TW201639878A - 具有改善之安定性的升糖素衍生物 - Google Patents
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Abstract
本發明係關於新穎升糖素衍生物肽以及含有該新穎升糖素衍生物肽作為活性成份之用以預防或治療低血糖症的組成物。本發明之升糖素衍生物具有起因於等電點改變(pI)同時對升糖素受體能維持活性的經改善之物理性質，且因此當使用作為低血糖症時可改善患者醫囑性，且亦適合用於與其他抗肥胖劑組合投藥。因此，本發明之升糖素衍生物可有效地使用於預防或治療低血糖症及肥胖。
Description
本發明關於起因於等電點(pI)改變而具有改善之物理性質的新穎升糖素衍生物，以及含有該升糖素衍生物作為活性成份之用於預防或治療低血糖症及肥胖之組成物。
近來的經濟進展以及生活型態改變伴隨著攝食習慣上的重大改變。特別地，現今的忙碌人類由於高卡洛里飲食以及不充足的運動而為體重過重以及肥胖。世界衛生組織(WHO)已報導全世界超過10億個成人為體重過重，其中超過三百萬人經臨床診斷為嚴重肥胖，且每年有二萬五千人因體重過重或肥胖相關疾病死亡(World Health Organization,Global Strategy on Diet,Physical Activity and Health,2004)。
體重過重及肥胖造成血壓及膽固醇量增加以及引起或惡化多種疾病，如心臟疾病、糖尿病、關節炎等。此外，肥胖問題亦成為兒童或青少年以及成人中增加動脈粥狀硬化、高血脂症或心臟疾病的主因。然而，肥胖不容易治療，此乃因其為與食慾調控以及能量代謝的機制
相關的複合性疾病。因此，肥胖的治療不僅需要患者本身的努力，也需要能治療與食慾調控及能量代謝相關的異常機制的方法。因此，已致力於開發用以治療異常機制的藥物。
該等努力的結果，已開發如利莫那班(Rimonabant)(Sanofi-Aventis)、西步曲明(Sibutramin)(Abbott)、康崔扶(Contrave)(Takeda)、及奧利司他(Orlistat)(Roche)等藥物，但其等具有嚴重副作用或非常弱的抗肥胖效果的缺點。例如，根據報導，利莫那班顯示中樞神經系統疾患的副作用，西步曲明及康崔扶顯示心血管副作用，以及奧利司他顯示當服用1年僅減少約4公斤體重。因此，尚未有對於肥胖患者可安全處方的肥胖治療劑。
已進行許多廣泛的研究以開發針對肥胖之可解決傳統抗肥胖藥物的問題的新穎治療劑。近來，升糖素衍生物受到許多關注。當因其他藥物或疾病，或激素或酵素缺乏的結果而血糖量下降時，由胰臟製造升糖素。升糖素刺激肝臟中的肝糖降解，且有助於葡萄糖釋放以提升血糖量至正常範圍。除了有效於增加血糖量，升糖素壓抑食慾且活化脂肪細胞之激素敏感脂解酶而有助於脂解，藉此顯示抗肥胖效果。然而，使用升糖素作為治療劑受到侷限在於其低溶解度以及於中性pH會沉澱的性質。
升糖素衍生物之一為類升糖素肽-1(GLP-1)，其已開發作為於罹患糖尿病的患者用於治療高血糖症的治療劑。GLP-1具有刺激胰島素合成與分泌、抑制升糖素分
泌、減緩胃排空、增加葡萄糖利用性以及抑制食物攝取的功能。
艾塞那肽(Exendin-4)係自蜥蜴毒液製備且具有與GLP-1約50%的胺基酸同源性，業經報導活化GLP-1受體，藉此於罹患糖尿病的患者降低高血糖症。然而，經報導含有GLP-1的抗肥胖藥物顯示如嘔吐及噁心之副作用。
因此，作為GLP-1的替代物，已有許多注意力著眼於泌酸調節素(oxyntomodulin)，其可結合至GLP-1及升糖素之二種肽的受體。泌酸調節素為自升糖素前驅物(前升糖素)所製備的肽，且具有抑制食物攝取以及增強GLP-1的飽足的功能，以及具有如同升糖素的脂解活性，因而於抗肥胖療法中增加其潛力。
然而，泌酸調節素或其衍生物具有嚴重缺點在於，因其具有低藥效以及活體內的短半衰期而應每日投藥過量的藥物以用於肥胖治療。
此外，當GLP-1及升糖素的活性二者存在於單一肽時，其活性比例變成固定，且因此難以利用各種比例去使用雙促效劑。因此，藉由調整GLP-1及升糖素的含量而能使用各種活性比例的組合療法可更為有效。
然而，對於組合療法，需要改善升糖素的物理特徵，升糖素於中性pH凝集且隨著時間沉澱，因此顯示不佳的溶解度。
於該等條件下，本發明人已開發具有升糖
