab)₂. Данные фрагменты могут быть выделены с использованием гель-фильтрации и т.д.

В более конкретном воплощении область Fc может представлять собой область Fc рекомбинантного иммуноглобулина, полученную из микроорганизма, по отношению к области Fc человеческого происхождения.

Кроме того, область Fc иммуноглобулина может находиться в форме с природным гликаном, с повышенным или пониженным содержанием гликанов по сравнению с его природным типом, или в дегликозилированной форме. Увеличение, уменьшение содержания или удаление гликанов Fc иммуноглобулина может достигаться традиционными способами, такими как химический способ, ферментативный способ и способ генной инженерии с использованием микроорганизма. Область Fc иммуноглобулина, полученная удалением гликанов из области Fc, демонстрирует значительное снижение аффинности связывания с комплементом (часть C1q) и снижение или потерю антителозависимой цитотоксичности или комплементзависимой цитотоксичности, и, таким образом, она не индуцирует необязательных иммунных ответов in vivo. В данном отношении область Fc иммуноглобулина в дегликозилированной или агликозилированной области Fc иммуноглобулина может быть более подходящей формой для удовлетворения исходной задачи настоящего изобретения в качестве носителя лекарственного средства.

Термин «дегликозилирование» в том виде, в котором он здесь используется, относится к ферментативному удалению сахарных группировок из области Fc, и термин «агликозилирование» относится к негликозилированной области Fc, продуцируемой в прокариотах, более конкретно в E.coli.

Тем временем, область Fc иммуноглобулина может быть получена от человека или животных, включающих коров, коз, мышей, кроликов, хомяков, крыс и морских свинок, и, предпочтительно, ее получают от человека. Кроме того, область Fc иммуноглобулина (Ig) может представлять собой область Fc, полученную из IgG, IgA, IgD, IgE, IgM или из их комбинации, или гибрида. Предпочтительно она может иметь происхождение из IgG или IgM, которые находятся среди самых массовых белков в человеческой крови, и, наиболее предпочтительно, она может иметь происхождение из IgG, который, как известно, увеличивает периоды полувыведения лигандсвязывающих белков.

Тем временем, термин «комбинация» в том виде, в котором он здесь используется, означает, что полипептиды, кодирующие одноцепочечные области Fc иммуноглобулина того же самого происхождения, связаны с одноцепочечным полипептидом другого происхождения с образованием димера или мультимера. То есть, димер или мультимер может быть получен из двух или более чем двух фрагментов, выбранных из группы, состоящей из фрагментов Fc IgG, Fc IgA, Fc IgM, Fc IgD и Fc IgE.

Термин «гибрид» в том виде, в котором он здесь используется, означает то, что последовательности, соответствующие двум или более чем двум фрагментам Fc иммуноглобулина разного происхождения, присутствуют в одной цепи области Fc иммуноглобулина. В настоящем изобретении возможны разные гибридные формы. То есть, гибридный домен может состоять из одного-четырех доменов, выбранных из группы, состоящей из CH1, CH2, CH3 и CH4 Fc IgG, Fc IgM, Fc IgA, Fc IgE и Fc IgD, и может включать шарнирную область.

Тем временем, IgG также может подразделяться на подклассы IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4, и настоящее изобретение может включать их комбинации или гибриды, предпочтительно подклассов IgG2 и IgG4, и наиболее предпочтительно область Fc IgG4, редко имеющую эффекторную функцию, такую как комплементзависимая цитотоксичность (CDC). То есть, область Fc иммуноглобулина по настоящему изобретению, подлежащая применению в качестве носителя лекарственного средства, может представлять собой агликозилированную область Fc, имеющую происхождение из человеческого IgG4. Область Fc, имеющая происхождение из человеческого IgG4, является предпочтительной относительно областей Fc, не являющихся человеческими, которые могут вызывать нежелательные иммунные ответы, как, например, действуя в качестве антигенов в человеческом организме, продуцируя, посредством этого, новые антитела против антигена и т.д.

В более конкретном воплощении физиологически активное вещество (например, природный инсулин или аналог инсулина) и биосовместимое вещество связаны через полиэтиленгликоль, который представляет собой линкер, имеющий размер от более чем 0 кДа до менее чем 3,4 кДа и располагается между ними, и биосовместимое вещество может представлять собой вещество, связывающееся с FcRn. Вещество, связывающееся с FcRn, может представлять собой, например, область Fc иммуноглобулина и, в частности, область Fc IgG.

Кроме того, согласно другому аспекту настоящего изобретения предложен способ получения конъюгата.

