KR102231217B1 - 면역글로불린 단편의 특정 위치를 연결 부위로 이용한 단백질 결합체 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 면역글로불린 Fc 영역을 캐리어로 사용시 면역글로불린 Fc의 결합부위를 N 말단 특이적으로 하여 결합체의 결합 위치 이성체를 최소화한 결합체 조성물에 관한 것이다. 또한, 면역글로불린 Fc의 결합부위를 N 말단 특이적으로 하여 생리활성 폴리펩타이드의 혈중 반감기를 연장시키고 생체 내 역가를 높게 유지하며, 면역 반응 유발의 위험이 없는 단백질 결합체, 이를 제조하는 방법 및 이를 포함하는 생리활성 폴리펩타이드의 생체 내 지속성 및 안정성 증가용 약학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 의하여 제조된 단백질 결합체는 다양한 생리활성 폴리펩타이드 약물의 지속형 제제 개발에 유용하게 이용될 수 있다.

Description

면역글로불린 단편의 특정 위치를 연결 부위로 이용한 단백질 결합체 {Protein complex by use of a specific site of an immunoglobulin fragment for linkage}
본 발명은 면역글로불린 Fc 단편이 비펩타이드성 중합체를 통하여 생리활성 폴리펩타이드에 연결된 단백질 결합체에 있어서, 비펩타이드성 중합체가 면역글로불린 Fc의 N-말단에 특이적으로 연결된 결합체, 이의 제조 방법 및 이를 포함하는 생리활성 폴리펩타이드의 생체 내 지속성 및 안정성 증가용 약학적 조성물에 관한 것이다. 또한, 상기 방법에 따라 제조된 단백질 결합체를 포함하는 단백질 결합체의 집합체에 관한 것이다.
폴리펩타이드는 일반적으로 안정성이 낮아 쉽게 변성되고 혈액 내 단백질 가수분해효소에 의해 분해되어 신장이나 간을 통해 쉽게 제거되기 때문에, 약리성분으로 폴리펩타이드를 포함하는 단백질 의약품의 혈중 농도 및 역가를 유지하기 위해서는 단백질 약물을 환자에게 자주 투여할 필요가 있다. 그러나 대부분 주사제 형태로 환자에게 투여되는 단백질 의약품의 경우, 활성 폴리펩타이드의 혈중 농도를 유지하기 위해 자주 주사를 놓는 것은 환자에게 엄청난 고통을 야기하게 된다. 이러한 문제점을 해결하기 위해, 단백질 약물의 혈중 안정성을 증가시키고 혈중 약물 농도를 오랫동안 높게 지속시켜 약효를 극대화하려는 노력이 계속되어 왔다. 이러한 단백질 약물의 지속성 제제는 단백질 약물의 안정성을 높이는 동시에 약물 자체의 역가가 충분히 높게 유지되어야 하고 환자에게 면역반응을 유발하지 않아야 한다.
단백질을 안정화시키고 단백질 가수분해효소와의 접촉 및 신장 소실을 억제하기 위한 방법으로, 종래에는 폴리에틸렌글리콜 (polyethylene glycol: 이하 "PEG"라 약칭함)과 같이 용해도가 높은 고분자를 단백질 약물 표면에 화학적으로 부가시키는 방법이 사용되어 왔다. PEG는 목적 단백질의 특정 부위 또는 다양한 부위에 비특이적으로 연결하여 용해도를 높임으로써 단백질을 안정화시키고, 단백질의 가수분해를 방지하는데 효과가 있으며 특별한 부작용도 일으키지 않는 것으로 알려져 있다 (Sada et al., J. Fermentation Bioengineering 71: 137-139, 1991). 그러나 PEG를 연결시키는 경우에 단백질의 안정성은 증가할 수 있지만 생리활성 단백질의 역가가 현저히 낮아지고, PEG의 분자량이 증가할수록 단백질과의 반응성이 낮아져 수율이 감소하는 문제가 있다. PEG를 단백질에 연결시킬 때 발생할 수 있는 또 다른 문제는 연결이 가능한 여러 위치들이 경쟁함으로 인하여 발생하는 결합체의 연결 위치 이성질화이다.
이는 PEG를 사용하는 결합체 약물의 제조에서 중요한 부분으로, 최대한의 효력과 효과를 갖게 하는 조건으로 제조된 균질한 약물이 요구된다. 약물의 효력에 영향을 주는 결합 위치에 PEG가 결합한 유연 물질이 과량 포함된 경우 원치 않는 효력의 감소를 야기할 수 있다.
이에 본 발명자는 생리활성 폴리펩타이드 결합체를 대량 생산에 적합한 공정으로 효력이 가장 높은 부위로 결합된 결합체를 제조할 수 있는 방법을 연구한 결과, 캐리어로 포함되는 면역글로불린 Fc 단편의 결합 위치를 특정하여 효력이 가장 높은 결합체를 고순도로 제조하는 방법을 발명하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 생리활성 폴리펩타이드 및 면역글로불린 Fc 단편이 비펩타이드성 중합체를 통하여 연결된 단백질 결합체로서, 상기 비펩타이드성 중합체는 면역글로불린 Fc 단편의 N 말단에 위치 특이적으로 결합한 것인, 단백질 결합체를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 하나의 목적은, 상기 단백질 결합체를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은, 상기 단백질 결합체를 유효성분으로 포함하는 생리활성 폴리펩타이드의 생체 내 지속성 및 안정성 증가용 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 일 양태는 생리활성 폴리펩타이드 및 면역글로불린 Fc 영역이 비펩타이드성 중합체를 통하여 연결된 단백질 결합체로서, 상기 비펩타이드성 중합체는 면역글로불린 Fc 영역의 N 말단에 위치 특이적으로 결합한 것인, 단백질 결합체를 제공한다.
본 발명의 하나의 구체예는 상기 비펩타이드성 중합체가 양 말단 반응기를 통해 생리활성 폴리펩타이드 및 면역글로불린 Fc 영역과 각각 공유결합으로 연결되는 것인, 단백질 결합체를 제공한다.
본 발명의 다른 하나의 구체예는 상기 면역글로불린 Fc 영역이 비당쇄화됨을 특징으로 하는, 단백질 결합체를 제공한다.
본 발명의 또 다른 하나의 구체예는 상기 면역글로불린 Fc 영역은 CH1, CH2, CH3 및 CH4 도메인으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1개 내지 4개 도메인으로 이루어진, 단백질 결합체를 제공한다.
본 발명의 또 다른 하나의 구체예는 상기 면역글로불린 Fc 영역이 힌지영역을 추가로 포함하는, 단백질 결합체를 제공한다.
본 발명의 또 다른 하나의 구체예는 상기 면역글로불린 Fc 영역이 IgG, IgA, IgD, IgE 또는 IgM에서 유래된 Fc 단편인, 단백질 결합체를 제공한다.
본 발명의 또 다른 하나의 구체예는 상기 면역글로불린 Fc 영역의 각각의 도메인이 IgG, IgA, IgD, IgE, IgM로 이루어진 군에서 선택되는 면역글로불린에서 유래된 상이한 기원을 가진 도메인의 하이브리드인, 단백질 결합체를 제공한다.
본 발명의 또 다른 하나의 구체예는 상기 면역글로불린 Fc 영역이 동일한 기원의 도메인으로 이루어진 단쇄 면역글로불린으로 구성된 이량체 또는 다량체인, 단백질 결합체를 제공한다.
본 발명의 또 다른 하나의 구체예는 상기 면역글로불린 Fc 영역이 IgG4 Fc 단편인, 단백질 결합체를 제공한다.
본 발명의 또 다른 하나의 구체예는 상기 면역글로불린 Fc 영역이 인간 비당쇄화 IgG4 Fc 단편인, 단백질 결합체를 제공한다.
본 발명의 또 다른 하나의 구체예는 상기 비펩타이드성 중합체는 폴리에틸렌글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 에틸렌 글리콜-프로필렌 글리콜 공중합체, 폴리옥시에틸화폴리올, 폴리비닐알콜, 폴리사카라이드, 덱스트란, 폴리비닐에틸에테르, 생분해성 고분자, 지질 중합체, 키니, 히아루론산 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 단백질 결합체를 제공한다.
본 발명의 또 다른 하나의 구체예는 상기 비펩타이드성 중합체는 폴리에틸렌글리콜인, 단백질 결합체를 제공한다.
본 발명의 또 다른 하나의 구체예는 상기 비펩타이드성 중합체의 반응기는 알데히드 그룹, 프로피온알데히드 그룹, 부틸알데히드 그룹, 말레이미드 그룹 및 석신이미드 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 단백질 결합체를 제공한다.
본 발명의 또 다른 하나의 구체예는 상기 석신이미드 유도체가 석신이미딜 카르복시메틸, 석신이미딜 발레르에이트, 석신이미딜 메틸부타노에이트, 석신이미딜 메틸프로피온에이트, 석신이미딜 부타노에이트, 석신이미딜 프로피온에이트, N-하이드록시석신이미드인 또는 석신이미딜 카보네이트인, 단백질 결합체를 제공한다.
본 발명의 또 다른 하나의 구체예는 상기 비펩타이드성 중합체는 양 말단에 알데히드 그룹 반응기를 갖는 것인, 단백질 결합체를 제공한다.
본 발명의 또 다른 하나의 구체예는 상기 비펩타이드성 중합체는 양 말단에 각각 알데히드 그룹 및 말레이미드 반응기를 갖는 것인, 단백질 결합체를 제공한다.
본 발명의 또 다른 하나의 구체예는 상기 비펩타이드성 중합체는 양 말단에 각각 알데히드 그룹 및 석시니미드 반응기를 갖는 것인, 단백질 결합체를 제공한다.
본 발명의 또 다른 하나의 구체예는 상기 비펩타이드성 중합체의 양 말단이 각각 면역글로불린 Fc 영역의 N 말단과 생리활성 폴리펩타이드의 N 말단, 라이신 잔기, 히스티딘 잔기 또는 시스테인 잔기의 유리 반응기에 결합되어 있는 것인, 단백질 결합체를 제공한다.
본 발명의 또 다른 하나의 구체예는 상기 생리활성 폴리펩타이드가 호르몬, 사이토카인, 효소, 항체, 성장인자, 전사조절인자, 혈액인자, 백신, 구조단백질, 리간드 단백질 및 수용체로 이루어진 군으로부터 선택되는, 단백질 결합체를 제공한다.
본 발명의 또 다른 하나의 구체예는 상기 생리활성 폴리펩타이드는 인간 성장 호르몬, 성장 호르몬 방출 호르몬, 성장 호르몬 방출 펩타이드, 인터페론류, 인터페론 수용체류, 콜로니 자극인자류, 글루카곤-유사 펩타이드류 (GLP-1등), 엑센딘류 (Exendin4 등), 옥신토모듈린, 지프로테인 관련수용체 (G-protein-coupled receptor), 인터루킨류, 인터루킨 수용체류, 효소류, 인터루킨 결합 단백질류, 사이토카인 결합 단백질 류, 마크로파지 활성인자, 마크로파지 펩타이드, B 세포인자, T 세포인자, 단백질 A, 알러지 억제인자, 세포 괴사 당단백질, 면역독소, 림포독소, 종양 괴사인자, 종양 억제인자, 전이 성장인자, 알파-1 안티트립신, 알부민, α-락트알부민, 아포리포단백질-E, 적혈구 생성인자, 고 당쇄화 적혈구 생성인자, 안지오포에이틴류, 헤모글로빈, 트롬빈, 트롬빈 수용체 활성 펩타이드, 트롬보모듈린, 혈액인자 Ⅶ , Ⅶa, Ⅷ, Ⅸ, 및 XIII, 플라즈미노젠 활성인자, 피브린-결합 펩타이드, 유로키나제, 스트렙토키나제, 히루딘, 단백질 C, C-반응성 단백질, 레닌 억제제, 콜라게나제 억제제, 수퍼옥사이드 디스뮤타제, 렙틴, 혈소판 유래 성장인자, 상피세포 성장인자, 표피세포 성장인자, 안지오스타틴, 안지오텐신, 골 형성 성장인자, 골 형성 촉진 단백질, 칼시토닌, 인슐린, 아트리오펩틴, 연골 유도인자, 엘카토닌, 결합조직 활성인자, 조직인자 경로 억제제, 여포 자극 호르몬, 황체 형성 호르몬, 황체 형성 호르몬 방출 호르몬, 신경 성장인자류, 부갑상선 호르몬, 릴랙신, 씨크레틴, 소마토 메딘, 인슐린 유사 성장인자, 부신피질 호르몬, 글루카곤, 콜레시스토키닌, 췌장 폴리펩타이드, 가스트린 방출 펩타이드, 코티코트로핀 방출인자, 갑상선 자극호르몬, 오토탁신, 락토페린, 미오스타틴, 수용체류, 수용체 길항물질, 세포표면항원, 바이러스 유래 백신 항원, 단일클론 항체, 다중클론 항체, 항체 단편류 및 각각의 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 단백질 결합체를 제공한다.
본 발명의 또 다른 하나의 구체예는 상기 생리활성 폴리펩타이드는 인간 성장 호르몬, 인터페론-알파, 과립구 콜로니자극인자, 적혈구 생성인자, 혈액인자, 인슐린, 옥시토모듈린, 글루카곤-유사 펩타이드류, 엑센딘류 및 각각의 유도체인, 단백질 결합체를 제공한다.
본 발명의 다른 양태는
(a) 양 말단에 반응기를 갖는 하나 이상의 비펩타이드성 중합체, 하나 이상의 생리활성 폴리펩타이드 및 하나 이상의 면역글로불린 Fc 영역을 공유결합으로 연결하여 단백질 결합체를 제조하는 단계; 및
(b) 상기 (a) 단계를 통해 제조한 공유결합으로 연결된 생리활성 폴리펩타이드, 비펩타이드성 중합체 및 면역글로불린 Fc 영역을 필수적으로 포함하고, 상기 비펩타이드성 중합체가 면역글로불린 Fc 영역의 N 말단을 통해 결합한 단백질 결합체를 분리하는 단계를 포함하는, 위치 특이적 단백질 결합체의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 하나의 구체예는 상기 (a) 단계는
(a1) 비펩타이드성 중합체의 한쪽 말단에 면역글로불린 Fc 영역 또는 생리활성 폴리펩타이드 중 어느 하나와 공유결합으로 연결하여 연결체를 제조하는 단계; 및
(a2) 상기 (a1) 단계에서 제조한 연결체를 분리하여, 분리된 연결체의 비펩타이드성 중합체의 다른 쪽 말단에 생리활성 폴리펩타이드 또는 면역글로불린 Fc 영역 중 다른 하나와 공유결합으로 연결하는 단계를 포함하는, 제조방법을 제공한다.
