KR20220167317A - Covid-19 융합 단백질에 대한 항원 특이적 면역요법 및 사용 방법 - Google Patents

Covid-19 융합 단백질에 대한 항원 특이적 면역요법 및 사용 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20220167317A
KR20220167317A KR1020227039307A KR20227039307A KR20220167317A KR 20220167317 A KR20220167317 A KR 20220167317A KR 1020227039307 A KR1020227039307 A KR 1020227039307A KR 20227039307 A KR20227039307 A KR 20227039307A KR 20220167317 A KR20220167317 A KR 20220167317A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
fusion protein
rbd
sars
cov
seq
Prior art date
Application number
KR1020227039307A
Other languages
English (en)
Inventor
토드 씨. 자이언
토마스 엠. 랭커스터
틸라이나야감 사티야셀란
케신 후앙
Original Assignee
악스톤 바이오사이언시스 코퍼레이션
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 악스톤 바이오사이언시스 코퍼레이션 filed Critical 악스톤 바이오사이언시스 코퍼레이션
Publication of KR20220167317A publication Critical patent/KR20220167317A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/215—Coronaviridae, e.g. avian infectious bronchitis virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C07K14/08—RNA viruses
    • C07K14/165—Coronaviridae, e.g. avian infectious bronchitis virus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55566—Emulsions, e.g. Freund's adjuvant, MF59
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55588—Adjuvants of undefined constitution
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6031—Proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6031—Proteins
    • A61K2039/6056—Antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6031—Proteins
    • A61K2039/6075—Viral proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/62—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the link between antigen and carrier
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/40—Immunoglobulins specific features characterized by post-translational modification
    • C07K2317/41—Glycosylation, sialylation, or fucosylation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/20011—Coronaviridae
    • C12N2770/20022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/20011—Coronaviridae
    • C12N2770/20034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Abstract

본 개시내용은 2019 신종 코로나바이러스(COVID-19)와 관련하여 사용하기 위한, 인간 Fc 단편에 연결된 SARS-CoV-2 수용체 결합 도메인(SARS-CoV-2-RBD) 단편 또는 이의 유사체를 포함하는 재조합적으로 제조된 융합 단백질을 제공한다. 구현예는 추가 백신접종으로서 COVID-19로부터 회복된 환자에게의, SARS-CoV-2 바이러스에 대한 항체를 생산하여 환자가 회복기 혈장 공여자가 될 수 있도록 하는 항체 나이브 환자에게의, 감염 범위를 제한하고 질병을 개선하기 위해 SARS-CoV-2 바이러스에 감염되었고 COVID-19에 걸린 환자에게의, 융합 단백질의 투여, 및 예방학적 COVID-19 백신으로서의 융합 단백질의 투여를 포함한다. 예시적인 Fc 융합 단백질 및 예시적인 Fc 융합 단백질의 약학 제형을, 사용 및 제조 방법에 추가하여 제공한다.