Данный конъюгат и компоненты, составляющие конъюгат, являются такими же, как было объяснено выше.

В конкретном воплощении согласно настоящему изобретению предложен способ получения конъюгата, который включает:

(а) проведение взаимодействия полиэтиленгликоля, который имеет размер от более чем 0 кДа до менее чем 3,4 кДа и по меньшей мере две концевые функциональные группы, с любым одним из физиологически активного вещества или вещества, способного увеличивать период полувыведения in vivo физиологически активного вещества, с получением полиэтиленгликоля, с которым ковалентно связано одно из физиологически активного вещества или вещества, способного увеличивать период полувыведения in vivo физиологически активного вещества, и который имеет по меньшей мере одну концевую функциональную группу; и

(б) проведение взаимодействия полиэтиленгликоля, с которым ковалентно связано одно из физиологически активного вещества или вещества, способного увеличивать период полувыведения in vivo физиологически активного вещества, и который имеет по меньшей мере одну концевую функциональную группу, полученного на стадии (а), с другим физиологически активным веществом или веществом, способным увеличивать период полувыведения in vivo физиологически активного вещества, с получением конъюгата, в котором физиологически активное вещество и вещество, способное увеличивать период полувыведения in vivo физиологически активного вещества, ковалентно связаны через полиэтиленгликоль, имеющий размер от более чем 0 кДа до менее чем 3,4 кДа.

Здесь стадия (а) называется стадией первичной реакции, и стадия (б) называется стадией вторичной реакции, соответственно.

Физиологически активное вещество и размер полиэтиленгликоля, используемого в получении конъюгата, и состав в отношении связывания конъюгата, включающего концевые функциональные группы, является таким же, как было объяснено выше.

В приведенном выше способе получения физиологически активное вещество имеет функциональную группу, которая реагирует с концевой функциональной группой полиэтиленгликоля и, посредством этого, формирует ковалентную связь, и данная функциональная группа может представлять собой аминогруппу или тиольную группу.

Кроме того, в приведенном выше способе получения вещество, которое может увеличивать период полувыведения физиологически активного вещества, имеет функциональную группу, которая реагирует с концевой функциональной группой и, посредством этого, образует ковалентную связь, и данная функциональная группа может представлять собой аминогруппу или тиольную группу.

В приведенном выше способе получения концевая функциональная группа полиэтиленгликоля может представлять собой функциональную группу, реагирующую с амином, или функциональную группу, реагирующую с тиолом.

В приведенном выше способе получения концевая функциональная группа полиэтиленгликоля может быть выбрана из группы, состоящей из альдегида, малеимида, сукцинимида, винилсульфона, тиола, С_6-20арилдисульфида, С_5-20гетероарилдисульфида и галогенированного ацетамида. Более конкретно, концевая функциональная группа полиэтиленгликоля может быть выбрана из группы, состоящей из альдегида, малеимида, сукцинимида, винилсульфона, тиола, орто-пиридилдисульфида и йодацетамида.

Сукцинимид может представлять собой сукцинимидилвалерат, сукцинимидилметилбутаноат, сукцинимидилметилпропионат, сукцинимидилбутаноат, сукцинимидилпропионат, N-гидроксисукцинимидил, сукцинимидилкарбоксиметил или сукцинимидилкарбонат, но сукцинимид конкретно не ограничивается ими.

На стадии первичной реакции или на стадии вторичной реакции по настоящему изобретению, когда концевая функциональная группа PEG представляет собой альдегид, ковалентная связь может образоваться между аминогруппой Х или аминогруппой F и альдегидной группой PEG посредством восстановительного аминирования. Например, «-NH2», расположенная на N-конце F, и альдегидная группа PEG могут реагировать и образовать ковалентную связь.

Восстановительное аминирование можно проводить в присутствии восстановителя. Данный восстановитель может содержаться на стадии первичной реакции в конечной концентрации от 1 мМ до 20 мМ и в конечной концентрации от 1 мМ до 100 мМ на стадии вторичной реакции, но концентрации конкретно не ограничиваются этим.

В настоящем изобретении восстановитель относится ко всем восстановителям, известным в данной области, способным образовать ковалентную связь посредством восстановления обратимой двойной иминосвязи, которая образуется посредством связывания альдегидной группы (то есть функциональной группы PEG) и аминогруппы полипептида (физиологически активный полипептид или область Fc иммуноглобулина). Для задачи настоящего изобретения восстановитель может содержаться в реакционном растворе для опосредования образования ковалентной связи между PEG и физиологически активным полипептидом или областью Fc иммуноглобулина.