본 발명의 다른 하나의 구체예는 상기 (a1) 단계에서 생리활성 폴리펩타이드와 비펩타이드성 중합체의 반응 몰 비는 1:1 내지 1:30이고, 면역글로불린 Fc 영역과 비펩타이드성 중합체의 반응 몰 비가 1:1 내지 1:20인 것인, 제조방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 하나의 구체예는 상기 (a1) 단계는 pH 4.0 내지 9.0에서 이루어지는 것을 특징으로 하는, 제조방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 하나의 구체예는 상기 (a1) 단계는 4.0 내지 25 ℃에서 이루어지는 것을 특징으로 하는, 제조방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 하나의 구체예는 상기 (a1) 단계에서 면역글로불린 Fc 영역 및 생리활성 폴리펩타이드의 반응 농도가 0.1 내지 100 ㎎/㎖인 것을 특징으로 하는, 제조방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 하나의 구체예는 상기 (a2) 단계에서 연결체 : 면역글로불린 Fc 영역 또는 생리활성 폴리펩타이드의 반응 몰 비가 1:0.1 내지 1:20인 것을 특징으로 하는, 제조방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 하나의 구체예는 상기 (a2) 단계는 pH 4.0 내지 9.0에서 이루어지는 것을 특징으로 하는, 제조방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 하나의 구체예는 상기 (a2) 단계는 4.0 내지 25 ℃에서 이루어지는 것을 특징으로 하는, 제조방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 하나의 구체예는 상기 (a2) 단계에서 면역글로불린 Fc 영역 및 생리활성 폴리펩타이드의 반응 농도가 0.1 내지 100 ㎎/㎖인 것을 특징으로 하는, 제조방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 하나의 구체예는 상기 (a1) 단계 및 (a2) 단계가 환원제의 존재 하에 수행되는 것을 특징으로 하는 것인, 제조방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 하나의 구체예는 상기 환원제가 나트륨 시아노보로하이드라이드(NaCNBH3), 수소화 붕소나트륨, 디메틸아민 붕산염 및 피리딘 붕산염으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 제조방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 하나의 구체예는 상기 (a2) 단계에서 연결체를 분리하기 위하여 음이온 교환 크로마토그래피, 양이온 교환 크로마토그래피, 소수성 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 또는 크기배제 크로마토그래피로부터 선택되는 정제방법을 단독 혹은 복수개로 수행하는 것인, 제조방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 하나의 구체예는 상기 음이온 교환 크로마토그래피 수지의 작용기가 쿼터너리암모늄(Q), 쿼터너리아미노에틸 (QAE), 디에틸아미노에틸 (DEAE), 폴리에틸렌이민 (PEI), 디메틸아미노메틸(DMAE), 및 트리메틸아미노에틸 (TMAE)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것 중 하나인, 제조방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 하나의 구체예는 상기 양이온 교환 크로마토그래피 수지의 작용기가 메틸설포네이트 (S), 설포프로필 (SP), 카르복시메틸 (CM), 설포에틸 (SE) 및 폴리아스파르트산（Poly aspartic acid)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것 중 하나인, 제조방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 하나의 구체예는 상기 소수성 크로마토그래피의 수지의 작용기가 페닐(phenyl), 옥틸(octyl), (이소)프로필((iso)propyl), 부틸(butyl) 및 에틸(ethyl)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것 중 하나인, 제조방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 하나의 구체예는 상기 친화성 크로마토그래피의 수지의 작용기가 프로테인에이 (proteinA), 헤파린 (heparin), 블루 (blue), 벤자미딘 (benzamidine), 금속이온 (코발트, 니켈, 구리) 및 비펩타이드성 중합체의 양쪽 말단이 각각 면역글로불린 Fc 영역 및 생리활성 폴리펩타이드와 결합된 단백질 결합체의 구성 성분의 일부 혹은 전체에 대한 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것 중 하나인, 제조방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 하나의 구체예는 상기 크기배제 크로마토그래피의 수지가 수퍼덱스 (superdex）, 세파크릴 (sephacryl), 수퍼로즈 (superose) 및 세파덱스 (sephadex)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것중 하나인, 제조방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 하나의 구체예는 상기 (b) 단계의 단백질 결합체를 분리하는 단계는 음이온 교환 크로마토그래피, 양이온 교환 크로마토그래피, 소수성 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 또는 크기배제 크로마토그래피로부터 선택되는 정제방법을 단독 혹은 복수개로 수행하는, 제조방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 하나의 구체예는 상기 음이온 교환 크로마토그래피 수지의 작용기가 쿼터너리암모늄(Q), 쿼터너리아미노에틸 (QAE), 디에틸아미노에틸 (DEAE), 폴리에틸렌이민 (PEI), 디메틸아미노메틸(DMAE), 및 트리메틸아미노에틸 (TMAE)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것 중 하나인, 제조방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 하나의 구체예는 상기 양이온 교환 크로마토그래피 수지의 작용기가 메틸설포네이트 (S), 설포프로필 (SP), 카르복시메틸 (CM), 설포에틸 (SE) 및 폴리아스파르트산（Poly aspartic acid)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것 중 하나인, 제조방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 하나의 구체예는 상기 소수성 크로마토그래피의 수지의 작용기가 페닐(phenyl), 옥틸(octyl), (이소)프로필((iso)propyl), 부틸(butyl) 및 에틸(ethyl)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것 중 하나인, 제조방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 하나의 구체예는 상기 친화성 크로마토그래피의 수지의 작용기가 프로테인에이 (proteinA), 헤파린 (heparin), 블루 (blue), 벤자미딘 (benzamidine), 금속이온 (코발트, 니켈, 구리) 및 비펩타이드성 중합체의 양쪽 말단이 각각 면역글로불린 Fc 영역 및 생리활성 폴리펩타이드와 결합된 단백질 결합체의 구성 성분의 일부 혹은 전체에 대한 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것 중 하나인, 제조방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 하나의 구체예는 상기 크기배제 크로마토그래피의 수지가 수퍼덱스 (superdex）, 세파크릴 (sephacryl), 수퍼로즈 (superose) 및 세파덱스 (sephadex)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것중 하나인, 제조방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 하나의 구체예는 상기 (b) 단계는 단백질 결합체를 구성하는 비펩타이드성 중합체와 면역글로불린 Fc 영역이 면역글로불린 Fc 영역의 N 말단을 통해 결합한 단백질 결합체를 분리하는 것을 특징으로 하는 것인, 제조방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태는 (a') 비펩타이드성 중합체의 한쪽 말단에 면역글로불린 Fc 영역 또는 생리활성 폴리펩타이드 중 어느 하나와 공유결합으로 연결하여 연결체를 제조하는 단계로서, pH 4.0 내지 9.0로 이루어지는 단계; (b') 상기 (a') 단계에서 제조한 연결체를 분리하여, 분리된 연결체의 비펩타이드성 중합체의 다른 쪽 말단에 생리활성 폴리펩타이드 또는 면역글로불린 Fc 영역 중 다른 하나와 공유결합으로 연결하는 단계로서, pH 4.0 내지 9.0로 이루어지는 단계; 및 (c') 상기 (b') 단계를 통해 제조한 공유결합으로 연결된 생리활성 폴리펩타이드, 비펩타이드성 중합체 및 면역글로불린 Fc 영역을 필수적으로 포함하고, 상기 비펩타이드성 중합체가 면역글로불린 Fc 영역의 N 말단을 통해 결합한 단백질 결합체를 분리하는 단계를 포함하는, 위치 특이적 단백질 결합체의 제조방법을 제공한다.
특히, 본 발명에서 비펩타이드성 중합체와 면역글로불린 Fc 영역의 N 말단이 결합하는 반응률에 중요한 조건은 pH로, 중성 이하의 pH, 즉 pH 7.0 이하에서 본 발명의 위치 특이적 결합 반응이 잘 일어날 수 있다.
비펩타이드성 중합체와 면역글로불린 Fc 영역의 N 말단이 결합하는 단계는 중성 이하의 pH에서 이루어지되 단백질의 3차 구조 또는 활성이 변성되지 않을 적정한 수준의 약산성 내지 산성의 pH를 가지는 것이 적절하나, 이에 제한되지 않는다. 상기 제한되지 않는 예로는, 본 발명에서 사용하고 있는 면역글로불린 Fc 영역은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 것으로, 약 pH 8.2 정도의 약 염기성에서도 N 말단 특이성을 가지는 것을 확인하였다(실시예 5).
즉 일반적인 면역글로불린 Fc 영역을 사용할 경우, 중성 이하에서 비펩타이드성 중합체와 면역글로불린 Fc 영역의 N 말단 특이적 결합 반응율이 증가하나, pH에 따른 민감도가 낮아진 변이 면역글로불린 Fc 영역을 이용하는 경우에는 해당 조건에 구속되지 않을 경우도 있다.
본 발명의 또 다른 양태는 (a') 비펩타이드성 중합체의 한쪽 말단에 면역글로불린 Fc 영역 또는 생리활성 폴리펩타이드 중 어느 하나와 공유결합으로 연결하여 연결체를 제조하는 단계로서, 생리활성 폴리펩타이드와 비펩타이드성 중합체의 반응 몰 비는 1:1 내지 1:30이고, 면역글로불린 Fc 영역과 비펩타이드성 중합체의 반응 몰 비가 1:1 내지 1:20이며, 환원제가 1 ~ 100 mM 농도로 포함되고, pH 4.0 내지 9.0, 반응온도 4.0 내지 25 ℃에서 이루어지며, 면역글로불린 Fc 영역 또는 생리활성 폴리펩타이드의 반응 농도가 0.1 내지 100 ㎎/㎖인 단계; (b') 상기 (a') 단계에서 제조한 연결체를 분리하여, 분리된 연결체의 비펩타이드성 중합체의 다른 쪽 말단에 생리활성 폴리펩타이드 또는 면역글로불린 Fc 영역 중 다른 하나와 공유결합으로 연결하는 단계로서, 연결체와 면역글로불린 Fc 영역 또는 생리활성 폴리펩타이드의 반응 몰 비가 1:0.1 내지 1:20이고, 환원제가 1 ~ 100 mM 농도로 포함되며, pH 4.0 내지 9.0, 반응온도 4.0 내지 25 ℃에서 이루어지고, 면역글로불린 Fc 영역 또는 생리활성 폴리펩타이드의 반응 농도가 0.1 내지 100 ㎎/㎖인 단계; 및 (c') 상기 (b') 단계를 통해 제조한 공유결합으로 연결된 생리활성 폴리펩타이드, 비펩타이드성 중합체 및 면역글로불린 Fc 영역을 필수적으로 포함하고, 상기 비펩타이드성 중합체가 면역글로불린 Fc 영역의 N 말단을 통해 결합한 단백질 결합체를 분리하는 단계를 포함하는, 위치 특이적 단백질 결합체의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 하나의 구체예는 상기 단백질 결합체 제조방법은 90% 이상의 N-말단 선택성을 갖는 것인, 제조방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태는 상기 단백질 결합체를 유효성분으로 포함하는 생리활성 폴리펩타이드의 생체 내 지속성 및 안정성 증가용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 하나의 구체예는 상기 단백질 결합체가 90 % 이상으로 포함된 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태는 상기 단백질 결합체 제조방법에 따라 제조된 단백질 결합체를 90 % 이상으로 포함하는 단백질 결합체의 집합체를 제공한다.
본 발명은 단백질 결합체 제조 중 특정위치를 사용하여 결합된 형태의 생체 내 지속성이 향상된 단백질 결합체에 관한 것으로, 구체적으로 생리활성 폴리펩타이드, 비펩타이드성 중합체 및 면역글로불린 Fc 영역 중 N 말단이 상호 공유결합에 의해 연결되어 있어 상기 생리활성 폴리펩타이드의 생체 내 지속성이 향상된 단백질 결합체에 관한 것이다. 본 발명에 의하여 제조된 단백질 결합체는 다양한 생리활성 폴리펩타이드 약물의 지속형 제제 개발에 유용하게 이용될 수 있다.
도 1a는 면역글로불린 Fc 영역의 N 말단 반응으로 제조된 IFNα-PEG-Fc 결합체를 SDS-PAGE 와 Western blotting를 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 1b는 면역글로불린 Fc 영역의 N 말단 반응으로 제조된 hGH-PEG-Fc 결합체를 SDS-PAGE 와 Western blotting를 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 1c는 면역글로불린 Fc 영역의 N 말단 반응으로 제조된 17,65Ser-G-CSF-PEG-Fc 결합체를 SDS-PAGE 와 Western blotting를 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 1d는 면역글로불린 Fc 영역의 N 말단 반응으로 제조된 Insulin-PEG-Fc 결합체를 SDS-PAGE 와 Western blotting를 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 1e는 면역글로불린 Fc 영역의 N 말단 반응으로 제조된 EPO-PEG-Fc 결합체를 SDS-PAGE 와 Western blotting를 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 1f는 면역글로불린 Fc 영역의 N 말단 반응으로 제조된 CA-Exendin4-PEG-Fc 결합체를 SDS-PAGE 와 Western blotting를 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 1g는 면역글로불린 Fc 영역의 N 말단 반응으로 제조된 FacVII-PEG-Fc 결합체를 SDS-PAGE 와 Western blotting를 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 2a는 면역글로불린 Fc 영역의 N 말단 반응으로 제조된 IFNα-PEG-Fc 결합체의 순도를 IE-HPLC 및 SE-HPLC 분석을 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 2b는 면역글로불린 Fc 영역의 N 말단 반응으로 제조된 hGH-PEG-Fc 결합체의 순도를 IE-HPLC 및 SE-HPLC 분석을 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 2c는 면역글로불린 Fc 영역의 N 말단 반응으로 제조된 17,65Ser-G-CSF-PEG-Fc 결합체의 순도를 IE-HPLC 및 SE-HPLC 분석을 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 2d는 면역글로불린 Fc 영역의 N 말단 반응으로 제조된 Insulin-PEG-Fc 결합체의 순도를 IE-HPLC 및 SE-HPLC 분석을 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 2e는 면역글로불린 Fc 영역의 N 말단 반응으로 제조된 EPO-PEG-Fc 결합체의 순도를 IE-HPLC 및 SE-HPLC 분석을 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 2f는 면역글로불린 Fc 영역의 N 말단 반응으로 제조된 CA-Exendin4-PEG-Fc 결합체의 순도를 IE-HPLC 및 SE-HPLC 분석을 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 3a는 면역글로불린 Fc 영역의 N 말단 반응으로 제조된 IFNα-PEG-Fc 결합체의 Fc 부분의 N 말단 결합 여부를 펩타이드 맵핑을 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 3b는 면역글로불린 Fc 영역의 N 말단 반응으로 제조된 hGH-PEG-Fc 결합체의 Fc 부분의 N 말단 결합 여부를 펩타이드 맵핑을 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 3c는 면역글로불린 Fc 영역의 N 말단 반응으로 제조된 17,65Ser-G-CSF-PEG-Fc 결합체의 Fc 부분의 N 말단 결합 여부를 펩타이드 맵핑을 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 3d는 면역글로불린 Fc 영역의 N 말단 반응으로 제조된 Insulin-PEG-Fc 결합체의 Fc 부분의 N 말단 결합 여부를 펩타이드 맵핑을 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 3e는 면역글로불린 Fc 영역의 N 말단 반응으로 제조된 EPO-PEG-Fc 결합체의 Fc 부분의 N 말단 결합 여부를 펩타이드 맵핑을 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 3f는 면역글로불린 Fc 영역의 N 말단 반응으로 제조된 CA-Exendin4-PEG-Fc 결합체의 Fc 부분의 N 말단 결합 여부를 펩타이드 맵핑을 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 일 양태는 생리활성 폴리펩타이드 및 면역글로불린 Fc 영역이 비펩타이드성 중합체를 통하여 연결된 단백질 결합체로서, 상기 비펩타이드성 중합체는 면역글로불린 Fc 영역의 N 말단에 위치 특이적으로 결합한 것인, 단백질 결합체에 대한 것이다.
본 발명에서 "단백질 결합체(complex)" 또는 "결합체"라 함은 하나 이상의 생리활성 폴리펩타이드, 양 말단에 반응기를 갖는 하나 이상의 비펩타이드성 중합체 및 하나 이상의 면역글로불린 Fc 영역을 포함하고, 이들 구성요소가 공유결합으로 상호 연결되어 있는 것을 가리킨다. 또한, 상기 "결합체"와 구별하기 위하여, 생리활성 폴리펩타이드, 비펩타이드성 중합체 및 면역글로불린 Fc 영역에서 선택된 2 종류의 물질 분자만이 공유결합으로 연결된 구조물은 "연결체(conjugate)"로 표시한다.
본 발명의 단백질 결합체는 비펩타이드성 중합체가 양 말단 반응기를 통해 생리활성 폴리펩타이드 및 면역글로불린 Fc 영역과 각각 공유결합으로 연결되는 것일 수 있다.
본 발명에서 "생리활성 폴리펩타이드", "생리활성 단백질", "활성 단백질" 또는 "단백질 약물"이란 생체 내에서 생리적 현상에 길항작용을 나타내는 폴리펩타이드 또는 단백질을 의미하는 용어로서 상호 교환적으로 사용될 수 있다.
본 발명에서 "비펩타이드성 중합체"는 반복 단위가 2개 이상 결합된 생체 적합성 중합체를 의미하며, 상기 반복 단위들은 펩타이드 결합이 아닌 임의의 공유결합을 통해 서로 연결되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 "면역글로불린 Fc 영역"은 면역글로불린의 중쇄와 경쇄 가변영역, 중쇄 불변영역 1 (CH1)과 경쇄 불변영역 1 (CL1)을 제외한 나머지 부분을 의미하며, 면역글로불린 Fc 영역은 중쇄 불변영역에 힌지 (hinge) 영역을 추가로 포함하기도 한다. 특히 면역글로불린 Fc 영역 전체 및 이의 일부를 포함하는 단편일 수 있어, 본 발명에서는 면역글로불린 Fc 영역은 면역글로불린 단편과 혼용될 수 있다.
천연형 Fc는 중쇄 불변영역 1에서 Asn297 부위에 당쇄가 존재하지만, 대장균 유래 재조합 Fc는 당쇄가 없는 형태로 발현된다. Fc에서 당쇄가 제거되면 중쇄 불변영역 1 에 결합하는 Fc 감마 수용체 1,2,3 과 보체(c1q)의 결합력이 저하되어 항체-의존성 세포독성 또는 보체-의존성 세포독성이 감소 또는 제거된다.
