KR20180090760A - 지속성이 증가된 생리활성 물질의 결합체 및 이의 용도 - Google Patents

지속성이 증가된 생리활성 물질의 결합체 및 이의 용도 Download PDF

Info

Publication number
KR20180090760A
KR20180090760A KR1020180013528A KR20180013528A KR20180090760A KR 20180090760 A KR20180090760 A KR 20180090760A KR 1020180013528 A KR1020180013528 A KR 1020180013528A KR 20180013528 A KR20180013528 A KR 20180013528A KR 20180090760 A KR20180090760 A KR 20180090760A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
amino acid
receptor
kda
insulin
interleukin
Prior art date
Application number
KR1020180013528A
Other languages
English (en)
Other versions
KR102645064B1 (ko
Inventor
박영진
이종수
최인영
Original Assignee
한미약품 주식회사
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 한미약품 주식회사 filed Critical 한미약품 주식회사
Publication of KR20180090760A publication Critical patent/KR20180090760A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102645064B1 publication Critical patent/KR102645064B1/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/22—Hormones
    • A61K38/28—Insulins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6889—Conjugates wherein the antibody being the modifying agent and wherein the linker, binder or spacer confers particular properties to the conjugates, e.g. peptidic enzyme-labile linkers or acid-labile linkers, providing for an acid-labile immuno conjugate wherein the drug may be released from its antibody conjugated part in an acidic, e.g. tumoural or environment
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/18—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for pancreatic disorders, e.g. pancreatic enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/48—Drugs for disorders of the endocrine system of the pancreatic hormones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/48—Drugs for disorders of the endocrine system of the pancreatic hormones
    • A61P5/50—Drugs for disorders of the endocrine system of the pancreatic hormones for increasing or potentiating the activity of insulin
    • Y10S514/866—

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

본 발명은 생리활성 물질, 링커, 및 생리활성 물질의 생체 내 반감기를 증가시킬 수 있는 물질을 포함하는, 결합체, 이의 제조방법, 및 이의 제제에 관한 것이다.

