JP7222710B2 - 免疫グロブリン断片の特定位置を連結部位として用いたタンパク質結合体 - Google Patents

免疫グロブリン断片の特定位置を連結部位として用いたタンパク質結合体 Download PDF

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Description

本発明は、免疫グロブリンＦｃ領域が非ペプチド性重合体を介して生理活性ポリペプチドに連結されたタンパク質結合体において、非ペプチド性重合体が免疫グロブリンＦｃ領域のＮ末端に特異的に連結された結合体、その製造方法及びこれを含む生理活性ポリペプチドの生体内持続性及び安定性増加用薬学的組成物に関する。また、前記方法によって製造されたタンパク質結合体を含むタンパク質結合体の集合体に関する。
ポリペプチドは、一般的に安定性が低く、容易に変性されて血液中のタンパク質加水分解酵素によって分解され、腎臓や肝臓を介して簡単に除去されるため、薬理成分としてポリペプチドを含むタンパク質医薬品の血中濃度及び力価を維持するためには、タンパク質薬物を患者に頻繁に投与する必要がある。しかし、ほとんどの注射剤の形態として患者に投与されるタンパク質医薬品の場合、活性ポリペプチドの血中濃度を維持するための頻繁な注射は、患者に過度の苦痛を引き起こすことになる。このような問題点を解決するために、タンパク質薬物の血中安定性を増加させ、血中薬物濃度を長時間高く持続させて薬効を極大化しようとする努力が続けられてきた。このようなタンパク質薬物の持続性製剤は、タンパク質薬物の安定性を高めると同時に、薬物自体の力価が十分に高く維持されるべきであり、患者に免疫反応を誘発してはならない。
タンパク質を安定化させ、タンパク質加水分解酵素との接触及び腎臓の消失を抑制するための方法として、従来にはポリエチレングリコール（以下「ＰＥＧ」と略す）のように溶解度が高い高分子をタンパク質薬物の表面に化学的に付加させる方法が用いられてきた。ＰＥＧは、目的タンパク質の特定部位または様々な部位に非特異的に連結して溶解度を高めることでタンパク質を安定化させ、タンパク質の加水分解を防止するのに効果があり、特別な副作用も起こさないことが知られている（非特許文献１）。しかし、ＰＥＧを連結させる場合に、タンパク質の安定性は増加しうるが、生理活性タンパク質の力価が著しく低くなり、ＰＥＧの分子量が増加するほどタンパク質との反応性が低くなり、収率が減少するという問題がある。ＰＥＧをタンパク質に連結するときに発生しうるもう一つの問題は、多くの可能性のある連結部位の競合によって引き起こされる結合体の連結異性化である。
これはＰＥＧを用いる結合体薬物の製造において重要な部分であり、最大の効力と効果を引き出す条件で製造された均質な薬物が要求される。薬物の効力に影響を与える結合位置にＰＥＧが結合した柔軟物質が過量に含まれる場合、効力の望ましくない低下が引き起こされる可能性がある。
国際特許公開第９７/３４６３１号 国際特許公開第９６/３２４７８号 韓国出願番号第１０‐２０１２‐０１１１５３７号
Sada et al., J. Fermentation Bioengineering 71: 137-139, 1991 H.Neurath, R.L.Hill, The Ｐｒｏteins, Academic Press, New York,197 9
そこで、本発明者は、生理活性ポリペプチド結合体を大量生産に適した工程で効力が最も高い部位で結合された結合体を製造しうる方法を研究した結果、担体として含まれる免疫グロブリンＦｃ断片の結合位置を特定して、効力が最も高い結合体を高純度で製造する方法を発明し、本発明を完成した。
本発明の一つの目的は、非ペプチド性重合体を介して免疫グロブリンＦｃ領域に連結された生理活性ポリペプチドを含むタンパク質結合体であって、前記非ペプチド性重合体が、免疫グロブリンＦｃ領域のＮ末端に位置特異的に結合したものである、タンパク質結合体を提供することにある。
本発明の他の目的は、前記タンパク質結合体を製造する方法を提供することにある。
本発明のもう一つの目的は、前記タンパク質結合体を有効成分として含む生理活性ポリペプチドの生体内持続性及び安定性増加用薬剤学的組成物を提供することにある。
本発明は、タンパク質結合体の製造中に特定位置を用いて製造された生体内持続性が向上されたタンパク質結合体に関する。具体的に、本発明は生理活性ポリペプチド、非ペプチド性重合体及び免疫グロブリンＦｃ領域のＮ末端が相互共有結合によって連結されており、前記生理活性ポリペプチドの生体内持続性が向上されたタンパク質結合体に関する。本発明により製造されたタンパク質結合体は、様々な生理活性ポリペプチド薬物の持続型製剤の開発に有用に用いることができる。
免疫グロブリンＦｃ領域のＮ末端の反応で製造されたＩＦＮα-ＰＥＧ-Ｆｃ結合体をＳＤＳ-ＰＡＧＥとウェスタンブロッティングを介して確認した結果を示した図である。 免疫グロブリンＦｃ領域のＮ末端の反応で製造されたｈＧＨ-ＰＥＧ-Ｆｃ結合体をＳＤＳ-ＰＡＧＥとウェスタンブロッティングを介して確認した結果を示した図である。 免疫グロブリンＦｃ領域のＮ末端の反応で製造された17、65Ｓｅｒ-Ｇ‐ＣＳＦ-ＰＥＧ-Ｆｃ結合体をＳＤＳ-ＰＡＧＥとウェスタンブロッティングを介して確認した結果を示した図である。 免疫グロブリンＦｃ領域のＮ末端の反応で製造されたインスリン-ＰＥＧ-Ｆｃ結合体をＳＤＳ-ＰＡＧＥとウェスタンブロッティングを介して確認した結果を示した図である。 免疫グロブリンＦｃ領域のＮ末端の反応で製造されたＥＰＯ-ＰＥＧ-Ｆｃ結合体をＳＤＳ-ＰＡＧＥとウェスタンブロッティングを介して確認した結果を示した図である。 免疫グロブリンＦｃ領域のＮ末端の反応で製造されたＣＡ-エキセンジン４-ＰＥＧ-Ｆｃ結合体をＳＤＳ-ＰＡＧＥとウェスタンブロッティングを介して確認した結果を示した図である。 免疫グロブリンＦｃ領域のＮ末端の反応で製造されたＦａｃＶＩＩ-ＰＥＧ-Ｆｃ結合体をＳＤＳ-ＰＡＧＥとウェスタンブロッティングを介して確認した結果を示した図である。 免疫グロブリンＦｃ領域のＮ末端の反応で製造されたＩＦＮα-ＰＥＧ-Ｆｃ結合体の純度をＩＥ-ＨＰＬＣ及びＳＥ-ＨＰＬＣ分析を介して確認した結果を示した図である。 免疫グロブリンＦｃ領域のＮ末端の反応で製造されたｈＧＨ-ＰＥＧ-Ｆｃ結合体の純度をＩＥ-ＨＰＬＣ及びＳＥ-ＨＰＬＣ分析を介して確認した結果を示した図である。 免疫グロブリンＦｃ領域のＮ末端の反応で製造された17、65Ｓｅｒ-Ｇ‐ＣＳＦ-ＰＥＧ-Ｆｃ結合体の純度をＩＥ-ＨＰＬＣ及びＳＥ-ＨＰＬＣ分析を介して確認した結果を示した図である。 免疫グロブリンＦｃ領域のＮ末端の反応で製造されたインスリン-ＰＥＧ-Ｆｃ結合体の純度をＩＥ-ＨＰＬＣ及びＳＥ-ＨＰＬＣ分析を介して確認した結果を示した図である。 免疫グロブリンＦｃ領域のＮ末端の反応で製造されたＥＰＯ-ＰＥＧ-Ｆｃ結合体の純度をＩＥ-ＨＰＬＣ及びＳＥ-ＨＰＬＣ分析を介して確認した結果を示した図である。 免疫グロブリンＦｃ領域のＮ末端の反応で製造されたＣＡ-エキセンジン４-ＰＥＧ-Ｆｃ結合体の純度をＩＥ-ＨＰＬＣ及びＳＥ-ＨＰＬＣ分析を介して確認した結果を示した図である。 免疫グロブリンＦｃ領域のＮ末端の反応で製造されたＩＦＮα-ＰＥＧ-Ｆｃ結合体のＦｃ領域のＮ末端結合有無をペプチドマッピングにより確認した結果を示した図である。 免疫グロブリンＦｃ領域のＮ末端の反応で製造されたｈＧＨ-ＰＥＧ-Ｆｃ結合体のＦｃ領域のＮ末端結合有無をペプチドマッピングにより確認した結果を示した図である。 免疫グロブリンＦｃ領域のＮ末端の反応で製造された17、65Ｓｅｒ-Ｇ‐ＣＳＦ-ＰＥＧ-Ｆｃ結合体のＦｃ領域のＮ末端結合有無をペプチドマッピングにより確認した結果を示した図である。 免疫グロブリンＦｃ領域のＮ末端の反応で製造されたインスリン-ＰＥＧ-Ｆｃ結合体のＦｃ領域のＮ末端結合有無をペプチドマッピングにより確認した結果を示した図である。 免疫グロブリンＦｃ領域のＮ末端の反応で製造されたＥＰＯ-ＰＥＧ-Ｆｃ結合体のＦｃ領域のＮ末端結合有無をペプチドマッピングにより確認した結果を示した図である。 免疫グロブリンＦｃ領域のＮ末端の反応で製造されたＣＡ-エキセンジン４-ＰＥＧ-Ｆｃ結合体のＦｃ領域のＮ末端結合有無をペプチドマッピングにより確認した結果を示した図である。
前記目的を達成するための本発明の一様態は、非ペプチド性重合体を介して免疫グロブリンＦｃ領域に連結された生理活性ポリペプチドを含むタンパク質結合体であって、前記非ペプチド性重合体が、免疫グロブリンＦｃ領域のＮ末端に位置特異的に結合したもの、タンパク質結合体を提供する。
本発明の一つの具体例は、前記非ペプチド性重合体の両末端が、反応基を介して生理活性ポリペプチド及び免疫グロブリンＦｃ領域にそれぞれ共有結合により連結されるものである、タンパク質結合体を提供する。
本発明のもう一つの具体例は、前記免疫グロブリンＦｃ領域が、非糖鎖化タンパク質結合体を提供する。
本発明のもう一つの具体例は、前記免疫グロブリンＦｃ領域が、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３及びＣＨ４ドメインからなる群から選択される１つ～４つのドメインからなる、タンパク質結合体を提供する。
本発明のもう一つの具体例は、前記免疫グロブリンＦｃ領域がヒンジ領域をさらに含む、タンパク質結合体を提供する。
本発明のもう一つの具体例は、前記免疫グロブリンＦｃ断片が、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥまたはＩｇＭ由来のＦｃ領域である、タンパク質結合体を提供する。
本発明のもう一つの具体例は、前記免疫グロブリンＦｃ断片のそれぞれのドメインがドメインのハイブリッドであり、各ドメインは、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ及びＩｇＭからなる群から選択される免疫グロブリンに由来する異なる起源を有する、タンパク質結合体を提供する。
本発明のもう一つの具体例は、前記免疫グロブリンＦｃ断片が、同一起源のドメインを含む一本鎖免疫グロブリンからなるダイマーまたはマルチマーである、タンパク質結合体を提供する。
本発明のもう一つの具体例は、前記免疫グロブリンＦｃ断片が、ＩｇＧ４ Ｆｃ断片である、タンパク質結合体を提供する。
本発明のもう一つの具体例は、前記免疫グロブリンＦｃ断片が、ヒト非糖鎖化ＩｇＧ４ Ｆｃ断片である、タンパク質結合体を提供する。
本発明のもう一つの具体例は、前記非ペプチド性重合体が、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコール-プロピレングリコール共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコール、ポリサカライド、デキストラン、ポリビニルエチルエーテル、生分解性高分子、脂質重合体、キチン、ヒアルロン酸及びこれらの組み合わせからなる群から選択されるものである、タンパク質結合体を提供する。
本発明のもう一つの具体例は、前記非ペプチド性重合体が、ポリエチレングリコールである、タンパク質結合体を提供する。
本発明のもう一つの具体例は、前記非ペプチド性重合体の反応基が、アルデヒドグループ、マレイミドグループ及びスクシンイミド誘導体からなる群から選択されるものである、タンパク質結合体を提供する。
本発明のもう一つの具体例は、前記非ペプチド性重合体の反応基が、プロピオンアルデヒドグループ、またはブチルアルデヒドグループである、タンパク質結合体を提供する。
本発明のもう一つの具体例は、前記スクシンイミド誘導体がスクシンイミジルカルボキシメチル、スクシンイミジルバレレート、スクシンイミジルメチルブタノエート、スクシンイミジルメチルプロピオネート、スクシンイミジルブタノエート、スクシンイミジルプロピオネート、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドまたはスクシンイミジルカーボネートである、タンパク質結合体を提供する。
本発明のもう一つの具体例は、前記非ペプチド性重合体は両末端に反応基としてアルデヒドグループを有するものである、タンパク質結合体を提供する。
本発明のもう一つの具体例は、前記非ペプチド性重合体は、両末端に反応基としてそれぞれアルデヒドグループ及びマレイミドグループを有するものである、タンパク質結合体を提供する。
本発明のもう一つの具体例は、前記非ペプチド性重合体は両末端に反応基としてそれぞれアルデヒドグループ及びスクシンイミドグループを有するものである、タンパク質結合体を提供する。
本発明のもう一つの具体例は、前記非ペプチド性重合体の両末端が、それぞれ免疫グロブリンＦｃ領域のＮ末端；及び生理活性ポリペプチドのＮ末端、Ｃ末端、またはリジン残基、ヒスチジン残基またはシステイン残基の遊離反応基に連結されるものである、タンパク質結合体を提供する。
本発明のもう一つの具体例は、前記生理活性ポリペプチドが、ホルモン、サイトカイン、酵素、抗体、成長因子、転写因子、血液凝固因子、ワクチン、構造タンパク質、リガンドタンパク質及び受容体からなる群から選択されるものである、タンパク質結合体を提供する。
本発明のもう一つの具体例は、前記生理活性ポリペプチドは、ヒト成長ホルモン、成長ホルモン放出ホルモン、成長ホルモン放出ペプチド、インターフェロン類、インターフェロン受容体類、コロニー刺激因子類、グルカゴン様ペプチド類（ＧＬＰ-１など）、エキセンジン類（Ｅｘｅｎｄｉｎ４など） 、オキシントモジュリン、Ｇタンパク質結合受容体、インターロイキン類、インターロイキン受容体類、酵素類、インターロイキン結合タンパク質類、サイトカイン結合タンパク質類、マクロファージ活性因子、マクロファージペプチド、Ｂ細胞因子、Ｔ細胞因子、タンパク質Ａ、アレルギー抑制因子、細胞壊死糖タンパク質、免疫毒素、リンホトキシン、腫瘍壊死因子、腫瘍抑制因子、転移成長因子、α-１アンチトリプシン、アルブミン、α-ラクトアルブミン、アポリポタンパク質Ｅ、赤血球生成因子、糖鎖化赤血球生成因子、アンジオポエチン類、ヘモグロビン、トロンビン、トロンビン受容体活性ペプチド、トロンボモジュリン、血液凝固因子ＶＩＩ、ＶＩＩａ、ＶＩＩＩ、ＩＸ及びＸＩＩＩ、プラスミノーゲン活性因子、フィブリン結合ペプチド、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、ヒルジン、タンパク質Ｃ、Ｃ反応性タンパク質、レニン抑制剤、コラゲナーゼ抑制剤、スーパーオキシドジスムターゼ、レプチン、血小板由来成長因子、上皮細胞成長因子、表皮細胞成長因子、アンジオスタチン、アンジオテンシン、骨形成成長因子、骨形成促進タンパク質、カルシトニン、インスリン、アトリオペプチン、軟骨誘導因子、エルカトニン、結合組織活性因子、組織因子経路阻害剤、卵胞刺激ホルモン、黄体形成ホルモン、黄体形成ホルモン放出ホルモン、神経成長因子類、副甲状腺ホルモン、リラキシン、セクレチン、ソマトメジン、インスリン様成長因子、副腎皮質ホルモン、グルカゴン、コルレシストキニン、膵臓ポリペプチド、ガストリン放出ペプチド、コルチコトロピン放出因子、甲状腺刺激ホルモン、オートタキシン、ラクトフェリン、ミオスタチン、受容体類、受容体アンタゴニスト、細胞表面抗原、ウイルス由来ワクチン抗原、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、抗体断片類及びそれぞれの誘導体からなる群から選択されるものである、タンパク質結合体を提供する。
本発明のもう一つの具体例は、前記生理活性ポリペプチドは、ヒト成長ホルモン、インターフェロンα、顆粒球コロニー刺激因子、赤血球生成因子、血液凝固因子、インスリン、オキシントモジュリン、グルカゴン様ペプチド類、エキセンジン類及びそれらの誘導体である、タンパク質結合体を提供する。
本発明の別の様態は、タンパク質結合体を調製する方法であって、
（ａ）両末端に反応基を有する少なくても１つの非ペプチド性重合体、少なくても１つの生理活性ポリペプチド、及び少なくても１つの免疫グロブリンＦｃ領域を共有結合により連結してタンパク質結合体を製造する段階；及び
（ｂ）前記（ａ）段階で製造された共有結合により連結された生理活性ポリペプチド、非ペプチド性重合体及び免疫グロブリンＦｃ領域を必須的に含み、前記非ペプチド性重合体が免疫グロブリンＦｃ断片のＮ末端に連結されたタンパク質結合体を分離する段階を含む、製造方法を提供する。
本発明の一つの具体例は、前記（ａ）段階は、
（ａ１）非ペプチジルポリマーの一末端を免疫グロブリンＦｃ領域または生理活性ポリペプチドに共有結合により連結させて連結体を製造する段階；及び
（ａ２）前記（ａ１）段階で製造した連結体を分離して、免疫グロブリンＦｃ領域及び生理活性ポリペプチドの他の方に共有結合により分離された連結体の非ペプチド性重合体のもう一つの末端を連結する段階を含む、製造方法を提供する。
本発明のもう一つの具体例は、 前記（ａ１）段階で生理活性ポリペプチドと非ペプチド性重合体との間の反応モル比が１：１～１：３０であり、免疫グロブリンＦｃ断片と非ペプチド性重合体との間の反応モル比が１：１～１：２０である、製造方法を提供する。
本発明のもう一つの具体例は、前記（ａ１）段階は、ｐＨ４．０～９．０の条件で行われる、製造方法を提供する。
本発明のもう一つの具体例は、前記（ａ１）段階が、４．０℃～２５℃で行われる、製造方法を提供する。
本発明のもう一つの具体例は、前記（ａ１）段階で免疫グロブリンＦｃ領域または生理活性ポリペプチドの反応濃度が、０．１～１００ｍｇ/ｍｌである、製造方法を提供する。