본 발명에서, "면역글로불린 불변영역"은 면역글로불린의 중쇄와 경쇄 가변영역, 중쇄 불변영역 1(CH1)과 경쇄 불변영역(CL)을 제외한, 중쇄 불변영역 2(CH2) 및 중쇄 불변영역 3(CH3) (또는 중쇄 불변영역 4(CH4) 포함)부분을 포함하는 Fc 단편을 의미할 수 있으며, 중쇄 불변영역에 힌지(hinge) 부분을 포함하기도 한다. 또한 본 발명의 면역글로불린 불변영역은 천연형과 실질적으로 동등 하거나 향상된 효과를 갖는 한, 면역 글로불린의 중쇄와 경쇄 가변영역만을 제외하고, 일부 또는 전체 중쇄 불변영역 1(CH1) 및/또는 경쇄불변영역(CL)을 포함하는 확장된 면역글로불린 불변영역일 수 있다. 또한, CH2 및/또는 CH3에 해당하는 상당히 긴 일부 아미노산 서열이 제거된 영역일 수도 있다. 즉, 본 발명의 면역글로불린 불변영역은 (1) CH1 도메인, CH2 도메인, CH3 도메인 및 CH4 도메인, (2) CH1 도메인 및 CH2 도메인, (3) CH1 도메인 및 CH3 도메인, (4) CH2 도메인 및 CH3 도메인, (5) 1개 또는 2개의 이상의 불변영역 도메인과 면역글로불린 힌지 영역(또는 힌지 영역의 일부)과의 조합, (6) 중쇄 불변영역 각 도메인과 경쇄 불변영역의 이량체일 수 있다. 면역글로불린 Fc 단편을 비롯한 불변영역은 생체 내에서 대사되는 생분해성의 폴리펩타이드이기 때문에, 약물의 캐리어로 사용하기에 안전하다. 또한, 면역글로불린 Fc 단편은 면역글로불린 전체 분자에 비해 상대적으로 분자량이 적기 때문에 결합체의 제조, 정제 및 수율 면에서 유리할 뿐만 아니라 아미노산 서열이 항체마다 다르기 때문에 높은 비균질성을 나타내는 Fab 부분이 제거되기 때문에 물질의 동질성이 크게 증가되고 혈중 항원성의 유발 가능성도 낮아지게 되는 효과도 기대할 수 있다.
한편, 면역글로불린 불변영역은 인간 또는 소, 염소, 돼지, 마우스, 래빗, 햄스터, 랫트, 기니아 픽 등의 동물기원일 수 있으며, 바람직하게는 인간기원이다. 또한, 면역글로불린 불변영역은 IgG, IgA, IgD, IgE, IgM 유래 또는 이들의 조합(combination) 또는 이들의 혼성(hybrid)에 의한 불변영역으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 바람직하게는 인간 혈액에 가장 풍부한 IgG 또는 IgM 유래이며 가장 바람직하게는 리간드 결합 단백질의 반감기를 향상시키는 것으로 공지된 IgG 유래일 수 있다. 본 발명에서 면역글로불린 Fc 영역은 동일한 기원의 도메인으로 이루어진 단쇄 면역글로불린으로 구성된 이량체 또는 다량체일 수 있다.
본 발명에서 "조합(combination)"이란 이량체 또는 다량체를 형성할 때, 동일 기원 단쇄 면역글로불린 불변영역(바람직하게는 Fc 영역)을 암호화하는 폴리펩타이드가 상이한 기원의 단쇄 폴리펩타이드와 결합을 형성하는 것을 의미한다. 즉, IgG Fc, IgA Fc, IgM Fc, IgD Fc 및 IgE의 Fc 단편으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 2개 이상의 단편으로부터 이량체 또는 다량체의 제조가 가능하다.
본 발명에서 "하이브리드(hybrid)"란 단쇄의 면역글로불린 불변영역(바람직하게는 Fc 영역)내에 2개 이상의 상이한 기원의 면역글로불린 불변영역에 해당하는 서열이 존재함을 의미하는 용어이다. 본 발명의 경우 여러 형태의 하이브리드가 가능하다. 즉, IgG Fc, IgM Fc, IgA Fc, IgE Fc 및 IgD Fc의 CH1, CH2, CH3 및 CH4로 이루어진 그룹으로부터 선택된 1개 내지 4개 도메인으로 이루어진 도메인의 하이브리드가 가능하며, 힌지영역을 추가로 포함할 수 있다.
IgG 역시 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4의 서브클래스로 나눌 수 있고 본 발명에서는 이들의 조합 또는 이들의 혼성화된 형태도 가능하다. 구체적으로는 IgG2 및 IgG4 서브클래스이며, 더욱 구체적으로는 보체 의존적 독성(CDC, Complementdependent cytotoxicity)과 같은 이펙터 기능(effector function)이 거의 없는 IgG4의 Fc 영역일 수 있다.
또한, 면역글로불린 불변영역은 천연형 당쇄, 천연형에 비해 증가된 당쇄, 천연형에 비해 감소한 당쇄 또는 당쇄가 제거된 형태일 수 있다. 이러한 면역글로불린 불변영역 당쇄의 증감 또는 제거에는 화학적 방법, 효소학적 방법 및 미생물을 이용한 유전 공학적 방법과 같은 통상적인 방법이 이용될 수 있다. 여기서, 면역글로불린 불변영역에서 당쇄가 제거된 면역글로불린 불변영역은 보체(c1q)의 결합력이 현저히 저하되고, 항체-의존성 세포독성 또는 보체-의존성 세포독성이 감소 또는 제거되므로, 생체 내에서 불필요한 면역반응을 유발하지 않는다. 이런 점에서 약물의 캐리어로서의 본래의 목적에 보다 부합하는 형태는 당쇄가 제거되거나 비당쇄화된 면역글로불린 불변영역이라 할 것이다. 따라서, 더욱더 구체적으로는, 인간 IgG4 유래의 비-당쇄화된 Fc 영역, 즉 인간 비당쇄화 IgG4 Fc 영역을 사용할 수 있다. 인간 유래의 Fc 영역은 인간 생체에서 항원으로 작용하여 이에 대한 새로운 항체를 생성하는 등의 바람직하지 않은 면역 반응을 일으킬 수 있는 비-인간 유래의 Fc 영역에 비하여 바람직할 수 있다.
또한, 본 발명의 면역글로불린 불변영역은 천연형 아미노산 서열뿐만 아니라 이의 서열유도체(mutant)를 포함한다. 아미노산 서열 유도체란 천연 아미노산 서열중의 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합에 의하여 상이한 서열을 가지는 것을 의미한다. 예를 들면, IgG Fc의 경우 결합에 중요하다고 알려진 214 내지 238, 297 내지 299, 318 내지 322 또는 327 내지 331번 아미노산 잔기들이 변형을 위해 적당한 부위로서 이용될 수 있다. 또한, 이황화 결합을 형성할 수 있는 부위가 제거되거나, 천연형 Fc에서 N-말단의 몇몇 아미노산이 제거되거나 또는 천연형 Fc의 N-말단에 메티오닌 잔기가 부가되는 등 다양한 종류의 유도체가 가능하다. 또한, 이펙터 기능을 없애기 위해 보체결합부위, 예를 들어 C1q 결합부위가 제거될 수도 있고, ADCC 부위가 제거될 수도 있다. 이러한 면역글로불린 불변영역의 서열 유도체를 제조하는 기술은 국제특허공개 제97/34631호, 국제특허공개 제96/32478호 등에 개시되어 있다.
분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 및 펩티드에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다(H.Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York,197 9). 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이다. 경우에 따라서는 인산화(phosphorylation), 황화(sulfation), 아크릴화(acrylation), 당화(glycosylation), 메틸화(methylation), 파네실화(farnesylation), 아세틸화(acetylation), 아밀화(amidation) 등으로 수식(modification)될 수도 있다.
상기 기술한 면역글로불린 불변영역 유도체는 본 발명의 면역글로불린 불변영역과 동일한 생물학적 활성을 나타내나, 면역글로불린 불변영역의 열, pH 등에 대한 구조적 안정성을 증대시킨 유도체일 수 있다. 또한, 이러한 면역글로불린 불변영역은 인간 및 소, 염소, 돼지, 마우스, 래빗, 햄스터, 랫트, 기니아 픽 등의 동물의 생체 내에서 분리한 천연형으로부터 얻어질 수도 있고, 형질전환된 동물세포 또는 미생물로부터 얻어진 재조합형 또는 이의 유도체일 수 있다. 여기서, 천연형으로부터 획득하는 방법은 전체 면역글로불린을 인간 또는 동물의 생체로부터 분리한 후, 단백질 분해효소를 처리하여 얻을 수 있다. 파파인을 처리할 경우에는 Fab 및 Fc로 절단되고, 펩신을 처리할 경우에는 pF'c 및 F(ab)2로 절단된다. 이를 크기 배제 크로마토그래피(size-exclusion chromatography) 등을 이용하여 Fc 또는 pF'c를 분리할 수 있다.
바람직하게는 인간 유래의 면역글로불린 불변영역을 미생물로부터 수득한 재 조합형 면역글로불린 불변영역일 수 있다.
본 발명의 단백질 결합체는 [생리활성 폴리펩타이드/비펩타이드성 중합체/면역글로불린 Fc 영역]의 단위구조를 하나 이상 포함할 수 있으며, 여기에서 모든 구성 요소들은 공유결합에 의해 선형으로 연결되어 있다. 비펩타이드성 중합체는 양 말단에 반응기를 가질 수 있으므로, 이를 통해 생리활성 폴리펩타이드 및 면역글로불린 Fc 영역과 각각 공유결합으로 연결된다. 즉, 하나의 면역글로불린 Fc 영역에, 생리활성 폴리펩타이드와 결합된 비펩타이드성 중합체의 연결체 하나 이상이 공유결합으로 연결됨으로써, 면역글로불린 Fc 영역을 매개체로 하여 생리활성 폴리펩타이드 단량체, 이량체 혹은 다량체를 형성할 수 있으며, 이를 통해 생체 내 활성 및 안정성 증가를 보다 효과적으로 달성할 수 있다.
상기 비펩타이드성 중합체의 양 말단 반응기는 반응 알데히드 그룹, 프로피온 알데히드 그룹, 부틸 알데히드 그룹, 말레이미드 (maleimide) 그룹 및 석시니미드 (succinimide) 유도체로 구성된 군으로부터 선택되는 것이 바람직하다. 상기에서, 석시니미드 유도체로는 하이드록시 석시니미딜, 석시니미딜 카르복시메틸, 석시니미딜 벨러레이트, 석시니미딜 메틸부타노에이트, 석시니미딜 메틸프로피오네이트, 석시니미딜 부타노에이트, 석시니미딜 프로피오네이트, N-하이드록시석시니미드 또는 석시니미딜 카보네이트가 이용될 수 있다. 특히 상기 비펩타이드성 중합체가 양 말단에 반응 알데히드 그룹의 반응기를 갖는 경우, 비 특이적 반응을 최소화하고, 비펩타이드성 중합체의 양 말단에서 생리활성 폴리펩타이드 및 면역글로불린 Fc 영역과 각각 결합하는 데 효과적이다. 알데히드 결합에 의한 환원성 알킬화로 생성된 최종 산물은 아미드 결합으로 연결된 것보다 훨씬 안정적이다.
본 발명의 비펩타이드성 중합체의 양 말단 반응기는 서로 같거나 다를 수 있다. 상기 비펩타이드성 중합체는 양 말단에 알데히드 그룹 반응기를 갖는 것일 수 있고, 또한 상기 비펩타이드성 중합체는 양 말단에 각각 알데히드 그룹 및 말레이미드 반응기를 가질 수 있거나, 양 말단에 각각 알데히드 그룹 및 석시니미드 반응기를 가질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
예를 들어, 한쪽 말단에는 말레이미드 그룹을, 다른 쪽 말단에는 알데히드 그룹, 프로피온 알데히드 그룹 또는 부틸 알데히드 그룹을 가질 수 있다. 또 한 가지 예로, 한쪽 말단에는 석시니미딜 그룹을, 다른 쪽 말단에는 프로피온 알데히드 그룹 또는 부틸 알데히드 그룹을 가질 수 있다. 프로피온양쪽 말단에 하이드록시 반응기를 갖는 폴리(에틸렌 글리콜)을 비펩타이드성 중합체로 이용하는 경우에는, 공지의 화학반응에 의해 상기 하이드록시기를 상기 다양한 반응기로 활성화하거나, 상업적으로 입수가능한 변형된 반응기를 갖는 폴리(에틸렌 글리콜)을 이용하여 본 발명의 단백질 결합체를 제조할 수 있다.
생리활성 폴리펩타이드와 면역글로불린 Fc 영역이 비펩타이드성 중합체를 매개로 연결되는 경우에는, 상기 비펩타이드성 중합체의 양 말단이 각각 면역글로불린 Fc 영역의 N 말단과 생리활성 폴리펩타이드의 N 말단(아미노 말단), C 말단(카르복실 말단), 라이신 잔기, 히스티딘 잔기 또는 시스테인 잔기의 유리 반응기에 결합되어 있는 것일 수 있다.
본 발명에서 "N-terminus"는 펩타이드의 아미노 말단을 의미하는 것으로, 본 발명의 목적상 non-peptidyl polymer를 비롯한 링커와 결합할 수 있는 위치를 말한다. 그 예로, 이에 제한되지는 않으나, N-말단의 최말단 아미노산 잔기 뿐만 아니라 N-말단 주위의 아미노산 잔기를 모두 포함할 수 있으며, 구체적으로는 최말단으로부터 첫 번째 내지 20 번째의 아미노산 잔기를 포함할 수 있다.
본 발명의 비펩타이드성 중합체는 폴리에틸렌글리콜, 폴리프로필렌글리콜, 에틸렌 글리콜과 프로필렌 글리콜의 공중합체, 폴리옥시 에틸화 폴리올, 폴리비닐 알콜, 폴리사카라이드, 덱스트란, 폴리비닐 에틸 에테르, PLA(poly(lactic acid)) 및 PLGA(poly(lactic-glycolic acid))와 같은 생분해성 고분자, 지질 중합체, 키틴류, 히아루론산 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있으며, 구체적으로는 폴리에틸렌글리콜(PEG)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 당해 분야에 이미 알려진 이들의 유도체 및 당해 분야의 기술 수준에서 용이하게 제조할 수 있는 유도체들도 본 발명의 비펩타이드성 중합체의 범위에 포함된다. 비펩타이드성 중합체로는 분자량이 1 내지 100 kDa 범위인 것, 구체적으로는 1 내지 20 kDa 범위인 것을 사용할 수 있다.
본 발명의 생리활성 폴리펩타이드로는 호르몬, 사이토카인, 인터루킨, 인터루킨 결합 단백질, 효소, 항체, 성장인자, 전사조절인자, 혈액인자, 백신, 구조단백질, 리간드 단백질 또는 수용체, 세포표면항원, 수용체 길항물질과 같은 다양한 생리활성 폴리펩타이드, 및 이들의 변이체 및 유사체들을 예시할 수 있다.
구체적으로, 생리활성 폴리펩타이드는 인간 성장 호르몬, 성장호르몬 방출 호르몬, 성장호르몬 방출 펩타이드, 인터페론류와 인터페론 수용체류(예: 인터페론-알파, -베타 및 -감마, 수용성 타입-I-인터페론 수용체등), 콜로니 자극 인자, 인터루킨류(예: 인터루킨-1, -2, -3, -4, -5, -6, -7, -8, -9, -10, -11, -12, -13, -14, -15, -16, -17, -18, -19, -20, -21, -22, -23, -24, -25, -26, -27, -28, -29, -30 등)와 인터루킨 수용체류(예 IL-1 수용체, IL-4수용체등), 효소류 (예:글루코세레브로시다제(glucocerebrosidase), iduronate-2-sulfatase, 알파-galactosidase-A, agalsidase alpha,beta, alpha-L-iduronidase, butyrylcholinesterase, Chitinase, glutamate decarboxylase, imiglucerase, lipase, Uricase, Platelet-Activating Factor Acetylhydrolase, neutral endopeptidase, myeloperoxidase 등), 인터루킨 및 사이토카인 결합 단백질류(예: IL-18bp, TNF-binding protein 등), 마크로파지 활성인자, 마크로파지 펩타이드, B세포 인자, T세포 인자, 단백질 A, 알러지 억제 인자, 세포 괴사 당단백질, 면역독소, 림포독소, 종양 괴사 인자, 종양 억제 인자, 전이 성장 인자, 알파-1 안티트립신, 알부민, alpha-lactalbumin, 아포리포단백질-E, 적혈구 생성 인자, 고 당쇄화 적혈구 생성 인자, angiopoeitin류, 헤모글로빈, thrombin, thrombin receptor activating peptide, thrombomodulin, 혈액인자 VII, 혈액인자 VIIa, 혈액인자 VIII, 혈액인자 IX, 혈액인자 XIII, 플라즈미노젠 활성 인자, fibrin-binding peptides, 유로키나제, 스트렙토키나제, hirudin, 단백질 C, C-반응성 단백질, 레닌 억제제, 콜라게나제 억제제, 수퍼옥사이드 디스뮤타제, 렙틴, 혈소판 유래 성장 인자, 상피 성장 인자, 표피 성장 인자, angiostatin, angiotensin, 골 형성 성장 인자, 골 형성 촉진 단백질, 칼시토닌, 인슐린, 옥신토모듈린, 글루카곤, 글루카곤 유도체, 글루카곤 유사 펩타이드, 엑센딘(Exendin4), 아트리오펩틴, 연골 유도인자, elcatonin, 결합조직 활성인자, tissue factor pathway inhibitor, 여포 자극 호르몬, 황체 형성 호르몬, 황체 형성 호르몬 방출 호르몬, 신경 성장 인자류(예:nerve growth factor, cilliary neurotrophic factor, axogenesis factor-1, brain-natriuretic peptide, glial derived neurotrophic factor, Netrin, neurophil inhibitor factor, neurotrophic factor, neurturin 등), 부갑상선 호르몬, 릴랙신, 씨크레틴, 소마토메딘, 인슐린 유사 성장인자, 부신피질 호르몬, 글루카곤, 콜레시스토키닌, 췌장 폴리펩타이드, 가스트린 방출 펩타이드, 코티코트로핀 방출 인자, 갑상선 자극호르몬, autotaxin, lactoferrin, Myostatin, 수용체류 (예: TNFR (P75), TNFR (P55), IL-1 receptor, VEGF receptor, B cell activating factor receptor 등), 수용체 길항물질(예: IL1-Ra 등), 세포표면항원(예: CD 2, 3, 4, 5, 7, 11a, 11b, 18, 19, 20, 23, 25, 33, 38, 40, 45, 69 등), 단일클론 항체, 폴리클론 항체, 항체 단편류 (예: scFv, Fab, Fab', F(ab')2 및 Fd), 바이러스 유래 백신 항원 등 다양한 종류를 포함한다.