素的胺基酸序列部分修飾的升糖素衍生物，藉由改善升糖素的物理性質而改善升糖素對於低血糖症及肥胖的治療效果，且已發現該等升糖素衍生物於中性pH具有改善的溶解度及較高的安定性，從而完成本發明。
本發明之目的係提供具有改善之物理性質的新穎升糖素衍生物。
本發明之另一目的係提供含有該升糖素衍生物作為活性成份之用於預防或治療低血糖症的組成物。
本發明之再一目的係提供含有該升糖素衍生物作為活性成分之用於預防或治療肥胖的組成物。
為了達成上述目的，於一態樣中，本發明提供新穎之升糖素衍生物，其包含下述通式I之胺基酸序列且具有與天然升糖素不相同(亦即不同)的等電點(pI)：X1-X2-QGTF-X7-SDYS-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18-X19-X20-X21-F-X23-X24-W-L-X27-X28-T (通式1)
其中，於通式1中，X1為組胺酸、去胺基-組胺酸、N-二甲基-組胺酸、β-羥基咪唑丙酸、4-咪唑乙酸、β-羧基咪唑丙酸、色胺酸、酪胺酸、或經刪除；X2為α-甲基-麩胺酸、胺基異丁酸(Aib)、D-丙胺酸、甘胺酸、Sar(N-甲基甘胺酸)、絲胺酸或D-絲胺酸；
X7為蘇胺酸或纈胺酸；X12為離胺酸或半胱胺酸；X13為酪胺酸或半胱胺酸；X14為白胺酸或半胱胺酸；X15為天冬胺酸、麩胺酸或半胱胺酸；X16為麩胺酸、天冬胺酸、絲胺酸、α-甲基-麩胺酸或半胱胺酸；X17為天冬胺酸、麩醯胺酸、麩胺酸、離胺酸、精胺酸、絲胺酸、纈胺酸或半胱胺酸；X18為天冬胺酸、麩醯胺酸、麩胺酸、精胺酸或半胱胺酸；X19為丙胺酸或半胱胺酸；X20為離胺酸，麩胺酸、麩醯胺酸、天冬胺酸、離胺酸或半胱胺酸；X21為天冬胺酸、麩胺酸、纈胺酸或半胱胺酸；X23為纈胺酸或精胺酸；X24為纈胺酸、白胺酸、麩醯胺酸或精胺酸；X27為異白胺酸或甲硫胺酸；以及X28為精胺酸或天冬醯胺(限制條件為當通式1的胺基酸序列與SEQ ID NO：1相同時，將其排除)。
根據本發明之升糖素衍生物包含肽、肽衍生物或肽模擬物，其等藉由修飾天然升糖素的部分胺基酸而具有與天然升糖素不同的等電點而具有改善之物理性
質。
如使用於本文，用語「天然升糖素」意指具有以下序列之天然人類升糖素His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr(SEQ ID NO：1)。
關於本發明之通式1的序列，根據傳統敘述方式，胺基酸自左方N-終端繼續至右方C-終端。因此，當任何特定殘基的「位置」指稱於通式1的序列中時，其應以與當指稱天然升糖素或其他分子的任何位置時之相同方式予以解讀。
本發明之說明書全文中，不僅對於天然產生的胺基酸使用傳統的一字母或三字母碼，對於其他胺基酸，如α-胺基異丁酸(Aib)、Sar(N-甲基甘胺酸)及α-甲基-麩胺酸，一般而言亦允許使用三字母碼。
此外，本文所述及的胺基酸根據IUPAC-IUB命名法簡寫如下：丙胺酸A；精胺酸R；天冬醯胺N；天冬胺酸D；半胱胺酸C；麩胺酸E；麩醯胺酸Q；甘胺酸G；組胺酸H；異白胺酸I；白胺酸L；離胺酸K；甲硫胺酸M；苯丙胺酸F；
脯胺酸P；絲胺酸S；蘇胺酸T；色胺酸W；酪胺酸Y；以及纈胺酸V。
如使用於本文，用語「肽」意指二個或更多個天然或非天然胺基酸或如α-胺基酸之胺基酸衍生物藉由肽鍵連結的化合物。如使用於本文，用語「升糖素衍生物」意指包含通式1或其衍生物、其類似物或其經修飾產物的序列的肽。本發明之肽包含類肽物(peptidomimetics)，其藉由以取代等形式修飾升糖素的部分胺基酸而相較於天然升糖素具有pI變化。本發明之例示性具體例中，升糖素衍生物具有不同於天然升糖素之等電點而仍維持升糖素受體的活性。本發明之更具體例示性具體例中，升糖素衍生物指稱為具有於生理性pH之改善的天然升糖素的溶解度同時維持升糖素受體活性之肽。
如使用於本文，用語「pI」或「等電點」意指如多肽之大分子不具有淨電荷(0)的pH值。在具有各種帶電荷官能基的多肽之情況中，於pH值與pI值相同時，全部多肽之淨電荷為「0」。於較高於pI的pH時，多肽之淨電荷將為負，而於較低於pI的pH時，多肽之淨電荷將為正。
可藉由所屬技術領域中習知的方法測量或估算pI值。例如，pI值可於由聚丙烯醯胺、澱粉或瓊脂膠所組成之固定化pH梯度凝膠上，藉由等電點電泳而測量，或例如使用pI/MW工具(http：//expasy.org/tools/pi_tool.html；
