CN110545849A - 具有增加的持续性的生理活性物质的缀合物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及缀合物、制备该缀合物的方法及其制剂，所述缀合物包括生理活性物质、接头、和能够增加生理活性物质的体内半衰期的物质。

Description

具有增加的持续性的生理活性物质的缀合物及其应用
技术领域
本发明涉及包括生理活性物质、接头、和能够增加生理活性物质的体内半衰期的物质的缀合物；制备该缀合物的方法；及其制剂。
背景技术
总体上，生理活性多肽由于其差的稳定性而容易变性和被体内蛋白酶降解，或者由于其相对小的尺寸而相对容易被肾脏去除。因此，为了维持含有这些生理活性多肽作为药物成分的蛋白质药物的血液浓度和滴度，必须更频繁地向患者给予含有这些生理活性多肽作为药物成分的蛋白质药物。然而，在大部分以注射形式给予患者蛋白质药物的情况下，需要通过注射频繁给药以维持生理活性多肽的血液浓度，这会给患者带来疼痛并且还引起高治疗成本。为了解决这些问题，已经进行了许多努力以通过增加其血液稳定性，同时在长时间段内将其血液浓度维持在高水平来最大化蛋白质药物的功效。
同时，胰岛素是由人体的胰腺分泌的血糖水平调控激素，并用于将血糖水平维持在正常范围内，同时将血液中过量的葡萄糖输送到细胞，从而为细胞提供能量来源。然而，糖尿病患者由于胰岛素缺乏、胰岛素抗性或β细胞功能丧失而不能维持正常的胰岛素功能，因此血液中的葡萄糖不能被用作能量来源。结果，糖尿病患者表现出称为高血糖症的高血糖水平的症状，并最终将葡萄糖排泄到尿中，这与若干并发症有关。
因此，胰岛素治疗对于不能产生胰岛素(I型)或胰岛素耐性(resistance)(II型)的糖尿病患者是必要的，并且可通过胰岛素给药将这些糖尿病患者的血糖水平保持在正常水平。然而，与其它蛋白质和肽激素一样，胰岛素具有极短的体内半衰期，因此具有必须重复给药的缺点，而频繁给药给患者带来严重的疼痛和不便。因此，已经进行了研究以开发各种类型的蛋白质剂型、化学缀合物(脂肪酸缀合物和聚乙烯聚合物缀合物)等，以通过增加这些蛋白质的体内半衰期来降低给药频率，从而改善患者的生活质量。目前市场上的长效胰岛素制剂的实例包括甘精胰岛素(insulin glargine)，(Sanofi-Aventis：约20至22小时的持续时间(duration))；地特胰岛素(insulin detemir)，(NovoNordisk：约18至22小时的持续时间)；和德谷胰岛素(insulin degludec)，(约40小时的持续时间)。这些长效胰岛素制剂因为血液中没有胰岛素浓度峰值而适合作为基础胰岛素，但是因为这些长效胰岛素半衰期不够长，其仍然具有需要每天给药一次或两次的不便。因此，对通过显著降低需要长期给药的糖尿病患者的给药频率来实现增加患者便利性的目的是有限的。
若干先前论文，如Authier F et al.(Biochem J.1998 Jun 1；332(Pt 2):421 to30)、Duckworth WC et al.(Endocr Rev.1998 Oct；19(5):608tO 24.)、和Valera Mora MEet al.(J Am Coll Nutr.2003 Dec；22(6):487tO 93)，描述了去除体内胰岛素的方法。检阅这些论文，已知多于50％的胰岛素从肾脏中被去除，而剩余的胰岛素在作用部位(targetsites)如肌肉、脂肪、肝脏等处通过受体介导的清除(receptor-mediated clearance)(RMC)被除去。
因此，越来越需要开发可由于血液半衰期显著增加而降低患者的给药频率同时能够避免RMC的生理活性物质制剂，特别是胰岛素制剂。
公开内容
技术难题
本发明的目的是提供用于延长生理活性物质的体内半衰期目的的生理活性物质的缀合物。
具体地，本发明旨在提供生理活性物质的缀合物，其中生理活性物质和能够增加生理活性物质的体内半衰期的物质通过聚乙二醇连接，并且聚乙二醇具有大于0kDa至小于3.4kDa的尺寸。
本发明的另一目的是提供含有缀合物的组合物。
具体地，本发明旨在提供含有缀合物的具有改善的体内持续性和稳定性的长效制剂。
另外，本发明旨在提供含有缀合物的用于预防或治疗糖尿病的制剂。
本发明的又一目的是提供用于制备缀合物的方法。
本发明的又一方面是提供用于制备药剂的缀合物或含有该缀合物的组合物的应用。
技术方案
为实现上述目的，本发明的一个方面提供了用于延长生理活性物质的体内半衰期目的的生理活性物质的缀合物。
在具体的实施方式中，本发明涉及生理活性物质的缀合物，其中生理活性物质和能够增加生理活性物质的体内半衰期的物质通过聚乙二醇连接，并且聚乙二醇具有大于0kDa至小于3.4kDa的尺寸。
在根据先前具体实施方式的缀合物中，缀合物由以下式1表示：
[式1]
X-L-F
其中：
X是生理活性物质；
L，作为接头，是尺寸为大于0kDa至小于3.4kDa的聚乙二醇；和
F是能够增加生理活性物质的体内半衰期的物质。
在根据先前具体实施方式中的任一项的缀合物中，与与缀合物的不同之处仅在于L是尺寸为3.4kDa的聚乙二醇的缀合物相比，缀合物表现出增加的体内半衰期。
在根据先前具体实施方式中的任一项的缀合物中，L是尺寸大于0kDa至3kDa以下的聚乙二醇。
在根据先前具体实施方式中的任一项的缀合物中，生理活性物质是生理活性多肽。
在根据先前具体实施方式中的任一项的缀合物中，生理活性物质选自毒素；胰高血糖素样肽-1(GLP-1)受体激动剂；胰高血糖素受体激动剂；肠抑胃肽(GIP)受体激动剂；成纤维细胞生长因子(FGF)受体激动剂；胆囊收缩素受体激动剂；胃泌素受体激动剂；黑皮质素受体激动剂；与GLP受体、胰高血糖素受体、和GIP受体中的两种或更多种受体结合的物质；生长抑素；肽YY(PYY)；神经肽Y(NPY)；泌酸调节肽；成纤维细胞生长因子(FGF)；缓激肽；麝香蛸毒肽；催产素；血管升压素；舍莫瑞林(sermorelin)；催乳素释放肽；食欲肽；甲状腺释放肽；钙调蛋白；促胃动素；血管活性肠肽；心房钠尿肽(ANP)；C型纳尿肽(CNP)；神经激肽A；神经调节肽；肾素；内皮素；角蝰毒素肽；carsomorphin肽；皮啡肽；强啡肽；内啡肽；脑啡肽(enkepalin)；肿瘤坏死因子受体；尿激酶受体；促胸腺生成素；胸腺肽；胸腺喷丁；胸腺素(tymosin)；胸腺体液因子；肾上腺髓质素(adrenomodullin)；抑咽侧体神经肽；淀粉样β蛋白片段；抗菌肽；抗氧化肽；蛙皮素；骨钙素；CART肽；E选择蛋白；细胞间粘附分子1(ICAM-1)；血管细胞粘附分子1(VCAM-1)；leucokine；三环(kringle)-5；层粘连蛋白；抑制素；甘丙肽；纤连蛋白；胰抑制素；恩夫韦肽(fuzeon)；胰高血糖素样肽(GLP-1或GLP-2等)；G蛋白偶联受体；红细胞生成性生长因子；白细胞生成素；支链淀粉；人生长激素；生长激素释放激素；生长激素释放肽；干扰素；干扰素受体；集落刺激因子；白细胞介素；白细胞介素受体；酶；白细胞介素结合蛋白；细胞因子结合蛋白；巨噬细胞活化因子；巨噬细胞肽；B细胞因子；T细胞因子；蛋白A；变态反应抑制因子；坏死糖蛋白；免疫毒素；淋巴细胞毒素；肿瘤坏死因子；肿瘤抑制因子；转化生长因子；α-1抗胰蛋白酶；白蛋白；α-乳清蛋白；载脂蛋白-E；促红细胞生成素；高糖基化促红细胞生成素；血管生成素(angiopoietins)；血红蛋白；凝血酶；凝血酶受体活化肽；血栓调节蛋白；血液因子VII；血液因子VIIa；血液因子VIII；血液因子IX；血液因子XIII；纤溶酶原活化因子；纤维蛋白结合肽；尿激酶；链激酶；水蛭素；蛋白C；C-反应蛋白；肾素抑制剂；胶原蛋白酶抑制剂；超氧化物歧化酶；瘦蛋白；血小板衍生生长因子；上皮生长因子；表皮生长因子；制管张素；血管紧张素；骨形态发生生长因子；骨形态发生蛋白；降钙素；胰岛素；心钠素；软骨诱导因子；依降钙素(elcatonin)；结缔组织活化因子；组织因子途径抑制剂(tissue factor pathway inhibitor)；促卵泡激素；促黄体生成激素；促黄体生成激素释放激素；神经生长因子；轴突发生因子(axogenesis factor)-1；脑促尿钠排泄肽；神经胶质衍生的神经营养因子；导蛋白；嗜中性白细胞抑制因子；神经营养因子；神经秩蛋白(neurturin)；甲状旁腺激素；松弛素；促胰液素；生长调节素；胰岛素样生长因子；肾上腺皮质激素；胰高血糖素；胆囊收缩素；胰多肽；胃泌素释放肽；胃泌素抑制肽；促肾上腺皮质激素释放因子；促甲状腺激素；自体毒素(autotaxin)；乳铁蛋白；肌肉生长抑制素(myostatin)；活动依赖性神经保护蛋白(ADNP)、β-分泌酶1(BACE1)、淀粉样前体蛋白(APP)、神经细胞黏着分子(NCAM)、淀粉样蛋白β、tau、渐进性糖化终极产物的受体(RAGE)、α-突触核蛋白、或其激动剂或拮抗剂；受体、受体激动剂；细胞表面抗原；单克隆抗体；多克隆抗体；抗体片段；病毒衍生的疫苗抗原；活化至少一种受体激动剂的杂合多肽或嵌合多肽；及其类似物。
在根据先前具体实施方式中的任一项的缀合物中，生理活性物质同时活化至少两种受体。
在根据先前具体实施方式中的任一项的缀合物中，
毒素选自美登素或其衍生物、奥利斯他汀(auristatin)或其衍生物、倍癌霉素或其衍生物、和吡咯并苯并二氮杂草(pyrrolobenzodiazepine)(PBD)或其衍生物；
胰高血糖素样肽-1(GLP-1)受体激动剂选自天然胰高血糖素样肽-1(GLP-1)、天然毒蜥外泌肽-3、天然毒蜥外泌肽-4、及其类似物；
FGF受体激动剂选自FGF1或其类似物、FGF19或其类似物、FGF21或其类似物、和FGF23或其类似物；
干扰素选自干扰素-α、干扰素-β、和干扰素-γ；
干扰素受体选自干扰素-α受体、干扰素-β受体、干扰素-γ受体、和可溶性I型干扰素受体；
白细胞介素选自白细胞介素-1、白细胞介素-2、白细胞介素-3、白细胞介素-4、白细胞介素-5、白细胞介素-6、白细胞介素-7、白细胞介素-8、白细胞介素-9、白细胞介素-10、白细胞介素-11、白细胞介素-12、白细胞介素-13、白细胞介素-14、白细胞介素-15、白细胞介素-16、白细胞介素-17、白细胞介素-18、白细胞介素-19、白细胞介素-20、白细胞介素-21、白细胞介素-22、白细胞介素-23、白细胞介素-24、白细胞介素-25、白细胞介素-26、白细胞介素-27、白细胞介素-28、白细胞介素-29、和白细胞介素-30；
白细胞介素受体是白细胞介素-1受体或白细胞介素-4受体；
酶选自β-葡糖苷酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、艾杜糖苷酸酶、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、半乳糖-6-硫酸酯酶、酸性α-葡糖苷酶、酸性神经酰胺酶、酸性鞘磷脂酶、半乳糖脑苷脂酶、芳基硫酸酯酶A、芳基硫酸酯酶B、β-氨基己糖苷酶A、β-氨基己糖苷酶B、肝素N-硫酸酯酶、α-D-甘露糖苷酶、β-葡糖醛酸酶、N-乙酰半乳糖胺-6硫酸酯酶、溶酶体酸性脂肪酶、α-N-乙酰葡糖苷酶、葡糖脑苷酯酶、丁酰胆碱酯酶、几丁质酶、谷氨酸脱羧酶、葡糖苷脂酰鞘氨醇酶类似物(imiglucerase)、脂肪酶、尿酸氧化酶、血小板活化因子乙酰水解酶(乙酰基hydrolase)、中性内肽酶、髓过氧化物酶、α-半乳糖苷酶-A、半乳糖苷酶(agalsidase)α、半乳糖苷酶β、α-L-艾杜糖苷酸酶、丁酰胆碱酯酶、几丁质酶、谷氨酸脱羧酶、和葡糖苷脂酰鞘氨醇酶类似物；
白细胞介素结合蛋白是IL-18bp；
细胞因子结合蛋白是肿瘤坏死因子(TNF)结合蛋白；
神经生长因子选自神经生长因子、睫状神经营养因子、轴突发生因子-1(axogenesis factor-1)、脑促尿钠排泄肽、神经胶质衍生的神经营养因子、导蛋白、嗜中性白细胞抑制因子、神经营养因子、和神经秩蛋白；
肌肉生长抑制素受体选自TNFR(P75)、TNFR(P55)、IL-1受体、VEGF受体、和B细胞活化因子受体；
肌肉生长抑制素受体拮抗剂是IL1-Ra；
细胞表面抗原选自CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD11a、CD11b、CD18、CD19、CD20、CD23、CD25、CD33、CD38、CD40、CD45、和CD69；和
抗体片段选自scFv、Fab、Fab′、F(ab′)2、和Fd。
在根据先前具体实施方式中的任一项的缀合物中，生理活性物质是天然毒蜥外泌肽-3或其类似物；天然毒蜥外泌肽-4或其类似物；天然胰岛素或其类似物；天然GLP-1或其类似物；天然GLP-2或其类似物；天然泌酸调节肽或其类似物；天然胰高血糖素或其类似物；天然成纤维细胞生长因子或其类似物；天然生长素释放肽或其类似物；天然降钙素或其类似物；天然粒细胞集落形成刺激因子或其类似物；或与GLP受体、胰高血糖素受体、和GIP受体中的两种或更多种受体结合的物质。
在根据先前具体实施方式中的任一项的缀合物中，生理活性物质是天然胰岛素或胰岛素类似物，所述胰岛素类似物与天然胰岛素相比对胰岛素受体具有降低的结合亲和力。
在根据先前具体实施方式中的任一项的缀合物中，胰岛素类似物是包括A链和B链的双链形式。
在根据先前具体实施方式中的任一项的缀合物中，与天然胰岛素相比，胰岛素类似物对胰岛素受体具有降低的结合亲和力，并包括天然胰岛素A链或B链中的至少一个氨基酸修饰或缺失。
在根据先前具体实施方式中的任一项的缀合物中，胰岛素类似物是其中至少一个氨基酸被不同的氨基酸取代或缺失的胰岛素类似物，所述至少一个氨基酸选自胰岛素B链的第1位氨基酸、第2位氨基酸、第3位氨基酸、第5位氨基酸、第8位氨基酸、第10位氨基酸、第12位氨基酸、第16位氨基酸、第23位氨基酸、第24位氨基酸、第25位氨基酸、第26位氨基酸、第27位氨基酸、第28位氨基酸、第29位氨基酸、和第30位氨基酸，和胰岛素A链的第1位氨基酸、第2位氨基酸、第5位氨基酸、第8位氨基酸、第10位氨基酸、第12位氨基酸、第14位氨基酸、第16位氨基酸、第17位氨基酸、第18位氨基酸、第19位氨基酸、和第21位氨基酸。
在根据先前具体实施方式中的任一项的缀合物中，胰岛素类似物是其中至少一个氨基酸被不同的氨基酸取代的胰岛素类似物，所述至少一个氨基酸选自天然胰岛素B链的第8位氨基酸、第23位氨基酸、第24位氨基酸、和第25位氨基酸，和天然胰岛素A链的第1位氨基酸、第2位氨基酸、第14位氨基酸、和第19位氨基酸。
在根据先前具体实施方式中的任一项的缀合物中，取代的(substituting)不同的氨基酸选自丙氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、异亮氨酸、缬氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、赖氨酸、组氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、和天冬氨酸。
在根据先前具体实施方式中的任一项的缀合物中，由于天然胰岛素的A链或B链的至少一个氨基酸的缺失，胰岛素类似物对胰岛素受体具有降低的结合亲和力。
在根据先前具体实施方式中的任一项的缀合物中，胰岛素类似物包括由以下通式1表示的SEQ ID NO:3的A链和由以下通式2表示的SEQ ID NO:4的B链(条件是，在以上胰岛素类似物中，排除其中A链与SEQ ID NO:1重叠且同时B链与SEQ ID NO:2重叠的那些胰岛素类似物)：
[通式1]
Xaa1-Xaa2-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Xaa14-Gln-Leu-Glu-Asn-Xaa19-Cys-Asn(SEQ ID NO:3)
其中，在以上通式1中，
Xaa1是甘氨酸或丙氨酸；
Xaa2是异亮氨酸或丙氨酸；
Xaa14是酪氨酸、谷氨酸、或天冬酰胺；和
Xaa19是酪氨酸或丙氨酸；和
[通式2]
Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Xaa8-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Xaa23-Xaa24-Xaa25-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr(SEQ ID NO:4)
在以上通式2中，
Xaa8是甘氨酸或丙氨酸；
Xaa23是甘氨酸或丙氨酸；
Xaa24是苯丙氨酸或丙氨酸；和
Xaa25是苯丙氨酸或丙氨酸。
在根据先前具体实施方式中的任一项的缀合物中，
胰岛素类似物的特征在于其包括：
(i)以上通式1的A链，其中Xaa1是丙氨酸、Xaa2是异亮氨酸、Xaa14是酪氨酸、和Xaa19是酪氨酸，和通式2的B链，其中Xaa8是甘氨酸、Xaa23是甘氨酸、Xaa24是苯丙氨酸、和Xaa25是苯丙氨酸；
(ii)通式1的A链，其中Xaa1是甘氨酸、Xaa2是丙氨酸、Xaa14是酪氨酸、和Xaa19是酪氨酸，和通式2的B链，其中Xaa8是甘氨酸、Xaa23是甘氨酸、Xaa24是苯丙氨酸、和Xaa25是苯丙氨酸；
(iii)通式1的A链，其中Xaa1是甘氨酸、Xaa2是异亮氨酸、Xaa14是谷氨酸或天冬酰胺、和Xaa19是酪氨酸，和通式2的B链，其中Xaa8是甘氨酸、Xaa23是甘氨酸、Xaa24是苯丙氨酸、和Xaa25是苯丙氨酸；