특히 구체적으로 본 발명의 생리활성 폴리펩타이드는, 질병의 치료 또는 예방의 목적으로 인체에 투여될 때 투여 빈도가 높은 인간 성장호르몬, 인터페론류 (인터페론-알파, -베타, -감마 등), 과립구 콜로니 자극인자, 적혈구 생성인자, 혈액인자 VII, 혈액인자 VIIa, 혈액인자 VIII, 인슐린, 옥신토모듈린, 글루카곤, 글루카곤 유사 펩타이드류, 엑센딘류, 항체 단편류 및 각각의 유도체 등일 수 있다. 또한, 상기 생리활성 폴리펩타이드의 천연형과 실질적으로 동등하거나 증가된 기능, 구조, 활성 또는 안정성을 갖는 한, 임의의 변이체 또는 유도체도 본 발명의 생리활성 폴리펩타이드의 범위에 포함된다.
본 발명에서 항체 단편은 특정 항원에 결합할 수 있는 능력을 지닌 Fab, Fab', F(ab')2, Fd 또는 scFv일 수 있으며, 바람직하게는 Fab'이다. Fab 단편은 경쇄의 가변 도메인(VL) 및 불변 도메인(CL)과 중쇄의 가변 도메인(VH) 및 제 1 불변 도메인(CH1)을 포함한다. Fab' 단편은 CH1 도메인의 카르복실 말단에 힌지(hinge) 영역으로부터의 하나 이상의 시스테인을 포함하는 수 개의 아미노산 잔기가 부가되어 있다는 점에서 Fab 단편과 구별된다. Fd 단편은 VH 및 CH1 도메인으로만 구성된 단편이며, F(ab')2는 두 분자의 Fab' 단편이 다이설파이드 결합 혹은 화학적 반응을 통해 결합한 것이다. scFv는 VL 및 VH 도메인만이 펩타이드 링커로 연결된 단일 폴리펩타이드 쇄이다.
또한, 본 발명의 단백질 결합체는 소 성장호르몬 또는 돼지 성장호르몬과 같은 동물 성장호르몬의 지속형 단백질 제제 및 인터페론과 같은 동물의 질병 치료 또는 예방용 단백질의 지속형 단백질 제제의 개발에도 사용될 수 있다.
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 본 발명의 단백질 결합체의 제조방법을 제공한다. 특히, 본 발명은 (a) 양 말단에 반응기를 갖는 하나 이상의 비펩타이드성 중합체, 하나 이상의 생리활성 폴리펩타이드 및 하나 이상의 면역글로불린 Fc 영역을 공유결합으로 연결하여 단백질 결합체를 제조하는 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계를 통해 제조한 공유결합으로 연결된 생리활성 폴리펩타이드, 비펩타이드성 중합체 및 면역글로불린 Fc 영역을 필수적으로 포함하고, 상기 비펩타이드성 중합체가 면역글로불린 Fc 영역의 N 말단을 통해 결합한 단백질 결합체를 분리하는 단계를 포함하는, 위치 특이적 단백질 결합체의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 면역글로불린 Fc 영역은 단량체(dimer) 형태일 수도 있으나, 동형 이량체(homodimer) 또는 이형 이량체(heterodimer) 형태일 수 있다. 이에 따라, 본 발명의 단백질 결합체를 구성하는 면역글로불린 Fc 영역은 1개 또는 2개 이상의 N 말단을 포함할 수 있으며, 이에 따라 하나 이상의 비펩타이드성 중합체와 면역글로불린 Fc 영역의 N 말단을 통해 결합할 수 있다. 특히, 본원발명의 면역글로불린 Fc 영역은 동형 이량체 형태일 수 있고, 이를 통하여 면역글로불린 Fc 영역 동형 이량체에 포함된 2개의 N 말단을 통해 1개 또는 2개의 비펩타이드성 중합체와 연결될 수 있다. 이 경우, 비펩타이드성 중합체는 각각 생리활성 폴리펩타이드와 결합할 수 있으므로, 단백질 결합체를 구성할 수 있다.
이에 따라, 본원발명 단백질 결합체는 1개 또는 2개 이상의 비펩타이드성 중합체, 1개 또는 2개 이상의 생리활성 폴리펩타이드 및 1개 또는 2개 이상의 면역글로불린 Fc 영역이 공유결합으로 연결되어 제조될 수 있다.
상기 (a) 단계에서, 세 구성요소의 공유결합은 순차적으로 또는 동시에 일어날 수 있다. 예를 들어, 비펩타이드성 중합체의 양쪽 말단에 각각 생리활성 폴리펩타이드 및 면역글로불린 Fc 영역을 결합시키는 경우에는, 생리활성 폴리펩타이드와 면역글로불린 Fc 영역 중 어느 하나를 먼저 비펩타이드성 중합체의 한쪽 말단에 결합시킨 후, 나머지 성분을 비펩타이드성 중합체의 다른 쪽 말단에 결합시키는 방식으로 순차적으로 반응을 진행하는 것이 목적하는 단백질 결합체 외의 부산물 생성을 최소화하여 고순도로 제조하는데 유리하다.
따라서, 상기 (a) 단계는
(i) 비펩타이드성 중합체의 한쪽 말단에 면역글로불린 Fc 영역의 특정 위치 또는 생리활성 폴리펩타이드를 공유결합에 의해 연결시키는 단계;
(ii) 상기 반응 혼합물로부터 비펩타이드성 중합체에 면역글로불린 Fc 영역의 특정 위치 또는 생리활성 폴리펩타이드가 결합된 연결체를 균질하게 분리하는 단계; 및
(iii) 분리된 연결체의 비펩타이드성 중합체의 다른 쪽 말단에 생리활성 폴리 또는 면역글로불린 Fc 영역의 특정 위치가 결합된 단백질 결합체를 생성하는 단계를 포함할 수 있다.
한편, 본 발명에서 상기 (a) 단계는 (a1) 비펩타이드성 중합체의 한쪽 말단에 면역글로불린 Fc 영역 또는 생리활성 폴리펩타이드 중 어느 하나와 공유결합으로 연결하여 연결체를 제조하는 단계; 및 (a2) 상기 (a1) 단계에서 제조한 연결체를 분리하여, 분리된 연결체의 비펩타이드성 중합체의 다른 쪽 말단에 생리활성 폴리펩타이드 또는 면역글로불린 Fc 영역 중 다른 하나와 공유결합으로 연결하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.
구체적으로 상기 (a) 단계는 (a1') 비펩타이드성 중합체의 한쪽 말단에 면역글로불린 Fc 영역을 공유결합으로 연결하여 연결체를 제조하는 단계; 및 (a2') 상기 (a1') 단계에서 제조한 연결체를 분리하여, 분리된 연결체의 비펩타이드성 중합체의 다른 쪽 말단에 생리활성 폴리펩타이드를 공유결합으로 연결하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.
또는, 상기 (a) 단계는 (a1'') 비펩타이드성 중합체의 한쪽 말단에 생리활성 폴리펩타이드를 공유결합으로 연결하여 연결체를 제조하는 단계; 및 (a2'') 상기 (a1'') 단계에서 제조한 연결체를 분리하여, 분리된 연결체의 비펩타이드성 중합체의 다른 쪽 말단에 면역글로불린 Fc 영역을 공유결합으로 연결하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.
본 발명에서 상기 (a1) 단계, (a1') 단계 또는 (a1'') 단계에서 생리활성 폴리펩타이드와 비펩타이드성 중합체의 반응 몰 비는 1:1 내지 1:30이고, 면역글로불린 Fc 영역과 비펩타이드성 중합체의 반응 몰 비가 1:1 내지 1:20일 수 있다. 구체적으로, 상기 (a1') 단계에서 면역글로불린 Fc 영역과 비펩타이드성 중합체의 반응 몰 비가 1:1 내지 1:20일 수 있으며 특히 1:1 내지 1:15, 1:1 내지 1:10 또는 1:1 내지 1:4 범위일 수 있고, 상기 (a1'') 단계에서 생리활성 폴리펩타이드와 비펩타이드성 중합체의 반응 몰 비가 1:1 내지 1:30일 수 있으며 특히 1:1 내지 1:15, 1:1 내지 1:10 범위일 수 있다. 상기 반응 몰 비율에 따라 제조 수율 및 비용이 최적화될 수 있다.
또한, 본 발명에서 상기 (a1) 단계, (a1') 단계 또는 (a1'') 단계는 pH 4.0 내지 9.0에서 이루어지는 것일 수 있으며; 상기 (a1) 단계, (a1') 단계 또는 (a1'') 단계는 4.0 내지 25 ℃에서 이루어지는 것일 수 있고; 상기 (a1) 단계, (a1') 단계 또는 (a1'') 단계에서 면역글로불린 Fc 영역 또는 생리활성 폴리펩타이드의 반응 농도가 0.1 내지 100 ㎎/㎖인 것일 수 있다.
특히, 본 발명에서 면역글로불린 Fc 영역과 비펩타이드성 중합체의 결합은
본 발명에서 상기 (a2) 단계, (a2') 단계 또는 (a2'') 단계에서 연결체 : 면역글로불린 Fc 영역 또는 생리활성 폴리펩타이드의 반응 몰 비가 1:0.1 내지 1:20일 수 있으며, 특히 1:0.2 내지 1:10 범위일 수 있다. 구체적으로, 상기 (a2') 단계에서 연결체 : 생리활성 폴리펩타이드의 반응 몰 비가 1:0.1 내지 1:20인 것일 수 있으며, 상기 (a2'') 단계에서 연결체 : 면역글로불린 Fc 영역의 반응 몰 비가 1: 0.1 내지 1:20인 것일 수 있다. 상기 반응 몰 비율에 따라 제조 수율 및 비용이 최적화될 수 있다.
또한, 본 발명에서 상기 (a2) 단계, (a2') 단계 또는 (a2'') 단계는 pH 4.0 내지 9.0에서 이루어지는 것일 수 있으며; 상기 (a2) 단계, (a2') 단계 또는 (a2'') 단계는 4.0 내지 25 ℃에서 이루어지는 것일 수 있고; 상기 (a2) 단계, (a2') 단계 또는 (a2'') 단계에서 면역글로불린 Fc 영역 또는 생리활성 폴리펩타이드의 반응 농도가 0.1 내지 100 ㎎/㎖인 것일 수 있다.
한편, 본 발명의 제조방법은 (a') 비펩타이드성 중합체의 한쪽 말단에 면역글로불린 Fc 영역 또는 생리활성 폴리펩타이드 중 어느 하나와 공유결합으로 연결하여 연결체를 제조하는 단계로서, 생리활성 폴리펩타이드와 비펩타이드성 중합체의 반응 몰 비는 1:1 내지 1:30이고, 면역글로불린 Fc 영역과 비펩타이드성 중합체의 반응 몰 비가 1:1 내지 1:20이며, 환원제가 1 ~ 100 mM 농도로 포함되고, pH 4.0 내지 9.0, 반응온도 4.0 내지 25 ℃에서 이루어지며, 면역글로불린 Fc 영역 또는 생리활성 폴리펩타이드의 반응 농도가 0.1 내지 100 ㎎/㎖인 단계; (b') 상기 (a') 단계에서 제조한 연결체를 분리하여, 분리된 연결체의 비펩타이드성 중합체의 다른 쪽 말단에 생리활성 폴리펩타이드 또는 면역글로불린 Fc 영역 중 다른 하나와 공유결합으로 연결하는 단계로서, 연결체와 면역글로불린 Fc 영역 또는 생리활성 폴리펩타이드의 반응 몰 비가 1:0.1 내지 1:20이고, 환원제가 1 ~ 100 mM 농도로 포함되며, pH 4.0 내지 9.0, 반응온도 4.0 내지 25 ℃에서 이루어지고, 면역글로불린 Fc 영역 또는 생리활성 폴리펩타이드의 반응 농도가 0.1 내지 100 ㎎/㎖인 단계; 및 (c') 상기 (b') 단계를 통해 제조한 공유결합으로 연결된 생리활성 폴리펩타이드, 비펩타이드성 중합체 및 면역글로불린 Fc 영역을 필수적으로 포함하고, 상기 비펩타이드성 중합체가 면역글로불린 Fc 영역의 N 말단을 통해 결합한 단백질 결합체를 분리하는 단계를 포함하는, 위치 특이적 단백질 결합체의 제조방법일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 상기 (a1) 단계, (a1') 단계, (a1'') 단계, (a2) 단계, (a2') 단계, 및 (a2'') 단계의 반응은, 반응에 참가하는 비펩타이드성 중합체의 양쪽 말단 반응기의 종류를 고려하여 필요에 따라 환원제의 존재 하에 수행될 수 있다. 본 발명에서 환원제로서, 나트륨 시아노보로하이드라이드(NaCNBH3), 수소화붕소나트륨, 디메틸아민 붕산염 또는 피리딘 붕산염 등이 사용될 수 있다. 이때 본 발명에서 환원제(예를 들어, 나트륨 시아노보로하이드라이드)의 농도와 반응용액의 온도, pH 그리고 반응에 참여하는 생리활성 폴리펩타이드 및 면역글로불린 Fc 영역의 전체 농도가 전체적으로 제조 수율과 순도에 중요하며, 균질한 고순도의 결합체를 최대한 많이 제조해내기 위한 다양한 조건의 조합이 필요하다. 제조하고자 하는 생리활성 폴리펩타이드의 특성에 따라서 다양한 조건이 가능하며 제한되지 않으나 일반적으로 환원제(예를 들어 나트륨 시아노보로하이드라이드)는 1 ~ 100 mM 농도로 포함되고, 반응용액의 온도는 0 ~ 25 ℃, pH 4.0 ~ 9.0일 수 있으며, 반응 단백질 농도(반응시 포함되는 면역글로불린 Fc 영역 또는 생리활성 폴리펩타이드의 농도)가 5 내지 100 ㎎/㎖인 조건일 수 있다.
한편, 상기 (a2) 단계, (a2') 단계 및 (a2'') 단계에서 연결체를 분리하는 것은 분리된 연결체에 요구되는 순도, 소수성, 분자량 및 전하량과 같은 특성을 고려하여, 단백질의 분리에 사용되는 통상의 방법들 중에서 필요에 따라 적절히 선택하여 수행할 수 있다. 예를 들어, 크기 배제 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 소수성 크로마토그래피 또는 이온 교환 크로마토그래피를 포함하는 다양한 공지의 방법들을 적용하여 수행할 수 있으며, 필요에 따라서는 보다 높은 순도로 정제하기 위해 복수개의 서로 다른 방법을 조합하여 사용할 수 있다.
제조하고자 하는 생리활성 폴리펩타이드의 특성에 따라서 다양한 조건이 가능하나 일반적으로 비펩타이드성 중합체에 결합된 면역글로불린 Fc 영역 또는 생리활성 폴리펩타이드 연결체를 분리하기 위하여 크기 배제 크로마토그래피가 가장 적용이 쉬우나 향후 스케일업과 원하는 특정 위치가 아닌 다른 위치에 비펩타이드성 중합체가 결합된 이성질체 혹은 제조 중 생성될 수도 있는 소량의 변성체들을 분리해내기 위해서는 친화성 크로마토그래피, 소수성 크로마토그래피나 이온 교환 크로마토그래피가 사용될 수 있다.
본 발명에서 상기 (b) 단계는 최종적으로 고순도의 결합체를 정제해내기 위해서 소수성, 분자량 및 전하량과 같은 특성을 고려하여, 단백질의 분리에 사용되는 통상의 방법들 중에서 필요에 따라 적절히 선택하여 수행할 수 있다. 예를 들어, 크기 배제 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 소수성 크로마토그래피 또는 이온 교환 크로마토그래피를 포함하는 다양한 공지의 방법들을 적용할 수 있으며, 필요에 따라서는 보다 높은 순도로 정제하기 위해 복수개의 서로 다른 방법을 조합하여 사용할 수 있다. 제조하고자 하는 생리활성 폴리펩타이드와 비펩타이드성 중합체 및 Fc 불변영역으로 이루어진 결합체의 성질에 따라서 다양한 분리 조건이 가능하나, 일반적으로 비펩타이드성 중합체의 양 말단에 생리활성 폴리펩타이드 및 면역글로불린 Fc 영역이 각각 공유결합에 의해 연결된 결합체를 분리하기 위하여 역시 크기 배제 크로마토그래피가 가장 적용이 쉽다. 하지만, 향후 대량 생산과 원하는 특정 위치가 아닌 다른 위치에 비펩타이드성 중합체를 포함한 생리활성 폴리펩타이드 또는 면역글로불린 Fc 영역이 결합된 이성질체나 부반응 물질들, 제조 중 생성될 수도 있는 소량의 변성체, 미반응 생리활성 폴리펩타이드, 비펩타이드 중합체 및 면역글로불린 Fc 영역 등을 효과적으로 분리해내기 위해서는 소수성 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피 또는 친화성 크로마토그래피를 조합하는 것일 수 있다. 특히, 소수성 크로마토그래피와 이온 교환 크로마토그래피를 조합하는 방법일 수 있으며, 다수의 소수성 크로마토그래피로의 조합 또는 다수의 이온교환 크로마토그래피로의 조합도 가능하며, 제조하고자하는 결합체에 따라서는 이온교환 크로마토그래피 또는 소수성 크로마토그래피를 단독으로 사용하는 방법도 가능하다.