Description

COVID-19 융합 단백질에 대한 항원 특이적 면역요법 및 사용 방법
관련 출원에 대한 상호 참조
본원은 2020년 4월 10일에 출원된 미국 가특허 출원 일련 번호 63/008,497, 2020년 4월 10일에 출원된 일련 번호 63/008,503, 2020년 4월 10일에 출원된 일련 번호 63/008,509, 2020년 4월 10일에 출원된 일련번호 63/008,515, 2020년 6월 19일에 출원된 일련번호 63/041,574, 2020년 6월 19일에 출원된 일련번호 63/041,579, 2020년 6월 19일에 출원된 일련번호 63/041,582, 2020년 6월 19일에 출원된 일련번호 63/041,584, 2020년 7월 7일에 출원된 일련번호 63/048,939, 2020년 8월 21일에 출원된 일련번호 63/068,775, 2020년 8월 21일에 출원된 일련번호 63/068,805, 2020년 8월 21일에 출원된 일련번호 63/068,843, 2020년 8월 21일에 출원된 일련번호 63/068,894, 및 2020년 8월 21일에 출원된 일련번호 63/068,911의 우선권을 주장하며, 이들은 각각 COVID-19 융합 단백질(fusion protein)에 대한 항원 특이적 면역요법 및 사용 방법이란 표제하에 출원되었으며, 각각 내용 전체가 본원에 참고로 포함된다.
서열 목록
하기의 출원은 2021년 4월 9일에 83 KB로 생성된 "SequenceListing_044"라는 표제로 ASCII 포맷의 텍스트 파일로 제출된, 컴퓨터 판독 가능한 포맷(CRF)의 서열 목록을 함유한다. CRF의 내용은 본원에 참고로 포함된다.
기술 분야
본 기술은 인간 Fc 단편에 연결된 SARS-CoV-2 수용체 결합 도메인(SARS-CoV-2-RBD) 또는 이의 유사체를 포함하는 SARS-CoV-2 표면 당단백질의 절두를 포함하는 융합 단백질 및 2019 신종 코로나바이러스(COVID-19)와 관련된 이의 용도에 관한 것이다.
하기의 배경 설명은 단순히 본 기술을 이해하는 데 도움을 주기 위해 제공되며, 본 기술에 대한 선행 기술을 설명하거나 구성하는 것으로 인정되지 않는다.
Fc 융합 단백질
Fc 융합 단백질은 치료 가능성이 있는 단백질 또는 펩티드와 같은 또 다른 펩티드에 연결되는 종-특이적 면역글로빈 Fc 도메인으로 구성된다. 본원에 사용된 용어 "융합 단백질" 및 "Fc 융합 단백질"은 펩티드 결합을 통해 공유적으로 연결되는, 예를 들어 상이한 공급원(예를 들어 상이한 단백질, 폴리펩티드, 세포 등)으로부터의 하나 초과의 부분을 포함하는 단백질을 지칭한다. Fc 융합 단백질은 바람직하게는 (i) 각 부분을 암호화하는 유전자를 단일 핵산 분자에 연결하고 (ii) 상기 핵산이 암호화하는 단백질을 숙주 세포(예를 들어, HEK 세포 또는 CHO 세포)에서 발현시킴으로써 공유적으로 연결된다. 완전 재조합 합성 접근법이, 치료 단백질과 Fc 단편을 별도로 합성한 다음 화학적으로 접합시키는 방법보다 선호된다. 화학적 접합 단계 및 후속 정제 공정은 제조 복잡성을 증가시키고 제품 수율을 감소시키며 비용을 증가시킨다.
용어 "Fc 단편", "Fc 영역", "Fc 도메인" 또는 "Fc 폴리펩티드"는 면역글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 정의하기 위해 본원에서 사용된다. Fc 단편, 영역, 도메인 또는 폴리펩티드는 천연 서열 Fc 영역 또는 변이체/돌연변이 Fc 영역일 수 있다. 면역글로불린 중쇄의 Fc 영역의 경계는 다양할 수 있지만, 일반적으로 중쇄의 힌지 영역, 중쇄의 CH2 영역 및 중쇄의 CH3 영역의 일부 또는 전부를 포함한다. Fc 단편(예를 들어, 개 또는 인간 Fc 단편)의 힌지 영역은 중쇄의 CH1 도메인을 중쇄의 CH2 영역에 연결하는 아미노산 서열을 포함하고, 하나 이상의 중쇄간 디설파이드 가교(disulfide bridge)를 형성하여, Fc 융합 단백질의 2개의 동일하지만 별도의 단량체로부터 Fc 융합 단백질의 동종이량체(homodimer)를 형성하는 하나 이상의 시스테인을 함유한다. 힌지 영역은 천연 아미노산 서열 또는 비-천연 아미노산 서열의 전부 또는 일부를 포함할 수 있다.
Fc 도메인의 존재는 신생아 Fc 수용체(FcRn)와의 상호작용으로 인해 혈장 반감기를 증가시킬 뿐만 아니라 큰 분자 크기로 인한 Fc 융합 단백질의 더 느린 신장 제거로 인해 분자의 생체내 재순환을 생성하여, 상기 연결된 펩티드의 연장된 활성 및 Fc 융합 단백질 분자의 개선된 용해도 및 안정성을 달성한다. Fc 도메인은 또한 Fc 융합 단백질이 면역 세포의 Fc 수용체와 상호작용할 수 있도록 한다. 일부 예에서, 치료 단백질 또는 펩티드는 링커(linker)를 통해 면역글로빈 Fc 도메인에 연결된다. 치료 단백질 또는 펩티드 및 링커는 Fc 영역을 온전하게 유지하면서 항체의 가변 영역을 효과적으로 대체한다.
Fc 수용체(FcR)는 항체의 Fc 단편 또는 Fc 영역에 결합하는 수용체를 의미한다. 예를 들어, FcR은 개 또는 인간 FcR의 고유 서열이고, FcR은 IgG 항체의 Fc 단편 또는 Fc 영역에 결합하는 것(감마 수용체)이며, 비제한적으로 Fc(감마) 수용체 I, Fc(감마) 수용체 IIa, Fc(감마) 수용체 IIb, 및 Fc(감마) 수용체 III 하위부류(대립형 변이체 및 대안적으로 이들 수용체의 스플라이싱된 형태 포함)의 수용체를 포함한다. "FcR"은 또한 신생아 수용체인 FcRn을 포함하며, 이는 모체 IgG 분자를 태아로 전달하는 역할을 하고 또한 생체내에서 항체 및 Fc-융합 단백질의 연장된 생체내 제거 반감기를 담당한다. 예를 들어, 인간 기원의 FcR은 이의 FcR 결합 특성을 평가하기 위해 임의의 포유동물 기원의 Fc 단편을 포함하는 Fc 융합 단백질의 결합을 측정하기 위해 시험관내에서(예를 들어, 분석에) 사용된다. 당업자는 하나의 종으로부터의 포유동물 FcR(예를 들어, 인간 기원의 FcR)이 때때로 제2 종으로부터의 Fc 단편(예를 들어, 개 기원의 FcR)과 시험관내 결합할 수 있음을 이해할 것이다.
본원은 각각의 바이러스 수용체 결합 도메인(viral receptor binding domain) 및 Fc 단편을 각각 포함하는 융합 단백질을 기재하며, 여기서 바이러스 수용체 결합 도메인 및 Fc 단편은 펩티드 링커와 같은 선택적 링커에 의해 연결된다. 하나 이상의 구현예에서, 바이러스 수용체 결합 도메인은 서열번호 1을 포함하는 SARS-CoV-2 표면 당단백질의 RBD 단편, 또는 이의 기능적 단편, 유사체, 또는 변이체/돌연변이체를 포함한다. 하나 이상의 구현예에서, 바이러스 수용체 결합 도메인은 서열번호 2 또는 서열번호 8을 포함하는 SP/RBD 단편 또는 RBD 단편, 또는 이의 기능적 단편, 유사체, 또는 변이체/돌연변이체를 포함한다. 하나 이상의 구현예에서, 바이러스 수용체 결합 도메인은 하기 서열 또는 이의 기능적 단편, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 13, 서열번호 14, 또는 서열번호 15를 포함한다. 하나 이상의 구현예에서, Fc 단편은 서열번호 6, 서열번호 7, 또는 서열번호 33의 서열 또는 기능적 단편을 포함한다. 하나 이상의 구현예에서, 링커는 존재한다면, 하기 서열: 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 또는 서열번호 27을 포함한다. 하나 이상의 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 16, 서열번호 17, 서열번호 18, 서열번호 19, 서열번호 20, 또는 서열번호 21의 서열, 또는 이의 기능적 단편을 포함한다(이들로 필수적으로 이루어지거나 또는 심지어 이들로 이루어진다). 하나 이상의 구현예에서, 융합 단백질은 동종이량체이다. 하나 이상의 구현예에서, Fc 단편은 글리코실화된다.
또한, 본원은 본원에 기재된 임의의 구현예 또는 구현예의 조합에 따른 융합 단백질(들), 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하거나 필수적으로 이들로 이루어진 면역원성 조성물(immunogenic composition)을 기재한다. 하나 이상의 구현예에서, 융합 단백질은 담체 중에 분산된다. 하나 이상의 구현예에서, 조성물은 항원보강제(adjuvant)를 추가로 포함한다. 하나 이상의 구현예에서, 항원보강제는 Montanide™ ISA-720이다. 하나 이상의 구현예에서, 융합 단백질은 항원보강제로 유화(emulsifying)된다. 하나 이상의 구현예에서, 유화는 투여 전에 현장에서 제조된다. 하나 이상의 구현예에서, 제조된 유화는 냉장(4℃) 또는 실온에서 적어도 8시간, 바람직하게는 최대 24시간 동안 안정하다. 하나 이상의 구현예에서, 조성물은 주사가능한 제형이다. 하나 이상의 구현예에서, 조성물은 피하 투여에 적합하다. 하나 이상의 구현예에서, 조성물은 예방적 백신접종에 적합하다. 하나 이상의 구현예에서, 조성물은 치료학적 백신접종에 적합하다.
또한 본원은 항원제(antigenic agent)에 대한 대상체(subject)에서 항체 생t산을 증가시키기 위한 다양한 방법을 기재한다. 방법은 일반적으로 본원에 기재된 임의의 구현예 또는 구현예의 조합에 따른 융합 단백질(들) 또는 면역원성 조성물(들)의 치료 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 하나 이상의 구현예에서, 대상체는 융합 단백질 또는 면역원성 조성물의 투여 전에 항원제에 대한 측정가능한 항체 역가(antibody titer)를 갖는다. 하나 이상의 구현예에서, 대상체는 융합 단백질 또는 면역원성 조성물의 투여 전에 항체 나이브(
Figure pct00001
)이다. 하나 이상의 구현예에서, 융합 단백질 또는 면역원성 조성물은 주사를 통해 투여된다. 하나 이상의 구현예에서, 융합 단백질 또는 면역원성 조성물은 피하 또는 근육내로 투여된다. 하나 이상의 구현예에서, 융합 단백질 또는 면역원성 조성물은 단위 투여형(unit dosage form)으로 제공된다. 하나 이상의 구현예에서, 융합 단백질 또는 면역원성 조성물은 항원보강제와 공-투여(co-administering)된다. 하나 이상의 구현예에서, 방법은 투여를 위한 융합 단백질 또는 면역원성 조성물을 제조하는 단계를 추가로 포함하고, 여기서 제제는 투여 전에 융합 단백질 또는 면역원성 조성물을 항원보강제와 예비-혼합(pre-mixing)하는 단계를 포함한다. 하나 이상의 구현예에서, 예비-혼합하는 단계는 항원보강제 및 융합 단백질을 유화시켜 유화액(emulsion)을 생성하고, 유화액을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 하나 이상의 구현예에서, 제조된 유화는 제조 후 적어도 8시간, 바람직하게는 최대 24시간 동안 냉장(4℃) 또는 실온에서 안정하다.
또한 본원은 바이러스 감염, 바람직하게는 SARS-CoV-2 바이러스, 보다 바람직하게는 COVID-19에 대해 대상체에서 면역 반응을 유도하는 방법을 기재한다. 방법은 일반적으로 본원에 기재된 임의의 구현예 또는 구현예의 조합에 따른 융합 단백질(들) 또는 면역원성 조성물(들)의 치료 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 하나 이상의 구현예에서, 대상체는 융합 단백질 또는 면역원성 조성물의 투여 전에 바이러스 감염에 대해 측정가능한 항체 역가를 갖는다. 하나 이상의 구현예에서, 대상체는 융합 단백질 또는 면역원성 조성물의 투여 전에 항체 나이브이다. 하나 이상의 구현예에서, 융합 단백질 또는 면역원성 조성물은 주사를 통해 투여된다. 하나 이상의 구현예에서, 융합 단백질 또는 면역원성 조성물은 피하 또는 근육내로 투여된다. 하나 이상의 구현예에서, 융합 단백질 또는 면역원성 조성물은 단위 투여형으로 제공된다. 하나 이상의 구현예에서, 융합 단백질 또는 면역원성 조성물은 항원보강제와 공-투여된다. 하나 이상의 구현예에서, 방법은 투여를 위한 융합 단백질 또는 면역원성 조성물을 제조하는 단계를 추가로 포함하고, 여기서 제제는 투여 전에 융합 단백질 또는 면역원성 조성물을 항원보강제와 예비-혼합하는 단계를 포함한다. 하나 이상의 구현예에서, 예비-혼합하는 단계는 항원보강제 및 융합 단백질을 유화시켜 유화액을 생성하고, 유화액을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 하나 이상의 구현예에서, 제조된 유화는 제조 후 적어도 8시간, 바람직하게는 최대 24시간 동안 냉장(4℃) 또는 실온에서 안정하다.
또한, 본원은 임의의 구현예 또는 구현예의 조합에 따른 융합 단백질의 생산 방법을 기재한다. 방법은 일반적으로 융합 단백질을 암호화하는 핵산을 HEK293 또는 CHO-SE 세포에 일시적으로 형질감염시키는 단계(여기서 형질감염된 HEK293 또는 CHO-SE 세포는 융합 단백질을 발현한다), 또는 융합 단백질을 암호화하는 핵산을 CHO 세포에 안정하게 형질감염시키는 단계(여기서 재조합 CHO 세포는 융합 단백질을 발현한다)를 포함한다. 하나 이상의 구현예에서, 융합 단백질은 세포에 의해 세포 배양 배지로 분비되며, 배지로부터 융합 단백질을 정제하거나 단리하는 단계를 추가로 포함한다. 유리하게는, 정제 또는 단리된 융합 단백질의 수율은 임의의 상기 발현 시스템에서 20 ㎎/L 초과이다.
또한, 본원은 본원에 기재된 임의의 구현예 또는 구현예의 조합에 따른 융합 단백질 또는 융합 단백질을 발현하도록 조작된 세포를 기재한다. 하나 이상의 구현예에서, 세포는 융합 단백질을 암호화하는 핵산으로 형질감염된다. 하나 이상의 구현예에서, 세포는 HEK293 세포 또는 CHO 세포이다.
또한, 본원은 본원에 기재된 임의의 구현예 또는 구현예의 조합에 따른 융합 단백질을 암호화하는 cDNA 분자를 기재한다. 본 개시내용은 또한 본원에 기재된 임의의 구현예 또는 구현예의 조합에 따른 융합 단백질을 암호화하는 cDNA를 포함하는 발현 벡터(expression vector) 및/또는 DNA 발현 구성물에 관한 것이다.
본원에 기재된 바와 같이, 본원에 기재된 임의의 구현예 또는 구현예의 조합에 따른 융합 단백질(들) 또는 면역원성 조성물(들)은 치료법(therapy)에, 및/또는 약제(medicament)로서 사용될 수 있다.
본원에 기재된 바와 같이, 본원에 기재된 임의의 구현예 또는 구현예의 조합에 따른 융합 단백질(들) 또는 면역원성 조성물(들)은 대상체에서 항체 생산을 증가시키는데 사용될 수 있다.
본원에 기재된 바와 같이, 본원에 기재된 임의의 구현예 또는 구현예의 조합에 따른 융합 단백질(들) 또는 면역원성 조성물(들)은 바이러스 감염, 바람직하게는 SARS-CoV-2 바이러스, 보다 바람직하게는 COVID-19의 치료 및/또는 예방에 사용될 수 있다.
본원에 기재된 바와 같이, 본원에 기재된 임의의 구현예 또는 구현예의 조합에 따른 융합 단백질(들) 또는 면역원성 조성물(들)은 예방, 치료 및/또는 추가 백신으로서 사용될 수 있다.
특정 구현예는 바이러스 감염, 바람직하게는 SARS-CoV-2 바이러스, 보다 바람직하게는 COVID-19의 치료 및/또는 예방에 사용하기 위한, 서열번호 16, 서열번호 18, 서열번호 19, 서열번호 20, 및 서열번호 21로 이루어진 그룹으로부터 선택된 융합 단백질(들), 또는 이의 약학 조성물에 관한 것이다.
본원에 기재된 바와 같이, 본원에 기재된 임의의 구현예 또는 구현예의 조합에 따른 융합 단백질(들) 또는 면역원성 조성물(들)은 바이러스 감염의 치료 및/또는 예방을 위한 약제의 제조에 사용될 수 있다.
예를 들어, ISA 720 항원보강제에 유화된 서열번호 19는 처음에 면역원성, 및 SARS-CoV-2 바이러스의 스파이크 단백질(SP)에 결합하여 이를 중화시키는 항체(Ab)의 생산을 유도하는 능력에 대해 BALB/c 마우스에서 평가되었다. SP의 수용체 결합 도메인(SP/RBD)에 결합시, 상기 백신-유도된 Ab는 바이러스가 폐, 혈관 및 뉴런의 내피 세포를 비롯한 다양한 세포 유형에서 발현되는 숙주 표적 단백질, ACE2에 부착하는 것을 방지한다. 항원보강제 MontanideTM ISA 720에 서열번호 19 1 ㎍ 내지 100 ㎍을 1회 주사한 후에도, 마우스, NHP 및 토끼에서 1) 재조합 SP/RBD에 결합되고, 2) 재조합 ACE2가 재조합 SP/RBD에 결합하는 것을 억제하고, 3) SARS-CoV-2 바이러스가, ACE2를 자연적으로 발현하는 생 VERO-E6 세포를 감염시키는 것을 예방하는 상당한 중화 Ab가 유도되었다. 특히, 상기 각 동물 모델에서 중화 Ab를 유도하는 서열번호 19 백신의 효능은 대개 회복기 COVID-19 대상체로부터 수득된 인간 혈청의 중화 능력과 동등하거나 그 이상이었으며, 이는 MontanideTM ISA 720 항원보강제 중의 서열번호 19가 인간에서 충분한 보호를 유도할 것이라는 기대를 일어나게 하였다. 본원에 기재된 분석 및 동물 모델을 사용하여, MontanideTM ISA 720 항원보강제 중의 서열번호 19의 최적의 용량 수준이 30 ㎍ 내지 100 ㎍의 범위이며, 피하(s.c.) 또는 근육내(i.m.) 제공된 두 용량이 최대의 면역원성 반응을 유도하고, 14일 간격으로 제공된 MontanideTM ISA 720 항원보강제 중의 서열번호 19 100 ㎍의 3회 용량이 토끼에서 GLP 독성학에 독성이나 심한 부작용을 나타내지 않음을 입증하였다. 예상대로 MontanideTM ISA 720 항원보강제로 인한 순하고 일시적인 주사 부위 반응이 관찰되었다.
도 1은 인슐린-Fc 융합 단백질 동종이량체의 개략도를 나타낸다.
도 2는 예시적인 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질 동종이량체의 개략도를 나타낸다.
도 3은 서열번호 29 및 서열번호 32의 인슐린-Fc 융합 단백질에 대한 Fc(감마) 수용체 I 결합을 나타낸다.
도 4는 서열번호 29의 인슐린-Fc 융합 단백질의 일련의 8회 용량에 걸쳐 화학적으로 유도된 당뇨병을 갖는 6마리의 비글에 대한, 200배 희석액에 대해 평균된 RHI에 대한 항-인슐린-항체(AIA)의 역가를 나타낸다.
도 5는 서열번호 29의 인슐린-Fc 융합 단백질의 일련의 8회 매주 용량에 걸쳐 화학적으로 유도된 당뇨병을 갖는 6마리의 비글에 대한, 시험 0일째부터의 RHI에 대한 항-인슐린 항체(AIA) 역가의 백분율 변화를 나타낸다.
도 6은 실시예 52의 프로토콜 1 또는 프로토콜 2에 따라 서열번호 29의 인슐린-Fc 융합 단백질로 당뇨병 치료된 8마리의 의뢰인 개에 대한 정규화된 AIA 역가를 나타낸다.
도 7은 치료의 중단과 함께 서열번호 29의 인슐린-Fc 융합 단백질로 당뇨병 치료된 단일 개에 대한 정규화된 AIA 역가를 나타낸다.
도 8은 HEK 일시적 세포 풀 또는 CHO 안정한 세포 풀에서 제조된 서열번호 29의 인슐린-Fc 융합 단백질로 당뇨병 치료된 후 AIA를 나타낸 개의 수의 그래프 표현을 나타낸다.
도 9는 서열번호 32의 인슐린-Fc 융합 단백질로 당뇨병 치료된 8마리의 개에 대한 표준화된 AIA 역가를 나타낸다.
도 10은 서열번호 29 또는 서열번호 32의 인슐린-Fc 융합 단백질로 당뇨병 치료된 후 AIA를 보인 개의 수의 그래프 표현을 나타낸다.
도 11은 Fc(감마) 수용체를 통한 Fc 융합 단백질의 APC 처리를 예시한다.
도 12는 B 세포 활성화 및 항-SARS-CoV-2 SP/RBD IgG 생산의 촉진을 예시한다.
도 13은 서열번호 2(SARS-CoV-2의 연장된 SP/RBD) 및 서열번호 9(SARS-CoV-2의 표면 당단백질의 새로운 절두)의 나란한 서열 비교를 예시한다.
도 14는 서열번호 2(SARS-CoV-2의 연장된 SP/RBD)와 서열번호 10(SARS-CoV-2의 표면 당단백질의 새로운 절두)의 나란한 서열 비교를 예시한다.
도 15는 서열번호 2(SARS-CoV-2의 연장된 SP/RBD)와 서열번호 14(SARS-CoV-2의 표면 당단백질의 새로운 절두)의 나란한 서열 비교를 예시한다.
도 16은 서열번호 2(SARS-CoV-2의 연장된 SP/RBD)와 서열번호 15(SARS-CoV-2의 표면 당단백질의 새로운 절두)의 나란한 서열 비교를 예시한다.
도 17은 서열번호 2(SARS-CoV-2의 연장된 SP/RBD)와 서열번호 13(SARS-CoV-2의 표면 당단백질의 새로운 절두)의 나란한 서열 비교를 예시한다.
도 18은 백신 항원보강제의 일반적인 작용 기전을 예시한다.
도 19는 서열번호 19의 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질에 결합하는 인간 Fc(감마)RI의 EC50을 예시한다.
도 20은 서열번호 19의 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질에 결합하는 인간 Fc(감마)RIIa의 EC50을 예시한다.
도 21은 서열번호 19의 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질에 결합하는 인간 Fc(감마)RIIb의 EC50을 예시한다.
도 22는 서열번호 19의 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질에 결합하는 인간 Fc(감마)RIII의 EC50을 예시한다.
도 23은 서열번호 19 및 인간 IgG의 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질에 결합하는 인간 ACE2의 EC50을 예시한다.
도 24는 서열번호 19의 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질에 결합하는 인간 FcRn 수용체의 EC50을 예시한다.
도 25는 다양한 용량 수준에 걸친, 서열번호 17의 SARS-CoV-2 RBD-hIgG-Fc 융합 단백질의 단일 투여 후 21일째에 6주 내지 8주령 암컷 BALB/c 마우스에서 항-SP/RBD IgG Ab 역가 반응을 예시한다.
도 26은 다양한 용량 수준에 걸친, 서열번호 17의 SARS-CoV-2 RBD-hIgG-Fc 융합 단백질의 0일 및 21일 주사 후 35일째에 6 내지 8주령 암컷 BALB/c 마우스에서 항-SP/RBD IgG Ab 역가 반응을 예시한다.
도 27은 서열번호 17의 SARS-CoV-2 RBD-hIgG-Fc 융합 단백질의 0일, 21일 및 42일 주사 후 1 ㎍, 3 ㎍, 10 ㎍, 30 ㎍ 및 100 ㎍의 용량 수준에 대한 동역학 반응을 예시한다.
도 28은 0일에 1회 투여 후 14일 및 21일째에 측정된 바와 같은 다양한 용량 수준에서 항원보강제 부재하에 6주 내지 8주령 마우스에게 서열번호 2의 SP/RBD 또는 서열번호 17의 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질 투여 후 유도된 항-SP/RBD IgG Ab 역가 반응을 예시한다.
도 29는 0일에 1회 투여 후 21일째에 10 ㎍ 용량 수준의 서열번호 17의 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질을 함유하는 다양한 항원보강제 첨가된 제형에서 6주 내지 8주령 암컷 BALB/c 마우스에서 항-SP/RBD IgG Ab 역가 반응을 예시한다.
도 30은 0일 및 21일에 주사 후 35일째에 10 ㎍ 용량 수준의 서열번호 17의 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질을 함유하는 다양한 항원보강제 첨가된 제형에서 6주 내지 8주령 암컷 BALB/c 마우스에서 항-SP/RBD IgG Ab 역가 반응을 예시한다.
도 31은 0일, 21일 및 42일에 주사 후 56일째에 10 ㎍ 용량 수준의 서열번호 17의 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질을 함유하는 다양한 항원보강제 첨가된 제형에서 6주 내지 8주령 암컷 BALB/c 마우스에서 항-SP/RBD IgG Ab 역가 반응을 예시한다.
도 32는 0일, 21일 및 42일에 주사 후 88일째에 10 ㎍ 용량 수준의 서열번호 17의 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질을 함유하는 다양한 항원보강제 첨가된 제형에서 6주 내지 8주령 암컷 BALB/c 마우스에서 항-SP/RBD IgG Ab 역가 반응을 예시한다.
도 33은 인간 회복기 혈청과 비교된, 6주 내지 8주령 마우스에서 항원보강제의 존재 및 부재하에서 서열번호 17의 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질의 0일 단일 주사 후 21일째에 계산된 ACE2-SP/RBD 결합 억제 효능(ID50)을 예시한다.
도 34는 인간 회복기 혈청과 비교된, 6주 내지 8주령 마우스에서 항원보강제의 존재 및 부재하에서 서열번호 17의 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질의 0일 및 21일 주사 후 35일째에 계산된 ACE2-SP/RBD 결합 억제 효능(ID50)을 예시한다.
도 35는 인간 회복기 혈청과 비교된, 6주 내지 8주령 마우스에서 항원보강제의 존재 및 부재하에서 서열번호 17의 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질의 0일, 21일 및 42일 주사 후 56일째에 계산된 ACE2-SP/RBD 결합 억제 효능(ID50)을 예시한다.
도 36은 인간 회복기 혈청과 비교된, 6주 내지 8주령 마우스에서 항원보강제의 존재 및 부재하에서 서열번호 17의 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질의 0일, 21일 및 42일 주사 후 88일째에 계산된 ACE2-SP/RBD 결합 억제 효능(ID50)을 예시한다.
도 37은 21일에 1회 용량 후 측정된 바와 같은, 다양한 용량 수준의 항원보강제와 함께 8개월 내지 10개월된 마우스에게 서열번호 17의 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질 투여 후 유도된 항-SP/RBD IgG Ab 반응 및 ACE2-SP/RBD 결합 억제 효능(ID50)을 예시한다.
도 38은 0일 및 21일에 주사 후 35일째에 측정된 바와 같은, 다양한 용량 수준의 항원보강제와 함께 8개월 내지 10개월된 마우스에게 서열번호 17의 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질 투여 후 유도된 항-SP/RBD IgG Ab 반응 및 ACE2-SP/RBD 결합 억제 효능(ID50)을 예시한다.
도 39는 0일, 21일 및 42일에 주사 후 56일째에 측정된 바와 같은, 다양한 용량 수준의 항원보강제와 함께 8개월 내지 10개월된 마우스에게 서열번호 17의 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질 투여 후 유도된 항-SP/RBD IgG Ab 반응 및 ACE2-SP/RBD 결합 억제 효능(ID50)을 예시한다.
도 40은 1회 용량 후 14일째에 다양한 항원보강제의 존재 및 부재하에서 1 ㎍ 또는 10 ㎍ 용량 수준의 서열번호 19의 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질이 투여된 6주 내지 8주령 암컷 BALB/c 마우스에서 항-SP/RBD IgG Ab 역가 반응을 예시한다.
도 41은 0일 및 21일에 주사 후 35일째에 다양한 항원보강제의 존재 및 부재하에서 1 ㎍ 또는 10 ㎍ 용량 수준의 서열번호 19의 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질이 투여된 6주 내지 8주령 암컷 BALB/c 마우스에서 항-SP/RBD IgG Ab 역가 반응을 예시한다.
도 42는 0일, 21일 및 42일에 주사 후 56일째에 다양한 항원보강제의 존재 및 부재하에서 1 ㎍ 또는 10 ㎍ 용량 수준의 서열번호 19의 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질이 투여된 6주 내지 8주령 암컷 BALB/c 마우스에서 항-SP/RBD IgG Ab 역가 반응을 예시한다.
도 43은 1회 주사 후 14일째에 다양한 항원보강제의 존재 및 부재하에서 1 ㎍ 또는 10 ㎍ 용량 수준의 서열번호 19의 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질이 투여된 6주 내지 8주령 암컷 BALB/c 마우스에서 ACE2-SP/RBD 결합 억제 효능(ID50)을 예시한다.
도 44는 인간 회복기 혈청과 비교된, 0일 및 21일에 주사 후 35일째에 항원보강제의 존재 및 부재하에서 1 ㎍ 또는 10 ㎍ 용량 수준의 서열번호 19의 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질이 투여된 6주 내지 8주령 암컷 BALB/c 마우스에서 ACE2-SP/RBD 결합 억제 효능(ID50)을 예시한다.
도 45는 인간 회복기 혈청과 비교된, 0일, 21일 및 42일에 주사 후 56일째에 다양한 항원보강제의 존재 및 부재하에서 1 ㎍ 또는 10 ㎍ 용량 수준의 서열번호 19의 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질이 투여된 6주 내지 8주령 암컷 BALB/c 마우스에서 ACE2-SP/RBD 결합 억제 효능(ID50)을 예시한다.
도 46은 21일 및 35일에 측정된 바와 같은, 0일 및 21일째에 1 ㎍ 또는 10 ㎍ 용량 수준의 서열번호 19가 투여된 6주 내지 8주령 암컷 BALB/c 마우스로부터의 혈청 샘플에서 항-SP/RBD PRNT 중화 효능의 유도를 예시한다.
도 47은 0일, 21일 및 42일에 주사 후 14일, 35일 및 56일째에 측정된 바와 같은, 항원보강제(MontanideTM ISA 720 포함)의 존재 및 부재하에서 10 ㎍ 용량 수준의 서열번호 19의 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질이 투여된 6-8주령 BALB/C 마우스에서 항-SP/RBD IgG1 역가를 예시한다.
도 48은 0일, 21일 및 42일에 주사 후 14일, 35일 및 56일째에 측정된 바와 같은, 항원보강제(MontanideTM ISA 720 포함)의 존재 및 부재하에서 10 ㎍ 용량 수준의 서열번호 19의 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질이 투여된 6-8주령 BALB/C 마우스에서 항-SP/RBD IgG2a 역가를 예시한다.
도 49는 0일, 21일 및 42일에 주사 후 14일, 35일 및 56일째에 측정된 바와 같은, 항원보강제(MontanideTM ISA 720 포함)의 존재 및 부재하에서 10 ㎍ 용량 수준의 서열번호 19의 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질이 투여된 6-8주령 BALB/C 마우스에서 항-SP/RBD IgG2b 역가를 예시한다.
도 50은 0일, 21일 및 42일에 주사 후 14일, 35일 및 56일째에 측정된 바와 같은, 항원보강제(MontanideTM ISA 720 포함)의 존재 및 부재하에서 10 ㎍ 용량 수준의 서열번호 19의 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질이 투여된 6-8주령 BALB/C 마우스에서 항-SP/RBD IgG3 역가를 예시한다.
도 51은 14일째에 측정된 바와 같은, 0일에 1 ㎍ 또는 10 ㎍ 용량 수준의 서열번호 19 또는 서열번호 23(마우스 IgG2a-Fc와 함께) 또는 0.5 ㎍ 또는 5 ㎍ 용량 수준의 서열번호 2가 단일 용량으로 투여된 6주 내지 8주령 암컷 BALB/c 마우스에서 항-SP/RBD IgG 역가를 예시한다.
도 52는 0일 및 21일에 주사 후 35일째에 측정된 바와 같은, 1 ㎍ 또는 10 ㎍ 용량 수준의 서열번호 19 또는 서열번호 23(마우스 IgG2a-Fc와 함께) 또는 0.5 ㎍ 또는 5 ㎍ 용량 수준의 서열번호 2가 투여된 6주 내지 8주령 암컷 BALB/c 마우스에서 항-SP/RBD IgG 역가를 예시한다.
도 53은 인간 회복기 혈청과 비교된, 14일째에 측정된 바와 같은, 1 ㎍ 또는 10 ㎍ 용량 수준의 서열번호 19 또는 서열번호 23(마우스 IgG2a-Fc와 함께) 또는 0.5 ㎍ 또는 5 ㎍ 용량 수준의 서열번호 2가 투여된 6주 내지 8주령 암컷 BALB/c 마우스에서 유도된 ACE2-SP/RBD 결합 억제 효능(ID50)을 예시한다.
도 54는 인간 회복기 혈청과 비교된, 0일 및 21일에 주사 후 53일째에 측정된 바와 같은, 1 ㎍ 또는 10 ㎍ 용량 수준의 서열번호 19 또는 서열번호 23(마우스 IgG2a-Fc와 함께) 또는 0.5 ㎍ 또는 5 ㎍ 용량 수준의 서열번호 2가 투여된 6주 내지 8주령 암컷 BALB/c 마우스에서 유도된 ACE2-SP/RBD 결합 억제 효능(ID50)을 예시한다.
도 55는 4℃ 및 25℃에서 1일 및 7일 동안 보관된 유화액에 대한, 신선하게 제조된 유화액 주사 후 14일째에 측정된 바와 같은, 마우스에서 서열번호 19의 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질의 유도된 ACE2-SP/RBD 결합 억제를 예시한다.
도 56은 키노몰구스 원숭이의 Fc(감마)RI 수용체와 비교된 바와 같은, 인간 Fc(감마)RI 수용체에 대한 서열번호 19의 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질의 결합을 예시한다.
도 57은 키노몰구스 원숭이의 Fc(감마)RIIa 수용체와 비교된 바와 같은, 인간 Fc(감마)RIIa 수용체에 대한 서열번호 19의 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질의 결합을 예시한다.
도 58은 키노몰구스 원숭이의 Fc(감마)RIII 수용체와 비교된 바와 같은, 인간 Fc(감마)RIII 수용체에 대한 서열번호 19의 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질의 결합을 예시한다.
도 59는 키노몰구스 원숭이의 FcRn 수용체와 비교된 바와 같은, 인간 FcRn 수용체에 대한 서열번호 19의 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질의 결합을 예시한다.
도 60은 0일 및 21일에 주사 후 0일, 14일, 21일, 35일 및 42일째에 MontanideTM ISA 720 항원보강제와 30%/70%(v/v)로 제형화된 10 ㎍ 또는 30 ㎍ 용량 수준의 서열번호 19의 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질이 투여된 수컷 및 암컷 키노몰구스 원숭이에서 항-SP/RBD IgG Ab 역가 반응을 예시한다.
도 61은 0일 및 21일에 주사 후 21일 및 42일째에 MontanideTM ISA 720 항원보강제와 30%/70%(v/v)로 제형화된 10 ㎍ 또는 30 ㎍ 용량 수준의 서열번호 19의 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질이 투여된 수컷 및 암컷 키노몰구스 원숭이에서 유도된 ACE2-SP/RBD 결합 억제 효능(ID50)을 예시한다.
도 62는 인간 회복기 혈청과 비교된, 21일 및 42일째에 측정된 바와 같은 NHP 혈청 샘플에서 서열번호 19의 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질 유도된 SARS-CoV-2 바이러스 중화 효능을 예시하며, 여기서 서열번호 19는 0일 및 21일에 주사 후 MontanideTM ISA 720 항원보강제와 30%/70%(v/v)로 제형화되었다.
도 63은 추가접종 주사를 수용한 후 접종된 NHP에서 항-SP/RBD 반응을 예시한다.
도 64는 서열번호 19로 처리된 NHP로부터의 면역 혈청이 재조합 N501Y 및 E484K SP/RBD 돌연변이체 뿐만 아니라 야생형 SP/RBD 분자 또는 그 이상에 결합하였음을 예시한다.
도 65는 서열번호 19로 처리된 마우스로부터의 면역 혈청이 재조합 N501Y 및 E484K RBD 돌연변이체 뿐만 아니라 야생형 RBD 또는 그 이상에 결합하였음을 예시한다.
도 66은 서열번호 2의 SP/RBD, 서열번호 24 및 서열번호 25의 SP/RBD 변이체의 나란히 서열 비교를 예시한다.
도 67은 1차 용량, 2차 용량 및 3차 용량 전후에 측정된, 1일, 15일 및 29일째에 Montanide™ ISA 720 항원보강제와 함께 비히클 대조군이 피하 투여된 뉴질랜드 흰토끼의 항-SP/RBD IgG Ab 역가를 예시한다.
도 68은 1차 용량, 2차 용량 및 3차 용량 전후에 측정된, 1일, 15일 및 29일째에 항원보강제 없이 30 ㎍ 용량 수준의 서열번호 19의 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질이 투여된 뉴질랜드 흰토끼의 상당한 항-SP/RBD IgG Ab 역가를 예시한다.
도 69는 1차 용량, 2차 용량 및 3차 용량 전후에 측정된, 1일, 15일 및 29일째에 항원보강제 없이 100 ㎍ 용량 수준의 서열번호 19의 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질이 투여된 뉴질랜드 흰토끼의 상당한 항-SP/RBD IgG Ab 역가를 예시한다.
도 70은 1차 용량, 2차 용량 및 3차 용량 전후에 측정된, 1일, 15일 및 29일째에 Montanide™ ISA 720 항원보강제와 함께 30 ㎍ 용량 수준의 서열번호 19의 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질이 투여된 뉴질랜드 흰토끼의 상당한 항-SP/RBD IgG Ab 역가를 예시한다.
도 71은 1차 용량, 2차 용량 및 3차 용량 전후에 측정된, 1일, 15일 및 29일째에 Montanide™ ISA 720 항원보강제와 함께 100 ㎍ 용량 수준의 서열번호 19의 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질이 투여된 뉴질랜드 흰토끼의 상당한 항-SP/RBD IgG Ab 역가를 예시한다.
도 72는 0일 및 21일에 주사 후에 15일 및 29일째에 측정된, Montanide™ ISA 720 항원보강제와 함께 30 ㎍ 또는 100 ㎍ 용량 수준의 서열번호 19의 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질이 투여된 뉴질랜드 흰토끼에서 유도된 ACE2-SP/RBD 결합 억제 효능(ID50)을 예시한다.
도 73은 서열번호 19의 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질이 인간 회복기 혈청과 비교하여, 21일 및 35일째에 측정된 뉴질랜드 흰토끼 혈청 샘플에서 SARS-CoV-2 바이러스 중화 효능을 유도하였음을 예시하며, 여기서 서열번호 19는 0일 및 21일에 MontanideTM ISA 720 항원보강제로 유화되고 투여되었다.
도 74는 0일 및 21일에 주사 후에 15일, 29일 및 36일째에 측정된, 피하(SC) 주사 또는 근육내 주사(IM)를 통해 Montanide™ ISA 720 항원보강제와 함께 100 ㎍ 용량 수준의 서열번호 19의 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질이 투여된 뉴질랜드 흰토끼에서 항-SP/RBD IgG Ab 역가를 예시한다.
도 75는 0일 및 21일에 주사 후에 15일, 29일 및 36일째에 측정된, 피하(SC) 주사 또는 근육내 주사(IM)를 통해 Montanide™ ISA 720 항원보강제와 함께 100 ㎍ 용량 수준의 서열번호 19의 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질이 투여된 뉴질랜드 흰토끼에서 유도된 ACE2-SP/RBD 결합 억제 효능(ID50)을 예시한다.
도 76은 0일 및 21일에 주사 후에 15일, 29일 및 36일째에 측정된, 피하(SC) 주사를 통해 Montanide™ ISA 720 항원보강제와 함께 100 ㎍ 용량 수준의 서열번호 19의 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질의 신선한 유화액 및 2-8℃에서 24시간 동안 보관된 유화액이 투여된 뉴질랜드 흰토끼에서 항-SP/RBD IgG Ab 역가를 예시한다.
도 77은 0일 및 21일에 주사 후에 15일, 29일 및 36일째에 측정된, 근육내(IM) 주사를 통해 Montanide™ ISA 720 항원보강제와 함께 100 ㎍ 용량 수준의 서열번호 19의 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질의 신선한 유화액 및 2-8℃에서 24시간 동안 보관된 유화액이 투여된 뉴질랜드 흰토끼에서 항-SP/RBD IgG Ab 역가를 예시한다.
도 78은 나이브 NHP 및 실시예 36에 따라 Montanide™ ISA 720과 함께 서열번호 19의 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질로 면역화된 NHP로부터 채취된 비강 면봉채취물의 ㎖당 게놈 또는 서브게놈 SARS-CoV-2 바이러스 RNA 사본을 예시한다.
도 79는 나이브 NHP 및 실시예 36에 따라 Montanide™ ISA 720과 함께 서열번호 19의 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질로 면역화된 NHP로부터 수집된 기관지폐포 세척액(BAL)의 ㎖당 게놈 또는 서브게놈 SARS-CoV-2 바이러스 RNA 사본을 예시한다.
도 80은 서열번호 8(SARS-CoV-2의 RBD)과 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 14 및 서열번호 15(전부, 새로운 돌연변이가 있는 SARS-CoV-2의 RBD)와의 나란한 서열 비교를 예시한다.
도 81은 혈청 중 기존의 SARS-CoV-2 항체 역가를 평가하기 위한 일반적인 혈청학 분석에 사용될 수 있는 것과 같은 96웰 마이크로플레이트를 예시한다.
신종 코로나바이러스 질병 2019
신종 코로나바이러스 질병 2019(COVID-19)는 SARS-CoV-2 바이러스에 의해 유발되는 중증 급성 호흡기 질환이다. 첫 번째 COVID-19 사례는 2019년 12월 중국 우한에서 보고되었으며 2020년 11월 18일 현재 지금까지 전 세계적으로 약 5천 6백만(M)건의 사례가 있어왔으며(확인 및 확인되지 않은 "있음직한" SARS-CoV-2 바이러스로서 정량화되었다), 이 중 COVID-19로 인한 활성 사례 18.5M, 회복된 사례 36M, 치명적인 사례 1.3M이 있다(University, J.H., COVID-19 Dashboard by the Center for Systems Science and Engineering (CSSE) at Johns Hopkins University; www.covidtracker.com/). 2020년 말, Pfizer-BioNTech COVID-19 백신 BNT162b2만이 세계보건기구(WHO)의 COVID-19 긴급사용목록(EUL) 절차에 따라 승인되었다. Moderna의 두 번째 백신(mRNA-1273)은 2021년 2월 말까지 COVID-19에 대한 백신 긴급 사용을 위한 WHO EUL 절차에 따라 승인될 것으로 예상된다. 집단에 충분한 수준의 면역성이 부여되지 않는 한, 그리고 충분한 면역성이 부여될 때까지는 사회가 정상으로 돌아갈 수 없다는 게 전문가들의 공통된 의견이다. 자연적 집단 면역을 달성하려면 인구의 최소 70%가 감염되어 전 세계적으로 수백만 명이 사망해야 하는 것으로 추정되며 이는 윤리적으로 용납할 수 없는 결과이다.
ACE2 수용체
안지오텐신-전환 효소 2(ACE2)는 SARS-CoV-2에 의한 감염 매개를 담당하는 숙주 세포 수용체(즉, 세포를 감염시키기 위해서 SARS-CoV-2가 여기에 결합한다)이다. ACE2는 1형 막관통 메탈로카복시펩티다제이다. 폴리머라제 연쇄 반응(PCR) 분석에 따르면 ACE2는 폐 상피, 혈관 내피, 특정 뉴런 세포에서 발현되며, 이는 각각 폐, 심혈관, 및 신경계 합병증을 포함한 COVID-19의 주요 임상 증상을 설명하는 것으로 보인다. SARS-CoV-2와 SARS-CoV 간의 수용체 결합 도메인의 서열 유사성을 기반으로 연구자들은 SARS-CoV-2가 인간 세포 표면에 발현된 ACE2를 사용하여 ACE2를 발현하는 HeLa 세포로 진입할 수 있음을 입증하였다.
바이러스 환자의 치료를 위한 회복기 혈청
전 세계의 임상의와 연구자들은 SARS-CoV-2로 인한 전염병을 완화하기 위한 다양한 해법을 개발하기 위해 노력하고 있다. 과학자들은 COVID-19를 예방할 수 있는 백신과 질병의 중증도와 증상을 줄이기 위한 항바이러스 치료제를 개발하기 위해 노력하고 있다. SARS-CoV-2를 치료하기 위한 백신, 단클론항체(mAb) 또는 약물의 개발이 진행 중이다. 많은 임상의들은 인간의 회복기 혈청이 COVID-19의 예방 및 치료에 실행 가능한 옵션이라고 여겼다.
회복기 혈청은, 항바이러스 항체를 함유하는 감염 및 회복된 개인의 혈청을 민감한 또는 감염된 개인에게 수혈하여, 상기 개인에게 질병의 중증도를 예방하거나 감소시키기 위한 일정 수준의 면역을 제공하는 수동 항체 요법의 한 형태이다. 이러한 치료는, 개인이 바이러스에 대해 자신의 항체를 생산하도록 면역 반응을 유도함으로써 작동하는 백신과 다르다. 2002년 SARS-CoV 발생 및 2009-2010년 H1N1 인플루엔자 발생 경험에 따르면, 바이러스에 감염되어 회복된 환자의 혈청(인간 회복기 혈청)은 바이러스를 중화시킬 수 있는 항체를 포함하여, 심각한 질병 증상이 있는 개인을 위한 중재로서 또는 예방 백신으로서 유용한 것으로 나타났다.
인간 회복기 혈청의 사용에는 위험과 한계가 있다. 첫째, 한 사람에서 다른 사람으로 혈액 물질이 전달되면 다른 혈청 성분에 대한 반응의 위험뿐만 아니라 다른 전염병의 우발적인 감염 위험이 따른다. 회복기 혈청을 사용할 때의 또 다른 문제는 바이러스성 질병에서 회복된 일부 환자의 중화 항체 역가가 높지 않다는 것이다. 또 다른 인간 코로나바이러스인 중동 호흡기 증후군(MERS-CoV)과 관련하여 한국에서 3명의 환자가 회복기 혈청으로 치료를 받았지만 그 중 2명만이 혈청에 중화항체를 갖고 있었다. 바이러스성 질병에서 회복된 후 중화 항체를 가지고 있는 이들 중 일부는 생존 가능한 공여자가 될 만큼 충분히 높은 중화 항체 역가를 갖지 않을 수 있다. SARS-CoV와 관련된 추가 조사에 따르면 SARS 환자의 회복기 혈청 샘플 99개 중 87개에서 중화 항체가 있었고 기하 평균 역가는 1:61이었다. 이들 및 기타 다양한 연구는 소수의 환자가 고-역가 반응을 보였고 또한 중화 항체 역가가 시간이 지남에 따라 감소함을 시사한다. 회복된 환자의 항체에만 의존하는 대신 재조합 항체를 생산하여 이 문제를 극복하고자 하는 회사가 많이 있으나; 생산 규모가 불충분하고, 수주에서 수개월 간격으로 환자에게 유효량을 투여하기 위해 필요한 의학적 개입(대부분 정맥 주사 또는 주입을 통해)이 매우 부담이 된다.
더 중요한 한계는 COVID-19 전염병에서 제안된 회복기 혈청의 사용이 고 역가의 SARS-CoV-2 중화 항체를 가진 제제에 의존할 것이라는 점이다. 이를 위해서는 질병에서 회복되어 회복기 혈청을 공여할 수 있는 상당한 수의 공여자가 필요하다. 누가 이미 질병에 걸렸고 면역력이 어느 정도 발달했는지 확인하는 것은 어려운 일이다. COVID-19는 다양한 중증도의 증상을 나타내며 경증의 많은 사람들은 자신이 질병에 걸렸다는 사실을 모를 수 있다. 항-SARS-CoV-2 항체를 측정하기 위해서 고도로 가용성이고 저렴한 검사 키트가 또한 필요하다.
그러나, 중화항체 역가가 높은 회복된 환자를 식별할 수 있는 능력이 있더라도 한 개인의 혈장이 몇 명 이상의 환자를 치료할 수 있을 것 같지는 않다. 따라서 회복기 혈청 치료에 대한 현재 접근 방식은 소수의 환자에서 COVID-19를 예방하거나 치료할 수 있지만 상기 해법은 이 대유행 기간 동안과 이후 인류의 더 큰 요구를 해결하지 못한다.
현행 백신의 개요 및 도전 과제
전 세계의 임상의와 연구원들은 SARS-CoV-2 바이러스로 인한 대유행을 완화하기 위한 다양한 해법을 개발하기 위해 노력하고 있다. 이러한 해법에는 COVID-19를 예방할 수 있는 백신과 질병의 심각성과 증상을 줄이기 위한 항바이러스 치료가 포함된다. 가까운 미래에 자연 면역 및 백신-유도 면역은 수명이 길지 않을 가능성이 높기 때문에 필요한 경우 6개월마다 빈번히 투여되는 비용-효과적이고 안전한 백신은 집단간에 강력한 면역을 유지해야 할 것으로 예상된다. 따라서 효과적인 예방적 COVID-19 백신의 중요한 설계 특징은 하기와 같다: i) 바람직하게는 단일 투여 후에, SARS-CoV-2 바이러스 중화 IgG 역가 및 현저한 1형 T 헬퍼(Th1) 세포 반응을 유도하는 효능 있는 능력; ii) 특히 반응원성(전신적 효과) 및 주사 부위(국소적 효과)로 인한 염증과 관련하여 허용가능한 안전성 및 내약성 프로파일, 용량-빈도 및 용량-수준을 지시하는 제조역량 및 백신 효능과 관련하여 유리한 물가(COG), 및 충분한 보관 수명과 확고한 시험 물품 준비 및 투여 절차를 포함한 적합한 공급망 경로.
생-약독화 또는 불활성 완전 바이러스 백신은 고전적인 전략을 나타낸다. 완전 바이러스 백신의 주요 이점은 고유한 면역원성, 및 TLR 3, TLR 7/8 및 TLR 9를 포함한 톨 유사 수용체(TLR)를 자극하는 능력이다. 그러나 생 바이러스 백신은 종종 안전성을 확인하기 위해 광범위한 추가 시험이 필요하다. 이는 생 또는 사 완전 바이러스 SARS 코로나바이러스 백신으로 면역화 후 감염력이 증가한다는 발견을 고려할 때 코로나바이러스 백신의 경우 특히 문제이다. Johnson & Johnson은 PER.C6® 세포주 기술로 제조된 Janssen의 AdVac® 아데노바이러스 벡터를 사용하여 리드 백신 JNJ-78436735를 생산하고 있는데, 이 백신은 최근 3상 시험을 완료하고 미국에서 긴급 사용이 승인되었다. 이 기술은 전 바이러스를, SARS-CoV-2 바이러스 DNA의 일부를 운반하는 양성으로 알려진 아데노바이러스 벡터로 대체하는 바이러스 벡터를 생산하려는 시도이다. 그러나 JNJ-78436735의 사용은 임상 시험 일시중지를 야기한 중대한 심각한 부작용(SAE)에 직면하였다.
SARS 코로나바이러스 백신의 초기 개발에서 두 가지 추가 장애물은 1) Th2-매개 호산구성 침윤 형태의 원치 않는 면역강화 및 2) ADE에 의해 구동된 증가된 바이러스 감염성(이는 완전 바이러스 백신 및 완전한 SP 백신으로 면역화 후 시험 감염에 이어 발생하는 것으로 언급된다)의 발견이었다. Th2-매개 호산구성 침윤 및 폐 병리의 위험은 SARS-CoV-2 감염에서 아직 조사 중이지만 호흡기 세포융합 바이러스(RSV) 또는 완전 RSV 백신으로 면역화된 유아 및 동물에서 발견되었다.
ADE는 원래 SARS-CoV, 뎅기열 바이러스 및 지카 바이러스 감염에 대한 백신을 포함하는 다른 바이러스 백신의 불리한 특성이며, 여기서 백신-유도된 Ab 농도 또는 친화도는 바이러스 감염을 중화시키기에는 너무 낮지만, 오히려 Ab의 Fc 도메인을 통해 골수 세포 표면상의 Fcγ 수용체와 상호작용하는 경향이 있는 바이러스와 면역 복합체를 형성한다. 이러한 Ab는 바이러스 감염을 중화시키거나 Fc 매개 바이러스 제거(Li)를 유도하지 않지만, Fc 수용체를 통한 바이러스 흡수를 직접 증가시키거나 선천 면역을 길항하는 하류 경로를 활성화하여 세포내 바이러스 복제를 촉진함으로써 바이러스 감염을 돕는다(Sun에서 검토됨). ADE 및 Th2-면역 강화 모두에서, 고양이 IgG2a mAb(가능하게는 Th2 아이소타입의)가 두 가지 불리한 조건을 모두 매개할 수 있는 반면, IgG1 mAb(강한 효과기 기능, 즉 Th1 이소타입을 갖는 것으로 공지됨)는 이러한 효과를 피할 수 있다는 증거가 존재한다.
ADE 및/또는 Th2-면역강화를 유발할 위험 외에도, 바이러스 벡터 백신의 또 다른 문제는 상대적으로 낮은 제조역량 처리량 및 따라서 계란 기반 생산 또는 세포 발현 시스템(Ewer)으로 인한 높은 매출 원가(COG)이다.
대안으로, COVID-19용 핵산 발현 벡터 백신 플랫폼은 숙주 수용체인 ACE2 결합을 통해 바이러스의 감염 기전을 매개하는 주요 코로나바이러스 표적 항원(Ag)인 스파이크 단백질(SP)을 암호화한다. 3상 시험을 통해 진행된 이러한 백신의 두 가지 예는 BioNTech/Pfizer에 의해 개발된 완전길이 SP를 암호화하는 mRNA 백신, BNT162b2 및 Moderna에 의해 개발된 mRNA-1273이다. 두 백신 모두 90% 이상의 증상이 있는 SARS-CoV-2 바이러스 감염으로부터의 보호 효능과 함께 매우 긍정적인 3상 결과를 보고하여 최근 미국 FDA의 긴급 사용 승인(EUA)을 받았다. RNA 또는 DNA로 면역화한다는 개념은 1993년 마우스에서 인플루엔자에 대한 보호 면역을 나타내는 유망한 결과로 시작되었지만, 수십 년 동안 이러한 발견은 인간에서 유사한 발견으로 번역되지 않았다. 더욱이, 이러한 RNA 및 DNA 발현 벡터 백신 중 다수는 복제가 불가능하지만 의도된 면역 반응이 유도된 후에도 표적 바이러스 Ag를 내인성으로 계속 생산하고, 이는 궁극적으로 바이러스에 대한 면역 내성을 생성할 수 있는 측면이며 이는 점점 더 우려되고 있고 이러한 현행 COVID-19 mRNA 백신의 경우 실제적인 위험이 될 수 있다. 이러한 핵산 백신의 다른 도전 과제는 너무 빈번한 투여가 요구될 수 있는 반응의 낮은 지속성, 및 화학적 합성을 통한 번거로운 제조역량으로 인한 불리한 COG이다. 더욱 또한, RNA의 고유한 불안정성으로 인해 제품을 냉동 상태에서 보관 및 운송해야 하므로 전 세계 대부분에서 접근하기가 매우 어렵다.
추가적인 대안으로, 재조합 서브유닛 백신은 SP에 대한 면역 반응을 유도하여 숙주 표적 단백질인 ACE2와의 도킹을 방지하는 데 의존한다. 이러한 백신은 단백질을 암호화하는 DNA 또는 RNA보다는 SP의 전체 또는 일부를 포함하며, 이어서 상기는 면역 반응을 향상시키기 위해 항원보강제와 혼합된다. RNA 및 DNA에 비해 단백질의 고유한 안정성으로 인해, 서브유닛 백신에 대한 보관 및 운송 요건은 덜 엄격하다. 재조합 서브유닛 백신을 개발하고 있는 회사로는, SP의 재조합 발현에 기반한 면역원성 바이러스-유사 나노입자, 사포닌 기반의 항원보강제 시스템인 Matrix-M™으로 제형화되는 NVX-Cov2373을 개발 생산한 Novavax, 및 특허받은 Trimer-Tag® 기술을 사용하여 삼량체화된 SARS-CoV-2 SP로 이루어지는 서브유닛 백신의 개발 중에 있는 Clover Biopharmaceuticals 등이 있다. 그러나 완전길이 SP 표적 Ag는 세포 발현 시스템에서 낮은 발현 수율을 갖는 것으로 공지되어 있으며 SARS 백신에 사용되는 경우 SP의 비-중화 에피토프에 대해 항-SP IgG 역가를 유도하여 증가된 바이러스 감염성(즉 ADE) 및 폐 호산구 증가증(eosinophilia)에 의해 유발된 염증(즉, Th2 매개 면역 강화, 하기에서 논의됨)을 다시 매개할 수 있는 것으로 공지되어 있다. SARS SP의 수용체 결합 도메인(RBD)만으로 구성된 서브유닛 백신은 이러한 안전성 문제를 완화할 가능성이 있다.
베일러(Baylor) 의과 대학의 텍사스 아동 병원 백신 개발 센터가 이끄는 컨소시엄은 SARS SP의 수용체 결합 도메인(RBD)만으로 구성된 서브유닛 백신을 개발 및 시험하였으며, 알룸과 함께 제형화될 때 상기 RBD-기반 백신은 ADE 및 면역 강화를 피하는 것 외에도 상동성 바이러스 공격 시 높은 수준의 보호 면역을 이끌어낼 수 있다. SARS 및 SARS-CoV-2 RBD가 80% 이상의 아미노산 유사성을 나타내고 동일한 ACE2 표적에 결합한다는 초기 발견은 Ag 단백질 중 하나를 서브유닛 백신으로 개발할 기회를 제공한다. 실제로, 그러한 서브유닛 백신 개념 증명은 MERS 및 SARS 감염의 코로나바이러스 SP/RBD Ag에 의해 성공적으로 입증되었다.
이러한 기능 중 일부(전부는 아님)는 현재 개발 중인 170개 이상의 SARS-CoV-2 백신 후보에서 구현되고 있다. 여기에는 생 바이러스, 핵산 및 궁극적으로 COVID-19에 대한 예방 백신으로서 가능성을 제공할 수 있는 재조합 단백질 서브유닛이 포함된다. 그러나 각 백신 전략은 최적의 방식으로 동시에 관리되어야 하는 제조, 안전성 및 효능과 관련하여 특유의 장점과 도전 과제를 가지고 있다.
본 개시내용은 온화한 온도에서 수송 및 보관될 수 있는 SARS-CoV-2 바이러스에 대한 재조합 서브유닛 백신의 비용 효과적인 생산을 가능하게 하는 신규의 융합 단백질의 제조 및 사용 방법에 관한 것이다. 본 개시내용은 구체적으로 환자가 SARS-CoV-2 바이러스에 대한 항바이러스 항체를 생성하도록 하는 데 효과적인 예방, 치료 또는 추가 백신에 사용하기 위한 융합 단백질의 제조 및 사용 방법에 관한 것이다. SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질을 사용하여 환자가 SARS-CoV-2 바이러스의 수용체 결합 도메인(RBD) 부분을 표적으로 하는 내인성 항체를 생성하게 하는 것은, 나중에 환자에게 주입되는 항-SARS-CoV-2 치료 항체를 재조합적으로 생성하는 것보다 훨씬 더 비용 효과적일 것으로 예상된다.
예에서, SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질을 포함하는 추가접종 백신은, 회복기 혈청 치료로 사용하기 위해 공여된 혈청이 더 많은 사람들을 치료하는 데 사용될 수 있도록 항-SARS-CoV-2 항체 역가를 증가시키기 위해서 항체 증폭 치료(AAT)로서 COVID-19에서 회복된 환자에게 투여될 수 있다. 회복된 환자는 모든 새로운 혈청 공여 몇 주 전에 이 AAT를 투여받을 수 있으며, 이는 추출된 혈청의 항-SARS-CoV-2 항체 역가를 상당히 증가시키고 결과적으로 각각의 공여로 치료될 수 있는 바이러스 환자의 수를 상당히 증가시킨다.
예에서, SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질은 개인으로부터 추출되는 혈청에서 항-SARS-CoV-2 항체를 검출하기 위해 사용될 수 있다. 혈청 내 항-SARS-CoV-2 항체의 존재 및 농도를 안정적으로 결정하기 위한 핵심 시약으로서 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질을 사용하여 시험 키트를 만드는 능력은, 임상의로 하여금 어느 개인이 상기 바이러스를 가졌고 이로부터 회복되었는 지를 결정할 수 있게 하며, 이는 증상이 거의 또는 전혀 없을 수도 있는 환자의 경우에 특히 중요하다. 예에서, 이러한 시험 키트는 백신접종-후 추출한 혈청에서 숙주-생산된 항-SARS-CoV-2의 존재와 농도를 신속하고 비용 효율적으로 측정할 수 있게 함으로써 SARS-CoV-2에 대한 새로운 백신 후보의 수행성능을 평가하는 데 사용될 수 있었다. 이러한 시험 키트의 광범위한 배포는 회복기 혈청의 잠재적 공여자의 수를 대단히 증가시킬 것으로 예상된다.
일례에서, SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질의 약학 조성물은, SARS-CoV-2 바이러스에 감염되어 COVID-19에 걸린 환자에게 투여되고 감염 범위를 제한하고 상기 질병을 개선시킨다. 예에서, SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질은 ACE2 수용체에 결합하여 SARS-CoV-2 바이러스의 수용체 결합 도메인(RBD)의 추가 흡수를 차단하는 동시에, SARS-CoV-2 바이러스를 중화하는 항체를 생성하여 숙주 세포에 노출되는 RBD를 줄인다.
일례에서, SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질의 약학 조성물은 SARS-CoV-2 바이러스에 감염되지 않은 개인을 위한 예방적 COVID-19 백신으로 투여되어, 상기 개인이 항-SARS-CoV-2 항체 및 면역성의 자체 풀을 생산하게 된다.
균등물 및 정의
본원에 사용된 바와 같이, 관사 "하나" 및 "한"은 관사의 문법적 대상 중 하나 이상, 예를 들어 적어도 하나를 지칭한다. 본원에서 "포함하는"이라는 용어와 함께 사용될 때 "하나" 또는 "한"이라는 단어의 사용은 "하나"를 의미할 수 있지만, 또한 "하나 이상", "적어도 하나" 및 "하나 또는 하나 초과"의 의미와 일치한다. 본원에 사용된 바와 같이, "및/또는"이라는 문구는 2개 이상의 항목의 목록에서 사용될 때 나열된 항목 중 임의의 하나가 단독으로 사용될 수 있거나 나열된 항목 중 2개 이상의 임의의 조합이 사용될 수 있음을 의미한다. 예를 들어, 조성물이 성분 A, B 및/또는 C를 함유하거나 배제하는 것으로 기재되는 경우, 조성물은 A 단독; B 단독; C 단독; A와 B의 조합; A와 C의 조합; B와 C의 조합; 또는 A, B 및 C의 조합을 함유하거나 배제할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "약" 및 "대략"은 일반적으로 측정의 성질 또는 정밀도가 주어지면 측정된 양에 대해 허용 가능한 오차 정도를 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, 장애(예를 들어, 본원에 기재된 장애)를 치료하는데 효과적인 분자, 화합물, 접합체 또는 물질의 양, "치료 유효량" 또는 "유효량"은 대상체에게 단일 또는 수회 용량 투여시, 대상체를 치료하거나, 또는 장애(예를 들어, 본원에 기재된 장애)가 있는 피험자를 이와 같은 치료의 부재하에서 예상되는 것 이상으로 치유, 완화, 경감 또는 개선시키는 데 유효한 분자, 화합물, 접합체, 또는 물질의 양을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "유사체"는 다른 화합물 또는 접합체와 유사하지만 적어도 하나의 측면에서 상이한 화학 구조를 갖는 화합물 또는 접합체(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 화합물 또는 접합체, 예를 들어, RBD)를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "항원"은 환자의 면역계가 이에 대한 항체를 생산하게 하는 임의의 물질을 지칭한다. 항원은 화학 물질, 세균, 바이러스 또는 꽃가루와 같은 환경의 물질이거나 체내에서 형성될 수도 있다. 항원의 예는 SARS-CoV-2 바이러스이다.
본원에 사용된 용어 "항체" 또는 "항체 분자"는 면역글로불린 분자(Ig), 또는 면역글로불린(Ig) 분자의 면역학적 활성 부분, 즉, 예를 들어 항원과 특이적으로 결합하는, 예를 들어 면역반응하는 항원 결합 부위를 함유하는 분자를 지칭한다. 본원에 사용된 용어 "항체 도메인"은 면역글로불린의 가변 또는 불변 영역을 지칭한다. 인간 항체가 여러 부류, 예를 들어 포유동물(예를 들어, 인간 및 개)의 경우 IgA, IgM 또는 IgG를 포함함이 당업계에 문서화되어 있다. 포유동물 IgG 면역글로불린의 부류는 개의 경우 IgGA, IgGB, IgGC 및 IgGD, 및 인간의 경우 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4와 같이, 상이한 아이소타입으로 추가로 분류될 수 있다. 당업자는 주어진 면역글로불린 부류의 면역글로불린 아이소타입이 서로 다른 아미노산 서열, 구조 및 기능적 특성(예를 들어, Fc(감마) 수용체 또는 ACE2 수용체에 대한 상이한 결합 친화도)을 포함할 것임을 인식할 것이다. "특이적으로 결합한다" 또는 "~와 면역반응한다"는 항체가 목적하는 항원의 하나 이상의 항원 결정기와 반응하고 다른 폴리펩티드에 대해 더 낮은 친화도를 가짐, 예를 들어 다른 폴리펩티드와 반응하지 않음을 의미한다.
본원에 사용된 용어 "이량체"는 공유적으로 연결된 2개의 폴리펩티드를 포함하는 단백질 또는 융합 단백질을 지칭한다. 구현예에서, 2개의 동일한 폴리펩티드가 공유적으로(예를 들어, 디설파이드 결합을 통해) 연결되어 "동종이량체"(참조를 위한 인슐린-Fc 융합 단백질의 예시인 도 1, 및 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질의 예시인 도 2에 도식적으로 표현됨)를 형성한다. 도 1을 보다 상세하게 설명하면, 인슐린 폴리펩티드(C-쇄 펩티드를 통해 인슐린 A-쇄 유사체에 연결된 인슐린 B-쇄 유사체 포함)는 천연 인슐린으로부터 하나 이상의 아미노산 돌연변이를 가질 수 있다. 인슐린 펩티드는 링커를 통해 Fc 단편에 연결된다. 디설파이드 결합(실제로 디설파이드 결합의 총 수는 도 1에 나타난 수보다 크거나 작을 수 있음)은 2개의 동일한 Fc 융합 단백질로부터 동종이량체를 생성한다. 도 2를 보다 상세하게 설명하면, SARS-CoV-2 RBD 단편은 전체 SARS-CoV-2 표면 당단백질의 일부를 포함할 수 있다. RBD 단편은 천연 SARS-CoV-2 표면 당단백질로부터 하나 이상의 아미노산 돌연변이를 가질 수 있다. RBD 단편은 선택적 링커를 사용하여 Fc 단편에 연결된다(일부 예에서, RBD 단편은 링커 없이 직접 Fc 단편에 공유적으로 연결된다됨). 디설파이드 결합은 2개의 동일한 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질로부터 동종이량체를 생성한다(실제로 디설파이드 결합의 총 수는 도 2에 도시된 수보다 많거나 적을 수 있다). Fc 융합 단백질 동종이량체는 단일 핵산 분자에 의해 암호화될 수 있으며, 여기서 동종이량체는 먼저 Fc 융합 단백질 단량체를 형성한 다음 세포 내부에서 추가로 처리시 2개의 동일한 Fc 융합 단백질 단량체를 동종이량체로 조립함으로써 세포 내부에서 재조합적으로 만들어진다.
본원에 사용된 용어 "다량체", "다량체성" 또는 "다량체 상태"는 Fc 융합 단백질 이량체와 평형을 이룰 수 있거나 또는 Fc 융합 단백질 이량체(예를 들어, Fc 융합 단백질 동종이량체의 이량체, Fc 융합 단백질 동종이량체의 삼량체, Fc 융합 단백질 동종이량체의 사량체, 또는 5개 이상의 Fc 융합 단백질 동종이량체를 함유하는 고차 응집체)의 영구적으로 응집된 버전으로서 작용할 수 있다. Fc 융합 단백질의 다량체 형태는 융합 단백질 동종이량체의 형태와 상이한 물리적, 안정성 또는 약리학적 활성을 가질 수 있음을 예상할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, RBD-Fc 융합 단백질 및 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질(이들 용어는 호환가능하게 사용될 수 있음)은 SARS-CoV-2 스파이크 단백질(SP) 수용체 결합 도메인(SP/RBD 또는 RBD) 또는 이의 유사체에 연결되는 인간 면역글로빈 Fc 도메인을 지칭하며, 이는 SARS-CoV-2 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 생성하는 데 유용하다. 참조의 편의를 위해, 용어 "RBD" 및/또는 "SP/RBD"는 본원에서 호환가능하게 사용될 수 있으며, 문맥상 달리 지시되지 않는 한, 수용체 결합 도메인 자체, 수용체 결합의 더 작은 단편, 또는 수용체 결합 도메인 및 스파이크 단백질 분절로부터의 인접 잔기를 포함하는 더 큰 변이체로 이루어지는 단백질 잔기를 포함하나, 단, 단편 및/또는 더 큰 변이체는 RBD의 활성을 유지해야 한다(예를 들어, 스파이크 단백질 수용체에 결합하는 능력을 유지해야 한다). 본원에 사용된 바와 같이, 일반적인 용어 "융합 단백질" 및 "Fc 융합 단백질"은 펩티드 결합을 통해 공유적으로 연결되는, 예를 들어 상이한 공급원(예를 들어, 상이한 단백질, 폴리펩티드, 세포 등)으로부터의 하나 초과의 부분을 포함하는 단백질을 지칭한다. Fc 융합 단백질은 (i) 각 부분을 암호화하는 유전자를 단일 핵산 분자에 연결하고 (ii) 숙주 세포(예를 들어, HEK 세포 또는 CHO 세포)에서 핵산 분자가 암호화하는 단백질을 발현함으로써 공유 연결된다. 완전 재조합 합성 접근법은, 치료 단백질과 Fc 단편을 별도로 합성한 다음 화학적으로 접합하는 방법보다 선호된다. 화학적 접합 단계 및 후속 정제 공정은 제조 복잡성을 증가시키고 제품 수율을 감소시키며 비용을 증가시킨다.
본원에 사용된 용어 "생물활성", "활성", "생물학적 활성", "효능", "생물활성 효능" 또는 "생물학적 효능"은 Fc 융합 단백질이 세포 수용체에 결합하거나 세포 수용체를 활성화시키고/시키거나 천연 또는 외래 물질의 생산 또는 감소를 발휘하는 정도를 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같이, "시험관내 활성" 또는 "수용체 활성"은 Fc 융합 단백질이 세포 수용체에 결합하는 친화도를 지칭하며, 전형적으로 Fc 융합 단백질이 이의 최대 결합의 절반(즉, EC50 값)에 도달하게 하는 Fc 융합 단백질의 농도에 의해 측정된다. 예를 들어, SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질의 "생물활성"은 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질이 세포 분석 또는 표적 대상체에서 항-SARS-CoV-2 항체의 생산을 유도하는 정도를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "생합성", "재조합 합성" 또는 "재조합적으로 만들어진"은 숙주 세포를 Fc 융합 단백질을 암호화하는 핵산 분자(예를 들어, 벡터)로 형질감염시킴으로써(예를 들어, 전체 Fc 융합 단백질이 단일 핵산 분자에 의해 암호화되는 경우) Fc 융합 단백질을 상기 세포 내에서 발현시키는 과정을 지칭한다. 예시적인 숙주 세포는 포유동물 세포, 예를 들어 HEK293 세포 또는 CHO 세포를 포함한다. 세포를 당해 분야의 표준 방법을 사용하여 배양할 수 있으며, 발현된 Fc 융합 단백질을 당해 분야의 표준 방법을 사용하여 세포 배양물로부터 수확하고 정제할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "세포 표면 수용체"는 일반적으로 세포 막의 외부 표면에서 발견되고 용해성 분자, 예를 들어 혈액 공급에서 순환하는 분자와 상호작용하는, 단백질과 같은 분자를 지칭한다. 일부 구현예에서, 세포 표면 수용체는 숙주 세포 수용체(예를 들어, ACE2 수용체) 또는 항체의 Fc 단편 또는 Fc 영역에 결합하는 Fc 수용체(예를 들어, Fc(감마) 수용체, 예를 들어 Fc(감마) 수용체 I, 또는 Fc 신생아 수용체, 예를 들어 FcRn)를 포함할 수 있다. 본원에 사용된 "시험관내 활성" 또는 "Fc(감마) 수용체 활성" 또는 "Fc(감마) 수용체 결합" 또는 "FcRn 수용체 활성" 또는 "FcRn 결합"은 Fc 융합 단백질이 Fc 수용체(예를 들어, Fc(감마) 수용체 또는 FcRn 수용체)이고, 전형적으로는 마이크로플레이트 판독기상에서 측정되는 바와 같이 OD 450 ㎚ 값을 사용하여 분석(예를 들어, 효소 결합 면역흡착 분석(ELISA) 분석)에서 측정시 Fc 융합 단백질이 최대 결합(즉, EC50 값)의 절반에 도달하도록 하는 Fc 융합 단백질의 농도에 의해 측정된다.
본원에 사용된 용어 "면역원성의" 또는 "면역원성"은 주어진 분자(예를 들어, 본 발명의 Fc 융합 단백질)가 표적 대상체의 면역계를 자극하여, 분자 투여 후 대상체가 분자의 전부 또는 특정 부분에 결합할 수 있는 항체(즉, 항-약물 항체 또는 ADA)를 발달시키는 능력을 지칭한다. 본원에 사용된 용어 "중화", "중화 항체", 또는 "중화 항-약물 항체"는 항체가 표적 대상체에서 Fc 융합 단백질의 생물학적 활성의 전부 또는 일부를 간섭하는 능력을 지칭한다. 예를 들어, SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 분자가 인간에게 투여된 경우, 면역원성은 분자의 hIgG-Fc 부분이 인간에 내인성이고 따라서 항-hIgG-Fc 항체를 유도할 것 같지 않으므로 분자의 SARS-CoV-2 RBD 부분에 결합하는 항체를 지칭한다. 마찬가지로, SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 분자의 투여에 의해 생성된 항체는 항-SARS-CoV-2 RBD 항체가 SARS-CoV-2 RBD와 ACE2 수용체 사이의 결합을 억제할 때 중화되고, 이는 대상체에서 SARS-CoV-2 RBD의 생물학적 활성과 직접적인 관련이 있다.
본원에 사용된 용어 "단량체"는 단일 폴리펩티드를 포함하는 단백질 또는 융합 단백질을 지칭한다. 구현예에서, "단량체"는 RBD 폴리펩티드 및 Fc 단편 폴리펩티드를 포함하는 단백질 또는 융합 단백질, 예를 들어 단일 폴리펩티드이고, 여기서 RBD 및 Fc 단편 폴리펩티드는 펩티드 결합에 의해 연결되어 단일 폴리펩티드를 형성한다. 구현예에서, 단량체는 단일 핵산 분자에 의해 암호화된다.
본원에 사용되고 도 1 및 도 2에 예시된 바와 같이, "N-말단"은 아미노산의 알파-아미노 기(예를 들어, 두 번째 탄소 원자에 인접하여 위치하는 하나의 탄소 원자에 공유적으로 연결되는 유리 아미노, 여기서 두 번째 탄소 원자는 아미노산의 카보닐 기의 일부이다)인 유리 아민 기를 함유하는 아미노산에 의해 개시되는 단백질 또는 폴리펩티드의 시작을 지칭한다. 본원에 사용되고 도 1 및 도 2에 예시된 바와 같이, "C-말단"은 카복실산 기를 함유하는 아미노산에 의해 종결되는 단백질 또는 폴리펩티드의 단부를 지칭하며, 여기서 카복실산 기의 탄소 원자는 아미노산의 알파-아미노 기에 인접하여 위치한다.
본원에서 사용된 용어 "담체"는 희석제, 부형제, 비히클 등을 지칭하는 것으로 본원에서 사용되며, 여기서 Fc 융합 단백질(들)은 투여를 위해 분산, 유화 또는 캡슐화될 수 있다. 적합한 담체는 약제학적으로 허용될 것이다. 본원에 사용된 용어 "약제학적으로 허용되는"은 과도한 독성, 자극 또는 알레르기 반응 없이 대상체에 투여될 수 있고, 함유된 조성물의 다른 성분 중 임의의 성분과 허용할 수 없는 생물학적 효과를 일으키지 않거나 유해한 방식으로 상호작용하지 않는다는 점에서 생물학적으로 또는 달리 바람직하지 않지 않은 것을 의미한다. 약제학적으로 허용되는 담체는 당업자에게 잘 알려진 바와 같이, 당연히 화합물 또는 다른 작용제의 임의의 분해를 최소화하고 대상체에서 임의의 유해한 부작용을 최소화하도록 선택될 것이다. 약제학적으로 허용되는 성분은 수의학적 용도 및 인간 약제학적 용도에 허용되는 것을 포함하며 투여 경로에 따라 달라질 것이다. 부형제(들) 및 Fc 융합 단백질(들)과 양립가능한 임의의 담체가 사용될 수 있다.
본원에 사용된 "약력학" 또는 "PD"는 일반적으로 대상체에서 Fc 융합 단백질의 생물학적 효과를 지칭한다. 예를 들어, 본원에서 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질의 PD는 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질 투여 후 대상체에서 시간 경과에 따른 항-SARS-CoV-2 항체 역가의 정도를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, "약동학" 또는 "PK"는 일반적으로 흡수, 분포, 대사 및 배출의 관점에서 Fc 융합 단백질과 대상체의 신체의 특징적인 상호작용을 지칭한다. 일례로서, 본원에서 PK는 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질 투여 후 주어진 시간에 피험자의 혈액 또는 혈청 내 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질의 농도를 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같이, "반감기"는 약물 제거를 위한 1차 지수 붕괴 모델로부터 계산된 바와 같이 대상체의 혈액 또는 혈청에서 Fc 융합 단백질의 농도가 원래 값의 절반에 도달하는 데 걸리는 시간을 의미한다. 더 큰 "반감기" 값을 갖는 Fc 융합 단백질은 표적 대상체에서 더 긴 작용 지속시간을 나타낸다.
본원에 사용된 바와 같이, 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열에서 "서열 일치성", "서열 상동성", "상동성" 또는 "일치하는"이라는 용어는, 변이체의 뉴클레오티드 서열 또는 아미노산 서열의 명시된, 연속적인 분절이 정렬되고 참조 서열의 뉴클레오티드 서열 또는 아미노산 서열과 비교될 때, 동일한 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기가 변이체 및 참조 서열 내에서 발견됨을 기재한다. 서열 정렬 및 서열 간의 일치성을 측정하는 방법은 유사성에 대해서 서열을 조직화, 정렬 및 비교하는 Clustal Omega의 사용을 포함하여, 당업계에 공지되어 있으며, 여기서 소프트웨어는 각 서열 위치를 강조 표시하고 해당 위치의 모든 서열을 비교하고 하기의 점수 중 하나를 할당한다: 단일의 완전히 보존된 잔기가 있는 서열 위치의 경우 "*"(별표), ":"(콜론)은 Gonnet PAM 250 매트릭스에서 0.5를 초과하는 점수로 매우 유사한 특성의 그룹 간의 보존을 가리키고, "." (마침표)는 Gonnet PAM 250 매트릭스에서 0.5 이하의 점수를 가진 약하게 유사한 특성의 그룹 간의 보존을 가리키며, "-"(대시)는 특정한 서열 범위내의 특정한 비교 세트내에 국소적인 상동성이 존재하지 않음을 의미하는 서열 끊김을 가리키고; 빈 공간 " "은 비교된 서열에 걸쳐 특정 위치에 대한 서열 상동성이 거의 또는 전혀 없음을 가리킨다.
2개의 뉴클레오티드 서열의 최적 정렬과 관련하여, 변이 뉴클레오티드 서열의 인접 분절은 참조 뉴클레오티드 서열에 대해 추가 뉴클레오티드 또는 결실된 뉴클레오티드를 가질 수 있다. 유사하게, 2개의 아미노산 서열의 최적 정렬의 목적을 위해, 변이 아미노산 서열의 인접 분절은 참조 아미노산 서열에 대해 추가의 아미노산 잔기 또는 결실된 아미노산 잔기를 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 참조 뉴클레오티드 서열 또는 참조 아미노산 서열과의 비교에 사용되는 인접 분절은 적어도 6, 10, 15 또는 20개의 인접 뉴클레오티드, 또는 아미노산 잔기를 포함할 것이고, 30, 40, 50, 100개 또는 그 이상의 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기가 있을 수 있다. 변이체의 뉴클레오티드 서열 또는 아미노산 서열에 끊김을 포함하는 것과 관련된 증가된 서열 일치성에 대한 수정은 끊김 벌점을 할당함으로써 이루어질 수 있다. 서열 정렬 방법은 당업계에 공지되어 있다.
구현예에서, 두 서열 사이의 일치성 퍼센트 또는 "상동성"의 측정은 수학적 알고리즘을 사용하여 달성된다. 예를 들어, 아미노산 서열의 일치성 퍼센트는 12의 끊김 벌점 및 2의 끊김 확장 벌점을 갖는 아핀 6 끊김 검색을 사용하는 스미스-워터만 상동성 탐색 알고리즘, BLOSUM 매트릭스 62를 사용하여 측정된다. 뉴클레오티드 서열의 일치성 퍼센트는 25의 끊김 벌점 및 5의 끊김 확장 벌점을 사용하는 스미스-워터만 상동성 검색 알고리즘을 사용하여 측정된다. 이와 같은 서열 일치성의 측정은, 예를 들어 TimeLogic의 DeCypher Hardware Accelerator를 사용하여 수행될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "상동성"은 예를 들어 베타 가닥, 나선 및 접힘의 공통적인 구조적 특성 및 공통적인 공간 분포를 찾아 2개 이상의 단백질을 비교하는 데 사용된다. 따라서 상동성 단백질 구조는 공간 분석에 의해 정의된다. 구조적 상동성을 측정하는 것은 공간의 기하학적 위상적 특징을 계산하는 것을 포함한다. 3차원(3D) 단백질 구조를 생성하고 분석하는 데 사용되는 한 가지 접근 방식은, 3D 유사성이 2D 유사성을 반영한다는 사실에 기초하여 유사한 서열을 찾는 방식으로 작동하는 상동성 모델링(비교 모델링 또는 지식 기반 모델링이라고도 함)이다. 상동성 구조는 서열 유사성을 필요 조건으로 의미하지 않는다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "대상체" 및 "환자"는 마우스, 비-인간 영장류(NHP), 토끼, 개 및 인간을 포함하는 것으로 의도된다. 예시적인 개 대상체는 질병 또는 장애, 예를 들어 당뇨병 또는 본원에 기재된 다른 질병 또는 장애를 갖는 개, 또는 정상 대상체를 포함한다. 예시적인 인간 대상체는 질병을 갖는 개인을 포함한다, 예를 들어, COVID-19 또는 SARS-Co-V-2 감염의 변종, 또는 다른 바이러스를 포함하는 COVID-19가 있는 개인, 또는 이전에 본원에 기재된 질병 또는 장애를 앓은 적이 있는 개인, 또는 정상 대상체를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "역가" 또는 "수율"은 세포 배양물 부피당 생합성으로부터 생성된(예를 들어, 포유동물 세포에서, 예를 들어 HEK293 세포 또는 CHO 세포에서) 융합 단백질 생성물(예를 들어 본원에 기재된 Fc 융합 단백질)의 양을 지칭한다. 생성물의 양을 생산 공정의 모든 단계(예를 들어, 정제 전 또는 후)에서 측정할 수 있지만, 수율 또는 역가는 항상 최초 세포 배양물의 부피당 서술된다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "생성물 수율" 또는 "총 단백질 수율"은 세포에 의해 발현되고 하나 이상의 친화성 크로마토그래피 단계(예를 들어, 단백질 A 또는 단백질 G)를 통해 정제된 Fc 융합 단백질의 총량을 지칭하며, Fc 융합 단백질의 단량체, Fc 융합 단백질의 동종이량체, 및 Fc 융합 단백질의 동종이량체의 고차 분자 응집체를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "동종이량체 퍼센트" 또는 "동종이량체%"는 목적하는 동종이량체인 융합 단백질 생성물(예를 들어, 본원에 기재된 Fc 융합 단백질)의 비율을 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "동종이량체 역가"는 세포 배양물 부피당 보고된 단백질 A 정제 단계 후 동종이량체% 및 총 단백질 수율의 산물을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "치료하다", "치료하는" 또는 "치료"는 질병 또는 장애가 있는 대상체의 발병을 예방하거나 감염 병리를 변경시킬 의도로 수행되는 개입을 지칭한다. 따라서 "치료"는 치료학적 치료 및 예방학적 또는 예방적 조치를 모두 의미한다. 치료제는 감염의 병리를 직접적으로 감소시키거나 감염을 다른 치료제 또는 예를 들어 숙주의 면역계에 의한 치료에 더 민감하게 만들 수 있다. 치료 후 개선은 이러한 증상의 감소 또는 제거로 나타날 수 있다. 따라서, 조성물은 감염으로부터 관찰 가능한 임상 증상의 발병을 예방하고/하거나 감염의 임상 증상 및/또는 영향의 발병률 또는 중증도를 감소시키고/시키거나 감염/증상/효과의 지속기간을 감소시킴으로써 감염을 치료하는 데 유용하다. 질병 또는 장애를 갖는 대상체를 치료하는 것은 질병 또는 장애를 갖는 대상체에게 섭생, 예를 들어 본원에 기재된 Fc 융합 단백질과 같은 융합 단백질, 또는 질병 또는 장애의 적어도 하나의 증상이 치유, 힐링, 경감, 완화, 변경, 치유, 개선 또는 개선되도록 본원에 기재된 Fc 융합 단백질과 같은 융합 단백질의 약학 조성물을 가함을 지칭할 수 있다. 치료는 질병 또는 장애, 또는 질병 또는 장애의 증상을 경감, 완화, 변경, 치료, 개선, 개선시키거나, 또는 이에 영향을 미치는 데 유효한 양을 투여하는 것을 포함한다. 치료는 정상 대상체 또는 이전에 질병 또는 장애를 앓았던 대상체에서 질병 또는 장애에 대한 항체를 생성하기에 유효한 양을 투여하는 것을 포함한다. 치료는 질병 또는 장애 증상의 열화 또는 악화를 억제할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "예방 백신"은 환자의 면역계가 항원에 대한 항체를 생성하고 관련 질병 또는 바이러스에 대한 대상체의 면역 반응을 증가 또는 개선시키는 것을 목표로 환자에게 항원을 도입하는 치료를 지칭한다. 다시 말해, 백신 접종된 대상체는 백신 접종되지 않은 대상체와 비교하여 관련 바이러스로부터의 병 또는 질병에 대해 더 높은 정도의 내성을 가질 것이다. 이러한 내성은 질병 증상의 심각성 또는 지속 기간의 감소, 바이러스 배출의 감소 또는 제거, 경우에 따라 백신 접종된 대상체에서 관찰 가능한 감염 증상의 예방에 의해 명백할 수 있다. 구현예에서, 예방 백신으로 치료된 환자는 예방 백신으로 치료하기 전에 항원에 대한 항체를 가지고 있지 않다(달리 서술하자면, 환자는 "항체 나이브"이다).
본원에 사용된 바와 같이, "치료 백신"은 환자의 면역계가 항원에 대한 항체를 생성하여 환자의 신체가 이미 가지고 있는 질병이나 바이러스에 대해 더 강하게 싸울 수 있도록 하는 것을 목표로, 이미 연관된 질병 또는 바이러스가 있는 환자에게 항원을 도입하는 치료법을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, "추가접종 백신"은 환자가 이전에 백신의 초기 투여를 받은 후 또는 환자가 관련 질병 또는 바이러스에 감염되고 회복되어 항체를 획득한 후 백신의 추가 투여를 지칭한다. 일부 예에서, 환자의 항원 항체 역가를 증가시켜 질병 또는 바이러스 유발 항원에 대한 환자의 면역성을 "증진"하기 위해 주기적으로 추가 용량의 백신이 필요하다.
본원에 사용된 바와 같이, SARS-CoV-2 표면 당단백질의 수용체 결합 도메인(RBD)을 포함하여, SARS-CoV-2 표면 당단백질의 일부에 있는 아미노산을 언급할 때, 인용된 아미노산 위치는 서열번호 1의 SARS-CoV-2 표면 당단백질 중의 아미노산의 위치로서 언급된다. 일례로서, SARS-CoV-2 RBD의 331번 위치의 아미노산의 돌연변이에 대한 언급은, SARS-CoV-2 RBD가 서열번호 1의 단지 일부만을 포함하는 경우에조차, 서열번호 1의 331번째 위치의 아미노산을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, "RBD 단편"은 서열번호 1의 SARS-CoV-2 표면 당단백질의 수용체 결합 도메인(RBD)의 일부를 포함하고, 또한 문맥상 달리 나타내지 않는 한 스파이크 단백질(SP)의 인접 잔기를 또한 포함할 수 있는 SARS-CoV-2-hIgG-Fc 융합 단백질의 일부를 지칭한다. 예에서, SARS-CoV-2 표면 당단백질의 RBD 단편 부분은 도 2에 예시된 바와 같이 Fc 단편에 연결된다.
Fc 융합 단백질 백신의 근거
상기에서 논의한 바와 같이, 재조합 단백질 기반 서브유닛 백신 접근법은 효능있는 중화 Ab 역가를 생성하는 대부분의 우성 에피토프의 선택적 용도를 허용하는 것 외에, 불활성화 또는 약독화 생 바이러스 및 핵산 벡터 기반 백신 포맷에 비해 안전성 및 다중 추가접종 용량의 이점을 갖는다. 또한, 이러한 단백질 기반 백신은 보다 비용 효율적으로 대량으로 제조될 수 있고 온화한 온도에서 안정하여 운송 및 보관이 용이하다. 그러나 면역학적으로 나이브인 인간 집단에서 강력한 보호 면역 반응을 유도하기 위한 재조합 SARS-CoV-2 SP 서브유닛 백신의 도전을 고려할 때, SP 항원을 나이브 T 및 B 세포의 활성화 한계를 극복하기 위해 추가적인 면역-강화 특징으로 변형 및/또는 제형화해야 한다.
개에서 인슐린-Fc 융합 단백질에 대한 실험 경험
치료 단백질을 면역글로빈 Fc 도메인에 연결함으로써 형성된 융합 단백질의 일례는 인슐린-Fc 융합 단백질이다. 이 구성물은 당뇨병 환자를 위한 초-장기 작용 기본 인슐린 요법을 제공하는 데 사용되었다. 펩티드 링커를 통한 Fc 도메인과 치료 단백질로서의 인슐린 유사체의 조합은 생체내에서 수일 단위로 상당히 더 긴 활성을 달성하는 것으로 나타났다. 고양이 및 개에서 당뇨병을 치료하는데 사용하기 위한 초-장기 작용 인슐린-Fc 융합 단백질의 예는 WO2020006529A1에 기재되어 있다. WO2020006529A1의 예에서, 예시적인 인슐린 유사체는 하기와 같고:
FVNQHLCGSHLVEALELVCGERGFHYGGGGGGSGGGGGIVEQCCTSTCSLDQLENYC(서열번호 28)
치료 단백질(즉, 인슐린 유사체)을 Fc 도메인에 연결하는 데 사용되는 예시적인 링커는 하기와 같다: GGGGGQGGGGQGGGGQGGGGG(서열번호 27).
당뇨병에 대한 초-장기 작용 치료에 적합한 주어진 종(예를 들어, 개, 고양이 또는 인간)에 대한 인슐린-Fc 융합 단백질 분자는 포유동물 세포, 예를 들어 인간 배아 신장(예를 들어, HEK, HEK293) 세포에서, 목적하는 동종이량체 생성물의 허용 가능한 역가(예를 들어, 일시적으로 형질감염된 HEK 세포에서 50 ㎎/L 초과 동종이량체 역가, 일시적으로 형질감염된 HEK 세포에서 75 ㎎/L 초과, 일시적으로 형질감염된 HEK 세포에서 100 ㎎/L 초과 등)와 함께 제조가능해야 한다. 경험에 따르면, 50 ㎎/L 미만의 동종이량체 역가는 동물용 제품에 대한 엄격하게 낮은 제조 비용 요구 사항을 충족하는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포에서 상업적 생산 동종이량체 역가를 초래하지 않을 것이다.
WO2020006529A1(본원에 참고로 포함됨) 및 본원에 기재된 개용 인슐린-Fc 융합 단백질을 실시예 45에 따른 HEK 세포 또는 실시예 46에 따른 CHO 세포에서 제조하였다. 인슐린-Fc 융합 단백질을 실시예 47에 따라 정제하였다. 통상적인 정제 방법을 사용하여, 개 IgGA 및 개 IgGB 면역글로빈 Fc 단편을 포함하는 화합물만이 임의의 인지할만한 단백질 수율을 나타내었다. 인슐린-Fc 융합 단백질의 구조는 실시 예 48에 따른 비-환원 및 환원 CE-SDS에 의해 확인되었고 서열은 실시예 49에 따라 글리칸 제거와 함께 LC-MS에 의해 확인되었다. 순도(융합 단백질 수율의 동종이량체 퍼센트에 의해 평가된 바와 같은)를 실시예 50에 따라 측정하였다. 인슐린-Fc 융합 단백질의 개 IgGA 버전은 낮은 수준의 생물활성으로 고도로 응집된 반면, 인슐린-Fc 융합 단백질의 개 IgGB 버전은 낮은 응집도(즉, 높은 동종이량체%), 목적하는 동종이량체의 높은 역가(즉, 50 ㎎/L 초과의 동종이량체 역가), 및 개에서 생물활성을 낮추는 인지할만한 수준의 장기간 글루코스를 나타내었다. 따라서, 개 IgGB(서열번호 26) 면역글로빈 Fc 단편은 개에서 사용되는 인슐린-Fc 융합 단백질에 대한 바람직한 Fc 단편이다.
DCPKCPAPE㎖GGPSVFIFPPKPKDTLLIARTPEVTCVVVDLDPEDPEVQISWFVDGKQMQTAKTQPREEQFNGTYRVVSVLPIGHQDWLKGKQFTCKVNNKALPSPIERTISKARGQAHQPSVYVLPPSREELSKNTVSLTCLIKDFFPPDIDVEWQSNGQQEPESKYRTTPPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSRWQRGDTFICAVMHEALHNHYTQESLSHSPG(서열번호 26)
서열번호 27의 펩티드 링커를 통해 서열번호 26의 개 천연 IgGB 단편과 서열번호 28의 인슐린 유사체를 포함하는 예시적인 개의 초-장기 작용 인슐린-Fc 융합 단백질은 하기와 같다:
FVNQHLCGSHLVEALELVCGERGFHYGGGGGGSGGGGGIVEQCCTSTCSLDQLENYCGGGGGQGGGGQGGGGQGGGGGDCPKCPAPE㎖GGPSVFIFPPKPKDTLLIARTPEVTCVVVDLDPEDPEVQISWFVDGKQMQTAKTQPREEQFNGTYRVVSVLPIGHQDWLKGKQFTCKVNNKALPSPIERTISKARGQAHQPSVYVLPPSREELSKNTVSLTCLIKDFFPPDIDVEWQSNGQQEPESKYRTTPPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSRWQRGDTFICAVMHEALHNHYTQESLSHSPG(서열번호 29)
서열번호 29의 인슐린-Fc 융합 단백질의 Fc(감마) 수용체 I(RI)에의 결합을 실시예 51에 따라 평가하였다. 개 수용체 I는 상업적으로 입수할 수 없었기 때문에, 인간 Fc(감마) 수용체 I(즉 rhFc(감마) 수용체 I)을 대체 포유동물 수용체로서 사용하였다. 서열번호 29에의 rhFc(감마) 수용체 I의 결합에 비례하는 OD 값을, 각각에 첨가된 rhFc(감마) 수용체 I의 로그 농도에 대해 플롯팅하여, GraphPad Prism 소프트웨어를 사용하여 결합 곡선을 생성하였다. 도 3에 도시된 결과는 OD450 값이 모든 Fc(감마) 수용체에 대해 서열번호 29의 인슐린-Fc 융합 단백질의 증가된 용량에 따라 증가함을 예시한다.
실시예 45에 따라 HEK 세포에서 제조된 서열번호 29의 인슐린-Fc 융합 단백질의 주기적인 투여 후 생체내 약력학(PD)을 실시예 52에 따라 평가하였다. 시험 집단은 알록산-스트렙토조토신을 사용하여 화학적으로 유도되는 당뇨병이 있는 6마리의 비글개로 이루어졌으며, 각 개의 체중은 대략 10 ㎏이었다. 항-인슐린 항체(AIA) 역가를, 실시예 53에 따라 서열번호 29에 대한 실험실 시험에서 대상체인 화학적으로 유도된 당뇨병이 있는 6마리의 비글개에 대해 8주에 걸쳐 매주 측정하였다. 도 4는 서열번호 29의 인슐린-Fc 융합 단백질의 일련의 8주 용량에 걸쳐 화학적으로 유도된 당뇨병을 갖는 6마리의 비글에 대한 AIA의 역가를 나타낸다. 도 5는 서열번호 29의 인슐린-Fc 융합 단백질의 일련의 8주 용량에 걸쳐 화학적으로 유도된 당뇨병을 갖는 6마리의 비글에 대한 시험 0일째부터의 AIA 역가의 백분율 변화를 보여준다. 데이터는 비글의 AIA 역가가 서열번호 29의 인슐린-Fc 융합 단백질의 8회 투여 용량에 걸쳐 실질적으로 증가하지 않았음을 입증한다.
화학적으로 유도된 당뇨병 비글에 대한 이러한 긍정적인 실험실 시험 결과를 기반으로, 다양한 연령, 품종 및 당뇨병 질환 정도의 실제 의뢰인 소유의 자연 발생 당뇨병 개에 대한 현장 시험이 실시예 52에 따라 시작되었다. 시험 현장의 의뢰인 개는 모두 시험 개시 시점까지 공지된 수의학적 또는 인간 인슐린 제품으로 인슐린 치료를 받았고 실시예 52에 기재된 바와 같이 프로토콜 1 또는 프로토콜 2에 따라 서열번호 29를 제공받았다.
AIA 역가를 실시예 54에 따라 치료 과정에 걸쳐 매주 다시 측정하였다. 뜻밖에도, 화학적으로 유도된 당뇨병 비글에서 얻은 결과와 대조적으로, 이 "야생" 환자 집단의 여러 의뢰인 개(8/20)는 항-인슐린 항체의 현저한 증가를 나타내었다. 0.15의 정규화된 AIA 역가는 서열번호 29에 대해 면역원성으로 간주되는 의뢰인 개의 최소 측정값으로 간주되었다. 치료 시작 시 AIA 역가가 0이 아닌 의뢰인 개의 경우, 서열번호 29의 인슐린-Fc 융합 단백질로 처리된 후 AIA가 두배를 초과하였으면, 서열번호 29의 인슐린-Fc 융합 단백질은 그 특정 의뢰인 개에서 면역원성인 것으로 간주되었다. 도 6은 서열번호 29의 인슐린-Fc 융합 단백질이 치료 기간 동안 매주 측정되었을 때 면역원성인 것으로 간주된 의뢰인 개 각각에 대한 정규화된 AIA 역가의 플롯이다(치료를 위해 수행된 실시예 52의 특정 프로토콜은 개에 표시된다). 도 6에 도시된 각각의 개에서, AIA는 서열번호 29의 인슐린-Fc 융합 단백질의 치료 효과를 중화시켜 의뢰인 소유의 당뇨병 개에서 혈당 수준을 더 이상 조절할 수 없게 만들었다. 관찰된 면역원성은 또한 인슐린-Fc 융합 단백질의 인슐린 유사체 부분이 개에 대한 거의 천연 펩티드이기 때문에 예상치 못한 것이었다. 또한, 인슐린-Fc 융합 단백질의 IgGB Fc 단편 부분은 천연 개 Fc 단편이다. 결과는 개 IgGB Fc 단편의 특이적 활성이, 융합 단백질(즉, 인슐린)의 치료 단백질 영역에 특이적인 항체 역가의 현저하고 지속적인 증가를 유도할 수 있음을 나타낸다. 중화 AIA 역가의 상당한 증가를 보여주는 것 외에, 개는 반복 투여를 통해 건강을 유지 했으며 치료와 관련된 아나필락시스 또는 사이토카인 폭풍의 징후를 경험하지 않았다.
일부 경우에, 의뢰인 개가 높은 수준의 AIA를 나타내기 시작했을 때, 서열번호 29의 인슐린-Fc 융합 단백질의 투여를 중단하였고, 이 시점에서 AIA 역가가 감소하기 시작하였다(예를 들어 도 4의 개 2). 도 7은 주 1회 투여의 12주의 기간에 걸친 정규화된 AIA 역가, 예를 들어 개 2의 플롯이다. AIA 역가는 4차 투여(21일) 이후에 측정가능하게 증가하기 시작하였고, AIA 역가는 6차 투여(35일) 이후에 급격히 증가하기 시작하였음을 알 수 있다. 8차 투여 후(49일) 투여를 중단하고, 56일 또는 63일에 약물이 투여되지 않았다. 도 7은 AIA 역가 성장이 즉시 느려졌고, 이어서 56일 이후에 AIA 역가가 떨어지기 시작하였음을 예시한다. 투여 섭생은 70일째에 재개되었고, 이때 70일째에 투여되고 77일째에 다시 투여되었다. 70일째에 투여 재개 후 AIA 역가 성장은 투여가 중단될 때까지 7주 동안 최대 AIA 역가 성장과 일치하거나 초과하였으며, 이는 항-약물 항체의 역가가 초기 일련의 용량에 걸친 축적보다 상당히 짧은 시간에 예기치 않게 회복되었음을 예시한다. 이러한 확고한 회상 반응은 반응성 기억 면역 세포 집단을 나타낼 수 있다.
의뢰인 소유의 당뇨병 개의 현장 시험에서의 또 다른 관찰은 실시예 46에 따라 CHO 세포에서 제조된 서열번호 29의 인슐린-Fc 융합 단백질, 및 실시예 45에 따라 HEK 세포에서 제조된 서열번호 29의 인슐린-Fc 융합 단백질, 서열번호 29의 CHO-제조된 인슐린-Fc 융합 단백질로 처리된 개들에서 명백한 차이가 존재한다는 것이었으며, 도 8에 도시된 바와 같이 항-약물 항체의 현저하게 더 높은 유병률을 나타낸다.
각각의 IgG 단편은 Fc 영역의 각 중쇄의 CH2 도메인에 보존된 아스파라긴(N)-글리코실화 부위를 포함한다. 여기서, 보존된 N-글리코실화 부위를 지칭하기 위해 사용된 표기법은 "cNg"(도 1 및 도 2에 도시됨)이다. 치료용 단클론 항체에서 글리코실화는 CH2 영역 중의 보존된 아미노산 N297에서 발생한다(도 1 및 도 2에 도시됨). 인슐린-Fc 융합 단백질의 경우, 인슐린-Fc 융합 단백질의 B-쇄의 N-말단으로부터 cNg 부위의 절대 위치는 인슐린 폴리펩티드의 길이, 링커의 길이 및 임의의 cNg 부위 앞의 Fc 단편에서 생략된 아미노산에 따라 변한다. 여기서, 주어진 인슐린-Fc 융합 단백질 서열(인슐린-Fc 융합 단백질의 B-쇄의 N-말단로부터 카운팅하여 측정됨)에서 cNg 부위의 절대 위치를 지칭하기 위해 사용되는 표기법은 "NB(번호)"이다. 예를 들어, cNg 부위가 B-쇄의 N 말단으로부터 카운트하여 151 번째 아미노산 위치에 있는 경우, 이 부위의 절대 위치를 cNg-NB151이라고 한다. 추가적인 예로서, cNg 부위가 B-쇄의 N-말단으로부터 카운트하여 151번째 아미노산 위치에서 발견되고, 이 부위의 아스파라긴이 세린으로 돌연변이되는 경우, 이 돌연변이는 "cNg- NB151-S"로 표기된다.
실시예 45에 따라 HEK 세포에서 재조합적으로 제조된 융합 단백질과 실시예 46에 따라 CHO 세포에서 재조합적으로 제조된 융합 단백질 사이의 한 가지 가능한 차이는 cNg 부위에 부착되는 올리고사카라이드의 조성이다. 개의 IgGB 아이소타입이 Fc(감마) 수용체와 상호작용한다는 점을 감안할 때, 반복 주사 후 원치 않는 면역원성의 위험이 있을 수 있다. Fc(감마) 상호작용을 감소시키는 한 가지 방법은 숙주 세포에서 합성하는 동안 Fc 단편의 글리코실화를 탈글리코실화하거나 방지하는 단계를 포함한다. 항체의 생성은, 항체가 약물의 치료 가치를 중화시키기 때문에 당뇨병과 같은 만성 질환의 치료에 분명히 바람직하지 않다. 따라서, 이는 글리코실화되지 않은 개 인슐린-Fc 융합 단백질을 생성하려는 시도로 이어졌다. 합성된 인슐린-Fc 융합 단백질로부터 부착된 글리칸을 제거하는 한 가지 방법은 cNg 부위를 돌연변이시켜 숙주 세포에서 생산하는 동안 글리칸의 부착을 모두 방지하는 것이다. 여기서, cNg 돌연변이를 설명하기 위해 사용된 표기법은 cNg-(치환된 아미노산)이다. 예를 들어, cNg 부위의 아스파라긴이 세린으로 돌연변이되면 이 돌연변이는 "cNg-S"로 표기된다. cNg 돌연변이가 있는 개 IgGB Fc 단편의 일반적인 표현을 서열번호 30에 나타낸다:
DCPKCPAPE㎖GGPSVFIFPPKPKDTLLIARTPEVTCVVVDLDPEDPEVQISWFVDGKQMQTAKTQPREEQFX 1 GTYRVVSVLPIGHQDWLKGKQFTCKVNNKALPSPIERTISKARGQAHQPSVYVLPPSREELSKNTVSLTCLIKDFFPPDIDVEWQSNGQQEPESKYRTTPPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSRWQRGDTFICAVMHEALHNHYTQESLSHSPG
여기서 X1 = S, D, K, Q 또는 A(서열번호 30).
X1=S인 서열번호 30의 IgGB Fc 단편(하기에서 볼드체 잔기), 서열번호 27의 링커, 및 하기 인슐린 유사체를 포함하는 개 인슐린-Fc 융합 단백질이 설계되었다:
FVNQHLCGSHLVEALALVCGERGFHYGGGGGGSGGGGGIVEQCCTSTCSLDQLENYC(서열번호 31)
생성된 인슐린-Fc 융합 단백질은 하기와 같다:
FVNQHLCGSHLVEALALVCGERGFHYGGGGGGSGGGGGIVEQCCTSTCSLDQLENYCGGGGGQGGGGQGGGGQGGGGGDCPKCPAPE㎖GGPSVFIFPPKPKDTLLIARTPEVTCVVVDLDPEDPEVQISWFVDGKQMQTAKTQPREEQFSGTYRVVSVLPIGHQDWLKGKQFTCKVNNKALPSPIERTISKARGQAHQPSVYVLPPSREELSKNTVSLTCLIKDFFPPDIDVEWQSNGQQEPESKYRTTPPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSRWQRGDTFICAVMHEALHNHYTQESLSHSPG(서열번호 32)
실시예 45에 따라 HEK 세포에서 또는 실시예 46에 따라 CHO 세포에서 서열번호 32의 인슐린-Fc 융합 단백질을 제조하였다. 실시예 47에 따라 인슐린-Fc 융합 단백질을 정제하였다. 인슐린-Fc의 구조 융합 단백질은 실시예 48에 따라 비-환원 및 환원 CE-SDS에 의해 확인되었고, 서열은 실시예 49에 따라 글리칸 제거와 함께 LC-MS에 의해 확인되었다. 순도(융합 단백질 수율의 동종이량체 퍼센트에 의해 평가됨)를 실시예 50에 따라 측정하였다.
이러한 융합 단백질은 서열번호 29와 유사한 바람직한 시험관내 및 생체내 특성을 입증하였다. 도 3에 예시된 바와 같이, 유일한 차이는 서열번호 29의 인슐린-Fc 융합 단백질에 비해 서열번호 32의 인슐린-Fc 융합 단백질에 대한 Fc(감마)RI 결합 친화도가 현저히 감소되었다는 점이다. 다양한 연령, 품종 및 당뇨병 질환 정도를 가진 5마리의 당뇨병 의뢰인 개에 대한 시험을 시작하였다. 현장 시험에 참여한 5마리의 의뢰인 개는 모두 시험 시작 시점까지 공지된 수의학적 또는 인간 인슐린 제품으로 인슐린 치료를 받았으며 1주일에 1회 기준으로 서열번호 32의 인슐린-Fc 융합 단백질을 받았다.
AIA 역가를 실시예 54에 따른 치료 과정에 걸쳐 매주 또는 가능한 한 자주 다시 측정하였다. 서열번호 29의 인슐린-Fc 융합 단백질을 투여받은 개와 비교하여, 이 "야생" 환자 집단은 서열번호 32의 글리코실화되지 않은 인슐린-Fc 융합 단백질과 함께 투여되었을 때 인슐린 항-약물 항체를 나타내었다. 0.15의 정규화된 AIA 역가는 서열번호 32에 대해 면역원성인 것으로 간주되는 의뢰인 개에 대한 최소 측정값으로 간주되었다. 치료 시작 시 AIA 역가가 0이 아닌 의뢰인 개의 경우, AIA가 서열번호 32의 인슐린-Fc 융합 단백질로 치료된 후 두 배 이상이라면 의뢰인 개는 면역원성으로 간주된다. 도 9는 치료 기간에 걸쳐 측정된 각각의 의뢰인 개에 대한 정규화된 AIA 역가의 플롯이며, 이는 상기 "야생" 환자 집단에서 5마리의 의뢰인 개 중 어느 것도 서열번호 32의 글리코실화되지 않은 인슐린-Fc 융합 단백질 투여시 인슐린 항-약물 항체를 나타내지 않았음을 입증한다. 도 10에 도시된 바와 같이, 이는 서열번호 29의 인슐린-Fc 융합 단백질을 투여받은 개와 대조적이며, 여기서 총 12마리의 개는 서열번호 32의 글리코실화되지 않은 인슐린-Fc 융합 단백질을 투여받지 않은 개와 비교하여 인슐린 항-약물 항체를 나타내었다.
종합하면, 결과는 뜻밖에도 실험실 동물 집단 밖에서, 특정 Fc 융합 단백질이 치료 펩티드 또는 단백질 성분에 대해 높은 역가의 항체를 유도할 가능성이 있으며 이 반응이 치료 펩티드 또는 단백질 성분의 후속 제시시 신속하고 확고하게 재-유도될 수 있음을 입증한다. 더욱 또한, 이러한 예비 데이터는 항-치료 단백질 또는 펩티드 항체의 유도가 특정 치료 단백질 또는 펩티드에 대한 면역 반응을 이미 발달시킨 개인에서 더 가능성이 있음을 나타낸다. 이러한 결과는 Fc 융합 단백질이, 융합된 치료 펩티드 또는 단백질에 대한 면역 관용을 유도할 수 있는 가능성을 보여주며, DNP, 뉴클레오시드 또는 페니실로일 기와 같은 합텐이 IgG 담체에 화학적으로 결합될 때, 높은 관용성의 합텐-담체 접합체임을 보였다는 다수의 발표된 결과와 대조적이다.
만성 질환(즉, 당뇨병)을 치료하는 데 사용되는 인슐린과 같은 치료 단백질의 경우 항-인슐린 항체는 치료를 무용지물로 만든다. 그럼에도 불구하고, 앞서 언급한 결과는 예를 들어 바이러스 항원에 대한 항체가 활성을 중화하도록 유도하기 위해 Fc 융합 단백질을 어떻게 효과적으로 설계할 수 있는지에 대한 독특한 통찰력으로 이어졌다. 현장 실험에 기초하여, 원하는 Fc 융합 단백질은 최소한 표적 피험자에 고유해야 하며(예를 들어, 인간 대상체의 경우 인간 Fc 또는 hFc, 개 피험자의 경우 개 Fc 또는 dFc), Fc-cNg 부위에서 적합하게 글리코실화되어야 하고, Fc(감마) I 수용체에 결합할 수 있어야 한다. 이러한 발견은 예를 들어 새로운 코로나바이러스 SARS-CoV-2에 대한 새로운 치료용 Fc-융합 단백질을 개발할 기회를 제시한다.
SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질
COVID-19의 발생은 공중 보건에 대한 심각한 위협을 나타낸다. 원인 인자인 SARS-CoV-2 바이러스에 의한 감염을 예방하기 위한 안전하고 효과적인 해법이 시급하다. SARS-CoV-2 스파이크 단백질(SP)의 수용체 결합 도메인(RBD)을 포함하는 표면 당단백질이 동정되었으며, SARS-CoV-2 SP/RBD가 인간과 박쥐 안지오텐신-전환 효소 2(ACE2) 수용체에 강하게 결합하는 것으로 밝혀졌다. SARS-CoV-2 SP/RBD는 외래 항원이고, 이 항원과 글리코실화된 인간 면역글로빈 Fc 단편을 포함하는 융합 단백질(본원에서 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질 또는 SP/RBD-Fc 융합 단백질로서 지칭됨)은 SARS-CoV-2에 대한 면역 반응이 없거나 낮은 환자에서 기존 항체 역가를 증폭하거나 새로운 항체 역가를 유도할 수 있는 융합 단백질을 만드는 유망한 접근법이다. 특히, 환자가 SARS-CoV-2 바이러스에 대한 항바이러스 항체를 생성하도록 하는 데 효과적인 예방 또는 추가 백신에 사용하기 위한 융합 단백질을 만들고 사용하는 방법은 이러한 긴급한 요구를 충족하며 상당한 공중 보건 가치를 가질 것이다.
따라서 목표는 새로운 방식으로 항원(SARS-CoV-2-SP/RBD)을 제시하여 환자가 높은 역가에서 항-SARS-CoV-2 항체를 빠르게 생산하도록 하는 제조 가능한 접합체를 생성하기 위해 글리코실화를 향하는 경향이 있는 부위 또는 잔기를 함유하는 SARS-CoV-2 표면 당단백질(또는 이의 유사체)의 일부 및 인간 Fc 단편(예를 들어 인간 IgG1 또는 hIgG1)을 포함하는 Fc 융합 단백질을 생성하는 것이다.
도 2에 나타낸 바와 같이 인간 IgG1 Fc 모이어티에 재조합적으로 융합된 SP/RBD의 2가 유사체를 포함하는 SP/RBD-Fc 융합 단백질은 (i) Fc(감마) 수용체를 통해 SP/RBD-Fc를 내면화하는 국소적인 APC로 SP/RBD Ag의 집중된 전달을 용이하게 한 다음, 도 12에 예시된 바와 같이 SP/RBD 단편을 처리 및 CD4+ Th 세포에 제시하며, 이는 차례로 도 12에 예시된 바와 같이 B 세포 활성화 및 항-SARS-CoV-2 SP/RBD IgG(즉, Ab) 생산을 촉진("도움")할 것이다. 또한, 보다 직접적이고 독특한 기전은 SP/RBD-Fc 융합 단백질이 Ag 특이적 B 세포 수용체(BCR)를 통해 기존 SARS-CoV-2 특이적 기억 B 세포에 직접 결합하는 것일 수 있다. 이러한 결합은 도 12에 예시된 바와 같이 CD4+ Th 세포의 부재 하에 향상된 증식 및 항-SARS-CoV-2 IgG 생산을 유도하는 서열번호 19의 SP/RBD 2가 특성을 통한 BCR 가교(cross-linking) 시 활성화 신호를 유발한다. 또한, SP/RBD-Fc 융합 단백질의 Fc 단편은 세포에서 발현되는 신생아 FcR(FcRn) 수용체의 결합으로 인해 더 많은 APC에 대한 SP/RBD의 반감기 및 생체 노출을 향상시킬 것이며, 이는 대부분의 단클론 Ab(mAb) 치료제의 혈청 반감기를 길게 할 수 있다.
SARS-CoV-2에 대한 완전한 표면 당단백질 단백질을 하기에 나타낸다(GenBank: QHD43416.1):
MFVFLVLLPLVSSQCVNLTTRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLPFFSNVTWFHAIHVSGTNGTKRFDNPVLPFNDGVYFASTEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQSLLIVNNATNVVIKVCEFQFCNDPFLGVYYHKNNKSWMESEFRVYSSANNCTFEYVSQPFLMDLEGKQGNFKNLREFVFKNIDGYFKIYSKHTPINLVRDLPQGFSALEPLVDLPIGINITRFQTLLALHRSYLTPGDSSSGWTAGAAAYYVGYLQPRTFLLKYNENGTITDAVDCALDPLSETKCTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVSVITPGTNTSNQVAVLYQDVNCTEVPVAIHADQLTPTWRVYSTGSNVFQTRAGCLIGAEHVNNSYECDIPIGAGICASYQTQTNSPRRARSVASQSIIAYTMSLGAENSVAYSNNSIAIPTNFTISVTTEILPVSMTKTSVDCTMYICGDSTECSNLLLQYGSFCTQLNRALTGIAVEQDKNTQEVFAQVKQIYKTPPIKDFGGFNFSQILPDPSKPSKRSFIEDLLFNKVTLADAGFIKQYGDCLGDIAARDLICAQKFNGLTVLPPLLTDEMIAQYTSALLAGTITSGWTFGAGAALQIPFAMQMAYRFNGIGVTQNVLYENQKLIANQFNSAIGKIQDSLSSTASALGKLQDVVNQNAQALNTLVKQLSSNFGAISSVLNDILSRLDKVEAEVQIDRLITGRLQSLQTYVTQQLIRAAEIRASANLAATKMSECVLGQSKRVDFCGKGYHLMSFPQSAPHGVVFLHVTYVPAQEKNFTTAPAICHDGKAHFPREGVFVSNGTHWFVTQRNFYEPQIITTDNTFVSGNCDVVIGIVNNTVYDPLQPELDSFKEELDKYFKNHTSPDVDLGDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQYIKWPWYIWLGFIAGLIAIVMVTIMLCCMTSCCSCLKGCCSCGSCCKFDEDDSEPVLKGVKLHYT(서열번호 1)
GenBank QHD43416.1에 따른 SARS-CoV-2의 표면 당단백질의 스파이크 단백질 수용체 결합 도메인(SP/RBD)은 하기에 나타낸 바와 같이 아미노산 330에서 아미노산 583까지의 표면 당단백질 부분을 포함한다:
PNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLE(서열번호 2)
스파이크 단백질의 RBD는 하기에 나타낸 바와 같이 SARS-CoV-2 표면 당단백질의 아미노산 331 내지 524를 포함한다:
NITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATV(서열번호 8)
WO2018107117A1 및 WO2020006529A1에 기재된 것과 같은 인슐린-Fc 융합 단백질에 대한 이전 연구는 단백질 서열, 링커 서열 및 Fc 도메인의 조성의 선택이 모두 잠재적으로 단백질 수율, 순도 및 생물활성에 영향을 미칠 수 있음을 입증하였다.
SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질에 대한 바이러스 단백질을 선택할 때, SP/RBD의 일부를 포함하는 표면 당단백질의 각 부분집합을 선택할 수 있음을 고려할 수 있다. SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질에 대한 바이러스 단백질은 SARS-CoV-2 표면 당단백질의 SP/RBD의 전부 또는 일부를 포함할 수 있다. SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질에 대한 바이러스 단백질은 SARS-CoV-2 표면 당단백질의 비-SP/RBD 부분의 전부 또는 일부를 포함할 수 있다. 예에서, SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질에 대한 바이러스 단백질은 SARS-CoV-2 표면 당단백질의 RBD의 전부 또는 일부 및 SARS-CoV-2 표면 당단백질의 비-SP/RBD 부분의 전부 또는 일부를 포함한다. SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질의 SP/RBD 단편에 있는 일부 아미노산은 이의 고유 상태에서 돌연변이된다.
인슐린-Fc 융합 단백질을 제조한 경험에 기초하여, 상이한 바이러스 단백질 설계는 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질의 상이한 단백질 수율을 초래할 것이다. 예를 들어, 서열번호 8의 SP/RBD 서열의 더 크거나 더 짧은 부분을 선택하고, 임의로 특정 아미노산을 돌연변이시켜 Fc 융합 단백질에 목적하는 바이러스 부분을 생산할 수 있다. 선택된 바이러스 단백질이 Fc 단편에 부착될 때 생성되는 단백질 수율을 실험적으로 측정할 수 있다. 더욱이, 선택된 바이러스 단백질을 Fc 단편에 연결하는 링커의 길이 및 조성은 유사하게 단백질 수율에 영향을 미치며, Fc 단편 및 바이러스 단백질에 연결되는 Fc 단편 힌지 영역의 부분도 마찬가지일 것이다.
도 2는 본 개시내용에 따른 예시적인 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질의 예시를 나타낸다. SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질은 링커, 예를 들어 펩티드 링커를 포함할 수 있다. SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질의 SP/RBD 단편은 Fc 단편에 직접 연결될 수 있다, 즉 링커가 존재하지 않을 수 있다. 예에서 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질의 SP/RBD 단편에 있는 일부 아미노산은 이의 고유의 상태에서 돌연변이된다. SARS-CoV-2 표면 당단백질의 일부를 포함하는 치료 단백질은 Fc 단편의 N-말단 측에 위치한다. 융합 단백질은 N-말단에서 C-말단으로 하기 배향의 도메인을 포함한다: (N-말단)--치료 단백질--링커--Fc 단편--(C-말단)(예를 들어, (N-말단)--SARS-CoV-2 펩티드--링커--Fc 단편--(C-말단)). 링커가 생략될 수 있으므로 융합 단백질이 N-말단에서 C-말단으로 하기 배향으로 도메인을 포함하도록 할 수 있다: (N-말단)--치료 단백질--Fc 단편--(C-말단)(예를 들어, (N -말단)--SARS-CoV-2 펩티드--Fc 단편--(C-말단)). 도 2에 도시된 융합 단백질의 SP/RBD 단편은 숙주 세포에서 재조합적으로 제조된(즉, 실시예 1에 따라 HEK 세포에서, 실시예 2에 따라 일시적으로 CHO 세포에서, 또는 실시예 3에 따라 안정한 CHO 세포에서 제조된) 융합 단백질의 일부로서 충분히 발현되거나 발현되지 않을 수 있다.
이어지는 모든 설명에서, 인용된 아미노산 위치는 서열번호 1의 SARS-CoV-2 표면 당단백질에서 아미노산의 위치를 나타낸다. SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질을 생성하기 위한 첫 번째 시도로서, 서열번호 2의 주요 바이러스 SARS-CoV-2 RBD를 단축시켜, 첫 번째 아미노산(위치 330)을 제거하였다. 서열번호 8의 SARS-CoV-2 RBD의 생성된 SP/RBD 단편은 아미노산 331 내지 524를 포함하였다. 이후 SP/RBD 단편에서 신규 돌연변이가 생성되었다. 먼저, 331번 및 343번 위치의 아스파라긴을 글루타민으로 돌연변이시켰다(일반적인 돌연변이는 도 2에 도식적으로 나타내었다). 이러한 돌연변이는 SP/RBD 단편의 글리코실화 부위의 수를 줄이기 위해 이루어졌는데, 이는 글리코실화 부위가 너무 많으면 실시예 1(HEK 세포), 실시예 2(일시적인 CHO-SETM 세포) 또는 실시예 3(CHO 세포)에 따라 Fc 융합 단백질을 재조합적으로 제조할 때 제조 수율을 낮출 가능성이 있다고 여겨졌기 때문이다. 분자의 SP/RBD 단편에 있는 글리칸은 항체를 개발하는 데 필요할 수 있는 주요 에피토프를 보호할 수 있다. 구현예에서, SP/RBD 단편은 도 2에 예시된 바와 같이 Fc 단편의 N-말단 측에 위치하였다.
SP/RBD 단편의 391번 위치에서 시스테인에서 메티오닌으로의 새로운 돌연변이가 추가로 발생하였다. 이 돌연변이는 HEK 또는 CHO 세포에서 재조합 제조 동안 바람직하지 않은 단백질 폴딩 및 바람직하지 않은 인공물을 방지하기 위해 짝을 이루지 않은 시스테인을 제거하기 위해 만들어졌다. 서열번호 1의 SARS-CoV-2 표면 당단백질의 생성된 유사체 SP/RBD 단편은 하기와 같다:
QITNLCPFGEVFQATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLMFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATV(서열번호 9)
Clustal Omega를 사용하여 서열번호 2의 SARS-CoV-2 고유 SP/RBD 및 유사체 SP/RBD 단편(서열번호 9)의 나란한 비교를 수행하였고, 이를 도 13에 나타낸다. "*"는 주어진 서열 위치에서 모든 서열에 걸쳐 완전한 상동성을 나타낸다. ":"(콜론)은 Gonnet PAM 250 매트릭스에서 0.5를 초과하는 점수로 매우 유사한 특성의 그룹 간의 보존을 가리킨다. "-"(대시)는 특정한 서열 범위내의 특정한 비교 세트내에 국소적인 상동성이 존재하지 않음을 의미하는 서열 끊김을 가리킨다.
유사체 SP/RBD 단편(서열번호 9)을 링커 GGGGGQGGGGQGGGGQGGGGG(서열번호 4)를 사용하여 하기 서열을 포함하는 고유의 인간 IgG1 Fc 단편에 연결하였다:
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(서열번호 6)
인간 IgG1 단편상의 N-말단 리신을 제조 수율 및 순도를 개선하기 위한 시도로 서열번호 6에 나타낸 바와 같이 제거하였다. 또한, 인간 IgG1 단편의 cNg 부위에 있는 아스파라긴을 숙주 세포에서 융합 단백질 생산 동안 글리칸 부착을 보존하기 위해 보존하였다. 생성된 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질은 하기와 같다:
QITNLCPFGEVFQATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLMFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVGGGGGQGGGGQGGGGQGGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(서열번호 11)
서열번호 11의 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질을 실시예 1에 따라 HEK293 세포에서 제조하고 실시예 4에 따라 정제하였다. 뜻밖에도, 이는 5 ㎎/L 미만의 극히 낮은 동종이량체 역가를 갖는 고도로 응집된 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질을 생성하였다.
SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질을 생성하려는 두 번째 시도에서, 주요 SARS-CoV-2 RBD(서열번호 2) 서열을 단축하고 처음 103개 아미노산(서열번호 1의 330-432번 위치에 있는 아미노산)을 제거하였다. 서열번호 1의 생성된 RBD 단편은 아미노산 433 내지 524를 포함하고 3D 모델에 따라 구조적으로 연속적인 것으로 간주되었다.
생성된 유사체 SP/RBD 단편을 하기에 나타낸다:
VIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATV(서열번호 10)
SARS-CoV-2 고유 SP/RBD(서열번호 2)와 유사체 SP/RBD 단편(서열번호 10)의 나란한 비교를 Clustal Omega를 사용하여 수행하고 도 14에 나타내었다. "*"는 주어진 서열 위치에서 모든 서열에 걸쳐 완전한 상동성을 나타낸다. ":"(콜론)은 Gonnet PAM 250 매트릭스에서 0.5를 초과하는 점수로 매우 유사한 특성의 그룹 간의 보존을 가리킨다. "-"(대시)는 특정한 서열 범위내의 특정한 비교 세트내에 국소적인 상동성이 존재하지 않음을 의미하는 서열 끊김을 가리킨다.
서열번호 10의 유사체 SP/RBD 단편은 서열번호 11의 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc에서 사용된 것과 동일한 링커 - GGGGGQGGGGQGGGGQGGGGG(서열번호 4) -를 통해 하기 서열을 포함하는 고유의 인간 IgG1 Fc 단편에 연결되었다:
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(서열번호 6)
인간 IgG1 단편의 N-말단 리신을 제조 수율 및 순도를 개선하기 위한 시도로 서열번호 6에 나타낸 바와 같이 제거하였다. 또한, 인간 IgG1 단편의 cNg 부위에 있는 아스파라긴을 숙주 세포에서 융합 단백질 생산 동안 글리칸 부착을 보존하기 위해 보존하였다. 생성된 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질을 하기에 제공한다:
VIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVGGGGGQGGGGQGGGGQGGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(서열번호 12)
서열번호 12의 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질을 실시예 1에 따라 HEK293 세포에서 제조하고 실시예 4에 따라 정제하였다. 뜻밖에도, 이는 1 ㎎/L 미만의 극히 낮은 동종이량체 역가를 갖는 고도로 응집된 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질을 생성하였다.
SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질을 생산하기 위한 추가 시도에서, SARS-CoV-2 RBD를 추가로 단축하는 대신 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질의 SP/RBD 단편을, 서열번호 1의 아미노산 319 내지 541을 포함하도록 SP/RBD 서열의 N- 및 C-말단을 확장시킴으로써 선택하여 더 잘 발현되고, 더 잘 폴딩되고, 더 양호하게 시스테인과 짝을 이룰 수 있는 서열을 생성하였다. 생성된 서열번호 14의 유사체 SP/RBD 단편을 하기에 나타낸다:
RVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNF(서열번호 14)
SARS-CoV-2 고유 SP/RBD(서열번호 2)와 SP/RBD 단편(서열번호 14)의 나란한 비교를 Clustal Omega를 사용하여 수행하였으며 도 15에 나타낸다. "*"는 주어진 서열 위치에서 모든 서열에 걸쳐 완전한 상동성을 나타낸다. ":"(콜론)은 Gonnet PAM 250 매트릭스에서 0.5를 초과하는 점수로 매우 유사한 특성의 그룹 간의 보존을 가리킨다. "-"(대시)는 특정한 서열 범위내의 특정한 비교 세트내에 국소적인 상동성이 존재하지 않음을 의미하는 서열 끊김을 가리키는 반면, ": ", "." 또는 공간은 각각 주어진 서열 위치에서 서열들에 걸친 보존적, 보통의, 또는 매우 상이한 아미노산 돌연변이를 지칭한다.
하나의 시도에서, 링커를 또한 단축시키고 조성을 GGGSGGG(서열번호 3)로 변화시켰으며, 인간 IgG1 Fc 단편의 힌지 영역과 C-말단 리신을 복원시켜 서열번호 7의 Fc 단편을 생산하였다:
PKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(서열번호 7)
인간 IgG1 단편의 cNg 부위에 있는 아스파라긴을 숙주 세포에서 융합 단백질 생산 동안 글리칸 부착을 보존하기 위해 보존하였다. 생성된 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질(서열번호 17)을 하기에 나타낸다:
RVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFGGGSGGGSPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(서열번호 17)
실시예 1에 따라 HEK293 세포에서 제조된 서열번호 17의 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질의 Fc(감마) 수용체 I 결합을 실시예 9에 따라 측정하였다. Fc(감마) 수용체 I, Fc(감마) 수용체 IIA, Fc(감마) 수용체 IIB, Fc(감마) 수용체 III, FcRn 및 ACE2 수용체 결합에 대한 OD450 정도는 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질의 농도의 함수로서 증가할 것으로 예상된다.
추가 시도에서, 서열번호 14의 SARS-CoV-2 RBD 단편 및 서열번호 3의 링커를 유지하였고, 인간 IgG1 Fc 단편 상의 C-말단 리신을 다시 제거하여, 서열번호 33의 Fc 단편을 생산하였다.
PKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(서열번호 33)
인간 IgG1 단편의 cNg 부위에 있는 아스파라긴을 숙주 세포에서 융합 단백질 생산 동안 글리칸 부착을 보존하기 위해 보존하였다. 생성된 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질을 하기에 나타낸다.
RVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFGGGSGGGSPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(서열번호 16)
서열번호 16의 Fc 융합 단백질을 실시예 2에 따라 일시적으로 형질감염된 CHO 세포에서 재조합적으로 제조하였다. 서열번호 16의 Fc 융합 단백질을 실시예 5에 따라 정제하였다. 서열번호 16의 융합 단백질 구성물은 실시예 6에 따라 확인되었으며, 실시예 7에 따라 서열 동정을 수행하였다. 제조된 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질의 동종이량체 역가를 획득하기 위해서, 동종이량체%를 실시예 8에 따라 측정하고, 동종이량체%에 재조합으로 제조된 융합 단백질의 단백질 역가를 곱하여 동종이량체 역가를 계산하였다. 서열번호 16의 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질의 동종이량체 역가는 139 ㎎/L인 것으로 계산되었다.
실시예 2에 따라 일시적으로 형질감염된 CHO 세포에서 또는 실시예 3에 따른 CHO 세포에서 제조된 서열번호 16의 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질의 Fc(감마) 수용체 I 결합을 실시예 9에 따라 측정한다. Fc(감마) 수용체 I, (감마) 수용체 IIA, Fc(감마) 수용체 IIB, Fc(감마) 수용체 III, FcRn 및 ACE2 수용체 결합의 OD450 정도는 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질의 농도의 함수로서 증가할 것으로 예상된다.
SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질을 생산하기 위한 추가 시도에서, 서열번호 14의 SARS-CoV-2 SP/RBD 단편을 서열번호 11의 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질에서 사용된 것과 동일한 링커 - GGGGGQGGGGQGGGGQGGGGG(서열번호 4) -를 통해 서열번호 6을 포함하는 인간 IgG1 Fc 단편에 연결하였다. 생성된 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질을 하기에 나타낸다.
RVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFGGGGGQGGGGQGGGGQGGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(서열번호 18)
서열번호 18의 Fc 융합 단백질을 실시예 2에 따라 일시적으로 형질감염된 CHO 세포에서 재조합적으로 제조하고 실시예 5에 따라 정제하였다. 예에서, 서열번호 18의 융합 단백질 구성물은 실시예 6에 따라 확인되었으며, 실시예 7에 따라 서열 동정을 수행하였다. 서열번호 18의 제조된 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질의 동종이량체 역가를 획득하기 위해서, 동종이량체%를 실시예 8에 따라 측정하고, 동종이량체%에 재조합으로 제조된 융합 단백질의 단백질 역가를 곱하여 동종이량체 역가를 계산하였다. 서열번호 18의 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질의 동종이량체 역가는 124 ㎎/L인 것으로 계산되었다.
실시예 2에 따라 일시적으로 형질감염된 CHO 세포에서 또는 실시예 3에 따른 CHO 세포에서 제조된 서열번호 18의 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질의 Fc(감마) 수용체 I 결합을 실시예 9에 따라 측정한다. Fc(감마) 수용체 I, (감마) 수용체 IIA, Fc(감마) 수용체 IIB, Fc(감마) 수용체 III, FcRn 및 ACE2 수용체 결합의 OD450 정도는 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질의 농도의 함수로서 증가할 것이며, 주어진 농도에서 OD450 정도는 참조 표준보다 클 것으로 예상된다.
SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질을 생산하기 위한 추가 시도에서, SARS-CoV-2 RBD를 추가로 단축하는 대신 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질의 SP/RBD 단편을, 서열번호 1의 아미노산 319 내지 541을 포함하도록 SP/RBD 서열의 N- 및 C-말단을 확장시킴으로써 선택하여 더 잘 발현되고, 더 잘 폴딩되고, 더 양호하게 시스테인과 짝을 이룰 수 있는 서열을 생성하였다.
RVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVK(서열번호 15)
SARS-CoV-2 고유 SP/RBD(서열번호 2)와 서열번호 15의 SP/RBD 단편의 나란한 비교를 Clustal Omega를 사용하여 수행하였으며 도 16에 나타낸다. "*"는 주어진 서열 위치에서 모든 서열에 걸쳐 완전한 상동성을 나타낸다. ":"(콜론)은 Gonnet PAM 250 매트릭스에서 0.5를 초과하는 점수로 매우 유사한 특성의 그룹 간의 보존을 가리킨다. "-"(대시)는 특정한 서열 범위내의 특정한 비교 세트내에 국소적인 상동성이 존재하지 않음을 의미하는 서열 끊김을 가리키는 반면, ": ", "." 또는 공간은 각각 주어진 서열 위치에서 서열들에 걸친 보존적, 보통의, 또는 매우 상이한 아미노산 돌연변이를 지칭한다.
링커를 또한 단축시키고 조성을 GGGSGGGS(서열번호 5)로 변화시키고, 이를 사용하여 SP/RBD 단편을 서열번호 6을 포함하는 인간 IgG1 Fc 단편에 연결하였다. 생성되는 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질을 하기에 나타낸다.
RVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKGGGSGGGSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(서열번호 20)
서열번호 20의 Fc 융합 단백질을 실시예 2에 따라 일시적으로 형질감염된 CHO 세포에서 재조합적으로 제조하고 실시예 4에 따라 정제하였다. 예에서, 서열번호 20의 융합 단백질 구성물은 실시예 6에 따라 확인되었으며, 실시예 7에 따라 서열 동정을 수행하였다. 제조된 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질의 동종이량체 역가를 획득하기 위해서, 서열번호 20의 동종이량체%를 실시예 8에 따라 측정하고, 동종이량체%에 재조합으로 제조된 융합 단백질의 단백질 역가를 곱하여 동종이량체 역가를 계산하였다. 서열번호 20의 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질의 동종이량체 역가는 134 ㎎/L인 것으로 계산되었다.
실시예 2에 따라 일시적으로 형질감염된 CHO 세포에서 또는 실시예 3에 따른 CHO 세포에서 제조된 서열번호 20의 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질의 Fc(감마) 수용체 I 결합을 실시예 9에 따라 측정한다. Fc(감마) 수용체 I, (감마) 수용체 IIA, Fc(감마) 수용체 IIB, Fc(감마) 수용체 III, FcRn 및 ACE2 수용체 결합의 OD450 정도는 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질의 농도의 함수로서 증가할 것이며, 주어진 농도에서 OD450 정도는 참조 표준보다 클 것으로 예상된다.
SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질을 생산하기 위한 추가 시도에서, SARS-CoV-2 RBD를 추가로 단축하는 대신 서열번호 15의 SP/RBD 단편을 유지시켰다. 링커를 제거하고 서열번호 15의 SP/RBD 단편을 서열번호 6의 인간 IgG1 Fc 단편에 직접 연결하였다. 생성되는 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질을 하기에 나타낸다.
RVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(서열번호 21)
서열번호 21의 Fc 융합 단백질을 실시예 2에 따라 일시적으로 형질감염된 CHO 세포에서 재조합적으로 제조하고 실시예 4에 따라 정제하였다. 예에서, 서열번호 21의 융합 단백질 구성물은 실시예 6에 따라 확인되었으며, 실시예 7에 따라 서열 동정을 수행하였다. 서열번호 21의 제조된 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질의 동종이량체 역가를 획득하기 위해서, 동종이량체%를 실시예 8에 따라 측정하고, 동종이량체%에 재조합으로 제조된 융합 단백질의 단백질 역가를 곱하여 동종이량체 역가를 계산하였다. 단백질 역가는 156 ㎎/L였으며 동종이량체%는 98.7%였고, 154 ㎎/L의 서열번호 21의 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질의 동종이량체 역가를 생성하였다.
실시예 2에 따라 일시적으로 형질감염된 CHO 세포에서 또는 실시예 3에 따른 CHO 세포에서 제조된 서열번호 21의 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질의 Fc(감마) 수용체 I 결합을 실시예 9에 따라 측정한다. Fc(감마) 수용체 I, (감마) 수용체 IIA, Fc(감마) 수용체 IIB, Fc(감마) 수용체 III, FcRn 및 ACE2 수용체 결합의 OD450 정도는 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질의 농도의 함수로 증가할 것이며, 주어진 농도에서 OD450 정도는 참조 표준보다 클 것으로 예상된다.
SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질을 생산하기 위한 추가 시도에서, SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질의 SP/RBD 단편을, SP/RBD가 하기 서열번호 13에 나타낸 바와 같이 서열번호 1의 아미노산 319 내지 591을 포함하도록 SP/RBD 서열의 C-말단을 확장시킴으로써 선택하였다.
RVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCS(서열번호 13)
SARS-CoV-2 고유 SP/RBD(서열번호 2)와 SP/RBD 단편(서열번호 13)의 나란한 비교를 Clustal Omega를 사용하여 수행하였으며 도 17에 나타낸다. "*"는 주어진 서열 위치에서 모든 서열에 걸쳐 완전한 상동성을 나타낸다. ":"(콜론)은 Gonnet PAM 250 매트릭스에서 0.5를 초과하는 점수로 매우 유사한 특성의 그룹 간의 보존을 가리킨다. "-"(대시)는 특정한 서열 범위내의 특정한 비교 세트내에 국소적인 상동성이 존재하지 않음을 의미하는 서열 끊김을 가리키는 반면, ": ", "." 또는 공간은 각각 주어진 서열 위치에서 서열들에 걸친 보존적, 보통의, 또는 매우 상이한 아미노산 돌연변이를 지칭한다.
GGGSGGGS(서열번호 5)의 단축된 링커를 사용하여 서열번호 13의 SP/RBD 단편을 서열번호 6의 인간 IgG1 Fc 단편에 연결하였다. 생성된 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질을 하기에 나타낸다.
RVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSGGGSGGGSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(서열번호 19)
서열번호 19의 Fc 융합 단백질을 실시예 2에 따라 일시적으로 형질감염된 CHO 세포에서 재조합적으로 제조하고 실시예 5에 따라 정제하였다. 예에서, 서열번호 19의 융합 단백질 구성물은 실시예 6에 따라 확인되었으며, 실시예 7에 따라 서열 동정을 수행하였다. 제조된 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질의 동종이량체 역가를 획득하기 위해서, 동종이량체%를 실시예 8에 따라 측정하고, 동종이량체%에 재조합으로 제조된 융합 단백질의 단백질 역가를 곱하여 동종이량체 역가를 계산하였다. 서열번호 19의 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질의 동종이량체 역가는 204 ㎎/L인 것으로 계산되었다.
서열번호 19의 Fc 융합 단백질을 실시예 3에 따라 안정하게 형질감염된 CHO 세포에서 재조합적으로 제조하였다. 서열번호 19의 융합 단백질을 실시예 5에 따라 정제하였다. 예에서, 서열번호 19의 융합 단백질 구성물은 실시예 6에 따라 확인되었으며, 실시예 7에 따라 서열 동정을 수행하였다. 제조된 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질의 동종이량체 역가를 획득하기 위해서, 동종이량체%를 실시예 8에 따라 측정하고, 동종이량체%에 재조합으로 제조된 융합 단백질의 단백질 역가를 곱하여 동종이량체 역가를 계산하였다. 서열번호 19의 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질의 동종이량체 역가는 750 ㎎/L인 것으로 계산되었다.
실시예 3에 따라 CHO 세포에서 제조된 서열번호 19의 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질의 Fc(감마) 수용체 I 결합을 실시예 9에 따라 측정한다. 실시예 16에 기재되고 도 19, 도 20, 도 21, 도 22 및 도 23에 도시된 바와 같이 인간 Fc(감마) 수용체 I, (감마) 수용체 IIA, Fc(감마) 수용체 IIB, Fc(감마) 수용체 III, FcRn 및 ACE2 수용체 결합의 OD450 정도는 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질의 농도의 함수로서 증가할 것으로 예상된다.
서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 14 및 서열번호 15의 SP/RBD 도메인의 나란한 비교를 Clustal Omega를 사용하여 수행하였으며 도 80에 나타낸다. "*"는 주어진 서열 위치에서 모든 서열에 걸쳐 완전한 상동성을 나타낸다. ":"(콜론)은 Gonnet PAM 250 매트릭스에서 0.5를 초과하는 점수로 매우 유사한 특성의 그룹 간의 보존을 가리킨다. "-"(대시)는 특정한 서열 범위내의 특정한 비교 세트내에 국소적인 상동성이 존재하지 않음을 의미하는 서열 끊김을 가리키는 반면, ": ", "." 또는 공간은 각각 주어진 서열 위치에서 서열들에 걸친 보존적, 보통의, 또는 매우 상이한 아미노산 돌연변이를 지칭한다.
1차 백신으로서 사용하기 위한 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질
SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질은 1차 백신으로 사용될 수 있다. 하나 이상의 구현예에서, SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질은 약학 조성물로 제공된다. 어떤 단백질이든 주입하면 면역 반응을 유발할 수 있으며, 그 크기와 유형은 각 면역 시스템의 "상태"에 크게 의존한다. 예를 들어, 자기 Ag에 대한 외래 항원(Ag)의 주입은 중추 및 말초 내성 기전을 유지하는 면역계에서 더 큰 면역 반응을 유도할 것이다. 더욱이, 각각의 Ag에 대한 이전 노출(예를 들어, 바이러스 감염)에 대해 프라이밍된 면역계에 대한 외래 Ag 투여는, Ag-나이브 시스템의 면역 반응에 비해 더 빠르고 상승된 면역 반응을 일으킬 것이다. 이러한 프라이밍의 면역학적 근거는 두 가지이다: 1) Ag-나이브 면역계는 Ag-프라이밍된 면역계의 Ag-프라이밍된 "기억" 세포보다 활성화 임계값이 훨씬 높은 나이브 B 및 T 림프구를 가지고 있으며, 따라서 Ag를 제시하는 항원 제시 세포(APC)는 프라이밍된 기억 T 세포를 활성화하기 위해 훨씬 적은 Ag를 필요로 하고, 2) Ag 프라이밍 노출 동안 기억 T 세포의 확장으로 인해, 주입된 Ag에 재-노출시 본질적으로 더 많은 수의 이와 같은 세포가 존재한다. 우세한 APC는 T 세포 Ag 수용체에, 표면의 주요 조직적합성 복합체(MHC) 분자와 복합체로 Ag를 제시하는 수지상 세포(DC) 및 대식세포라는 점에 유의한다.
APC는 Ag에 대한 반응의 "크기"와 "유형" 모두에 영향을 미칠 수 있다. B 세포는 체액 면역(항체 생산)에 의해 직접 면역 반응에 참여하고 T 세포에 항원을 선택적으로 포착하여 제시하는 특정 APC로서 T 세포 면역 반응에도 참여한다. 이러한 기능은 모두 특정 항원에 특이적으로 결합하는 본질적으로 막 결합된 항체인 표면 B 세포 수용체(BCR)의 활성화를 통해 달성된다. 특정 항원을 포함하는 Fc-융합 동종이량체와 같은 다가의 용해성 항원은 BCR에 의해 인식되어 활성화될 수 있다. 따라서 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 단백질 동종이량체는 항원 특이적 BCR 활성화를 통해 B 세포를 활성화하여 항체 생산을 증가시킬 뿐만 아니라 RBD에 대해 특이적으로 지시된 T 세포 활성을 증가시킬 수 있다. 따라서, 이들 융합 단백질은 투여 후 체액성 및 세포성 면역을 모두 활성화시킨다. 보다 구체적으로, 유도된 Th1형(세포) 면역은 이미 바이러스에 감염되어 있는 세포를 표적으로 하는 세포독성 T 세포, NK 세포 및 대식세포와 같은 신체의 세포 사멸 기구를 활성화한다. 동시에 Th2형 면역에서 T 헬퍼 세포는 B 세포를 자극하여 증식하고 항원 특이적 항체를 분비하는 형질 세포로 분화한다. 이 항체는, 항체가 감염된 세포의 표면에 제시된 항원에 결합하고 NK 세포가 그들을 파괴하도록 지시할 때 발생하는 항체 유도 세포 독성(ADC)에 의한 감염을 제어하는 데 도움이 된다. 항체는 또한 세포와의 상호작용을 방지하고 궁극적으로 Fc 유도 식균작용(phagocytosis)을 통해 바이러스를 제거함으로써 바이러스에 결합하고 바이러스를 중화하는 데 도움이 된다.
항원보강제
일부 예에서 Th1 세포 반응은 대부분의 바이러스 및 세균 감염을 제거하는 데 필요하며, 여기서 바이러스 유사 또는 세균 유사 물질(실제로는 Ag가 아님)은 APC를 조건화하여 Ag 제시 중, T 세포가 Th1 유형이 되도록 구동하는 주요 사이토카인 및 표면 공동 자극 분자를 발현시킨다. 실제로, 이러한 APC 활성화는 항원보강제라고 하는 다수의 면역 강화 물질의 개념적 기초이다. 백신 항원보강제의 일반적인 기전은 도 18에 예시되어 있다. 우세한 APC는 T 세포 Ag 수용체에, 표면의 주요 조직적합성 복합체(MHC) 분자와 복합체로 Ag를 제시하는 수지상 세포(DC) 및 대식세포라는 점에 유의하시오(도 1). 이러한 APC는 Ag에 대한 반응의 "크기"와 "유형" 모두에 영향을 미칠 수 있다. 일부 항원보강제는 면역계가, 주사된 백신 Ag가 진행 중인 감염의 일부인 것처럼 상기 Ag에 반응하게 속이도록 설계되었다(즉, 감염원이 이러한 천연 바이러스 또는 세균성 항원보강제 물질을 제공한다). 따라서, 항원보강제는 각각의 감염을 효과적으로 제거하기 위해 Th1 반응으로의 발달을 형성하는 것 외에도 나이브 T 세포의 높은 활성화 한계를 극복하는 데 필요한 더 큰 Ag 제시 기능을 위해 APC를 활성화한다. 이러한 T 세포는 각각의 Ag에 특이적으로 결합하여 Ag 특이적 항체(Ab) 역가를 생산하는 B 세포에 중요한 도움을 제공한다(도 12).
1차 백신으로 사용되는 Fc 융합 단백질은 표적 대상체에서 면역 반응을 향상시키거나 달리 변경하기 위해 항원보강제와 공-투여될 수 있다. 항원보강제는 각각의 감염을 효과적으로 제거하기 위해 Th1 반응으로의 발달을 형성하는 것 외에도 나이브 T 세포의 높은 활성화 한계를 극복하는 데 필요한 더 큰 Ag 제시 기능을 위해 APC를 활성화한다. 예에서, 항-SARS-CoV-2 항체의 유도를 향상시키기 위해 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질의 약학 조성물에 공지된 항원보강제가 사용될 수 있다. 공지된 항원보강제는 인간 임상 연구에서 지난 10년 동안 3가 또는 1가 인플루엔자 백신, 대유행 H1N1, H5N1 및 SARS-CoV 백신을 포함하는 호흡기 바이러스 감염에 사용된 항원보강제를 포함한다.
본원에 개시된 약학 조성물에 사용될 수 있는 항원보강제의 예는 비제한적으로, 수중 유적형, 비결정성 알루미늄 하이드록시포스페이트 설페이트(AAHS), 알루미늄 하이드록사이드, 알루미늄 포스페이트, 칼륨 알루미늄 설페이트(알룸), 프로인트 항원보강제(완전 및/또는 불완전), 스쿠알렌, AS02, AS03, AS04, MF59, AS01B, QS-21, CpG 1018, ISCOMS, Montanide™ ISA-51, Montanide™ ISA-720, 폴리락티드 코-글리콜라이드(PLG), 모노포스포릴 지질 A (MPL), Detox, AGP [RC-529], DC_Chol, OM-174(지질 A 유도체), CpG 동기(면역자극 CpG 동기를 함유하는 합성 올리고뉴클레오티드), 변형된 LT 및 CT, hGM-CSF, hIL-12, Immudaptin, 금 입자와 같은 불활성 비히클 뿐만 아니라 Advax(호주)와 같은 출처로부터의 다양한 실험 항원보강제, 예를 들어 AddaVax(Invivogen) 또는 다른 Advax-기반 백신 항원보강제를 포함한다.
일부 예에서, 선택된 항원보강제는 MF59(Novartis) 및 AS-03(GlaxoSmithKline)일 수 있다. MF59(Novartis)의 맞춤형 제형 또는 AddaVax(Invivogen) 또는 Vaxine Pvt Ltd.(호주)의 기타 Advax 기반 백신 항원보강제와 같은 균등물을 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질의 약학 조성물에 사용할 수 있다. 바람직한 구현예에서, SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질은 표적 대상체에서 면역 반응을 향상시키거나 달리 변경하기 위해 Montanide™ ISA-720 항원보강제와 공-투여된다. 호흡기 바이러스 감염에 사용되는 다양한 항원보강제는 계절성 3가 독감 백신과 호주의 대유행 H1N1 및 H5N1 백신(Protein Sciences)과 최근 미국의 Sanofi Pasteur가 수행한 NIH 지원 인간 인플루엔자 백신 시험에서 광범위하게 시험되었으며 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질의 약학 조성물에 사용될 수 있다.
하나 이상의 구현예에서, SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질 제형은 투여를 위해 현장에서 제조된다. 하나의 측면에서, SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질은 멸균 혼합 조건 하에 현장에서 항원보강제와 혼합된다. 하나의 측면에서, SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질 및 항원보강제를 완전히 혼합 및/또는 유화시켜 대상체에 투여하기 위한 균질한 유화액을 제조한다. Fc 융합 단백질의 항원보강제 첨가된 제형 또는 이의 약학 조성물은 피하(s.c.) 주사 또는 근육내(i.m.) 주사에 의해 환자에게 투여되는데, 이는 s.c. 또는 i.m. 주사 부위가 피하 및 근육 내 공간에 더 많은 수지상 세포(DC)의 존재로 인해 강한 항체 반응을 유도할 가능성이 더 높기 때문이다.
항체 나이브 환자에게 본 개시내용의 예시적인 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질 또는 이의 약학 조성물 중 하나 이상의 치료제를 투여한 후, 항-SARS-CoV-2 항체를 실시예 11에 따라 측정하고 이의 중화 능력을 실시예 13에 따라 평가한다. 본 개시내용의 예시적인 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질 또는 이의 약학 조성물에 의한 이전의 항체 나이브 환자의 치료는 치료-후 추출된 혈청 중에 측정가능한 항-SARS-CoV-2 항체 역가를 유도할 것으로 예상된다.
상기 기재된 바와 같이, 일부 경우에, 실시예 11에 따라 측정된 항-SARS-CoV-2 항체 역가의 양 및/또는 실시예 13에 따라 측정된 항-SARS-CoV-2 항체 역가의 바이러스-중화 능력을 증가시키기 위해서 약학 조성물에 항원보강제를 사용하는 것이 유리할 수 있다. 항원보강제의 사용은 바이러스 또는 SP/RBD에 대한 기저 면역 반응을 갖지 않는 항체 나이브 환자에게 특히 유리할 수 있다. 더욱 또한, 항원보강제는 나이가 듦에 따라 면역 능력이 변하는, 소위 시간이 지남에 따라 면역계의 여러 수준에서의 변화의 결과인 면역노화를 경험하는 나이가 많은 피험자에게 유리할 수 있다. 일단 환자가 측정 가능한 항체를 갖게 되면, SARS-CoV-2 바이러스 재-공격시 환자는 COVID-19에 대한 자체 방어를 위해 매우 빠른 항-SARS-CoV-2 항체 발달을 보일 것이다.
마우스에서 평가된 1차 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 백신
본 개시내용의 예시적인 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질 또는 이의 약학 조성물의 효능을, 실시예 12의 과정에 따라 상이한 투여 전략을 사용하여 고역가 중화 AB 반응을 유도하는 능력에 대해 마우스 면역화 연구에서 초기에 평가하였다. BALB/c 마우스는 백신의 전임상 면역원성 평가에 광범위하게 사용된 관련 동물 모델이다. 이 계통은 항원보강된 및 항원보강되지 않은 백신 후보로 면역화될 때 강력한 Ab 반응을 생성한다. 또한, 관련 Ab 아이소타입 및 T 세포 반응(예를 들어, Th1 대 Th2 반응)을 포함하여 백신 접종에 대한 다양한 면역 반응의 동역학 및 특성을 평가하는 데 마우스 특이적 시약이 광범위하게 이용될 수 있다. 따라서 BALB/c 마우스 모델을 선택하여, Ag 용량, 항원보강제에 의한 강화, 투여 경로 및 최적의 Ab 반응을 달성하는 데 필요한 투여 빈도와 관련하여 SP/RBD-Fc 백신의 면역원성을 평가하였다.
간단히 말해서, 표적 마우스(예를 들어, BALB/c 마우스)에 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질(항원보강제가 있거나 없는) 또는 이의 약학 조성물을 소정의 간격(예를 들어 3주마다)으로 최대 3회까지 주사하고, 혈청을 규칙적인 간격으로 수집하였다. 실시예 10의 과정 또는 실시예 11의 과정에 따라 혈청 항-SARS-CoV-2 항체 역가를 측정하고 실시예 13에 따라 ACE2-SP/RBD 결합을 억제하는 효능을 평가하였다. 실험 변수에는 SARS- CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질 조성 및 용량 수준, 주사 횟수 및 항원보강제의 유형이 포함되었다.
실시예 17에 상세히 기재된 바와 같이, 서열번호 17의 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질의 1 내지 100 ㎍ 사이의 용량 수준이, 각각 도 25 및 도 26에 도시된 바와 같이 단일 주사 후 21일 및 2차 주사 후 14일째에 유의한 항-SP/RBD Ab 역가를 유도하는 것으로 나타났다. 1, 2, 3회 접종 후 1 ㎍에서 100 ㎍까지 다양한 용량 수준에 대한 동역학 반응, 즉 반응 지속기간은 도 27에 나타낸 바와 같이, 백신 접종 후 적어도 56일까지 모든 용량 수준에서 항-SP/RBD Ab 역가를 증가시키는 것으로 나타났다. 결과는 항-SP/RBD IgG Ab 역가 반응의 측정 가능한 증가가 각 용량 후 14일째에 관찰될 수 있고 SP/RBD IgG Ab 역가 반응이 모든 용량 수준에 대해 각 추가 용량으로 계속 증가하였음을 강조한다.
실시예 18에서, 중요하게도 서열번호 17의 항원보강제가 첨가되지 않은 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질의 Fc 단편이, 서열번호 2의 SP/RBD 단량체 Ag(Fc가 결여됨)가 21일째에 측정된 면역원성 반응과 관련하여 유효하지 않다는 사실에 의해 입증된 바와 같이, 유의한 항-SP/RBD IgG Ab 역가를 유도하는데 필요한 것으로 나타났다. Fc 단편을 포함하여 서열번호 17의 유도된 항-SP/RBD IgG Ab 역가가 도 28에 도시된 바와 같이 초기 용량 후 14일째에조차 거의 최대 역가에 도달한 반면, Fc 단편이 없는 서열번호 2의 SP/RBD 단량체 Ag는 21일 후에도 항-SP/RBD IgG Ab 역가 반응을 실질적으로 유도하지 않았다. Fc 모이어티의 이러한 21일째 효과는 상기가 여러 용량 수준에서 유지되었다는 점에서 매우 확고하다. 이러한 두 항원보강되지 않은 물질 사이의 면역원성의 차이는 융합 단백질 Ag의 Fc 모이어티의 상당한 "내장된 항원보강제" 능력을 입증한다.
이전에 논의된 바와 같이, 항원보강제는 각각의 감염을 효과적으로 제거하기 위해 Th1 반응으로의 발달을 형성하는 것 외에도, 나이브 T 세포의 높은 활성화 한계를 극복하는 데 필요한 더 큰 Ag-제시 능력을 위해 APC를 활성화한다. 실시예 19에서, 서열번호 17의 10 ㎍ 용량 수준의 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질을 함유하는 항원보강된 제형 중 일부(전부는 아님)가, 1차(21일째에 측정됨 - 도 29에 도시된 바와 같이), 2차(35일째에 측정됨 - 도 30에 도시된 바와 같이), 및 3차(56일째에 측정됨 - 도 31에 도시됨) 용량 후에 대략 3 내지 5배까지 면역원성을 향상시킨 것으로 나타났으며, 이는 항원보강제간에 일련의 유효도를 입증한다. 특히, 3차 용량 후 32일째에(즉, 도 32에 나타낸 바와 같이 88일째에 측정됨), 모든 제형에 의해 유도된 역가는 유의하게 상승된 상태를 유지하며, 이는 1차 주사후 3개월이 지난 후에도 서열번호 17의 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-융합 단백질에 대한 면역원성 반응이 지속됨을 입증한다.
ACE2-SP/RBD 결합의 억제 효능은 ACE2 결합의 50%가 혈청 샘플에 의해 달성된 희석의 역수를 나타내는 ID50 값으로 계산된다. 실시예 20에 기재된 바와 같이, ACE2-SP/RBD 결합의 유도된 억제 효능은 0일에 단일 주사 후 21일째에, 0일 및 21일에 주사 후 42일째에, 및 0일, 21일 및 42일에 주사 후 56일 및 88일째에 계산되었다. 서열번호 17의 3회 용량으로 면역화된 마우스로부터의 면역 혈청의 계산 된 ID50 값은, 억제 효능이 마지막 주사 후 32일까지 유지되는 반응을 나타내었다(도 36). 더욱이, MontanideTM ISA 720 항원보강제는 각 시점에서 일관되게 최고 효능을 유도하였다. MontanideTM ISA 720 결과는 이 항원보강제로 얻은 총 IgG 역가가 다른 항원보강제가 첨가된 제형에 비해 예외적으로 강력하지 않았다는 것을 고려할 때 특히 흥미롭고 놀라운 것이었으며, 따라서 이는 MontanideTM ISA 720으로 IgG 분자당 더 큰 고유 효능이 유도됨을 암시한다. 이들 데이터는 이 백신 개발 프로그램의 주요 항원보강제 후보로 Montanide™ ISA 720의 선택을 강하게 지지하였다.
60세가 넘는 개인은 COVID-19로 인해 더 높은 사망률과 함께 중증 질환에 더 취약한 것으로 밝혀졌다. 따라서, 면역계가 노령의 인간 성인의 노화 면역계에 대한 신뢰할 수 있는 모델인 노령 마우스에서 면역 반응을 유도하는 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질 제형의 능력을 평가하는 것이 중요하였다.
실시예 21의 과정에 따라, 8-10개월령의 BALB/c 마우스를 서열번호 17의 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질로 면역화시켰다. 생후 8개월 이후의 마우스에서 더욱 높은 자연 사망률로 인해, 대략 15마리의 마우스를 각 연구 그룹에 할당하였다. 서열번호 17의 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질의 10, 30 및 100 ㎍ 용량 수준은 항원보강제 없이 1차 용량(21일째에 측정), 2차 용량(35일째에 측정) 및 3차 용량(56일째에 측정) 후에 상당한 IgG 역가를 유도한 반면, 항원보강제는 도 37, 도 38 및 도 39에 예시된 바와 같이 서열번호 17의 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질 10 ㎍을 포함하는 제형에서 이러한 면역원성을 강하게 강화시켰다. 더 어린 마우스에서의 면역원성 프로파일과 유사하게, 항원보강제 Montanide™ ISA 720의 사용은 서열번호 17의 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질의 억제 효능(ID50)을, 56일째에 측정된 항원보강제 없이 얻은 수준에 비해 17배까지 극적이고 예기치 않게 향상시켰다. 더욱이, Montanide™ ISA 720으로 얻은 억제 효능(ID50)은 다시 다른 항원보강제보다 우수하였다. 중요하게는, 항원보강제의 존재 및 부재하에서 서열번호 17의 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질에 의해 유도된 이러한 억제 효능은 인간 회복기 혈청의 억제 효능보다 높았으며(도 33, 도 34, 도 35 및 도 36 참조), 이는 이러한 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질 백신의 유망한 효과를 입증한다.
종합적으로, 상기에 기재된 BALB/c 마우스의 결과는 서열번호 17의 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질이 ACE2에 대한 SARS-CoV-2 바이러스 SP/RBD 결합을 억제하는 상당한 가능성을 갖는 IgG 역가를 실질적으로 유도한다는 것을 입증하였다. 또한 Montanide™ ISA 720을 이용한 면역화가 가장 큰 억제 효능을 보였고 이것이 인간에서의 반응원성 감소를 위해 제형화되었기 때문에, 상기가 추가 평가를 위한 주요 개발 후보 항원보강제로 선택되었다.
유사한 연구를, 서열번호 19의 더 높은 수율의 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질을 사용하여 수행하였다. 실시예 22에 보다 상세히 기재된 바와 같이, 서열번호 19의 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질은 실시예 11의 개선된 ELISA 포맷에 따라 측정된 바와 같이 항원보강제의 부재하에 1 ㎍ 및 10 ㎍ 용량 수준에서 마우스에서 상당한 IgG 역가를 유도하였고, 이는 상술한 서열번호 17의 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질의 면역원성 프로파일과 일치하였으며, 이는 1차(14일째) 및 2차(35일째) 용량 후 2개의 용량 수준 사이에서 현저한 용량-반응을 나타내었다(도 40 , 도 41 및 도 42). 예상한 바와 같이, 상이한 항원보강제로 제형화된 서열번호 19의 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질은 실시예 22에 따라 측정된 바와 같이, 각 용량 후 항원보강제 부재하의 경우에 비해 실질적으로 더 높은 역가를 유도하였고(1차 및 2차 용량 후 ~3 내지 10배), Montanide™ ISA 720은 유효도가 각 용량 후 Ad-Vax-2의 효과와 유사하였지만, Montanide™ ISA 51은 덜 효과적이었다. 또한, 서열번호 19의 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질은 실시예 23에 따라 측정된 바와 같이, 강한 ACE2-SP/RBD 억제 효능(ID50 값)을 유도하였고 이는 각 용량 후에 인간 회복기 혈청의 것보다 상당히 높았다(도 43, 도 44 및 도 45). Montanide™ ISA 720은 3차 용량 후에 가장 높은 효능을 달성한 것에 유의한다.
실시예 24는 모든 항원보강제와 함께 서열번호 19의 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질이, Montanide™ ISA 720이 모든 시점에서 지속적으로 강력한 향상을 나타내는 유의미한 Th1-촉진된 IgG2a, IgG2b 및 IgG3 아이소타입 역가를 유도함을 확인하였다(도 48, 도 49 및 도 50). 또한, Th2-촉진된 아이소타입, IgG1 역가는 Th1-연관 아이소타입보다 대략 10배 적었다(도 47). 이러한 결과는 Montanide™ ISA 720 항원보강제가 서열번호 19와 함께 전달될 때, 특히 Th1 반응으로의 목적하는 이동을 촉진함으로써 강력한 강화 효과를 유지하였음을 입증하며, 이는 이의 용량-절약 특징 및 임상적 선두 항원보강제로서의 선택을 지지한다.
SP/RBD-Fc 융합 단백질 백신의 면역원성에 대한 기여에서 Fc 단편의 역할을, 마우스에서 인간 IgG Fc 구성물의 사용이 효능에 어떻게 영향을 미칠 수 있는지 이해하려고 시도함으로써 마우스에서 추가로 조사하였다. 마우스 IgG2a는 인간 IgG1의 기능적 유사체이다. 실시예 25에 기재된 실험은 i) Fc 종 불합치가 SP/RBD-Fc 융합 단백질의 근본적인 면역원성의 원인일 수 있는지의 여부 및 ii) 동물 모델에서 인간 IgG Fc 구성물로부터의 결과가 인간에서의 성능을 예측하는 데 적합한 지의 여부를 결정하는 것을 목적으로 한다.
항원보강제 없이 서열번호 19(인간 Fc) 및 마우스 IgG2a를 포함하는 쥐 Fc를 포함하는 서열번호 23을 사용한 면역화는, 1차 또는 2차 용량 후 14일째(즉, 도 51에 도시된 바와 같이 14일째 및 도 52에 도시된 바와 같이 35일째)에 항-SP/RBD IgG Ab 역가의 유도에 그다지 차이를 나타내지 않았으며, 이는 인간 Fc 항원성 서열이 BALB/c 마우스 면역원성 모델에서 고유의 마우스 Fc 서열과 어떠한 차이도 없이 수행됨을 입증한다. 더욱 또한, 항원보강제 없이 서열번호 19 및 서열번호 23을 사용한 면역화는 1차 또는 2차 용량 후 14일째(즉, 도 53에 도시된 바와 같이 14일째 및 도 54에 도시된 바와 같이 35일째)에 ACE2-SP/RBD 결합 억제 효능에서 유의한 차이를 나타내지 않았으며, 이는 인간 Fc 항원성 서열이 BALB/c 마우스 면역원성 모델에서 고유의 마우스 Fc 서열과 어떠한 차이도 없이 수행됨을 입증한다. 서열번호 19 및 서열번호 23 둘 다 단 1회 용량 후에도 인간 회복기 혈청(HCS)보다 더 큰 ACE2-SP/RBD 결합 억제 효능을 나타내었다. SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질의 마우스 버전(서열번호 23)이 네이키드 SP/RBD 단백질(서열번호 2)에 비해 마우스에서 향상된 면역원성을 나타낸다는 점을 감안할 때, 인간 버전이 인간에서 강화된 면역원성을 나타낼 가능성이 매우 높다.
이러한 번역 연구를 진행함에 있어서, 실시예 15의 과정에 따르고 도 46에 도시된 바와 같은 플라크 감소 중화 시험(PRNT)에서 생 VERO-E6 세포를 감염시키는 생 SARS-CoV-2 바이러스의 중화를 통해, 재조합 ACE2 및 SP/RBD의 생화학적 상호작용을 방해하는 상기 억제 효능이 확인되었다.
냉장 온도 또는 실온에서 백신을 보관 및/또는 운송하는 능력은 특히 정교한 저온 유통 운송 및 저장 인프라가 부족한 국가에서 백신의 효과적인 유통에 매우 중요하다. 실시예 26은 서열번호 19/ISA 720 유화액의 신선하게 제조된 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질의 SP/RBD IgG Ab 역가 반응을 생성하는 효과를 제조 후 1일 및 7일 동안 4℃ 및 25℃에서 보관된 동일한 유화액과 비교한 생체내 연구를 기재한다.
실시예 13에 기재된 ACE2 결합 억제 분석의 결과는, 서열번호 19의 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질이 1일 및 7일 동안 4℃ 및 25℃에서 보관된 동일한 유화액에 대해, 신선하게 제조된 유화액 주사 후 마우스의 혈청에서 유사한 억제 효능(ID50 값)을 유도함을 입증하였다. 도 55에 도시된 바와 같이, 신선하게 제조된 유화액을 주사한 동물 대 임의의 숙성된 유화액 간에 ID50 값에서 유의한 차이가 없다(p>0.05).
항원보강제 Montanide™ ISA 720을 갖는 서열번호 19의 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질 백신이 SARS-CoV-2 바이러스의 변종에 대해 유효한지 이해하려는 시도에서, UK N501Y 바이러스 변종(서열번호 24) 및 남아프리카 E484K 바이러스 변종(서열번호 25)의 유사체 RBD 단편을 2회 용량의, 항원보강제, Montanide™ ISA 720을 포함하는 서열번호 19의 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질 백신과 함께 실시예 22에 따라 면역화된 마우스로부터의 56일째 혈청 샘플을 사용하여 분석하였다. 도 66은 Clustal Omega를 사용하여 수행된, 서열번호 2의 SARS-CoV-2 고유 RBD와 UK N501Y 바이러스 변종(서열번호 24) 및 남아프리카 E484K 바이러스 변종(서열번호 25)의 유사체 RBD 단편의 나란한 비교를 도시하며, 여기서 "*"는 주어진 서열 위치에서 모든 서열에 걸쳐 완전한 상동성을 나타낸다. ":"(콜론)은 Gonnet PAM 250 매트릭스에서 0.5를 초과하는 점수로 매우 유사한 특성의 그룹 간의 보존을 가리킨다. "-"(대시)는 특정한 서열 범위내의 특정한 비교 세트내에 국소적인 상동성이 존재하지 않음을 의미하는 서열 끊김을 가리킨다.
혈청 샘플을 플라스틱-결합된 재조합 RBD 야생형(Lake Pharma, Worcester, MA) 또는 돌연변이 N501Y(UK 변종, Sino Biological, Wayne, PA에서 제공) 또는 E484K(남아프리카 변종, AcroBiosystems, Newark, DE에서 제공)에 추가하였다. 결합된 RBD-특이적 IgG는 표지된 항-마우스 IgG 2차 항체로 검출되었고 IgG ㎍/㎖ 역가 값은 마우스 ELISA 참조 혈청 표준 곡선을 통해 측정되었다. 도 65에 도시된 결과는 마우스로부터의 이러한 면역 혈청이 재조합 RBD 돌연변이체, N501Y 및 E484K뿐만 아니라 야생형 RBD 분자 또는 그 이상에 결합함을 보여주며, 이는 UK(N501Y) 및 남아프리카(E484K) 바이러스 변종이 서열번호 19 유도된 면역을 탈출할 가능성이 없음을 나타낸다.
비-인간 영장류에서 평가된 1차 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 백신
SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질 면역원성 결과를 마우스에서 인간 임상 연구로 번역하기 위해서, Montanide™ ISA 720으로 제형화된 서열번호 19의 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질을 실시예 27 및 실시예 28에 따라, 보다 유전적으로 관련된 NHP 종인 키노몰구스 원숭이에서 시험하였다. Montanide™ ISA 720으로 제형화된 10 ㎍ 및 30 ㎍ 용량 수준의 서열번호 19의 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질은 실시예 11에 따라 측정된 바와 같이 IgG 역가를 효능있게 유도하였으며, 여기서 30 ㎍ 용량 수준이 1차 및 2차 용량 후 모든 시점에서 10 ㎍ 용량 수준보다 더 큰 면역원성을 나타내었다(도 60). 더욱 또한, 이러한 IgG 역가 면역원성 프로파일은 실시예 13에 따라 측정된 바와 같이 10 ㎍ 및 30 ㎍ 용량 수준 모두에 대해 인간 회복기 혈청의 효능(도 61)을 훨씬 능가하는 ACE2-SP/RBD 결합 억제 효능과 일치하였다. 이러한 번역 연구를 진행하면서, 실시예 28의 과정에 따르고 도 62에 도시된 플라크 감소 중화 시험(PRNT)에서 생 VERO-E6 세포를 감염시키는 생 SARS-CoV-2 바이러스의 중화로, 재조합 ACE2와 SP/RBD의 생화학적 상호작용을 방해하는 상기 억제 효능이 확인되었다. 이 결과는 NHP에서 백신접종을 시험하는 것의 가치를 입증하며 인간으로의 번역에 귀중한 지침을 제공한다.
항원보강제, Montanide™ ISA 720을 갖는 서열번호 19의 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질 백신이 SARS-CoV-2 바이러스의 변종에 대해 효과적임을 추가로 확인하기 위해서, 실시예 27에 따른 항원보강제, Montanide™ ISA와 함께 2회 용량의 서열번호 19의 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질 백신으로 면역화된 5개의 NHP로부터의 혈청 샘플을 42일째에 추출하고 상기 혈청 샘플을 플라스틱-결합된 재조합 RBD 야생형 또는 돌연변이 N501Y 또는 E484K에 가하였다. 도 64에 도시된 결과는 마우스 연구와 유사하게, NHP 및 마우스로부터의 면역 혈청이 재조합 RBD 돌연변이체, N501Y 및 E484K 뿐만 아니라 야생형 RBD 분자 또는 그 이상에 결합되었음을 예시한다.
서열번호 19 백신의 효능을 SARS-CoV-2의 붉은털 원숭이 챌린지(challenge) 모델을 사용하여 실시예 27의 면역화된 NHP에서 평가하였다. NHP의 2개 그룹(하나는 실시예 27에 따라 1회 백신접종 및 추가접종 주사가 투여되고, 다른 것은 나이브)을 0일에 SARS-CoV-2 바이러스로 챌린지시켰다. 챌린지 전 및 7일에 혈액을 수집하였다. 비강 면봉채취, 구강 면봉채취, 및 BAL 유체의 수집을 챌린지 전 및 2, 4 및 7일에 수행하였다. 종료 후 7일에 부검을 수행하였다.
Montanide™ ISA-720과 함께 서열번호 19로 면역화된 NHP는 두 분석 모두에 대해 무시할 수 있거나 감지할 수 없는 수준을 갖는 나이브 대조용 NHP와 비교하여, 바이러스 챌린지 직전에 유의한 항-SP/RBD IgG 역가 및 ACE2 억제 ID50 값을 나타내었다. 챌린지-후 비강 면봉채취물(도 78) 및 BAL 샘플(도 79)에서 SARS-CoV-2 바이러스 게놈(실시예 39) 및 서브게놈 RNA 역가(실시예 40)의 무시할만한 수준은 COVID-19에 대한 보호에서 백신의 효능을 입증한다. 낮은 서브게놈 RNA(sgRNA) 수는 이들이 복제 중간체이기 때문에 특히 고무적이며, 따라서 이들의 풍부성은 바이러스 복제 활성 및 숙주 감염의 중증도와 관련이 있다. 종합하면, 데이터는 Montanide™ ISA-720이 포함된 서열번호 19가 COVID-19로부터 보호하고 NHP에서 COVID-19 질병의 악화 위험이 없음을 결정적으로 입증한다.
토끼에서 평가된 1차 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 백신
실시예 30, 실시예 31, 실시예 32, 실시예 33 및 실시예 34에 더 상세히 기재된 바와 같이, 뉴질랜드 흰토끼를 사용한 전임상 GLP 독성학 IND-활성화 연구를 Sinclair Research, LLC(Auxvasse, MO)에서 수행하였다. 토끼를 사용했는데, 이 종은 강력한 Ab 반응을 일으키는 백신 유도 면역원성에 대한 전임상 연구에 광범위하게 사용되었기 때문이다. 또한 토끼는 SARS-CoV-2 바이러스 수용체인 ACE2를 발현하며, 이는 바이러스가 동물에 결합하여 동물을 감염시켜 인간 COVID-19 질병과 유사한 질병 증상을 유발시킨다.
실시예 31에 기재된 바와 같이, 1차, 2차 및 3차 주사 후 Montanide™ ISA-720 항원보강제와 함께 서열번호 19의 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질 30 ㎍ 및 100 ㎍의 용량 수준이 주사된 토끼에서 실질적인 특이적 IgG 역가가 유도되었다(도 70 및 도 71). 혈청 샘플을 또한 실시예 13에 기재된 바와 같이 기능적 억제 효능에 대해 평가하였다. 이 ACE2 억제 분석에서, 항원보강제가 첨가된 서열번호 19의 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질의 30 ㎍ 내지 100 ㎍ 용량 수준 사이의 억제 효능에서 명확한 용량 반응이 존재하였으며, 이는 2차 용량 후 14일째에 상승하고 유사하게 되었다(도 72). 두 시점에서의 효능 값은 인간 회복기 혈청에 대해 얻은 것보다 실질적으로 높았다. 이 억제 효능은 실시예 15의 과정에 따라 플라크 감소 중화 시험(PRNT)에서 생 VERO-E6 세포를 감염시키는 것으로부터 생 SARS-CoV-2 바이러스의 중화로 추가로 확인되었고 도 73에 도시되었다.
토끼에서 얻은 결과는 ISA 720 중에 유화된 서열번호 19의 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질이 COVID-19 감염 및 질병으로부터 회복된 인간에서 발견되는 수준에서 기능적 면역원성을 유도한다는 것을 입증하며, 이러한 독성학 결과를 깨끗한 안전성 프로파일에 대한 기대를 지지하는 임상 맥락에 더한다. 주요 연구 종료 시 시험 항목 관련 사망률 또는 기관 중량 변화는 관찰되지 않았다. 피브리노겐 증가와 같은 경미한 효과는, 투여 단계에서 Montanide™ ISA 720 항원보강제로 인한 것일 가능성이 가장 높으며 회복 단계에서 완화되었다. 예상되는 거시적 및 미시적 일시 주사 부위 AE 또한 항원보강제로 인한 듯 하다. 이 독성 연구에서 면역원성의 관련된 임상 수준을 고려할 때, 임상 시험으로의 이동에 대해 우려를 제기할만한 안전성 문제는 없다고 결론지었다.
피하(s.c.) 전달 경로와 비교하여 근육내(i.m.) 경로를 브릿징(bridging) 연구와 함께 실시예 33에 따라 평가하였다. 15일, 29일 및 36일째의 분석은 실시예 13에 따라 측정된 바와 같이 Montanide™ ISA 720 중의 서열번호 19의 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질(100 ㎍ 용량 수준)의 s.c.과 i.m. 투여간의 항-RBD Ab 역가(도 74) 또는 ACE2-억제 효능(도 75)에서 통계적으로 유의한 차이를 나타내지 않았으며, 이는 임상 시험에서 어느 한 투여 경로의 평가를 지지한다.
신선하게 제조된 유화액과 냉장 온도에서 24시간 동안 보관한 후 동일한 유화액 간의 차이를, 15일(1차 투여 후), 29일(2차 투여 후) 및 36일(3차 투여 후)에 측정된 ACE2-SP/RBD 결합 억제 효능(IC50) 결과(실시예 13에 따라 측정)에 대한 하위 그룹 연구를 사용하여 분석하였다. 다시, 마우스 면역원성 연구에 대해 상술한 바와 같이(실시예 26), 신선한 유화액과 보관된 유화액간에 억제 효능의 통계적 차이는 없었으며, 이는 항원보강제가 첨가된 서열번호 19 제형 성능이 도 76(피하 투여에 대해) 및 도 77(근육내 투여에 대해)에 도시된 바와 같이 제조 후 적어도 24시간 동안 안정함을 가리킨다.
추가접종 백신으로서 사용하기 위한 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질
예에서, SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질은 추가 백신으로 사용될 수 있다. 항체 역가를 증폭하기 위해서 SARS-CoV-2 항원에 대해 이미 낮지만 측정 가능한 항체 수준을 가진 대상체에게 융합 단백질을 투여하면 항바이러스 보호가 증가한다. SP/RBD 단편 변이체는 서열번호 2의 고유 SARS-CoV-2 SP/RBD와 비교하여 Fc 영역이 항원 체류 시간을 연장하는 동안 항원성을 최대화하도록 합성된다. 임의의 특정한 기전 이론에 얽매이고자 하는 것은 아니지만, 더 긴 생체내 체류 시간 동안 자연적으로 글리코실화된 인간 Fc 단편이 SARS-CoV-2 RBD 유사체 항원을 항원 제 세포(APC)에 제시할 것으로 여겨지며, 이는 SARS-CoV-2 RBD 항원에 대한 강한 면역 반응을 일으킬 것으로 예상된다. 구체적으로, APC는 Fc(감마) 수용체를 통해 SARS-CoV-2 RBD 항원을 내면화하고, 이어서 RBD 단편(도 12)을 처리하고 CD4+ Th 세포에 제시하며, 이는 차례로 B 세포 활성화 및 항-SARS-CoV-2 RBD IgG(즉, Ab) 생산을 촉진("도움")한다(도 12).
도 12에 상세히 기재된 바와 같이, 항원 제시 세포는 Fc-수용체 매개된 식균작용을 통해(예를 들어, 면역 세포에서 Fc(감마) 수용체에 결합하는 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질의 Fc 영역을 통해) 서열번호 19의 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질의 분자를 내면화할 수 있는 수지상 세포(DC), 단핵구 또는 대식세포일 수 있다. 예를 들어 DC의 하위집합(예를 들어 cDC2S)에 의한 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질의 Fc-매개된 흡수는 IL-10 및 IL-33의 분비를 통해 항-SARS-CoV-2 T 헬퍼 2(Th2) 세포의 발달을 촉진한다. 항-SARS-CoV-2 Th2 세포는 예를 들어 B 세포가 Th2 세포를 유인할 수 있도록 항원 수용체를 교차 연결함으로써 항 SARS-CoV-2 B 세포를 활성화한다. B-세포 항원 수용체(BCR) 매개된 흡수는 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질 분자의 SARS-CoV-2 RBD 단편에 결합하고, 이어서 상기 SARS-CoV-2 항원을 세포내 부위로 전달하고, 상기는 MHC 부류 II 분자에 결합된 펩티드로서 분해되어 B 세포 표면으로 되돌아간다. 펩티드 MCH 부류 II 복합체는 SARS-CoV-2-특이적인 헬퍼 T 세포에 의해 인식되어 단백질을 제조하도록 시뮬레이션하고, 차례로 B-세포가 증식하여 이의 자손을 항-SARS-CoV-2 항체를 분비하는 B 세포로 분화되게 할 수 있다. 서열번호 19의 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질은 Fc 단편의 존재로 인해 지연된 기간 동안 항원 생산 세포에 SARS-CoV-2 SP/RBD 단편을 직접 노출시킬 수 있다. 더욱 또한, 앞서 기재된 바와 같이, 서열번호 19에 따른 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질의 글리코실화된 Fc 단편은 상기 융합 단백질의 치료학적 또는 항원 부분에 대한 매우 강한 면역 반응을 유도할 것으로 예상된다. 이러한 특성은 조합되어 항바이러스 항체의 양을 상당히 증가시키는 동시에 필요한 면역 반응을 생산하는 데 필요한 항원의 양을 감소시킨다.
예에서, 서열번호 19, 서열번호 16, 서열번호 18, 서열번호 20 또는 서열번호 21의 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질 또는 이의 약학 조성물로의 환자의 치료를 포함하는 치료법은, 항체 역가 및 친화도를 증폭시키는 수단으로서 SARS-CoV-2에 이미 항체 양성인 COVID-19의 회복된 환자에게 추가 백신으로서 투여될 수 있으며, 따라서 이러한 치료를 받은 환자가 후속적으로 상기 바이러스에 직면했을 때 SARS-CoV-2 바이러스 감염 및/또는 상기 감염과 관련된 심각한 증상을 예방하기에 충분한 면역성을 갖게 될 것이다. 더욱 또한, 서열번호 19, 서열번호 16, 서열번호 18, 서열번호 20 또는 서열번호 21의 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질 또는 이의 약학 조성물로의 환자의 치료를 포함하는 치료법은, 항체 역가 및 구체적으로 SP/RBD에 대한 친화도를 증폭시키는 수단으로서 SARS-CoV-2 바이러스에 대한 백신으로 앞서 면역화된 대상체에게 추가 백신으로서 투여될 수 있다. 이와 같은 치료법은 백신이 100% 효과적이지 않거나 유도된 항체 역가가 시간이 지남에 따라 약해지는 경우에 중요하다. 예에서, 서열번호 19, 서열번호 16, 서열번호 18, 서열번호 20 또는 서열번호 21의 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질 또는 이의 약학 조성물을 환자에게 피하 주사(s.c.) 또는 근육내(i.m.) 주사에 의해 투여할 수 있는데, 이는 s.c. 또는 i.m. 주사 부위가, 상기 피하 및 근육내 공간에 더 많은 수지상 세포(DC)가 있기 때문에 강한 항체 반응을 유도할 가능성이 더 높기 때문이다.
마우스 및 NHP에서 평가된 추가접종 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 백신
추가접종 백신 사용의 효능을 실시예 12에 더 상세히 기재된 바와 같이 마우스에서 평가하였다. BALB/c 마우스에게 여러가지 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질 또는 이의 약학 조성물을 소정의 간격(예를 들어, 매 3주마다)으로 최대 3회 주사하였으며, 혈청을 규칙적인 간격으로 수집하였다. 실시예 10 또는 실시예 11의 과정에 따라 혈청 SARS-CoV-2 SP/RBD IgG 항체 역가를 측정하고, 실시예 13에 따라 이의 중화 능력을 평가하였다. 실험 변수로는 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질 조성 및 용량 수준, 주사 횟수 및 항원보강제의 유형이 포함된다. 면역화된 마우스를, 이의 항체 수준이 기준선/최소 수준으로 감소할 때까지 추가로 30-60일 동안 치료를 받지 않은 상태로 둔 다음 추가로 일련의 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질 또는 이의 약학 조성물 주사를 제공하여 회상(기억) 면역 반응을 평가할 수 있다.
추가접종으로서 MontanideTM ISA 720과 함께 서열번호 19의 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질의 사용에 대한 분석에서, NHP에 먼저 10 ㎍ 또는 30 ㎍ 용량의 융합 단백질을 주사하고, 혈청을 실시예 27에 기재된 바와 같이 규칙적인 간격으로 수집하였다. 항체 수준이 감소한 3개월 내지 4개월 반 후에, NHP에 30 ㎍ 용량 수준의 추가접종 백신을 주사하였다(3차 주사). 도 63에 도시된 바와 같이, 모든 경우에 추가접종 백신은 강한 기억 면역 반응을 촉발하였다.
Fc 융합 단백질 생산
구현예에서, 융합 단백질은 실시예 섹션에 더 상세히 기재된 바와 같이 세포에 의해 발현될 수 있다.
발현 및 정제
Fc 융합 단백질을, 예를 들어 진핵 세포, 예를 들어 포유동물 세포 또는 비포유동물 세포에서 재조합적으로 발현시킬 수 있다. 발현에 사용되는 예시적인 포유동물 세포는 HEK 세포(예를 들어, HEK293 세포) 또는 CHO 세포를 포함한다. CHO 세포는 다양한 균주 또는 하위부류(예를 들어, CHO DG44, CHO-M, CHO-SE™ 및 CHO-K1)로 세분될 수 있으며, 이러한 세포 균주 중 일부는 특정 유형의 핵산 분자(예를 들어, DNA를 포함하는 벡터) 또는 실시예 섹션에 기재된 바와 같은 특정 세포 성장 배지 조성물과 함께 최적의 사용을 위해 유전적으로 조작될 수 있다. 세포를 Fc 융합 단백질을 암호화하는 핵산 분자(예를 들어, 벡터)로 형질감염시킬 수 있다(예를 들어, 전체 Fc 융합 단백질이 단일 핵산 분자에 의해 암호화되는 경우). HEK293 세포를, Fc 융합 단백질을 암호화하는 벡터로 형질감염시킬 수 있지만, 이 과정은 숙주 세포가 인식가능한 수준의 Fc 융합 단백질 발현을 중단하기 전에 단지 일정 기간(예를 들어, 3일, 4일, 5일, 7일, 10일, 12일, 14일 또는 그 이상) 동안 Fc 융합 단백질의 일시적인 발현을 생성한다(즉, 일시적 형질감염). Fc 융합 단백질을 암호화하는 핵산 서열로 일시적으로 형질감염되는 HEK293 세포는 종종 다중 Fc 융합 단백질 후보의 제조 및 스크리닝을 용이하게 하는 재조합 단백질의 보다 신속한 생산을 가능하게 한다. 예에서, CHO-SE™(LakePharma, Belmont, CA) 세포는 Fc 융합 단백질을 암호화하는 벡터로 형질감염되지만, 이 과정은 숙주 세포가 인식가능한 수준의 Fc 융합 단백질 발현을 중단하기 전에 단지 일정 기간(예를 들어, 3일, 4일, 5일, 7일, 10일, 12일, 14일 또는 그 이상) 동안 Fc 융합 단백질의 일시적인 발현을 생성한다(즉, 일시적 형질감염). Fc 융합 단백질을 암호화하는 핵산 서열로 일시적으로 형질감염되는 CHO-SE™(LakePharma, Belmont, CA) 세포는 종종 다중 Fc 융합 단백질 후보의 제조 및 스크리닝을 용이하게 하는 재조합 단백질의 보다 신속한 생산을 가능하게 한다. CHO 세포를, 숙주 세포 DNA에 영구적으로 통합되고 세포가 적절하게 배양되는 한 Fc 융합 단백질의 일관되고 영구적인 발현(즉, 안정한 형질감염)을 유도하는 벡터로 형질감염시킬 수 있다. Fc 융합 단백질을 암호화하는 핵산으로 안정적으로 형질감염되는 CHO 세포 및 CHO 세포주는 종종 개발 시간이 더 오래 걸리지만, 종종 더 높은 단백질 수율을 생산하고 저비용 제품(예를 들어, 수의학 의약품 시장에 사용되는 제품)을 보다 더 잘 제조할 수 있게 한다. 세포와 세포주를 당해 분야의 표준 방법을 사용하여 배양할 수 있다.
예에서, Fc 융합 단백질을 (예를 들어, 세포의 용해에 의해) 세포로부터 정제하거나 단리할 수 있다. Fc 융합 단백질은 세포에 의해 분비되며, 세포가 성장한 세포 배양 배지로부터 정제 또는 단리될 수 있다. Fc 융합 단백질의 정제는 컬럼 크로마토그래피(예를 들어, 친화성 크로마토그래피)를 사용하거나 특정 분자에 대한 크기, 전하 및/또는 친화도의 차이를 기반으로 하는 다른 분리 방법을 사용하는 것을 포함할 수 있다. Fc 융합 단백질의 정제는 예를 들어, Fc 단편을 함유하는 단백질이 중성 용액 pH에서 단백질 A 비드에 공유 접합된 단백질 A에 높은 친화도로 결합되도록 하는 단백질 A 비드 또는 단백질 A 컬럼을 사용하여, Fc 단편을 함유하는 단백질을 선택하거나 농축하는 것을 포함한다. 이어서 상기 결합된 Fc 융합 단백질을 용액 변수의 변화(예를 들어, 용액 pH의 감소)에 의해 단백질 A 비드로부터 용출시킬 수 있다. 이온 교환 크로마토그래피 및/또는 겔 여과 크로마토그래피와 같은 다른 분리 방법도 대안적으로 또는 추가로 사용될 수 있다. Fc 융합 단백질의 정제는 단백질 제제의 여과 또는 원심분리, 정용여과, 한외여과, 및 다양한 크기의 다공성 막을 통한 여과뿐만 아니라 부형제를 사용한 최종 제형화를 추가로 포함할 수 있다.
정제된 Fc 융합 단백질을 다양한 방법, 예를 들어 280 ㎚에서의 흡광도(예를 들어, 단백질 수율을 측정하기 위해), 크기 배제 또는 모세관 전기영동(예를 들어, 분자량, 퍼센트 응집 및/또는 순도를 측정하기 위해), 질량 분석법(MS) 및/또는 액체 크로마토그래피(LC-MS)(예를 들어, 순도 및/또는 글리코실화를 측정하기 위해), 및/또는 ELISA(예를 들어, SARS-CoV-2 항체 또는 ACE2에 대한 결합, 예를 들어 친화도의 정도를 측정하기 위해)를 사용하여, 예를 들어 순도, 단백질 수율, 구조 및/또는 활성에 대해 특성화할 수 있다. 특성화의 예시적인 방법은 또한 실시예 섹션에 기재되어 있다.
일시적으로 형질감염된 HEK 세포 및 단백질 A 정제에서 생산 후 Fc 융합 단백질의 단백질 수율은 5 ㎎/L, 10 ㎎/L, 또는 20 ㎎/L, 또는 보다 바람직하게는 50 ㎎/L 초과(예를 들어, 60 ㎎/L 초과, 70 ㎎/L 초과, 80 ㎎/L 초과, 90 ㎎/L 초과, 100 ㎎/L 초과)일 수 있다. 일시적으로 형질감염된 HEK 세포 및 단백질 A 정제에서 생산 후 Fc 융합 단백질의 동종이량체%는 70% 초과(예를 들어, 80% 초과, 85% 초과, 90% 초과, 95% 초과, 96% 초과, 97% 초과, 98% 초과, 99% 초과)이다. Fc 융합 단백질 수율과 동종이량체% 사이의 곱으로서 계산된, 일시적으로 형질감염된 HEK 세포 및 단백질 A 정제에서 생산 후의 Fc 융합 단백질의 동종이량체 역가는 50 ㎎/L 초과(예를 들어, 60 ㎎/L 초과, 70 ㎎/L 초과, 80 ㎎/L 초과, 90 ㎎/L 초과, 100 ㎎/L 초과)일 수 있다.
예에서, 일시적으로 형질감염된 CHO-SE™(LakePharma, Belmont, CA) 세포 및 단백질 A 정제에서 생산 후 Fc 융합 단백질의 단백질 수율은 5 ㎎/L 또는 10 ㎎/L 초과이다. 바람직한 구현예에서, 일시적으로 형질감염된 CHO-SE™(LakePharma, Belmont, CA) 세포 및 단백질 A 정제에서 생산 후 Fc 융합 단백질의 단백질 수율은 20 ㎎/L 초과(예를 들어, 30 ㎎/L 초과, 40 ㎎/L 초과, 50 ㎎/L 초과, 60 ㎎/L 초과, 70 ㎎/L 초과, 80 ㎎/L 초과, 90 ㎎/L 초과, 100 ㎎/L 초과)이다. 일시적으로 형질감염된 CHO-SE™(LakePharma, Belmont, CA) 세포 및 단백질 A 정제에서 생산 후 Fc 융합 단백질의 동종이량체%는 70% 초과(예를 들어, 80% 초과, 85% 초과, 90% 초과, 95% 초과, 96% 초과, 97% 초과, 98% 초과, 99% 초과)일 수 있다. 구현예에서, Fc 융합 단백질 수율과 동종이량체% 간의 곱으로 계산된, 일시적으로 형질감염된 CHO-SE™(LakePharma, Belmont, CA) 세포 및 단백질 A 정제에서 생산 후 Fc 융합 단백질의 동종이량체 역가는 20 ㎎/L 초과(예를 들어, 30 ㎎/L 초과, 40 ㎎/L 초과, 50 ㎎/L 초과, 60 ㎎/L 초과, 70 ㎎/L 초과, 80 ㎎/L 초과, 90 ㎎/L 초과, 100 ㎎/L 초과)이다.
안정적으로 형질감염된 CHO 세포(예를 들어, CHO 세포주 또는 CHO 세포 클론) 및 단백질 A 정제에서 생산 후 Fc 융합 단백질의 단백질 수율은 L당 100 ㎎ 초과의 Fc 융합 단백질(예를 들어, ㎎/L의 배양 배지)일 수 있다. 구현예에서, 안정적으로 형질감염된 CHO 세포(예를 들어, CHO 세포주 또는 CHO 세포 클론) 및 단백질 A 정제에서 생산 후 Fc 융합 단백질의 단백질 수율은 50 ㎎ 초과의 Fc 융합 단백질/배양 배지 L(예를 들어, 100 ㎎/L 초과, 200 ㎎/L 초과, 300 ㎎/L 초과, 400 ㎎/L 초과, 500 ㎎/L 초과, 600 ㎎/L 초과 또는 그 이상)이다. 안정적으로 형질감염된 CHO 세포(예를 들어, CHO 세포주 또는 CHO 세포 클론) 및 단백질 A 정제에서 생산 후 Fc 융합 단백질의 동종이량체%는 70% 초과(예를 들어, 80% 초과, 85% 초과, 90% 초과, 95% 초과, 96% 초과, 97% 초과, 98% 초과, 99% 초과)일 수 있다. 구현예에서, Fc 융합 단백질 수율과 동종이량체% 간의 곱으로 계산된, 안정적으로 형질감염된 CHO 세포(예를 들어, CHO 세포주 또는 CHO 세포 클론) 및 단백질 A 정제에서의 생산 후의 Fc 융합 단백질의 동종이량체 역가는 150 ㎎/L 초과(예를 들어, 200 ㎎/L 초과, 300 ㎎/L 초과, 400 ㎎/L 초과, 500 ㎎/L 초과, 600 ㎎/L 초과)이다.
약학 조성물 및 투여 경로
약학 조성물 중 Fc 융합 단백질의 양 및 농도뿐만 아니라 대상체에게 투여되는 약학 조성물의 양을, 임상적으로 관련된 인자, 예를 들어 대상체의 의학적으로 관련된 특징(예를 들어, 연령, 체중, 성별, 기타 의학적 상태 등), 약학 조성물 중 화합물의 용해도, 화합물의 효능 및 활성, 및 약학 조성물의 투여 방식을 기반으로 선택할 수 있다.
본 개시내용의 제형은 비경구 투여에 적합한 제형을 포함한다. 본원에 사용된 "비경구 투여" 및 "비경구적으로 투여된"이라는 문구는 경장 및 국소 투여 이외의 투여 방식, 대개 정맥 주사, 근육 주사 또는 피하 주사에 의한 투여 방식을 의미한다.
본 개시내용의 약학 조성물에 사용될 수 있는 적합한 수성 및 비-수성 담체의 예는 수, 염수(saline), 에탄올, 염, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 등) 및 이들의 적합한 혼합물, 올리브 오일과 같은 식물성 오일, 및 에틸 올레이트와 같은 주사가능한 유기 에스테르, 칼륨 및/또는 나트륨 포스페이트와 같은 완충제, 염산 및/또는 수산화 나트륨과 같은 pH 완충제 등을 포함한다. 적합한 유동성은 예를 들어 코팅 또는 유화제 물질, 예를 들어 레시틴의 사용, 분산의 경우 필요한 입자 크기의 유지, 및 계면활성제, 예를 들어 트윈-유사 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 일부 예에서, 약학 조성물(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은)은 트윈-유사 계면활성제, 예를 들어 폴리소르베이트-20, 트윈-20 또는 트윈-80을 포함한다. 일부 예에서, 약학 조성물(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은)은 트윈-유사 계면활성제, 예를 들어 트윈-80을, 약 0.001% 내지 약 2% 농도 또는 약 0.005% 내지 약 0.1%, 또는 약 0.01% 내지 약 0.5%의 농도로 포함한다.
Fc 융합 단백질은 일시주사, 주입 또는 정맥내 푸시(intravenous push)로 투여되거나, 또는 주사기 주사, 펌프, 펜, 바늘 또는 유치 카테터를 통해 투여될 수 있다. Fc 융합 단백질은 피하 일시 주사에 의해 투여될 수 있다. 예에서, Fc 융합 단백질 또는 이의 약학 조성물은 피하 주사(s.c.) 또는 근육내(i.m.)에 의해 환자에게 투여되는데, 이는 s.c. 또는 i.m. 주사 부위가, 피하 및 근육내 공간 중에 보다 많은 수지상 세포(DC)가 존재함으로 인해 강한 항체 반응을 유도할 가능성이 더 크기 때문이다. 도입 방법은 또한 충전식 또는 생분해성 장치에 의해 제공될 수 있다. 단백질성 생물약제를 포함하여, 약물의 조절된 전달을 위해 최근 수년간 다양한 서방성 중합체성 장치가 개발되고 생체내에서 시험되었다. 생분해성 및 비-분해성 중합체 모두를 포함하여, 다양한 생체적합성 중합체(하이드로겔 포함)를 사용하여, 특정한 표적 부위에 화합물의 지속 방출을 위한 임플란트를 형성시킬 수 있다. 조성물에 사용하기 위한 추가의 약제학적으로 허용되는 성분은 완충제, 염, 안정화제, 희석제, 보존제, 항생제, 등장제 등을 포함한다.
투여량
사용시, 치료 유효량의 Fc 융합 단백질을, 이를 필요로 하는 대상체에게 투여한다. Fc 융합 단백질의 투여는 대상체에서 면역 반응, 보다 구체적으로 코로나바이러스 감염, 보다 구체적으로 SARS-CoV-2 또는 변종에 대한 면역 반응을 유도한다. 면역 반응은 관찰가능한 임상 증상의 결여, 또는 감염된 대상체에 의해 통상적으로 나타나는 임상 증상의 감소, 감소된 바이러스 배출, 감염으로부터의 빠른 회복 시간, 및/또는 감소된 감염 지속기간에 의해 입증될 것이다. 또 다른 구현예에서, 치료 유효량의 Fc 융합 단백질을 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 감염 또는 질병 부위에서 면역 세포를 활성화하는 방법을 제공한다. 또 다른 측면에서, 치료 유효량의 Fc 융합 단백질을 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 항체 생산을 증가시키는 방법을 제공한다.
본원에 기재된 치료 및 예방 방법을, 비제한적으로 개, 고양이 및 기타 반려 동물 뿐만 아니라 설치류, 영장류, 말, 소, 양, 돼지 등을 포함한 임의의 적합한 온혈 동물 뿐만 아니라 인간에게도 적용 가능하다는 것이 이해될 것이다. 이 방법을 임상 연구 및/또는 연구에도 적용할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "유효량" 또는 "치료 유효량"이라는 어구는 목적하는 치료 섭생에 따라 투여시, 상기와 같은 감염 증상 중 일부 또는 전부를 완화시키거나 감염에 대한 소인을 감소시킴을 포함하여, 목적하는 치료 또는 예방 효과 또는 반응을 이끌어내는, 본 개시내용의 구현예에 적합할 수 있는 Fc 융합 단백질의 치료 또는 예방량을 지칭함을 의미한다. 당업자는 상태가 완전히 근절되거나 예방되지 않는다 하더라도, 상기 상태 또는 이의 증상 및/또는 효과가 대상체에서 부분적으로 개선되거나 완화된 경우 하나의 양을 치료학적으로 "유효한" 것으로 간주할 수 있다. Fc 융합 펩티드의 치료 유효량은 대상체의 크기와 종, 투여 방식에 따라 달라질 수 있다.
Fc 융합 단백질의 실제 투여량 수준은 특정 대상체에 대해 목적하는 치료 반응을 달성하는데 효과적인 활성 성분의 양을 얻기 위해 다양할 수 있다. 선택된 투여량 수준은 사용된 특정 융합 단백질, 또는 이의 에스테르, 염 또는 아미드의 활성, 투여 경로, 투여 시간, 사용되는 특정 화합물의 배출 속도, 치료 지속기간, 사용된 특정 융합 단백질과 함께 사용되는 기타 약물, 화합물 및/또는 물질, 치료되는 대상체의 연령, 성별, 체중, 상태, 일반적인 건강 및 이전의 병력, 및 의학 분야에 주지된 유사한 인자를 포함한 다양한 인자에 따라 변할 것이다. 일반적으로, Fc 융합 단백질의 적합한 용량은 치료 효과를 생산하는데 효과적인 가장 낮은 용량인 양일 것이다. 이러한 유효 용량은 일반적으로 상술한 요인에 따라 변할 것이다.
면역원성 제형을, 다양한 측면에서, 투여 용이성 및 투여량의 균일성을 위해 단위 투여형으로 제공한다. 본원에 사용된 "단위 투여형"은 치료되는 대상체에 대해 단일 투여량으로 적합한 물리적으로 분리된 단위를 지칭하며, 각 단위는 목적하는 약학 담체와 관련하여 목적하는 치료 효과를 생산하도록 계산된, 소정량의 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질을 함유한다. 단위 투여형에 대한 사양은 부형제(들) 및 치료제(들)의 고유한 특성 및 달성할 특정 생물학적 효과에 의해 지시되고 이에 직접적으로 의존한다. 하나 이상의 구현예에서, 제형은 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질을 대상체에게 투여하기 위한 성분들의 키트 중에서 제공된다. 하나 이상의 구현예에서, 적합한 담체에 분산된 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질을 포함하는 약학 조성물은 단위 투여형(예를 들어, 바이알)으로 제공된다. 하나 이상의 구현예에서, 키트는 투여를 위한 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질의 현장 혼합을 위한 항원보강제 및/또는 기타 담체 시스템을 함유하는 별개의 단위 투여형(예를 들어, 바이알)을 추가로 포함한다. 하나 이상의 구현예에서, 키트는 투여를 위한 면역원성 제형의 현장 혼합을 위한 하나 이상의 유화 바늘 및 주사기를 포함한다. 하나 이상의 구현예에서, 키트는 제조된 면역학적 조성물을 대상체에게 투여하기 위한 하나 이상의 투여 주사기를 포함한다. 하나 이상의 구현예에서, 키트는 면역원성 조성물을 제조하고/하거나 면역원성 조성물을 투여하기 위한 설명서를 추가로 포함한다.
상술한 과정에 따른 실시예 및 하기의 실시예에서, 1 ㎍ 내지 100 ㎍의 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질의 용량 수준이 마우스 및 토끼에서 단일 주사 후 21일째에 유의한 항-SP/RBD Ab 역가를 유도하는 것으로 나타났다. 예에서, 10 ㎍ 및 30 ㎍의 용량 수준은 비-인간 영장류에서 유효하였다(도 60, 도 61 및 도 62 참조). 토끼에서 반응의 동역학은 100 ㎍의 용량 수준이 1차, 2차 및 3차 용량(항원보강제 부재 - 도 69 참조, 및 Montanide™ ISA-720 항원보강제 - 도 71 참조 모두) 후 가장 높은 면역원성을 유도함을 입증하였다(IgG Ab 역가에서와 같이).
서열번호 17 면역원성의 초기 평가를, 항원보강제 없이 0.05, 0.1, 0.3, 1, 3, 10, 30, 또는 100 ㎍의 서열번호 17, 또는 표 1에 나타낸 바와 같은 항원보강제와 함께 3 ㎍ 또는 10 ㎍의 서열번호 17이 투여된 6주 내지 8주령 암컷 BALB/c 마우스에서 실시예 17에 따라 수행하였다(모든 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질:항원보강제 혼합물은 50%:50% v/v이나, 30%/70% v/v로 혼합된 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질:Montanide™ ISA 720은 제외한다). 또한, Fc 단편의 면역원성 기여도를 조사하기 위해 Fc 융합 모이어티가 결여된 서열번호 2를 평가하였다.
[표 1]
Figure pct00002
본 개시내용은 임의의 상기 언급된 약학 조성물 및 제제에서의 Fc 융합 단백질의 제형화를 고려한다. 더욱 또한, 본 개시내용은 임의의 상기 투여 경로를 통한 투여를 고려한다. 당업자는 치료되는 환자의 치료되는 상태 및 전체적인 건강, 연령 및 크기를 기초로 적합한 제형, 용량 수준 및 투여 경로를 선택할 수 있다.
실시예
본 기술은 하기 실시예에 의해 추가로 예시된다. 그러나, 이들 예는 예시로서 제공되고 그 안에 있는 어떠한 것도 기술의 전체 범위에 대한 제한으로 간주되어서는 안 된다는 것을 이해해야 한다.
SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질의 합성, 정제 및 검증을 위한 일반적인 실시예
실시예 1: HEK293 세포에서 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질의 합성 및 제조 방법
SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질을 하기와 같이 합성하였다. 관심 유전자 서열을 독점 소프트웨어(LakePharma, Belmont, CA)를 사용하여 구성하고 고발현 포유동물 벡터에 클로닝하였다. HEK293 세포를 형질감염 24시간 전에 진탕 플라스크에 시딩하고 무혈청의 화학적으로 정의된 배지를 사용하여 생육시켰다. 관심 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질을 암호화하는 DNA 발현 구성물을, 일시적 형질감염을 위한 표준 작업 과정(LakePharma, Belmont, CA)을 사용하여 HEK293 세포 현탁액에 일시적으로 형질감염시켰다. 20시간 후, 세포를 카운트하여 생존율 및 생존 세포 수를 측정하고, 역가를 ForteBio® Octet®(Pall ForteBio LLC, Fremont, CA)로 측정 하였다. 일시적인 형질감염 생산 실행 전반에 걸쳐 추가적인 판독값을 취하였다. 배양물을 5일째 또는 그 이후에 수확하였다.
실시예 2: 일시적으로 형질감염된 CHO 세포에서 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질의 합성 및 제조 방법
SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질을 하기와 같이 합성하였다. 관심 유전자 서열을 독점 소프트웨어(LakePharma, Belmont, CA)를 사용하여 구성하고 인간 Fc 융합 단백질 특이적 고발현 벡터에 클로닝하였다. CHO-SE™(LakePharma, Belmont, CA) 세포를 형질감염 24시간 전에 진탕 플라스크에 시딩하고 무혈청의 화학적으로 정의된 배지(MEDNA Bio)를 사용하여 생육시켰다. 관심 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질을 암호화 하는 DNA 발현 구성물을 일시적 형질감염을 위한 표준 작업 과정(LakePharma, Belmont, CA)를 사용하여 CHO-SE 세포 현탁액에 일시적으로 형질감염시켰다. 거의 24시간 후, 세포를 카운트하여 생존율 및 생존 세포 수를 측정하고, 역가를 ForteBio® Octet®(Pall ForteBio LLC, Fremont, CA)로 측정하였다. 일시적인 형질감염 생산 실행 전반에 걸쳐 추가 판독값을 취하였다. 배양물을 7일째 또는 그 이후에 수확하였다.
실시예 3: 안정하게 형질감염된 CHO 세포에서 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질의 합성 및 제조 방법
CHO 세포주는 원래 CHO-K1(LakePharma, Belmont, CA)에서 유래되었으며, 내인성 글루타민 합성효소(GS) 유전자를 당업계에 공지된 방법을 사용하여 재조합 기술에 의해 녹아웃시켰다. 안정한 발현 DNA 벡터를 CHO 발현 및 GS 선택을 위해 설계 및 최적화하였으며 고발현 포유동물 벡터(LakePharma, Belmont, CA)에 통합시켰다. 확장 실험을 시작하기 전에 완성된 각 구성성물의 서열을 확인하였다. 현탁-적응된 CHO 세포를 화학적으로 정의된 배지(CD OptiCHO; Invitrogen, Carlsbad, CA)에서 37℃의 가습된 5% CO2 배양기에서 배양하였다. CHO 세포 배양에 혈청 또는 기타 동물 유래 제품을 사용하지 않았다.
지수 증식기 동안 CD OptiCHO 배지에서 생육하는 약 8천만 개의 현탁-적응된 CHO 세포를 80 ㎍ DNA로 MaxCyte® STX® 시스템(MaxCyte, Inc., Gaithersburg, MD)을 사용하여 일렉트로포레이션에 의해 형질감염시켜, 각각의 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질에 대한 안정한 CHO 세포주를 생성하였다(DNA 구성물은 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질의 완전길이 서열을 포함한다). 24시간 후, 형질감염된 세포를 카운트하고 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 유전자의 안정적인 통합을 위한 선택하에 두었다. 형질감염된 세포를 진탕 플라스크에서 0.5 x 106 세포/㎖의 세포 밀도로 0-100 μM 메티오닌 설폭스이민(MSX)을 함유하는 CD OptiCHO 선택 배지에 시딩하고 37℃에서 5% CO2로 배양하였다. 선택 과정 동안, CHO 안정한 풀이 성장률 및 생존율을 회복할 때까지 세포를 회전시키고 신선한 선택 배지에 2-3일마다 재현탁하였다. 세포 배양물을 성장 및 역가에 대해 모니터링하였다.
세포를 ㎖당 2.5 x 106 세포로 생육시켰다. 세포은행을 위한 수확시 생존율은 95% 이상이었다. 이어서 세포를 원심분리하고, 세포 펠릿을 7.5% 디메틸 설폭사이드(DMSO)가 포함된 CD OptiCHO 배지에 재현탁하여 바이알당 ㎖당 15 x 106 세포의 세포 수로 재현탁시켰다. 바이알을 보관을 위해 액체 질소에서 냉동보존하였다.
CHO 세포를 사용하여 하기와 같이 소규모 확대 생산을 수행하였다. 세포를 37℃에서 100 μM MSX를 포함하는 CD OptiCHO 생육 배지에서 생산을 위해 규모를 확대하고 필요에 따라 2-4일마다 공급하였으며, 필요한 경우 약 14-21일 동안 글루코스 및 추가 아미노산이 보충된 CD OptiCHO 생육 배지를 공급하였다. 안정적인 풀 생산 실행에서 수확된 순화 배지 상등액을 원심분리기 회전에 의해 정화시켰다. 단백질을, 결합 완충액으로 미리 평형화시킨 단백질 A(MabSelect, GE Healthcare, Little Chalfont, United Kingdom) 컬럼에서 실행시켰다. 이어서 세척 완충액을 OD280 값(NanoDrop, Thermo Scientific)이 배경 수준이거나 그 근처인 것으로 측정될 때까지 컬럼에 통과시켰다. SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질을 낮은 pH 완충액을 사용하여 용출시키고, 용출 분획을 수집하고, 각 분획의 OD280 값을 기록하였다. 표적 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질을 포함하는 분획을 모으고 임의로 0.2 ㎛ 멤브레인 필터를 사용하여 추가로 여과하였다.
세포주를 선택적으로 단클론성으로 추가 서브클로닝할 수 있으며, 당업자에게 공지된 방법인 제한 희석 방법을 사용하여 고역가 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc-융합 단백질-발현 클론을 임의로 추가로 선택할 수 있다. 고역가의 단클론 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질-발현 세포주를 수득한 후, SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질의 생산을, MSX가 없는 생육 배지, 또는 임의로 MSX를 포함하는 생육 배지에서 상술한 바와 같이 수행하여, 재조합의 CHO-제조된 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질을 함유하는 세포 배양 상등액을 수득하였다. MSX 농도를 더 높은 생성물 역가를 산출할 수 있는 클론에 대한 추가 선택성을 발휘하기 위해 시간에 걸쳐 임의로 증가시킬 수 있다.
실시예 4: HEK293 세포에서 제조된 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질의 정제
SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질의 정제를 하기과 같이 수행하였다. 분비된 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질을 포함하는 순화 배지 상등액을, 일시적으로 형질감염된 HEK293 생산 실행에서 수확하고 원심분리에 의해 정화시켰다. 목적하는 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질을 포함하는 상등액을 단백질 A 컬럼 상에서 실행하고, 세척하고 낮은 pH 구배를 사용하여 용출시켰다. 그 후, 목적하는 단백질을 함유하는 용출 분획을 모으고, 완충액을 200 mM HEPES, 100 mM NaCl, 50 mM NaOAc, pH 7.0 완충액으로 교환하였다. 0.2 ㎛ 멤브레인 필터를 사용하여 최종 여과 단계를 수행하였다. 최종 단백질 농도를 280 ㎚에서 용액 광학 밀도로부터 계산하였다. 필요에 따라 이온 교환 크로마토그래피(예를 들어, 음이온 교환 비드 수지 또는 양이온 교환 비드 수지 사용), 겔 여과 크로마토그래피 또는 기타 방법에 의한 추가의 선택적 정제를 수행하였다.
실시예 5: CHO 세포에서 제조된 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질의 정제
SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질의 정제를 하기와 같이 수행하였다. 분비된 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질을 포함하는 순화 배지 상등액을 일시적으로 형질감염된 CHO 또는 안정적으로 형질감염된 CHO 생산 실행에서 수확하고, 원심분리에 의해 정화시켰다. 목적하는 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질을 포함하는 상등액을 단백질 A 컬럼상에서 실행하고, 세척하고 낮은 pH 구배를 사용하여 용출시켰다. 그 후, 목적하는 단백질을 함유하는 용출 분획을 모으고 완충액을 200 mM HEPES, 100 mM NaCl, 50 mM NaOAc, pH 7.0 완충액으로 교환하였다. 0.2 ㎛ 멤브레인 필터를 사용하여 최종 여과 단계를 수행하였다. 최종 단백질 농도를 280 ㎚에서 용액 광학 밀도로부터 계산하였다. 필요에 따라 이온 교환 크로마토그래피(예를 들어, 음이온 교환 비드 수지 또는 양이온 교환 비드 수지 사용), 겔 여과 크로마토그래피 또는 기타 방법에 의한 추가의 선택적 정제를 수행하였다.
실시예 6: 비-환원 및 환원 CE-SDS에 의한 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질 구조 확인
200 mM HEPES, 100 mM NaCl, 50 mM NaOAc, pH 7.0 완충액에 용해된 정제된 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질의 용액상에서 LabChip® GXII(Perkin Elmer, Waltham, MA)에서 모세관 전기영동 나트륨 도데실 설페이트(CE-SDS) 분석을 수행하고, 전기영동도를 플롯팅한다. 비-환원 조건하에서, 샘플을 공지된 분자량(MW) 단백질 표준에 대해 실행시키며, 용출 피크는 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질 동종이량체의 '겉보기' MW를 나타낸다.
환원 조건하에서(예를 들어, SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질 동종이량체의 디설파이드 결합을 절단하기 위해 베타-머캅토에탄올을 사용), SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질의 구조적 순도가 정확할 가능성이 있음을 결정하는 방법으로서, 생성된 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질 단량체의 겉보기 MW를 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질 동종이량체의 절반 분자량과 비교한다.
실시예 7: 글리칸 제거와 함께 LC-MS에 의한 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질 서열 확인.
질량 분광법(MS)을 통해 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질 질량의 정확한 추정치를 획득하기 위해서, 먼저 샘플을 처리하여 MS 분석을 방해할 수 있는 자연 발생 글리칸을 제거한다. 200 mM HEPES, 100 mM NaCl, 50 mM NaOAc, pH 7.0 완충 용액에 용해된 2.5 ㎎/㎖ SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질 100 ㎕을 먼저 Zeba 탈염 컬럼(Pierce, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA)을 사용하여 5 mM EDTA를 함유하는 0.1 M 트리스, pH 8.0 완충제로 완충제 교환한다. 이 용액에 1.67 ㎕의 PNGase F 효소(Prozyme N-글리카나제)를 첨가하여 융합 단백질에 존재하는 N-연결된 글리칸(예를 들어, cNg-N 부위에 위치한 아스파라긴의 측쇄에 연결된 글리칸)을 제거하고, 혼합물을 배양기에서 밤새 37℃에서 배양한다. 이어서 샘플을 LC-MS(NovaBioassays, Woburn, MA)를 통해 분석하여 글리칸이 없는 목적하는 동종이량체에 해당하는 분자의 분자량을 생성한다. 이어서 cNg-아스파라긴에서 글리칸을 절단하는 데 사용된 효소적 과정이 또한 아스파라긴 측쇄를 탈아민화하여 아스파트산을 형성시키므로 상기 질량을 추가로 보정하고, 그렇게 함으로써 효소 처리된 동종이량체는 전체적으로 2 Da이 증가하며, 이는 상기 동종이량체 중에 존재하는 각각의 쇄에 대한 1 Da의 질량에 상응한다. 따라서 실제 분자량은 분석 샘플 중의 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질 구조물의 각각의 효소 변형을 보정하기 위해 측정된 질량에서 2Da를 뺀 값이다.
실시예 8: SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질에 대한 크기-배제 크로마토그래피에 의한 동종이량체%.
SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질의 크기 배제 크로마토그래피(SEC-HPLC)를 280 ㎚의 파장에서 2998 포토다이오드 어레이에 연결된 Waters 2795HT HPLC(Waters Corporation, Milford, MA)를 사용하여 수행하였다. 관심 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질이 포함된 샘플 100 ㎕ 이하를, 0.2 ㎖/분의 유량 및 50 mM 나트륨 포스페이트, 300 mM NaCl, 및 0.05% w/v 나트륨 아지드, pH 6.2를 포함하는 이동상으로 작동하는 MAbPac SEC-1, 5 ㎛, 4 × 300 ㎜ 컬럼(ThermoFisher Scientific, Waltham, MA)에 주입하였다. MAbPac SEC-1 컬럼은 분자 크기 분리 원리에 따라 작동한다. 따라서, 더 큰 용해성 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 응집체(예를 들어, SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질 동종이량체의 다량체)는 더 이른 체류 시간에 용출되고, 응집되지 않은 동종이량체는 나중의 체류 시간에 용출된다. 분석 SEC-HPLC를 통해, 응집된 다량체성 동종이량체로부터 동종이량체 혼합물을 분리함에 있어서, 응집되지 않은 동종이량체의 백분율에 의해 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질 용액의 순도를 확인하였다.
실시예 9: SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질에 대한 시험관내 Fc(감마), FcRn, 및 ACE2 수용체 결합 친화도.
pH 7.4에서 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질의 Fc(감마) 수용체에 대한 결합을 하기와 같이 ELISA 분석을 사용하여 수행한다. 인간 Fc(감마) 수용체 I, IIa, IIb, III 및 FcRn 수용체는 포유동물 수용체로서 사용된다. SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질을 pH 9.6에서 중탄산나트륨 완충액에서 10 ㎍/㎖로 희석하고 4℃에서 밤새 Maxisorp(Nunc) 미세적정 플레이트에 코팅하고, 그 후에 미세 플레이트 스트립을 PBST(PBS/0.05% 트윈-20) 완충액으로 5회 세척하고 Superblock 차단 시약(ThermoFisher)으로 차단한다. 비오틴화된 rhFc(감마) 수용체(재조합 인간 Fc(감마)RI, Fc(감마)RIIa, Fc(감마)RIIb, Fc(감마)RIII, FcRn; R&D Systems)의 일련의 희석액을 PBST/10% Superblock 완충액 중에서 6000 ng/㎖ 내지 8.2 ng/㎖로 제조하고, SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질이 코팅된 마이크로플레이트 스트립에 100㎕/웰로 로딩한다. 재조합 인간 ACE2 수용체를 R&D systems에서 구입하고 공지된 접합 과정을 사용하여 비오틴화한 다음 6000 ng/㎖ 내지 8.2 ng/㎖의 PBST/10% Superblock 완충액 중에서 제조하고 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질이 코팅된 마이크로플레이트 스트립에 100 ㎕/웰로 로딩한다. 미세적정 플레이트를 실온에서 1시간 동안 배양한 후 마이크로플레이트 스트립을 PBST로 5회 세척하고 이어서 PBST/10% Superblock 완충액에서 1:10000으로 희석된 스트렙트아비딘-HRP 100 ㎕/웰을 로딩한다. 45분 동안 배양한 후, 마이크로플레이트 스트립을 PBST로 다시 5회 세척한다. TMB를 상기 결합된 Fc(감마), FcRn 또는 ACE2 수용체 단백질을 나타내기 위해 첨가하고 ELISA 정지 시약(Boston Bioproducts)으로 정지시킨다. 플레이트를 450 ㎚에서 ELISA 플레이트 판독기에서 판독하고, OD 값(각 rhFc(감마), FcRn, 또는 ACE2 수용체의 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질에의 결합에 비례한다)을 GraphPad Prism 소프트웨어를 사용하여 결합 곡선을 생성하기 위해 각 웰에 첨가된 각 rhFc(감마) 수용체 또는 FcRn 또는 ACE2 수용체의 로그 농도에 대해 플롯팅한다.
혈청 중 SARS-CoV-2 RBD-hIgG-Fc 융합 단백질 작용을 평가하기 위한 생체내 혈청학 분석의 일반적인 실시예
실시예 10: 인간 또는 마우스 혈청에서 SARS-CoV-2 RBD IgG 항체 역가를 평가하기 위한 생체내 정량적 ELISA.
정량적 SARS-CoV-2 SP/RBD 특이적 IgG ELISA를 사용하여, 열-불활성화된 혈청 또는 열-불활성화된 혈장을 포함한, 인간 또는 마우스 혈청 및 혈장 샘플 중의 항-SP/RBD IgG Ab 역가를 측정한다. ELISA 방법은 마이크로플레이트 웰 중에서 배양시 혈청 샘플 중의 항-SP/RBD-특이적 항체(IgG)에 결합하는 포획 항원으로서 96-웰 미세적정 ELISA 플레이트(도 81에 도시된 바와 같은)의 플라스틱 웰에 고정화된 재조합 SP/RBD를 사용한다. 세척 단계는 결합되지 않은 모든 단백질을 제거하여 플레이트에 결합된 항-SP/RBD IgG를 남긴다. 항-SP/RBD 항체를, 혈청 샘플의 종 기원에 따라 양고추냉이 퍼옥시다제(HRP)에 접합되는 항-인간 또는 항-마우스 IgG 항체(IgM에 교차 반응하지 않음)의 첨가를 통해 검출한다. 결합되지 않은 HRP-항체 접합체를 제거하기 위한 두 번째 세척 후, 3,3',5,5'-트리메틸벤지딘(TMB)을, 결합된 HRP-항체 접합체의 양에 비례하는 비색 변화를 유발하는 HRP 효소에 의해 촉매화되는 각 웰에 첨가한다. 산을 첨가하여 발색을 멈추고 분광광도계 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 각 웰의 색상 밀도를 측정하고, SoftMax Pro 또는 Gen 5 소프트웨어를 사용하여 흡광도 데이터를 수집하고 표준 곡선을 사용하여 각 샘플에 대한 역가 값을 분석한다. 표준 곡선을, 플라스틱 웰에 직접 결합된 공지된 양(즉, ㎍/㎖)의 정제된 인간 또는 마우스 IgG 샘플의 연속 희석을 사용하여 생성하고(즉, 웰에는 결합된 SP/RBD 또는 혈청 샘플이 포함되지 않음), 혈청 샘플에 대해 상술한 바와 동일하게 전개하였다. 각 혈청 샘플에 대한 SP/RBD 특이적 항체의 양(즉, 역가 값)을, 적합한 소프트웨어(예를 들어, SoftMaxPro 또는 Gen 5)를 통해 4-매개변수 곡선 적합을 사용하여 표준 곡선으로부터 유래된 ㎍/㎖ 단위로 나타낸다.
