BR112017014205B1 - Derivados de glucagon e seu uso, e uso de uma composição farmacêutica - Google Patents

Abstract

DERIVADOS DE GLUCAGON E SEU USO, POLINUCLEOTÍDEO, USO DE UMA COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA. A presente invenção se refere a um peptídeo derivado de glucagon inovador e a uma composição para prevenir ou tratar hipoglicemia que contém o peptídeo derivado de glucagon inovador como um ingrediente ativo. O derivado de glucagon de acordo com a presente invenção tem propriedades físicas aprimoradas devido à mudança no ponto isoelétrico (pI) ao mesmo tempo em que tem capacidade para manter uma atividade nos receptores de glucagon e pode, então, aprimorar a adaptação do paciente quando usado como um agente hipoglicêmico e é também adequado para administração com outros agentes antiobesidade. Consequentemente, o derivado de glucagon de acordo com a presente invenção pode ser usa do com eficácia na prevenção e no tratamento de hipoglicemia e obesidade.

Description

[001] CAMPO DA TÉCNICA

[002] A presente invenção se refere a derivados inovadores de glucagon que têm propriedades físicas aprimoradas devido à mudança no ponto isoelétrico (pI) e uma composição para prevenir ou tratar hipoglicemia e obesidade que contém os mesmos como um ingrediente ativo.

[003] ANTECEDENTES DA TÉCNICA

[004] Os recentes avanços e mudanças em estilo de vida têm sido acompanhados por grandes mudanças nos hábitos alimentares. Particularmente, pessoas ocupadas dos dias atuais estão acima do peso e obesas devido a dietas de ricas em calorias e exercícios insuficientes. A Organização Mundial de Saúde (OMS) relatou que mais de um bilhão de adultos estão acima do peso ao redor do mundo, dentre os mesmos mais de três milhões são diagnosticados clinicamente com obesidade grave, e 25.000 pessoas morrem de ou doenças relacionadas à obesidade ou ao excesso de peso a cada ano (World Health Organization, Global Strategy on Diet, Physical Activity and Health, 2004).

[005] Excesso de peso e obesidade são responsáveis pelo aumento da pressão sanguínea e de níveis de colesterol e por causar ou por piorar várias doenças, tais como doenças cardíacas, diabetes, artrite, etc. Além disso, o problema de obesidade está se tornando também uma causa principal na incidência aumentada de arteriosclerose, hipertensão, hiperlipidemia ou doenças cardíacas em crianças ou adolescentes assim como adultos. No entanto, a obesidade não é fácil de tratar, devido ao fato de que é uma doença complexa associada aos mecânicos de controle de apetite e metabolismo de energia. Consequentemente, o tratamento de obesidade exige não apenas os esforços do próprio paciente como também um método com capacidade para tratar mecanismos anormais associados ao controle de apetite e ao metabolismo de energia. Desse modo, realizaram-se esforços para desenvolver fármacos para tratar os mecanismos anormais.

[006] Como resultado desses esforços, fármacos tais como Rimonabanto (Sanofi-Aventis), Sibutramina (Abbott), Contrave (Takeda) e Orlistate (Roche) foram desenvolvidos, porém, têm as desvantagens de sérios efeitos adversos ou efeitos antiobesidade muito fracos. Por exemplo, de acordo com relatórios, o Rimonabanto mostrou um efeito colateral de distúrbio do sistema nervoso central, Sibutramina e Contrave mostraram efeitos colaterais cardiovasculares e Orlistate mostrou apenas cerca de 4 kg de perda de peso quando usado por 1 ano. Consequentemente, não há agentes terapêuticos para obesidade que possam ser prescritos com segurança para pacientes obesos.

[007] Muitos estudos extensivos foram feitos para desenvolver agentes terapêuticos inovadores para obesidade que possam solucionar os problemas dos fármacos antiobesidade convencionais. Recentemente, os derivados de glucagon receberam muita atenção. O glucagon é produzido pelo pâncreas quando os níveis de glicose no sangue caem como resultado de outros medicamentos ou doenças ou deficiências hormonais ou de enzima. O glucagon estimula o colapso de glicogênio no fígado e facilita a liberação de glicose para elevar os níveis de glicose no sangue a uma faixa normal. Além do efeito de aumentar os níveis de glicose no sangue, glucagon inibe o apetite e ativa lipase sensível a hormônios de adipócitos para facilitar a lipólise, desse modo, mostrando um efeito antiobesidade. No entanto, o uso de glucagon como um agente terapêutico foi limitado devido à sua baixa solubilidade e propriedade de ser precipitado em um pH neutro.

[008] Um dentre os derivados de glucagon, peptídeo semelhante a glucagon 1 (GLP-1), está sob desenvolvimento como um agente terapêutico para tratar hiperglicemia em pacientes com diabetes. O GLP-1 tem as funções de estimular síntese e secreção de insulina, inibir a secreção de glucagon, desacelerar o esvaziamento gástrico, aumentar a utilização de glicose e inibir a entrada de alimento.

[009] Relatou-se que a exendin-4, preparada a partir de veneno de lagarto e que tem uma homologia de aminoácido de cerca de 50% com GLP-1, também ativa o receptor de GLP-1, desse modo, reduzindo a hiperglicemia em pacientes com diabetes. No entanto, relatou-se que os fármacos antiobesidade que contêm GLP-1 mostram efeitos colaterais, tais como vômito e náusea.

[010] Portanto, como alternativa ao GLP-1, muita atenção foi dada à oxintomodulina, que pode se ligar a ambos os receptores dos dois peptídeos, GLP-1 e glucagon. A oxintomodulina é um peptídeo preparado a partir de um precursor de glucagon, pré-glucagon e tem as funções de inibir entrada de alimento e intensificar a saciedade de GLP-1 e tem atividade lipolítica como glucagon, aumentado assim a potência do mesmo em terapia antiobesidade.

[011] No entanto, a oxintomodulina ou derivados dos mesmos têm uma séria desvantagem pelo fato de que uma quantidade excessiva do fármaco deve ser administrada diariamente para tratamento de obesidade devido ao fato de que têm baixa eficácia e uma meia-vida in vivo curta.