本発明のもう一つの具体例は、前記（ａ２）の段階で連結体と免疫グロブリンＦｃ領域または生理活性ポリペプチドとの間の反応モル比が、１：０．１～１：２０である、製造方法を提供する。
本発明のもう一つの具体例は、前記（ａ２）段階は、ｐＨ４．０～９．０の条件で行われる、製造方法を提供する。
本発明のもう一つの具体例は、前記（ａ２）段階は、４．０～２５℃で行われる、製造方法を提供する。
本発明のもう一つの具体例は、前記（ａ２）段階で免疫グロブリンＦｃ領域または生理活性ポリペプチドの反応濃度が、０．１～１００ｍｇ/ｍｌである、製造方法を提供する。
本発明のもう一つの具体例は、前記（ａ１）段階及び（ａ２）段階が、還元剤の存在下で行われる、製造方法を提供する。
本発明のもう一つの具体例は、前記還元剤が、シアノ水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＣＮＢＨ3）、水素化ホウ素ナトリウム、ジメチルアミンホウ酸塩及びピリジンホウ酸塩からなる群から選択されるものである、製造方法を提供する。
本発明のもう一つの具体例は、前記（ａ２）の段階で分離が、陰イオン交換クロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー及びサイズ排除クロマトグラフィーからなる群から選択される精製方法を単独または組み合わせて行うものである、製造方法を提供する。
本発明のもう一つの具体例は、前記陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂の官能基が、第四級アンモニウム（Ｑ）、第四級アミノエチル（ＱＡＥ）、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ジメチルアミノメチル（ＤＭＡＥ）及びトリメチルアミノエチル（ＴＭＡＥ）からなる群から選択されるいずれか一つである、製造方法を提供する。
本発明のもう一つの具体例は、前記陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂の官能基が、メチルスルホネート（Ｓ）、スルホプロピル（ＳＰ）、カルボキシメチル（ＣＭ）、スルホエチル（ＳＥ）及びポリアスパラギン酸からなる群から選択されるいずれか一つである、製造方法を提供する。
本発明のもう一つの具体例は、前記疎水性クロマトグラフィーの樹脂の官能基が、フェニル、オクチル、（イソ）プロピル、ブチル及びエチルからなる群から選択されるいずれか一つである、製造方法を提供する。
本発明のもう一つの具体例は、前記親和性クロマトグラフィーの樹脂の官能基が、プロテインＡ、ヘパリン、ブルー、ベンズアミジン、金属イオン（コバルト、ニッケル及び銅）、及び非ペプチド性重合体の両末端がそれぞれ免疫グロブリンＦｃ領域及び生理活性ポリペプチドに連結されたタンパク質結合体の構成成分の一部または全体に対する抗体からなる群から選択されるいずれか一つである、製造方法を提供する。
本発明のもう一つの具体例は、前記サイズ排除クロマトグラフィーの樹脂が、スーパーデックス、セファクリル、スーパーロース及びセファデックスからなる群から選択されるいずれか一つである、製造方法を提供する。
本発明のもう一つの具体例は、前記（ｂ）段階のタンパク質結合体の分離が、陰イオン交換クロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー及びサイズ排除クロマトグラフィーからなる群から選択される精製方法を単独または組み合わせて行うものである、製造方法を提供する。
本発明のもう一つの具体例は、前記陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂の官能基が、第四級アンモニウム（Ｑ）、第四級アミノエチル（ＱＡＥ）、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ジメチルアミノメチル（ＤＭＡＥ）及びトリメチルアミノエチル（ＴＭＡＥ）からなる群から選択されるいずれか一つである、製造方法を提供する。
本発明のもう一つの具体例は、前記陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂の官能基が、メチルスルホネート（Ｓ）、スルホプロピル（ＳＰ）、カルボキシメチル（ＣＭ）、スルホエチル（ＳＥ）及びポリアスパラギン酸からなる群から選択されるいずれか一つである、製造方法を提供する。
本発明のもう一つの具体例は、前記疎水性クロマトグラフィーの樹脂の官能基が、フェニル、オクチル、（イソ）プロピル、ブチル及びエチルからなる群から選択されるいずれか一つである、製造方法を提供する。
本発明のもう一つの具体例は、前記親和性クロマトグラフィーの樹脂の官能基が、プロテインＡ、ヘパリン、ブルー、ベンズアミジン、金属イオン（コバルト、ニッケル及び銅）、及び非ペプチド性重合体の両末端がそれぞれ免疫グロブリンＦｃ領域及び生理活性ポリペプチドに連結されたタンパク質結合体の構成成分の一部または全体に対する抗体からなる群から選択されるいずれか一つである、製造方法を提供する。
本発明のもう一つの具体例は、前記サイズ排除クロマトグラフィーの樹脂が、スーパーデックス、セファクリル、スーパーロース及びセファデックスからなる群から選択されるいずれか一つである、製造方法を提供する。
本発明のもう一つの具体例は、前記（ｂ）段階は、タンパク質結合体を構成する非ペプチド性重合体と免疫グロブリンＦｃ領域が免疫グロブリンＦｃ領域のＮ末端を介して結合したタンパク質結合体を分離する、製造方法を提供する。
本発明のもう一つの様態は、（タンパク質結合体を製造する方法であって、
（ａ’）非ペプチド性重合体の一末端を免疫グロブリンＦｃ領域または生理活性ポリペプチドに共有結合により連結して連結体を製造する段階であり、ｐＨ４．０～９．０の条件で行われる段階；
（ｂ’）前記（ａ’）段階で製造した連結体を分離して、分離された連結体の非ペプチド性重合体の他方の末端を免疫グロブリンＦｃ領域または生理活性ポリペプチドの他の一つと共有結合により連結する段階であり、ｐＨ４．０～９．０の条件で行われる段階；及び（ｃ’）前記（ｂ’）段階で製造された共有結合により連結された生理活性ポリペプチド、非ペプチド性重合体及び免疫グロブリンＦｃ領域を必須的に含み、前記非ペプチド性重合体が免疫グロブリンＦｃ断片のＮ末端に連結されたタンパク質結合体を分離する段階を含む、製造方法を提供する。
特に、非ペプチド性重合体と免疫グロブリンＦｃ領域のＮ末端との間の結合において、反応率に重要な条件はｐＨであり、中性以下のｐＨ、すなわちｐＨ７．０以下で位置特異的結合がよく起こる。
非ペプチド性重合体と免疫グロブリンＦｃ領域のＮ末端との連結は、中性以下のｐＨで行われてもよいが、タンパク質の３次構造または活性が変性されない適正な水準の弱酸性～酸性のｐＨを有することが適切であるが、これに制限されない。非制限的な例としては、本発明で用いている免疫グロブリンＦｃ領域は、配列番号１のアミノ酸配列を有し、約ｐＨ ８．２程度の弱塩基性の条件でＮ末端特異性を有することを確認した（実施例５）。
つまり、一般的な免疫グロブリンＦｃ領域を用いる場合、中性以下のｐＨで非ペプチド性重合体と免疫グロブリンＦｃ領域のＮ末端との特異的結合の反応率が増加する。しかし、より低いｐＨ敏感度に変異した免疫グロブリンＦｃ領域を用いる場合には、当該条件に拘束されない場合もある。
本発明のもう一つの様態は、タンパク質結合体を製造する方法であって、
（ａ’）非ペプチド性重合体の一末端を免疫グロブリンＦｃ領域または生理活性ポリペプチドに共有結合により連結して連結体を製造する段階を含み、生理活性ポリペプチドと非ペプチド性重合体との間の反応モル比が、１：１～１：３０であり、免疫グロブリンＦｃ領域と非ペプチド性重合体との間の反応モル比が、１：１～１：２０であり、還元剤が、１ｍＭ ～１００ｍＭの範囲で含まれ、反応が、ｐＨ４．０～９．０の条件、４．０℃～２５℃の温度で行われて、免疫グロブリンＦｃ領域または生理活性ポリペプチドの濃度が、０．１ｍｇ/ｍｌ～１００ｍｇ/ｍｌである段階;
（ｂ’）前記（ａ’）段階で製造した連結体を分離して、分離された連結体の非ペプチド性重合体の他方の末端を免疫グロブリンＦｃ領域または生理活性ポリペプチドの他の一つに共有結合により連結する段階を含み、連結体と免疫グロブリンＦｃ領域または生理活性ポリペプチドとの間の反応モル比が、１：０.１～１：２０であり、還元剤が、１ｍＭ～１００ｍＭの範囲で含まれ、反応が、ｐＨ４．０～９．０の条件、４．０℃～２５℃の温度で行われて、免疫グロブリンＦｃ領域または生理活性ポリペプチドの濃度が、０．１ｍｇ/ｍｌ～１００ｍｇ/ｍｌで行われる段階；及び
（ｃ’）前記（ｂ’）段階で製造された共有結合により連結された生理活性ポリペプチド、非ペプチド性重合体及び免疫グロブリンＦｃ領域を必須的に含み、前記非ペプチド性重合体が免疫グロブリンＦｃ断片のＮ末端に連結されたタンパク質結合体を分離する段階を含む、製造方法を提供する。
本発明のもう一つの具体例は、９０％以上のＮ末端選択性を有するタンパク質結合体の製造方法を提供する。
本発明のもう一つの様態は、前記タンパク質結合体を有効成分として含む生理活性ポリペプチドの生体内持続性及び安定性増加用薬学的組成物を提供する。
本発明の一つの具体例は、 前記タンパク質結合体を９０％以上の量で含む組成物を提供する。
本発明のもう一つの様態は、前記タンパク質結合体の製造方法により製造されたタンパク質結合体を９０％以上に含む、タンパク質結合体の集合体を提供する。
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の一様態は、非ペプチド性重合体を介して免疫グロブリンＦｃ領域に連結された生理活性ポリペプチドを含むタンパク質結合体であって、前記非ペプチド性重合体が、免疫グロブリンＦｃ領域のＮ末端に位置特異的に結合したものである、タンパク質結合体に関する。
本発明で使用される用語、「タンパク質結合体」または「結合体」とは、少なくても一つの生理活性ポリペプチド、両末端に反応基を有する少なくても１つの非ペプチド性重合体及び少なくても１つの免疫グロブリンＦｃ領域が共有結合により相互連結されていることを指す。また、前記「結合体」と区別するために、生理活性ポリペプチド、非ペプチド性重合体及び免疫グロブリンＦｃ領域で選択された２種類の物質の分子だけが共有結合により連結された構造物は、「連結体」と表示する。
本発明のタンパク質結合体は、非ペプチド性重合体の両末端が、反応基を介して生理活性ポリペプチド及び免疫グロブリンＦｃ領域にそれぞれ共有結合により連結されるものであってもよい。
本発明で使用される用語、「生理活性ポリペプチド」、「生理活性タンパク質」、「活性タンパク質」または「タンパク質薬物」とは、生体内で生理的現象に拮抗作用を示すポリペプチドまたはタンパク質を意味する用語であって、相互交換的に用いてもよい。
本発明で使用される用語、「非ペプチド性重合体」は、繰り返し単位が２つ以上含まれた生体適合性重合体を意味し、前記繰り返し単位は、ペプチド結合ではなく、任意の共有結合を介して互いに連結されるものであってもよいが、これに限定されない。
本発明で使用される用語、「免疫グロブリンＦｃ領域」は、免疫グロブリンの重鎖と軽鎖可変領域、重鎖不変領域１（ＣH１）と軽鎖不変領域１（ＣL１）を除いた残りの部分を意味する。免疫グロブリンＦｃ領域は、重鎖不変領域にヒンジ領域をさらに含んでもよい。特に、本発明で免疫グロブリンＦｃ領域全体及びその一部を含む断片であってもよく、本発明で免疫グロブリンＦｃ領域は、免疫グロブリン断片と混用されてもよい。
天然型Ｆｃは、重鎖不変領域１のＡｓｎ２９７部位に糖鎖を有するが、大腸菌由来の組み換えＦｃは非糖鎖化の形態として発現される。Ｆｃから糖鎖が除去されると、重鎖不変領域１に結合するＦｃガンマ受容体１，２及び３と補体（Ｃ１ｑ）の結合力が低下され、抗体依存性細胞毒性または補体依存性細胞毒性が減少または除去される。
本発明で使用される用語、「免疫グロブリンの不変領域」は、免疫グロブリンの重鎖と軽鎖可変領域、重鎖不変領域１（ＣＨ１）と軽鎖不変領域（ＣＬ）を除いた、重鎖不変領域２（ＣＨ２）及び重鎖不変領域３（ＣＨ３）（または重鎖不変領域４（ＣＨ４）を含む）部分を含むＦｃ断片を意味してもよく、重鎖不変領域にヒンジ部分をさらに含んでもよい。また、本発明の免疫グロブリンの不変領域は、天然型タンパク質と実質的に同等であるかまたは向上された効果を有する限り、免疫グロブリンの重鎖と軽鎖可変領域を除いて、重鎖不変領域１（ＣＨ１）及び/または軽鎖不変領域（ＣＬ）の 一部または全体を含む拡張された免疫グロブリンの不変領域であってもよい。また、ＣＨ２及び/またはＣＨ３に該当する非常に長い部分のアミノ酸配列が除去された領域であってもよい。すなわち、本発明の免疫グロブリンの不変領域は、（１）ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン及びＣＨ４ドメイン、（２）ＣＨ１ドメイン及びＣＨ２ドメイン、（３）ＣＨ１ドメイン及びＣＨ３ドメイン、（４）ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメイン、（５）不変領域の一つ以上のドメインと免疫グロブリンヒンジ領域（またはヒンジ領域の一部）との組み合わせ、及び（６）重鎖不変領域の各ドメインと軽鎖不変領域とのダイマーであってもよい。免疫グロブリンＦｃ断片を含む免疫グロブリン不変領域は、生体内で代謝されうる生分解性のポリペプチドであるため、薬物の担体として用いるのに安全である。また、免疫グロブリンＦｃ断片は、免疫グロブリン全体分子に比べて相対的に分子量が少ないため、結合体の製造、精製及び収率の面で有利である。また、アミノ酸配列が抗体ごとに異なるため、高い非均質性を示すＦａｂ部分が除去されるため、物質の同質性が大幅に増加して血液中の抗原性の誘発可能性も低くなる効果も期待できる。
一方、免疫グロブリンの不変領域は、ヒトまたは牛、ヤギ、ブタ、マウス、ウサギ、ハムスター、ラット、モルモットなどの動物起源であってもよく、好ましくは、ヒト起源であってもよい。また、免疫グロブリンの不変領域は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭ由来またはこれらの組み合わせまたは混成に由来の不変領域からなる群から選択されてもよく、好ましくは、ヒト血液に最も豊富なＩｇＧまたはＩｇＭ由来であり、最も好ましくは、リガンド結合タンパク質の半減期を向上させることが公知されたＩｇＧ由来であってもよい。本発明で、免疫グロブリンＦｃ領域は、同一起源のドメインからなる一本鎖免疫グロブリンからなるダイマーまたはマルチマーであってもよい。
本発明で使用される用語、「組み合わせ」とは、ダイマーまたはマルチマーを形成するとき、同一起源の一本鎖免疫グロブリンの不変領域（好ましくは、Ｆｃ領域）を暗号化するポリペプチドが異なる起源の一本鎖ポリペプチドと結合を形成することを意味する。つまり、ＩｇＧ Ｆｃ、ＩｇＡ Ｆｃ、ＩｇＭ Ｆｃ、ＩｇＤ Ｆｃ及びＩｇＥ ＦｃのＦｃ断片からなる群から選択された２つ以上の断片からダイマーまたはマルチマーの製造が可能である。
本発明で使用される用語、「ハイブリッド」とは、異なる起源の２つ以上の免疫グロブリンの不変領域（好ましくは、Ｆｃ領域）をコードする配列が、免疫グロブリンの不変領域の 一本鎖に存在することを意味する。本発明の場合、様々な形態のハイブリッドが可能である。例えば、ハイブリッドドメインは、ＩｇＧ Ｆｃ、ＩｇＭ Ｆｃ、ＩｇＡ Ｆｃ、ＩｇＥ Ｆｃ及びＩｇＤ ＦｃのＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３及びＣＨ４からなる群から選択された１つ～４つのドメインから構成されてもよく、ヒンジ領域をさらに含んでもよい。
ＩｇＧもＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４のサブクラスに分けることができ、本発明では、これらの組み合わせまたは混成化を含んでもよい。好ましくは、ＩｇＧ２及びＩｇＧ４サブクラスであり、より好ましくは、補体依存性毒性（ＣＤＣ）のようなエフェクター機能がほとんどないＩｇＧ４のＦｃ領域であってもよい。
免疫グロブリンの不変領域は、天然型と同等またはそれよりも大きくまたはより小さい程度で糖鎖化の形態を有していてもよく、または脱糖鎖化型であってもよい。免疫グロブリンの不変領域の増加または減少された糖鎖化または脱糖鎖化は、化学的方法、酵素学的方法または微生物を用いた遺伝工学的方法のような通常の方法により達成されてもよい。ここで、脱糖鎖化された場合、免疫グロブリンの不変領域への補体結合（Ｃ１ｑ）が著しく減少し、抗体依存性細胞毒性または補体依存性細胞毒性が減少または除去され、それにより生体内で不要な免疫反応を誘発しない。この点で、脱糖鎖化または非糖鎖化された免疫グロブリン不変領域は、薬物担体の目的とより一致する。したがって、前記免疫グロブリンＦｃ領域はより具体的には、ヒトＩｇＧ４由来の非糖鎖化されたＦｃ領域であり、すなわち、ヒト非糖鎖化ＩｇＧ４ Ｆｃ領域である。ヒト由来のＦｃ領域は、人体で抗原として作用して、これに対する新しい抗体を生成するなどの望ましくない免疫反応を引き起こす可能性がある非ヒト由来のＦｃ領域に比べて好ましい。