실시예 11: 마우스 및 NHP 혈청에서 SARS-CoV-2 RBD IgG 항체 역가를 평가하기 위한 개선된 생체내 정량적 ELISA.
정량적 SARS-CoV-2 SP/RBD 특이적 IgG ELISA를 사용하여, 열-불활성화된 혈청 또는 열-불활성화된 혈장을 포함한, 마우스 또는 NHP 혈청 및 혈장 샘플 중의 항-SP/RBD IgG Ab 역가를 측정한다. ELISA 방법은 마이크로플레이트 웰 중에서 배양시 혈청 샘플 중의 항-SP/RBD-특이적 항체(IgG)에 결합하는 포획 항원으로서 96-웰 미세적정 ELISA 플레이트(도 81에 도시된 바와 같은)의 플라스틱 웰에 고정화된 재조합 SP/RBD(Lake Pharma)를 사용한다.
SPD/RBD 단백질(Lake Pharma, Belmont CA)을 Carb/Bicarb 코팅 완충액 pH 9.6에서 2.5 ㎍/㎖로 희석하고 볼텍싱하여 혼합한다. 100 ㎕/웰의 코팅 용액을 다중 채널 피펫을 사용하여 Maxisorb ELISA 플레이트의 모든 웰에 추가한다. 플레이트를 플레이트 실러로 덮고 2-8℃에서 밤새 배양한다. 플레이트를 플레이트 세척제(300 ㎕/웰/세척)를 사용하여 PBST로 5x 세척하여, 결합되지 않은 모든 단백질을 제거한다. 300 ㎕의 Superblock 차단 용액을 각 웰에 첨가하고 플레이트를 실온에서 1시간 이상 배양한다.
표준 마우스 혈청 또는 NHP 혈청을 희석하여 종-특이적 분석 포맷에 따라 표준 곡선을 생성한다. 첫 번째 표준을 생성하기 위해서, 높은 항-SP/RBD 역가로 양성인 것으로 공지된 마우스 혈청 또는 NHP 혈청 샘플을 1:10으로 희석하고(각 샘플 20 ㎕ + 샘플 희석 완충액 180 ㎕) 볼텍싱하여 철저히 혼합한다. 나머지 표준은 1:10 샘플의 2배 연속 희석으로 생성한다. 표준 마우스 또는 NHP 샘플의 각 희석액을 각 플레이트에서 100㎕/웰로 이중으로 실행시킨다.
혈청 또는 혈장 샘플을 1:100으로 희석하고(각 샘플 4 ㎕ + 샘플 희석 완충액 396 ㎕) 볼텍싱하여 철저히 혼합한다. 차단 용액을 플레이트 웰에서 경사분리하고 플레이트를 플레이트 세척제(100 ㎕ PBST/웰/세척)를 사용하여 PBST로 5회 세척한다. 100 ㎕의 희석된 표준 샘플을 각 플레이트의 컬럼 1 및 2에 있는 각 웰에 로딩한다. 희석된 시험 혈청 샘플 100 ㎕를 나머지 웰에 추가한다. 시험 플레이트를 밀봉 테이프로 덮고 실온에서 1시간 동안 배양한다.
10 ㎕의 항-마우스 또는 항-NHP IgG-Fc HRP와 9.99 ㎖의 1x HRP 접합체 스톡 안정제를 볼텍싱에 의해 잘 혼합하여 1:1000 모액을 생성한다. 모액을, 300 ㎕의 1:1000 용액을 11.7 ㎖의 PBST/SB와 볼텍싱에 의해 추가 희석하여 1:40,000 희석액을 생성한다. 플레이트를 300 ㎕ PBST/웰로 5회 세척하고 플레이트 세척제로 세척하고 플레이트를 종이 타월로 가볍게 두드려 건조시킨다.
웰당 100 ㎕를 1:40,000 희석된 항-마우스 또는 항-NHP IgG-Fc HRP를 첨가하고 플레이트를 실온의 암실에서 1시간 동안 배양한다. 이어서 플레이트를 플레이트 세척제로 300 ㎕ PBST/웰/세척으로 5회 세척하고 dH2O(300 ㎕ dH2O/웰/세척)로 수동으로 1회 세척한다. 이어서 플레이트를 종이 타월로 두드려 건조시킨다. TMB 용액을 동일한 시간 간격으로 컬럼 1에서 컬럼 12까지 순서대로 한 번에 하나의 컬럼에 100 ㎕씩 첨가한 다음, 발색을 모니터링하면서 암실 속에서 10-20분 동안 배양한다. TMB 기질 용액에 대해 이전에 수행한 것과 동일한 시간 간격으로 컬럼 1에서 컬럼 12까지 동일한 순서로 100 ㎕/웰 정지 시약을 추가하여 발색을 중지시킨다. 각 웰의 색상 밀도를 450 nM에서 분광광도측정 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 30분 이내에 측정하고, SoftMax Pro 또는 Gen 5 소프트웨어를 사용하여 흡광도 데이터를 획득하고 표준 곡선을 사용하여 각 샘플의 역가 값을 분석한다.
OD 값에 대한 농도(표준 마우스 또는 NHP 샘플의 1/희석의 로그)를 사용하여 표준 곡선을 생성한다. 샘플의 항체 역가를, 가장 높은 R2 값을 생성하는 표준 곡선상의 10-12개 점을 통해 선형 회귀에 의해 분석한다. 값을 RBD-특이적 IgG 역가로 보고한다(참조(Ref.) 역가 단위).
실시예 12: 마우스에서 항-SP/RBD IgG Ab 역가 반응을 유도하는데 있어서 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 제형의 유효도의 생체내 일반적인 전임상 평가
상이한 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질 제형의 유효도를 평가하기 위한 생체내 연구를 하기와 같이 마우스에서 수행한다.
6 내지 8주령의 암컷 BALB/c 마우스 또는 8 내지 10개월령의 암컷 BALB/c 마우스(Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME)를 체중을 측정하기 전에 최소 7일 동안 순응시킨 다음 투여를 위해 연구 그룹에 할당한다. 고령자(예를 들어, 70세 이상)에서 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질 제형의 유효도를 모델링하기 위해 더 나이든 마우스를 사용한다. 6 내지 8주령 그룹당 N=5마리, 8 내지 10개월령 그룹당 N=15마리 마우스를 사용하며, 마우스를 각 연구 그룹에 무작위로 할당한다. 마우스를 자동 환기 랙에서 케이지당 5마리씩 유지시키고 표준 조사된 먹이와 여과수를 마음껏 제공한다. 마우스를 표준 운영 절차(SOP) 및 특정 연구 프로토콜에 따라, 식별을 위해 개별적으로 귀 태그하고, 연구 케이지를 동물 ID, 연구명 및 연구 그룹 식별, 개별 및 그룹 투여 시트, 혈액/혈청 수집 시트, 체중 측정 및 건강 관찰 기록을 포함한 연구 기록으로 표지한다.
실시예 1에 따라 일시적으로 형질감염된 HEK293 세포, 실시예 2에 따라 일시적으로 형질감염된 CHO 세포, 또는 실시예 3에 따라 안정적으로 형질감염된 CHO 세포에서 합성된 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질, 또는 상업적 출처에서 얻은 SARS-CoV-2 스파이크 단백질 RBD의 최대 3회 용량을 마우스에게 투여한다. 용량은 피하(s.c.), 근육내(i.m.) 또는 피내(i.d.) 주사를 통해 3주 간격으로(0일, 21일 및 42일) 제공된다. 투여 후 1-3시간 동안 마우스를 관찰하여 즉각적인 반응을 관찰한 후 일반적인 건강 상태에 대해 매일 관찰한다. 모든 마우스는 SARS-CoV-2 RBD IgG Ab 역가 평가를 위한 혈청 샘플을 얻기 위해 첫 번째 면역화 7 내지 14일 전, 및 각 용량 투여 12 내지 14일 후에 턱밑 정맥 천자를 통해 비-말단 채혈한다. 수집된 혈액을 응고시키고, 마이크로-진공관을 원심분리하여 혈청을 분리하고, 실시예 10 또는 실시예 11에 기재된 방법에 따라 ELISA에 의한 항체 분석을 위해 분액하고 동결시킨다.
3차 면역화 후 12-14일(즉, 54-56일)에 마지막 혈청 수집 후 실질적인 항체 반응을 보인 마우스 그룹과 면역되지 않은 대조군을 추가 평가를 위해 보관할 수 있다. 보관된 마우스의 경우 3차 투여 후 30일 및 60일(각각 72일 및 102일)에 턱밑 정맥천자법으로 각 마우스로부터 혈액을 수집 및 응고시키고 마이크로 진공관 및 원심분리기로 혈청을 분리하고, 실시예 10, 실시예 11 및 실시예 13에 기재된 방법에 따라 ELISA에 의한 항체 분석을 위해 분액하고 동결시켰다.
상당한 항체 반응을 보여 유지된 마우스에, 102일째에 s.c., i.m., 또는 i.d. 주사를 통해 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질의 추가접종 용량을 제공한다. 마우스를, 투여 후 1-3시간 동안 임의의 즉각적인 반응에 대해 관찰한 다음 일반적인 건강에 대해 매일 관찰한다. 혈액을 턱밑 정맥천자법에 의해 각 마우스로부터, 최종 추가접종 투여 12일 내지 14일 후에 수집하여 응고시키고, 혈액을 마이크로 진공관을 원심분리하여 분리시키고, 실시예 10, 실시예 11 및 실시예 13에 기재된 방법에 따라 ELISA에 의한 항체 분석을 위해 분액하고 동결시켜 이들 그룹의 회상(기억) 면역 반응을 평가하였다.
상이한 항원보강제(예를 들어, Advax-2, Advax-3, VacAdx, Montanide™ ISA-51, Montanide™ ISA-720 또는 대체물)를 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질과 조합하여 시험할 수 있다. 적합한 v/v 비의 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질 및 항원보강제는 마우스에 투여되기 직전에 혼합/유화시킨다.
실시예 13: SARS-CoV-2-스파이크 단백질-RBD에 대한 ACE2 결합을 중화하는데 있어서 혈청 중 SARS-CoV-2 항체의 효능을 평가하기 위한 생체내 일반적인 혈청학 분석
ACE2 억제 효소 결합 면역흡착 분석(ELISA)을, 재조합 SP/RBD에 대한 재조합 인간 ACE2의 결합을 억제하는 혈청 중에 존재하는 억제성 항-SP/RBD IgG 역가의 수준을 측정하도록 설계하였다. 분석에서 혈청 샘플의 연속 희석은 해당 샘플의 효능 값인 억제 희석 50%(ID50)를 산출할 것이며, 이는 총 ACE2 결합 신호의 50%가 발생하는 희석을 나타낸다. 분석을 사용하여 여러 종, 예를 들어 인간, NHP, 마우스 및 토끼의 샘플을 평가할 수 있으며, 따라서 임의의 샘플 ID50 값을 종 간 및 별도의 실험 간의 이러한 비교를 허용하는 임의의 다른 샘플의 값과 비교할 수 있다.
이 분석은, 연속 희석된 혈청 샘플과 비오틴화된 인간 ACE2(비오틴-huACE2, R&D Systems, Minneapolis, MN)을 재조합 SP/RBD에 대한 경쟁적인 결합을 위해 96-웰 플레이트의 플라스틱 웰에 결합된 재조합 SP/RBD 단백질에 첨가하는 경쟁적 억제 ELISA이다. 혈청 샘플 중에 존재하는 억제(즉, 중화) IgG(즉, 항체)의 수준은 SP/RBD에 대한 비오틴-huACE2 결합의 억제 정도와 상관관계가 있을 것이다. 혈청 및 비오틴-huACE2를 세척한 후, SP/RBD에 결합한 임의의 비오틴-huACE2에 결합하는 스트렙트아비딘-HRP(Thermo Fisher, Waltham, MA)를 첨가한 후 세척하고 TMB 기질의 첨가를 통해 발색을 수행한다. HRP(효소)/TMB(기질) 반응을 정지 시약(1% H2SO4) 의 첨가에 의해 중단시키고 색상 강도(광학 밀도, OD)를 450 ㎚ 파장에서 마이크로플레이트 판독기를 통해 측정한다. 각 샘플의 ID50 효능 값을 4-매개변수 곡선 적합(로그 억제제 대 반응, 가변 기울기) 알고리즘을 통해 GraphPad Prism 소프트웨어를 사용하여 비-경쟁 비오틴-huACE2에 의해 달성된 전체 신호의 정확히 50%(즉, 최대 OD450 값, 100%)인 OD450 값에 해당하는 역 희석으로 계산한다.
실시예 14: 토끼에서 GLP 독성학 연구를 위한 항-SP/RBD IgG Ab 역가 반응을 유도함에 있어서 SARS-CoV-2 RBD 제형의 유효도를 평가하기 위한 생체내 일반적인 정량적 ELISA.
서열번호 19의 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질 제형의 독성학을 평가하기 위한 생체내 연구를 하기와 같이 토끼에서 수행한다.
서열번호 19 유도된 면역원성 분석은, 토끼 비임상 연구 혈청 샘플에 존재하는 항-SP/RBD 항체를 미세적정 웰상에 코팅된 SARS-CoV-2 SP/RBD를 사용하여 포획한 다음 HRP-효소 접합된 항-토끼 IgGH+L-HRP 2차 항체에 이어서 TMB 기질 시스템에 의해 검출하는 ELISA이다. 표준 곡선(1000 ng/㎖ 내지 1.37 ng/㎖)을 샘플 희석 수준과 일치하는 정상 토끼 혈청의 백분율을 포함하는 완충액에 스파이크된 SARS-CoV-2(2019-nCoV) 스파이크 RBD 항체 토끼 pAb를 사용하여 생성한다. (예를 들어, 시험 샘플을 1:100으로 희석하는 경우, 1% 정상 혈청 완충액을 사용하여 표준 곡선을 작성한다.) 혈청 샘플의 항 SP/RBD 항체 농도를, SoftMax 소프트웨어를 사용하여 4-매개변수 표준 곡선 적합에 보간하여 분석한다. 토끼 pAb를 완충액에 스파이킹하여 3개의 양성 분석 대조군(높은 QC, 중간 QC, 낮은 QC) 및 음성 대조군(음성 QC)을 제조하고 단일-해동 사용 분액으로서 -20℃에서 냉동 보관하였다. (이들 QC는 정확성 및 정밀도를 평가하기 위한 검증 분석에서도 사용되었다.) 특정 검증 시험(예를 들어, 단기 안정성, 동결/해동 안정성)을 위한 추가 샘플을, 토끼 다클론성 항-SP/RBD 항체를 토끼 혈청에 직접 스파이킹함으로써 제조하였다. 검증을 위해, 샘플 희석 완충액에서 1:100의 최소 요구 희석(MRD)을 실제 연구 혈청 샘플에 사용된 MRD와 합치하도록 검증 동안 사용된 혈청 샘플에 사용하였다. 혈청 샘플 또는 혈청 함유 완충액을 필요로 하는 대부분의 검증 작업은 재조성된 정상 토끼 혈청을 사용하여 수행되었지만, 선형성 및 정량 한계와 같은 선택된 매개변수를 또한 실제 연구 혈청 샘플을 더 잘 나타내기 위해 모은 정상 토끼 혈청(BioIVT)을 사용하여 시험하였다.
검증 중에 결정된 바와 같이, 이 분석에 대한 분석 내 및 분석 간 정확도는 0이 아닌 3개의 모든 QC 수준에 걸쳐 88 내지 117% 범위이며, 이때 분석 간 및 분석 내 정확도 범위는 모든 QC 수준에 걸쳐 각각 6 내지 10% 및 1 내지 11%이다. 혼주 혈청을 사용하여, LLOQ가, 정상 혈청의 1 ng/㎖에 대해, 2 ng/㎖인 것으로 결정되었다. ULOQ는, 정상 혈청의 1000 ng/㎖에 대해, 혼주 혈청에서 500 ng/㎖인 것으로 밝혀졌다. 혼주 혈청이 연구 샘플을 더 가깝게 나타내기 때문에, LLOQ 및 ULOQ는 각각 2 ng/㎖ 및 500 ng/㎖로 설정되었다. 상당한 후크 효과가 ~1000 ng/㎖ 이상에서 나타났지만, 분석은 이러한 정량 한계 사이에서 선형인 것으로 밝혀졌다. 매우 높은 스파이크 항체 농도에서 측정된 값은 192 ng/㎖만큼 낮은 것으로 밝혀졌다. (이 결과를 기반으로, 연구 샘플 분석 중 192 ng/㎖를 초과하는 모든 샘플은 더 높은 희석 수준에서 다시 시험되었다.) 스파이크-회복은 11개의 상이한 혈청 샘플에서 정확하였으며, 이때 회복 범위는 높은 스파이크 수준(400 ng/㎖)에서 74 내지 105%, 중간 스파이크 수준(80 ng/㎖)에서 91 내지 117%, 및 낮은 스파이크 수준(10 ng/㎖)에서 86 내지 98% 범위였다. 스파이크된 혈청 샘플은 적어도 3x 동결-해동 주기(93 내지 118% 회복)를 통해 4℃에서 최대 1주일(90 내지 93% 회복), 및 실온에서 4시간(92 내지 106%)에서 안정적인 것으로 밝혀졌다. 이러한 검증 결과는 서열번호 19 면역원성 ELISA가 매우 정확하고 재현가능하며 목적에 적합함을 보여준다.
실시예 15: 플라크 감소 중화 시험(PRNT).
중화 Ab(nAb) 역가를 플라크 감소 중화 시험(PRNT)에 의해 측정한다. 간단히, 혈청을 섭씨 56도에서 30분 동안 열-불활성화시킨 다음, 미세적정 플레이트에서 연속적으로 2배 희석한다. 희석된 바이러스 현탁액을 1:1(v/v) 비로 희석된 샘플에 첨가하고 1시간 동안 섭씨 37도에서 배양하여 혈청 IgG가 바이러스에 결합할 수 있도록 한다. 그런 다음 이 혈청-바이러스 혼합물을 조직 배양물-처리된 플라스틱 플레이트에서 80% 융합율로 Vero E6 세포의 단층 위에 첨가하여 유리 바이러스가 세포를 감염시킬 수 있도록 한다(이 세포는 높은 수준의 SP 표적 단백질, huACE2를 발현한다). 이때, 완전한 DMEM 배지, 2XMEM 및 1.5% 아가로스의 오버레이를 1:1:1(v/v/v) 비로 첨가한다. 세포를 48시간 동안 배양한 후 10% 중성 완충 포르말린으로 30분 이상 고정시킨다. 아가로스 오버레이 플러그를 제거하고 세포를 0.5% 크리스탈 바이올렛으로 염색한다. 얼룩을 씻어낸 후 세포를 주위 온도에서 밤새 건조시키고 플라크를 나열한다. 음성 및 -양성 대조군 nAb(Sino Biological, Wayne, PA)를 사용하여 샘플 희석 곡선의 흡광도 값을, ID50 중화 효능 값이 각 샘플에 대해 유도되는 중화 백분율 값으로 전환시킨다.
SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질의 시험관내 및 생체내 수행성능을 예시하는 실시예
실시예 16: 서열번호 19의 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질에 대한 시험관내 인간 Fc(감마) 및 ACE2 수용체 결합 친화도
pH 7.4에서 서열번호 19의 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질의 인간 Fc(감마) 및 ACE2 수용체에 대한 시험관내 결합을 실시예 9의 과정에 따라 수행하였다. pH 7.4에서 인간 IgG의 인간 FcRn에 대한 시험관내 결합을 실시예 9의 과정에 따라 수행하였다.
플레이트를 450 ㎚에서 ELISA 플레이트 판독기로 판독하고 OD 값(서열번호 19의 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질에 대한 각 rhFc(감마) 수용체의 결합에 비례한다)을, GraphPad Prism 소프트웨어를 사용하여 결합 곡선을 생성하기 위해 각 웰에 첨가된 각 rhFc(감마) 수용체의 로그 농도에 대해 플롯팅하였다.
도 19에 예시된 바와 같이, 서열번호 19의 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질에 결합하는 인간 Fc(감마)RI의 EC50은 33.86 ng/㎖이다. 도 20에 예시된 바와 같이, 서열번호 19의 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질에 결합하는 인간 Fc(감마)RIIa의 EC50은 2282 ng/㎖이다. 도 21에 예시된 바와 같이, 서열번호 19의 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질에 결합하는 인간 Fc(감마)RIIb의 EC50은 2053 ng/㎖이다. 도 22에 예시된 바와 같이, 서열번호 19의 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질에 결합하는 인간 Fc(감마)RIIIa F176의 EC50은 95.54 ng/㎖이고, 서열번호 19의 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질에 결합하는 인간 Fc(감마)RIIIa V176의 EC50은 24.61 ng/㎖이고, 서열번호 19의 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질에 결합하는 인간 Fc(감마)RIIIb의 EC50은 11674 ng/㎖이다. 도 23에 예시된 바와 같이, 서열번호 19의 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질에 결합하는 인간 ACE2의 EC50은 87.00 ng/㎖이다.
도 24에 예시된 바와 같이, 서열번호 19의 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질에 결합하는 인간 FcRn의 EC50은 39.46 ng/㎖인 반면, 인간 IgG(대조군으로서 사용됨)에 결합하는 인간 FcRn의 EC50은 29.23 ng/㎖이고, 이는 FcRn 수용체 결합이 인간 IgG 대조군과 비교하여 서열번호 19를 사용하여 보존됨을 가리킨다.
실시예 17: 항원보강제 없이 마우스에서 서열번호 17의 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질의 유효도의 생체내 스크리닝.
서열번호 17의 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질을 실시예 1에 따라 합성하고, 실시예 4에 따라 정제하였다. 상기 융합 단백질 구조물을 실시예 6에 따라 비-환원 및 환원 CE-SDS에 의해 확인하였으며 융합 단백질 서열 정체를 실시예 7에 따라 글리칸 제거와 함께 LC-MS로 확인하였다.
실시예 12의 과정에 따라, 서열번호 17의 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질을 N=5, 6 내지 8주령 암컷 BALB/c 마우스의 8개 그룹에 피하 주사를 통해, 표 2에 따라 100 ㎕의 부피로 항원보강제 없이 0일, 21일 및 42일에 0.05 ㎍/용량 내지 100 ㎍/용량까지 다양한 용량 수준에서 투여하였다. 모든 마우스를 항-SP/RBD Ab 역가 평가를 위한 혈청 샘플을 수득하기 위해 각 주사 후 14 및 21일째에 턱밑 정맥 천자를 통해 비-말단적으로 채혈하였다. 항원보강제 없이 서열번호 17의 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질을 투여한 후 유도된 항-SP/RBD IgG Ab 역가 반응(IgG ELISA 표준 곡선을 통한 평균 IgG ㎍/㎖)을 실시예 10에 따라 측정하고 도 25에 예시된 바와 같이 21일, 및 도 26에 예시된 바와 같이 35일에 2차 용량 직전에 투여된 용량 수준(㎍)에 대해 플롯팅하였다.
[표 2]
Figure pct00003
데이터는 1 ㎍ 내지 100 ㎍의 용량 수준에서 유도된 항-SP/RBD IgG Ab 역가 반응이 눈에 띄게 증가하였으며 35일째에 1 ㎍, 10 ㎍ 및 100 ㎍ 용량 수준에서 가장 좋은 반응이 있었음을 보인다. 1, 2 및 3차 용량 후 서열번호 17의 1 ㎍, 3 ㎍, 10 ㎍, 30 ㎍ 및 100 ㎍의 용량 수준에 대한 동역학적 반응을 도 27에 예시하며, 이는 항-SP/RBD IgG Ab 역가 반응의 측정가능한 증가를 각 용량 후 14일째에 볼 수 있고, SP/RBD IgG Ab 역가 반응이 모든 용량 수준에 대해 각각의 추가 용량으로 계속 증가하였음을 강조한다.
실시예 18: 항원보강제 없이 마우스에서 서열번호 2의 SP-RBD의 유효도의 생체내 스크리닝.
서열번호 2의 SARS-CoV-2 SP/RBD(Fc 없음)를 상업적 출처(품목 # 46438; Lake Pharma, Inc., San Mateo, CA)로부터 수득하고, 이를 사용하여, 실시예 1에 따라 합성되고, 실시예 4에 따라 정제되고, 실시예 6에 따라 비-환원 및 환원 CE-SDS에 의해 구조적으로 확인되고, 실시예 7에 따라 글리칸 제거와 함께 LC-MS에 의해 확인된 구조 정체를 갖는, 서열번호 17의 Fc 함유 SP/RBD-Fc 단백질에 의한 Ab 반응의 증대를 비교하였다. 상대적인 용량 수준을 서열번호 17의 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질 및 서열번호 2의 SP/RBD간의 동몰량의 SP/RBD Ag에 기초하여 표준화하였다.
실시예 12의 과정에 따라, N=5, 6 내지 8주령 암컷 BALB/c 마우스의 그룹에, 100 ㎕의 부피로 5 ㎍/용량, 15 ㎍/용량, 및 40㎍/용량의 용량 수준으로 서열번호 2의 SP/RBD, 또는 표 3에 따라 항원보강제 없이, 100 ㎕의 부피로 0일, 21일 및 42일에 1 ㎍/용량, 3 ㎍/용량, 5 ㎍/용량, 30 ㎍/용량, 및 100 ㎍/용량의 용량 수준으로 항원보강제 없이 서열번호 17의 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질을 피하 주사를 통해 투여하였다. 한 그룹의 마우스에 염수 대조군을 투여하였다. 모든 마우스를 항-SP/RBD Ab 역가 평가를 위한 혈청 샘플을 수득하기 위해 각 주사 후 14일 및 21일에 턱밑 정맥천자를 통해 비-말단으로 채혈하였다. 각각의 용량 수준에서 항원보강제 없이 서열번호 2의 SP/RBD 또는 서열번호 17의 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질을 투여한 후 유도된 항-SP/RBD IgG Ab 역가 반응(IgG ELISA 표준 곡선을 통한 평균 IgG ㎍/㎖)을 14일 및 21일에 실시예 10에 따라 측정하고 이를 도 28에 예시한다.
중요하게는, 화학식량 및 2가의 서열번호 17의 고려에 기초하여 서열번호 2의 SP/RBD(27 kDa 단량체)와 서열번호 17(104 kDa 이량체) 사이에 대략 0.5의 상대적 "에피토프 용량" 차이가 존재한다; 즉 서열번호 17의 2가 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질은 2개의 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질 단량체의 대략 2배인 총 화학식량을 갖는 SP/RBD 에피토프의 2개의 모이어티를 함유한다(즉, 각각 104 kDa 대 54 kDa). 예를 들어, 서열번호 17 이량체 10 ㎍은 서열번호 17 단량체 ~5 ㎍과 같다.
[표 3]
Figure pct00004
Fc 모이어티의 효과는 14일과 21일 모두에서 입증되었다. 도 28에 나타낸 바와 같이, Fc 단편을 포함하는 서열번호 17의 유도된 항-SP/RBD IgG Ab 역가 반응은 초기 용량 후 14일째에도 거의 최대 역가에 도달한 반면, Fc 단편이 없는 SP/RBD는 21일 후에도 항-SP/RBD IgG Ab 역가 반응을 실질적으로 유도하지 않았다. 이 2개의 항원보강되지 않은 물질간의 이러한 면역원성 차이는 융합 단백질 Ag의 Fc 모이어티의 상당한 "내장된 항원보강제" 능력을 입증한다.
실시예 19: 항원보강제의 존재하에 마우스에서 서열번호 17의 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질의 유효도의 생체내 스크리닝.
서열번호 17의 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질을 실시예 1에 따라 합성하고, 실시예 4에 따라 정제하였다. 융합 단백질 구조물을 실시예 6에 따라 비-환원 및 환원 CE-SDS에 의해 확인하고 융합 단백질 서열 정체를 실시예 7에 따라 글리칸 제거와 함께 LC-MS에 의해 확인하였다. 서열번호 2의 SARS-CoV-2 SP/RBD(Fc가 없음)를 상업적인 출처(품목 #46438, Lake Pharma, Inc., San Mateo, CA)로부터 수득하였다.
실시예 12의 과정에 따라, N=5, 6 내지 8주령 암컷 BALB/c 마우스의 그룹에 표 4 및 표 5에 제공된 바와 같은 용량 수준의 서열번호 17의 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질 및 항원보강제, 및 0일, 21일 및 42일에 5 ㎍/용량의 용량 수준의 서열번호 2의 SP/RBD이 투여되었다. 서열번호 17의 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질 및 서열번호 2의 SP/RBD 투여 후 유도된 항-SP/RBD IgG Ab 역가 반응(IgG ELISA 표준 곡선을 통한 평균 IgG ㎍/㎖)을 실시예 10에 따라 21일(도 29에 예시됨), 35일(도 30에 예시됨), 56일(도 31에 예시됨) 및 88일(도 32에 예시됨)에 측정하였다.
[표 4]
Figure pct00005
[표 5]
Figure pct00006
전부는 아니지만, 10 ㎍ 용량 수준을 포함하는 일부 항원보강제 제형은 1차(21일), 2차(35일) 및 3차(56일) 투여 후 면역원성을 약 3 내지 5배 증가시켰으며, 이는 항원보강제들간의 다양한 효과를 입증하였다. 특히, 3차 용량 후 32일(즉, 88일)째에, 모든 제형에 의해 유도된 역가가 유의하게 상승된 상태를 유지하여, 1차 주사 후 3개월 후에도 서열번호 17에 대한 반응의 지속성을 입증하였다(도 32). 또한, 서열번호 17의 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질의 Fc 부분은, 서열번호 2(Fc 단편이 결여된)가 서열번호 17에 비해 21일에 유효하지 않았고 35일에 단지 약간만 유효하였으므로, 처음 2회 용량 후 유의한 항-SP/RBD IgG Ab 역가를 유도하는데 필요하였다.
실시예 20: 항원보강제의 존재 및 부재하에 마우스에서 서열번호 17의 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질에 의해 유도된 ACE2-결합 억제 효능의 생체내 효능 평가.
ACE2-결합 억제 효능의 생체내 평가를, Ag-결합 ELISA에 의해 측정된 백신-유도 IgG 역가가 특히, SARS-CoV-2 바이러스의 SP/RBD의 내인성 인간 표적 단백질, ACE2에의 결합의 억제와 관련하여 면역 혈청의 바이러스 중화 능력과 관련이 있는지 여부를 결정하기 위해 수행하였다. 면역 혈청의 일련의 희석과 함께 또는 상기 희석 없이 첨가된 표지된-재조합 인간 ACE 및 플레이트에 결합된 SP/RBD를 갖는 ELISA 포맷에서 재조합 SP/RBD의 재조합 ACE2에의 결합을 억제하는 면역 혈청의 효능을 수행하였다.
서열번호 17의 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질의 유효도를 추가로 평가하기위한 생체내 연구를 6 내지 8주령 Balb/c 마우스(Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME)에서 실시예 12에 기재된 일반적인 방법에 따라 수행하였다. 서열번호 17의 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질을 실시예 1에 따라 합성하고 실시예 4에 따라 정제하였다. 융합 단백질 구조물을 실시예 6에 따른 비-환원 및 환원 CE-SDS에 의해 확인하고, 융합 단백질 서열 정체를 실시예 7에 따라 글리칸 제거와 함께 LC-MS에 의해 확인하였다. 항원보강제 없이 10 ㎍/용량의 용량 수준의 서열번호 17의 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질 및 다양한 항원보강제와 함께 10 ㎍/용량의 용량 수준의 서열번호 17의 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질은 표 6에 따라 0일, 21일 및 42일에 피하 투여되었다.
[표 6]
Figure pct00007
혈액을 각 마우스로부터 턱밑 정맥천자법에 의해 각 투여 후 21일째(및 다음 용량 전)에 수집하고, 응고되도록 두고, 혈청을 실시예 10에 기재된 방법에 따라 ELISA에 의한 항체 분석을 위해 마이크로-진공관을 원심분리시켜 분리하고, 분액하고 동결시켰다. 실시예 13에 기재된 혈청학 분석의 결과는 결합된 재조합 인간 ACE2에의 재조합 SP/RBD의 결합을 억제하는 효능을 평가하였다. GraphPad Prism 소프트웨어를 사용하여 억제 희석 50%(ID50) 값이 유도된 혼주 혈청 샘플의 연속 희석을 수행하였다(즉, 특정 그룹의 각 마우스로부터 동일한 부피의 혈청을 혼합하고 이 혼주 샘플을 평가하였다). ID50 값은 ACE2 결합의 50%가 혈청 샘플에 의해 달성된 희석의 역수를 나타낸다. 0일에 단일 주사 후 21일에 계산된 ID50으로 측정된 ACE2 SP/RBD 결합의 억제 효능을 도 33에 예시한다. 0일 및 21일에 주사 후 42일째에 계산된 ID50을 도 34에 예시한다. 0일, 21일 및 42일에 주사 후 56일째에 계산된 ID50을 도 35에 예시하고, 88일째에 계산된 최종 ID50을 도 36에 예시한다.
이러한 서열번호 17의 3회 용량으로 면역된 마우스로부터의 면역 혈청의 ID50 값은 마지막 주사 후 32일(88일)까지 억제 효능이 유지되는 반응을 나타내었다(도 36). 더욱이, Montanide™ ISA 720 항원보강제는 각 시점에서 지속적으로 최고의 효능을 유도하였다. Montanide™ ISA 720 결과는 이 항원보강제로 얻은 총 IgG 역가가 다른 항원보강제가 첨가된 제형에 비해 예외적으로 강력하지 않았기 때문에 ISA 720으로 IgG 분자당 더 큰 고유 효능을 유도한다는 점을 감안할 때 특히 흥미롭고 놀라운 결과였다. 이러한 데이터는 이 백신 개발 프로그램의 주요 항원보강제 후보로 Montanide™ ISA 720의 선택을 강하게 지지하였다.
실시예 21: 노령의 마우스에서 항원보강제의 존재 및 부재하에 서열번호 17의 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질의 유도된 ACE2-결합 억제 효능의 유효도 및 효능의 생체내 스크리닝
현재 COVID-19 발병 기간 동안, 60세 이상의 개인은 더 높은 사망률과 함께 중증 질환에 대해 더 큰 감수성을 갖는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 면역계가 노화된 인간 성인의 노화 면역계에 대한 신뢰할 수 있는 모델인 노령의 마우스에서 면역 반응을 유도하는 백신 제형의 능력을 평가하는 것이 중요하다. 8개월령 후 마우스의 자연 사망률이 더 높기 때문에, 각 연구 그룹에 대략 15마리의 마우스를 할당하였다.
항원보강제의 존재 및 부재하의 서열번호 17의 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질의 유효도를 평가하기 위한 생체내 연구를 8 내지 10개월령의 암컷 BALB/c 마우스(Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME)에서 실시예 12에 기재된 일반적인 방법에 따라 수행하였다. 서열번호 17의 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질을 실시예 1에 따라 합성하고 실시예 4에 따라 정제하였다. 융합 단백질 구조물을, 실시예 6에 따라 비환원 및 환원된 CE-SDS에 의해 확인하고, 융합 단백질 서열 정체를 실시예 7에 따라 글리칸이 제거와 함께 LC-MS에 의해 확인하였다.
N=15, 8 내지 10개월령의 암컷 BALB/c 마우스 그룹에, 0일, 21일 및 42일에 100 ㎕ 부피로 표 7에 따른 항원보강제의 존재 및 부재하에 10 ㎍/용량의 용량 수준으로 서열번호 17의 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질DL 피하 투여되었다. 혈액을 각 마우스로부터 턱밑 정맥천자법에 의해 각 투여 후 21일째(및 다음 용량 전)에 수집하고, 응고되도록 두고, 혈청을 실시예 10에 기재된 방법에 따라 ELISA에 의한 항체 분석을 위해 마이크로-진공관을 원심분리시켜 분리하고, 분액하고 동결시켰다.
[표 7]
Figure pct00008
100 ㎕ 부피로 표 7에 따른 서열번호 17의 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질 투여 후 유도된 항-SP/RBD IgG Ab 역가 반응(IgG ELISA 표준 곡선을 통한 평균 IgG ㎍/㎖)을 실시예 10에 따라 측정하고 플롯팅하였다. 21일에 측정된 SP/RBD IgG Ab 역가 반응을 도 37에 예시한다. 35일에 측정된 SP/RBD IgG Ab 역가 반응을 도 38에 예시한다. 56일에 측정된 SP/RBD IgG Ab 역가 반응을 도 39에 예시한다.
항원보강제는 10 ㎍/용량의 서열번호 17을 갖는 제형에서 이러한 면역원성을 강하게 강화시켰다. 더 어린 마우스에서의 면역원성 프로파일과 유사하게, Montanide™ ISA 720은 56일에 항원보강제 없이 획득된 수준에 비해 서열번호 17의 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질의 억제 효능 ID50(실시예 13에 따라 측정된 바와 같은)을 17배까지 대단히 향상시켰다. 중요하게, 항원보강제의 존재 및 부재하에 서열번호 17의 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질에 의해 유도된 이러한 억제 효능은 인간 회복기 혈청 이상이었으며, 이는 이러한 SP/RBD-Fc 백신의 유망한 효과를 입증한다. 따라서, 서열번호 17의 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질은 항원보강제의 존재 및 부재하에서 노화된 면역계에서 충분한 효능과 함께 항-SP/RBD IgG 역가의 면역원성을 유지하여, 고령의 대상체에서 이와 같은 백신을 시험해야 하는 강력한 근거를 제공한다.
실시예 22: 항원보강제의 존재 및 부재하에 마우스에서 서열번호 19의 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질의 유효도의 생체내 스크리닝.
SP/RBD IgG Ab 역가 반응을 생성하는데 있어서 서열번호 19의 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질의 유효도를 평가하기 위한 생체내 연구를 수행하였다. 서열번호 19의 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질을 실시예 3에 따라 합성하고, 실시예 5에 따라 정제하였다. 융합 단백질 구조물을, 실시예 6에 따라 비환원 및 환원된 CE-SDS에 의해 확인하고, 융합 단백질 서열 정체를 실시예 7에 따라 글리칸이 제거와 함께 LC-MS에 의해 확인하였다.
실시예 12의 과정에 따라, N=5, 6 내지 8주령의 암컷 BALB/c 마우스(Jackson Laboratories) 그룹에, 0일, 21일 및 42일에 100 ㎕ 부피로 표 8에 따른 항원보강제의 존재 및 부재하에 1 ㎍ 및 10 ㎍의 용량 수준으로 서열번호 19의 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질이 피하 투여되었다.
[표 8]
Figure pct00009
혈액을 각 마우스로부터 턱밑 정맥천자법에 의해 각 투여 후 14일째에(즉 14일, 35일 및 56일에) 수집하고, 응고되도록 두고, 혈청을 ELISA에 의한 항체 분석을 위해 마이크로-진공관을 원심분리시켜 분리하고, 분액하고 동결시켰다.
유도된 SP/RBD IgG Ab 역가 반응(IgG ELISA 표준 곡선을 통한 평균 IgG ㎍/㎖)을 실시예 11에 따라 14일(도 40), 35일(도 41) 및 56일(도 42)에 측정 하였다.
서열번호 19의 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질은 항원보강제의 부재 하에 1 및 10 ㎍ 용량 수준에서 실질적인 IgG 역가를 유도하였으며, 이는 실시예 17에서 서열번호 17의 면역원성 프로파일과 일치하고, 1차(14일) 및 2차(35일) 용량 후 2개의 용량 수준 사이에서 현저한 용량-반응을 나타낸다. 예상한 바와 같이, 상이한 항원보강제와 함께 제형화된 서열번호 19의 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질은 각 투여 후 항원보강제가 없는 경우에 비해 실질적으로 더 높은 역가를 유도하였으며(1차 및 2차 용량 후 ~3 내지 10배), 항원보강제 Montanide™ ISA 720은 각 투여 후 Ad-Vax-2와 효과가 유사했지만 Montanide™ ISA 51은 덜 효과적이었다.
실시예 23: 항원보강제의 존재 및 부재하에 서열번호 19의 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질에 의해 유도된 ACE2-결합 억제 효능 및 플라크 감소 중화 시험(PRNT)의 효능의 생체내 평가.
항원보강제의 존재 및 부재하에 마우스에서 서열번호 19의 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질에 의해 유도된 ACE2-결합 억제 효능을 평가하기 위한 생체내 연구를 수행하였다.
서열번호 19의 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질을 실시예 3에 따라 합성하고, 실시예 5에 따라 정제하였다. 융합 단백질 구조물을, 실시예 6에 따라 비환원 및 환원된 CE-SDS에 의해 확인하고, 융합 단백질 서열 정체를 실시예 7에 따라 글리칸이 제거와 함께 LC-MS에 의해 확인하였다.
실시예 12의 과정에 따라, N=5, 6 내지 8주령의 암컷 BALB/c 마우스(Jackson Laboratories) 그룹에, 0일, 21일 및 42일에 100 ㎕ 부피로 표 8에 따른 항원보강제의 존재 및 부재하에 1 ㎍ 및 10 ㎍의 용량 수준으로 서열번호 19의 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질은 피하 주사를 통해 투여되었다.
혈액을 각 마우스로부터 턱밑 정맥천자법에 의해 각 투여 후 14일째에(즉 14일, 35일 및 56일에) 수집하고, 응고되도록 두고, 혈청을 ELISA에 의한 항체 분석을 위해 마이크로-진공관을 원심분리시켜 분리하고, 분액하고 동결시켰다.
실시예 13에 기재된 혈청학적 분석 결과는 결합된 재조합 인간 ACE2에 대한 재조합 SP/RBD의 결합을 억제하는 효능을 평가하였다. GraphPad Prism 소프트웨어를 사용하여 억제 희석 50%(ID50) 값이 도출된 혼주 혈청 샘플의 연속 희석을 수행하였다(즉, 특정 그룹의 각 마우스로부터 동일한 부피의 혈청을 혼합하고 이 혼주 샘플을 평가하였다). ID50 값은 ACE2 결합의 50%가 혈청 샘플에 의해 달성된 희석의 역수를 나타낸다. 0일에 단일 주사 후 14일째에 계산된 ID50으로서 측정된 ACE2 SP/RBD 결합의 억제 효능을 도 43에 예시한다. 0일 및 21일에 주사 후 35일째에 계산된 ID50을 도 44에 예시한다. 0일, 21일 및 42일에 주사 후 56일째에 계산된 ID50을 도 45에 예시한다.
서열번호 19의 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질은, 각 투여 후 인간 회복기 혈청의 것보다 상당히 높은 강한 ACE2-SP/RBD 억제 효능(ID50 값)을 유도하였다(도 43, 도 44 및 도 45). Montanide™ ISA720 항원보강제와 함께 제형화된 서열번호 19의 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질은 3차 용량 후에 가장 높은 효능을 달성하였음을 주목한다. 모든 경우에 서열번호 19의 더 높은 용량의 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질은, SARS-CoV-2 바이러스가 환자의 세포로 들어가는 것을 억제할 가능성이 더 높은 고 친화도 항체를 생산한다. 예상과 달리, 실시예 13에 기재된 ACE2 결합 억제 분석의 결과는 Montanide™ ISA 720 항원보강제와의 제형에서 서열번호 19의 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질이 실시예 11에 기재된 바와 같이 측정시 가장 낮은 수준의 항-RBD IgG 항체 역가 중 하나를 유도함에도 불구하고 모든 항원보강제 제형 중 가장 큰 억제성 항체를 생산함을 입증하였다. Montanide™ ISA 720 항원보강제는 피하 체류 시간 및 서열번호 19의 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질의 항원 제시 가능성을 증가시켜 가장 친화도가 높은 바이러스 중화 항체를 생산하는 데 매우 유리할 수 있다.
플라크 감소 중화 시험(PRNT)을 실시예 15에 따라 표 8에 기재된 바와 같이 코호트 3 및 코호트 4를 사용하여 수행하였다(서열번호 19의 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질을 Montanide™ ISA 720 항원보강제와 함께 1 ㎍ 및 10 ㎍의 용량 수준으로 투여하였다). 마우스 혈청 샘플 중의 유도된 SARS-CoV-2 바이러스 중화 효능을 도 46에 나타낸다. 흥미롭게도, 실시예 12의 절차에 따른 Montanide™ ISA 720 항원보강제와 함께 서열번호 19의 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질에 의한 마우스의 면역화는 또한 강한 PRNT 중화 효능을 나타내었으며, 1회 용량에서 2회 용량으로의 예상된 점진적인 상승이 이어졌고, 따라서 1차 용량 이후의 효능은 인간 혈청의 효능보다 낮지만, 2차 용량 이후의 혈청에서 유도된 효능은 인간 회복기 혈청의 효능보다 훨씬 더 컸다(~10배). 이것을 도 46에 예시한다. 중화 효능은 ACE2 억제 효능과 유사한 프로파일을 보였다.
실시예 24: 마우스에서 항-SP/RBD IgG2a, IgG2b 및 IgG3 아이소타입 역가를 유도하기 위한, 항원보강제의 존재 및 부재하에 서열번호 19의 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질의 유효도의 생체내 스크리닝.
항원보강제의 존재 및 부재하에 서열번호 19의 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질의 마우스에서의 항-SP/RBD IgG2a, IgG2b 및 IgG3 아이소타입 역가를 생성하는 유효도를 비교하기 위한 생체내 연구를 수행하였다. 서열번호 19의 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질을 실시예 3에 따라 합성하고, 실시예 5에 따라 정제하였다. 융합 단백질 구조물을, 실시예 6에 따라 비환원 및 환원된 CE-SDS에 의해 확인하고, 융합 단백질 서열 정체를 실시예 7에 따라 글리칸이 제거와 함께 LC-MS에 의해 확인하였다.
실시예 12의 과정에 따라, N=5, 6 내지 8주령의 암컷 BALB/c 마우스(Jackson Laboratories) 그룹에, 0일, 21일 및 42일에 표 9에 따른 항원보강제의 존재 및 부재하에 서열번호 19의 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질을 피하 주사를 통해 투여하였다.
[표 9]
Figure pct00010
혈액을 각 마우스로부터 턱밑 정맥천자법에 의해 각 투여 후 14일째에 수집하고, 응고되도록 두고, 혈청을 실시예 11에 기재된 방법에 따라 ELISA에 의한 항체 분석을 위해 마이크로-진공관을 원심분리시켜 분리하고, 분액하고 동결시켰다. 모든 항원보강제와 함께 서열번호 19의 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질은, 상당히 Th1-촉진된 IgG2a, IgG2b 및 IgG3 아이소타입 역가를 유도하였으며, 여기서 Montanide™ ISA 720은 모든 시점에서 일관되게 강력한 향상을 나타내었다(도 48, 도 49 및 도 50을 참조하시오). 또한, Th2-촉진 아이소타입, IgG1 역가는 Th1-연관 아이소타입보다 대략 10배 적었다(도 47). 이러한 결과는 Montanide™ ISA 720 항원보강제가 서열번호 19와 함께 전달될 때 특히 Th1 반응으로의 원하는 이동을 촉진하고 용량 절약 특성을 지원하고 임상 리드 항원보강제로서의 선택을 지원함으로써 강한 강화 효과를 유지하였음을 입증한다.
실시예 25: 마우스에서 항-SP/RBD IgG 아이소타입 역가를 유도하기 위한, 항원보강제의 존재 및 부재하에 서열번호 23의 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질 의 유효도의 생체내 스크리닝.
SP/RBD-Fc 융합 단백질 백신의 면역원성에 대한 기여에서 Fc 단편의 역할을, 마우스에서 인간 IgG Fc 구성물의 사용이 효능에 어떻게 영향을 미칠 수 있는지 이해하려고 시도함으로써 마우스에서 추가로 조사하였다. 마우스 IgG2a(서열번호 22)는 인간 IgG1에 대한 기능적 유사체이다.
EPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK(서열번호 22)
실험은 i) Fc 종 불합치가 SP/RBD-Fc 융합 단백질의 근본적인 면역원성의 원인일 수 있는지 여부 및 ii) 동물 모델에서 인간 IgG Fc 구성물로부터의 결과가 인간의 성능을 예측하는 데 적합한지의 여부를 결정하는 것을 목표로 하였다.
따라서 서열번호 23의 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질을, 서열번호 5의 링커와 함께 서열번호 14의 SP/RBD 및 서열번호 22의 마우스 IgG2a Fc 단편을 포함하도록 구성하였다.
RVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFGGGSGGGSEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK(서열번호 23)
서열번호 23의 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질의 SP/RBD IgG 아이소타입 역가 반응을 생성하는 유효도 및 서열번호 19의 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질 및 서열번호 2의 SP/RBD의 SP/RBD IgG 아이소타입 역가 반응을 생성하는 유효도의 비교를 수행하였다.
서열번호 19의 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질을 실시예 2에 따라 합성하고, 실시예 5에 따라 정제하였다. 융합 단백질 구조물을, 실시예 6에 따라 비환원 및 환원된 CE-SDS에 의해 확인하고, 융합 단백질 서열 정체를 실시예 7에 따라 글리칸이 제거와 함께 LC-MS에 의해 확인하였다. 서열번호 23의 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질을 상업적 출처(카탈로그 # SPD-C5259, ACRO Biosystems, Newark, DE)로부터 수득하였다. 서열번호 2의 SARS-CoV-2 스파이크 단백질 수용체 결합 도메인(SP/RBD)(Fc 없음)을 상업적 출처(품목 46438; Lake Pharma, Inc., San Mateo, CA)로부터 수득하였다.
실시예 12의 과정에 따라, N=5, 6 내지 8주령의 암컷 BALB/c 마우스(Jackson Laboratories) 그룹에, 0일 및 21일에 표 10에 주어진 용량 수준에 따라 서열번호 19의 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질, 서열번호 23의 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질, 또는 서열번호 2의 SP/RBD를 피하 주사를 통해 투여하였다.
[표 10]
Figure pct00011
혈액을 각 마우스로부터 턱밑 정맥천자법에 의해 각 투여 후 14일째에 수집하고, 응고되도록 두고, 혈청을 실시예 11에 기재된 방법에 따라 ELISA에 의한 항체 분석 및 실시예 13에 기재된 방법에 따라 ACE2-SP/RBD 결합 억제 효능을 위해 마이크로-진공관을 원심분리시켜 분리하고, 분액하고 동결시켰다.
항원보강제 없이 마우스 IgG2a를 포함하는 쥐 Fc를 함유하는 서열번호 19 및 서열번호 23을 사용한 면역화(표 10의 코호트 1, 2, 5, 및 6)는 1차 또는 2차 용량 후 14일째(즉, 도 51에 도시된 14일째 및 도 52에 도시된 35일째)에 IgG 역가의 유도에서 유의한 차이를 나타내지 않았으며, 이는 인간 Fc 항원성 서열이 BALB/c 마우스 면역원성 모델에서 고유의 마우스 Fc 서열과 어떠한 차이도 없이 수행되지 않음을 입증한다. 서열번호 17을 사용하여 얻은 결과와 유사하게, Fc 단편이 없는 서열번호 2(표 10의 코호트 9 및 10)는 항원보강제의 부재하에 서열번호 23 또는 서열번호 19에 비해 1차 및 2차 용량 후에 면역원성이 아니었다. SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질(서열번호 23)의 마우스 버전이 네이키드 SP/RBD 단백질(서열번호 2)에 비해 마우스에서 향상된 면역원성을 나타낸다는 점을 감안할 때, 인간 버전이 인간에서 강화된 면역원성을 나타낼 가능성이 매우 높다.
항원보강제 존재하에 마우스 IgG2a를 포함하는 쥐 Fc를 함유하는 서열번호 19 및 서열번호 23을 사용한 면역화(표 10의 코호트 3, 4, 7 및 8)는 1차 또는 2차 용량 후 14일째(즉, 도 53에 도시된 14일째 및 도 54에 도시된 35일째)에 ACE2-SP/RBD 결합 억제 효능에서 유의한 차이를 나타내지 않았으며, 이는 인간 Fc 항원성 서열이 BALB/c 마우스 면역원성 모델에서 고유의 마우스 Fc 서열과 어떠한 차이도 없이 수행되지 않음을 입증한다. 서열번호 19 및 서열번호 23은 모두 단지 1회 용량 후에조차도 인간 회복기 혈청(HCS)보다 큰 ACE2-SP/RBD 결합 억제 효능을 나타내었다. 서열번호 17을 사용하여 얻은 결과와 유사하게, Fc 단편이 없는 서열번호 2는 항원보강제의 부재하에서조차 서열번호 23 또는 서열번호 19에 비해 1차 및 2차 용량 후에 ACE2-SP/RBD 결합 억제의 면에서 효능이 없었다. SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질(서열번호 23)의 마우스 버전이 네이키드 SP/RBD 단백질(서열번호 2)에 비해 마우스에서 향상된 면역원성을 나타낸다는 점을 감안할 때, 인간 버전이 인간에서 강화된 면역원성을 나타낼 가능성이 매우 높다.
실시예 26: 보관 후 Montanide™ ISA-720 항원보강제의 존재하에 마우스에서 서열번호 19의 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질의 유효도의 생체내 스크리닝.
제조 후 1일 및 7일간 4℃ 및 25℃에서 보관된 동일한 유화액으로 Montanide™ ISA 720 유화액을 사용하여 신선하게 제조된 서열번호 19의 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질의 SP/RBD IgG Ab 역가 반응을 생성하는 유효도를 비교하기 위한 생체내 연구를 수행하였다. 서열번호 19의 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질을 실시예 3에 따라 합성하고, 실시예 5에 따라 정제하였다. 융합 단백질 구조물을, 실시예 6에 따라 비환원 및 환원된 CE-SDS에 의해 확인하고, 융합 단백질 서열 정체를 실시예 7에 따라 글리칸이 제거와 함께 LC-MS에 의해 확인하였다.
실시예 12의 과정에 따라, N=5, 6 내지 8주령의 암컷 BALB/c 마우스(Jackson Laboratories) 그룹에, 신선하게 또는 1일 및 7일간 4℃ 및 25℃에서 보관 후 Montanide™ ISA 720 항원보강제 30%/70% v/v와 혼합된 10 ㎍의 용량 수준의 서열번호 19의 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질을 피하 주사를 통해 투여하였다.
혈액을 각 마우스로부터 턱밑 정맥천자법에 의해 각 투여 후 14일째에 수집하고, 응고되도록 두고, 혈청을 실시예 13에 기재된 방법에 따라 ELISA에 의한 항체 분석을 위해 마이크로-진공관을 원심분리시켜 분리하고, 분액하고 동결시켰다.
실시예 13에 기재된 ACE2 결합 억제 분석의 결과는 서열번호 19의 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질이 새로 제조된 유화액 대 1일 및 7일간 4℃ 및 25℃에서 보관된 유화액의 주사 후 마우스의 혈청에서 유사한 억제 효능(ID50 값)을 유도함을 입증하였다. 도 55에 도시된 바와 같이, 신선하게 제조된 유화액을 주사한 동물 대 임의의 오래된 유화액 사이에 ID50 값에서 유의한 차이가 없다(p>0.05).
실시예 27: 비인간 영장류(NHP; 즉 키노몰구스 원숭이)에서 항원보강제, Montanide™ ISA 720 존재하에 서열번호 19에 의해 유도된 ACE2-결합 억제 효능의 예비 투여 유효도 및 효능.
마우스로부터의 상기 인간 IgG1 Fc 융합 단백질 면역원성 지식을 인간 임상 연구로 번역하기 위해, 항원보강제(Montanide™ ISA 720)의 존재 또는 부재하에 제형화된 서열번호 19의 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질을 유전적으로 더 관련이 있는 NHP 종인 키노몰구스 원숭이에서 시험하였다. 키노몰구스 원숭이 IgG1-Fc 영역 서열은 인간 IgG1-Fc 서열과 매우 유사하고 키노몰구스 IgG 효과기 기능 및 인간 IgG1은 키노몰구스 원숭이에서 실제로 활성이었지만 다소 감소된 효능을 갖는다. 따라서, 인간 IgG1-Fc 융합 단백질을 갖는 키노몰구스 원숭이에서 획득된 효능 결과는 인간에서 인간 IgG1-Fc 융합 단백질의 성능을 약간 과소평가할 가능성이 있다. 마지막으로, 키노몰구스 원숭이 결과의 번역 가능성은 서열번호 19의 인간 IgG Fc 단편이 인간 FcR 및 FcRn 수용체에 대해 획득된 것과 유사한 효능으로 키노몰구스 FcR 및 FcRn 상동체에 결합할 수 있음을 입증함으로써 확인되었다. 상이한 농도의 His-태그된 인간 및 키노몰구스 FcR 상동체 분자를 플라스틱-결합된 서열번호 19에 첨가하였다. 결합되지 않은 분자를 세척한 후, 결합된 분자를 표지된 항-His 2차 항체로 검출하고 비색적으로 전개시키고 흡광도(OD 450)를 분광광도계를 통해 측정하였다. 도 56, 도 57, 도 58 및 도 59에 나타낸 바와 같이, 키노몰구스 원숭이 결과의 번역 가능성은, 서열번호 19의 인간 IgG Fc 단편이 인간 FcR 및 FcRn 수용체에 대해 획득된 것과 유사한 효능으로 키노몰구스 FcR 및 FcRn 상동체에 결합할 수 있음을 입증하여, NHP 모델의 임상 관련성을 확립시킴으로써 확인되었다.
서열번호 19의 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질을 실시예 2 또는 실시예 3에 따라 합성하고, 실시예 5에 따라 정제하였다. 융합 단백질 구조물을, 실시예 6에 따라 비환원 및 환원된 CE-SDS에 의해 확인하고, 융합 단백질 서열 정체를 실시예 7에 따라 글리칸이 제거와 함께 LC-MS에 의해 확인하였다.
N=3의 수컷 및 암컷 키노몰구스 원숭이 그룹에, 표 11에 따라 0일 및 21일에 단일 피하 주사를 통해 30%/70%(v/v)의 Montanide™ ISA 720 항원보강제 중의 서열번호 19의 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질을 피하 투여하였다. 6마리 원숭이 중 5마리에게 두 번째 주사 후 약 3개월에서 4개월 반 사이에 30%/70%(v/v)의 Montanide™ ISA 720 항원보강제 중의 서열번호 19의 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질의 추가접종 주사를 투여하였다.
[표 11]
Figure pct00012
혈액을 각 NHP부터 수집하고, 응고되도록 두고, 혈청을 실시예 11에 기재된 방법에 따라 ELISA에 의한 항체 분석을 위해 마이크로-진공관을 원심분리시켜 분리하고, 분액하고 동결시켰다.
10 ㎍ 및 30 ㎍의 용량 수준에서 Montanide™ ISA 720 항원보강제와 함께 제형화된 서열번호 19의 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질의 유도된 항-SP/RBD IgG Ab 역가 반응(IgG ELISA 참조 혈청 표준 곡선을 통한 평균 IgG ㎍/㎖)을, 실시예 11에 따라 1회 용량 후 0일, 1회 용량 후 14일, 1회 용량 후 20일, 2회 용량 후 35일 및 2회 용량 후 42일째에 측정하였으며, 이는 강력하게 유도된 IgG Ab 역가를 나타내었고, 여기서 30 ㎍의 더 높은 용량 수준은 도 60에 도시된 바와 같이 0일 및 21일 용량 후 모든 시점에서 10 ㎍의 더 낮은 용량 수준보다 더 큰 면역원성을 나타내었다.
항-SP/RBD IgG Ab 역가가 떨어진 후 102일 또는 154일째에 추가접종(3차) 용량을 받은 동물의 경우, 단일 추가접종 용량 후 유도된 항-SP/RBD IgG Ab 역가 반응은 도 61에 도시된 바와 같이 유의수준이었으며, 이는 강한 기억 회상을 가리킨다.
또한, 이들 IgG Ab 역가 면역원성 프로파일은 서열번호 19의 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질에 의해 유도되고 실시예 13에 따라 측정된 ACE2-결합 억제 효능(ID50)과 일치하였으며, 이는 도 61에 도시된 바와 같이 인간 회복기 혈청(HCS)의 효능보다 훨씬 높고, 이때 ID50 값은 10 ㎍ 및 100 ㎍ 용량 수준 모두에 대해 1회 투여 후 21일 및 2회 투여 후 42일째에 계산된 혈청 샘플에 의해 ACE2 결합의 50%가 달성된 희석의 역수를 나타낸다.
실시예 28: 비인간 영장류(NHP; 즉, 키노몰구스 원숭이)에서 항원보강제, Montanide™ ISA 720 존재하에 서열번호 19의 재조합 ACE2 및 SP/RBD의 생화학적 상호작용을 방해하는 억제 효능을 확인하기 위한 플라크 감소 중화 시험.
이러한 번역 연구를 진행함에 있어서, 플라크 감소 중화 시험(PRNT)에서 생 VERO-E6 세포를 감염시키는 생 SARS-CoV-2 바이러스의 중화를 통해 재조합 ACE2와 SP/RBD의 생화학적 상호작용을 방해하는 상기 억제력이 확인되었다.
N=3의 수컷 및 암컷 키노몰구스 원숭이 그룹에, 표 11에 따라 0일 및 21일에 30%/70%(v/v)로 Montanide™ ISA 720 항원보강제 중의 서열번호 19의 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질을 피하 투여하였다. 혈액을 각 NHP로부터 수집하고, 응고되도록 하고, 혈청을 분석을 위해 미세 진공 튜브를 원심분리하여 분리하고, 분액하고, 동결시켰다.
플라크 감소 중화 시험을 실시예 15에 따라 수행하였다. NHP 혈청 샘플에서 서열번호 19의 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질 유도된 SARS-CoV-2 바이러스 중화 효능을 도 62에 나타낸다. 이러한 PRNT ID50 값은 인간 회복기 혈청의 값과 유사했지만, 중화 효능은 ACE2 억제 효능과 유사한 프로파일을 나타내었다.
이러한 결과는 NHP에서 백신접종을 시험하는 가치를 입증하고 최초의 인간 임상 시험을 설계하기 위한 귀중한 지침을 제공하며 인간으로의 번역에 대한 기대치를 설정한다.
실시예 29: 마우스 및 비-인간 영장류(NHP; 즉 키노몰구스 원숭이)에서 SARS-CoV-2의 영국 변종(N501Y) 및 남아프리카 변종(E484K)에 대한 항원보강제, Montanide™ ISA 720 존재하의 서열번호 19의 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질 백신의 유효도.
서열번호 19의 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질과 항원보강제 Montanide™ ISA 720이 SARS-CoV-2 바이러스의 변종, 특히 영국 및 남아프리카 바이러스 변종에 대해 유효한 지를 이해하고자 분석을 수행하였다.
도 66은 Clustal Omega를 사용하여 수행된, 서열번호 2의 SARS-CoV-2 고유 SP/RBD와, UK N501Y 바이러스 변종(서열번호 24) 및 남아프리카 E484K 바이러스 변종(서열번호 25)의 유사체 SP/RBD 단편의 나란한 비교를 예시한다. "*"는 주어진 서열 위치에서 모든 서열에 걸쳐 완전한 상동성을 나타낸다. ":"(콜론)은 Gonnet PAM 250 매트릭스에서 0.5를 초과하는 점수로 매우 유사한 특성의 그룹 간의 보존을 가리킨다. "-"(대시)는 특정한 서열 범위내의 특정한 비교 세트내에 국소적인 상동성이 존재하지 않음을 의미하는 서열 끊김을 가리킨다.
PNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTYGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLE(서열번호 24)
PNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVKGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLE(서열번호 25)
실시예 27에 따라 투여된 NHP로부터의 혈청 샘플을 동물 1, 2, 3, 5 및 6으로부터 42일째에 추출하였다. 실시예 22에 따라 투여된 마우스로부터의 혈청 샘플을 56일째에 추출하였다. NHP 및 마우스 둘다 항원보강제, Montanide™ ISA 720과 함께 서열번호 19의 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질 백신 2회 용량으로 면역화시켰다.
혈청 샘플을 플라스틱-결합된 재조합 RBD 야생형(Lake Pharma, San Mateo, CA) 또는 돌연변이 N501Y(영국 변종, SINO Biological, Wayne PA에서 제공) 또는 E484K(남아프리카 변종, AcroBiosystems, Newark, DE 에서 제공)에 추가하였다. 결합된 RBD-특이적 IgG를, 표지된 항-NHP 또는 항-마우스 IgG 2차 항체로 검출하고 비색 전개시켰다(OD450 값). IgG ㎍/㎖ 역가 값을 NHP 또는 마우스 ELISA 참조 혈청 표준 곡선을 통해 측정하고 평균(N=4)을 보고하였다.
도 64 및 도 65에 나타낸 결과는 NHP 및 마우스로부터의 이러한 면역 혈청이 재조합 RBD 돌연변이체, N501Y 및 E484K, 뿐만 아니라 야생형 RBD 분자 또는 그 이상에 결합함을 예시하며, 이는 영국(N501Y) 및 남아프리카(E484K) 바이러스 변종이 서열번호 19 유도 면역을 이탈할 가능성이 없음을 가리킨다.
서열번호 19의 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질의 독성학 연구 결과를 예시하는 실시예
실시예 30: 2주의 회복 기간을 가진 뉴질랜드 흰토끼에서 서열번호 19의 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질 백신의 반복 용량 독성 연구.
뉴질랜드 흰토끼를 사용하여 독성학 IND를 가능하게 하는 연구를 수행하였다. 토끼는 이 종이 강력한 Ab 반응을 일으키는 백신 유도 면역원성에 대한 전임상 연구에 광범위하게 사용되었기 때문에 선택되었다. 또한, 토끼는 SARS-CoV-2 바이러스 수용체인 ACE2를 발현하며, 이는 상기 바이러스가 동물에 결합하여 동물을 감염시켜 인간 COVID-19와 유사한 질병 증상을 유발시키게 한다. 백신 항원 서브유닛은 인간 IgG1 Fc 분자에 융합된 SARS-CoV-2 바이러스의 스파이크 단백질의 ACE2 수용체 결합 도메인으로, 이는 잠재적으로 토끼(폐, 상피, 뉴런에서 발현됨)에서 ACE2에 직접 결합하여 병리를 유발할 수 있다.
Montanide™ ISA 720 항원보강제 존재 및 부재하에 서열번호 19의 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질의 안전성, 독성, 독력학 및 면역원성 프로파일을 총 3회 주사 동안 14일마다 피하 주사된 백신 제형을 사용하여 평가하고 14-일 무치료 회복 기간 동안 독성 징후의 가역성을 평가한다. 적극적인 14일 주사 일정은, 인간 임상 연구에서 의도한 덜 공격적인 28일 주사 일정이 동물 독성학에 의해 충분히 뒷받침되도록 하기 위한 것이다. 연구 종점에는 임상 관찰, 체중 증가/감소, 음식 섭취, 임상 병리학, 및 말기 육안 부검, 기관 중량 및 조직병리가 포함된다.
서열번호 19의 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질을 실시예 3에 따라 합성하고, 실시예 5에 따라 정제하였다. 융합 단백질 구조물을, 실시예 6에 따라 비환원 및 환원된 CE-SDS에 의해 확인하고, 융합 단백질 서열 정체를 실시예 7에 따라 글리칸이 제거와 함께 LC-MS에 의해 확인하였다.
연구 대상체는 생후 3 내지 4개월, 체중 2 내지 4 ㎏의 나이브, 특정 병원체 없는 수컷 및 암컷 뉴질랜드 흰토끼이다. 토끼를 스테인레스 스틸 이동식 케이지에 단독으로 또는 그룹으로 수용하고 투여 전에 14일간 순응시킨다.
주요 연구 처리 그룹당 5마리의 수컷 및 5마리의 암컷 토끼와 회복 처리 그룹당 3마리의 수컷 및 3마리의 암컷 토끼에, Montanide™ ISA 720 항원보강제와 함께 또는 상기 항원보강제 없이 제형화된 서열번호 19의 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질 30 ㎍ 또는 100 ㎍ 용량, 또는 비히클 음성 대조군(염수)을 제공하였다. 처리 기간 동안 관찰된 모든 부작용의 가역성을 조사하고, 임의의 가능한 지연된 부작용 가능성을 스크리닝하기 위해 회복 그룹을 포함시켰다. 토끼에 대한 반복 투여 독성학 연구의 구체적인 세부 사항을 표 12에 제공한다.
[표 12]
Figure pct00013
서열번호 19의 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질의 표적 생성물 프로파일은 인간에서 2회 이하의 면역 주사를 포함하므로, 3회 백신 용량이 1, 15 및 29일에 투여되는 "임상 투여 + 1" 전략이 사용되었다(15일 및 29일 독력학 주사가 각각 1일 및 15일 주사로부터 유도된 항-SP/RBD 역가의 존재하에 있도록 설계된다). s.c. 및 i.m. 투여 경로를 모두 평가하였다.
실시예 31: 토끼의 GLP 독성학 연구에서 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질의 혈청 수준, 항-SP/RBD IgG의 혈청 수준, 및 관찰 및 정량적 안전성 평가.
PK/TK 분석은 토끼 혈청 연구 샘플에 존재하는 서열번호 19의 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질이 미세적정 웰상에 코팅된 염소 항-인간에 의해 포획되고 이어서 고감도 스트렙트아비딘-HRP 검출 항체와 반응하는 항-인간 IgG-Fc 비오틴 접합체에 이어서 TMB 기질 시스템에 의해 정량분석되는 효소 결합 면역흡착 분석(ELISA)이다. 정제된 서열번호 19는 분석을 위한 표준 곡선을 준비하고 분석 대조군을 만드는 데 사용된다. 4개의 QC(고 QC, 중간 QC, 저 QC 및 음성 QC)를, 정제된 서열번호 19 모액을 정상 토끼 혈청(Jackson Immuno)에 스파이킹하여 10x로 준비하고 여러 번 시험하여 공칭 값을 설정하고, 단일-해동 사용을 위해 소량 분액으로 -20℃에서 냉동 보관하였다. 이러한 QC는 정확성, 정밀도, 정량 한계, 희석 선형성, 스파이크 회수 및 단기 안정성을 평가하기 위한 검증 분석에서 스파이크 검증 샘플로 사용되었다.
사전 검증 동안, 1:10의 최소 요구 희석액(MRD)이 이 ELISA에 최적인 것으로 결정되었으며 이 희석액을 검증 실행에 사용하였다. 따라서, 10%의 정상 토끼 혈청(Jackson Immuno; H2O로 재조성된 동결건조된 정상 토끼 혈청)을, 1차 검증 실행 동안 표준 곡선을 만드는 데 사용되는 희석 완충액에 첨가하였다. 실제 정상 토끼 혈청(BioIVT)으로 스파이크 회복을 시험했을 때, 정상 토끼 혈청에서는 볼 수 없는 매트릭스 효과로 인해 스파이크 값의 유의한 과소 회복이 관찰되었다.
이러한 결과에 기초하여, 비-임상 토끼 혈청 샘플에서 서열번호 19의 회수를 더 잘 나타내기 위해 표준 곡선의 작성에 정상 토끼 혈청보다는 토끼 혼주 혈청을 사용해야 한다고 결정하였다. 정확도 및 정밀도, 선형성, 스파이크 및 복구와 같은 선택된 매개변수를 표준 곡선 완충액에서 10% 정상 토끼 혼주 혈청(BioIVT)을 사용하여 다시 시험하였다.
혼주 혈청 표준 곡선을 사용할 때, 분석-내 및 분석-간 정확도는 3개의 0이 아닌 QC 수준 모두에서 93 내지 105% 범위였다. 분석은 2 ng/㎖ 내지 100 ng/㎖에서 선형인 것으로 밝혀졌으며, 해당 값은 각각 정량 하한(LLOQ) 및 정량 상한(ULOQ)인 것으로 나타났다. 혼주 혈청 표준 곡선을 사용할 때 스파이크 회복은 11개의 서로 다른 혈청 샘플에서 매우 정확했으며 높은 스파이크 수준(70 ng/㎖)에서 100 내지 117%, 중간 스파이크 수준(40 ng/㎖)에서 107 내지 116%, 및 낮은 스파이크 수준(10 ng/㎖)에서 108 내지 123%의 회복 범위를 보였다. 스파이크 혈청 샘플은 적어도 3x 동결-해동 주기(95 내지 103% 회복)를 통해 4℃에서 최대 1주일(97 내지 100% 회복), 및 실온에서 4시간(91 내지 98%)에서 안정적인 것으로 밝혀졌다. 이러한 검증 결과는 서열번호 19 PK/TK ELISA가 매우 정확하고 재현가능하며 목적에 적합함을 보여준다.
동일한 동물을 투여 전, 1차, 2차 및 3차 주사 후 6h, 24h 및 48h 째에 채혈하는 4-시점 TK 연구를 수행하였으며, 적합한 혈액 부피를 면역원성 분석 외에 TK 분석을 위해 각 채혈로부터 수득하였다.
면역계에 대한 전신 효과를, 림프절을 배액하고 1차 투여 전, 및 1차 및 마지막 용량 투여 후 약 2 내지 3일 동안, 본 연구를 위한 중단시, 및 회복 그룹의 중단시 혈액학 및 혈청 화학을 수행함으로써 평가하였으며, 절대 및 상대적인 차등 백혈구(WBC) 수(림프구, 단핵구, 과립구, 비정상 세포), 알부민/글로불린 비, 효소 및 전해질을 포함하였다. 혈청 샘플을 백신 특이적 Ab 역가 및 TK 수준에 대해 평가하였다.
매일의 임상 관찰에는 주사 후 최대 3일 동안 주사 부위의 국소 염증 반응 검사 및 그 후 매주 검사(이러한 관찰에는 부기, 만지면 통증 반응, 운동 장애 및 육아종성 결절이 포함된다)가 포함되었다. 건강 상태(기면, 운동 부족, 걷기 어려움, 먹지 않음 등)에 대한 매일 관찰도 수행하였다. 대략 12시간의 금식 후 연구 종료 시 주간 체중 및 음식 소비(식욕 결여, 식욕 부진)를 모니터링하고 평가하였다.
연구 종료 시, 혈청 화학, 혈액학 및 면역학적 조사를 위해 혈액 샘플을 수집하고, 이 시점에서 전체 병변 및 기관 중량의 검사와 함께 완전한 육안 부검을 수행하였다. 조직의 조직병리학적 검사를 수행하고 면역 기관(국소 및 원위 림프절, 비장, 골수 및 페이에르판), 중추 기관(폐, 간, 신장, 뇌 및 생식 기관) 및 백신 투여 부위에 특별한 주의를 기울였다. 국소 독성(백신 투여 부위) 평가에는 염증 반응(예를 들어, 연성 육아종 결절, 경질 섬유성 결절, 궤양 등) 및 절제된 부위에 대한 평가가 포함되었고, 조직병리학적 검사가 수행되었다. 폐 조직의 호산구 증가증을 특히 평가하였다.
용량을 표 12에 따라 제형화하고 제조하였다. 투여 부위를 회전하고, 투여 전에 클립 고정하고, 지울 수 없는 마커로 표시하였으며, 토끼에게 1일, 15일 및 29일에 피하 투여하고, 토끼를 각 용량 전 및 1시간 후에 1일 2회, 매일 및 매주 상세한 임상 관찰을 수행하였다. 주사 부위 염증을 평가하기 위한 Draize 채점을 각 용량 후 24, 48 & 72시간째에 수행하였다. 용량 후 72시간째에 0이 아닌 점수가 제공된 경우, 결과가 해결되거나 동물이 희생될 때까지 7일마다 상기 부위를 채점하였다.
체온을 각 용량 전, 및 각 용량 후 6시간 및 24시간째에 측정하였다. 체온이 40℃를 초과하면, 값이 정상으로 돌아올 때까지 24시간마다 추가 측정을 하거나 동물을 희생시켰다. 체중을 첫 번째 투여 전, 첫 번째 투여 후 24시간 및 48시간 후, 매주 및 예정된 각 부검 전에 기록하였다. 토끼를, 순응 기간에 한 번, 그 다음에는 사망에 대해 매일 2회 검사하였다. 음식 소비량은 매일 정량적으로 측정하였다. 안과 검사는 1차 용량 전과 예정된 각 부검 전에 1회 수행되었다.
임상 화학 및 혈액학을 1차 용량 전에 한 번, 1차 및 마지막 투여 후 48시간에, 주요 연구 그룹의 부검 시 모든 동물 및 회복 기간 종료 시 나머지 동물에 대해 수행하였다. 응고는 1차 용량 전, 각 투여 후 3일에 한 번, 주요 연구 그룹의 부검 시 모든 동물 및 회복 기간 종료 시 나머지 동물에 대해 조사되었다.
C-반응성 단백질에 대해서 혈액을, 1차 투여 전 1회, 각 투여 후 3일, 주요 연구 그룹의 부검 시 모든 동물 및 회복 기간 종료 시 나머지 동물에서 수집하였다. 1차 용량 전과 각 투여 후 14일째, 주요 연구 그룹의 부검 시 모든 동물, 및 회복기간 종료 시 나머지 동물상에서, ELISA를 통해 ADA에 대해 모든 동물로부터 혈액을 수집하였다(최종 투여 제외). 연구에서 각 동물에 대한 4-점 독력학(TK) 혈액 샘플링을 1차, 2차 및 3차 용량에서 수집하였다. 즉, 혈액을 투여 전 1일째와 각 투여 후 6h, 24h 및 48h 후에 채취한 다음, 본 연구를 위한 중단 36일째 및 회복 동물의 경우 43일째에 1회의 추가 샘플링하였으며; 혈청 서열번호 19 농도 분석을 ELISA를 통해 수행하였다.
36일째(주 연구) 및 43일째(회복)에 전체 부검을 계획된 각 부검에서 모든 동물에 대해 전체 조직 수집 및 표준 기관 중량으로 수행하였다. 조직 병리학 검사는 슬라이드로 처리된 조직을 통해 수행되었으며 모든 주요 연구 및 회복 동물뿐만 아니라 발견된 사망, 및 사지에서 안락사된 동물에 대해 평가되었다.
독성 연구 결과 사망은 없었다. 투여 단계 동안, 투여 단계 4일째부터 Montanide™ ISA 720과 함께 100 ㎍ 서열번호 19를 제공하고 투여 단계 32일째부터 Montanide™ ISA 720과 함께 30 또는 100 ㎍ 서열번호 19를 제공한 수컷, 및 투여 단계 18일째부터 Montanide™ ISA 720과 함께 100 ㎍ 100 ㎍ 서열번호 19, 및 투여 단계 32일째부터 Montanide™ ISA 720과 함께 30 또는 100 ㎍ 100 ㎍ 서열번호 19를 제공한 암컷에서 피브리노겐의 증가는 일반적으로 통계적으로 유의하였으며 시험 항목 및 만성 활동성 염증의 현미경적 발견과 관련이 있을 수 있다. 회복 단계 동안 피브리노겐의 차이가 회복된 것으로 간주되었다. 통계적으로 유의한 피브리노겐 차이가 암컷에서 나타났지만 순응 값과 비슷하였으며 생물학적 변이로 인해 시험 항목과 관련이 없을 가능성이 있는 것으로 간주되었다. 예정된 수집에서 다른 시험 항목 관련된 임상 병리학적 변화는 없었다.
오직 수컷에서 알라닌 아미노트랜스퍼라제, 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라제, 칼슘, 락테이트 데하이드로게나제, 칼륨, 클로라이드, 림프구 퍼센트, 활성화된 부분 트롬보플라스틴 시간, 및 오직 암컷에서 나트륨의 통계적으로 유의한 차이가 생물학적 변이로 인해 고려되었으며 이들은 시험 항목과 관련이 없다. 수컷과 암컷의 글루코스, 글로불린 또는 알부민/글로불린 비, 이염색백혈구 및 이염색백혈구 퍼센트, 프로트롬빈 시간의 통계적으로 유의한 차이는 적응 값에 필적하거나 세션 간에 일치하지 않는다. 이러한 차이는 작았고, 수컷에게는 존재하지 않았거나, 값이 순응 시 값에 필적하였으며, 시험 항목과 관련되지 않고 생물학적 변이에 기인한 것으로 간주되었다. 주요 또는 회복 종료 지점에서 기관 중량 차이는 없었다. 작은 차이는 통계적으로 유의하지 않았거나, 용량과 무관하거나, 성별 간에 일치하지 않았으며 시험 항목 투여와 관련이 없는 것으로 간주되었다.
독력학(TK) 연구에서, 토끼에서 SP/RBD Ag에 특이적인 서열번호 19 유도된 항-약물 항체(ADA) IgG 역가를 측정하였다. 토끼를, PBS 비히클(그룹 1), 30 ㎍ 서열번호 19(그룹 2), 100 ㎍ 서열번호 19(그룹 3), Montanide™ ISA 720이 있는 서열번호 19 30 ㎍(그룹 4), 또는 Montanide™ ISA 720이 있는 서열번호 19 100 ㎍(그룹 5)을 14일 간격으로 3회 투여한 N=10 동물/그룹으로 나누었다. 지정된 시간 후에 혈청 샘플을 수집하고 실시예 14에 따라 항-SP/RBD IgG Ab 역가(토끼 IgG 표준 곡선을 사용한 ELISA를 통한 IgG ㎍/㎖ 평균)에 대해 평가하였다.
항원보강제 없이 서열번호 19의 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질(즉, 도 68 및 도 69에 도시된 바와 같은 그룹 2 및 3)은 비히클 대조용 그룹 1의 범위에 있는, 즉 10 ㎍/㎖ 미만인 모든 시점에서 무시해도 될 정도로 약한 항-SP/RBD-특이적 IgG 역가를 나타내었다(도 67에 도시된 바와 같다). 그러나, 1차(15일), 2차(29일) 및 3차(43일) 주사 후에 30 ㎍ 및 100 ㎍(각각 그룹 4 및 5)의 서열번호 19 용량과 함께 Montanide™ ISA 720 항원보강제의 존재하에서 상당한 특이성 IgG 역가가 유도되었으며, 이는 도 70 및 도 71에 도시된 바와 같이 2차 및 3차 투여 후 인간 회복기 혈청의 주사보다 훨씬 높았다(~10배). 항원보강제 Montanide™ ISA 720과 함께 서열번호 19의 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질로 처리된 그룹 4 및 5에서 30 ㎍ 내지 100 ㎍ 용량 수준의 용량 반응의 약간의 경향(통계적으로 유의하지 않음)이 존재하였다.
실시예 32: 토끼에서 GLP 독성학 연구로부터 수집된 토끼 혈청 샘플로부터의 기능적 억제 효능 결과.
TK 및 ADA의 1차 종점에 사용된 혈청 샘플을 지정된 시간 후에 수집하고, ACE2-SP/RBD 결합을 억제하고(실시예 13의 방법에 따라) 실시예 15의 방법에 따라 플라크 감소 중화 시험(PRNT)에서 생 SARS-CoV-2 바이러스가 VERO-E6 세포를 감염시키는 것을 억제하는 효능(ID50 값)에 대해 평가하였다. 실시예 31에 기재된 바와 같이, N=10 동물/그룹에게 30 ㎍의 Montanide™ ISA 720이 있는 서열번호 19(그룹 4) 또는 100 ㎍의 ISA 720이 있는 서열번호 19(그룹 5)를 14일 간격으로 2회 용량으로 제공하였다. 목적하는 서열번호 19의 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질 백신은 Montanide™ ISA 720 항원보강제를 포함하는 제형을 포함하기 때문에, 그룹 4 및 5만을 2개의 기능 분석에서 평가하였다. ID50 값은 분석 신호의 50%가 혈청 샘플에 의해 달성된 희석의 역수를 나타낸다.
실시예 13의 ACE2 억제 분석에서, 도 72에 도시된 바와 같이 상승되고 2차 용량 후 14일째에 유사해진 30 ㎍ 내지 100 ㎍ 용량 수준의 억제 효능의 분명한 용량 반응이 존재하였다. 두 시점 모두에서의 이러한 효능 값은 인간 회복기 혈청에 대해 얻은 것보다 실질적으로 높았다. 생 바이러스가 세포를 감염시키는 것을 억제하는 능력의 평가는 도 73에 예시된 바와 같이 30 ㎍ 및 100 ㎍ 용량 수준 모두에서 강한 효능을 입증하였으며, 이는 2차 투여 후(즉, 35일째) 더 큰 효능으로 향하는 경향을 보여주고 이 효능은 인간 회복기 혈청의 효능과 유사함을 보여준다. 이러한 결과는 Montanide™ ISA 720에 유화된 서열번호 19의 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질이 COVID-19 감염에서 회복된 인간에서 발견된 수준에서 이 GLP 독성학 연구에서 기능적 면역원성을 유도함을 입증하며, 이러한 독성학 결과를 깨끗한 안전성 프로파일에 대한 기대를 선호하는 임상적 상황에 둔다.
실시예 33: 피하 경로의 독성 결과와 근육내 경로의 독성 결과를 연결하기 위한 뉴질랜드 흰토끼에서 서열번호 19의 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질의 반복 용량 독성 연구.
허가된 백신의 대부분은 근육내(i.m.) 주사로 투여되지만 일부는 피하(s.c.) 또는 피내(i.d.) 사용이 승인되었는데, 이는 주로 s.c.와 i.d.가 i.m. 경로보다 더 효율적인 방식으로 백신 Ag를 배액 램프절로 전달할 수 있는 더 많은 수의 APC를 포함하는 부위라는 이론적 근거 때문이다. 근육내 투여는 수행하기 쉽고 일반적으로 내약성이 좋으며 주사 부위의 부작용 위험이 낮기 때문에 선호되는 경우가 많다. 그러나 근육에 비해 면역능력이 높은 부위로 피부에 백신을 전달하는 것은 백신 반응을 증폭시키는 전략으로 오랫동안 여겨져 왔다. 황열병이나 인플루엔자 바이러스 백신과 같은 일부 경우에, s.c.는 i.m. 주사보다 우수하여 건강한 개인, 특히 무반응자 또는 저반응자에서 면역원성이 향상되었다. 일부 경우에, 피하 백신 접종은 일시적으로 더 높은 수준의 백신 특이적 T 세포 반응 및 Ab 역가를 수반하는 주사 부위에서 APC의 보다 효율적인 활성화(i.m.과 비교)를 초래하였다. 그러나 일반적으로, B형 및 A형 간염 바이러스, 대상 포진 바이러스, 인플루엔자, 디프테리아 독소, 홍역, 볼거리, 풍진, 및 수두, 및 진드기 매개 뇌염 바이러스에 대한 것과 같은 다수의 승인된 백신과의 비교 임상 연구에서 입증된 s.c.와 i.m. 경로간에 면역원성 차이의 위험은 거의 없는 것으로 보인다. 그럼에도 불구하고, 목적하는 전달 경로로 i.m. 백신접종을 동기 부여한 i.m. 면역화된 개체에 비해, s.c.를 통한 경미한 주사 부위 부작용의 발생률이 약간 증가한 것으로 보인다.
실시예 32에서 사용된 동일한 연구 설계 및 일반 프로토콜 하의 연구에 뉴질랜드 흰토끼를 사용하였다. 연구 설계를 표 13 및 표 14에 기재한다. 1일, 15일 및 29일에 s.c. 또는 i.m.으로 투여된 100 ㎍ 용량의 A 720 항원보강제 중에 유화된 서열번호 19(100)로 수컷(N=5) 및 암컷(N=5) 토끼에서 ACE2-결합을 억제하는 항-SP/RBD IgG 역가의 유도(실시예 14에 따라 측정), 및 혈청을 실시예 13에 따라 측정된 결합 억제 분석을 위해 0일, 15일(용량 2 투여 전), 29일(용량 3 투여 전) 및 36일에 수집하였다. ID50 값은 ACE2 결합의 50%가 혈청 샘플에 의해 달성되는 희석의 역수를 나타낸다.
분석은 임의의 측정일에 Montanide™ ISA 720 중의 서열번호 19 100 ㎍ 용량의 s.c.와 i.m. 투여간의 IgG 역가 또는 ACE2 억제 효능 역가에서 통계적으로 유의한 차이가 없음을 입증하였으며(도 74 및 도 75), 이는 임상 시험에서 어느 한 투여 경로의 평가를 지지한다.
[표 13]
Figure pct00014
[표 14]
Figure pct00015
실시예 34: 항원보강제 존재하에 신선하게 제조된 대 숙성된 유화액의 효과를 분석하기 위한 뉴질랜드 흰토끼에서 서열번호 19의 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질의 하위그룹 분석.
토끼의 GLP 반복 용량 독성 연구(실시예 30)에서 너무 많은 동물에게 투여해야 하는 물류로 인해, 동물의 절반(수컷 토끼)은 Montanide™ ISA 720이 있는 서열번호 19 유화액 제조시에 투여하고(T=0), 동물의 다른 절반(암컷 토끼)은 2-8℃에서 유화액 보관 후 24시간(T=24)째에 투여하였다. 따라서, 15일(1회 투여 후), 29일(2회 투여 후) 및 36일(3회 투여 후)에 측정된 ACE2-SP/RBD 결합 억제 효능(IC50) 결과(실시예 13에 따라 측정)에 대한 하위 그룹 분석을 수행하여 신선하게 제조된 유화액과 보관된 유화액간의 수행성능의 차이가 존재하는 지의 여부를 결정할 수 있었다. 다시, 마우스 면역원성 연구에 대해 상술한 바와 같이(실시예 26) 신선환 유화액과 보관된 유화액간의 억제 효능의 통계적 차이는 없었으며, 이는 항원보강제가 첨가된 서열번호 19 제형 수행성능이 도 76(피하 투여용) 및 도 77(근육내 투여용)에 도시된 바와 같이 제조 후 적어도 24시간 동안 안정함을 가리킨다.
항원보강제, Montanide™ ISA 720과 함께 서열번호 19의 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질 백신으로 면역화된 NHP에 대한 NHP SARS-CoV-2 바이러스 챌린지 모델에서의 효능 시험에 대한 실시예
실시예 35: NHP SARS-CoV-2 바이러스 챌린지 모델에서 서열번호 19 + ISA 720 효능 테스트에 대한 그룹 할당.
서열번호 19 백신의 효능을, ARS-CoV-2의 붉은털 원숭이 챌린지 모델을 사용하여 실시예 27의 면역화된 NHP에서 평가한다. 챌린지 후, 기관지폐포세척액(BAL), 비강 세척액뿐만 아니라, 비강 및 인두 면봉 채취물의 수집 및 분석을 통한 실험을 통해 SARS-CoV-2 부하를 모니터링한다. 바이러스 부하를 부검 후 조직에서 평가한다.
N=5 키노몰구스 원숭이의 2개 그룹을 하기 표 15에 나타낸 바와 같이 챌린지시켰다. 하나의 그룹은 실시예 27에 따른 항원보강제, Montanide™ ISA 720이 있는 서열번호 19의 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질 백신 면역화되고 이어서 1차 주사 후 3개월에서 4개월 반 사이에 30 ㎍ 용량 수준의 항원보강제 MontanideTM ISA 720이 있는 서열번호 19의 SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc 융합 단백질 백신의 추가접종 백신(3차 주사)이 주사된 6마리의 키노물구스 원숭이 중 5마리로 이루어졌다. 두 번째 그룹은 처리되지 않은 5마리의 키노몰구스 원숭이로 이루어졌다.
[표 15]
Figure pct00016
두 그룹을 0일에 SARS-CoV-2 바이러스로 챌린지시켰다. 챌린지 이전과 7일에 혈액을 수집하였다. 비강 면봉채취, 구강 면봉채취, 및 BAL 액 수집을 챌린지 이전 및 2, 4 및 7일에 수행하였다. 종료 후 부검을 7일에 수행하였다. 연구 일정을 표 16에 제공한다.
[표 16]
Figure pct00017
실시예 36: NHP SARS-CoV-2 바이러스 챌린지 모델에서 서열번호 19 + ISA 720 효능 시험을 위한 바이러스 접종.
바이러스 접종물을, 2 ㎖ 중 1x105 TCID50의 의도된 용량 수준에 도달하도록 PBS에서 연속 희석하여 제조하였다. 케타민 진정 하에 바이러스 투여를 수행하였다. 비강내(IN) 경로 투여를 하기와 같이 수행하였다. 보정된 P1000 피펫터를 사용하여 바이러스 접종물 0.5 ㎖를 동물당 1.0 ㎖씩 각 콧구멍에 적가하였다. 마취된 NHP를 수술대에 등을 대고 고정시켰다. 기술자는 콧구멍이 천장을 가리키도록 동물의 머리를 뒤로 기울였다. 기술자는 주사기 끝을 첫 번째 콧구멍에 넣고 천천히 플런저를 누르고 비강에 접종물을 주입한 다음 주사기를 꺼냈다. 이것을 두 번째 콧구멍에 대해 반복하였다. 동물의 머리를 약 20초 동안 뒤로 기울인 다음 수용 유닛으로 돌려보내고 완전히 회복될 때까지 모니터링하였다.
기관내(IT) 경로 투여를 하기와 같이 수행하였다. 희석된 바이러스 1 ㎖를 프랑스 고무 카테터/공급 튜브, 크기 10, 멸균(길이 4"-6" 절단)을 사용하여 기관 내로 전달하였다. 처방된 용량의 접종물을 주사기로 뽑았다. 카테터에 접종물이 있는 주사기를 삽입하기 전에, 기술자는 주사기를 뒤로 당겨 주사기에 1.5 cc의 공기를 허용하였다. 이 공기는 카테터를 통해 모든 접종물을 밀어낸다. 마취된 동물을 상기 과정을 위해 배치하고 조력자는 동물의 입을 열었다. 접종물을 포함하는 주사기를 멸균 프렌치 카테터 또는 공급 튜브에 부착하였다. 후두개가 시각화되고 성문이 개방되면, 공급 튜브의 작은 끝을 성문에 삽입하였다. 일단 제자리에 배치되면 기술자는 접종물을 기관에 주입한 다음 기관에서 카테터를 제거하였다. 각 동물에 대해 새 장비 또는 멸균된 장비를 사용하였다. 연구 동물을 수용 유닛으로 돌려보냈고 완전히 회복될 때까지 모니터링하였다.
챌린지 접종물을 적절한 용량 수준의 확인을 위해 플라크 또는 TCID50 분석을 통해 역-적정하였다. 나머지 접종물도 2 ㎖ 저온바이알에 분액하고 바이러스 부하 분석에서 양성 대조군으로 사용하기 위해 -70℃ 미만의 온도에서 보관하였다.
실시예 37: NHP SARS-CoV-2 바이러스 챌린지 모델에서 서열번호 19 + ISA 720 효능 시험을 위한 샘플 수집.
면봉(COPAN 플록 면봉)을 사용하여 진정된 NHP에서 점막 분비물의 수집을 수행하였다. 면봉을 비강에 삽입하고 부드럽게 회전시켰다. 수집 후, 면봉을 qPCR 분석을 위해 1 ㎖ PBS가 들어 있는 수집 바이알(2/시편)에 넣었다. 모든 바이알을 바이러스 부하 시험시까지 -70℃ 미만의 온도에서 보관하였다.
기관지폐포 세척(BAL) 절차를 마취된 동물에 대해 "의자 방법"으로 수행하였다. 이 절차를 위해 한 명의 기술자는 실제 BAL 세척 절차를 수행하고 다른 기술자는 동물의 가슴에 손을 얹었다. 이는 임의의 가능한 시편 오염을 최소화하기 위해서, 절차 중 가능한 기침으로 인한 동물의 움직임을 줄이거나 피하기 위한 것이다. NHP를 의자 채널에 등쪽으로 누운 상태로 배치하였다. 동물이 의자 채널 아래로 미끄러지는 것을 방지하기 위해 의자 베이스의 손잡이를 동물에 대해 밀어 올렸다. 손잡이가 동물의 무게를 지탱하는 위치에 놓이면 손잡이를 제자리에서 조였다. 빨간색 고무 공급 튜브를 미리 측정 하고 배치하기 전에 표시하였다. 동물의 머리를 의자 채널의 가장자리 아래로 뒤로 기울였다. 그런 다음 흡기 시 후두경을 통해 빨간 고무 공급 튜브를 동물의 기관에 삽입하였다. 튜브를 올바른 위치에 놓고 BAL 세척 절차를 실행하였다. 총 10 ㎖을 튜브를 통해 플러싱하였다. 샘플이 완성되면 의자 바닥의 손잡이를 풀고 동물을 의자에서 제거하였다.
각 동물로부터 주입 및 회수된 부피와 BAL 샘플의 혈액 존재 여부를 기록하였다. 수집된 BAL 샘플을 즉시 젖은 얼음 위에 놓고 유체 단리를 위해 처리하였다(예를 들어, 바이러스 부하 분석을 위해). 이 절차를 위해 튜브를 4℃에서 원심분리(8분 300-400 xg)하고 상등액을 제거하였다. 하기의 BAL 분액을 준비하고 바이러스 부하(VL) 또는 기타 시험까지 동결보존하였다: VL 시험의 경우 3x 0.2㎖; 기타 분석 및 뱅킹의 경우 3x 1 ㎖.
실시예 38: NHP SARS-CoV-2 바이러스 챌린지 모델에서 서열번호 19 + ISA 720 효능 시험을 위한 혈액 수집.
표 16에 따라 마취 하에 있는 동안 혈액을 수집하였다. 혈액을, 진공채혈기 21 gx 1" 채혈 바늘 또는 진공채혈기 채혈 튜브에 부착된 Abbott Butterfly 23 g x 3/4" 튜브를 사용하여 대퇴 정맥 천자를 사용하여 마취된 동물로부터 채취하였다. 혈액을 EDTA 항응고제를 함유하는 BD Vacutainer® 튜브에 수집하고 사내 IDEXX BioResearch 분석기를 사용하여 분석하였다. 하기의 통상적인 패널을 분석하였다: CBC: WBC, RBC, HGB, HCT, MCV, MCH, MCHC, NRBC, 호중구 SEG, 림프구, 단핵구, 호산구, 호염기구, 절대 호중구 SEG, 절대 림프구, 절대 호산구, 절대 호염기구.
폐 조직 수집을 위해 예정된 부검을 수행하였다. 동물의 체중을 측정하고 체온을 기록한 다음 흉강에서 폐를 제거하였다. 동물과 폐의 총체적 평가를 폐의 디지털 이미지와 함께 캡처하고 기록하였다. 조직을, 왼쪽 및 오른쪽 꼬리 및 머리쪽 폐엽(총 8개 조각)에서 2개의 작은 조각(각각 0.1-0.2 g)을 수집하여 바이러스 부하 분석을 위해 샘플링하였다. 바이러스 분석을 위한 조직 수집 후, 폐에 10% 중성 완충된 포르말린 NBF를 주입하고 침지시켰다. 수집된 폐 및 기타 문제는 조직학적 처리 및 분석을 위해 NBF에 보존될 것이다.
바이러스 부하 분석을 위해, 조직을 칭량하고, 예비-표지한 Sarstedt 저온바이알(2/샘플)에 넣고, 드라이아이스 상에서 급속 동결시켰다(스냅 동결 시간은 무게 하트상에 기록됨). 바이러스 부하 분석에서 시험하기 전에 조직을 휴대용 조직 균질화기(SOP BV-035; Omni International, Kennesaw, GA)를 사용하여 약 20초 동안 0.5 ㎖ 저온 배지(DMEM/10% FBS/젠타마이신) 또는 RNA-Stat(PCR 기반 분석의 경우)에서 균질화하였다. 그런 다음 샘플을 회전시켜 바이러스 부하 측정을 위해 단리된 파편 및 상등액을 제거하였다.
실시예 39: NHP SARS-CoV-2 바이러스 챌린지 모델에서 서열번호 19의 SARS-CoV-2 + ISA 720 효능 시험에 대한 정량적 RT-PCR 분석.
qRT-PCR 분석을 사용하여 체액 ㎖당 또는 조직 그램당 RNA 사본의 양을 측정하였다. qRT-PCR 분석은 코로나바이러스의 뉴클레오캡시드 유전자 보존 영역을 증폭시키고 이에 결합하도록 특별히 설계된 프라이머와 탐침을 사용한다. 신호를 공지된 표준 곡선과 비교하고 ㎖ 당 사본을 제공하도록 계산하였다. qRT-PCR 분석의 경우 Qiagen MinElute 바이러스 스핀 키트(카탈로그 번호 57704)를 사용하여 비강 세척액에서 바이러스 RNA를 먼저 단리하였다. 조직의 경우 RNA-STAT 60(Tel-test "B")/클로로포름으로 추출하고, RNAse가 없는 물에 침전 및 재현탁하였다. 증폭 반응에 대한 대조군을 생성하기 위해, 동일한 절차를 사용하여 해당 바이러스 스톡에서 RNA를 단리하였다. RNA의 양을 A260에서 1.0 OD가 RNA 40 ㎍/㎖와 같다는 추정치를 사용하여, 260에서의 OD 판독값으로부터 측정하였다. 공지된 염기의 수 및 무게가 340.5 g/몰인 RNA의 평균 염기를 사용하여, 사본의 수를 계산하고 이에 따라 대조군을 희석하였다. 이어서 3 ㎕당 108개 사본의 최종 희석액을 10 ㎕의 단일 사용 분액으로 나누었다. 이를 필요할 때까지 -80℃에서 보관하였다. 다수의 분액을 무작위로 선택하고 일관성을 확인하기 위해 이전 대조군과 비교하였다. 마스터 믹스 제조를 위해서, TaqMan RT-PCR 키트(Bioline cat# BIO-78005)에서 얻은 Taq-폴리머라제를 포함하는 2X 완충액 2.5 ㎖를 15 ㎖ 튜브에 첨가하였다. 키트로부터, 50 ㎕의 RT와 100 ㎕의 RNAse 억제제도 추가하였다. 이어서 2 μM 농도의 프라이머 쌍을 1.5 ㎖의 부피로 첨가하였다. 마지막으로 0.5 ㎖의 물과 350 ㎕의 2 μM 농도의 탐침을 첨가하고 튜브를 볼텍싱하였다. 반응을 위해 45 ㎕의 마스터 믹스와 5㎕ 의 샘플 RNA를 96웰 플레이트의 웰에 추가하였다. 모든 샘플을 3중으로 시험하였다. 플레이트를 플라스틱 시트로 밀봉하였다.
대조용 곡선 작성을 위해서, 대조용 RNA 샘플을 -80℃ 냉동고에서 수득하였다. 대조용 RNA를, 3 ㎕ 당 106 내지 107 사본을 함유하도록 제조하였다. 대조용 RNA의 여덟(8)개의 10배 연속 희석액을, 5 ㎕의 대조군을 45 ㎕의 수에 첨가하고 이것을 7회 희석에 대해 반복함으로써 RNAse가 없는 물을 사용하여 제조하였다. 이는 1 내지 107 사본/반응 범위의 표준 곡선을 제공한다. 각 희석액의 중복 샘플을 상술한 바와 같이 제조하였다. 사본수가 검출 상한을 초과한 경우, 필요에 따라 샘플을 희석하였다. 증폭을 위해 플레이트를 Applied Biosystems 7500 Sequence 검출기에 넣고 하기의 프로그램을 사용하여 증폭시켰다: 48℃ 30분, 95℃ 10분, 이어서 40 주기의 95℃ 15초, 및 55℃ 1분. ㎖ 당 RNA 사본 수를, 표준 곡선에서 외삽하고 0.2 ㎖ 추출 부피의 역수를 곱하여 계산하였다. 이는 비강 세척의 경우 ㎖ 당 50 내지 5 x 108 RNA 사본의 실제 범위를 제공하였으며 조직의 경우 그램당 바이러스 부하를 제공하였다.
실시예 40: NHP SARS-CoV-2 바이러스 챌린지 모델에서 서열번호 19의 SARS-CoV-2 + ISA 720 효능 시험에 대한 서브게놈 mRNA 분석.
sgRNA에 대한 RT-PCR 분석은 코로나바이러스의 E 유전자 메신저 RNA 영역을 증폭하고 결합하도록 특별히 설계된 프라이머와 탐침을 사용한다. 이는 비리온에 패키징되지 않았다. 신호를, 바이러스에 없는 부분을 포함하는 메신저 RNA 부분의 서열을 포함하는 플라스미드의 공지된 표준 곡선과 비교하고, qRT-PCR 분석을 위해 ㎖당 사본을 제공하도록 계산하였다. 증폭 반응에 대한 대조군을 생성하기 위해, E 유전자 메신저 RNA의 일부를 함유하는 플라스미드. 이어서 3 ㎕당 106개 사본의 최종 희석액을 10 ㎕의 단일 사용 분액으로 나누었다. 이를 필요할 때까지 -80℃에서 보관하였다.
다수의 분액을 무작위로 선택하고 일관성을 확인하기 위해 이전 대조군과 비교하였다. 이어서 바이러스 RNA에 대해 추출된 샘플을, sgRNA를 픽업하기 위해 증폭시켰다. 대조용 DNA를 3 ㎕당 107개 사본을 함유하도록 제조하였다. 대조용 RNA의 일곱(7)개의 10배 연속 희석액을, 5 ㎕의 대조군을 45 ㎕의 수에 첨가하고 7회 희석에 대해 이를 반복하여 AVE를 사용하여 제조하였다. 이는 1 내지 106 사본/반응 범위의 표준 곡선을 제공한다. 각 희석액의 중복 샘플을 상술한 바와 같이 제조하였다. 사본수가 검출 상한을 초과한 경우, 필요에 따라 샘플을 희석하였다. 증폭을 위해 플레이트를 Applied Biosystems 7500 Sequence 검출기에 넣고 하기의 프로그램을 사용하여 증폭시켰다: 48℃ 30분, 95℃ 10분, 이어서 40 주기의 95℃ 15초, 및 55℃ 1분. ㎖ 당 RNA 사본 수를, 표준 곡선에서 외삽하고 0.2 ㎖ 추출 부피의 역수를 곱하여 계산하였다. 이는 비강 세척의 경우 ㎖ 당 50 내지 5 x 107 RNA 사본의 실제 범위를 제공하였으며 조직의 경우 그램당 바이러스 부하를 제공하였다.
실시예 41: NHP SARS-CoV-2 바이러스 챌린지 모델에서 Montanide TM ISA 720 효능 시험과 함께 서열번호 19의 SARS-CoV-2에 대한 SARS-CoV-2 스파이크 단백질에 대한 항체 ELISA
동물의 사전 스크리닝으로 SARS-CoV-2 스파이크 단백질에 대한 결합 항체에 대한 혈청 샘플을 분석하기 위해 표준 간접 ELISA를 수행하였다. 분석은 코팅 항원 및 IgG 2차 항체를 사용하였다. 이 분석을 위해, Nunc MaxiSorp 96웰 플레이트(Thermo Scientific, Cat# 439454)를 1 x 카보네이트-비카보네이트 완충액(CBB, Sigma, Cat# C3041-50CAP) 중에서 2 ㎍/㎖로 희석된 50 ㎕의 SARS-CoV-2 스파이크 단백질(Sino Biological, cat.no. 40589-V08B1)로 코팅하였다. 플레이트를 2-8℃에서 밤새 정적으로 배양하였다. PBS + 0.05% 트윈-20이 포함된 200 ㎕로 5회 세척하여 각 웰의 결합되지 않은 코팅 항원을 제거하였다. 플레이트를 100 ㎕의 PBS + 1% BSA로 차단하였다. 시험 및 양성 대조용 샘플을 분석 희석제(PBS-트윈20-1% BSA)에서 1:20의 출발점 희석으로 희석한 다음 U 바닥 희석 플레이트를 사용하여 4배 연속 희석하였다.
일단 차단이 완료되면, 차단 완충제를 뒤집어 제거하고 각각의 샘플을 도말하였다. 플레이트를 실온에서 1시간 동안 정적으로 배양한 다음, 200 ㎕ PBS + 0.05% 트윈-20으로 5회 세척하여 결합되지 않은 혈청을 제거하였다. 50 ㎕의 2차 검출 항체(염소 항-원숭이 IgG(H+L) 2차 항체, HRP, Invitrogen, PA1-84631)를 1:10,000의 희석비로 첨가하고 플레이트를 실온에서 60분 동안 배양하였다. 결합되지 않은 항체는 PBS + 0.05% 트윈-20이 있는 200 ㎕로 5회 및 PBS 200 ㎕로 1회 세척하여 후속적으로 제거하였다. 현상을 위해 1-Step Ultra TMB 기질(SERA CARE, KPL Cat# 5120-0075) 100 ㎕를 각 웰에 첨가하고 플레이트를 현상하였다. 반응을 50 ㎕의 TMB 정지액(SERA CARE, Cat # 5150-0020)으로 ~10분 후에 정지시켰다. 플레이트를 30분 이내에, Thermo Labsystems Multiskan 분광 광도계로 450 ㎚에서 판독하였다.
실시예 42: NHP SARS-CoV-2 바이러스 챌린지 모델에서 Montanide TM ISA 720 효능 시험과 함께 서열번호 19의 SARS-CoV-2에 대한 플라크 감소 중화 시험(PRNT).
PRNT 분석을 예비-스크리닝을 위해 혈청 샘플에 대해 수행하였다. 이 분석을 위해, Vero E6 세포(ATCC, cat# CRL-1586)를 DMEM + 10% FBS + 젠타마이신 중 175,000개 세포/웰로 24웰 플레이트에 도말하였다. 플레이트를, 세포가 다음날 80 - 100% 융합 상태에 도달할 때까지 37℃, 5.0% CO2에서 배양하였다. 분석 당일, 혈청 샘플을 56℃에서 30분 동안 열 불활성화시켰다. 분석 설정을 하기와 같이 수행하였다: 96 깊은 웰 플레이트에서, 405 ㎕의 희석제(DMEM + 2% FBS + 젠타마이신)를 컬럼 1에 첨가하고 300 ㎕의 희석제를 컬럼 3, 5, 7, 9 및 11에 첨가하였다. 열 불활성화 혈청 샘플 45 ㎕를 첫 번째 컬럼에 첨가하였다(1:10 희석). 모든 샘플이 첨가되었으면, P200 피펫터를 사용하여 웰의 내용물을 위아래로 ~5회 혼합하고 150 ㎕를 1:3배 희석을 위해 컬럼 3으로 옮겼다. 이것을, 플레이트 하부에서 컬럼 11까지 다음 웰 세트에 대해 반복하였다. 바이러스 양성 대조군의 경우, 300 ㎕의 희석제를 컬럼 1, 3, 5, 7, 9 및 11에 첨가하고 이러는 동안 600 ㎕의 희석제를 1열에 첨가하였으며, 이는 음성 대조군을 나타낸다. 30 pfu/웰 농도의 바이러스를 제조하고 사용할 때까지 얼음상에서 보관하였다.
상술한 바와 같이 적정 플레이트를 제조한 후, 300 ㎕의 30 pfu/웰 바이러스 희석액을 모든 샘플과 양성 대조용 웰에 첨가하였다. 이는 샘플 희석 인자를 배가시켰다(첫 번째 웰은 1:20에서 시작한다). 이어서 플레이트를 플레이트 실러로 덮고 37℃, 5.0% CO2에서 1시간 동안 배양하였다. 배양이 완료된 후, 24-웰 플레이트에서 배지를 제거하고 다중 채널 피펫을 사용하여 적정 플레이트에서 250 ㎕의 적정 샘플을 이중으로 첨가하였다. 세포 건조를 방지하기 위해 한 번에 하나의 플레이트만 제조하였다. 24웰 플레이트를 바이러스 감염을 위해 37℃, 5.0% CO2에서 1시간 동안 배양하였다. 이 시간 동안 0.5% 메틸셀룰로스 배지를 37℃ 수욕에서 가열하였다. 1시간 배양 후, 0.5% 메틸셀룰로스 배지 1 ㎖를 각 웰에 첨가하고 플레이트를 37℃, 5% CO2에서 3일 동안 배양한다. 메틸셀룰로스 배지를 제거하고, 플레이트를 1 ㎖ PBS로 1회 세척하였다. 플레이트를 -20℃에서 30분 동안 웰당 400 ㎕ 빙냉 메탄올로 고정시켰다. 고정 후 메탄올을 버리고 단층을 웰당 250 ㎕의 0.2% 크리스탈 바이올렛(20% MeOH, 80% dH2O)으로 실온에서 30분 동안 염색하였다. 플레이트를 최종적으로 PBS 또는 dH2O로 1회 세척하고 ~15분 동안 건조시켰다. 각 웰의 플라크를 기록하고 바이러스 대조용 웰에서 검출된 플라크의 평균 수를 기반으로 IC50 및 IC90 역가를 계산하였다.
실시예 43: NHP SARS-CoV-2 바이러스 챌린지 모델에서 Montanide TM ISA 720 효능 시험과 함께 서열번호 19의 SARS-CoV-2에 대한 감염성 바이러스 부하 분석(TCID50).
Vero E6 세포(ATCC 카탈로그 번호 CRL-1586)를 DMEM + 10% FBS + 젠타마이신에서 25,000개 세포/웰로 도말하고 배양물을 37℃, 5.0% CO2에서 배양하였다. 세포는 다음날 80-100% 융합되어야 한다. 배지를 흡출하고 180 ㎕의 DMEM + 2% FBS + 젠타마이신으로 교체하였다. 샘플 20 ㎕를 맨 윗줄에 4번 추가하고 P200 피펫터를 사용하여 5회 혼합하였다. 피펫터를 사용하여 20 ㎕를 다음 열로 옮기고 10배 희석을 나타내는 플레이트(컬럼 A-H) 아래로 반복하였다. 팁을 각 열에 배치하고 마지막 열까지 반복하였다. 양성(분석에서 공지된 감염 역가의 바이러스 스톡) 및 음성(배지 단독) 대조용 웰을 각 분석 설정에 포함하였다. 플레이트를 37℃, 5.0% CO2에서 4일 동안 배양하였다. 세포 단층을 CPE에 대해 육안으로 검사하였다. 감염되지 않은 웰은 투명한 융합 세포 층이 있는 반면 감염된 세포는 세포 라운딩이 있다. CPE의 존재는 실험실 양식에 +로 표시되고 CPE가 없는 것은 -로 표시된다. TCID50 값을 Read-Muench 공식을 사용하여 계산하였다.
실시예 44: NHP SARS-CoV-2 바이러스 챌린지 모델에서 Montanide TM ISA 720 효능 시험과 함께 서열번호 19에 대한 결과.
표 17에 나타낸 바와 같이, ISA-720과 함께 서열번호 19로 면역화된 5개의 NHP는, 두 분석 모두에 대해 무시할만한 또는 검출가능하지 않은 수준을 갖는 5개의 나이브 대조용 NHP와 비교하여 바이러스 챌린지 직전에 현저한 항-SP/RBD IgG 역가 및 ACE2 억제 ID50 값을 나타내었다. 도 78에 도시된 챌린지-후 결과는, 실시예 37의 과정에 따라 수득된 비강 면봉채취물에서 SARS-CoV-2 바이러스 게놈 및 바이러스 서브게놈 RNA 역가(실시예 39의 과정에 따라 측정됨)의 무시할만하거나 또는 검출가능하지 않은 수준에 의해 입증된 바와 같이 COVID-19 감염에 대한 보호에서 ISA-720 백신 존재하의 서열번호 19의 효능의 엄연한 입증이다. 유사하게, 도 79는 실시예 37의 과정에 따라 수득된 BAL 샘플에서 SARS-CoV-2 바이러스 게놈 및 바이러스 서브게놈 RNA 역가(실시예 40의 과정에 따라 측정됨)의 무시할만하거나 또는 검출가능하지 않은 수준을 예시한다. 낮은 서브게놈 RNA(sgRNA) 카운트는 특히, 상기가 복제 중간체이기 때문에 특히 고무적이며, 따라서 이들의 풍부성은 바이러스 복제 활성 및 숙주 감염의 중증도와 관련이 있다. 종합하면, 데이터는 ISA-720 존재하의 서열번호 19가 COVID-19에 대해 보호하고 NHP에서 COVID-19 질병의 악화 위험이 없음을 결정적으로 입증한다.
[표 17]
Figure pct00018
조직병리학적 검사를 주요 기관/조직, 특히 간, 폐, 호흡기, 비장, 신장, 뇌 및 림프절에 대해 수행하였다. SARS-CoV-2는 간세포를 감염시키고 사람에게 간염을 유발하는 것으로 나타났다. 따라서 조직병리학적 검사를 간염 중증도의 정도와 백신 접종 및 비접종 대조군의 챌린지와 관련된 감소를 평가하기 위해 수행하였다. 폐와 호흡기에서 심각한 감염 및 폐렴과 관련된 병변이 있는지 검사하였다.
개 인슐린-Fc 융합 단백질의 합성, 정제 및 검증에 대한 일반적인 실시예
실시예 45: HEK293 세포에서 인슐린-Fc 융합 단백질의 합성 및 제조 방법.
인슐린-Fc 융합 단백질을 하기와 같이 합성하였다. 관심 유전자 서열을 독점 소프트웨어(LakePharma, Belmont, CA)를 사용하여 구성하고 고 발현 포유동물 벡터에 클로닝하였다. HEK293 세포를 형질감염 24시간 전에 진탕 플라스크에 접종하고 화학적으로 정의된 무혈청 배지를 사용하여 생육시켰다. 관심 인슐린-Fc 융합 단백질을 암호화하는 DNA 발현 구성물을, 일시적 형질감염을 위해 (LakePharma, Belmont, CA) 표준 작업 과정을 사용하여 HEK293 세포의 현탁액 내로 일시적으로 형질감염시켰다. 20시간 후, 세포를 카운트하여 생존율 및 생존 세포 수를 측정하고, 역가를 ForteBio® Octet®(Pall ForteBio LLC, Fremont, CA)로 측정하였다. 일시적인 형질감염 생산 실행 전반에 걸쳐 추가 판독값을 취하였다. 배양물을 5일째 또는 그 이후에 수확하였다.
실시예 46: CHO 세포에서 인슐린-Fc 융합 단백질의 합성 및 제조 방법.
CHO 세포주는 원래 CHO-K1(LakePharma, Belmont, CA)에서 유래되었으며, 내인성 글루타민 합성효소(GS) 유전자는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 재조합 기술에 의해 녹아웃시켰다. 안정적인 발현 DNA 벡터를 CHO 발현 및 GS 선택을 위해 설계 및 최적화하였으며, 고 발현 포유동물 벡터(LakePharma, Belmont, CA)에 통합시켰다. 확장 실험을 시작하기 전에 완성된 각 구성물의 서열을 확인하였다. 현탁-적응된 CHO 세포를 화학적으로 정의된 배지(CD OptiCHO; Invitrogen, Carlsbad, CA)에서 37℃의 가습된 5% CO2 배양기에서 배양하였다. CHO 세포 배양에 혈청 또는 기타 동물 유래 제품을 사용하지 않았다.