(iv)通式1的A链，其中Xaa1是甘氨酸、Xaa2是异亮氨酸、Xaa14是酪氨酸、和Xaa19是丙氨酸，和通式2的B链，其中Xaa8是甘氨酸、Xaa23是甘氨酸、Xaa24是苯丙氨酸、和Xaa25是苯丙氨酸；
(v)通式1的A链，其中Xaa1是甘氨酸、Xaa2是异亮氨酸、Xaa14是酪氨酸、和Xaa19是酪氨酸，和通式2的B链，其中Xaa8是丙氨酸、Xaa23是甘氨酸、Xaa24是苯丙氨酸、和Xaa25是苯丙氨酸；
(vi)通式1的A链，其中Xaa1是甘氨酸、Xaa2是异亮氨酸、Xaa14是酪氨酸、和Xaa19是酪氨酸，和通式2的B链，其中Xaa8是甘氨酸、Xaa23是丙氨酸、Xaa24是苯丙氨酸、和Xaa25是苯丙氨酸；
(vii)通式1的A链，其中Xaa1是甘氨酸、Xaa2是异亮氨酸、Xaa14是酪氨酸、和Xaa19是酪氨酸，和通式2的B链，其中Xaa8是甘氨酸、Xaa23是甘氨酸、Xaa24是丙氨酸、和Xaa25是苯丙氨酸；和
(viii)通式1的A链，其中Xaa1是甘氨酸、Xaa2是异亮氨酸、Xaa14是酪氨酸、和Xaa19是酪氨酸，和通式2的B链，其中Xaa8是甘氨酸、Xaa23是甘氨酸、Xaa24是苯丙氨酸、和Xaa25是丙氨酸。
在根据先前具体实施方式中的任一项的缀合物中，胰岛素类似物的特征在于其包括由以下通式3表示的SEQ ID NO:5的A链和由以下通式4表示的SEQ ID NO:6的B链(条件是，在以上胰岛素类似物中，排除其中A链与SEQ ID NO:1重叠且同时B链与SEQ ID NO:2重叠的那些胰岛素类似物)：
[通式3]
Xaa1-Ile-Val-Glu-Xaa5-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Xaa12-Leu-Xaa14-Gln-Xaa16-Glu-Asn-Xaa19-Cys-Xaa21(SEQ ID NO:5)
其中，在以上通式3中，
Xaa1是丙氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、组氨酸、谷氨酸、或天冬酰胺，
Xaa5是丙氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、组氨酸、或天冬酰胺，
Xaa12是丙氨酸、丝氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、组氨酸、或天冬酰胺，
Xaa14是丙氨酸、酪氨酸、谷氨酸、组氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、或天冬酰胺，
Xaa16是丙氨酸、亮氨酸、酪氨酸、组氨酸、谷氨酸、或天冬酰胺，
Xaa19是丙氨酸、酪氨酸、丝氨酸、谷氨酸、组氨酸、苏氨酸、或天冬酰胺，和
Xaa21是天冬酰胺、甘氨酸、组氨酸、或丙氨酸；和
[通式4]
Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Xaa16-Leu-Val-Cys-Gl y-Glu-Arg-Gly-Phe-Xaa25-Tyr-Xaa27-Xaa28-Lys-Thr(SEQ ID NO:6)
在以上通式4中，
Xaa16是酪氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸、或天冬氨酸、或不存在，
Xaa25是苯丙氨酸、天冬氨酸、或谷氨酸、或不存在，
Xaa27是苏氨酸或不存在，和
Xaa28是脯氨酸、谷氨酸、或天冬氨酸、或不存在。
在根据先前具体实施方式中的任一项的缀合物中，胰岛素类似物的特征在于：
在以上通式3中，Xaa1是甘氨酸、Xaa5是谷氨酰胺、Xaa12是丝氨酸、Xaa14是谷氨酸或天冬酰胺、Xaa16是亮氨酸、Xaa19是酪氨酸、和Xaa21是天冬酰胺；和
在以上通式4中，Xaa16是酪氨酸、Xaa25是苯丙氨酸或不存在、Xaa27是苏氨酸、Xaa28是脯氨酸、谷氨酸、或天冬氨酸、或不存在，但胰岛素类似物不特别限制于此。
在根据先前具体实施方式中的任一项的缀合物中，胰岛素类似物的特征在于：
(1)在SEQ ID NO:5的胰岛素的A链中，Xaa1是甘氨酸、Xaa5是谷氨酰胺、Xaa12是丝氨酸、Xaa14是谷氨酸、Xaa16是亮氨酸、Xaa19是酪氨酸、和Xaa21是天冬酰胺；和
在SEQ ID NO:6的胰岛素的B链中，Xaa16是酪氨酸、Xaa25是苯丙氨酸、Xaa27是苏氨酸、Xaa28是脯氨酸、谷氨酸、或天冬氨酸、或不存在；
(2)在SEQ ID NO:5的胰岛素的A链中，Xaa1是甘氨酸、Xaa5是谷氨酰胺、Xaa12是丝氨酸、Xaa14是天冬酰胺、Xaa16是亮氨酸、Xaa19是酪氨酸、和Xaa21是天冬酰胺；和
在SEQ ID NO:6的胰岛素的B链中，Xaa16是酪氨酸、Xaa25是苯丙氨酸、Xaa27是苏氨酸、Xaa28是脯氨酸、谷氨酸、或天冬氨酸、或不存在；
(3)在SEQ ID NO:5的胰岛素的A链中，Xaa1是甘氨酸、Xaa5是谷氨酰胺、Xaa12是丝氨酸、Xaa14是谷氨酸、Xaa16是亮氨酸、Xaa19是酪氨酸、和Xaa21是天冬酰胺；和，
在SEQ ID NO:6的胰岛素的B链中，Xaa16是酪氨酸、Xaa25不存在、Xaa27是苏氨酸、Xaa28是脯氨酸、谷氨酸、或天冬氨酸、或不存在；或
(4)在SEQ ID NO:5的胰岛素的A链中，Xaa1是甘氨酸、Xaa5是谷氨酰胺、Xaa12是丝氨酸、Xaa14是丙氨酸、Xaa16是亮氨酸、Xaa19是酪氨酸、Xaa21是天冬酰胺；和，在SEQ IDNO:6的胰岛素的B链中，Xaa16是谷氨酸、Xaa25不存在、Xaa27是苏氨酸、Xaa28是脯氨酸、谷氨酸、或天冬氨酸、或不存在。
在根据先前具体实施方式中的任一项的缀合物中，胰岛素类似物的特征在于：
(1)在以上通式3中，Xaa1是甘氨酸、Xaa5是谷氨酰胺、Xaa12是丝氨酸、Xaa14是谷氨酸、Xaa16是亮氨酸、Xaa19是酪氨酸、和Xaa21是天冬酰胺；和
在以上通式4中，Xaa16是酪氨酸、Xaa25不存在、Xaa27是苏氨酸、和Xaa28是脯氨酸；
(2)在以上通式3中，Xaa1是甘氨酸、Xaa5是谷氨酰胺、Xaa12是丝氨酸、Xaa14是丙氨酸、Xaa16是亮氨酸、Xaa19是酪氨酸、和Xaa21是天冬酰胺；和
在以上通式4中，Xaa16是谷氨酸、Xaa25不存在、Xaa27是苏氨酸、和Xaa28是脯氨酸；
(3)在以上通式3中，Xaa1是甘氨酸、Xaa5是谷氨酰胺、Xaa12是丝氨酸、Xaa14是组氨酸、Xaa16是亮氨酸、Xaa19是酪氨酸、和Xaa21是天冬酰胺；和
在以上通式4中，Xaa16是酪氨酸、Xaa25是苯丙氨酸、Xaa27是苏氨酸、和Xaa28是脯氨酸；
(4)在以上通式3中，Xaa1是甘氨酸、Xaa5是谷氨酰胺、Xaa12是丝氨酸、Xaa14是赖氨酸、Xaa16是亮氨酸、Xaa19是酪氨酸、和Xaa21是天冬酰胺；和
在以上通式4中、Xaa16是酪氨酸、Xaa25是苯丙氨酸、Xaa27是苏氨酸、和Xaa28是脯氨酸；
(5)在以上通式3中，Xaa1是甘氨酸、Xaa5是谷氨酰胺、Xaa12是丝氨酸、Xaa14是酪氨酸、Xaa16是亮氨酸、Xaa19是谷氨酸、和Xaa21是天冬酰胺；和
在以上通式4中，Xaa16是酪氨酸、Xaa25是苯丙氨酸、Xaa27是苏氨酸、和Xaa28是脯氨酸；
(6)在以上通式3中，Xaa1是甘氨酸、Xaa5是谷氨酰胺、Xaa12是丝氨酸、Xaa14是酪氨酸、Xaa16是亮氨酸、Xaa19是丝氨酸、和Xaa21是天冬酰胺；和
在以上通式4中，Xaa16是酪氨酸、Xaa25是苯丙氨酸、Xaa27是苏氨酸、和Xaa28是脯氨酸；
(7)在以上通式3中，Xaa1是甘氨酸、Xaa5是谷氨酰胺、Xaa12是丝氨酸、Xaa14是酪氨酸、Xaa16是亮氨酸、Xaa19是苏氨酸、和Xaa21是天冬酰胺；和
在以上通式4中，Xaa16是酪氨酸、Xaa25是苯丙氨酸、Xaa27是苏氨酸、和Xaa28是脯氨酸；
(8)在以上通式3中，Xaa1是甘氨酸、Xaa5是谷氨酰胺、Xaa12是丝氨酸、Xaa14是酪氨酸、Xaa16是亮氨酸、Xaa19是酪氨酸、和Xaa21是天冬酰胺；和
在以上通式4中，Xaa16是谷氨酸、Xaa25是苯丙氨酸、Xaa27是苏氨酸、和Xaa28是脯氨酸；
(9)在以上通式3中，Xaa1是甘氨酸、Xaa5是谷氨酰胺、Xaa12是丝氨酸、Xaa14是酪氨酸、Xaa16是亮氨酸、Xaa19是酪氨酸、和Xaa21是天冬酰胺；和
在以上通式4中，Xaa16是丝氨酸、Xaa25是苯丙氨酸、Xaa27是苏氨酸、和Xaa28是脯氨酸；
(10)在以上通式3中，Xaa1是甘氨酸、Xaa5是谷氨酰胺、Xaa12是丝氨酸、Xaa14是酪氨酸、Xaa16是亮氨酸、Xaa19是酪氨酸、和Xaa21是天冬酰胺；和
在以上通式4中，Xaa16是苏氨酸、Xaa25是苯丙氨酸、Xaa27是苏氨酸、和Xaa28是脯氨酸；
(11)在以上通式3中，Xaa1是甘氨酸、Xaa5是谷氨酰胺、Xaa12是丝氨酸、Xaa14是丙氨酸、Xaa16是亮氨酸、Xaa19是酪氨酸、和Xaa21是天冬酰胺；和
在以上通式4中，Xaa16是酪氨酸、Xaa25是苯丙氨酸、Xaa27是苏氨酸、和Xaa28是脯氨酸；
(12)在以上通式3中，Xaa1是甘氨酸、Xaa5是谷氨酰胺、Xaa12是丝氨酸、Xaa14是天冬氨酸、Xaa16是亮氨酸、Xaa19是酪氨酸、和Xaa21是天冬酰胺；和
在以上通式4中，Xaa16是酪氨酸、Xaa25是苯丙氨酸、Xaa27是苏氨酸、和Xaa28是脯氨酸；
(13)在以上通式3中，Xaa1是甘氨酸、Xaa5是谷氨酰胺、Xaa12是丝氨酸、Xaa14是酪氨酸、Xaa16是亮氨酸、Xaa19是酪氨酸、和Xaa21是天冬酰胺；和
在以上通式4中，Xaa16是天冬氨酸、Xaa25是苯丙氨酸、Xaa27是苏氨酸、和Xaa28是脯氨酸；
(14)在以上通式3中，Xaa1是甘氨酸、Xaa5是谷氨酰胺、Xaa12是丝氨酸、Xaa14是酪氨酸、Xaa16是亮氨酸、Xaa19是酪氨酸、和Xaa21是天冬酰胺；和
在以上通式4中，Xaa16是酪氨酸、Xaa25是天冬氨酸、Xaa27是苏氨酸、和Xaa28是脯氨酸；或
(15)在以上通式3中，Xaa1是甘氨酸、Xaa5是谷氨酰胺、Xaa12是丝氨酸、Xaa14是酪氨酸、Xaa16是亮氨酸、Xaa19是酪氨酸、和Xaa21是天冬酰胺；和
在以上通式4中，Xaa16是酪氨酸、Xaa25是谷氨酸、Xaa27是苏氨酸、和Xaa28是脯氨酸。
在根据先前具体实施方式中的任一项的缀合物中，缀合物由以下式2表示：
[式2]
X-L-F
其中在以上式2中，
X是天然胰岛素或胰岛素类似物，所述胰岛素类似物与天然胰岛素相比对胰岛素受体具有降低的结合亲和力；
L，作为接头，是尺寸为大于0kDa至小于3.4kDa的聚乙二醇；和
F是能够增加X的体内半衰期的物质。
在根据先前具体实施方式中的任一项的缀合物中，由以上式2表示的缀合物具有降低的受体介导的清除(RMC)。
在根据先前具体实施方式中的任一项的缀合物中，在以上式2中，L被连接到X(其是天然胰岛素或其类似物)的β链的氨基端区。
在根据先前具体实施方式中的任一项的缀合物中，X和F通过共价化学键、非共价化学键、或其组合通过L彼此连接。
在根据先前具体实施方式中的任一项的缀合物中，能够增加生理活性物质的体内半衰期的物质是生物相容性物质。
在根据先前具体实施方式中的任一项的缀合物中，F选自聚合物、脂肪酸、胆固醇、白蛋白及其片段、白蛋白结合物质、特定氨基酸序列的重复单元的聚合物、抗体、抗体片段、FcRn结合物质、体内结缔组织、核苷酸、纤连蛋白、转铁蛋白、糖、肝素、和弹性蛋白。
在根据先前具体实施方式中的任一项的缀合物中，聚合物选自聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇-丙二醇共聚物、聚氧乙烯化多元醇(polyoxyethylated polyol)、聚乙烯醇、多糖、葡聚糖、聚乙烯基乙醚、生物可降解的聚合物、脂质聚合物、几丁质、透明质酸、寡核苷酸、及其组合。
在根据先前具体实施方式中的任一项的缀合物中，FcRn结合物质是包括免疫球蛋白Fc区的多肽。
在根据先前具体实施方式中的任一项的缀合物中，F是IgG Fc区。
在根据先前具体实施方式中的任一项的缀合物中，在以上式1或式2中，F是IgG Fc区，且L被连接到F的N端区。
本发明的另一方面提供了用于制备缀合物的方法。
在具体的实施方式中，本发明涉及用于制备缀合物的方法，其包括：
(a)使具有大于0kDa至小于3.4kDa尺寸和至少两个末端官能团的聚乙二醇与生理活性物质或能够增加生理活性物质的体内半衰期的物质中的任一种反应，以制备聚乙二醇，其共价地连接到生理活性物质或能够增加生理活性物质的体内半衰期的物质中的一种，且其具有至少一个末端官能团；和
(b)使步骤(a)中制备的聚乙二醇(其共价地连接到生理活性物质或能够增加生理活性物质的体内半衰期的物质中的一种且其具有至少一个末端官能团)与生理活性物质或能够增加生理活性物质的体内半衰期的物质中的另一个反应以制备缀合物，其中生理活性物质和能够增加生理活性物质的体内半衰期的物质通过尺寸为大于0kDa至小于3.4kDa的聚乙二醇共价地连接。
在根据先前具体实施方式的方法中，生理活性物质具有通过与聚乙二醇的末端官能团反应而形成共价键的官能团，且官能团是胺基或硫醇基。
在根据先前具体实施方式中的任一项的方法中，能够增加生理活性物质的体内半衰期的物质具有通过与聚乙二醇的末端官能团反应而形成共价键的官能团，且官能团是胺基或硫醇基。
在根据先前具体实施方式中的任一项的方法中，聚乙二醇的末端官能团是胺反应性官能团或硫醇反应性官能团。
在根据先前具体实施方式中的任一项的方法中，聚乙二醇的末端官能团选自醛、马来酰亚胺、琥珀酰亚胺、乙烯砜、硫醇、C6-20芳基二硫化物、C5-20杂芳基二硫化物、和卤化乙酰胺。
在根据先前具体实施方式中的任一项的方法中，聚乙二醇的末端官能团选自醛、马来酰亚胺、琥珀酰亚胺、乙烯砜、硫醇、邻吡啶基二硫化物、和碘乙酰胺。
在根据先前具体实施方式中的任一项的方法中，琥珀酰亚胺是琥珀酰亚胺基(succinimidyl)戊酸酯、琥珀酰亚胺基甲基丁酸酯、琥珀酰亚胺基甲基丙酸酯、琥珀酰亚胺基丁酸酯、琥珀酰亚胺基丙酸酯、N-羟基琥珀酰亚胺、琥珀酰亚胺基羧甲基、或琥珀酰亚胺基碳酸酯。
本发明的又一方面涉及含有缀合物的具有增加的体内持续性和稳定性的长效胰岛素制剂。
本发明的又一方面涉及含有缀合物的用于预防或治疗糖尿病的制剂。
本发明的又一方面涉及用于治疗胰岛素相关疾病的方法，所述方法包括向有此需要的对象给予由式2表示的缀合物或含有缀合物的组合物或制剂。
[有利作用]
根据本发明的生理活性物质的缀合物可有效用于对应生理活性是必要的领域。
[附图说明]
图1显示了关于胰岛素–3.4kDa PEG–免疫球蛋白Fc片段缀合物的SDS-PAGE的结果。
图2显示了关于胰岛素–1kDa PEG–免疫球蛋白Fc片段缀合物的SDS-PAGE的结果。
图3显示了关于胰岛素–1、2、2.5、3、3.4kDa PEG–免疫球蛋白Fc片段缀合物中的每一个的尺寸排阻高效液相色谱(SE-HPLC)的结果。
图4显示了关于胰岛素–1、2、2.5、3、3.4kDa PEG–免疫球蛋白Fc片段缀合物中的每一个的反相高效液相色谱(RP-HPLC)的结果。
图5显示了关于胰岛素–1、2、2.5、3、3.4kDa PEG–免疫球蛋白Fc片段缀合物的色谱重叠(chromatography overlay)的图。
图6显示了关于根据PEG接头长度的长效胰岛素缀合物的功效持续时间的比较结果。
[最优模式]
在下文中，将更详细地描述本发明。
同时，本文公开的每个说明和示例性实施方式可应用于其各自的其它说明和示例性实施方式。即，本文公开的各种因素的所有组合都属于本发明的范围。另外，本发明的范围不应被下文提供的具体公开内容限制。另外，本领域普通技术人员仅使用常规实验便能够识别和确认关于本发明中描述的本发明的具体实施方式的多个等同物。另外，旨在将这些等同物包括在本发明中。
在整个说明书中，使用对于氨基酸的常规的单字母或三字母代码。另外，本文提及的氨基酸根据IUPAC-IUB命名规则被缩写。
本发明的方面提供了用于延长生理活性物质的体内半衰期目的的生理活性物质的缀合物。
具体地，本发明提供了生理活性物质的缀合物，其中生理活性物质和能够增加生理活性物质的体内半衰期的物质通过聚乙二醇连接，且聚乙二醇具有大于0kDa至小于3.4kDa的尺寸。
在更具体的实施方式中，本发明提供了具有以下式1的缀合物：
[式1]
X-L-F
其中
X是生理活性物质；
L，作为接头，是尺寸为大于0kDa至小于3.4kDa的聚乙二醇；和
F是能够增加生理活性物质的体内半衰期的物质。
如本文所用，术语“由以上式1表示的缀合物”与“长效缀合物”互换使用。
如本文所用，术语“长效缀合物”指代生理活性物质，其通过接头与能够延长生理活性物质的体内半衰期的物质(例如，生物相容性物质)连接。
与仅与缀合物的不同之处在于L是尺寸为3.4kDa的聚乙二醇的缀合物相比，缀合物可表现出增加的体内半衰期，但缀合物不特别限制于此。
更具体地，与具有与缀合物相同的X和F但具有不同的L(其是尺寸为3.4kDa的聚乙二醇)的缀合物相比，缀合物对生理活性物质的受体可表现出降低的结合亲和力，并且由于受体介导的清除(RMC)的减弱，可表现出增加的血液半衰期，但缀合物不特别限制于此。