Description

지속성이 증가된 생리활성 물질의 결합체 및 이의 용도{Long-acting conjugate of a physiologically active material and use thereof}
본 발명은 생리활성 물질, 링커, 및 생리활성 물질의 생체 내 반감기를 증가시킬 수 있는 물질을 포함하는 결합체, 이의 제조방법, 및 이의 제제에 관한 것이다.
생리활성 폴리펩타이드는 일반적으로 안정성이 낮아 쉽게 변성되고 체내 단백질 가수분해효소에 의해 분해되거나, 상대적으로 작은 크기로 인해 신장을 통해 쉽게 제거되기 때문에, 약리성분으로 생리활성 폴리펩타이드를 포함하는 단백질 의약품의 혈중 농도 및 역가를 유지하기 위해서는 단백질 약물을 환자에게 자주 투여할 필요가 있다. 그러나, 대부분 주사제 형태로 환자에게 투여되는 단백질 의약품의 경우, 생리활성 폴리펩타이드의 혈중 농도를 유지하기 위해 주사를 통한 잦은 투약이 필요한데 이는 환자에게 고통을 야기하며, 높은 치료비용의 원인이 된다. 이러한 문제점을 해결하기 위해, 단백질 약물의 혈중 안정성을 증가시키고 혈중 약물 농도를 오랫동안 높게 지속시켜 약효를 극대화하려는 노력이 계속되어 왔다.
한편, 인슐린은 인체의 췌장에서 분비되는 혈당 조절 호르몬으로, 혈액 내의 잉여 포도당을 세포로 옮겨 세포에 에너지원을 공급하는 한편, 혈당을 정상 수준으로 유지시켜 주는 역할을 한다. 그러나 당뇨 환자의 경우, 이러한 인슐린이 부족하거나 인슐린 저항성 및 베타 세포의 기능소실로 인하여, 인슐린이 정상적인 기능을 나타내지 않아, 혈액 내의 포도당을 에너지원으로 이용하지 못하게 된다. 그 결과, 혈중 포도당 수준이 높은 고혈당 증세를 나타내어 결국 소변으로 당을 배출하게 된다. 이는 여러 합병증과 연계되어 있다.
따라서, 인슐린 생성이 이상이 있거나(Type I), 인슐린 내성으로 인한(Type II) 당뇨 환자에게는 인슐린 치료가 필수적이며, 인슐린 투여로 인해 혈당을 정상 수준으로 조절할 수 있다. 하지만, 인슐린의 경우 다른 단백질 및 펩타이드 호르몬과 마찬가지로 체내의 반감기가 극히 짧아 지속적으로 반복 투여를 해야 한다는 단점이 있다. 이와 같은 잦은 투여는 환자에게 엄청난 고통과 불편함을 야기하게 된다. 따라서, 단백질의 생체 내 반감기를 증가시켜 투여 횟수를 줄임으로써 환자의 삶의 질을 높이기 위한 여러 단백질 제형화 연구와 화학적 결합체 등(지방산 결합체, 폴리에틸렌중합체 결합체)에 대한 연구가 진행되어 왔다. 현재 시판중인 지속형 인슐린으로 사노피-아벤티스사(Sanofi-Aventis)의 인슐린 글라진(insulin glargine, lantus, 지속시간 약 20-22시간)과 노보노디스크사(Novo Nordisk)의 인슐린 디터미르(insulin detemir, levemir, 지속시간 약 18-22시간) 및 트레시바 (degludec, tresiba, 지속시간 약 40시간)가 있다. 이들 지속성 인슐린들은 혈중 인슐린 농도의 피크가 없어 기저 인슐린으로 적합하지만, 이들 또한 반감기가 충분하게 길지 않아 매일 1회 또는 2회 투여해야 하는 불편함이 여전히 존재한다. 따라서, 장기간 투여해야 하는 당뇨병 환자에서 투여 빈도를 획기적으로 낮추어 환자의 편의성을 증가시킨다는 목적 달성에는 한계가 있다.
여러 선행 논문 (Authier F et al (Biochem J. 1998 Jun 1;332 ( Pt 2):421-30.), Duckworth WC et al (Endocr Rev. 1998 Oct;19(5):608-24.) 및 Valera Mora ME et al (J Am Coll Nutr. 2003 Dec;22(6):487-93.)) 등은 체내 인슐린의 제거과정에 대해 기술해 놓았다. 이를 살펴보면 50% 이상의 인슐린은 신장에서 제거되며, 나머지 인슐린들은 근육, 지방, 간 등의 작용 부위(target site)에서 수용체 매개 제거 공정(receptor mediated clearance, RMC)을 통해 제거되는 것으로 알려져 있다.
따라서, 상기 RMC를 피할 수 있으면서, 혈중 반감기가 획기적으로 증가되어 환자의 투여 빈도를 줄일 수 있는 생리활성 물질 제제, 특히 인슐린 제제의 개발의 필요성은 더욱더 커지고 있는 상황이다.
본 발명의 하나의 목적은 생리활성 물질의 체내 반감기 연장을 위한 목적을 가진 생리활성 물질의 결합체를 제공하는 것이다.
구체적으로, 본 발명은 생리활성 물질 및 이의 생체 내 반감기를 증가시킬 수 있는 물질이 폴리에틸렌 글리콜을 통해 연결되고, 상기 폴리에틸렌 글리콜은 0 kDa 초과 내지 3.4 kDa 미만의 크기인 것을 특징으로 하는 생리활성 물질의 결합체를 제공하고자 한다.
본 발명의 또 하나의 목적은 상기 결합체를 포함하는, 조성물을 제공하는 것이다.
구체적으로, 본 발명은 상기 결합체를 포함하는 생체 내 지속성 및 안정성이 증가된 지속성 제제를 제공하고자 한다.
또한, 본 발명은 상기 결합체를 포함하는, 당뇨병 예방 또는 치료용 제제를 제공하고자 한다.
본 발명의 또 하나의 목적은 상기 결합체를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 하나의 목적은 약제의 제조에 사용하기 위한, 상기 결합체 또는 이를 포함하는 조성물의 용도를 제공하는 것이다.
상기 과제를 해결하기 위한 본 발명의 하나의 양태는, 생리활성 물질의 체내 반감기 연장을 위한 목적을 가진, 생리활성 물질의 결합체를 제공한다.
하나의 구체예에서, 본 발명은 생리활성 물질 및 이의 생체 내 반감기를 증가시킬 수 있는 물질이 폴리에틸렌 글리콜을 통해 연결되고, 상기 폴리에틸렌 글리콜은 0 kDa 초과 내지 3.4 kDa 미만의 크기인 것을 특징으로 하는 생리활성 물질의 결합체에 관한 것이다.
앞선 구체예에 따른 결합체에서, 상기 결합체는 하기 화학식 1로 표시되는 것을 특징으로 한다:
[화학식 1]
X-L-F;
여기에서,
X는 생리활성 물질이고,
L은 링커로서, 0 kDa 초과 내지 3.4 kDa 미만의 크기를 갖는 폴리에틸렌 글리콜이며,
F는 생리활성 물질의 생체 내 반감기를 증가시킬 수 있는 물질임.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 결합체에서, 상기 결합체와 L이 3.4 kDa 크기를 갖는 폴리에틸렌 글리콜인 것만이 다른 결합체와 비교하여, 상기 결합체는 증가된 생체 내 반감기를 나타내는 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 결합체에서, 상기 L은 0kDa 초과 3kDa 이하의 크기를 갖는 폴리에틸렌 글리콜인 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 결합체에서, 상기 생리활성 물질은 생리활성 폴리펩타이드인 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 결합체에서, 상기 생리활성 물질은 톡신; 또는 GLP-1(Glucagon like peptide-1) 수용체 아고니스트; 글루카곤 수용체 아고니스트; GIP(Gastric inhibitory polypeptide) 수용체 아고니스트; FGF(Fibroblast growth factor) 수용체 아고니스트; 콜레키스토키닌 (Cholecystokinin) 수용체 아고니스트; 가스트린(gastrin) 수용체 아고니스트; 멜라노코르틴(melanocortin) 수용체 아고니스트; GLP 수용체, 글루카곤 수용체, 및 GIP 수용체 중 2 이상의 수용체에 대하여 결합하는 물질; 소마토스타틴; PYY(peptide YY); NPY(neuropeptide Y); 옥신토모듈린; 섬유아세포성장인자 (Fibroblast growth factor); 브래디키닌; 엘레도이신(Eledoisin); 옥시토신(Oxytocin); 바소프레신(vasopressin); 세르모레린(Sermorelin); 프로락틴 방출 펩타이드; 오렉신(Orexin); 갑상선 방출 펩타이드; 칼모듈린; 모틸린(Motilin); 관활성장관펩타이드(Vasoactive intestinal peptide); 심방나트륨이뇨 펩타이드(Atrial natriuretic peptide; ANP); C-형 나트륨이뇨 펩타이드(C-type natriuretic peptide; CNP); 뉴로키닌(Neurokinin) A; 뉴로메딘(Neuromedin); 레닌(Renin); 엔도텔린(Endothelin); 사라포톡신 펩타이드(Sarafotoxin peptide); 카르소모르핀 펩타이드(Carsomorphin peptide); 데모르핀(Dermorphin); 디노르핀(Dynorphin); 엔도르핀(Endorphin); 엔케팔린(Enkepalin); 종양괴사인자 수용체; 유로키나아제 수용체; 티모포이에틴(Thymopoietin); 티물린(Thymulin); 티모펜틴(Thymopentin); 티모신(Tymosin); 흉선 체액성 인자(Thymic humoral factor); 아드레노모둘린(Adrenomodullin); 알라토스타틴(Allatostatin); 아밀로이드 베타-프로테인 단편(Amyloid beta-protein fragment); 항균성 펩타이드; 항산화제 펩타이드; 봄베신(Bombesin); 오스테오칼신(Osteocalcin); CART 펩타이드; E-셀렉틴(selectin); ICAM-1 (Intercellular Adhesion Molecule 1); VCAM-1 (vascular cell adhesion molecule 1); 류코카인(Leucokine); 크링글(Kringle)-5; 라미닌(Laminin); 인히빈(Inhibin); 갈라닌(Galanin); 피브로넥틴(Fibronectin); 판크레아스타틴(Pancreastatin); 푸제온(Fuzeon); 글루카곤 유사 펩타이드 (GLP-1 또는 GLP-2 등); 지프로테인 관련수용체 (Gprotein-coupled receptor); 적혈구 증식인자; 백혈구 증식인자; 아밀린; 인간 성장호르몬; 성장호르몬 방출 호르몬; 성장호르몬 방출 펩타이드; 인터페론; 인터페론 수용체; 콜로니 자극인자; 인터루킨; 인터루킨 수용체; 효소; 인터루킨 결합 단백질; 사이토카인 결합 단백질; 마크로파지 활성인자; 마크로파지 펩타이드; B 세포인자; T 세포인자; 단백질 A; 알러지 억제인자; 세포 괴사 당단백질; 면역독소; 림포독소; 종양 괴사인자; 종양 억제인자; 전이 성장인자; 알파-1 안티트립신; 알부민; 알파-락트알부민(alpha-lactalbumin); 아포리포 단백질-E; 적혈구 생성 인자; 고 당쇄화 적혈구 생성인자; 안지오포이에틴(angiopoietin); 헤모글로빈; 트롬빈(thrombin); 트롬빈 수용체 활성 펩타이드; 트롬보모듈린(thrombomodulin); 혈액인자 VII; 혈액인자 VIIa; 혈액인자 VIII; 혈액인자 IX; 혈액인자 XIII; 플라즈미노겐 활성인자; 피브린-결합 펩타이드; 유로키나제; 스트렙토키나제; 히루딘(hirudin); 단백질 C; C-반응성 단백질; 레닌 억제제; 콜라게나제 억제제; 수퍼옥사이드 디스뮤타제; 렙틴; 혈소판 유래 성장인자; 상피세포 성장인자; 표피세포 성장인자; 안지오스타틴(angiostatin); 안지오텐신(angiotensin); 골 형성 성장인자; 골 형성 촉진 단백질; 칼시토닌; 인슐린; 아트리오펩틴; 연골 유도인자; 엘카토닌(elcatonin); 결합조직 활성인자; 조직인자 경로 억제제(tissue factor pathway inhibitor); 여포 자극 호르몬; 황체 형성 호르몬; 황체 형성 호르몬 방출 호르몬; 신경 성장인자류; 악소제네시스 인자-1(axogenesis factor-1); 뇌-나트륨 이뇨 펩타이드(brain-natriuretic peptide); 신경교 유래 신경영양인자(glial derived neurotrophic factor); 네트린(netrin); 중성구 억제인자(neutrophil inhibitory factor); 신경영양인자; 뉴트린(neuturin); 부갑상선 호르몬; 릴랙신; 시크레틴; 소마토메딘; 인슐린 유사 성장인자; 부신피질 호르몬; 글루카곤; 콜레시스토키닌; 췌장 폴리펩타이드; 가스트린 방출 펩타이드; 가스트린억제 펩타이드; 코티코트로핀 방출인자; 갑상선 자극호르몬; 오토탁신(autotaxin); 락토페린(lactoferrin); 미오스타틴(myostatin); ADNP(activity-dependent neuroprotective protein), BACE1(beta-secretase1), APP(Amyloid Precursor Protein), NCAM(Neural cell adhesion molecule), 아밀로이드 베타(Amyloid beta), 타우(Tau), RAGE(receptor for advanced glycation endproducts), 알파-시누클레인(alpha-synuclein), 또는 이들의 아고니스트 또는 안타고니스트; 수용체류, 수용체 아고니스트; 세포표면항원; 단일클론 항체; 다중클론 항체; 항체 단편; 바이러스 유래 백신 항원; 하나 이상의 수용체 아고니스트를 활성화 시키는 하이브리드 폴리펩타이드 또는 키메릭 (chimeric) 폴리펩타이드; 및 이들의 아날로그인 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 결합체에서, 상기 생리활성 물질은 2개 이상의 수용체를 동시에 활성화시키는 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 결합체에서,
상기 톡신은 메이탄신(Maytansine) 또는 이의 유도체, 오리스타틴 (Auristatin) 또는 이의 유도체, 듀오카마이신(Duocarmycin) 또는 이의 유도체, 및 PBD(Pyrrolobenzodiazepine) 또는 이의 유도체로 이루어진 군에서 선택되고,
GLP-1(Glucagon like peptide-1) 수용체 아고니스트는 천연형 GLP-1(Glucagon-like peptide-1), 천연형 엑센딘-3, 천연형 엑센딘-4, 및 이들의 아날로그로 이루어진 군에서 선택된 것이며,
FGF 수용체 아고니스트는 FGF1 또는 이의 아날로그, FGF19 또는 이의 아날로그, FGF21 또는 이의 아날로그, 및 FGF23 또는 이의 아날로그로 이루어진 군에서 선택되고,
인터페론은 인터페론-알파, 인터페론-베타 및 인터페론-감마로 이루어진 군에서 선택되고,
인터페론 수용체는 인터페론-알파 수용체, 인터페론-베타 수용체, 인터페론-감마 수용체, 및 수용성 타입 I 인터페론 수용체로 이루어진 군에서 선택되고,
인터루킨은 인터루킨-1, 인터루킨-2, 인터루킨-3, 인터루킨-4, 인터루킨-5, 인터루킨-6, 인터루킨-7, 인터루킨-8, 인터루킨-9, 인터루킨-10, 인터루킨-11, 인터루킨-12, 인터루킨-13, 인터루킨-14, 인터루킨-15, 인터루킨-16, 인터루킨-17, 인터루킨-18, 인터루킨-19, 인터루킨-20, 인터루킨-21, 인터루킨-22, 인터루킨-23, 인터루킨-24, 인터루킨-25, 인터루킨-26, 인터루킨-27, 인터루킨-28, 인터루킨-29, 및 인터루킨-30으로 이루어진 군에서 선택되고,
인터루킨 수용체는 인터루킨- 1 수용체 또는 인터루킨-4 수용체이고,
효소는 베타글루코시다제(beta-glucosidase), 알파갈락토시다제(alpha-galactosidase), 베타갈락토시다제(beta-galactosidase), 이두로니다제(iduronidase), 이두로네이트 2-설파타제(iduronate-2-sulfatase), 갈락토스-6-설파타제(Galactose-6-sulfatase), 산성 알파-글루코시다제(acid alpha-glucosidase), 산성 세라미다제(acid ceramidase), 산성 스핑고미엘리나제(acid sphingomyelinsase), 갈락토세레브로시다제(galactocerebrosidase), 아릴설파타제(arylsulfatase) A, 아릴설파타제 B, 베타-헥소사미니다제 (beta-hexosaminidase) A, 베타-헥소사미니다제 B, 헤파린-N-설파타제(heparin N-sulfatase), 알파-D-마노시다제(alpha-D-mannosidase), 베타-글루쿠로니다제(beta-glucuronidase), N-아세틸갈락토사민-6-설파타제(N-acetylgalactosamine-6 sulfatase), 리소좀 산성 리파제(lysosomal acid lipase), 알파-N-아세틸-글루코사미니다제(alpha-N-acetyl-glucosaminidase), 글루코세레브로시다제(glucocerebrosidase), 부티릴콜린에스터라제(butyrylcholinesterase), 키티나제(Chitinase), 글루타메이트 디카르복실라제(glutamate decarboxylase), 이미글루세라제(imiglucerase), 리파아제(lipase), 우리카제(Uricase), 혈소판활성인자 아세틸하이드로라제(Platelet-Activating Factor Acetylhydrolase), 뉴트럴 엔도펩티다제(neutral endopeptidase), 미엘로퍼옥시다제(myeloperoxidase), 알파-갈락토시다제-A, 아갈시다제 알파(agalsidase alpha), 아갈시다제 베타, 알파-L-이두로니다제(alpha-L-iduronidase), 뷰티릴콜린에스터라제(butyrylcholinesterase), 키티나제(chitinase), 글루타메이트 디카르복실라제(glutamate decarboxylase), 및 이미글루세라제(imiglucerase)로 이루어진 군에서 선택되고,
인터루킨 결합 단백질은 IL-18bp이고,
사이토카인 결합 단백질은 TNF (Tumor necrosis factor) 결합 단백질이고,
신경 성장인자류는 신경 성장인자, 모양체 신경영양인자(ciliary neurotrophic factor), 악소제네시스 인자-1(axogenesis factor-1), 뇌-나트륨 이뇨 펩타이드(brain-natriuretic peptide), 신경교 유래 신경영양인자(glial derived neurotrophic factor), 네트린(netrin), 중성구 억제인자(neutrophil inhibitory factor), 신경영양인자, 및 뉴트린(neuturin)으로 이루어진 군에서 선택되고,
미오스타틴 수용체는 TNFR(P75), TNFR(P55), IL-1 수용체, VEGF 수용체, 및 B 세포 활성인자 수용체로 이루어진 군에서 선택되고,
미오스타틴 수용체 안타고니스트는 IL1-Ra이고,
세포표면 항원은 CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD11a, CD11b, CD18, CD19, CD20, CD23, CD25, CD33, CD38, CD40, CD45 및 CD69로 이루어진 군에서 선택되고,
항체 단편류는 scFv, Fab, Fab', F(ab')2 및 Fd로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 결합체에서,
상기 생리활성 물질은 천연형 엑센딘-3 또는 이의 아날로그, 천연형 엑센딘-4 또는 이의 아날로그, 천연형 인슐린 또는 이의 아날로그, 천연형 GLP-1 또는 이의 아날로그, 천연형 GLP-2 또는 이의 아날로그, 천연형 옥신토모듈린 또는 이의 아날로그, 천연형 글루카곤 또는 이의 아날로그, 천연형 섬유아세포성장인자 또는 이의 아날로그, 천연형 그렐린 또는 이의 아날로그, 천연형 칼시토닌 또는 이의 아날로그, 천연형 과립구 콜로니 자극인자 또는 이의 아날로그, 또는 GLP 수용체, 글루카곤 수용체, 및 GIP 수용체 중 2 이상의 수용체에 대하여 결합하는 물질인 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 결합체에서,
상기 생리활성 물질은 천연형 인슐린 또는 천연형 인슐린에 비해 인슐린 수용체 결합력이 감소된 인슐린 아날로그인 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 결합체에서, 상기 인슐린 아날로그는 A쇄 및 B쇄를 모두 포함하는 이중쇄 형태인 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 결합체에서,
상기 인슐린 아날로그는 천연형 인슐린에 비해 감소된 인슐린 수용체 결합력을 가지고, 천연형 인슐린의 B쇄 또는 A쇄의 하나 이상의 아미노산의 변이 또는 결실을 포함하는 것인 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 결합체에서,
상기 인슐린 아날로그는 인슐린 B쇄의 1번 아미노산, 2번 아미노산, 3번 아미노산, 5번 아미노산, 8번 아미노산, 10번 아미노산, 12번 아미노산, 16번 아미노산, 23번 아미노산, 24번 아미노산, 25번 아미노산, 26번 아미노산, 27번 아미노산, 28번 아미노산, 29번 아미노산, 30번 아미노산, A쇄의 1번 아미노산, 2번 아미노산, 5번 아미노산, 8번 아미노산, 10번 아미노산, 12번 아미노산, 14번 아미노산, 16번 아미노산, 17번 아미노산, 18번 아미노산, 19번 아미노산 및 21번 아미노산으로 이루어진 군에서 선택된 하나 또는 그 이상의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환되거나 결실된 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 결합체에서,
상기 인슐린 아날로그는 천연형 인슐린 B쇄의 8번 아미노산, 23번 아미노산, 24번 아미노산, 25번 아미노산, 천연형 인슐린 A쇄의 1번 아미노산, 2번 아미노산, 14번 아미노산 및 19번 아미노산으로 이루어진 군에서 선택된 하나 또는 그 이상의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 결합체에서,
상기 치환하는 다른 아미노산은 알라닌, 글루탐산, 아스파라긴, 이소루신, 발린, 글루타민, 글리신, 라이신, 히스티딘, 시스테인, 페닐알라닌, 트립토판, 프로린, 세린, 트레오닌 및 아스파르트산으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 결합체에서, 상기 인슐린 아날로그는 천연형 인슐린 A쇄 또는 B쇄의 하나 이상의 아미노산이 결실(deletion)되어 천연형 인슐린 대비 인슐린 수용체 결합력이 감소된 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 결합체에서, 상기 인슐린 아날로그는 하기 일반식 1으로 표시되는 서열번호: 3의 A쇄와 하기 일반식 2로 표시되는 서열번호: 4의 B쇄를 포함하는 것을 특징으로 한다(다만, 상기 인슐린 아날로그들 중 그 A쇄가 서열번호: 1과 일치하면서, 동시에 B쇄가 서열번호: 2와 일치하는 것은 제외된다):
[일반식 1]
Xaa1-Xaa2-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Xaa14-Gln-Leu-Glu-Asn-Xaa19-Cys-Asn (서열번호: 3)
상기 일반식 1에서,
Xaa1은 글리신 또는 알라닌이고,
Xaa2는 이소류신 또는 알라닌이며,
Xaa14는 타이로신, 글루탐산 또는 아스파라긴이며,
Xaa19는 타이로신 또는 알라닌임.
[일반식 2]
Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Xaa8-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Xaa23-Xaa24-Xaa25-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr (서열번호: 4)
상기 일반식 2에서,
Xaa8는 글리신 또는 알라닌이며,
Xaa23은 글리신 또는 알라닌이며,
Xaa24은 페닐알라닌 또는 알라닌이며,
Xaa25은 페닐알라닌 또는 알라닌임.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 결합체에서,
상기 인슐린 아날로그는
(i) 상기 일반식 1에서 Xaa1은 알라닌이고, Xaa2는 이소류신이며, Xaa14는 타이로신이며, Xaa19는 타이로신인 A쇄 및 상기 일반식 2에서 Xaa8는 글리신이고, Xaa23은 글리신이며, Xaa24은 페닐알라닌이며, Xaa25은 페닐알라닌인 B쇄를 포함하거나;
(ii) 상기 일반식 1에서 Xaa1은 글리신이고, Xaa2는 알라닌이며, Xaa14는 타이로신이며, Xaa19는 타이로신인 A쇄 및 상기 일반식 2에서 Xaa8는 글리신이고, Xaa23은 글리신이며, Xaa24은 페닐알라닌이며, Xaa25은 페닐알라닌인 B쇄를 포함하거나;
(iii) 상기 일반식 1에서 Xaa1은 글리신이고, Xaa2는 이소류신이며, Xaa14는 글루탐산 또는 아스파라긴이며, Xaa19는 타이로신인 A쇄 및 상기 일반식 2에서 Xaa8는 글리신이고, Xaa23은 글리신이며, Xaa24은 페닐알라닌이며, Xaa25은 페닐알라닌인 B쇄를 포함하거나;
(iv) 상기 일반식 1에서 Xaa1은 글리신이고, Xaa2는 이소류신이며, Xaa14는 타이로신이며, Xaa19는 알라닌인 A쇄 및 상기 일반식 2에서 Xaa8는 글리신이고, Xaa23은 글리신이며, Xaa24은 페닐알라닌이며, Xaa25은 페닐알라닌인 B쇄를 포함하거나;
(v) 상기 일반식 1에서 Xaa1은 글리신이고, Xaa2는 이소류신이며, Xaa14는 타이로신이며, Xaa19는 타이로신인 A쇄 및 상기 일반식 2에서 Xaa8는 알라닌이고, Xaa23는 글리신이며, Xaa24은 페닐알라닌이며, Xaa25은 페닐알라닌인 B쇄를 포함하거나;
(vi) 상기 일반식 1에서 Xaa1은 글리신이고, Xaa2는 이소류신이며, Xaa14는 타이로신이며, Xaa19는 타이로신인 A쇄 및 상기 일반식 2에서 Xaa8는 글리신이고, Xaa23는 알라닌이며, Xaa24는 페닐알라닌이며, Xaa25은 페닐알라닌인 B쇄를 포함하거나;
(vii) 상기 일반식 1에서 Xaa1은 글리신이고, Xaa2는 이소류신이며, Xaa14는 타이로신이며, Xaa19는 타이로신인 A쇄 및 상기 일반식 2에서 Xaa8는 글리신이고, Xaa23는 글리신이며, Xaa24은 알라닌이며, Xaa25은 페닐알라닌인 B쇄를 포함하거나;
(viii) 상기 일반식 1에서 Xaa1은 글리신이고, Xaa2는 이소류신이며, Xaa14는 타이로신이며, Xaa19는 타이로신인 A쇄 및 상기 일반식 2에서 Xaa8는 글리신이고, Xaa23는 글리신이며, Xaa24은 페닐알라닌이며, Xaa25은 알라닌인 B쇄를 포함하는 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 결합체에서,
상기 인슐린 아날로그는 하기 일반식 3으로 표시되는 서열번호: 5의 A쇄와 하기 일반식 4로 표시되는 서열번호: 6의 B쇄를 포함하는 것을 특징으로 한다 (다만, 상기 인슐린 아날로그들 중 그 A쇄가 서열번호: 1과 일치하면서, 동시에 B쇄가 서열번호: 2와 일치하는 것은 제외된다):
[일반식 3]
Xaa1-Ile-Val-Glu-Xaa5-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Xaa12-Leu-Xaa14-Gln-Xaa16-Glu-Asn-Xaa19-Cys-Xaa21(서열번호: 5)
상기 일반식 3에서,
Xaa1는 알라닌, 글리신, 글루타민, 히스티딘, 글루탐산 또는 아스파라긴이고,
Xaa5는 알라닌, 글루탐산, 글루타민, 히스티딘 또는 아스파라긴이고,
Xaa12는 알라닌, 세린, 글루타민, 글루탐산, 히스티딘 또는 아스파라긴이고,
Xaa14는 알라닌, 티로신, 글루탐산, 히스티딘, 라이신, 아스파르트산 또는 아스파라긴이고,
Xaa16는 알라닌, 류신, 티로신, 히스티닌, 글루탐산 또는 아스파라긴이고,
Xaa19는 알라닌, 티로신, 세린, 글루탐산, 히스티딘, 트레오닌 또는 아스파라긴이고,
Xaa21은 아스파라긴, 글리신, 히스티딘, 또는 알라닌임.
[일반식 4]
Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Xaa16-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Xaa25-Tyr-Xaa27-Xaa28-Lys-Thr(서열번호: 6)
상기 일반식 4에서,
Xaa16은 티로신, 글루탐산, 세린, 트레오닌 또는 아스파르트산이거나, 부존재하며,
Xaa25는 페닐알라닌, 아스파트산 또는 글루탐산이거나, 부존재하며,
Xaa27는 트레오닌이거나, 부존재하며,
Xaa28은 프롤린, 글루탐산 또는 아스파르트산이거나, 부존재함.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 결합체에서, 상기 인슐린 아날로그는,
상기 일반식 3에서 Xaa1는 글리신이고, Xaa5는 글루타민이고, Xaa12는 세린이고, Xaa14는 글루탐산, 또는 아스파라긴이고, Xaa16는 류신이고, Xaa19는 티로신이고, Xaa21은 아스파라긴이며,
상기 일반식 4에서 Xaa16은 티로신이고, Xaa25는 페닐알라닌이거나, 부존재하며, Xaa27는 트레오닌이고, Xaa28은 프롤린, 글루탐산, 또는 아스파르트산이거나, 부존재하는 것을 특징으로 하나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 결합체에서, 상기 인슐린 아날로그는,
(1) 상기 서열번호: 5의 A-쇄에서 Xaa1이 글리신이고, Xaa5가 글루타민이고, Xaa12이 세린이고, Xaa14가 글루탐산이고, Xaa16가 류신이고, Xaa19이 티로신이고, Xaa21이 아스파라긴이고,
서열번호: 6의 B-쇄에서 Xaa16이 티로신이고, Xaa25가 페닐알라닌이고, Xaa27이 트레오닌이고, Xaa28은 프롤린, 글루탐산, 또는 아스파르트산이거나, 부존재하는 것;
(2) 상기 서열번호: 5의 A-쇄에서 Xaa1이 글리신이고, Xaa5가 글루타민이고, Xaa12이 세린이고, Xaa14가 아스파라긴이고, Xaa16가 류신이고, Xaa19이 티로신이고, Xaa21이 아스파라긴이고,
서열번호: 6의 B-쇄에서 Xaa16이 티로신이고, Xaa25가 페닐알라닌이고, Xaa27이 트레오닌이고, Xaa28은 프롤린, 글루탐산, 또는 아스파르트산이거나, 부존재하는 것;
(3) 상기 서열번호: 5의 A-쇄에서 Xaa1이 글리신이고, Xaa5가 글루타민이고, Xaa12이 세린이고, Xaa14가 글루탐산이고, Xaa16가 류신이고, Xaa19이 티로신이고, Xaa21이 아스파라긴이고,
서열번호: 6의 B-쇄에서 Xaa16이 티로신이고, Xaa25가 부존재하고, Xaa27이 트레오닌이고, Xaa28은 프롤린, 글루탐산, 또는 아스파르트산이거나, 부존재하는 것; 또는
(4) 상기 서열번호: 5의 A-쇄에서 Xaa1이 글리신이고, Xaa5가 글루타민이고, Xaa12이 세린이고, Xaa14가 알라닌이고, Xaa16가 류신이고, Xaa19이 티로신이고, Xaa21이 아스파라긴이고,
서열번호: 6의 B-쇄에서 Xaa16이 글루탐산, Xaa25가 부존재하고, Xaa27이 트레오닌이고, Xaa28은 프롤린, 글루탐산, 또는 아스파르트산이거나, 부존재하는 것
을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 결합체에서, 상기 인슐린 아날로그는,