Gasteiger et al.,2003)於ExPASy伺服器中由胺基酸序列而估算。
本發明之特定具體例中，含有通式1之胺基酸序列的升糖素衍生物涵蓋於SEQ ID NO：1所示天然升糖素之胺基酸中藉由置換、添加、刪除或轉譯後修飾(例如，甲基化、醯化、泛素化或分子內共價鍵結)所製備之任何肽，因其pI與天然升糖素的pI不同且同時維持其原有之升糖素受體活性，而顯示改善之根據溶液pH的溶解度，藉此具有改善的活體內化學安定性。
於胺基酸的置換或添加中，不僅可使用通常可見於人體蛋白質的20個胺基酸，亦可使用非天然產生的胺基酸及其衍生物。非典型胺基酸的商業來源可包括Sigma-Aldrich、ChemPep Inc.、Genzyme Pharmaceuticals等。包含該等胺基酸序列及非典型胺基酸序列的肽可由供應商，如American Peptide Company、Bachem(USA)或Anygen(Korea)合成及購得。胺基酸衍生物，如去胺基-組胺酸、β-羥基咪唑丙酸、4-咪唑乙酸或β-羥基咪唑丙酸，可以相同方式獲得。
由於升糖素具有約7的pH，其於具有pH為6至8之溶液中為不溶且於中性pH傾向沉澱。於具有pH為3或更低的水溶液中，升糖素於初始階段溶解，但於一小時內形成凝膠而沉澱。由於凝膠化升糖素是主要由β-摺板原纖維所組成，由此而沉澱的升糖素經由注射針或靜脈內注射的投藥會阻塞血管，且因而不適合使用作為注射
劑。為了延遲沉澱過程，通常使用酸性(pH2至4)調配物，且藉此，升糖素可於短時間其間維持相對非凝集狀態。然而，於低pH時，升糖素可非常快速地形成原纖維，且因此該等酸性調配物必須於製備時注射。
所屬技術領域廣泛已知蛋白質於溶液中的溶解度、活性及安定性可根據pI變動(Shaw,K.L.et al.,Protein Science 10,pp 1206-1215,2001)。
因此，本發明者們已開發藉由修飾天然升糖素的序列，藉此改變其pI而具有延長安定性及功能效果的升糖素衍生物。本發明之升糖素衍生物藉由具有相較於天然升糖素為經改變的pI，係以相較於天然升糖素，其等具有根據給定溶液的pH之經改善的溶解度及安定性為特徵。
本發明之特定具體例中，升糖素衍生物可為肽，其中於通式1的胺基酸序列中：X1為組胺酸或色胺酸、酪胺酸、或經刪除；X2為絲胺酸或胺基異丁酸(Aib)；X7為蘇胺酸或纈胺酸；X12為離胺酸或半胱胺酸；X13為酪胺酸或半胱胺酸；X14為白胺酸或半胱胺酸；X15為天冬胺酸或半胱胺酸；X16為麩胺酸、天冬胺酸、絲胺酸或半胱胺酸；X17為天冬胺酸、麩胺酸、離胺酸、精胺酸、纈胺酸
或半胱胺酸；X18為天冬胺酸、麩胺酸、精胺酸或半胱胺酸；X19為丙胺酸或半胱胺酸；X20為離胺酸，麩胺酸、麩醯胺酸、天冬胺酸、離胺酸或半胱胺酸；X21為天冬胺酸、麩胺酸、纈胺酸或半胱胺酸；X23為纈胺酸或精胺酸；X24為纈胺酸，白胺酸或麩醯胺酸；X27為異白胺酸或甲硫胺酸；以及X28為精胺酸或天冬醯胺(限制條件為當通式1的胺基酸序列與SEQ ID NO：1相同時，將其排除)。
更佳地，本發明之升糖素衍生物可為包含由SEQ ID NO：2至34所示之胺基酸序列中之任一胺基酸序列的肽。
本發明之包含升糖素衍生物的肽可藉由標準合成方法、重組表現系統或所屬技術領域中之任何其他方法所製備。因此，根據本發明之升糖素類似物可藉由包含下述方法之許多方法合成：(a)藉由逐步的固相或液相方法或藉由片段組裝，接著藉由單離及純化最終肽產物的合成肽的方法；或者(b)於宿主細胞中表現編碼肽的核酸構築物且自宿主細胞培養物回收表現產物的方法；或者(c)進行編碼肽之核酸構築物活體外無細胞表現且自
其回收產物的方法；或者(d)藉由方法(a)、(b)及(c)的任何組合而獲得肽片段，藉由聯結該等肽片段而獲得肽，以及然後回收該肽的方法。
本發明之例示性態樣中，已確認本發明之升糖素衍生物相較於天然升糖素具有不同pI(參照表1)。結果為本發明之升糖素衍生物，相較於天然升糖素，根據給定溶液的pH具有經改善的溶解度及較高的安定性。因此，當本發明之升糖素衍生物使用作為低血糖劑時可增加患者醫囑性且亦適用於與其他抗肥胖劑組合而用於投藥之組合投藥，且因而可有效率地使用於低血糖症及肥胖的預防與治療。
就此點而言，本發明之升糖素衍生物可提供對於低血糖、肥胖或其相關疾患之具吸引力的治療選項。