另外，除了以上作用或其独立地作用外(further to the above effects orindependently thereof)，即使由于连接在X和F之间并具有小于3.4kDa的尺寸的聚乙二醇而使X和F紧密相邻呈现，与具有与缀合物相同的X和F但具有不同的L(其是尺寸为3.4kDa的聚乙二醇)的缀合物相比，缀合物可表现出与X本身的生理活性或F本身的活性基本相同的活性或更高的活性但缀合物不特别限制于此。
在本发明中，L(作为接头和构成缀合物的部分)指代具有大于0kDa至小于3.4kDa尺寸的聚乙二醇，且其包括具有以下尺寸的所有聚乙二醇：大于0kDa至小于3.4kDa、大于0kDa至3.3kDa以下、大于0kDa至3.2kDa以下、大于0kDa至3.1kDa以下、大于0kDa至3.0kDa以下、大于0kDa至2.9kDa以下、大于0kDa至2.8kDa以下、大于0kDa至2.7kDa以下、大于0kDa至2.6kDa以下、大于0kDa至2.5kDa以下、大于0kDa至2.4kDa以下、大于0kDa至2.3kDa以下、大于0kDa至2.2kDa以下、大于0kDa至2.1kDa以下、大于0kDa至2.0kDa以下、大于0kDa至1.9kDa以下、大于0kDa至1.8kDa以下、大于0kDa至1.7kDa以下、大于0kDa至1.6kDa以下、大于0kDa至1.5kDa以下、大于0kDa至1.4kDa以下、大于0kDa至1.3kDa以下、大于0kDa至1.2kDa以下、大于0kDa至1.1kDa以下、大于0kDa至1.0kDa以下、0.5kDa以上至小于3.4kDa、0.5kDa以上至3.3kDa以下、0.5kDa以上至3.2kDa以下、0.5kDa以上至3.1kDa以下、0.5kDa以上至3kDa以下、0.5kDa以上至2.9kDa以下、0.5kDa以上至2.8kDa以下、0.5kDa以上至2.7kDa以下、0.5kDa以上至2.6kDa以下、0.5kDa以上至2.5kDa以下、0.5kDa以上至2.4kDa以下、0.5kDa以上至2.3kDa以下、0.5kDa以上至2.2kDa以下、0.5kDa以上至2.1kDa以下、0.5kDa以上至2kDa以下、0.5kDa以上至1.9kDa以下、0.5kDa以上至1.8kDa以下、0.5kDa以上至1.7kDa以下、0.5kDa以上至1.6kDa以下、0.5kDa以上至1.5kDa以下、0.5kDa以上至1.4kDa以下、0.5kDa以上至1.3kDa以下、0.5kDa以上至1.2kDa以下、0.5kDa以上至1.1kDa以下、0.5kDa以上至1kDa以下、大于0.5kDa至小于3.4kDa、大于0.5kDa至3.3kDa以下、大于0.5kDa至3.2kDa以下、大于0.5kDa至3.1kDa以下、大于0.5kDa至3kDa以下、大于0.5kDa至2.9kDa以下、大于0.5kDa至2.8kDa以下、大于0.5kDa至2.7kDa以下、大于0.5kDa至2.6kDa以下、大于0.5kDa至2.5kDa以下、大于0.5kDa至2.4kDa以下、大于0.5kDa至2.3kDa以下、大于0.5kDa至2.2kDa以下、大于0.5kDa至2.1kDa以下、大于0.5kDa至2kDa以下、大于0.5kDa至1.9kDa以下、大于0.5kDa至1.8kDa以下、大于0.5kDa至1.7kDa以下、大于0.5kDa至1.6kDa以下、大于0.5kDa至1.5kDa以下、大于0.5kDa至1.4kDa以下、大于0.5kDa至1.3kDa以下、大于0.5kDa至1.2kDa以下、大于0.5kDa至1.1kDa以下、大于0.5kDa至1.0kDa以下、0.75kDa以上至小于3.4kDa、0.75kDa以上至3.3kDa以下、0.75kDa以上至3.2kDa以下、0.75kDa以上至3.1kDa以下、0.75kDa以上至3kDa以下、0.75kDa以上至2.9kDa以下、0.75kDa以上至2.8kDa以下、0.75kDa以上至2.7kDa以下、0.75kDa以上至2.6kDa以下、0.75kDa以上至2.5kDa以下、0.75kDa以上至2.4kDa以下、0.75kDa以上至2.3kDa以下、0.75kDa以上至2.2kDa以下、0.75kDa以上至2.1kDa以下、0.75kDa以上至2kDa以下、0.75kDa以上至1.9kDa以下、0.75kDa以上至1.8kDa以下、0.75kDa以上至1.7kDa以下、0.75kDa以上至1.6kDa以下、0.75kDa以上至1.5kDa以下、0.75kDa以上至1.4kDa以下、0.75kDa以上至1.3kDa以下、0.75kDa以上至1.2kDa以下、0.75kDa以上至1.1kDa以下、0.75kDa以上至1kDa以下、大于0.75kDa至2kDa以下、大于0.75kDa至小于2kDa、大于0.75kDa至1.5kDa以下、约1.0kDa、或1.0kDa，但聚乙二醇的尺寸不限于此。
如本文所用，术语“约”指代包括±0.5、±0.4、±0.3、±0.2、±0.1等全部的范围，并包括与该值随后的那些值等同或类似的所有值，但范围不限于此。
如本文所用，术语“X”指代是构成缀合物的部分的生理活性物质。生理活性物质指代具有任意体内生理活性的物质。
生理活性物质可以是毒素或生理活性多肽，并可包括用于治疗或预防人类疾病的各种类型的生理活性多肽，如细胞因子、白细胞介素、白细胞介素结合蛋白、酶、抗体、生长因子、转录调控因子、血液因子、疫苗、结构蛋白、配体蛋白或受体、细胞表面抗原、受体拮抗剂、在小肠和胰腺中释放的对糖尿病和肥胖的治疗具有治疗作用的生理活性肽、G蛋白偶联受体(GPCR)激动剂或拮抗剂等、或其类似物，但生理活性物质不限于此。
如本文所用，术语“X的类似物”指代能够与X表现出相同类型活性的物质，且其包括所有X的激动剂、X的衍生物、X的片段、X的变体等。
这种X可以是天然生理活性多肽。
具体地，“天然生理活性多肽的衍生物”包括与天然生理活性多肽的氨基酸序列相比具有至少一个氨基酸序列差异的肽；通过修饰天然生理活性多肽的序列制备的修饰肽；和具有与天然生理活性多肽相同类型的活性的模拟物(mimetics)。
具体地，可通过关于天然生理活性多肽的部分氨基酸利用选自取代、添加、缺失、修饰及其组合中的任一种方法制备天然生理活性多肽的衍生物，且被操作以对通过这种方法制备的至少两种相互不同的受体具有结合亲和力的人工肽也属于以上衍生物的范围。
另外，对天然生理活性多肽的衍生物制剂的修饰包括使用以下中的全部：L型或D型氨基酸、和/或非天然氨基酸的修饰；和/或天然序列的修饰(例如，侧链中官能团(一种或多种)的修饰、分子内共价键合(intramolecular covalent bonding)(例如，侧链间的成环作用、甲基化、酰化、泛素化、磷酸化、氨基-己烷化(amino-hexanation)、生物素化等))。
另外，天然生理活性多肽的衍生物还包括其中一个或多个氨基酸被添加到天然生理活性多肽的氨基和/或羧基端的那些衍生物。
作为待取代或添加的氨基酸，可使用非典型的或非天然存在的氨基酸以及在人类蛋白质中常规观察到的20种氨基酸。
如本文所用，术语“天然生理活性多肽的片段或天然生理活性多肽的衍生物的片段”指代其中从天然生理活性多肽或天然生理活性多肽的衍生物的氨基或羧基端缺失一个或多个氨基酸的天然生理活性多肽或天然生理活性多肽的衍生物的形式。
生理活性物质可选自毒素；胰高血糖素样肽-1(GLP-1)受体激动剂；胰高血糖素受体激动剂；肠抑胃肽(GIP)受体激动剂；成纤维细胞生长因子(FGF)受体激动剂；胆囊收缩素受体激动剂；胃泌素受体激动剂(胃泌素)；黑皮质素受体激动剂；与GLP受体、胰高血糖素受体、和GIP受体中的两种或更多种受体结合的物质；生长抑素；肽YY(PYY)；神经肽Y(NPY)；泌酸调节肽；成纤维细胞生长因子(FGF)；缓激肽；麝香蛸毒肽；催产素；血管升压素；舍莫瑞林；催乳素释放肽；食欲肽；甲状腺释放肽；钙调蛋白；促胃动素；血管活性肠肽；心房钠尿肽(ANP)；C型纳尿肽(CNP)；神经激肽A；神经调节肽；肾素；内皮素；角蝰毒素肽；carsomorphin肽；皮啡肽；强啡肽；内啡肽；脑啡肽；肿瘤坏死因子受体；尿激酶受体；促胸腺生成素；胸腺肽；胸腺喷丁；胸腺素；胸腺体液因子；肾上腺髓质素；抑咽侧体神经肽；淀粉样β蛋白片段；抗菌肽；抗氧化肽；蛙皮素；骨钙素；CART肽；E选择蛋白；细胞间粘附分子1(ICAM-1)；血管细胞粘附分子1(VCAM-1)；leucokine；三环-5；层粘连蛋白；抑制素；甘丙肽；纤连蛋白；胰抑制素；恩夫韦肽；胰高血糖素样肽；G蛋白偶联受体；红细胞生成性生长因子；白细胞生成素；支链淀粉；人生长激素；生长激素释放激素；生长激素释放肽；干扰素；干扰素受体；集落刺激因子；白细胞介素；白细胞介素受体；酶；白细胞介素结合蛋白；细胞因子结合蛋白；巨噬细胞活化因子；巨噬细胞肽；B细胞因子；T细胞因子；蛋白A；变态反应抑制因子；坏死糖蛋白；免疫毒素；淋巴细胞毒素；肿瘤坏死因子；肿瘤抑制因子；转化生长因子；α-1抗胰蛋白酶；白蛋白；α-乳清蛋白；载脂蛋白-E；促红细胞生成素；高糖基化促红细胞生成素；血管生成素；血红蛋白；凝血酶；凝血酶受体活化肽；血栓调节蛋白；血液因子VII(凝血因子VII)；血液因子VIIa(凝血因子VIIa)；血液因子VIII(凝血因子VIII)；血液因子IX(凝血因子IX)；血液因子XIII(凝血因子XIII)；纤溶酶原活化因子；纤维蛋白结合肽；尿激酶；链激酶；水蛭素；蛋白C；C-反应蛋白；肾素抑制剂；胶原蛋白酶抑制剂；超氧化物歧化酶；瘦蛋白；血小板衍生生长因子；上皮生长因子；表皮生长因子；制管张素；血管紧张素；骨形态发生生长因子；骨形态发生蛋白；降钙素；胰岛素；心钠素；软骨诱导因子；依降钙素；结缔组织活化因子；组织因子途径抑制剂；促卵泡激素；促黄体生成激素；促黄体生成激素释放激素；神经生长因子；轴突发生因子-1；脑促尿钠排泄肽；神经胶质衍生的神经营养因子；导蛋白；嗜中性白细胞抑制因子；神经营养因子；神经秩蛋白；甲状旁腺激素；松弛素；促胰液素；生长调节素；胰岛素样生长因子；肾上腺皮质激素；胰高血糖素；胆囊收缩素；胰多肽；胃泌素释放肽；胃泌素抑制肽；促肾上腺皮质激素释放因子；促甲状腺激素；自体毒素；乳铁蛋白；肌肉生长抑制素；活动依赖性神经保护蛋白(ADNP)、β-分泌酶1(BACE1)、淀粉样前体蛋白(APP)、神经细胞黏着分子(NCAM)、淀粉样蛋白β、tau、渐进性糖化终极产物的受体(RAGE)、α-突触核蛋白、或其激动剂或拮抗剂；受体、受体激动剂；细胞表面抗原；单克隆抗体；多克隆抗体；抗体片段；病毒衍生的疫苗抗原；活化至少一种受体激动剂的杂合多肽或嵌合多肽；及其类似物。
另外，毒素可选自美登素或其衍生物、奥利斯他汀或其衍生物、倍癌霉素或其衍生物、和吡咯并苯并二氮杂草(PBD)或其衍生物；
胰高血糖素样肽-1(GLP-1)受体激动剂可选自天然胰高血糖素样肽-1(GLP-1)、天然GLP-2、天然毒蜥外泌肽-3、天然毒蜥外泌肽-4、及其类似物；
FGF受体激动剂可选自FGF1或其类似物、FGF19或其类似物、FGF21或其类似物、和FGF23或其类似物；
干扰素可选自干扰素-α、干扰素-β、和干扰素-γ；
干扰素受体可选自干扰素-α受体、干扰素-β受体、干扰素-γ受体、和可溶性I型干扰素受体；
白细胞介素选自白细胞介素-1、白细胞介素-2、白细胞介素-3、白细胞介素-4、白细胞介素-5、白细胞介素-6、白细胞介素-7、白细胞介素-8、白细胞介素-9、白细胞介素-10、白细胞介素-11、白细胞介素-12、白细胞介素-13、白细胞介素-14、白细胞介素-15、白细胞介素-16、白细胞介素-17、白细胞介素-18、白细胞介素-19、白细胞介素-20、白细胞介素-21、白细胞介素-22、白细胞介素-23、白细胞介素-24、白细胞介素-25、白细胞介素-26、白细胞介素-27、白细胞介素-28、白细胞介素-29、和白细胞介素-30；
白细胞介素受体可以是白细胞介素-1受体或白细胞介素-4受体；
酶可选自β-葡糖苷酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、艾杜糖苷酸酶、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、半乳糖-6-硫酸酯酶、酸性α-葡糖苷酶、酸性神经酰胺酶、酸性鞘磷脂酶、半乳糖脑苷脂酶、芳基硫酸酯酶A、芳基硫酸酯酶B、β-氨基己糖苷酶A、β-氨基己糖苷酶B、肝素N-硫酸酯酶、α-D-甘露糖苷酶、β-葡糖醛酸酶、N-乙酰半乳糖胺-6硫酸酯酶、溶酶体酸性脂肪酶、α-N-乙酰葡糖苷酶、葡糖脑苷酯酶、丁酰胆碱酯酶、几丁质酶、谷氨酸脱羧酶、葡糖苷脂酰鞘氨醇酶类似物、脂肪酶、尿酸氧化酶、血小板活化因子乙酰水解酶、中性内肽酶、髓过氧化物酶、α-半乳糖苷酶-A、半乳糖苷酶α、半乳糖苷酶β、α-L-艾杜糖苷酸酶、丁酰胆碱酯酶、几丁质酶、谷氨酸脱羧酶、和葡糖苷脂酰鞘氨醇酶类似物；
白细胞介素结合蛋白可以是IL-18bp；
细胞因子结合蛋白可以是TNF结合蛋白；
神经生长因子可选自神经生长因子、睫状神经营养因子、轴突发生因子-1、脑促尿钠排泄肽、神经胶质衍生的神经营养因子、导蛋白、嗜中性白细胞抑制因子、神经营养因子、和神经秩蛋白；
肌肉生长抑制素受体可选自TNFR(P75)、TNFR(P55)、IL-1受体、VEGF受体、和B细胞活化因子受体；
肌肉生长抑制素受体拮抗剂可以是IL1-Ra；
细胞表面抗原可选自CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD11a、CD11b、CD18、CD19、CD20、CD23、CD25、CD33、CD38、CD40、CD45、和CD69；和
抗体片段可选自scFv、Fab、Fab′、F(ab′)2、和Fd，但这些生理活性物质不特别限制于此。
另外，生理活性物质可选自天然毒蜥外泌肽-3或其类似物；天然毒蜥外泌肽-4或其类似物；天然胰岛素或其类似物；天然GLP-1或其类似物；天然GLP-2或其类似物；天然泌酸调节肽或其类似物；天然胰高血糖素或其类似物；天然成纤维细胞生长因子或其类似物；天然生长素释放肽或其类似物；天然降钙素或其类似物；和天然粒细胞集落形成刺激因子或其类似物，但生理活性物质不特别限制于此。
具体地，作为生理活性物质，天然毒蜥外泌肽-3类似物可选自其中N端胺基从天然毒蜥外泌肽-3缺失的毒蜥外泌肽-3；其中天然毒蜥外泌肽-3的N端胺基被羟基基团取代的毒蜥外泌肽-3；其中天然毒蜥外泌肽-3的N端胺基被二甲基基团修饰的毒蜥外泌肽-3；其中天然毒蜥外泌肽-3的N端胺基被羧基基团取代的毒蜥外泌肽-3；和其中天然毒蜥外泌肽-3的第1位氨基酸(即，组氨酸)的α-碳从天然毒蜥外泌肽-3中缺失的毒蜥外泌肽-3；和其中毒蜥外泌肽-3的第12位氨基酸(即，赖氨酸)被丝氨酸取代的毒蜥外泌肽-3；和其中毒蜥外泌肽-3的第12位氨基酸(即，赖氨酸)被精氨酸取代的毒蜥外泌肽-3；和
作为生理活性物质，天然毒蜥外泌肽-4类似物可选自其中N端胺基从天然毒蜥外泌肽-4缺失的毒蜥外泌肽-4；其中天然毒蜥外泌肽-4的N端胺基被羟基基团取代的毒蜥外泌肽-4；其中天然毒蜥外泌肽-4的N端胺基被二甲基基团修饰的毒蜥外泌肽-4；其中天然毒蜥外泌肽-4的N端胺基被羧基基团取代的毒蜥外泌肽-4；和其中天然毒蜥外泌肽-4的第1位氨基酸(即，组氨酸)的α-碳从天然毒蜥外泌肽-4缺失的毒蜥外泌肽-4；和其中毒蜥外泌肽-4的第12位氨基酸(即，赖氨酸)被丝氨酸取代的毒蜥外泌肽-4；和其中毒蜥外泌肽-4的第12位氨基酸(即，赖氨酸)被精氨酸取代的毒蜥外泌肽-4，但天然毒蜥外泌肽-3类似物和天然毒蜥外泌肽-4类似物不特别限制于此。
更具体地，天然毒蜥外泌肽-4类似物可以是选自以下中的一个：脱氨基-组胺酰基(des-amino-histidyl)(DA)-毒蜥外泌肽-4、β-羟基-咪唑并-丙酰基(HY)-毒蜥外泌肽-4、咪唑并-乙酰基(CA)-毒蜥外泌肽-4、和二甲基-组胺酰基(DM)-毒蜥外泌肽-4，但天然毒蜥外泌肽-4类似物不特别限制于此。
属于以上毒蜥外泌肽范围的天然毒蜥外泌肽的衍生物详细描述于韩国专利申请公开号10-2009-0008151(国际专利公开号WO 2009/011544 A2)中。另外，韩国专利申请公开(国际专利公开)的整个说明书通过引用并入本文。
另外，生理活性物质可以是天然泌酸调节肽或其衍生物。属于泌酸调节肽范围的天然泌酸调节肽的衍生物详细描述于韩国专利申请公开号10-2012-0139579(国际专利公开号WO 2012/173422 A9)和韩国专利申请公开号10-2012-0137271(国际专利公开号WO2012/169798 A2)中。另外，韩国专利申请公开(国际专利公开)的整个说明书通过引用并入本文。
另外，生理活性物质可以是天然粒细胞集落形成刺激因子或其衍生物。
具体地，生理活性物质可以是天然人粒细胞集落形成刺激因子衍生物，其中天然人粒细胞集落形成刺激因子的第1位、第2位、第3位、和第17位氨基酸中的任一个被不同的氨基酸取代，且第65位氨基酸残基(即，脯氨酸)进一步被丝氨酸取代。更具体地，生理活性物质可以是天然人粒细胞集落形成刺激因子的衍生物，其包括其中第17位氨基酸残基(即，半胱氨酸)、第65位氨基酸残基(即，脯氨酸)、以及这些氨基酸残基两者均被丝氨酸取代的衍生物，但生理活性物质不特别限制于此。
属于粒细胞集落形成刺激因子范围的天然粒细胞集落形成刺激因子的衍生物详细描述于韩国专利申请公开号10-2001-0009171(国际专利公开号WO 2001/004329 A1)中。另外，韩国专利申请公开(国际专利公开)的整个说明书通过引用并入本文。