В настоящем изобретении в качестве восстановителя можно использовать все восстановители, традиционно используемые в данной области. В частности, восстановитель может представлять собой цианоборгидрид натрия (SCB), комплекс боран-пиридин, боргидрид натрия, комплекс боран-диметиламин, комплекс боран-триметиламин или триацетоксиборгидрид натрия, но восстановитель не ограничивается ими. Подходящий восстановитель может быть свободно выбран согласно типам Х или F и реакционному растворителю.

Тем временем, на стадии первичной реакции или на стадии вторичной реакции по настоящему изобретению, когда концевая функциональная группа PEG представляет собой малеимидную группу, тиольная группа в остатке цистеина Х или тиольная группа в остатке цистеина F (то есть сульфгидрильная группировка) может реагировать с малеимидной группой PEG с образованием ковалентной связи (тиоэфирной связи).

Согласно еще одному аспекту настоящего изобретения предложен препарат инсулина длительного действия с улучшенной продолжительностью действия и стабильностью in vivo.

Данный конъюгат является таким же, как было объяснено выше.

Тем временем, в качестве копмозиций, которые могут увеличивать биодоступность или поддерживать пролонгированную активность, в препарате могут содержаться композиции с замедленным высвобождением посредством микрочастиц, наночастиц и т.д. с использованием PLGA (сополимер молочной и гликолевой кислот), гиалуроновой кислоты, хитозана и т.д.

Кроме того, другие типы препаратов, которые могут увеличивать биодоступность или поддерживать пролонгированную активность, могут включать препараты в виде импланта, для ингаляции, назального применения и пластыри.

Препарат длительного действия может представлять собой препарат инсулина длительного действия с улучшенной продолжительностью действия и стабильностью in vivo по сравнению с продолжительностью действия и стабильностью in vivo природного физиологически активного вещества.

Когда физиологически активное вещество представляет собой природный инсулин или его аналог, препарат длительного действия может представлять собой фармацевтическую композицию для предупреждения или лечения заболеваний, связанных с инсулином (например, диабета), но физиологически активное вещество не ограничивается ими.

Термин «заболевание, связанное с инсулином» в том виде, в котором он здесь используется, относится к заболеванию, которое возникает или прогрессирует из-за низкой или отсутствующей физиологической активности инсулина, и оно может включать, например, диабет, но заболевание, связанное с инсулином, конкретно не ограничивается им.

Фармацевтическая композиция, содержащая конъюгат по настоящему изобретению, может содержать фармацевтически приемлемый носитель. Примеры фармацевтически приемлемого носителя могут включать связующее вещество, скользящее вещество, разрыхлитель, эксципиент, солюбилизатор, диспергент, стабилизатор, суспендирующий агент, краситель, отдушку и т.д. для перорального введения; буфер, консервант, анальгетик, солюбилизатор, изотонический агент, стабилизатор и т.д. могут смешиваться для применения для инъекций; и основа, эксципиент, смазывающее вещество, консервант и т.д. - для местного введения.

Тип состава фармацевтической композиции по настоящему изобретению можно получать разными способами, посредством объединения с фармацевтически приемлемыми носителями, описанными выше. Например, для перорального введения композиция может быть приготовлена в виде таблеток, лепешек, капсул, эликсиров, суспензий, сиропоы, облаток и т.д. Для инъекций композиция может быть приготовлена в однодозовых ампулах или многодозовых формах. Данная фармацевтическая композиция также может быть приготовлена в других формах, таких

как растворы, суспензии, таблетки, пилюли, капсулы, препараты с замедленным высвобождением и т.д.

Тем временем, примеры подходящего носителя, эксципиента и разбавителя могут включать лактозу, декстрозу, сахарозу, сорбит, маннит, ксилит, эритрит, мальтит, крахмал, гуммиарабик, альгинат, желатин, фосфат кальция, силикат кальция, целлюлозу, метилцеллюлозу, микрокристаллическую целлюлозу, поливинилпиролидон, воду, метилгидроксибензоат, пропилгидроксибензоат, тальк, стеарат магния, минеральное масло и т.д.

Кроме того, фармацевтическая композиция может дополнительно содержать наполнитель, противосвертывающее средство, смазывающее вещество, увлажнитель, ароматизатор, консервант и т.д.

Кроме того, конъюгат по настоящему изобретению может содержаться в количестве от 0,001% масс. до 10% масс. по отношению к общему количеству композиции по настоящему изобретению, но данное количество конкретно не ограничивается им.