また、本発明の免疫グロブリンの不変領域は、天然型アミノ酸配列だけでなく、その配列誘導体（変異体）を含む。アミノ酸配列誘導体とは、天然アミノ酸配列のうちの一つ以上のアミノ酸残基が欠失、挿入、非保存的または保存的置換またはこれらの組み合わせによって異なる配列を有することを意味する。例えば、ＩｇＧ Ｆｃの場合、結合に重要であると知られている２１４～２３８、２９７～２９９、３１８～３２２または３２７～３３１番のアミノ酸残基が変形のために適当な部位として用いられてもよい。また、ジスルフィド結合を形成しうる部位が除去されるか、天然型ＦｃからＮ末端のいくつかのアミノ酸が除去されるか、又は天然型ＦｃのＮ末端にメチオニン残基が付加されるなどの様々な種類の誘導体が可能である。また、エフェクター機能をなくすために、補体結合部位、例えばＣ１ｑ結合部位、またはＡＤＣＣ部位が除去されることもある。このような免疫グロブリンの不変領域の配列誘導体を製造する技術は、特許文献１及び２などに開示されている。
分子の活性を全体的に変更させないタンパク質及びペプチドのアミノ酸交換は、当該分野で知られている（非特許文献２）。最も通常に起こる交換は、アミノ酸残基Ａｌａ/Ｓｅｒ、Ｖａｌ/Ｉｌｅ、Ａｓｐ/Ｇｌｕ、Ｔｈｒ/Ｓｅｒ、Ａｌａ/Ｇｌｙ、Ａｌａ/Ｔｈｒ、Ｓｅｒ/Ａｓｎ、Ａｌａ/Ｖａｌ、Ｓｅｒ/Ｇｌｙ、Ｔｈｒ/ＰＨｅ、Ａｌａ/Ｐｒｏ、Ｌｙｓ/Ａｒｇ、Ａｓｐ/Ａｓｎ、Ｌｅｕ/Ｉｌｅ、Ｌｅｕ/Ｖａｌ、Ａｌａ/Ｇｌｕ、Ａｓｐ/Ｇｌｙ間の交換である。場合によっては、リン酸化、硫酸化、アクリル化、グリコシル化、メチル化、ファルネシル化、アセチル化、アミド化などに修飾されうる。
前述した免疫グロブリンの不変領域誘導体は、本発明の免疫グロブリンの不変領域と同様の生物学的活性を示すが、免疫グロブリンの不変領域の熱、ｐＨなどに対する構造的安定性を増大させた誘導体であってもよい。また、このような免疫グロブリンの不変領域は、ヒト及び牛、ヤギ、ブタ、マウス、ウサギ、ハムスター、ラット、モルモットなどの動物の生体内で分離した天然型から得られてもよく、形質転換された動物細胞または微生物から得られた組み換え型またはその誘導体であってもよい。ここで、ヒトまたは動物の生物体から全体免疫グロブリンを単離し、それらをタンパク質分解酵素で処理することによって天然型の免疫グロブリンから得ることができる。パパインは、天然型の免疫グロブリンをＦａｂ及びＦｃに切断し、ペプシンは、ｐＦ’ｃ及びＦ(ａｂ)２に切断する。これらの断片は、例えば、ＦｃまたはｐＦ’ｃを単離するためのサイズ排除クロマトグラフィーに供され得る。
好ましくは、ヒト由来の免疫グロブリンの不変領域を微生物から収得した組み換え型免疫グロブリンの不変領域であってもよい。
本発明のタンパク質結合体は、［生理活性ポリペプチド/非ペプチド性重合体/免疫グロブリンＦｃ領域］の単位構造を一つ以上含んでもよく、ここで、すべての構成要素は共有結合によって線形に連結されてもよい。非ペプチド性重合体は、両末端に反応基を有することができるため、これを介して生理活性ポリペプチド及び免疫グロブリンＦｃ領域にそれぞれ共有結合により連結される。つまり、生理活性ポリペプチドと生理活性プリペプチドの少なくても一つの連結体は共有結合により一つの免疫グロブリンＦｃ領域に連結され、免疫グロブリンＦｃ領域を媒介体として生理活性ポリペプチドのモノマー、ダイマーもしくはマルチマーを形成することができる。これにより生体内活性及び安定性の増加をより効果的に達成しうる。
前記非ペプチド性重合体の両末端の反応基は、反応アルデヒドグループ、プロピオンアルデヒドグループ、ブチルアルデヒドグループ、マレイミドグループ及びスクシンイミド誘導体で構成された群から選択されることが望ましい。前記スクシンイミド 誘導体には、ヒドロキシスクシンイミジル、スクシンイミジルカルボキシメチル、スクシンイミジルバレレート、スクシンイミジルメチルブタノエート、スクシンイミジルメチルプロピオネート、スクシンイミジルブタノエート、スクシンイミジルプロピオネート、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド、またはスクシンイミジルカーボネートが用いられてもよい。特に、前記非ペプチド性重合体が両末端に反応アルデヒドグループの反応基を有する場合、生理活性ポリペプチド及び免疫グロブリンＦｃ領域の両末端を非特異的反応を最小化して連結することは効果的である。アルデヒド結合による還元性アルキル化で生成された最終産物は、アミド結合で連結されたものよりもはるかに安定的である。
本発明の非ペプチド性重合体の両末端の反応基は、互いに同様であるか、または異なってもよい。前記非ペプチド性重合体は、両末端にアルデヒド反応基を有するものであってもよく、または一方の末端にはアルデヒドグループ及び他の末端にはマレイミド反応基を有するか、または、一方の末端にはアルデヒドグループ及び他の末端にはスクシンイミド反応基を有してもよいが、これに限定されない。
例えば、前記非ペプチド性重合体は、一方の末端にはマレイミドグループを、他方の末端にはアルデヒドグループ、プロピオンアルデヒドグループまたはブチルアルデヒドグループを有してもよい。また、前記非ペプチド性重合体は、一方の末端にはスクシンイミジルグループを、他方の末端にはプロピオンアルデヒドグループまたはブチルアルデヒドグループを有してもよい。両末端に反応性ヒドロキシ基を有するポリエチレングリコールが非ペプチド性重合体として用いる場合には、前記ヒドロキシ基は公知の化学反応によって、様々な反応基で活性化されてもよく、または変形された反応基を有する商業的に入手可能なポリエチレングリコールを用いて、本発明のタンパク質結合体を製造してもよい。
生理活性ポリペプチドと免疫グロブリンＦｃ領域が非ペプチド性重合体を媒介として連結される場合には、前記非ペプチド性重合体の両末端がそれぞれ免疫グロブリンＦｃ領域のＮ末端と生理活性ポリペプチドのＮ末端（アミノ末端）、Ｃ末端（カルボキシル末端）、リジン残基、ヒスチジン残基またはシステイン残基の遊離反応基に結合されたものであってもよい。
本発明で使用される用語、「Ｎ末端」は、ペプチドのＮ末端を意味するもので、本発明の目的上、非ペプチド性重合体を含むリンカーと結合しうる位置である。Ｎ末端の例として、Ｎ末端のアミノ酸残基のみならず、Ｎ末端近傍のアミノ酸残基を挙げることができるが、これに限定されない。具体的には、末端から最初～２０番目のアミノ酸残基を含んでもよい。
本発明の非ペプチド性重合体は、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコールとプロピレングリコールの共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコール、ポリサカライド、デキストラン、ポリビニルエチルエーテル、ＰＬＡ（ポリ乳酸）及びＰＬＧＡ（ポリ乳酸‐グリコール酸）のような生分解性高分子、脂質重合体、キチン類、ヒアルロン酸及びこれらの組み合わせで構成された群から選択されてもよく、具体的には、ポリエチレングリコールであってもよいが、これに限定されない。また、当該分野ではすでに知られているこれらの誘導体及び当該分野の技術水準で容易に製造しうる誘導体も、本発明の非ペプチド性重合体の範囲に含まれる。非ペプチド性重合体では、分子量が１ｋＤａ～１００ｋＤａの範囲、具体的には、１ｋＤａ～２０ｋＤａの範囲であってもよい。
本発明の生理活性ポリペプチドには、ホルモン、サイトカイン、インターロイキン、インターロイキン結合タンパク質、酵素、抗体、成長因子、転写因子、血液因子、ワクチン、構造タンパク質、リガンドタンパク質または受容体、細胞表面抗原、受容体アンタゴニスト及びこれらの誘導体またはアナログのような様々な生理活性ポリペプチドにより例示しうる。
具体的には、前記生理活性ポリペプチドは、ヒト成長ホルモン、成長ホルモン放出ホルモン、成長ホルモン放出ペプチド、インターフェロン類とインターフェロン受容体類（例：インターフェロン‐α、-β及び‐γ、水溶性タイプ‐I‐インターフェロン受容体など）、コロニー刺激因子、インターロイキン類（例：インターロイキン‐１、‐２、‐３、‐４、‐５、‐６、‐７、‐８、‐９、‐１０、‐１１、‐１２、‐１３、‐１４、‐１５、‐１６、‐１７、‐１８、‐１９、‐２０、‐２１、‐２２、‐２３、‐２４、‐２５、‐２６、‐２７、‐２８、‐２９、‐３０など）とインターロイキン受容体類（例：ＩＬ‐１受容体、ＩＬ‐４受容体など）、酵素類（例：グルコセレブロシダーゼ、イズロン酸‐２‐スルファターゼ 、α‐ガラクトシダーゼＡ、アガルシダーゼα、β、α‐Ｌ‐イズロニダーゼ、ブチリルコリンエステラーゼ、キチナーゼ、グルタミン酸デカルボキシラーゼ、イミグルセラーゼ、リパーゼ、ウリカーゼ、血小板活性化因子アセチルヒドロラーゼ、中性エンドペプチダーゼ、ミエロペルオキシダーゼなど）、インターロイキン及びサイトカイン結合タンパク質類（例：ＩＬ‐１８ｂｐ、ＴＮＦ結合タンパク質など）、マクロファージ活性因子、マクロファージペプチド、Ｂ細胞因子、Ｔ細胞因子、タンパク質Ａ、アレルギー抑制因子、細胞壊死糖タンパク質、免疫毒素、リンホトキシン、腫瘍壊死因子、腫瘍抑制因子、転移成長因子、α-１アンチトリプシン、アルブミン、α-ラクトアルブミン、アポリポタンパク質Ｅ、赤血球生成因子、糖鎖化された赤血球生成因子、アンジオポエチン類、ヘモグロビン、トロンビン、トロンビン受容体活性ペプチド、トロンボモジュリン、血液因子ＶＩＩ、ＶＩＩａ、ＶＩＩＩ、ＩＸ及びＸＩＩＩ、プラスミノーゲン活性因子、フィブリン結合ペプチド、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、ヒルジン、タンパク質Ｃ、Ｃ反応性タンパク質、レニン抑制剤、コラゲナーゼ抑制剤、スーパーオキシドジスムターゼ、レプチン、血小板由来成長因子、上皮細胞成長因子、表皮細胞成長因子、アンジオスタチン、アンジオテンシン、骨形成成長因子、骨形成促進タンパク質、カルシトニン、インスリン、オキシントモジュリン、グルカゴン、グルカゴン誘導体、グルカゴン様ペプチド、エキセンジン（エキセンジン４）、アトリオペプチン、軟骨誘導因子、エルカトニン、結合組織活性因子、組織因子経路阻害剤、卵胞刺激ホルモン、黄体形成ホルモン、黄体形成ホルモン放出ホルモン、神経成長因子類（例： 神経成長因子、毛様体神経栄養因子、アキソジェネシス因子１、脳性ナトリウム利尿ペプチド、グリア由来神経栄養因子、ネトリン、好中球阻害因子、神経栄養因子、ニュールツリンなど）、副甲状腺ホルモン、リラキシン、セクレチン、ソマトメジン、インスリン様成長因子、副腎皮質ホルモン、グルカゴン、コルレシストキニン、膵臓ポリペプチド、ガストリン放出ペプチド、コルチコトロピン放出因子、甲状腺刺激ホルモン、オートタキシン、ラクトフェリン、ミオスタチン、受容体類、（ＴＮＦＲ (Ｐ７５)、ＴＮＦＲ (Ｐ５５)、ＩＬ‐１受容体、ＶＥＧＦ受容体、Ｂ細胞活性化因子受容体など）受容体アンタゴニスト（ＩＬ１‐Ｒａなど）、細胞表面抗原（例：ＣＤ２，３，４，５，６，１１ａ、１１ｂ、１８，１９，２０，２３，２５，３３，３８，４０，４５，６９など）、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、抗体断片類（例：ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ '、Ｆ（ａｂ’）２及びＦｄ）及びウイルス由来ワクチン抗原などの様々な種類を含む。
具体的に、本発明の生理活性ポリペプチドは、疾病の治療または予防の目的で人体に投与されるときに投与頻度が高いヒト成長ホルモン、インターフェロン類（インターフェロン‐α、‐β、‐γなど）、顆粒球コロニー刺激因子、赤血球生成因子、血液因子ＶＩＩ、血液因子ＶＩＩａ、血液因子ＶＩＩＩ、インスリン、オキシントモジュリン、グルカゴン、グルカゴン様ペプチド類、エキセンジン類、抗体断片類及びそれぞれの誘導体などであってもよい。また、前記生理活性ポリペプチドの天然型と実質的に同等であるか、または増加された機能、構造、活性または安定性を有する限り、任意の変異体または誘導体も本発明の生理活性ポリペプチドの範囲に含まれる。
本発明で抗体断片は、特定の抗原に結合しうる能力を有するＦａｂ、Ｆａｂ '、Ｆ（ａｂ’）2、ＦｄまたはｓｃＦｖであってもよく、好ましくはＦａｂ 'である。 Ｆａｂ断片は、軽鎖の可変ドメイン（ＶＬ）及び不変ドメイン（ＣＬ）と重鎖の可変ドメイン（ＶＨ）及び第１不変ドメイン（ＣＨ１）を含む。 Ｆａｂ '断片は、ＣＨ１ドメインのカルボキシル末端にヒンジ領域からの一つ以上のシステイン残基を含む数個のアミノ酸残基が付加されているという点でＦａｂ断片とは区別される。Ｆｄ断片は、ＶＨ及びＣＨ１ドメインのみで構成された断片であり、Ｆ（ａｂ’）2断片は２分子のＦａｂ’断片がジスルフィド結合もしくは化学的反応を介して結合したものである。ｓｃＦｖ断片は、ＶＬとＶＨドメインのみがペプチドリンカーにより互いに連結された単一ポリペプチド鎖である。
また、本発明のタンパク質結合体は、ウシ成長ホルモンまたはブタ成長ホルモンのような動物成長ホルモンの持続型タンパク質製剤及びインターフェロンのような動物の病気治療または予防用の持続型タンパク質製剤の開発にも用いられてもよい。
もう一つの様態として、本発明は、本発明のタンパク質結合体の製造方法を提供する。特に、本発明は、（ａ）両末端に反応基を有する少なくても一つの非ペプチド性重合体、少なくても一つの生理活性ポリペプチド及び少なくても一つの免疫グロブリンＦｃ領域を共有結合により連結して、タンパク質結合体を製造する段階；及び（ｂ）前記（ａ）段階で製造された共有結合により連結された生理活性ポリペプチド、非ペプチド性重合体及び免疫グロブリンＦｃ領域を必須的に含み、前記非ペプチド性重合体が免疫グロブリンＦｃ断片のＮ末端に連結されたタンパク質結合体を分離する段階を含む、位置特異的タンパク質結合体の製造方法を提供する。
本発明の免疫グロブリンＦｃ領域は、ダイマーの形態であってもよいが、ホモダイマーまたはヘテロダイマーの形態であってもよい。これにより、本発明のタンパク質結合体を構成する免疫グロブリンＦｃ領域は、一つまたは二つ以上のＮ末端を含んでもよい。したがって、免疫グロブリンＦｃ領域はＮ末端を介して少なくても一つの非ペプチド性重合体に連結されてもよい。特に、本発明の免疫グロブリンＦｃ領域は、ホモダイマーの形態であってもよく、これにより免疫グロブリンＦｃ領域のホモダイマーに含まれている二つのＮ末端を介して、一つまたは二つの非ペプチド性重合体と連結される。この点で、前記非ペプチド性重合体は、それぞれ生理活性ポリペプチドに結合しうるため、タンパク質結合体を構成する。
したがって、本発明のタンパク質結合体は、一つまたは二つ以上の非ペプチド性重合体、一つまたは二つ以上の生理活性ポリペプチド及び一つまたは二つ以上の免疫グロブリンＦｃ領域が共有結合により連結されて製造されうる。
（ａ）段階で、三つの構成要素の間の共有結合は、順次的にまたは同時に発生しうる。例えば、非ペプチド性重合体の両端にそれぞれ生理活性ポリペプチド及び免疫グロブリンＦｃ領域を結合させる場合には、生理活性ポリペプチド及び免疫グロブリンＦｃ領域のいずれかを先に非ペプチド性重合体の一方の末端に連結させ、その後、残りの成分を非ペプチド性重合体の他方の末端に連結させる。この方法は、所望のタンパク質結合体以外の副産物の生成が最小限に抑えられ、タンパク質結合体が高純度で調製される点で有利である。
したがって、前記（ａ）段階は、
（ｉ）非ペプチド性重合体の一方の末端に免疫グロブリンＦｃ領域の特定位置または生理活性ポリペプチドを共有結合により連結させる段階；
（ｉｉ）前記反応混合物から非ペプチド性重合体に免疫グロブリンＦｃ領域の特定位置または生理活性ポリペプチドが連結して製造された連結体を均質に分離する段階；及び
（ｉｉｉ）分離された連結体の非ペプチド性重合体の他方の末端に生理活性ポリペプチドまたは免疫グロブリンＦｃ領域の特定位置を連結させたタンパク質結合体を生成する段階を含んでもよい。
一方、本発明で、前記（ａ）段階は、（ａ１）非ペプチド性重合体の一方の末端を免疫グロブリンＦｃ領域または生理活性ポリペプチドのいずれかに共有結合により連結させて連結体を製造する段階；及び（ａ２）前記（ａ１）段階で製造された連結体を分離して、生理活性ポリペプチド及び免疫グロブリンＦｃ領域の他の一つに共有結合により分離された連結体の非ペプチド性重合体の他方の末端を連結する段階を含むものであってもよい。
具体的に、前記（ａ）段階は、（ａ１’）非ペプチド性重合体の一方の末端を免疫グロブリンＦｃ領域に共有結合により連結させて連結体を製造する段階；及び（ａ２’）前記（ａ１’）段階で製造された連結体を分離して、生理活性ポリペプチドに共有結合により分離された連結体の非ペプチド性重合体の他方の末端を連結する段階を含むものであってもよい。
または、前記（ａ）段階は、（ａ１’'）非ペプチド性重合体の一方の末端を生理活性ポリペプチドに共有結合により連結させて連結体を製造する段階；及び（ａ２’'）前記（ａ１’'）段階で製造された連結体を分離して、生理活性ポリペプチドに共有結合により分離された連結体の免疫グロブリンＦｃ領域の他方の末端を連結する段階を含むものであってもよい。
本発明の（ａ１）、（ａ１’）または（ａ１’'）の段階で、生理活性ポリペプチドと非ペプチド性重合体との間の反応モル比が１：１～１：３０であり、免疫グロブリンＦｃ領域と非ペプチド性重合体との間の反応モル比が１：１～１：２０であってもよい。具体的には、（ａ１’）段階で、免疫グロブリンＦｃ領域と非ペプチド性重合体との間の反応モル比が１：１～１：２０であり、特に１：１～１：１５、１：１～１：１０または１：１～１：４の範囲であってもよい。（ａ１’'）段階で、生理活性ポリペプチドと非ペプチド性重合体との間の反応モル比が１：１～１：３０であり、特に１：１～１：１５、１：１～１：１０の範囲であってもよい。前記反応モル比に基づいて、製造収率及びコストが最適化されうる。
本発明の（ａ１）、（ａ１’）または（ａ１’’）段階は、ｐＨ ４．０～９．０の条件で行われてもよく；（ａ１）、（ａ１’）または（ａ１’’）段階は、４．０℃～２５℃の温度で行われてもよく；（ａ１）、（ａ１’）または（ａ１’’）段階で、免疫グロブリンＦｃ領域または生理活性ポリペプチドの反応濃度は、０．１ｍｇ/ｍｌ～１００ｍｇ/ｍｌであってもよい。
本発明の（ａ２）、（ａ２’）または（ａ２’’）段階で、連結体と疫グロブリンＦｃ領域または生理活性ポリペプチドとの間の反応モル比が１：０．１～１：２０であってもよく、特に１：０．２～１：１０の範囲であってもよい。具体的に、（ａ２ '）段階で、連結体と生理活性ポリペプチドとの間の反応モル比が１：０．１～１：２０であってもよく、及び（ａ２' '）段階で、連結体と免疫グロブリンＦｃ領域との間の反応モル比が１：０．１～１：２０であってもよい。前記反応モル比に基づいて、製造収率及びコストを最適化されうる。
本発明で、（ａ２）、（ａ２’）または（ａ２’’）段階は、ｐＨ４．０～９．０の条件で行われてもよく；（ａ２）、（ａ２’）または（ａ２’’）段階は、４．０℃～２５℃の温度で行われてもよく；（ａ２）、（ａ２’）または（ａ２’’）段階で、免疫グロブリンＦｃ領域または生理活性プリペプチドの反応濃度は、０．１ｍｇ/ｍｌ～１００ｍｇ/ｍｌの範囲であってもよい。
一方、本発明の製造方法は、（ａ’）非ペプチド性重合体の一方の末端を免疫グロブリンＦｃ領域または生理活性ポリペプチドのいずれかに共有結合により連結して連結体を製造する段階であって、生理活性ポリペプチドと非ペプチド性重合体との間の反応モル比が、１：１～１：３０であり、免疫グロブリンＦｃ領域と非ペプチド性重合体との間の反応モル比が、１：１～１：２０であり、還元剤が１ｍＭ～１００ｍＭの範囲で含まれ、反応が、ｐＨ４．０～９．０の条件、４．０℃～２５℃の温度で行われ、免疫グロブリンＦｃ領域または生理活性ポリペプチドの反応濃度が、０.１ｍｇ/ｍｌ～１００ｍｇ/ｍｌで行われる段階；
（ｂ’）前記（ａ’）段階で製造された連結体を分離して、分離された連結体の非ペプチド性重合体の他方の末端に生理活性ポリペプチドまたは免疫グロブリンＦｃ領域の他の一つと共有結合により連結する段階であって、連結体と免疫グロブリンＦｃ領域または生理活性ポリペプチドとの間の反応モル比が、１：０．１～１：２０であり、還元剤が１ｍＭ～１００ｍＭの範囲で含まれ、反応が、ｐＨ４．０～９．０の条件、４．０℃～２５℃の温度で行われ、免疫グロブリンＦｃ領域または生理活性ポリペプチドの反応濃度が、０.１ｍｇ/ｍｌ～１００ｍｇ/ｍｌで行われる段階；及び
（ｃ’）前記（ｂ’）段階で製造された共有結合により連結された生理活性ポリペプチド、非ペプチド性重合体及び免疫グロブリンＦｃ領域を必須的に含み、前記非ペプチド性重合体が免疫グロブリンＦｃ領域のＮ末端に連結されたタンパク質結合体を分離する段階を含む、位置特異的タンパク質結合体の製造方法であってもよいが、これに限定されない。
本発明の（ａ１）、（ａ１’）、（ａ１’’）、（ａ２）、（ａ２’）及び（ａ２’’）段階の反応は、反応に参加する非ペプチド性重合体の両末端の反応基の種類を考慮して、必要に応じて還元剤の存在下で行われてもよい。本発明の還元剤は、シアノ水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＣＮＢＨ3）、水素化ホウ素ナトリウム、ジメチルアミンホウ酸塩及びピリジンホウ酸塩であってもよい。この点で、本発明で還元剤（例：シアノ水素化ホウ素ナトリウム）の濃度、反応溶液の温度、ｐＨ及び反応に参加する生理活性ポリペプチド及び免疫グロブリンＦｃ領域の全体濃度が製造収率と純度に重要である。高純度の均一な結合体の生成を最大にするために、多様な条件の組み合わせが必要である。製造しようとする生理活性ポリペプチドの特性に応じて、多様な条件が可能であり、制限されないが、還元剤（例：シアノ水素化ホウ素ナトリウム）は、１ｍＭ～１００ｍＭの範囲で含まれ、反応溶液は０℃～２５℃の温度、ｐＨ４．０～９．０の条件であってもよく、反応タンパク質の濃度（反応時に含まれる免疫グロブリンＦｃ領域または生理活性ポリペプチドの濃度）は５ｍｇ/ｍｌ～１００ｍｇ/ｍｌの範囲であってもよい。
一方、（ａ２）、（ａ２ '）及び（ａ２' '）段階で連結体を分離することは、分離された連結体に要求される純度、疎水性、分子量及び電荷量のような特性を考慮して、タンパク質の分離に用いられる通常の方法の中で、必要に応じて適宜選択して行ってもよい。例えば、サイズ排除クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィーまたはイオン交換クロマトグラフィーを含む様々な公知の方法を適用して行ってもよく、必要に応じてはより高い純度に連結体を精製するために複数の異なる方法を組み合わせて用いてもよい。
製造しようとする生理活性ポリペプチドの特性に応じて、多様な条件が可能である。しかし、非ペプチド性重合体に連結された免疫グロブリンＦｃ領域または生理活性ポリペプチドの連結体を分離するために、サイズ排除クロマトグラフィーが一般的に行われる。今後のスケールアップと望ましい特定位置ではない他の位置に非ペプチド性重合体が結合された異性体もしくは製造中に生成されることもある少量の変性体を分離するためには、親和性クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィーまたはイオン交換クロマトグラフィーが用いられてもよい。
本発明で、前記（ｂ）段階は、最終的に高純度の結合体を精製するために疎水性、分子量及び電荷量のような特性を考慮して、タンパク質の分離に用いられる通常の方法の中で、必要に応じて適宜選択して行ってもよい。例えば、サイズ排除クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィーまたはイオン交換クロマトグラフィーを含む様々な公知の方法を適用してもよく、必要に応じてより高い純度に結合体を精製するために、複数の異なる方法を組み合わせて用いてもよい。生理活性ポリペプチドと非ペプチド性重合体及びＦｃ不変領域からなる 所望の結合体の性質に応じて、様々な分離条件が可能である。しかし、生理活性ポリペプチド及び免疫グロブリンＦｃ領域が非ペプチド性重合体の両末端にそれぞれ共有結合により連結された結合体を分離するためには、サイズ排除クロマトグラフィーが一般的に行われる。しかし、今後のスケールアップと望ましい位置ではない他の位置に非ペプチド性重合体を含む生理活性ポリペプチドまたは免疫グロブリンＦｃ領域が連結された異性体または副反応物質、製造中に生成されることもある少量の変性体、未反応生理活性ポリペプチド、非ペプチド重合体及び免疫グロブリンＦｃ領域などを効果的に分離するためには、疎水性クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーまたは親和性クロマトグラフィーを組み合わせたものであってもよい。特に、疎水性クロマトグラフィーとイオン交換クロマトグラフィーを組み合わせる方法であってもよく、多数の疎水性クロマトグラフィーの組み合わせ、または多数のイオン交換クロマトグラフィーの組み合わせも可能である。製造しようとする結合体によってはイオン交換クロマトラフィーまたは疎水性クロマトグラフィーを単独で使用する方法も可能である。
本発明で、イオン交換クロマトグラフィーは、特定ｐＨでタンパク質が電荷性を帯びることを用いて、電荷を帯びたイオン樹脂が固定されたクロマトグラフィーを通過させて、タンパク質の移動速度の差を用いてタンパク質を分離するものであって、陰イオン交換クロマトグラフィーまたは陽イオン交換クロマトグラフィーであってもよい。
前記陰イオン交換クロマトグラフィーは、陽イオン樹脂を用いるもので、該当陰イオン交換クロマトグラフィーを構成する樹脂の官能基が、 第四級アンモニウム（Ｑ）、 第四級アミノエチル（ＱＡＥ）、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ジメチルアミノメチル（ＤＭＡＥ）及びトリメチルアミノエチル（ＴＭＡＥ）からなる群から選択されるいずれか一つであってもよいが、これに限定されない。
また、前記陽イオン交換クロマトグラフィーは、陰イオン樹脂を用いるもので、該当陽イオン交換クロマトグラフィーを構成する樹脂の官能基が、メチルスルホネート（Ｓ）、スルホプロピル（ＳＰ）、カルボキシメチル（ＣＭ）、スルホエチル（ＳＥ）及びポリアスパラギン酸からなる群から選択されるいずれか一つであってもよいが、これに限定されない。
本発明で、疎水性クロマトグラフィーを構成する樹脂の官能基が、フェニル、オクチル、（イソ）プロピル、ブチル及びエチルからなる群から選択されるいずれか一つであってもよいが、これに限定されない。
本発明で、サイズ排除クロマトグラフィーを構成する樹脂が、スーパーデックス、セファクリル、スーパーロース及びセファデックスからなる群から選択されるいずれか一つであってもよいが、これに制限されない。
さらに、本発明の親和性クロマトグラフィーは、リガンドが固定された 樹脂のタンパク質と相互作用しうるリガンドとタンパク質との相互作用に起因するタンパク質の移動速度の差を用い、タンパク質を分離する。前記親和性クロマトグラフィーを構成する樹脂の官能基は、プロテインＡ、ヘパリン、ブルー、ベンズアミジン、金属イオン（コバルト、ニッケル、銅）及び非ペプチド性重合体の両末端がそれぞれ免疫グロブリンＦｃ領域及び生理活性ポリペプチドと連結されたタンパク質結合体の構成成分の一部あるいは全体に対する抗体からなる群から選択されるいずれか一つであってもよいが、これに限定されない。
本発明で、（ｂ）段階は、非ペプチド性重合体と免疫グロブリンＦｃ領域が免疫グロブリンＦｃ領域のＮ末端を介し互いに連結されたタンパク質結合体を分離する。
もう一つの様態として、本発明は、９０％以上のＮ末端選択性を有するタンパク質結合体の製造方法を提供する。具体的に、本発明に係る製造方法によって製造されたタンパク質結合体は、非ペプチド性重合体の一方の末端が免疫グロブリンＦｃ領域のＮ末端に９０％以上の選択的で連結でき、より具体的には、９５％以上、さらに具体的には、９８％以上、よりさらに具体的には、９９％以上で選択的に連結されてもよいが、これに限定されない。
本発明で使用される用語、「９０％以上のＮ末端選択性で連結」ということは、本発明に係る一連の反応で得られたタンパク質結合体の画分を精製して製造したタンパク質結合体の９０％以上がＦｃ領域のＮ末端に位置特異的に非ペプチド性重合体が連結されてことを意味する。本発明で使用される用語、「９０％以上」とは、ｖ/ｖ、ｗ/ｗ、ピーク/ピークを意味することができ、特定単位に制限されるものではない。Ｆｃ領域のＮ末端に位置特異的に連結された非ペプチド性重合体を含むタンパク質結合体の収率は、反応条件、非ペプチド性重合体の反応基によって変化しうる。
本発明の実施例では、様々な生理活性ポリペプチド、非ペプチド性重合体、及びＦｃ結合体の製造を通じて、本発明に係る製造方法で９０％以上のＮ末端選択性を有するタンパク質結合体を製造しうることを確認した。
もう一つの様態として、本発明は、前記タンパク質結合体または前記タンパク質結合体の製造方法によって製造されたタンパク質結合体を有効成分として含む、生理活性ポリペプチドの生体内持続性及び安定性が増加した薬学的組成物を提供する。
具体的に、前記薬学的組成物には、本発明の生理活性ポリペプチド‐非ペプチド性重合体‐免疫グロブリンＦｃ領域のＮ末端を含むタンパク質結合体が９０％以上、より具体的には、９５％以上、さらに具体的には９８％以上、よりさらに具体的には、９９％以上で含まれてもよいが、これに限定されない。前記「９０％以上」とは、ｖ/ｖ、ｗ/ｗ、ピーク/ピークなどを意味することができ、特定単位に制限されるものではない。
前記薬学的組成物は、薬学的に許容可能な賦形剤をさらに含んでもよい。
本発明の薬学的組成物は、経口、経皮、皮下、静脈または筋肉を含むいくつかの経路を介して投与されてもよく、好ましくは注射剤の形態として投与されてもよい。また、本発明の薬学的組成物は、哺乳動物に投与された後、活性成分の迅速、持続または遅延された放出が提供できるように、当業界でよく知られている方法を用いて剤形化されてもよい。剤形は、錠剤、丸剤、粉末、サシェ剤（sachet）、 エリキシル（elixir）、懸濁液、エマルジョン、溶液、シロップ、エアロゾル、軟質または硬質ゼラチンカプセル、滅菌注射溶液、滅菌粉末などの形態であってもよい。製剤化に適した担体、賦形剤及び希釈剤の例としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、でん粉、アカシアゴム、アルギン酸塩、ゼラチン、カルシウムホスフェート、カルシウムシリケート、セルロース、メチルセルロース、微晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、ステアリン酸マグネシウムまたは鉱物油などが用いられてもよい。また、充填剤、抗凝集剤、潤滑剤、湿潤剤、香料、乳化剤、防腐剤などをさらに含んでもよい。
本発明のタンパク質結合体の実際の投与量は、治療疾患、投与経路、患者の年齢、性別及び体重、及び疾患の重症度などの様々な関連因子と一緒に、活性成分である生理活性ポリペプチドの種類に応じて決定される。本発明のタンパク質結合体は、血中持続性と生体内の力価が非常に優れるため、本発明のタンパク質結合体を含むペプチド製剤の投与量、投与回数及び頻度を著しく減少させうる。
もう一つの様態として、本発明は、前記製造方法で製造されたタンパク質結合体を９０％以上で含むタンパク質結合体の集合体を提供する。
本発明で使用される用語、「結合体の集合体」、「集合体」は、混用されて用いることができ、Ｆｃ領域のＮ末端に非ペプチド性重合体が連結されたタンパク質結合体及び/またはＦｃ領域のＮ末端ではなく他の部位に非ペプチド性重合体が連結されたタンパク質結合体を含むタンパク質結合体群を意味する。
前記集合体は、Ｆｃ領域のＮ末端に非ペプチド性重合体が連結されたタンパク質結合体のみを含んでもよく、Ｆｃ領域のＮ末端ではなく他の部位に非ペプチド性重合体が連結されたタンパク質結合体を一緒に含んでもよい。具体的に、前記集合体に含まれるＦｃ領域のＮ末端ではない領域に非ペプチド性重合体が連結されたタンパク質結合体の割合は、９０％以上であってもよく、より具体的には、９５％以上、さらに具体的には、９８％以上、よりさらに具体的には、９９％以上であってもよいが、これに限定されない。前記「９０％以上」とは、ｖ/ｖ、ｗ/ｗ、ピーク/ピークなどを意味することができ、特定単位に制限されるものではない。
本発明の目的上、前記集合体は、本発明の製造方法を通じて製造したタンパク質結合体から不純物、未反応物質などを除去して、Ｆｃ領域のＮ末端に非ペプチド性重合体が結合したタンパク質結合体の比率を高めた集合体を意味しうる。また、９０％以上のＮ末端選択性を有する結合体の製造方法により製造された集合体であってもよいが、これに制限されない。本発明の方法によって効率的に精製されうる。
（実施例）
以下、実施例を通じて本発明をさらに詳細に説明する。これらの実施例は、ひたすら本発明をより具体的に説明するためのもので、本発明の範囲がこれらの実施例により制限されるものではない。
実施例1：インターフェロンアルファ（ＩＦＮα）‐ＰＥＧ‐免疫グロブリンＦｃのＮ末端領域の結合体の製造
１－１．ＩＦＮα-ＰＥＧ連結体の製造
両末端にアルデヒド反応基を有する分子量３．４ｋＤａのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）であるＡＬＤ‐ＰＥＧ‐ＡＬＤ（ＩＤＢ、韓国）をヒトインターフェロンアルファ-２ｂ（ｈＩＦＮα-２ｂ、分子量１９ｋＤａ）が５ｍｇ/ｍｌ濃度で溶解された１００ｍＭリン酸緩衝溶液にｈＩＦＮα：ＰＥＧのモル比がそれぞれ１：５～１：１０になるように添加した。ここで、還元剤であるシアノ水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＣＮＢＨ3、Ｓｉｇｍａ）を最終濃度２０ｍＭになるように添加し、４～８℃でゆっくり攪拌しながら約１時間反応させた。インターフェロンアルファのアミノ末端部位に選択的にＰＥＧが連結され、ＰＥＧとインターフェロンアルファが１：１の比率で互いに連結された連結体を得るために、前記反応混合物はＳＰ ＨＰ（GE healthcare、米国）陰イオン交換クロマトグラフィーを行い、高純度でＩＦＮα-ＰＥＧ連結体を精製した。
１－２．ＩＦＮα-ＰＥＧ-Ｆｃ結合体の製造
実施例１－１で精製したＩＦＮα-ＰＥＧ連結体を免疫グロブリンＦｃのＮ末端のプロリン残基に連結させるために、前記免疫グロブリンＦｃ断片をＩＦＮα-ＰＥＧ連結体：免疫グロブリンＦｃのモル比が１：１～１：４になるように添加して反応させた。反応液を１００ｍＭリン酸緩衝溶液（ｐＨ５.５～６．５）で作り、還元剤としてシアノ水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＣＮＢＨ3、Ｓｉｇｍａ）を最終濃度が２０～５０ｍＭになるように添加した。前記反応は４～８℃で約１２～１６時間、ゆっくり攪拌しながら行った。