각각의 인슐린-Fc 융합 단백질에 대한 안정한 CHO 세포주를 생성하기 위해 지수 증식기 동안 CD OptiCHO 배지에서 성장하는 약 8천만 개의 현탁-적응된 CHO 세포는 80 ㎍ DNA로 MaxCyte® STX® 시스템(MaxCyte, Inc., Gaithersburg, MD)을 사용하여 일렉트로포레이션에 의해 형질감염되었다.(DNA 구성물은 인슐린-Fc 융합 단백질의 완전길이 서열을 함유한다). 24시간 후에, 형질감염된 세포를 카운트하고 인슐린-Fc 융합 유전자의 안정적인 통합을 위한 선택하에 두었다. 형질감염된 세포를 진탕 플라스크에 0.5 x 106 세포/㎖의 세포 밀도로 0-100 ㎛ 메티오닌 설폭스이민(MSX)을 함유하는 CD OptiCHO 선택 배지에 시딩하고 37℃에서 5% CO2로 배양하였다. 선택 과정 동안, CHO 안정한 풀이 성장률과 생존율을 회복할 때까지 세포를 회전시키고 신선한 선택 배지에 2-3일마다 재현탁시켰다. 세포 배양물을 성장 및 역가에 대해 모니터링하였다.
세포를 ㎖당 2.5 x 106 세포로 생육시켰다. 세포 뱅킹을 위한 수확 당시 생존율은 95% 이상이었다. 이어서 세포를 원심분리하고, 세포 펠렛을 7.5% 디메틸 설폭사이드(DMSO)가 포함된 CD OptiCHO 배지에 재현탁하여 바이알당 ㎖당 15 x 106개 세포의 세포 수로 재현탁시켰다. 바이알을 액체 질소에서 보존을 위해 냉동보존하였다.
CHO 세포를 사용하여 하기와 같이 소규모 확대 생산을 수행하였다. 세포를 37℃에서 100 μM MSX를 포함하는 CD OptiCHO 생육 배지에서 생산을 위해 규모를 확대하고 필요에 따라 2-4일마다 공급하였으며, 필요한 경우 약 14-21일 동안 글루코스 및 추가 아미노산이 보충된 CD OptiCHO 생육 배지를 공급하였다. 안정적인 풀 생산 실행에서 수확된 순화 배지 상등액을 원심분리기 회전에 의해 정화시켰다. 단백질을, 결합 완충액으로 미리 평형화시킨 단백질 A(MabSelect, GE Healthcare, Little Chalfont, United Kingdom) 컬럼에서 실행시켰다. 이어서 세척 완충액을 OD280 값(NanoDrop, Thermo Scientific)이 배경 수준이거나 그 근처인 것으로 측정될 때까지 컬럼에 통과시켰다. 인슐린-Fc 융합 단백질을 낮은 pH 완충액을 사용하여 용출시키고, 용출 분획을 수집하고, 각 분획의 OD280 값을 기록하였다. 표적 인슐린-Fc 융합 단백질을 포함하는 분획을 모으고 임의로 0.2 ㎛ 멤브레인 필터를 사용하여 추가로 여과하였다.
세포주를 선택적으로 단클론성으로 추가 서브클로닝할 수 있으며, 당업자에게 공지된 방법인 제한 희석 방법을 사용하여 고역가 인슐린-Fc-융합 단백질-발현 클론을 임의로 추가로 선택할 수 있다. 고역가의 단클론 인슐린-Fc 융합 단백질-발현 세포주를 수득한 후, 인슐린-Fc 융합 단백질의 생산을, MSX가 없는 생육 배지, 또는 임의로 MSX를 포함하는 생육 배지에서 상술한 바와 같이 수행하여, 재조합, CHO-제조된 인슐린-Fc 융합 단백질을 함유하는 세포 배양 상등액을 수득하였다. MSX 농도를 더 높은 생성물 역가를 산출할 수 있는 클론에 대한 추가 선택성을 발휘하기 위해 시간에 걸쳐 임의로 증가시킬 수 있다.
실시예 47: 인슐린-Fc 융합 단백질의 정제
인슐린-Fc 융합 단백질의 정제를 하기과 같이 수행하였다. 분비된 인슐린-Fc 융합 단백질을 포함하는 순화 배지 상등액을, 일시적으로 또는 안정하게 형질감염된 HEK 생산 실행에서 수확하고 원심분리에 의해 정화시켰다. 목적하는 인슐린-Fc 융합 단백질을 포함하는 상등액을 단백질 A 컬럼 상에서 실행하고, 낮은 pH 구배를 사용하여 용출시켰다. 그 후, 목적하는 단백질을 함유하는 용출 분획을 모으고, 완충액을 200 mM HEPES, 100 mM NaCl, 50 mM NaOAc, pH 7.0 완충액으로 교환하였다. 0.2 ㎛ 멤브레인 필터를 사용하여 최종 여과 단계를 수행하였다. 최종 단백질 농도를 280 ㎚에서 용액 광학 밀도로부터 계산하였다. 필요에 따라 이온 교환 크로마토그래피(예를 들어, 음이온 교환 비드 수지 또는 양이온 교환 비드 수지 사용), 겔 여과 크로마토그래피 또는 기타 방법에 의한 추가의 선택적 정제를 수행하였다.
실시예 48: 비-환원 및 환원 CE-SDS에 의한 인슐린-Fc 융합 단백질 구조 확인.
모세관 전기영동 나트륨 도데실 설페이트(CE-SDS) 분석을 200 mM HEPES, 100 mM NaCl, 50 mM NaOAc, pH 7.0 완충액에 용해된 정제된 인슐린-Fc 융합 단백질 용액에 대해 LabChip® GXII(Perkin Elmer, Waltham, MA)에서 수행하고, 전기영동도를 플롯팅하였다. 비-환원 조건하에서 샘플을 공지된 분자량(MW) 단백질 표준에 대해 실행하였으며, 용출 피크는 인슐린-Fc 융합 단백질 동종이량체의 '겉보기' MW를 나타내었다.
환원 조건 하에서(예를 들어, 베타-머캅토에탄올을 사용하여 인슐린-Fc 융합 동종이량체의 디설파이드 결합을 절단시킴), 생성된 인슐린-Fc 융합 단백질 단량체의 겉보기 MW를, 인슐린-Fc 융합 단백질의 구조적 순도가 정확할 가능성이 있는지를 결정하는 방법으로서 인슐린-Fc 융합 단백질 동종이량체의 분자량의 절반과 비교한다.
실시예 49: 글리칸 제거와 함께 LC-MS에 의한 인슐린-Fc 융합 단백질 서열 확인.
질량 분광학(MS)을 통해 인슐린-Fc 융합 단백질 질량의 정확한 추정치를 얻기 위해서, 먼저 샘플을 처리하여 MS 분석을 방해할 수 있는 자연 발생 글리칸을 제거하였다. 200 mM HEPES, 100 mM NaCl, 50 mM NaOAc, pH 7.0 완충액에 용해된 100 ㎕의 2.5 ㎎/㎖ 인슐린-Fc 융합 단백질을 먼저 Zeba 탈염 컬럼(Pierce, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA)을 사용하여 5 mM EDTA가 포함된 0.1M 트리스, pH 8.0 완충액으로 완충액 교환하였다. 이 용액에 1.67 ㎕의 PNGase F 효소(Prozyme N-글리카나제)를 첨가하여 인슐린-Fc 융합 단백질에 존재하는 N-연결된 글리칸(예를 들어, cNg-N 부위에 위치한 아스파라긴의 측쇄에 연결된 글리칸)을 제거하고, 혼합물을 배양기에서 밤새 37℃에서 배양하였다. 이어서, 샘플을 LC-MS(NovaBioassays, Woburn, MA)를 통해 분석하여 글리칸이 없는 목적하는 동종이량체에 상응하는 분자의 분자량을 생성하였다. cNg-아스파라긴에서 글리칸을 절단하는 데 사용된 효소적 과정이 또한 아스파라긴 측쇄를 탈아민화하여 아스파트산을 형성시키므로 상기 질량을 추가로 보정하고, 그렇게 함으로써 효소 처리된 동종이량체는 전체적으로 2 Da이 증가하며, 이는 상기 동종이량체 중에 존재하는 각각의 쇄에 대해 1 Da의 질량에 상응한다. 따라서 실제 분자량은 분석 샘플 중의 인슐린-Fc 융합 단백질 구조물의 효소 변형을 보정하기 위해 측정된 질량에서 2Da를 뺀 값이었다.
실시예 50: 인슐린-Fc 융합 단백질에 대한 크기-배제 크로마토그래피에 의한 동종이량체%.
인슐린-Fc 융합 단백질의 크기 배제 크로마토그래피(SEC-HPLC)를 280 ㎚의 파장에서 2998 포토다이오드 어레이에 연결된 Waters 2795HT HPLC(Waters Corporation, Milford, MA)를 사용하여 수행하였다. 관심 인슐린-Fc 융합 단백질이 포함된 샘플 100 ㎕ 이하를, 0.2 ㎖/분의 유량 및 50 mM 나트륨 포스페이트, 300 mM NaCl, 및 0.05% w/v 나트륨 아지드, pH 6.2를 포함하는 이동상으로 작동하는 MAbPac SEC-1, 5 ㎛, 4 × 300 ㎜ 컬럼(ThermoFisher Scientific, Waltham, MA)에 주입하였다. MAbPac SEC-1 컬럼은 분자 크기 분리 원리에 따라 작동한다. 따라서, 더 큰 용해성 인슐린-Fc 응집체(예를 들어, 인슐린-Fc 융합 단백질 동종이량체의 다량체)는 더 이른 체류 시간에 용출되고, 응집되지 않은 동종이량체는 나중의 체류 시간에 용출된다. 분석 SEC-HPLC를 통해, 응집된 다량체성 동종이량체로부터 동종이량체 혼합물을 분리함에 있어서, 응집되지 않은 동종이량체의 백분율에 의해 인슐린-Fc 융합 단백질 용액의 순도를 확인하였다.
실시예 51: 인슐린-Fc 융합 단백질에 대한 시험관내 Fc(감마) 수용체 I 결합 친화도 분석.
pH 7.4에서 인슐린-Fc 융합 단백질의 Fc(감마) 수용체 I에 대한 결합을 하기와 같이 ELISA 분석을 사용하여 수행하였다. 개 Fc(감마) 수용체 I을 상업적으로 입수할 수 없었기 때문에, 인간 Fc(감마) 수용체 I(즉 rhFc(감마) 수용체 I)을 대체 포유동물 수용체로서 사용하였다. 인슐린-Fc 화합물을 pH 9.6에서 중탄산나트륨 완충액에서 10 ㎍/㎖로 희석하고 4℃에서 밤새 Maxisorp(Nunc) 미세적정 플레이트에 코팅하고, 그 후에 마이크로플레이트 스트립을 PBST(PBS/0.05% 트윈-20) 완충액으로 5회 세척하고 Superblock 차단 시약(ThermoFisher)으로 차단하였다. 비오틴화된 rhFc(감마) 수용체 I(재조합 인간 Fc(감마)R-I; R&D Systems)의 일련의 희석액을 PBST/10% Superblock 완충액 중에서 6000 ng/㎖ 내지 8.2 ng/㎖로 제조하고, 인슐린-Fc 융합 단백질이 코팅된 마이크로플레이트 스트립에 100㎕/웰로 로딩하였다. 미세적정 플레이트를 실온에서 1시간 동안 배양한 후 마이크로플레이트 스트립을 PBST로 5회 세척하고 이어서 PBST/10% Superblock 완충액에서 1:10000으로 희석된 스트렙트아비딘-HRP 100 ㎕/웰을 로딩하였다. 45분 동안 배양한 후, 마이크로플레이트 스트립을 PBST로 다시 5회 세척하였다. TMB를 상기 결합된 Fc(감마) 수용체 I 단백질을 나타내기 위해 첨가하고 ELISA 정지 시약(Boston Bioproducts)으로 정지시켰다. 플레이트를 450 ㎚에서 ELISA 플레이트 판독기에서 판독하고 OD 값(rhFc(감마) 수용체 I의 인슐린-Fc 융합 단백질에의 결합에 비례한다)을 GraphPad Prism 소프트웨어를 사용하여 결합 곡선을 생성하기 위해 각 웰에 첨가된 rhFc(감마) 수용체 I의 로그 농도에 대해 플롯팅한다.
실시예 52: 의뢰인 소유 개에서 인슐린 Fc-융합 단백질의 주기적 투여 후 생체내 약력학(PD).
실시예 45 또는 실시예 46에 따라 생물활성 인슐린-Fc 융합 동종이량체 구성물을 합성하고 실시예 47에 따라 정제하여 공복 혈당 수치에 미치는 영향을 하기와 같이 평가하였다.
프로토콜 1은 당뇨병 진단을 받은 의뢰인 소유 개를 인슐린-Fc 융합 단백질로 치료하는 비공개, 자기-조절, 단일 부문, 파일럿 현장 효능 연구이다. 약물의 효과를, 표준 인슐린 요법(1주일 동안) 대, 8주에 걸쳐 인슐린-Fc 융합 단백질의 점증 용량에 의한 치료를 투여받는 동안 혈당 조절(임상 징후, 프럭토스아민 수준, 및 연속 혈당 모니터링 장치(CGMS)를 사용한 간질 글루코스 농도에 기초함)을 비교하여 평가한다. 용량을 0.1 ㎎/㎏에서 시작하여 피하 투여한 다음 CGMS 결과 및 임상 징후에 따라 최대 0.5 ㎎/㎏까지 매주 연속적으로 증량한다. 일부 개에 사용된 프로토콜 1 연구 일정을 표 18에 제공한다.
[표 18]
Figure pct00019
프로토콜 2는 당뇨병 진단을 받은 의뢰인 소유 개를 인슐린-Fc 융합 단백질로 치료하는 비공개, 자기-조절, 단일 부문, 파일럿 현장 효능 연구이다. 약물의 효과를, 표준 인슐린 요법(1주일 동안) 대, 5주에 걸쳐 인슐린-Fc 융합 단백질의 점증 용량에 의한 치료를 투여받는 동안 혈당 조절(임상 징후, 프럭토스아민 수준, 및 연속 혈당 모니터링 장치(CGMS)를 사용한 간질 글루코스 농도에 기초함)을 비교하여 평가한다. 용량을 0.1 ㎎/㎏에서 시작하여 피하 투여한 다음 CGMS 결과 및 임상 징후에 따라 최대 0.5 ㎎/㎏까지 매주 연속적으로 증량한다. 일부 개에 사용된 프로토콜 2 연구 일정을 표 19에 제공한다.
[표 19]
Figure pct00020
위의 프로토콜 중 하나를 완료한 후 최대 1년 동안 선택적 "가정 사용" 평가가 존재한다. 이 단계에서 수의사는 기존 인슐린을 사용하는 다른 환자와 마찬가지로 각각의 개를 사례별로 치료한다. 연속 글루코스 모니터링 장치(CGMS)를 사용한 임상 징후 및 간질 글루코스 농도를 이 연구 단계 전반에 걸쳐 모니터링한다. 또한 프럭토사민 수준, 혈액 화학 및 혈구 수를 평가하고 항약물 및 항인슐린 항체의 존재 여부를 검사하기 위해 가능한 한 자주 혈액 샘플을 수집한다.
실시예 53: 개에서 인슐린-Fc 융합 단백질의 주기적 투여 후 생체내 항-인슐린 항체(AIA) 역가 측정 - 프로토콜 1.
Maxisorp ELISA 플레이트(Nunc)를 4℃에서 밤새 30 ㎍/㎖로 코팅 완충액(pH=9.6 카보네이트-비카보네이트 완충액)에 희석한 정제된 RHI로 코팅하였다. 이어서 플레이트를 PBST(PBS + 0.05% 트윈 20)로 5회 세척 하고 SuperBlock 차단 용액(ThermoFisher)으로 ≥1시간(또는 밤새) 차단하였다. 개 IgG 단위의 AIA를 계산하기 위해, 스트립을 4℃에서 밤새 300-4.69 ng/㎖ 농도의 pH=9.6 Carb-Biocarb 코팅 완충액에서 개 IgG(Jackson Immunoresearch)의 1:2 연속 희석액으로 직접 코팅하고, 이를 사용하여 7 점 의사-표준 곡선을 생성하였다. 표준 스트립 플레이트를 또한 세척하고 SuperBlock 차단 용액으로 ≥1시간 동안(또는 밤새) 차단하였다.
시험 혈청 샘플을 PBST/SB/20%HS 샘플 희석 완충액(PBS+0.1% 트윈 20+10% SuperBlock+20% 말 혈청)에서 ≥1:100(전형적으로 1:200으로 시험)으로 희석하고 RHI 코팅된 스트립에 100 ㎕/웰을 중복하여 첨가하였다. 개 IgG 코팅된 표준 스트립의 이중 스트립을 또한 각 플레이트에 첨가하고 PBST/SB(PBS+0.1% 트윈 20+10% SuperBlock) 완충액 100㎕/웰로 충전하였다. 플레이트를 실온에서 1시간 동안 배양하였다. 배양 후, 플레이트를 PBST로 5회 세척하였다. AIA의 검출을 위해, 개 IgG에 교차 반응된 HRP 접합된 염소 항-개 IgG F(ab')2(Jackson Immunoresearch)를 PBST/SB에서 1:10,000으로 희석하고 샘플과 표준 웰 모두에 100 ㎕/웰을 첨가하고 실온의 암실에서 45분 동안 배양하였다. 플레이트를 PBST로 5회 세척하고 100㎕/웰 TMB 기질(Invitrogen)을 실온의 암실에서 15-20분 동안 첨가하여 현상시켰다. 이어서 100 ㎕/웰의 ELISA 정지액(Boston Bioproducts)을 첨가하여 발색을 중단하고 30분 이내에 SpectraMax 플레이트 판독기를 사용하여 450 ㎚에서 흡광도를 판독한다. 항약물 항체 농도를 SoftMax Pro 소프트웨어를 사용하여 4-PL 의사-표준 곡선의 OD 값을 보간하여 측정하였다.
실시예 54: 개에서 인슐린-Fc 융합 단백질의 주기적 투여 후 생체내 항-인슐린 항체(AIA) 역가 측정 - 프로토콜 2.
일반적인 과정은 하기와 같다. 표지된 항원이 있는 혈청을 냉 인슐린과 함께 또는 상기 없이 밤새 배양한다. 항체 결합 표지된 항원을 96웰 플레이트 포맷에서 단백질-A/G 세파로스로 침전시키고, 이때 각 혈청을 이중으로 시험한다. 96웰 플레이트를 세척하여 결합되지 않은 표지된 항원을 제거한다. 각 웰을 96웰 플레이트 베타 카운터로 카운트한다. 결과를, 특정 분석에서 양성 및 음성 대조용 혈청의 델타 cpm에 대한 시험 혈청의 분당 델타 카운트(cpm)를 조정하는 지수로 표현한다.
구체적인 과정은 하기와 같은 두 가지 완충액의 제조를 수반한다: 완충액 1(150 mM NaCl, 20 mM 트리스-HCl, 1% BSA, 0.15% 트윈-20, 0.1% 나트륨 아지드 pH 7.4) 및 완충액 2(1% BSA 대신 0.1% BSA를 제외하고 완충액 1과 동일하다). 필요한 경우 각 혈청 샘플을 회전시켜 피브린 덩어리를 제거한다. 이어서 방사성 표지된 인슐린의 모액을, PBS에서 5% BSA 1 ㎖에 125I-인슐린 분말 10μCi를 용해하여 제조한다. "고온" 인슐린 항원 용액을, 3040 ㎕의 완충액 1 및 160 ㎕의 방사성 표지된 인슐린 모액을 사용하여 제조한다. "저온 억제된" 인슐린 항원 용액은 2784 ㎕의 완충액 1, 방사성 표지된 인슐린 모액 160㎕, 및 Humulin® 용액(Eli Lilly, IN) 256㎕를 사용하여 제조한다. 모든 용액을 사용 전에 얼음에 보관한다. 각 혈청 샘플 6 ㎕를 "고온" 인슐린 항원 용액 30 ㎕와 혼합하고, 각 혈청 샘플 6 ㎕를 PCR 튜브에서 "저온 억제된" 인슐린 항원 용액 30 ㎕와 혼합한다. 생성된 혼합물을 4℃에서 밤새 배양한다. 이어서 플레이트를, 150 ㎕의 완충액 1을 각 웰에 첨가하여 BSA로 코팅한 다음 알루미늄 호일 커버하에 실온에서 밤새 배양한 다음, 세척하고 세척 완충액을 제거한다. 단백질-A/G 세파로스 혼합물을 두 부분으로 제조한다. 단백질-A/G 세파로스 용액을 완충액 1에서 부피 기준 62.5% 농도로 제조한다. 단백질-A/G 세파로스 용액을 완충액 1에서 부피 기준 40% 농도로 제조한다. 마지막으로, 단백질-A/G 세파로스 혼합물을, 단백질-A 및 단백질-G 세파로스 용액을 4:1 비로 혼합하여 제조한다(최종 농도: 50% 단백질-A/8% 단백질-G 세파로스). 분석을 수행하기 위해서, 50 ㎕의 단백질 A/G-세파로스 혼합물 및 30 ㎕의 밤새 배양된 혈청 용액을 각 웰에 이중으로 첨가한다. 플레이트를 4℃에서 45분 동안 플레이트 진탕기에서 혼합한 다음 웰당 200 ㎕의 세척 완충액으로 Millipore 플레이트 세척 장치를 사용하여 7회 세척한 다음 37℃ 배양기에 15분 동안 넣어 건조시킨다. 50 ㎕의 섬광 칵테일(Microscint-20)을 각 웰에 첨가하고 96-웰 플레이트 카운터를 사용하여 플레이트를 카운트하여 각 웰에 대한 cpm을 측정한다.
균등물
청구범위에서, "a", "an" 및 "the"와 같은 관사는 상반되게 표시되거나 문맥상 달리 명백하지 않는 한 하나 또는 하나 초과를 의미할 수 있다. 그룹의 하나 이상의 구성원 사이의 "또는"을 포함하는 청구항 또는 설명은 명시되지 않는 한 그룹 구성원 중 하나, 하나 초과, 또는 모두가, 상반되게 표시되거나 문맥상 달리 명백하지 않는 한 주어진 생성물 또는 공정에 존재하거나 사용되거나 달리 관련이 있는 경우 충족된 것으로 간주된다. 본 개시내용은 그룹의 정확히 한 구성원이 주어진 생성물 또는 공정에 존재하거나 사용되거나 달리 관련된 구현예를 포함한다. 본 개시내용은 그룹 구성원 중 하나 초과 또는 모두가 주어진 생성물 또는 공정에 존재하거나 사용되거나 달리 관련된 구현예를 포함한다.
더욱 또한, 본 개시내용은 열거된 청구범위 중 하나 이상으로부터의 하나 이상의 제한, 요소, 절 및 설명 용어가 또 다른 청구범위에 도입되는 모든 변형, 조합 및 순열을 포함한다. 예를 들어, 또 다른 청구항에 종속되는 임의의 청구항은 동일한 기본 청구항에 종속되는 임의의 다른 청구항에서 발견되는 하나 이상의 제한을 포함하도록 수정될 수 있다. 요소가 예를 들어 Markush 그룹 포맷에서 목록으로서 표시되는 경우, 상기 요소의 각 하위 그룹도 또한 개시되며, 임의의 요소(들)는 그룹에서 제거될 수 있다. 일반적으로, 본 개시내용 또는 본 개시내용의 측면이 특정 요소 및/또는 특징을 포함하는 것으로 언급되는 경우, 본 개시내용의 특정 구현예 또는 본 개시내용의 측면은 그러한 요소 및/또는 특징으로 이루어지거나, 또는 필수적으로 이루어진다. 간략성을 위해서, 이들 구현예는 본원에서 구체적으로 제시되지 않았다. 또한 "포함하다", "포함하는", "함유하다", 및 "함유하는"이라는 용어는 개방된 용어이며 이들의 사용은 추가 요소 또는 단계의 포함을 허용한다는 점에 유의해야 한다. 범위가 주어지면 끝점이 포함된다. 더욱이, 달리 표시되지 않거나 문맥상 및 당업자의 이해로부터 명백하지 않은 한, 범위로서 표현되는 값은, 문맥에서 달리 명시하지 않는 한 범위의 하한 단위의 10분의 1까지, 본 개시내용의 상이한 구현예에서 언급된 범위 내에서 임의의 특정 값 또는 하위 범위를 가정할 수 있다.
기술의 다양한 구현예의 추가적인 이점은 본원의 개시내용 및 하기의 실행 실시예를 검토할 때 당업자에게 명백할 것이다. 본원에 기재된 다양한 구현예는 여기에 달리 표시되지 않는 한 반드시 상호 배타적이지 않다는 것이 이해될 것이다. 예를 들어, 하나의 구현예에서 설명되거나 묘사된 특징은 다른 구현예에도 포함될 수 있지만 반드시 포함되는 것은 아니다. 따라서, 본 발명은 여기에 설명된 특정 구현예의 다양한 조합 및/또는 통합을 포함한다.
본 설명은 또한 수치 범위를 사용하여 본 발명의 다양한 구현예와 관련된 특정 매개변수를 정량화한다. 수치 범위가 제공될 때, 그러한 범위는 상기 범위의 더 낮은 값만 인용하는 청구 제한뿐만 아니라 상기 범위의 더 높은 값만 인용하는 청구 제한에 대한 문자 그대로의 지원을 제공하는 것으로 해석되어야 함을 이해해야 한다. 예를 들어, 약 10 내지 약 100의 개시된 수치 범위는 "약 10 초과"(상한 없음)를 인용하는 청구항 및 "약 100 미만"(하한 없음)을 인용하는 청구항에 대한 문자 그대로의 지원을 제공한다.
SEQUENCE LISTING <110> Akston Biosciences Corporation <120> ANTIGEN SPECIFIC IMMUNOTHERAPY FOR COVID-19 FUSION PROTEINS AND METHODS OF USE <130> 55280-PCT <160> 33 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1273 <212> PRT <213> SARS-CoV-2 Surface Glycoprotein <400> 1 Met Phe Val Phe Leu Val Leu Leu Pro Leu Val Ser Ser Gln Cys Val 1 5 10 15 Asn Leu Thr Thr Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala Tyr Thr Asn Ser Phe 20 25 30 Thr Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Lys Val Phe Arg Ser Ser Val Leu 35 40 45 His Ser Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Phe Ser Asn Val Thr Trp 50 55 60 Phe His Ala Ile His Val Ser Gly Thr Asn Gly Thr Lys Arg Phe Asp 65 70 75 80 Asn Pro Val Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val Tyr Phe Ala Ser Thr Glu 85 90 95 Lys Ser Asn Ile Ile Arg Gly Trp Ile Phe Gly Thr Thr Leu Asp Ser 100 105 110 Lys Thr Gln Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr Asn Val Val Ile 115 120 125 Lys Val Cys Glu Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro Phe Leu Gly Val Tyr 130 135 140 Tyr His Lys Asn Asn Lys Ser Trp Met Glu Ser Glu Phe Arg Val Tyr 145 150 155 160 Ser Ser Ala Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser Gln Pro Phe Leu 165 170 175 Met Asp Leu Glu Gly Lys Gln Gly Asn Phe Lys Asn Leu Arg Glu Phe 180 185 190 Val Phe Lys Asn Ile Asp Gly Tyr Phe Lys Ile Tyr Ser Lys His Thr 195 200 205 Pro Ile Asn Leu Val Arg Asp Leu Pro Gln Gly Phe Ser Ala Leu Glu 210 215 220 Pro Leu Val Asp Leu Pro Ile Gly Ile Asn Ile Thr Arg Phe Gln Thr 225 230 235 240 Leu Leu Ala Leu His Arg Ser Tyr Leu Thr Pro Gly Asp Ser Ser Ser 245 250 255 Gly Trp Thr Ala Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr Val Gly Tyr Leu Gln Pro 260 265 270 Arg Thr Phe Leu Leu Lys Tyr Asn Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp Ala 275 280 285 Val Asp Cys Ala Leu Asp Pro Leu Ser Glu Thr Lys Cys Thr Leu Lys 290 295 300 Ser Phe Thr Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val 305 310 315 320 Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys 325 330 335 Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala 340 345 350 Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu 355 360 365 Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro 370 375 380 Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe 385 390 395 400 Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly 405 410 415 Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys 420 425 430 Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn 435 440 445 Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe 450 455 460 Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys 465 470 475 480 Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly 485 490 495 Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val 500 505 510 Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys 515 520 525 Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn Phe Asn 530 535 540 Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn Lys Lys Phe Leu 545 550 555 560 Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr Thr Asp Ala Val 565 570 575 Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr Pro Cys Ser Phe 580 585 590 Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Thr Ser Asn Gln Val 595 600 605 Ala Val Leu Tyr Gln Asp Val Asn Cys Thr Glu Val Pro Val Ala Ile 610 615 620 His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Thr Trp Arg Val Tyr Ser Thr Gly Ser 625 630 635 640 Asn Val Phe Gln Thr Arg Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala Glu His Val 645 650 655 Asn Asn Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile Cys Ala 660 665 670 Ser Tyr Gln Thr Gln Thr Asn Ser Pro Arg Arg Ala Arg Ser Val Ala 675 680 685 Ser Gln Ser Ile Ile Ala Tyr Thr Met Ser Leu Gly Ala Glu Asn Ser 690 695 700 Val Ala Tyr Ser Asn Asn Ser Ile Ala Ile Pro Thr Asn Phe Thr Ile 705 710 715 720 Ser Val Thr Thr Glu Ile Leu Pro Val Ser Met Thr Lys Thr Ser Val 725 730 735 Asp Cys Thr Met Tyr Ile Cys Gly Asp Ser Thr Glu Cys Ser Asn Leu 740 745 750 Leu Leu Gln Tyr Gly Ser Phe Cys Thr Gln Leu Asn Arg Ala Leu Thr 755 760 765 Gly Ile Ala Val Glu Gln Asp Lys Asn Thr Gln Glu Val Phe Ala Gln 770 775 780 Val Lys Gln Ile Tyr Lys Thr Pro Pro Ile Lys Asp Phe Gly Gly Phe 785 790 795 800 Asn Phe Ser Gln Ile Leu Pro Asp Pro Ser Lys Pro Ser Lys Arg Ser 805 810 815 Phe Ile Glu Asp Leu Leu Phe Asn Lys Val Thr Leu Ala Asp Ala Gly 820 825 830 Phe Ile Lys Gln Tyr Gly Asp Cys Leu Gly Asp Ile Ala Ala Arg Asp 835 840 845 Leu Ile Cys Ala Gln Lys Phe Asn Gly Leu Thr Val Leu Pro Pro Leu 850 855 860 Leu Thr Asp Glu Met Ile Ala Gln Tyr Thr Ser Ala Leu Leu Ala Gly 865 870 875 880 Thr Ile Thr Ser Gly Trp Thr Phe Gly Ala Gly Ala Ala Leu Gln Ile 885 890 895 Pro Phe Ala Met Gln Met Ala Tyr Arg Phe Asn Gly Ile Gly Val Thr 900 905 910 Gln Asn Val Leu Tyr Glu Asn Gln Lys Leu Ile Ala Asn Gln Phe Asn 915 920 925 Ser Ala Ile Gly Lys Ile Gln Asp Ser Leu Ser Ser Thr Ala Ser Ala 930 935 940 Leu Gly Lys Leu Gln Asp Val Val Asn Gln Asn Ala Gln Ala Leu Asn 945 950 955 960 Thr Leu Val Lys Gln Leu Ser Ser Asn Phe Gly Ala Ile Ser Ser Val 965 970 975 Leu Asn Asp Ile Leu Ser Arg Leu Asp Lys Val Glu Ala Glu Val Gln 980 985 990 Ile Asp Arg Leu Ile Thr Gly Arg Leu Gln Ser Leu Gln Thr Tyr Val 995 1000 1005 Thr Gln Gln Leu Ile Arg Ala Ala Glu Ile Arg Ala Ser Ala Asn 1010 1015 1020 Leu Ala Ala Thr Lys Met Ser Glu Cys Val Leu Gly Gln Ser Lys 1025 1030 1035 Arg Val Asp Phe Cys Gly Lys Gly Tyr His Leu Met Ser Phe Pro 1040 1045 1050 Gln Ser Ala Pro His Gly Val Val Phe Leu His Val Thr Tyr Val 1055 1060 1065 Pro Ala Gln Glu Lys Asn Phe Thr Thr Ala Pro Ala Ile Cys His 1070 1075 1080 Asp Gly Lys Ala His Phe Pro Arg Glu Gly Val Phe Val Ser Asn 1085 1090 1095 Gly Thr His Trp Phe Val Thr Gln Arg Asn Phe Tyr Glu Pro Gln 1100 1105 1110 Ile Ile Thr Thr Asp Asn Thr Phe Val Ser Gly Asn Cys Asp Val 1115 1120 1125 Val Ile Gly Ile Val Asn Asn Thr Val Tyr Asp Pro Leu Gln Pro 1130 1135 1140 Glu Leu Asp Ser Phe Lys Glu Glu Leu Asp Lys Tyr Phe Lys Asn 1145 1150 1155 His Thr Ser Pro Asp Val Asp Leu Gly Asp Ile Ser Gly Ile Asn 1160 1165 1170 Ala Ser Val Val Asn Ile Gln Lys Glu Ile Asp Arg Leu Asn Glu 1175 1180 1185 Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp Leu Gln Glu Leu 1190 1195 1200 Gly Lys Tyr Glu Gln Tyr Ile Lys Trp Pro Trp Tyr Ile Trp Leu 1205 1210 1215 Gly Phe Ile Ala Gly Leu Ile Ala Ile Val Met Val Thr Ile Met 1220 1225 1230 Leu Cys Cys Met Thr Ser Cys Cys Ser Cys Leu Lys Gly Cys Cys 1235 1240 1245 Ser Cys Gly Ser Cys Cys Lys Phe Asp Glu Asp Asp Ser Glu Pro 1250 1255 1260 Val Leu Lys Gly Val Lys Leu His Tyr Thr 1265 1270 <210> 2 <211> 254 <212> PRT <213> SARS-Cov-2 RBD <400> 2 Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr 1 5 10 15 Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys 20 25 30 Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe 35 40 45 Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr 50 55 60 Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln 65 70 75 80 Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu 85 90 95 Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu 100 105 110 Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg 115 120 125 Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr 130 135 140 Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr 145 150 155 160 Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr 165 170 175 Gln Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro 180 185 190 Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys 195 200 205 Cys Val Asn Phe Asn Phe Asn Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr 210 215 220 Glu Ser Asn Lys Lys Phe Leu Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile 225 230 235 240 Ala Asp Thr Thr Asp Ala Val Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu 245 250 <210> 3 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Linker <400> 3 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 1 5 <210> 4 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Linker <400> 4 Gly Gly Gly Gly Gly Gln Gly Gly Gly Gly Gln Gly Gly Gly Gly Gln 1 5 10 15 Gly Gly Gly Gly Gly 20 <210> 5 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Linker <400> 5 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 6 <211> 226 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Fc Fragment <400> 6 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 1 5 10 15 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 20 25 30 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 35 40 45 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 50 55 60 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 65 70 75 80 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 85 90 95 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 100 105 110 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 115 120 125 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser 130 135 140 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 145 150 155 160 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 165 170 175 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 180 185 190 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 195 200 205 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 210 215 220 Pro Gly 225 <210> 7 <211> 231 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Fc Fragment <400> 7 Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 1 5 10 15 Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 20 25 30 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 35 40 45 Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp 50 55 60 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr 65 70 75 80 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 85 90 95 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu 100 105 110 Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 115 120 125 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys 130 135 140 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 145 150 155 160 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 165 170 175 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 180 185 190 Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser 195 200 205 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 210 215 220 Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 225 230 <210> 8 <211> 194 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic SARS-Cov-2 RBD Analog <400> 8 Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg 1 5 10 15 Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val 20 25 30 Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys 35 40 45 Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn 50 55 60 Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile 65 70 75 80 Ala Pro Gly Gln Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro 85 90 95 Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp 100 105 110 Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys 115 120 125 Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln 130 135 140 Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe 145 150 155 160 Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln 165 170 175 Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala 180 185 190 Thr Val <210> 9 <211> 194 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic SARS-Cov-2 RBD Analog <400> 9 Gln Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Gln Ala Thr Arg 1 5 10 15 Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val 20 25 30 Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys 35 40 45 Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Met Phe Thr Asn 50 55 60 Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile 65 70 75 80 Ala Pro Gly Gln Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro 85 90 95 Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp 100 105 110 Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys 115 120 125 Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln 130 135 140 Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe 145 150 155 160 Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln 165 170 175 Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala 180 185 190 Thr Val <210> 10 <211> 92 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic SARS-Cov-2 RBD Analog <400> 10 Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn 1 5 10 15 Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe 20 25 30 Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys 35 40 45 Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly 50 55 60 Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val 65 70 75 80 Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val 85 90 <210> 11 <211> 441 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc Fusion Protein <400> 11 Gln Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Gln Ala Thr Arg 1 5 10 15 Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val 20 25 30 Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys 35 40 45 Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Met Phe Thr Asn 50 55 60 Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile 65 70 75 80 Ala Pro Gly Gln Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro 85 90 95 Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp 100 105 110 Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys 115 120 125 Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln 130 135 140 Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe 145 150 155 160 Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln 165 170 175 Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala 180 185 190 Thr Val Gly Gly Gly Gly Gly Gln Gly Gly Gly Gly Gln Gly Gly Gly 195 200 205 Gly Gln Gly Gly Gly Gly Gly Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 210 215 220 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 225 230 235 240 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 245 250 255 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 260 265 270 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 275 280 285 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 290 295 300 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 305 310 315 320 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 325 330 335 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 340 345 350 Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 355 360 365 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 370 375 380 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 385 390 395 400 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 405 410 415 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 420 425 430 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 435 440 <210> 12 <211> 339 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc Fusion Protein <400> 12 Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn 1 5 10 15 Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe 20 25 30 Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys 35 40 45 Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly 50 55 60 Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val 65 70 75 80 Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Gly Gly Gly Gly 85 90 95 Gly Gln Gly Gly Gly Gly Gln Gly Gly Gly Gly Gln Gly Gly Gly Gly 100 105 110 Gly Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu 115 120 125 Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 130 135 140 Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 145 150 155 160 His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 165 170 175 Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr 180 185 190 Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn 195 200 205 Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro 210 215 220 Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln 225 230 235 240 Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val 245 250 255 Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val 260 265 270 Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 275 280 285 Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr 290 295 300 Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val 305 310 315 320 Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu 325 330 335 Ser Pro Gly <210> 13 <211> 273 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic SARS-Cov-2 RBD Analog <400> 13 Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn 1 5 10 15 Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val 20 25 30 Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser 35 40 45 Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val 50 55 60 Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp 65 70 75 80 Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln 85 90 95 Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr 100 105 110 Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly 115 120 125 Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys 130 135 140 Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr 145 150 155 160 Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser 165 170 175 Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val 180 185 190 Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly 195 200 205 Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn 210 215 220 Phe Asn Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn Lys Lys 225 230 235 240 Phe Leu Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr Thr Asp 245 250 255 Ala Val Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr Pro Cys 260 265 270 Ser <210> 14 <211> 223 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic SARS-Cov-2 RBD Analog <400> 14 Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn 1 5 10 15 Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val 20 25 30 Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser 35 40 45 Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val 50 55 60 Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp 65 70 75 80 Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln 85 90 95 Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr 100 105 110 Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly 115 120 125 Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys 130 135 140 Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr 145 150 155 160 Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser 165 170 175 Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val 180 185 190 Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly 195 200 205 Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe 210 215 220 <210> 15 <211> 217 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic SARS-Cov-2 RBD Analog <400> 15 Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn 1 5 10 15 Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val 20 25 30 Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser 35 40 45 Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val 50 55 60 Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp 65 70 75 80 Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln 85 90 95 Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr 100 105 110 Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly 115 120 125 Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys 130 135 140 Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr 145 150 155 160 Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser 165 170 175 Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val 180 185 190 Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly 195 200 205 Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys 210 215 <210> 16 <211> 461 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc Fusion Protein <400> 16 Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn 1 5 10 15 Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val 20 25 30 Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser 35 40 45 Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val 50 55 60 Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp 65 70 75 80 Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln 85 90 95 Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr 100 105 110 Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly 115 120 125 Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys 130 135 140 Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr 145 150 155 160 Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser 165 170 175 Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val 180 185 190 Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly 195 200 205 Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Gly 210 215 220 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr 225 230 235 240 Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe 245 250 255 Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro 260 265 270 Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val 275 280 285 Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr 290 295 300 Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val 305 310 315 320 Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 325 330 335 Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser 340 345 350 Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro 355 360 365 Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val 370 375 380 Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly 385 390 395 400 Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp 405 410 415 Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp 420 425 430 Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His 435 440 445 Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 450 455 460 <210> 17 <211> 462 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc Fusion Protein <400> 17 Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn 1 5 10 15 Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val 20 25 30 Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser 35 40 45 Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val 50 55 60 Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp 65 70 75 80 Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln 85 90 95 Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr 100 105 110 Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly 115 120 125 Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys 130 135 140 Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr 145 150 155 160 Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser 165 170 175 Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val 180 185 190 Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly 195 200 205 Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Gly 210 215 220 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr 225 230 235 240 Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe 245 250 255 Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro 260 265 270 Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val 275 280 285 Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr 290 295 300 Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val 305 310 315 320 Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 325 330 335 Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser 340 345 350 Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro 355 360 365 Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val 370 375 380 Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly 385 390 395 400 Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp 405 410 415 Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp 420 425 430 Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His 435 440 445 Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 450 455 460 <210> 18 <211> 470 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc Fusion Protein <400> 18 Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn 1 5 10 15 Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val 20 25 30 Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser 35 40 45 Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val 50 55 60 Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp 65 70 75 80 Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln 85 90 95 Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr 100 105 110 Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly 115 120 125 Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys 130 135 140 Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr 145 150 155 160 Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser 165 170 175 Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val 180 185 190 Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly 195 200 205 Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Gly 210 215 220 Gly Gly Gly Gly Gln Gly Gly Gly Gly Gln Gly Gly Gly Gly Gln Gly 225 230 235 240 Gly Gly Gly Gly Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 245 250 255 Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 260 265 270 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 275 280 285 Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp 290 295 300 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr 305 310 315 320 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 325 330 335 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu 340 345 350 Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 355 360 365 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys 370 375 380 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 385 390 395 400 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 405 410 415 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 420 425 430 Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser 435 440 445 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 450 455 460 Leu Ser Leu Ser Pro Gly 465 470 <210> 19 <211> 507 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc Fusion Protein <400> 19 Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn 1 5 10 15 Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val 20 25 30 Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser 35 40 45 Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val 50 55 60 Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp 65 70 75 80 Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln 85 90 95 Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr 100 105 110 Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly 115 120 125 Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys 130 135 140 Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr 145 150 155 160 Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser 165 170 175 Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val 180 185 190 Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly 195 200 205 Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn 210 215 220 Phe Asn Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn Lys Lys 225 230 235 240 Phe Leu Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr Thr Asp 245 250 255 Ala Val Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr Pro Cys 260 265 270 Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro 275 280 285 Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe 290 295 300 Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val 305 310 315 320 Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe 325 330 335 Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro 340 345 350 Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr 355 360 365 Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val 370 375 380 Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala 385 390 395 400 Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg 405 410 415 Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly 420 425 430 Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro 435 440 445 Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser 450 455 460 Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln 465 470 475 480 Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His 485 490 495 Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 500 505 <210> 20 <211> 451 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc Fusion Protein <400> 20 Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn 1 5 10 15 Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val 20 25 30 Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser 35 40 45 Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val 50 55 60 Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp 65 70 75 80 Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln 85 90 95 Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr 100 105 110 Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly 115 120 125 Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys 130 135 140 Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr 145 150 155 160 Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser 165 170 175 Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val 180 185 190 Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly 195 200 205 Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 210 215 220 Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu 225 230 235 240 Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 245 250 255 Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 260 265 270 His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 275 280 285 Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr 290 295 300 Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn 305 310 315 320 Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro 325 330 335 Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln 340 345 350 Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val 355 360 365 Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val 370 375 380 Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 385 390 395 400 Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr 405 410 415 Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val 420 425 430 Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu 435 440 445 Ser Pro Gly 450 <210> 21 <211> 443 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic SARS-CoV-2-RBD-hIgG-Fc Fusion Protein <400> 21 Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn 1 5 10 15 Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val 20 25 30 Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser 35 40 45 Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val 50 55 60 Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp 65 70 75 80 Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln 85 90 95 Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr 100 105 110 Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly 115 120 125 Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys 130 135 140 Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr 145 150 155 160 Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser 165 170 175 Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val 180 185 190 Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly 195 200 205 Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro 210 215 220 Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe 225 230 235 240 Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val 245 250 255 Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe 260 265 270 Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro 275 280 285 Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr 290 295 300 Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val 305 310 315 320 Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala 325 330 335 Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg 340 345 350 Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly 355 360 365 Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro 370 375 380 Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser 385 390 395 400 Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln 405 410 415 Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His 420 425 430 Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 435 440 <210> 22 <211> 233 <212> PRT <213> Mouse IgG2a Fc Fragment <400> 22 Glu Pro Arg Gly Pro Thr Ile Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro 1 5 10 15 Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys 20 25 30 Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys Val 35 40 45 Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe 50 55 60 Val Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu 65 70 75 80 Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His 85 90 95 Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys 100 105 110 Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly Ser 115 120 125 Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu Met 130 135 140 Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met Pro 145 150 155 160 Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu Asn 165 170 175 Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met 180 185 190 Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser 195 200 205 Tyr Ser Cys Ser Val Val His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Thr 210 215 220 Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly Lys 225 230 <210> 23 <211> 464 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic SARS-CoV-2-RBD-Mouse-IgG2a-Fc Fusion Protein <400> 23 Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn 1 5 10 15 Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val 20 25 30 Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser 35 40 45 Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val 50 55 60 Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp 65 70 75 80 Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln 85 90 95 Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr 100 105 110 Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly 115 120 125 Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys 130 135 140 Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr 145 150 155 160 Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser 165 170 175 Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val 180 185 190 Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly 195 200 205 Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Gly 210 215 220 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Pro Arg Gly Pro Thr Ile Lys Pro 225 230 235 240 Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro Ser 245 250 255 Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu 260 265 270 Ser Pro Ile Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro 275 280 285 Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala 290 295 300 Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val 305 310 315 320 Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe 325 330 335 Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg Thr 340 345 350 Ile Ser Lys Pro Lys Gly Ser Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val Leu 355 360 365 Pro Pro Pro Glu Glu Glu Met Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr Cys 370 375 380 Met Val Thr Asp Phe Met Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr Asn 385 390 395 400 Asn Gly Lys Thr Glu Leu Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu Asp 405 410 415 Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys Lys 420 425 430 Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val His Glu Gly 435 440 445 Leu His Asn His His Thr Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly Lys 450 455 460 <210> 24 <211> 254 <212> PRT <213> SARS-Cov-2 RBD UK Variant (N501Y) <400> 24 Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr 1 5 10 15 Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys 20 25 30 Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe 35 40 45 Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr 50 55 60 Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln 65 70 75 80 Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu 85 90 95 Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu 100 105 110 Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg 115 120 125 Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr 130 135 140 Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr 145 150 155 160 Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Tyr Gly Val Gly Tyr 165 170 175 Gln Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro 180 185 190 Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys 195 200 205 Cys Val Asn Phe Asn Phe Asn Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr 210 215 220 Glu Ser Asn Lys Lys Phe Leu Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile 225 230 235 240 Ala Asp Thr Thr Asp Ala Val Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu 245 250 <210> 25 <211> 254 <212> PRT <213> SARS-Cov-2 RBD South Africa Variant (E484K) <400> 25 Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr 1 5 10 15 Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys 20 25 30 Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe 35 40 45 Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr 50 55 60 Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln 65 70 75 80 Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu 85 90 95 Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu 100 105 110 Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg 115 120 125 Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr 130 135 140 Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val Lys Gly Phe Asn Cys Tyr 145 150 155 160 Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr 165 170 175 Gln Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro 180 185 190 Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys 195 200 205 Cys Val Asn Phe Asn Phe Asn Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr 210 215 220 Glu Ser Asn Lys Lys Phe Leu Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile 225 230 235 240 Ala Asp Thr Thr Asp Ala Val Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu 245 250 <210> 26 <211> 224 <212> PRT <213> Canine Native IgGB <400> 26 Asp Cys Pro Lys Cys Pro Ala Pro Glu Met Leu Gly Gly Pro Ser Val 1 5 10 15 Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Leu Ile Ala Arg Thr 20 25 30 Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Leu Asp Pro Glu Asp Pro Glu 35 40 45 Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asp Gly Lys Gln Met Gln Thr Ala Lys 50 55 60 Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Gly Thr Tyr Arg Val Val Ser 65 70 75 80 Val Leu Pro Ile Gly His Gln Asp Trp Leu Lys Gly Lys Gln Phe Thr 85 90 95 Cys Lys Val Asn Asn Lys Ala Leu Pro Ser Pro Ile Glu Arg Thr Ile 100 105 110 Ser Lys Ala Arg Gly Gln Ala His Gln Pro Ser Val Tyr Val Leu Pro 115 120 125 Pro Ser Arg Glu Glu Leu Ser Lys Asn Thr Val Ser Leu Thr Cys Leu 130 135 140 Ile Lys Asp Phe Phe Pro Pro Asp Ile Asp Val Glu Trp Gln Ser Asn 145 150 155 160 Gly Gln Gln Glu Pro Glu Ser Lys Tyr Arg Thr Thr Pro Pro Gln Leu 165 170 175 Asp Glu Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ser Val Asp Lys 180 185 190 Ser Arg Trp Gln Arg Gly Asp Thr Phe Ile Cys Ala Val Met His Glu 195 200 205 Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Glu Ser Leu Ser His Ser Pro Gly 210 215 220 <210> 27 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Linker <400> 27 Gly Gly Gly Gly Gly Gln Gly Gly Gly Gly Gln Gly Gly Gly Gly Gln 1 5 10 15 Gly Gly Gly Gly Gly 20 <210> 28 <211> 57 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Insulin Analog (B-C-A) <400> 28 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Glu 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe His Tyr Gly Gly Gly Gly Gly Gly 20 25 30 Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Thr Cys 35 40 45 Ser Leu Asp Gln Leu Glu Asn Tyr Cys 50 55 <210> 29 <211> 302 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Canine Insulin-Fc Fusion Protein <400> 29 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Glu 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe His Tyr Gly Gly Gly Gly Gly Gly 20 25 30 Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Thr Cys 35 40 45 Ser Leu Asp Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Gly Gly Gly Gly Gly Gln Gly 50 55 60 Gly Gly Gly Gln Gly Gly Gly Gly Gln Gly Gly Gly Gly Gly Asp Cys 65 70 75 80 Pro Lys Cys Pro Ala Pro Glu Met Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile 85 90 95 Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Leu Ile Ala Arg Thr Pro Glu 100 105 110 Val Thr Cys Val Val Val Asp Leu Asp Pro Glu Asp Pro Glu Val Gln 115 120 125 Ile Ser Trp Phe Val Asp Gly Lys Gln Met Gln Thr Ala Lys Thr Gln 130 135 140 Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Gly Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu 145 150 155 160 Pro Ile Gly His Gln Asp Trp Leu Lys Gly Lys Gln Phe Thr Cys Lys 165 170 175 Val Asn Asn Lys Ala Leu Pro Ser Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys 180 185 190 Ala Arg Gly Gln Ala His Gln Pro Ser Val Tyr Val Leu Pro Pro Ser 195 200 205 Arg Glu Glu Leu Ser Lys Asn Thr Val Ser Leu Thr Cys Leu Ile Lys 210 215 220 Asp Phe Phe Pro Pro Asp Ile Asp Val Glu Trp Gln Ser Asn Gly Gln 225 230 235 240 Gln Glu Pro Glu Ser Lys Tyr Arg Thr Thr Pro Pro Gln Leu Asp Glu 245 250 255 Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ser Val Asp Lys Ser Arg 260 265 270 Trp Gln Arg Gly Asp Thr Phe Ile Cys Ala Val Met His Glu Ala Leu 275 280 285 His Asn His Tyr Thr Gln Glu Ser Leu Ser His Ser Pro Gly 290 295 300 <210> 30 <211> 224 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Fc Fragment <220> <221> MISC_FEATURE <222> (73)..(73) <223> Xaa = S, Q, D, K, A <400> 30 Asp Cys Pro Lys Cys Pro Ala Pro Glu Met Leu Gly Gly Pro Ser Val 1 5 10 15 Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Leu Ile Ala Arg Thr 20 25 30 Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Leu Asp Pro Glu Asp Pro Glu 35 40 45 Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asp Gly Lys Gln Met Gln Thr Ala Lys 50 55 60 Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Xaa Gly Thr Tyr Arg Val Val Ser 65 70 75 80 Val Leu Pro Ile Gly His Gln Asp Trp Leu Lys Gly Lys Gln Phe Thr 85 90 95 Cys Lys Val Asn Asn Lys Ala Leu Pro Ser Pro Ile Glu Arg Thr Ile 100 105 110 Ser Lys Ala Arg Gly Gln Ala His Gln Pro Ser Val Tyr Val Leu Pro 115 120 125 Pro Ser Arg Glu Glu Leu Ser Lys Asn Thr Val Ser Leu Thr Cys Leu 130 135 140 Ile Lys Asp Phe Phe Pro Pro Asp Ile Asp Val Glu Trp Gln Ser Asn 145 150 155 160 Gly Gln Gln Glu Pro Glu Ser Lys Tyr Arg Thr Thr Pro Pro Gln Leu 165 170 175 Asp Glu Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ser Val Asp Lys 180 185 190 Ser Arg Trp Gln Arg Gly Asp Thr Phe Ile Cys Ala Val Met His Glu 195 200 205 Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Glu Ser Leu Ser His Ser Pro Gly 210 215 220 <210> 31 <211> 57 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Insulin Analog (B-C-A) <400> 31 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Ala 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe His Tyr Gly Gly Gly Gly Gly Gly 20 25 30 Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Thr Cys 35 40 45 Ser Leu Asp Gln Leu Glu Asn Tyr Cys 50 55 <210> 32 <211> 302 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Canine Insulin-Fc Fusion Protein <400> 32 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Ala 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe His Tyr Gly Gly Gly Gly Gly Gly 20 25 30 Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Thr Cys 35 40 45 Ser Leu Asp Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Gly Gly Gly Gly Gly Gln Gly 50 55 60 Gly Gly Gly Gln Gly Gly Gly Gly Gln Gly Gly Gly Gly Gly Asp Cys 65 70 75 80 Pro Lys Cys Pro Ala Pro Glu Met Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile 85 90 95 Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Leu Ile Ala Arg Thr Pro Glu 100 105 110 Val Thr Cys Val Val Val Asp Leu Asp Pro Glu Asp Pro Glu Val Gln 115 120 125 Ile Ser Trp Phe Val Asp Gly Lys Gln Met Gln Thr Ala Lys Thr Gln 130 135 140 Pro Arg Glu Glu Gln Phe Ser Gly Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu 145 150 155 160 Pro Ile Gly His Gln Asp Trp Leu Lys Gly Lys Gln Phe Thr Cys Lys 165 170 175 Val Asn Asn Lys Ala Leu Pro Ser Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys 180 185 190 Ala Arg Gly Gln Ala His Gln Pro Ser Val Tyr Val Leu Pro Pro Ser 195 200 205 Arg Glu Glu Leu Ser Lys Asn Thr Val Ser Leu Thr Cys Leu Ile Lys 210 215 220 Asp Phe Phe Pro Pro Asp Ile Asp Val Glu Trp Gln Ser Asn Gly Gln 225 230 235 240 Gln Glu Pro Glu Ser Lys Tyr Arg Thr Thr Pro Pro Gln Leu Asp Glu 245 250 255 Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ser Val Asp Lys Ser Arg 260 265 270 Trp Gln Arg Gly Asp Thr Phe Ile Cys Ala Val Met His Glu Ala Leu 275 280 285 His Asn His Tyr Thr Gln Glu Ser Leu Ser His Ser Pro Gly 290 295 300 <210> 33 <211> 230 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Fc Fragment <400> 33 Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 1 5 10 15 Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 20 25 30 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 35 40 45 Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp 50 55 60 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr 65 70 75 80 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 85 90 95 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu 100 105 110 Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 115 120 125 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys 130 135 140 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 145 150 155 160 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 165 170 175 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 180 185 190 Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser 195 200 205 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 210 215 220 Leu Ser Leu Ser Pro Gly 225 230