(1) 상기 일반식 3에서, Xaa1이 글리신이고, Xaa5가 글루타민이고, Xaa12이 세린이고, Xaa14가 글루탐산이고, Xaa16가 류신이고, Xaa19이 티로신이고, Xaa21이 아스파라긴이고,
상기 일반식 4에서, Xaa16이 티로신이고, Xaa25가 부존재하고, Xaa27이 트레오닌이고, Xaa28은 프롤린이거나; (2) 상기 일반식 3에서, Xaa1이 글리신이고, Xaa5가 글루타민이고, Xaa12이 세린이고, Xaa14가 알라닌이고, Xaa16가 류신이고, Xaa19이 티로신이고, Xaa21이 아스파라긴이고,
상기 일반식 4에서, Xaa16이 글루탐산, Xaa25가 부존재하고, Xaa27이 트레오닌이고, Xaa28은 프롤린이거나;
(3) 상기 일반식 3에서, Xaa1는 글리신이고, Xaa5는 글루타민이고, Xaa12는 세린이고, Xaa14는 히스티딘이고, Xaa16는 류신이고, Xaa19는 티로신이고, Xaa21은 아스파라긴이며,
상기 일반식 4에서, Xaa16은 티로신이고, Xaa25는 페닐알라닌이고, Xaa27은 트레오닌이며, Xaa28은 프롤린이거나;
(4) 상기 일반식 3에서, Xaa1는 글리신이고, Xaa5는 글루타민이고, Xaa12는 세린이고, Xaa14는 라이신이고, Xaa16는 류신이고, Xaa19는 티로신이고, Xaa21은 아스파라긴이며,
상기 일반식 4에서, Xaa16은 티로신이고, Xaa25는 페닐알라닌이고, Xaa27은 트레오닌이며, Xaa28은 프롤린이거나;
(5) 상기 일반식 3에서, Xaa1는 글리신이고, Xaa5는 글루타민이고, Xaa12는 세린이고, Xaa14는 티로신이고, Xaa16는 류신이고, Xaa19는 글루탐산이고, Xaa21은 아스파라긴이며,
상기 일반식 4에서, Xaa16은 티로신이고, Xaa25는 페닐알라닌이고, Xaa27은 트레오닌이며, Xaa28은 프롤린이거나;
(6) 상기 일반식 3에서, Xaa1는 글리신이고, Xaa5는 글루타민이고, Xaa12는 세린이고, Xaa14는 티로신이고, Xaa16는 류신이고, Xaa19는 세린이고, Xaa21은 아스파라긴이며,
상기 일반식 4에서, Xaa16은 티로신이고, Xaa25는 페닐알라닌이고, Xaa27은 트레오닌이며, Xaa28은 프롤린이거나;
(7) 상기 일반식 3에서, Xaa1는 글리신이고, Xaa5는 글루타민이고, Xaa12는 세린이고, Xaa14는 티로신이고, Xaa16는 류신이고, Xaa19는 트레오닌이고, Xaa21은 아스파라긴이며,
상기 일반식 4에서, Xaa16은 티로신이고, Xaa25는 페닐알라닌이고, Xaa27은 트레오닌이며, Xaa28은 프롤린이거나;
(8) 상기 일반식 3에서, Xaa1는 글리신이고, Xaa5는 글루타민이고, Xaa12는 세린이고, Xaa14는 티로신이고, Xaa16는 류신이고, Xaa19는 티로신이고, Xaa21은 아스파라긴이며,
상기 일반식 4에서, Xaa16은 글루탐산이고, Xaa25는 페닐알라닌이고, Xaa27은 트레오닌이며, Xaa28은 프롤린이거나;
(9) 상기 일반식 3에서, Xaa1는 글리신이고, Xaa5는 글루타민이고, Xaa12는 세린이고, Xaa14는 티로신이고, Xaa16는 류신이고, Xaa19는 티로신이고, Xaa21은 아스파라긴이며,
상기 일반식 4에서, Xaa16은 세린이고, Xaa25는 페닐알라닌이고, Xaa27은 트레오닌이며, Xaa28은 프롤린이거나;
(10) 상기 일반식 3에서, Xaa1는 글리신이고, Xaa5는 글루타민이고, Xaa12는 세린이고, Xaa14는 티로신이고, Xaa16는 류신이고, Xaa19는 티로신이고, Xaa21은 아스파라긴이며,
상기 일반식 4에서, Xaa16은 트레오닌이고, Xaa25는 페닐알라닌이고, Xaa27은 트레오닌이며, Xaa28은 프롤린이거나;
(11) 상기 일반식 3에서, Xaa1는 글리신이고, Xaa5는 글루타민이고, Xaa12는 세린이고, Xaa14는 알라닌이고, Xaa16는 류신이고, Xaa19는 티로신이고, Xaa21은 아스파라긴이며,
상기 일반식 4에서, Xaa16은 티로신이고, Xaa25는 페닐알라닌이고, Xaa27은 트레오닌이며, Xaa28은 프롤린이거나;
(12) 상기 일반식 3에서, Xaa1는 글리신이고, Xaa5는 글루타민이고, Xaa12는 세린이고, Xaa14는 아스파르트산이고, Xaa16는 류신이고, Xaa19는 티로신이고, Xaa21은 아스파라긴이며,
상기 일반식 4에서, Xaa16은 티로신이고, Xaa25는 페닐알라닌이고, Xaa27은 트레오닌이며, Xaa28은 프롤린이거나;
(13) 상기 일반식 3에서, Xaa1는 글리신이고, Xaa5는 글루타민이고, Xaa12는 세린이고, Xaa14는 티로신이고, Xaa16는 류신이고, Xaa19는 티로신이고, Xaa21은 아스파라긴이며,
상기 일반식 4에서, Xaa16은 아스파르트산이고, Xaa25는 페닐알라닌이고, Xaa27은 트레오닌이며, Xaa28은 프롤린이거나;
(14) 상기 일반식 3에서, Xaa1는 글리신이고, Xaa5는 글루타민이고, Xaa12는 세린이고, Xaa14는 티로신이고, Xaa16는 류신이고, Xaa19는 티로신이고, Xaa21은 아스파라긴이며,
상기 일반식 4에서, Xaa16은 티로신이고, Xaa25는 아스파르트산이고, Xaa27은 트레오닌이며, Xaa28은 프롤린이거나;
(15) 상기 일반식 3에서, Xaa1는 글리신이고, Xaa5는 글루타민이고, Xaa12는 세린이고, Xaa14는 티로신이고, Xaa16는 류신이고, Xaa19는 티로신이고, Xaa21은 아스파라긴이며,
상기 일반식 4에서, Xaa16은 티로신이고, Xaa25는 글루탐산이고, Xaa27은 트레오닌이며, Xaa28은 프롤린인 것
을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 결합체에서, 상기 결합체는 하기 화학식 2로 표시되는 것을 특징으로 한다:
[화학식 2]
X-L-F;
여기에서,
X는 천연형 인슐린 또는 천연형 인슐린에 비해 인슐린 수용체 결합력이 감소된 인슐린 아날로그이고,
L은 링커로서, 0 kDa 초과 내지 3.4 kDa 미만의 크기를 갖는 폴리에틸렌 글리콜이며,
F는 X의 생체 내 반감기를 증가시킬 수 있는 물질임.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 결합체에서, 상기 화학식 2로 표시되는 결합체는 RMC (receptor mediated clearance)가 감소된 인슐린 결합체인 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 결합체에서, 상기 화학식 2에서, L은 X인 천연형 인슐린 또는 이의 아날로그의 베타 체인의 아미노 말단 영역에 연결되어 있는 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 결합체에서, 상기 X와 F는 공유 화학 결합, 비공유 화학 결합 또는 이들의 조합으로 L에 의해 서로 결합되는 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 결합체에서,
상기 생리활성 물질의 생체 내 반감기를 증가시킬 수 있는 물질은 생체 적합성 물질인 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 결합체에서,
상기 F는 고분자 중합체, 지방산, 콜레스테롤, 알부민 및 이의 단편, 알부민 결합물질, 특정 아미노산 서열의 반복단위의 중합체, 항체, 항체 단편, FcRn 결합물질, 생체 내 결합조직, 뉴클레오타이드, 파이브로넥틴, 트랜스페린(Transferrin), 다당류(saccharide), 헤파린, 및 엘라스틴으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 결합체에서,
상기 고분자 중합체는 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 에틸렌 글리콜-프로필렌 글리콜 공중합체, 폴리옥시에틸화폴리올, 폴리비닐알콜, 폴리사카라이드, 덱스트란, 폴리비닐에틸에테르, 생분해성 고분자, 지질 중합체, 키틴, 히아루론산, 올리고뉴클레오타이드 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 결합체에서, 상기 FcRn 결합 물질은 면역글로불린 Fc 영역을 포함하는 폴리펩타이드인 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 결합체에서, F는 IgG Fc 영역인 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 결합체에서, 상기 화학식 1 또는 화학식 2에서, 상기 F는 면역글로불린 Fc 영역이고, L은 F의 N-말단 영역에 연결되어 있는 것을 특징으로 한다.
본 발명을 구현하는 다른 하나의 양태는 상기 결합체의 제조 방법이다.
하나의 구체예에서, 본 발명은
(a) 적어도 2개의 말단 작용기를 보유하는 0 kDa 초과 내지 3.4 kDa 미만의 크기를 갖는 폴리에틸렌 글리콜과 생리활성 물질 또는 생리활성 물질의 생체 내 반감기를 증가시킬 수 있는 물질 중 어느 하나를 반응시켜, 생리활성 물질 또는 생리활성 물질의 생체 내 반감기를 증가시킬 수 있는 물질 중 어느 하나가 공유결합으로 연결되어 있으며, 적어도 하나의 말단 작용기를 보유하는, 폴리에틸렌 글리콜을 제조하는 단계;
(b) 상기 (a) 단계에서 제조된 생리활성 물질 또는 이의 생체 내 반감기를 증가시킬 수 있는 물질 중 어느 하나가 공유결합으로 연결되어 있으며, 적어도 하나의 말단 작용기를 보유하는, 폴리에틸렌 글리콜과 생리활성 물질 또는 생리활성 물질의 생체 내 반감기를 증가시킬 수 있는 물질 중 다른 하나와 반응시켜,
생리활성 물질 및 이의 생체 내 반감기를 증가시킬 수 있는 물질이 0 kDa 초과 내지 3.4 kDa 미만의 크기를 갖는 폴리에틸렌 글리콜을 통하여 공유결합으로 연결된 결합체를 제조하는 단계를 포함하는, 결합체의 제조 방법에 관한 것이다.
앞선 구체예에 따른 제조 방법에서,
상기 생리활성 물질은 폴리에틸렌 글리콜의 말단 작용기와 반응하여 공유 결합을 형성하는 작용기를 보유하며, 상기 작용기는 아민기 또는 티올기인 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 제조 방법에서,
상기 생리활성 물질의 반감기를 증가시키는 물질은 폴리에틸렌 글리콜의 말단 작용기와 반응하여 공유 결합을 형성하는 작용기를 보유하며, 상기 작용기는 아민기 또는 티올기인 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 제조 방법에서, 상기 폴리에틸렌 글리콜의 말단 작용기는 아민-반응성 작용기 (amine-reactive functional group) 또는 티올-반응성 작용기 (thiol-reactive functional group)인 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 제조방법에서, 상기 폴리에틸렌 글리콜의 말단 작용기는 알데히드, 말레이미드, 석시니미드, 비닐술폰, 티올, C6 내지 C20 아릴디설파이드, C5 내지 C20 헤테로아릴디설파이드, 및 할로겐화 아세트아미드로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 제조방법에서, 상기 폴리에틸렌 글리콜의 말단 작용기는 알데히드, 말레이미드, 석시니미드, 비닐술폰, 티올, 오르토-피리딜디설파이드(Ortho-pyridyl disulfide), 및 요오드화 아세트아미드로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 제조방법에서, 상기 석시니미드는 석시니미딜 발레르에이트, 석시니미딜 메틸부타노에이트, 석시니미딜 메틸프로피온에이트, 석시니미딜 부타노에이트, 석시니미딜 프로피오네이트, 히드록시 석시니미딜, 석시니미딜 카르복시메틸 또는 석시니미딜 카보네이트인 것을 특징으로 한다.
본 발명을 구현하는 다른 하나의 양태는 상기 결합체를 포함하는, 생체 내 지속성 및 안정성이 증가된 인슐린 지속성 제제이다.
본 발명을 구현하는 다른 하나의 양태는 상기 결합체를 포함하는, 당뇨병의 예방 또는 치료용 제제이다.
본 발명을 구현하는 다른 하나의 양태는 상기 화학식 2로 표시되는 결합체 또는 이를 포함하는 조성물 혹은 제제를 이를 필요로 하는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 인슐린 관련 질환의 치료 방법이다.
본 발명의 생리활성 물질 결합체는 해당 생리활성이 필요한 분야에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 인슐린-3.4 kDa PEG-면역글로불린 Fc 단편 결합체의 SDS-PAGE 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 인슐린-1 kDa PEG-면역글로불린 Fc 단편 결합체의 SDS-PAGE 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 인슐린-1, 2, 2.5, 3, 3.4 kDa PEG-면역글로불린 Fc 단편 결합체의 각각의 크기배제 크로마토그래피(SE-HPLC) 분석결과를 나타낸 도이다.
도 4는 인슐린-1, 2, 2.5, 3, 3.4 kDa PEG-면역글로불린 Fc 단편 결합체의 각각의 역상 크로마토그래피(RP-HPLC) 분석결과를 나타낸 도이다.
도 5는, 인슐린-1, 2, 2.5, 3, 3.4 kDa PEG-면역글로불린 Fc 단편 결합체의 크로마토그래피 중첩(overlay) 그래프이다.
도 6은 PEG 링커의 길이에 따른 지속형 인슐린 결합체의 약효지속성 비교 결과를 나타낸 도이다.
이하에서는, 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.
한편, 본원에서 개시되는 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술되는 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 할 수 없다.
또한, 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 통상의 실험만을 사용하여 본 출원에 기재된 본 발명의 특정 양태에 대한 다수의 등가물을 인지하거나 확인할 수 있다. 또한, 이러한 등가물은 본 발명에 포함되는 것으로 의도된다.
본 명세서 전반을 통하여, 아미노산에 대한 통상의 1문자 및 3문자 코드가 사용된다. 또한 본 명세서에서 약어로 언급된 아미노산은 IUPAC-IUB 명명법에 따라 기재되었다.
본 발명을 구현하기 위한 하나의 양태는, 생리활성 물질의 체내 반감기 연장을 위한 목적을 가진 생리활성 물질의 결합체를 제공한다.
구체적으로, 본 발명은 생리활성 물질 및 이의 생체 내 반감기를 증가시킬 수 있는 물질이 폴리에틸렌 글리콜을 통해 연결되고, 상기 폴리에틸렌 글리콜은 0 kDa 초과 내지 3.4 kDa 미만의 크기인 것을 특징으로 하는 생리활성 물질의 결합체를 제공한다.
본 발명을 구현하기 위한 보다 구체적인 양태는, 하기 화학식 1을 갖는 결합체를 제공한다:
[화학식 1]
X-L-F;
여기에서,
X는 생리활성 물질이고,
L은 링커로서, 0 kDa 초과 내지 3.4 kDa 미만의 크기를 갖는 폴리에틸렌 글리콜이며,
F는 생리활성 물질의 생체 내 반감기를 증가시킬 수 있는 물질임.
본원에서 상기 화학식 1로 표시되는 결합체는 본원에서 "지속형 결합체"와 혼용되어 사용된다.
본 발명에서 "지속형 결합체"란, 생리활성 물질이 이의 생체 내 반감기를 연장시킬 수 있는 물질, 예컨대, 생체적합성 물질이 링커에 의해 결합된 물질을 말한다.
특별히 이에 제한되지는 않으나, 상기 결합체는, 상기 결합체와 L이 3.4 kDa 크기를 갖는 폴리에틸렌 글리콜인 것만이 다른 결합체와 비교하여, 증가된 생체 내 반감기를 나타낼 수 있다.
보다 구체적으로, 상기 결합체와 X 및 F는 동일하고, 3.4 kDa 크기를 갖는 폴리에틸렌 글리콜을 L인 것을 특징으로 하는 다른 결합체와 비교하여, 상기 결합체는 생리활성 물질의 수용체에 대해 감소된 결합력을 나타낼 수 있고, RMC (receptor mediated clearance)가 약화되어 이로 인해 혈중 반감기가 증가될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.
또한, 상기 효과에 더하여 또는 독립적으로, 상기 결합체에서는 X 및 F를 연결하는 0 kDa 초과 내지 3.4 kDa 미만의 크기를 갖는 폴리에틸렌 글리콜에 의하여 X 및 F가 근접하여 존재하더라도, 상기 결합체와 X 및 F는 동일하고, 3.4 kDa 크기를 갖는 폴리에틸렌 글리콜을 L인 것을 특징으로 하는 다른 결합체와 비교하여 X 자체의 생리활성 및 F 자체의 활성 각각이 실질적으로 동등하거나, 그 이상의 활성을 나타낼 수 있으나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, L은 링커로서, 상기 결합체를 구성하는 일 모이어티 (moiety)로서, 0 kDa 초과 내지 3.4 kDa 미만의 크기를 갖는 폴리에틸렌 글리콜을 의미하는 것으로, 이에 제한되지 않으나, 0 kDa 초과 내지 3.4 kDa 미만, 0 kDa 초과 내지 3.3 kDa 이하, 0 kDa 초과 내지 3.2 kDa 이하, 0 kDa 초과 내지 3.1 kDa 이하, 0 kDa 초과 내지 3.0 kDa 이하, 0 kDa 초과 내지 2.9 kDa 이하, 0 kDa 초과 내지 2.8 kDa 이하, 0 kDa 초과 내지 2.7 kDa 이하, 0 kDa 초과 내지 2.6 kDa 이하, 0 kDa 초과 내지 2.5 kDa 이하, 0 kDa 초과 내지 2.4 kDa 이하, 0 kDa 초과 내지 2.3 kDa 이하, 0 kDa 초과 내지 2.2 kDa 이하, 0 kDa 초과 내지 2.1 kDa 이하, 0 kDa 초과 내지 2.0 kDa 이하, 0 kDa 초과 내지 1.9 kDa 이하, 0 kDa 초과 내지 1.8 kDa 이하, 0 kDa 초과 내지 1.7 kDa 이하, 0 kDa 초과 내지 1.6 kDa 이하, 0 kDa 초과 내지 1.5 kDa 이하, 0 kDa 초과 내지 1.4 kDa 이하, 0 kDa 초과 내지 1.3 kDa 이하, 0 kDa 초과 내지 1.2 kDa 이하, 0 kDa 초과 내지 1.1 kDa 이하, 0 kDa 초과 내지 1.0 kDa 이하, 0.5 kDa 이상 내지 3.4 kDa 미만, 0.5 kDa 이상 내지 3.3 kDa 이하, 0.5 kDa 이상 내지 3.2 kDa 이하, 0.5 kDa 이상 내지 3.1 kDa 이하, 0.5 kDa 이상 내지 3 kDa 이하, 0.5 kDa 이상 내지 2.9 kDa 이하, 0.5 kDa 이상 내지 2.8 kDa 이하, 0.5 kDa 이상 내지 2.7 kDa 이하, 0.5 kDa 이상 내지 2.6 kDa 이하, 0.5 kDa 이상 내지 2.5 kDa 이하, 0.5 kDa 이상 내지 2.4 kDa 이하, 0.5 kDa 이상 내지 2.3 kDa 이하, 0.5 kDa 이상 내지 2.2 kDa 이하, 0.5 kDa 이상 내지 2.1 kDa 이하, 0.5 kDa 이상 내지 2 kDa 이하, 0.5 kDa 이상 내지 1.9 kDa 이하, 0.5 kDa 이상 내지 1.8 kDa 이하, 0.5 kDa 이상 내지 1.7 kDa 이하, 0.5 kDa 이상 내지 1.6 kDa 이하, 0.5 kDa 이상 내지 1.5 kDa 이하, 0.5 kDa 이상 내지 1.4 kDa 이하, 0.5 kDa 이상 내지 1.3 kDa 이하, 0.5 kDa 이상 내지 1.2 kDa 이하, 0.5 kDa 이상 내지 1.1 kDa 이하, 0.5 kDa 이상 내지 1 kDa 이하, 0.5 kDa 초과 내지 3.4 kDa 미만, 0.5 kDa 초과 내지 3.3 kDa 이하, 0.5 kDa 초과 내지 3.2 kDa 이하, 0.5 kDa 초과 내지 3.1 kDa 이하, 0.5 kDa 초과 내지 3 kDa 이하, 0.5 kDa 초과 내지 2.9 kDa 이하, 0.5 kDa 초과 내지 2.8 kDa 이하, 0.5 kDa 초과 내지 2.7 kDa 이하, 0.5 kDa 초과 내지 2.6 kDa 이하, 0.5 kDa 초과 내지 2.5 kDa 이하, 0.5 kDa 초과 내지 2.4 kDa 이하, 0.5 kDa 초과 내지 2.3 kDa 이하, 0.5 kDa 초과 내지 2.2 kDa 이하, 0.5 kDa 초과 내지 2.1 kDa 이하, 0.5 kDa 초과 내지 2 kDa 이하, 0.5 kDa 초과 내지 1.9 kDa 이하, 0.5 kDa 초과 내지 1.8 kDa 이하, 0.5 kDa 초과 내지 1.7 kDa 이하, 0.5 kDa 초과 내지 1.6 kDa 이하, 0.5 kDa 초과 내지 1.5 kDa 이하, 0.5 kDa 초과 내지 1.4 kDa 이하, 0.5 kDa 초과 내지 1.3 kDa 이하, 0.5 kDa 초과 내지 1.2 kDa 이하, 0.5 kDa 초과 내지 1.1 kDa 이하, 0.5 kDa 초과 내지 1.0 kDa 이하, 0.75 kDa 이상 내지 3.4 kDa 미만, 0.75 kDa 이상 내지 3.3 kDa 이하, 0.75 kDa 이상 내지 3.2 kDa 이하, 0.75 kDa 이상 내지 3.1 kDa 이하, 0.75 kDa 이상 내지 3 kDa 이하, 0.75 kDa 이상 내지 2.9 kDa 이하, 0.75 kDa 이상 내지 2.8 kDa 이하, 0.75 kDa 이상 내지 2.7 kDa 이하, 0.75 kDa 이상 내지 2.6 kDa 이하, 0.75 kDa 이상 내지 2.5 kDa 이하, 0.75 kDa 이상 내지 2.4 kDa 이하, 0.75 kDa 이상 내지 2.3 kDa 이하, 0.75 kDa 이상 내지 2.2 kDa 이하, 0.75 kDa 이상 내지 2.1 kDa 이하, 0.75 kDa 이상 내지 2 kDa 이하, 0.75 kDa 이상 내지 1.9 kDa 이하, 0.75 kDa 이상 내지 1.8 kDa 이하, 0.75 kDa 이상 내지 1.7 kDa 이하, 0.75 kDa 이상 내지 1.6 kDa 이하, 0.75 kDa 이상 내지 1.5 kDa 이하, 0.75 kDa 이상 내지 1.4 kDa 이하, 0.75 kDa 이상 내지 1.3 kDa 이하, 0.75 kDa 이상 내지 1.2 kDa 이하, 0.75 kDa 이상 내지 1.1 kDa 이하, 0.75 kDa 이상 내지 1 kDa 이하, 0.75 kDa 초과 내지 2 kDa 이하, 0.75 kDa 초과 내지 2 kDa 미만, 0.75 kDa 초과 내지 1.5 kDa 이하, 약 1.0 kDa, 또는 1.0 kDa의 크기를 갖는 폴리에틸렌 글리콜을 모두 포함한다.
본 발명에서 용어, "약"은 ±0.5, ±0.4, ±0.3, ±0.2, ±0.1 등을 모두 포함하는 범위로, 약 이란 용어 뒤에 나오는 수치와 동등하거나 유사한 범위의 수치를 모두 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서, X는 상기 결합체를 구성하는 일 모이어티 (moiety)인 생리활성 물질이다. 상기 생리활성 물질은 생체 내에서 임의의 생리작용을 가지는 물질을 말한다.
이와 같은 생리활성 물질은 톡신 또는 생리활성 폴리펩타이드일 수 있고, 인간의 질병을 치료 또는 예방할 목적으로 사용되는 사이토카인, 인터루킨, 인터루킨 결합 단백질, 효소, 항체, 성장인자, 전사조절인자, 혈액인자, 백신, 구조단백질, 리간드 단백질 또는 수용체, 세포표면항원, 수용체 안타고니스트, 당뇨 및 비만에 치료효과를 보이는 소장 및 췌장에서 분비되는 생리활성 펩타이드, GPCR (G protein-coupled receptors) 아고니스트 혹은 안타고니스트 등과 같은 다양한 생리활성 폴리펩타이드, 이들의 아날로그들을 예시할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 사용되는 용어, "X의 아날로그"는 X와 동일한 종류의 활성을 나타낼 수 있는 물질로서, X의 아고니스트(agonist), X의 유도체(derivatives), X의 단편(fragments), X의 변이체(variants) 등을 모두 포함한다.
이러한 X는 천연형인 생리활성 폴리펩타이드일 수 있다.
구체적으로, "천연형인 생리활성 폴리펩타이드의 유도체"는 천연형 생리활성 폴리펩타이드와 비교하여 아미노산 서열에 하나 이상의 차이가 있는 펩타이드, 천연형 생리활성 폴리펩타이드 서열을 개질(modification)을 통하여 변형시킨 펩타이드, 천연형 생리활성 폴리펩타이드와 동일한 종류의 활성을 보유하는 모방체를 포함한다.
구체적으로, 천연형 생리활성 폴리펩타이드의 유도체는 천연형 생리활성 폴리펩타이드에서 일부 아미노산이 치환(substitution), 추가(addition), 제거(deletion) 및 수식(modification) 중 어느 하나의 방법 또는 이러한 방법들의 조합을 통하여 변형시켜 제조할 수 있으며, 이와 같은 방법으로 제조된 서로 다른 2개 이상의 수용체에 결합력을 갖도록 조작된 인위의 펩타이드류도 상기 유도체의 범주에 포함된다.
또한, 천연형 생리활성 폴리펩타이드의 유도체의 제조를 위한 이러한 변형은 L-형 혹은 D-형 아미노산, 및/또는 비-천연형 아미노산을 이용한 변형; 및/또는 천연형 서열을 개질, 예를 들어 측쇄 작용기의 변형, 분자 내 공유결합, 예컨대, 측쇄 간 고리 형성, 메틸화, 아실화, 유비퀴틴화, 인산화, 아미노헥산화, 바이오틴화 등과 같이 개질함으로써 변형하는 것을 모두 포함한다.
또한, 천연형 생리활성 폴리펩타이드의 아미노 및/또는 카르복시 말단에 하나 또는 그 이상의 아미노산이 추가된 것을 모두 포함한다.
상기 치환되거나 추가되는 아미노산은 인간 단백질에서 통상적으로 관찰되는 20개의 아미노산뿐만 아니라 비정형 또는 비-자연적 발생 아미노산을 사용할 수 있다.
본 발명에서 용어, "천연형 생리활성 폴리펩타이드 혹은 천연형 생리활성 폴리펩타이드의 유도체의 단편"은 천연형 생리활성 폴리펩타이드 혹은 천연형 생리활성 폴리펩타이드의 유도체의 아미노 말단 혹은 카르복시 말단에 하나 또는 그 이상의 아미노산이 제거된 형태를 말한다.
상기 생리활성 물질은 톡신; 또는 GLP-1(Glucagon like peptide-1) 수용체 아고니스트; 글루카곤 수용체 아고니스트; GIP(Gastric inhibitory polypeptide) 수용체 아고니스트; FGF(Fibroblast growth factor) 수용체 아고니스트; 콜레키스토키닌 (Cholecystokinin) 수용체 아고니스트; 가스트린(gastrin) 수용체 아고니스트 (가스트린); 멜라노코르틴(melanocortin) 수용체 아고니스트; GLP 수용체, 글루카곤 수용체, 및 GIP 수용체 중 2 이상의 수용체에 대하여 결합하는 물질; 소마토스타틴; PYY(peptide YY); NPY(neuropeptide Y); 옥신토모듈린; 섬유아세포성장인자 (Fibroblast growth factor); 브래디키닌; 엘레도이신(Eledoisin); 옥시토신(Oxytocin); 바소프레신(vasopressin); 세르모레린(Sermorelin); 프로락틴 방출 펩타이드; 오렉신(Orexin); 갑상선 방출 펩타이드; 칼모듈린; 모틸린(Motilin); 관활성장관펩타이드(Vasoactive intestinal peptide); 심방나트륨이뇨 펩타이드(Atrial natriuretic peptide; ANP); C-형 나트륨이뇨 펩타이드(C-type natriuretic peptide; CNP); 뉴로키닌(Neurokinin) A; 뉴로메딘(Neuromedin); 레닌(Renin); 엔도텔린(Endothelin); 사라포톡신 펩타이드(Sarafotoxin peptide); 카르소모르핀 펩타이드(Carsomorphin peptide); 데모르핀(Dermorphin); 디노르핀(Dynorphin); 엔도르핀(Endorphin); 엔케팔린(Enkepalin); 종양괴사인자 수용체; 유로키나아제 수용체; 티모포이에틴(Thymopoietin); 티물린(Thymulin); 티모펜틴(Thymopentin); 티모신(Tymosin); 흉선 체액성 인자(Thymic humoral factor); 아드레노모둘린(Adrenomodullin); 알라토스타틴(Allatostatin); 아밀로이드 베타-프로테인 단편(Amyloid beta-protein fragment); 항균성 펩타이드; 항산화제 펩타이드; 봄베신(Bombesin); 오스테오칼신(Osteocalcin); CART 펩타이드; E-셀렉틴(selectin); ICAM-1 (Intercellular Adhesion Molecule 1); VCAM-1 (vascular cell adhesion molecule 1); 류코카인(Leucokine); 크링글(Kringle)-5; 라미닌(Laminin); 인히빈(Inhibin); 갈라닌(Galanin); 피브로넥틴(Fibronectin); 판크레아스타틴(Pancreastatin); 푸제온(Fuzeon); 글루카곤 유사 펩타이드; 지프로테인 관련수용체 (Gprotein-coupled receptor); 적혈구 증식인자; 백혈구 증식인자; 아밀린; 인간 성장호르몬; 성장호르몬 방출 호르몬; 성장호르몬 방출 펩타이드; 인터페론; 인터페론 수용체; 콜로니 자극인자; 인터루킨; 인터루킨 수용체; 효소; 인터루킨 결합 단백질; 사이토카인 결합 단백질; 마크로파지 활성인자; 마크로파지 펩타이드; B 세포인자; T 세포인자; 단백질 A; 알러지 억제인자; 세포 괴사 당단백질; 면역독소; 림포독소; 종양 괴사인자; 종양 억제인자; 전이 성장인자; 알파-1 안티트립신; 알부민; 알파-락트알부민(alpha-lactalbumin); 아포리포 단백질-E; 적혈구 생성 인자; 고 당쇄화 적혈구 생성인자; 안지오포이에틴(angiopoietin); 헤모글로빈; 트롬빈(thrombin); 트롬빈 수용체 활성 펩타이드; 트롬보모듈린(thrombomodulin); 혈액인자 VII (혈액응고인자 VII); 혈액인자 VIIa (혈액응고인자 VIIa); 혈액인자 VIII (혈액응고인자 VIII); 혈액인자 IX (혈액응고인자 IX); 혈액인자 XIII (혈액응고인자 XIII); 플라즈미노겐 활성인자; 피브린-결합 펩타이드; 유로키나제; 스트렙토키나제; 히루딘(hirudin); 단백질 C; C-반응성 단백질; 레닌 억제제; 콜라게나제 억제제; 수퍼옥사이드 디스뮤타제; 렙틴; 혈소판 유래 성장인자; 상피세포 성장인자; 표피세포 성장인자; 안지오스타틴(angiostatin); 안지오텐신(angiotensin); 골 형성 성장인자; 골 형성 촉진 단백질; 칼시토닌; 인슐린; 아트리오펩틴; 연골 유도인자; 엘카토닌(elcatonin); 결합조직 활성인자; 조직인자 경로 억제제(tissue factor pathway inhibitor); 여포 자극 호르몬; 황체 형성 호르몬; 황체 형성 호르몬 방출 호르몬; 신경 성장인자류; 악소제네시스 인자-1(axogenesis factor-1); 뇌-나트륨 이뇨 펩타이드(brain-natriuretic peptide); 신경교 유래 신경영양인자(glial derived neurotrophic factor); 네트린(netrin); 중성구 억제인자(neutrophil inhibitory factor); 신경영양인자; 뉴트린(neuturin); 부갑상선 호르몬; 릴랙신; 시크레틴; 소마토메딘; 인슐린 유사 성장인자; 부신피질 호르몬; 글루카곤; 콜레시스토키닌; 췌장 폴리펩타이드; 가스트린 방출 펩타이드; 가스트린억제 펩타이드; 코티코트로핀 방출인자; 갑상선 자극호르몬; 오토탁신(autotaxin); 락토페린(lactoferrin); 미오스타틴(myostatin); ADNP(activity-dependent neuroprotective protein), BACE1(beta-secretase1), APP(Amyloid Precursor Protein), NCAM(Neural cell adhesion molecule), 아밀로이드 베타(Amyloid beta), 타우(Tau), RAGE(receptor for advanced glycation endproducts), 알파-시누클레인(alpha-synuclein), 또는 이들의 아고니스트 또는 안타고니스트; 수용체류, 수용체 아고니스트; 세포표면항원; 단일클론 항체; 다중클론 항체; 항체 단편; 바이러스 유래 백신 항원; 하나 이상의 수용체 아고니스트를 활성화 시키는 하이브리드 폴리펩타이드 또는 키메릭 (chimeric) 폴리펩타이드; 또는 이들의 아날로그일 수 있다.