Согласно еще одному другому аспекту настоящего изобретения предложен способ лечения заболеваний, связанных с инсулином, который включает введение конъюгата, представленного Формулой 2, приведенной выше, или препарата, содержащего конъюгат, субъекту, нуждающемуся в этом.

Конъюгат по настоящему изобретению является эффективным для лечения диабета, и, таким образом, лечение заболеваний, связанных с инсулином, можно стимулировать введением фармацевтической композиции, содержащей конъюгат.

Термин «введение» в том виде, в котором он здесь используется, относится к введению конкретного вещества пациенту подходящим способом, и конъюгат можно вводить посредством любого из обычных путей, при условии, что лекарственное средство может прибывать в ткань-мишень посредством любого общего пути. Например, введение можно осуществлять внутрибрюшинно, внутривенно, внутримышечно, подкожно, внутрикожно, перорально, местно, интраназально, внутрилегочно, интраректально и т.д., но способ введения не ограничивается этим. Однако, поскольку пептиды расщепляются при пероральном введении, активные ингредиенты композиции для перорального введения должны быть покрыты или приготовлены для защиты против деградации в желудке. Предпочтительно фармацевтическую композицию можно вводить в инъецируемой форме. Кроме того, фармацевтическую композицию можно вводить с использованием любого устройства, способного транспортировать активные ингредиенты в клетку-мишень.

Кроме того, конъюгат или фармацевтическая композиция по настоящему изобретению, содержащая данный конъюгат, может быть определена посредством нескольких связанных факторов, включающих типы заболеваний, подлежащих лечению, пути введения, возраст, пол, массу пациента и тяжесть заболевания, а также типы лекарственного средства в качестве активного ингредиента. Поскольку фармацевтическая композиция по настоящему изобретению имеет превосходную продолжительность действия и титр in vivo, она может значительно снизить частоту введения и дозы фармацевтического препарата по настоящему изобретению.

Далее настоящее изобретение будет более подробно описано со ссылкой на следующие Примеры. Однако данные Примеры служат только для иллюстративных целей, и данное изобретение не ограничивается данными Примерами.

Пример 1: получение конъюгатаинсулин-3,4 кДа PEG-Fc иммуноглобулина

После растворения порошка инсулина (Biocon, Индия) в 10 мМ HCl для пэгилирования 3,4 кДа дипропиональдегид-PEG (PEG, имеющий пропиональдегидную группу на обоих концах соответственно, NOF, США) с N-концом бета цепи инсулина, инсулин (5 мг/мл) и PEG смешивали в мольном соотношении 1:4 и подвергали взаимодействию при 4°С в течение примерно 2 часов. В частности, реакцию проводили в смешанном растворителе из 50 мМ натрий-цитратного буфера (рН 5,0) и 45% изопропанола посредством добавления цианоборгидрида натрия (NaCNBH₃) в качестве восстановителя. Реакционный раствор очищали с использованием колонки SP-HP (GE Healthcare), в которой используется буфер, содержащий цитрат натрия (рН 3,0) и 45% EtOH, и концентрационный градиент KCl.

Затем очищенный монопэгилированный инсулин и фрагмент Fc иммуноглобулина смешивали в мольном соотношении 1:1,2, общую концентрацию белка доводили до 20 мг/мл и проводили взаимодействие при 25°С в течение 15 часов. В частности, реакционный раствор получали смешиванием 100 мМ буфера HEPES (pH 8,2) и хлорида натрия, и добавления к ним 20 мМ цианоборгидрида натрия (NaCNBH₃) в качестве восстановителя.

При завершении реакции реакционный раствор наносили на колонку Q-HP (GE, США) с использованием буфера Tris-HCl (pH 7,5) и концентрационного градиента NaCl, осуществляли еще одно нанесение на колонку Source 15ISO (GE, США) с использованием концентрационного градиента сульфата аммония и Tris-HCl (pH 7,5), и, посредством этого, очищали конъюгат инсулин-3,4 кДа PEG-Fc иммуноглобулина.

В настоящем изобретении термин «конъюгат инсулин-3,4 кДа PEG-Fc иммуноглобулина» используется взаимозаменяемо с термином «конъюгат инсулина длительного действия, в котором связан линкер - 3,4 кДа PEG».

Элюированный конъюгат инсулин-3,4 кДа PEG-Fc иммуноглобулина анализировали посредством SE-HPLC и RP-HPLC, и посредством этого было подтверждено, что его чистота составляет 98,5% и 97,4% соответственно (ФИГ. 3 и 4). Результаты анализа чистоты посредством SDS-PAGE показаны на ФИГ. 1.