Claims (47)

  1. 바이러스 수용체 결합 도메인(viral receptor binding domain) 및 Fc 단편을 포함하는 융합 단백질(fusion protein)로서, 상기 바이러스 수용체 결합 도메인 및 Fc 단편은 펩티드 링커(linker)와 같은 선택적 링커에 의해 연결되고, 상기 바이러스 수용체 결합 도메인은 하기 서열 또는 이의 기능적 단편을 포함하는, 융합 단백질:
    RVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCS(서열번호 13); 또는
    RVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNF(서열번호 14); 또는
    RVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVK(서열번호 15).
  2. 제1항에 있어서,
    Fc 단편이 하기 서열 또는 이의 기능적 단편을 포함하는, 융합 단백질:
    DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(서열번호 6); 또는
    PKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(서열번호 33).
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    링커가, 존재하는 경우, 하기 서열을 포함하는, 융합 단백질:
    GGGSGGGS(서열번호 5) 또는 GGGGGQGGGGQGGGGQGGGGG(서열번호 27).
  4. 제1항에 있어서,
    하기 서열 또는 이의 기능적 단편을 포함하는 융합 단백질:
    RVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFGGGSGGGSPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(서열번호 16); 또는
    RVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFGGGGGQGGGGQGGGGQGGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(서열번호 18); 또는
    RVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSGGGSGGGSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(서열번호 19); 또는
    RVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKGGGSGGGSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(서열번호 20); 또는
    RVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(서열번호 21).
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    동종이량체(homodimer)인 융합 단백질.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    Fc 단편이 글리코실화되는, 융합 단백질.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 융합 단백질 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 면역원성 조성물(immunogenic composition).
  8. 제7항에 있어서,
    항원보강제(adjuvant)를 추가로 포함하는, 면역원성 조성물.
  9. 제8항에 있어서,
    항원보강제가 MontanideTM ISA-720인, 면역원성 조성물.
  10. 제8항 또는 제9항에 있어서,
    상기 융합 단백질이 상기 항원보강제로 유화(emulsifying)되는, 면역원성 조성물.
  11. 제7항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    주사가능한 제형인, 면역원성 조성물.
  12. 제7항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    피하 투여에 적합한, 면역원성 조성물.
  13. 제7항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
    예방학적 백신접종에 적합한, 면역원성 조성물.
  14. 제7항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
    치료학적 백신접종에 적합한, 면역원성 조성물.
  15. 제7항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
    융합 단백질이 상기 담체 중에 분산되는, 면역원성 조성물.
  16. 대상체(subject)에서 항원제(antigenic agent)에 대한 항체 생산을 증가시키는 방법으로서, 상기 방법이 상기 대상체에게 치료 유효량의 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 융합 단백질, 또는 제7항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 면역원성 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  17. 제16항에 있어서,
    대상체가 융합 단백질 또는 면역원성 조성물의 투여 전에 상기 항원제에 대해 측정가능한 항체 역가(antibody titer)를 갖는, 방법.
  18. 제16항에 있어서,
    대상체가 융합 단백질 또는 면역원성 조성물의 투여 전에 항체 나이브(
    Figure pct00021
    )인, 방법.
  19. 제16항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서,
    융합 단백질 또는 면역원성 조성물이 주사를 통해 투여되는 방법.
  20. 제19항에 있어서,
    융합 단백질 또는 면역원성 조성물이 피하 또는 근육내로 투여되는 방법.
  21. 제16항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서,
    융합 단백질 또는 면역원성 조성물이 단위 투여형(unit dosage form)으로서 제공되는 방법.
  22. 제16항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서,
    융합 단백질 또는 면역원성 조성물이 항원보강제와 공-투여(co-administering)되는 방법.
  23. 제16항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서,
    투여를 위해 상기 융합 단백질 또는 면역원성 조성물을 제조하는 단계를 추가로 포함하고, 상기 제조가 상기 투여 전에 상기 융합 단백질 또는 면역원성 조성물을 항원보강제와 예비-혼합(pre-mixing)하는 단계를 포함하는, 방법.
  24. 제23항에 있어서,
    상기 예비-혼합하는 단계가 상기 항원보강제 및 상기 융합 단백질을 유화시켜 유화액(emulsion)을 생성하고, 상기 유화액을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  25. 대상체에서 바이러스 감염, 바람직하게는 SARS-CoV-2 바이러스, 보다 바람직하게는 COVID-19에 대한 면역 반응을 유도하는 방법으로서, 상기 방법이 상기 대상체에게 치료 유효량의 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 융합 단백질, 또는 제7항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 면역원성 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  26. 제25항에 있어서,
    대상체가 융합 단백질 또는 면역원성 조성물의 투여 전에 상기 바이러스 감염에 대해 측정가능한 항체 역가를 갖는, 방법.
  27. 제25항에 있어서,
    대상체가 융합 단백질 또는 면역원성 조성물의 투여 전에 항체 나이브인, 방법.
  28. 제25항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서,
    융합 단백질 또는 면역원성 조성물이 주사를 통해 투여되는 방법.
  29. 제29항에 있어서,
    융합 단백질 또는 면역원성 조성물이 피하 또는 근육내로 투여되는 방법.
  30. 제25항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서,
    융합 단백질 또는 면역원성 조성물이 단위 투여형으로서 제공되는 방법.
  31. 제25항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서,
    융합 단백질 또는 면역원성 조성물이 항원보강제와 공-투여되는 방법.
  32. 제25항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서,
    투여를 위해 상기 융합 단백질 또는 면역원성 조성물을 제조하는 단계를 추가로 포함하고, 상기 제조가 상기 투여 전에 상기 융합 단백질 또는 면역원성 조성물을 항원보강제와 예비-혼합하는 단계를 포함하는, 방법.
  33. 제32항에 있어서,
    상기 예비-혼합하는 단계가 상기 항원보강제 및 상기 융합 단백질을 유화시키고, 상기 유화액을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  34. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 융합 단백질을 생산하는 방법으로서, 상기 방법이 융합 단백질을 암호화하는 핵산을 HEK293 또는 CHO-SE 세포에 일시적으로 형질감염시키는 단계(여기서 형질감염된 HEK293 또는 CHO-SE 세포는 상기 융합 단백질을 발현한다), 또는 융합 단백질을 암호화하는 핵산을 CHO 세포 내로 안정적으로 형질감염시키는 단계(여기서 재조합 CHO 세포는 상기 융합 단백질을 발현한다)를 포함하는, 방법.
  35. 제34항에 있어서,
    융합 단백질이 세포에 의해 세포 배양 배지로 분비되고, 상기 배지로부터 상기 융합 단백질을 정제 또는 단리하는 단계를 추가로 포함하며, 상기 정제 또는 단리된 융합 단백질의 수율이 상기 발현 시스템 중 어느 하나에서 20 ㎎/L를 초과하는, 방법.
  36. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 융합 단백질을 발현하도록 조작된 세포.
  37. 제36항에 있어서,
    융합 단백질을 암호화하는 핵산으로 형질감염되는 세포.
  38. 제36항 또는 제37항에 있어서,
    HEK293 세포 또는 CHO 세포인 세포.
  39. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 융합 단백질을 암호화하는 cDNA.
  40. 제39항에 따른 cDNA를 포함하는 발현 벡터(expression vector).
  41. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 또는 제7항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 치료법(therapy)에 및/또는 약제(medicament)로서 사용하기 위한, 융합 단백질, 또는 면역원성 조성물.
  42. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 또는 제7항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체에서 항체 생산을 증가시키는 데 사용하기 위한, 융합 단백질, 또는 면역원성 조성물.
  43. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 또는 제7항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 바이러스 감염, 바람직하게는 SARS-CoV-2 바이러스, 보다 바람직하게는 COVID-19의 치료 및/또는 예방에 사용하기 위한, 융합 단백질, 또는 면역원성 조성물.
  44. (내용없음).
  45. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 또는 제7항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 예방학적, 치료학적 및/또는 추가접종 백신으로서 제34항에 따라 사용하기 위한, 융합 단백질, 또는 면역원성 조성물.
  46. 바이러스 감염, 바람직하게는 SARS-CoV-2 바이러스, 보다 바람직하게는 COVID-19의 치료 및/또는 예방에 사용하기 위한, 서열번호 16, 서열번호 18, 서열번호 19, 서열번호 20 및 서열번호 21로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 융합 단백질 또는 이의 약학 조성물.
  47. 바이러스 감염의 치료 및/또는 예방을 위한 약제의 제조에서의, 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 융합 단백질, 또는 제7항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 면역원성 조성물의 용도.
KR1020227039307A 2020-04-10 2021-04-09 Covid-19 융합 단백질에 대한 항원 특이적 면역요법 및 사용 방법 KR20220167317A (ko)