또한, 상기 톡신은 메이탄신(Maytansine) 또는 이의 유도체, 오리스타틴 (Auristatin) 또는 이의 유도체, 듀오카마이신(Duocarmycin) 또는 이의 유도체, 및 PBD(Pyrrolobenzodiazepine) 또는 이의 유도체로 이루어진 군에서 선택되고, GLP-1(Glucagon like peptide-1) 수용체 아고니스트는 천연형 GLP-1(Glucagon-like peptide-1), 천연형 GLP-2, 천연형 엑센딘-3, 천연형 엑센딘-4, 및 이들의 아날로그로 이루어진 군에서 선택된 것이며, FGF 수용체 아고니스트는 FGF1 또는 이의 아날로그, FGF19 또는 이의 아날로그, FGF21 또는 이의 아날로그, 및 FGF23 또는 이의 아날로그로 이루어진 군에서 선택되고, 인터페론은 인터페론-알파, 인터페론-베타 및 인터페론-감마로 이루어진 군에서 선택되고, 인터페론 수용체는 인터페론-알파 수용체, 인터페론-베타 수용체, 인터페론-감마 수용체, 및 수용성 타입 I 인터페론 수용체로 이루어진 군에서 선택되고, 인터루킨은 인터루킨-1, 인터루킨-2, 인터루킨-3, 인터루킨-4, 인터루킨-5, 인터루킨-6, 인터루킨-7, 인터루킨-8, 인터루킨-9, 인터루킨-10, 인터루킨-11, 인터루킨-12, 인터루킨-13, 인터루킨-14, 인터루킨-15, 인터루킨-16, 인터루킨-17, 인터루킨-18, 인터루킨-19, 인터루킨-20, 인터루킨-21, 인터루킨-22, 인터루킨-23, 인터루킨-24, 인터루킨-25, 인터루킨-26, 인터루킨-27, 인터루킨-28, 인터루킨-29, 및 인터루킨-30으로 이루어진 군에서 선택되고, 인터루킨 수용체는 인터루킨- 1 수용체 또는 인터루킨-4 수용체이고, 효소는 베타글루코시다제(beta-glucosidase), 알파갈락토시다제(alpha-galactosidase), 베타갈락토시다제(beta-galactosidase), 이두로니다제(iduronidase), 이두로네이트 2-설파타제(iduronate-2-sulfatase), 갈락토스-6-설파타제(Galactose-6-sulfatase), 산성 알파-글루코시다제(acid alpha-glucosidase), 산성 세라미다제(acid ceramidase), 산성 스핑고미엘리나제(acid sphingomyelinsase), 갈락토세레브로시다제(galactocerebrosidase), 아릴설파타제(arylsulfatase) A, 아릴설파타제 B, 베타-헥소사미니다제 (beta-hexosaminidase) A, 베타-헥소사미니다제 B, 헤파린-N-설파타제(heparin N-sulfatase), 알파-D-마노시다제(alpha-D-mannosidase), 베타-글루쿠로니다제(beta-glucuronidase), N-아세틸갈락토사민-6-설파타제(N-acetylgalactosamine-6 sulfatase), 리소좀 산성 리파제(lysosomal acid lipase), 알파-N-아세틸-글루코사미니다제(alpha-N-acetyl-glucosaminidase), 글루코세레브로시다제(glucocerebrosidase), 부티릴콜린에스터라제(butyrylcholinesterase), 키티나제(Chitinase), 글루타메이트 디카르복실라제(glutamate decarboxylase), 이미글루세라제(imiglucerase), 리파아제(lipase), 우리카제(Uricase), 혈소판활성인자 아세틸하이드로라제(Platelet-Activating Factor Acetylhydrolase), 뉴트럴 엔도펩티다제(neutral endopeptidase), 미엘로퍼옥시다제(myeloperoxidase), 알파-갈락토시다제-A, 아갈시다제 알파(agalsidase alpha), 아갈시다제 베타, 알파-L-이두로니다제(alpha-L-iduronidase), 뷰티릴콜린에스터라제(butyrylcholinesterase), 키티나제(chitinase), 글루타메이트 디카르복실라제(glutamate decarboxylase), 및 이미글루세라제(imiglucerase)로 이루어진 군에서 선택되고, 인터루킨 결합 단백질은 IL-18bp이고, 사이토카인 결합 단백질은 TNF (Tumor necrosis factor) 결합 단백질이고, 신경 성장인자류는 신경 성장인자, 모양체 신경영양인자(ciliary neurotrophic factor), 악소제네시스 인자-1(axogenesis factor-1), 뇌-나트륨 이뇨 펩타이드(brain-natriuretic peptide), 신경교 유래 신경영양인자(glial derived neurotrophic factor), 네트린(netrin), 중성구 억제인자(neutrophil inhibitory factor), 신경영양인자, 및 뉴트린(neuturin)으로 이루어진 군에서 선택되고, 미오스타틴 수용체는 TNFR(P75), TNFR(P55), IL-1 수용체, VEGF 수용체, 및 B 세포 활성인자 수용체로 이루어진 군에서 선택되고, 미오스타틴 수용체 안타고니스트는 IL1-Ra이고, 세포표면 항원은 CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD11a, CD11b, CD18, CD19, CD20, CD23, CD25, CD33, CD38, CD40, CD45 및 CD69로 이루어진 군에서 선택되고, 항체 단편류는 scFv, Fab, Fab', F(ab')2 및 Fd로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.
또한, 상기 생리활성 물질은 천연형 엑센딘-3 또는 이의 아날로그, 천연형 엑센딘-4 또는 이의 아날로그, 천연형 인슐린 또는 이의 아날로그, 천연형 GLP-1 또는 이의 아날로그, 천연형 GLP-2 또는 이의 아날로그, 천연형 옥신토모듈린 또는 이의 아날로그, 천연형 글루카곤 또는 이의 아날로그, 천연형 섬유아세포성장인자 또는 이의 아날로그, 천연형 그렐린 또는 이의 아날로그, 천연형 칼시토닌 또는 이의 아날로그, 또는 천연형 과립구 콜로니 자극인자 또는 이의 아날로그일 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.
구체적으로, 상기 생리활성 물질로서 천연형 엑센딘-3의 아날로그는 천연형 엑센딘-3의 N-말단 아민기가 제거된 엑센딘-3; 천연형 엑센딘-3의 N-말단 아민기가 하이드록실기로 치환된 엑센딘-3; 천연형 엑센딘-3의 N-말단 아민기가 디메틸기로 수식된 엑센딘-3; 천연형 엑센딘-3의 N-말단 아민기가 카르복실기로 치환된 엑센딘-3; 및 엑센딘-3의 첫 번째 아미노산(히스티딘)의 알파 탄소를 제거(deletion)한 엑센딘-3; 및 상기 엑센딘-3에서 열두 번째 아미노산(리신)이 세린으로 치환된 엑센딘-3; 및 상기 엑센딘-3의 열두 번째 아미노산(리신)이 아르기닌으로 치환된 엑센딘-3로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있고,
상기 생리활성 물질로서 천연형 엑센딘-4의 아날로그는 천연형 엑센딘-4의 N-말단 아민기가 제거된 엑센딘-4; 천연형 엑센딘-4의 N-말단 아민기가 하이드록실기로 치환된 엑센딘-4; 천연형 엑센딘-4의 N-말단 아민기가 디메틸기로 수식된 엑센딘-4; 천연형 엑센딘-4의 N-말단 아민기가 카르복실기로 치환된 엑센딘-4; 및 엑센딘-4의 첫 번째 아미노산(히스티딘)의 알파 탄소가 제거(deletion)된 엑센딘-4; 및 상기 엑센딘-4의 열두 번째 아미노산(리신)이 세린으로 치환된 엑센딘-4, 및 상기 엑센딘-4의 열두 번째 아미노산(리신)이 아르기닌으로 치환된 엑센딘-4로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있으나, 특별히 이에 제한되지 않는다.
보다 구체적으로, 상기 천연형 엑센딘-4의 아날로그는 데스-아미노-히스티딜(DA)-엑센딘-4, 베타-히드록시-이미다조-프로피오닐(HY)-엑센딘-4, 이미다조-아세틸(CA)-엑센딘-4 및 디메틸-히스티딜(DM)-엑센딘-4로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있으나, 특별히 이에 제한되지 않는다.
상기 엑센딘의 범주에 속하는 천연형 엑센딘의 유도체에 대해서는 대한민국 공개특허 제10-2009-0008151호 (국제공개특허 WO2009-011544 A2)에 자세히 기술되어 있다. 또한, 본원의 참조자료로서 상기 대한민국 공개특허 및 국제공개특허의 전문이 포함된다.
또한, 상기 생리활성 물질은 천연형 옥신토모듈린 또는 이의 유도체일 수 있다. 상기 옥신토모듈린의 범주에 속하는 천연형 옥신토모듈린의 유도체에 대해서는 대한민국 공개특허 제10-2012-0139579호 (국제공개특허 WO2012-173422 A9) 및 대한민국 공개특허 제10-2012-0137271호 (국제공개특허 　WO2012-169798 A2)에 자세히 기술되어 있다. 또한, 본원의 참조자료로서 상기 대한민국 공개특허 및 국제공개특허의 전문이 포함된다.
또한, 상기 생리활성 물질은 천연형 과립구 콜로니 자극인자이거나, 천연형 과립구 콜로니 자극인자의 유도체일 수 있다.
구체적으로, 천연형 인간 과립구 콜로니 자극인자의 1, 2, 3, 및 17번째 아미노산 중 하나 이상의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 천연형 인간 과립구 콜로니 자극인자일 수 있으며, 추가로 65번째 프롤린 잔기가 세린으로 치환된 것일 수 있다. 보다 더 구체적으로 천연형 인간 과립구 콜로니 자극인자에서 17번째 시스테인 잔기, 65번째 프롤린 잔기, 또는 이들 두 잔기의 세린으로의 치환을 포함하는 천연형 인간 과립구 콜로니 자극인자의 유도체일 수 있으나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 과립구 콜로니 자극인자의 범주에 속하는 천연형 과립구 콜로니 자극인자의 유도체에 대해서는 대한민국 공개특허 제10-2001-0009171호 (국제공개특허 WO2001-004329 A1)에 자세히 기술되어 있다. 또한, 본원의 참조자료로서 상기 대한민국 공개특허 및 국제공개특허의 전문이 포함된다.
또한, 상기 생리활성 물질은 GLP 수용체, 글루카곤 수용체, 및 GIP 수용체 중 2 이상의 수용체에 대하여 결합하는 물질일 수 있다. 상기 물질은 GLP 수용체, 글루카곤 수용체, 및 GIP 수용체 중 2 이상의 수용체에 대하여 활성을 가지는 물질일 수 있다. 즉, 해당 수용체에 물질이 결합하면, 해당 수용체가 활성을 나타낼 수 있다.
구체적으로, 글루카곤 수용체, GLP-1 수용체, 및 GIP 수용체 중 2 이상의 수용체에 대하여 결합하는 물질일 수 있으며, 보다 구체적으로 글루카곤 수용체 및 GLP-1 수용체에 대하여 결합하는 물질; GLP-1 수용체 및 GIP 수용체에 대하여 결합하는 물질; GLP-1 수용체 및 글루카곤 수용체에 대하여 결합하는 물질; 또는 글루카곤 수용체, GLP-1 수용체, 및 GIP 수용체 모두에 대하여 결합하는 물질일 수 있으나, 특별히 이에 제한되지 않는다. 상기 3개의 수용체에 대해 결합하는 물질을 삼중 작용제 (혹은 삼중 활성체)로, 2개의 수용체에 대해 결합하는 물질을 이중 작용제로 명명될 수 있다.
글루카곤 수용체, GLP-1 수용체, 및 GIP 수용체에 대해 활성을 갖는 펩타이드의 예시에 대해서는 본 출원인의 선행출원인 WO2017/116205 A1 및 WO2017/116204 A1에 기술되어 있으며, 해당 문헌의 전문은 본원에 참고자료로서 모두 포함된다.
또한, 글루카곤/GLP-1 이중 작용제의 예시에 대해서는 본 출원인의 선행출원인 WO 2015/183054 또는 WO 2016/043533 등을 들 수 있으며, 해당 문헌의 전문은 본원에 참고자료로서 모두 포함된다.
또한, 상기 생리활성 물질은 천연형 글루카곤의 유도체일 수 있다.
상기 글루카곤 유도체의 예시에 대해서는 WO 2016/108586 또는 WO2017/003191 등을 들 수 있으며, 해당 문헌의 전문은 본원에 참고자료로서 모두 포함된다.
또한, 상기 생리활성 물질은 천연형 인슐린 또는 이의 아날로그일 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 생리활성 물질은 천연형 인슐린 또는 천연형 인슐린에 비해 인슐린 수용체 결합력이 감소된, 인슐린 아날로그일 수 있다.
본 발명에서 용어, "인슐린 아날로그(insulin analog)"란 천연형 인슐린과 상이한 비천연형 인슐린을 의미한다. 상기 인슐린 아날로그는 천연형 인간 인슐린과 상이한 비천연형 인간 인슐린을 포함한다.
이러한 인슐린 아날로그는 천연형 인슐린의 일부 아미노산을 부가 및/또는 결실 및/또는 치환의 형태로 변형시킨 아날로그를 포함한다.
구체적으로, 본 발명의 인슐린 아날로그는 천연형 인슐린 서열과 서열 동일성을 비교하였을 때, 적어도 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 또는 95% 이상의 서열 동일성을 가지는 것일 수 있다. 또한, 본 발명의 인슐린 아날로그는 천연형 인슐린 서열과 상기의 서열 동일성을 가지면서, 천연형 인슐린에 비해 수용체 결합 능력이 저하된 것일 수 있다. 또한, 상기 인슐린 아날로그는 천연형 인슐린과 같이 글루코스 흡수능을 보유한 것일 수 있거나/있으며 생체 내에서 혈중 글루코스를 강하시키는 능력을 보유할 수 있다.
보다 구체적으로, 본 발명의 인슐린 아날로그는 천연형 인슐린의 인슐린 수용체 결합력 (100%)과 비교하여 약 99% 또는 그 이하, 약 95% 또는 그 이하, 약 90% 또는 그 이하, 약 85% 또는 그 이하, 약 80% 또는 그 이하, 약 75% 또는 그 이하, 약 70% 또는 그 이하, 약 65% 또는 그 이하, 약 60% 또는 그 이하, 약 55% 또는 그 이하, 약 50% 또는 그 이하, 약 45% 또는 그 이하, 약 40% 또는 그 이하, 약 35% 또는 그 이하, 약 30% 또는 그 이하, 약 25% 또는 그 이하, 약 20% 또는 그 이하, 약 15% 또는 그 이하, 약 10% 또는 그 이하, 약 9% 또는 그 이하, 약 8% 또는 그 이하, 약 7% 또는 그 이하, 약 6% 또는 그 이하, 약 5% 또는 그 이하, 약 4% 또는 그 이하, 약 3% 또는 그 이하, 약 2% 또는 그 이하, 약 1% 또는 그 이하, 또는 약 0.1% 또는 그 이하의 인슐린 수용체에 대한 결합력을 나타낼 수 있다 (다만, 본 발명의 인슐린 아날로그는 인슐린 수용체에 대한 결합력이 0%에 해당하지는 않는다). 인슐린 아날로그의 수용체 결합 능력은 재조합 인간 인슐린 수용체를 과발현하는 세포막에서 인슐린 아날로그와 요오드 125가 결합된 인슐린간의 경쟁반응을 이용하는 SPA (Scintillation Proximity Assay)법을 사용하여 평가될 수 있다.
또한, 상기 인슐린 아날로그는 인슐린 수용체에 대한 결합력 감소로 천연형 인슐린 대비 반감기가 10% 이상 증가한 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명의 인슐린 아날로그는 천연형 인슐린과 같이 글루코스 흡수능을 보유할 수 있다.
구체적으로, 본 발명에 따른 인슐린 아날로그는 천연형 인슐린의 글루코스 흡수능 (100%) 대비 약 10% 이상, 약 20% 이상, 약 30% 이상, 약 40% 이상, 약 50% 이상, 약 55% 이상, 약 60% 이상, 약 65% 이상, 약 70% 이상, 약 75% 이상, 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 95% 이상, 약 100% 이상, 약 110% 이상, 약 120% 이상, 약 130% 이상, 약 140% 이상, 약 150% 이상, 약 160% 이상, 약 170% 이상, 약 180% 이상, 약 190% 이상, 또는 약 200% 이상의 글루코스 흡수능을 보유한 것일 수 있다.
글루코스 흡수능의 측정은 당업계에 공지된 다양한 글루코스 흡수능 측정 방법을 이용하여 달성될 수 있다.
상기 인슐린 아날로그의 범주에 속하는 인슐린 아날로그에 대해서는 대한민국 공개특허 제10-2015-0087130호 (국제공개특허 WO2015-108398 A1) 및 대한민국 공개특허 제10-2017-0026284호 (국제공개특허 WO2017-039267 A1)에 자세히 기술되어 있다. 또한, 본원의 참조자료로서 상기 대한민국 공개특허 및 국제공개특허의 전문이 포함된다. 그러나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 본 발명의 인슐린 아날로그는 이외에도 대한민국 특허 공개번호 제10-2014-0106452호에 개시된 인슐린 아날로그를 모두 포함되나, 이에 제한되지 않는다. 상기 특허 명세서는 본 발명의 참조로 모두 포함된다.
구체적으로, 상기 인슐린 아날로그는 단쇄이거나, 이중쇄 (two polypeptide chains) 형태일 수 있으며, 보다 바람직하게는 이중쇄 형태이나, 특별히 이에 제한되지 않는다.
상기 이중쇄 형태인 인슐린 아날로그는 천연형 인슐린의 A-쇄에 대응되는 폴리펩타이드와 천연형 인슐린의 B-쇄에 대응되는 폴리펩타이드, 두 개의 폴리펩타이드로 구성되는 것일 수 있다. 여기서, 상기 천연형 인슐린의 A-쇄 혹은 B-쇄에 대응된다는 것은 상기 이중쇄의 폴리펩타이드 중 어느 하나인 쇄를 천연형 인슐린의 A-쇄 또는 B-쇄와 서열 동일성을 비교하였을 때, 적어도 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 또는 95% 이상의 서열 동일성을 가지는 경우를 들 수 있으며, 특별히 이에 제한되지 않으며, 이중쇄를 구성하는 서열과 천연형 인슐린의 A-쇄 혹은 B-쇄의 서열과의 비교를 통하여 당업자가 용이하게 파악할 수 있다.
천연형 인슐린은 췌장에서 분비되는 호르몬으로서 일반적으로 세포 내 글루코스 흡수를 촉진하고 지방의 분해를 억제하여 체내의 혈당을 조절하는 역할을 한다. 인슐린은 혈당조절 기능이 없는 프로인슐린(proinsulin) 전구체의 형태에서 프로세싱을 거쳐 혈당 조절 기능을 가지는 인슐린이 된다. 인슐린은 2개의 폴리펩티드 쇄, 즉 각각 21개 및 30개 아미노산 잔기를 포함하는 A-쇄 및 B-쇄로 구성되어 있고, 이들은 2개의 이황화 다리로 상호 연결되어 있다. 천연형 인슐린의 A-쇄 및 B-쇄는 각각 하기 서열번호: 1 및 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함한다.
A-쇄:
Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn (서열번호: 1)
B-쇄:
Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr (서열번호: 2)
본 발명의 일 실시양태에 따르면, 본원에 기술된 인슐린 아날로그는 천연형 인슐린과 같이 생체 내에서 혈당 조절 기능을 보유하면서 수용체 결합 능력이 저하된 것일 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 인슐린 아날로그는 생체 내에서 혈중 글루코스를 강하시키는 능력을 보유할 수 있다.
또한, 본 발명의 일 실시양태에서 상기 인슐린 아날로그는 낮은 수용체-매개 내재화(receptor-mediated internalization) 및/또는 수용체-매개 제거(receptor-mediated clearance)를 나타낼 수 있다면 특별히 그 종류 및 크기에 제한되지 않을 수 있다. 이에 따라, 본 발명의 인슐린 아날로그는 천연형 인슐린에 비해 증가된 혈중 반감기를 나타낼 수 있다.
본 발명의 인슐린 아날로그는 역방향 인슐린, 천연형 인슐린의 유도체, 천연형 인슐린의 단편 등을 포함한다. 이러한 인슐린 아날로그는 유전자 재조합법뿐만 아니라, 고상(solid phase) 방법으로도 제조할 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다. 한편, 본 발명의 인슐린 아날로그는 유전자 재조합 기술로 만든 인슐린 아날로그뿐 아니라, 본 발명은 이것에만 국한되는 것이 아니라 인슐린 수용체 결합력이 감소된 모든 인슐린 아날로그를 포함한다.
본 발명에서 용어, "천연형 인슐린의 유도체"는 천연형 인슐린과 비교하여 아미노산 서열에 하나 이상의 차이가 있는 펩타이드, 천연형 인슐린 서열을 개질(modification)을 통하여 변형시킨 펩타이드, 천연형 인슐린과 같이 생체 내의 혈당 조절 기능을 조절하는 천연형 인슐린의 모방체를 포함한다. 이러한 천연형 인슐린의 유도체는 생체 내 혈당 조절 기능을 가지는 것일 수 있다.
구체적으로, 천연형 인슐린의 유도체는 천연형 인슐린에서 일부 아미노산이 치환(substitution), 추가(addition), 제거(deletion) 및 수식(modification) 중 어느 하나의 방법 또는 이러한 방법들의 조합을 통하여 변형시킬 수 있다.
구체적으로, 천연형 인슐린의 A 쇄, B 쇄와 각각 적어도 80% 이상 아미노산 서열에서 상동성을 보이는 것일 수 있고/있거나 인슐린의 아미노산 한 잔기의 일부 그룹이 화학적으로 치환(예; alpha-methylation, alpha-hydroxylation), 제거(예; deamination) 또는 수식(예; N-methylation) 된 형태일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
유도체 제조를 위한 여러 방법들의 조합으로 본 발명에 적용되는 천연형 인슐린의 유도체를 제조할 수 있다.
또한, 천연형 인슐린의 유도체의 제조를 위한 이러한 변형은 L-형 혹은 D-형 아미노산, 및/또는 비-천연형 아미노산을 이용한 변형; 및/또는 천연형 서열을 개질 혹은 번역 후 변형 (예, 메틸화, 아실화, 유비퀴틴화, 분자 내 공유결합 등) 함으로써 변형하는 것을 모두 포함한다.
또한, 천연형 인슐린의 아미노 및/또는 카르복시 말단에 하나 또는 그 이상의 아미노산이 추가된 것을 모두 포함한다.
상기 치환되거나 추가되는 아미노산은 인간 단백질에서 통상적으로 관찰되는 20개의 아미노산뿐만 아니라 비정형 또는 비-자연적 발생 아미노산을 사용할 수 있다. 비정형 아미노산의 상업적 출처에는 Sigma-Aldrich, ChemPep과 Genzyme pharmaceuticals가 포함된다. 이러한 아미노산이 포함된 펩타이드와 정형적인 펩타이드 서열은 상업화된 펩타이드 합성 회사, 예를 들어 미국의 American peptide company나 Bachem, 또는 한국의 Anygen을 통해 합성 및 구매 가능하나, 특별히 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 용어, "천연형 인슐린 혹은 천연형 인슐린의 유도체의 단편"은 천연형 인슐린 혹은 천연형 인슐린의 유도체의 아미노 말단 혹은 카르복시 말단에 하나 또는 그 이상의 아미노산이 제거된 형태를 말한다. 이러한 인슐린 단편은 체내에서 혈당조절 기능을 보유할 수 있다.
또한, 본 발명의 인슐린 아날로그는 상기 천연형 인슐린의 유도체 및 단편의 제조에 사용된 각각의 제조 방법이 독립적으로 사용되거나, 조합되어 사용되어 제조된 것일 수 있다.
구체적으로, 본 발명에 따른 인슐린 아날로그는 상기와 같은 천연형 인슐린의 A-쇄 및 B-쇄에서 특정 아미노산 잔기의 변형을 포함하는 것으로, 구체적으로는 천연형 인슐린의 A-쇄의 특정 아미노산 잔기가 변형되고/되거나 B-쇄의 특정 아미노산 잔기가 변형된 것일 수 있다.
구체적으로, 상기 인슐린 아날로그는 천연형 인슐린에 비해 인슐린 수용체 결합력이 감소된, 천연형 인슐린의 B 쇄 또는 A 쇄의 하나 이상의 아미노산의 변이 및/또는 결실을 포함하는 인슐린 아날로그일 수 있다. 예컨대, 천연형 인슐린의 일부 아미노산을 부가, 결실, 치환 및 이들의 조합 형태로 변형시켜서 천연형 인슐린에 비해 인슐린 수용체 결합력이 감소된 것일 수 있다.
구체적으로, 상기 인슐린 아날로그는 천연형 인슐린 B쇄의 1번 아미노산, 2번 아미노산, 3번 아미노산, 5번 아미노산, 8번 아미노산, 10번 아미노산, 12번 아미노산, 16번 아미노산, 23번 아미노산, 24번 아미노산, 25번 아미노산, 26번 아미노산, 27번 아미노산, 28번 아미노산, 29번 아미노산, 30번 아미노산, A쇄의 1번 아미노산, 2번 아미노산, 5번 아미노산, 8번 아미노산, 10번 아미노산, 12번 아미노산, 14번 아미노산, 16번 아미노산, 17번 아미노산, 18번 아미노산, 19번 아미노산 및 21번 아미노산으로 이루어진 군에서 선택된 하나 또는 그 이상의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환 된 것일 수 있으며, 보다 구체적으로는 B쇄의 8번 아미노산, 23번 아미노산, 24번 아미노산, 25번 아미노산, A쇄의 1번 아미노산, 2번 아미노산, 14번 아미노산 및 19번 아미노산으로 이루어진 군에서 선택된 하나 또는 그 이상의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 것일 수 있다. 구체적으로,
상기 기술한 아미노산에서 1 이상, 2 이상, 3 이상, 4 이상, 5 이상, 6 이상, 7 이상, 8 이상, 9 이상, 10 이상, 11 이상, 12 이상, 13 이상, 14 이상, 15 이상, 16 이상, 17 이상, 18 이상, 19 이상, 20 이상, 21 이상, 22 이상, 23 이상, 24 이상, 25 이상, 26 이상, 또는 27 이상의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 기술한 위치의 아미노산 잔기들은 또한 알라닌, 글루탐산, 아스파라긴, 이소루신, 발린, 글루타민, 글라이신, 라이신, 히스티딘, 시스테인, 페닐알라닌, 트립토판, 프로린, 세린, 트레오닌 또는/및 아스파르트산으로 치환될 수 있다. 또한, 인슐린 A쇄 또는 B쇄의 하나 이상의 아미노산이 결실(deletion) 되어 인슐린 수용체 결합력이 감소한 인슐린 아날로그도 본 발명의 범주에 속하나 인슐린 수용체 결합력이 감소된 인슐린 아날로그는 제한 없이 포함될 수 있다.
보다 구체적으로, 상기 인슐린 아날로그는 하기 일반식 1으로 표시되는 서열번호 3의 A쇄와 하기 일반식 2로 표시되는 서열번호 4의 B쇄를 포함하는 것일 수 있다. 또한, 상기 A쇄 및 B쇄 서열이 이황화 결합으로 상호 연결된 형태일 수 있다. 다만, 이에 제한되는 것은 아니다.
[일반식 1]
Xaa1-Xaa2-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Xaa14-Gln-Leu-Glu-Asn-Xaa19-Cys-Asn (서열번호: 3)
상기 일반식 1에서,
Xaa1은 글리신 또는 알라닌이고,
Xaa2는 이소류신 또는 알라닌이며,
Xaa14는 타이로신, 글루탐산 또는 아스파라긴이며,
Xaa19는 타이로신 또는 알라닌임.
[일반식 2]
Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Xaa8-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Xaa23-Xaa24-Xaa25-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr (서열번호: 4)
상기 일반식 2에서,
Xaa8는 글리신 또는 알라닌이며,
Xaa23은 글리신 또는 알라닌이며,
Xaa24은 페닐알라닌 또는 알라닌이며,
Xaa25은 페닐알라닌 또는 알라닌임.
보다 더 구체적으로, 상기 인슐린 아날로그는
(i) 상기 일반식 1에서 Xaa1은 알라닌이고, Xaa2는 이소류신이며, Xaa14는 타이로신이며, Xaa19는 타이로신인 A쇄 및 상기 일반식 2에서 Xaa8는 글리신이고, Xaa23은 글리신이며, Xaa24은 페닐알라닌이며, Xaa25은 페닐알라닌인 B쇄를 포함하거나;
(ii) 상기 일반식 1에서 Xaa1은 글리신이고, Xaa2는 알라닌이며, Xaa14는 타이로신이며, Xaa19는 타이로신인 A쇄 및 상기 일반식 2에서 Xaa8는 글리신이고, Xaa23은 글리신이며, Xaa24은 페닐알라닌이며, Xaa25은 페닐알라닌인 B쇄를 포함하거나;
(iii) 상기 일반식 1에서 Xaa1은 글리신이고, Xaa2는 이소류신이며, Xaa14는 글루탐산 또는 아스파라긴이며, Xaa19는 타이로신인 A쇄 및 상기 일반식 2에서 Xaa8는 글리신이고, Xaa23은 글리신이며, Xaa24은 페닐알라닌이며, Xaa25은 페닐알라닌인 B쇄를 포함하거나;
(iv) 상기 일반식 1에서 Xaa1은 글리신이고, Xaa2는 이소류신이며, Xaa14는 타이로신이며, Xaa19는 알라닌인 A쇄 및 상기 일반식 2에서 Xaa8는 글리신이고, Xaa23은 글리신이며, Xaa24은 페닐알라닌이며, Xaa25은 페닐알라닌인 B쇄를 포함하거나;
(v) 상기 일반식 1에서 Xaa1은 글리신이고, Xaa2는 이소류신이며, Xaa14는 타이로신이며, Xaa19는 타이로신인 A쇄 및 상기 일반식 2에서 Xaa8는 알라닌이고, Xaa23는 글리신이며, Xaa24은 페닐알라닌이며, Xaa25은 페닐알라닌인 B쇄를 포함하거나;
(vi) 상기 일반식 1에서 Xaa1은 글리신이고, Xaa2는 이소류신이며, Xaa14는 타이로신이며, Xaa19는 타이로신인 A쇄 및 상기 일반식 2에서 Xaa8는 글리신이고, Xaa23는 알라닌이며, Xaa24는 페닐알라닌이며, Xaa25은 페닐알라닌인 B쇄를 포함하거나;
(vii) 상기 일반식 1에서 Xaa1은 글리신이고, Xaa2는 이소류신이며, Xaa14는 타이로신이며, Xaa19는 타이로신인 A쇄 및 상기 일반식 2에서 Xaa8는 글리신이고, Xaa23는 글리신이며, Xaa24은 알라닌이며, Xaa25은 페닐알라닌인 B쇄를 포함하거나;
(viii) 상기 일반식 1에서 Xaa1은 글리신이고, Xaa2는 이소류신이며, Xaa14는 타이로신이며, Xaa19는 타이로신인 A쇄 및 상기 일반식 2에서 Xaa8는 글리신이고, Xaa23는 글리신이며, Xaa24은 페닐알라닌이며, Xaa25은 알라닌인 B쇄를 포함하는 것일 수 있다.
또한, 상기 인슐린 아날로그는 하기 일반식 3으로 표시되는 서열번호: 5의 A쇄와 하기 일반식 4로 표시되는 서열번호: 6의 B쇄를 포함하는 것일 수 있다. 또한, 상기 A쇄 및 B쇄 서열이 이황화 결합으로 상호 연결된 형태일 수 있다. 다만, 이에 제한되는 것은 아니다.