例如，本發明之升糖素衍生物為主要胰島素回應-調控激素，且於糖尿病患中可有效地使用於治療嚴重的低血糖症。
此外，本發明之升糖素衍生物可使用作為不僅預防體重增加、促進體重降低、減少體重過重以及包含死亡肥胖之肥胖症(例如，藉由調控食慾、攝取、攝食、卡洛里攝取及/或能量消耗)的醫藥物，亦可使用作為治療肥胖相關炎症、肥胖相關膽囊疾病以及肥胖誘發睡眠呼吸中止症，但不限於其等的醫藥物，且可使用於治療其相關疾病或健康狀況。本發明之升糖素衍生物亦可使用於治療可能與肥胖相關之健康狀況，如代謝症候群、高血壓、動
脈粥狀誘發之血脂異常、動脈粥狀硬化、動脈的硬化、冠狀心臟疾病、中風等。然而，根據本發明之升糖素衍生物的功效可全部或部分地藉由上述的體重相關功效予以介導，或可不依賴該功效。
同時，為了改善本發明升糖素衍生物的治療效果，該升糖素衍生物可使用所屬技術領域之典型技術予以修飾，包含利用例如聚乙二醇(PEG)之聚合物及糖鏈之修飾，或與白蛋白、轉鐵蛋白、脂肪酸以及免疫球蛋白之融合等。例如，本發明化合物中之至少一胺基酸側鏈可附接至聚合物以增加其活體內之溶解度及/或半衰期，及/或增加其生物可利用性。該修飾已知為降低治療性蛋白質及肽之廓清。
對於該等聚合物，合適為可溶性(兩親性或親水性)、非毒性以及醫藥惰性聚合物，以及較佳地，其等可包含PEG、PEG的均聚合物或共聚物、經單甲基取代之聚合物(mPEG)以及如聚-離胺酸、聚-天冬胺酸與聚-麩胺酸之聚-胺基酸。
如上所述之升糖素衍生物的變異體亦屬於本發明之範疇。
另一態樣中，本發明提供編碼如上所述升糖素衍生物之多核苷酸。
用語「同源性」，如使用於本文之多核苷酸，意指相似於野生型胺基酸序列與野生型核酸序列的程度，且包含基因序列其與編碼升糖素衍生物的多核苷酸序
列有75%或更高，較佳為85%或更高，更佳為90%或更高，以及再更佳為95%或更高相同。同源性評估可以裸視或使用商業可得程式完成。使用商業可得電腦程式，介於二或更多個序列之間的同源性可表示為百分比(%)，且可評估介於相鄰序列之間的同源性(%)。編碼升糖素衍生物的多核苷酸可經插入至載體且經表現以獲得大量的升糖素衍生物。
對於該等重組表現，本發明之多核苷酸通常係經插入至合適載體以構築含有該等多核苷酸的選殖載體或重組載體，且該等載體亦屬於本發明之範疇。
如使用於本文，用語「重組載體」意指包含編碼目標肽之多核苷酸序列的DNA構築物，該多核苷酸序列係可操作地連結至合適的調控序列，使得目標肽，例如升糖素衍生物，能於宿主細胞中表現。該調控序列包含能起始轉錄的啟動子、用於調控轉錄的任何其他操作子序列、編碼合適的mRNA核糖體-結合功能域的序列以及調控轉錄及轉譯終止的序列。重組載體於轉形至適當的宿主細胞後，可無關於宿主基因體而進行複製或作用，或可整合至宿主基因體本身。
使用於本發明之重組載體可不必特別限定，只要該載體可於宿主細胞中複製，且其可使用所屬技術領域中習知的任何載體構築。該載體之實例可包含天然或重組質體、黏接質體、病毒、以及噬菌體。例如，作為噬菌體或黏接質體，可使用pWE15、M13、MBL3、MBL4、IXII、ASHII、APII、t10、t11、Charon4A、Charon21A等；
以及作為質體載體，可使用彼等基於pBR、pUC、pBluescriptII、pGEM、pTZ、pCL、pET等者。可使用於本發明之載體不特限定，所屬技術領域已知的任何表現載體皆可使用。
重組載體係使用於宿主的轉形用以生產本發明之升糖素衍生物。此外，該等經轉形之細胞，作為本發明之一部分，可使用於核酸片段及載體的擴增，或可為使用於生產本發明升糖素衍生物之經培養之細胞或細胞株。
如使用於本文，用語「轉形」意指將包含編碼目標蛋白質的多核苷酸的重組載體導入至宿主細胞，藉此能於該宿主細胞中表現該多核苷酸所編碼的蛋白質。對於經轉形之多核苷酸，不論其是否插入至其所在之宿主細胞的染色體或為於染色體外，只要其可於宿主細胞中表現即可，且該二種情形皆包含於本發明。
此外，多核苷酸包含編碼目標蛋白質的DNA及RNA。多核苷酸可以任何形式插入，只要其可被導入至宿主細胞且於其中表現即可。例如，該多核苷酸可以表現匣的形式被導入至宿主細胞。該表現匣可傳統地包含可操作地連結至該核苷酸的啟動子、轉錄終止信號、核糖體結合功能域以及轉譯終止信號。表現匣可為能自我複製的表現載體形式。此外，該多核苷酸可以其原樣被導入至宿主細胞且於宿主細胞中可操作地連結至主要用於其表現的序列，但不限定為此。此外，如使用於本文，用語「可