Пример 2: получение конъюгата инсулин-3,0 кДа PEG-Fc иммуноглобулина

После растворения порошка инсулина (Biocon, Индия) в 10 мМ HCl для пэгилирования 3 кДа дибутиральдегид-PEG (PEG, имеющий бутиральдегидную группу на обоих концах соответственно, Hanmi Fine Chemical, Корея) с N-концом бета цепи инсулина и Fc иммуноглобулина, получали конъюгат инсулин-3 кДа PEG-Fc иммуноглобулина, очищали согласно условиям реакции пэгилирования, и его очистка и условия реакции с фрагментом Fc иммуноглобулина, и их очистка являются такими же, как и в Примере 1.

В настоящем изобретении термин «конъюгат инсулин-3 кДа PEG-Fc иммуноглобулина» используется взаимозаменяемо с термином «конъюгат инсулина длительного действия, в котором связан линкер - 3 кДа PEG».

Элюированный конъюгат инсулин-3 кДа PEG-Fc иммуноглобулина анализировали посредством SE-HPLC и IE-HPLC (ионообменная высокоэффективная жидкостная хроматография), и посредством этого было подтверждено, что его чистота составляет 99,7% и 97,9% соответственно (ФИГ. 3 и 4).

Пример 3: получение конъюгата инсулин-2,5 кДа PEG-Fc иммуноглобулина

После растворения порошка инсулина (Biocon, Индия) в 10 мМ HCl для пэгилирования 2,5 кДа дибутиральдегид-PEG (PEG, имеющий бутиральдегидную группу на обоих концах соответственно, Hanmi Fine Chemical, Корея) с N-концом бета цепи инсулина и Fc иммуноглобулина, получали конъюгат инсулин-2,5 кДа PEG-Fc иммуноглобулина, очищали согласно условиям реакции пэгилирования, и его очистка и условия реакции с фрагментом Fc иммуноглобулина, и их очистка являются такими же, как и в Примере 1.

В настоящем изобретении термин «конъюгат инсулин-2,5 кДа PEG-Fc иммуноглобулина» используется взаимозаменяемо с термином «конъюгат инсулина длительного действия, в котором связан линкер - 2,5 кДа PEG».

Элюированный конъюгат инсулин-2,5 кДа PEG-Fc иммуноглобулина анализировали посредством SE-HPLC и RP-HPLC, и посредством этого было подтверждено, что его чистота составляет 99,4% и 99,4% соответственно (ФИГ. 3 и 4).

Пример 4: получение конъюгата инсулин-2 кДа PEG-Fc иммуноглобулина

После растворения порошка инсулина (Biocon, Индия) в 10 мМ HCl для пэгилирования 2 кДа дибутиральдегид-PEG (PEG, имеющий бутиральдегидную группу на обоих концах соответственно, LAYSAN BIO, США) с N-концом бета цепи инсулина и Fc иммуноглобулина, получали конъюгат инсулин-2 кДа PEG-Fc иммуноглобулина, очищали согласно условиям реакции пэгилирования, и его очистка и условия реакции с фрагментом Fc иммуноглобулина, и их очистка являются такими же, как и в Примере 1. Однако при завершении реакции реакционный раствор наносили на колонку Source 15Q (GE, США) с использованием буфера Tris-HCl (pH 7,5) и концентрационного градиента NaCl, осуществляли еще одно нанесение на колонку Source 15ISO (GE, США) с использованием концентрационного градиента сульфата аммония и Tris-HCl (pH 7,5), и, посредством этого, очищали конъюгат инсулин-2 кДа PEG-Fc иммуноглобулина.

В настоящем изобретении термин «конъюгат инсулин-2 кДа PEG-Fc иммуноглобулина» используется взаимозаменяемо с термином «конъюгат инсулина длительного действия, в котором связан линкер - 2 кДа PEG».

Элюированный конъюгат инсулин-2 кДа PEG-Fc иммуноглобулина анализировали посредством SE-HPLC и RP-HPLC, и посредством этого было подтверждено, что его чистота составляет 99,9% и 99,4% соответственно (ФИГ. 3 и 4).

Пример 5: получение конъюгата инсулин-1 кДа PEG-Fc иммуноглобулина

После растворения порошка инсулина (Biocon, Индия) в 10 мМ HCl для пэгилирования 1 кДа дибутиральдегид-PEG (PEG, имеющий бутиральдегидную группу на обоих концах соответственно, NEKTAR, США) с N-концом бета цепи инсулина, получали конъюгат инсулин-1 кДа PEG-Fc иммуноглобулина, очищали согласно условиям реакции пэгилирования, и его очистка и условия реакции с фрагментом Fc иммуноглобулина, и их очистка являются такими же, как и в Примере 1.