[일반식 3]
Xaa1-Ile-Val-Glu-Xaa5-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Xaa12-Leu-Xaa14-Gln-Xaa16-Glu-Asn-Xaa19-Cys-Xaa21(서열번호: 5)
상기 일반식 3에서,
Xaa1는 알라닌, 글리신, 글루타민, 히스티딘, 글루탐산 또는 아스파라긴이고,
Xaa5는 알라닌, 글루탐산, 글루타민, 히스티딘 또는 아스파라긴이고,
Xaa12는 알라닌, 세린, 글루타민, 글루탐산, 히스티딘 또는 아스파라긴이고,
Xaa14는 알라닌, 티로신, 글루탐산, 히스티딘, 라이신, 아스파르트산 또는 아스파라긴이고,
Xaa16는 알라닌, 류신, 티로신, 히스티닌, 글루탐산 또는 아스파라긴이고,
Xaa19는 알라닌, 티로신, 세린, 글루탐산, 히스티딘, 트레오닌 또는 아스파라긴이고,
Xaa21은 아스파라긴, 글리신, 히스티딘, 또는 알라닌임.
[일반식 4]
Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Xaa16-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Xaa25-Tyr-Xaa27-Xaa28-Lys-Thr(서열번호: 6)
상기 일반식 4에서,
Xaa16은 티로신, 글루탐산, 세린, 트레오닌 또는 아스파르트산이거나, 부존재하며,
Xaa25는 페닐알라닌, 아스파트산 또는 글루탐산이거나, 부존재하며,
Xaa27는 트레오닌이거나, 부존재하며,
Xaa28은 프롤린, 글루탐산, 또는 아스파르트산이거나, 부존재함.
보다 더 구체적으로, 상기 인슐린 아날로그는
상기 일반식 3에서 Xaa1는 글리신이고, Xaa5는 글루타민이고, Xaa12는 세린이고, Xaa14는 글루탐산, 또는 아스파라긴이고, Xaa16는 류신이고, Xaa19는 티로신이고, Xaa21은 아스파라긴이며,
상기 일반식 4에서 Xaa16은 티로신이고, Xaa25는 페닐알라닌이거나, 부존재하며, Xaa27는 트레오닌이고, Xaa28은 프롤린, 글루탐산, 또는 아스파르트산이거나, 부존재하는 것을 특징으로 하는 것일 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.
보다 더 구체적으로, 상기 인슐린 아날로그는
(1) 상기 서열번호: 5의 A-쇄에서 Xaa1이 글리신이고, Xaa5가 글루타민이고, Xaa12이 세린이고, Xaa14가 글루탐산이고, Xaa16가 류신이고, Xaa19이 티로신이고, Xaa21이 아스파라긴이고,
서열번호: 6의 B-쇄에서 Xaa16이 티로신이고, Xaa25가 페닐알라닌이고, Xaa27이 트레오닌이고, Xaa28은 프롤린, 글루탐산, 또는 아스파르트산이거나, 부존재하는 것;
(2) 상기 서열번호: 5의 A-쇄에서 Xaa1이 글리신이고, Xaa5가 글루타민이고, Xaa12이 세린이고, Xaa14가 아스파라긴이고, Xaa16가 류신이고, Xaa19이 티로신이고, Xaa21이 아스파라긴이고,
서열번호: 6의 B-쇄에서 Xaa16이 티로신이고, Xaa25가 페닐알라닌이고, Xaa27이 트레오닌이고, Xaa28은 프롤린, 글루탐산, 또는 아스파르트산이거나, 부존재하는 것;
(3) 상기 서열번호: 5의 A-쇄에서 Xaa1이 글리신이고, Xaa5가 글루타민이고, Xaa12이 세린이고, Xaa14가 글루탐산이고, Xaa16가 류신이고, Xaa19이 티로신이고, Xaa21이 아스파라긴이고,
서열번호: 6의 B-쇄에서 Xaa16이 티로신이고, Xaa25가 부존재하고, Xaa27이 트레오닌이고, Xaa28은 프롤린, 글루탐산, 또는 아스파르트산이거나, 부존재하는 것; 또는
(4) 상기 서열번호: 5의 A-쇄에서 Xaa1이 글리신이고, Xaa5가 글루타민이고, Xaa12이 세린이고, Xaa14가 알라닌이고, Xaa16가 류신이고, Xaa19이 티로신이고, Xaa21이 아스파라긴이고,
서열번호: 6의 B-쇄에서 Xaa16이 글루탐산, Xaa25가 부존재하고, Xaa27이 트레오닌이고, Xaa28은 프롤린, 글루탐산, 또는 아스파르트산이거나, 부존재하는 것
을 특징으로 하는 것일 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.
보다 더 구체적으로, 상기 인슐린 아날로그는,
(1) 상기 일반식 3에서 Xaa1이 글리신이고, Xaa5가 글루타민이고, Xaa12이 세린이고, Xaa14가 글루탐산이고, Xaa16가 류신이고, Xaa19이 티로신이고, Xaa21이 아스파라긴이고,
상기 일반식 4에서 Xaa16이 티로신이고, Xaa25가 부존재하고, Xaa27이 트레오닌이고, Xaa28은 프롤린이거나;
(2) 상기 일반식 3에서 Xaa1이 글리신이고, Xaa5가 글루타민이고, Xaa12이 세린이고, Xaa14가 알라닌이고, Xaa16가 류신이고, Xaa19이 티로신이고, Xaa21이 아스파라긴이고,
상기 일반식 4에서 Xaa16이 글루탐산, Xaa25가 부존재하고, Xaa27이 트레오닌이고, Xaa28은 프롤린이거나;
(3) 상기 일반식 3에서, Xaa1는 글리신이고, Xaa5는 글루타민이고, Xaa12는 세린이고, Xaa14는 히스티딘이고, Xaa16는 류신이고, Xaa19는 티로신이고, Xaa21은 아스파라긴이며,
상기 일반식 4에서, Xaa16은 티로신이고, Xaa25는 페닐알라닌이고, Xaa27은 트레오닌이며, Xaa28은 프롤린이거나;
(4) 상기 일반식 3에서, Xaa1는 글리신이고, Xaa5는 글루타민이고, Xaa12는 세린이고, Xaa14는 라이신이고, Xaa16는 류신이고, Xaa19는 티로신이고, Xaa21은 아스파라긴이며,
상기 일반식 4에서, Xaa16은 티로신이고, Xaa25는 페닐알라닌이고, Xaa27은 트레오닌이며, Xaa28은 프롤린이거나;
(5) 상기 일반식 3에서, Xaa1는 글리신이고, Xaa5는 글루타민이고, Xaa12는 세린이고, Xaa14는 티로신이고, Xaa16는 류신이고, Xaa19는 글루탐산이고, Xaa21은 아스파라긴이며,
상기 일반식 4에서, Xaa16은 티로신이고, Xaa25는 페닐알라닌이고, Xaa27은 트레오닌이며, Xaa28은 프롤린이거나;
(6) 상기 일반식 3에서, Xaa1는 글리신이고, Xaa5는 글루타민이고, Xaa12는 세린이고, Xaa14는 티로신이고, Xaa16는 류신이고, Xaa19는 세린이고, Xaa21은 아스파라긴이며,
상기 일반식 4에서, Xaa16은 티로신이고, Xaa25는 페닐알라닌이고, Xaa27은 트레오닌이며, Xaa28은 프롤린이거나;
(7) 상기 일반식 3에서, Xaa1는 글리신이고, Xaa5는 글루타민이고, Xaa12는 세린이고, Xaa14는 티로신이고, Xaa16는 류신이고, Xaa19는 트레오닌이고, Xaa21은 아스파라긴이며,
상기 일반식 4에서, Xaa16은 티로신이고, Xaa25는 페닐알라닌이고, Xaa27은 트레오닌이며, Xaa28은 프롤린이거나;
(8) 상기 일반식 3에서, Xaa1는 글리신이고, Xaa5는 글루타민이고, Xaa12는 세린이고, Xaa14는 티로신이고, Xaa16는 류신이고, Xaa19는 티로신이고, Xaa21은 아스파라긴이며,
상기 일반식 4에서, Xaa16은 글루탐산이고, Xaa25는 페닐알라닌이고, Xaa27은 트레오닌이며, Xaa28은 프롤린이거나;
(9) 상기 일반식 3에서, Xaa1는 글리신이고, Xaa5는 글루타민이고, Xaa12는 세린이고, Xaa14는 티로신이고, Xaa16는 류신이고, Xaa19는 티로신이고, Xaa21은 아스파라긴이며,
상기 일반식 4에서, Xaa16은 세린이고, Xaa25는 페닐알라닌이고, Xaa27은 트레오닌이며, Xaa28은 프롤린이거나;
(10) 상기 일반식 3에서, Xaa1는 글리신이고, Xaa5는 글루타민이고, Xaa12는 세린이고, Xaa14는 티로신이고, Xaa16는 류신이고, Xaa19는 티로신이고, Xaa21은 아스파라긴이며,
상기 일반식 4에서, Xaa16은 트레오닌이고, Xaa25는 페닐알라닌이고, Xaa27은 트레오닌이며, Xaa28은 프롤린이거나;
(11) 상기 일반식 3에서, Xaa1는 글리신이고, Xaa5는 글루타민이고, Xaa12는 세린이고, Xaa14는 알라닌이고, Xaa16는 류신이고, Xaa19는 티로신이고, Xaa21은 아스파라긴이며,
상기 일반식 4에서, Xaa16은 티로신이고, Xaa25는 페닐알라닌이고, Xaa27은 트레오닌이며, Xaa28은 프롤린이거나;
(12) 상기 일반식 3에서, Xaa1는 글리신이고, Xaa5는 글루타민이고, Xaa12는 세린이고, Xaa14는 아스파르트산이고, Xaa16는 류신이고, Xaa19는 티로신이고, Xaa21은 아스파라긴이며,
상기 일반식 4에서, Xaa16은 티로신이고, Xaa25는 페닐알라닌이고, Xaa27은 트레오닌이며, Xaa28은 프롤린이거나;
(13) 상기 일반식 3에서, Xaa1는 글리신이고, Xaa5는 글루타민이고, Xaa12는 세린이고, Xaa14는 티로신이고, Xaa16는 류신이고, Xaa19는 티로신이고, Xaa21은 아스파라긴이며,
상기 일반식 4에서, Xaa16은 아스파르트산이고, Xaa25는 페닐알라닌이고, Xaa27은 트레오닌이며, Xaa28은 프롤린이거나;
(14) 상기 일반식 3에서, Xaa1는 글리신이고, Xaa5는 글루타민이고, Xaa12는 세린이고, Xaa14는 티로신이고, Xaa16는 류신이고, Xaa19는 티로신이고, Xaa21은 아스파라긴이며,
상기 일반식 4에서, Xaa16은 티로신이고, Xaa25는 아스파르트산이고, Xaa27은 트레오닌이며, Xaa28은 프롤린이거나;
(15) 상기 일반식 3에서, Xaa1는 글리신이고, Xaa5는 글루타민이고, Xaa12는 세린이고, Xaa14는 티로신이고, Xaa16는 류신이고, Xaa19는 티로신이고, Xaa21은 아스파라긴이며,
상기 일반식 4에서, Xaa16은 티로신이고, Xaa25는 글루탐산이고, Xaa27은 트레오닌이며, Xaa28은 프롤린인 것
을 특징으로 하는 것일 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.
그러나, 상기 예에 제한되는 것은 아니다. 그 예로, 상기 기술한 특징적인 아미노산 잔기를 포함하면서, 해당 인슐린 아날로그와 70% 이상, 구체적으로는 80% 이상, 보다 구체적으로는 90% 이상, 보다 더 구체적으로는 95% 이상의 상동성을 가지며, 천연형 인슐린에 비하여 감소된 인슐린 수용체 결합력을 가지는 펩타이드 역시 본 발명의 범주에 포함된다.
본 발명에서 용어, "상동성(homology)"은 천연형(wild type) 단백질의 아미노산 서열 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열과의 유사한 정도를 나타내기 위한 것으로서, 본 발명의 아미노산 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열과 상기와 같은 퍼센트 이상의 동일한 서열을 가지는 서열을 포함한다. 이러한 상동성은 두 서열을 육안으로 비교하여 결정할 수도 있으나, 비교대상이 되는 서열을 나란히 배열하여 상동성 정도를 분석해 주는 생물정보 알고리즘(bioinformatic algorithm)을 사용하여 결정할 수 있다. 상기 두 개의 아미노산 서열 사이의 상동성은 백분율로 표시할 수 있다. 유용한 자동화된 알고리즘은 Wisconsin Genetics Software Package (Genetics Computer Group, Madison, W, USA)의 GAP, BESTFIT, FASTA와 TFASTA 컴퓨터 소프트웨어 모듈에서 이용가능하다. 상기 모듈에서 자동화된 배열 알고리즘은 Needleman & Wunsch와 Pearson & Lipman과 Smith & Waterman 서열 배열 알고리즘을 포함한다. 다른 유용한 배열에 대한 알고리즘과 상동성 결정은 FASTP, BLAST, BLAST2, PSIBLAST와 CLUSTAL W를 포함하는 소프트웨어에서 자동화되어 있다.
상기 인슐린 아날로그를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 표준 분자생물학 기술을 이용하여 분리 또는 제조할 수 있다. 예를 들어, 적절한 프라이머 서열을 이용하여 천연형 인슐린 유전자 서열(NM_000207.2, NCBI)로부터 PCR(중합효소 연쇄반응)을 통해 증폭할 수 있고, 자동화된 DNA 합성기를 이용하는 표준 합성기술을 이용하여 제조할 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 본 발명에서 핵산과 혼용되어 사용될 수 있다.
상기 인슐린 아날로그를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 상기 기술한 A쇄 및 B쇄의 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것일 수 있다. 그러나, 상기 예에 제한되지 않는다. 그 예로, 상기 기술한 폴리뉴클레오티드 서열뿐만 아니라, 상기 서열과 70% 이상, 구체적으로는 80% 이상, 보다 구체적으로는 90% 이상, 보다 더 구체적으로는 95% 이상의 상동성을 가지며, 천연형 인슐린에 비하여 감소된 인슐린 수용체 결합력을 가지는 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 역시 본 발명의 범주에 포함된다.
한편, 상기한 천연형 인슐린 또는 이의 아날로그에 대한 결합체는 다음 화학식 2로 표시되는 것일 수 있다:
[화학식 2]
X-L-F;
여기에서,
X는 천연형 인슐린 또는 천연형 인슐린에 비해 인슐린 수용체 결합력이 감소된 인슐린 아날로그이고,
L은 링커로서, 0 kDa 초과 내지 3.4 kDa 미만의 크기를 갖는 폴리에틸렌 글리콜이며,
F는 X의 생체 내 반감기를 증가시킬 수 있는 물질임.
상기 화학식 2로 표시되는 결합체는 RMC (receptor mediated clearance)가 감소된 것일 수 있으나, 특별히 이에 제한되지 않는다.
상기 화학식 2로 표시되는 결합체에서, L은 X인 천연형 인슐린 또는 이의 아날로그의 베타 체인의 아미노 말단 영역에 연결되어 있는 것일 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.
본원에서 "N-말단 영역 또는 아미노-말단 영역"은 펩타이드 또는 단백질의 아미노 말단 영역을 의미한다. 그 예로, 이에 제한되지는 않으나, 상기 "N-말단 영역"은 N-말단 영역의 최말단 아미노산 잔기뿐만 아니라 N-말단 아미노산 잔기 주변의 아미노산 잔기를 모두 포함할 수 있으며, 구체적으로는 최말단으로부터 첫 번째 내지 20 번째의 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 그러나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.
한편, 본 발명에 따른 결합체에서 상기 X와 F는 공유 화학 결합, 비공유 화학 결합 또는 이들의 조합으로 L에 의해 서로 결합되는 것일 수 있고, 보다 구체적으로는 공유 화학 결합에 의하여 X 및 F가 L에 의하여 연결되는 것일 수 있다.
상기 화학식 1 또는 2에서 "-"는 공유 화학 결합 또는 비공유 화학 결합일 수 있고, 보다 구체적으로는 공유 화학 결합일 수 있으나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 화학식 1 또는 2의 결합체는 X, L, 및 F의 순으로 결합된 구조를 가진다.
하나의 구체적인 양태에서, 상기 L의 양 말단이 각각 F, 예컨대 면역글로불린 Fc 영역의 아민기 또는 티올기 및 X의 아민기 또는 티올기에 결합하여 상기의 결합체가 제조될 수 있다. 상기 아민기는 1차 아민 또는 2차 아민일 수 있다.
이러한 아민기는 생리활성 폴리펩타이드 또는 면역글로불린 Fc 영역과 같은 폴리펩타이드의 N-말단이나 라이신 잔기 측쇄에 위치하고, 상기 티올기는 생리활성 폴리펩타이드 또는 면역글로불린 Fc 영역과 같은 폴리펩타이드의 시스테인 잔기 측쇄에 위치할 수 있다.
상기 생리활성 폴리펩타이드 또는 면역글로불린 Fc 영역과 같은 폴리펩타이드의 아민기는 알데히드 또는 N-히드록시석시니미드 에스터와 반응하여 공유결합을 형성할 수 있다.
상기 생리활성 폴리펩타이드 또는 면역글로불린 Fc 영역과 같은 폴리펩타이드의 티올기는, 말레이미드, 요오드화 아세트아미드, 비닐술폰, 피리딜디설파이드, 또는 티올기와 반응하여 공유결합을 형성할 수 있다.
구체적으로, 결합체를 형성하기 전에, 상기 L은 양쪽 말단에 각각 F 및 X와 결합될 수 있는 반응기, 구체적으로는 X의 N-말단 또는 리신에 위치한 아민기, 또는 시스테인의 티올기 혹은 F의 N-말단 또는 리신에 위치한 아민기, 또는 시스테인의 티올기와 결합될 수 있는 반응기를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
X 및 F 모두와 결합되기 전, L은 적어도 2개의 말단 작용기를 가질 수 있으며, 구체적으로는 2개 또는 3개의 말단 작용기를 가질 수 있고, 보다 더 구체적으로는 2개의 말단 작용기를 가질 수 있다.
구체적으로, L은 적어도 2개의 말단 작용기의 종류가 모두 동일한 동종기능성(homofunctional) PEG일 수 있으며, 적어도 1개의 말단 작용기가 다른 말단 작용기와 다른 종류인, 이종기능성(heterofunctional) PEG 일 수 있다. 예컨대, 상기 PEG의 한쪽 말단은 알데히드기이고 다른 말단은 말레이미드기인, 양 말단을 가진 PEG 일 수 있다.
또한, 상기 PEG의 양 말단 또는 세 말단이 모두 알데히드기인 동종 기능성 PEG일 수 있다.
예컨대, 상기 L은 양 말단에 프로피온 알데하이드기 또는 부틸알데히드기를 가지는 PEG일 수 있으나, 특별히 이에 제한되지 않는다.
상기 L이 양 말단에 반응 알데히드기의 작용기를 갖는 경우, 비특이적 반응을 최소화하고, L의 양 말단에서 생리활성 폴리펩타이드 및 면역글로불린 Fc 영역과 각각 결합하는데 효과적이다. 알데히드 결합에 의한 환원성 아민화로 생성된 최종 산물은 아미드 결합으로 연결된 것보다 훨씬 안정적이다. 알데히드 작용기는 낮은 pH에서 N-말단에 선택적으로 반응하며, 높은 pH, 예를 들어 pH9.0 조건에서는 라이신 잔기와 공유결합을 형성할 수 있다.
상술한 L의 말단 작용기는 아민-반응성 작용기 (amine-reactive functional group) 또는 티올-반응성 작용기 (thiol-reactive functional group)일 수 있다.
보다 구체적으로, 상기 L의 적어도 하나의 말단 작용기는 각각 독립적으로 알데히드, 말레이미드, 석시니미드, 비닐술폰, 티올, C6 내지 C20 아릴디설파이드, C5 내지 C20 헤테로아릴디설파이드, 및 할로겐화 아세트아미드로 이루어진 군에서 선택될 수 있으며, 보다 구체적으로 알데히드, 말레이미드, 석시니미드, 비닐술폰, 티올, 오르토-피리딜디설파이드(Ortho-pyridyl disulfide), 및 요오드화 아세트아미드로 이루어진 군에서 각각 독립적으로 선택될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지 않는다.
상기 L의 작용기는 상기 기술된 종류뿐만 아니라, 이의 당해 분야에 알려진 이들의 유도체 및 당해 분야의 기술 수준에서 용이하게 제조할 수 있는 유도체들 역시 본 발명의 범주에 포함하는 것이다.
상기 알데히드기는 알킬 알데히드일 수 있고, 예컨대 C2-C6 알킬 알데히드일 수 있으며, 구체적으로 프로피온 알데히드기, 부틸 알데히드기 등일 수 있으나, 특별히 이에 제한되지 않는다.
상기 석시니미드기는 석시니미딜 발레르에이트, 석시니미딜 메틸부타노에이트, 석시니미딜 메틸프로피온에이트, 석시니미딜 부타노에이트, 석시니미딜 프로피오네이트, 히드록시 석시니미딜 (구체적으로, N-히드록시 석시니미딜), 석시니미딜 카르복시메틸 또는 석시니미딜 카보네이트일 수 있다. 상기 석시니미드기는 생리활성 폴리펩타이드 또는 면역글로불린 Fc 영역에 위치하는 목적하는 작용기에 결합되기 위하여 적절한 형태를 가질 수 있다. 예컨대, 상기 석시니미드기는 N-히드록시 석시니미딜 에스터일 수 있다.
또한, 양쪽 말단에 히드록시 작용기를 갖는 PEG를 이용하는 경우, 공지의 화학반응에 의해 상기 히드록시기를 상기 다양한 반응기로 활성화할 수 있다.
기존 인프레임 퓨전(inframe fusion) 방법으로 제조된 융합 단백질에서 사용된 펩타이드성 링커의 경우, 생체 내에서 단백질분해효소에 의해 쉽게 절단되어 캐리어에 의한 활성 약물의 혈중반감기 증가 효과를 기대만큼 얻을 수 없을 수도 있으므로, 본 발명에서는 비펩타이드 링커인 폴리에틸렌 글리콜을 이용하여 결합체를 제조할 수 있다. 비펩타이드 링커는 단백질분해효소에 저항성 있는 폴리에틸렌 글리콜을 사용하여 캐리어와 유사하게 펩타이드의 혈중반감기를 유지할 수 있다. 폴리에틸렌 글리콜의 분자량은 3.4 kDa 미만의 범위이나 이에 제한되지 않는다.
한편, 본 발명에서 사용되는 폴리에틸렌 글리콜의 분자량에 대해 앞서 설명한 내용이 상기한 내용 및 후술할 내용에 모두 적용된다.
본 발명에 따른 결합체에서 F는 생리활성 물질의 생체 내 반감기를 증가시킬 수 있는 물질을 말한다. 상기 용어는 본 발명에서 "생체적합성 물질" 또는 캐리어와 서로 혼용되어 사용될 수 있다.
본 발명에서 "생체적합성 물질 또는 생체 내 반감기를 증가시킬 수 있는 물질"은 상기 결합체를 구성하는 일 모이어티이다.
상기 생체적합성 물질 또는 캐리어는 목적하는 생리활성 물질에 결합되어 이의 생체 내 반감기를 연장시킬 수 있는 물질이라면 그 종류가 제한되지 않는다. 비제한적인 예로서, 상기 생체적합성 물질 또는 캐리어는 고분자 중합체, 지방산, 콜레스테롤, 알부민 및 이의 단편, 알부민 결합물질, 특정 아미노산 서열의 반복단위의 중합체, 항체, 항체 단편, FcRn 결합물질, 생체 내 결합조직, 뉴클레오타이드, 파이브로넥틴, 트랜스페린(Transferrin), 다당류(saccharide), 헤파린, 및 엘라스틴으로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다.
상기 고분자 중합체는 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 에틸렌 글리콜-프로필렌 글리콜 공중합체, 폴리옥시에틸화폴리올, 폴리비닐알콜, 폴리사카라이드, 덱스트란, 폴리비닐에틸에테르, 생분해성 고분자, 지질 중합체, 키틴, 히아루론산, 올리고뉴클레오타이드 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.
상기 생체적합성 물질 혹은 캐리어는 공유 또는 비공유 결합으로 X에 결합될 수 있다. 또한, 상기 FcRn 결합물질은 면역글로불린 Fc 영역을 포함하는 폴리펩타이드, 구체적으로 면역글로불린 Fc 영역일 수 있으며, 그 예로 IgG Fc일 수 있다.
알부민을 캐리어로 사용할 경우 알부민 혹은 알부민 단편을 직접 생리활성 물질에 링커를 통해 직접 공유결합하여 생체 내 안정성을 높일 수 있는 기술이 포함될 수 있으며 알부민을 직접 결합하지 않더라도 알부민에 결합하는 물질, 예를 들어 알부민 특이적 결합 항체 혹은 항체 단편을 생리활성 물질에 결합시켜 알부민에 결합하게 하는 기술 및 알부민에 결합력을 가진 특정 펩타이드/단백질(예를 들어혹은 Affibody사의 albumod 기술을 이용하여 생산된 알부민 결합 펩타이드)을 생리활성 물질에 결합하는 기술이 포함될 수 있으며, 알부민에 결합력을 가진 지방산 등을 결합시키는 기술들이 이에 포함될 수 있으나, 이에 한정되지 않으며, 알부민을 이용한 생체 내 안정성을 높일 수 있는 어떤 기술, 결합방식 등이 이에 포함될 수 있다.
생체 내 반감기를 증가시키기 위해 항체 혹은 항체 단편을 캐리어로 사용하여 생리활성 물질에 결합시키는 기술도 본 발명에 포함될 수 있다. FcRn 결합 부위를 같는 항체 혹은 항체 단편일 수 있으며, Fab등 FcRn 결합부위를 포함하지 않는 어떠한 항체 단편일 수 있다. Catalytic 항체를 이용하는 CovX사의 CovX-body 기술이 이에 포함될 수 있으며, 면역글로불린 Fc 영역을 이용하여 생리활성 물질의 생체 내 반감기를 증가시키는 기술도 본 발명에 포함될 수 있다.
또한, 생체 내 반감기를 증가시키기 위해 펩타이드 혹은 단백질 단편을 캐리어로 사용하여 생리활성 물질에 결합시키는 기술도 본 발명에 포함될 수 있다. 사용되는 펩타이드 혹은 단백질 단편은 특정 아미노산의 조합의 반복단위로 구성된 엘라스틴-유사 폴리펩타이드 (Elastin like polypeptide, ELP) 일수 있으며 versartis사의 인위적 폴리펩타이드 PEG인 Xten 기술도 본 발명에 포함된다. 또한 Zealand사의 멀티-라이신 (multi-Lysine)을 이용하여 생체 내 반감기를 증가시키는 SIP(Structure inducing probe) 기술도 이에 포함되며 Prolor사의 CTP 융합기술도 이에 포함되며, 생체 내 안정성이 높다고 알려진 트랜스페린(transferrin) 혹은 결합조직의 구성성분인 피브로넥틴(fibronectin) 등과 이의 유도체 등도 포함될 수 있다. 생리활성 물질에 결합시키는 펩타이드 혹은 단백질은 이에 한정되지 않으며 생리활성 물질의 생체 내 반감기를 증가시키는 어떠한 펩타이드 혹은 단백질은 본 발명의 범주에 포함된다.
또한 생체내 반감기를 증가시키기 위해 사용되는 캐리어는 다당류 혹은 지방산 등 비펩타이드성 물질일 수 있다.
면역글로불린 Fc 영역을 이용할 경우 Fc 영역과 생리활성 물질을 결합시키는 링커 및 결합방식은 폴리에틸렌글리콜을 이용한 비펩타이드성 결합일 수 있다. Fc 영역과 생리활성 물질의 결합 비는 1:1 혹은 1:2 일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 구체적으로, 상기 Fc 영역은 이량체 형태일 수 있고, 이량체 형태인 면역글로불린 Fc 영역 한 사슬에 한 분자의 생리활성 물질이 결합되거나, 이량체 형태의 면역글로불린 Fc의 두 사슬 각각에 생리활성 물질이 한 분자씩 결합된 형태일 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.
또한, 상기 결합체에서, 상기 화학식 1 또는 화학식 2에서, 상기 F가 면역글로불린 Fc 영역일 때, L은 F의 N-말단 영역에 연결되어 있는 것일 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.
면역글로불린 Fc 영역은 생체 내에서 대사되는 생분해성의 폴리펩타이드이기 때문에, 약물의 캐리어로 사용하기에 안전하다. 또한, 면역글로불린 Fc 영역은 면역글로불린 전체 분자에 비해 상대적으로 분자량이 적기 때문에 결합체의 제조, 정제 및 수율 면에서 유리할 뿐만 아니라, 아미노산 서열이 항체마다 다르기 때문에 높은 비균질성을 나타내는 Fab 부분이 제거되기 때문에 물질의 동질성이 크게 증가되고 혈중 항원성의 유발 가능성도 낮아지게 되는 효과도 기대할 수 있다
본 발명에서, "면역글로불린 Fc 영역"은, 면역글로불린의 중쇄와 경쇄 가변영역을 제외한, 중쇄 불변영역 2(CH2) 및 중쇄 불변영역 3(CH3) 부분을 포함하는 물질을 말한다.
상기 면역글로불린 Fc 영역은 중쇄 불변영역에 힌지(hinge) 부분을 포함하기도 한다. 또한 본 발명의 면역글로불린 Fc 영역은 천연형 Fc와 실질적으로 동등하거나 향상된 효과를 갖는 한, 면역글로불린의 중쇄와 경쇄 가변영역만을 제외하고, 일부 또는 전체 중쇄 불변영역 1(CH1) 및/또는 경쇄불변영역 1(CL1)을 포함하는 확장된 Fc영역일 수 있다. 또한, CH2및/또는 CH3에 해당하는 상당히 긴 일부 아미노산 서열이 제거된 영역일 수도 있다.
구체적으로, 본 발명의 면역글로불린 Fc 영역은 1) CH1 도메인, CH2 도메인, CH3 도메인 및 CH4 도메인, 2) CH1 도메인 및 CH2 도메인, 3) CH1 도메인 및 CH3 도메인, 4) CH2 도메인 및 CH3 도메인, 5) CH1 도메인, CH2 도메인, CH3 도메인 및 CH4 도메인 중 1개 또는 2개의 이상의 도메인과 면역글로불린 힌지 영역(또는 힌지 영역의 일부)와의 조합 (예, CH2 도메인 및 CH3 도메인과 힌지 영역 또는 그 일부와의 조합, 그리고 상술한 조합을 가지는 폴리펩타이드 두 개의 이량체 형태), 6) 중쇄 불변영역 각 도메인과 경쇄 불변영역의 이량체일 수 있다.
또한, 상기 면역글로불린 Fc 영역은 천연형 아미노산 서열뿐만 아니라 이의 서열 변이체(mutant)를 포함한다. 아미노산 서열 변이체란 천연 아미노산 서열 중의 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합에 의하여 상이한 서열을 가지는 것을 의미한다. 예를 들면, IgG Fc의 경우 결합에 중요하다고 알려진 214 내지 238, 297 내지 299, 318 내지 322 또는 327 내지 331번 아미노산 잔기들이 변형을 위해 적당한 부위로서 이용될 수 있다.
또한, 이황화 결합을 형성할 수 있는 부위가 제거되거나, 천연형 Fc에서 N-말단의 몇몇 아미노산이 제거되거나 또는 천연형 Fc의 N-말단에 메티오닌 잔기가 부가될 수도 있는 등 다양한 종류의 변이체가 가능하다. 또한, 이펙터 기능을 없애기 위해 보체결합부위, 예로 C1q 결합부위가 제거될 수도 있고, ADCC(antibody dependent cell mediated cytotoxicity) 부위가 제거될 수도 있다. 이러한 면역글로불린 Fc 영역의 서열 유도체를 제조하는 기술은 국제특허공개 제WO 97/34631호, 국제특허공개 제96/32478호 등에 개시되어 있다.
분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 및 펩타이드에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다 (H.Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 197 9). 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이다.
경우에 따라서는 인산화(phosphorylation), 황화(sulfation), 아크릴화 (acrylation), 당화(glycosylation), 메틸화(methylation), 파네실화(farnesylation), 아세틸화(acetylation) 및 아밀화(amidation) 등으로 수식(modification)될 수도 있다.
상기 기술한 Fc 변이체는 본 발명의 Fc 영역과 동일한 생물학적 활성을 나타내나 Fc 영역의 열, pH 등에 대한 구조적 안정성을 증대시킨 변이체다.
또한, 이러한 Fc 영역은 인간 및 소, 염소, 돼지, 마우스, 래빗, 햄스터, 랫트, 기니아 픽 등의 동물의 생체 내에서 분리한 천연형으로부터 얻어질 수도 있고, 형질전환된 동물세포 또는 미생물로부터 얻어진 재조합형 또는 이의 유도체 일 수 있다. 여기서, 천연형으로부터 획득하는 방법은 전체 면역글로불린을 인간 또는 동물의 생체로부터 분리한 후, 단백질 분해효소를 처리하여 얻을 수 있다. 파파인을 처리할 경우에는 Fab 및 Fc로 절단되고, 펩신을 처리할 경우에는 pF'c 및 F(ab)2로 절단된다. 이를 크기 배제 크로마토그래피(size-exclusion chromatography) 등을 이용하여 Fc 또는 pF'c를 분리할 수 있다.