[012] Adicionalmente, quando ambas as atividades de GLP-1 e de glucagon estão presentes em um único peptídeo, a razão de atividade dos mesmos se torna fixa e, portanto, é difícil de usar um agonista duplo com várias razões. Consequentemente, uma terapia combinada com capacidade para usar várias razões de atividade ajustando-se os teores de GLP-1 e glucagon pode ser eficaz.

[013] No entanto, para a terapia combinada, é exigido aprimorar as características físicas do glucagon, que se agrega em um pH neutro e se precipita com o tempo, mostrando assim pouca solubilidade.

[014] Sob essas circunstâncias, os presentes inventores desenvolveram derivados de glucagon com modificações parciais da sequência de aminoácidos de glucagon para o aprimoramento dos efeitos terapêuticos de glucagon em hipoglicemia e em obesidade aprimorando-se as propriedades físicas de glucagon e constataram que esses derivados de glucagon têm solubilidade aprimorada e maior estabilidade em um pH neutro, desse modo concluindo a presente invenção.

[015] [REVELAÇÃO]

[016] [PROBLEMA DA TÉCNICA]

[017] Um objeto da presente invenção é fornecer um derivado de glucagon inovador com propriedades físicas aprimoradas.

[018] Outro objeto da presente invenção é fornecer uma composição para prevenir ou tratar hipoglicemia que contém o derivado de glucagon como um ingrediente ativo.

[019] Um objeto adicional da presente invenção é fornecer uma composição para prevenir ou tratar obesidade que contém o derivado de glucagon como um ingrediente ativo.

[020] [SOLUÇÃO DA TÉCNICA]

[021] A fim de alcançar esses objetos acima, em um aspecto, a presente invenção fornece um derivado de glucagon inovador que inclui a sequência de aminoácidos da Fórmula Geral 1 a seguir e tem um ponto isoelétrico (pI), que não é igual, isto é, é diferente, àquele do glucagon nativo:

[022] X1-X2-QGTF-X7-SDYS-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18-X19-X20- X21-F-X23-X24-W-L-X27-X28-T (Fórmula Geral 1)

[023] em que, na Fórmula Geral 1,

[024] X1 é histidina, desamino-histidina, N-dimetil-histidina, ácido β- hidroxiimidazopropiônico, ácido 4-imidazoacético, ácido β- carboxiimidazopropiônico, triptofano, tirosina ou deletada;

[025] X2 é um ácido a-metil-glutâmico, ácido aminoisobutírico (Aib), D- alanina, glicina, Sar(N-metilglicina), serina ou D-serina;

[026] X7 é treonina ou valina;

[027] X12 é lisina ou cisteína;

[028] X13 é tirosina ou cisteína;

[029] X14 é leucina ou cisteína;

[030] X15 é ácido aspártico, ácido glutâmico, ou cisteína;

[031] X16 é ácido glutâmico, ácido aspártico, serina, ácido a-metil-glutâmico ou cisteína;

[032] X17 é ácido aspártico, glutamina, ácido glutâmico, lisina, arginina, serina, valina ou cisteína;

[033] X18 é ácido aspártico, glutamina, ácido glutâmico, arginina ou cisteína;

[034] X19 é alanina ou cisteína;

[035] X20 é lisina, ácido glutâmico, glutamina, ácido aspártico, lisina ou cisteína;

[036] X21 é ácido aspártico, ácido glutâmico, valina ou cisteína;

[037] X23 é valina ou arginina;

[038] X24 é valina, leucina, glutamina ou arginina;

[039] X27 é isoleucina ou metionina; e

[040] X28 é arginina ou asparagina

[041] (com a condição de que, quando a sequência de aminoácidos de Fórmula Geral 1 for idêntica à SEQ ID NO: 1, a mesma seja excluída).

[042] O derivado de glucagon de acordo com a presente invenção inclui um peptídeo, um derivado de peptídeo ou um peptídeo mimético que tem propriedades físicas aprimoradas com a presença de um pI diferente daquele de um glucagon nativo modificando-se uma parte do aminoácido (ou aminoácidos) de glucagon nativo.

[043] Conforme usado no presente documento, o termo “glucagon nativo” se refere a glucagon nativo humano que tem a sequência de His-Ser-Gln-Gly- Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe- Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr (SEQ ID NO: 1).

[044] Referindo-se à sequência de Fórmula Geral 1 de acordo com a presente invenção, os aminoácidos procedem do N-terminal na esquerda para o C-terminal na direita de acordo com o método convencional de descrição. Consequentemente, quando a “posição” de qualquer resíduo particular é indicada na sequência de Fórmula Geral 1, a mesma deve ser interpretada da mesma maneira quando qualquer posição em glucagon nativo ou outras moléculas é mencionada.

[045] Ao longo de todo o relatório descritivo da presente invenção, não apenas os códigos convencionais de uma letra ou de três letras para aminoácidos que ocorrem naturalmente, como também aqueles códigos de três letras permitidos de modo geral para outros aminoácidos, tais como ácido α- aminoisobutírico (Aib), Sar(N-metilglicina) e ácido a-metil-glutâmico, são usados.

[046] Adicionalmente, os aminoácidos mencionados no presente documento são abreviados de acordo com as regras de nomenclatura do IUPAC- IUB de acordo com o seguinte:

[047] Conforme usado no presente documento, o termo “peptídeo” se refere a um composto de dois ou mais aminoácidos nativos ou não nativos ou derivados de aminoácido, tais como a-aminoácidos ligados por uma ligação de peptídeo. Conforme usado no presente documento, o termo “derivado de glucagon” se refere a um peptídeo que inclui a sequência de Fórmula Geral 1 ou um derivado da mesma, um análogo ou um produto modificado do mesmo. O peptídeo de acordo com a presente invenção inclui peptidomimético que tem uma mudança em pI em comparação àquele de glucagon nativo modificando-se uma parte do aminoácido (ou aminoácidos) de glucagon na forma de uma substituição, etc. Em uma modalidade exemplificativa da presente invenção, o derivado de glucagon tem um ponto isoelétrico diferente daquele do glucagon nativo ao mesmo tempo em que mantém a atividade de um receptor de glucagon. Em uma modalidade exemplificativa mais específica da presente invenção, o derivado de glucagon se refere a um peptídeo com solubilidade aprimorada de glucagon nativo em um pH fisiológico ao mesmo tempo em que mantém a atividade de receptor de glucagon.