另外，生理活性物质可以是可与GLP受体、胰高血糖素受体、和GIP受体中的两种或更多种受体结合的物质。物质可对GLP受体、胰高血糖素受体、和GIP受体中的两种或更多种受体具有活性。即，一旦物质与对象受体结合，该受体可就表现出活性。
具体地，生理活性物质可以是可与胰高血糖素受体、GLP-1受体、和GIP受体中的两种或更多种受体结合的物质，且更具体地，可与胰高血糖素受体和GLP-1受体结合的物质；可与GLP-1受体和GIP受体结合的物质；可与GLP-1受体和胰高血糖素受体结合的物质；或可与所有胰高血糖素受体、GLP-1受体、和GIP受体结合的物质，但生理活性物质不特别限制于此。可与三种受体结合的物质可被称为三重(triple)激动剂(或三重活化剂)，而可与两种受体结合的物质可被称为双重(dual)激动剂。
对胰高血糖素受体、GLP-1受体、和GIP受体具有活性的肽的实例描述于WO 2017/116205 A1和WO 2017/116204 A1中，其是本发明的申请人在先提交的申请，并且这些申请的整体通过引用并入本文。
另外，胰高血糖素/GLP-1双重激动剂的实例描述于WO 2015/183054、WO 2016/043533等中，且这些申请的整个说明书通过引用并入本文。
另外，生理活性物质可以是天然胰高血糖素的衍生物。
胰高血糖素衍生物的实例描述于WO 2016/108586、WO 2017/003191等中，且这些申请的整个说明书通过引用并入本文。
另外，生理活性物质可以是天然胰岛素或其类似物。更具体地，生理活性物质可以是天然胰岛素或胰岛素类似物，所述胰岛素类似物与天然胰岛素相比对胰岛素受体具有降低的结合亲和力。
如本文所用，术语“胰岛素类似物”指代与天然胰岛素不同的非天然胰岛素。胰岛素类似物包括与天然人胰岛素不同的非天然人胰岛素。
这些胰岛素类似物包括其中天然胰岛素的部分氨基酸以添加和/或缺失和/或取代的形式被修饰的那些胰岛素类似物。
具体地，当比较序列同一性时，本发明的胰岛素类似物与天然胰岛素的序列可具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、或至少95％的序列同源性。另外，本发明的胰岛素类似物可以是与天然胰岛素相比具有降低的受体结合亲和力同时与天然胰岛素的序列具有以上序列同源性的胰岛素类似物。另外，胰岛素类似物可以如天然胰岛素是具有葡萄糖摄取(uptake)能力和/或具有体内降低血糖能力的胰岛素类似物。
更具体地，与天然胰岛素的结合亲和力(100％)相比，本发明的胰岛素类似物对胰岛素受体可表现出约99％以下、约95％以下、约90％以下、约85％以下、约80％以下、约75％以下、约70％以下、约65％以下、约60％以下、约55％以下、约50％以下、约45％以下、约40％以下、约35％以下、约30％以下、约25％以下、约20％以下、约15％以下、约10％以下、约9％以下、约8％以下、约7％以下、约6％以下、约5％以下、约4％以下、约3％以下、约2％以下、约1％以下、或约0.1％以下的结合亲和力(但本发明的胰岛素类似物对胰岛素受体的结合亲和力不对应于0％)。可使用闪烁亲近测定法(SPA)评估胰岛素类似物的结合亲和力，所述闪烁亲近测定法利用胰岛素类似物和过表达重组人胰岛素受体的细胞膜中的I125结合的胰岛素之间的竞争反应。
另外，胰岛素类似物可以是由于对胰岛素受体的结合亲和力降低而与天然胰岛素相比具有至少10％半衰期增加的胰岛素类似物，但胰岛素类似物不限于此。
另外，本发明的胰岛素类似物可以如天然胰岛素具有葡萄糖摄取能力。
具体地，与天然胰岛素的葡萄糖摄取能力(100％)相比，本发明的胰岛素类似物可以是具有至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约100％、至少约110％、至少约120％、至少约130％、至少约140％、至少约150％、至少约160％、至少约170％、至少约180％、至少约190％、或至少约200％的葡萄糖摄取能力的胰岛素类似物。
可使用本领域已知的各种用于测量葡萄糖摄取能力的方法实现葡萄糖摄取能力的测量。
属于以上胰岛素类似物范围的胰岛素类似物详细描述于韩国专利申请公开号10-2015-0087130(国际专利公开号WO 2015/108398 A1)和韩国专利申请公开号10-2017-0026284(国际专利公开号WO 2017/039267 A1)中。另外，韩国专利申请公开(国际专利公开)的整个说明书通过引用并入本文，但胰岛素类似物不限于此。另外，本发明的胰岛素类似物还包括韩国专利申请公开号10-2014-0106452中公开的所有那些胰岛素类似物，但胰岛素类似物不限于此。所有以上专利说明书通过引用并入本文。
具体地，胰岛素类似物可以是单多肽链或双多肽链的形式，且更具体地是双多肽链的形式，但胰岛素类似物不特别限制于此。
双多肽链形式的胰岛素类似物可以是由对应于天然胰岛素A链的多肽和对应于天然胰岛素B链的多肽组成的胰岛素类似物。具体地，“对应于天然胰岛素的A链或B链”可指代其中双多肽链中的任一个与天然胰岛素的A链或B链相比具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、或至少95％的序列同一性的情况，但不特别限制于此，且本领域普通技术人员通过比较由双多肽链组成的序列和天然胰岛素的A链或B链的序列能够容易地理解。
天然胰岛素是由胰腺分泌的以通常促进葡萄糖摄取和抑制脂肪分解，因此起到调控血糖水平的作用的激素。胰岛素由其前体(胰岛素原)的加工产生，所述胰岛素原不具有调控血糖水平的作用。胰岛素由双多肽链(即分别具有21个和30氨基酸的A链和B链，且其通过两个二硫键互相连接)组成。天然胰岛素的A链和B链分别包括由以下SEQ ID NOS:1和2表示的氨基酸序列。
A链：
Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn(SEQ ID NO:1)
B链：
Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr(SEQ ID NO:2)
根据本发明的示例性实施方式，本发明中描述的胰岛素类似物可以是对受体具有降低的结合亲和力，同时如天然胰岛素具有体内血糖水平调控作用的胰岛素类似物。更具体地，胰岛素类似物可具有在体内降低血糖水平的能力。
只要胰岛素类似物可表现出低受体介导的内化和/或受体介导的清除，则不特别限制胰岛素的类型和尺寸。因此，与天然胰岛素相比，本发明的胰岛素类似物可表现出显著增加的血液半衰期。
本发明的胰岛素类似物包括反向(inverted)胰岛素、天然胰岛素的衍生物、天然胰岛素的片段等。可通过固相方法以及基因重组方法制备胰岛素类似物，但制备胰岛素类似物的方法不限于此。同时，本发明的胰岛素类似物不仅包括通过基因重组方法制备的那些胰岛素类似物，还包括对胰岛素受体具有降低的结合亲和力的的所有胰岛素类似物。
如本文所用，术语“天然胰岛素的衍生物”指代与天然胰岛素相比，在氨基酸序列具有至少一个差异的肽；通过修饰天然胰岛素的序列制备的修饰肽；和如天然胰岛素的能够调节体内血糖水平的天然胰岛素的模拟物。天然胰岛素的这些衍生物可以是具有调节体内血糖水平作用的衍生物。
具体地，可使用选自关于天然胰岛素的部分氨基酸的取代、添加、缺失、修饰中的任一种方法，及这些方法组合来制备天然胰岛素的衍生物。
具体地，天然胰岛素的衍生物可以是与天然胰岛素的A链和B链中的每一个相比显示在氨基酸序列中至少80％的序列同源性的衍生物，和/或是其中胰岛素的氨基酸残基的一些基团通过化学取代(例如，α-甲基化、α-羟基化)、缺失(例如，脱氨基作用)、或修饰(例如，N-甲基化)而改变的形式，但天然胰岛素的衍生物的序列同源性和形式不限于此。
可通过用于制备衍生物的各种方法的组合来制备可应用于本发明的天然胰岛素的衍生物。
另外，对天然胰岛素的衍生物的制剂的修饰包括以下中的所有修饰：使用L-型或D-型氨基酸、和/或非天然氨基酸的修饰；和/或天然序列的改变或翻译后修饰(例如，甲基化、酰化、泛素化、分子内共价键合等)。
另外，天然胰岛素的衍生物还可包括其中一个或多个氨基酸被添加到天然胰岛素的氨基和/或羧基端的衍生物。
作为待取代或添加的氨基酸，因此可使用非典型的或非天然存在的氨基酸以及在人类蛋白质中常规观察到的20种氨基酸。非典型氨基酸的商业来源包括Sigma-Aldrich、ChemPep Inc.、Genzyme Pharmaceuticals等。可由商业供应商(例如，American PeptideCompany,Bachem(USA)、或Anygen(Korea))合成或从其购买包括这些氨基酸的肽序列和非典型肽序列，但获得这些肽序列的方法不特别限制于此。
如本文所用，术语“天然胰岛素的片段或天然胰岛素的衍生物的片段”指代其中从天然胰岛素或天然胰岛素衍生物的氨基或羧基端缺失一个或多个氨基酸的天然胰岛素或天然胰岛素衍生物的形式。天然胰岛素或天然胰岛素衍生物的这些片段可具有在体内调节血糖水平的作用。
另外，本发明的胰岛素类似物可包括独立地使用用于制备上述天然胰岛素的衍生物和片段的每种方法制备的或使用其组合方法制备的胰岛素类似物。
具体地，根据本发明的胰岛素类似物可包括天然胰岛素的A链和B链中的特定氨基酸残基的修饰，且具体地，这些胰岛素类似物可以是其中天然胰岛素的A链的特定氨基酸残基被修饰和/或天然胰岛素的B链的特定氨基酸残基被修饰的胰岛素类似物。
具体地，根据本发明的胰岛素类似物可以是与天然胰岛素相比对胰岛素受体具有降低的结合亲和力并包括天然胰岛素的A链或B链的至少一个氨基酸的修饰和/或缺失的胰岛素类似物。例如，胰岛素类似物可以是其中天然胰岛素的部分氨基酸以添加、缺失、取代、及其组合的形式被修饰，从而与天然胰岛素相比，其对胰岛素受体的结合亲和力降低的类似物。
具体地，胰岛素类似物可以是其中至少一种氨基酸被不同的氨基酸取代的胰岛素类似物，所述至少一种氨基酸选自胰岛素B链的第1位氨基酸、第2位氨基酸、第3位氨基酸、第5位氨基酸、第8位氨基酸、第10位氨基酸、第12位氨基酸、第16位氨基酸、第23位氨基酸、第24位氨基酸、第25位氨基酸、第26位氨基酸、第27位氨基酸、第28位氨基酸、第29位氨基酸、和第30位氨基酸，和胰岛素A链的第1位氨基酸、第2位氨基酸、第5位氨基酸、第8位氨基酸、第10位氨基酸、第12位氨基酸、第14位氨基酸、第16位氨基酸、第17位氨基酸、第18位氨基酸、第19位氨基酸、和第21位氨基酸；或更具体地是，其中至少一种氨基酸被不同的氨基酸取代的胰岛素类似物，所述至少一种氨基酸选自胰岛素B链的第8位氨基酸、第23位氨基酸、第24位氨基酸、和第25位氨基酸，和胰岛素A链的第1位氨基酸、第2位氨基酸、第14位氨基酸、和第19位氨基酸。
具体地，胰岛素类似物可以是其中上述氨基酸中的至少1种氨基酸、至少2种氨基酸、至少3种氨基酸、至少4种氨基酸、至少5种氨基酸、至少6种氨基酸、至少7种氨基酸、至少8种氨基酸、至少9种氨基酸、至少10种氨基酸、至少11种氨基酸、至少12种氨基酸、至少13种氨基酸、至少14种氨基酸、至少15种氨基酸、至少16种氨基酸、至少17种氨基酸、至少18种氨基酸、至少19种氨基酸、至少20种氨基酸、至少21种氨基酸、至少22种氨基酸、至少23种氨基酸、至少24种氨基酸、至少25种氨基酸、至少26种氨基酸、或至少27种氨基酸被不同的氨基酸取代的胰岛素类似物，但胰岛素类似物不限于此。
上述位置中的氨基酸残基可被丙氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、异亮氨酸、缬氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、赖氨酸、组氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、和/或天冬氨酸取代。另外，由于天然胰岛素的A链或B链中的至少一个氨基酸的缺失而对胰岛素受体具有降低的结合亲和力的那些胰岛素类似物可属于本发明的范围，但可没有限制地包括对胰岛素受体具有降低的结合亲和力的任何胰岛素类似物。
更具体地，胰岛素类似物可以是包括由以下通式1表示的SEQ ID NO:3的A链和由以下通式2表示的SEQ ID NO:4的B链的胰岛素类似物。另外，胰岛素类似物可以是其中A链和B链的序列通过二硫键相互连接的形式，但胰岛素类似物的形式不限于此。
[通式1]
Xaa1-Xaa2-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Xaa14-Gln-Leu-Glu-Asn-Xaa19-Cys-Asn(SEQ ID NO:3)
在以上通式1中，
Xaa1是甘氨酸或丙氨酸，
Xaa2是异亮氨酸或丙氨酸，
Xaa14是酪氨酸、谷氨酸、或天冬酰胺，和
Xaa19是酪氨酸或丙氨酸。
[通式2]
Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Xaa8-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Xaa23-Xaa24-Xaa25-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr(SEQ ID NO:4)
在以上通式2中，
Xaa8是甘氨酸或丙氨酸，
Xaa23是甘氨酸或丙氨酸，
Xaa24是苯丙氨酸或丙氨酸，和
Xaa25是苯丙氨酸或丙氨酸。
更具体地，胰岛素类似物可包括：
(i)以上通式1的A链，其中Xaa1是丙氨酸、Xaa2是异亮氨酸、Xaa14是酪氨酸、和Xaa19是酪氨酸，和通式2的B链，其中Xaa8是甘氨酸、Xaa23是甘氨酸、Xaa24是苯丙氨酸、和Xaa25是苯丙氨酸；
(ii)通式1的A链，其中Xaa1是甘氨酸、Xaa2是丙氨酸、Xaa14是酪氨酸、和Xaa19是酪氨酸，和通式2的B链，其中Xaa8是甘氨酸、Xaa23是甘氨酸、Xaa24是苯丙氨酸、和Xaa25是苯丙氨酸；
(iii)通式1的A链，其中Xaa1是甘氨酸、Xaa2是异亮氨酸、Xaa14是谷氨酸或天冬酰胺、和Xaa19是酪氨酸，和通式2的B链，其中Xaa8是甘氨酸、Xaa23是甘氨酸、Xaa24是苯丙氨酸、和Xaa25是苯丙氨酸；
(iv)通式1的A链，其中Xaa1是甘氨酸、Xaa2是异亮氨酸、Xaa14是酪氨酸、Xaa19是丙氨酸，和通式2的B链，其中Xaa8是甘氨酸、Xaa23是甘氨酸、Xaa24是苯丙氨酸、和Xaa25是苯丙氨酸；
(v)通式1的A链，其中Xaa1是甘氨酸、Xaa2是异亮氨酸、Xaa14是酪氨酸、和Xaa19是酪氨酸，和通式2的B链，其中Xaa8是丙氨酸、Xaa23是甘氨酸、Xaa24是苯丙氨酸、和Xaa25是苯丙氨酸；
(vi)通式1的A链，其中Xaa1是甘氨酸、Xaa2是异亮氨酸、Xaa14是酪氨酸、和Xaa19是酪氨酸，和通式2的B链，其中Xaa8是甘氨酸、Xaa23是丙氨酸、Xaa24是苯丙氨酸、和Xaa25是苯丙氨酸；
(vii)通式1的A链，其中Xaa1是甘氨酸、Xaa2是异亮氨酸、Xaa14是酪氨酸、和Xaa19是酪氨酸，和通式2的B链，其中Xaa8是甘氨酸、Xaa23是甘氨酸、Xaa24是丙氨酸、和Xaa25是苯丙氨酸；和
(viii)通式1的A链，其中Xaa1是甘氨酸、Xaa2是异亮氨酸、Xaa14是酪氨酸、和Xaa19是酪氨酸，和通式2的B链，其中Xaa8是甘氨酸、Xaa23是甘氨酸、Xaa24是苯丙氨酸、和Xaa25是丙氨酸。
另外，胰岛素类似物可以是包括由以下通式3表示的SEQ ID NO:5的A链和由以下通式4表示的SEQ ID NO:6的B链。另外，胰岛素类似物可以是其中A链和B链的序列通过二硫键相互连接的形式，但胰岛素类似物的形式不限于此。
[通式3]
Xaa1-Ile-Val-Glu-Xaa5-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Xaa12-Leu-Xaa14-Gln-Xaa16-Glu-Asn-Xaa19-Cys-Xaa21(SEQ ID NO:5)
在以上通式3中，
Xaa1是丙氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、组氨酸、谷氨酸、或天冬酰胺，
Xaa5是丙氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、组氨酸、或天冬酰胺，
Xaa12是丙氨酸、丝氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、组氨酸、或天冬酰胺，
Xaa14是丙氨酸、酪氨酸、谷氨酸、组氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、或天冬酰胺，
Xaa16是丙氨酸、亮氨酸、酪氨酸、组氨酸、谷氨酸、或天冬酰胺，
Xaa19是丙氨酸、酪氨酸、丝氨酸、谷氨酸、组氨酸、苏氨酸、或天冬酰胺，和
Xaa21是天冬酰胺、甘氨酸、组氨酸、或丙氨酸。
[通式4]
Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Xaa16-Leu-Val-Cys-Gl y-Glu-Arg-Gly-Phe-Xaa25-Tyr-Xaa27-Xaa28-Lys-Thr(SEQ ID NO:6)
在以上通式4中，
Xaa16是酪氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸、或天冬氨酸、或不存在，
Xaa25是苯丙氨酸、天冬氨酸、或谷氨酸、或不存在，
Xaa27是苏氨酸或不存在，和