바람직하게는 인간 유래의 Fc 영역을 미생물로부터 수득한 재조합형 면역글로불린 Fc 영역이다.
또한, 면역글로불린 Fc 영역은 천연형 당쇄, 천연형에 비해 증가된 당쇄, 천연형에 비해 감소한 당쇄 또는 당쇄가 제거된 형태일 수 있다. 이러한 면역글로불린 Fc 당쇄의 증감 또는 제거에는 화학적 방법, 효소학적 방법 및 미생물을 이용한 유전 공학적 방법과 같은 통상적인 방법이 이용될 수 있다. 여기서, Fc에서 당쇄가 제거된 면역글로불린 Fc 영역은 보체(c1q)의 결합력이 현저히 저하되고, 항체-의존성 세포독성 또는 보체-의존성 세포독성이 감소 또는 제거되므로, 생체 내에서 불필요한 면역반응을 유발하지 않는다. 이런 점에서 약물의 캐리어로서의 본래의 목적에 보다 부합하는 형태는 당쇄가 제거되거나 비당쇄화된 면역글로불린 Fc 영역이라 할 것이다.
본 발명에서 당쇄의 제거(Deglycosylation)는 효소로 당을 제거한 Fc 영역을 말하며, 비당쇄화(Aglycosylation)는 원핵동물, 바람직하게는 대장균에서 생산하여 당쇄화되지 않은 Fc 영역을 의미한다.
한편, 면역글로불린 Fc 영역은 인간 또는 소, 염소, 돼지, 마우스, 래빗, 햄스터, 랫트, 기니아 픽 등의 동물기원일 수 있으며, 바람직하게는 인간기원이다. 또한, 면역글로불린 Fc 영역은 IgG, IgA, IgD, IgE, IgM 유래 또는 이들의 조합(combination) 또는 이들의 혼성(hybrid)에 의한 Fc 영역일 수 있다. 바람직하게는 인간 혈액에 가장 풍부한 IgG 또는 IgM 유래이며 가장 바람직하게는 리간드 결합 단백질의 반감기를 향상시키는 것으로 공지된 IgG 유래이다.
한편, 본 발명에서 "조합"이란 이량체 또는 다량체를 형성할 때, 동일 기원 단쇄 면역글로불린 Fc 영역을 암호화하는 폴리펩타이드가 상이한 기원의 단쇄 폴리펩타이드와 결합을 형성하는 것을 의미한다. 즉, IgG Fc, IgA Fc, IgM Fc, IgD Fc 및 IgE의 Fc 단편으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 2개 이상의 단편으로부터 이량체 또는 다량체의 제조가 가능하다.
본 발명에서 "하이브리드(hybrid)"란 단쇄의 면역글로불린 Fc 영역 내에 2개 이상의 상이한 기원의 면역글로불린 Fc 단편에 해당하는 서열이 존재함을 의미하는 용어이다. 본 발명의 경우 여러 형태의 하이브리드가 가능하다. 즉, IgG Fc, IgM Fc, IgA Fc, IgE Fc 및 IgD Fc의 CH1, CH2, CH3 및 CH4로 이루어진 그룹으로부터 1개 내지 4개 도메인으로 이루어진 도메인의 하이브리드가 가능하며, 힌지를 포함할 수 있다.
한편, IgG 역시 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4의 서브클래스로 나눌 수 있고 본 발명에서는 이들의 조합 또는 이들의 혼성화도 가능하다. 바람직하게는 IgG2 및 IgG4 서브클래스이며, 가장 바람직하게는 보체 의존적 독성(CDC, complementdependent cytotoxicity)과 같은 이펙터 기능(effector function)이 거의 없는 IgG4의 Fc 영역이다. 즉, 가장 바람직한 본 발명의 약물의 캐리어용 면역글로불린 Fc 영역은, 인간 IgG4 유래의 비-당쇄화된 Fc 영역이다. 인간 유래의 Fc 영역은 인간 생체에서 항원으로 작용하여 이에 대한 새로운 항체를 생성하는 등의 바람직하지 않은 면역 반응을 일으킬 수 있는 비-인간 유래의 Fc 영역에 비하여 바람직하다.
보다 구체적인 하나의 양태에서, 상기 생리활성 물질 (예컨대, 천연형 인슐린 또는 인슐린 아날로그)와 생체적합성 물질은 그 사이에 개재하는 링커인 0 kDa 초과 내지 3.4 kDa 미만의 크기를 갖는 폴리에틸렌 글리콜을 통하여 연결되어 있고, 상기 생체적합성 물질은 FcRn 결합물질일 수 있으며, 그 예로 FcRn 결합물질은 면역글로불린 Fc 영역, 구체적으로는 IgG Fc 영역일 수 있다.
본 발명의 또 하나의 양태는 상기 결합체를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 결합체 및 이를 구성하는 구성요소에 대해서는 앞서 설명한 바와 같다.
하나의 구체예에서, 본 발명은
(a) 적어도 2개의 말단 작용기를 보유하는 0 kDa 초과 내지 3.4 kDa 미만의 크기를 갖는 폴리에틸렌 글리콜과 생리활성 물질 또는 생리활성 물질의 생체 내 반감기를 증가시킬 수 있는 물질 중 어느 하나를 반응시켜, 생리활성 물질 또는 생리활성 물질의 생체 내 반감기를 증가시킬 수 있는 물질 중 어느 하나가 공유결합으로 연결되어 있으며, 적어도 하나의 말단 작용기를 보유하는, 폴리에틸렌 글리콜을 제조하는 단계;
(b) 상기 (a) 단계에서 제조된 생리활성 물질 또는 이의 생체 내 반감기를 증가시킬 수 있는 물질 중 어느 하나가 공유결합으로 연결되어 있으며, 적어도 하나의 말단 작용기를 보유하는, 폴리에틸렌 글리콜과 생리활성 물질 또는 생리활성 물질의 생체 내 반감기를 증가시킬 수 있는 물질 중 다른 하나와 반응시켜,
생리활성 물질 및 이의 생체 내 반감기를 증가시킬 수 있는 물질이 0 kDa 초과 내지 3.4 kDa 미만의 크기를 갖는 폴리에틸렌 글리콜을 통하여 공유결합으로 연결된 결합체를 제조하는 단계를 포함할 수 있다.
여기서, 상기 (a) 단계는 1차 반응 단계, (b) 단계는 2차 반응 단계로 명명된다.
상기 결합체의 제조에 사용되는 생리활성 물질, 폴리에틸렌 글리콜의 크기 및 말단 작용기를 비롯한 결합체의 연결 구성에 대해서는 앞서 설명한 바와 같다.
상기 제조 방법에서 상기 생리활성 물질은 폴리에틸렌 글리콜의 말단 작용기와 반응하여 공유 결합을 형성하는 작용기를 보유하며, 상기 작용기는 아민기 또는 티올기일 수 있다.
또한, 상기 제조 방법에서 상기 생리활성 물질의 반감기를 증가시키는 물질은 폴리에틸렌 글리콜의 말단 작용기와 반응하여 공유 결합을 형성하는 작용기를 보유하며, 상기 작용기는 아민기 또는 티올기일 수 있다.
상기 제조 방법에서, 상기 폴리에틸렌 글리콜의 말단 작용기는 아민-반응성 작용기 (amine-reactive functional group) 또는 티올-반응성 작용기 (thiol-reactive functional group)일 수 있다.
상기 제조 방법에서, 상기 폴리에틸렌 글리콜의 말단 작용기는 알데히드, 말레이미드, 석시니미드, 비닐술폰, 티올, C6 내지 C20 아릴디설파이드, C5 내지 C20 헤테로아릴디설파이드, 및 할로겐화 아세트아미드로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있고, 보다 구체적으로 상기 폴리에틸렌 글리콜의 말단 작용기는 알데히드, 말레이미드, 석시니미드, 비닐술폰, 티올, 오르토-피리딜디설파이드(Ortho-pyridyl disulfide), 및 요오드화 아세트아미드로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다.
상기 석시니미드는 석시니미딜 발레르에이트, 석시니미딜 메틸부타노에이트, 석시니미딜 메틸프로피온에이트, 석시니미딜 부타노에이트, 석시니미딜 프로피오네이트, 히드록시 석시니미딜, 석시니미딜 카르복시메틸 또는 석시니미딜 카보네이트일 수 있으나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 1차 반응 단계 또는 2 차 반응 단계에서, 상기 PEG의 말단 작용기가 알데히드기인 경우, X의 아민기 또는 F의 아민기와 PEG의 알데히드기 간의 환원성 아민화 반응으로 공유결합을 형성할 수 있다. 예를 들어, F의 N-말단에 위치한 -NH2와 PEG의 알데히드기가 반응하여 공유결합을 형성할 수 있다.
이러한 환원성 아민화 반응은 환원제의 존재 하에 수행될 수 있으며, 상기 환원제는 1차 반응 단계에서는 1 내지 20mM의 최종 농도로 포함될 수 있으며, 2차 반응 단계에서는 1 내지 100mM의 최종 농도로 포함될 수 있다. 그러나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 환원제는 PEG의 작용기인 알데히드기와 폴리펩타이드(생리활성 폴리펩타이드 또는 면역글로불린 Fc 영역)의 아민기가 결합하여 생성되는 가역적 이민 이중결합을 환원시킴으로써 공유결합을 생성시킬 수 있는 당해 분야에 알려진 모든 환원제를 의미하며, 본 발명의 목적상 PEG가 생리활성 폴리펩타이드 또는 면역글로불린 Fc 영역과 공유결합될 수 있도록 하기 위하여 반응용액에 포함될 수 있다.
본 발명에서 상기 환원제는 당업계에서 통상적으로 사용하는 환원제를 모두 사용할 수 있으며, 이에 제한되지는 않으나 구체적으로는 소디움 시아노보로하이드라이드(Sodium cyanoborohydride, SCB), 보란 피리딘 콤플렉스(Borane pyridine complex), 소디움 보로하이드라이드(Sodium borohydride), 보란 디메틸아민 콤플렉스(Borane dimethylamine complex), 보란 트리메틸아민 콤플렉스(Borane trimethylamine complex) 또는 소디움 트리아세톡시보로하이드라이드(Sodium triacetoxyborohydride) 일 수 있다. 상기 환원제는 X 또는 F의 종류와 반응 용매에 따라 적합한 환원제를 자유롭게 선택할 수 있다.
한편, 상기 1차 반응 단계 또는 2 차 반응 단계에서, 상기 PEG의 말단 작용기가 말레이미드기인 경우, 상기 X의 시스테인 잔기의 티올 기 또는 F의 시스테인 잔기의 티올 기, 즉 설프히드릴기 (sulfhydryl moiety)와 PEG의 말레이미드기 간의 반응으로 공유결합 (티오에테르 결합)을 형성할 수 있다.
본 발명의 또 하나의 양태는 상기 결합체를 포함하는, 생체 내 지속성 및 안정성이 증가된 인슐린 지속성 제제를 제공한다.
상기 결합체에 대해서는 앞서 설명한 바와 같다.
한편, 생체이용율을 증가 혹은 지속적인 활성유지를 할 수 있는 제형으로서 PLGA, 히알루론산, 키토산등을 이용한 마이크로 파티클, 나노파티클 등에 의한 서방성(sustained release) 제형이 상기 제제에 포함될 수 있다.
또한, 생체 이용율을 증가 혹은 지속적인 활성유지를 할 수 있는 다른 양태의 제제로는 임플란트(implant), 흡입제(inhalation), 나잘(nasal) 제제, 패치(patch)와 같은 형태의 제제일 수 있다.
상기 지속성 제제는 생체 내 지속성 및 안정성이 천연형 생리활성 물질에 비하여 증가된 인슐린 지속성 제제일 수 있다.
생리활성 물질이 천연형 인슐린 또는 이의 아날로그인 경우, 상기 지속성 제제는 인슐린 관련 질환, 예컨대 당뇨병의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물일 수 있다. 다만, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 용어, "인슐린 관련 질환"은 인슐린의 생리활성이 없거나 낮아 발생하거나 진행하는 질환으로서, 예컨대 당뇨병을 들 수 있으나, 특별히 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 결합체를 포함한 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용되는 담체는 경구투여시에는 결합제, 활택제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소 및 향료 등을 사용할 수 있으며, 주사제의 경우에는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장화제 및 안정화제 등을 혼합하여 사용할 수 있으며, 국소투여용의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제 및 보존제 등을 사용할 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 제형은 상술한 바와 같은 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 다양하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여시에는 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭서, 서스펜션, 시럽 및 웨이퍼 등의 형태로 제조할 수 있으며, 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 형태로 제조할 수 있다. 기타, 용액, 현탁액, 정제, 환약, 캡슐 및 서방형 제제 등으로 제형화 할 수 있다.
한편, 제제화에 적합한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 또는 광물유 등이 사용될 수 있다.
또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
또한, 본 출원의 결합체는 본 출원의 조성물의 총 중량에 대하여 0.001 중량% 내지 10 중량%로 포함될 수 있으나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 하나의 양태는 상기 화학식 2로 표시되는 결합체 또는 이를 포함하는 제제를 이를 필요로 하는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 인슐린 관련 질환 치료 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 결합체는 당뇨 치료에 유용한바, 이를 포함하는 약제학적 조성물을 투여함으로써, 상기 질환의 치료를 도모할 수 있다.
본 발명에서 "투여"는, 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며, 상기 결합체의 투여 경로는 약물이 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 복강 내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여 및 직장 내 투여 등이 될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 그러나 경구 투여시, 펩타이드는 소화가 되기 때문에 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화 하는 것이 바람직하다. 바람직하게는 주사제 형태로 투여될 수 있다. 또한, 약제학적 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.
또한, 본 발명의 결합체 또는 이를 포함하는 약제학적 조성물은 치료할 질환, 투여 경로, 환자의 연령, 성별 및 체중 및 질환의 중등도 등의 여러 관련 인자와 함께, 활성성분인 약물의 종류에 따라 결정된다. 본 발명의 약제학적 조성물은 생체 내 지속성 및 역가가 우수하므로, 본 발명의 약제학적 제제의 투여 횟수 및 빈도를 현저하게 감소시킬 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
실시예 1: 인슐린-3.4 kDa PEG -면역글로불린 Fc 결합체의 제조
인슐린 분말 (Biocon, India)을 10 mM HCl에 용해시킨 후, 3.4K propion-ALD(2) PEG(양 말단에 각각 프로피온 알데하이드기를 하나씩 지니고 있는 PEG, NOF사, 미국)를 인슐린 베타 체인의 N-말단에 페길화시키기 위하여, 인슐린 : PEG의 몰 비를 1 : 4로, 인슐린 농도를 5 mg/ml로 4°C에서 약 2시간 반응시켰다. 이때 반응은 50mM 구연산 나트륨 완충액 (pH 5.0)과 45% 아이소프로판올의 혼합 용매에서, 3mM 농도의 소디움 시아노보로하이드라이드(sodium cyanoborohydride (NaCNBH3)) 환원제를 첨가하여 반응시켰다. 반응액은 구연산 나트륨 (pH 3.0), 45% EtOH가 포함된 버퍼와 KCl 농도 구배를 이용한 SP-HP(GE Healthcare) 컬럼을 사용하여 정제하였다.
다음으로, 상기 정제된 모노 페길화된(mono-PEGylated) 인슐린과 면역글로불린 Fc 단편의 몰비가 1 : 1.2가 되도록 하고, 전체 단백질 농도를 20 mg/ml로 하여 25°C에서 15시간 반응시켰다. 이때 반응액은 100mM 헤페스(HEPES) 완충액(pH 8.2)과 염화 나트륨에 환원제로서 20mM 소디움 시아노보로하이드라이드를 첨가하였다.
반응이 종결된 후 반응액은 Tris-HCl(pH 7.5) 버퍼와 NaCl 농도 구배를 이용하여 Q-HP(GE, 미국) 컬럼에 적용하고, 황산암모늄(ammoniumsulfate)과 Tris-HCl (pH 7.5)의 농도 구배를 이용하여, Source 15ISO(GE, 미국)에 적용하여, 인슐린-3.4K PEG-면역글로불린 Fc 결합체를 정제하였다.
상기 인슐린-3.4K PEG-면역글로불린 Fc 결합체는 본원에서 3.4kDa PEG 링커가 결합된 지속형 인슐린 결합체와 혼용되어 사용된다.
용출된 인슐린-3.4K PEG-면역글로불린 Fc 결합체는 SE-HPLC, RP-HPLC를 사용하여 분석하여 각각 98.5%, 97.4% 순도를 확인하였고(도 3, 4), SDS-PAGE 순도 결과는 도 1과 같다.
실시예 2: 인슐린-3.0 kDa PEG -면역글로불린 Fc 결합체의 제조
인슐린 분말 (Biocon, India)을 10 mM HCl에 용해시킨 후, 3 K butyl-ALD(2) PEG(양 말단에 각각 부틸 알데하이드기를 하나씩 지니고 있는 PEG, 한미정밀화학, 한국)를 인슐린 베타 체인과 면역글로불린 Fc의 N-말단에 페길화시키기 위하여, 위 실시예 1과 같은 페길화 반응 조건 및 정제 조건과 면역글로불린 Fc 단편과의 반응 조건 및 정제 조건을 따라 인슐린-3 kDa PEG-면역글로불린 Fc 결합체를 제조 및 정제하였다.
상기 인슐린-3 kDa PEG-면역글로불린 Fc 결합체는 본원에서 3 kDa PEG 링커가 결합된 지속형 인슐린 결합체와 혼용되어 사용된다.
용출된 인슐린-3 kDa PEG-면역글로불린 Fc 결합체는 SE-HPLC, IE-HPLC를 사용하여 분석하여 각각 99.7%. 97.9%의 순도를 확인하였다 (도 3, 4).
실시예 3: 인슐린-2.5 kDa PEG -면역글로불린 Fc 결합체의 제조
인슐린 분말 (Biocon, India)을 10 mM HCl에 용해시킨 후, 2.5K butyl-ALD(2) PEG(양 말단에 각각 부틸 알데하이드기를 하나씩 지니고 있는 PEG, 한미정밀화학, 한국)를 인슐린 베타 체인과 면역글로불린 Fc의 N-말단에 페길화시키기 위하여, 위 실시예 1과 같은 페길화 반응 조건 및 정제 조건과 면역글로불린 Fc 단편과의 반응 조건 및 정제 조건을 따라 인슐린-2.5kDa PEG-면역글로불린 Fc 결합체를 제조 및 정제하였다.
상기 인슐린-2.5kDa PEG-면역글로불린 Fc 결합체는 본원에서 2.5 kDa PEG 링커가 결합된 지속형 인슐린 결합체와 혼용되어 사용된다.
용출된 인슐린-2.5 kDa PEG-면역글로불린 Fc 결합체는 SE-HPLC, RP-HPLC를 사용하여 분석하여 각각 99.4% 및 99.4%의 순도를 확인하였다(도 3, 4).
실시예 4: 인슐린-2 kDa PEG -면역글로불린 Fc 결합체의 제조
인슐린 분말 (Biocon, India)을 10 mM HCl에 용해시킨 후, 2K butyr-ALD(2) PEG(양 말단에 각각 부틸 알데하이드기를 하나씩 지니고 있는 PEG, LAYSAN BIO사, 미국)를 인슐린 베타 체인과 면역글로불린 Fc의 N-말단에 페길화시키기 위하여, 위 실시예 1과 같은 페길화 반응 조건 및 정제 조건과 면역글로불린 Fc 단편과의 반응 조건 및 정제 조건을 따라 인슐린-2 kDa PEG-면역글로불린 Fc 결합체를 제조 및 정제하였다. 단, 반응이 종결된 후 반응액은 Tris-HCl(pH 7.5) 버퍼와 NaCl 농도 구배를 이용하여 Source 15Q(GE, 미국) 컬럼을 적용하고, 황산암모늄과 Tris-HCl (pH 7.5)의 농도 구배를 이용하여, Source 15ISO(GE, 미국)에 적용하여, 인슐린-2 kDa PEG-면역글로불린 Fc 결합체를 정제하였다.
상기 인슐린-2 kDa PEG-면역글로불린 Fc 결합체는 본원에서 2 kDa PEG 링커가 결합된 지속형 인슐린 결합체와 혼용되어 사용된다.
용출된 인슐린-2 kDa PEG-면역글로불린 Fc 결합체는 SE-HPLC, RP-HPLC를 사용하여 분석하여 각각 99.9% 및 99.4%의 순도를 확인하였다(도 3, 4).
실시예 5: 인슐린-1 kDa PEG -면역글로불린 Fc 결합체의 제조
인슐린 분말 (Biocon, 인도)을 10 mM HCl에 용해시킨 후, 1 K butyl-ALD (2) PEG (양 말단에 각각 부틸 알데하이드기를 하나씩 지니고 있는 PEG, NEKTAR사, 미국)를 인슐린 베타 체인의 N-말단에 페길화시키기 위하여, 위 실시예 1과 같은 페길화 반응 조건 및 정제 조건과 면역글로불린 Fc 단편과의 반응 조건 및 정제 조건을 따라 인슐린-1kDa PEG-면역글로불린 Fc 결합체를 제조 및 정제하였다.
상기 인슐린-1kDa PEG-면역글로불린 Fc 결합체는 본원에서 1kDa PEG 링커가 결합된 지속형 인슐린 결합체와 혼용되어 사용된다.
용출된 인슐린-1kDa PEG-면역글로불린 Fc 결합체는 SE-HPLC, RP-HPLC를 사용하여 분석하여 각각 99.8% 및 99.2%의 순도를 확인하였고(도 3, 4). SDS-PAGE 순도 결과는 도 2와 같다.
실시예 6: 지속형 인슐린 결합체의 PEG 링커 길이에 따른 정상 랫드에서의 약효지속성 효과 분석
정상 랫드에 상기에서 제조한 1 kDa, 2 kDa, 2.5 kDa, 3 kDa 또는 3.4 kDa PEG 링커가 결합된 지속형 인슐린 결합체를 투여하여 지속형 인슐린 결합체의 PEG 링커의 길이에 따른 약효지속성의 차이를 확인하였다.
8주령의 정상 랫드를 대조군(vehicle), 1 kDa PEG 링커가 결합된 지속형 인슐린 결합체 투여 군(65.1 nmol/kg), 2 kDa PEG 링커가 결합된 지속형 인슐린 결합체 투여 군(65.1 nmol/kg), 2.5 kDa PEG 링커가 결합된 지속형 인슐린 결합체 투여 군(65.1 nmol/kg), 3 kDa PEG 링커가 결합된 지속형 인슐린 결합체 투여 군(65.1 nmol/kg) 그리고 3.4 kDa PEG 링커가 결합된 지속형 인슐린 결합체(65.1 nmol/kg) 투여 군으로 각각 나누었다. 정상 랫드에 상기 시험물질을 각 군마다 3마리씩 단회 피하 투여 후 1, 4, 8, 24, 48, 및 72시간에 각각 미정맥 채혈을 통해 전혈을 1.5 mL 용량의 마이크로 튜브에 넣고 5,000 rpm으로 10분간 상온에서 원심 분리하여 혈청을 분리한 뒤, -20°C에 보관하였다. 보관된 각 군의 혈청은 ELISA 분석법을 이용하여 혈청 내 인슐린 결합체의 농도를 정량화하였다. ELISA 분석은 인슐린 단 클론 항체가 코팅된 플레이트(ALPCO, #80-INSHU-E10.1)에 각 시간에 취하여진 혈청과 항 인간 IgG4-HPR (Alpha Diagonosis, #10124)를 동시에 넣고, 한 시간 동안 상온에서 반응시킨 뒤, TMB 시약으로 발색 반응시키고, 450 nm 파장에서 흡광도를 측정하는 방식으로 하였다.
그 결과, 3.4 kDa PEG 링커가 결합된 지속형 인슐린 결합체의 투여 군에 비하여 1 kDa PEG 링커가 결합된 지속형 인슐린 결합체는 AUC가 1.84 배, 2 kDa PEG 링커가 결합된 지속형 인슐린 결합체는 1.80 배, 2.5 kDa PEG 링커가 결합된 지속형 인슐린 결합체는 1.41 배, 그리고 3 kDa PEG 링커가 결합된 지속형 인슐린 결합체는 1.43 배 증가되는 것을 확인하였다 (도 6).
이와 같은 결과들은 링커로 사용되는 폴리에틸렌 글리콜의 크기가 짧아 질수록 인슐린 결합체가 놀랍게도 생체 내에서 혈중 반감기가 증가하여 안정적인 인슐린 제제로 제공될 수 있으며 당뇨병 치료제로 효과적으로 사용될 수 있음을 시사하는 것이다.
또한, 링커로 사용되는 폴리에틸렌 글리콜의 크기가 짧아질수록 이를 이용한 생리활성 폴리펩타이드 결합체의 생체 내에서 혈중 반감기가 놀라울 정도로 증가하여 안정적인 약제로 제공될 수 있음을 시사하는 것이다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
<110> HANMI PHARM. CO., LTD. <120> Long-acting conjugate of a physiologically active material and use thereof <130> KPA170119-KR-P1 <150> KR 10-2017-0015663 <151> 2017-02-03 <150> KR 10-2017-0127187 <151> 2017-09-29 <160> 6 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 21 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu 1 5 10 15 Glu Asn Tyr Cys Asn 20 <210> 2 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr 20 25 30 <210> 3 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Insulin analog A-chain <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1) <223> Xaa is glycine or alanine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2) <223> Xaa is isoleucine or alanine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (14) <223> Xaa is tyrosine, glutamic acid, or aspargine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (19) <223> Xaa is tyrosine or alanine <400> 3 Xaa Xaa Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Xaa Gln Leu 1 5 10 15 Glu Asn Xaa Cys Asn 20 <210> 4 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Insulin B-chain <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8) <223> Xaa is glycine or alanine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (23) <223> Xaa is glycine or alanine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (24) <223> Xaa is phenylalanine or alanine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (25) <223> Xaa is phenylalanine or alanine <400> 4 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Xaa Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Xaa Xaa Xaa Tyr Thr Pro Lys Thr 20 25 30 <210> 5 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Insulin analog A-chain <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1) <223> Xaa is alanine, glycine, glutamine, histidine, glutamic acid, or asparagine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5) <223> Xaa is alanine, glutamic acid, glutamine, histidine, or asparagine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12) <223> Xaa is alanine, serine, glutamine, glutamic acid, histidine, or asparagine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (14) <223> Xaa is alanine, tyrosine, glutamic acid, histidine, lysine, aspartic acid, or asparagine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16) <223> Xaa is alanine, leucine, tyrosine, histidine, glutamic acid, or asparagine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (19) <223> Xaa is alanine, tyrosine, serine, glutamic acid, histidine, threonine or asparagine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (21) <223> Xaa is asparagine, glycine, histidine, or alanine <400> 5 Xaa Ile Val Glu Xaa Cys Cys Thr Ser Ile Cys Xaa Leu Xaa Gln Xaa 1 5 10 15 Glu Asn Xaa Cys Xaa 20 <210> 6 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Insulin analog B-chain <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16) <223> Xaa is tyrosine, glutamic acid, serine, threonine, or aspartic acid, or is absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (25) <223> Xaa is phenylalanine, aspartic acid, or glutamic acid, or is absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (27) <223> Xaa is threonine, or is absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (28) <223> Xaa is proline, glutamic acid, or aspartic acid, or is absent <400> 6 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Xaa 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Xaa Tyr Xaa Xaa Lys Thr 20 25 30