操作地連結」意指介於啟動子序列(其起始及介導編碼本發明目標蛋白質的多核苷酸的轉錄)以及上述基因序列之間的功能性連接。
使用於本發明的合適宿主不特別限定，只要其可表現本發明的多核苷酸即可。合適宿主的實例可包含如大腸桿菌(E.coli)之屬於埃希氏菌屬的細菌，如枯草桿菌(Bacillus subtilis)之屬於芽孢桿菌屬的細菌，如惡臭假單胞桿菌(Pseudomonas putida)之屬於假單孢桿菌屬的細菌，釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)及裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)，如秋行軍蟲(Spodoptera frugiperda)(Sf9)之昆蟲細胞，以及如CHO、COS及BSC之動物細胞。
另一態樣中，本發明提供用於預防或治療低血糖症或肥胖之含有升糖素衍生物的醫藥組成物。
如使用於本文，用語「預防」意指藉由投藥升糖素衍生物或醫藥組成物而造成肥胖發症的壓抑或延遲的任何作用，以及用語「治療」意指藉由投藥升糖素衍生物或醫藥組成物而造成肥胖症狀的改善或有利改變的任何作用。
如使用於本文，用語「投藥」意指藉由合適的方式對患者導入特定材料，且組成物可經由一般途徑投藥，只要組成物可到達目標組織即可。例如，投藥可為腹腔內、靜脈內、肌肉內、皮下、穿皮、經口、局部、鼻內、肺腔內、直腸內等進行。
如使用於本文，用語「低血糖症」意指糖尿病的急性症狀，其中血糖濃度低於正常人者，且通常意指當血糖濃度為50mg/dL或更低的狀態。當服用經口低血糖劑者攝食低於平常情況或已進行活動或運動多於平常情況時，通常引起低血糖症。此外，低血糖症可因使用降葡萄糖濃度劑、嚴重身體疾病、如腎上腺皮質激素及升糖素之激素缺乏、於產生胰島素之胰臟中的腫瘤、胰島素自體免疫症候群、胃切除患者、先天性碳水化合物代謝異常等。
低血糖症的症狀包含虛弱、發抖、皮膚蒼白、冷汗、頭暈、激動、焦慮、胸悶、空腹、疲勞等。於持續性低血糖的情況中，其可導致抽搐或癲癇，且引起休克而後昏暈。
如使用於本文，用語「肥胖」意指體內具有過多體脂肪的醫學狀況，且當人具有身體質量指數(BMI；身體質量(kg)除以身高(m)平方)為25或更高時診斷為具有肥胖。一般而言，肥胖因長時間能量不平衡所引起，其中能量攝取超過能量消耗。肥胖為影響全身的代謝疾病，其增加糖尿病、高血脂症、性功能障礙、關節炎以及心血管疾病的風險，而且於某些情況中，其亦相關於癌症的發症。
本發明之醫藥組成物可含有醫藥可接受的載劑、賦形劑或稀釋劑。如使用於本文，用語「醫藥可接受的」意指具有足量以顯現治療功效且不引起不良效果的性質，且可由所屬技術領域中具有通常知識者基於醫藥領域所習知的因子予以決定，該等因子如疾病的種類，患者
的年齡、體重、健康狀態、性別、藥物敏感性，投藥途徑，投藥方法，投藥頻率、治療持續時間，欲混合或組合同時投藥的藥物等。
含有本發明升糖素衍生物之本發明醫藥組成物可進一步含有醫藥可接受的載劑。醫藥可接受的載劑可包含，對於經口投藥為黏合劑、助流劑、崩解劑、賦形劑、溶解助劑、分散劑、安定化劑、懸浮劑、著色劑、矯味劑等；對於注射劑為緩衝劑、防腐劑、鎮痛藥、溶解助劑、等張劑、安定化劑等，其等可組合使用；以及對於局部投藥為基劑、賦形劑、潤滑劑、防腐劑等，然不以該等為限。
根據本發明之組成物的調配物類型可藉由與如上所述之醫藥可接受的載劑組合而製備各樣式。例如，對於經口投藥，組成物可調配為錠劑、片劑、膠囊、酏劑、懸浮劑、漿劑、圓片劑等。對於注射，組成物可調配為單一劑量安瓿或多劑量容器。組成物可調配為溶液、懸浮劑、錠劑、膠囊以及持續釋放調配物。
同時，合適的載劑、賦形劑及稀釋劑的實例可包含乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、木糖醇、赤蘚醇、麥芽糖醇、澱粉、阿拉伯膠、海藻膠、明膠、磷酸鈣、矽酸鈣、纖維素、甲基纖維素、微晶纖維素、聚乙烯吡咯啶酮、水、羥基苯甲酸甲酯、滑石、硬脂酸鎂、礦物油等。此外，組成物可進一步含有填料、抗凝結劑、潤滑劑、保濕劑、矯味劑、防腐劑等。