Xaa28是脯氨酸、谷氨酸、或天冬氨酸、或不存在。
更具体地，胰岛素类似物可以是以下的胰岛素类似物，其中：
在以上通式3中，Xaa1是甘氨酸、Xaa5是谷氨酰胺、Xaa12是丝氨酸、Xaa14是谷氨酸或天冬酰胺、Xaa16是亮氨酸、Xaa19是酪氨酸、Xaa21是天冬酰胺，
在以上通式4中，Xaa16是酪氨酸、Xaa25是苯丙氨酸或不存在、Xaa27是苏氨酸、Xaa28是脯氨酸、谷氨酸、或天冬氨酸、或不存在，但胰岛素类似物不特别限制于此。
更具体地，胰岛素类似物可以是以下的胰岛素类似物，其中：
(1)在SEQ ID NO:5的胰岛素的A链中，Xaa1是甘氨酸、Xaa5是谷氨酰胺、Xaa12是丝氨酸、Xaa14是谷氨酸、Xaa16是亮氨酸、Xaa19是酪氨酸、和Xaa21是天冬酰胺；和
在SEQ ID NO:6的胰岛素的B链中，Xaa16是酪氨酸、Xaa25是苯丙氨酸、Xaa27是苏氨酸、Xaa28是脯氨酸、谷氨酸、或天冬氨酸、或不存在；
(2)在SEQ ID NO:5的胰岛素的A链中，Xaa1是甘氨酸、Xaa5是谷氨酰胺、Xaa12是丝氨酸、Xaa14是天冬酰胺、Xaa16是亮氨酸、Xaa19是酪氨酸、和Xaa21是天冬酰胺；和
在SEQ ID NO:6的胰岛素的B链中，Xaa16是酪氨酸、Xaa25是苯丙氨酸、Xaa27是苏氨酸、Xaa28是脯氨酸、谷氨酸、或天冬氨酸、或不存在；
(3)在SEQ ID NO:5的胰岛素的A链中，Xaa1是甘氨酸、Xaa5是谷氨酰胺、Xaa12是丝氨酸、Xaa14是谷氨酸、Xaa16是亮氨酸、Xaa19是酪氨酸、和Xaa21是天冬酰胺；和，
在SEQ ID NO:6的胰岛素的B链中，Xaa16是酪氨酸、Xaa25不存在、Xaa27是苏氨酸、Xaa28是脯氨酸、谷氨酸、或天冬氨酸、或不存在；或
(4)在SEQ ID NO:5的胰岛素的A链中，Xaa1是甘氨酸、Xaa5是谷氨酰胺、Xaa12是丝氨酸、Xaa14是丙氨酸、Xaa16是亮氨酸、Xaa19是酪氨酸、Xaa21是天冬酰胺；和，在SEQ IDNO:6的胰岛素的B链中，Xaa16是谷氨酸、Xaa25不存在、Xaa27是苏氨酸、Xaa28是脯氨酸、谷氨酸、或天冬氨酸、或不存在，但胰岛素类似物不特别限制于此。
更具体地，胰岛素类似物可以是以下的胰岛素类似物，其中：
(1)在以上通式3中，Xaa1是甘氨酸、Xaa5是谷氨酰胺、Xaa12是丝氨酸、Xaa14是谷氨酸、Xaa16是亮氨酸、Xaa19是酪氨酸、和Xaa21是天冬酰胺；和
在以上通式4中，Xaa16是酪氨酸、Xaa25不存在、Xaa27是苏氨酸、和Xaa28是脯氨酸；
(2)在以上通式3中，Xaa1是甘氨酸、Xaa5是谷氨酰胺、Xaa12是丝氨酸、Xaa14是丙氨酸、Xaa16是亮氨酸、Xaa19是酪氨酸、和Xaa21是天冬酰胺；和
在以上通式4中，Xaa16是谷氨酸、Xaa25不存在、Xaa27是苏氨酸、和Xaa28是脯氨酸；
(3)在以上通式3中，Xaa1是甘氨酸、Xaa5是谷氨酰胺、Xaa12是丝氨酸、Xaa14是组氨酸、Xaa16是亮氨酸、Xaa19是酪氨酸、和Xaa21是天冬酰胺；和
在以上通式4中，Xaa16是酪氨酸、Xaa25是苯丙氨酸、Xaa27是苏氨酸、和Xaa28是脯氨酸；
(4)在以上通式3中，Xaa1是甘氨酸、Xaa5是谷氨酰胺、Xaa12是丝氨酸、Xaa14是赖氨酸、Xaa16是亮氨酸、Xaa19是酪氨酸、和Xaa21是天冬酰胺；和
在以上通式4中，Xaa16是酪氨酸、Xaa25是苯丙氨酸、Xaa27是苏氨酸、和Xaa28是脯氨酸；
(5)在以上通式3中，Xaa1是甘氨酸、Xaa5是谷氨酰胺、Xaa12是丝氨酸、Xaa14是酪氨酸、Xaa16是亮氨酸、Xaa19是谷氨酸、和Xaa21是天冬酰胺；和
在以上通式4中，Xaa16是酪氨酸、Xaa25是苯丙氨酸、Xaa27是苏氨酸、和Xaa28是脯氨酸；
(6)在以上通式3中，Xaa1是甘氨酸、Xaa5是谷氨酰胺、Xaa12是丝氨酸、Xaa14是酪氨酸、Xaa16是亮氨酸、Xaa19是丝氨酸、和Xaa21是天冬酰胺；和
在以上通式4中，Xaa16是酪氨酸、Xaa25是苯丙氨酸、Xaa27是苏氨酸、和Xaa28是脯氨酸；
(7)在以上通式3中，Xaa1是甘氨酸、Xaa5是谷氨酰胺、Xaa12是丝氨酸、Xaa14是酪氨酸、Xaa16是亮氨酸、Xaa19是苏氨酸、和Xaa21是天冬酰胺；和
在以上通式4中，Xaa16是酪氨酸、Xaa25是苯丙氨酸、Xaa27是苏氨酸、和Xaa28是脯氨酸；
(8)在以上通式3中，Xaa1是甘氨酸、Xaa5是谷氨酰胺、Xaa12是丝氨酸、Xaa14是酪氨酸、Xaa16是亮氨酸、Xaa19是酪氨酸、和Xaa21是天冬酰胺；和
在以上通式4中，Xaa16是谷氨酸、Xaa25是苯丙氨酸、Xaa27是苏氨酸、和Xaa28是脯氨酸；
(9)在以上通式3中、Xaa1是甘氨酸、Xaa5是谷氨酰胺、Xaa12是丝氨酸、Xaa14是酪氨酸、Xaa16是亮氨酸、Xaa19是酪氨酸、和Xaa21是天冬酰胺；和
在以上通式4中，Xaa16是丝氨酸、Xaa25是苯丙氨酸、Xaa27是苏氨酸、和Xaa28是脯氨酸；
(10)在以上通式3中，Xaa1是甘氨酸、Xaa5是谷氨酰胺、Xaa12是丝氨酸、Xaa14是酪氨酸、Xaa16是亮氨酸、Xaa19是酪氨酸、和Xaa21是天冬酰胺；和
在以上通式4中，Xaa16是苏氨酸、Xaa25是苯丙氨酸、Xaa27是苏氨酸、和Xaa28是脯氨酸；
(11)在以上通式3中，Xaa1是甘氨酸、Xaa5是谷氨酰胺、Xaa12是丝氨酸、Xaa14是丙氨酸、Xaa16是亮氨酸、Xaa19是酪氨酸、和Xaa21是天冬酰胺；和
在以上通式4中，Xaa16是酪氨酸、Xaa25是苯丙氨酸、Xaa27是苏氨酸、和Xaa28是脯氨酸；
(12)在以上通式3中，Xaa1是甘氨酸、Xaa5是谷氨酰胺、Xaa12是丝氨酸、Xaa14是天冬氨酸、Xaa16是亮氨酸、Xaa19是酪氨酸、和Xaa21是天冬酰胺；和
在以上通式4中，Xaa16是酪氨酸、Xaa25是苯丙氨酸、Xaa27是苏氨酸、和Xaa28是脯氨酸；
(13)在以上通式3中，Xaa1是甘氨酸、Xaa5是谷氨酰胺、Xaa12是丝氨酸、Xaa14是酪氨酸、Xaa16是亮氨酸、Xaa19是酪氨酸、和Xaa21是天冬酰胺；和
在以上通式4中，Xaa16是天冬氨酸、Xaa25是苯丙氨酸、Xaa27是苏氨酸、和Xaa28是脯氨酸；
(14)在以上通式3中，Xaa1是甘氨酸、Xaa5是谷氨酰胺、Xaa12是丝氨酸、Xaa14是酪氨酸、Xaa16是亮氨酸、Xaa19是酪氨酸、和Xaa21是天冬酰胺；和
在以上通式4中，Xaa16是酪氨酸、Xaa25是天冬氨酸、Xaa27是苏氨酸、和Xaa28是脯氨酸；或
(15)在以上通式3中，Xaa1是甘氨酸、Xaa5是谷氨酰胺、Xaa12是丝氨酸、Xaa14是酪氨酸、Xaa16是亮氨酸、Xaa19是酪氨酸、和Xaa21是天冬酰胺；和
在以上通式4中，Xaa16是酪氨酸、Xaa25是谷氨酸、Xaa27是苏氨酸、和Xaa28是脯氨酸，但胰岛素类似物不特别限制于此。
然而，胰岛素类似物不限于以上实施方式。例如，与天然胰岛素相比对胰岛素受体具有降低的结合亲和力，同时含有上述特征氨基酸残基并与对象胰岛素类似物具有至少70％、具体地至少80％、更具体地至少90％、甚至更具体地至少95％同源性的那些肽也包括在本发明的范围内。
如本文所用，术语“同源性”指代与天然(野生型)蛋白质的氨基酸序列或编码该天然蛋白质的氨基酸序列的多核苷酸序列的序列相似的程度，且其包括具有上述百分比或比本发明的氨基酸序列或多核苷酸序列更高百分比的序列同一性的那些序列。可通过用肉眼比较两个序列来确定这些同源性，或可选地，可使用生物信息学算法确定这些同源性，所述生物信息学算法比对待比较的序列并分析同源性程度。两个氨基酸序列之间的同源性可表示为百分比。有用的自动算法可在Wisconsin Genetics Software Package(GeneticsComputer Group,Madison,WI,USA)的GAP、BESTFIT、FASTA、和TFASTA计算机软件模块中获得。这种模块中的自动阵列算法包括Needleman&Wunsch、Pearson&Lipman、和mith&Waterman序列比对算法。其它有用阵列的算法和同源性确定在包括FASTP、BLAST、BLAST2、PSIBLAST、和CLUSTAL W的软件中被自动化。
可使用标准分子生物学技术分离或制备编码胰岛素类似物的多核苷酸。例如，编码胰岛素类似物的多核苷酸可使用适当的引物序列通过聚合酶链式反应(PCR)从天然胰岛素的基因序列(NM_000207.2，NCBI)扩增，或可利用标准合成技术(使用自动化DNA合成仪)制备。多核苷酸可与本发明的核酸互换使用。
编码胰岛素类似物的多核苷酸可包括编码上述A链和B链的氨基酸序列的那些多核苷酸，但多核苷酸不限于此。例如，除了上述多核苷酸序列，编码与上述序列具有至少70％、具体地至少80％、更具体地至少90％、和甚至更具体地至少95％的同源性并与天然胰岛素相比对胰岛素受体具有降低的结合亲和力的肽的那些多核苷酸也包括在本发明的范围内。
同时，关于天然胰岛素或其类似物的缀合物可以是由以下式2表示的缀合物：
[式2]
X-L-F
其中，在以上式2中，
X是天然胰岛素或胰岛素类似物，所述胰岛素类似物与天然胰岛素相比对胰岛素受体具有降低的结合亲和力，
L，作为接头，是尺寸为大于0kDa至小于3.4kDa的聚乙二醇，和
F是能够增加X的体内半衰期的物质。
由以上式2表示的缀合物可以是其中其中受体介导的清除(RMC)被降低的缀合物，但缀合物不特别限制于此。
在由以上式2表示的缀合物中，L可被连接到天然胰岛素或其类似物(即，X)的β链的氨基端区，但缀合物不特别限制于此。
在本发明中，术语“N端区或氨基端区”指代肽或蛋白质的氨基端区。例如，“N端区”不仅可包括N端区的大多数末端氨基酸残基，还包括N端氨基酸残基邻近的氨基酸残基，且具体地，从最末端起第1位氨基酸残基至第20位氨基酸残基，但N端区不特别限制于此。
同时，在根据本发明的缀合物中，X和F可通过共价化学键、非共价化学键、或其组合通过L彼此连接，且更具体地，X和F可通过共价化学键通过L彼此连接。
在以上式1或2中，“-”可表示共价化学键或非共价化学键，且更具体地是共价化学键，但不特别限制于此。
以上式1或2的缀合物具有其中X、L、和F是以此顺序连接的结构。
在具体的实施方式中，L的两端分别与F(例如，免疫球蛋白Fc区)的胺基或硫醇基和X的胺基或硫醇基连接，以制备缀合物。胺基可以是伯胺或仲胺。
胺基可位于多肽(如生理活性多肽或免疫球蛋白Fc区)的赖氨酸残基的N端或侧链上；且硫醇基可位于多肽(如生理活性多肽或免疫球蛋白Fc区)的半胱氨酸残基上。
多肽(如生理活性多肽或免疫球蛋白Fc区)的胺基可通过与醛或N-羟基琥珀酰亚胺酯反应形成共价键。
多肽(如生理活性多肽或免疫球蛋白Fc区)的硫醇基可通过与马来酰亚胺、碘乙酰胺、乙烯砜、吡啶基二硫化物或硫醇基反应形成共价键。
具体地，在形成缀合物前，L可包括分别与其两端的F和X结合的反应基，具体地是可与位于X的N端或赖氨酸残基的胺基或半胱氨酸残基中的硫醇基结合的反应基；或与位于F的N端的或赖氨酸残基的胺基或半胱氨酸残基中的硫醇基结合的反应基，但反应基不限于此。
在连接到X和F两者之前，L可具有至少两个末端官能团，具体地两个或三个末端官能团，且更具体地两个末端官能团。
具体地，L可以是同功能(homofunctional)PEG或异功能(heterofunctional)PEG，在所述同功能PEG中，至少两个官能团的类型全部相同，在所述异功能PEG中，至少一个官能团的类型不同于另一官能团(一种或多种)的类型。例如，PEG可以是具有两个末端的形式，其中PEG的一个末端是醛，而另一末端是马来酰亚胺。
另外，L可以是同功能PEG，其中两个末端或所有三个末端是醛。
例如，L可以是在两端具有丙醛基或丁醛基的PEG，但不特别限制于此。
当L在两端具有反应醛的官能团时，L有效地分别在两端与生理活性多肽和免疫球蛋白Fc区连接，同时最小化非特异性反应的发生。与通过酰胺键形成的最终产物相比，通过醛键由还原性胺化形成的最终产物显著地更稳定。醛官能团在低pH下在N端选择性反应，并可在高pH(例如，pH 9.0)下与赖氨酸残基形成共价键。
上述L的末端官能团可以是胺反应性官能团或硫醇反应性官能团。
更具体地，L的至少一个末端官能团可各自独立地选自醛、马来酰亚胺、琥珀酰亚胺、乙烯砜、硫醇、C6-20芳基二硫化物、C5-20杂芳基二硫化物、和卤化乙酰胺，且甚至更具体地，可各自独立地选自醛、马来酰亚胺、琥珀酰亚胺、乙烯砜、硫醇、邻吡啶基二硫化物、和碘乙酰胺，但末端官能团不特别限制于此。
作为L的官能团，本领域已知的衍生物和可在本领域技术水平容易制备的衍生物以及上述那些类型也可包括在本发明的范围内。
醛基可以是烷基醛(例如，C2-6烷基醛)，且更具体地丙醛基、丁醛基等，但醛基不特别限制于此。
琥珀酰亚胺基可以是琥珀酰亚胺基戊酸酯、琥珀酰亚胺基甲基丁酸酯、琥珀酰亚胺基甲基丙酸酯、琥珀酰亚胺基丁酸酯、琥珀酰亚胺基丙酸酯、羟基琥珀酰亚胺基(具体地是N-羟基琥珀酰亚胺基)、琥珀酰亚胺基羧甲基、或琥珀酰亚胺基碳酸酯。琥珀酰亚胺基可具有适当的形式，以与位于生理活性多肽或免疫球蛋白Fc区的靶官能团连接。例如，琥珀酰亚胺基可以是N-羟基琥珀酰亚胺基酯。
另外，当使用在两端具有羟基官能团的PEG时，可通过已知的化学反应将羟基活化成上述各种反应基。
在通过常规符合读框的融合方法获得的融合蛋白中使用的肽接头的情况下，肽接头在体内可容易地被蛋白酶切割，因此不能如预期获得通过载体增加活性药物的血清半衰期的充分效果。因此，在本发明中，可使用为非肽接头的聚乙二醇制备缀合物。对蛋白酶具有抗性的PEG可用作非肽接头，以类似于载体维持给定肽的血液半衰期。聚乙二醇的分子量在小于3.4kDa的范围内，但其分子量不限于此。
同时，关于本发明中使用的聚乙二醇的分子量，所有先前解释的内容将适用于上述分子量和以下描述的分子量。
在根据本发明的缀合物中，“F”指代可增加生理活性物质的体内半衰期的物质。在本发明中，术语“F”可与“生物相容性物质”或载体互换使用。
在本发明中，“生物相容性物质或能够增加体内半衰期的物质”是构成缀合物的一部分。
只要其是与目标生理活性物质连接并从而能够延长生理活性物质的体内半衰期的物质，生物相容性物质或载体的类型就不受限制。作为非限制性实例，生物相容性物质或载体可选自聚合物、脂肪酸、胆固醇、白蛋白及其片段、白蛋白结合物质、特定氨基酸序列的重复单元的聚合物、抗体、抗体片段、FcRn结合物质、体内结缔组织、核苷酸、纤连蛋白、转铁蛋白、糖、肝素、和弹性蛋白。
聚合物可选自聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇-丙二醇共聚物、聚氧乙烯化多元醇、聚乙烯醇、多糖、葡聚糖、聚乙烯基乙醚、生物可降解的聚合物、脂质聚合物、几丁质、透明质酸、寡核苷酸、及其组合，但聚合物不特别限制于此。
生物相容性物质或载体可与X共价地或非共价地连接。另外，FcRn结合物质可以是包括免疫球蛋白Fc区的多肽，且具体地是免疫球蛋白Fc区(例如，IgG Fc)。
当白蛋白被用作载体时，可使用可通过接头将白蛋白或其片段与生理活性物质直接共价连接，从而增加生理活性物质体内稳定性的技术。另外，可使用虽然不能将白蛋白与生理活性物质直接连接，但可将白蛋白结合物质(如白蛋白特异性结合抗体或其抗体片段)与生理活性物质连接从而使生理活性物质与白蛋白连接的技术、和可将对白蛋白(例如，使用Affibody公司的Albumod技术生产白蛋白结合肽)具有结合亲和力的特定肽/蛋白质与生理活性物质连接的技术，以及可使用可连接对白蛋白具有结合亲和力的脂肪酸等的技术，但技术不限于此，但可包括可使用白蛋白增加生理活性物质的体内稳定性的任意技术、连接方法等。
为增加生理活性物质的体内半衰期，还可包括可将作为载体的抗体或抗体片段链接至生理活性物质的技术。抗体或抗体片段可以是具有FcRn结合区的抗体或抗体片段，且其可以是不包括FcRn结合区(如Fab等)的任意抗体片段。可包括使用催化性抗体的CovX公司的CovX-body技术，且本发明中可包括可使用免疫球蛋白Fc区增加生理活性物质的体内半衰期的技术。
另外，本发明中也可包括可将作为载体的肽或蛋白质的片段与生理活性物质连接，以增加体内半衰期的技术。待使用的肽或蛋白质的片段可以是弹性蛋白样多肽(ELP)，所述弹性蛋白样多肽由特定氨基酸序列的组合的重复单元的聚合物组成，且Xten技术采用Versartis Inc的人工多肽PEG。另外，本发明中还包括Zealand公司的结构诱导探针(structure inducing probe(SIP))技术和Prolor Biotech Inc.的CTP融合技术，所述结构诱导探针技术可使用多赖氨酸增加生理活性物质的体内半衰期，且还可包括已知具有高体内稳定性的转铁蛋白、或纤连蛋白(结缔组织的构成成分)、或其衍生物等。与生理活性物质连接的肽或蛋白质不限于上述那些，而可增加生理活性物质的体内半衰期的任何肽或蛋白质都包括在本发明的范围内。
另外，为增加体内半衰期而使用的载体可以是非肽物质，如多糖或脂肪酸等。
当使用免疫球蛋白时，用于将Fc区与生理活性物质连接的接头和连接的方法可以是使用聚乙二醇的非肽键合(linkage)。Fc区和生理活性物质可以1:1或1:2的比连接，但比不限于此。具体地，Fc区可以是二聚体的形式，和其中与二聚体形式的免疫球蛋白Fc区的单链连接一分子的生理活性物质的形式，或其中与二聚体形式的免疫球蛋白Fc区的两个链中的每个分别地连接一分子的生理活性物质的形式，但键合的形式不特别限制于此。