[048] Conforme usado no presente documento, o termo “pI” ou “ponto isoelétrico” se refere ao valor de pH no qual uma macromolécula, tal como um polipeptídeo, não tem carga (0). No caso de um polipeptídeo com vários grupos funcionais carregados, a carga líquida do polipeptídeo total é “0” em um ponto em que o valor de pH é igual ao pI. A carga líquida do polipeptídeo em um pH superior ao pI será negativa ao passo que a carga líquida do polipeptídeo em um pH inferior ao pI será positiva.

[049] Os valores de pI podem ser medidos ou estimados por um método convencional usado na técnica. Por exemplo, os valores de pI podem ser medidos em um gel gradiente de pH imobilizado que consiste em poliacrilamida, amido ou agarose por eletroforese isoelétrica ou, por exemplo, podem ser estimados de uma sequência de aminoácidos com o uso de uma ferramenta pI/MW (http://expasy.org/tools/pi_tool.html; Gasteiger et al., 2003) em um servidor ExPASy.

[050] Em uma modalidade específica da presente invenção, o derivado de glucagon que contém uma sequência de aminoácidos de Fórmula Geral 1 abrange qualquer peptídeo que é preparado pela substituição, adição, deleção ou modificação pós-traducional (por exemplo, metilação, acilação, ubiquitinação ou ligação covalente intramolecular) de aminoácido (ou aminoácidos) na sequência de aminoácidos de glucagon nativo representada por SEQ ID NO: 1 que exibe solubilidade aprimorada de acordo com o pH de uma solução devido à diferença entre o pI do mesmo e aquele do glucagon nativo ao mesmo tempo em que mantém as atividades de receptor de glucagon normalmente, desse modo, tendo estabilidade química aprimorada in vivo.

[051] Durante a substituição ou adição de aminoácidos, não apenas os 20 aminoácidos constatados comumente em proteínas humanas, como também aminoácidos atípicos ou que ocorrem naturalmente e derivados dos mesmos podem ser usados. As fontes comerciais de aminoácidos atípicos podem incluir Sigma-Aldrich, ChemPep Inc., Genzyme Pharmaceuticals, etc. Os peptídeos que incluem esses aminoácidos e sequências de peptídeos atípicos podem ser sintetizados e comprados de fornecedores comerciais, por exemplo, American Peptide Company, Bachem (E.U.A.) ou Anygen (Coeria). Os derivados de aminoácido, por exemplo, desamino-histidina, ácido β-hidroxiimidazopropi0nico, ácido 4-imidazoacético, ou ácido β-carboxiimidazopropi0nico, podem ser obtidos da mesma maneira.

[052] Uma vez que o glucagon tem um pH de cerca de 7, o mesmo é insolúvel em uma solução que tem um pH de 6 a 8 e tende a precipitar em um pH neutro. Em uma solução aquosa com um pH de 3 ou mais baixo, o glucagon é dissolvido em um estágio inicial, porém, se precipita dentro de uma hora formando-se um gel. Uma vez que o glucagon gelificado consiste principalmente em fibrilas de β-folha, a administração do glucagon então precipitado por meio de uma agulha de injeção ou injeção intravenosa bloqueará os vasos sanguíneos e, então, não é adequada para uso como um agente de injeção. A fim de atrasar o processo de precipitação, formulações ácidas (pH de 2 a 4) são usadas comumente e, realizando-se isso, o glucagon pode ser mantido em um estado relativamente não agregado por um período curto de tempo. No entanto, o glucagon pode formar fibrilas muito rapidamente em um pH baixo e, então, essas formulações ácidas precisam ser injetadas mediante a preparação.

[053] É amplamente conhecido na técnica que a solubilidade, a atividade e a estabilidade de uma proteína em uma solução podem variar de acordo com pI (Shaw, K. L. et al., Protein Science 10, páginas 1206 a 1215, 2001).

[054] Portanto, os presentes inventores desenvolveram derivados de glucagon com estabilidade e efeitos funcionais estendidos modificando-se a sequência de glucagon nativo, desse modo, alterando o pI da mesma. Os derivados de glucagon da presente invenção, com a presença de um pI alterado em comparação àquele de glucagon nativo, são distinguidos pelo fato de que têm solubilidade e estabilidade aprimoradas de acordo com o pH de uma determinada solução em comparação àquele de glucagon nativo.

[055] Em uma modalidade específica da presente invenção, o derivado de glucagon pode ser um peptídeo no qual, na sequência de aminoácidos de Fórmula Geral 1,

[056] X1 é histidina ou triptofano, tirosina ou deletada;

[057] X2 é serina ou ácido aminoisobutírico (Aib);

[058] X7 é treonina ou valina;

[059] X12 é lisina ou cisteína;

[060] X13 é tirosina ou cisteína;

[061] X14 é leucina ou cisteína;

[062] X15 é ácido aspártico ou cisteína;

[063] X16 é ácido glutâmico, ácido aspártico, serina ou cisteína;

[064] X17 é ácido aspártico, ácido glutâmico, lisina, arginina, valina ou cisteína;

[065] X18 é ácido aspártico, ácido glutâmico, arginina ou cisteína;

[066] X19 é alanina ou cisteína;

[067] X20 é lisina, ácido glutâmico, glutamina, ácido aspártico, lisina ou cisteína;

[068] X21 é ácido aspártico, ácido glutâmico, valina ou cisteína;

[069] X23 é valina ou arginina;

[070] X24 é valina, leucina ou glutamina;

[071] X27 é isoleucina ou metionina; e

[072] X28 é arginina ou asparagina

[073] (com a condição de que quando, a sequência de aminoácidos de Fórmula Geral 1 for idêntica à SEQ ID NO: 1, a mesma seja excluída).

[074] Mais preferencialmente, o derivado de glucagon da presente invenção pode ser um peptídeo que inclui qualquer sequência de aminoácidos dentre as sequências de aminoácidos representadas pelos SEQ ID NOS: 2 a 34.