此外，本發明之醫藥組成物可製備選自下列所組成群組之任何調配物類型：錠劑、丸劑、粉劑、粒劑、膠囊、懸浮劑、用於內部使用之液體醫藥、乳劑、漿劑、無菌注射溶液、非液體溶劑、凍乾調配物以及栓劑。
此外，組成物可調配為適合用於患者身體的單一劑型，且較佳係根據醫藥領域中之典型方法調配為有用於肽藥物的製劑，使得藉由經口或非經腸途徑投藥，如經由皮膚、靜脈內、肌肉內、動脈內、骨髓內、鞘內、腦室內、肺內、穿皮、皮下、腹腔內、鼻內、長內、局部、舌下、陰道內或直腸內，但不限於此等。
此外，升糖素衍生物可藉由與如生理鹽水或有機溶劑之各種醫藥可接受的載劑摻混而使用。為了增加安定性或吸收性，可使用碳水化合物如葡萄糖、蔗糖或右旋糖，抗氧化劑如抗壞血酸或穀胱甘肽，螯合劑，低分子量蛋白質或其他安定化劑。
本發明之醫藥組成物的投藥劑量與頻率係由活性成份類型，與各種因子如欲治療的疾病，投藥途徑，患者的年齡、性別與體重以及疾病的嚴重性而予以決定。
本發明組成物之總有效劑量可為以單一劑量投藥至患者，或可根據區段治療方案以多劑量投藥長的時間期。本發明之醫藥組成物中，活性成分的含量可根據疾病嚴重性而變化。較佳地，本發明之肽的每日總劑量可為患者體重每1kg約0.0001μg至500mg。然而，升糖素衍生物的有效劑量，除了該醫藥組成物的投藥途徑與治療
頻率以外，係考慮包含患者的年齡、體重、健康狀況、性別、疾病嚴重性、膳食以及排泄率之各種因子而予以決定。關於此點，所屬技術領域中具有通常知識者可容易的決定適合於本發明醫藥組成物的特別用途的有效劑量。根據本發明之醫藥組成物不特別限定調配物以及投藥途徑與模式，只要其顯示本發明之效果即可。
本發明之醫藥組成物顯示優異的活體內藥效與效價的持續時間，藉此顯著地降低其投藥的次數與頻率。
特別地，由於本發明之醫藥組成物含有作為活性成分之升糖素衍生物，該升糖素衍生物具有經改變的不同於天然升糖素的pI，其根據給定溶液的pH顯示經改善的溶解度與高安定性，且因而本發明之醫藥組成物可有效地使用於製備用於治療低血糖症或肥胖的安定升糖素調配物。
再者，本發明之醫藥組成物可單獨投藥或與對肥胖顯示預防效果或治療效果的其他一或多種醫藥調配物組合投藥。此外，本發明之醫藥組成物可進一步含有對於肥胖顯示預防或治療效果的醫藥調配物。
對於肥胖顯示預防或治療效果的醫藥調配物並不特別限定，且可包含GLP-1受體促效劑、葡萄糖依賴性促胰島素肽(GIP)受體拮抗劑、瘦體素受體促效劑、DPP-IV抑制劑、Y5受體拮抗劑、黑色素濃縮激素(MCH)受體拮抗劑、Y2/3/4受體促效劑、MC3/4受體促效劑、胃/
胰脂肪酶抑制劑、5HT2c促效劑、β 3A受體促效劑、澱粉素受體促效劑、飢餓肽拮抗劑與飢餓肽受體拮抗劑、FGF1、FGF21受體促效劑、膽囊收縮素(CCK)受體促效劑、胰多肽(PP)受體促效劑、多巴胺再吸收抑制劑等。
又另一態樣中，本發明提供用於預防或治療低血糖症或肥胖的方法，包含對個體投藥升糖素衍生物或含有該升糖素衍生物之醫藥組成物。
如使用本文，用語「個體」意指懷疑具有低血糖症或肥胖者，其為具有低血糖症或肥胖，或具有低血糖症或肥胖之可能性之包含人類之哺乳動物、小鼠及畜養動物。然而，可包含欲利用本發明之升糖素衍生物或醫藥組成物的任何個體而不特別限定。含有本發明升糖素衍生物之醫藥組成物，可投藥至懷疑具有低血糖症或肥胖的個體，藉此有效地治療個體。低血糖症及肥胖係與上述相同者。
本發明之治療方法可包含以含有醫藥有效量之升糖素衍生物的醫藥組成物投藥。較佳地，每日總劑量應基於醫師的合適醫學判斷且投藥一次或數次。根據本發明的目的，對於任何特別患者的特定治療有效劑量可根據多種因子改變，如所欲達成的回應的種類與程度，包含其他成分是否使用於其中的特定組成物，患者的年齡、體重、健康狀況、以及膳食，投藥的時間與途徑，組成物的分泌速率，治療的持續時間，與特定組成物組合或同時使用的其他藥物以及於醫學領域習知的類似因子。
又另一態樣中，本發明提供升糖素衍生物於製備用於預防或治療低血糖症或肥胖的醫藥物的用途。
本發明之新穎升糖素衍生物藉由具有不同於天然升糖素之pI而根據給定溶液的pH具有優異的安定性與溶解度。因此，當本發明之新穎升糖素衍生物使用作為用於治療低血糖症之治療劑時，可增加患者的醫囑性。此外，本發明之新穎升糖素衍生物適合用於與其他抗肥胖劑組合投藥，且因此其可為有效地用於預防或治療低血糖症及肥胖。
後文中，本發明將參照下述實施例更詳細說明。然而，該等實施例僅作為說明的目的，且不意圖限制本發明的範疇。