１－３．ＩＦＮα-ＰＥＧ-Ｆｃ結合体の分離及び精製
実施例１－２の結合反応後、未反応物質及び副産物を除去し、生成されたＩＦＮα-ＰＥＧ-Ｆｃタンパク質結合体を精製するために、反応混合物を１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）に緩衝液交換した後、Ｓｏｕｒｃｅ Ｑ（GE healthcare、米国）陰イオン交換クロマトグラフィーカラムに通過させて未反応Ｆｃを除去し、ＩＦＮα-ＰＥＧ-Ｆｃタンパク質結合体の分画を得た。具体的には、反応液を１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）で平衡化させたＳｏｕｒｃｅ Ｑカラムに適用し、５０ｍＭ塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）を含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）緩衝溶液を使用して等溶媒洗浄により不純物を削除した。その後、１５０ｍＭ塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）を含む緩衝溶液の濃度勾配で、ＩＦＮα-ＰＥＧ-Ｆｃタンパク質結合体を溶出した。得られたＩＦＮα-ＰＥＧ-Ｆｃタンパク質結合体の画分には、不純物として少量の未反応Ｆｃ及びインターフェロンアルファのダイマーが存在した。前記不純物を除去するためにＳｏｕｒｃｅ ｉｓｏ（GE healthcare、米国）疎水性クロマトグラフィーをさらに行った。具体的には、Ｓｏｕｒｃｅ ｉｓｏ（GE healthcare、米国）を約１．３Ｍの硫酸アンモニウムを含む２０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ６．０）緩衝溶液で平衡化させた後、精製されたＩＦＮα-ＰＥＧ-Ｆｃタンパク質結合体の分画を適用した。最終的に、２０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ６．０）緩衝溶液を用いた直線濃度勾配の方法で高純度のＩＦＮα-ＰＥＧ-Ｆｃタンパク質結合体を精製した。製造されたＩＦＮα-ＰＥＧ-Ｆｃタンパク質結合体のＦｃ領域のＮ末端選択性は、ペプチドマッピング分析法で確認し、選択性は９０％以上であった。
実施例２：ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）‐ＰＥＧ‐Ｆｃ結合体の製造
２－１．ｈＧＨ‐ＰＥＧ連結体の製造
両末端にアルデヒド反応基を有する分子量３．４ｋＤａのポリエチレングリコールであるＡＬＤ‐ＰＥＧ‐ＡＬＤ（ＩＤＢ、韓国）をヒト成長ホルモン（ｈＧＨ、分子量２２ｋＤａ）が５ｍｇ/ｍｌ濃度で溶解された１００ｍＭリン酸緩衝溶液にｈＧＨ：ＰＥＧのモル比がそれぞれ１：５～１：１０になるように添加した。ここで、還元剤であるシアノ水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＣＮＢＨ3、Ｓｉｇｍａ）を最終濃度２０ｍＭになるように添加し、４～８℃でゆっくり攪拌しながら約１時間反応させた。ヒト成長ホルモンのアミノ末端部位に選択的にＰＥＧが連結され、ＰＥＧとｈＧＨが１：１の比率で互いに連結された連結体を得るために、前記反応混合物はＳｏｕｒｃｅ Ｑ（GE healthcare、米国）陰イオン交換クロマトグラフィーを行い、高純度のｈＧＨ-ＰＥＧを精製した。
２－２．ｈＧＨ-ＰＥＧ-Ｆｃ結合体の製造
実施例２－１で精製したｈＧＨ-ＰＥＧ連結体を免疫グロブリンＦｃのＮ末端に連結させるために、前記免疫グロブリンＦｃ断片をｈＧＨ-ＰＥＧ連結体：免疫グロブリンＦｃのモル比が１：１～１：４になるように添加して反応させた。反応液を１００ｍＭリン酸緩衝溶液（ｐＨ５．５～６．５）で作り、還元剤としてシアノ水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＣＮＢＨ3、Ｓｉｇｍａ）を最終濃度２０ｍＭになるように添加した。前記反応は、４～８℃でゆっくり攪拌しながら行った。
２－３．ｈＧＨ-ＰＥＧ-Ｆｃ結合体の分離及び精製
実施例２－２の結合反応後、未反応物質及び副産物を除去し、生成されたｈＧＨ-ＰＥＧ-Ｆｃタンパク質結合体を精製するために、反応混合物を１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）に緩衝液交換した後、Ｓｏｕｒｃｅ Ｑ（GE healthcare、米国）陰イオン交換クロマトグラフィーカラムに通過させて未反応Ｆｃを除去し、ｈＧＨ-ＰＥＧ-Ｆｃタンパク質結合体の分画を得た。具体的には、反応液を１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）で平衡化させたＳｏｕｒｃｅ Ｑカラムに適用し、７０ｍＭ塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）を含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）緩衝溶液を用いて等溶媒洗浄により不純物を除去した。その後、１５０ｍＭ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）緩衝溶液の濃度勾配で、高純度のｈＧＨ-ＰＥＧ-Ｆｃタンパク質結合体を溶出した。製造されたｈＧＨ-ＰＥＧ-Ｆｃタンパク質結合体のＦｃ領域のＮ末端選択性は、ペプチドマッピング分析法で確認し、選択性は９０％以上であった。
実施例３：ヒト顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ‐ＣＳＦ）‐ＰＥＧ‐Ｆｃ結合体の製造
天然型Ｇ‐ＣＳＦの１７番目及び６５番目のアミノ酸がセリンに置換された誘導体（17、65Ｓ‐Ｇ‐ＣＳＦ）を用いて、17、65Ｓ‐Ｇ‐ＣＳＦ-ＰＥＧ-Ｆｃタンパク質結合体を製造及び精製した。
３－１． 17、65 Ｓ‐Ｇ‐ＣＳＦ-ＰＥＧ連結体の製造
両末端にアルデヒド反応基を有する分子量３．４ｋＤａのポリエチレングリコールであるＡＬＤ‐ＰＥＧ‐ＡＬＤ（ＩＤＢ、韓国）を17、65Ｓ‐Ｇ‐ＣＳＦ（分子量１８ｋＤａ）が５ｍｇ/ｍｌ濃度で溶解された１００ｍＭリン酸緩衝溶液にＧ‐ＣＳＦ：ＰＥＧのモル比がそれぞれ１：５～１：１０になるように添加した。ここで、還元剤であるシアノ水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＣＮＢＨ3、Ｓｉｇｍａ）を最終濃度２０ｍＭになるように添加し、４～８℃でゆっくり攪拌しながら約１時間反応させた。ヒト顆粒球コロニー刺激因子のアミノ末端部位に選択的にＰＥＧが連結され、ＰＥＧとＧ‐ＣＳＦが１：１の比率で互いに連結された連結体を得るために、前記反応混合物はＳＰ ＨＰ（GE healthcare、米国）陽イオン交換クロマトグラフィーを行い、高純度で17、65Ｓ‐Ｇ‐ＣＳＦ-ＰＥＧ連結体を精製した。
３－２． 17、65 Ｓ‐Ｇ‐ＣＳＦ-ＰＥＧ-Ｆｃ結合体の製造
実施例３－１で精製した17、65Ｓ‐Ｇ‐ＣＳＦ-ＰＥＧ連結体を免疫グロブリンＦｃのＮ末端に連結させるために、前記免疫グロブリンＦｃ断片を17、65Ｓ‐Ｇ‐ＣＳＦ-ＰＥＧ連結体：免疫グロブリンＦｃのモル比が１：１～１：４になるように添加して反応させた。反応液を１００ｍＭリン酸緩衝溶液（ｐＨ５．５～６．５）で作り、還元剤としてシアノ水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＣＮＢＨ3、Ｓｉｇｍａ）を最終濃度２０ｍＭになるように添加した。前記反応は、４～８℃でゆっくり攪拌しながら行った。
３－３． 17、65 Ｓ‐Ｇ‐ＣＳＦ-ＰＥＧ-Ｆｃ結合体の分離及び精製
実施例３－２の結合反応後、未反応物質及び副産物を除去し、生成された17、65Ｓ‐Ｇ‐ＣＳＦ-ＰＥＧ-Ｆｃタンパク質結合体を精製するために、反応混合物を２Ｍ ＮａＣｌが含まれた１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）で平衡化させたＳｏｕｒｃｅ ｐｈｅｎｙｌカラムを通過させた。不純物を除去するために、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）緩衝溶液の濃度勾配で17、65Ｓ‐Ｇ‐ＣＳＦ-ＰＥＧ-Ｆｃタンパク質結合体を精製した。得られた17、65Ｓ‐Ｇ‐ＣＳＦ-ＰＥＧ-Ｆｃタンパク質結合体の画分には、不純物として少量の未反応免疫グロブリンＦｃ及び17、65Ｓ‐Ｇ‐ＣＳＦダイマーが存在した。前記不純物除去するためにＱ ＨＰ（GE healthcare 、米国）陰イオンクロマトグラフィーをさらに行った。 Ｑ ＨＰ（GE healthcare、米国）を２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）緩衝溶液で平衡化させた後、精製された17、65Ｓ‐Ｇ‐ＣＳＦ-ＰＥＧ-Ｆｃタンパク質結合体の分画をそれに適用した。最終的に、１Ｍ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）緩衝溶液を用いた直線濃度勾配の方法で高純度の17、65Ｓ‐Ｇ‐ＣＳＦ-ＰＥＧ-Ｆｃタンパク質結合体を精製した。製造された17、65Ｓ‐Ｇ‐ＣＳＦ-ＰＥＧ-Ｆｃタンパク質結合体のＦｃ領域のＮ末端選択性は、ペプチドマッピング分析法で確認し、選択性は９０％以上であった。
実施例４：ヒト赤血球生成因子（ＥＰＯ）‐ＰＥＧ‐Ｆｃ結合体の製造
４－１．ヒト赤血球生成因子（ＥＰＯ）‐ＰＥＧ連結体の製造
両末端にアルデヒド反応基を有する分子量３．４ｋＤａのポリエチレングリコールであるＡＬＤ‐ＰＥＧ‐ＡＬＤ（ＩＤＢ、韓国）をヒト赤血球生成因子（ＥＰＯ、分子量３０．６ｋＤａ）が５ｍｇ/ｍｌ濃度で溶解された１００ｍＭリン酸緩衝溶液にＥＰＯ：ＰＥＧのモル比が１：１５になるように添加した。ここで、還元剤であるシアノ水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＣＮＢＨ3、Ｓｉｇｍａ）を最終濃度２０ｍＭになるように添加し、４～８℃でゆっくり攪拌しながら約２時間反応させた。ヒト赤血球生成因子のアミノ末端部位に選択的にＰＥＧが連結され、ＰＥＧとヒト赤血球生成因子が１：１の比率で互いに連結された連結体を得るために、前記反応混合物はＳＰ ＨＰ（GE healthcare、米国）陽イオン交換クロマトグラフィーを行い、ＥＰＯ-ＰＥＧを含むメイン画分を精製した。
４－２．ＥＰＯ‐ＰＥＧ‐Ｆｃ結合体の製造
実施例４－１で精製したＥＰＯ-ＰＥＧ連結体を免疫グロブリンＦｃのＮ末端に連結させるために、前記免疫グロブリンＦｃ断片をＥＰＯ-ＰＥＧ連結体：Ｆｃのモル比が１：４になるように添加して反応させた。反応液を１００ｍＭリン酸緩衝溶液（ｐＨ５．５～６．５）で作り、還元剤としてシアノ水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＣＮＢＨ3、Ｓｉｇｍａ）を最終濃度が２０ｍＭになるように添加した。前記反応は、４～８℃でゆっくり攪拌しながら約１２～１６時間行った。
４－３．ＥＰＯ‐ＰＥＧ Ｆｃ結合体の分離及び精製
実施例４－２の結合反応後、未反応物質及び副産物を除去し、生成されたＥＰＯ-ＰＥＧ-Ｆｃタンパク質結合体を精製するために、反応混合物をＳｏｕｒｃｅ Ｑ（GE healthcare、米国）陰イオン交換クロマトグラフィーカラムに通過させて未反応Ｆｃを除去し、ＥＰＯ-ＰＥＧ-Ｆｃタンパク質結合体の分画を得た。 Ｓｏｕｒｃｅ Ｑ精製は、反応液を２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）緩衝液で平衡化させたＳｏｕｒｃｅ Ｑカラムに適用し、１Ｍ塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）を含む緩衝溶液の濃度勾配でＥＰＯ-ＰＥＧ-Ｆｃタンパク質結合体を精製した。得られたＥＰＯ-ＰＥＧ-Ｆｃタンパク質結合体の画分には、不純物として少量の未反応Ｆｃ及びＥＰＯダイマーが存在した。前記不純物を除去するためにＳｏｕｒｃｅ ｉｓｏ（GE healthcare、米国）疎水性クロマトグラフィーをさらに行った。具体的には、Ｓｏｕｒｃｅ ｉｓｏ（GE healthcare、米国）を１．６Ｍ硫酸アンモニウムを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）緩衝溶液で平衡化させた後、精製されたＥＰＯ-ＰＥＧ-Ｆｃタンパク質結合体の分画を適用した。最終的に、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）緩衝溶液を用いた直線濃度勾配の方法で高純度のＥＰＯ-ＰＥＧ-Ｆｃタンパク質結合体を精製した。製造されたＥＰＯ-ＰＥＧ-Ｆｃタンパク質結合体のＦｃ領域のＮ末端選択性は、ペプチドマッピング分析法で確認し、選択性は９０％以上であった。
実施例５：ヒトインスリン‐ＰＥＧ-Ｆｃ結合体の製造
５－１．インスリン‐ＰＥＧ連結体の製造
インスリン粉末を１０ｍＭ ＨＣｌ溶液に溶解させた後、３．４Ｋ Ｐｒｏｔｉｏｎ-ＡＬＤ2 ＰＥＧ（プロピオンアルデヒド基を二つ有するＰＥＧ、ＩＤＢ、韓国）をインスリンベータ鎖のＮ末端にＰＥＧ化（PEGylation）させるために、インスリン：ＰＥＧのモル比を１：２とし、インスリン濃度を５ｍｇ/ｍｌとして４℃～室温で約２時間反応させた。この反応は５０ｍＭクエン酸ナトリウムｐＨ６．０、４５％イソプロパノールで行われ、２～２０ｍＭのシアノ水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＣＮＢＨ3、Ｓｉｇｍａ）を添加して反応させた。反応液は、クエン酸ナトリウム（ｐＨ３．０）及び４５％ＥｔＯＨを含む緩衝液とＫＣｌ濃度勾配を用いたＳＰ ＨＰ（GE Healthcare）カラムを用いて精製した。
５－２．インスリン‐ＰＥＧ‐Ｆｃ結合体の製造
インスリン‐ＰＥＧ‐Ｆｃ結合体を製造するために、実施例５－１で製造されたモノＰＥＧ化されたインスリンとＦｃはモル比が約１：１になるようにして、全体のタンパク質濃度を、２０ｍｇ/ｍｌ～５０ｍｇ/ｍｌにして、２０℃～２５℃で約１５時間～１７時間反応させた。この時、反応液は、１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ、２２ｍＭリン酸カリウム及び１０％エタノール、ｐＨ７．５～８．５であり、還元剤である２０ｍＭシアノ水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＣＮＢＨ3、Ｓｉｇｍａ）を添加した。
５-３．インスリン‐ＰＥＧ‐Ｆｃ結合体の分離及び精製
反応が終結した後、反応液をＳｏｕｒｃｅ Ｑ（GE Healthcare）カラムに通過させてＴｒｉｓ-ＨＣｌ（ｐＨ７．５）緩衝液とＮａＣｌ濃度勾配を用いて、未反応インスリン、未反応免疫グロブリンＦｃ断片、インスリン‐ＰＥＧ‐Ｆｃ結合体、及びモノＰＥＧ化されたインスリンが二つ以上結合した結合体を分離及び精製した。この時、インスリン‐ＰＥＧ‐免疫グロブリンＦｃ断片結合体の製造比率は、精製クロマトグラフィーの２８０ｎｍでのＵＶ吸光度を観察して決定した。
その後、Ｓｏｕｒｃｅ ｉｓｏ（GE Healthcare）を２次カラムとして用いて、残留した免疫グロブリンＦｃ及びマルチＰＥＧ化されたインスリン結合体を除去した。
この場合、溶出はＴｒｉｓ-ＨＣｌ（ｐＨ７．５）が含まれた硫酸アンモニウムの濃度勾配を用いて行い、高純度のインスリン‐ＰＥＧ‐Ｆｃ結合体を精製した。製造されたインスリン‐ＰＥＧ‐Ｆｃ結合体のＦｃ領域のＮ末端選択性は、ペプチドマッピング分析法で確認し、選択性は９０％以上であった。
実施例６：エキセンジン４誘導体（ＣＡ‐エクセンジン４）‐ＰＥＧ‐Ｆｃ結合体の製造
６－１．ＣＡ‐エキセンジン４連結体の製造
インスリン粉末を１０ｍＭ ＨＣｌに溶解させた後、３．４Ｋ Ｐｒｏｐｉｏｎ-ＡＬＤ2 ＰＥＧ（プロピオンアルデヒド基を二つ有するＰＥＧ、ＩＤＢ、韓国）をＣＡ‐エキセンジン４のリジン位置にＰＥＧ化させるために、ＣＡ‐エキセンジン４ ：ＰＥＧのモル比を１：５～１：１５とし、ＣＡ‐エキセンジン４濃度を６～１２ｍｇ/ｍｌとして４～８℃から常温で約４～１２時間反応させた。この反応は０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５～８．５、４５％イソプロパノールで行われ、２～２０ｍＭのシアノ水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＣＮＢＨ3、Ｓｉｇｍａ）を添加して反応させた。反応液は、クエン酸ナトリウム（ｐＨ２．０）及び４５％ＥｔＯＨを含む緩衝液とＫＣｌ濃度勾配を用いたＳｏｕｒｃｅ Ｓ（GE Healthcare）カラムを用いて精製した。
６－２．ＣＡ-エキセンジン４‐ＰＥＧ‐Ｆｃ結合体の製造
ＣＡ-エキセンジン４‐ＰＥＧ‐Ｆｃ結合体を製造するために、実施例６－１で製造されたモノＰＥＧ化されたＣＡ‐エキセンジン４にＦｃを添加して、全体のタンパク質濃度を１０～５０ｍｇ/ｍｌにして、４℃～８℃で約１２時間～１７時間反応させた。この時、反応液は、０．１Ｍリン酸カリウム、ｐＨ５．５～８．５であり、還元剤である２０ｍＭシアノ水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＣＮＢＨ3、Ｓｉｇｍａ）を添加した。