[075] O peptídeo, que inclui o derivado de glucagon da presente invenção, pode ser preparado por um método de síntese padrão, um sistema de expressão recombinante ou qualquer outro método na técnica. Consequentemente, o análogo de glucagon de acordo com a presente invenção pode ser sintetizado por muitos métodos, incluindo os métodos descritos abaixo:

[076] (a) um método para sintetizar um peptídeo por um método de fase sólida ou de fase líquida em etapas ou por uma montagem de fragmento, seguido pelo isolamento e purificação do produto de peptídeo final; ou

[077] (b) um método para expressar um construto de ácido nucleico que codifica um peptídeo em uma célula hospedeira e recuperar o produto de expressão da cultura de célula hospedeira; ou

[078] (c) um método para realizar uma expressão livre de células in vitro de um construto de ácido nucleico que codifica um peptídeo e recuperar o produto de expressão do mesmo; ou

[079] (d) um método para obter fragmentos de peptídeo por qualquer combinação dos métodos (a), (b) e (c), obter o peptídeo ligando-se os fragmentos de peptídeo e, em seguida, recuperar o peptídeo.

[080] Em um aspecto exemplificativo da presente invenção, confirmou-se que o derivado de glucagon da presente invenção tem um pI diferente em comparação àquele do glucagon nativo (consultar a Tabela 1). Como resultado, o derivado de glucagon da presente invenção tem solubilidade aprimorada e maior estabilidade de acordo com o pH de uma determinada solução, em comparação àquele do glucagon nativo. Consequentemente, o derivado de glucagon da presente invenção pode aumentar a adaptação do paciente quando usado como um agente hipoglicêmico e é também adequado para a administração combinada para ser administrado em combinação com outros agentes antiobesidade e, então, pode ser usado com eficácia para a prevenção e tratamento de hipoglicemia e obesidade.

[081] Nesse aspecto, o derivado de glucagon da presente invenção pode fornecer uma seleção terapêutica atrativa em relação à hipoglicemia, obesidade ou doenças associadas das mesmas.

[082] Por exemplo, o derivado de glucagon da presente invenção é um hormônio importante de controle de resposta à insulina e pode ser usado com eficácia para o tratamento de hipoglicemia grave em pacientes diabéticos.

[083] Adicionalmente, o derivado de glucagon da presente invenção pode ser usado como uma droga farmacêutica não apenas para prevenir aumento de peso corporal, promover diminuição de peso corporal, reduzir excesso de peso e obesidades, incluindo obesidade mórbida (por exemplo, controlando-se apetite, ingestão, entrada de alimento, entrada de calorias e/ou consumo de energia) como também para tratar inflação relacionada à obesidade, doença na vesícula biliar relacionada à obesidade e apneia do sono induzida por obesidade, porém, sem limitação às mesmas, e pode ser usado para tratar as doenças associadas ou afecções de saúde das mesmas. O derivado de glucagon da presente invenção pode ser usado também para tratar as afecções de saúde que podem ser associadas à obesidade, tais como síndrome metabólica, hipertensão, dislipidemia induzida por arteriosclerose, arteriosclerose, esclerose arterial, doença cardíaca coronariana, derrames etc. No entanto, os efeitos do derivado de glucagon de acordo com a presente invenção podem ser mediados completa ou parcialmente pelos efeitos relacionados ao peso corporal descrito acima ou podem ser independentes do mesmo.

[084] Enquanto isso, para o aprimoramento dos efeitos terapêuticos do derivado de glucagon da presente invenção, o derivado de glucagon pode ser modificado com o uso de procedimentos típicos na técnica, incluindo uma modificação com polímeros, tal como polietileno glicol (PEG) e cadeias de açúcar, ou uma fusão com albumina, transferrina, ácido graxo, e imunoglobulina, etc. Por exemplo, pelo menos uma cadeia lateral de aminoácido dentro dos compostos da presente invenção pode ser ligada a um polímero a fim de aumentar a solubilidade e/ou meias-vidas in vivo e/ou aumentar a biodisponibilidades do mesmo. Essas modificações são conhecidas por reduzirem o espaçamento das proteínas e peptídeos terapêuticos.

[085] Para esses polímeros, polímeros solúveis (anfipáticos ou hidrofílicos) não tóxicos e farmaceuticamente inertes são apropriados e, de preferência, podem incluir PEG, homopolímeros ou copolímeros de PEG, polímeros substituídos por monometila (mPEG) e poliaminoácidos, tais como polilisina, ácido poliaspártico e ácido poliglutâmico.

[086] As variantes do derivado de glucagon, conforme descrito, também pertencem ao escopo da presente invenção.

[087] Em outro aspecto, a presente invenção fornece polinucleotídeos que codificam os derivados de glucagon descritos acima.

[088] O termo “homologia”, conforme usado no presente documento para o polinucleotídeo, indica o grau de semelhança a uma sequência de aminoácidos do tipo selvagem e uma sequência de ácidos nucleicos do tipo selvagem e inclui uma sequência de genes que é 75% ou mais, de preferência, 85% ou mais, mais preferencialmente, 90% ou mais e, ainda mais preferencialmente, 95% ou mais idêntica à sequência de polinucleotídeo que codifica os derivados de glucagon. A avaliação de homologia pode ser feita a olho nu ou com o uso de um programa comercialmente disponível. Com o uso de um programa de computador comercialmente disponível, a homologia entre duas ou mais sequências pode ser expressa como uma porcentagem (%) e a homologia (%) entre sequências adjacentes pode ser avaliada. O polinucleotídeo que codifica os derivados de glucagon pode ser inserido em um vetor e expresso para obter uma grande quantidade dos derivados de glucagon.

[089] Para essas expressões recombinantes, os polinucleotídeos da presente invenção são inseridos de modo geral em vetores apropriados para construir vetores ou vetores recombinantes que contêm esses polinucleotídeos e esses vetores também pertencem ao escopo da presente invenção.