본 발명에서 이온 교환 크로마토그래피는 특정 pH에서 단백질이 전하성을 띠는 것을 이용하여, 전하를 띤 이온 수지가 고정된 크로마토그래피를 통과시켜 단백질의 이동 속도의 차이를 통해 단백질을 분리해내는 것으로서, 음이온 교환 크로마토그래피 또는 양이온 교환 크로마토그래피일 수 있다.
상기 음이온 교환 크로마토그래피는 양이온 수지를 이용하는 것으로, 해당 음이온 교환 크로마토그래피를 구성하는 수지의 작용기가 쿼터너리암모늄(Q), 쿼터너리아미노에틸 (QAE), 디에틸아미노에틸 (DEAE), 폴리에틸렌이민 (PEI), 디메틸아미노메틸(DMAE), 및 트리메틸아미노에틸 (TMAE)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것 중 하나인 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 양이온 교환 크로마토그래피는 음이온 수지를 이용하는 것으로, 해당 양이온 교환 크로마토그래피를 구성하는 수지의 작용기가 메틸설포네이트 (S), 설포프로필 (SP), 카르복시메틸 (CM), 설포에틸 (SE) 및 폴리아스파르트산（Poly aspartic acid)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것 중 하나인 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 소수성 크로마토그래피는 이를 구성하는 수지의 작용기가 페닐(phenyl), 옥틸(octyl), (이소)프로필((iso)propyl), 부틸(butyl) 및 에틸(ethyl)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것 중 하나일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 크기배제 크로마토그래피는 이를 구성하는 수지가 수퍼덱스 (superdex）, 세파크릴 (sephacryl), 수퍼로즈 (superose)및 세파덱스 (sephadex)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것 중 하나일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
아울러, 본 발명에서 친화성 크로마토그래피는 특정 단백질과 상호작용할 수 있는 리간드가 부착된 수지를 이용하여, 해당 리간드와 상호작용을 하는지 여부에 따라 단백질 이동 속도의 차이를 이용하여 단백질을 분리해내는 것으로, 상기 친화성 크로마토그래피를 구성하는 수지의 작용기는 프로테인에이 (proteinA), 헤파린 (heparin), 블루 (blue), 벤자미딘 (benzamidine), 금속이온 (코발트, 니켈, 구리) 및 비펩타이드성 중합체의 양쪽 말단이 각각 면역글로불린 Fc 영역 및 생리활성 폴리펩타이드와 결합된 단백질 결합체의 구성 성분의 일부 혹은 전체에 대한 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것 중 하나일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 상기 (b) 단계는 단백질 결합체를 구성하는 비펩타이드성 중합체와 면역글로불린 Fc 영역이 면역글로불린 Fc 영역의 N 말단을 통해 결합한 단백질 결합체를 분리하는 것일 수 있다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 90% 이상의 N-말단 선택성을 갖는 단백질 결합체 제조방법을 제공한다. 구체적으로, 본 발명에 따른 제조방법에 의해 제조된 단백질 결합체는 비펩타이드성 중합체의 일 말단이 면역글로불린 Fc 영역의 N-말단에 90% 이상의 선택성으로 연결될 수 있으며, 더욱 구체적으로는 95 % 이상, 더욱 구체적으로는 98%이상, 더욱 구체적으로는 99%이상으로 선택적으로 연결될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 "N-말단 90% 이상의 선택성으로 연결"된다는 것은, 본 발명에 따른 일련의 반응으로 얻은 단백질 결합체 분획을 정제하여 제조한 단백질 결합체의 90% 이상이 Fc 영역의 N-말단에 위치특이적으로 비펩타이드성 중합체가 연결된 것을 의미한다. 상기 "90% 이상"은 v/v, w/w, peak/peak 등을 의미할 수 있으며, 특정 단위에 제한되는 것은 아니다. 반응 조건, 비펩타이드성 중합체의 반응기 등에 의해 Fc 영역의 N-말단에 위치특이적으로 연결된 비펩타이드성 중합체를 포함하는 단백질 결합체의 수율이 변할 수 있다.
본 발명의 실시예에서는 다양한 생리활성 폴리펩타이드, 비펩타이드성 중합체, 및 Fc 결합체의 제조를 통해, 본 발명에 따른 제조방법으로 90% 이상의 N-말단 선택성을 갖는 단백질 결합체를 제조할 수 있음을 확인하였다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 단백질 결합체 또는 상기 단백질 결합체 제조방법에 따라 제조된 단백질 결합체를 유효성분으로 포함하는 생리활성 폴리펩타이드의 생체 내 지속성 및 안정성이 증가된 약학적 조성물을 제공한다.
구체적으로, 상기 약학적 조성물에는 본 발명의 생리활성 폴리펩타이드-비펩타이드성 중합체-면역글로불린 Fc 영역의 N-말단을 포함하는 단백질 결합체가 90 % 이상, 더욱 구체적으로는 95 % 이상, 더욱 구체적으로는 98%이상, 더욱 구체적으로는 99%이상으로 포함될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 "90% 이상"은 v/v, w/w, peak/peak 등을 의미할 수 있으며, 특정 단위에 제한되는 것은 아니다.
상기 약학적 조성물은 약학적으로 허용가능한 부형제를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있으며, 바람직하게는 주사제 형태로 투여될 수 있다. 또한, 본 발명의 약학적 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 잘 알려진 방법을 사용하여 제형화될 수 있다. 제형은 정제, 알약, 분말, 새세이 (sachet), 엘릭서 (elixir), 현탁액, 에멀젼, 용액, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀, 멸균 주사용액, 멸균 분말 등의 형태일 수 있다. 제제화에 적합한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말디톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 또는 광물유 등이 사용될 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 단백질 결합체의 실제 투여량은 치료할 질환, 투여 경로, 환자의 연령, 성별 및 체중, 및 질환의 중증도 등의 여러 관련 인자와 함께, 활성성분인 생리활성 폴리펩타이드의 종류에 따라 결정된다. 본 발명의 단백질 결합체는 혈중 지속성과 생체 내 역가가 매우 우수하므로, 본 발명의 단백질 결합체를 포함하는 펩타이드 제제의 투여량, 투여 횟수 및 빈도를 현저하게 감소시킬 수 있다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 제조방법으로 제조된 단백질 결합체를 90 % 이상으로 포함하는 단백질 결합체의 집합체를 제공한다.
본 발명에서 "단백질 결합체의 집합체 (population of complex)", "집합체 (population)"는 혼용되어 사용될 수 있으며, 본 발명의 Fc N-말단에 비펩타이드성 중합체가 결합한 단백질 결합체 및/또는 Fc N-말단이 아닌 다른 부위에 비펩타이드성 중합체가 결합한 단백질 결합체를 포함하는 단백질 결합체 군 (group)을 의미한다.
상기 집합체는 Fc N-말단에 비펩타이드성 중합체가 결합한 단백질 결합체만을 포함할 수도 있고, Fc N-말단이 아닌 다른 부위에 비펩타이드성 중합체가 결합한 단백질 결합체를 함께 포함할 수도 있다. 구체적으로, 상기 집합체에 포함되는, 본 발명의 Fc N-말단에 비펩타이드성 중합체가 결합한 단백질 결합체의 비율은 90% 이상일 수 있고, 더욱 구체적으로는 95 % 이상, 더욱 구체적으로는 98%이상, 더욱 구체적으로는 99 % 이상 일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 "90% 이상"은 v/v, w/w, peak/peak 등을 의미할 수 있으며, 특정 단위에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 목적상 상기 집합체는 본원발명의 제조방법을 통해 제조한 단백질 결합체로부터 불순물, 미반응 물질 등을 제거하여 Fc N-말단에 비펩타이드성 중합체가 결합한 단백질 결합체의 비율을 높인 집합체를 의미할 수 있다. 또한, 90% 이상의 N-말단 선택성을 갖는 결합체 제조방법에 의해 제조된 집합체 일 수 있으나, 제한되지 않는다. 본 발명에 따른 방법에 의해 효율적으로 정제될 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
실시예 1: 인터페론 알파 (IFNα)-PEG-면역글로불린 Fc의 N-말단 영역 (Fc) 결합체의 제조
1-1. IFNα-PEG 연결체의 제조
양쪽 말단에 알데히드 반응기를 가진 분자량 3.4 kDa의 폴리에틸렌글리콜(PEG)인 ALD-PEG-ALD (IDB, 한국)를 인간 인터페론 알파-2b (hIFNα-2b, 분자량 19 kDa)가 5 ㎎/㎖ 농도로 용해된 100 mM 인산염 완충용액에 hIFNα : PEG의 몰비가 각각 1:5 ∼ 1:10이 되도록 첨가하였다. 여기에 환원제인 나트륨 시아노보로하이드라이드 (NaCNBH3, Sigma 사)를 최종 농도 20 mM이 되도록 첨가하고, 4 ∼ 8℃에서 천천히 교반하면서 약 1 시간 동안 반응시켰다. 인터페론 알파의 아미노 말단 부위에 선택적으로 PEG가 연결되고, PEG와 인터페론 알파가 1:1로 결합된 연결체를 얻기 위하여 상기 반응 혼합물을 가지고 SP HP (GE healthcare, 미국) 음이온 교환 (cation exchange) 크로마토그래피를 실시하여 고순도로 IFNα-PEG 연결체를 정제 하였다.
1-2. IFNα-PEG-Fc 결합체 제조
상기 실시예 1-1에서 정제한 IFNα-PEG 연결체에 면역글로불린 Fc의 N 말단 프롤린 잔기에 결합시키기 위하여, 면역글로불린 Fc 단편을 IFNα-PEG 연결체:면역글로불린 Fc의 몰비가 각각 1:1 ∼ 1:4 가 되도록 첨가하여 반응시켰다. 반응액을 100 mM 인산염 완충용액(pH 5.5 내지 6.5) 상태로 만들었고, 환원제로서 나트륨 시아노보로하이드라이드 (NaCNBH3, Sigma 사)를 최종 농도가 20∼50 mM이 되도록 첨가한 후 4∼8 ℃에서 약 12∼16 시간 동안 천천히 교반하면서 반응시켰다.
1-3. IFNα-PEG-Fc 결합체의 분리 및 정제
상기 실시예 1-2의 결합반응 후 미반응 물질 및 부산물을 제거하고 생성된 IFNα-PEG-Fc 단백질 결합체를 정제하기 위하여 반응 혼합물을 10 mM Tris (pH 7.5) 버퍼교환 후 Source Q (GE healthcare, 미국) 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼에 통과시켜 결합되지 않은 Fc를 제거하고 IFNα-PEG-Fc 단백질 결합체 분획을 얻었다. 구체적으로는, 반응액을 10 mM Tris (pH 7.5)으로 평형화시킨 Source Q 컬럼에 부하하고 50 mM 염화나트륨 (NaCl)을 포함한 20 mM Tris (pH 7.5) 완충용액을 사용하여 등용매 세척을 통하여 불순물을 제거한 후 150 mM 염화나트륨 (NaCl)을 포함한 완충용액으로 농도구배를 주어 IFNα-PEG-Fc 단백질 결합체를 정제하였다. 얻어진 IFNα-PEG-Fc 단백질 결합체 분획에는 불순물로서 소량의 미반응 Fc 및 인터페론 알파 이량체가 혼재되어 있기 때문에 이를 제거하기 위해 추가로 Source iso (GE healthcare, 미국), 소수성 크로마토그래피를 수행하였다. 구체적으로는, Source iso (GE healthcare, 미국)을 약 1.3 M 암모늄설페이트를 포함한 20 mM 포타슘포스페이트 (pH 6.0) 완충용액으로 평형화시킨 후 정제된 IFNα-PEG-Fc 단백질 결합체 분획을 부하하고 20 mM 포타슘포스페이트 (pH 6.0) 완충용액을 사용한 직선 농도구배 방법으로 흘려 최종적으로 고순도의 IFNα-PEG-Fc 단백질 결합체를 정제하였다. 제조된 IFNα-PEG-Fc 단백질 결합체의 Fc 부분의 N 말단 선택성은 펩타이드 맵핑 분석법으로 확인하였으며 90 % 이상이었다.
실시예 2: 인간 성장호르몬(hGH)-PEG-Fc 결합체의 제조
2-1. hGH-PEG 연결체의 제조
양쪽 말단에 알데히드 반응기를 가진 분자량 3.4 kDa의 폴리에틸렌글리콜인 ALD-PEG-ALD (IDB, 한국)를 인간 성장호르몬 (hGH, 분자량 22 kDa)가 5 ㎎/㎖ 농도로 용해된 100 mM 인산염 완충용액에 hGH : PEG의 몰비가 각각 1:5 ∼ 1:10이 되도록 첨가하였다. 여기에 환원제인 나트륨 시아노보로하이드라이드 (NaCNBH3, Sigma 사)를 최종 농도 20 mM이 되도록 첨가하고, 4 ∼ 8 ℃에서 천천히 교반하면서 약 1시간동안 반응시켰다. 인간 성장호르몬의 아미노 말단 부위에 선택적으로 PEG가 연결되고, PEG와 hGH가 1:1로 결합된 연결체를 얻기 위하여 상기 반응 혼합물을 가지고 Source Q (GE healthcare, 미국) 음이온 교환 (anion exchange) 크로마토그래피를 실시하여 고순도의 hGH-PEG를 정제하였다.
2-2. hGH-PEG-Fc 결합체 제조
상기 실시예 2-1에서 정제한 hGH-PEG 연결체에 면역글로불린 Fc의 N 말단에 결합시키기 위하여, 면역글로불린 Fc 단편을 hGH-PEG 연결체 : 면역글로불린 Fc의 몰비가 각각 1:1 ∼ 1:4가 되도록 첨가하여 반응시켰다. 반응액을 100 mM 인산염 완충용액 (pH 5.5 내지 6.5) 상태로 만들었고, 환원제로서 나트륨 시아노보로하이드라이드 (NaCNBH3, Sigma 사)를 최종 농도 20 mM이 되도록 첨가하고, 4 ∼ 8 ℃에서 천천히 교반하면서 반응시켰다.
2-3. hGH-PEG-Fc 결합체의 분리 및 정제
상기 실시예 2-2의 결합반응 후 미반응 물질 및 부산물을 제거하고 생성된 hGH-PEG-Fc 단백질 결합체를 정제하기 위하여 반응 혼합물을 10 mM Tris (pH 7.5) 버퍼교환 후 Source Q (GE healthcare, 미국) 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼에 통과시켜 결합되지 않은 Fc를 제거하고 hGH-PEG-Fc 단백질 결합체 분획을 얻었다. 구체적으로는 반응액을 10 mM Tris (pH 7.5)으로 평형화시킨 Source Q 컬럼에 부하하고 70 mM 염화나트륨 (NaCl)을 포함한 20 mM Tris (pH 7.5) 완충용액을 사용하여 불순물을 제거하기 위하여 등용매 세척을 해내고, 150 mM 염화나트륨을 포함한 20 mM Tris (pH 7.5) 완충용액을 사용하여 농도구배를 주어 고순도의 hGH-PEG-Fc 단백질 결합체를 정제하였다. 제조된 hGH-PEG-Fc 단백질 결합체의 Fc 부분의 N 말단 선택성은 펩타이드 맵핑 분석법으로 확인하였으며 90 % 이상이었다.
실시예 3: 인간 과립구 콜로니 자극인자(G-CSF)-PEG-Fc 결합체의 제조
천연형 G-CSF의 17번째 및 65번째 아미노산이 세린으로 치환된 유도체 (17,65S-G-CSF)를 이용하여 17,65S-G-CSF-PEG-Fc 단백질 결합체를 제조 및 정제하였다.