另外，在关于以上式1或式2的缀合物中，当F是免疫球蛋白Fc区时，L可与F的N端区连接，但不特别限制于此。
由于免疫球蛋白Fc区是可在体内代谢的生物可降解的多肽，因此其可安全地用作药物载体。另外，与整个免疫球蛋白分子相比，免疫球蛋白Fc区具有相对低的分子量，在缀合物的制备、纯化和产率方面是有利的。另外，因为由于抗体与抗体的氨基酸序列的差异而表现出高异质性的Fab区被去除了，预期物质的同质性可大辐增加，且诱导血液抗原性(antigenicity)的风险也可降低。
如本文所用，术语“免疫球蛋白Fc区”指代包括免疫球蛋白的重链恒定区2(CH2)和重链恒定区3(CH3)、不包括免疫球蛋白的重链可变区和轻链可变区的蛋白质。
免疫球蛋白Fc区可包括重链恒定区中的铰链区。另外，只要免疫球蛋白Fc区具有与天然Fc相比基本相同或更改善的效果，则本发明的免疫球蛋白Fc区可以是延伸的Fc区，所述延伸的Fc区包括部分或全部的重链恒定区1(CH1)和/或轻链恒定区1(CL1)，不包括免疫球蛋白的重链可变区和轻链可变区。另外，本发明的免疫球蛋白Fc区可以是其中将对应于CH2和/或CH3的显著长的部分氨基酸序列去除了的区。
具体地，本发明的免疫球蛋白Fc区可以是1)CH1结构域、CH2结构域、CH3结构域、和CH4结构域，2)CH1结构域和CH2结构域，3)CH1结构域和CH3结构域，4)CH2结构域和CH3结构域，和5)选自CH1结构域、CH2结构域、CH3结构域、和CH4结构域的一个或两个或更多个结构域和免疫球蛋白的铰链区(或部分铰链区)之间的组合(例如，CH2结构域和CH3结构域与铰链区或部分铰链区之间的组合；和具有上述组合的两种多肽的二聚体)，和6)重链恒定区的各结构域和轻链恒定区之间的二聚体。
另外，免疫球蛋白Fc区不仅包括其天然氨基酸序列，还包括其序列变体(突变体)。如本文所用，术语“氨基酸序列突变体”指代由于天然氨基酸序列的一个或多个氨基酸残基的缺失、插入、非保守或保守取代、或其组合而与天然氨基酸序列不同的序列。例如，在IgGFc的情况下，已知在结合中是重要的位置214至238、297至299、318至322、或327至331的氨基酸残基可用作修饰的合适位点。
另外，其它各种类型的突变体是可能的，包括缺失能够形成二硫键的区域、或在天然Fc的N端处缺失一些氨基酸残基、或在天然Fc的N端处添加甲硫氨酸残基等的突变体。进一步，为去除效应子功能，缺失可发生在补体结合位点中，如C1q结合位点和依赖抗体的细胞毒性(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity)(ADCC)位点。用于制备免疫球蛋白Fc区的这种序列衍生物的技术公开于国际专利公开号WO 97/34631、WO 96/32478等中。
通常不会改变蛋白质或肽的活性的蛋白质和肽中的氨基酸交换是本领域已知的(H.Neurath,R.L.Hill,The Proteins,Academic Press,New York,1979)。最常见发生的交换是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Thy/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu、和Asp/Gly。
在一些情况下，可通过磷酸化、硫酸化、丙烯酸化、糖基化、甲基化、法尼基化、乙酰化、酰胺化等修饰Fc区。
上述Fc突变体可以是显示出与本发明的Fc区相同的生物活性但具有针对热、PH等的改善的结构稳定性的Fc突变体。
另外，Fc区可以是获自从人或动物(如牛、山羊、猪、小鼠、兔、仓鼠、大鼠、豚鼠等)体内分离的天然形式，或者可以是获自转化的动物细胞或微生物的重组体或其衍生物。本文中，可通过从活的人体或动物体分离整个免疫球蛋白并用蛋白酶处理分离的免疫球蛋白而从天然免疫球蛋白获得Fc区。当用木瓜蛋白酶处理整个免疫球蛋白时，免疫球蛋白被切割成Fab和Fc区，而当用胃蛋白酶处理整个免疫球蛋白时，免疫球蛋白被切割成pF′c和F(ab)2片段。可使用尺寸排阻层析等分离片段。
在更具体的实施方式中，Fc区可以是关于人源性Fc区的从微生物获得的重组免疫球蛋白Fc区。
另外，免疫球蛋白Fc区可以是天然聚糖的形式、与其天然类型相比增加的或降低的聚糖形式、或去糖基化的形式。可通过常规方法(如化学方法、酶促方法和使用微生物的基因工程方法)实现免疫球蛋白Fc聚糖的增加、减少或去除。通过从Fc区去除聚糖获得的免疫球蛋白Fc区显示出对补体(C1q部分)的结合亲和力显著降低和抗体依赖性细胞毒性或补体依赖性细胞毒性的降低或丧失，因此其不会诱导不必要的体内免疫反应。在此方面，去糖基化或非糖基化的免疫球蛋白Fc区中的免疫球蛋白Fc区可以是更合适的形式，以满足本发明作为药物载体的原始目的。
如本文所用，术语“去糖基化”指代从Fc区酶促去除糖部分，而术语“非糖基化”指代在原核生物(更具体地大肠杆菌(E.coli))中产生的未糖基化的Fc区。
同时，免疫球蛋白Fc区可源自人或动物(包括牛、山羊、猪、小鼠、兔、仓鼠、大鼠、和豚鼠)，且优选地，其源自人。另外，免疫球蛋白(Ig)Fc区可以是源自IgG、IgA、IgD、IgE、IgM、或其组合或其杂合的Fc区。优选地，其可源自IgG或IgM，所述IgG或IgM属于人血液中最丰富的蛋白质，且更优选地，其可源自IgG，已知IgG可增加配体结合蛋白的半衰期。
同时，如本文所用，术语“组合”是指编码相同来源的单链免疫球蛋白Fc区的多肽与不同来源的单链多肽连接以形成二聚体或多聚体。即，二聚体或多聚体可由选自IgG Fc、IgA Fc、IgM Fc、IgD Fc、和IgE Fc片段的两种或更多种片段制备。
如本文所用，术语“杂合(hybrid)”是指对应于不同来源的两种或更多种免疫球蛋白Fc片段的序列存在于免疫球蛋白Fc区的单链中。在本发明中，各种杂合形式是可能的。即，杂合结构域可由选自IgG Fc、IgM Fc、IgAFc、IgE Fc、和IgD Fc的CH1、CH2、CH3、和CH4中的一至四个结构域组成，并可包括铰链区。
同时，IgG也可被分为IgG1、IgG2、IgG3、和IgG4亚类，并且本发明可包括其组合或其杂合，优选地是，IgG2和IgG4亚类，且最优选地是，很少具有效应子功能(如补体依赖性细胞毒性(CDC))的IgG4的Fc区。即，用作药物载体的本发明的免疫球蛋白Fc区可以是源自人IgG4的非糖基化Fc区。源自人IgG4的Fc区优于非人源性Fc区，所述非人源性Fc区可引起不期望的免疫反应，如在人体中充当抗原，从而产生针对抗原的新抗体等。
在更具体的实施方式中，生理活性物质(例如，天然胰岛素或胰岛素类似物)和生物相容性物质通过聚乙二醇连接，所述聚乙二醇是尺寸为大于0kDa至小于3.4kDa并被插入在生理活性物质和生物相容性物质之间的接头，且生物相容性物质可以是FcRn结合物质。FcRn结合物质可以是例如免疫球蛋白Fc区，且具体地是IgG Fc区。
本发明的又一方面提供了用于制备缀合物的方法。
缀合物和构成缀合物的组分与上面解释的相同。
在具体的实施方式中，本发明提供了用于制备缀合物的方法，其包括：
(a)使具有大于0kDa至小于3.4kDa尺寸和至少两个末端官能团的聚乙二醇与生理活性物质或能够增加生理活性物质的体内半衰期的物质中的任一种反应，以制备聚乙二醇，其共价地连接有生理活性物质或能够增加生理活性物质的体内半衰期的物质中的一种且其具有至少一个末端官能团；和
(b)使步骤(a)中制备的聚乙二醇(其共价地连接有生理活性物质或能够增加生理活性物质的体内半衰期的物质中的一种并且其具有至少一个末端官能团)与生理活性物质或能够增加生理活性物质的体内半衰期的物质中的另一个反应以制备缀合物，其中生理活性物质和能够增加生理活性物质的体内半衰期的物质通过尺寸为大于0kDa至小于3.4kDa的聚乙二醇共价地连接。
本文中，分别地，步骤(a)被称为初级反应步骤，步骤(b)被称为次级反应步骤。
用于制备缀合物的生理活性物质和聚乙二醇的尺寸和关于包括末端官能团的缀合物的连接的构成与上面解释的相同。
在以上制备方法中，生理活性物质具有与聚乙二醇的末端官能团反应从而形成共价键的官能团，且官能团可以是胺基或硫醇基。
另外，在以上制备方法中，可增加生理活性物质的半衰期的物质具有与末端官能团反应从而形成共价键的官能团，且官能团可以是胺基或硫醇基。
在以上制备方法中，聚乙二醇的末端官能团可以是胺反应性官能团或硫醇反应性官能团。
在以上制备方法中，聚乙二醇的末端官能团可选自醛、马来酰亚胺、琥珀酰亚胺、乙烯砜、硫醇、C6-20芳基二硫化物、C5-20杂芳基二硫化物、和卤化乙酰胺。更具体地，聚乙二醇的末端官能团可选自醛、马来酰亚胺、琥珀酰亚胺、乙烯砜、硫醇、邻吡啶基二硫化物、和碘乙酰胺。
琥珀酰亚胺可以是琥珀酰亚胺基戊酸酯、琥珀酰亚胺基甲基丁酸酯、琥珀酰亚胺基甲基丙酸酯、琥珀酰亚胺基丁酸酯、琥珀酰亚胺基丙酸酯、N-羟基琥珀酰亚胺基、琥珀酰亚胺基羧甲基、或琥珀酰亚胺基碳酸酯，但琥珀酰亚胺不特别限制于此。
在本发明的初级反应步骤或次级反应步骤中，当PEG的末端官能团是醛时，可通过还原性胺化在X的胺基或F的胺基与PEG的醛基之间形成共价键。例如，位于F的N端的“-NH2”和PEG的醛基可反应并形成共价键。
还原性胺化可在还原剂的存在下进行。可在初级反应步骤中以1mM至20mM的最终浓度，在次级反应步骤中以1mM至100mM的最终浓度含有还原剂，但浓度不特别限制于此。
在本发明中，还原剂指代本领域已知的能够通过还原可逆亚胺双键形成共价键的所有还原剂，所述可逆亚胺双键通过连接醛基(即，PEG的官能团)和多肽(生理活性多肽或免疫球蛋白Fc区)的胺基形成。为了本发明的目的，还原剂可含有在反应溶液中以介导PEG和生理活性多肽或免疫球蛋白Fc区之间的共价键。
在本发明中，本领域常规使用的所有还原剂均可用作还原剂。具体地，还原剂可以是氰基硼氢钠(SCB)、硼烷吡啶络合物、硼氢化钠、硼烷二甲胺络合物、硼烷三甲胺络合物或三乙酰氧基硼氢化钠，但还原剂不限于此。可根据X或F的类型和反应溶剂自由选择适当的还原剂。
同时，在本发明的初级反应步骤或次级反应步骤中，当PEG的末端官能团是马来酰亚胺基团时，X的半胱氨酸残基中的硫醇基或F的半胱氨酸残基中的硫醇基(即，巯基部分)可与PEG的马来酰亚胺基团反应以形成共价键(硫醚键)。
本发明的又一方面提供了具有改善的体内持续性和稳定性的长效胰岛素制剂。
缀合物与上面解释的相同。
同时，作为可增加生物有效度(bioavailability)或维持持续活性的剂型，可在制剂中含有使用PLGA、透明质酸、壳聚糖等的微粒(microparticles)、纳米颗粒等的缓释剂型。
另外，可增加生物有效度或维持持续活性的其它类型的制剂可包括植入物(implant)、吸入剂(inhalation)、鼻剂(nasal)、和膜片(patches)形式的制剂。
长效制剂可以是长效胰岛素制剂，与其天然生理活性物质相比，所述长效胰岛素制剂具有改善的体内持续性和稳定性。
当生理活性物质是天然胰岛素或其类似物时，长效制剂可以是用于预防或治疗胰岛素相关疾病(即，糖尿病)的药物组合物，但生理活性物质不限于此。
如本文所用，“胰岛素相关疾病”指代由于胰岛素的低生理活性或无生理活性而发生或进展(progresses)的疾病，并包括例如糖尿病，但胰岛素相关疾病不特别限制于此。
含有本发明的缀合物的药物组合物可含有药学上可接受的载体。药学上可接受的载体的实例包括，用于口服给药的黏合剂、助流剂、分解剂、赋形剂、增溶剂(solubilizer)、分散剂、稳定剂、悬浮剂、着色剂、香料(fragrance)等；可混合以用于注射的缓冲液、保存剂、镇痛药、增溶剂、等渗剂(isotonic agent)、和稳定剂等；和用于局部给药的碱、赋形剂、润滑剂、保存剂等。
可通过与上述药学上可接受的载体组合多样地制备本发明的药物组合物的剂型。例如，对于口服给药，可将组合物配制成片剂、锭剂、胶囊剂、酏剂、悬浮剂、糖浆剂、薄片等。对于注射，可将组合物配制成单位剂量安瓿或多剂量形式。还可将药物组合物配制成其它形式，如溶液、悬浮剂、片剂、丸剂、胶囊剂、缓释制剂等。
同时，合适的载体、赋形剂、和稀释剂的实例可包括乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、金合欢橡胶(acacia rubber)、褐藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁、矿物油等。
另外，药物组合物可进一步含有填料、抗凝剂、润滑剂、湿润剂、香料、保存剂等。
另外，相对于本发明的组合物的总量，本发明的缀合物的含量可以为0.001wt％至10wt％，但其量不特别限制于此。
本发明的又一方面提供了用于治疗胰岛素相关疾病的方法，其包括向有此需要的对象给予由以上式2表示的缀合物或含有该缀合物的制剂。
根据本发明的缀合物可有效用于治疗糖尿病，因此通过给予含有缀合物的药物组合物可促进胰岛素相关疾病的治疗。
如本文所用，术语“给药”指代通过适当的方式将特定物质引入患者中，并且只要药物可通过任何通常途径到达靶组织，则可通过任何常用途径给予缀合物。例如，可腹膜内、静脉内、肌肉内、皮下、皮内、口服、局部、鼻内、肺内、直肠内等进行给药，但给药不限于此。然而，由于肽在口服给药时被消化，因此必须对用于口服给药的组合物的活性成分进行包被或配制以防止胃中的降解。优选地，可以可注射的形式给予药物组合物。另外，可使用能够将活性成分运输到靶细胞中的任何装置给予药物组合物。
另外，本发明的缀合物或含有缀合物的药物组合物可由包括待治疗的疾病的类型、给药途径、年龄、性别、和患者的体重、和疾病的严重性的若干相关因素以及作为活性成分的药物的类型来决定。由于本发明的药物组合物具有优异的体内持续性和滴度，因此其可显著(considerably)降低本发明的药物制剂的给药频率和剂量。
在下文中，将参考以下实施例详细描述本发明。然而，这些实施例仅用于示例性的目的，而本发明不受这些实施例的限制。
实施例1：胰岛素–3.4kDa PEG–免疫球蛋白Fc缀合物的制备
将胰岛素粉末(Biocon，India)溶解于10mM HCl后，对于将3.4k二乙基酮(propion)-ALD(2)PEG(分别在两端具有丙醛基的PEG，NOF，USA)聚乙二醇化(pegylation)至胰岛素β链的N端，胰岛素(5mg/mL)和PEG以1:4的摩尔比混合，并在4℃下反应约2小时。此时(In particular)，通过加入氰基硼氢钠(NaCNBH3)作为还原剂，在50mM柠檬酸钠缓冲液(pH 5.0)和45％异丙醇的混合溶剂中进行反应。使用SP-HP(GE Healthcare)柱纯化反应溶液，所述SP-HP(GE Healthcare)柱利用含有柠檬酸钠(pH 3.0)和45％EtOH的缓冲液和KCl浓度梯度。
然后，将纯化的单聚乙二醇化的胰岛素和免疫球蛋白Fc片段以1:1.2的摩尔比混合，并将总蛋白质浓度调节至20mg/mL，并在25℃下反应15小时。此时，通过将100mM HEPES缓冲液(pH 8.2)和氯化钠混合来制备反应溶液，并向其中加入20mM氰基硼氢钠(NaCNBH3)作为还原剂。
在反应完成后，使用Tris-HCl(pH 7.5)缓冲液和NaCl浓度梯度将反应溶液应用于Q-HP(GE，USA)柱，再使用硫酸铵和Tris-HCl(pH 7.5)浓度梯度应用于Source 15ISO(GE，USA)柱，从而纯化胰岛素–3.4kDa PEG–免疫球蛋白Fc缀合物。
在本发明中，胰岛素–3.4kDa PEG–免疫球蛋白Fc缀合物与其中结合有3.4kDa PEG接头的长效胰岛素缀合物互换使用。
通过SE-HPLC和RP-HPLC分析洗脱的胰岛素–3.4kDa PEG–免疫球蛋白Fc缀合物，从而确认其纯度分别为98.5％和97.4％(图3和4)。图1显示了SDS-PAGE纯度分析的结果。
实施例2：胰岛素–3.0kDa PEG–免疫球蛋白Fc缀合物的制备
将胰岛素粉末(Biocon，India)溶解于10mM HCl后，为了将3k丁基-ALD(2)PEG(分别在两端具有丁醛基的PEG，Hanmi Fine Chemical，Korea)聚乙二醇化至胰岛素β链和免疫球蛋白Fc的N端，根据与实施例1相同方式的聚乙二醇化反应及其纯化条件和与免疫球蛋白Fc片段的反应及其纯化条件制备和纯化胰岛素–3kDa PEG–免疫球蛋白Fc缀合物。
在本发明中，胰岛素–3kDa PEG–免疫球蛋白Fc缀合物与其中结合有3kDa PEG接头的长效胰岛素缀合物互换使用。
通过SE-HPLC和IE-HPLC分析洗脱的胰岛素–3kDa PEG–免疫球蛋白Fc缀合物，从而确认其纯度分别为99.7％和97.9％(图3和4)。
实施例3：胰岛素–2.5kDa PEG–免疫球蛋白Fc缀合物的制备
将胰岛素粉末(Biocon，India)溶解于10mM HCl后，为了将2.5k丁基-ALD(2)PEG(分别在两端具有丁醛基的PEG，Hanmi Fine Chemical，Korea)聚乙二醇化至胰岛素β链和免疫球蛋白Fc的N端，根据与实施例1相同方式的聚乙二醇化反应及其纯化条件和与免疫球蛋白Fc片段的反应及其纯化条件制备和纯化胰岛素–2.5kDa PEG–免疫球蛋白Fc缀合物。
在本发明中，胰岛素–2.5kDa PEG–免疫球蛋白Fc缀合物与其中结合有2.5kDa PEG接头的长效胰岛素缀合物互换使用。
通过SE-HPLC和RP-HPLC分析洗脱的胰岛素–2.5kDa PEG–免疫球蛋白Fc缀合物，从而确认其纯度分别为99.4％和99.4％(图3和4)。