６－３．ＣＡ-エキセンジン４‐ＰＥＧ‐Ｆｃ結合体の分離及び精製
反応が終結した後、反応液をＳｏｕｒｃｅ ｐｈｅｎｙｌ（GE Healthcare）カラムに通過させてＴｒｉｓ‐ＨＣｌ（ｐＨ７．５）緩衝液とＮａＣｌ濃度勾配を用いて、未反応免疫グロブリンＦｃ断片を分離及び精製した。この時、ＣＡ‐エキセンジン４‐ＰＥＧ‐免疫グロブリンＦｃ断片結合体の製造比率は、精製クロマトグラフィーの２８０ｎｍでのＵＶ吸光度を観察して決定した。
その後、Ｓｏｕｒｃｅ Ｑ（GE Healthcare）を２次カラムとして用いて、残留した免疫グロブリンＦｃ及びマルチＰＥＧ化されたＣＡ‐エキセンジン４結合体を除去した。この場合、溶出はＴｒｉｓ‐ＨＣｌ（ｐＨ７．５）が含まれたＮａＣｌの濃度勾配を用いて行い、高純度のＣＡ‐エキセンジン４‐ＰＥＧ‐Ｆｃ結合体を精製した。製造されたＣＡ‐エキセンジン４‐ＰＥＧ‐Ｆｃ結合体のＦｃ領域のＮ末端選択性は、ペプチドマッピング分析法で確認し、選択性は９０％以上であった。
実施例７：反応基の種類が異なるＰＥＧを用いたタンパク質結合体の製造
７－１． 17、65 Ｓ‐Ｇ‐ＣＳＦ‐ＰＥＧ連結体の製造
両端にスクシンイミジルα-メチルブタノエート（ＳＭＢ）反応基を有する分子量３．４ｋＤａのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）であるＳＭＢ‐ＰＥＧ‐ＳＭＢ（Nektar、米国）を17、65Ｓ‐Ｇ‐ＣＳＦ（分子量１８ｋＤａ）が１０ｍｇ/ｍｌ濃度で溶解された２０ｍＭリン酸緩衝溶液（ｐＨ８．０）にＧ‐ＣＳＦ：ＰＥＧのモル比が１：３になるように添加し、常温でゆっくり攪拌しながら３０分間反応させた。17、65Ｓ‐Ｇ‐ＣＳＦのアミノ末端に選択的にＰＥＧが連結され、ＰＥＧと17、65Ｓ‐Ｇ‐ＣＳＦが１：１の比率で互いに連結された連結体を得るために、前記反応混合物をＳＰ ＨＰ（GE Healthcare 、米国）陽イオン交換クロマトグラフィーに適用させた。
７－２． 17、65 Ｓ‐Ｇ‐ＣＳＦ‐ＰＥＧ‐Ｆｃ結合体の製造
実施例７－１で精製された17、65Ｓ‐Ｇ‐ＣＳＦ‐ＰＥＧ連結体に免疫グロブリンＦｃのＮ末端以外の領域を連結させるために、前記免疫グロブリンＦｃ断片を17、65Ｓ‐Ｇ‐ＣＳＦ‐ＰＥＧ連結体：免疫グロブリンＦｃのモル比が１：４～１：８になるように添加して反応させた。前記反応は、ゆっくり攪拌しながら、常温で約２時間、２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．５～６．５）で行った。
７－３． 17、65 Ｓ‐Ｇ‐ＣＳＦ‐ＰＥＧ‐Ｆｃ結合体の分離及び精製
実施例７－２の結合反応後、未反応物質及び副産物を除去し、生成された17、65Ｓ‐Ｇ‐ＣＳＦ‐ＰＥＧ‐Ｆｃタンパク質結合体を精製するために、反応混合物をＱ ＨＰ（GE Healthcare、米国）陰イオン交換クロマトグラフィーカラムに通過させて未反応Ｆｃを除去し、17、65Ｓ‐Ｇ‐ＣＳＦ‐ＰＥＧ‐Ｆｃタンパク質結合体の分画を得た。Ｑ ＨＰ精製は、反応液を２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）緩衝液で平衡化させたＱ ＨＰカラムに適用し、１Ｍ塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）を含む緩衝溶液の濃度勾配で17、65Ｓ‐Ｇ‐ＣＳＦ‐ＰＥＧ‐Ｆｃタンパク質結合体を精製した。得られた17、65Ｓ‐Ｇ‐ＣＳＦ‐ＰＥＧ‐Ｆｃタンパク質結合体画分には、不純物として少量の未反応Ｆｃ及び17、65Ｓ‐Ｇ‐ＣＳＦダイマーが存在した。前記不純物を除去するためにＳｏｕｒｃｅ ｉｓｏ（GE Healthcare、米国）疎水性クロマトグラフィーをさらに行った。Ｓｏｕｒｃｅ ｉｓｏ（GE Healthcare、米国）を１．２Ｍ硫酸アンモニウムを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）緩衝溶液を用いた直線濃度勾配の方法で高純度の17、65Ｓ‐Ｇ‐ＣＳＦ‐ＰＥＧ‐Ｆｃタンパク質結合体を精製した。製造された17、65Ｓ‐Ｇ‐ＣＳＦ‐ＰＥＧ‐Ｆｃタンパク質結合体のＦｃ領域のＮ末端選択性は、ペプチドマッピング分析法で確認し、選択性は９０％以上であった。
実施例８：反応基の種類が異なるＰＥＧを用いたタンパク質結合体の製造
本発明者は、既出願した（特許文献３）ＦａｃＶＩＩの誘導体であるＦａｃＶＩＩ‐ＡＴＫＡＶＣを用いてＦａｃＶＩＩ‐ＡＴＫＡＶＣ‐ＰＥＧ‐Ｆｃ結合体を製造した。
８－１．ＰＥＧ‐Ｆｃ結合体の分離及び精製
まず、マレイミド‐１０ｋＤａ‐ＰＥＧ‐アルデヒド（NOF、日本）のアルデヒド反応基を免疫グロブリンＦｃ断片のＮ末端に連結するために、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．５～６．５）の条件下で、前記免疫グロブリンＦｃ領域とマレイミド‐１０ｋＤａ ＰＥＧ‐アルデヒドを１：１のモル比で混合し、タンパク質濃度１０ｍｇ/ｍｌの条件下で還元剤である２０ｍＭシアノ水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＣＮＢＨ3、Ｓｉｇｍａ）を添加した。前記反応は、低温（４～８℃）で約２時間反応させた。モノＰＥＧ化された免疫グロブリンＦｃ断片（マレイミド‐１０ｋＤａ ＰＥＧ‐Ｆｃ）を得るために、Ｓｏｕｒｃｅ Ｑ（GE Healthcare、米国）陰イオンクロマトグラフィーを用い、溶出は、２０ｍＭトリス緩衝液ｐＨ７．５で塩化ナトリウムの濃度勾配で行った。
８－２．ＦａｃＶＩＩ‐ＡＴＫＡＶＣ‐ＰＥＧ‐Ｆｃ結合体の製造
ＦａｃＶＩＩ‐ＡＴＫＡＶＣは１０ｍＭグリシルグリシン緩衝液、ｐＨ５．５の条件で還元剤である０．５～２ｍＭトリフェニルホスフィン‐３,３’,３’’トリスルホン酸トリナトリウム塩水和物を加え、室温で約２時間反応させてＣ末端を還元させた。Ｃ末端が還元されたＦａｃＶＩＩ‐ＡＴＫＡＶＣとモノＰＥＧ化された免疫グロブリンＦｃ断片（マレイミド‐１０ｋＤａ ＰＥＧ‐Ｆｃ）を１：４～１：２０のモル比で混合して、総タンパク質濃度１～２ｍｇ/ｍｌで５０ｍＭトリス緩衝液、ｐＨ７．５の条件下で、約２時間、室温で反応させた。
８－３．ＦａｃＶＩＩ‐ＡＴＫＡＶＣ‐ＰＥＧ‐Ｆｃ結合体の分離及び精製
実施例８－２の反応液は、Ｓｏｕｒｃｅ Ｑ陰イオンクロマトグラフィーを行い、緩衝液２０ｍＭトリス緩衝液、ｐＨ７．５で塩化ナトリウムの濃度勾配でＦａｃＶＩＩ‐ＡＴＫＡＶＣ‐１０ｋ ＰＥＧ‐Ｆｃ結合体を溶出した。ＦａｃＶＩＩ‐ＡＴＫＡＶＣ‐ＰＥＧ‐Ｆｃ結合体のＦａｃＶＩＩを活性化させるために、反応は、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ‐ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ８．０でＦａｃＶＩＩの約４ｍｇ/ｍｌの条件下で約１８時間、低温（４～８℃）で行った。最終的に、１０ｍＭグリシルグリシン緩衝液、ｐＨ５．５でスーパーデックス２００を用いてサイズ排除クロマトグラフィー（GE Healthcare、米国）により高純度のＦａｃＶＩＩa‐ＡＴＫＡＶＣ‐ＰＥＧ‐Ｆｃを精製した。製造されたＦａｃＶＩＩa‐ＡＴＫＡＶＣ‐ＰＥＧ‐Ｆｃタンパク質結合体のＦｃ領域のＮ末端選択性は、ペプチドマッピング分析法で確認し、選択性は９０％以上であった。
実施例９：分子量が異なるＰＥＧを用いたタンパク質結合体の製造
両末端にアルデヒド反応基を有する分子量が１０ｋＤａのポリエチレングリコールであるＡＬＤ‐ＰＥＧ‐ＡＬＤ（Nektar、米国）を用いて、実施例５－２と同様の方法でインスリン‐１０Ｋ ＰＥＧ連結体を製造及び精製した。精製されたインスリン‐１０Ｋ ＰＥＧ連結体を約５ｍｇ/ｍｌの濃度になるように濃縮した後、実施例５－３と同様の方法でインスリン‐１０Ｋ ＰＥＧ‐Ｆｃタンパク質結合体を製造及び精製した。
実施例１０：Ｆａｂ'‐Ｓ‐ＰＥＧ‐Ｎ‐Ｆｃ結合体の製造（‐ＳＨ基）
１０－１．Ｆａｂ’の発現及び精製
抗腫瘍壊死因子‐アルファＦａｂ’を発現する大腸菌形質転換体であるＢＬ２１/ｐｏＤＬＨＦ（寄託番号：ＫＣＣＭ １０５１１）をＬＢ培地１００ｍｌに接種して一晩振とう培養した後、５Ｌの発酵器（Marubishi）に接種し、温度３０℃、空気投入量２０ｖｖｍ、攪拌速度５００ｒｐｍの条件下で培養した。発酵が進むにつれて、微生物の成長のために不足しているエネルギー源はブドウ糖と酵母抽出液を微生物の発酵状態に応じて投与し、吸光度６００ｎｍでＯＤ値が８０になる時期にＩＰＴＧを投与してタンパク質の発現を誘導した。これは約４０～４５時間培養して吸光度６００ｎｍでＯＤ値が１２０～１４０になるように高濃度で培養した。得られた発酵液を遠心分離（２０，０００ｇ、３０分）して沈殿物は捨てて、上清液のみを取った。
得られた上清液から、次のような手順でカラムクロマトグラフィーを経て抗腫瘍壊死因子‐アルファＦａｂ’を純粋に精製した。２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化させたＨｉＴｒａｐタンパク質Ｇ（Ge Healthcare、米国）カラムに前記上清液を滴下した後、１００ｍＭグリシン（ｐＨ３．０）緩衝液で溶出した。溶出されたＦａｂ’画分を１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ＰＢＳ、ｐＨ７．３）で平衡化させたスーパーデックス２００（GE Healthcare、米国）カラムに適下し、同様の緩衝液で溶出した。溶出されたＦａｂ’画分をｐｏｌｙＣＡＴ ２１×２５０（PolyLC Inc.、米国）カラムを用いて最終的精製したが、１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）を直線濃度勾配（塩化ナトリウム濃度０．１５Ｍ ‐> ０．４Ｍ）の方法で流して、純粋な抗腫瘍壊死因子‐アルファＦａｂ’画分を得た。
１０－２．Ｆｃ‐ＰＥＧ連結体の製造及び精製
免疫グロブリンＦｃを１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５～６．５）に５ｍｇ/ｍｌの濃度で溶解させ、ここにＮＨＳ‐ＰＥＧ‐ＭＡＬを除去した。緩衝液交換後反応物をｐｏｌｙＣＡＴ（PolyLC Inc.、米国）カラムに適用し、２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）を直線濃度勾配（塩化ナトリウム濃度０．１５Ｍ ‐> ０．５Ｍ ）の方法で流し、免疫グロブリンＦｃ‐ＰＥＧ連結体まず溶出して、後に反応しない免疫グロブリンＦｃが 溶出されて分離除去した。
１０－３．Ｆａｂ'‐Ｓ‐ＰＥＧ‐Ｎ‐Ｆｃ結合体（‐ＳＨ基）の製造及び精製
前記実施例１０－１で精製されたＦａｂ’を１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．３）に２ｍｇ/ｍｌで溶解させた後、同様の緩衝液に実施例１０－２で用意された免疫グロブリンＦｃ‐ＰＥＧ連結体をＦａｂ’：連結体のモル比が１：５になるように入れた。最終タンパク質濃度が５０ｍｇ/ｍｌになるように濃縮し、４～８℃でゆっくり攪拌しながら約２４時間反応させた。
カップリング反応終了後、反応液を１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．３）で平衡化させたスーパーデックス２００（GE Healthcare、米国）カラムに適下し、同様の緩衝液を１ｍｌ/分の流速で流して、溶出させた。カップリングされたＦａｂ'‐Ｓ‐ＰＥＧ‐Ｎ‐Ｆｃ結合体は、分子量が大きくてまず溶出され、その後に反応しない免疫グロブリンＦｃ‐ＰＥＧ連結体及びＦａｂ’が 溶出されて分離除去した。
完全に削除されてない未反応免疫グロブリンＦｃを除去するために、溶出されたＦａｂ'‐Ｓ‐ＰＥＧ‐Ｎ‐Ｆｃ結合体分画を再びｐｏｌｙＣＡＴ ２１×２５０（PolyLC Inc.、米国）カラムに適下、２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）を直線濃度勾配（塩化ナトリウム濃度０．１５Ｍ ‐> ０．５Ｍ）の方法で流して、純粋なＦａｂ'‐Ｓ‐ＰＥＧ‐Ｎ‐Ｆｃ結合体（Ｆｃ‐ＰＥＧ連結体Ｆａｂ’のＣ末端付近の‐ＳＨ期に連結される）を得た。
実施例１１：Ｆａｂ'‐Ｎ‐ＰＥＧ‐Ｎ‐Ｆｃ結合体の製造（Ｎ末端）
１１－１．Ｆａｂ'‐ＰＥＧ連結体（Ｎ末端）の製造及び精製
実施例１０－１で得られた精製されたＦａｂ’、４０ｍｇを１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５～６．５）に５ｍｇ/ｍｌで溶解させた後、ＢｕｔｙｌＡＬＤ‐ＰＥＧ‐ＢｕｔｙｌＡＬＤ（分子量３．４ｋＤａ、Nektar Inc.、米国）をＦａｂ’：ＰＥＧのモル比が１：５になるように添加した。還元剤としてシアノ水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＣＮＢＨ3、Ｓｉｇｍａ）を最終濃度が２０ｍＭになるように添加した。前記反応は４～８℃でゆっくり攪拌しながら約２時間行った。
反応終了後、反応緩衝液を２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）に交換した。緩衝液交換後反応物をｐｏｌｙＣＡＴ（PolyLC Inc.、米国）カラムに適用し、２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）を直線濃度勾配（塩化ナトリウム濃度０．１５Ｍ ‐> ０．４Ｍ ）の方法で流して、Ｆａｂ'‐ＰＥＧ連結体分画を先に溶出し、その後に反応しないＦａｂ’が溶出されて分離除去した。
１１－２．Ｆａｂ’‐Ｎ‐ＰＥＧ‐Ｎ‐Ｆｃ結合体の製造及び精製
実施例１１－１で精製されたＦａｂ'‐ＰＥＧ連結体を１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）に１０ｍｇ/ｍｌで溶解させた後、同様の緩衝液に溶解された免疫グロブリンＦｃをＦａｂ’‐ＰＥＧ連結体：Ｆｃのモル比が１：５になるように入れた。最終タンパク質濃度が５０ｍｇ/ｍｌになるように濃縮し、還元剤としてシアノ水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＣＮＢＨ3、Ｓｉｇｍａ）を最終濃度が２０ｍＭになるように添加した。前記反応は４～８℃でゆっくり攪拌しながら約２４時間行った。
カップリング反応終了後、反応液を１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．３）で平衡化させたスーパーデックス２００（GE Healthcare、米国）カラムに適下し、同様の緩衝液を１ｍｌ/分の流速で流して、溶出させた。カップリングされたＦａｂ’‐Ｎ‐ＰＥＧ‐Ｎ‐Ｆｃ結合体は、分子量が大きくて先に溶出され、その後に反応しない免疫グロブリンＦｃとＦａｂ'‐ＰＥＧ連結体が溶出されて分離除去した。完全に削除されない未反応免疫グロブリンＦｃを除去するために、溶出したＦａｂ’‐Ｎ‐ＰＥＧ‐Ｎ‐Ｆｃ結合体の分画を再びｐｏｌｙＣＡＴ ２１×２５０（polyLC Inc.米国）カラムに適用し、２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）を直線濃度勾配（塩化ナトリウム濃度０．１５Ｍ ‐> ０．５Ｍ ）の方法で流して、純粋なＦａｂ’‐Ｎ‐ＰＥＧ‐Ｎ‐Ｆｃ結合体（免疫グロブリンＦｃ‐ＰＥＧ連結体がＦａｂ’のＮ末端に連結される）を得た。
実施例で製造されたタンパク質結合体を下記実験例により分析した。
実験例１：タンパク質結合体の純度の確認
１－１．タンパク質結合体の確認
前記実施例で製造されたタンパク質結合体は、４～２０％の濃度勾配ゲル及び１２％ゲルを用いて非還元性ＳＤＳ‐ＰＡＧＥの方法で分析した。各タンパク質結合体のＳＤＳ‐ＰＡＧＥとウエスタンブロット分析は免疫グロブリンＦｃとそれぞれの生理活性ポリペプチドに対する抗体を用いて行った。図１で示したように、カップリング反応は、ＩＦＮα‐ＰＥＧ‐Ｆｃ（Ａ）、ｈＧＨ‐ＰＥＧ‐Ｆｃ（ｂ）、17、65Ｓ‐Ｇ‐ＣＳＦ‐ＰＥＧ‐Ｆｃ（Ｃ）、インスリン‐ＰＥＧ‐Ｆｃ（Ｄ）、ＥＰＯ‐ＰＥＧ‐Ｆｃ（Ｅ）、ＣＡ‐エキセンジン４‐ＰＥＧ‐ Ｆｃ（Ｆ）及びＦａｃＶＩＩ‐ＰＥＧ‐Ｆｃ（Ｇ）を成功的に生産した。
１－２．タンパク質結合体の純度の確認
前記実施例で製造されたタンパク質結合体であるＩＦＮα‐ＰＥＧ‐Ｆｃ（Ａ）、ｈＧＨ‐ＰＥＧ‐Ｆｃ（ｂ）、17、65Ｓ‐Ｇ‐ＣＳＦ‐ＰＥＧ‐Ｆｃ（Ｃ）、インスリン‐ＰＥＧ‐Ｆｃ（Ｄ）、ＥＰＯ‐ＰＥＧ‐Ｆｃ（Ｅ）及びＣＡ‐エキセンジン４‐ＰＥＧ‐ Ｆｃ（Ｆ）に対してそれぞれＨＰＬＣを用いたサイズ排除クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、あるいはイオン交換クロマトグラフィーを適用した。図２で示したように、各分析で９５％以上の高純度に対応する単一のピークを示した。
１－３．タンパク質結合体の位置選択性の確認
前記実施例で製造されたタンパク質結合体であるＩＦＮα‐ＰＥＧ‐Ｆｃ（Ａ）、ｈＧＨ‐ＰＥＧ‐Ｆｃ（ｂ）、17、65Ｓ‐Ｇ‐ＣＳＦ‐ＰＥＧ‐Ｆｃ（Ｃ）、インスリン‐ＰＥＧ‐Ｆｃ（Ｄ）、ＥＰＯ‐ＰＥＧ‐Ｆｃ（Ｅ）に対してタンパク質分解酵素を用いたペプチドマッピング分析（逆相クロマトグラフィー）を適用した。図３で示したように、分析で９０％以上の高選択性で免疫グロブリンＦｃ領域Ｎ末端を介して連結されたタンパク質結合体が製造されたことが確認された。
実験例２：Ｆｃの結合位置による結合体の効力比較
実施例で製造されたタンパク質結合体であるＣＡ‐エキセンジン４‐ＰＥＧ‐Ｆｃ、17、65Ｓ‐Ｇ‐ＣＳＦ‐ＰＥＧ‐Ｆｃ及びＥＰＯ‐ＰＥＧ‐Ｆｃに対して試験管内及び生体内の効力試験をそれぞれ適用した。以下の表の結果で示したように、ＦｃのＮ末端（プロリン）に結合する場合、その他の位置（例、リジン）に結合する場合に比べてよい効果を示すことを確認した。
表１
ＣＡエキセンジン‐ＰＥＧ‐Ｆｃ位置異性体の試験管内活性‐ＣＨＯ/ＧＬＰ‐１Ｒ ｂｉｏａｓｓａｙ
Figure 0007222710000001

前記表１で示したように、ＣＡエキセンジン‐ＰＥＧ‐Ｆｃ位置異性体の試験管内の活性を比較した結果、本発明の免疫グロブリンＦｃ断片のＮ末端に特異的結合して製造されたＣＡエキセンジン‐ＰＥＧ‐Ｆｃ結合体が、免疫グロブリンＦｃ領域の他の位置に結合して製造されたＣＡエキセンジン‐ＰＥＧ‐Ｆｃ結合体に比べて６倍以上の優れた力価を有することを確認した。
表２
17、65Ｓ‐Ｇ‐ＣＳＦ‐ＰＥＧ‐Ｆｃの位置異性体の試験管内活性‐マウス骨髄細胞増殖実験
Figure 0007222710000002

前記表２で示したように、17、65Ｓ‐Ｇ‐ＣＳＦ‐ＰＥＧ‐Ｆｃの位置異性体の試験管内の活性を比較した結果、本発明の免疫グロブリンＦｃ断片のＮ末端に特異的結合して製造された17、65Ｓ‐Ｇ‐ＣＳＦ‐ＰＥＧ‐Ｆｃ結合体が、免疫グロブリンＦｃ領域の他の位置に結合して製造された17、65Ｓ‐Ｇ‐ＣＳＦ‐ＰＥＧ‐Ｆｃ結合体に比べて約６７％増加した力価を有することを確認した。
一方、本発明のタンパク質結合体は、特にＥＰＯ‐ＰＥＧ‐Ｆｃの位置異性体の生体内での活性を確認するために、正常細胞型マウスアッセイ（Normocythemic mice assay）を介して正常細胞型マウスにＥＰＯ‐ＰＥＧ‐Ｆｃを皮下に投与した後、妄想赤血球レベルを測定した。
表３
ＥＰＯ‐ＰＥＧ‐Ｆｃの位置異性体の生体内バイオ力価‐網状赤血球レベルの測定（正常細胞型マウスに皮下注射した後）
Figure 0007222710000003

前記表３で示したように、ＥＰＯ‐ＰＥＧ‐Ｆｃの位置異性体の生体内の活性を比較した結果、本発明の免疫グロブリンＦｃ断片のＮ末端に特異的結合して製造されたＥＰＯ‐ＰＥＧ‐Ｆｃ結合体が、免疫グロブリンＦｃ領域の他の位置に結合して製造されたＥＰＯ ‐ＰＥＧ‐Ｆｃ結合体に比べて約４０％増加した力価を有することを確認した。
これらの結果は、生理活性ポリペプチド、非ペプチド性重合体及び免疫グロブリンＦｃ領域を含むタンパク質結合体の製造において、免疫グロブリンＦｃ断片の特定位置を結合部位として利用して製造する場合、生理活性ポリペプチドの生体内活性が向上されたタンパク質結合体が製造されることを示唆する。
前記実施例及び実験例を総合すると、本発明者らは、生理活性ポリペプチドの生体内持
続性を高めると同時に、生体内活性（力価）を高めたり維持するために、生理活性ポリペ
プチド、非ペプチド性重合体及び免疫グロブリンＦｃ領域からなるタンパク質結合体を製
造した。具体的に、様々な生理活性ポリペプチドに対するタンパク質結合体を製造し、特
に免疫グロブリンＦｃ領域の特定位置、特にＮ末端を結合部位とするタンパク質結合体を
製造した。
その結果、本発明のタンパク質結合体の製造方法により製造された様々なタンパク質結
合体の免疫グロブリンＦｃ断片のＮ末端選択性は９０％であることを確認しており、本発
明の免疫グロブリンＦｃ領域のＮ末端特異的結合タンパク質結合体の力価がＦｃ領域の他
の部位に結合したタンパク質結合体よりも約４０％から最大４００％以上の優秀さを確認
した。
以上の説明から、本発明が属する技術分野の当業者は本発明がその技術的思想や必須の
特徴を変更せず、他の具体的な形態で実施できることを理解できるだろう。これに関連し
、以上で記述した実施例は、すべての面で例示的なものであり、限定的なものではないと
理解するべきである。本発明の範囲は、前記の詳細な説明ではなく、後述する特許請求の
範囲の意味及び範囲、そしてその等価概念から導出されるすべての変更または変形された
形態が本発明の範囲に含まれるものと解釈されるべきである。
次に、本発明のまた別の好ましい態様を示す。
１． 非ペプチド性重合体を介して免疫グロブリンＦｃ領域に連結された生理活性ポリペプチドを含むタンパク質結合体であって、前記非ペプチド性重合体が、免疫グロブリンＦｃ領域のＮ末端に位置特異的に結合したものである、タンパク質結合体。
２． 前記非ペプチド性重合体の両末端が、反応基を介して生理活性ポリペプチド及び免疫グロブリンＦｃ領域にそれぞれ共有結合により連結されるものである、上記１に記載のタンパク質結合体。
３． 前記免疫グロブリンＦｃ領域が、非糖鎖化されたものである、上記１に記載のタンパク質結合体。
４． 前記免疫グロブリンＦｃ領域が、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３及びＣＨ４ドメインからなる群から選択される１つ ～４つのドメインからなる、上記１に記載のタンパク質結合体。
５． 前記免疫グロブリンＦｃ領域が、ヒンジ領域をさらに含む、上記４に記載のタンパク質結合体。
６． 前記免疫グロブリンＦｃ領域が、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥまたはＩｇＭ由来の免疫グロブリンＦｃ断片である、上記１に記載のタンパク質結合体。
７． 前記免疫グロブリンＦｃ断片のそれぞれのドメインが、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ及びＩｇＭからなる群から選択される免疫グロブリンに由来する異なる起源を有するドメインのハイブリッドである、上記６に記載のタンパク質結合体。
８． 前記免疫グロブリンＦｃ断片が、同一起源を有するドメインを含む一本鎖免疫グロブリンからなるダイマーまたはマルチマーである、上記６に記載のタンパク質結合体。
９． 前記免疫グロブリンＦｃ断片が、ＩｇＧ４ Ｆｃ断片である、上記６に記載のタンパク質結合体。
１０． 前記免疫グロブリンＦｃ断片が、ヒト非糖鎖化ＩｇＧ４ Ｆｃ断片である、上記６に記載のタンパク質結合体。
１１． 前記非ペプチド性重合体が、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコール-プロピレングリコール共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコール、ポリサカライド、デキストラン、ポリビニルエチルエーテル、生分解性高分子、脂質重合体、キチン、ヒアルロン酸及びこれらの組み合わせからなる群から選択されるものである、上記１に記載のタンパク質結合体。
１２． 前記非ペプチド性重合体が、ポリエチレングリコールである、上記１１に記載のタンパク質結合体。
１３． 前記非ペプチド性重合体の反応基が、アルデヒドグループ、マレイミドグループ及びスクシンイミド誘導体からなる群から選択されるものである、上記１に記載のタンパク質結合体。
１４． 前記アルデヒドグループが、プロピオンアルデヒドグループまたはブチルアルデヒドグループである、上記１３に記載のタンパク質結合体。
１５． 前記スクシンイミド誘導体が、スクシンイミジルカルボキシメチル、スクシンイミジルバレレート、スクシンイミジルメチルブタノエート、スクシンイミジルメチルプロピオネート、スクシンイミジルブタノエート、スクシンイミジルプロピオネート、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド、またはスクシンイミジルカーボネートである、上記１３に記載のタンパク質結合体。
１６． 前記非ペプチド性重合体が、両末端に反応基としてアルデヒドグループを有するものである、上記１に記載のタンパク質結合体。
１７． 前記非ペプチド性重合体が、両末端に反応基としてそれぞれアルデヒドグループ及びマレイミドグループを有するものである、上記１に記載のタンパク質結合体。
１８． 前記非ペプチド性重合体が、両末端に反応基としてそれぞれアルデヒドグループ及びスクシンイミドグループを有するものである、上記１に記載のタンパク質結合体。
１９． 前記非ペプチド性重合体の両末端が、それぞれ免疫グロブリンＦｃ領域のＮ末端と生理活性ポリペプチドのＮ末端、Ｃ末端、またはリジン残基、ヒスチジン残基またはシステイン残基の遊離反応基に連結されるものである、上記１に記載のタンパク質結合体。
２０． 前記生理活性ポリペプチドが、ホルモン、サイトカイン、酵素、抗体、成長因子、転写因子、血液凝固因子、ワクチン、構造タンパク質、リガンドタンパク質及び受容体からなる群から選択されるものである、上記１に記載のタンパク質結合体。
２１． 前記生理活性ポリペプチドが、ヒト成長ホルモン、成長ホルモン放出ホルモン、成長ホルモン放出ペプチド、インターフェロン類、インターフェロン受容体類、コロニー刺激因子類、グルカゴン様ペプチド類（ＧＬＰ-１など）、エキセンジン類（Ｅｘｅｎｄｉｎ４など） 、オキシントモジュリン、Ｇタンパク質関連受容体（G-Protein-coupled receptor）、インターロイキン類、インターロイキン受容体類、酵素類、インターロイキン結合タンパク質類、サイトカイン結合タンパク質類、マクロファージ活性因子、マクロファージペプチド、Ｂ細胞因子、Ｔ細胞因子、タンパク質Ａ、アレルギー抑制因子、細胞壊死糖タンパク質、免疫毒素、リンホトキシン、腫瘍壊死因子、腫瘍抑制因子、転移成長因子、α-１アンチトリプシン、アルブミン、α-ラクトアルブミン、アポリポタンパク質Ｅ、赤血球生成因子、糖鎖化赤血球生成因子、アンジオポエチン類、ヘモグロビン、トロンビン、トロンビン受容体活性ペプチド、トロンボモジュリン、血液因子ＶＩＩ、ＶＩＩａ、ＶＩＩＩ、ＩＸ及びＸＩＩＩ、プラスミノーゲン活性因子、フィブリン結合ペプチド、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、ヒルジン、タンパク質Ｃ、Ｃ反応性タンパク質、レニン抑制剤、コラゲナーゼ抑制剤、スーパーオキシドジスムターゼ、レプチン、血小板由来成長因子、上皮細胞成長因子、表皮細胞成長因子、アンジオスタチン、アンジオテンシン、骨形成成長因子、骨形成促進タンパク質、カルシトニン、インスリン、アトリオペプチン、軟骨誘導因子、エルカトニン、結合組織活性因子、組織因子経路阻害剤、卵胞刺激ホルモン、黄体形成ホルモン、黄体形成ホルモン放出ホルモン、神経成長因子類、副甲状腺ホルモン、リラキシン、セクレチン、ソマトメジン、インスリン様成長因子、副腎皮質ホルモン、グルカゴン、コルレシストキニン、膵臓ポリペプチド、ガストリン放出ペプチド、コルチコトロピン放出因子、甲状腺刺激ホルモン、オートタキシン、ラクトフェリン、ミオスタチン、受容体類、受容体アンタゴニスト、細胞表面抗原、ウイルス由来ワクチン抗原、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、抗体断片類及びそれらの誘導体からなる群から選択されるものである、上記２０に記載のタンパク質結合体。
２２． 前記生理活性ポリペプチドが、ヒト成長ホルモン、インターフェロンα、顆粒球コロニー刺激因子、赤血球生成因子、血液凝固因子、インスリン、オキシントモジュリン、グルカゴン様ペプチド類、エキセンジン類及びそれらの誘導体である、上記２１に記載のタンパク質結合体。
２３． （ａ）両末端に反応基を有する少なくても１つの非ペプチド性重合体；少なくても１つの生理活性ポリペプチド；及び少なくても１つの免疫グロブリンＦｃ領域を共有結合により連結してタンパク質結合体を製造する段階；及び
（ｂ）前記（ａ）段階で製造された共有結合により連結された生理活性ポリペプチド、非ペプチド性重合体及び免疫グロブリンＦｃ領域を必須的に含み、前記非ペプチド性重合体が免疫グロブリンＦｃ断片のＮ末端に連結されたタンパク質結合体を分離する段階を含む、上記１に記載のタンパク質結合体の製造方法。
２４． 前記（ａ）段階が、
（ａ１）非ペプチジルポリマーの一末端を免疫グロブリンＦｃ領域または生理活性ポリペプチドに共有結合により連結させて連結体を製造する段階；及び
（ａ２）前記（ａ１）段階で製造した連結体を分離して、前記分離された連結体の非ペプチド性重合体のもう一つの末端を免疫グロブリンＦｃ領域または生理活性ポリペプチドの他の方に共有結合により連結する段階を含む、上記２３に記載の製造方法。
２５． 前記（ａ１）段階で生理活性ポリペプチドと非ペプチド性重合体との間の反応モル比が１：１～１：３０であり、免疫グロブリンＦｃ断片と非ペプチド性重合体との間の反応モル比が１：１～１：２０である、上記２４に記載の製造方法。
２６． 前記（ａ１）段階が、ｐＨ４．０～９．０の条件で行われる、上記２４に記載の製造方法。
２７． 前記（ａ１）段階が、４．０℃～２５℃の温度で行われる、上記２４に記載の製造方法。
２８． 前記（ａ１）段階で免疫グロブリンＦｃ領域または生理活性ポリペプチドの反応濃度が、０．１ｍｇ/ｍｌ～１００ｍｇ/ｍｌである、上記２４に記載の製造方法。
２９． 前記（ａ２）の段階で前記連結体と免疫グロブリンＦｃ領域または生理活性ポリペプチドとの間の反応モル比が、１：０．１～１：２０である、上記２４に記載の製造方法。
３０． 前記（ａ２）段階が、ｐＨ４．０～９．０の条件で行われる、上記２４に記載の製造方法。
３１． 前記（ａ２）段階が、４．０～２５℃の温度で行われる、上記２４に記載の製造方法。
３２． 前記（ａ２）段階で免疫グロブリンＦｃ領域または生理活性ポリペプチドの反応濃度が、０．１ｍｇ/ｍｌ～１００ｍｇ/ｍｌである、上記２４に記載の製造方法。
３３． 前記（ａ１）段階及び（ａ２）段階が、還元剤の存在下で行われる、上記２４に記載の製造方法。
３４． 前記還元剤が、シアノ水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＣＮＢＨ 3 ）、水素化ホウ素ナトリウム、ジメチルアミンホウ酸塩及びピリジンホウ酸塩からなる群から選択されるものである、上記３３に記載の製造方法。
３５． 前記（ａ２）の段階で分離が、陰イオン交換クロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー及びサイズ排除クロマトグラフィーからなる群から選択される精製方法を単独または組合わせて行うものである、上記２４に記載の製造方法。
３６． 前記陰イオン交換クロマトグラフィーの樹脂の官能基が、第四級アンモニウム（Ｑ）、 第四級アミノエチル（ＱＡＥ）、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ジメチルアミノメチル（ＤＭＡＥ）及びトリメチルアミノエチル（ＴＭＡＥ）からなる群から選択されるいずれか一つである、上記３５に記載の製造方法。
３７． 前記陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂の官能基が、メチルスルホネート（Ｓ）、スルホプロピル（ＳＰ）、カルボキシメチル（ＣＭ）、スルホエチル（ＳＥ）及びポリアスパラギン酸からなる群から選択されるいずれか一つである、上記３５に記載の製造方法。
３８． 前記疎水性クロマトグラフィーの樹脂の官能基が、フェニル、オクチル、（イソ）プロピルＰｒｏ、ブチル及びエチルからなる群から選択されるいずれか一つである、上記３５に記載の製造方法。
３９． 前記親和性クロマトグラフィーの樹脂の官能基が、プロテインＡＰｒｏ、ヘパリン、ブルー、ベンズアミジン、金属イオン（コバルト、ニッケル及び銅）、及び非ペプチド性重合体の両末端がそれぞれ免疫グロブリンＦｃ領域及び生理活性ポリペプチドに連結されたタンパク質結合体の構成成分の一部または全体に対する抗体からなる群から選択されるいずれか一つである、上記３５に記載の製造方法。
４０． 前記サイズ排除クロマトグラフィーの樹脂が、スーパーデックス、セファクリル、スーパーロース及びセファデックスからなる群から選択されるいずれか一つである、上記３５に記載の製造方法。
４１． タンパク質結合体の分離が、陰イオン交換クロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー及びサイズ排除クロマトグラフィーからなる群から選択される精製方法を単独または組合わせて行うものである、上記２３に記載の製造方法。
４２． 前記陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂の官能基が、第四級アンモニウム（Ｑ）、第四級アミノエチル（ＱＡＥ）、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ジメチルアミノメチル（ＤＭＡＥ）及びトリメチルアミノエチル（ＴＭＡＥ）からなる群から選択されるいずれか一つである、上記４１に記載の製造方法。
４３． 前記陽イオン交換クロマトグラフィーの樹脂の官能基が、メチルスルホネート（Ｓ）、スルホプロピル（ＳＰ）、カルボキシメチル（ＣＭ）、スルホエチル（ＳＥ）及びポリアスパラギン酸からなる群から選択されるいずれか一つである、上記４１に記載の製造方法。
４４． 前記疎水性クロマトグラフィーの樹脂の官能基が、フェニル、オクチル、（イソ）プロピル、ブチル及びエチルからなる群から選択されるいずれか一つである、上記４１に記載の製造方法。
４５．前記親和性クロマトグラフィーの樹脂の官能基が、プロテインＡＰｒｏ、ヘパリン、ブルー、ベンズアミジン、金属イオン（コバルト、ニッケル及び銅）、及び非ペプチド性重合体の両末端がそれぞれ免疫グロブリンＦｃ領域及び生理活性ポリペプチドに連結されたタンパク質結合体の構成成分の一部または全体に対する抗体からなる群から選択されるいずれか一つである、上記４１に記載の製造方法。
４６． 前記サイズ排除クロマトグラフィーの樹脂が、スーパーデックス、セファクリル、スーパーロース及びセファデックスからなる群から選択されるいずれか一つである、上記４１に記載の製造方法。
４７． 前記（ｂ）段階が、タンパク質結合体を構成する非ペプチド性重合体と免疫グロブリンＦｃ領域が免疫グロブリンＦｃ領域のＮ末端を介して結合したタンパク質結合体を分離する、上記２３に記載の製造方法。
４８．（ａ’）非ペプチド性重合体の一末端を免疫グロブリンＦｃ領域または生理活性ポリペプチドに共有結合により連結して連結体を製造する段階であり、ｐＨ４．０～９．０の条件で行われる段階；
（ｂ’）前記（ａ’）段階で製造した連結体を分離して、分離された連結体の非ペプチド性重合体の他方の末端を免疫グロブリンＦｃ領域または生理活性ポリペプチドの他の一つと共有結合により連結する段階であり、ｐＨ４．０～９．０の条件で行われる段階；及び（ｃ’）前記（ｂ’）段階で製造された共有結合により連結された生理活性ポリペプチド、非ペプチド性重合体及び免疫グロブリンＦｃ領域を必須的に含み、前記非ペプチド性重合体が免疫グロブリンＦｃ断片のＮ末端に連結されたタンパク質結合体を分離する段階を含む、上記１に記載のタンパク質結合体の製造方法。
４９．（ａ’）非ペプチド性重合体の一末端を免疫グロブリンＦｃ領域または生理活性ポリペプチドに共有結合により連結して連結体を製造する段階であり、生理活性ポリペプチドと非ペプチド性重合体との間の反応モル比が、１：１～１：３０であり、免疫グロブリンＦｃ領域と非ペプチド性重合体との間の反応モル比が、１：１～１：２０であり、還元剤が、１ｍＭ～１００ｍＭの濃度で含まれ、反応が、ｐＨ４．０～９．０の条件、反応温度４．０～２５℃で行われて、免疫グロブリンＦｃ領域または生理活性ポリペプチドの濃度が、０．１ｍｇ/ｍｌ～１００ｍｇ/ｍｌである段階;
（ｂ’）前記（ａ’）段階で製造した連結体を分離して、分離された連結体の非ペプチド性重合体の他方の末端を免疫グロブリンＦｃ領域または生理活性ポリペプチドの他の一つに共有結合により連結する段階であり、連結体と免疫グロブリンＦｃ領域または生理活性ポリペプチドとの間の反応モル比が、１：０.１～１：２０であり、還元剤が、１～１００ｍＭの濃度で含まれ、反応が、ｐＨ４．０～９．０の条件、反応温度４．０～２５℃で行われて、免疫グロブリンＦｃ領域または生理活性ポリペプチドの濃度が、０．１ｍｇ/ｍｌ～１００ｍｇ/ｍｌである段階；及び
（ｃ’）前記（ｂ’）段階で製造された共有結合により連結された生理活性ポリペプチド、非ペプチド性重合体及び免疫グロブリンＦｃ領域を必須的に含み、前記非ペプチド性重合体が免疫グロブリンＦｃ断片のＮ末端に連結されたタンパク質結合体を分離する段階を含む、上記１に記載のタンパク質結合体の製造方法。
５０． 前記タンパク質結合体の製造方法が、Ｎ末端選択性を有するものである、上記２３～４９のいずれか一項に記載の製造方法。
５１． 上記１に記載のタンパク質結合体を有効成分として含む、生理活性ポリペプチドの生体内持続性及び安定性増加用薬学的組成物。
５２． 前記薬学的組成物が、前記タンパク質結合体が９０％以上で含まれるものである、上記５１に記載の組成物。
５３． 上記２３～４９のいずれか一項に記載の方法により製造されたタンパク質結合体を９０％以上含む、タンパク質結合体の集合体。

Claims (43)

  1. 非ペプチド性重合体を介して免疫グロブリンＦｃ領域に連結された生理活性ポリペプチドを含むタンパク質結合体であって、前記非ペプチド性重合体が、免疫グロブリンＦｃ領域の末端のプロリンに位置特異的に結合したものであり、
    前記生理活性ポリペプチドが、天然型Ｇ‐ＣＳＦの１７番目及び６５番目のアミノ酸がセリンに置換された顆粒球コロニー刺激因子誘導体であり、
    前記免疫グロブリンＦｃ領域が配列番号１のアミノ酸配列からなる、タンパク質結合体。
  2. 前記非ペプチド性重合体の両末端が、反応基を介して生理活性ポリペプチド及び免疫グロブリンＦｃ領域にそれぞれ共有結合により連結されるものである、請求項１に記載のタンパク質結合体。
  3. 前記免疫グロブリンＦｃ領域が、非糖鎖化されたものである、請求項１に記載のタンパク質結合体。
  4. 前記非ペプチド性重合体が、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコール-プロピレングリコール共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコール、ポリサカライド、デキストラン、ポリビニルエチルエーテル、生分解性高分子、脂質重合体、キチン、ヒアルロン酸及びこれらの組み合わせからなる群から選択されるものである、請求項１に記載のタンパク質結合体。
  5. 前記非ペプチド性重合体が、ポリエチレングリコールである、請求項４に記載のタンパク質結合体。
  6. 前記非ペプチド性重合体の反応基が、アルデヒド基、マレイミド基及びスクシンイミド誘導体からなる群から選択されるものである、請求項２に記載のタンパク質結合体。
  7. 前記アルデヒド基が、プロピオンアルデヒド基またはブチルアルデヒド基である、請求項６に記載のタンパク質結合体。
  8. 前記スクシンイミド誘導体が、スクシンイミジルカルボキシメチル、スクシンイミジルバレレート、スクシンイミジルメチルブタノエート、スクシンイミジルメチルプロピオネート、スクシンイミジルブタノエート、スクシンイミジルプロピオネート、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド、またはスクシンイミジルカーボネートである、請求項６に記載のタンパク質結合体。
  9. 前記非ペプチド性重合体が、両末端に反応基としてアルデヒド基を有するものである、請求項１に記載のタンパク質結合体。
  10. 前記非ペプチド性重合体が、両末端に反応基としてそれぞれアルデヒド基及びマレイミド基を有するものである、請求項１に記載のタンパク質結合体。
  11. 前記非ペプチド性重合体が、両末端に反応基としてそれぞれアルデヒド基及びスクシンイミド基を有するものである、請求項１に記載のタンパク質結合体。
  12. 前記非ペプチド性重合体の両末端が、それぞれ免疫グロブリンＦｃ領域の末端のプロリンと生理活性ポリペプチドのＮ末端、Ｃ末端、またはリジン残基、ヒスチジン残基またはシステイン残基の遊離反応基に連結されるものである、請求項１に記載のタンパク質結合体。
  13. （ａ）両末端に反応基を有する少なくても１つの非ペプチド性重合体；少なくても１つの生理活性ポリペプチド；及び少なくても１つの免疫グロブリンＦｃ領域を共有結合により連結してタンパク質結合体を製造する段階；及び
    （ｂ）前記（ａ）段階で製造された共有結合により連結された生理活性ポリペプチド、非ペプチド性重合体及び免疫グロブリンＦｃ領域を必須的に含み、前記非ペプチド性重合体が免疫グロブリンＦｃ断片の末端のプロリンに連結されたタンパク質結合体を分離する段階を含み、
    前記生理活性ポリペプチドが、天然型Ｇ‐ＣＳＦの１７番目及び６５番目のアミノ酸がセリンに置換された顆粒球コロニー刺激因子誘導体であり、
    前記免疫グロブリンＦｃ領域が配列番号１のアミノ酸配列からなる、請求項１に記載のタンパク質結合体の製造方法。
  14. 前記（ａ）段階が、
    （ａ１）非ペプチド性重合体の一末端を免疫グロブリンＦｃ領域または生理活性ポリペプチドに共有結合により連結させて連結体を製造する段階；及び
    （ａ２）前記（ａ１）段階で製造した連結体を分離して、前記分離された連結体の非ペプチド性重合体のもう一つの末端を免疫グロブリンＦｃ領域または生理活性ポリペプチドの他の方に共有結合により連結する段階を含む、請求項１３に記載の製造方法。
  15. 前記（ａ１）段階で生理活性ポリペプチドと非ペプチド性重合体との間の反応モル比が１：１～１：３０であり、免疫グロブリンＦｃ断片と非ペプチド性重合体との間の反応モル比が１：１～１：２０である、請求項１４に記載の製造方法。
  16. 前記（ａ１）段階が、ｐＨ４．０～９．０の条件で行われる、請求項１４に記載の製造方法。
  17. 前記（ａ１）段階が、４．０℃～２５℃の温度で行われる、請求項１４に記載の製造方法。
  18. 前記（ａ１）段階で免疫グロブリンＦｃ領域または生理活性ポリペプチドの反応濃度が、０．１ｍｇ/ｍｌ～１００ｍｇ/ｍｌである、請求項１４に記載の製造方法。
  19. 前記（ａ２）の段階で前記連結体と免疫グロブリンＦｃ領域または生理活性ポリペプチドとの間の反応モル比が、１：０．１～１：２０である、請求項１４に記載の製造方法。
  20. 前記（ａ２）段階が、ｐＨ４．０～９．０の条件で行われる、請求項１４に記載の製造方法。
  21. 前記（ａ２）段階が、４．０～２５℃の温度で行われる、請求項１４に記載の製造方法。
  22. 前記（ａ２）段階で免疫グロブリンＦｃ領域または生理活性ポリペプチドの反応濃度が、０．１ｍｇ/ｍｌ～１００ｍｇ/ｍｌである、請求項１４に記載の製造方法。
  23. 前記（ａ１）段階及び（ａ２）段階が、還元剤の存在下で行われる、請求項１４に記載の製造方法。
  24. 前記還元剤が、シアノ水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＣＮＢＨ3）、水素化ホウ素ナトリウム、ジメチルアミンホウ酸塩及びピリジンホウ酸塩からなる群から選択されるものである、請求項２３に記載の製造方法。
  25. 前記（ａ２）の段階で分離が、陰イオン交換クロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー及びサイズ排除クロマトグラフィーからなる群から選択される精製方法を単独または組合わせて行うものである、請求項１４に記載の製造方法。
  26. 前記陰イオン交換クロマトグラフィーの樹脂の官能基が、第四級アンモニウム（Ｑ）、 第四級アミノエチル（ＱＡＥ）、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ジメチルアミノメチル（ＤＭＡＥ）及びトリメチルアミノエチル（ＴＭＡＥ）からなる群から選択されるいずれか一つである、請求項２５に記載の製造方法。
  27. 前記陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂の官能基が、メチルスルホネート（Ｓ）、スルホプロピル（ＳＰ）、カルボキシメチル（ＣＭ）、スルホエチル（ＳＥ）及びポリアスパラギン酸からなる群から選択されるいずれか一つである、請求項２５に記載の製造方法。
  28. 前記疎水性クロマトグラフィーの樹脂の官能基が、フェニル、オクチル、（イソ）プロピル、ブチル及びエチルからなる群から選択されるいずれか一つである、請求項２５に記載の製造方法。
  29. 前記親和性クロマトグラフィーの樹脂の官能基が、プロテインＡ、ヘパリン、ブルー、ベンズアミジン、金属イオン（コバルト、ニッケル及び銅）、及び非ペプチド性重合体の両末端がそれぞれ免疫グロブリンＦｃ領域及び生理活性ポリペプチドに連結されたタンパク質結合体の構成成分の一部または全体に対する抗体からなる群から選択されるいずれか一つである、請求項２５に記載の製造方法。
  30. 前記サイズ排除クロマトグラフィーの樹脂が、スーパーデックス、セファクリル、スーパーロース及びセファデックスからなる群から選択される、請求項２５に記載の製造方法。
  31. タンパク質結合体の分離が、陰イオン交換クロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー及びサイズ排除クロマトグラフィーからなる群から選択される方法を単独または組合わせて行うものである、請求項１３に記載の製造方法。
  32. 前記陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂の官能基が、第四級アンモニウム（Ｑ）、第四級アミノエチル（ＱＡＥ）、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ジメチルアミノメチル（ＤＭＡＥ）及びトリメチルアミノエチル（ＴＭＡＥ）からなる群から選択されるいずれか一つである、請求項３１に記載の製造方法。
  33. 前記陽イオン交換クロマトグラフィーの樹脂の官能基が、メチルスルホネート（Ｓ）、スルホプロピル（ＳＰ）、カルボキシメチル（ＣＭ）、スルホエチル（ＳＥ）及びポリアスパラギン酸からなる群から選択されるいずれか一つである、請求項３１に記載の製造方法。
  34. 前記疎水性クロマトグラフィーの樹脂の官能基が、フェニル、オクチル、（イソ）プロピル、ブチル及びエチルからなる群から選択されるいずれか一つである、請求項３１に記載の製造方法。
  35. 前記親和性クロマトグラフィーの樹脂の官能基が、プロテインＡ、ヘパリン、ブルー、ベンズアミジン、金属イオン（コバルト、ニッケル及び銅）、及び非ペプチド性重合体の両末端がそれぞれ免疫グロブリンＦｃ領域及び生理活性ポリペプチドに連結されたタンパク質結合体の構成成分の一部または全体に対する抗体からなる群から選択されるいずれか一つである、請求項３１に記載の製造方法。
  36. 前記サイズ排除クロマトグラフィーの樹脂が、スーパーデックス、セファクリル、スーパーロース及びセファデックスからなる群から選択される、請求項３１に記載の製造方法。
  37. 前記（ｂ）段階が、タンパク質結合体を構成する非ペプチド性重合体と免疫グロブリンＦｃ領域が免疫グロブリンＦｃ領域の末端のプロリンを介して結合したタンパク質結合体を分離する、請求項１３に記載の製造方法。
  38. （ａ’）非ペプチド性重合体の一末端を免疫グロブリンＦｃ領域または生理活性ポリペプチドに共有結合により連結して連結体を製造する段階であり、ｐＨ４．０～９．０の条件で行われる段階；
    （ｂ’）前記（ａ’）段階で製造した連結体を分離して、分離された連結体の非ペプチド性重合体の他方の末端を免疫グロブリンＦｃ領域または生理活性ポリペプチドの他の一つと共有結合により連結する段階であり、ｐＨ４．０～９．０の条件で行われる段階；及び
    （ｃ’）前記（ｂ’）段階で製造された共有結合により連結された生理活性ポリペプチド、非ペプチド性重合体及び免疫グロブリンＦｃ領域を必須的に含み、前記非ペプチド性重合体が免疫グロブリンＦｃ断片の末端のプロリンに連結されたタンパク質結合体を分離する段階を含み、
    前記生理活性ポリペプチドが、天然型Ｇ‐ＣＳＦの１７番目及び６５番目のアミノ酸がセリンに置換された顆粒球コロニー刺激因子誘導体であり、
    前記免疫グロブリンＦｃ領域が配列番号１のアミノ酸配列からなる、請求項１に記載のタンパク質結合体の製造方法。
  39. （ａ’）非ペプチド性重合体の一末端を免疫グロブリンＦｃ領域または生理活性ポリペプチドに共有結合により連結して連結体を製造する段階であり、生理活性ポリペプチドと非ペプチド性重合体との間の反応モル比が、１：１～１：３０であり、免疫グロブリンＦｃ領域と非ペプチド性重合体との間の反応モル比が、１：１～１：２０であり、還元剤が、１ｍＭ～１００ｍＭの濃度で含まれ、反応が、ｐＨ４．０～９．０の条件、反応温度４．０～２５℃で行われて、免疫グロブリンＦｃ領域または生理活性ポリペプチドの濃度が、０．１ｍｇ/ｍｌ～１００ｍｇ/ｍｌである段階;
    （ｂ’）前記（ａ’）段階で製造した連結体を分離して、分離された連結体の非ペプチド性重合体の他方の末端を免疫グロブリンＦｃ領域または生理活性ポリペプチドの他の一つに共有結合により連結する段階であり、連結体と免疫グロブリンＦｃ領域または生理活性ポリペプチドとの間の反応モル比が、１：０.１～１：２０であり、還元剤が、１～１００ｍＭの濃度で含まれ、反応が、ｐＨ４．０～９．０の条件、反応温度４．０～２５℃で行われて、免疫グロブリンＦｃ領域または生理活性ポリペプチドの濃度が、０．１ｍｇ/ｍｌ～１００ｍｇ/ｍｌである段階；及び
    （ｃ’）前記（ｂ’）段階で製造された共有結合により連結された生理活性ポリペプチド、非ペプチド性重合体及び免疫グロブリンＦｃ領域を必須的に含み、前記非ペプチド性重合体が免疫グロブリンＦｃ断片の末端のプロリンに連結されたタンパク質結合体を分離する段階を含み、
    前記生理活性ポリペプチドが、天然型Ｇ‐ＣＳＦの１７番目及び６５番目のアミノ酸がセリンに置換された顆粒球コロニー刺激因子誘導体であり、
    前記免疫グロブリンＦｃ領域が配列番号１のアミノ酸配列からなる、請求項１に記載のタンパク質結合体の製造方法。
  40. 前記タンパク質結合体の製造方法が、Ｎ末端選択性を有するものである、請求項１３～３９のいずれか一項に記載の製造方法。
  41. 請求項１に記載のタンパク質結合体を有効成分として含む組成物。
  42. 前記組成物が、前記タンパク質結合体が９０％以上で含まれるものである、請求項４１に記載の組成物。
  43. 請求項１３～３９のいずれか一項に記載の方法により製造されたタンパク質結合体を９０％以上含む、タンパク質結合体の集合体。
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