[090] Conforme usado no presente documento, o termo “vetor recombinante” se refere a uma construção de DNA que inclui a sequência de um polinucleotídeo que codifica um peptídeo-alvo que é ligado de maneira operacional a uma sequência regulatória apropriada para possibilitar a expressão do peptídeo-alvo, por exemplo, um derivado de glucagon, em uma célula hospedeira. A sequência regulatória inclui um promotor com capacidade para iniciar a transcrição, qualquer sequência de operador para a regulação da transcrição, uma sequência que codifica um domínio de ligação de ribossomo de mRNA apropriado e uma sequência que regula o término da transcrição e da tradução. O vetor recombinante, após ser transformado em uma célula hospedeira adequada, pode ser replicado ou funciona independentemente do genoma hospedeiro ou pode ser integrado no próprio genoma hospedeiro.

[091] O vetor recombinante usado na presente invenção pode não ser limitado particularmente desde que o vetor seja replicável na célula hospedeira e pode ser construído com o uso de qualquer vetor conhecido na técnica. Os exemplos do vetor podem incluir plasmídeos naturais ou recombinantes, cosmídeos, vírus e bacteriófagos. Por exemplo, como um vetor de fago ou vetor de cosmídeo, pWE15, M13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A, Charon21A, etc. podem ser usados; e como um vetor de plasmídeo, aqueles com base em pBR, pUC, pBluescriptII, pGEM, pTZ, pCL, pET, etc. podem ser usados. Os vetores que podem ser usados na presente invenção não são particularmente limitados e qualquer vetor de expressão conhecido pode ser usado.

[092] O vetor recombinante é usado para a transformação de uma célula hospedeira para produzir derivados de glucagon da presente invenção. Adicionalmente, essas células transformadas, como parte da presente invenção, podem ser usadas para a amplificação de fragmentos e vetores de ácido nucleico ou podem ser células cultivadas ou linhagens de células na produção recombinante de derivados de glucagon da presente invenção.

[093] Conforme usado no presente documento, o termo “transformação” se refere a um processo para introduzir um vetor recombinante que inclui um polinucleotídeo que codifica uma proteína-alvo em uma célula hospedeira, desse modo, possibilitando a expressão do polinucleotídeo codificado pela proteína na célula hospedeira. Para o polinucleotídeo transformado, não importa se o mesmo é inserido no cromossomo de uma célula hospedeira e localizado no mesmo ou localizado no exterior do cromossomo, desde que possa ser expresso na célula hospedeira e ambos os casos são incluídos.

[094] Adicionalmente, o polinucleotídeo inclui DNA e RNA que codificam a proteína-alvo. O polinucleotídeo pode ser inserido em qualquer forma desde que possa ser introduzido em uma célula hospedeira e expresso na mesma. Por exemplo, o polinucleotídeo pode ser introduzido em uma célula hospedeira na forma de um cassete de expressão. O cassete de expressão pode incluir convencionalmente um promotor ligado operacionalmente polinucleotídeo, a um sinal de terminação de transcrição, a um domínio de ligação de ribossoma e a um sinal de terminação de tradução. O cassete de expressão pode ser na forma de um vetor de expressão com a capacidade de autorreplicação. Adicionalmente, o polinucleotídeo pode ser introduzido em uma célula hospedeira conforme é ligado operacionalmente a uma sequência essencial para a expressão do mesmo na célula hospedeira, porém, sem limitação a isso. Adicionalmente, conforme usado no presente documento, o termo “ligado operacionalmente” se refere a uma conexão funcional entre uma sequência de promotores que inicia e media a transcrição do polinucleotídeo que codifica a proteína-alvo da presente invenção e a sequência de genes acima.

[095] Um hospedeiro apropriado a ser usado na presente invenção pode ser não ser limitado particularmente desde que possa expressa o polinucleotídeo da presente invenção. Os exemplos do hospedeiro apropriado podem incluir bactérias que pertencem ao gênero Escherichia, tal como E. coli, bactérias que pertencem ao gênero Bacillus, tal como Bacillus subtilis, bactérias que pertencem ao gênero Pseudomonas, tal como Pseudomonas putida, leveduras, tal como Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae e Schizosaccharomyces pombe, células de inseto, tais como Spodoptera frugiperda (Sf9) e células animais, tais como CHO, COS e BSC.

[096] Em outro aspecto, a presente invenção fornece uma composição farmacêutica para prevenir ou tratar hipoglicemia ou obesidade que contém os derivados de glucagon.

[097] Conforme usado no presente documento, o termo “prevenção” se refere a qualquer ação que resulte na supressão ou atraso do início da obesidade pela administração dos derivados de glucagon ou a composição farmacêutica, e o termo “tratamento” se refere a qualquer ação que resulte no aprimoramento de sintomas de obesidade ou a alteração benéfica pela administração dos derivados de glucagon ou a composição farmacêutica.

[098] Conforme usado no presente documento, o termo “administração” se refere à introdução de um material particular a um paciente por uma maneira apropriada, e a composição pode ser administrada por meio de qualquer uma dentre as rotas comuns desde que a composição possa chegar a um tecido-alvo. Por exemplo, a administração pode ser realizada de maneira intraperitoneal, intravenosa, intramuscular, subcutânea, intradérmica, oral, tópica, intranasal, intrapulmonar, intrarectal etc.

[099] Conforme usado no presente documento, o termo “hipoglicemia” se refere a um sintoma agudo de diabetes, no qual os níveis de glicose no sangue são inferiores àqueles de pessoas normais e, de modo geral, se refere a um estado em que os níveis de glicose no sangue são 50 mg/dl ou menos. A hipoglicemia é causada frequentemente quando uma pessoa que toma um agente hipoglicêmico oral comeu menos que o normal ou realizou atividades ou se exercitou mais que o normal. Além disso, uma hipoglicemia pode ocorrer devido ao uso de fármacos de diminuição de nível de glicose, doenças físicas graves, deficiência de hormônio, tal como hormônios adrenocorticais e glucagon, tumor no pâncreas que produz insulina, síndrome autoimune de insulina, pacientes de gastrectomia, erro inato de distúrbio de metabolismo de carboidrato etc.

[100] Os sintomas de hipoglicemia incluem fraqueza, tremor, pele pálida, suor frio, tonteira, excitação, ansiedade, coração acelerado, estômago vazio, dor de cabeça, fadiga etc. No caso de hipoglicemia persistente, isso pode levar à convulsão ou ataque e pode causar choque e, então, desmaio.