实施例4：胰岛素–2kDa PEG–免疫球蛋白Fc缀合物的制备
将胰岛素粉末(Biocon，India)溶解于10mM HCl后，为了将2k丁基(butyr)-ALD(2)PEG(分别在两端具有丁醛基的PEG，LAYSAN BIO，USA)聚乙二醇化至胰岛素β链和免疫球蛋白Fc的N端，根据与实施例1相同方式的聚乙二醇化反应及其纯化条件和与免疫球蛋白Fc片段的反应及其纯化条件制备和纯化胰岛素–2kDa PEG–免疫球蛋白Fc缀合物。然而，在反应完成后，使用Tris-HCl(pH 7.5)缓冲液和NaCl浓度梯度将反应溶液应用于Source 15Q(GE，USA)柱，再使用硫酸铵和Tris-HCl(pH 7.5)浓度梯度应用于Source 15ISO(GE，USA)柱，从而纯化胰岛素–2kDa PEG–免疫球蛋白Fc缀合物。
在本发明中，胰岛素–2kDa PEG–免疫球蛋白Fc缀合物与其中结合有2kDa PEG接头的长效胰岛素缀合物互换使用。
通过SE-HPLC和RP-HPLC分析洗脱的胰岛素–2kDa PEG–免疫球蛋白Fc缀合物，从而确认其纯度分别为99.9％和99.4％(图3和4)。
实施例5：胰岛素–1kDa PEG–免疫球蛋白Fc缀合物的制备
将胰岛素粉末(Biocon，India)溶解于10mM HCl后，为了将1k丁基-ALD(2)PEG(分别在两端具有丁醛基的PEG，NEKTAR，USA)聚乙二醇化至胰岛素β链的N端，根据与实施例1相同方式的聚乙二醇化反应及其纯化条件和与免疫球蛋白Fc片段的反应及其纯化条件制备和纯化胰岛素–1kDa PEG–免疫球蛋白Fc缀合物。
在本发明中，胰岛素–1kDa PEG–免疫球蛋白Fc缀合物与其中结合有1kDa PEG接头的长效胰岛素缀合物互换使用。
通过SE-HPLC和RP-HPLC分析洗脱的胰岛素–1kDa PEG–免疫球蛋白Fc缀合物，从而确认其纯度分别为99.8％和99.2％(图3和4)。图2显示了SDS-PAGE纯度分析的结果。
实施例6：长效胰岛素缀合物根据PEG接头长度在正常大鼠中的药物作用持续时间 的效果的分析
通过给予以上制备的长效胰岛素缀合物在正常大鼠中确认根据长效胰岛素缀合物的PEG接头长度的药物作用持续时间的差异，其中每种长效胰岛素缀合物结合有1kDa、2kDa、2.5kDa、3kDa、或3.4kDa PEG接头。
将八周龄正常大鼠分别再分为对照组(媒介物(vehicle))、给予其中结合有1kDaPEG接头(65.1nmol/kg)的长效胰岛素缀合物的组、给予其中结合有2kDa PEG接头(65.1nmol/kg)的长效胰岛素缀合物的组、给予其中结合有2.5kDa PEG接头(65.1nmol/kg)的长效胰岛素缀合物的组、给予其中结合有3kDa PEG接头(65.1nmol/kg)的长效胰岛素缀合物的组、和给予其中结合有3.4kDa PEG接头的长效胰岛素缀合物的组。对每组中的3只大鼠，皮下给予正常大鼠试验物质一次，分别在1、4、8、24、48、和72小时通过其尾静脉采集其全血样品，将全血样品加入每个1.5mL微管中，在室温下以5,000rpm离心10分钟，分别分离每种血清并储存在-20℃下。通过ELISA测定将每组血清中含有的胰岛素缀合物的每种浓度定量。ELISA测定以下述的方式进行，将每次收集的血清与抗人IgG4-HPR(AlphaDiagnosis，#10124)同时加入包被有胰岛素单克隆抗体(ALPCO，#80-INSHU-E10.1)的每个平板中，在室温下反应1小时，用TMB试剂显色(develop colors)，并分别在450nm下测量其吸光度。
结果，与给予其中结合有3.4kDa PEG接头的长效胰岛素缀合物的组相比，分别地，给予其中结合有1kDa PEG接头的长效胰岛素缀合物的组显示AUC增加1.84倍；给予其中结合有2kDa PEG接头的长效胰岛素缀合物的组显示AUC增加1.80倍；给予其中结合有2.5kDaPEG接头的长效胰岛素缀合物的组显示AUC增加1.41倍；和给予其中结合有3kDa PEG接头的长效胰岛素缀合物的组显示AUC增加1.43倍(图6)。
这些结果令人惊讶地表明，随着用作接头的聚乙二醇的尺寸变得更短，胰岛素缀合物的体内半衰期显著增加，因此可作为稳定的胰岛素制剂提供并有效地用于治疗糖尿病。
另外，随着用作接头的聚乙二醇的尺寸变得更短，其中连接有生理活性多肽的缀合物的体内半衰期可显著增加，从而允许其作为稳定的制剂提供。
由上可知，本发明所属领域的技术人员将能够理解，在不修改本发明的技术概念或本质特征的情况下，可以其它具体形式实施本发明。在这方面，本文公开的示例性实施方式仅用于示例性目的，而不应被解释为限制本发明的范围。相反，本发明不仅旨在涵盖示例性的实施方式，还涵盖可包括在由随附权利要求限定的本发明的精神和范围内的各种替换、修改、等同物、和其它实施方式。
<110> 韩美药品株式会社
<120> 具有增加的持续性的生理活性物质的缀合物及其应用
<130> OPA18057-PCT
<150> KR 10-2017-0015663
<151> 2017-02-03
<150> KR 10-2017-0127187
<151> 2017-09-29
<160> 6
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 21
<212> PRT
<213> 智人
<400> 1
Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu
1 5 10 15
Glu Asn Tyr Cys Asn
20
<210> 2
<211> 30
<212> PRT
<213> 智人
<400> 2
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr
20 25 30
<210> 3
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胰岛素类似物A链
<220>
<221> MISC_特征
<222> (1)
<223> Xaa是甘氨酸或丙氨酸
<220>
<221> MISC_特征
<222> (2)
<223> Xaa是异亮氨酸或丙氨酸
<220>
<221> MISC_特征
<222> (14)
<223> Xaa是酪氨酸、谷氨酸、或天冬酰胺（aspargine）
<220>
<221> MISC_特征
<222> (19)
<223> Xaa是酪氨酸或丙氨酸
<400> 3
Xaa Xaa Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Xaa Gln Leu
1 5 10 15
Glu Asn Xaa Cys Asn
20
<210> 4
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胰岛素B链
<220>
<221> MISC_特征
<222> (8)
<223> Xaa是甘氨酸或丙氨酸
<220>
<221> MISC_特征
<222> (23)
<223> Xaa是甘氨酸或丙氨酸
<220>
<221> MISC_特征
<222> (24)
<223> Xaa是苯丙氨酸或丙氨酸
<220>
<221> MISC_特征
<222> (25)
<223> Xaa是苯丙氨酸或丙氨酸
<400> 4
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Xaa Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Xaa Xaa Xaa Tyr Thr Pro Lys Thr
20 25 30
<210> 5
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胰岛素类似物A链
<220>
<221> MISC_特征
<222> (1)
<223> Xaa是丙氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、组氨酸、谷氨酸、或
天冬酰胺
<220>
<221> MISC_特征
<222> (5)
<223> Xaa是丙氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、组氨酸、或
天冬酰胺
<220>
<221> MISC_特征
<222> (12)
<223> Xaa是丙氨酸、丝氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、组氨酸、或
天冬酰胺
<220>
<221> MISC_特征
<222> (14)
<223> Xaa是丙氨酸、酪氨酸、谷氨酸、组氨酸、赖氨酸、
天冬氨酸、或天冬酰胺
<220>
<221> MISC_特征
<222> (16)
<223> Xaa是丙氨酸、亮氨酸、酪氨酸、组氨酸、谷氨酸、或
天冬酰胺
<220>
<221> MISC_特征
<222> (19)
<223> Xaa是丙氨酸、酪氨酸、丝氨酸、谷氨酸、组氨酸、
苏氨酸或天冬酰胺
<220>
<221> MISC_特征
<222> (21)
<223> Xaa是天冬酰胺、甘氨酸、组氨酸、或丙氨酸
<400> 5
Xaa Ile Val Glu Xaa Cys Cys Thr Ser Ile Cys Xaa Leu Xaa Gln Xaa
1 5 10 15
Glu Asn Xaa Cys Xaa
20
<210> 6
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胰岛素类似物B链
<220>
<221> MISC_特征
<222> (16)
<223> Xaa是酪氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸、或天冬氨酸、
或不存在
<220>
<221> MISC_特征
<222> (25)
<223> Xaa是苯丙氨酸、天冬氨酸、或谷氨酸、或不存在
<220>
<221> MISC_特征
<222> (27)
<223> Xaa是苏氨酸、或不存在
<220>
<221> MISC_特征
<222> (28)
<223> Xaa是脯氨酸、谷氨酸、或天冬氨酸、或不存在
<400> 6
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Xaa
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Xaa Tyr Xaa Xaa Lys Thr
20 25 30

Claims (19)

1.以下式1的缀合物：
[式1]
X-L-F
其中：
X是生理活性物质；
L，作为接头，是尺寸为大于0kDa至小于3.4kDa的聚乙二醇；和
F是能够增加生理活性物质的体内半衰期的物质。
2.权利要求1所述的缀合物，其中与所述缀合物具有相同X和F但具有不同L作为接头的缀合物相比，所述缀合物表现出增加的体内半衰期，所述L是尺寸为3.4kDa的聚乙二醇。
3.权利要求1所述的缀合物，其中L是尺寸为大于0kDa至3kDa以下的聚乙二醇。
4.权利要求1所述的缀合物，其中所述生理活性物质选自毒素；胰高血糖素样肽-1(GLP-1)受体激动剂；胰高血糖素受体激动剂；肠抑胃肽(GIP)受体激动剂；成纤维细胞生长因子(FGF)受体激动剂；胆囊收缩素受体激动剂；胃泌素受体激动剂；黑皮质素受体激动剂；与GLP受体、胰高血糖素受体、和GIP受体中的两种或更多种受体结合的物质；生长抑素；肽YY(PYY)；神经肽Y(NPY)；泌酸调节肽；成纤维细胞生长因子(FGF)；缓激肽；麝香蛸毒肽；催产素；血管升压素；舍莫瑞林；催乳素释放肽；食欲肽；甲状腺释放肽；钙调蛋白；促胃动素；血管活性肠肽；心房钠尿肽(ANP)；C型纳尿肽(CNP)；神经激肽A；神经调节肽；肾素；内皮素；角蝰毒素肽；carsomorphin肽；皮啡肽；强啡肽；内啡肽；脑啡肽；肿瘤坏死因子受体；尿激酶受体；促胸腺生成素；胸腺肽；胸腺喷丁；胸腺素；胸腺体液因子；肾上腺髓质素；抑咽侧体神经肽；淀粉样β蛋白片段；抗菌肽；抗氧化肽；蛙皮素；骨钙素；CART肽；E选择蛋白；细胞间粘附分子1(ICAM-1)；血管细胞粘附分子1(VCAM-1)；leucokine；三环-5；层粘连蛋白；抑制素；甘丙肽；纤连蛋白；胰抑制素；恩夫韦肽；胰高血糖素样肽；G蛋白偶联受体；促红细胞生长因子；白细胞生成素；支链淀粉；人生长激素；生长激素释放激素；生长激素释放肽；干扰素；干扰素受体；集落刺激因子；白细胞介素；白细胞介素受体；酶；白细胞介素结合蛋白；细胞因子结合蛋白；巨噬细胞活化因子；巨噬细胞肽；B细胞因子；T细胞因子；蛋白A；变态反应抑制因子；坏死糖蛋白；免疫毒素；淋巴细胞毒素；肿瘤坏死因子；肿瘤抑制因子；转化生长因子；α-1抗胰蛋白酶；白蛋白；α-乳清蛋白；载脂蛋白-E；促红细胞生成素；高糖基化促红细胞生成素；血管生成素；血红蛋白；凝血酶；凝血酶受体活化肽；血栓调节蛋白；凝血因子VII；凝血因子VIIa；凝血因子VIII；凝血因子IX；凝血因子XIII；纤溶酶原活化因子；纤维蛋白结合肽；尿激酶；链激酶；水蛭素；蛋白C；C-反应蛋白；肾素抑制剂；胶原蛋白酶抑制剂；超氧化物歧化酶；瘦蛋白；血小板衍生生长因子；上皮生长因子；表皮生长因子；制管张素；血管紧张素；骨形态发生生长因子；骨形态发生蛋白；降钙素；胰岛素；心钠素；软骨诱导因子；依降钙素；结缔组织活化因子；组织因子途径抑制剂；促卵泡激素；促黄体生成激素；促黄体生成激素释放激素；神经生长因子；轴突发生因子-1；脑促尿钠排泄肽；神经胶质衍生的神经营养因子；导蛋白；嗜中性白细胞抑制因子；神经营养因子；神经秩蛋白；甲状旁腺激素；松弛素；促胰液素；生长调节素；胰岛素样生长因子；肾上腺皮质激素；胰高血糖素；胆囊收缩素；胰多肽；胃泌素释放肽；胃泌素抑制肽；促肾上腺皮质激素释放因子；促甲状腺激素；自体毒素；乳铁蛋白；肌肉生长抑制素；活动依赖性神经保护蛋白(ADNP)、β-分泌酶1(BACE1)、淀粉样前体蛋白(APP)、神经细胞黏着分子(NCAM)、淀粉样蛋白β、tau、渐进性糖化终极产物(RAGE)的受体、α-突触核蛋白、或其激动剂或拮抗剂；受体、受体激动剂；细胞表面抗原；单克隆抗体；多克隆抗体；抗体片段；病毒衍生的疫苗抗原；活化至少一种受体激动剂的杂合多肽或嵌合多肽；及其类似物。
5.权利要求4所述的缀合物，其中：
所述毒素选自美登素或其衍生物、奥利斯他汀或其衍生物、倍癌霉素或其衍生物、和吡咯并苯并二氮杂草(PBD)或其衍生物；
所述胰高血糖素样肽-1(GLP-1)受体激动剂选自天然胰高血糖素样肽-1(GLP-1)、天然毒蜥外泌肽-3、天然毒蜥外泌肽-4及其类似物；
所述FGF受体激动剂选自FGF1或其类似物、FGF19或其类似物、FGF21或其类似物、和FGF23或其类似物；
所述干扰素选自干扰素-α、干扰素-β、和干扰素-γ；
所述干扰素受体选自干扰素-α受体、干扰素-β受体、干扰素-γ受体、和可溶性I型干扰素受体；
所述白细胞介素选自白细胞介素-1、白细胞介素-2、白细胞介素-3、白细胞介素-4、白细胞介素-5、白细胞介素-6、白细胞介素-7、白细胞介素-8、白细胞介素-9、白细胞介素-10、白细胞介素-11、白细胞介素-12、白细胞介素-13、白细胞介素-14、白细胞介素-15、白细胞介素-16、白细胞介素-17、白细胞介素-18、白细胞介素-19、白细胞介素-20、白细胞介素-21、白细胞介素-22、白细胞介素-23、白细胞介素-24、白细胞介素-25、白细胞介素-26、白细胞介素-27、白细胞介素-28、白细胞介素-29、和白细胞介素-30；
所述白细胞介素受体是白细胞介素-1受体或白细胞介素-4受体；
所述酶选自β-葡糖苷酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、艾杜糖苷酸酶、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、半乳糖-6-硫酸酯酶、酸性α-葡糖苷酶、酸性神经酰胺酶、酸性鞘磷脂酶、半乳糖脑苷脂酶、芳基硫酸酯酶A、芳基硫酸酯酶B、β-氨基己糖苷酶A、β-氨基己糖苷酶B、肝素N-硫酸酯酶、α-D-甘露糖苷酶、β-葡糖醛酸酶、N-乙酰半乳糖胺-6硫酸酯酶、溶酶体酸性脂肪酶、α-N-乙酰葡糖苷酶、葡糖脑苷酯酶、丁酰胆碱酯酶、几丁质酶、谷氨酸脱羧酶、葡糖苷脂酰鞘氨醇酶类似物、脂肪酶、尿酸氧化酶、血小板活化因子乙酰水解酶、中性内肽酶、髓过氧化物酶、α-半乳糖苷酶-A、半乳糖苷酶α、半乳糖苷酶β、α-L-艾杜糖苷酸酶、丁酰胆碱酯酶、几丁质酶、谷氨酸脱羧酶、和葡糖苷脂酰鞘氨醇酶类似物；
所述白细胞介素结合蛋白是IL-18bp；
所述细胞因子结合蛋白是肿瘤坏死因子(TNF)结合蛋白；
所述神经生长因子选自神经生长因子、睫状神经营养因子、轴突发生因子-1、脑促尿钠排泄肽、神经胶质衍生的神经营养因子、导蛋白、嗜中性白细胞抑制因子、神经营养因子、和神经秩蛋白；
所述肌肉生长抑制素受体选自TNFR(P75)、TNFR(P55)、IL-1受体、VEGF受体、和B细胞活化因子受体；
所述肌肉生长抑制素受体拮抗剂是IL1-Ra；
所述细胞表面抗原选自CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD11a、CD11b、CD18、CD19、CD20、CD23、CD25、CD33、CD38、CD40、CD45、和CD69；和