Applications Claiming Priority (29)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US202063008497P 2020-04-10 2020-04-10
US202063008503P 2020-04-10 2020-04-10
US202063008515P 2020-04-10 2020-04-10
US202063008509P 2020-04-10 2020-04-10
US63/008,503 2020-04-10
US63/008,509 2020-04-10
US63/008,497 2020-04-10
US63/008,515 2020-04-10
US202063041582P 2020-06-19 2020-06-19
US202063041584P 2020-06-19 2020-06-19
US202063041574P 2020-06-19 2020-06-19
US202063041579P 2020-06-19 2020-06-19
US63/041,582 2020-06-19
US63/041,579 2020-06-19
US63/041,574 2020-06-19
US63/041,584 2020-06-19
US202063048939P 2020-07-07 2020-07-07
US63/048,939 2020-07-07
US202063068775P 2020-08-21 2020-08-21
US202063068911P 2020-08-21 2020-08-21
US202063068805P 2020-08-21 2020-08-21
US202063068843P 2020-08-21 2020-08-21
US202063068894P 2020-08-21 2020-08-21
US63/068,911 2020-08-21
US63/068,805 2020-08-21
US63/068,894 2020-08-21
US63/068,775 2020-08-21
US63/068,843 2020-08-21
PCT/US2021/026577 WO2021207599A1 (en) 2020-04-10 2021-04-09 Antigen specific immunotherapy for covid-19 fusion proteins and methods of use

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20220167317A true KR20220167317A (ko) 2022-12-20

Family

ID=75640036

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020227039307A KR20220167317A (ko) 2020-04-10 2021-04-09 Covid-19 융합 단백질에 대한 항원 특이적 면역요법 및 사용 방법

Country Status (17)

Country Link
US (3) US11213581B2 (ko)
EP (2) EP4248983A3 (ko)
JP (1) JP2023522597A (ko)
KR (1) KR20220167317A (ko)
CN (1) CN116096733A (ko)
AU (2) AU2021253926B2 (ko)
BR (1) BR112022020486A2 (ko)
CA (1) CA3146464C (ko)
DK (1) DK3972987T3 (ko)
FI (1) FI3972987T3 (ko)
HR (1) HRP20230990T1 (ko)
HU (1) HUE062716T2 (ko)
IL (1) IL297064A (ko)
LT (1) LT3972987T (ko)
SI (1) SI3972987T1 (ko)
WO (1) WO2021207599A1 (ko)
ZA (1) ZA202210992B (ko)

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112500498B (zh) * 2020-02-26 2022-09-06 四川大学 新型冠状病毒疫苗及其制备方法和应用
DK3972987T3 (da) * 2020-04-10 2023-07-31 Akston Biosciences Corp Antigenspecifik immunterapi til COVID-19-fusionsproteiner og fremgangsmåder til anvendelse deraf
CA3202603A1 (en) * 2020-12-16 2022-06-23 Vicente Guillermo Verez Bencomo Use of vaccine compositions based on sars-cov-2 receptor binding domain in delivering protective immunity
AU2021407771A1 (en) * 2020-12-23 2023-07-20 The University Of Melbourne Coronavirus vaccine
KR20220109996A (ko) * 2021-01-29 2022-08-05 (주)셀트리온 사스-코로나바이러스-2 융합 단백질 및 이를 포함하는 면역원성 조성물
CN114014940B (zh) * 2021-11-25 2022-11-15 华兰基因工程有限公司 一种2019-nCoV表面蛋白受体结合区融合蛋白制备方法
CN113980135B (zh) * 2021-12-27 2022-04-19 三优生物医药(上海)有限公司 一种结合冠状病毒双特异性抗体的抗药抗体及其制备方法和应用
WO2023154402A2 (en) * 2022-02-09 2023-08-17 University Of Maryland, College Park Compositions and methods for fcrn-targeted intranasal coronavirus vaccination
WO2023212579A1 (en) * 2022-04-25 2023-11-02 Boost Biopharma, Inc. Recombinant polypeptides containing at least one immunogenic fragment and uses thereof
KR20240009373A (ko) * 2022-07-12 2024-01-22 에스케이바이오사이언스(주) SARS-CoV-2 백신 부스터 조성물

Family Cites Families (45)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030040601A1 (en) 2001-06-08 2003-02-27 Ivan Diers Method for making insulin precursors and insulin analog precursors
EP1909823A2 (en) * 2005-07-29 2008-04-16 Amprotein Corporation Chimeric therapeutic agents
US8569231B2 (en) 2009-03-20 2013-10-29 Smartcells, Inc. Soluble non-depot insulin conjugates and uses thereof
EP2413969A4 (en) 2009-03-30 2012-09-05 Boehringer Ingelheim Int FUSION PROTEINS WITH DOG FC ELEMENTS
CN101891823B (zh) 2010-06-11 2012-10-03 北京东方百泰生物科技有限公司 一种Exendin-4及其类似物融合蛋白
EP2598170A4 (en) 2010-07-28 2016-07-06 Smartcells Inc MEDICAMENT-LIGAND CONJUGATES, THEIR SYNTHESIS AND CORRESPONDING INTERMEDIATES
AU2011282988A1 (en) 2010-07-28 2013-01-31 Smartcells, Inc. Recombinantly expressed insulin polypeptides and uses thereof
AR087433A1 (es) 2011-08-08 2014-03-26 Merck Sharp & Dohme Analogos de insulina n-glicosilados
WO2013074598A1 (en) 2011-11-18 2013-05-23 Merck Sharp & Dohme Corp. Fc CONTAINING POLYPEPTIDES HAVING INCREASED ANTI-INFLAMMATORY PROPERTIES AND INCREASED FcRN BINDING
KR102041412B1 (ko) 2011-12-30 2019-11-11 한미사이언스 주식회사 면역글로불린 Ｆｃ 단편 유도체
CN103509118B (zh) 2012-06-15 2016-03-23 郭怀祖 胰岛素-Fc融合蛋白
PT2963056T (pt) 2013-02-26 2020-02-19 Hanmi Pharm Ind Co Ltd Análogo de insulina e utilização do mesmo
CN105934441A (zh) 2013-11-26 2016-09-07 贝勒医学院 新型sars免疫原性组合物
CN107074928B (zh) 2014-09-18 2021-03-12 奥美药业有限公司 新型猫促红细胞生成素受体激动剂
US10822386B2 (en) 2014-12-24 2020-11-03 Case Western Reserve University Insulin analogues with enhanced stability and reduced mitogenicity
US20180215805A1 (en) 2015-01-29 2018-08-02 Nexvet Australia Pty Ltd Therapeutic and diagnostic agents
CN107810202A (zh) 2015-02-17 2018-03-16 韩美药品株式会社 长效胰岛素或胰岛素类似物复合物
RU2745801C2 (ru) 2015-05-04 2021-04-01 Аподжиникс Аг Одноцепочечные белки-агонисты рецептора cd40
AR105616A1 (es) 2015-05-07 2017-10-25 Lilly Co Eli Proteínas de fusión
JP6983075B2 (ja) 2015-06-02 2021-12-17 ノヴォ ノルディスク アー／エス 極性の組換え延長部を有するインスリン
CN114874313A (zh) 2015-11-16 2022-08-09 Ubi蛋白公司 用于延长蛋白质半衰期的方法
CN110267674A (zh) 2016-07-08 2019-09-20 奥美药业有限公司 包含瘦素的融合蛋白及其生产和使用方法
JP7158378B2 (ja) 2016-09-23 2022-10-21 ハンミ ファーマシューティカル カンパニー リミテッド インスリン受容体との結合力が減少された、インスリンアナログ及びその用途
CN110114369A (zh) 2016-10-17 2019-08-09 威隆股份公司 修饰的抗体恒定区
JP7170332B2 (ja) 2016-12-09 2022-11-14 アクストン バイオサイエンシズ コーポレーション インスリンとｆｃの融合物および使用方法
WO2018165290A1 (en) 2017-03-07 2018-09-13 Case Western Reserve University Single-chain insulin analogues stabilized by a fourth disulfide bridge
CA3071337A1 (en) 2017-08-15 2019-02-21 Kindred Biosciences, Inc. Igg fc variants for veterinary use
KR20210005630A (ko) 2018-04-16 2021-01-14 유니버시티 오브 유타 리서치 파운데이션 글루코스-반응성 인슐린
US11696948B2 (en) * 2018-06-12 2023-07-11 Kbio Holdings Limited Vaccines formed by virus and antigen conjugation
US11267862B2 (en) 2018-06-29 2022-03-08 Akston Biosciences Corporation Ultra-long acting insulin-Fc fusion proteins and methods of use
AU2019291945A1 (en) 2018-06-29 2021-01-14 Akston Biosciences Corporation Ultra-long acting insulin-Fc fusion proteins and methods of use
BR112021005634A2 (pt) 2018-09-25 2021-06-29 Absci, Llc métodos de purificação de proteína
AR116605A1 (es) 2018-10-05 2021-05-26 Novo Nordisk As Compuestos bifuncionales que comprenden péptidos de insulina y péptidos de egf(a)
CN113330025A (zh) 2018-11-19 2021-08-31 卡斯西部储备大学 具有聚丙氨酸c结构域子区段的单链胰岛素类似物
US20220235111A1 (en) 2019-05-17 2022-07-28 Case Western Reserve University Variant Single-Chain Insulin Analogues
WO2021011827A1 (en) 2019-07-16 2021-01-21 Akston Biosciences Corporation Ultra-long acting insulin-fc fusion proteins and methods of use
TW202120536A (zh) 2019-07-31 2021-06-01 美商美國禮來大藥廠 鬆弛素(relaxin)類似物及其使用方法
CN114846025A (zh) 2019-12-19 2022-08-02 阿卡斯通生物科学公司 超长效胰岛素-Fc融合蛋白及其使用方法
US11186623B2 (en) 2019-12-24 2021-11-30 Akston Bioscience Corporation Ultra-long acting insulin-Fc fusion proteins and methods of use
CN111333704B (zh) 2020-02-24 2021-01-12 军事科学院军事医学研究院微生物流行病研究所 新型冠状病毒covid-19疫苗、制备方法及其应用
DK3972987T3 (da) * 2020-04-10 2023-07-31 Akston Biosciences Corp Antigenspecifik immunterapi til COVID-19-fusionsproteiner og fremgangsmåder til anvendelse deraf
US11192930B2 (en) 2020-04-10 2021-12-07 Askton Bioscences Corporation Ultra-long acting insulin-Fc fusion protein and methods of use
US11198719B2 (en) 2020-04-29 2021-12-14 Akston Biosciences Corporation Ultra-long acting insulin-Fc fusion protein and methods of use
CN111647077B (zh) * 2020-06-02 2021-02-09 深圳市因诺赛生物科技有限公司 新型冠状病毒(sars-cov-2)刺突蛋白结合分子及其应用
CN112480268B (zh) 2020-12-10 2021-08-03 北京康乐卫士生物技术股份有限公司 一种新型冠状病毒的重组亚单位疫苗及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
AU2022231665A1 (en) 2022-10-06
CA3146464A1 (en) 2021-10-14
HRP20230990T1 (hr) 2023-12-08
JP2023522597A (ja) 2023-05-31
CN116096733A (zh) 2023-05-09
US20210346490A1 (en) 2021-11-11
AU2022231665B2 (en) 2024-02-22
SI3972987T1 (sl) 2023-10-30
US20220088182A1 (en) 2022-03-24
AU2021253926B2 (en) 2022-07-21
IL297064A (en) 2022-12-01
EP3972987B1 (en) 2023-06-07
ZA202210992B (en) 2023-08-30
EP4248983A2 (en) 2023-09-27
LT3972987T (lt) 2023-09-25
BR112022020486A2 (pt) 2023-01-17
AU2021253926A1 (en) 2022-02-24
US20240016921A1 (en) 2024-01-18
CA3146464C (en) 2024-03-12
WO2021207599A9 (en) 2022-01-06
FI3972987T3 (fi) 2023-07-25
EP3972987A1 (en) 2022-03-30
US11213581B2 (en) 2022-01-04
US11707517B2 (en) 2023-07-25
DK3972987T3 (da) 2023-07-31
WO2021207599A1 (en) 2021-10-14
EP4248983A3 (en) 2024-01-24
HUE062716T2 (hu) 2023-11-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR20220167317A (ko) Covid-19 융합 단백질에 대한 항원 특이적 면역요법 및 사용 방법
JP2023515800A (ja) コロナウイルス感染症２０１９（ｃｏｖｉｄ－１９）の検出、予防及び治療のためのデザイナーペプチド及びタンパク質
KR20230005962A (ko) 베타코로나바이러스 예방 및 치료요법
JP2016525889A (ja) インフルエンザウイルスワクチンおよびその使用
KR20210018206A (ko) 항원성 호흡기 세포융합 바이러스 폴리펩타이드
DK3110434T3 (en) UTI FUSION PROTEINS
EP2910634A1 (en) Vaccine for preventing porcine edema disease
US20230399364A1 (en) Immunogenic Coronavirus Fusion Proteins and Related Methods
WO2021223647A1 (en) Compositions and methods for making and using vaccines against covid-19
WO2014210358A1 (en) Methods and compositions for dengue virus vaccines
WO2021231729A1 (en) Adjuvanted stabilized stem hemagglutinin nanoparticles and methods of using the same to induce broadly neutralizing antibodies against influenza
JP2022525431A (ja) 抗原性多量体呼吸器合胞体ウイルスポリペプチド
WO2023018817A1 (en) Truncated influenza neuraminidase and methods of using the same
CN115960180A (zh) 2019-nCoV S蛋白的突变体及其基因工程化的mRNA和疫苗组合物
KR20190039065A (ko) 조작된 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩티드의 변형
EP4282880A1 (en) Fully human broad-spectrum neutralizing antibody 76e1 against coronavirus, and use thereof
TW202320845A (zh) 用於預防及治療２０１９冠狀病毒病（ＣＯＶＩＤ—１９）之ＳＡＲＳ—ＣｏＶ—２多重表位肽／蛋白質疫苗
CN117777308A (zh) 基于干扰素协同免疫检查点阻断抗体治疗慢性乙型肝炎
WO2022161598A1 (en) Antibodies broadly targeting coronaviruses and uses thereof
CN116964104A (zh) 免疫原性冠状病毒融合蛋白及相关方法