[101] Conforme usado no presente documento, o termo “obesidade” se refere a uma afecção médica com gordura corpórea em excesso e quando uma pessoa que tem um índice de massa corporal (IMC; massa corporal (kg) dividida pela altura do corpo ao quadro (m)) de 25 ou maior é diagnosticada com obesidade. Geralmente, a obesidade ocorre devido a um desequilíbrio de energia a longo prazo no qual a entrada de energia excede o gasto. A obesidade é uma doença metabólica que afeta todo o corpo que aumenta o risco de diabetes, hiperlipidemia, disfunção sexual, artrite e doença cardiovascular e, em alguns casos, isso pode ser associado também à ocorrência de cânceres.

[102] A composição farmacêutica da presente invenção pode conter um carreador, excipiente ou diluente farmaceuticamente aceitável. Conforme usado no presente documento, o termo “farmaceuticamente aceitável” se refere às propriedades de ter uma quantidade suficiente para exibir um efeito terapêutico e de não causar efeitos adversos e pode ser determinado facilmente por uma pessoa versada na técnica com base nos fatores bem conhecidas no campo da medicina, tal como o tipo de doença, idade, peso corporal, estado de saúde, sexo, sensibilidade de um paciente a fármaco, rota de administração, método de administração, frequência de administração, duração de tratamento, um fármaco a ser misturado ou administrado simultaneamente em combinação etc.

[103] A composição farmacêutica da presente invenção que contém o derivado de glucagon da presente invenção pode conter adicionalmente um carreador farmaceuticamente aceitável. O carreador farmaceuticamente aceitável pode inclui, para administração oral, um ligante, um deslizante, um desintegrante, um excipiente, um agente solubilizante, um dispersante, um agente estabilizante, um agente de suspensão, um agente de coloração, um agente flavorizante etc.; para injeções, um agente de tamponamento, um agente conservante, um analgésico, um agente solubilizante, um agente isotônico, um agente estabilizante etc., que pode ser combinado para ser usado; e para administrações tópicas, uma base, um excipiente, um lubrificante, um agente conservante etc. embora não seja limitado aos mesmos.

[104] O tipo de formulação da composição de acordo com a presente invenção pode ser preparado de várias maneiras combinando-se com um carreador farmaceuticamente aceitável conforme descrito acima. Por exemplo, para administração oral, a composição pode ser formulada em tabletes, trociscos, cápsulas, elixires, suspensões, xaropes, pastilhas etc. Para injeções, a composição pode ser formulada em ampolas de dose única ou recipientes de múltiplas doses. A composição pode ser formulada também em soluções, suspensões, tabletes, cápsulas e formulações de liberação prolongada.

[105] Enquanto isso, os exemplos de carreadores, excipientes e diluentes adequados podem incluir lactose, dextrose, sacarose, sorbitol, manitol, xilitol, eritritol, maltitol, borracha de acácia de amido, alginato, gelatina, fosfato de cálcio, silicato de cálcio, celulose, metil celulose, celulose microcristalina, polivinilpirrolidona, água, metil hidroxibenzoato, propil hidroxibenzoato, talco, estearato de magnésio, óleo mineral, etc. Adicionalmente, a composição pode conter adicionalmente um enchimento, um anticoagulante, um lubrificante, um umectante, um agente flavorizante, um conservante etc.

[106] Adicionalmente, a composição farmacêutica da presente invenção pode ser preparada em qualquer tipo de formulação selecionado dentre o grupo que consiste em tabletes, pílulas, pós, granules, cápsulas, suspensões, medicamento líquido para uso interno, emulsões, xaropes, soluções de injeção estéril, solventes não aquosos, formulações liofilizadas e supositórios.

[107] Adicionalmente, a composição pode ser formulada em uma forma de dosagem única adequada para o corpo do paciente e, de preferência, é formulada em uma preparação útil para os fármacos de peptídeo de acordo com o método típico no campo farmacêuticos de modo a ser administrada por uma rota oral ou parenteral, tal como através da pele, de maneira intravenosa, intramuscular, intra-arterial, intramedular, intratecal, intraventricular, pulmonar, transdérmica, de maneira subcutânea, intraperitoneal, intranasal, intragástrica, tópica, sublingual, vaginal ou retal, porém, sem limitação aos mesmos.

[108] Adicionalmente, o derivado de glucagon pode ser usado mesclando- se com uma variedade de carreadores farmaceuticamente aceitáveis, tais como soluções salinas fisiológicas ou solves orgânicos. A fim de aumentar a estabilidade ou absorvência, carboidratos, tais como glicose, sacarose ou dextranos, antioxidantes tal como ácido ascórbico ou glutationa, agentes quelantes, proteínas de baixo peso molecular ou outros estabilizantes podem ser usados.

[109] A dose e frequência de administração da composição farmacêutica da presente invenção são determinadas pelo tipo de ingrediente (ou ingredientes) ativo, junto de vários fatores, tais como a doença a ser tratada, rota de administração, idade do paciente, gênero e peso corporal e gravidade da doença.

[110] A dose eficaz total da composição da presente invenção pode ser administrada a um paciente em uma dose única ou pode ser administrada por um longo período de tempo em múltiplas doses de acordo com um protocolo de tratamento fracionado. Na composição farmacêutica da presente invenção, o teor do ingrediente (ou ingredientes) ativo pode variar dependendo da gravidade de doença. De preferência, a dose total diária do peptídeo da presente invenção pode ser aproximadamente 0,0001 μg a 500 mg por 1 kg do peso corporal de um paciente. No entanto, a dose eficaz do derivado de glucagon é determinada em consideração de vários fatores incluindo a idade, peso corporal, condições de saúde, gênero, gravidade de doença, dieta e taxa de excreção do paciente além da rota de administração e da frequência de tratamento da composição farmacêutica. Nesse aspecto, as pessoas versadas na técnica podem determinar facilmente a dose eficaz adequada para o uso particular da composição farmacêutica da presente invenção. A composição farmacêutica de acordo com a presente invenção não é particularmente limitada à formulação e à rota e modo de administração, desde que mostre os efeitos da presente invenção.

[111] A composição farmacêutica da presente invenção mostra excelente duração de eficácia in vivo e titulação, desse modo, reduzindo consideravelmente o número e frequência de administração dos mesmos.