3-1. 17,65 S-G-CSF-PEG 연결체의 제조
양쪽 말단에 알데히드 반응기를 가진 분자량 3.4 kDa의 폴리에틸렌 글리콜인 ALD-PEG-ALD (IDB, 한국)를 17,65S-G-CSF (분자량 18 kDa)가 5 ㎎/㎖ 농도로 용해된 100 mM 인산염 완충용액에 G-CSF : PEG의 몰비가 각각 1:5 ∼ 1:10이 되도록 첨가하였다. 여기에 환원제인 나트륨 시아노보로하이드라이드 (NaCNBH3, Sigma 사)를 최종 농도 20 mM이 되도록 첨가하고, 4 ∼ 8 ℃에서 천천히 교반하면서 약 1시간 동안 반응시켰다. 인간 과립구 콜로니 자극인자의 아미노 말단 부위에 선택적으로 PEG가 연결되고, PEG와 G-CSF가 1:1로 결합된 연결체를 얻기 위하여 상기 반응 혼합물을 가지고 SP HP (GE healthcare, 미국) 양이온 교환 (anion exchange) 크로마토그래피를 실시하여 고순도의 17,65S-G-CSF-PEG 연결체를 정제하였다.
3-2. 17,65 S-G-CSF-PEG-Fc 결합체 제조
상기 실시예 3-1에서 정제한 17,65S-G-CSF-PEG 연결체에 면역글로불린 Fc의 N 말단을 결합시키기 위하여, 면역글로불린 Fc 단편을 17,65S-G-CSF-PEG 연결체 : 면역글로불린 Fc의 몰비가 각각 1:1 ∼ 1:4가 되도록 첨가하여 반응시켰다. 반응액을 100 mM 인산염 완충용액 (pH 5.5 내지 6.5) 상태로 만들었고, 환원제로서 나트륨 시아노보로하이드라이드 (NaCNBH3, Sigma 사)를 최종 농도 20 mM이 되도록 첨가하고, 4 ∼ 8 ℃에서 천천히 교반하면서 반응시켰다.
3-3. 17,65 S-G-CSF-PEG-Fc 결합체의 분리 및 정제
상기 실시예 3-2의 결합반응 후 미반응 물질 및 부산물을 제거하고 생성된 17,65S-G-CSF-PEG-Fc 단백질 결합체를 정제하기 위하여 반응 혼합물을 2 M NaCl이 포함된 10 mM Tris (pH 8.0)으로 평형화시킨 Source Phenyl 컬럼에 부하하고, 20 mM Tris (pH 8.0) 완충용액을 사용하여 불순물을 제거하기 위하여 농도구배를 주어 17,65S-G-CSF-PEG-Fc 단백질 결합체를 정제하였다. 얻어진 17,65S-G-CSF-PEG-Fc 단백질 결합체 분획에는 불순물로서 소량의 미반응 면역글로불린 Fc 및 17,65S-G-CSF 이량체가 혼재되어 있기 때문에 이를 제거하기 위해 추가로 Q HP (GE healthcare, 미국), 음이온 크로마토그래피를 수행하였다. Q HP (GE healthcare, 미국)을 20 mM Tris (pH 8.0) 완충용액으로 평형화시킨 후 정제된 17,65S-G-CSF-PEG-Fc 단백질 결합체 분획을 부하하고 1M 염화나트륨을 포함한 20 mM Tris (pH 8.0) 완충용액을 사용한 직선 농도구배 방법으로 흘려 고순도의 17,65S-G-CSF-PEG-Fc 단백질 결합체를 정제하였다. 제조된 17,65S-G-CSF-PEG-Fc 단백질 결합체의 Fc 부분의 N 말단 선택성은 펩타이드 맵핑 분석법으로 확인하였으며 90 % 이상이었다.
실시예 4: 인간 적혈구 생성인자(EPO)-PEG-Fc 결합체의 제조
4-1. 인간 적혈구 생성인자(EPO)-PEG 연결체의 제조
양쪽 말단에 알데히드 반응기를 가진 분자량 3.4 kDa의 폴리에틸렌글리콜인 ALD-PEG-ALD (IDB, 한국)를 인간 적혈구 생성인자(EPO, 분자량 30.6 kDa)가 5 ㎎/㎖ 농도로 용해된 100 mM 인산염 완충용액에 EPO : PEG의 몰비가 1:15가 되도록 첨가하였다. 여기에 환원제인 나트륨 시아노보로하이드라이드 (NaCNBH3, Sigma 사)를 최종 농도 20 mM이 되도록 첨가하고, 4 ∼ 8 ℃에서 천천히 교반하면서 약 2 시간 동안 반응시켰다. 인간 적혈구 생성인자의 아미노 말단 부위에 선택적으로 PEG가 연결되고, PEG와 인간 적혈구 생성인자가 1:1로 결합된 연결체를 얻기 위하여 상기 반응 혼합물을 가지고 SP HP (GE healthcare, 미국) 양이온 교환 크로마토그래피를 실시하여 EPO-PEG를 포함한 메인 분획을 정제하였다.
4-2. EPO-PEG-Fc 결합체 제조
상기 실시예 4-1에서 정제한 EPO-PEG 연결체에 면역글로불린 Fc의 N 말단을 결합시키기 위하여, 면역글로불린 Fc 단편을 EPO-PEG 연결체:Fc의 몰비가 1:4가 되도록 첨가하여 반응시켰다. 반응액을 100 mM 인산염 완충용액 (pH 5.5 내지 6.5) 상태로 만들었고, 환원제로서 나트륨 시아노보로하이드라이드 (NaCNBH3, Sigma 사)를 최종 농도 20 mM이 되도록 첨가하고, 4 ∼ 8 ℃에서 천천히 교반하면서 약 12 ∼ 16 시간 동안 반응시켰다.
4-3. EPO-PEG Gc 결합체의 분리 및 정제
상기 실시예 4-2의 결합반응 후 미반응 물질 및 부산물을 제거하고 생성된 EPO-PEG-Fc 단백질 결합체를 정제하기 위하여 반응 혼합물을 Source Q (GE healthcare, 미국) 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼에 통과시켜 결합되지 않은 Fc를 제거하고 EPO-PEG-Fc 단백질 결합체 분획을 얻었다. Source Q 정제는 반응액을 20 mM Tris (pH 7.5) 버퍼로 평형화시킨 Source Q 컬럼에 부하하고 1 M 염화나트륨 (NaCl)을 포함한 완충용액으로 농도구배를 주어 EPO-PEG-Fc 단백질 결합체를 정제하였다. 얻어진 EPO-PEG-Fc 단백질 결합체 분획에는 불순물로서 소량의 미반응 Fc 및 EPO 이량체가 혼재되어 있기 때문에 이를 제거하기 위해 추가로 Source iso (GE healthcare, 미국) 소수성 크로마토그래피를 수행하였다. 구체적으로는, Source iso (GE healthcare, 미국)을 1.6 M 암모늄설페이트를 포함한 50 mM Tris (pH 7.5) 완충용액으로 평형화시킨 후 정제된 EPO-PEG-Fc 단백질 결합체 분획을 부하하고 50 mM Tris (pH 7.5) 완충용액을 사용한 직선 농도구배 방법으로 흘려 고순도의 EPO-PEG-Fc 단백질 결합체를 정제하였다. 제조된 EPO-PEG-Fc 단백질 결합체의 Fc 부분의 N 말단 선택성은 펩타이드 맵핑 분석법으로 확인하였으며, 90% 이상이었다.
실시예 5: 인간 인슐린(Insulin)-PEG-Fc 결합체의 제조
5-1. Insulin-PEG 연결체의 제조
인슐린 분말을 10 mM HCl 용액에 용해시킨 후, 3.4 K protion-ALD2 PEG (프로피온 알데히드기를 2개 가지고 있는 PEG, IDB, 한국)를 인슐린 베타 체인의 N 말단에 페길화(PEGylation)시키기 위하여, 인슐린 : PEG의 몰 비를 1 : 2로, 인슐린 농도를 5 ㎎/㎖로 4 ℃ 내지 상온에서 약 2시간 반응시켰다. 이때 반응은 50 mM 소디움 시트레이트 (Sodium Citrate) pH 6.0, 45% 이소프로판올에서 이루어졌으며, 2 내지 20 mM 농도의 나트륨 시아노보로하이드라이드 (NaCNBH3, Sigma 사)를 첨가하여 반응시켰다. 반응액은 소디움 시트레이트 (pH 3.0), 45% EtOH가 포함된 버퍼와 KCl 농도 구배를 이용한 SP HP (GE Healthcare) 컬럼을 사용하여 정제하였다.
5-2. Insulin-PEG-Fc 결합체 제조
Insulin-PEG-Fc 결합체를 제조하기 위하여, 상기 실시예 5-1을 통하여 얻은 모노 페길화된(mono-PEGylated) 인슐린과 Fc의 몰비가 약 1:1이 되도록 하고 전체 단백질 농도를 20 ∼ 50 ㎎/㎖로 하여 20 ∼ 25 ℃에서 약 15 내지 17 시간 반응시켰다. 이때 반응액은 100 mM HEPES, 22 mM Potassium phosphate, 10 % 에탄올, pH 7.5 내지 8.5이고, 환원제인 20 mM 나트륨 시아노보로하이드라이드 (NaCNBH3, Sigma 사)를 첨가하였다.
5-3. Insulin-PEG-Fc 결합체의 분리 및 정제
반응이 종결된 후 반응액은 Source Q (GE Healthcare) 컬럼에 Tris-HCl (pH 7.5) 버퍼와 NaCl 농도 구배를 이용하여 반응하지 않은 인슐린, 반응하지 않은 면역글로불린 Fc 단편, Insulin-PEG-Fc 결합체, 모노 페길화된 인슐린(Insulin-PEG)이 2개 이상 결합한 결합체를 분리 정제하였다. 이때 인슐린-PEG-면역글로불린 Fc 단편 결합체 제조 비율은 정제 크로마토그래피의 280 nm에서의 UV 흡광 정도를 관찰하여 결정하였다.
이후 Source iso (GE Healthcare)를 2차 컬럼으로 사용하여, 잔류한 면역글로불린 Fc 및 멀티 페길화된 인슐린 결합체를 제거하였으며 이때, Tris-HCl (pH 7.5)가 포함된 Ammonium Sulfate의 농도 구배를 이용하여 용출하여 고순도의 Insulin-PEG-Fc 결합체를 정제하였다. 제조된 Insulin-PEG-Fc 단백질 결합체의 Fc 부분의 N 말단 선택성은 펩타이드 맵핑 분석법으로 확인하였으며 90 % 이상이었다.
실시예 6: 엑센딘 4 유도체 (CA-Exendin 4)-PEG-Fc 결합체의 제조
6-1. CA-Exendin4 연결체의 제조
인슐린 분말을 10 mM HCl에 용해시킨 후, 3.4K propion-ALD2 PEG (프로피온 알데히드기를 2개 가지고 있는 PEG, IDB, 한국)를 CA-Exendin4의 라이신 위치에 페길화(PEGylation)시키기 위하여, CA-Exendin4 : PEG의 몰비를 1:5 ∼ 1:15로, CA-Exendin4 농도를 6 ∼ 12 ㎎/㎖로 4 ∼ 8 ℃ 내지 상온에서 약 4 ∼ 12 시간 반응시켰다. 이때 반응은 0.1 M HEPES pH 7.5 내지 8.5, 45% 이소프로판올에서 이루어졌으며, 2 ∼ 20 mM 농도의 나트륨 시아노보로하이드라이드 (NaCNBH3, Sigma 사)를 첨가하여 반응시켰다. 반응액은 소디움 시트레이트 (pH 2.0), 45 % EtOH가 포함된 버퍼와 KCl 농도 구배를 이용한 Source S (GE Healthcare) 컬럼을 사용하여 정제하였다.
6-2. CA-Exendin4-PEG-Fc 결합체 제조
CA-Exendin4-PEG-Fc 결합체를 제조하기 위하여, 상기 실시예 6-1을 통해 얻은 모노 페길화된(mono-PEGylated) CA-Exendin4에 Fc를 첨가하여 전체 단백질 농도를 10 ∼ 50 ㎎/㎖로 하여 4 ∼ 8 ℃에서 약 12 ∼ 17시간 반응시켰다. 이때 반응액은 0.1 M 포타슘 포스페이트 pH 5.5 내지 8.5이며 환원제인 20 mM 나트륨 시아노보로하이드라이드 (NaCNBH3, Sigma 사)를 첨가하였다.
6-3. CA-Exendin4-PEG-Fc 결합체의 분리 및 정제
반응이 종결된 후 반응액은 Source Phenyl (GE Healthcare) 컬럼에 Tris-HCl (pH 7.5) 버퍼와 NaCl 농도 구배를 이용하여 반응하지 않은 면역글로불린 Fc 단편을 분리 정제하였다. 이때 CA-Exendin4-PEG-면역글로불린 Fc 단편 결합체 제조 비율은 정제 크로마토그래피의 280 nm에서의 UV 흡광 정도를 관찰하여 결정하였다.
이후, Source Q (GE Healthcare)를 2차 컬럼으로 사용하여, 잔류한 면역글로불린 Fc 및 멀티 페길화된 CA-Exendin4 결합체를 제거하였으며 이때, Tris-HCl(pH 7.5)가 포함된 NaCl의 농도 구배를 이용하여 용출하여 고순도의 CA-Exendin4-PEG-Fc 결합체를 정제하였다. 제조된 CA-Exendin4-PEG-Fc 단백질 결합체의 Fc 부분의 N 말단 선택성은 펩타이드 맵핑 분석법으로 확인하였으며 90 % 이상이었다.
실시예 7: 반응기 종류를 달리하는 PEG를 이용한 단백질 결합체의 제조
7-1. 17,65 S-G-CSF-PEG 연결체의 제조
양쪽 말단의 반응 그룹이 모두 석시니미딜 프로피오네이트 (succinimidyl alphamethylbutanoate; SMB)인 분자량 3.4 kDa의 폴리에틸렌글리콜(SMB-PEG-SMB, Nektar, 미국)을 17,65S-G-CSF (분자량 18 kDa)가 10 ㎎/㎖ 농도로 용해된 20 mM 인산염 완충용액 (pH 8.0)에 G-CSF : PEG의 몰비가 1:3이 되도록 첨가하였다. 반응은 상온에서 천천히 교반하면서 30분 동안 수행하였다. 17,65S-G-CSF의 아미노 말단 부위에 선택적으로 PEG가 연결되고, PEG와 17,65S-G-CSF가 1:1로 결합된 연결체를 얻기 위하여 상기 반응 혼합물을 가지고 SP HP (GE Healthcare, 미국) 양이온 교환 크로마토그래피를 실시하였다.
7-2. 17,65 S-G-CSF-PEG-Fc 결합체의 제조
상기 실시예 7-1에서 정제한 17,65S-G-CSF-PEG 연결체에 면역글로불린 Fc의 N 말단 이외의 영역을 결합시키기 위하여, 면역글로불린 Fc 단편을 17,65S-G-CSF-PEG 연결체 : 면역글로불린 Fc의 몰비가 1:4 내지 1:8이 되도록 첨가하여 반응시켰다. 반응은 20 mM 인산염 완충용액(pH 5.5 내지 6.5) 상에서 수행하였으며, 상온에서 약 2시간 동안 천천히 교반하면서 반응시켰다.
7-3. 17,65 S-G-CSF-PEG-Fc 결합체의 분리 및 정제
상기 실시예 7-2의 결합반응 후 미반응 물질 및 부산물을 제거하고 생성된 17,65S-G-CSF-PEG-Fc 단백질 결합체를 정제하기 위하여 반응 혼합물을 Q HP (GE Healthcare, 미국) 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼에 통과시켜 결합되지 않은 Fc를 제거하고 17,65S-G-CSF-PEG-Fc 단백질 결합체 분획을 얻었다. Q HP 정제는 반응액을 20 mM Tris (pH 8.0) 버퍼로 평형화시킨 Q HP 컬럼에 부하하고 1 M 염화나트륨(NaCl)을 포함한 완충용액으로 농도구배를 주어 17,65S-G-CSF-PEG-Fc 단백질 결합체를 정제하였다. 얻어진 17,65S-G-CSF-PEG-Fc 단백질 결합체 분획에는 불순물로서 소량의 미반응 Fc 및 17,65S-G-CSF 이량체가 혼재되어 있기 때문에 이를 제거하기 위해 추가로 Source iso (GE Healthcare, 미국) 소수성 크로마토그래피를 수행하였다. Source iso (GE Healthcare, 미국)을 1.2 M 암모늄설페이트를 포함한 50 mM Tris (pH 7.5) 완충용액을 사용한 직선 농도구배 방법으로 흘려 고순도의 17,65S-G-CSF-PEG-Fc 단백질 결합체를 정제하였다. 제조된 17,65S-G-CSF-PEG-Fc 단백질 결합체의 Fc 부분의 N 말단 선택성은 펩타이드 맵핑 분석법으로 확인하였으며 90 % 이상이었다.
실시예 8: 반응기 종류를 달리하는 PEG를 이용한 단백질 결합체의 제조
본 발명자가 기출원하였던 (대한민국 출원번호 제10-2012-0111537호) FacVII의 유도체인 FacVII-ATKAVC의 FacVII-ATKAVC-PEG-Fc 결합체를 제조하였다.
8-1. PEG-Fc 결합체의 분리 및 정제
말레이미드-10 kDa-PEG-알데하이드 (NOF, 일본)의 알데하이드 반응기와 면역글로불린 Fc 단편의 N 말단과 먼저 결합을 시키기 위하여, 100 mM 포스페이트 완충액 (pH 5.5 내지 6.5)의 조건하에서 면역글로불린 Fc 영역과 말레이미드-10 kDa PEG-알데하이드를 1:1 몰비로 혼합하고, 단백질 농도 10 ㎎/㎖ 조건하에서 환원제인 20 mM 나트륨 시아노보로하이드라이드 (NaCNBH3, Sigma 사)을 가하여 저온(4 ∼ 8℃)에서 약 2시간 동안 반응시켰다. 모노 페길화된 면역글로불린 Fc 단편 (말레이미드-10 kDa PEG-Fc)를 얻기 위해서 Source Q (GE Healthcare, 미국) 음이온 크로마토그래피를 이용하였으며, 20 mM 트리스 완충액 pH 7.5에서 염화나트륨의 농도 구배로 용출하였다.
8-2. FacVII-ATKAVC-PEG-Fc 결합체 제조
FacVII-ATKAVC는 10 mM Glycil-Glycine 완충액 pH 5.5 조건에서 환원제인 0.5 ∼ 2 mM 트리페닐 포스핀 (triphenylphosphine-3,3', 3''-trisulfonic trisodium salt hydrate)를 가하여 상온에서 약 2시간 동안 반응시켜 C 말단을 환원시켰다. C 말단이 환원된 FacVII-ATKAVC와 모노 페길화된 면역글로불린 Fc 단편 (말레이미드-10 kDa PEG-Fc)를 1:4 ∼ 1:20 몰비로 혼합하여, 총 단백질 농도 1 ∼ 2 ㎎/㎖로 50 mM 트리스 완충액 pH 7.5 조건하에서 약 2시간 동안 상온에서 반응시켰다.
8-3. FacVII-ATKAVC-PEG-Fc 결합체의 분리 및 정제
상기 실시예 8-2의 반응액은 음이온 크로마토그래피인 Source Q를 수행하여 완충액 20 mM 트리스 완충액 pH 7.5에서 염화나트륨의 농도구배로 FacVII-ATKAVC-10k PEG-Fc 복합체를 용출하였다. FacVII-ATKAVC-PEG-Fc 복합체의 FacVII를 활성화시키기 위하여 0.1 M Tris-HCl 완충액 pH 8.0에서 FacVII 기준 약 4 ㎎/㎖ 조건으로 약 18시간 동안 저온(4 ∼ 8℃)에서 용액 반응 (solution reaction)하였다. 10 mM Glycil-Glycine 완충액 pH 5.5로 크기배제 크로마토그래피인 Superdex 200 (GE Healthcare, 미국)을 수행하여, 최종적으로 고순도의 FacVIIa-ATKAVC-PEG-Fc를 정제하였다. 제조된 FacVIIa-ATKAVC-PEG-Fc 단백질 결합체의 Fc 부분의 N 말단 선택성은 펩타이드 맵핑 분석법으로 확인하였으며 90 % 이상이었다.
실시예 9: 분자량이 다른 PEG를 이용한 단백질 결합체의 제조
분자량이 10 kDa이고, 양쪽 말단에 알데히드 반응기를 가진 폴리에틸렌글리콜인 ALD-PEG-ALD (Nektar, 미국)를 사용하여 상기 실시예 5-2와 동일한 방법으로 Insulin-10K PEG 연결체를 제조 및 정제하였다. 정제된 Insulin-10K PEG 연결체를 약 5 ㎎/㎖이 되도록 농축한 후, 이를 이용하여 실시예 5-3과 동일한 방법으로 Insulin-10K PEG-Fc 단백질 결합체를 제조 및 정제하였다.
실시예 10: Fab'-S-PEG-N-Fc 결합체의 제조(-SH 기)
10-1. Fab'의 발현 및 정제
항-종양 괴사인자-알파 Fab'를 발현하는 대장균 형질전환체 BL21/poDLHF (기탁번호: KCCM 10511)를 LB 배지 100 ㎖에 접종하여 밤새 진탕 배양한 후 5ℓ의 발효기(Marubishi)에 접종하여 온도 30 ℃, 공기 투입량 20 vvm, 교반 속도 500 rpm의 조건 하에 배양하였다. 발효가 진행됨에 따라 미생물의 성장을 위해 부족한 에너지원은 포도당 (glucose)과 효모 추출액 (yeast extract)을 미생물의 발효 상태에 따라 투여하였고, 흡광도 600 nm에서 OD값이 80이 되는 시기에 IPTG를 투여하여 단백질 발현을 유도하였다. 이를 약 40 내지 45시간 동안 배양하여 흡광도 600 nm에서 OD값이 120 내지 140이 되도록 고농도로 배양하였다. 얻어진 발효액을 원심분리(20,000 g, 30분)하여 침전물은 버리고 상층액만을 취하였다.
얻어진 상층액으로부터 다음과 같은 단계를 통해 컬럼 크로마토그래피를 거쳐 항-종양괴사인자-알파 Fab'를 순수하게 정제하였다. 20 mM 인산염 완충액 (pH 7.0)으로 평형화시킨 HiTrap 단백질 G (Ge Healthcare, 미국) 컬럼에 상기 상층액을 점적한 후, 100 mM 글리신 (Glycine, pH 3.0) 완충액으로 용출하였다. 용출된 Fab' 분획을 10 mM 인산나트륨 완충액 (PBS, pH 7.3)으로 평형화시킨 슈퍼덱스 200 (GE Healthcare, 미국) 컬럼에 점적하였으며, 동일한 완충액으로 용출하였다. 용출된 Fab' 분획을 polyCAT 21x250 (PolyLC Inc. 미국) 컬럼을 사용하여 최종 정제하였는데, 10 mM 아세테이트 완충액 (pH 4.5)을 직선 농도구배(염화나트륨 농도 0.15 M -> 0.4 M) 방법으로 흘려 순수한 항-종양괴사인자-알파 Fab' 분획을 얻었다.
10-2. Fc-PEG 연결체의 제조 및 정제
면역글로불린 Fc를 100 mM 인산나트륨 완충액(pH 5.5 내지 6.5)에 5 ㎎/㎖ 농도로 용해시키고, 여기에 NHS-PEG-MAL을 제거하였다. 완충액 교환 후 반응물을 polyCAT (PolyLC Inc. 미국) 컬럼에 부하하고, 20 mM 인산나트륨 완충액 (pH 6.0)을 직선 농도구배(염화나트륨 농도 0.15 M -> 0.5 M) 방법으로 흘려 면역글로불린 Fc-PEG 연결체를 먼저 용출하여 얻고, 이후에 반응하지 않은 면역글로불린 Fc가 용출되어 분리 제거하였다.
10-3. Fab'-S-PEG-N-Fc 결합체 (-SH 기)의 제조 및 정제
상기 실시예 10-1에서 정제된 Fab'를 100 mM 인산나트륨 완충액 (pH 7.3)에 2 ㎎/㎖로 용해시킨 후, 동일한 완충액에 상기 실시예 10-2에서 준비된 면역글로불린 Fc-PEG 연결체를 Fab':연결체의 몰비가 1:5가 되도록 넣어주었다. 최종 단백질 농도가 50 ㎎/㎖이 되도록 농축하였고, 4 ∼ 8 ℃에서 천천히 교반하면서 약 24시간동안 반응시켰다.
커플링 반응 종료 후, 반응액을 10 mM 인산나트륨 완충액 (pH 7.3)으로 평형화시킨 슈퍼덱스 200 (GE Healthcare, 미국) 컬럼에 점적하였으며, 동일한 완충액을 1 ㎖/분의 유속으로 흘려 용출시켰다. 커플링된 Fab'-S-PEG-N-Fc 결합체는 분자량이 커세 먼저 용출되고, 이후에 반응하지 않은 면역글로불린 Fc-PEG 연결체 및 Fab'가 용출되어 분리 제거하였다.
완전히 제거되지 않는 미반응 면역글로불린 Fc를 제거하기 위해, 용출된 Fab'-S-PEG-N-Fc 결합체 분획을 다시 polyCAT 21x250 (PolyLC Inc. 미국) 컬럼에 점적하고, 20 mM 인산나트륨 완충액 (pH 6.0)을 직선 농도구배 (염화나트륨 농도 0.15 M -> 0.5 M) 방법으로 흘려 순수한 Fab'-S-PEG-N-Fc 결합체(Fc-PEG 연결체가 Fab'의 C 말단 부근 -SH 기에 연결됨)를 얻었다.
실시예 11: Fab'-N-PEG-N-Fc 결합체의 제조 (N 말단)
11-1. Fab'-PEG 연결체(N 말단)의 제조 및 정제
상기 실시예 10-1에서 얻은 정제된 Fab' 40 ㎎을 100 mM 인산나트륨 완충액 (pH 5.5 내지 6.5)에 5 ㎎/㎖로 용해시킨 후, ButylALD-PEG-ButylALD (분자량 3.4 kDa, Nektar Inc., 미국)을 Fab':PEG의 몰비가 1:5가 되도록 첨가하였다. 환원제로서 나트륨 시아노보로하이드라이드 (NaCNBH3, Sigma 사)를 최종 농도가 20 mM이 되도록 점가한 후, 4 ∼ 8℃에서 천천히 교반하면서 약 2시간 동안 반응시켰다.
반응 종료 후, 반응 완충액을 20 mM 인산나트륨 완충액 (pH 6.0)으로 교환하였다. 완충액 교환 후 반응물을 polyCAT (PolyLC Inc. 미국) 컬럼에 부하하고, 20 mM 아세테이트 완충액 (pH 4.5)을 직선 농도구배(염화나트륨 농도 0.15 M -> 0.4 M) 방법으로 흘려 Fab'-PEG 연결체 분획을 먼저 용출하여 얻고, 이후에 반응하지 않은 Fab'가 용출되어 분리 제거하였다.
11-2. Fab'-N-PEG-N-Fc 결합체의 제조 및 정제
상기 실시예 11-1에서 정제된 Fab'-PEG 연결체를 100 mM 인산나트륨 완충액 (pH 6.0)에 10 ㎎/㎖로 용해시킨 후, 동일한 완충액에 용해된 면역글로불린 Fc를 Fab'-PEG 연결체 : Fc의 몰비가 1:5가 되도록 넣어주었다. 최종 단백질 농도가 50 ㎎/㎖이 되도록 농축하였고, 환원제로서 나트륨 시아노보로하이드라이드 (NaCNBH3, Sigma 사)를 최종 농도가 20 mM이 되도록 점가한 후, 4 ∼ 8℃에서 천천히 교반하면서 약 24시간 동안 반응시켰다.
커플링 반응 종료 후, 반응액을 10 mM 인산나트륨 완충액 (pH 7.3)으로 평형화시킨 슈퍼덱스 200 (GE Healthcare, 미국) 컬럼에 점적하였으며, 동일한 완충액을 1 ㎖/분의 유속으로 흘려 용출시켰다. 커플링된 Fab'-N-PEG-N-Fc 결합체는 분자량이 커서 먼저 용출되고, 이후에 반응하지 않은 면역글로불린 Fc 및 Fab'-PEG 연결체가 용출되어 분리 제거하였다. 완전히 제거되지 않은 미반응 면역글로불린 Fc를 제거하기 위해, 용출된 Fab'-N-PEG-N-Fc 결합체 분획을 다시 polyCAT 21x250 (polyLC Inc. 미국) 컬럼에 부하하고, 20 mM 인산나트륨 완충액 (pH 6.0)을 직선 농도구배 (염화나트륨 농도 0.15 M -> 0.5 M) 방법으로 흘려 순수한 Fab'-N-PEG-N-Fc 결합체 (면역글로불린 Fc-PEG 연결체가 Fab'의 N 말단에 연결됨)을 얻었다.
상기 실시예를 통해 제조한 단백질 결합체에 대한 분석은 하기 실험예를 통해 진행하였다.
실험예 1: 단백질 결합체의 순도 확인
1-1. 단백질 결합체의 확인
상기 실시예에서 제조한 단백질 결합체는 4 내지 20 % 농도구배 겔 및 12 % 겔을 사용한 비환원성 SDS-PAGE 방법으로 확인하였다. 각 단백질 결합체에 대해서 SDS-PAGE와 면역글로불린 Fc와 각각의 생리활성 폴리펩타이드로의 항체를 사용한 웨스턴 블랏팅한 결과, 도 1에서 나타난 바와 같이, 커플링 반응 후 생성된 IFNα-PEG-Fc (A), hGH-PEG-Fc (B), 17,65S-G-CSF-PEG-Fc (C), Insulin-PEG-Fc (D), EPO-PEG-Fc (E), CA-Exendin4-PEG-Fc (F) 및 FacVII-PEG-Fc (G)를 확인하였다.
1-2. 단백질 결합체의 순도 확인
각각의 실시예에서 얻은 단백질 결합체에 대해 HPLC 기기를 사용하여 크기 배제 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피 혹은 이온교환 크로마토그래피를 IFNα-PEG-Fc (A), hGH-PEG-Fc (B), 17,65S-G-CSF-PEG-Fc (C), Insulin-PEG-Fc (D), EPO-PEG-Fc (E) 및 CA-Exendin4-PEG-Fc (F)에 대하여 각각 실시하였으며, 도 2에서 나타낸 것처럼 각 분석에서 95% 이상의 고순도 단일 피크를 나타내었다.
1-3. 단백질 결합체의 위치 선택성 확인
각각의 실시예에서 얻은 단백질 결합체로 단백질 분해 엔자임을 사용한 펩타이드 맵핑 분석 (역상 크로마토그래피)을 IFNα-PEG-Fc (A), hGH-PEG-Fc (B), 17,65S-G-CSF-PEG-Fc (C), Insulin-PEG-Fc (D), EPO-PEG-Fc (E)에 대하여 각각 실시하였으며, 도 3 결과에서 나타낸 것처럼 분석에서 90 % 이상의 고 선택성으로 면역글로불린 Fc 영역 N 말단을 통해 연결된 단백질 결합체가 제조되었음이 확인되었다.
실험예 2: Fc 결합 위치에 따른 결합체의 효력 비교
각각의 실시예에서 얻은 단백질 결합체에 대해 in vitro, in vivo 효력 시험을 CA-Exendin4-PEG-Fc, 17,65S-G-CSF-PEG-Fc 및 EPO-PEG-Fc에 대하여 각각 실시하였으며, 아래 표의 결과에서 나타낸 것처럼 Fc의 N 말단(프롤린)에 결합하는 경우가 그 외의 위치 (예, 라이신)에 결합하는 경우에 비하여 좋은 효력을 나타내는 것을 확인하였다.
CA 엑센딘-PEG-Fc 위치 이성체의 in vitro 활성-CHO/GLP-1R bioassay
시험물질 EC50(ng/mL) % vs. 실험군
CA 엑센딘 (라이신)-PEG-(N 말단) Fc - 실험군 95.35 100.00
CA 엑센딘 (라이신)-PEG-(라이신) Fc 590.57 16.15
상기 표 1에서 확인할 수 있듯이, CA 엑센딘-PEG-Fc 위치 이성체의 in vitro 활성을 비교한 결과 본 발명의 면역글로불린 Fc 단편 N 말단 특이적 결합 CA 엑센딘-PEG-Fc 결합체가 면역글로불린 Fc 영역 타 위치 결합 CA 엑센딘-PEG-Fc 결합체에 비해서 6배 이상 우수한 역가를 가짐을 확인하였다.
17,65S-G-CSF-PEG-Fc 위치 이성체의 in vitro 활성-마우스 골수세포 증식 실험
시험물질 EC50(ng/mL) % vs. 실험군
17,65S-G-CSF (N 말단)-PEG-(N 말단) Fc - 실험군 134.43 100.00
17,65S-G-CSF (N 말단)-PEG-(라이신) Fc 225.87 59.50
상기 표 2에서 확인할 수 있듯이, 17,65S-G-CSF-PEG-Fc 위치 이성체의 in vitro 활성을 비교한 결과 본 발명의 면역글로불린 Fc 영역 N 말단 특이적 결합 17,65S-G-CSF-PEG-Fc 결합체가 면역글로불린 Fc 영역 타 위치 결합 17,65S-G-CSF-PEG-Fc 결합체에 비해서 약 67% 증가한 역가를 가짐을 확인하였다.
한편, 본 발명의 단백질 결합체, 특히 EPO-PEG-Fc 위치 이성체의 in vivo에서의 활성을 확인하기 위하여 Normocythemic mice assay를 통하여 Normocythemic 마우스에 EPO-PEG-Fc를 피하에 투여한 후 망상 적혈구(reticulocyte level) 수준을 측정하였다.
EPO-PEG-Fc 위치 이성체의 in vivo bio-potency - reticulocyte level 측정 (normocythemic mice 사용 subcutaneous route 투여 후)
시험물질 Bio potency
(IU/mg)		 % vs. 실험군
EPO (N-말단 84.4%)-PEG-(N-말단 100%) Fc - 실험군 14,189,403 100.00
EPO (N-말단 38.2%)-PEG-(라이신 83.0%) Fc 9,951,501 70.10
상기 표 3에서 확인할 수 있듯이, EPO-PEG-Fc 위치 이성체의 in vivo 활성을 비교한 결과 본 발명의 면역글로불린 Fc 단편 N 말단 특이적 결합 EPO-PEG-Fc 결합체가 면역글로불린 Fc 단편 타 위치 결합 EPO-PEG-Fc 결합체에 비해서 약 40% 증가한 역가를 가짐을 확인하였다.