В настоящем изобретении термин «конъюгат инсулин-1 кДа PEG-Fc иммуноглобулина» используется взаимозаменяемо с термином «конъюгат инсулина длительного действия, в котором связан линкер - 1 кДа PEG».

Элюированный конъюгат инсулин-1 кДа PEG-Fc иммуноглобулина анализировали посредством SE-HPLC и RP-HPLC, и посредством этого было подтверждено, что его чистота составляет 99,8% и 99,2% соответственно (ФИГ. 3 и 4). Результаты анализа чистоты SDS-PAGE показаны на ФИГ. 2.

Пример 6: анализ эффекта продолжительности влияния лекарственного средства - конъюгата инсулина длительного действия - у нормальных крыс согласно длине PEG линкера

Различие в продолжительности эффектов лекарственных средств согласно длине PEG линкера конъюгатов инсулина длительного действия подтверждали у нормальных крыс посредством введения конъюгатов инсулина длительного действия, полученных выше, с каждым из которых связан линкер - 1 кДа, 2 кДа, 2,5 кДа, 3 кДа или 3,4 кДа PEG.

Восьминедельных нормальных крыс подразделяли на контрольную группу (носитель), группу, которой вводили конъюгат инсулина длительного действия, в котором связан 1 кДа PEG линкер (65,1 нмоль/кг), группу, которой вводили конъюгат инсулина длительного действия, в котором связан 2 кДа PEG линкер (65,1 нмоль/кг), группу, которой вводили конъюгат инсулина длительного действия, в котором связан 2,5 кДа PEG линкер (65,1 нмоль/кг), группу, которой вводили конъюгат инсулина длительного действия, в котором связан 3 кДа PEG линкер (65,1 нмоль/кг), и группу, которой вводили конъюгат инсулина длительного действия, в котором связан 3,4 кДа PEG линкер (65,1 нмоль/кг) соответственно. Нормальным крысам один раз подкожно вводили опытные вещества для 3 крыс в каждой группе, и образцы их цельной крови отбирали через хвостовые вены в 1, 4, 8, 24, 48 и 72 часа, соответственно, каждый добавляли в 1,5 мл микропробирки, центрифугировали при 5000 об/мин при комнатной температуре, и каждую сыворотку отделяли и хранили при -20°С соответственно. Каждую концентрацию конъюгатов инсулина, содержащихся в сыворотках каждой группы, количественно измеряли анализом ELISA (твердофазный иммуноферментный анализ). Анализ ELISA проводили таким образом, что сыворотки, отобранные каждый раз, и антитело против человеческого IgG4, конъюгированное с HRP (пероксидаза хрена) (Alpha Diagnosis, #10124), одновременно добавляли в каждый планшет, покрытый моноклональным антителом к инсулину (ALPCO, #80-INSHU-E10.1), проводили взаимодействие при комнатной температуре в течение 1 часа, давали развиться окрашиваниям с использованием реактива ТМВ (тетраметилбензидин), и их оптическую плотность измеряли при 450 нм соответственно.

В результате, по сравнению с группой, которой вводили конъюгат инсулина длительного действия, в котором связан 3,4 кДа PEG линкер, группа, которой вводили конъюгат инсулина длительного действия, в котором связан 1 кДа PEG линкер, демонстрировала 1,84-кратное увеличение AUC (площадь под кривой концентрации относительно времени); группа, которой вводили конъюгат инсулина длительного действия, в котором связан 2 кДа PEG линкер, демонстрировала 1,80-кратное увеличение AUC; группа, которой вводили конъюгат инсулина длительного действия, в котором связан 2,5 кДа PEG линкер, демонстрировала 1,41-кратное увеличение AUC; и группа, которой вводили конъюгат инсулина длительного действия, в котором связан 3 кДа PEG линкер, демонстрировала 1,43-кратное увеличение AUC соответственно (ФИГ. 6).

Данные результаты свидетельствуют о том, что, неожиданно, по мере того как размер полиэтиленгликоля, использованного в качестве линкера, становится меньше, период полувыведения in vivo конъюгата инсулина значимо возрастает, и, таким образом, он может быть предоставлен в виде стабильного препарата инсулина и эффективно использоваться для лечения диабета.

Кроме того, по мере того как размер полиэтиленгликоля, использованного в качестве линкера, становиться меньше, период полувыведения in vivo конъюгата, в котором связан физиологически активный полипептид, может быть значимо увеличен, таким образом, обеспечивая его предоставление в виде стабильного препарата.

Из вышеописаного специалист в области, к которой относится настоящее изобретение, сможет понять, что настоящее изобретение может быть воплощено в других конкретных формах без модификации технических идей или существенных характеристик настоящего изобретения. В данном отношении раскрытые здесь типичные воплощения служат лишь для иллюстративных целей и не должны истолковываться как ограничивающие объем настоящего изобретения. С другой стороны, подразумевается то, что настоящее изобретение охватывает не только типичные воплощения, но также и разные альтернативы, модификации, эквиваленты и другие воплощения, которые могут быть включены в пределы сущности и объема настоящего изобретения, как определено приложенной формулой изобретения.

--->

<110> HANMI PHARM. CO., LTD.

<120> Конъюгат физиологически активного вещества длительного действия

и его применение

<130> OPA18057-PCT

<150> KR 10-2017-0015663

<151> 2017-02-03

<150> KR 10-2017-0127187

<151> 2017-09-29

<160> 6

<170> KoPatentIn 3.0

<210> 1

<211> 21

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 1

Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu

1 5 10 15

Glu Asn Tyr Cys Asn

20

<210> 2

<211> 30

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 2

Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr

1 5 10 15

Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr

20 25 30

<210> 3

<211> 21

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> A-цепь аналога инсулина

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)

<223> Xaa представляет собой глицин или аланин

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (2)

<223> Xaa представляет собой изолейцин или аланин

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (14)

<223> Xaa представляет собой тирозин, глутаминовую кислоту или

аспарагин

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (19)

<223> Xaa представляет собой тирозин или аланин

<400> 3

Xaa Xaa Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Xaa Gln Leu

1 5 10 15

Glu Asn Xaa Cys Asn

20

<210> 4

<211> 30

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> В-цепь инсулина

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (8)

<223> Xaa представляет собой глицин или аланин

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (23)

<223> Xaa представляет собой глицин или аланин

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (24)

<223> Xaa представляет собой фенилаланин или аланин

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (25)

<400> 4

Phe Val Asn Gln His Leu Cys Xaa Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr

1 5 10 15

Leu Val Cys Gly Glu Arg Xaa Xaa Xaa Tyr Thr Pro Lys Thr

20 25 30

<210> 5

<211> 21

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> A-цепь аналога инсулина

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)

<223> Xaa представляет собой аланин, глицин, глутамин, гистидин,

глутаминовую кислоту или аспарагин

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (5)

<223> Xaa представляет собой аланин, глутаминовую кислоту, глутамин,

гистидин или аспарагин

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (12)

<223> Xaa представляет собой аланин, серин, глутамин, глутаминовую

кислоту, гистидин или аспарагин

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (14)

<223> Xaa представляет собой аланин, тирозин, глутаминовую кислоту,

гистидин, лизин, аспарагиновую кислоту или аспарагин

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (16)

<223> Xaa представляет собой аланин, лейцин, тирозин, гистидин,

глутаминовую кислоту или аспарагин

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (19)

<223> Xaa представляет собой аланин, тирозин, серин, глутаминовую

кислоту, гистидин, треонин или аспарагин

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (21)

<223> Xaa представляет собой аспарагин, глицин, гистидин или аланин

<400> 5

Xaa Ile Val Glu Xaa Cys Cys Thr Ser Ile Cys Xaa Leu Xaa Gln Xaa

1 5 10 15

Glu Asn Xaa Cys Xaa

20

<210> 6

<211> 30

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> B-цепь аналога инсулина

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (16)

<223> Xaa представляет собой тирозин, глутаминовую кислоту, серин,

треонин или аспарагиновую кислоту, или отсутствует

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (25)

<223> Xaa представляет собой фенилаланин, аспарагиновую кислоту или

глутаминовую кислоту, или отсутствует

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (27)

<223> Xaa представляет собой треонин или отсутствует

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (28)

<223> Xaa представляет собой пролин, глутаминовую кислоту или

аспарагиновую кислоту, или отсутствует

<400> 6

Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Xaa

1 5 10 15

Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Xaa Tyr Xaa Xaa Lys Thr

20 25 30

<---

Claims

1. Конъюгат Формулы 1, приведенной ниже:

[Формула 1]

X-L-F,

где:

Х представляет собой физиологически активное вещество, представляющее собой природный человеческий инсулин или аналог человеческого инсулина, который имеет пониженную аффинность связывания в отношении инсулинового рецептора по сравнению с природным инсулином;

F представляет собой область Fc иммуноглобулина,

где конъюгат демонстрирует увеличенный период полувыведения in vivo по сравнению с конъюгатом, который имеет такой же Х и F, что и данный конъюгат, но имеет другой L в качестве линкера, который представляет собой полиэтиленгликоль, имеющий размер 3,4 кДа.

2. Конъюгат по п. 1, где L представляет собой полиэтиленгликоль, имеющий размер от более чем 0 кДа до 3 кДа или менее.

3. Конъюгат по п. 1, где аналог инсулина имеет пониженную аффинность связывания в отношении инсулинового рецептора по сравнению с природным инсулином и включает по меньшей мере одну аминокислотную модификацию или делецию в цепи А или цепи В природного инсулина.

4. Конъюгат по п. 3, где аналог инсулина представляет собой аналог инсулина, в котором по меньшей мере одна аминокислота, выбранная из группы, состоящей из 1-й аминокислоты, 2-й аминокислоты, 3-й аминокислоты, 5-й аминокислоты, 8-й аминокислоты, 10-й аминокислоты, 12-й аминокислоты, 16-й аминокислоты, 23-й аминокислоты, 24-й аминокислоты, 25-й аминокислоты, 26-й аминокислоты, 27-й аминокислоты, 28-й аминокислоты, 29-й аминокислоты и 30-й аминокислоты цепи В инсулина, и 1-й аминокислоты, 2-й аминокислоты, 5-й аминокислоты, 8-й аминокислоты, 10-й аминокислоты, 12-й аминокислоты, 14-й аминокислоты, 16-й аминокислоты, 17-й аминокислоты, 18-й аминокислоты, 19-й аминокислоты и 21-й аминокислоты цепи А инсулина, заменена другой аминокислотой или делетирована.

5. Конъюгат по п. 4, где аналог инсулина представляет собой аналог инсулина, в котором по меньшей мере одна аминокислота, выбранная из группы, состоящей из 8-й аминокислоты, 23-й аминокислоты, 24-й аминокислоты и 25-й аминокислоты цепи В природного инсулина, и 1-й аминокислоты, 2-й аминокислоты, 14-й аминокислоты и 19-й аминокислоты цепи А природного инсулина, заменена другой аминокислотой.

6. Конъюгат по п. 5, где заменяющая другая аминокислота выбрана из группы, состоящей из аланина, глутаминовой кислоты, аспарагина, изолейцина, валина, глутамина, глицина, лизина, гистидина, цистеина, фенилаланина, триптофана, пролина, серина, треонина и аспарагиновой кислоты.

7. Конъюгат по п. 1, где F представляет собой область Fc IgG.

8. Способ получения конъюгата по п. 1, включающий:

(а) проведение взаимодействия полиэтиленгликоля, который имеет размер от более чем 0 кДа до менее чем 3,4 кДа и по меньшей мере две концевые функциональные группы, с любым одним из физиологически активного вещества или вещества, способного увеличивать период полувыведения in vivo физиологически активного вещества, с получением полиэтиленгликоля, с которым ковалентно связано одно из физиологически активного вещества или вещества, способного увеличивать период полувыведения in vivo физиологически активного вещества, и который имеет по меньшей мере одну концевую функциональную группу; и

(б) проведение взаимодействия полиэтиленгликоля, полученного на стадии (а), с другим физиологически активным веществом или веществом, способным увеличивать период полувыведения in vivo физиологически активного вещества, с получением конъюгата, в котором физиологически активное вещество и вещество, способное увеличивать период полувыведения in vivo физиологически активного вещества, ковалентно связаны через полиэтиленгликоль, имеющий размер от более чем 0 кДа до менее чем 3,4 кДа, где физиологически активное вещество представляет собой природный человеческий инсулин или аналог человеческого инсулина, который имеет пониженную аффинность связывания в отношении инсулинового рецептора по сравнению с природным инсулином и где F представляет собой область Fc иммуноглобулина.

9. Препарат длительного действия для предупреждения или лечения диабета с улучшенной продолжительностью действия и стабильностью in vivo, содержащий конъюгат по любому из пп. 1-7 в качестве активного ингредиента.

10. Препарат для предупреждения или лечения диабета, содержащий конъюгат по любому из пп. 3-6 в качестве активного ингредиента.

11. Способ лечения диабета, включающий введение препарата для предупреждения или лечения диабета по п. 10 субъекту, нуждающемуся в этом.