[112] Em particular, visto que a composição farmacêutica da presente invenção contém, como um ingrediente ativo, um derivado de glucagon que tem um pI alterado diferente daquele de glucagon nativo, a mesma mostra solubilidade aprimorada e alta estabilidade de acordo com o pH de uma determinada solução e, desse modo, a composição farmacêutica da presente invenção pode ser usada com eficácia na preparação de uma formulação de glucagon estável para tratar a hipoglicemia ou obesidade.

[113] Além disso, a composição farmacêutica da presente invenção pode ser administrada sozinha ou em combinação com outra formulação (ou formulações) farmacêutica que mostra efeitos profiláticos ou terapêuticos em obesidade. Adicionalmente, a composição farmacêutica da presente invenção pode conter adicionalmente uma formulação farmacêutica que mostra efeitos profiláticos ou terapêuticos na obesidade.

[114] As formulações farmacêuticas que mostram efeitos profiláticos ou terapêuticos na obesidade não são limitadas particularmente e podem incluir um agonista de receptor de GLP-1, um antagonista de receptor de peptídeo insulinotrópico dependente de glicose (GIP), um agonista de receptor de leptina, um inibidor de DPP-IV, um antagonista de receptor Y5, um antagonista de receptor de hormônio que contém melanina (MCH), um agonista de receptor Y2/3/4, um agonista de receptor MC3/4, um inibidor de lipase gástrica/pancreática, um agonista 5HT2c, um agonista de receptor β3A, um agonista de receptor de amilina, um antagonista de grelina e um antagonista de receptor de grelina, FGF1, um agonista de receptor de FGF21, um agonista de receptor de colecistocinina (CCK), um agonista de receptor de polipeptídeo pancreático (PP), um inibidor de reabsorção de dopamina, etc.

[115] Em ainda outro aspecto, a presente invenção fornece um método para prevenir ou tratar hipoglicemia ou obesidade, incluindo administração do derivado de glucagon ou a composição farmacêutica que contém o mesmo a um indivíduo.

[116] Conforme usado no presente documento, o termo “indivíduo” se refere àqueles suspeitos de terem hipoglicemia ou obesidade que são mamíferos incluindo seres humanos, camundongos e animais de gado que têm hipoglicemia ou obesidade ou com a possibilidade de terem hipoglicemia ou obesidade. No entanto, qualquer indivíduo a ser tratado com os derivados de glucagon ou com a composição farmacêutica da presente invenção está incluído sem limitação. A composição farmacêutica que contém o derivado de glucagon da presente invenção pode ser administrada a um indivíduo suspeito de ter hipoglicemia ou obesidade, desse modo, tratando o indivíduo com eficácia. A hipoglicemia e obesidade são iguais, conforme descrito acima.

[117] O método terapêutico da presente invenção pode incluir administração da composição farmacêutica que contém o derivado de glucagon em uma quantidade farmaceuticamente eficaz. De preferência, a dose diária total deve ser determinada com base no julgamento médico apropriado por um médico e administrada uma vez ou diversas vezes. Tendo em vista os objetos da presente invenção, a dose específica terapeuticamente eficaz para qualquer paciente particular pode variar dependendo de vários fatores, tais como o tipo e o grau da resposta a ser alcançada, composições específicas incluindo a possibilidade de outro agente (ou agentes) ser usado com a mesma ou não, a idade, peso corporal, condição de saúde, gênero e dieta do paciente, o tempo e a rota de administração, a taxa de secreção da composição, durante de terapia, outro fármaco (ou fármacos) usado em combinação ou com as composições específicas e fatores semelhantes bem conhecidos na técnica médica.

[118] Em ainda outro aspecto, a presente invenção fornece um uso dos derivados de glucagon na preparação de fármacos farmacêuticos para a prevenção ou tratamento de hipoglicemia ou obesidade.

[119] EFEITOS VANTAJOSOS

[120] Os derivados inovadores de glucagon da presente invenção têm estabilidade e solubilidade excelentes de acordo com o pH de uma determinada solução com a presença de um pI diferente daquela de glucagon nativo. Portanto, quando os derivados inovadores de glucagon da presente invenção são usados como um agente terapêutico para tratar hipoglicemia, os mesmos podem aumentar a adaptação do paciente. Adicionalmente, os derivados inovadores de glucagon da presente invenção são adequados para a administração em combinação com outros agentes antiobesidade e, desse modo, os mesmos podem ser usados com eficácia para prevenir ou tratar hipoglicemia e obesidade.

[121] DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[122] Doravante, a presente revelação será descrita mais detalhadamente com referência aos Exemplos a seguir. No entanto, esses exemplos são a título de ilustração apenas e não estão destinados a limitar o escopo da presente invenção.

[123] EXEMPLO 1: PRODUÇÃO DE UMA LINHAGEM DE CÉLULAS QUE TÊM UMA RESPOSTA AO cAMP A GLUCAGON

[124] A PCR foi realizada com o uso de uma região correspondente a um quadro de leitura aberto (ORF) em cDNA (OriGene Technologies, Inc., E.U.A.) de gene receptor de glucagon humano como um modelo, e os iniciadores diretos e reversos dos SEQ ID NOS: 35 e 36, incluindo cada um dentre os sítios de restrição HindIII e EcoRI.

[125] Em particular, a PCR foi realizada por um total de 30 ciclos com o uso das seguintes condições: Desnaturação de 95 °C por 60 segundos, um recozimento a 55 °C por 60 segundos e extensão a 68 °C por 30 segundos. O produto de PCR então obtido passou por eletroforese em um gel de agarose a 1,0% e uma faixa de um tamanho de 450 bp foi obtida do mesmo por eluição.