使用對應於人類升糖素受體基因的cDNA(OriGene Technologies,Inc.,USA)中的開放讀架(ORF)區域作為模板，以及下述包含HindIII及EcoRI各限制酶為點的SEQ ID NOS：35及36之前置引子及反置引子而進行PCR。
具體地，PCR係使用下述條件進行全部30個循環：95℃變性60秒，55℃黏合60秒，以及68℃延伸
30秒。由此所得PCR產物於1.0%瓊脂凝膠進行電泳，藉由洗脫自其獲得具有尺寸為450bp的帶。
5’-CAGCGACACCGACCGTCCCCCCGTACTTAAGGCC-3’(SEQ ID NO：35)
5’-CTAACCGACTCTCGGGGAAGACTGAGCTCGCC-3’(SEQ ID NO：36)
PCR產物經選殖至已知動物細胞表現載體x0GC/dhfr，以製備重組載體x0GC/GCGR。培養於DMEM/F12(10% FBS)培養基的CHO DG44細胞株使用Lipofectamine 以重組載體x0GC/GCGR轉染，且選擇性地培養於含有1mg/mL G418及10nM胺甲蝶呤(methotraxate)的選擇培養基。藉由限制稀釋法自其選擇單一純株細胞株，且於其等之中，最終自其選擇顯示呈濃度依賴性方式之針對升糖素之優異cAMP回應的細胞株。
所屬技術領域已知蛋白質於溶液中的溶解度、活性及安定性可根據pI而變化(Shaw,K.L.et al.,Protein Science 10,pp 1206-1215,2001)。為了製備具有改善的物理性質的升糖素衍生物，由SEQ ID NO：1所表示的天然升糖素的胺基酸序列以具有正電荷及負電荷的胺基酸取代，且藉此合成如下表1所示之升糖素衍生物。
關於示於表1之SEQ ID NOS：8至31及33至34，由X表示之胺基酸代表非天然胺基酸，胺基異丁酸(Aib)；於SEQ ID NO：32的胺基酸序列中的「-」意指沒有胺基酸殘基存在於對應位置；以及兩個粗體及下底線胺基酸殘基代表於兩個胺基酸殘基之間形成環。
為了測量實施例2中所合成的升糖素衍生物的經改善之物理性質，使用pI/Mw工具(http：//expasy.org/tools/pi_tool.html；Gasteiger et al.,2003)於ExPASy伺服器中基於胺基酸序列計算pI值。
如表2所示，雖SEQ ID NO：1的天然升糖素具有6.8的pI，然根據本發明之升糖素衍生物顯示自約4至約9的pI值，因此顯示改善的物理性質。由於根據本發明之升糖素衍生物具有不同於天然升糖素的pI值，其等可根據給定溶液的pH條件顯示改善的溶解度及較高的安定性。
因此，當根據本發明之升糖素衍生物使用作為用於治療低血糖症的治療劑時，其等可改善患者醫囑性，且亦適合用於與其他抗肥胖劑，例如GLP-1受體拮抗劑、葡萄糖依賴性促胰島素肽(GIP)受體拮抗劑等組合投藥，且因此可有效地使用作為用於治療低血糖症及肥胖的治療劑。
彼等所屬技術領域中具有通常知識者將認知本發明可以其它特定形式具體化，但不悖離其精神或必要特徵。所述具體例咸信僅為在各方面說明，且非限制性。因此，本發明的範疇係由隨附的申請專利範圍而非由前述的說明所界定。來自申請專利範圍同等性的意義及範圍內的所有變化皆涵括於本發明的範疇。
<110> 韓美藥品股份有限公司
<120> 具有改善之安定性的升糖素衍生物
<130> OPA15322
<150> KR 10-2014-0193800
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Claims (15)
- 一種升糖素衍生物，係包括下述通式1之胺基酸序列及具有不同於天然升糖素之等電點(pI)：X1-X2-QGTF-X7-SDYS-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18-X19-X20-X21-F-X23-X24-W-L-X27-X28-T (通式1)其中，通式1中，X1為組胺酸、去胺基-組胺酸、N-二甲基-組胺酸、β-羥基咪唑丙酸、4-咪唑乙酸、β-羧基咪唑丙酸、色胺酸、酪胺酸或經刪除；X2為α-甲基-麩胺酸、胺基異丁酸(Aib)、D-丙胺酸、甘胺酸、Sar(N-甲基甘胺酸)、絲胺酸或D-絲胺酸；X7為蘇胺酸或纈胺酸；X12為離胺酸或半胱胺酸；X13為酪胺酸或半胱胺酸；X14為白胺酸或半胱胺酸；X15為天冬胺酸、麩胺酸或半胱胺酸；X16為麩胺酸、天冬胺酸、絲胺酸、α-甲基-麩胺酸或半胱胺酸；X17為天冬胺酸、麩醯胺酸、麩胺酸、離胺酸、精胺酸、絲胺酸、纈胺酸或半胱胺酸；X18為天冬胺酸、麩醯胺酸、麩胺酸、精胺酸或半胱胺酸；X19為丙胺酸或半胱胺酸；X20為離胺酸、麩胺酸、麩醯胺酸、天冬胺酸、離 胺酸或半胱胺酸；X21為天冬胺酸、麩胺酸、纈胺酸或半胱胺酸；X23為纈胺酸或精胺酸；X24為纈胺酸、白胺酸、麩醯胺酸或精胺酸；X27為異白胺酸或甲硫胺酸；及X28為精胺酸或天冬醯胺，限制條件為當通式1的胺基酸序列與SEQ ID NO：1相同時，將其排除。
- 如申請專利範圍第1項所述之升糖素衍生物，其中，通式1的胺基酸序列中，X1為組胺酸、色胺酸、酪胺酸或經刪除；X2為絲胺酸或胺基異丁酸(Aib)；X7為蘇胺酸或纈胺酸；X12為離胺酸或半胱胺酸；X13為酪胺酸或半胱胺酸；X14為白胺酸或半胱胺酸；X15為天冬胺酸或半胱胺酸；X16為麩胺酸、天冬胺酸、絲胺酸或半胱胺酸；X17為天冬胺酸、麩胺酸、離胺酸、精胺酸、纈胺酸或半胱胺酸；X18為天冬胺酸、麩胺酸、精胺酸或半胱胺酸；X19為丙胺酸或半胱胺酸；X20為離胺酸、麩胺酸、麩醯胺酸、天冬胺酸、離胺酸或半胱胺酸； X21為天冬胺酸、麩胺酸、纈胺酸或半胱胺酸；X23為纈胺酸或精胺酸；X24為纈胺酸、白胺酸或麩醯胺酸；X27為異白胺酸或甲硫胺酸；及X28為精胺酸或天冬醯胺，限制條件為當通式1的胺基酸序列與SEQ ID NO：1相同時，將其排除。
- 如申請專利範圍第1項所述之升糖素衍生物，其中，該升糖素衍生物具有升糖素受體刺激活性。
- 如申請專利範圍第1項所述之升糖素衍生物，其中，該升糖素衍生物包括選自由SEQ ID NOS：2至34所代表之胺基酸序列所組成群組之胺基酸序列。
- 一種多核苷酸，係編碼如申請專利範圍第1至4項中任一項所述之升糖素衍生物。
- 一種用於預防或治療低血糖症之醫藥組成物，係包括如申請專利範圍第1至4項中任一項所述之升糖素衍生物作為活性成分。
- 一種用於預防或治療肥胖之醫藥組成物，係包括如申請專利範圍第1至4項中任一項所述之升糖素衍生物作為活性成分。
- 如申請專利範圍第6項所述之醫藥組成物，復包括醫藥上可接受載劑。
- 如申請專利範圍第7項所述之醫藥組成物，復包括醫藥上可接受載劑。
- 如申請專利範圍第7項所述之醫藥組成物，其中，該醫藥組成物係單獨投藥或與具有預防或治療肥胖效果之醫藥劑組合投藥。
- 如申請專利範圍第7項所述之醫藥組成物，復包括具有預防或治療肥胖效果之醫藥劑。
- 如申請專利範圍第10項所述之醫藥組成物，其中，該具有預防或治療肥胖效果之醫藥劑係選自由下列所組成之群組：GLP-1受體促效劑、葡萄糖依賴性促胰島素肽(GIP)受體拮抗劑、瘦體素受體促效劑、DPP-IV抑制劑、Y5受體拮抗劑、黑色素濃縮激素(MCH)受體拮抗劑、Y2/3/4受體促效劑、MC3/4受體促效劑、胃/胰脂肪酶抑制劑、5HT2c促效劑、β 3A受體促效劑、澱粉素受體促效劑、飢餓肽拮抗劑、飢餓肽受體拮抗劑、FGF1、FGF21受體促效劑、膽囊收縮素(CCK)受體促效劑、胰多肽(PP)受體促效劑、多巴胺再吸收抑制劑及其組合。
- 如申請專利範圍第11項所述之醫藥組成物，其中，該具有預防或治療肥胖效果之醫藥劑係選自由下列所組成之群組：GLP-1受體促效劑、葡萄糖依賴性促胰島素肽(GIP)受體拮抗劑、瘦體素受體促效劑、DPP-IV抑制劑、Y5受體拮抗劑、黑色素濃縮激素(MCH)受體拮抗劑、Y2/3/4受體促效劑、MC3/4受體促效劑、胃/胰脂肪酶抑制劑、5HT2c促效劑、β 3A受體促效劑、澱粉素受體促效劑、飢餓肽拮抗劑、飢餓肽受體拮抗劑、 FGF1、FGF21受體促效劑、膽囊收縮素(CCK)受體促效劑、胰多肽(PP)受體促效劑、多巴胺再吸收抑制劑及其組合。
- 一種用於預防或治療低血糖症或肥胖的方法，包括對有需要的個體投予如申請專利範圍第1至4項中任一項所述之升糖素衍生物或包含該升糖素衍生物之醫藥組成物。
- 一種如申請專利範圍第1至4項中任一項所述之升糖素衍生物或包含該升糖素衍生物之醫藥組成物之用途，係用於製備用以預防或治療肥胖之醫藥物。
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