Claims (18)

  1. 하기 화학식 1을 갖는 결합체:
    [화학식 1]
    X-L-F;
    여기에서,
    X는 생리활성 물질이고,
    L은 링커로서, 0 kDa 초과 내지 3.4 kDa 미만의 크기를 갖는 폴리에틸렌 글리콜이며,
    F는 생리활성 물질의 생체 내 반감기를 증가시킬 수 있는 물질임.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 결합체는 상기 결합체와 X 및 F는 동일하고, 링커인 L이 3.4 kDa 크기를 갖는 폴리에틸렌 글리콜인 것이 다른 결합체와 비교하여, 증가된 생체 내 반감기를 나타내는, 결합체.
  3. 제1항에 있어서, 상기 L은 0kDa 초과 3kDa 이하의 크기를 갖는 폴리에틸렌 글리콜인, 결합체.
  4. 제1항에 있어서, 상기 생리활성 물질은
    톡신; 또는 GLP-1(Glucagon like peptide-1) 수용체 아고니스트; 글루카곤 수용체 아고니스트; GIP(Gastric inhibitory polypeptide) 수용체 아고니스트; FGF(Fibroblast growth factor) 수용체 아고니스트; 콜레키스토키닌 (Cholecystokinin) 수용체 아고니스트; 가스트린(gastrin) 수용체 아고니스트; 멜라노코르틴(melanocortin) 수용체 아고니스트; GLP 수용체, 글루카곤 수용체, 및 GIP 수용체 중 2 이상의 수용체에 대하여 결합하는 물질; 소마토스타틴; PYY(peptide YY); NPY(neuropeptide Y); 옥신토모듈린; 섬유아세포성장인자 (Fibroblast growth factor); 브래디키닌; 엘레도이신(Eledoisin); 옥시토신(Oxytocin); 바소프레신(vasopressin); 세르모레린(Sermorelin); 프로락틴 방출 펩타이드; 오렉신(Orexin); 갑상선 방출 펩타이드; 칼모듈린; 모틸린(Motilin); 관활성장관펩타이드(Vasoactive intestinal peptide); 심방나트륨이뇨 펩타이드(Atrial natriuretic peptide; ANP); C-형 나트륨이뇨 펩타이드(C-type natriuretic peptide; CNP); 뉴로키닌(Neurokinin) A; 뉴로메딘(Neuromedin); 레닌(Renin); 엔도텔린(Endothelin); 사라포톡신 펩타이드(Sarafotoxin peptide); 카르소모르핀 펩타이드(Carsomorphin peptide); 데모르핀(Dermorphin); 디노르핀(Dynorphin); 엔도르핀(Endorphin); 엔케팔린(Enkepalin); 종양괴사인자 수용체; 유로키나아제 수용체; 티모포이에틴(Thymopoietin); 티물린(Thymulin); 티모펜틴(Thymopentin); 티모신(Tymosin); 흉선 체액성 인자(Thymic humoral factor); 아드레노모둘린(Adrenomodullin); 알라토스타틴(Allatostatin); 아밀로이드 베타-프로테인 단편(Amyloid beta-protein fragment); 항균성 펩타이드; 항산화제 펩타이드; 봄베신(Bombesin); 오스테오칼신(Osteocalcin); CART 펩타이드; E-셀렉틴(selectin); ICAM-1 (Intercellular Adhesion Molecule 1); VCAM-1 (vascular cell adhesion molecule 1); 류코카인(Leucokine); 크링글(Kringle)-5; 라미닌(Laminin); 인히빈(Inhibin); 갈라닌(Galanin); 피브로넥틴(Fibronectin); 판크레아스타틴(Pancreastatin); 푸제온(Fuzeon); 글루카곤 유사 펩타이드; 지프로테인 관련수용체 (Gprotein-coupled receptor); 적혈구 증식인자; 백혈구 증식인자; 아밀린; 인간 성장호르몬; 성장호르몬 방출 호르몬; 성장호르몬 방출 펩타이드; 인터페론; 인터페론 수용체; 콜로니 자극인자; 인터루킨; 인터루킨 수용체; 효소; 인터루킨 결합 단백질; 사이토카인 결합 단백질; 마크로파지 활성인자; 마크로파지 펩타이드; B 세포인자; T 세포인자; 단백질 A; 알러지 억제인자; 세포 괴사 당단백질; 면역독소; 림포독소; 종양 괴사인자; 종양 억제인자; 전이 성장인자; 알파-1 안티트립신; 알부민; 알파-락트알부민(alpha-lactalbumin); 아포리포 단백질-E; 적혈구 생성 인자; 고 당쇄화 적혈구 생성인자; 안지오포이에틴(angiopoietin); 헤모글로빈; 트롬빈(thrombin); 트롬빈 수용체 활성 펩타이드; 트롬보모듈린(thrombomodulin); 혈액응고인자 VII; 혈액응고인자 VIIa; 혈액응고인자 VIII; 혈액응고인자 IX; 혈액응고인자 XIII; 플라즈미노겐 활성인자; 피브린-결합 펩타이드; 유로키나제; 스트렙토키나제; 히루딘(hirudin); 단백질 C; C-반응성 단백질; 레닌 억제제; 콜라게나제 억제제; 수퍼옥사이드 디스뮤타제; 렙틴; 혈소판 유래 성장인자; 상피세포 성장인자; 표피세포 성장인자; 안지오스타틴(angiostatin); 안지오텐신(angiotensin); 골 형성 성장인자; 골 형성 촉진 단백질; 칼시토닌; 인슐린; 아트리오펩틴; 연골 유도인자; 엘카토닌(elcatonin); 결합조직 활성인자; 조직인자 경로 억제제(tissue factor pathway inhibitor); 여포 자극 호르몬; 황체 형성 호르몬; 황체 형성 호르몬 방출 호르몬; 신경 성장인자류; 악소제네시스 인자-1(axogenesis factor-1); 뇌-나트륨 이뇨 펩타이드(brain-natriuretic peptide); 신경교 유래 신경영양인자(glial derived neurotrophic factor); 네트린(netrin); 중성구 억제인자(neutrophil inhibitory factor); 신경영양인자; 뉴트린(neuturin); 부갑상선 호르몬; 릴랙신; 시크레틴; 소마토메딘; 인슐린 유사 성장인자; 부신피질 호르몬; 글루카곤; 콜레시스토키닌; 췌장 폴리펩타이드; 가스트린 방출 펩타이드; 가스트린억제 펩타이드; 코티코트로핀 방출인자; 갑상선 자극호르몬; 오토탁신(autotaxin); 락토페린(lactoferrin); 미오스타틴(myostatin); ADNP(activity-dependent neuroprotective protein), BACE1(beta-secretase1), APP(Amyloid Precursor Protein), NCAM(Neural cell adhesion molecule), 아밀로이드 베타(Amyloid beta), 타우(Tau), RAGE(receptor for advanced glycation endproducts), 알파-시누클레인(alpha-synuclein), 또는 이들의 아고니스트 또는 안타고니스트; 수용체류, 수용체 아고니스트; 세포표면항원; 단일클론 항체; 다중클론 항체; 항체 단편; 바이러스 유래 백신 항원; 하나 이상의 수용체 아고니스트를 활성화 시키는 하이브리드 폴리펩타이드 또는 키메릭 (chimeric) 폴리펩타이드; 및 이들의 아날로그인, 결합체.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 톡신은 메이탄신(Maytansine) 또는 이의 유도체, 오리스타틴 (Auristatin) 또는 이의 유도체, 듀오카마이신(Duocarmycin) 또는 이의 유도체, 및 PBD(Pyrrolobenzodiazepine) 또는 이의 유도체로 이루어진 군에서 선택되고,
    GLP-1(Glucagon like peptide-1) 수용체 아고니스트는 천연형 GLP-1(Glucagon-like peptide-1), 천연형 엑센딘-3, 천연형 엑센딘-4, 및 이들의 아날로그로 이루어진 군에서 선택된 것이며,
    FGF 수용체 아고니스트는 FGF1 또는 이의 아날로그, FGF19 또는 이의 아날로그, FGF21 또는 이의 아날로그, 및 FGF23 또는 이의 아날로그로 이루어진 군에서 선택되고,
    인터페론은 인터페론-알파, 인터페론-베타 및 인터페론-감마로 이루어진 군에서 선택되고,
    인터페론 수용체는 인터페론-알파 수용체, 인터페론-베타 수용체, 인터페론-감마 수용체, 및 수용성 타입 I 인터페론 수용체로 이루어진 군에서 선택되고,
    인터루킨은 인터루킨-1, 인터루킨-2, 인터루킨-3, 인터루킨-4, 인터루킨-5, 인터루킨-6, 인터루킨-7, 인터루킨-8, 인터루킨-9, 인터루킨-10, 인터루킨-11, 인터루킨-12, 인터루킨-13, 인터루킨-14, 인터루킨-15, 인터루킨-16, 인터루킨-17, 인터루킨-18, 인터루킨-19, 인터루킨-20, 인터루킨-21, 인터루킨-22, 인터루킨-23, 인터루킨-24, 인터루킨-25, 인터루킨-26, 인터루킨-27, 인터루킨-28, 인터루킨-29, 및 인터루킨-30으로 이루어진 군에서 선택되고,
    인터루킨 수용체는 인터루킨- 1 수용체 또는 인터루킨-4 수용체이고,
    효소는 베타글루코시다제(beta-glucosidase), 알파갈락토시다제(alpha-galactosidase), 베타갈락토시다제(beta-galactosidase), 이두로니다제(iduronidase), 이두로네이트 2-설파타제(iduronate-2-sulfatase), 갈락토스-6-설파타제(Galactose-6-sulfatase), 산성 알파-글루코시다제(acid alpha-glucosidase), 산성 세라미다제(acid ceramidase), 산성 스핑고미엘리나제(acid sphingomyelinsase), 갈락토세레브로시다제(galactocerebrosidase), 아릴설파타제(arylsulfatase) A, 아릴설파타제 B, 베타-헥소사미니다제 (beta-hexosaminidase) A, 베타-헥소사미니다제 B, 헤파린-N-설파타제(heparin N-sulfatase), 알파-D-마노시다제(alpha-D-mannosidase), 베타-글루쿠로니다제(beta-glucuronidase), N-아세틸갈락토사민-6-설파타제(N-acetylgalactosamine-6 sulfatase), 리소좀 산성 리파제(lysosomal acid lipase), 알파-N-아세틸-글루코사미니다제(alpha-N-acetyl-glucosaminidase), 글루코세레브로시다제(glucocerebrosidase), 부티릴콜린에스터라제(butyrylcholinesterase), 키티나제(Chitinase), 글루타메이트 디카르복실라제(glutamate decarboxylase), 이미글루세라제(imiglucerase), 리파아제(lipase), 우리카제(Uricase), 혈소판활성인자 아세틸하이드로라제(Platelet-Activating Factor Acetylhydrolase), 뉴트럴 엔도펩티다제(neutral endopeptidase), 미엘로퍼옥시다제(myeloperoxidase), 알파-갈락토시다제-A, 아갈시다제 알파(agalsidase alpha), 아갈시다제 베타, 알파-L-이두로니다제(alpha-L-iduronidase), 뷰티릴콜린에스터라제(butyrylcholinesterase), 키티나제(chitinase), 글루타메이트 디카르복실라제(glutamate decarboxylase), 및 이미글루세라제(imiglucerase)로 이루어진 군에서 선택되고,
    인터루킨 결합 단백질은 IL-18bp이고,
    사이토카인 결합 단백질은 TNF (Tumor necrosis factor) 결합 단백질이고,
    신경 성장인자류는 신경 성장인자, 모양체 신경영양인자(ciliary neurotrophic factor), 악소제네시스 인자-1(axogenesis factor-1), 뇌-나트륨 이뇨 펩타이드(brain-natriuretic peptide), 신경교 유래 신경영양인자(glial derived neurotrophic factor), 네트린(netrin), 중성구 억제인자(neutrophil inhibitory factor), 신경영양인자, 및 뉴트린(neuturin)으로 이루어진 군에서 선택되고,
    미오스타틴 수용체는 TNFR(P75), TNFR(P55), IL-1 수용체, VEGF 수용체, 및 B 세포 활성인자 수용체로 이루어진 군에서 선택되고,
    미오스타틴 수용체 안타고니스트는 IL1-Ra이고,
    세포표면 항원은 CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD11a, CD11b, CD18, CD19, CD20, CD23, CD25, CD33, CD38, CD40, CD45 및 CD69로 이루어진 군에서 선택되고,
    항체 단편류는 scFv, Fab, Fab', F(ab')2 및 Fd로 이루어진 군에서 선택되는,
    결합체.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 생리활성 물질은 천연형 엑센딘-3 또는 이의 아날로그, 천연형 엑센딘-4 또는 이의 아날로그, 천연형 인슐린 또는 이의 아날로그, 천연형 GLP-1 또는 이의 아날로그, 천연형 GLP-2 또는 이의 아날로그, 천연형 옥신토모듈린 또는 이의 아날로그, 천연형 글루카곤 또는 이의 아날로그, 천연형 섬유아세포성장인자 또는 이의 아날로그, 천연형 그렐린 또는 이의 아날로그, 천연형 칼시토닌 또는 이의 아날로그, 천연형 과립구 콜로니 자극인자 또는 이의 아날로그, 또는 GLP 수용체, 글루카곤 수용체, 및 GIP 수용체 중 2 이상의 수용체에 대하여 결합하는 물질; 인, 결합체.
  7. 제1항에 있어서, 상기 생리활성 물질은 천연형 인슐린 또는 천연형 인슐린에 비해 인슐린 수용체 결합력이 감소된 인슐린 아날로그인, 결합체.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 인슐린 아날로그는 천연형 인슐린에 비해 감소된 인슐린 수용체 결합력을 가지고, 천연형 인슐린의 B쇄 또는 A쇄의 하나 이상의 아미노산의 변이 또는 결실을 포함하는 것인, 결합체.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 인슐린 아날로그는 인슐린 B쇄의 1번 아미노산, 2번 아미노산, 3번 아미노산, 5번 아미노산, 8번 아미노산, 10번 아미노산, 12번 아미노산, 16번 아미노산, 23번 아미노산, 24번 아미노산, 25번 아미노산, 26번 아미노산, 27번 아미노산, 28번 아미노산, 29번 아미노산, 30번 아미노산, A쇄의 1번 아미노산, 2번 아미노산, 5번 아미노산, 8번 아미노산, 10번 아미노산, 12번 아미노산, 14번 아미노산, 16번 아미노산, 17번 아미노산, 18번 아미노산, 19번 아미노산 및 21번 아미노산으로 이루어진 군에서 선택된 하나 또는 그 이상의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환되거나 결실된 것인, 결합체.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 인슐린 아날로그는 천연형 인슐린 B쇄의 8번 아미노산, 23번 아미노산, 24번 아미노산, 25번 아미노산, 천연형 인슐린 A쇄의 1번 아미노산, 2번 아미노산, 14번 아미노산 및 19번 아미노산으로 이루어진 군에서 선택된 하나 또는 그 이상의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 것인, 결합체.
  11. 제10항에 있어서, 상기 치환하는 다른 아미노산은 알라닌, 글루탐산, 아스파라긴, 이소루신, 발린, 글루타민, 글리신, 라이신, 히스티딘, 시스테인, 페닐알라닌, 트립토판, 프로린, 세린, 트레오닌 및 아스파르트산으로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 결합체.
  12. 제1항에 있어서,
    F는 고분자 중합체, 지방산, 콜레스테롤, 알부민 및 이의 단편, 알부민 결합물질, 특정 아미노산 서열의 반복단위의 중합체, 항체, 항체 단편, FcRn 결합물질, 생체 내 결합조직, 뉴클레오타이드, 파이브로넥틴, 트랜스페린(Transferrin), 다당류(saccharide), 헤파린, 및 엘라스틴으로 이루어진 군에서 선택되는, 결합체.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 고분자 중합체는 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 에틸렌 글리콜-프로필렌 글리콜 공중합체, 폴리옥시에틸화폴리올, 폴리비닐알콜, 폴리사카라이드, 덱스트란, 폴리비닐에틸에테르, 생분해성 고분자, 지질 중합체, 키틴, 히아루론산, 올리고뉴클레오타이드 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 결합체.
  14. 제1항에 있어서,
    상기 F는 면역글로불린 Fc 영역인, 결합체.
  15. 제1항에 있어서,
    F는 IgG Fc 영역인 것인, 결합체.
  16. (a) 적어도 2개의 말단 작용기를 보유하는 0 kDa 초과 내지 3.4 kDa 미만의 크기를 갖는 폴리에틸렌 글리콜과 생리활성 물질 또는 생리활성 물질의 생체 내 반감기를 증가시킬 수 있는 물질 중 어느 하나를 반응시켜, 생리활성 물질 또는 생리활성 물질의 생체 내 반감기를 증가시킬 수 있는 물질 중 어느 하나가 공유결합으로 연결되어 있으며, 적어도 하나의 말단 작용기를 보유하는, 폴리에틸렌 글리콜을 제조하는 단계;
    (b) 상기 (a) 단계에서 제조된 폴리에틸렌 글리콜과 생리활성 물질 또는 생리활성 물질의 생체 내 반감기를 증가시킬 수 있는 물질 중 다른 하나와 반응시켜,
    생리활성 물질 및 이의 생체 내 반감기를 증가시킬 수 있는 물질이 0 kDa 초과 내지 3.4 kDa 미만의 크기를 갖는 폴리에틸렌 글리콜을 통하여 공유결합으로 연결된 결합체를 제조하는 단계를 포함하는,
    제1항의 결합체의 제조 방법.
  17. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 결합체를 포함하는, 생체 내 지속성 및 안정성이 증가된 지속성 제제.
  18. 제7항 내지 제11항 중 어느 한 항의 결합체를 포함하는, 당뇨병의 예방 또는 치료용 제제.
KR1020180013528A 2017-02-03 2018-02-02 지속성이 증가된 생리활성 물질의 결합체 및 이의 용도 KR102645064B1 (ko)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020170015663 2017-02-03
KR20170015663 2017-02-03
KR1020170127187 2017-09-29
KR20170127187 2017-09-29