[126] Iniciador Direto: 5’- CAGCGACACCGACCGTCCCCCCGTACTTAAGGCC-3’ (SEQ ID NO: 35)

[127] Iniciador Reverso: 5’- CTAACCGACTCTCGGGGAAGACTGAGCTCGCC-3’ (SEQ ID NO: 36)

[128] O produto de PCR foi clonado em um vetor de expressão de célula animal conhecido, x0GC/dhfr para preparar um vetor recombinante x0GC/GCGR. A linhagem de células CHO DG44 cultivada em um meio DMEM/F12 (10% de FBS) foi transfectada com o vetor recombinante x0GC/GCGR com o uso de Lipofectamina e cultivada seletivamente em um meio de seleção que contém 1 mg/ml de G418 e 10 nM de Metotrexato. As linhagens de células de clone único foram selecionadas das mesmas por um método de diluição limite e, dentre as mesmas, uma linhagem de células que mostra uma excelente resposta ao cAMP a glucagon de maneira dependente de concentração foi, por fim, selecionada das mesmas.

[129] Exemplo 2: Síntese de Derivados de Glucagon

[130] É amplamente conhecido na técnica que a solubilidade, a atividade e a estabilidade de uma proteína em uma solução podem variar de acordo com pI (Shaw, K. L. et al., Protein Science 10, páginas 1206 a 1215, 2001). A fim de preparar os derivados de glucagon com propriedades físicas aprimoradas, a sequência de aminoácidos de glucagon nativo representada pelo SEQ ID NO: 1 foi substituída por resíduos de aminoácido que tem cargas positivas e negativas e, desse modo, derivados de glucagon foram sintetizados conforme mostrado na Tabela 1 abaixo.

[131] TABELA 1

[132] Em relação aos SEQ ID NOS: 8 a 31 e 33 a 34 mostrados na Tabela 1, o aminoácido representado por X representa um aminoácido não nativo, ácido aminoisobutírico (Aib); “-” na sequência de aminoácidos do SEQ ID NO: 32 significa que nenhum resíduo de aminoácido está presente na posição correspondente; e os dois resíduos de aminoácido em negrito e sublinhados representam formação de um anel entre os dois resíduos de aminoácido.

[133] EXEMPLO 3: MEDIÇÃO DE PI DE DERIVADOS DE GLUCAGON

[134] A fim de medir as propriedades físicas aprimoradas de derivados de glucagon sintetizados no Exemplo 2, os valores de pI foram calculados com base nas sequências de aminoácidos com o uso da ferramenta pI/Mw (http://expasy.org/tools/pi_tool.html; Gasteiger et al., 2003) no servidor ExPASy.

[135] TABELA 2

[136] Conforme mostrado na Tabela 2 acima, embora o glucagon nativo do SEQ ID NO: 1 tivesse um pI de 6,8, os derivados de glucagon de acordo com a presente invenção mostraram valores de pI na faixa de cerca de 4 a cerca de 9, mostrando assim propriedades físicas aprimoradas. Uma vez que os derivados de glucagon de acordo com a presente invenção têm valores de pI diferentes daquele do glucagon nativo, os mesmos podem exibir solubilidade aprimorada e estabilidade maior de acordo com as condições de pH de uma solução determinada.

[137] Consequentemente, quando os derivados de glucagon de acordo com a presente invenção são usados como um agente terapêutico para tratar hipoglicemia, os mesmos podem aprimorar a adaptação do paciente e também são adequados para administração em combinação com outros agentes antiobesidade, por exemplo, um antagonista de receptor de GLP-1, um antagonista de receptor de peptídeo insulinotrópico dependente de glicose (GIP) etc. e, desse modo, pode ser usado com eficácia como um agente terapêutico para tratar hipoglicemia e obesidade.

[138] As pessoas de habilidade comum na técnica reconhecerão que a presente invenção pode ser incorporada em outras formas específicas sem que haja afastamento do espírito ou das características essenciais. As modalidades descritas devem ser consideradas em todos os aspectos somente como ilustrativas e não como restritivas. Portanto, o escopo da presente invenção é indicado pelas reivindicações anexas em vez da descrição supracitada. Todas as mudanças que são abrangidas pelo significado e alcance de equivalência das reivindicações devem ser abrangidas pelo escopo da presente invenção.

Claims (9)

1. Derivado de glucagon caracterizado por compreender uma sequência de aminoácidos selecionada dentre o grupo que consiste em sequências de aminoácidos representadas pelos SEQ ID NOS: 19 a 25, 27, 29 e 34.

2. Derivado de glucagon, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o derivado de glucagon ter atividade de estímulo de receptor de glucagon.

3. Uso de uma composição farmacêutica caracterizado por compreender um derivado de glucagon, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, na preparação de um medicamento para prevenir ou tratar hipoglicemia.

4. Uso de uma composição farmacêutica caracterizado por compreender um derivado de glucagon, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, na preparação de um medicamento para prevenir ou tratar obesidade.

5. Uso, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por a composição farmacêutica compreender adicionalmente um carreador farmaceuticamente aceitável.

6. Uso, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por a composição farmacêutica compreender adicionalmente um carreador farmaceuticamente aceitável.

7. Uso, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por a composição farmacêutica compreender adicionalmente um agente farmacêutico que tem o efeito de prevenir ou tratar obesidade, em que o agente farmacêutico que tem o efeito de prevenir ou tratar obesidade é selecionado dentre o grupo que consiste em um agonista de receptor de GLP-1, um antagonista de receptor de peptídeo insulinotrópico dependente de glicose (GIP), um agonista de receptor de leptina, um inibidor de DPP-IV, um antagonista de receptor Y5, um antagonista de receptor de hormônio que contém melanina (MCH), um agonista de receptor Y2/3/4, um agonista de receptor MC3/4, um inibidor de lipase gástrica/pancreática, um agonista 5HT2c, um agonista de receptor β3A, um agonista de receptor de amilina, um antagonista de grelina, um antagonista de receptor de grelina, agonista de receptor FGF1 e FGF21, um agonista de receptor de colecistocinina (CCK), um agonista de receptor de polipeptídeo pancreático (PP), um inibidor de reabsorção de dopamina e uma combinação dos mesmos.

8. Uso de um derivado de glucagon, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, ou de uma composição farmacêutica que contém o mesmo caracterizado por ser na preparação de um medicamento para prevenir ou tratar hipoglicemia ou obesidade em um indivíduo que necessite do mesmo.

9. Uso do derivado de glucagon, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, ou de uma composição farmacêutica que contém o mesmo, caracterizado por ser na preparação de uma droga farmacêutica para prevenir ou tratar obesidade.