所述抗体片段选自scFv、Fab、Fab′、F(ab′)2、和Fd。
6.权利要求1所述的缀合物，其中所述生理活性物质是天然毒蜥外泌肽-3或其类似物；天然毒蜥外泌肽-4或其类似物；天然胰岛素或其类似物；天然GLP-1或其类似物；天然GLP-2或其类似物；天然泌酸调节肽或其类似物；天然胰高血糖素或其类似物；天然成纤维细胞生长因子或其类似物；天然生长素释放肽或其类似物；天然降钙素或其类似物；天然粒细胞集落形成刺激因子或其类似物；或与GLP受体、胰高血糖素受体、和GIP受体中的两种或更多种受体结合的物质。
7.权利要求1所述的缀合物，其中所述生理活性物质是天然胰岛素或胰岛素类似物，所述胰岛素类似物与天然胰岛素相比对胰岛素受体具有降低的结合亲和力。
8.权利要求7所述的缀合物，其中所述胰岛素类似物与天然胰岛素相比对胰岛素受体具有降低的结合亲和力，并在天然胰岛素的A链或B链中包含至少一个氨基酸修饰或缺失。
9.权利要求8所述的缀合物，其中所述胰岛素类似物是其中至少一个氨基酸被不同的氨基酸取代或缺失的胰岛素类似物，所述至少一个氨基酸选自胰岛素B链的第1位氨基酸、第2位氨基酸、第3位氨基酸、第5位氨基酸、第8位氨基酸、第10位氨基酸、第12位氨基酸、第16位氨基酸、第23位氨基酸、第24位氨基酸、第25位氨基酸、第26位氨基酸、第27位氨基酸、第28位氨基酸、第29位氨基酸、和第30位氨基酸，和胰岛素A链的第1位氨基酸、第2位氨基酸、第5位氨基酸、第8位氨基酸、第10位氨基酸、第12位氨基酸、第14位氨基酸、第16位氨基酸、第17位氨基酸、第18位氨基酸、第19位氨基酸、和第21位氨基酸。
10.权利要求9所述的缀合物，其中所述胰岛素类似物是其中至少一个氨基酸被不同的氨基酸取代的胰岛素类似物，所述至少一个氨基酸选自所述天然胰岛素B链的第8位氨基酸、第23位氨基酸、第24位氨基酸、和第25位氨基酸，和所述天然胰岛素A链的第1位氨基酸、第2位氨基酸、第14位氨基酸、和第19位氨基酸。
11.权利要求10所述的缀合物，其中所述取代的不同的氨基酸选自丙氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、异亮氨酸、缬氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、赖氨酸、组氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、和天冬氨酸。
12.权利要求1所述的缀合物，其中F选自聚合物、脂肪酸、胆固醇、白蛋白及其片段、白蛋白结合物质、特定氨基酸序列的重复单元的聚合物、抗体、抗体片段、FcRn结合物质、体内结缔组织、核苷酸、纤连蛋白、转铁蛋白、糖、肝素、和弹性蛋白。
13.权利要求12所述的缀合物，其中所述聚合物选自聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇-丙二醇共聚物、聚氧乙烯化多元醇、聚乙烯醇、多糖、葡聚糖、聚乙烯基乙醚、生物可降解的聚合物、脂质聚合物、几丁质、透明质酸、寡核苷酸及其组合。
14.权利要求1所述的缀合物，其中F是免疫球蛋白Fc区。
15.权利要求1所述的缀合物，其中F是IgG Fc区。
16.用于制备权利要求1所述的缀合物的方法，其包括：
(a)使具有大于0kDa至小于3.4kDa尺寸和至少两个末端官能团的聚乙二醇与生理活性物质或能够增加所述生理活性物质的体内半衰期的物质中的任一种反应，以制备聚乙二醇，其共价地连接到所述生理活性物质或所述能够增加生理活性物质的体内半衰期的物质中的一种且其具有至少一个末端官能团；以及
(b)使步骤(a)中制备的所述聚乙二醇与生理活性物质或能够增加所述生理活性物质的体内半衰期的物质中的另一个反应以制备缀合物，其中所述生理活性物质和能够增加所述生理活性物质的体内半衰期的物质通过尺寸为大于0kDa至小于3.4kDa的聚乙二醇共价地连接。
17.具有改善的体内持续性和稳定性的长效制剂，所述长效制剂包含权利要求1至15中任一项所述的缀合物。
18.用于预防或治疗糖尿病的制剂，所述制剂包含权利要求7至11中任一项所述的缀合物。
19.用于治疗糖尿病的方法，所述方法包括向有此需要的对象给予权利要求18所述的用于预防或治疗糖尿病的制剂。
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MX (1) MX2019009149A (zh)
TW (1) TW201831207A (zh)
WO (1) WO2018143729A1 (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2020228610A1 (zh) * 2019-05-10 2020-11-19 宁波鲲鹏生物科技有限公司 多肽衍生物及其制备方法

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2020530440A (ja) 2017-07-03 2020-10-22 トルク セラピューティクス， インコーポレイテッド 免疫刺激性融合分子をコードするポリヌクレオチドおよびその使用
WO2020120479A1 (en) 2018-12-11 2020-06-18 Sanofi Peptide binder
CN113453703A (zh) * 2018-12-21 2021-09-28 韩美药品株式会社 包括胰岛素和对胰高血糖素和glp-1和gip受体均具有活性的三重激动剂的药物组合物
EP3900734A4 (en) * 2018-12-21 2022-10-12 Hanmi Pharm. Co., Ltd. PHARMACEUTICAL COMPOSITION WITH INSULIN AND GLUCAGON
WO2022030580A1 (ja) * 2020-08-06 2022-02-10 国立大学法人宮崎大学 長時間作用型新規アドレノメデュリン誘導体、その製造方法及びその医薬用途
CN116419765A (zh) * 2020-10-16 2023-07-11 韩美药品株式会社 Glp-1/gip双重激动剂、其长效缀合物，以及包括其的药物组合物
WO2023173086A1 (en) * 2022-03-11 2023-09-14 Avirmax Biopharma Inc. Compositions and methods for expressing therapeutics

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20110134209A (ko) * 2010-06-08 2011-12-14 한미홀딩스 주식회사 면역글로불린 단편을 이용한 단쇄 인슐린 아날로그 약물 결합체
CN102869371A (zh) * 2010-04-02 2013-01-09 韩美科学株式会社 使用免疫球蛋白片段的胰岛素缀合物
CN103435699A (zh) * 2007-01-05 2013-12-11 韩美科学株式会社 使用免疫球蛋白片段的促胰岛素缀合物
US20140120120A1 (en) * 2011-06-02 2014-05-01 Hanmi Science Co., Ltd Composition for treating diabetes comprising long-acting insulin conjugate and long-acting insulinotropic peptide conjugate
WO2015199511A1 (en) * 2014-06-27 2015-12-30 Hanmi Pharm. Co., Ltd. Novel long-acting insulin analogue and use thereof
US20170020991A1 (en) * 2010-04-02 2017-01-26 Hanmi Science Co., Ltd Insulin conjugate using an immunoglobulin fragment

Family Cites Families (26)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6096871A (en) 1995-04-14 2000-08-01 Genentech, Inc. Polypeptides altered to contain an epitope from the Fc region of an IgG molecule for increased half-life
DE69731289D1 (de) 1996-03-18 2004-11-25 Univ Texas Immunglobulinähnliche domäne mit erhöhten halbwertszeiten
KR100356140B1 (ko) 1999-07-08 2002-10-19 한미약품공업 주식회사 인간 과립구 콜로니 자극인자 변이체 및 이의 생산 방법
ES2438098T3 (es) * 2003-11-13 2014-01-15 Hanmi Science Co., Ltd. Composición farmacéutica que comprende un Fc de inmunoglobulina como vehículo
JP2009019027A (ja) 2007-07-16 2009-01-29 Hanmi Pharmaceutical Co Ltd アミノ末端のアミノ酸が変異したインスリン分泌ペプチド誘導体
CN103732618B (zh) 2011-06-10 2018-10-09 韩美科学株式会社 新型泌酸调节肽衍生物和包含该泌酸调节肽衍生物的用于治疗肥胖的药物组合物
SI2721062T1 (sl) 2011-06-17 2019-03-29 Hanmi Science Co., Ltd. Konjugat, obsegajoč oksintomodulinski in imunoglobinski fragment, in uporaba le-tega
ES2868351T3 (es) 2013-02-26 2021-10-21 Hanmi Pharm Ind Co Ltd Conjugados de análogos de insulina y usos de los mismos
KR101895634B1 (ko) * 2013-05-31 2018-09-05 한미약품 주식회사 변이된 힌지 영역을 포함하는 IgG4 Fc 단편
EP3098235A4 (en) 2014-01-20 2017-10-18 Hanmi Pharm. Co., Ltd. Long-acting insulin and use thereof
SG11201608120TA (en) * 2014-03-31 2016-11-29 Hanmi Pharm Ind Co Ltd Method for improving solubility of protein and peptide by using immunoglobulin fc fragment linkage
AR100639A1 (es) * 2014-05-29 2016-10-19 Hanmi Pharm Ind Co Ltd Composición para tratar diabetes que comprende conjugados de análogos de insulina de acción prolongada y conjugados de péptidos insulinotrópicos de acción prolongada
AR100695A1 (es) * 2014-05-30 2016-10-26 Hanmi Pharm Ind Co Ltd Composición para el tratamiento de diabetes mellitus que comprende insulina y un agonista dual glp-1 / glucagón
KR20150140177A (ko) * 2014-06-05 2015-12-15 한미약품 주식회사 단백질 및 펩타이드의 면역원성을 감소시키는 방법
KR20160007295A (ko) * 2014-07-11 2016-01-20 한미약품 주식회사 인슐린 아날로그
TWI802396B (zh) 2014-09-16 2023-05-11 南韓商韓美藥品股份有限公司 長效glp-1/高血糖素受體雙促效劑治療非酒精性脂肝疾病之用途
TW201639878A (zh) 2014-12-30 2016-11-16 韓美藥品股份有限公司 具有改善之安定性的升糖素衍生物
PT3322437T (pt) * 2015-06-30 2024-03-20 Hanmi Pharmaceutical Co Ltd Derivado de glucagon e composição que compreende um conjugado de ação prolongada do mesmo
UY36870A (es) 2015-08-28 2017-03-31 Hanmi Pharm Ind Co Ltd Análogos de insulina novedosos
JP7222710B2 (ja) * 2015-09-24 2023-02-15 ハンミ ファーマシューティカル カンパニー リミテッド 免疫グロブリン断片の特定位置を連結部位として用いたタンパク質結合体
TW201718629A (zh) * 2015-09-25 2017-06-01 韓美藥品股份有限公司 包含多個生理多肽及免疫球蛋白Ｆｃ區之蛋白質接合物
CN116063453A (zh) 2015-12-31 2023-05-05 韩美药品株式会社 胰高血糖素/glp-1/gip受体三重激动剂
MX2019000019A (es) * 2016-06-29 2019-05-06 Hanmi Pharm Ind Co Ltd Derivado de glucagon, conjugado del mismo, composicion que comprende el mismo y uso terapeutico del mismo.
US20200078470A1 (en) * 2016-12-05 2020-03-12 Hanmi Pharm. Co., Ltd. Conjugate with attenuated immune response
MX2019011297A (es) * 2017-03-23 2019-11-12 Hanmi Pharm Ind Co Ltd Complejo de analogo de insulina con afinidad reducida por el receptor de insulina y uso del mismo.
JP2020535199A (ja) * 2017-09-29 2020-12-03 ハンミ ファーマシューティカル カンパニー リミテッド 効力が向上した持続性タンパク質結合体

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103435699A (zh) * 2007-01-05 2013-12-11 韩美科学株式会社 使用免疫球蛋白片段的促胰岛素缀合物
CN102869371A (zh) * 2010-04-02 2013-01-09 韩美科学株式会社 使用免疫球蛋白片段的胰岛素缀合物
US20170020991A1 (en) * 2010-04-02 2017-01-26 Hanmi Science Co., Ltd Insulin conjugate using an immunoglobulin fragment
KR20110134209A (ko) * 2010-06-08 2011-12-14 한미홀딩스 주식회사 면역글로불린 단편을 이용한 단쇄 인슐린 아날로그 약물 결합체
US20140120120A1 (en) * 2011-06-02 2014-05-01 Hanmi Science Co., Ltd Composition for treating diabetes comprising long-acting insulin conjugate and long-acting insulinotropic peptide conjugate
WO2015199511A1 (en) * 2014-06-27 2015-12-30 Hanmi Pharm. Co., Ltd. Novel long-acting insulin analogue and use thereof

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2020228610A1 (zh) * 2019-05-10 2020-11-19 宁波鲲鹏生物科技有限公司 多肽衍生物及其制备方法

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