상기 결과는 생리활성 폴리펩타이드, 비펩타이드성 중합체 및 면역글로불린 Fc 영역으로 이루어진 단백질 결합체 제조에 있어 면역글로불린 Fc 단편의 특정 위치를 결합부위로 이용하여 제조할 경우 생리활성 폴리펩타이드의 생체 내 활성이 향상된 단백질 결합체가 제조됨을 나타낸다.
상기 실시예 및 실험예를 종합하면, 본 발명자들은 생리활성 폴리펩타이드의 생체 내 지속성를 높이는 동시에 생체 내 활성(역가)을 높이거나 유지하기 위하여, 생리활성 폴리펩타이드, 비펩타이드성 중합체 및 연역글로불린 Fc 영역으로 이루어진 단백질 결합체를 제조하였다. 구체적으로 다양한 생리활성 폴리펩타이드에 대한 단백질 결합체를 제조하였으며, 특히 면역글로불린 Fc 영역의 특정 위치, 특히 N 말단을 결합부위로 하는 단백질 결합체를 제조하였다.
그 결과, 본 발명의 단백질 결합체 제조방법에 의하여 제조된 다양한 단백질 결합체들의 면역글로불린 Fc 영역의 N 말단 선택성은 90 %임을 확인하였으며, 본 발명의 면역글로불린 Fc 영역의 N 말단 특이적 결합 단백질 결합체들의 역가가 Fc 영역의 다른 부위에 결합한 단백질 결합체들보다 약 40 % 에서 최대 400% 이상 우수함을 확인하였다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
<110> HANMI PHARM. CO., LTD.. <120> Protein complex by use of a specific site of an immunoglobulin fragment for linkage <130> KPA150462-KR-P1 <150> KR 10-2015-0135874 <151> 2015-09-24 <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 221 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> human immunoclobulin Fc region derivative monomer <400> 1 Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu 1 5 10 15 Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu 20 25 30 Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln 35 40 45 Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys 50 55 60 Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu 65 70 75 80 Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys 85 90 95 Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys 100 105 110 Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser 115 120 125 Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys 130 135 140 Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln 145 150 155 160 Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly 165 170 175 Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln 180 185 190 Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn 195 200 205 His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 210 215 220

Claims (53)

  1. 생리활성 폴리펩타이드 및 면역글로불린 Fc 영역이 비펩타이드성 중합체를 통하여 연결된 단백질 결합체로서,
    상기 비펩타이드성 중합체가 면역글로불린 Fc 영역의 N 말단에 위치 특이적으로 결합하고,
    상기 생리활성 폴리펩타이드가 천연형 과립구 콜로니 자극인자(G-CSF)의 17번째 및 65번째 아미노산이 세린으로 치환된 과립구 콜로니 자극인자, 인슐린, 옥신토모듈린, 글루카곤-유사 펩타이드-1(GLP-1), 엑센딘-4, 글루카곤, 또는 혈액인자 VII이고,
    상기 비펩타이드성 중합체가 폴리에틸렌글리콜이고,
    상기 면역글로불린 Fc 영역이 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 것인, 단백질 결합체.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 비펩타이드성 중합체가 양 말단 반응기를 통해 생리활성 폴리펩타이드 및 면역글로불린 Fc 영역과 각각 공유결합으로 연결되는 것인, 단백질 결합체.
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 삭제
  13. 제1항에 있어서,
    상기 비펩타이드성 중합체가 알데히드 그룹, 말레이미드 그룹 및 석신이미드 그룹으로 이루어진 군으로부터 선택되는 반응기를 갖는 것인, 단백질 결합체.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 알데히드 그룹은 프로피온알데히드 그룹 또는 부틸알데히드 그룹인, 단백질 결합체.
  15. 제13항에 있어서,
    상기 석신이미드 그룹이 석신이미딜 카르복시메틸, 석신이미딜 발레르에이트, 석신이미딜 메틸부타노에이트, 석신이미딜 메틸프로피온에이트, 석신이미딜 부타노에이트, 석신이미딜 프로피온에이트, N-하이드록시석신이미드인 또는 석신이미딜 카보네이트인 단백질 결합체.
  16. 제1항에 있어서,
    상기 비펩타이드성 중합체는 양 말단에 알데히드 그룹 반응기를 갖는 것인, 단백질 결합체.
  17. 제1항에 있어서,
    상기 비펩타이드성 중합체는 양 말단에 각각 알데히드 그룹 및 말레이미드 반응기를 갖는 것인, 단백질 결합체.
  18. 제1항에 있어서,
    상기 비펩타이드성 중합체는 양 말단에 각각 알데히드 그룹 및 석시니미드 반응기를 갖는 것인, 단백질 결합체.
  19. 제1항에 있어서,
    상기 비펩타이드성 중합체의 양 말단이 각각 면역글로불린 Fc 영역의 N 말단과 생리활성 폴리펩타이드의 N 말단, C 말단, 라이신 잔기, 히스티딘 잔기 또는 시스테인 잔기의 유리 반응기에 결합되어 있는 것인, 단백질 결합체.
  20. 제1항에 있어서,
    상기 생리활성 폴리펩타이드가 천연형 과립구 콜로니 자극인자(G-CSF)의 17번째 및 65번째 아미노산이 세린으로 치환된 과립구 콜로니 자극인자인, 단백질 결합체.
  21. 제1항에 있어서,
    상기 엑센딘-4가 CA-엑센딘-4인 것인, 단백질 결합체.
  22. 삭제
  23. (a') 비펩타이드성 중합체의 한쪽 말단에 면역글로불린 Fc 영역 또는 생리활성 폴리펩타이드 중 어느 하나와 공유결합으로 연결하여 연결체를 제조하는 단계로서, pH 4.0 내지 7.0으로 이루어지는 단계;
    (b') 상기 (a') 단계에서 제조한 연결체를 분리하여, 분리된 연결체의 비펩타이드성 중합체의 다른 쪽 말단에 생리활성 폴리펩타이드 또는 면역글로불린 Fc 영역 중 다른 하나와 공유결합으로 연결하는 단계로서, pH 4.0 내지 7.0으로 이루어지는 단계; 및
    (c') 상기 (b') 단계를 통해 제조한 공유결합으로 연결된 생리활성 폴리펩타이드, 비펩타이드성 중합체 및 면역글로불린 Fc 영역을 필수적으로 포함하고, 상기 비펩타이드성 중합체가 면역글로불린 Fc 영역의 N 말단을 통해 결합한 단백질 결합체를 분리하는 단계를 포함하는, 제1항의 단백질 결합체 제조방법으로서,
    상기 생리활성 폴리펩타이드가 천연형 과립구 콜로니 자극인자(G-CSF)의 17번째 및 65번째 아미노산이 세린으로 치환된 과립구 콜로니 자극인자, 인슐린, 옥신토모듈린, 글루카곤-유사 펩타이드-1(GLP-1), 엑센딘-4, 글루카곤, 또는 혈액인자 VII이고,
    상기 비펩타이드성 중합체가 폴리에틸렌글리콜이고,
    상기 제조방법이 90% 이상의 면역글로불린 Fc 영역 N-말단 선택성을 갖는 것인, 제조방법.
  24. 제23항에 있어서, 상기 생리활성 폴리펩타이드가 천연형 과립구 콜로니 자극인자(G-CSF)의 17번째 및 65번째 아미노산이 세린으로 치환된 과립구 콜로니 자극인자인, 제조방법.
  25. 제23항에 있어서,
    상기 (a') 단계에서 생리활성 폴리펩타이드와 비펩타이드성 중합체의 반응 몰 비가 1:1 내지 1:30이고, 면역글로불린 Fc 단편과 비펩타이드성 중합체의 반응 몰 비가 1:1 내지 1:20인 것인, 제조방법.
  26. 제23항에 있어서,
    상기 엑센딘-4가 CA-엑센딘-4인 것인, 제조방법.
  27. 제23항에 있어서,
    상기 (a') 단계는 4.0 ℃내지 25 ℃에서 이루어지는 것을 특징으로 하는, 제조방법.
  28. 제23항에 있어서,
    상기 (a') 단계에서 면역글로불린 Fc 영역 또는 생리활성 폴리펩타이드의 반응 농도가 0.1 내지 100 ㎎/㎖인 것을 특징으로 하는, 제조방법.
  29. 제23항에 있어서,
    상기 (b') 단계에서 연결체 : 면역글로불린 Fc 영역 또는 생리활성 폴리펩타이드의 반응 몰 비가 1:0.1 내지 1:20인 것을 특징으로 하는, 제조방법.
  30. 삭제
  31. 제23항에 있어서,
    상기 (b') 단계는 4.0 내지 25 ℃에서 이루어지는 것을 특징으로 하는, 제조방법.
  32. 제23항에 있어서,
    상기 (b') 단계에서 면역글로불린 Fc 영역 또는 생리활성 폴리펩타이드의 반응 농도가 0.1 내지 100 ㎎/㎖인 것을 특징으로 하는, 제조방법.
  33. 제23항에 있어서,
    상기 (a') 단계 및 (b') 단계가 환원제의 존재 하에 수행되는 것을 특징으로 하는 것인, 제조방법.
  34. 제33항에 있어서,
    상기 환원제가 나트륨 시아노보로하이드라이드(NaCNBH3), 수소화 붕소나트륨, 디메틸아민 붕산염 및 피리딘 붕산염으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 제조방법.
  35. 제23항에 있어서,
    상기 (b') 단계에서 연결체를 분리하기 위하여 음이온 교환 크로마토그래피, 양이온 교환 크로마토그래피, 소수성 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 또는 크기배제 크로마토그래피로부터 선택되는 정제방법을 단독 혹은 복수개로 수행하는 것인, 제조방법.
  36. 제35항에 있어서,
    상기 음이온 교환 크로마토그래피 수지의 작용기가 쿼터너리암모늄(Q), 쿼터너리아미노에틸 (QAE), 디에틸아미노에틸 (DEAE), 폴리에틸렌이민 (PEI), 디메틸아미노메틸(DMAE), 및 트리메틸아미노에틸 (TMAE)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것 중 하나인, 제조방법.
  37. 제35항에 있어서,
    상기 양이온 교환 크로마토그래피 수지의 작용기가 메틸설포네이트 (S), 설포프로필 (SP), 카르복시메틸 (CM), 설포에틸 (SE) 및 폴리아스파르트산（Poly aspartic acid)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것 중 하나인, 제조방법.
  38. 제35항에 있어서,
    상기 소수성 크로마토그래피의 수지의 작용기가 페닐(phenyl), 옥틸(octyl), (이소)프로필((iso)propyl), 부틸(butyl) 및 에틸(ethyl)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것 중 하나인, 제조방법.
  39. 제35항에 있어서,
    상기 친화성 크로마토그래피의 수지의 작용기가 프로테인에이 (proteinA), 헤파린 (heparin), 블루 (blue), 벤자미딘 (benzamidine), 금속이온 (코발트, 니켈, 구리) 및 비펩타이드성 중합체의 양쪽 말단이 각각 면역글로불린 Fc 영역 및 생리활성 폴리펩타이드와 결합된 단백질 결합체의 구성 성분의 일부 혹은 전체에 대한 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것 중 하나인, 제조방법.
  40. 제35항에 있어서,
    상기 크기배제 크로마토그래피의 수지가 수퍼덱스 (superdex）, 세파크릴 (sephacryl), 수퍼로즈 (superose)및 세파덱스 (sephadex)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것중 하나인, 제조방법.
  41. 제23항에 있어서,
    상기 (c') 단계의 단백질 결합체를 분리하는 단계는 음이온 교환 크로마토그래피, 양이온 교환 크로마토그래피, 소수성 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 또는 크기배제 크로마토그래피로부터 선택되는 정제방법을 단독 혹은 복수개로 수행하는, 제조방법.
  42. 제41항에 있어서,
    상기 음이온 교환 크로마토그래피 수지의 작용기가 쿼터너리암모늄(Q), 쿼터너리아미노에틸 (QAE), 디에틸아미노에틸 (DEAE), 폴리에틸렌이민 (PEI), 디메틸아미노메틸(DMAE), 및 트리메틸아미노에틸 (TMAE)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것 중 하나인, 제조방법.
  43. 제41항에 있어서,
    상기 양이온 교환 크로마토그래피 수지의 작용기가 메틸설포네이트 (S), 설포프로필 (SP), 카르복시메틸 (CM), 설포에틸 (SE) 및 폴리아스파르트산（Poly aspartic acid)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것 중 하나인, 제조방법.
  44. 제41항에 있어서,
    상기 소수성 크로마토그래피의 수지의 작용기가 페닐(phenyl), 옥틸(octyl), (이소)프로필((iso)propyl), 부틸(butyl) 및 에틸(ethyl)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것 중 하나인, 제조방법.
  45. 제41항에 있어서,
    상기 친화성 크로마토그래피의 수지의 작용기가 프로테인에이 (proteinA), 헤파린 (heparin), 블루 (blue), 벤자미딘 (benzamidine), 금속이온 (코발트, 니켈, 구리) 및 비펩타이드성 중합체의 양쪽 말단이 각각 면역글로불린 Fc 영역 및 생리활성 폴리펩타이드와 결합된 단백질 결합체의 구성 성분의 일부 혹은 전체에 대한 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것 중 하나인, 제조방법.
  46. 제41항에 있어서,
    상기 크기배제 크로마토그래피의 수지의 작용기가 수퍼덱스 (superdex）, 세파크릴 (sephacryl), 수퍼로즈 (superose) 및 세파덱스 (sephadex)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것 중 하나인, 제조방법.
  47. 삭제
  48. 삭제
  49. (a') 비펩타이드성 중합체의 한쪽 말단에 면역글로불린 Fc 영역 또는 생리활성 폴리펩타이드 중 어느 하나와 공유결합으로 연결하여 연결체를 제조하는 단계로서, 생리활성 폴리펩타이드와 비펩타이드성 중합체의 반응 몰 비는 1:1 내지 1:30이고, 면역글로불린 Fc 영역과 비펩타이드성 중합체의 반응 몰 비가 1:1 내지 1:20이며, 환원제가 1 ~ 100 mM 농도로 포함되고, pH 4.0 내지 7.0, 반응온도 4.0 내지 25 ℃에서 이루어지며, 면역글로불린 Fc 영역 또는 생리활성 폴리펩타이드의 반응 농도가 0.1 내지 100 ㎎/㎖인 단계;
    (b') 상기 (a') 단계에서 제조한 연결체를 분리하여, 분리된 연결체의 비펩타이드성 중합체의 다른 쪽 말단에 생리활성 폴리펩타이드 또는 면역글로불린 Fc 영역 중 다른 하나와 공유결합으로 연결하는 단계로서, 연결체와 면역글로불린 Fc 영역 또는 생리활성 폴리펩타이드의 반응 몰 비가 1:0.1 내지 1:20이고, 환원제가 1 ~ 100 mM 농도로 포함되며, pH 4.0 내지 7.0, 반응온도 4.0 내지 25 ℃에서 이루어지고, 면역글로불린 Fc 영역 또는 생리활성 폴리펩타이드의 반응 농도가 0.1 내지 100 ㎎/㎖인 단계; 및
    (c') 상기 (b') 단계를 통해 제조한 공유결합으로 연결된 생리활성 폴리펩타이드, 비펩타이드성 중합체 및 면역글로불린 Fc 영역을 필수적으로 포함하고, 상기 비펩타이드성 중합체가 면역글로불린 Fc 영역의 N 말단을 통해 결합한 단백질 결합체를 분리하는 단계를 포함하는, 제1항의 단백질 결합체 제조방법으로서,
    상기 생리활성 폴리펩타이드가 천연형 과립구 콜로니 자극인자(G-CSF)의 17번째 및 65번째 아미노산이 세린으로 치환된 과립구 콜로니 자극인자, 인슐린, 옥신토모듈린, 글루카곤-유사 펩타이드-1(GLP-1), 엑센딘-4, 글루카곤, 또는 혈액인자 VII이고,
    상기 비펩타이드성 중합체가 폴리에틸렌글리콜이고,
    상기 제조방법이 90% 이상의 면역글로불린 Fc 영역 N-말단 선택성을 갖는 것인, 제조방법.
  50. 제49항에 있어서,
    상기 엑센딘-4가 CA-엑센딘-4인 것인, 제조방법.
  51. 제1항에 따른 단백질 결합체를 유효성분으로 포함하는 생리활성 폴리펩타이드의 생체 내 지속성 및 안정성 증가용 약학적 조성물.
  52. 제51항에 있어서,
    상기 약학적 조성물은 상기 단백질 결합체가 90 % 이상으로 포함된 것인, 조성물.
  53. 제23항 내지 제29항, 제31항 내지 제46항, 제49항, 및 제50항 중 어느 한 방법에 따라 제조된 단백질 결합체를 90 % 이상으로 포함하는 단백질 결합체의 집합체.
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