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20180090760A true KR20180090760A (ko) 2018-08-13
KR102645064B1 KR102645064B1 (ko) 2024-03-08

Family

ID=63040216

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020180013528A KR102645064B1 (ko) 2017-02-03 2018-02-02 지속성이 증가된 생리활성 물질의 결합체 및 이의 용도

Country Status (11)

Country Link
US (1) US20200230250A1 (ko)
EP (1) EP3578204A4 (ko)
JP (2) JP2020506932A (ko)
KR (1) KR102645064B1 (ko)
CN (1) CN110545849A (ko)
AU (1) AU2018215840A1 (ko)
BR (1) BR112019016077A2 (ko)
CA (1) CA3052410A1 (ko)
MX (1) MX2019009149A (ko)
TW (1) TW201831207A (ko)
WO (1) WO2018143729A1 (ko)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2020130751A1 (ko) * 2018-12-21 2020-06-25 한미약품 주식회사 인슐린 및 글루카곤을 포함하는 약학 조성물
WO2020130749A1 (ko) * 2018-12-21 2020-06-25 한미약품 주식회사 글루카곤, glp-1 및 gip 수용체 모두에 활성을 갖는 삼중 활성체 및 인슐린을 포함하는 약학 조성물
WO2022080986A1 (ko) * 2020-10-16 2022-04-21 한미약품 주식회사 Glp-1/gip 이중작용제, 이의 지속형 결합체, 및 이를 포함하는 약학적 조성물
KR20240121674A (ko) 2023-02-01 2024-08-09 주식회사 에이티지씨 생체 내 지속성이 증가된 생리활성물질의 결합체

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3675892A4 (en) 2017-07-03 2021-10-06 Torque Therapeutics, Inc. IMMUNOSTIMULATORY FUSION MOLECULES AND THEIR USES
SG11202106168VA (en) 2018-12-11 2021-07-29 Sanofi Sa Insulin analogs having reduced insulin receptor binding affinity
CN111909256A (zh) * 2019-05-10 2020-11-10 宁波鲲鹏生物科技有限公司 多肽衍生物及其制备方法
WO2022030580A1 (ja) * 2020-08-06 2022-02-10 国立大学法人宮崎大学 長時間作用型新規アドレノメデュリン誘導体、その製造方法及びその医薬用途
WO2023173086A1 (en) * 2022-03-11 2023-09-14 Avirmax Biopharma Inc. Compositions and methods for expressing therapeutics

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20150138101A (ko) * 2014-05-29 2015-12-09 한미약품 주식회사 지속형 인슐린 아날로그 결합체 및 지속형 인슐린 분비 펩타이드 결합체를 포함하는 당뇨병 치료용 조성물

Family Cites Families (31)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6096871A (en) 1995-04-14 2000-08-01 Genentech, Inc. Polypeptides altered to contain an epitope from the Fc region of an IgG molecule for increased half-life
EP0904107B1 (en) 1996-03-18 2004-10-20 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobin-like domains with increased half lives
KR100356140B1 (ko) 1999-07-08 2002-10-19 한미약품공업 주식회사 인간 과립구 콜로니 자극인자 변이체 및 이의 생산 방법
WO2005047334A1 (en) * 2003-11-13 2005-05-26 Hanmi Pharmaceutical. Co., Ltd. Igg fc fragment for a drug carrier and method for the preparation thereof
JP2008169195A (ja) * 2007-01-05 2008-07-24 Hanmi Pharmaceutical Co Ltd キャリア物質を用いたインスリン分泌ペプチド薬物結合体
JP2009019027A (ja) 2007-07-16 2009-01-29 Hanmi Pharmaceutical Co Ltd アミノ末端のアミノ酸が変異したインスリン分泌ペプチド誘導体
US9981017B2 (en) * 2010-04-02 2018-05-29 Hanmi Science Co., Ltd. Insulin conjugate using an immunoglobulin fragment
AR081066A1 (es) * 2010-04-02 2012-06-06 Hanmi Holdings Co Ltd Conjugado de insulina donde se usa un fragmento de inmunoglobulina
KR101324828B1 (ko) * 2010-06-08 2013-11-01 한미사이언스 주식회사 면역글로불린 단편을 이용한 단쇄 인슐린 아날로그 약물 결합체
UA113626C2 (xx) * 2011-06-02 2017-02-27 Композиція для лікування діабету, що містить кон'югат інсуліну тривалої дії та кон'югат інсулінотропного пептиду тривалої дії
EP3434687B1 (en) 2011-06-10 2021-03-10 Hanmi Science Co., Ltd. Novel oxyntomodulin derivatives and pharmaceutical composition for treating obesity comprising the same
CN109306015B (zh) 2011-06-17 2022-04-26 韩美科学株式会社 包括泌酸调节肽和免疫球蛋白片段的结合物以及其应用
EP3616727B1 (en) * 2013-02-26 2021-03-31 Hanmi Pharm. Co., Ltd. Insulin analog conjugates and use thereof
KR101895634B1 (ko) * 2013-05-31 2018-09-05 한미약품 주식회사 변이된 힌지 영역을 포함하는 IgG4 Fc 단편
PE20161153A1 (es) 2014-01-20 2016-10-27 Hanmi Pharm Ind Co Ltd Insulina de accion prolongada y uso de la misma
ES2897935T3 (es) * 2014-03-31 2022-03-03 Hanmi Pharm Ind Co Ltd Método para mejorar la solubilidad de proteína y péptido mediante el uso del enlace a un fragmento Fc de inmunoglobulina
AR100695A1 (es) 2014-05-30 2016-10-26 Hanmi Pharm Ind Co Ltd Composición para el tratamiento de diabetes mellitus que comprende insulina y un agonista dual glp-1 / glucagón
KR20150140177A (ko) * 2014-06-05 2015-12-15 한미약품 주식회사 단백질 및 펩타이드의 면역원성을 감소시키는 방법
KR20160001391A (ko) * 2014-06-27 2016-01-06 한미약품 주식회사 신규한 지속형 인슐린 아날로그 결합체 및 이의 용도
KR20160007295A (ko) * 2014-07-11 2016-01-20 한미약품 주식회사 인슐린 아날로그
TWI772252B (zh) 2014-09-16 2022-08-01 南韓商韓美藥品股份有限公司 長效glp-1/高血糖素受體雙促效劑治療非酒精性脂肝疾病之用途
US11135271B2 (en) 2014-12-30 2021-10-05 Hanmi Pharm. Co., Ltd. Glucagon derivatives with improved stability
EP3322437B1 (en) 2015-06-30 2024-01-17 Hanmi Pharm. Co., Ltd. Glucagon derivative and a composition comprising a long acting conjugate of the same
UY36870A (es) 2015-08-28 2017-03-31 Hanmi Pharm Ind Co Ltd Análogos de insulina novedosos
KR102231217B1 (ko) * 2015-09-24 2021-03-24 한미약품 주식회사 면역글로불린 단편의 특정 위치를 연결 부위로 이용한 단백질 결합체
TW201718629A (zh) * 2015-09-25 2017-06-01 韓美藥品股份有限公司 包含多個生理多肽及免疫球蛋白Ｆｃ區之蛋白質接合物
BR112018013525A2 (pt) 2015-12-31 2018-12-04 Hanmi Pharm. Co., Ltd. conjugado de longa atuação de agonista de receptor de glucagon/glp-1/gip triplo e composição farmacêutica
SG11201811697SA (en) * 2016-06-29 2019-01-30 Hanmi Pharmaceutical Co Ltd Glucagon derivative, conjugate thereof, composition comprising same and therapeutic use thereof
US20200078470A1 (en) * 2016-12-05 2020-03-12 Hanmi Pharm. Co., Ltd. Conjugate with attenuated immune response
CA3054899A1 (en) * 2017-03-23 2018-09-27 Hanmi Pharm. Co., Ltd. Insulin analog complex with reduced affinity for insulin receptor and use thereof
KR20190038456A (ko) * 2017-09-29 2019-04-08 한미약품 주식회사 효력이 향상된 지속성 단백질 결합체

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20150138101A (ko) * 2014-05-29 2015-12-09 한미약품 주식회사 지속형 인슐린 아날로그 결합체 및 지속형 인슐린 분비 펩타이드 결합체를 포함하는 당뇨병 치료용 조성물

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2020130751A1 (ko) * 2018-12-21 2020-06-25 한미약품 주식회사 인슐린 및 글루카곤을 포함하는 약학 조성물
WO2020130749A1 (ko) * 2018-12-21 2020-06-25 한미약품 주식회사 글루카곤, glp-1 및 gip 수용체 모두에 활성을 갖는 삼중 활성체 및 인슐린을 포함하는 약학 조성물
CN113365651A (zh) * 2018-12-21 2021-09-07 韩美药品株式会社 包含胰岛素和胰高血糖素的药物组合物
US20220088148A1 (en) * 2018-12-21 2022-03-24 Hanmi Pharm, Co., Ltd. A pharmaceutical composition comprising insulin and trigonal glucagon/glp-1/gip receptor agonist
WO2022080986A1 (ko) * 2020-10-16 2022-04-21 한미약품 주식회사 Glp-1/gip 이중작용제, 이의 지속형 결합체, 및 이를 포함하는 약학적 조성물
KR20240121674A (ko) 2023-02-01 2024-08-09 주식회사 에이티지씨 생체 내 지속성이 증가된 생리활성물질의 결합체

Also Published As

Publication number Publication date
WO2018143729A1 (ko) 2018-08-09
CN110545849A (zh) 2019-12-06
JP2022190132A (ja) 2022-12-22
US20200230250A1 (en) 2020-07-23
MX2019009149A (es) 2019-10-14
TW201831207A (zh) 2018-09-01
KR102645064B1 (ko) 2024-03-08
RU2019126074A3 (ko) 2021-05-20
AU2018215840A1 (en) 2019-08-01
BR112019016077A2 (pt) 2020-03-31
JP2020506932A (ja) 2020-03-05
CA3052410A1 (en) 2018-08-09
EP3578204A1 (en) 2019-12-11
EP3578204A4 (en) 2021-01-06
RU2019126074A (ru) 2021-03-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR102645064B1 (ko) 지속성이 증가된 생리활성 물질의 결합체 및 이의 용도
US11040110B2 (en) Polypeptide complex comprising non-peptidyl polymer having three functional ends
CN110876808B (zh) 具有降低的受体介导的清除率的生物活性多肽单体-免疫球蛋白Fc片段缀合物及制备方法
KR20170037564A (ko) 다수의 생리활성 폴리펩타이드 및 면역글로불린 Fc 영역을 포함하는, 단백질 결합체
JP2018531237A6 (ja) 多数の生理活性ポリペプチド及び免疫グロブリンＦｃ領域を含む、タンパク質結合体
CN110339369B (zh) 制备生理活性多肽复合物的改进方法
US10660940B2 (en) Preparation method for high-yield production of physiologically active polypeptide conjugate
RU2773823C2 (ru) Конъюгат физиологически активного вещества длительного действия и его применение
NZ716251B2 (en) Conjugate of biologically active polypeptide monomer and immunoglobulin fc fragment with reduced receptor-mediated clearance, and the method for preparing the same

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant