JP2023515800A - コロナウイルス感染症２０１９（ｃｏｖｉｄ－１９）の検出、予防及び治療のためのデザイナーペプチド及びタンパク質 - Google Patents

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Abstract

本開示は、ＣＯＶＩＤ－１９の効果的な検出、予防及び治療のための緩和システムに関するものであり、当該緩和システムは、（１）ウイルス感染の検出及び疫学的監視のための血清学的診断アッセイ、（２）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２による感染の予防のための高精度な部位特異的ペプチド免疫原構築物、（３）感染患者における疾患の治療のための受容体に基づく抗ウイルス療法、ならびに（４）Ｓ１－ＲＢＤ－ｓＦｃを含有するデザイナータンパク質ワクチンを含む。本開示の緩和システムは、ＣＯＶＩＤ－１９の検出、予防及び治療のための診断法、ワクチン及び抗ウイルス療法としてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質からのアミノ酸配列、及びヒト受容体を最適なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原性ペプチド、ペプチド免疫原構築物、ＣＨＯ由来タンパク質免疫原構築物、長時間作用性ＣＨＯ由来ＡＣＥ２タンパク質及びその製剤の設計及び製造のために利用する。【選択図】図１

Description

本願は、2020年2月19日出願の米国仮出願第62/978,596号、2020年3月16日出願の米国仮出願第62/990,382号、2020年5月19日出願の米国仮出願第63/027,290号、2020年11月25日出願の米国仮出願第63/118,596号に基づく利益を主張するＰＣＴ国際出願であり、これをもって参照によりそれら全ての全体を本明細書に援用する。
本開示は、ウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２によって引き起こされるコロナウイルス感染症２０１９（ＣＯＶＩＤ－１９）の検出、予防及び治療のためのＣＯＶＩＤ－１９緩和システムに関する。本開示の緩和システムは、ＣＯＶＩＤ－１９の検出、予防及び治療のための診断法、ワクチン及び抗ウイルス療法としてウイルスの及び宿主受容体のアミノ酸配列を最適なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原性ペプチド、ペプチド免疫原構築物、ＣＨＯ由来タンパク質免疫原構築物、長時間作用性ＣＨＯ由来ＡＣＥ２タンパク質の製造及びその製剤化のために利用する。
2019年12月に人畜共通感染性コロナウイルスが、この数十年において３度目に、種をまたいでヒト集団に感染した。ウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２によって引き起こされる疾患は、2019年の終わり頃に病気が初めて検出されたことから、世界保健機構（ＷＨＯ）によって公式に、コロナウイルス感染症２０１９を意味する「ＣＯＶＩＤ－１９」と名付けられた。ウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、中国の武漢で最初同定され、他の生きた動物も販売している海産物卸売市場に曝露された人々を襲った。ウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２はヒトからヒトへと伝染し、他の２つの病原性ヒト呼吸器コロナウイルス（すなわち、重症急性呼吸器症候群関連コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）及び中東呼吸器症候群コロナウイルス（ＭＥＲＳ－ＣｏＶ））によって引き起こされた大流行に類似する重篤な呼吸器疾患を引き起こす。
コロナウイルス（Nidovirales目Coronaviridae科）は、典型的な冠状の外観を有する大型のエンベローププラス鎖ＲＮＡウイルスである（ウェブサイト：en.wikipedia.org/wiki/Coronavirus）。それらのウイルスゲノム（２６～３２ｋｂ）は、全てのＲＮＡウイルスのうちで最も大きいもののなかに数えられる。コロナウイルスは、当初はスパイク（Ｓ）、エンベロープ（Ｅ）、膜（Ｍ）及びヌクレオカプシド（Ｎ）タンパク質の抗原関係性に基づいて、４つの亜群（アルファコロナウイルス（Alphacoronavirus）、ベータコロナウイルス（Betacoronavirus）、ガンマコロナウイルス（Gammacoronavirus）及びデルタコロナウイルス（Deltacoronavirus））に分類される。ベータコロナウイルス亜群には、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３、ＨＣｏＶ－ＨＫＵ１、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２が含まれる。遺伝子組換えが同じ及び異なる亜群のメンバーの間で容易に起こり、遺伝子多様性の増大の機会をもたらす。
Zhu, N., et al., 2020は、臨床検体（気管支肺胞洗浄液）及びヒト気道上皮細胞ウイルス単離物からＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の同定及び特性評価、ならびにウイルスゲノムの配列決定を行った。配列は、以前に公開されたＳＡＲＳ様ＣｏＶゲノム（ｂａｔ－ＳＬ－ＣｏＶＺＣ４５、ＭＧ７７２９３３．１）との８６．９％のヌクレオチド同一性を有することが見出された。さらなる論文（Chen, Y., et al., 2020、及びPerlman, S., 2020）では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を含めた、新しいコロナウイルスのゲノム構造、複製及び発病機序についてさらに特性評価を行っている。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構造の模式図を図１に示す。ウイルス表面タンパク質（Ｓ、Ｅ、Ｍ及びＮタンパク質）は、宿主細胞によって産生された脂質二重層エンベロープの中に埋め込まれており、一本鎖プラスセンスウイルスＲＮＡはヌクレオカプシドタンパク質と結び付いている。他のベータコロナウイルスとは違ってＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２はヘマグルチニンエステラーゼ糖タンパク質を有していない。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ及びＭＥＲＳ－ＣｏＶを成長させるために使用されるのと同じ細胞において増殖し得る。しかしながら、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は初代ヒト気道上皮細胞においてより良好に成長し、これに対してＳＡＲＳ－ＣｏＶ及びＭＥＲＳ－ＣｏＶは上気道の細胞よりも肺内上皮細胞の方に多く感染する。加えて、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ及びＭＥＲＳ－ＣｏＶの伝染は主に、病気の既知の兆候及び症候を示している患者から起こるが、これに対してＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、無症候患者、または軽度のもしくは非特異的な兆候を有する患者から伝染し得る。これらの違いが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ及びＭＥＲＳ－ＣｏＶに比べてより速くより広範なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の伝染の一因となっている可能性が高い。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は細胞侵入のために細胞受容体ｈＡＣＥ２（ヒトアンジオテンシン変換酵素２）を使用すると報告されたが、これは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶが使用するのと同じ受容体であり、ＭＥＲＳ－ＣｏＶが使用するＣＤ２６受容体とは異なる（Zhou, P., et al, 2020、及びLei, C., 2020）。このため、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の伝染は下気道疾患の兆候が進展した後にのみ予期されると示唆された。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶは、２００２～２００４年の流行によって、その細胞受容体により良好に結合するように及びヒト細胞における複製を最適化するように変異したが、これによってその毒性は増強された。コロナウイルスは、変異を起こしやすいＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを有しており、変異及び組換え事象が頻繁に起こるため、適応が速やかに起こる。対照的に、ＭＥＲＳは、２０１２年におけるその検出以来、ヒト感染性を著しく増強する変異は見出されていない。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶにより類似した挙動をすることになり、ｈＡＣＥ２に対する結合の強化によってヒト宿主にさらに適応することになる可能性が高い。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ及びＭＥＲＳ－ＣｏＶの流行後、コロナウイルスプロテアーゼ、ポリメラーゼ、ＭＴアーゼ及び侵入タンパク質を標的とする新しい抗ウイルス剤の開発に多大な努力が向けられた。しかしながら、それらはどれも臨床試験において有効性が示されていない（Chan, JFW, et al., 2013、Cheng, KW, et al., 2015、Wang, Y., et al., 2015）。救急事態を脱した回復期患者から得られた血漿及び抗体は重度の臨床症候を有する患者を治療するために使用されている（Mair-Jenkins, J., et al., 2015）。加えて、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ及びＭＥＲＳ－ＣｏＶを標的とする様々なワクチン戦略、例えば、不活化ウイルス、生弱化ウイルス、ウイルスベクター系ワクチン、サブユニットワクチン、組換えタンパク質及びＤＮＡワクチンが開発されたが、現在のところ、動物において評価されているにすぎない（Graham, RL, et al., 2013、de Wit, E., et al., 2016）。
ＣＯＶＩＤ－１９の悲劇的な大流行に直面して有効な療法またはワクチンはないので、ウイルスの伝染を減らすための、及び莫大な経済的損失を招く不要な社会的パニックを回避するための現行の最善の手段は、（１）ＲＴ－ＰＣＲアッセイによる早期検出、（２）医療環境における普遍的予防措置の厳格な遵守を伴う、確認陽性個体と接触した者の症例報告及び隔離、（３）対症療法、ならびに（４）流行情報の時宜を得た公開によって感染源を管理することである。も、良好な個人衛生、密着マスクの使用、及び混雑した場所の回避によってＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の伝染を減らすのに役立ち得る。
大流行を制御し、それが招く死を含む災害を減らすためには、（ａ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の有効かつ速やかな検出及び監視のための血清学的アッセイ、（ｂ）非感染個人をＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２との接触から守るためのワクチン、ならびに（ｃ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染した個人を効果的に治療するための抗ウイルス療法を開発することが、差し迫って必要とされている。
参考文献:
この願書の中で引用される以下の文書、及びその中で引用されているさらなる参考文献は、これをもって参照によりその全体が、あたかも本明細書中に十分に開示されているかのように援用される。
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本開示は、ＣＯＶＩＤ－１９の効果的な検出、予防及び治療のための緩和システムに関するものであり、当該緩和システムは、（１）ウイルス感染の検出及び疫学的監視のための血清学的診断アッセイ、（２）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２による感染の予防のための高精度な部位特異的ペプチド免疫原構築物、（３）感染患者における疾患の治療のための受容体に基づく抗ウイルス療法、ならびに（４）Ｓ１－ＲＢＤ－ｓＦｃを含有するデザイナータンパク質ワクチンを含む。本開示の緩和システムは、ＣＯＶＩＤ－１９の検出、予防及び治療のための診断法、ワクチン及び抗ウイルス療法としてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質からのアミノ酸配列、及びヒト受容体を最適なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原性ペプチド、ペプチド免疫原構築物、ＣＨＯ由来タンパク質免疫原構築物、長時間作用性ＣＨＯ由来ＡＣＥ２タンパク質及びその製剤の設計及び製造のために利用する。
より具体的には、本発明は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの及び受容体のアミノ酸配列を含むバイオインフォマティクスを、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原性ペプチド、ペプチド免疫原構築物及び長時間作用性ＡＣＥ２受容体タンパク質ならびにその製剤の設計及び製造のために利用して、（１）Ｍタンパク質（例えば配列番号４及び５）、Ｎタンパク質（例えば配列番号１７及び１８、２５９、２６１、２６３、２６５、２６６及び２７０）及びＳタンパク質（例えば配列番号２３、２４、２６～３４、３７、３８、２８１、３０８、３２１、３２２、３２３、３２４）に由来する改変型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原性ペプチドを感染個体及び／またはワクチン接種個体におけるウイルス感染の検出及び血清中和抗体の疫学的監視またはモニタリングのために採用する血清学的診断アッセイ、（２）高精度なＳ－ＲＢＤ（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質からの受容体結合ドメイン、別称Ｓ１－ＲＢＤ）由来Ｂエピトープ免疫原構築物（配列番号１０７～１４４、２０、２２６、２２７、２３９、２４０、２４１、２４６、２４７）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＣＴＬエピトープペプチド（配列番号１４５～１６０）、病原体タンパク質からのＴヘルパー細胞（Ｔｈ）エピトープ（例えば配列番号４９～１００）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に由来するＴｈエピトープペプチド（例えば配列番号１６１～１６５）、（３）ＣＯＶＩＤ－１９の治療のための抗ウイルス療法としてのＣＨＯ発現Ｓ１－ＲＢＤ－一本鎖Ｆｃ（ｓ－Ｆｃ）融合タンパク質（配列番号２３５及び２３６）及びＣＨＯ発現ＡＣＥ２－ＥＣＤ－一本鎖Ｆｃ融合タンパク質（ＡＣＥ２の細胞外ドメイン）（配列番号２３７及び２３８）タンパク質、ならびに（４）Ｓ１－ＲＢＤ－ｓＦｃを含有するデザイナータンパク質ワクチン（例えば配列番号２３５及び２３６）を開発するための、体系的手法に関する。
図１は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の構造を示す模式図である。ウイルス表面タンパク質（スパイク、エンベロープ及び膜）は、宿主細胞に由来する脂質二重層エンベロープの中に埋め込まれている。他のｂｅｔａｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓｅｓとは違ってＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２はヘマグルチニンエステラーゼ糖タンパク質を有していない。一本鎖プラスセンスウイルスＲＮＡはヌクレオカプシドタンパク質と結び付いている。 図２は、ＡＣＥ２とＳＡＲＳ－ＣｏＶとが結合した複合体の調整３Ｄ構造（画像はタンパク質データバンク（ＰＤＢ）登録事項：２ＡＪＦによって取得した）に基づく、束縛されたループＡ、Ｂ及びＣをそれぞれ含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ－ＲＢＤ（すなわち、スパイクタンパク質からの受容体結合ドメイン）由来Ｂ細胞エピトープペプチド免疫原構築物の代表的なデザインである。 図３は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ及びＭＥＲＳ－ＣｏＶからのＭタンパク質配列のアライメントである。星印（＊）は、その位置において同一であるアミノ酸を表し、コロン（：）は保存的置換を表し、ピリオド（．）は半保存的置換を表し、下線（＿）は抗原性ペプチドを表す。 図４は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ及びＭＥＲＳ－ＣｏＶからのＮタンパク質配列のアライメントである。星印（＊）は、その位置において同一であるアミノ酸を表し、コロン（：）は保存的置換を表し、ピリオド（．）は半保存的置換を表し、下線（＿）は抗原性ペプチドを表し、破線（－－）はＣＴＬエピトープを表し、点線（．．．）はＴｈエピトープを表す。 図５Ａ～図５Ｃは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ及びＭＥＲＳ－ＣｏＶからのＳタンパク質配列のアライメントである。星印（＊）は、その位置において同一であるアミノ酸を表し、コロン（：）は保存的置換を表し、ピリオド（．）は半保存的置換を表し、下線（＿）は抗原性ペプチドを表し、破線（－－）はＣＴＬエピトープを表し、点線（．．．）はＴｈエピトープを表し、四角（□）はＢ細胞エピトープを表す。 図５Ａ～図５Ｃは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ及びＭＥＲＳ－ＣｏＶからのＳタンパク質配列のアライメントである。星印（＊）は、その位置において同一であるアミノ酸を表し、コロン（：）は保存的置換を表し、ピリオド（．）は半保存的置換を表し、下線（＿）は抗原性ペプチドを表し、破線（－－）はＣＴＬエピトープを表し、点線（．．．）はＴｈエピトープを表し、四角（□）はＢ細胞エピトープを表す。 図５Ａ～図５Ｃは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ及びＭＥＲＳ－ＣｏＶからのＳタンパク質配列のアライメントである。星印（＊）は、その位置において同一であるアミノ酸を表し、コロン（：）は保存的置換を表し、ピリオド（．）は半保存的置換を表し、下線（＿）は抗原性ペプチドを表し、破線（－－）はＣＴＬエピトープを表し、点線（．．．）はＴｈエピトープを表し、四角（□）はＢ細胞エピトープを表す。 図６Ａ～図６Ｄは、本開示の様々な実施形態による一本鎖融合タンパク質のデザインを示す。図６Ａは、ヒトＩｇＧのヒンジ領域及びＦｃ断片（ＣＨ２及びＣＨ３ドメイン）に共有結合で連結されたＳ－ＲＢＤをＮ末端に含む融合タンパク質の構造を示す。図６Ｂは、リンカーを介してヒトＩｇＧのヒンジ領域及びＦｃ断片（ＣＨ２及びＣＨ３ドメイン）に共有結合で連結されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２からのＳ－ＲＢＤをＮ末端に含む融合タンパク質を示す。図６Ｃは、ヒトＩｇＧのヒンジ領域及びＦｃ断片（ＣＨ２及びＣＨ３ドメイン）に共有結合で連結されたＡＣＥ２－ＥＣＤ（すなわちＡＣＥ２の細胞外ドメイン）をＮ末端に含む融合タンパク質を示す。図６Ｄは、リンカーを介してヒトＩｇＧのヒンジ領域及びＦｃ断片（ＣＨ２及びＣＨ３ドメイン）に共有結合で連結されたＡＣＥ２－ＥＣＤをＮ末端に含む融合タンパク質を示す。 図７は、ＤｐＺＤ／Ｓ－ＲＢＤ－ｓＦｃプラスミドのマップを示す。ｐＺＤ／Ｓ－ＲＢＤ－ｓＦｃプラスミドは、本発明の実施形態によるＳ－ＲＢＤ－ｓＦｃ融合タンパク質をコードする。 図８は、ｐＺＤ／ｈＡＣＥ２－ｓＦｃプラスミドのマップを示す。ｐＺＤ／ｈＡＣＥ２－ｓＦｃプラスミドは、本発明の実施形態によるＡＣＥ２－ｓＦｃ融合タンパク質をコードする。 図９は、非還元及び還元条件下でクーマシーブルー染色を用いたＳＤＳ－ＰＡＧＥによる代表的な精製デザイナーＳ１－ＲＢＤ－ｓＦＣタンパク質の生化学特性評価を示す。 図１０は、非還元及び還元条件下でクーマシーブルー染色を用いたＳＤＳ－ＰＡＧＥによる代表的な精製デザイナーＳ１－ＲＢＤ－Ｈｉｓタンパク質の生化学特性評価を示す。 図１１は、非還元及び還元条件下でクーマシーブルー染色を用いたＳＤＳ－ＰＡＧＥによる代表的な精製デザイナーＡＣＥ２－ＥＣＤ－ｓＦＣタンパク質の生化学特性評価を示す。 図１２は、ＬＣ質量分析による代表的な精製デザイナーＳ１－ＲＢＤ－Ｈｉｓタンパク質の生化学特性評価を示す。 図１３は、配列番号２３５の配列を有する代表的な精製デザイナーＳ１－ＲＢＤ－ｓＦｃタンパク質のＮ－及びＯ－グリコシル化パターンを示す。 図１４は、ＬＣ質量分析による代表的な精製デザイナーＳ１－ＲＢＤ－ｓＦｃタンパク質の生化学特性評価を示す。 図１５は、配列番号２３７の配列を有する代表的な精製デザイナーＡＣＥ２－ＥＣＤ－ｓＦｃタンパク質のＮ－及びＯ－グリコシル化パターンを示す。 図１６は、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析による代表的な精製デザイナーＡＣＥ２－ＥＣＤ－ｓＦｃタンパク質の生化学特性評価を示す。 図１７は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｎ（ヌクレオカプシド）タンパク質からの抗原性ペプチドのデザイン及び同定を示す。完全長Ｎタンパク質の模式図を上側に示し、本明細書に開示されるデザイナーペプチド抗原を下側に示す。 図１８は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ（スパイク）タンパク質からの抗原性ペプチドのデザイン及び同定を示す。完全長Ｓタンパク質の模式図を上側に示し、本明細書に開示されるデザイナーペプチド抗原を下側に示す。 図１９は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｍ（膜）タンパク質からの抗原性ペプチドのデザイン及び同定を示す。完全長Ｍタンパク質の模式図を上側に示し、本明細書に開示されるデザイナーペプチド抗原を下側に示す。 図２０は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｅ（エンベロープ）タンパク質からの抗原性ペプチドのデザイン及び同定を示す。完全長Ｅタンパク質の模式図を上側に示し、本明細書に開示されるデザイナーペプチド抗原を下側に示す。 図２１は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＯＲＦ９ｂタンパク質からの抗原性ペプチドのデザイン及び同定を示す。完全長ＯＲＦ９ｂタンパク質の模式図を上側に示し、本明細書に開示されるデザイナーペプチド抗原を下側に示す。 図２２は、代表的なＣＯＶＩＤ－１９患者から得られた血清抗体による、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｎ（ヌクレオカプシド）タンパク質に由来する様々な領域からの特定された抗原性ペプチドとの反応性を示す。 図２３は、代表的なＣＯＶＩＤ－１９患者からの血清抗体による、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ（スパイク）タンパク質からの抗原性領域のマッピングを示す。 図２４は、代表的なＣＯＶＩＤ－１９患者からの血清抗体による、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｅ（エンベロープ）タンパク質からの抗原性領域を示す。 図２５は、代表的なＣＯＶＩＤ－１９患者からの血清抗体による、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｅ（エンベロープ）タンパク質からの抗原性領域を示す。 図２６は、代表的なＣＯＶＩＤ－１９患者からの血清抗体による、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｍ（膜）タンパク質からの抗原性領域を示す。 図２７は、代表的なＣＯＶＩＤ－１９患者からの血清抗体による、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＯＲＦ９ｂタンパク質からの抗原性領域を示す。 図２８は、代表的なＰＣＲ陽性ＣＯＶＩＤ－１９患者からの血清を使用したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＥＬＩＳＡの分析感度を示す。 図２９は、Ｎタンパク質（配列番号１８、２６１及び２６６）、Ｍタンパク質（配列番号５）及びＳタンパク質（配列番号３８、２８１及び３２２）に由来する個々の抗原性ペプチドで被覆されたプレートを使用したＥＬＩＳＡによって検出された、ＣＯＶＩＤ－１９患者血清の血清反応性パターンを示す。 図３０は、Ｎタンパク質（配列番号１８、２６１及び２６６）、Ｍタンパク質（配列番号５）及びＳタンパク質（配列番号３８、２８１及び３２２）に由来する個々の抗原性ペプチドで被覆されたプレートを使用した検証的ＥＬＩＳＡによる、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＥＬＩＳＡ陽性無症候個体の血清反応性パターンを示す。 図３１は、プレート実施による非反応性対象（ＮＲＣ）平均値の分布を示す。 図３２は、入院後１０日未満、入院１０日目よりも後、退院日、及び退院後１４日目において得た試料からの、ＣＯＶＩＤ－１９患者についてのＯＤ４５０ｎｍ読み値の分布を示す。 図３３は、様々な時間点で得たＣＯＶＩＤ－１９患者からの試料の、及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染に無関係な個体から採取した試料からの、Ｓ／Ｃ比率の分布を示す。 図３４は、ＥＬＩＳＡによるＡＣＥ２－ＥＣＤ－ｓＦｃに対するＨＲＰコンジュゲートＳ１－ＲＢＤタンパク質の結合性を示す。 図３５は、Ｓ１－ＲＢＤ免疫化によって生み出された免疫血清を使用したＥＬＩＳＡによるＡＣＥ２－ＥＣＤ－ｓＦｃに対するＳ１－ＲＢＤ結合の阻害を示す。 図３６は、Ｓ１タンパク質被覆プレートを使用したＥＬＩＳＡによる、様々な形態のデザイナータンパク質に関連する免疫原性の評価を示す。 図３７Ａ～図３７Ｂは、ＥＬＩＳＡによるＳ１－ＲＢＤ融合タンパク質の免疫原性及び中和評価を示す。図３７Ａは、Ｓ１タンパク質被覆プレートを使用したＥＬＩＳＡによる免疫血清（３及び５ＷＰＩ）の滴定による免疫原性評価を提供する。 図３７Ｂは、５ＷＰＩのモルモット免疫血清によるＥＬＩＳＡにおけるＡＣＥ２に対するＳ１タンパク質結合での中和阻害希釈ＩＤ５０（幾何平均力価、ＧＭＴ）を提供する。 図３８は、Ｓ１タンパク質被覆プレートを使用したＥＬＩＳＡによる免疫血清（３及び５ＷＰＩ）の滴定による免疫原性評価を示す。 図３９は、方法Ａと方法Ｂとの２つの別個の方法を用いたＳ１－ＲＢＤとＡＣＥ２との結合の阻害アッセイによる中和抗体力価の評価を示す。 図３９は、方法Ａと方法Ｂとの２つの別個の方法を用いたＳ１－ＲＢＤとＡＣＥ２との結合の阻害アッセイによる中和抗体力価の評価を示す。 図４０は、異なる血清希釈度で方法Ａを用いたときの、様々な形態のデザイナーＳ１－ＲＢＤタンパク質免疫原によって生み出された免疫血清（５ＷＰＩ）によるＳ１－ＲＢＤとＡＣＥ２との結合の阻害の評価を示す。 図４１は、デザイナーＳ１－ＲＢＤタンパク質免疫原の形態を様々に変えて方法（Ｂ）を用いて生み出された免疫血清による、異なる血清希釈度でのＳ１－ＲＢＤとＡＣＥ２との結合の阻害の評価を示す。 図４２は、細胞ベース遮断アッセイによる、様々な形態のデザイナーＳ１－ＲＢＤタンパク質免疫原によって生み出された免疫血清によるＳ１－ＲＢＤとＡＣＥ２との結合の阻害の評価を示す。 図４３は、異なる血清希釈度での細胞ベース遮断アッセイによる、様々な形態のデザイナーＳ１－ＲＢＤタンパク質免疫原によって生み出された免疫血清によるＳ１－ＲＢＤとＡＣＥ２との結合の阻害の評価を示す。 図４４は、異なる血清での細胞ベース遮断アッセイによる、様々な形態のデザイナーＳ１－ＲＢＤタンパク質免疫原によって生み出された免疫血清（０、３及び５ＷＰＩ）によるＳ１－ＲＢＤとＡＣＥ２との結合の阻害の評価を示す。 図４５は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する代表的なデザイナーワクチンのための第Ｉ相臨床試験デザインを示す。 図４６は、健常成人ボランティアからのワクチンの選抜基準を示す。 図４７は、健常成人ボランティアにおいてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対するデザイナーワクチンの安全性、忍容性及び免疫原性を評価する第Ｉ相非盲検試験のための臨床デザインを示す。 図４８は、健常成人ボランティアにおいてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対するデザイナーワクチンの安全性、忍容性及び免疫原性を評価する第Ｉ相非盲検試験に関連する臨床活動を示す。 図４９は、４つのコホートを用いて２段階で健常成人ボランティアにおいてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対するデザイナーワクチンの安全性、忍容性及び免疫原性を評価する第Ｉ相非盲検試験のための臨床デザインを示す。 図５０は、ＡＣＥ２－ｓＦｃがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ１タンパク質に高い結合親和性で結合することを示す。 図５１は、ＡＣＥ２－ｓＦｃが、ＥＬＩＳＡプレート上に塗布されたＡＣＥ２に対するＳ１タンパク質の結合を遮断できることを示す。 図５２Ａ～図５２Ｃは、Ｓ１－ＲＢＤ－ｓＦｃのアミノ酸配列、構造及び機能を示す。図５２Ａは、Ｓ１－ＲＢＤ－ｓＦｃの配列を示し、Ｎ結合グリコシル化部位（＊）、Ｏ結合グリコシル化部位（＋） ＡｓｎからＨｉｓへの変異（下線部の残基）、及びジスルフィド結合（連結線）を特定している。図５２Ｂは、Ｓ１－ＲＢＤ－ｓＦｃ融合タンパク質中のジスルフィド結合を概略で示す。 図５２Ｃは、光学濃度によってｈＡＣＥ２に対するＳ１－ＲＢＤ－ｓＦｃの結合能力を示すグラフである。 図５３は、モルモット血清及び回復期患者血清によるＳ１－ＲＢＤ：ＡＣＥ２結合阻害の比較を示す。正常健常者からのヒト血清試料（ＮＨＰ、ｎ＝１０）及びウイルス学的に診断されたＣＯＶＩＤ－１９患者（ｎ＝１０）についてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２阻害率を、１：２０の希釈度で試験して評価した。３ＷＰＩ及び５ＷＰＩにおいて採取したＳ１－ＲＢＤ－ｓＦｃワクチン接種ＧＰからのプールされた免疫血清を、それぞれ１：１０００及び１：８０００の希釈度で試験した。 図５４は、免疫血清による生ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の強力な中和を示す。０及び３ＷＰＩにおいてＳ１－ＲＢＤ－ｓＦｃ、Ｓ１－ＲＢＤａ－ｓＦｃ及びＳ１－ＲＢＤ－ＦｃをＭＯＮＴＡＮＩＤＥ（商標）ＩＳＡ ５０Ｖ２と共にワクチン接種されたモルモットから５ＷＰＩにおいて採取された免疫血清を分析した。ウイルス血清混合物に感染したＶｅｒｏ－Ｅ６細胞の単層を免疫蛍光法（ＩＦＡ）によって評価した。細胞をヒト抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｎタンパク質抗体で染色し、抗ヒトＩｇＧ－４８８（明るい色合い）で検出した。核はＤＡＰＩ（４’，６－ジアミノ－２－フェニルインドール）（暗い色合い）で対比染色した。 図５５は、盲検化された血清試料に対する中和試験を示す。ネオングリーンタンパク質を発現する組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ｉｃ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ｍＮＧ）によって、ウイルス複製の読み値として蛍光信号を用いて中和を評価した。アッセイの検出限界は１：２０であり、陰性試料に１：１０の力価を割り当てた。陽性対照として、回復期ＣＯＶＩＤ－１９ヒト患者からの血漿を含めた。このアッセイでは、Ａｃａｄｅｍｉａ Ｓｉｎｉｃａにおいて得られた中和力価との強い相関関係（Ｒ＝０．９４）があった。 図５６は、本明細書に開示されるマルチトープタンパク質／ペプチドワクチンの成分を示す模式図である。ワクチン組成物は、Ｂ細胞エピトープのためのＳ１－ＲＢＤ－ｓＦｃ融合タンパク質、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ、Ｍ及びＮタンパク質に由来するクラスＩ及びＩＩ ＭＨＣ分子のための５つの合成Ｔｈ／ＣＴＬペプチド、ならびにＵＢＩＴｈ（登録商標）１ａペプチドを含有する。これらの成分は、（設計されて）正に帯電したペプチドに双極子相互作用によって結合するとともにアジュバントとしての役割も果たすＣｐＧ１と混合され、今度はこれがＡＤＪＵ－ＰＨＯＳ（登録商標）アジュバントに結合してマルチトープワクチン薬物製品を構成する。 図５７Ａ～図５７Ｃは、ラットにおける体液性免疫原性試験を示す。図５７Ａは、ＩＳＡ５１／ＣｐＧ３（左パネル）またはＡＤＪＵ－ＰＨＯＳ（登録商標）／ＣｐＧ１（右パネル）をアジュバントとして含むワクチン組成物の免疫原性を示す。Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラットを０週目及び２週目に（Ｓ１－ＲＢＤ－ｓＦｃを１０～３００μｇ／用量の用量範囲で合成デザイナーペプチド及びアジュバントと共に製剤化した）ワクチン組成物で免疫化した。０、２、３及び４ＷＰＩにおいて免疫血清をＳ１－ＲＢＤタンパク質に対する直接結合についてＥＬＩＳＡで検査した。 図５７Ｂ（左パネル）は、ＩＳＡ５１／ＣｐＧ３またはＡＤＪＵ－ＰＨＯＳ（登録商標）／ＣｐＧ１をアジュバントとして含むワクチン組成物で免疫化したラットからの４ＷＰＩで得た試料からの抗体によるｈＡＣＥ結合阻害を示す。図５７Ｂ（右パネル）は、ＩＳＡ５１／ＣｐＧ３またはＡＤＪＵ－ＰＨＯＳ（登録商標）ＣｐＧ１をアジュバントとして含むワクチン組成物についてＶＮＴ５０として表される、ラット免疫血清による生ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の強力な中和を示す。 図５７Ｃは、回復期ＣＯＶＩＤ－１９患者と比較したときの、様々な用量のワクチン組成物で免疫化したラットからの血清のＲＢＤ ＡＣＥ２阻害力価（左パネル）、及びＶＮＴ５０として表される生ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の強力な中和（右パネル）を示す。 図５８Ａ～図５８Ｃは、ラットにおける細胞免疫原性試験を示す（ワクチン組成物で免疫化したラットにおけるＩＦＮ－γ、ＩＬ－２及びＩＬ－４分泌細胞のＥＬＩＳｐｏｔ検出）。図５８Ａは、０及び２ＷＰＩに１～１００μｇの範囲のワクチン組成物で免疫化したラットのＴｈ／ＣＴＬペプチドプールで刺激した細胞からのＩＦＮ－γ及びＩＬ－４分泌ＥＬＩＳｐｏｔ分析を示す。図５８Ｂは、０及び２ＷＰＩに１～１００μｇの範囲のワクチン組成物で免疫化したラットのＴｈ／ＣＴＬペプチドプールで刺激した細胞からのＩＬ－２及びＩＬ－４分泌ＥＬＩＳｐｏｔ分析を示す。 図５８Ｃは、示されている個々のペプチドで刺激した細胞からのＩＬ－２及びＩＬ－４応答を示す。陰性対照ウェルを差し引くことによって、細胞百万個あたりのサイトカイン分泌細胞（ＳＣ）を計算した。バーは平均標準偏差（ｎ＝３）を表す。３０及び１００μｇ群においてＩＦＮ－γまたはＩＬ－２の分泌はＩＬ－４の分泌に比べて有意により多いことが認められたが（最小二乗平均及びペアワイズ比較を用いて＊＊＊ｐ＜０．００５）、１または３μｇ用量群においてそれらは統計的に差がなかった。レーン１、２、３及び４は、それぞれ１、３、３０及び１００μｇ／用量のワクチン組成物で免疫化した動物を表す。 図５９Ａ～図５９Ｃは、異なる用量の本開示のワクチン組成物を与えた後のｈＡＣＥ形質導入マウスにおける生ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２攻撃試験からの結果を示す。図５９Ａは、免疫化及び攻撃計画を示す模式図である。 図５９Ｂは、生ウイルスで攻撃したマウスからの、ＲＴ－ＰＣＲ（左パネル）及びＴＣＩＤ５０（右パネル）によるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２力価を示す。 図５９Ｃは、生ウイルスで攻撃したマウスから単離された肺の染色部分を示す。 図６０Ａ～図６０Ｃは、異なる用量の本開示のワクチン組成物を与えた後のアカゲザル（ＲＭ）における免疫原性結果を示す。図６０Ａは、ＥＬＩＳＡによるＳ１－ＲＢＤに対するＲＭ免疫血清の直接結合を示す。ＥＬＩＳＡに基づく血清抗体力価（平均Ｌｏｇ１０標準偏差）は、カットオフ値を上回るＯＤ４５０値を有する最高希釈倍率として定義された（＊ｐ≦０．０５、＊＊ｐ≦０．０１）。 図６０Ｂは、ＲＭ免疫血清による生ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の強力な中和を示す。０及び４週目にワクチン接種したＲＭから４２日目に採取された免疫血清をＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染Ｖｅｒｏ－Ｅ６細胞において細胞変性効果（ＣＰＥ）について検査した。 図６０Ｃは、３５日目に採取されＴｈ／ＣＴＬペプチドプールで刺激されたＲＭ末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）のＩＦＮ－γ ＥＬＩＳｐｏｔ分析を示す（＊＊ｐ≦０．０１）。
本開示は、ＣＯＶＩＤ－１９の効果的な検出、予防及び治療のための緩和システムに関するものであり、当該緩和システムは、（１）ウイルス感染の検出及び疫学的監視のための血清学的診断アッセイ、（２）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２による感染の予防のための高精度な部位特異的ペプチド免疫原構築物、（３）感染患者における疾患の治療のための受容体に基づく抗ウイルス療法、ならびに（４）Ｓ１－ＲＢＤ－ｓＦｃタンパク質を含有するデザイナータンパク質ワクチンを含む。本開示の緩和システムは、ＣＯＶＩＤ－１９の検出、予防及び治療のための診断法、ワクチン及び抗ウイルス療法としてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質からのアミノ酸配列、及びヒト受容体を最適なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原性ペプチド、ペプチド免疫原構築物、ＣＨＯ由来タンパク質免疫原構築物、長時間作用性ＣＨＯ由来ＡＣＥ２タンパク質及びその製剤の設計及び製造のために利用する。
本開示の緩和システムの各態様について以下にさらに詳しく論述する。
総則
本明細書中で使用される節の見出しは構成上の目的のためのものであるにすぎず、記載された主題を限定しているとみなされるべきでない。本願書において引用される全ての参考文献または参考文献の部分は、本明細書において、参照によりその全体があらゆる目的のために明示的に援用される。
特に説明していない限り、本明細書中で使用される全ての科学技術用語は、本発明が属する当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。単数形の用語「ａ」、「an」及び「the」は複数形の意味を含み、但し、そうでないことを文脈が明確に示している場合を除く。同様に、「または」という単語は「及び」を含むことを意図し、但し、そうでないことを文脈が明確に示している場合を除く。それゆえ、「ＡまたはＢを含んでいる」という表現は、ＡもしくはＢ、またはＡ及びＢを含むことを意味する。さらには、ポリペプチドに与えられる全てのアミノ酸サイズ、及び全ての分子量値または分子質量値が近似的なものであり、説明のために提供されていることが理解されるべきである。本明細書に記載のものに類似する、または等価である方法及び材料を、本開示の方法の実施または試験に用いることはできるが、以下では好適な方法及び材料を記載する。本明細書中で言及される全ての刊行物、特許出願、特許及び他の参考文献は、参照によりそれらの全体が援用される。矛盾がある場合、用語の説明を含めて本明細書が優先される。加えて、本明細書に開示される材料、方法及び実施例は例示的なものであるにすぎず、限定する意図はない。
本明細書中で使用する場合、「ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２」という用語は、中国の武漢において最初に同定され、他の生きた動物も販売している海産物卸売市場に曝露された人々が罹患した、２０１９新型コロナウイルス株を指す。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）としても知られ、コロナウイルス感染症２０１９（ＣＯＶＩＤ－ＩＤ）の原因である。
「ＣＯＶＩＤ－１９」という用語は、本明細書中で使用される場合、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス株によって引き起こされるヒト感染性疾患を指す。ＣＯＶＩＤ－１９は当初、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２急性呼吸器疾患として知られた。当該疾患は、症候を最初は全くもしくはあまり示さないことがあり、または発熱、咳、息切れ、筋肉痛及び疲労感に発展することがある。合併症には肺炎及び急性呼吸窮迫症候群が含まれ得る。
Ａ．ウイルス感染の検出及び疫学的監視のための血清学的診断アッセイ
１．論理的根拠
本開示の緩和システムの第１の態様は、ウイルス感染の検出及び疫学的監視のための血清学的診断アッセイに関する。
２つ以上の時間点での感染患者からの血清試料における抗体の検出は、感染後の抗体陽転を実証するために重要である。リスクのある集団からの血清学的データの採取及び分析は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２によるＣＯＶＩＤ－１９大流行への対応の手引きとなる監視ピラミッドを構築することで医療専門家の役に立つであろう。現在、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のヒトからヒトへの伝染の規模がどの程度であるかについての知見はない。武漢におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２大流行の公的な発表から１ヶ月も経たないうちに、ウイルスは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ及びＭＥＲＳ－ＣｏＶと比較して伝染性がよりはるかに高く、病原性がより低いとみられ、よって個体レベルに与える健康上の脅威がより小さい、ということが見出された。しかしながら、大流行はスーパースプレッダー現象によって大規模な蔓延を招いて、集団レベルでの未曾有の高リスクを課し、これは世界中の公衆衛生体制の崩壊及び経済損失を引き起こした。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の伝染の連鎖を断つために感染個体の追跡及び診断、ならびにリスクを有する個体の追跡評価を行うことを目指す意欲的な対応には、個体からの生体試料においてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する抗体を検出する速やかで正確で簡単に実施できる血清学的検査が必要とされるであろう。そのような血清学的検査は、自動化された血液スクリーニング作業を用いて処理され得ることが好ましい。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する抗体の検出のための速やかで正確で簡単に実施できる血清学的検査は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の同定、管理及び排除において大いに価値があるであろう。
本開示の一態様は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２による感染を検出及び診断するための免疫吸着剤として免疫アッセイ、アッセイ及び／または診断キットに使用するための、１つ以上のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原性ペプチドまたはその断片（複数可）に関する。抗原性ペプチドまたはその断片（複数可）の１つ以上を含有する免疫アッセイ及び／または診断キットは、感染によってまたはワクチン接種によって誘導された抗体を同定及び検出する上で有用である。そのような検査は、診療所においてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染の存在についてスクリーニングするために、疫学的監視のために、及びワクチンの有効性を検査するために用いられ得る。
２．感染個体におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＭ、Ｎ及びＳタンパク質に対する抗体の検出のための抗原性ペプチド
本開示の血清学的診断アッセイは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の完全長の膜（Ｍ）、ヌクレオカプシド（Ｎ）及びスパイク（Ｓ）タンパク質、またはその断片を利用する。いくつかの実施形態では、診断アッセイは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＭ、Ｎ及びＳタンパク質からのアミノ酸配列に由来する抗原性ペプチドを利用する。そのような抗原性ペプチドは、抗体認識のためのエピトープを形成する、Ｍ、Ｎ及びＳタンパク質中のアミノ酸配列の部分に対応する。好ましくは、抗原性ペプチドは、ＣＯＶＩＤ－１９の患者に抗体を産生させるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２からのＢ細胞エピトープである。そのようなエピトープは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染していることが知られているＣＯＶＩＤ－１９患者からの試料を使用して実験的に決定され得る。当技術分野で知られている、抗原性ペプチドを使用する任意の免疫アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ、イムノドット、イムノブロットなど）は、対象からの生体試料においてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体の存在を検出するために用いられ得る。
抗原性ペプチドの長さは、Ｍタンパク質（配列番号１）、Ｎタンパク質（配列番号６）またはＳタンパク質（配列番号２０）の約１５アミノ酸残基から完全長アミノ酸配列まで様々であり得る。好ましくは、本発明の抗原性ペプチドは約２０～約７０アミノ酸残基である。
バイオインフォマティクス、及びＳＡＲＳ－ＣｏＶからの対応するタンパク質配列との配列アライメントを用いる、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＭ、Ｎ及びＳタンパク質からの抗原性ペプチド。それらは、始めに設計され、合成され、ＣＯＶＩＤ－１９の患者からの血清の大パネルによって、これらの患者血清に結合されるそれらの能力について大規模に試験された。この手法を用いて、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２陽性血清パネルに対する最も大きな一貫した抗原性及び結合親和性を有すると考えられるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２からのいくつかの抗原性ペプチドが同定された：
Ｍタンパク質：アミノ酸残基１～２３（配列番号４）、
Ｎタンパク質：アミノ酸残基３５５～４１９（配列番号１７、２５９、２６１、２６３、２６５、２６６、２７０）、及び
Ｓタンパク質：アミノ酸残基７８５～８３９（配列番号３７、２８１、３０８、３２１、３２２、３２３、３２４）。
これら３つの抗原性ペプチドを、溶解性及びプレート被覆効率を向上させるべくそのＮ末端における３つのリジン残基（ＫＫＫ）の付加によってさらに最適化して、それぞれ配列番号５、１８及び３８の最適化抗原ペプチドを生成した。Ｎ末端リジン尾部を含有する最適化抗原性ペプチド（配列番号５、１８及び３８）は血清学的診断アッセイにおいて個別に使用されてもよいし、またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する抗体の検出のための最適な抗体捕捉相を作り出すためにそれらを組み合わせて混合物としてもよい。
いくつかの実施形態では、血清学的診断アッセイ及び／または診断キットは、配列番号５、１８、２５９、２６１、２６３、２６５、２６６、２７０、３８、２８１、３０８、３２１、３２２、３２３及び３２４のものから選択される最適化抗原性ペプチドの混合物をＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する抗体の検出のための抗体捕捉相として利用する。ある特定の実施形態では、最適化抗原性ペプチドに結合する抗体は、ＥＬＩＳＡを用いて検出される。
３．ワクチン接種個体における抗体の検出のための抗原性ペプチド
患者がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染しているか否かを検出及び診断することに加えて、本明細書に記載のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチンで免疫化された患者の有効性を評価することも重要である。ワクチン組成物に使用される抗原性ペプチドを利用する血清学的アッセイは、ワクチンによる免疫化の有効性を判定するために用いられ得る。
ワクチン接種個体において産生された抗体を検出するために使用され得るＢ細胞クラスター抗原性ペプチドが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質からの受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）（配列番号２２６）または中和部位の周辺で同定及び設計された。Ｓ１タンパク質のＲＢＤからの代表的な複数のＢ細胞クラスター抗原性ペプチドを表３、１１及び１３に示す（例えば、配列番号２３～２４、２６～２７、２９～３４、２２６、２２７及び３１９）。これらのＢ細胞エピトープペプチドのいくつかは、立体配座保存のための局所的束縛を可能にするシステイン残基間のジスルフィド結合によって作り出された環状／ループ型構造を含有する。
いくつかの実施形態では、感染個体及び本明細書に記載のＳ－ＲＢＤペプチド免疫原構築物を受けているワクチン接種個体において産生されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体を検出するための血清学的アッセイは、配列番号２６、３８、２２６、２２７、２８１、３１５～３１９及び３２２のＢ細胞エピトープペプチドを抗体捕捉相として利用する。ある特定の実施形態では、Ｂ細胞エピトープペプチドに結合する抗体はＥＬＩＳＡを用いて検出される。
４．ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する抗体の検出のための２つの血清学的検査
本開示は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する抗体の検出のための２つの血清学的検査に関する。一実施形態において、血清学的検査は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染した個体の同定のために、配列番号５、１８及び３８、２５９、２６１、２６３、２６５、２６６、２７０、２８１、３０８、３２１、３２２、３２３ならびに３２４のものから選択されるペプチドで被覆された固相を含む。１つ目の検査とは区別され得るものである２つ目の検査では、固相を配列番号２６、２２６、２２７または３１９のペプチドで被覆して中和抗体の力価を評価する。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ペプチド（例えば、配列番号５、１８及び３８、２５９、２６１、２６３、２６５、２７０、３８、２８１、３０８、３２１、３２２、３２３ならびに３２４）及び（配列番号２６、２２６、２２７または３１９）を含む診断検査キットの製造及び使用は、本開示の様々な例示的実施形態の範囲に含まれる。
具体的な実施形態において、抗原性ペプチドまたはＢ細胞エピトープペプチドは、ＣＯＶＩＤ－１９の診断のための患者からの生体試料におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体の検出に役立つ。生体試料としては、血液、血清、血漿、唾液、尿、粘液、便、組織抽出物及び組織液を含むがこれらに限定されない、抗体を含有し得る任意の体液または組織が挙げられる。患者という用語は、非霊長類（例えば、ウシ、ブタ、ウマ、ネコ、イヌ、ラットなど）及び霊長類（例えばサル及びヒト）などの任意の動物、好ましくはヒトを包含することを意図している。
本開示の抗原性ペプチド及びＢ細胞エピトープペプチドは、患者からの生体試料においてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体の存在を検出するための免疫アッセイに使用され得る。当技術分野で知られている任意の免疫アッセイが用いられ得る。例えば、生体試料を、結合するよう導く条件の下で１つ以上のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原性もしくはＢ細胞エピトープペプチド、またはその免疫学的機能性類縁体と接触させ得る。生体試料と、抗原性もしくはＢ細胞エピトープペプチドまたはその免疫学的機能性類縁体との任意の結合は、当技術分野で知られている方法によって測定され得る。上記生体試料と、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原性ペプチドまたはその免疫学的機能性類縁体との結合が検出されることは、試料におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の存在を示唆する。より具体的な実施形態では、試料におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体の存在を評価するためにＥＬＩＳＡ免疫アッセイが用いられ得る。そのようなＥＬＩＳＡ免疫アッセイは、
ｉ．抗原性ペプチド（配列番号４～５、１７～１８、３７～３８、２５９、２６１、２６３、２６５、２６６、２７０、２８１、３０８、３２１、３２２、３２３及び３２４）またはＢ細胞エピトープペプチド（例えば、配列番号２３～２４、２６、２７及び２９～３４、２２６、２２７及び３１５～３１９）を含むペプチドまたはペプチドの混合物を固体担体に結合させるステップ、
ｉｉ．固体担体に結合した抗原性ペプチドまたはＢ細胞エピトープペプチドを、患者からの抗体を含有する生体試料に、抗体がペプチドに結合するよう導く条件の下で曝露するステップ、
ｉｉｉ．固体担体に結合したペプチドに結合した抗体の存在を検出するステップ
を含む。
５．ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ペプチドの免疫学的機能性相同体及び類縁体
いくつかの実施形態では、抗原性ペプチド（例えば、配列番号４～５、１７～１８、３７～３８、２５９、２６１、２６３、２６５、２６６、２７０、２８１、３０８、３２１、３２２、３２３及び３２４）またはＢ細胞エピトープペプチド（例えば、配列番号２３～２４、２６、２７、２９～３４、２２６、２２７及び３１５～３１９）は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の変異体及びバリアント株からの対応する配列及び立体配座要素を有する免疫学的機能性相同体及び／または類縁体を含む。
本開示のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ペプチドの相同体及び／または類縁体は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２によって誘発された抗体と結合または交差反応するものであり、本開示に含まれる。アレルバリアント、種バリアント及び誘導バリアントを含めて、類縁体は、しばしば保存的置換によって、天然に存在するペプチドとは１つ、２つまたは少数の位置において異なっているのが典型的である。類縁体は典型的に、天然ペプチドとの少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％または９５％の配列同一性を呈する。いくつかの類縁体は、１つ、２つまたは少数の位置に非天然アミノ酸、またはＮもしくはＣ末端アミノ酸の修飾も含む。
機能性類縁体である多様体は、アミノ酸位置における保存的置換；全体電荷の変化；別の部分に対する共有結合；またはアミノ酸付加、挿入もしくは欠失；及び／またはその任意の組合せを有し得る。
保存的置換は、１つのアミノ酸残基が、類似する化学特性を有する別のアミノ酸残基の代わりに使用される場合をいう。例えば、非極性（疎水性）アミノ酸としては、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン及びメチオニンが挙げられ、極性中性アミノ酸としては、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン及びグルタミンが挙げられ、正に帯電した（塩基性）アミノ酸としては、アルギニン、リジン及びヒスチジンが挙げられ、負に帯電した（酸性）アミノ酸としては、アスパラギン酸及びグルタミン酸が挙げられる。
特定の実施形態では、機能性類縁体は、元のアミノ酸配列との少なくとも５０％の同一性を有する。別の実施形態では、機能性類縁体は、元のアミノ酸配列との少なくとも８０％の同一性を有する。さらに別の実施形態では、機能性類縁体は、元のアミノ酸配列との少なくとも８５％の同一性を有する。さらに別の実施形態では、機能性類縁体は、元のアミノ酸配列との少なくとも９０％の同一性を有する。
相同ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ペプチドは、対応するペプチドと比較したとき、元のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ペプチドと実質的に同じ免疫原性を保持しつつも何らかの改変（例えば、配列もしくは電荷の変更、別の部分に対する共有結合、１つ以上の分岐構造の付加、及び／または多量体化）がなされている配列を含有する。
相同体は、配列アライメントプログラム、例えば、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａ、またはタンパク質ＢＬＡＳＴ解析によって容易に同定され得る。図３～５は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、ＳＡＲＳ ＣｏＶ及びＭＥＲＳ ＣｏＶのコロナウイルス株からのアミノ酸配列のアライメントを示す。感染したまたはワクチン接種された個体からの生体試料における免疫アッセイ（例えばＥＬＩＳＡ）によってＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＭ、Ｎ及びＳタンパク質に対する抗体を検出するのに最も適する抗体捕捉相を構成すべく、これらの相同ペプチドを、個別に使用してもよいし、または組み合わせて混合物としてもよい。本開示のペプチドの相同体は、当該ペプチドとの少なくとも５０％の同一性を有する、ＳＡＲＳ－ＣｏＶまたはＭＥＲＳ－ＣｏＶなどの多様体株のアミノ酸配列の対応する位置から得られるペプチドとしてさらに定義される。
いくつかの実施形態では、多様体ペプチド相同体は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の配列番号１、６、２０との約５０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％を上回る配列同一性を有するＳＡＲＳ－ＣｏＶまたはＭＥＲＳ－ＣｏＶからの配列（例えば、配列番号２、３、７、８、２１または２２）のアミノ酸位置から得られる。別の実施形態では、ＳＡＲＳ株Ｓ－ＲＢＤペプチド相同体（配列番号２８）は配列番号２６との約５８．６％の同一性を有する。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｍタンパク質（例えば配列番号４～５）、Ｎタンパク質（例えば、配列番号１７～１８、２５９、２６１、２６３、２６５、２６６及び２７０）及びＳタンパク質（例えば、配列番号３７～３８、２８１、３０８、３２１、３２２、３２３及び３２４）の抗原性領域、ならびにその相同体に相当する一連の合成ペプチドは、単独で、または組み合わせて、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２による感染の検出及び診断のために患者からの生体試料においてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する抗体を検出するのに役立ち得る。加えて、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質の受容体結合ドメイン（Ｓ－ＲＢＤまたはＳ１－ＲＢＤ）（例えば、配列番号２６、２２６、２２７または３１５～３１９）及びその相同体に相当する一連の合成ペプチドは、単独で、または組み合わせて、本明細書に記載の製剤をワクチン接種された個体の免疫化有効性を判定するために生体試料においてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する中和抗体を検出するのに役立ち得る。
６．ＵＢＩ（登録商標）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＥＬＩＳＡ製品
ａ．商標名及び意図された用途
ＵＢＩ（登録商標）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＥＬＩＳＡは、ヒト血清及び血漿（ヘパリンナトリウムまたはＥＤＴＡ二カリウム（Ｋ２））におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対するＩｇＧ抗体の定性的検出を意図した酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）である。ＵＢＩ（登録商標）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＥＬＩＳＡは、最近または以前の感染を示唆するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する適応免疫応答を有する個体を特定する上での補助としての用途を意図したものである。本時点では、感染後に抗体がどれだけ長く持続するか、及び抗体の存在が保護的免疫を付与するのかは未知である。ＵＢＩ（登録商標）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＥＬＩＳＡは、急性ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症を診断または除外するために用いられるべきではない。検査は、１９８８年臨床検査改善改正法案（ＣＬＩＡ）、４２Ｕ．Ｓ．Ｃ２６３ａの下に認定された、複雑性の高い検査を実施するための要件を満たす検査施設に限られる。
結果はＩｇＧ ＳＡＲＳ ＣｏＶ－２抗体の検出に関するものである。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対するＩｇＧ抗体は、通常、初回感染の数日後の血液において検出可能であり、但し、感染後に抗体が存在する持続時間は十分に特徴付けられていない。個体は、抗体陽転後の数週間にわたって存在する検出可能なウイルスを有し得る。
米国及びその領土にある検査施設は、全ての結果を適切な公的保健局に報告することが求められる。
感染後すぐのＵＢＩ（登録商標）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＥＬＩＳＡの感度は未知である。陰性結果は急性ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症の可能性を除外するものではない。急性感染症が疑われる場合、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の直接検査が必要である。
ＵＢＩ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＥＬＩＳＡによる偽陽性結果は、既存抗体からの交差反応性、または他のあり得る原因のために起こり得る。偽陽性結果のリスクがあるので、第２の異なるＩｇＧ抗体アッセイを用いて陽性結果を確認することを検討しなければならない。
試料は、症候開始から１５日以上後の個体からのものだけを検査しなければならない。
ＵＢＩ（登録商標）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＥＬＩＳＡは現在、米国食品医薬品局の緊急使用許可の下でのみ用いられる。
ｂ．検査の概要及び説明
ＵＢＩ（登録商標）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＥＬＩＳＡは、ヒト血清または血漿におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する抗体の検出のためにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のマトリックス（Ｍ）、スパイク（Ｓ）及びヌクレオカプシド（Ｎ）タンパク質に由来する合成ペプチドを採用する免疫アッセイである。これらの合成ペプチドは、組換えウイルスタンパク質を製造する元となる細胞またはＥ．ｃｏｌｉに由来する不純物を含まない状態で、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の構造Ｍ、Ｎ及びＳタンパク質の高抗原性セグメントに特異的な抗体と結合し、固相抗原性免疫吸着剤を構成する。カットオフ値以上の吸光度値（すなわち、信号対カットオフ比≧１．００）を有する検体が陽性と定義される。
ｃ．手順の化学的及び生物学的原理
ＵＢＩ（登録商標）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＥＬＩＳＡは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイク（Ｓ）、マトリックス（Ｍ）及びヌクレオカプシド（Ｎ）タンパク質の高抗原性セグメントに対する特異性を有する抗体を捕捉する合成ペプチドからなる、反応マイクロプレートのウェルに結合した免疫吸着剤を採用している。
アッセイの過程で、希釈された陰性対照及び検体を反応マイクロプレートウェルに加え、インキュベートする。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異抗体は、存在する場合、免疫吸着剤に結合することになる。反応マイクロプレートウェルを十分に洗浄して未結合抗体及び他の血清／血漿成分を除去した後、ヒトＩｇＧに対して特異的な西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲートヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体の標準化調製物を各ウェルに加える。その後、このコンジュゲート調製物を、捕捉された抗体と反応させる。ウェルをもう１回十分に洗浄して未結合西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート抗体を除去した後、過酸化水素及び３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を含有する基質溶液を添加する。大抵の場合、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異ＩｇＧ抗体が存在するときその量に比例して青色に呈色する。マイクロプレートリーダー、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ（登録商標）のＶＥＲＳＡＭＡＸ（商標）またはそれに等価なものを使用して、１５分以内に４５０ｎｍで各ウェルの吸光度を測定する。
ｄ．試薬成分及びそれらの保存条件
ＵＢＩ（登録商標）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＥＬＩＳＡ １９２検査
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２反応マイクロプレート １９２ウェル
各マイクロプレートウェルは、吸着したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２合成ペプチドを含有する。乾燥剤で密封して２～８℃で保存すること。
非反応性対照／標準物質 ０．２ｍＬ
０．１％のアジ化ナトリウム及び０．０２％のゲンタマイシンを保存剤として含有する不活化正常ヒト血清。２～８℃で保存すること。
検体希釈剤（緩衝液Ｉ） ４５ｍＬ
カゼイン、ゼラチン、ならびに保存剤の０．１％のアジ化ナトリウム及び０．０２％のゲンタマイシンを含有する、リン酸緩衝生理食塩水。２～８℃で保存すること。
コンジュゲート ０．５ｍＬ
０．０２％のゲンタマイシン及び０．０５％の４－ジメチルアミノアンチピリンを含む西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲートヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体。２～８℃で保存すること。
コンジュゲート希釈剤（緩衝液ＩＩ） ３０ｍＬ
保存剤としての０．０２％のゲンタマイシンと共に界面活性剤及び加熱処理済み正常ヤギ血清を含有する、リン酸緩衝生理食塩水。２～８℃で保存すること。
ＴＭＢ溶液 １４ｍＬ
３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）溶液。２～８℃で保存すること。
基質希釈剤 １４ｍＬ
過酸化水素を含有するクエン酸緩衝液。２～８℃で保存すること。
停止溶液 ２５ｍＬ
希硫酸溶液（１．０ＭのＨ２ＳＯ４）。２～３０℃で保存すること。
洗浄用緩衝液濃縮物 １５０ｍＬ
界面活性剤を含むリン酸緩衝生理食塩水の２５倍濃縮物。２～３０℃で保存すること。
希釈用マイクロプレート １９２ウェル
検体の予備希釈のための空の黄色のマイクロプレート。２～３０℃で保存すること。
プレートカバー ６枚
各インキュベーションの間、反応マイクロプレートウェルを覆うために使用される透明なプラスチック製の粘着シート。プレートの全てに満たない反応マイクロプレートウェルを検査するときは、剥離紙を取り除く前にプラスチック製シートを切断してもよい。あるいは、標準マイクロプレート蓋を使用してもよい。
必要な材料－非提供品
１．抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２陽性対照 ０．２ｍＬ
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＩｇＧ抗体を含有する不活化ヒト血漿。－２０℃以下で保存すること。それはＵＢＩ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＥＬＩＳＡのための抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２陽性対照（ＰＮ２００２３８）として別個に購入されてもよい。
２．手動または自動マルチチャネル－８または１２チャネルピペッター（５０μＬから３００μＬまで）。
３．手動または自動可変ピペッター（１μＬから２００μＬまで）。
４．インキュベータ（３７±２℃）。
５．キャップ付きのポリプロピレン製またはガラス製容器（容量２５ｍＬ）。
６．次亜塩素酸ナトリウム溶液、５．２５％（液体家庭用漂白剤）。
７．４５０±２ｎｍの光を送ることができるマイクロプレートリーダー。
８．２５０～３５０μＬを分注及び吸引することができる自動または手動吸引洗浄システム。
９．ピペッター入れまたは皿。
１０．試薬グレード（またはより高い等級）の水。
１１．使い捨て手袋。
１２．タイマー。
１３．吸収性ティッシュペーパー。
１４．バイオハザード廃棄物容器。
１５．ピペッターチップ。
警告及び使用上の注意
試験管内での診断研究用
現行では処方用途に限る
現行では緊急使用許可のために限る
１．本出願の出願日時点において：
ａ．この検査はＦＤＡの審査通過または承認が済んでいないが、１９８８年臨床検査改善改正法案（ＣＬＩＡ）、４２Ｕ．Ｓ．Ｃ．２６３ａの下に認定された、複雑性の高い検査を実施するための要件を満たす検査施設による使用のために、ＦＤＡによってＥＵＡの下に緊急使用の許可を得ている。
ｂ．この検査の緊急使用は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対するＩｇＧ抗体を検出するためだけに許可されており、他のいかなるウイルスまたは病原体のためにも許可されていない。
ｃ．この検査の緊急使用は、食品医薬品化粧品法（２１ Ｕ．Ｓ．Ｃ．§３６０ｂｂｂ－３（ｂ）（１））の第５６４条（ｂ）（１）項の下にＣＯＶＩＤ－１９の検出及び／または診断のための試験管内での診断検査の緊急使用許可を正当化する状況が存在するという宣言の継続期間にわたってのみ許可されるが、但し、より早く宣言が終了するかまたは許可が廃止される場合はこの限りでない。
２．アッセイ検体、反応性及び非反応性対照を、感染性物質の伝染が可能なものとして取り扱うこと。検査手順の全体にわたって使い捨て手袋を着用すること。手袋をバイオハザード廃棄物として処分すること。後で手を十分に洗うこと。
３．試薬を１つのキットロットから別のものに取り替えないこと。コンジュゲート及び反応マイクロプレートは最適な性能のために適合されている。製造業者によって提供された試薬のみを使用すること。
４．キット構成要素をその使用期限を超えて使用しないこと。
５．非反応性対照／標準物質は、検体についての実施の度に各プレートにおいて３反復で検査されなければならず、検体と同様に希釈されなければならない。
６．試薬グレードの品質の水のみを使用して洗浄用緩衝液濃縮物を希釈すること。
７．使用前に全てのキット試薬及び材料を室温（１５～３０℃）に達せしめること。
８．必要になるまでマイクロプレートを保存袋から取りださないこと。未使用のストリップは、提供された乾燥剤と共にその箔パウチに入れて確実に密閉して２～８℃で保存しなければならない。
９．注意：停止溶液（１ｍｏｌ／ＬのＨ２ＳＯ４）は火傷を引き起こす。この製品に決して水を加えないこと。目に入った場合は直ちに大量の水ですすぎ、医師に相談すること。
１０．１ｍｏｌ／Ｌの硫酸（停止溶液）といかなる酸化剤または金属との接触も避けること。
１１．マイクロプレートリーダー及び自動マイクロプレート洗浄機は共に、機器製造業者によって提供された装置、操作、較正及び維持についての指示事項に従うこと。
１２．こぼした場合はヨードホール消毒剤または次亜塩素酸ナトリウム溶液を使用して十分に清掃しなければならない。
ヨードホール消毒剤：有効ヨウ素が少なくとも１００ｐｐｍとなる希釈度で使用しなければならない。
次亜塩素酸ナトリウム：
ａ．酸を含有しないものをこぼした場合は、５．２５％の次亜塩素酸ナトリウム溶液で十分に拭き取らなければならない。
ｂ．酸を含有するものをこぼした場合は、拭き取って乾燥させなければならない。その後、こぼした領域を５．２５％の次亜塩素酸ナトリウム溶液（液体家庭用漂白剤）で拭かなければならない。
１３．この製品はアジ化ナトリウムを保存剤として含有する。アジ化ナトリウムは検査施設の配管系統においてアジ化鉛またはアジ化銅を形成することがある。
これらのアジ化物は、ハンマーで打つような衝突があると爆発することがある。アジ化鉛またはアジ化銅の形成を防ぐために、排液を処理した後に排液管を水で十分に洗い流すこと。アジ化物蓄積の疑いを除去するために、国立労働安全衛生研究所（米国）は、（１）ホースを使用して排液トラップから液体をサイフォンで吸い出すこと、（２）１０％の水酸化ナトリウム溶液で満たすこと、（３）１６時間留まらせること、及び（４）水でよく洗い流すことを推奨している。
廃棄物処理
検査を実施するために使用した全ての検体及び材料は、あたかもそれらが感染性物質を含有するかのように処理すること。焼却前に１２１℃以上でのオートクレーブ処理が推奨される。
酸を含有しない液体廃棄物は、最終混合物が１．０％の次亜塩素酸ナトリウムを含有するような体積の次亜塩素酸ナトリウムと混合され得る。酸を含有する液体廃棄物は、比例量の塩基で中和されてから次亜塩素酸ナトリウムが添加されなければならない。除染を完了させるためには室温で少なくとも３０分経過させること。その後、液体は地方条例に従って処分され得る。
検体採取及び調製
１．ＵＢＩ（登録商標）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＥＬＩＳＡは、ヒト血清または血漿（抗凝固剤ヘパリンナトリウムまたはＥＤＴＡ二カリウム）に対して実施され得る。沈澱物または微粒子状物質を含有する検体は、一貫しない検査結果を与えることがある。必要に応じて、検査前に遠心分離によって検体を清澄化しなければならない。
２．アッセイ前に検体を加熱によって不活化してはならない。
３．検体は、４８時間を上限として２～８℃で、または２ヶ月間を上限として－２０℃以下で保存され得る。
４．検体の凍結及び解凍は１回行われ得る。
試薬の調製
アッセイ試薬を冷蔵庫から取り出した後、それを室温に達せしめ、ピペット操作前に穏やかな旋回によって十分に混合すること。
洗浄用緩衝液：
アッセイ手順を開始する前に調製及びプレート洗浄機内への充填を行うこと。１体積の洗浄用緩衝液濃縮物を２４体積の試薬グレードの水で希釈すること。よく混ぜ合わせること。希釈洗浄溶液は、時節混合することで調製後３ヶ月にわたって安定である。２～３０℃で保存すること。希釈洗浄溶液の使用は、冷蔵庫でそれを保存していたのであればそれが室温（１５～３０℃）に達してから行うこと。
使用コンジュゲート溶液：
アッセイ手順のステップ６として調製すること。コンジュゲートをコンジュゲート希釈剤で１：１００に希釈すること。調製すべき使用コンジュゲート溶液の正確な量については以下の表を参照すること。溶液を確実に均質にするためによく混合すること。
使用コンジュゲート溶液の調製表
Figure 2023515800000002
ＴＭＢ基質溶液：
アッセイ手順のステップ８として調製すること。ＴＭＢ溶液と基質希釈剤とを等体積で混合すること。調製すべきＴＭＢ基質溶液の正確な量については以下の表を参照すること。調製から１０分以内に使用し、直射日光から保護すること。
Figure 2023515800000003
全ての物質は室温（１５～３０℃）で使用されなければならない。液体試薬は使用前に十分かつ穏やかに混合されなければならない。
保存についての指示事項
１．ＵＢＩ（登録商標）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＥＬＩＳＡキット及びその構成要素は、使用しない時は２～８℃で保存し、キット使用期限までに使用すること。
２．開封後、未使用の反応マイクロプレートのストリップは、提供された乾燥剤と共に箔パウチに入れて確実に密閉して２～８℃で保存しなければならない。一度開封した後、閉じたパウチの中に２～８℃で保った場合、反応マイクロプレートは８週間にわたって安定である。
不安定性または劣化のしるし
１．供給された試薬の物理的外観の変化は、これらの物質の劣化を表している可能性がある。明らかに濁っている試薬を使用しないこと。
２．アッセイの適切な性能を得るためには、ＴＭＢ溶液、基質希釈剤、及び調製された基質溶液の色が無色～淡黄色でなければならない。他のいかなる色も、ＴＭＢ溶液及び／または基質溶液の劣化を表している可能性がある。
不安定性または劣化のしるし
抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２陽性対照は、検査試料と同様に処理され、検査実施を検証するために使用される。陽性対照については実施の度に患者検体と同時進行で別個のウェルで実施することが推奨される。陽性対照の吸光度値は０．５以上でなければならず、信号対カットオフ比は１．０超でなければならない。陽性対照吸光度値か信号対カットオフ比かのどちらかが限度を超える場合、プレートは無効であり、検査を繰り返さなければならない。
非反応性対照／標準物質は、アッセイ手順の節に記載されるとおりに検査される。
非反応性対照／標準物質についての予測される結果は、アッセイ検証の節に示される。
アッセイ手順
１．希釈用マイクロプレートに対して：
Ａ．２００μＬの検体希釈剤（緩衝液Ｉ）を全てのウェルに分注する。
Ｂ．ウェルＡ１を試薬ブランクとして使用する。
Ｃ．１０μＬの非反応性対照／標準物質をウェルＢ１、Ｃ１、Ｄ１に加える。
Ｄ．１０μＬの抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２陽性対照を適切なウェルに加える。
Ｅ．１０μＬの検査検体を適切なウェルに加える。
２．ウェルの内容物が十分に混合されることを確実にする。手作業でピペットを使用して混合すること、またはプレートを穏やかに振動させることは、許容される。
３．箔パウチを開け、反応マイクロプレートを取り出す。反応マイクロプレート全体を使用しない場合は余分なストリップを枠体から取り外してそれらを提供された保存パウチに戻し、しっかりと封をする。使用する洗浄システムによっては代替のストリップを挿入することが必要になることがある。
４．希釈用マイクロプレートの各ウェルから、１００μＬの試薬ブランク、非反応性対照／標準物質、及び希釈検体を、反応マイクロプレートのその対応するウェルに移す。
５．カバーを付け、３７±２℃で６０±２分間インキュベートする。
６．反応マイクロプレートを洗浄する前に、試薬の調製において記載されているとおりに使用コンジュゲート溶液（１：１０１）を調製する。
７．試薬の調製において記載されているとおりにマイクロプレートを洗浄用緩衝液で洗浄する。
Ａ．自動マイクロプレート洗浄機－少なくとも３００μＬ／ウェル／洗浄として６回洗浄を用いる。
Ｂ．手動マイクロプレート洗浄機またはピペッター（８または１２チャネル）－少なくとも３００μＬ／ウェル／洗浄を用いて６回洗浄する。プレート全体を満たし、その後、同じ順序で吸引する。
８．例えば軽く叩きつけることで吸取紙に吸い取らせることによって、残りの体積を最小限に抑えることを必ず行う。
９．調製した使用コンジュゲート溶液（１：１０１）１００μＬを反応マイクロプレートの全てのウェルに加える。カバーを付け、３７±２℃で３０±１分間インキュベートする。
１０．インキュベーション中に、試薬の調製において記載されているとおりにＴＭＢ基質溶液を使用前に調製する。溶液を直射日光から遮蔽する。
１１．ステップ７及びステップ８のとおりに洗浄手順を繰り返す。
１２．調製したＴＭＢ基質溶液１００μＬを反応マイクロプレートの各ウェルに加える。
１３．カバーを付け、３７±２℃で１５±１分間インキュベートする。
１４．１００μＬの停止溶液を反応マイクロプレートの各ウェルに加える。例えばプレートを穏やかに軽く叩くか振動させることによって、混合する。
１５．空気ブランクによって４５０±２ｎｍの吸光度を読み取る。注：吸光度は、停止溶液を反応マイクロプレートに加えた後１５分以内に読み取らなければならない。
アッセイ検証及び結果の計算
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対して特異的な抗体の存在または非存在を、カットオフ値に対して検体の吸光度を関係付けることによって判定する。
アッセイ検証
アッセイが有効となるためには、
１．試薬ブランクの吸光度値が０．１５０未満でなければならない。この限界の外にあるときは、プレートは無効であり、検査を繰り返さなければならない。
２．個々の非反応性対照／標準物質の吸光度値は０．２００未満でしかも試薬ブランクよりも大きくなければならない。３つの非反応性対照／標準物質の値のうち１つがこれらの限界のどちらかの外にあるときは、２つの許容可能な対照値に基づいて非反応性／標準物質の平均を再計算する。３つの対照値のうち２つ以上がどちらかの限界（０．２００未満、及び試薬ブランクよりも大きい）の外にあるときは、プレートは無効であり、検査を繰り返さなければならない。
３．抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２陽性対照の吸光度値は０．５以上でなければならず、信号対カットオフ比は１．０よりも大きくなければならない。陽性対照の吸光度値か信号対カットオフ比かのどちらかが限界の外になるときは、プレートは無効であり、検査を繰り返さなければならない。
結果の計算
１．試薬ブランク（ＲＢ）の吸光度
例：試薬ブランク 吸光度
ウェルＡ１ ０．０４４
２．非反応性対照／標準物質（ＮＲＣ）の平均の決定
例：ＮＲＣ 吸光度
ウェルＢ１ ０．０６２
ウェルＣ１ ０．０６６
ウェルＤ１ ０．０６３
合計 ０．１９１
平均 ０．１９１÷３＝０．０６４
３．カットオフ値の計算：
カットオフ値 ＝平均ＮＲＣ＋０．２
例：平均ＮＲＣ ＝０．０６４
カットオフ値 ＝０．０６４＋０．２＝０．２６４
４．信号対カットオフ（Ｓ／Ｃ）比の計算：
Ｓ／Ｃ比 ＝試料のＯＤ÷カットオフ値
例：試料ＯＤ ＝０．５４２
カットオフ値 ＝０．２６４
Ｓ／Ｃ比 ＝０．５４２／０．２６４＝２．０５
結果の解釈
１．カットオフ値未満（すなわち、信号対カットオフ比＜１．００）の吸光度値を有する検体は、ＵＢＩ（登録商標）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＥＬＩＳＡの判定基準によって陰性であり、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対するＩｇＧ抗体が陰性であるとみなされ得る。
２．カットオフ値以上（すなわち、信号対カットオフ比≧１．００）の吸光度値を有する検体は、ＵＢＩ（登録商標）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＥＬＩＳＡの判定基準によって陽性であり、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する抗体が陽性であるとみなされ得る。
ＵＢＩ（登録商標）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＥＬＩＳＡの結果は以下のとおりに解釈される：
Figure 2023515800000004
測定された結果の、カットオフを上回る大きさは、試料中に存在する抗体の総量を表すものではない。
手順の制限
１．ＵＢＩ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＥＬＩＳＡの使用は、訓練された検査施設職員に制限される。家庭用ではない。
２．ＵＢＩ（登録商標）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＥＬＩＳＡ手順、及び結果の解釈の節を厳密に固守しなければならない。
３．性能は、意図する用途の中で列挙される検体種に関してのみ確立されている。他の検体種については評価されておらず、このアッセイで使用すべきでない。
４．このアッセイは、フィンガースティック検体では評価されていない。この検査は、フィンガースティック全血による使用が許可されていない。
５．ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体は、１５日未満にわたって症候を呈している患者から採取した試料では検出可能レベル未満になる可能性がある。試料は、症候開始後１５日以上の個体から採取されなければならない。試料は、症候開始後１５日未満の個体から採取された場合は検査されるべきでない。
６．アッセイ結果は、個々の患者に判断を下す際に臨床医を支援するために他の臨床及び検査施設方法と併せて利用されるべきである。
７．急性ＣＯＶＩＤ－１９感染所を診断もしくは除外するために、または感染状態を知らせるためにアッセイ結果を用いてはならない。急性感染症が疑われる場合は直接ウイルス核酸検出または抗原検出法を実施しなければならない。
８．既存抗体からの交差反応性、または他のあり得る原因によって、偽陽性結果が起こる可能性がある。
９．個々の被験者についての陰性結果は、検出可能な抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体の非存在を表す。陰性結果は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染の可能性を除外するものではなく、患者管理の判断のための唯一の基準として用いられるべきでない。感染後すぐのこのアッセイの感度は未知である。
１０．検体中に存在するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスに対する抗体の量がアッセイの検出限界未満である場合、または試料を採取する疾患ステージの間、検出される抗体が存在していない場合、陰性結果が起こり得る。
１１．非ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２コロナウイルス（普通の風邪）の株、例えばＨＫＵ１、ＮＬ６３、ＯＣ４３または２２９Ｅに対する抗体の直接的証拠を有する、信頼できる所出を有する検体は、このアッセイによって評価されていない。
１２．結果が臨床的証拠と一致しない場合は、結果を裏付けるための追加の検査が提案される。
１３．ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する抗体の存在が感染に対する免疫性を付与するか否かは、現段階では分かっていない。
１４．陽性結果は、以前のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を示していないことがある。免疫応答を確認するための第２の、但し異なる血清学検査の必要性を評価する際には、臨床履歴及び局地的疾患流行を含めて他の情報を考慮すること。
１５．ＵＢＩ（登録商標）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＥＬＩＳＡは、手作業によるアッセイ手順で用いるために許可されている。自動装置基幹において用いるためのアッセイ性能は確立されていない。
１６．献血のスクリーニング用ではない。
検査施設の認可の条件
ＵＢＩ（登録商標）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＥＬＩＳＡ委任状は、医療従事者のための規定のファクトシート、患者のための規定のファクトシート、及び規定の表示と共に、ＦＤＡウェブサイト（ウェブサイト：www.fda.gov/medical-devices/coronavirus-disease-2019-covid-19-emergency-use-authorizations-medical-devices/vitro-diagnostics-euas）において入手できる。
ＵＢＩ（登録商標）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＥＬＩＳＡを用いる認可された検査施設は、委任状において示された以下に列挙される認可の条件を固守しなければならない：
１．ＵＢＩ（登録商標）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＥＬＩＳＡを用いる認可された検査施設（「１９８８年臨床検査改善改定法案（ＣＬＩＡ）、４２Ｕ．Ｓ．Ｃ．第２６３条ａの下に認定された、複雑性の高い検査を実施するための要件を満たす検査施設」を「認可された検査施設」とする）は、検査結果報告と共に、全ての認可ファクトシートを含んでいなければならない。危急の状況下では、これらのファクトシートを広めるための他の適切な方法を用いてもよく、これには、マスメディアが含まれ得る。
２、認可された検査施設は．規定の表示において概要が示されているとおりにＵＢＩ（登録商標）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＥＬＩＳＡを用いなければならない。許可された臨床検体種、許可された対照材料、許可された他の付随試薬、及び製品を使用するために必要とされる許可された材料を含めて、許可された手順からの逸脱は許容されない。
３．ＵＢＩ（登録商標）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＥＬＩＳＡを受ける認可された検査施設は、検査を開始する前に、関連する公的保険局にアッセイの実施の意図を通知しなければならない。
４．ＵＢＩ（登録商標）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＥＬＩＳＡを用いる認可された検査施設は、必要に応じて医療従事者及び関連する公的保険局に検査結果を報告するために実施される過程を有していなければならない。
５．認可された検査施設は、ＵＢＩ（登録商標）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＥＬＩＳＡについての情報を収集し、偽陽性または偽陰性結果、及び確立されたアッセイ性能特性からの著しい逸脱の疑いがあると認識されたいかなる事象もＤＭＤ／ＯＨＴ７－ＯＩＲ／ＯＰＥＱ／ＣＤＲＨに（電子メールで：ＣＤＲＨ ＥＵＡ－Ｒｅｐｏｒｔｉｎｇ（ａｔ）ｆｄａ．ｈｈｓ．ｇｏｖ）及びＵＢＩ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｓｕｐｐｏｒｔ（ウェブサイト：www.unitedbiomedical.com/support.html）に報告しなければならない。
６．ＵＢＩ（登録商標）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＥＬＩＳＡを用いる全ての検査施設職員は、免疫アッセイ技術についての訓練が適切にされていなければならず、検査施設及び人を保護する適切な装備をこのキットの取扱い時に使用しなければならず、規定の表示に従ってＵＢＩ（登録商標）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＥＬＩＳＡを用いなければならない。アッセイを用いる全ての検査施設職員は、ＵＢＩ（登録商標）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＥＬＩＳＡの結果の解釈についての訓練もされていなければならず、かつそれに精通していなければならない
７．Ｕｎｉｔｅｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｎｃ．、認可された供給業者、及びＵＢＩ（登録商標）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＥＬＩＳＡを用いる認可された検査施設は、このＥＵＡに関連するいかなる記録も維持されることを、そうしなくてもよいという通達がＦＤＡによってなされるまで確保しなければならない。そのような記録は、求めに応じた査察のためにＦＤＡによる利用が可能にされることになる。
性能評価
性能評価研究については以下の実施例１１でさらに詳しく述べる。
７．具体的な実施形態
（１）ＣＯＶＩＤ－１９についてのウイルス感染の検出及び疫学的監視のための血清学的診断アッセイであって、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＭタンパク質（配列番号１）、Ｎタンパク質（配列番号６）及びＳタンパク質（配列番号２０）からの抗原性ペプチドを含む、前記血清学的診断アッセイ。
（２）前記抗原性ペプチドが、配列番号４～５、１７～１８、３７～３８、２５９、２６１、２６３、２６５、２６６、２７０、２８１、３０８、３２１、３２２、３２３及び３２４、ならびにその任意の組合せからなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、（１）に記載の血清学的診断アッセイ。
（３）前記抗原性ペプチドが、配列番号５、１８、３８、２６１、２６６、２８１、３２２及びその任意の組合せからなる群から選択される、（１）に記載の血清学的診断アッセイ。
（４）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２による感染を検出する方法であって、
ａ）配列番号４～５、１７～１８、２３～２４、２６、２９～３４、３７～３８、２５９、２６１、２６３、２６５、２６６、２７０、２８１、３０８、３２１、３２２、３２３及び３２４、ならびにその任意の組合せからなる群から選択される抗原性ペプチドを、固体担体に結合させること、
ｂ）（ａ）において前記固体担体に結合した前記抗原性ペプチドを、患者からの抗体を含有する生体試料に、前記抗体が前記ペプチドに結合するよう導く条件の下で曝露すること、ならびに
ｃ）前記固体担体に結合した前記ペプチドに結合した前記抗体の存在を検出すること
を含む、前記方法。
（５）（ａ）の前記抗原性ペプチドが、配列番号５、１８、３８、２６１、２６６、２８１、３２２及びその任意の組合せからなる群から選択される、（４）に記載の方法。
Ｂ．ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２による感染の予防のための高精度な部位特異的ペプチド免疫原構築物
本開示の緩和システムの第２の態様は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２による感染の予防のための高精度な部位特異的ペプチド免疫原構築物に関する。
１．Ｓ－ＲＢＤペプチド免疫原構築物の開発
本開示は、スパイクタンパク質（配列番号２２６）またはその相同体もしくは多様体（例えば配列番号２２７）のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）（Ｓ－ＲＢＤまたはＳ１－ＲＢＤ）に由来する約６～約１００個のアミノ酸を有するＢ細胞エピトープペプチドを含有するペプチド免疫原構築物を提供する。ある特定の実施形態では、Ｂ細胞エピトープペプチドは、表３及び表１３に示される配列番号２３～２４、２６～２７、２９～３４及び３１５～３１９から選択されるアミノ酸配列を有する。
Ｂ細胞エピトープは直接、または任意選択の異種スペーサー（例えば、表７の配列番号１０１～１０３）を介して、病原体タンパク質に由来する異種Ｔヘルパー細胞（Ｔｈ）エピトープ（例えば、表６に示される配列番号４９～１００）に共有結合で連結され得る。これらの構築物は、設計されたＢ細胞エピトープ及びＴｈエピトープを両方とも含有した状態で一緒に、Ｓ－ＲＢＤ部位（配列番号２２６）及びその断片（例えば配列番号２６）との交差反応性を有する高度に特異的な抗体の生成を刺激するように作用する。
「Ｓ－ＲＢＤペプチド免疫原構築物」または「Ｓ１－ＲＢＤペプチド免疫原構築物」または「ペプチド免疫原構築物」という表現は、本明細書中で使用される場合、（ａ）Ｓ－ＲＢＤ結合部位（配列番号２２６または２２７）またはそのバリアントからの約６連続アミノ酸残基よりも多くを有するＢ細胞エピトープ、例えば、配列番号２３～２４、２６～２７、２９～３４及び３１５～３１９、（ｂ）異種Ｔｈエピトープ（例えば配列番号４９～１００）、ならびに（ｃ）任意選択の異種スペーサーを含有する、約２０個よりも多いアミノ酸を有するペプチドを指す。
ある特定の実施形態では、Ｓ－ＲＢＤペプチド免疫原構築物は、式：
（Ｔｈ）ｍ－（Ａ）ｎ－（Ｓ－ＲＢＤ Ｂ細胞エピトープペプチド）－Ｘ
または
（Ｓ－ＲＢＤ Ｂ細胞エピトープペプチド）－（Ａ）ｎ－（Ｔｈ）ｍ－Ｘ
または
（Ｔｈ）ｍ－（Ａ）ｎ－（Ｓ－ＲＢＤ Ｂ細胞エピトープペプチド）－（Ａ）ｎ－（Ｔｈ）ｍ－Ｘ
によって表され得、
式中、
Ｔｈは異種Ｔヘルパーエピトープであり、
Ａは異種スペーサーであり、
（Ｓ－ＲＢＤ Ｂ細胞エピトープペプチド）は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に指向される抗体を誘発することができるＳ－ＲＢＤ（配列番号２２６）またはそのバリアントからの６～約３５アミノ酸残基を有するＢ細胞エピトープペプチドであり、
Ｘは、アミノ酸のα－ＣＯＯＨまたはα－ＣＯＮＨ２であり、
ｍは１～約４であり、
ｎは０～約１０である。
本開示のＳ－ＲＢＤペプチド免疫原構築物は、以下を含む複数の論理的根拠に基づいて設計及び選択された。
ｉ．Ｓ－ＲＢＤ Ｂ細胞エピトープペプチドは、タンパク質担体またはタンパク質Ｔヘルパーエピトープ（複数可）を使用することによって免疫原にされ得る。
ｉｉ．Ｓ－ＲＢＤ Ｂ細胞エピトープペプチドが免疫原にされ、宿主に投与された場合、ペプチド免疫原構築物は、
ａ．タンパク質担体またはＴヘルパーエピトープ（複数可）ではなくＳ－ＲＢＤ Ｂ細胞エピトープ（複数可）に優先的に指向される高力価抗体を誘発し、
ｂ．ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を中和することができる高度に特異的な抗体を生み出し、さらに
ｃ．Ｓ－ＲＢＤのその受容体ＡＣＥ２に対する結合を阻害することができる高度に特異的な抗体を生み出す。
本開示のＳ－ＲＢＤペプチド免疫原構築物及びその製剤は、（ＣＯＶＩＤ－１９）を予防及び／または治療するための医薬組成物またはワクチン製剤として有効に機能し得る。
本開示のＳ－ＲＢＤペプチド免疫原構築物の様々な成分について以下にさらに詳しく述べる。
ａ．Ｓ－ＲＢＤからのＢ細胞エピトープペプチド
本開示は、Ｓ－ＲＢＤ部位（例えば配列番号２２６または２２７）及びその断片（例えば配列番号２３～２４、２６～２７、２９～３４及び３１５～３１９）に対する特異性を有する高力価抗体を生み出すための新規ペプチド組成物に関する。ペプチド免疫原構築物の部位特異性は、Ｓ－ＲＢＤ以外の領域にある不適切な部位、または担体タンパク質上の不適切な部位に指向される抗体の生成を最小限に抑え、かくして高い安全率をもたらす。
「Ｓ－ＲＢＤ」または「Ｓ１－ＲＢＤ」という用語は、本明細書中で使用される場合、２０個のアミノ酸を含有し、４つのジスルフィ架橋をシステイン間に形成している８つのシステインを有する、ＡＣＥ２受容体（図２）に結合する受容体結合ドメインを指す。本開示の一態様は、能動的な免疫化によってＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を予防及び／または治療することである。したがって、本開示は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する中和抗体、またはヒト受容体ＡＣＥ２に対するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の結合を阻害する抗体を誘発するための、Ｓ－ＲＢＤの部分（例えば、配列番号２３～２４、２６～２７、２９～３４及び３１５～３１９）を標的とするペプチド免疫原構築物及びその製剤に関する。
Ｓ－ＲＢＤペプチド免疫原構築物のＢ細胞エピトープ部分は、Ｓ－ＲＢＤ部位（配列番号２２６）またはそのバリアントからの約６～約３５個のアミノ酸を含有し得る。いくつかの実施形態では、Ｂ細胞エピトープペプチドは、表３及び表１３に示される配列番号２３～２４、２６～２７、２９～３４及び３１５～３１９から選択されるアミノ酸配列を有する。本開示のＳ－ＲＢＤ Ｂ細胞エピトープペプチドには、表３に示されるような異なるコロナウイルス株、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ（配列番号２１）及びＭＥＲＳ－ＣｏＶ（配列番号２２）からのＳ－ＲＢＤ配列を含む、Ｓ－ＲＢＤの免疫学的機能性類縁体または相同体も含まれる。Ｓ－ＲＢＤ Ｂ細胞エピトープペプチドの機能性免疫学的類縁体または相同体には、タンパク質の主要フレームワーク内のアミノ酸位置における置換、全体電荷の変化、別の部分に対する共有結合、またはアミノ酸付加、挿入もしくは欠失、及び／またはその任意の組合せを有し得るバリアントが含まれる。いくつかの実施形態では、Ｓ－ＲＢＤからの配列のバリアントは、ジスルフィド結合によって束縛され得るペプチドを生成すべく天然アミノ酸残基をシステイン残基で置き換える部位特異的変異を含む（例えば、配列番号２４、３２及び３４）。
Ｓ－ＲＢＤからのＢ細胞エピトープを含有するペプチド免疫原構築物によって生み出された抗体は、高度に特異的であり、完全長Ｓ－ＲＢＤ結合部位（例えば配列番号２２６）またはその断片（例えば配列番号２６）との交差反応性を有する。本開示のＳ－ＲＢＤペプチド免疫原構築物によって誘発された抗体は、その独特な特徴及び特性に基づいて、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染に対する予防手法を提供することができる。
ｂ．異種Ｔヘルパー細胞エピトープ（Ｔｈエピトープ）
本開示は、直接、または任意選択の異種スペーサーを介して異種Ｔヘルパー細胞（Ｔｈ）エピトープに共有結合で連結されたＳ－ＲＢＤからのＢ細胞エピトープを含有するペプチド免疫原構築物を提供する。
ペプチド免疫原構築物中の異種ＴｈエピトープはＳ－ＲＢＤ Ｂ細胞エピトープの免疫原性を増強するが、これによって、設計の論理的根拠に基づいてスクリーニング及び選抜された最適化Ｓ－ＲＢＤ Ｂ細胞エピトープペプチドに指向される特異的な高力価抗体の産生が容易になる。
「異種」という用語は、本明細書中で使用される場合、Ｓ－ＲＢＤの野生型配列の一部でない、またはそれと相同でないアミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を指す。したがって、異種Ｔｈエピトープは、Ｓ－ＲＢＤにおいて天然にみられないアミノ酸配列に由来するＴｈエピトープである（つまり、ＴｈエピトープはＳ－ＲＢＤに対して自家ではない）。ＴｈエピトープはＳ－ＲＢＤに対して異種であるため、異種ＴｈエピトープをＳ－ＲＢＤ Ｂ細胞エピトープペプチドに共有結合で連結した場合にＳ－ＲＢＤの天然のアミノ酸配列はＮ末端またはＣ末端のどちらの方向にも伸張されない。
本開示の異種Ｔｈエピトープは、Ｓ－ＲＢＤにおいて天然にみられるアミノ酸配列を有さない任意のＴｈエピトープであり得る。Ｔｈエピトープは、複数の種のＭＨＣクラスＩＩ分子に対する無差別結合モチーフも有し得る。ある特定の実施形態では、Ｔｈエピトープは、Ｔヘルパー細胞の最大限の活性化を可能にして免疫応答の開始及び調節をもたらすべく、複数の無差別ＭＨＣクラスＩＩ結合モチーフを含む。Ｔｈエピトープは、好ましくはそれ自体では免疫サイレントであり、つまり、Ｓ－ＲＢＤペプチド免疫原構築物によって生み出された抗体がＴｈエピトープへと指向されることはたとえあったとしてもほとんどなく、かくして、標的となるＳ－ＲＢＤ分子のＢ細胞エピトープペプチドに指向される非常に集中した免疫応答が可能になる。
本開示のエピトープは、限定はされないが、表６に例示されるような外来病原体に由来するアミノ酸配列を含む（例えば配列番号４９～１００）。ある特定の実施形態では、Ｓ－ＲＢＤ Ｂ細胞エピトープペプチドの免疫原性を増強するために採用される異種Ｔｈエピトープは、天然の病原体ＥＢＶ ＢＰＬＦ１（配列番号９３）、ＥＢＶ ＣＰ（配列番号９１）、破傷風菌（Clostridium Tetani）（配列番号８２～８７）、コレラ毒素（配列番号８１）及びマンソン住血吸虫（Schistosoma mansoni）（配列番号１００）に由来するもの、ならびに麻疹ウイルス融合タンパク質（ＭＶＦ４９～６６）及びＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ６７～７９）に由来し、単一の配列（例えば、ＭＶＦでは配列番号４９～５２、５４～５７、５９～６０、６２～６３、６５～６６、またＨＢｓＡｇでは配列番号６７～７１、７３～７４、７６～７８）か組合せ配列（例えば、ＭｖＦでは配列番号５３、５８、６１、６４、またＨＢｓＡｇでは配列番号７２及び７５）かのどちらかの形態である理想化人工Ｔｈエピトープである。組合せ理想化人工Ｔｈエピトープは、その特定のペプチドの相同体の可変残基に基づくペプチドフレームワークの中での特定位置に表されたアミノ酸残基の混合体を含有する。組合せペプチドの組立体は、合成プロセス中に１つの特定のアミノ酸の代わりに指定の保護されたアミノ酸の混合物を特定位置に付加することによって、１つのプロセスで合成され得る。そのような組合せ異種Ｔｈエピトープペプチド組立体は、多様な遺伝的背景を有する動物のために幅広いＴｈエピトープを網羅することを可能にし得る。異種Ｔｈエピトープペプチドの代表的な組合せ配列としては配列番号５３、５８、６１、６４、７２及び７５が挙げられ、これらは表６に示される。本発明のＴｈエピトープペプチドは、遺伝的に多様な集団からの動物及び患者に幅広い反応性及び免疫原性を提供する。
ｃ．異種スペーサー
本開示のＳ－ＲＢＤペプチド免疫原構築物は、任意選択的に、Ｓ－ＲＢＤ Ｂ細胞エピトープペプチドを異種Ｔヘルパー細胞（Ｔｈ）エピトープに共有結合で連結する異種スペーサーを含有する。
上述したように、「異種」という用語は、Ｓ－ＲＢＤの天然型配列の一部でない、またはそれと相同でないアミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を指す。したがって、スペーサーはＳ－ＲＢＤ配列に対して異種であるため、異種スペーサーをＳ－ＲＢＤ Ｂ細胞エピトープペプチドに共有結合で連結した場合にＳ－ＲＢＤの天然のアミノ酸配列はＮ末端またはＣ末端のどちらの方向にも伸張されない。
スペーサーは、２つのアミノ酸及び／またはペプチド同士を連結することができる任意の分子または化学構造である。スペーサーは用途に応じて長さまたは極性が様々であり得る。スペーサーを結合させることはアミドリンケージまたはカルボキシルリンケージによってなされ得るが、他の官能性も可能である。スペーサーは、化学化合物、天然に存在するアミノ酸または天然に存在しないアミノ酸を含み得る。
スペーサーは、Ｓ－ＲＢＤペプチド免疫原構築物に構造的特徴部を提供し得る。構造的にはスペーサーは、Ｓ－ＲＢＤ断片のＢ細胞エピトープからのＴｈエピトープの物理的隔離をもたらす。スペーサーによる物理的隔離は、Ｂ細胞エピトープにＴｈエピトープを接合することによって作り出されるいかなる人為的二次構造も妨害し得る。加えて、スペーサーによるエピトープの物理的隔離は、Ｔｈ細胞及び／またはＢ細胞応答同士の干渉を排除し得る。さらに、スペーサーは、ペプチド免疫原構築物の二次構造を作り出すまたは改変するように設計され得る。例えば、スペーサーは、ＴｈエピトープとＢ細胞エピトープとの隔離を強化するための屈曲性ヒンジとして作用するように設計され得る。屈曲性ヒンジスペーサーはまた、提示されたペプチド免疫原と適切なＴｈ細胞及びＢ細胞との間のより効率的な相互作用を可能にしてＴｈエピトープ及びＢ細胞エピトープに対する免疫応答を増強することもできる。屈曲性ヒンジをコードする配列の例は、免疫グロブリン重鎖ヒンジ領域において認められるが、これはプロリンに富むことが多い。スペーサーとして使用され得る１つの特に有用な屈曲性ヒンジは、配列Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｘａａ－Ｐｒｏ－Ｘａａ－Ｐｒｏ（配列番号１０３）によってもたらされ、ここで、Ｘａａは任意のアミノ酸、好ましくはアスパラギン酸である。
スペーサーはまた、Ｓ－ＲＢＤペプチド免疫原構築物に機能的特徴部も提供し得る。例えば、スペーサーは、ペプチド免疫原構築物の溶解性に影響を及ぼすものであるＳ－ＲＢＤペプチド免疫原構築物の全体電荷を変化させるように設計され得る。加えて、Ｓ－ＲＢＤペプチド免疫原構築物の全体電荷を変化させることは、ペプチド免疫原構築物が他の化合物及び試薬と会合する能力に影響を及ぼし得る。以下にさらに詳しく論述されるように、Ｓ－ＲＢＤペプチド免疫原構築物から、静電会合によって、高度に帯電したオリゴヌクレオチド、例えばＣｐＧオリゴマーとの安定した免疫刺激複合体が形成され得る。Ｓ－ＲＢＤペプチド免疫原構築物の全体電荷は、これらの安定した免疫刺激複合体の形成のために重要である。
スペーサーとして使用され得る化学化合物としては、（２－アミノエトキシ）酢酸（ＡＥＡ）、５－アミノ吉草酸（ＡＶＡ）、６－アミノカプロン酸（Ａｈｘ）、８－アミノ－３，６－ジオキサオクタン酸（ＡＥＥＡ、ｍｉｎｉ－ＰＥＧ１）、１２－アミノ－４，７，１０－トリオキサドデカン酸（ｍｉｎｉ－ＰＥＧ２）、１５－アミノ－４，７，１０，１３－テトラオキサペンタデカン酸（ｍｉｎｉ－ＰＥＧ３）、トリオキサトリデカン－スクシナミン酸（Ｔｔｄｓ）、１２－アミノ－ドデカン酸、Ｆｍｏｃ－５－アミノ－３－オキサペンタン酸（Ｏ１Ｐｅｎ）などが挙げられるが、これらに限定されない。
天然に存在するアミノ酸としては、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン及びバリンが挙げられる。
天然に存在しないアミノ酸としては、ε－Ｎリジン、β－アラニン、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、サイロキシン、γ－アミノ酪酸、ホモセリン、シトルリン、アミノ安息香酸、６－アミノカプロン酸（Ａｃａ、６－アミノヘキサン酸）、ヒドロキシプロリン、メルカプトプロピオン酸（ＭＰＡ）、３－ニトロ－チロシン、ピログルタミン酸などが挙げられるが、これらに限定されない。
Ｓ－ＲＢＤペプチド免疫原構築物中のスペーサーは、Ｔｈエピトープ及びＳ－ＲＢＤ Ｂ細胞エピトープペプチドのＮ末端かＣ末端かのどちらかに共有結合で連結され得る。いくつかの実施形態では、スペーサーは、ＴｈエピトープのＣ末端に、及びＳ－ＲＢＤ Ｂ細胞エピトープペプチドのＮ末端に共有結合で連結される。他の実施形態では、スペーサーは、Ｓ－ＲＢＤ Ｂ細胞エピトープペプチドのＣ末端に、及びＴｈエピトープのＮ末端に共有結合で連結される。ある特定の実施形態では、１つよりも多いスペーサーが使用されることがあり、これは例えば、１つよりも多いＴｈエピトープがＳ－ＲＢＤペプチド免疫原構築物中に存在する場合である。１つよりも多いスペーサーが使用される場合、各スペーサーは互いに同じであってもよいし、または異なっていてもよい。加えて、１つよりも多いＴｈエピトープがＳ－ＲＢＤペプチド免疫原構築物中に存在する場合、Ｔｈエピトープ同士はスペーサーによって隔てられ得るが、これは、ＴｈエピトープをＳ－ＲＢＤ Ｂ細胞エピトープペプチドから隔てるために使用されるスペーサーと同じであってもよいし、または異なっていてもよい。ＴｈエピトープまたはＳ－ＲＢＤ Ｂ細胞エピトープペプチドに関するスペーサーの並び方に制限はない。
ある特定の実施形態では、異種スペーサーは、天然に存在するアミノ酸または天然に存在しないアミノ酸である。他の実施形態では、スペーサーは、１つよりも多い天然に存在するまたは天然に存在しないアミノ酸を含有する。具体的な実施形態では、スペーサーは、Ｌｙｓ－、Ｇｌｙ－、Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－、（α，ε－Ｎ）Ｌｙｓ、ε－Ｎ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ（配列番号１０１）、またはＬｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－ε－Ｎ－Ｌｙｓ（配列番号１０２）である。
ｄ．Ｓ－ＲＢＤペプチド免疫原構築物の具体的な実施形態
ある特定の実施形態では、Ｓ－ＲＢＤペプチド免疫原構築物は、以下の式：
（Ｔｈ）ｍ－（Ａ）ｎ－（Ｓ－ＲＢＤ Ｂ細胞エピトープペプチド）－Ｘ
または
（Ｓ－ＲＢＤ Ｂ細胞エピトープペプチド）－（Ａ）ｎ－（Ｔｈ）ｍ－Ｘ
または
（Ｔｈ）ｍ－（Ａ）ｎ－（Ｓ－ＲＢＤ Ｂ細胞エピトープペプチド）－（Ａ）ｎ－（Ｔｈ）ｍ－Ｘ
によって表され得、
式中、
Ｔｈは異種Ｔヘルパーエピトープであり、
Ａは異種スペーサーであり、
（Ｓ－ＲＢＤ Ｂ細胞エピトープペプチド）は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を中和できるかまたはＳ－ＲＢＤのその受容体ＡＣＥ２との結合を阻害できる抗体を生み出すことができるＳ－ＲＢＤ（配列番号２２６または２２７）またはそのバリアントからの６～３５アミノ酸残基を有するＢ細胞エピトープペプチドであり、
Ｘは、アミノ酸のα－ＣＯＯＨまたはα－ＣＯＮＨ２であり、
ｍは１～約４であり、
ｎは０～約１０である。
Ｂ細胞エピトープペプチドは、配列番号２２６によって表される完全長Ｓ－ＲＢＤポリペプチドの部分からの約６～約３５個のアミノ酸を含有し得る。いくつかの実施形態では、Ｂ細胞エピトープは、表３及び表１３に示す配列番号２３～２４、２６～２７、２９～３４及び３１５～３１９のいずれかから選択されるアミノ酸配列を有する。
Ｓ－ＲＢＤペプチド免疫原構築物中の異種Ｔｈエピトープは、表６に示される配列番号４９～１００のいずれかまたはその組合せから選択されるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、１つよりも多いＴｈエピトープがＳ－ＲＢＤペプチド免疫原構築物中に存在する。
任意選択の異種スペーサーは、Ｌｙｓ－、Ｇｌｙ－、Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－、（α，ε－Ｎ）Ｌｙｓ、Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｘａａ－Ｐｒｏ－Ｘａａ－Ｐｒｏ（配列番号１０３）、ε－Ｎ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ（配列番号１０１）、Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－ε－Ｎ－Ｌｙｓ（配列番号１０２）のいずれか、及びその任意の組合せから選択され、ここで、Ｘａａは、任意のアミノ酸であるが、好ましくはアスパラギン酸である。具体的な実施形態では、異種スペーサーは、ε－Ｎ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ（配列番号１０１）、またはＬｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－ε－Ｎ－Ｌｙｓ（配列番号１０２）である。
ある特定の実施形態では、Ｓ－ＲＢＤペプチド免疫原構築物は、表８に示される配列番号１０７～１４４のいずれかから選択されるアミノ酸配列を有する。
Ｔｈエピトープを含むＳ－ＲＢＤペプチド免疫原構築物は、Ｓ－ＲＢＤ断片と一緒に単一の固相ペプチド合成において同時に生産される。Ｔｈエピトープには、Ｔｈエピトープの免疫学的類縁体も含まれる。免疫学的Ｔｈ類縁体としては、免疫増強性類縁体、交差反応性類縁体、及びＳ－ＲＢＤ Ｂ細胞エピトープペプチドに対する免疫応答を増強または刺激するのに十分なこれらのＴｈエピトープのいずれかのセグメントが挙げられる。
Ｓ－ＲＢＤペプチド免疫原構築物中のＴｈエピトープは、Ｓ－ＲＢＤ Ｂ細胞エピトープペプチドのＮ末端かＣ末端かのどちらかに共有結合で連結され得る。いくつかの実施形態では、Ｔｈエピトープは、Ｓ－ＲＢＤ Ｂ細胞エピトープペプチドのＮ末端に共有結合で連結される。他の実施形態では、Ｔｈエピトープは、Ｓ－ＲＢＤ Ｂ細胞エピトープペプチドのＣ末端に共有結合で連結される。ある特定の実施形態では、１つよりも多いＴｈエピトープがＳ－ＲＢＤ Ｂ細胞エピトープペプチドに共有結合で連結される。１つよりも多いＴｈエピトープがＳ－ＲＢＤ Ｂ細胞エピトープペプチドに連結される場合、各Ｔｈエピトープは同じアミノ酸配列を有していてもよいし、または異なるアミノ酸配列を有していてもよい。加えて、１つよりも多いＴｈエピトープがＳ－ＲＢＤ Ｂ細胞エピトープペプチドに連結される場合、Ｔｈエピトープはいかなる順序で並べられてもよい。例えば、ＴｈエピトープはＳ－ＲＢＤ Ｂ細胞エピトープペプチドのＮ末端に連続的に連結され得るかもしくはＳ－ＲＢＤ Ｂ細胞エピトープペプチドのＣ末端に連続的に連結され得、またはＴｈエピトープがＳ－ＲＢＤ Ｂ細胞エピトープペプチドのＮ末端に共有結合で連結され得ると同時に別個のＴｈエピトープがＳ－ＲＢＤＢ細胞エピトープペプチドのＣ末端に共有結合で連結される。Ｓ－ＲＢＤ Ｂ細胞エピトープペプチドに関するＴｈエピトープの並び方に制限はない。
いくつかの実施形態では、Ｔｈエピトープは直接、Ｓ－ＲＢＤ Ｂ細胞エピトープペプチドに共有結合で連結される。他の実施形態では、Ｔｈエピトープは異種スペーサーを介してＳ－ＲＢＤ断片に共有結合で連結される。
ｅ．バリアント、相同体及び機能性類縁体
好ましいＳ－ＲＢＤ Ｂ細胞エピトープペプチドに対する抗体を誘導する及び／またはそれと交差反応する、上記免疫原性ペプチド構築物のバリアント及び類縁体を使用してもよい。アレルバリアント、種バリアント及び誘導バリアントを含めて、類縁体は、しばしばアミノ酸置換によって、天然に存在するペプチドとは１つ、２つまたは少数の位置において異なっているのが典型的である。類縁体は典型的に、天然ペプチドとの少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％または９５％の配列同一性を呈する。いくつかの類縁体は、１つ、２つまたは少数の位置に非天然アミノ酸、またはＮもしくはＣ末端アミノ酸の修飾も含む。
機能性類縁体であるバリアントは、アミノ酸位置における置換；全体電荷の変化；別の部分に対する共有結合；またはアミノ酸付加、挿入もしくは欠失；及び／またはその任意の組合せを有し得る。
保存的置換は、１つのアミノ酸残基が、類似する化学特性を有する別のアミノ酸残基の代わりに使用される場合をいう。例えば、非極性（疎水性）アミノ酸としては、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン及びメチオニンが挙げられ、極性中性アミノ酸としては、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン及びグルタミンが挙げられ、正に帯電した（塩基性）アミノ酸としては、アルギニン、リジン及びヒスチジンが挙げられ、負に帯電した（酸性）アミノ酸としては、アスパラギン酸及びグルタミン酸が挙げられる。
特定の実施形態では、機能性類縁体は、元のアミノ酸配列との少なくとも５０％の同一性を有する。別の実施形態では、機能性類縁体は、元のアミノ酸配列との少なくとも８０％の同一性を有する。さらに別の実施形態では、機能性類縁体は、元のアミノ酸配列との少なくとも８５％の同一性を有する。さらに別の実施形態では、機能性類縁体は、元のアミノ酸配列との少なくとも９０％の同一性を有する。
Ｔｈエピトープペプチドの機能性免疫学的類縁体も有効であり、本発明の一部として含まれる。機能性免疫学的Ｔｈ類縁体は、ＴｈエピトープのＴｈ刺激機能を本質的に改変しないＴｈエピトープにおける１～約５アミノ酸残基の保存的置換、付加、欠失及び挿入を含み得る。保存的置換、付加及び挿入は、Ｓ－ＲＢＤ Ｂ細胞エピトープペプチドについて上に記載したような天然または非天然アミノ酸を使用して成し遂げられ得る。表６は、Ｔｈエピトープペプチドの機能性類縁体の別の変形形態を明らかにしている。特に、ＭｖＦ１及びＭｖＦ２ Ｔｈの配列番号５４及び５５は、各々Ｎ及びＣ末端にある２つのアミノ酸の欠失（配列番号５４及び５５）または組入れ（配列番号６２～６４及び６５）によってアミノ酸枠が異なっているという点で、それぞれＭｖＦ４及びＭｖＦ５の配列番号６２～６４及び６５の機能性類縁体である。これらの２つの系統の類縁体配列の違いは、これらの配列の中に含有されるＴｈエピトープの機能に影響を及ぼさないであろう。したがって、機能性免疫学的Ｔｈ類縁体は、麻疹ウイルス融合タンパク質ＭｖＦ１～４（配列番号５４～６４）及び肝炎表面タンパク質ＨＢｓＡｇ１～３ Ｔｈ（配列番号６７～７６）に由来するＴｈエピトープのいくつかの変化形態を含む。
２．組成物
本開示は、本開示のＳ－ＲＢＤ免疫原ペプチド構築物を含む組成物も提供する。
ａ．ペプチド組成物
本開示のＳ－ＲＢＤペプチド免疫原構築物を含有する組成物は、液体または固体／凍結乾燥形態であり得る。液体組成物は、Ｓ－ＲＢＤペプチド免疫原構築物の構造的または機能的特性を変化させない水、緩衝剤、溶媒、塩及び／または他の任意の許容可能な試薬を含み得る。ペプチド組成物は、本開示のＳ－ＲＢＤペプチド免疫原構築物の１つ以上を含有し得る。
ｂ．医薬組成物
本開示は、本開示のＳ－ＲＢＤペプチド免疫原構築物を含有する医薬組成物にも関する。
医薬組成物は、薬学的に許容される送達システムにおいて、担体及び／または他の添加剤を含有し得る。したがって、医薬組成物は、薬学的有効量のＳ－ＲＢＤペプチド免疫原構築物を、薬学的に許容される担体、アジュバント及び／または他の賦形剤、例えば、希釈剤、添加剤、安定化剤、保存剤、可溶化剤、緩衝剤などと一緒に含有し得る。
医薬組成物は、いかなる特異的な抗原性作用もそれ自体が有することなくＳ－ＲＢＤペプチド免疫原構築物に対する免疫応答を加速、延長または増強するように作用する１つ以上のアジュバントを含有し得る。医薬組成物に使用されるアジュバントは、油、油エマルジョン、アルミニウム塩、カルシウム塩、免疫刺激複合体、細菌性及びウイルス性派生物、ビロソーム、炭水化物、サイトカイン、高分子微粒子を含み得る。ある特定の実施形態では、アジュバントは、ミョウバン（リン酸アルミニウムカリウム）、リン酸アルミニウム（例えばＡＤＪＵ－ＰＨＯＳ（登録商標））、水酸化アルミニウム（例えばＡＬＨＹＤＲＯＧＥＬ（登録商標））、リン酸カルシウム、不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）、フロイント完全アジュバント、ＭＦ５９、アジュバント６５、Ｌｉｐｏｖａｎｔ、ＩＳＣＯＭ、リポシン、サポニン、スクアレン、Ｌ１２１、ＥＭＵＬＳＩＧＥＮ（登録商標）、ＥｍｕｌｓＩＬ－６ｎ（登録商標）、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）、Ｑｕｉｌ Ａ、ＱＳ２１、ＭＯＮＴＡＮＩＤＥ（登録商標）ＩＳＡ３５、ＩＳＡ５０Ｖ、ＩＳＡ５０Ｖ２、ＩＳＡ５１、ＩＳＡ２０６、ＩＳＡ７２０、リポソーム、ホスホリピド、ペプチドグリカン、リポ多糖（ＬＰＳ）、ＡＳＯ１、ＡＳＯ２、ＡＳＯ３、ＡＳＯ４、ＡＦ０３、親油性リン脂質（リピドＡ）、ガンマイヌリン、アルガムリン、グルカン、デキストラン、クルコマンナン、ガラクトマンナン、レバン、キシラン、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡ）、ならびにその他のアジュバント及び乳化剤から選択され得る。
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、ＭＯＮＴＡＮＩＤＥ（商標）ＩＳＡ５１（油中水型エマルジョンを製造するための、植物油及びオレイン酸マンニドで構成される油アジュバント組成物）、ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０（別名：ポリソルベート８０またはポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレエート）、ＣｐＧオリゴヌクレオチド及び／またはその任意の組合せを含有する。他の実施形態では、医薬組成物は、アジュバントとしてＥＭＵＬＳＩＧＥＮまたはＥＭＵＬＳＩＧＥＮ Ｄを含んだ水中油中水（すなわちｗ／ｏ／ｗ）型エマルジョンである。
医薬組成物は、薬学的に許容される添加剤または賦形剤も含み得る。例えば、医薬組成物は、酸化防止剤、結合剤、緩衝剤、増量剤、担体、キレート剤、着色剤、希釈剤、崩壊剤、乳化剤、フィラー、ゲル化剤、ｐＨ緩衝剤、保存剤、可溶化剤、安定化剤などを含有し得る。
医薬組成物は、即放性または持続放出性製剤として製剤化され得る。加えて、医薬組成物は、免疫原捕捉及び微粒子との共投与によって全身の、または限局された粘膜の免疫性を誘導するために製剤化され得る。そのような送達システムは、当業者によって容易に決定される。
医薬組成物は、液体溶液か懸濁液かのどちらかとしての注射剤として調製され得る。Ｓ－ＲＢＤペプチド免疫原構築物を含有する液体ビヒクルを注射前に調製してもよい。医薬組成物は、任意の好適な適用様式、例えば、皮内、静脈内、腹腔内、筋肉内、鼻腔内、経口、皮下などによって、及び任意の好適な送達装置で投与され得る。ある特定の実施形態では、医薬組成物は、皮下、皮内または筋肉内投与のために製剤化される。経口及び鼻腔内への適用を含めた他の投与様式に適する医薬組成物も調製され得る。
医薬組成物は、好適な単位剤形としても製剤化され得る。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、体重１ｋｇあたり約０．１μｇ～約１ｍｇのＳ－ＲＢＤペプチド免疫原構築物を含有する。医薬組成物の有効用量は、投与手段、標的部位、患者の生理学的状態、患者がヒトであるのかそれとも動物であるのか、他の投与される医薬、及び治療が予防的であるのかそれとも治療的であるのかを含めた多くの異なる因子によって様々である。通例、患者はヒトであるが、遺伝子導入哺乳動物を含めた非ヒト哺乳動物も治療され得る。複数回用量で送達する場合、医薬組成物は、単位剤形１つあたりの適切な量に好都合に分割され得る。投与する投薬量は、治療分野ではよく知られているように、対象の年齢、体重及び全身の健康状態によって決まることになる。
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、１つよりも多いＳ－ＲＢＤペプチド免疫原構築物を含有する。構築物の免疫有効性の相乗的増強を可能にするための、１つよりも多いＳ－ＲＢＤペプチド免疫原構築物の混合物を含有する医薬組成物。１つよりも多いＳ－ＲＢＤペプチド免疫原構築物を含有する医薬組成物は、ＭＨＣクラスＩＩ適用範囲が広いので、より大きな遺伝的集団においてより効果的であり得、したがって、Ｓ－ＲＢＤペプチド免疫原構築物に対する改善された免疫応答をもたらし得る。
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、表８の配列番号１０７～１４４、ならびにその相同体、類縁体及び／または組合せから選択されるＳ－ＲＢＤペプチド免疫原構築物を含有し得る。
ある特定の実施形態では、組合せ形態でＭｖＦ及びＨＢｓＡｇに由来する異種Ｔｈエピトープ（配列番号５９～６１、６７～７２）を有するＳ－ＲＢＤペプチド免疫原構築物（配列番号１２６及び１２７）は、多様な遺伝的背景を有する宿主集団を最大限に網羅することを可能にするための製剤に使用するために、等モル比で混合され得る。
さらに、（例えば、ＵＢＩＴｈ（登録商標）１、配列番号１０７～１１６を利用した）Ｓ－ＲＢＤペプチド免疫原構築物によって誘発される抗体応答は、免疫原性増強のために採用された異種Ｔｈエピトープに指向されることがあったとしてもあまりない状態で、大部分（９０％超）がＳ－ＲＢＤのＢ細胞エピトープペプチドに対する所望の交差反応性に集中する。これは、そのようなＳ－ＲＢＤペプチド免疫原性増強のために使用される従来のタンパク質、例えばＫＬＨ、または他の生物学的タンパク質担体とは実に対照的である。
他の実施形態では、例えばＳ－ＲＢＤペプチド免疫原構築物の混合物の、ペプチド組成物を、懸濁液製剤を形成するためのアジュバントとしてのミョウバンゲル（ＡＬＨＹＤＲＯＧＥＬ）またはリン酸アルミニウム（ＡＤＪＵＰＨＯＳ）を含めた無機塩と接触した状態で含む医薬組成物が、宿主への投与のために使用された。
Ｓ－ＲＢＤペプチド免疫原構築物を含有する医薬組成物は、投与によって宿主において免疫応答を誘発する及び抗体を産生するために使用され得る。
ｃ．内因性ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｔｈ及びＣＴＬエピトープペプチドも含有する医薬組成物
Ｓ－ＲＢＤペプチド免疫原構築物を含有する医薬組成物は、ペプチド免疫原構築物とは別個の（つまり、それに共有結合で連結されていない）内因性ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｔヘルパーエピトープペプチド及び／またはＣＴＬエピトープペプチドも含み得る。医薬製剤／ワクチン製剤におけるＴｈ及びＣＴＬエピトープの存在は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染からの保護に相関するものである抗原特異的なＴ細胞活性化を開始することによって、処置された対象における免疫応答の初回刺激となる。加えて、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２からのタンパク質の上に提示される入念に選定された内因性Ｔｈエピトープ及び／またはＣＴＬエピトープを含む製剤は、多様な遺伝的性質を有する対象を治療及び保護する上で製剤を有効にするものでもある広範な細胞媒介免疫性を生じさせ得る。
Ｓ－ＲＢＤペプチド免疫原構築物を含有する医薬組成物の中に、内因性ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｔｈエピトープ及び／またはＣＴＬエピトープを含有する１つ以上の別個のペプチドを含むことはペプチドを互いに近接させるが、これは、エピトープが抗原提示Ｂ細胞、マクロファージ、受容細胞などに見つけられてプロセシングされることを可能にする。これらの細胞は抗原をプロセシングし、それを表面に提示して、抗体を生み出すため及びＴ細胞にウイルス感染細胞の殺滅の媒介を助けるさらなるＴ細胞応答を誘発させるためにＢ細胞と接触する。
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、Ｓ－ＲＢＤペプチド免疫原構築物とは別個の１つ以上の内因性ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｔｈエピトープペプチドを含有する。ある特定の実施形態では、内因性ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｔｈエピトープペプチドは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＮタンパク質またはＳタンパク質からのものである。具体的な実施形態では、内因性ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｔｈエピトープペプチドは、配列番号１３、３９～４１及び４４（表５）、配列番号１６１～１６５（表８）、ならびにその任意の組合せからなる群から選択される。配列番号１６１～１６５（表８）の内因性ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｔｈエピトープペプチドはそれぞれ配列番号３９、４０、４４、４１及び１３の配列に対応するが、Ｎ末端にＬｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ（ＫＫＫ）尾部を含有する。配列番号１６１～１６５の内因性Ｔｈエピトープは、ＣｐＧオリゴヌクレオチド（ＯＤＮ）との免疫刺激複合体として製剤化された医薬組成物に使用する場合に特に有用である、というのも、カチオン性ＫＫＫ尾部は静電会合によってＣｐＧ ＯＤＮと相互作用することができるからである。ペプチド免疫原構築物における内因性ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｔｈエピトープの使用はＳ－ＲＢＤ Ｂ細胞エピトープペプチドの免疫原性を増強して、設計の論理的根拠に基づいてスクリーニング及び選抜された最適化Ｓ－ＲＢＤ Ｂ細胞エピトープペプチドに指向される特異的な高力価抗体の、感染後の産生を容易にし得る。
他の実施形態では、医薬組成物は、Ｓ－ＲＢＤペプチド免疫原構築物とは別個の１つ以上の内因性ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＣＴＬエピトープペプチドを含有する。ある特定の実施形態では、内因性ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＣＴＬエピトープペプチドは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＮタンパク質またはＳタンパク質からのものである。具体的な実施形態では、内因性ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＣＴＬエピトープペプチドは、配列番号９～１２、１４～１６、１９、３５～３６、４２～４３、４５～４８（表４）、配列番号１４５～１６０（表８）、ならびにその任意の組合せからなる群から選択される。配列番号１４５～１６０の内因性ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＣＴＬエピトープペプチドはそれぞれ配列番号４５、４２、４６、３６、４８、４３、４７、３５、１２、１１、１０、１４、１９、９、１６及び１５の配列に対応するが、Ｎ末端にＬｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ（ＫＫＫ）尾部を含有する。配列番号１４５～１６０の内因性ＣＴＬエピトープは、ＣｐＧオリゴヌクレオチド（ＯＤＮ）との免疫刺激複合体として製剤化された医薬組成物に使用する場合に特に有用である、というのも、カチオン性ＫＫＫ尾部は静電会合によってＣｐＧ ＯＤＮと相互作用することができるからである。ペプチド免疫原構築物における内因性ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＣＴＬエピトープの使用はＳ－ＲＢＤ Ｂ細胞エピトープペプチドの免疫原性を増強して、設計の論理的根拠に基づいてスクリーニング及び選抜された最適化Ｓ－ＲＢＤ Ｂ細胞エピトープペプチドに指向される特異的な高力価抗体の、感染後の産生を容易にし得る。
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、１つ以上のＳ－ＲＢＤペプチド免疫原構築物（配列番号１０７～１４４またはその任意の組合せ）を、内因性ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｔｈエピトープペプチド（配列番号１３、３９～４１、４４、１６１～１６５またはその任意の組合せ）及び／または内因性ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＣＴＬエピトープペプチド（配列番号９～１２、１４～１６、１９、３５～３６、４２～４３、４５～４８、１４５～１６０またはその任意の組合せ）を含有する１つ以上の別個のペプチドと一緒に含有する。
ｄ．免疫刺激複合体
本開示は、Ｓ－ＲＢＤペプチド免疫原構築物をＣｐＧオリゴヌクレオチドとの免疫刺激複合体の形態で含有する医薬組成物にも関する。そのような免疫刺激複合体は、アジュバント及び／またはペプチド免疫原安定化剤として作用する上で特に適合している。免疫刺激複合体は、Ｓ－ＲＢＤペプチド免疫原を免疫系の細胞に効率的に提示して免疫応答を生じさせることができる微粒子の形態である。免疫刺激複合体は、非経口投与のための懸濁剤として製剤化され得る。免疫刺激複合体は、非経口投与後の宿主の免疫系の細胞へのＳ－ＲＢＤペプチド免疫原構築物の効率的送達のために無機塩または系中ゲル化ポリマーと組み合わせて懸濁剤として、油中水（ｗ／ｏ）型エマルジョンの形態にも製剤化され得る。
安定化免疫刺激複合体は、静電会合によってＳ－ＲＢＤペプチド免疫原構築物をアニオン性分子、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチドまたはその組合せと複合体化することによって形成され得る。安定化免疫刺激複合体は、免疫原送達システムとして医薬組成物に組み込まれ得る。
ある特定の実施形態では、Ｓ－ＲＢＤペプチド免疫原構築物は、５．０～８．０の範囲のｐＨにおいて正に帯電するカチオン性部分を含有するように設計される。Ｓ－ＲＢＤペプチド免疫原構築物または構築物の混合物のカチオン性部分の正味の電荷は、配列内のリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）またはヒスチジン（Ｈ）の各々に＋１の電荷を、アスパラギン酸（Ｄ）またはグルタミン酸（Ｅ）の各々に－１の電荷を、ならびにその他のアミノ酸に０の電荷を割り当てることによって算出される。Ｓ－ＲＢＤペプチド免疫原構築物のカチオン性部分の中で電荷を合計し、正味の平均電荷として表す。好適なペプチド免疫原は、正味の平均電荷が＋１であるカチオン性部分を有する。好ましくは、ペプチド免疫原は、＋２よりも大きい範囲の正味の正電荷を有する。いくつかの実施形態では、Ｓ－ＲＢＤペプチド免疫原構築物のカチオン性部分は異種スペーサーである。ある特定の実施形態では、Ｓ－ＲＢＤペプチド免疫原構築物のカチオン性部分は、スペーサー配列が（α，ε－Ｎ）Ｌｙｓ、（α，ε－Ｎ）－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ（配列番号１０１）またはＬｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－ε－Ｎ－Ｌｙｓ（配列番号１０２）である場合に＋４の電荷を有する。
本明細書に記載の「アニオン性分子」は、５．０～８．０の範囲において負に帯電する任意の分子を指す。ある特定の実施形態では、アニオン性分子はオリゴマーまたはポリマーである。オリゴマー上またはポリマー上の正味の負電荷は、オリゴマー中の各ホスホジエステルまたはホスホロチオエート基に－１の電荷を割り当てることによって算出される。好適なアニオン性オリゴヌクレオチドは、８～６４個のヌクレオチド塩基を有しＣｐＧモチーフの繰り返し回数が１～１０の範囲である一本鎖ＤＮＡ分子である。好ましくは、ＣｐＧ免疫刺激性一本鎖ＤＮＡ分子は、１８～４８個のヌクレオチド塩基を含有し、ＣｐＧモチーフの繰り返し回数が３～８の範囲である。
より好ましくは、アニオン性オリゴヌクレオチドは、式５’Ｘ１ＣＧＸ２３’によって表され、式中のＣ及びＧは非メチル化されており、Ｘ１は、Ａ（アデニン）、Ｇ（グアニン）及びＴ（チミン）からなる群から選択され、Ｘ２はＣ（シトシン）またはＴ（チミン）である。または、アニオン性オリゴヌクレオチドは、式５’（Ｘ３）２ＣＧ（Ｘ４）２３’によって表され、式中のＣ及びＧは非メチル化であり、Ｘ３は、Ａ、ＴまたはＧからなる群から選択され、Ｘ４はＣまたはＴである。具体的な実施形態では、ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、ＣｐＧ１：５’ＴＣｇＴＣｇＴＴＴＴｇＴＣｇＴＴＴＴｇＴＣｇＴＴＴＴｇＴＣｇＴＴ３’（完全にホスホロチオエート化された）（配列番号１０４）、ＣｐＧ２：５’ホスフェートＴＣｇＴＣｇＴＴＴＴｇＴＣｇＴＴＴＴｇＴＣｇＴＴ３’（完全にホスホロチオエート化されたもの）（配列番号１０５）、またはＣｐＧ３ ５’ＴＣｇＴＣｇＴＴＴＴｇＴＣｇＴＴＴＴｇＴＣｇＴＴ３’（完全にホスホロチオエート化されたもの）（配列番号１０６）の配列を有する。
結果として得られる免疫刺激複合体は、径が典型的には１～５０ミクロンの範囲である粒子の形態であり、相対電荷化学量論及び相互作用種の分子量を含めた多くの因子の関数である。微粒子化された免疫刺激複合体は、生体内で特定の免疫応答の補助及び上方制御を提供するという利点を有する。加えて、安定化免疫刺激複合体は、油中水型エマルジョン、無機塩懸濁液及びポリマーゲルを含めた医薬組成物を様々なプロセスによって調製するのに適している。
本開示は、ＣＯＶＩＤ－１９の予防及び／または治療のための、製剤を含めた医薬組成物にも関する。いくつかの実施形態では、安定化免疫刺激複合体を含む医薬組成物は、ＣｐＧオリゴマーを、Ｓ－ＲＢＤペプチド免疫原構築物（配列番号１０７～１４４）の混合物を含有するペプチド組成物と混合することによって静電会合によって形成されるものであるが、Ｓ－ＲＢＤペプチド免疫原構築物の免疫原性をさらに増強し、配列番号２２６のＳ－ＲＢＤ結合部位またはその断片、例えば配列番号２６との交差反応性を有する抗体を誘発する。
さらに他の実施形態では、医薬組成物は、高い安全率を有するアジュバントとしてのミョウバンゲル（ＡＬＨＹＤＲＯＧＥＬ）またはリン酸アルミニウム（ＡＤＪＵＰＨＯＳ）を含めた無機塩と任意選択的に混合されて宿主への投与のための懸濁液製剤を形成した状態で、Ｓ－ＲＢＤペプチド免疫原構築物の混合物（配列番号１０７～１４４の任意の組合せ）をＣｐＧオリゴマーとの安定化免疫刺激複合体の形態で含有する。
３．抗体
本開示は、Ｓ－ＲＢＤペプチド免疫原構築物によって誘発される抗体も提供する。
本開示は、免疫化された宿主において高い奏効者率でＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する高力価の中和抗体を誘発すること及びＳ－ＲＢＤのその受容体ＡＣＥ２に対する結合を阻害することができる、製造時の費用対効果が高くデザインが最適であるＳ－ＲＢＤペプチド免疫原構築物及びその製剤を提供する。いくつかの実施形態では、抗体を誘発するためのＳ－ＲＢＤペプチド免疫原構築物は、病原性タンパク質に由来する異種Ｔｈエピトープ、例えば麻疹ウイルス融合（ＭＶＦ）タンパク質など（例えば表６の配列番号４９～１００）及び／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来内因性Ｔｈエピトープ（表５の配列番号１３、３９～４１及び４４、ならびに表８の配列番号１６１～１６５）に任意選択の異種スペーサーを介して連結された完全長Ｓ－ＲＢＤ（配列番号２２６）の中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ４８０～５０９領域（配列番号２６）の周辺にあるＳ－ＲＢＤ部位を対象とするＳ－ＲＢＤペプチドのハイブリッドを含む。Ｓ－ＲＢＤペプチド免疫原構築物のＢ細胞エピトープ及びＴｈエピトープペプチドは、完全長Ｓ－ＲＢＤ部位（配列番号２２６）またはその断片（例えば配列番号２６）との交差反応性を有する高度に特異的な抗体の生成を刺激するように一緒に作用する。
ペプチドを、担体タンパク質、例えば、Ｋｅｙｈｏｌｅ Ｌｉｍｐｅｔ Ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ（ＫＬＨ）または他の担体タンパク質、例えばジフテリアトキソイド（ＤＴ）及び破傷風トキソイド（ＴＴ）タンパク質に対する化学的カップリングなどによって免疫的に強化するための従来の方法は、典型的に、担体タンパク質に指向される大量の抗体の生成を招く。したがって、そのようなペプチド－担体タンパク質組成物の主要な欠陥は、免疫原によって生み出される抗体の大部分（９０％超）が、担体タンパク質ＫＬＨ、ＤＴまたはＴＴに指向される非機能性抗体であり、それがエピトープ抑制を招く、ということである。
ペプチドを免疫的に強化する従来の方法とは違って、本開示のＳ－ＲＢＤペプチド免疫原構築物（例えば配列番号１０７～１４４）によって生み出された抗体は、抗体が異種Ｔｈエピトープ（例えば配列番号４９～１００）、内因性ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｔｈエピトープ（配列番号１３、３９～４１、４４及び１６１～１６５）または任意選択の異種スペーサーに指向されることがあったとしてもほとんどない状態で、完全長Ｓ－ＲＢＤ部位（配列番号２２６）またはその断片（配列番号２６）に高い特異性で結合することができる。
４．方法
本開示は、Ｓ－ＲＢＤペプチド免疫原構築物、組成物及び医薬組成物を作る及び使用する方法にも関する。
ａ．Ｓ－ＲＢＤペプチド免疫原構築物を製造する方法
本開示のＳ－ＲＢＤペプチド免疫原構築物は、当業者によく知られている化学的合成法によって作られ得る（例えば、Fields, G. B., et al., 1992を参照されたい）。Ｓ－ＲＢＤペプチド免疫原構築物は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓペプチド合成装置モデル４３０Ａまたは４３１で側鎖保護アミノ酸を使用してｔ－ＢｏｃかＦ－ｍｏｃかのどちらかの化学によってα－ＮＨ２を保護して固相合成の自動化メリフィールド技術を用いて合成され得る。Ｔｈエピトープのためのコンビナトリアルライブラリーペプチドを含むＳ－ＲＢＤペプチド免疫原構築物の調製は、所与の可変位置でのカップリングのための代替アミノ酸の混合物を供給することによって成し遂げられ得る。
所望のＳ－ＲＢＤペプチド免疫原構築物の組立てが完了した後、ペプチドを樹脂から切り離すために樹脂が標準的手順に従って処理され得、アミノ酸側鎖上の官能基が脱保護され得る。遊離ペプチドは、ＨＰＬＣによって精製され得、生化学的に、例えばアミノ酸分析または配列決定によって、特性評価され得る。ペプチドの精製及び特性評価の方法は、当業者によく知られている。
この化学プロセスによって生産されたペプチドの品質は制御及び規定され得、結果としてＳ－ＲＢＤペプチド免疫原構築物の再現性、免疫原性及び収率が保証される。固相ペプチド合成によるＳ－ＲＢＤペプチド免疫原構築物の製造についての詳細な説明は実施例１に示される。
意図した免疫学的活性の保持を可能にする構造可変性の範囲は、小分子薬による特異的な薬物活性、または生物由来薬物と共生産される大分子にみられる所望の活性及び望ましくない毒性の保持のために許容される構造可変性の範囲よりもはるかに寛容であることが見出された。
このため、ペプチド類縁体は、意図的に設計されたものであろうと、合成プロセスのエラーによってクロマトグラフィー的及び免疫学的特性が意図したペプチドに類似している欠失配列副生成物の混合物として不可避的に生成したものであろうと、所望のペプチドの精製された調製物と同じくらい有効であることが頻繁にある。設計された類縁体と意図しない類縁体との混合物は、これらのペプチドを採用する最終生成物の再現性及び有効性を保証するように製造プロセス及び生成物評価プロセスを両方とも監視する鑑識的ＱＣ手順が開発される限りにおいて有効である。
Ｓ－ＲＢＤペプチド免疫原構築物は、核酸分子、ベクター及び／または宿主細胞を含む組換えＤＮＡ技術を用いても作られ得る。よって、Ｓ－ＲＢＤペプチド免疫原構築物及びその免疫学的機能性類縁体をコードする核酸分子も本発明の一部として本開示に包含される。同様に、核酸分子を含むベクター、例えば発現ベクター、及びベクターを含有する宿主細胞も、本発明の一部として本開示に包含される。
様々な例示的実施形態は、Ｓ－ＲＢＤペプチド免疫原構築物及びその免疫学的機能性類縁体を生産する方法も包含する。例えば、方法は、Ｓ－ＲＢＤペプチド免疫原構築物及び／またはその免疫学的機能性類縁体をコードする核酸分子を含有する発現ベクターを含有する宿主細胞を、ペプチド及び／または類縁体が発現するような条件の下でインキュベートするステップを含み得る。より長い合成ペプチド免疫原は、既知の組換えＤＮＡ技術によって合成され得る。そのような技術は、よく知られている標準的マニュアルの中に詳細なプロトコールと共に提供されている。本発明のペプチドをコードする遺伝子を構築するためには、アミノ酸配列を逆翻訳して、アミノ酸配列をコードしており好ましくは遺伝子を発現させる生物にとって最適なコドンを有している核酸配列を得る。次いで、典型的にはペプチド及び任意の調節エレメントを必要に応じてコードするオリゴヌクレオチドを合成することによって、合成遺伝子を作る。合成遺伝子を好適なクローニングベクターに挿入し、宿主細胞にトランスフェクトする。その後、選択された発現システム及び宿主に適した条件の下でペプチドを発現させる。標準的方法によってペプチドを精製及び特性評価する。
ｂ．免疫刺激複合体を製造する方法
様々な例示的実施形態は、Ｓ－ＲＢＤペプチド免疫原構築物及びＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）分子を含む免疫刺激複合体を生産する方法も包含する。安定化免疫刺激複合体（ＩＳＣ）は、Ｓ－ＲＢＤペプチド免疫原構築物のカチオン性部分、及びポリアニオン性ＣｐＧ ＯＤＮ分子に由来する。電荷の静電中和によって、自己組織化する体制が促される。Ｓ－ＲＢＤペプチド免疫原構築物のアニオン性オリゴマーに対するカチオン性部分のモル電荷比の化学量論が会合の程度を決定する。Ｓ－ＲＢＤペプチド免疫原構築物とＣｐＧ ＯＤＮとの非共有結合的静電会合は、完全に再現可能なプロセスである。ペプチド／ＣｐＧ ＯＤＮ免疫刺激複合体は凝集するが、これが免疫系の「プロフェッショナルな」抗原提示細胞（ＡＰＣ）への提示を容易にし、かくして複合体の免疫原性をさらに増強する。これらの複合体は、製造中の品質管理のための特性評価が簡単である。ペプチド／ＣｐＧ ＩＳＣは生体内で良好に忍容される。ＣｐＧ ＯＤＮ及びＳ－ＲＢＤペプチド免疫原構築物を含むこの新規微粒子システムは、ＣｐＧ ＯＤＮの使用と関連付いた汎用化されたＢ細胞分裂促進性を利用するように、及び均衡のとれたＴｈ－１／Ｔｈ－２型応答を促進するように設計される。
本開示の医薬組成物の中のＣｐＧ ＯＤＮは、反対電荷の静電中和によって媒介されるプロセスにおいて免疫原に１００％結合してミクロンサイズの微粒子の形成をもたらす。微粒子形態は、ＣｐＧアジュバントの従来の使用から大幅に低減されたＣｐＧの投薬量を可能にし、有害な自然免疫応答の可能性をより低くし、抗原提示細胞（ＡＰＣ）を含む代替免疫原プロセシング経路を容易にする。結果として、そのような製剤は概念的に新しく、代替機序による免疫応答の刺激を促進することによって潜在的利点を提供する。
ｃ．医薬組成物を製造する方法
様々な例示的実施形態は、Ｓ－ＲＢＤペプチド免疫原構築物を含有する医薬組成物も包含する。ある特定の実施形態では、医薬組成物は、油中水型エマルジョン、及び無機塩を使用した懸濁液を採用する。
大きな集団によって使用される医薬組成物のためには、安全性がもう１つの重要な考慮因子になる。多くの臨床試験において油中水型エマルジョンが使用されているにもかかわらず、ミョウバンはその安全性ゆえに、製剤に使用するための主要なアジュバントであり続けている。それゆえ、ミョウバンまたはその無機塩であるリン酸アルミニウム（ＡＤＪＵＰＨＯＳ）は、臨床用途のための調製物においてアジュバントとして頻繁に使用される。
他のアジュバント及び免疫刺激剤としては、３Ｄｅ－Ｏ－アシル化モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）または３－ＤＭＰ、高分子型または単量体型アミノ酸、例えばポリグルタミン酸またはポリリジンが挙げられる。そのようなアジュバントは、他の特定の免疫刺激剤、例えば、ムラミルペプチド（例えば、Ｎ－アセチルムラミル－Ｌ－スレオニル－Ｄ－イソグルタミン（ｔｈｒ－ＭＤＰ）、Ｎ－アセチル－ノルムラミル－Ｌ－アラニル－Ｄ－イソグルタミン（ｎｏｒ－ＭＤＰ）、Ｎ－アセチルムラミル－Ｌ－アラニル－Ｄ－イソグルタミニル－Ｌ－アラニン－２－（１’－２’ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ヒドロキシホスホリルオキシ）－エチルアミン（ＭＴＰ－ＰＥ）、Ｎ－アセチルグルコサミニル－Ｎ－アセチルムラミル－Ｌ－Ａｌ－Ｄ－イソグル－Ｌ－Ａｌａ－ジパルミトイルプロピルアミド（ＤＴＰ－ＤＰＰ）ＴＨＥＲＡＭＩＤＥ（商標））または他の細菌細胞壁構成物質を伴ってまたは伴わずに使用され得る。水中油型エマルジョンとしては、マイクロフルイダイザーを使用してサブミクロンの粒子として製剤化された、５％のスクアレン、０．５％のＴＷＥＥＮ８０及び０．５％のＳｐａｎ８５を含有する（任意選択的に様々な量のＭＴＰ－ＰＥを含有する）ＭＦ５９（Van Nest, G., et al.のＷＯ１９９０／０１４８３７を参照されたく、これをもって参照によりその全体を援用する）；サブミクロンのエマルジョンとして微小流体化されたかあるいはボルテックス処理されて大粒径エマルジョンを生成した、１０％のスクアレン、０．４％のＴＷＥＥＮ８０、５％のプルロニック遮断ポリマーＬ１２１及びｔｈｒ－ＭＤＰを含有するＳＡＦ；ならびに２％のスクアレンと、０．２％のＴＷＥＥＮ８０と、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）、トレハロースジミコラート（ＴＤＭ）及び細胞壁骨格（ＣＷＳ）、好ましくはＭＰＬ＋ＣＷＳ（Ｄｅｔｏｘ（商標））からなる群から選択される１つ以上の細菌細胞壁構成物質とを含有するＲＩＢＩ（商標）アジュバント系（ＲＡＳ）（ＲＩＢＩ ＩｍｍｕｎｏＣｈｅｍ，Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ｍｏｎｔ．）が挙げられる。他のアジュバントとしては、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）、不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）、ならびにサイトカイン、例えば、インターロイキン（ＩＬ－１、ＩＬ－２及びＩＬ－１２）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ－ＣＳＦ）及び腫瘍壊死因子（ＴＮＦ－α）が挙げられる。
アジュバントの選択は、アジュバントを含有する免疫原性製剤の安定性、投与経路、投薬計画、免疫化しようとする種におけるアジュバントの有効性によって決まり、ヒトにおいては、薬学的に許容されるアジュバントは、関係する規制機関によってヒト投与が承認されたかまたは承認できるものとする。例えば、ミョウバン、ＭＰＬまたは不完全フロイントアジュバント（Chang, J. C. C., et al., 1998）、これをもって参照によりその全体を援用する）は、単独で、または任意選択的にその全ての組合せがヒト投与に適している。
組成物は、薬学的に許容される無毒の担体または希釈剤を含み得、これは、動物またはヒト投与のための医薬組成物を製剤化するために一般的に使用されるビヒクルとして定義される。希釈剤は、合剤の生物学的活性に影響を及ぼさないように選択される。そのような希釈剤の例は、蒸留水、リン酸緩衝生理食塩水、リンガー液、デキストロース溶液及びハンクス液である。加えて、医薬組成物または製剤は、他の担体、アジュバント、または無毒で非治療的な非免疫原性安定化剤なども含み得る。
医薬組成物は、大きな緩徐に代謝される巨大分子、例えば、タンパク質、多糖、例えばキトサン、ポリ乳酸、ポリグリコール酸及びコポリマー（例えば、ラテックス官能化セファロース、アガロース、セルロースなど）、高分子型アミノ酸、アミノ酸コポリマー、ならびに脂質凝集体（例えば油滴またはリポソーム）も含み得る。加えて、これらの担体は、免疫刺激剤（すなわちアジュバント）として機能し得る。
本発明の医薬組成物は、好適な送達ビヒクルをさらに含み得る。好適な送達ビヒクルとしては、ウイルス、細菌、生分解性マイクロスフェア、微粒子、ナノ粒子、リポソーム、コラーゲンミニペレット及び渦巻体が挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、１つ以上のＳ－ＲＢＤペプチド免疫原構築物（配列番号１０７～１４４またはその任意の組合せ）を、内因性ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｔｈエピトープペプチド（配列番号１３、３９～４１、４４及び１６１～１６５またはその任意の組合せ）を含有する１つ以上の別個のペプチド、及び／または内因性ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＣＴＬエピトープペプチド（配列番号９～１２、１４～１６、１９、３５～３６、４２～４３、４５～４８、１４５～１６０またはその任意の組合せ）と一緒に組み合わせることによって、ＣｐＧ ＯＤＮを含有する免疫刺激複合体の形態で調製される。
ｄ．医薬組成物を使用する方法
本開示には、Ｓ－ＲＢＤペプチド免疫原構築物を含有する医薬組成物を使用する方法も含まれる。
ある特定の実施形態では、Ｓ－ＲＢＤペプチド免疫原構築物を含有する医薬組成物は、ＣＯＶＩＤ－１９を予防及び／または治療するために使用され得る。
いくつかの実施形態では、方法は、薬理学的有効量のＳ－ＲＢＤペプチド免疫原構築物を含む医薬組成物の投与を、それを必要とする宿主において行うことを含む。ある特定の実施形態では、方法は、薬理学的有効量のＳ－ＲＢＤペプチド免疫原構築物を含む医薬組成物を温血動物（例えば、ヒト、サル、モルモット、マウス、ネコなど）に投与して、Ｓ－ＲＢＤの完全長配列（配列番号２２６）の中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ４８０～５０９領域（配列番号２６）の周辺にあるＳ－ＲＢＤ部位または他のコロナウイルス（例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶまたはＭＥＲＳ－ＣｏＶ）からのＳ－ＲＢＤ配列との交差反応性を有する高度に特異的な抗体を誘発することを含む。
ある特定の実施形態では、Ｓ－ＲＢＤペプチド免疫原構築物を含有する医薬組成物は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２による感染によって引き起こされるＣＯＶＩＤ－１９を予防するために使用され得る。
ｅ．試験管内での機能アッセイ及び生体内での概念実証研究
免疫化宿主においてＳ－ＲＢＤペプチド免疫原構築物によって誘発された抗体は、試験管内での機能アッセイに使用され得る。これらの機能アッセイは、限定されないが、
（１）ＥＬＩＳＡアッセイを含めた血清学的アッセイによる、Ｓ－ＲＢＤ（配列番号２２６）中のＳ－ＲＢＤ部位（配列番号２６）に対する試験管内での結合、
（２）Ｓ－ＲＢＤのその受容体ＡＣＥ２に対する結合の試験管内での阻害、
（３）宿主細胞のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２によって媒介される感染の試験管内での中和、
（４）動物モデルにおけるワクチン接種宿主のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２媒介感染症の生体内での予防
を含む。
５．具体的な実施形態
（１）約２０個以上のアミノ酸を有するＳ－ＲＢＤペプチド免疫原構築物であって、式：
（Ｔｈ）ｍ－（Ａ）ｎ－（Ｓ－ＲＢＤ Ｂ細胞エピトープペプチド）－Ｘ
または
（Ｓ－ＲＢＤ Ｂ細胞エピトープペプチド）－（Ａ）ｎ－（Ｔｈ）ｍ－Ｘ
または
（Ｔｈ）ｍ－（Ａ）ｎ－（Ｓ－ＲＢＤ Ｂ細胞エピトープペプチド）－（Ａ）ｎ－（Ｔｈ）ｍ－Ｘ
によって表され、
式中、
Ｔｈは異種Ｔヘルパーエピトープであり、
Ａは異種スペーサーであり、
（Ｓ－ＲＢＤ Ｂ細胞エピトープペプチド）は、Ｓ－ＲＢＤ（配列番号２２６）またはそのバリアントからの６～約３５アミノ酸残基を有するＢ細胞エピトープペプチドであり、
Ｘは、アミノ酸のα－ＣＯＯＨまたはα－ＣＯＮＨ２であり、
ｍは１～約４であり、
ｎは０～約１０である、
前記Ｓ－ＲＢＤペプチド免疫原構築物。
（２）前記Ｓ－ＲＢＤ Ｂ細胞エピトープペプチドが、配列番号２３～２４、２６～２７及び２９～３４からなる群から選択されるエピトープの局所的束縛を可能にする鎖内ジスルフィド結合を形成している、（１）に記載のＳ－ＲＢＤペプチド免疫原構築物。
（３）前記異種Ｔヘルパーが、配列番号４９～１００からなる群から選択される、（１）に記載のＳ－ＲＢＤペプチド免疫原構築物。
（４）前記Ｓ－ＲＢＤ Ｂ細胞エピトープペプチドが、配列番号２３～２４、２６～２７、２９～３４及び３１５～３１９からなる群から選択され、前記Ｔｈエピトープが、配列番号４９～１００からなる群から選択される、（１）に記載のＳ－ＲＢＤペプチド免疫原構築物。
（５）前記ペプチド免疫原構築物が、配列番号１０７～１４４からなる群から選択される、（１）に記載のＳ－ＲＢＤペプチド免疫原構築物。
（６）Ｓ－ＲＢＤペプチド免疫原構築物であって、
ａ．配列番号２２６のＳ－ＲＢＤ配列からの約６～約３５アミノ酸残基を含むＢ細胞エピトープ、
ｂ．配列番号４９～１００及びその任意の組合せからなる群から選択されるアミノ酸配列を含む異種Ｔヘルパーエピトープ、ならびに
ｃ．アミノ酸、Ｌｙｓ－、Ｇｌｙ－、Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－、（α、ε－Ｎ）Ｌｙｓ、ε－Ｎ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ（配列番号１０１）、Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－ε－Ｎ－Ｌｙｓ（配列番号１０２）及びＰｒｏ－Ｐｒｏ－Ｘａａ－Ｐｒｏ－Ｘａａ－Ｐｒｏ（配列番号１０３）ならびにその任意の組合せからなる群から選択される、任意選択の異種スペーサー
を含み、前記Ｂ細胞エピトープが直接、または任意選択の異種スペーサーを介して前記Ｔヘルパーエピトープに共有結合で連結されている、前記Ｓ－ＲＢＤペプチド免疫原構築物。
（７）前記Ｂ細胞エピトープが、配列番号２３～２４、２６～２７、２９～３４及び３１５～３１９からなる群から選択される、（６）に記載のＳ－ＲＢＤペプチド免疫原構築物。
（８）前記任意選択の異種スペーサーが、（α、ε－Ｎ）Ｌｙｓ、ε－Ｎ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ（配列番号１０１）、Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－ε－Ｎ－Ｌｙｓ（配列番号１０２）、またはＰｒｏ－Ｐｒｏ－Ｘａａ－Ｐｒｏ－Ｘａａ－Ｐｒｏ（配列番号１０３）であり、式中、Ｘａａは任意のアミノ酸である、（６）に記載のＳ－ＲＢＤペプチド免疫原構築物。
（９）前記Ｔヘルパーエピトープが前記Ｂ細胞エピトープのアミノまたはカルボキシル末端に共有結合で連結されている、（６）に記載のＳ－ＲＢＤペプチド免疫原構築物。
（１０）前記Ｔヘルパーエピトープが前記任意選択の異種スペーサーを介して前記Ｂ細胞エピトープのアミノまたはカルボキシルに共有結合で連結されている、（６）に記載のＳ－ＲＢＤペプチド免疫原構築物。
（１１）（１）に記載のＳ－ＲＢＤペプチド免疫原構築物を含む組成物。
（１２）医薬組成物であって、
ａ．（１）に記載のペプチド免疫原構築物、及び
ｂ．薬学的に許容される送達ビヒクル及び／またはアジュバント
を含む、前記医薬組成物。
（１３）ａ．前記Ｓ－ＲＢＤ Ｂ細胞エピトープペプチドが、配列番号２３～２４、２６～２７、２９～３４及び３１５～３１９からなる群から選択され、
ｂ．前記異種Ｔヘルパーエピトープが、配列番号４９～１００からなる群から選択され、
ｃ．前記異種スペーサーが、アミノ酸、Ｌｙｓ－、Ｇｌｙ－、Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－、（α、ε－Ｎ）Ｌｙｓ、ε－Ｎ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ（配列番号１０１）、Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－ε－Ｎ－Ｌｙｓ（配列番号１０２）及びＰｒｏ－Ｐｒｏ－Ｘａａ－Ｐｒｏ－Ｘａａ－Ｐｒｏ（配列番号１０３）、ならびにその任意の組合せからなる群から選択され、
前記Ｓ－ＲＢＤペプチド免疫原構築物が、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）と混合されて安定化免疫刺激複合体を形成する、
（１２）に記載の医薬組成物。
（１４）ａ．前記Ｓ－ＲＢＤペプチド免疫原構築物が、配列番号１０７～１４４からなる群から選択され、
前記Ｓ－ＲＢＤペプチド免疫原構築物が、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）と混合されて安定化免疫刺激複合体を形成する、
（１２）に記載の医薬組成物。
（１５）前記医薬組成物が、配列番号１３、３９～４１、４４、１６１～１６５またはその任意の組合せの内因性ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｔｈエピトープ配列を含有する別個のペプチドをさらに含有する、（１４）に記載の医薬組成物。
（１６）前記医薬組成物が、配列番号９～１２、１４～１６、１９、３５～３６、４２～４３、４５～４８、１４５～１６０またはその任意の組合せの内因性ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＣＴＬエピトープ配列を含有する別個のペプチドをさらに含有する、（１４）に記載の医薬組成物。
（１７）前記医薬組成物が、
ａ．配列番号１３、３９～４１、４４、１６１～１６５またはその任意の組合せの内因性ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｔｈエピトープ配列を含有する別個のペプチド、及び
ｂ．配列番号９～１２、１４～１６、１９、３５～３６、４２～４３、４５～４８、１４５～１６０またはその任意の組合せの内因性ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＣＴＬエピトープ配列を含有する別個のペプチド
をさらに含有する、（１４）に記載の医薬組成物。
（１８）動物においてＳ－ＲＢＤに対する抗体を生み出す方法であって、（１２）に記載の医薬組成物を前記動物に投与することを含む、前記方法。
（１９）動物においてＳ－ＲＢＤに対する抗体を生み出す方法であって、（１５）に記載の医薬組成物を前記動物に投与することを含む、前記方法。
（２０）動物においてＳ－ＲＢＤに対する抗体を生み出す方法であって、（１６）に記載の医薬組成物を前記動物に投与することを含む、前記方法。
（２１）動物においてＳ－ＲＢＤに対する抗体を生み出す方法であって、（１７）に記載の医薬組成物を前記動物に投与することを含む、前記方法。
（２２）配列番号２３～２４、２６～２７、２９～３４または２２６のアミノ酸配列に特異的に結合する、単離された抗体またはそのエピトープ結合性断片。
（２３）前記Ｓ－ＲＢＤペプチド免疫原構築物に結合している、（２２）に記載の単離された抗体またはそのエピトープ結合性断片。
（２４）（２２）に記載の単離された抗体またはそのエピトープ結合性断片を含む、組成物。
（２５）動物におけるＣＯＶＩＤ－１９を予防及び／または治療する方法であって、（１２）に記載の医薬組成物を前記動物に投与することを含む、前記方法。
（２６）動物におけるＣＯＶＩＤ－１９を予防及び／または治療する方法であって、（１５）に記載の医薬組成物を前記動物に投与することを含む、前記方法。
（２７）動物におけるＣＯＶＩＤ－１９を予防及び／または治療する方法であって、（１６）に記載の医薬組成物を前記動物に投与することを含む、前記方法。
（２８）動物におけるＣＯＶＩＤ－１９を予防及び／または治療する方法であって、（１７）に記載の医薬組成物を前記動物に投与することを含む、前記方法。
Ｃ．感染患者におけるＣＯＶＩＤ－１９の治療のための受容体に基づく抗ウイルス療法
本開示の緩和システムの第３の態様は、感染患者におけるＣＯＶＩＤ－１９の治療のための受容体に基づく抗ウイルス療法に関する。
本開示は、生物活性分子、及び免疫グロブリン分子の部分を含む、新規融合タンパク質に関する。本開示の様々な態様は、融合タンパク質、その組成物、ならびに本開示の融合タンパク質を作る及び使用する方法に関する。本開示の融合タンパク質は、生物において生物活性分子の血清中半減期を延ばすために有用である。
以下は、本発明を当業者が実施するのに役立てるために提供される詳細な説明である。当業者であれば、本明細書に明示的に記載される実施形態の、本明細書中に含有される情報の趣旨及び範囲から逸脱しない改変形態または変形形態が、本開示に包含されることを理解するであろう。説明の中で使用される専門用語は、特定の実施形態を説明するためのものであるにすぎず、本発明を限定することを意図していない。以下において使用される節の見出しは、構成上の目的のためのものであり、記載される主題を限定しているとみなされるべきでない。
１．融合タンパク質
本明細書中で使用する場合、「融合タンパク質」または「融合ポリペプチド」は、天然には通常見受けられないような連結され合い方をした少なくとも２つのタンパク質またはペプチドを含む、ハイブリッドタンパク質またはポリペプチドである。
本開示の一態様は、免疫グロブリン（Ｉｇ）Ｆｃ断片及び生物活性分子を含む融合タンパク質に関する。本開示の融合タンパク質に組み込まれた生物活性分子は、融合されていないかあるいは従来技術の融合タンパク質（例えば２本鎖Ｆｃ領域を含有する融合タンパク質）の中に組み込まれている同じ生物活性分子と比較して、改善された生物学的特性を有する。例えば、本開示の融合タンパク質に組み込まれた生物活性分子は、その非融合型対応物に比べてより長い血清中半減期を有する。加えて、本開示の融合タンパク質は、機能の低下を何ら伴うことなく生物活性分子の完全な生物学的活性を維持するが、このことは、二本鎖Ｆｃ領域からの立体障害のために活性が低下する従来技術の融合タンパク質に勝る改善点である。
本開示の融合タンパク質は、非融合型の生物活性分子、及び従来技術に記載された融合タンパク質に組み込まれた生物活性分子と比較して、生物活性分子に大きな生物学的利点を提供する。
本開示の融合タンパク質は、以下の式（図６Ａ～Ｄにも示す）のいずれか：
（Ｂ）－（ヒンジ）－（ＣＨ２－ＣＨ３）
または
（ＣＨ２－ＣＨ３）－（ヒンジ）－（Ｂ）
または
（Ｂ）－（Ｌ）ｍ－（ヒンジ）－（ＣＨ２－ＣＨ３）
または
（ＣＨ２－ＣＨ３）－（ヒンジ）－（Ｌ）ｍ－（Ｂ）
を有し得、
式中、
「Ｂ」は生物活性分子であり、
「ヒンジ」はＩｇＧ分子のヒンジ領域であり、
「ＣＨ２－ＣＨ３」はＩｇＧ重鎖のＣＨ２及びＣＨ３定常領域ドメインであり、
「Ｌ」は任意選択のリンカーであり、
「ｍ」は任意の整数または０である。
融合タンパク質の様々な部分／断片について以下にさらに論述する。
ａ．Ｆｃ領域及びＦｃ断片
本開示の融合タンパク質は、免疫グロブリン（Ｉｇ）分子からのＦｃ断片を含有する。
以下において使用する場合、「Ｆｃ領域」は、重鎖定常領域のｃ末端に位置する免疫グロブリンの部分を指す。Ｆｃ領域は、細胞表面受容体（Ｆｃ受容体）及び補体系の他のタンパク質と相互作用して免疫系の活性化を支援する免疫グロブリンの部分である。ＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＤアイソタイプでは、Ｆｃ領域は２つの重鎖ドメイン（ＣＨ２及びＣＨ３ドメイン）を含有する。ＩｇＭ及びＩｇＥアイソタイプでは、Ｆｃ領域は３つの重鎖定常ドメイン（ＣＨ２～ＣＨ４ドメイン）を含有する。Ｆｃ部分の境界は様々であり得るが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ部分は通例、残基Ｃ２２６またはＰ２３０からそのカルボキシル末端までを含むものと定義され、付番はＥＵインデックスに従うものである。
ある特定の実施形態では、融合タンパク質は、循環流中へと再利用され得るＦｃＲｎ結合性断片であるＣＨ２－ＣＨ３ドメインを含む。このドメインを有する融合タンパク質は、融合タンパク質の生体内での半減期の延長を示す。
本明細書中で使用する場合、「Ｆｃ断片」は、任意のアイソタイプからの免疫グロブリン分子のＦｃ領域に対応する融合タンパク質の部分を指す。いくつかの実施形態では、Ｆｃ断片はＩｇＧのＦｃ領域を含む。具体的な実施形態では、Ｆｃ断片はＩｇＧ１のＦｃ領域の完全長領域を含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃ断片は、当技術分野において特徴付けられ記述がなされた免疫グロブリン分子の完全長Ｆｃ領域を指す。他の実施形態では、Ｆｃ断片は、完全長Ｆｃ領域の部分または断片、例えば重鎖ドメインの部分（例えば、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメインなど）、及び／またはＦｃ領域内に典型的にみられるヒンジ領域を含む。例えば、Ｆｃ断片は、ＣＨ２ドメインの全てもしくは一部、及び／またはＣＨ３ドメインの全てもしくは一部を含み得る。いくつかの実施形態では、Ｆｃ断片は、完全長Ｆｃ領域またはその部分の機能性類縁体を含む。
本明細書中で使用する場合、「機能性類縁体」は、元の配列と実質的に同じ機能的特徴（結合認識、結合親和性など）を保持した、アミノ酸配列または核酸配列のバリアントを指す。機能性類縁体の例としては、元の配列と類似するがアミノ酸位置における保存的置換；全体電荷の変化；別の部分に対する共有結合；または小さな付加、挿入、欠失もしくは保存的置換、及び／またはその任意の組合せを含有する配列が挙げられる。Ｆｃ断片の機能性類縁体は、当技術分野で知られている任意の方法によって合成生産され得る。例えば、機能性類縁体は、既知のアミノ酸配列を部位特異的変異によるアミノ酸の付加、欠失及び／または置換によって改変することによって生産され得る。いくつかの実施形態では、機能性類縁体は、所与の配列と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を有する。２つの配列の間の同一性パーセントは標準的なアライメントアルゴリズム、例えばＣｌｕｓｔａｌＯｍｅｇａによって、２つの配列の最良のアライメントが当該アライメントアルゴリズムに従ってなされたときに、決定される。
免疫グロブリン分子は、任意の動物（例えば、ヒト、ウシ、ヤギ、ブタ、マウス、ウサギ、ハムスター、ラット、モルモット）から得られ得る、または由来し得る。加えて、免疫グロブリンのＦｃ断片は、任意のアイソタイプ（例えば、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧまたはＩｇＭ）、またはアイソタイプ内のサブクラス（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４）から得られ得る、または由来し得る。いくつかの実施形態ではＦｃ断片はＩｇＧから得られ、または由来し、特定の実施形態ではＦｃ断片はヒト化ＩｇＧを含めたヒトＩｇＧから得られる、または由来する。
Ｆｃ断片は、当技術分野で知られている任意の方法によって得られ得る、または生産され得る。例えば、Ｆｃ断片を動物から単離及び精製することもあるし、組換えによって発現させることもあるし、または合成によって生産することもある。いくつかの実施形態では、Ｆｃ断片は、核酸分子（例えばＤＮＡまたはＲＮＡ）にコードされ、細胞、生殖細胞系、ｃＤＮＡライブラリーまたはファージライブラリーから単離される。
Ｆｃ領域及び／またはＦｃ断片は、いくつかの免疫グロブリンアイソタイプ（ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＧ）にみられるヒンジ領域を含み得る。ある特定の実施形態では、Ｆｃ断片は、ヒンジ領域を、それがＣｙｓを全く含有せずジスルフィド結合を形成できないように変異させることによって、改変される。ヒンジ領域については以下にさらに論述される。
本開示の融合タンパク質のＦｃ断片は、好ましくは一本鎖Ｆｃである。本明細書中で使用する場合、（「ｓＦｃ」の）「一本鎖Ｆｃ」は、Ｆｃ断片がその二量体の形成が防止されるように（例えば、化学的修飾、または変異によるアミノ酸の付加、欠失もしくは置換（substation）によって）改変されていることを意味する。
ある特定の実施形態では、融合タンパク質のＦｃ断片は、野生型ヒトＩｇＧ１アミノ酸配列またはその変形形態を含み得るものであるヒトＩｇＧ１に由来する。いくつかの実施形態では、融合タンパク質のＦｃ断片は、表１１に示すＦｃ断片（配列番号２３１）における残基６７に対応する、天然ヒトＩｇＧ１分子の（米国特許第７，５０１，４９４号の中で論述されているＩｇＧ１についての欧州付番方式に基づく）アミノ酸位置２９７において、Ｎ－グリコシル化部位としての役割を果たすＡｓｎ（Ｎ）アミノ酸を含有する。他の実施形態では、Ｆｃ断片のＮ－グリコシル化部位は、Ａｓｎ（Ｎ）残基をＨｉｓ（Ｈ）（配列番号２３２）またはＡｌａ（Ａ）（配列番号２３３）（表１１）に変異させることによって除去されている。Ｎ－グリコシル化部位に可変位置を含有するＦｃ断片は配列番号２３４として表１１に示される。
いくつかの実施形態では、Ｆｃ断片のＣＨ３－ＣＨ２ドメインは、野生型配列に対応する（配列番号２３１に開示される）アミノ酸配列を有する。ある特定の実施形態では、Ｆｃ断片のＣＨ３－ＣＨ２ドメインは、配列番号２３２のアミノ酸配列を有し、Ｎ－グリコシル化部位は、Ａｓｎ（Ｎ）残基をＨｉｓ（Ｈ）に変異させることによって除去されている。ある特定の実施形態では、Ｆｃ断片のＣＨ３－ＣＨ２ドメインは、配列番号２３３のアミノ酸配列を有し、Ｎ－グリコシル化部位は、Ａｓｎ（Ｎ）残基をＡｌａ（Ａ）に変異させることによって除去されている。
ｂ．ヒンジ領域
本開示の融合タンパク質は、いくつかの免疫グロブリンアイソタイプ（ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＧ）にみられるヒンジ領域を含み得る。ヒンジ領域は、Ｆｃ領域をＦａｂ領域から離隔させ、分子に屈曲性を付与し、２つの重鎖をジスルフィド結合によって連結し得る。２つのＣＨ２－ＣＨ３ドメインを含む二量体を形成することが、完全Ｆｃ領域によって提供される機能のために必要とされる。野生型ヒンジ領域内のシステイン同士の鎖間ジスルフィド結合は、Ｆｃ分子の２本の鎖を一緒に保って機能性単位を作り出すのに役立つ。
ある特定の実施形態では、ヒンジ領域は、ＩｇＧ、好ましくはＩｇＧ１に由来する。ヒンジ領域は、完全長または改変型（切断型）ヒンジ領域であり得る。
具体的な実施形態では、ヒンジ領域は、融合タンパク質が別の融合タンパク質または免疫グロブリン分子とジスルフィド結合を形成するのを防止する改変を含有する。具体的な実施形態では、ヒンジ領域は、ジスルフィド結合の形成を防止すべく１つ以上のシステインアミノ酸を変異及び／または欠失させることによって改変される。完全長ヒンジ領域のＮ末端またはＣ末端を欠失させて切断型ヒンジ領域を形成してもよい。ジスルフィド結合の形成を回避するためには、ヒンジ領域内のシステイン（Ｃｙｓ）を非Ｃｙｓアミノ酸で置換するかまたは欠失させることがある。具体的な実施形態では、ヒンジ領域のＣｙｓは、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、ＭｅｔまたはＶａｌで置換され得る。ＩｇＧ１～ＩｇＧ４からの野生型及び変異型ヒンジ領域の例としては、表９に示されるアミノ酸配列（配列番号１６６～１８７）が挙げられる。ジスルフィド結合は、変異型配列を含有する２つのヒンジ領域の間には形成され得ない。ＩｇＧ１ヒンジ領域は、表１０に示される配列（配列番号１８８～２２５）を有する様々な変異型ヒンジ領域を許容するように改変された。
ｃ．リンカー
融合タンパク質は、Ｆｃ断片のＮ末端に連結された生物活性分子を有し得る。あるいは、融合タンパク質は、Ｆｃ断片のＣ末端に連結された生物活性分子を有し得る。リンケージは、共有結合、好ましくはペプチド結合である。
本発明では、１つ以上の生物活性分子がＦｃ断片のＣ末端またはＮ末端に直接連結され得る。好ましくは、生物活性分子（複数可）はＦｃ断片のヒンジに直接連結され得る。
加えて、融合タンパク質は任意選択的に少なくとも１つのリンカーを含み得る。したがって、生物活性分子はＦｃ断片に直接連結されていなくてもよい。リンカーは、生物活性分子とＦｃ断片との間に介在し得る。リンカーは、Ｆｃ断片のＮ末端またはＦｃ断片のＣ末端に連結され得る。
一実施形態では、リンカーはアミノ酸を含む。リンカーは１～５個のアミノ酸を含み得る。
ｄ．生物活性分子
本明細書中で使用する場合、「生物学的活性分子」という用語は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のタンパク質か、細胞内へのウイルス侵入に関与する宿主受容体かのどちらかに由来する、タンパク質またはタンパク質の部分を指す。生物学的活性分子の例としては、２０１９－ＣｏＶからのスパイク（Ｓ）、エンベロープ（Ｅ）、膜（Ｍ）及びヌクレオカプシド（Ｎ）タンパク質、ヒト受容体ＡＣＥ２（ｈＡＣＥ２）、及び／またはその断片が挙げられる。
一実施形態では、生物学的活性分子はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質（配列番号２０）である。ある特定の実施形態では、生物学的活性分子はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質の受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）（Ｓ－ＲＢＤまたはＳ１－ＲＢＤ）（配列番号２２６）であるが、これは完全長Ｓタンパク質のアミノ酸残基３３１～５３０に対応する。ある特定の実施形態では、配列番号２２７に示されるように、配列番号２２６のＳ－ＲＢＤ配列の位置６１及び１９５にあるシステイン（Ｃ）残基はアラニン（Ａ）残基に変異している（Ｓ－ＲＢＤの残基６１及び１９５は配列番号２０の完全長Ｓタンパク質の残基３９１及び５２５に対応する）。変異型Ｓ－ＲＢＤ配列は本開示においてＳ－ＲＢＤａとも呼称される。Ｓ－ＲＢＤ配列におけるＣ６１Ａ及びＣ１９５Ａ変異は、組換えタンパク質発現時のジスルフィド結合形成の不整合を回避するために導入されている。
別の実施形態では、生物学的活性分子はヒト受容体ＡＣＥ２（ｈＡＣＥ２）（配列番号２２８）である。ある特定の実施形態では、生物学的活性分子はｈＡＣＥ２の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）（ｈＡＣＥ２ＥＣＤ）（配列番号２２９）であるが、これは、完全長ｈＡＣＥ２タンパク質のアミノ酸残基１～７４０に対応する。いくつかの実施形態では、配列番号２３０（本開示ではＡＣＥ２ＮＥＣＤとも呼称される）に示されるように、配列番号２２９のｈＡＣＥ２ＥＣＤ配列の位置３７４及び３７８にあるヒスチジン（Ｈ）残基はアスパラギン（Ｎ）残基に変異している。Ｈ３７４Ｎ及びＨ３７８Ｎ変異は、ｈＡＣＥ２のペプチダーゼ活性を消失させるために導入されている。
２．組成物
ある特定の実施形態では、本発明は、融合タンパク質、ならびに薬学的に許容される担体、アジュバント及び／または他の賦形剤、例えば希釈剤、添加剤、安定化剤、保存剤、可溶化剤、緩衝剤などを含む、医薬組成物を含めた組成物に関する。
医薬組成物は、融合タンパク質を最適な薬学的に許容される担体と混合することによって調製され得る。薬学的に許容される担体としては、溶媒、分散媒、等張化剤などが挙げられる。担体の例としては、水、生理食塩水もしくは他の緩衝剤（例えば、リン酸塩、クエン酸塩緩衝剤）、油、アルコール、タンパク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチン）、炭化水素（例えば、単糖類、二糖類、及び他の炭水化物、例えば、グルコース、スクロース、トレハロース、マンノース、マンニトール、ソルビトールまたはデキストリン）、ゲル、脂質、リポソーム、安定化剤、保存剤、酸化防止剤、例えばアスコルビン酸及びメチオニン、キレート剤、例えばＥＤＴＡ；塩を形成する対イオン、例えばナトリウム；非イオン性界面活性剤、例えば、ＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）もしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、またはその組合せが挙げられる。
医薬組成物は、特異的な抗原性作用を自身では全く有さずに融合タンパク質に対する免疫応答を加速させるように、長引かせるように、または増強するように作用する、１つ以上のアジュバントを含有し得る。医薬組成物に使用されるアジュバントは、油、油エマルジョン、アルミニウム塩、カルシウム塩、免疫刺激複合体、細菌性及びウイルス性派生物、ビロソーム、炭水化物、サイトカイン、高分子微粒子を含み得る。ある特定の実施形態では、アジュバントは、ミョウバン（リン酸アルミニウムカリウム）、リン酸アルミニウム（例えばＡＤＪＵ－ＰＨＯＳ（登録商標））、水酸化アルミニウム（例えばＡＬＨＹＤＲＯＧＥＬ（登録商標））、リン酸カルシウム、不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）、フロイント完全アジュバント、ＭＦ５９、アジュバント６５、Ｌｉｐｏｖａｎｔ、ＩＳＣＯＭ、リポシン、サポニン、スクアレン、Ｌ１２１、ＥＭＵＬＳＩＧＥＮ（登録商標）、ＥｍｕｌｓＩＬ－６ｎ（登録商標）、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）、Ｑｕｉｌ Ａ、ＱＳ２１、ＭＯＮＴＡＮＩＤＥ（登録商標）ＩＳＡ３５、ＩＳＡ５０Ｖ、ＩＳＡ５０Ｖ２、ＩＳＡ５１、ＩＳＡ２０６、ＩＳＡ７２０、リポソーム、ホスホリピド、ペプチドグリカン、リポ多糖（ＬＰＳ）、ＡＳＯ１、ＡＳＯ２、ＡＳＯ３、ＡＳＯ４、ＡＦ０３、親油性リン脂質（リピドＡ）、ガンマイヌリン、アルガムリン、グルカン、デキストラン、クルコマンナン、ガラクトマンナン、レバン、キシラン、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡ）、ならびにその他のアジュバント及び乳化剤から選択され得る。
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、ＭＯＮＴＡＮＩＤＥ（商標）ＩＳＡ５１（油中水型エマルジョンを製造するための、植物油及びオレイン酸マンニドで構成される油アジュバント組成物）、ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０（別名：ポリソルベート８０またはポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレエート）、ＣｐＧオリゴヌクレオチド及び／またはその任意の組合せを含有する。他の実施形態では、医薬組成物は、アジュバントとしてＥＭＵＬＳＩＧＥＮまたはＥＭＵＬＳＩＧＥＮ Ｄを含んだ水中油中水（すなわちｗ／ｏ／ｗ）型エマルジョンである。
医薬組成物は、薬学的に許容される添加剤または賦形剤も含み得る。例えば、医薬組成物は、酸化防止剤、結合剤、緩衝剤、増量剤、担体、キレート剤、着色剤、希釈剤、崩壊剤、乳化剤、フィラー、ゲル化剤、ｐＨ緩衝剤、保存剤、可溶化剤、安定化剤などを含有し得る。
医薬組成物は、即放性または持続放出性製剤として製剤化され得る。加えて、医薬組成物は、免疫原捕捉及び微粒子との共投与によって全身の、または限局された粘膜の免疫性を誘導するために製剤化され得る。そのような送達システムは、当業者によって容易に決定される。
医薬組成物は、液体溶液か懸濁液かのどちらかとしての注射剤として調製され得る。Ｓ－ＲＢＤペプチド免疫原構築物を含有する液体ビヒクルを注射前に調製してもよい。医薬組成物は、任意の好適な適用様式、例えば、皮内、静脈内、腹腔内、筋肉内、鼻腔内、経口、皮下などによって、及び任意の好適な送達装置で投与され得る。ある特定の実施形態では、医薬組成物は、皮下、皮内または筋肉内投与のために製剤化される。経口及び鼻腔内への適用を含めた他の投与様式に適する医薬組成物も調製され得る。
医薬組成物は、好適な単位剤形にも製剤化され得る。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、体重１ｋｇあたり約０．１μｇ～約１ｍｇの融合タンパク質を含有する。医薬組成物の有効用量は、投与手段、標的部位、患者の生理学的状態、患者がヒトであるのかそれとも動物であるのか、他の投与される医薬、及び治療が予防的であるのかそれとも治療的であるのかを含めた多くの異なる因子によって様々である。通例、患者はヒトであるが、遺伝子導入哺乳動物を含めた非ヒト哺乳動物も治療され得る。複数回用量で送達する場合、医薬組成物は、単位剤形１つあたりの適切な量に好都合に分割され得る。投与する投薬量は、治療分野ではよく知られているように、対象の年齢、体重及び全身の健康状態によって決まることになる。
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、１つよりも多い融合タンパク質を含有する。融合タンパク質の免疫有効性の相乗的増強を可能にするための、１つよりも多い融合タンパク質の混合物を含有する医薬組成物。１つよりも多い融合タンパク質を含有する医薬組成物は、ＭＨＣクラスＩＩ適用範囲が広いので、より大きな遺伝的集団においてより効果的であり得、したがって、融合タンパク質に対する改善された免疫応答をもたらし得る。
医薬組成物は１つよりも多い活性化合物も含有し得る。例えば、製剤は１つ以上の融合タンパク質及び／または１つ以上の付加的な有益な化合物（複数可）を含有し得る。有効成分は任意の簡便かつ実用的な方法で、例えば、混合、溶液、懸濁液、乳化、カプセル封入、吸収などによって担体と組み合わされ得、製剤、例えば、散剤（凍結乾燥された散剤を含む）、注射や輸注などに適する懸濁剤にされ得る。持続放出性製剤を調製してもよい。
ある特定の実施形態では、医薬組成物は、ヒトに使用するための融合タンパク質を含有する。医薬組成物は、クエン酸塩、リン酸塩、トリス、ビス－トリスなどを含むがこれらに限定されない適切な緩衝液で適切なｐＨで調製され得、さらには賦形剤、例えば、糖（５０～５００ｍＭのスクロース、トレハロース、マンニトールまたはその混合物）、界面活性剤（例えば０．０２５～０．５％のＴＷＥＥＮ２０またはＴＷＥＥＮ８０）及び／または他の試薬も含有し得る。製剤は、様々な量の融合タンパク質を含有するように調製され得る。一般に、対象への投与のための製剤は、約０．１μｇ／ｍＬ～約２００μｇ／ｍＬを含有する。ある特定の実施形態では、製剤は、約０．５μｇ／ｍＬ～約５０μｇ／ｍＬ、約１０μｇ／ｍＬ～約２５μｇ／ｍＬの融合タンパク質を含有し得る。具体的な実施形態では、製剤は、約１．０μｇ／ｍＬ、約５．０μｇ／ｍＬ、約１０．０μｇ／ｍＬまたは約２５．０μｇ／ｍＬの融合タンパク質を含有する。
３．方法
本発明の別の態様は、融合タンパク質及びその組成物を作る及び使用する方法に関する。
ａ．融合タンパク質の生産
いくつかの実施形態では、融合タンパク質を作る方法は、（ｉ）生物活性分子、及びヒンジ領域を含むＦｃ断片を提供すること、（ｉｉ）ヒンジ領域を、それがジスルフィド結合を形成するのを防止するために改変すること、及び（ｉｉｉ）生物活性分子を直接、または間接的に変異型ヒンジ領域によってｓＦｃに連結して融合タンパク質、ハイブリッド、コンジュゲートまたはその組成物を形成することを含む。本開示はまた、融合タンパク質を精製する方法も提供し、方法は、（ｉ）融合タンパク質を提供すること、及び（ｉｉ）プロテインＡ系またはプロテインＧ系クロマトグラフィー媒体によって融合タンパク質を精製することを含む。
あるいは、よく知られている分子生物学技術によって融合タンパク質を発現させてもよい。分子クローニング技術についての任意の標準的マニュアルは、本発明の融合タンパク質を組換えＤＮＡ及びＲＮＡの発現によって生産するための詳細なプロトコールを提供している。本発明の融合タンパク質を発現させる遺伝子を構築するためには、好ましくは遺伝子を発現させることになる生物のために最適化されたコドンを使用して、アミノ酸配列を核酸配列に逆翻訳する。次いで、典型的には融合タンパク質及び必要な調節エレメントをコードする重複オリゴヌクレオチドを合成することによって、ペプチドまたはタンパク質をコードする遺伝子を作る。合成遺伝子を組み立て、所望の発現ベクターに挿入する。本発明に包含される合成核酸配列には、本発明の融合タンパク質をコードするもの、及びコードされる分子の生物学的活性を変化させない非コード配列中の変化を特徴とする核酸構築物が含まれる。合成遺伝子を好適なクローニングベクターに挿入し、組換体を得て特性評価を行う。融合タンパク質を、選択された発現システム及び宿主に適した条件の下で発現させる。融合タンパク質をプロテインＡまたはプロテインＧの親和性カラム（例えば、ＳＯＦＴＭＡＸ（登録商標）、ＡＣＲＯＳＥＰ（登録商標）、ＳＥＲＡ－ＭＡＧ（登録商標）またはＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標））によって精製する。
本発明の融合タンパク質は、哺乳動物細胞、より下等な真核生物、または原核生物において生産され得る。哺乳動物細胞の例としては、サルＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、ヒト腎臓２９３細胞、ヒト上皮Ａ４３１細胞、ヒトＣｏｌｏ２０５細胞、３Ｔ３細胞、ＣＶ－１細胞、他の形質転換霊長類細胞株、正常二倍体細胞、初代組織、初代外植体、ＨｅＬａ細胞、マウスＬ細胞、ＢＨＫ、ＨＬ－６０、Ｕ９３７、ＨａＫまたはＪｕｒｋａｔ細胞の試験管内培養物に由来する細胞株が挙げられる。
本発明はまた、免疫グロブリンＧの一本鎖Ｆｃ（ｓＦｃ）領域を生産する方法であって、ＩｇＧのＦｃのヒンジ領域内のＣｙｓを変異させる、置換する、または欠失させることを含む、当該方法も提供する。一実施形態では、ＣｙｓをＳｅｒ、Ｇｌｙ、Ｔｈｅ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、ＩｌｅまたはＭｅｔで置換する。別の実施形態では、Ｃｙｓを欠失させる。さらなる実施形態では、ヒンジの断片を欠失させる。
本発明は、融合タンパク質を生産する方法をさらに提供し、方法は、（ａ）生物活性分子、及びヒンジ領域を含むＩｇＧ Ｆｃ断片を提供すること、（ｂ）ヒンジ領域をアミノ酸置換及び／または欠失によって変異させてジスルフィド結合形成を伴わない変異型Ｆｃを形成すること、及び（ｃ）生物活性分子と変異型Ｆｃとを組み合わせることを含む。
ｂ．融合タンパク質の使用
融合タンパク質を含有する医薬組成物は、即放性または持続放出性製剤として製剤化され得る。加えて、医薬組成物は、免疫原捕捉及び微粒子との共投与によって全身の、または限局された粘膜の免疫性を誘導するために製剤化され得る。そのような送達システムは、当業者によって容易に決定される。
本発明の融合タンパク質は、静脈内、皮下、筋肉内に、または任意の粘膜表面を介して、例えば、経口的、舌下、頬側、舌下、鼻腔内、経直腸的、経膣的に、または肺経路を介して投与され得る。ある特定の実施形態では、医薬組成物は、皮下、皮内または筋肉内投与のために製剤化される。経口及び鼻腔内適用を含めた他の投与経路に適する医薬組成物を調製してもよい。
本発明の融合タンパク質の用量は、対象及び特定の投与様式に応じて様々であろう。必要とされる投薬量は、融合タンパク質、対象の種及び対象の大きさを含むがこれらに限定されない当業者に知られている複数の因子に応じて様々であろう。投薬量は、０．１～１００，０００μｇ／ｋｇ体重の範囲であり得る。ある特定の実施形態では、投薬量は、体重１ｋｇあたり約０．１μｇ～約１ｍｇの融合タンパク質である。融合タンパク質は、単回用量で、２４時間の期間全体にわたる複数回用量で、または連続輸注によって投与され得る。融合タンパク質は、連続的に、または特定の計画で投与され得る。有効用量は、動物モデルから得られた用量－応答曲線から外挿され得る。
４．具体的な実施形態
本発明の具体的な実施形態は、限定はされないが、以下を含む：
（１）融合タンパク質であって、ＩｇＧ分子のＦｃ断片及び生物活性分子を含み、前記Ｆｃ断片が一本鎖Ｆｃ（ｓＦｃ）である、前記融合タンパク質。
（２）前記Ｆｃ断片がヒンジ領域を含む、（１）に記載の融合タンパク質。
（３）前記ヒンジ領域が、変異されており、ジスルフィド結合を形成しないものである、（２）に記載の融合タンパク質。
（４）前記ヒンジ領域が、配列番号１６６～２２５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、（２）に記載の融合タンパク質。
（５）前記ヒンジ領域が配列番号１８８のアミノ酸配列を含む、（２）に記載の融合タンパク質。
（６）前記生物活性分子が、配列番号２２６のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２からのＳタンパク質の受容体結合ドメイン（Ｓ－ＲＢＤ）、または配列番号２２７のＳ－ＲＢＤの変異形態である、（１）に記載の融合タンパク質。
（７）前記生物活性分子が、配列番号２２８のヒト受容体ＡＣＥ２の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）（ＥＣＤ－ｈＡＣＥ２）、または配列番号２２９のＥＣＤ－ｈＡＣＥ２の変異形態である、（１）に記載の融合タンパク質。
（８）前記生物活性分子が変異型ヒンジ領域によって前記Ｆｃ断片に連結されている、（１）に記載の融合タンパク質。
（９）前記融合タンパク質のアミノ酸配列が、配列番号２３５～２３８からなる群から選択される、（１）に記載の融合タンパク質。
（１０）（１）～（９）のいずれか１項に記載の融合タンパク質、及び薬学的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物。
（１１）融合タンパク質を生産する方法であって、
ａ）生物活性分子、及びヒンジ領域を含むＦｃ断片を提供すること、
ｂ）前記ヒンジ領域をアミノ酸置換及び／または欠失によって変異させて変異型Ｆｃを形成すること、ならびに
ｃ）前記生物活性分子と前記変異型Ｆｃとを組み合わせること
を含む、前記方法。
（１２）前記ヒンジ領域がシステイン残基の置換及び／または欠失によって変異されている、（１１）に記載の方法。
（１３）前記生物活性分子が前記ヒンジ領域によって前記変異型Ｆｃと組み合わされる、（１１）に記載の方法。
（１４）前記生物活性分子が、配列番号２２６のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２からのＳタンパク質の受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）（Ｓ－ＲＢＤ）、または配列番号２２７のＳ－ＲＢＤの変異形態である、（１１）に記載の方法。
（１５）前記生物活性分子が、配列番号２２８のヒト受容体ＡＣＥ２の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）（ＥＣＤ－ｈＡＣＥ２）、または配列番号２２９のＥＣＤ－ｈＡＣＥ２の変異形態である、（１１）に記載の方法。
本発明のさらなる具体的な実施形態は、限定されないが以下の例を含む。
Ｄ．ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２による感染の予防のためのマルチトープタンパク質／ペプチドワクチン組成物
本開示の緩和システムの第４の態様は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２による感染の予防のためのマルチトープタンパク質／ペプチドワクチン組成物に関する。本明細書に開示されるマルチトープタンパク質／ペプチドワクチン組成物は、「ＵＢ－６１２」とも呼称される。
１．Ｓ１－受容体結合領域系デザイナータンパク質
現在臨床試験中であるワクチンの大部分は、中和抗体応答を誘導するために完全長Ｓタンパク質のみを標的とする。Ｔ細胞応答の誘導は、天然の多遺伝子性ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染によって生み出された応答に比べて制限されるであろう。Ｓ１－ＲＢＤ領域はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の必須成分である。それは細胞結合のために必要なものであり、極めて類似しているＳＡＲＳ－ＣｏＶのウイルスの主要な中和ドメインに相当しており、完全長Ｓ抗原では実現できない安全性の余地を提供し、有効であったはずの不活化ＲＳＶワクチンの取り下げを招く潜在的に致命的な副作用の可能性を排除する。したがって、ＦＤＡ緊急使用許可によって承認された、新たに診断されたＣＯＶＩＤ－１９の治療のためのモノクローナル抗体（Ｌｉｌｌｙの中和抗体バムラニビマブ、ＬＹ－ＣｏＶ５５５及びＲＥＧＮ－ＣＯＶ２抗体カクテル）はどれもＳ１－ＲＢＤに指向される。
強いＳ１－ＲＢＤワクチン成分が明らかに有益であることから、マルチトープタンパク質／ペプチドワクチン組成物（ＵＢ－６１２）は、上記第Ｃ部に記載されるＳ１－受容体結合領域系デザイナータンパク質を含む。上に記載されるように、Ｓ１－ＲＢＤ－ｓＦｃは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳ１－ＲＢＤをヒトＩｇＧ１の一本鎖結晶性断片領域（ｓＦｃ）に融合させることによって作られた組換えタンパク質である。ワクチン抗体とＦｃ断片との遺伝学的融合は、アカゲザルにおけるＨＩＶ ｇｐ１２０に対する、またはＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるエプスタイン・バーウイルスｇｐ３５０に対する抗体誘導及び中和活性を促進することが示された（Shubin, Z., et al., 2017、及びZhao, B., et al., 2018）。さらに、操作型Ｆｃは、非特異的結合を最小限に抑えるための、ならびに溶解性、収率、熱安定性及び生体内での半減期を向上させるための解決策として多くの治療抗体において使用された（Liu, H., et al., 2017）。
いくつかの実施形態では、ワクチン組成物は、配列番号２３５のＳ１－ＲＢＤ－ｓＦｃ融合タンパク質を含有する。Ｓ１－ＲＢＤ－ｓＦｃタンパク質（配列番号２３５）は、ＩｇＧからの変異型ヒンジ領域（配列番号１８８）によって一本鎖Ｆｃペプチド（配列番号２３２）に融合された、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の完全長Ｓタンパク質のアミノ酸残基３３１～５３０に対応するＳ１－ＲＢＤペプチド（配列番号２２６）を含有する。
いくつかの実施形態では、配列番号２２７に示されるように、配列番号２２６のＳ－ＲＢＤ配列の位置６１及び１９５にあるシステイン（Ｃ）残基６１はアラニン（Ａ）残基に変異している（Ｓ－ＲＢＤの残基６１及び１９５は配列番号２０の完全長Ｓタンパク質の残基３９１及び５２５に対応する）。変異型Ｓ－ＲＢＤ配列は本開示においてＳ－ＲＢＤａとも呼称される。Ｓ－ＲＢＤ配列におけるＣ６１Ａ及びＣ１９５Ａ変異は、組換えタンパク質発現時のジスルフィド結合形成の不整合を回避するために導入されている。一本鎖Ｆｃペプチドに融合されたＳ－ＲＢＤａ（Ｓ－ＲＢＤａ－ｓＦｃ）のアミノ酸配列は配列番号２３６である。
ワクチン組成物中のＳ１－受容体結合領域系デザイナータンパク質の量は、必要性または用途によって様々であり得る。ワクチン組成物は、約１μｇ～約１，０００μｇのＳ１－受容体結合領域系デザイナータンパク質を含有し得る。いくつかの実施形態では、ワクチン組成物は、約１０μｇ～約２００μｇのＳ１－受容体結合領域系デザイナータンパク質を含有する。
２．Ｔｈ／ＣＴＬペプチド
Ｓタンパク質単独に対する中和応答は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、及び変異型Ｂ細胞エピトープを有するその明らかになりつつあるバリアントに対する持続的保護を提供する可能性が低い。長期にわたる細胞応答は、初回中和応答を（メモリーＢ細胞活性化によって）補強して、抗体価が減弱するときに免疫性のよりはるかに長い持続期間をもたらす可能性がある。近年の研究は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染個体の９０％超において２～３ヶ月以内にＳに対するＩｇＧ応答が急速に低下したことを示した（Long, Q.-X., et al., 2020）。対照的に、ＳＡＲＳに対するメモリーＴ細胞は２００３年のＳＡＲＳ大流行後の１１～１７年間にわたって存在し続けることが示された（Ng., O.-W., et al., 2016、及びLe Bert, N., et al., 2020）。Ｓタンパク質は、ＣＤ４＋エピトープを大抵において含有する体液性免疫性を誘発するのに必須な抗原である（Braun, J., et al., 2020）。明らかなＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染に対する細胞性免疫応答を生じさせる／補強するためには他の抗原が必要とされる。報告されているＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質中のＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープの大多数は、ＯＲＦ１ａｂ、Ｎ、Ｍ及びＯＲＦ３ａ領域に位置しており；３つだけがＳ中に位置し、１つのＣＤ８＋エピトープだけがＳ１－ＲＢＤ中に位置している（Ferretti, A. P., et al., 2020）。より小さいＭ及びＮ構造タンパク質は、感染症の制御に成功した患者のＴ細胞によって認識される。英国における３，０００人近くの人々の研究では、Ｔ細胞の数がより多い個体はＴ細胞応答が低い個体と比較してＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する保護がより大きかったことが見出され、ＣＯＶＩＤ－１９の予防においてＴ細胞免疫性が重要な役割を果たしている可能性があることが示唆された（Wyllie, D., et al., 2020）。
免疫原を提供してＴ細胞応答を誘発するために、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳ、Ｎ及びＭタンパク質に由来する高度に保存された配列からのＴｈ／ＣＴＬエピトープが大掛かりな文献検索の後に同定された（例えば、Ahmed, S. F., et al., 2020/0）。これらのＴｈ／ＣＴＬペプチドを表４及び表５に示す。これらの領域の中にあるいくつかのペプチドを選出してさらなる設計に供した。選出された各ペプチドは、ＭＨＣ ＩまたはＩＩとの結合が以前に確認されているＴｈまたはＣＴＬエピトープを含有し、良好な製造性特徴（最適な長さ、及び高品質合成に対する従順性）を呈する。ワクチン製剤における使用のためにペプチド溶解性を改善し、正電荷に富ませるために、これらの合理的に設計されたＴｈ／ＣＴＬペプチドを各々のペプチドのＮ末端へのＬｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ尾部の付加によってさらに改変した。５つの最終ペプチド及びそれらの各々のＨＬＡアレルのデザイン及び配列を表３２に示す。
免疫応答を増強するためには、ワクチン組成物のペプチド混合物に専売ペプチドＵＢＩＴｈ（登録商標）１ａ（配列番号６６）が加えられ得る。ＵＢＩＴｈ（登録商標）１ａは、元のフレームワーク配列が麻疹ウイルス融合タンパク質（ＭＶＦ）に由来するものである専売合成ペプチドである。この配列を、配列内で回文的プロファイルを呈してこの短い１９アミノ酸のペプチドの中での複数のＭＨＣクラスＩＩ結合モチーフの許容を可能にするようにさらに改変した。Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ配列をこの人工ＴｈペプチドのＮ末端に付加すると同時に、その正電荷を増加させ、かくして、後にペプチドが、負に大きく帯電したＣｐＧオリゴヌクレオチド分子に結合して免疫刺激複合体を「電荷中和」によって形成するのを容易にした。以前の研究では、自己タンパク質に由来する標的「機能性Ｂエピトープペプチド」に対するＵＢＩＴｈ（登録商標）１ａの結合は自己ペプチドを免疫原性にし、かくして、免疫寛容を打ち破った（Wang, C. Y., et al, 2017）。ＵＢＩＴｈ（登録商標）１のＴｈエピトープは、標的ペプチドに共有結合で連結されていようが、「電荷中和」作用によってＣｐＧ１と寄せ合わされる他の設計された標的ペプチドと一緒に遊離帯電ペプチドとして投与されようが、この刺激活性を示して、部位特異的なＢまたはＣＴＬ応答を誘発した。そのような免疫刺激複合体は、同伴する標的免疫原の弱かったかまたは中等度であったはずの応答を増強することが示された（例えば、ＷＯ２０２０／１３２２７５Ａ１）。ＣｐＧ１は、合理的に設計された免疫原を「電荷中和」によって寄せ合わせて、ワクチン接種宿主における均衡のとれたＢ細胞（中和抗体の誘導）及びＴｈ／ＣＴＬ応答を生じさせる。加えて、ＣｐＧによるＴＬＲ－９シグナル伝達の活性化は、ＩｇＡ産生を促進すること及びＴｈ１免疫応答に有利に働くことが知られている。ＵＢＩＴｈ（登録商標）１ペプチドは、その「エピトープクラスター」の性質がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来Ｔｈ及びＣＴＬエピトープペプチドをそれらの抗ウイルス活性に関してさらに増強することのための、Ｔｈペプチドの１つとして組み込まれる。ＵＢＩＴｈ（登録商標）１のアミノ酸配列は配列番号６５であり、ＵＢＩＴｈ（登録商標）１ａの配列は配列番号６６である。ＣｐＧ１の核酸配列は配列番号１０４である。
上記に鑑みて、マルチトープタンパク質／ペプチドワクチン組成物は、１つ以上のＴｈ／ＣＴＬペプチドを含有し得る。Ｔｈ／ＣＴＬペプチドは、
ａ．配列番号１のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｍタンパク質に由来するペプチド（例えば配列番号３６１）、
ｂ．配列番号６のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｎタンパク質に由来するペプチド（例えば配列番号９～１６、１９、１５３～１６０、１６５、３４７、３５０、３５１及び３６３）、
ｃ．配列番号２０のＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２ Ｓタンパク質に由来するペプチド（例えば配列番号３５～３６、３９～４８、１４５～１５２、１６１～１６４、３４５～３４６、３４８、３６２、３６４及び３６５）、及び／または
ｄ．病原体タンパク質に由来する人工Ｔｈエピトープ（例えば配列番号４９～１００）
を含み得る。
ワクチン組成物は、Ｔｈ／ＣＴＬペプチドの１つ以上を含有し得る。ある特定の実施形態では、ワクチン組成物は、１つよりも多いＴｈ／ＣＴＬペプチドの混合物を含有する。混合物中に存在する場合、各Ｔｈ／ＣＴＬペプチドは、その他のペプチドまたは複数のペプチドに対して任意の量または比で存在し得る。例えば、Ｔｈ／ＣＴＬペプチドは、等モル量、等重量で混合され得、または混合物中の各ペプチドの量は混合物中のその他のペプチド（複数可）の量とは異なり得る。２つよりも多いＴｈ／ＣＴＬペプチドが混合物中に存在する場合、ペプチドの量は、混合物中のその他のペプチドと同じであってもよいし、または異なっていてもよい。
ワクチン組成物中に存在するＴｈ／ＣＴＬペプチド（複数可）の量は、必要性または用途に応じて様々であり得る。ワクチン組成物は、合計約０．１μｇ～約１００μｇのＴｈ／ＣＴＬペプチド（複数可）を含有し得る。いくつかの実施形態では、ワクチン組成物は、合計約１μｇ～約５０μｇのＴｈ／ＣＴＬペプチド（複数可）を含有し得る。
ある特定の実施形態では、ワクチン組成物は、配列番号３４５、３４６、３４７、３４８、３６１及び６６の混合物を含有し得る。これらのＴｈ／ＣＴＬペプチドは、等モル量、等重量で混合され得、または混合物中の各ペプチドの量は混合物中のその他のペプチド（複数可）の量とは異なり得る。ある特定の実施形態では、これらのＴｈ／ＣＴＬペプチドはワクチン組成物において等重量で混合され得る。
３．賦形剤
ワクチン組成物は、薬学的に許容される賦形剤も含有し得る。
本明細書中で使用する場合、「賦形剤（excipient）」または「賦形剤（excipients）」は、（ａ）Ｓ１－受容体結合領域系デザイナータンパク質でなく、（ｂ）Ｔｈ／ＣＴＬペプチド（複数可）でもない、ワクチン組成物中の任意の成分を指す。賦形剤の例としては、担体、アジュバント、酸化防止剤、結合剤、緩衝剤、増量剤、キレート剤、着色剤、希釈剤、崩壊剤、乳化剤、界面活性剤、溶剤、フィラー、ゲル化剤、ｐＨ緩衝剤、保存剤、可溶化剤、安定化剤などが挙げられる。したがって、ワクチン組成物は、薬学的有効量の医薬品原薬（ＡＰＩ）、例えばＳ１－受容体結合領域系デザイナータンパク質及び／またはＴｈ／ＣＴＬペプチドを薬学的に許容される賦形剤と一緒に含有し得る。
ワクチン組成物は、いかなる特異的な抗原性作用も自ら有することなくＡＰＩに対する免疫応答を加速、延長または増強するように作用する１つ以上のアジュバントを含有し得る。アジュバントは、油、油エマルジョン、アルミニウム塩、カルシウム塩、免疫刺激複合体、細菌性及びウイルス性派生物、ビロソーム、炭水化物、サイトカイン、高分子微粒子を含み得る。ある特定の実施形態では、アジュバントは、ＣｐＧオリゴヌクレオチド、ミョウバン（リン酸アルミニウムカリウム）、リン酸アルミニウム（例えばＡＤＪＵ－ＰＨＯＳ（登録商標））、水酸化アルミニウム（例えばＡＬＨＹＤＲＯＧＥＬ（登録商標））、リン酸カルシウム、不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）、フロイント完全アジュバント、ＭＦ５９、アジュバント６５、Ｌｉｐｏｖａｎｔ、ＩＳＣＯＭ、リポシン、サポニン、スクアレン、Ｌ１２１、ＥＭＵＬＳＩＧＥＮ（登録商標）、ＥｍｕｌｓＩＬ－６ｎ（登録商標）、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）、Ｑｕｉｌ Ａ、ＱＳ２１、ＭＯＮＴＡＮＩＤＥ（登録商標）ＩＳＡ３５、ＩＳＡ５０Ｖ、ＩＳＡ５０Ｖ２、ＩＳＡ５１、ＩＳＡ２０６、ＩＳＡ７２０、リポソーム、ホスホリピド、ペプチドグリカン、リポ多糖（ＬＰＳ）、ＡＳＯ１、ＡＳＯ２、ＡＳＯ３、ＡＳＯ４、ＡＦ０３、親油性リン脂質（リピドＡ）、ガンマイヌリン、アルガムリン、グルカン、デキストラン、クルコマンナン、ガラクトマンナン、レバン、キシラン、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡ）、ならびにその他のアジュバント及び乳化剤から選択され得る。
いくつかの実施形態では、ワクチン医薬組成物は、ＡＤＪＵ－ＰＨＯＳ（登録商標）（リン酸アルミニウム）、ＭＯＮＴＡＮＩＤＥ（商標）ＩＳＡ５１（油中水型エマルジョンを製造するための、植物油及びオレイン酸マンニドで構成される油アジュバント組成物）、ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０（別名：ポリソルベート８０またはポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレエート）、ＣｐＧオリゴヌクレオチド及び／またはその任意の組合せを含有する。他の実施形態では、医薬組成物は、アジュバントとしてＥＭＵＬＳＩＧＥＮまたはＥＭＵＬＳＩＧＥＮ Ｄを含んだ水中油中水（すなわちｗ／ｏ／ｗ）型エマルジョンである。
ある特定の実施形態では、マルチトープタンパク質／ペプチドワクチン組成物は、免疫応答を改善するためのアジュバントとしてＡＤＪＵ－ＰＨＯＳ（登録商標）（リン酸アルミニウム）を含有する。リン酸アルミニウムは、ヌクレオチド結合オリゴマー化ドメイン（ＮＯＤ）様受容体タンパク質３（ＮＬＲＰ３）インフラマソーム経路を介してＴｈ２指向性アジュバントとしての役割を果たす。加えて、それは食作用促進効果及び貯蔵庫効果を有し、多くのワクチン製剤において安全性、及びタンパク質を標的とする免疫応答を改善する能力が長期にわたって記録されている。
ワクチン組成物は、ｐＨ調整剤及び／または緩衝剤、例えば、塩酸、リン酸、クエン酸、酢酸、ヒスチジン、ヒスチジンＨＣｌ・Ｈ２Ｏ、乳酸、トロメタミン、グルコン酸、アスパラギン酸、グルタミン酸、酒石酸、コハク酸、リンゴ酸、フマル酸、α－ケトグルタル酸及びアルギニンＨＣｌを含有し得る。
ワクチン組成物は、界面活性剤及び乳化剤、例えば、オリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル（ポリソルベート、ＴＷＥＥＮ（登録商標））、ポリオキシエチレン１５ヒドロキシステアレート（マクロゴール１５ヒドロキシステアレート、ＳＯＬＵＴＯＬ ＨＳ１５（登録商標））、ポリオキシエチレンヒマシ油誘導体（ＣＲＥＭＯＰＨＯＲＥ（登録商標）ＥＬ、ＥＬＰ、ＲＨ４０）、ポリオキシエチレンステアレート（ＭＹＲＪ（登録商標））、ソルビタン脂肪酸エステル（ＳＰＡＮ（登録商標））、ポリオキシエチレンアルキルエーテル（ＢＲＩＪ（登録商標））及びポリオキシエチレンノニルフェノールエーテル（ＮＯＮＯＸＹＮＯＬ（登録商標））を含有し得る。
ワクチン組成物は、担体、溶媒または浸透圧保持剤、例えば、水、アルコール及び生理食塩水（例えば塩化ナトリウム）を含有し得る。
ワクチン組成物は、保存剤、例えば、アルキル／アリールアルコール（例えば、ベンジルアルコール、クロロブタノール、２－エトキシエタノール）、アミノアリール酸エステル（例えば、メチル、エチル、プロピルブチルパラベン及び組合せ）、アルキル／アリール酸（例えば、安息香酸、ソルビン酸）、ビグアニド（例えばクロルヘキシジン）、芳香族エーテル（例えば、フェノール、３－クレゾール、２－フェノキシエタノール）、有機水銀製剤（例えば、チメロサール、フェニル水銀塩）を含有し得る。
４．製剤
ワクチン組成物は、即放性または持続放出性製剤として製剤化され得る。加えて、ワクチン組成物は、免疫原捕捉及び微粒子との共投与によって全身の、または限局された粘膜の免疫性を誘導するために製剤化され得る。そのような送達システムは、当業者によって容易に決定される。
ワクチン組成物は、液体溶液か懸濁液かのどちらかとしての注射剤として調製され得る。ワクチン組成物を含有する液体ビヒクルを注射前に調製してもよい。ワクチン組成物は、任意の好適な適用様式、例えば、皮内、静脈内、腹腔内、筋肉内、鼻腔内、経口、皮下などによって、及び任意の好適な送達装置で投与され得る。ある特定の実施形態では、ワクチン組成物は、皮下、皮内または筋肉内投与のために製剤化される。経口及び鼻腔内への適用を含めた他の投与様式のためのワクチン組成物も調製され得る。
ワクチン組成物は、好適な単位剤形としても製剤化され得る。いくつかの実施形態では、ワクチン組成物は、約１μｇ～約１，０００μｇのＡＰＩ（例えば、Ｓ１－受容体結合領域系デザイナータンパク質、及び／またはＴｈ／ＣＴＬペプチドの１つ以上）を含有する。ワクチン組成物の有効用量は、投与手段、標的部位、対象の生理学的状態、対象がヒトであるのかそれとも動物であるのか、他の投与される医薬、及び治療が予防的であるのかそれとも治療的であるのかを含めた多くの異なる因子によって様々であり得る。通例、対象はヒトであるが、非ヒト哺乳動物も治療され得る。複数回用量で送達する場合、ワクチン組成物は、単位剤形１つあたりの適切な量に好都合に分割され得る。投与する投薬量は、治療分野ではよく知られているように、対象の年齢、体重及び全身の健康状態によって決まることになる。
いくつかの実施形態では、ワクチン組成物は、Ｓ１－受容体結合領域系デザイナータンパク質、及び１つ以上のＴｈ／ＣＴＬペプチドを製剤中に添加剤及び／または賦形剤と共に含有する。ある特定の実施形態では、ワクチン組成物は、Ｓ１－受容体結合領域系デザイナータンパク質及び１つよりも多いＴｈ／ＣＴＬペプチドを製剤中に添加剤及び／または賦形剤と共に含有する。１つよりも多いＴｈ／ＣＴＬペプチドの混合物を含有するワクチン組成物は、組成物の免疫有効性の相乗的増強をもたらし得る。Ｓ１－受容体結合領域系デザイナータンパク質及び１つよりも多いＴｈ／ＣＴＬペプチドを製剤中に添加剤及び／または賦形剤と共に含有するワクチン組成物は、広いＭＨＣクラスＩＩ適用範囲ゆえに、より大きな遺伝的集団においてはデザイナータンパク質または１つのＴｈ／ＣＴＬペプチドのみを含有する組成物に比べてより有効となり得、かくして、ワクチン組成物に対する改善された免疫応答をもたらし得る。
ワクチン組成物がＳ１－受容体結合領域系デザイナータンパク質及び１つ以上のＴｈ／ＣＴＬペプチドをＡＰＩとして含有する場合、デザイナータンパク質及びＴｈ／ＣＴＬペプチドの相対量は、互いに対する任意の量または比で存在し得る。例えば、デザイナータンパク質及びＴｈ／ＣＴＬペプチド（複数可）は、等モル量、等重量で混合されてもよいし、またはデザイナータンパク質及びＴｈ／ＣＴＬペプチド（複数可）の量が異なっていてもよい。加えて、１つよりも多いＴｈ／ＣＴＬペプチドが組成物中に存在する場合、デザイナータンパク質及び各Ｔｈ／ＣＴＬペプチドの量は互いに同じであってもよいし、または異なっていてもよい。いくつかの実施形態では、デザイナータンパク質のモル量または重量は、Ｔｈ／ＣＴＬペプチドよりも多い量で組成物中に存在する。他の実施形態では、デザイナータンパク質のモル量または重量は、Ｔｈ／ＣＴＬペプチドよりも少ない量で組成物中に存在する。デザイナータンパク質のＴｈ／ＣＴＬペプチド（複数可）に対する比（重量：重量）は、必要性または用途に応じて様々であり得る。いくつかの実施形態では、デザイナーペプチドのＴｈ／ＣＴＬペプチド（複数可）に対する比（ｗ：ｗ）は、１０：９０、２０：８０、３０：７０、４０：６０、５０：５０、６０：４０、７０：３０、８０：２０または９０：１０であり得る。具体的な実施形態では、デザイナーペプチドのＴｈ／ＣＴＬペプチド（複数可）に対する比（ｗ：ｗ）は、９５：５、９４：６、９３：７、９２：８、９１：９、９０：１０、８９：１１、８８：１２、８７：１３、８６：１４または８５：１５である。具体的な実施形態では、デザイナーペプチドのＴｈ／ＣＴＬペプチド（複数可）に対する比（ｗ：ｗ）は８８：１２である。
いくつかの実施形態では、ワクチン組成物は、配列番号２３５のＳ１－受容体結合領域系デザイナータンパク質を含む。他の実施形態では、ワクチン組成物は１つ以上のＴｈ／ＣＴＬペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ワクチン組成物は、配列番号２３５のＳ１－受容体結合領域系デザイナータンパク質を配列番号３４５、３４６、３４７、３４８、３６１及び６６のＴｈ／ＣＴＬペプチドと組み合わせて含む。ある特定の実施形態では、ワクチン組成物は、配列番号２３５のＳ１－受容体結合領域系デザイナータンパク質、配列番号３４５、３４６、３４７、３４８、３６１及び６６のＴｈ／ＣＴＬペプチドを、１つ以上のアジュバント及び／または賦形剤と一緒に含む。様々な実施形態において、ワクチン組成物は、配列番号２３５を配列番号３４５、３４６、３４７、３４８、３６１及び６６のＴｈ／ＣＴＬペプチドと一緒に含み、Ｔｈ／ＣＴＬペプチドは互いに等しい重量比で存在し、Ｔｈ／ＣＴＬペプチドの合計重量に対する配列番号２３５の比（ｗ：ｗ）は８８：１２である。Ｓ１－ＲＢＤ－ｓＦＣタンパク質（配列番号２３５）と配列番号３４５、３４６、３４７、３４８、３６１及び６６のＴｈ／ＣＴＬペプチドとを合わせた総重量を基準として２０μｇ／ｍＬ、６０μｇ／ｍＬ及び２００μｇ／ｍＬを含有するワクチン組成物の具体的な実施形態をそれぞれ表３３～３５に示す。
５．抗体
本開示は、ワクチン組成物によって誘発される抗体も提供する。
本開示は、免疫化宿主において高い奏効率でＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する高力価の中和抗体を誘発すること及びＳ－ＲＢＤのその受容体ＡＣＥ２に対する結合を阻害することができる、Ｓ１－受容体結合領域系デザイナータンパク質（例えば配列番号２３５のＳ１－ＲＢＤ－ｓＦｃ）及び１つ以上のＴｈ／ＣＴＬペプチド（例えば配列番号３４５、３４６、３４７、３４８、３６１及び６６）を製剤中に添加剤及び／または賦形剤と共に含むワクチン組成物を提供する。
本開示のワクチン組成物によって誘発される抗体も本開示に含まれる。そのような抗体は、当技術分野で知られている方法を用いて単離及び精製され得る。単離及び精製された抗体は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に曝露された対象の予防及び／または治療に使用するための医薬組成物または製剤の中に含められ得る。
６．方法
本開示は、ワクチン組成物及びその製剤を作る及び使用する方法にも関する。
ａ．Ｓ１－受容体結合領域系デザイナータンパク質及びＴｈ／ＣＴＬペプチドを製造する方法
本開示のＳ１－受容体結合領域系デザイナータンパク質は、上記第Ｃ部（３）に記載される方法に従って、または実施例１５に従って製造され得る。加えて、本開示のＴｈ／ＣＴＬペプチドは上記第Ｂ部（４）に記載される方法に従って製造され得る。
ｂ．ワクチン組成物を使用する方法
予防的用途において、本開示のマルチトープタンパク質／ペプチドワクチン組成物は、疾患のリスクを排除もしくは低減する、その重症度を低下させる、またはその発症を遅らせるために、ＣＯＶＩＤ－１９を引き起こすウイルスであるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染しやすい、またはそれに感染するリスクがある対象に投与され得る。
予防的治療を成し遂げるのに十分なワクチン組成物の量は、予防的有効量として定義される。本開示のマルチトープタンパク質／ペプチドワクチン組成物は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２による感染を予防するために十分な免疫応答を生じさせる１回以上の用量で対象に投与され得る。典型的には、免疫応答をモニターし、免疫応答が減弱し始めた場合に反復投薬量を与える。
ワクチン組成物は、即放性または持続放出性製剤として製剤化され得る。加えて、ワクチン組成物は、免疫原捕捉及び微粒子との共投与によって全身の、または限局された粘膜の免疫性を誘導するために製剤化され得る。そのような送達システムは、当業者によって容易に決定される。
本発明のワクチン組成物は、液体溶液か懸濁液かのどちらかとしての注射剤として調製され得る。ワクチン組成物を含有する液体ビヒクルを注射前に調製してもよい。ワクチン組成物は、任意の好適な適用様式、例えば、皮内、静脈内、腹腔内、筋肉内、鼻腔内、経口、皮下などによって、及び任意の好適な送達装置で投与され得る。ある特定の実施形態では、ワクチン組成物は、皮下、皮内または筋肉内投与のために製剤化される。経口及び鼻腔内への適用を含めた他の投与様式のためのワクチン組成物も調製され得る。
ワクチン組成物の用量は、対象及び特定の投与様式によって様々であり得る。必要とされる投薬量は、対象の種及び大きさを含むがこれらに限定されない当業者に知られている複数の因子に応じて様々であろう。投薬量は、デザイナータンパク質とＴｈ／ＣＴＬペプチドとの合計重量で１～１，０００μｇの範囲であり得る。投薬量は、デザイナータンパク質とＴｈ／ＣＴＬペプチドとの合計重量で約１μｇ～約１ｍｇ、約１０μｇ～約５００μｇ、約２０μｇ～約２００μｇであり得る。デザイナータンパク質とＴｈ／ＣＴＬペプチドとの合計重量によって測定される投薬量は、約１０μｇ、約２０μｇ、約３０μｇ、約４０μｇ、約５０μｇ、約６０μｇ、約７０μｇ、約８０μｇ、約９０μｇ、約１００μｇ、約１１０μｇ、約１２０μｇ、約１３０μｇ、約１４０μｇ、約１５０μｇ、約１６０μｇ、約１７０μｇ、約１８０μｇ、約１９０μｇ、約２００μｇ、約２５０μｇ、約３００μｇ、約４００μｇ、約５００μｇ、約６００μｇ、約７００μｇ、約８００μｇ、約９００μｇ、約１，０００μｇである。デザイナータンパク質のＴｈ／ＣＴＬペプチド（複数可）に対する比（重量：重量）は、必要性または用途に応じて様々であり得る。いくつかの実施形態では、デザイナーペプチドのＴｈ／ＣＴＬペプチド（複数可）に対する比（ｗ：ｗ）が、１０：９０、２０：８０、３０：７０、４０：６０、５０：５０、６０：４０、７０：３０、８０：２０、９０：１０、９９：１であり得るか、または１用量あたりのＴｈ／ＣＴＬペプチドの量が固定され得る。具体的な実施形態では、デザイナーペプチドのＴｈ／ＣＴＬペプチド（複数可）に対する比（ｗ：ｗ）は、９５：５、９４：６、９３：７、９２：８、９１：９、９０：１０、８９：１１、８８：１２、８７：１３、８６：１４または８５：１５である。具体的な実施形態では、デザイナーペプチドのＴｈ／ＣＴＬペプチド（複数可）に対する比（ｗ：ｗ）は８８：１２である。具体的な実施形態では、ワクチン組成物は、表３３～３５に示される成分を含有する。
ワクチン組成物は、単回用量で、一定期間にわたる複数回用量で、投与され得る。有効用量は、動物モデルから得られた用量－応答曲線から外挿され得る。いくつかの実施形態では、ワクチン組成物を単回の投与で対象に提供する。他の実施形態では、ワクチン組成物を複数回（２回以上）の投与で対象に提供する。複数回の投与で提供する場合、投与間の持続期間は、用途または必要性に応じて様々であり得る。いくつかの実施形態では、ワクチン組成物の第１用量を対象に投与し、第１用量の約１週間～約１２週間後に第２用量を投与する。ある特定の実施形態では、第２用量は、１回目の投与の約１週間、約２週間、約３週間、約４週間、約５週間、約６週間、約７週間、約８週間、約９週間、約１０週間、約１１週間または約１２週間後に投与される。具体的な実施形態では、第２用量は１回目の投与の約４週間後に投与される。
初回ワクチン接種計画の後には、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する免疫性を向上させるために追加免疫用量のワクチン組成物が対象に投与され得る。いくつかの実施形態では、追加免疫用量のワクチン組成物は、初回ワクチン接種計画の約６ヶ月～約１０年後に対象に投与される。ある特定の実施形態では、追加免疫用量のワクチン組成物は、初回ワクチン接種計画または最後の追加免疫用量の約６ヶ月、約１年、約２年、約３年、約４年、約５年、約６年、約７年、約８年、約９年または約１０年後に投与される。
７．具体的な実施形態
（１）配列番号２３５のＳ１－ＲＢＤ－ｓＦｃ、配列番号２３６のＳ１－ＲＢＤａ－ｓＦｃ及び配列番号３５５のＳ１－ＲＢＤ－Ｆｃからなる群から選択される融合タンパク質。
（２）ＣＯＶＩＤ－１９ワクチン組成物であって、
ａ．（１）に記載の融合タンパク質、及び
ｂ．薬学的に許容される賦形剤
を含む、前記ＣＯＶＩＤ－１９ワクチン組成物。
（３）前記融合タンパク質が配列番号２３５のＳ１－ＲＢＤ－ｓＦｃである、（２）に記載のＣＯＶＩＤ－１９ワクチン組成物。
（４）Ｔｈ／ＣＴＬペプチドをさらに含む、（２）に記載のＣＯＶＩＤ－１９ワクチン組成物。
（５）前記Ｔｈ／ＣＴＬペプチドが、配列番号１のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｍタンパク質、配列番号６のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｎタンパク質、配列番号２０のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質、病原体タンパク質またはその任意の組合せに由来するものである、（４）に記載のＣＯＶＩＤ－１９ワクチン組成物。
（６）
ａ．前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｍタンパク質に由来する前記Ｔｈ／ＣＴＬペプチドが配列番号３６１であり、
ｂ．前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｎタンパク質に由来する前記Ｔｈ／ＣＴＬペプチドが、配列番号９～１６、１９、１５３～１６０、１６５、３４７、３５０、３５１及び３６３からなる群から選択され、
ｃ．前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質に由来する前記Ｔｈ／ＣＴＬペプチドが、配列番号３５～３６、３９～４８、１４５～１５２、１６１～１６４、３４５～３４６、３４８、３６２、３６４及び３６５からなる群から選択され、
ｄ．病原体タンパク質に由来する前記Ｔｈ／ＣＴＬペプチドが、配列番号４９～１００からなる群から選択される、
（５）に記載のＣＯＶＩＤ－１９ワクチン組成物。
（７）配列番号３４５、３４６、３４７、３４８、３６１及び６６のＴｈ／ＣＴＬペプチドの混合物をさらに含む、（２）に記載のＣＯＶＩＤ－１９ワクチン組成物。
（８）前記Ｔｈ／ＣＴＬペプチドの各々が等重量で前記混合物中に存在する、（７）に記載のＣＯＶＩＤ－１９ワクチン組成物。
（９）前記Ｓ１－ＲＢＤ－ｓＦｃタンパク質の前記Ｔｈ／ＣＴＬペプチドの混合物の総重量に対する比（ｗ：ｗ）が８８：１２である、（８）に記載のＣＯＶＩＤ－１９ワクチン組成物。
（１０）前記薬学的に許容される賦形剤が、アジュバント、緩衝剤、界面活性剤、乳化剤、ｐＨ調整剤、生理食塩水、保存剤、溶剤またはその任意の組合せである、（２）に記載のＣＯＶＩＤ－１９ワクチン組成物。
（１１）前記薬学的に許容される賦形剤が、ＣｐＧオリゴヌクレオチド、ＡＤＪＵＰＨＯＳ（リン酸アルミニウム）、ヒスチジン、ヒスチジンＨＣｌ・Ｈ２Ｏ、アルギニンＨＣｌ、ＴＷＥＥＮ８０（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレエート）、塩酸、塩化ナトリウム、２－フェノキシエタノール、水及びその任意の組合せからなる群から選択される、（２）に記載のＣＯＶＩＤ－１９ワクチン組成物。
（１２）ＣＯＶＩＤ－１９ワクチン組成物であって、
ａ．配列番号２３５のＳ－ＲＢＤ－ｓＦｃタンパク質、
ｂ．配列番号９～１６、１９、３５～３６、３９～１００、１４５～１６５、３４５～３４８、３５０、３５１、３６２～３６５及びその任意の組合せからなる群から選択される、Ｔｈ／ＣＴＬペプチド、
ｃ．薬学的に許容される賦形剤
を含む、前記ＣＯＶＩＤ－１９ワクチン組成物。
（１３）（ｂ）の前記Ｔｈ／ＣＴＬペプチドが配列番号３４５、３４６、３４７、３４８、３６１及び６６の混合物である、（１２）に記載のＣＯＶＩＤ－１９ワクチン組成物。
（１４）前記Ｔｈ／ＣＴＬペプチドの各々が等重量で前記混合物中に存在する、（１２）に記載のＣＯＶＩＤ－１９ワクチン組成物。
（１５）前記Ｔｈ／ＣＴＬペプチドの混合物の総重量に対する前記Ｓ－ＲＢＤ－ｓＦｃタンパク質の比（ｗ：ｗ）が８８：１２である、（１３）に記載のＣＯＶＩＤ－１９ワクチン組成物。
（１６）前記薬学的に許容される賦形剤が、アジュバント、緩衝剤、界面活性剤、乳化剤、ｐＨ調整剤、生理食塩水、保存剤、溶剤またはその任意の組合せである、（１２）に記載のＣＯＶＩＤ－１９ワクチン組成物。
（１７）前記薬学的に許容される賦形剤が、ＣｐＧオリゴヌクレオチド、ＡＤＪＵＰＨＯＳ（リン酸アルミニウム）、ヒスチジン、ヒスチジンＨＣｌ・Ｈ２Ｏ、アルギニンＨＣｌ、ＴＷＥＥＮ８０（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレエート）、塩酸、塩化ナトリウム、２－フェノキシエタノール、水及びその任意の組合せからなる群から選択される、（１２）に記載のＣＯＶＩＤ－１９ワクチン組成物。
（１８）前記Ｔｈ／ＣＴＬペプチドが配列番号３４５、３４６、３４７、３４８、３６１及び６６の混合物であり、各ペプチドが等重量で前記混合物中に存在しており；
前記薬学的に許容される賦形剤が、ＣｐＧ１オリゴヌクレオチド、ＡＤＪＵＰＨＯＳ（リン酸アルミニウム）、ヒスチジン、ヒスチジンＨＣｌ・Ｈ２Ｏ、アルギニンＨＣｌ、ＴＷＥＥＮ８０（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレエート）、塩酸、塩化ナトリウム及び２－フェノキシエタノールを組み合わせて水中に含むものである、
（１２）に記載のＣＯＶＩＤ－１９ワクチン組成物。
（１９）配列番号２３５の前記Ｓ－ＲＢＤ－ｓＦｃタンパク質の総量が約１０μｇ～約２００μｇであり、
前記Ｔｈ／ＣＴＬペプチドの総量が約２μｇ～約２５μｇである、
（１８）に記載のＣＯＶＩＤ－１９ワクチン組成物。
（２０）配列番号２３５の前記Ｓ－ＲＢＤ－ｓＦｃタンパク質の総量が約１７．６μｇであり、前記Ｔｈ／ＣＴＬペプチドの総量が約約２．４μｇである、
（１８）に記載のＣＯＶＩＤ－１９ワクチン組成物。
（２１）配列番号２３５のＳ－ＲＢＤ－ｓＦｃタンパク質の総量が約５２．８μｇであり、前記Ｔｈ／ＣＴＬペプチドの総量が約７．２μｇである、
（１８）に記載のＣＯＶＩＤ－１９ワクチン組成物。
（２２）配列番号２３５の前記Ｓ－ＲＢＤ－ｓＦｃタンパク質の総量が約１７６μｇであり、前記Ｔｈ／ＣＴＬペプチドの総量が約２４μｇである、
（１８）に記載のＣＯＶＩＤ－１９ワクチン組成物。
（２３）対象におけるＣＯＶＩＤ－１９を予防する方法であって、薬学的有効量の（１２）に記載のワクチン組成物を前記対象に投与することを含む、前記方法。
（２４）前記ワクチン組成物の前記薬学的有効量が２回用量で前記対象に投与される、（２３）に記載の方法。
（２５）前記ワクチン組成物の第１用量が前記対象に投与され、前記第１用量の約４週間後に前記ワクチン組成物の第２用量が前記対象に投与される、（２４）に記載の方法。
（２６）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する抗体を生み出す方法であって、薬学的有効量の（１２）に記載のワクチン組成物を対象に投与することを含む、前記方法。
（２７）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質のＳ－ＲＢＤ部分（すなわち配列番号２２６）に特異的に結合する、単離された抗体またはそのエピトープ結合性断片。
（２８）（２７）に記載の単離された抗体またはそのエピトープ結合性断片を含む、組成物。
（２９）表２８に示す量で成分を含むＣＯＶＩＤ－１９ワクチン組成物。
（３０）表２９に示す量で成分を含むＣＯＶＩＤ－１９ワクチン組成物。
（３１）表３０に示す量で成分を含むＣＯＶＩＤ－１９ワクチン組成物。
８．他の具体的な実施形態
（１）Ｓ１－ＲＢＤ－ｓＦｃ（配列番号２３５）、Ｓ１－ＲＢＤａ－ｓＦｃ（配列番号２３６）及びＳ１－ＲＢＤ－Ｆｃ（配列番号２５５）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する融合タンパク質。
（２）（１）に記載の融合タンパク質を含む組成物。
（３）配列番号３４５、３４６、３４７、３４８、３６１及びその任意の組合せからなる群から選択されるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ペプチドをさらに含む、（２）に記載の組成物。
（４）ＵＢＩＴｈ（登録商標）１ａペプチド（配列番号６６）をさらに含む、（２または３）のいずれか１項に記載の組成物。
（５）
ａ）配列番号３４５、３４６、３４７、３４８、３６１及びその任意の組合せからなる群から選択されるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ペプチド、及び
ｂ）ＵＢＩＴｈ（登録商標）１ａペプチド（配列番号６６）
をさらに含む、請求項２に記載の組成物。
（６）組成物であって、
ａ）（１）に記載の融合タンパク質、
ｂ）配列番号３４５、３４６、３４７、３４８及び３６１を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ペプチドの混合物、ならびに
ｃ）ＵＢＩＴｈ（登録商標）１ａペプチド（配列番号６６）
を含む、前記組成物。
（７）前記融合タンパク質がＳ１－ＲＢＤ－ｓＦｃ（配列番号２３５）である、（５または６）のいずれか１項に記載の組成物。
（８）前記融合タンパク質がＳ１－ＲＢＤａ－ｓＦｃ（配列番号２３６）である、（５または６）のいずれか１項に記載の組成物。
（９）前記融合タンパク質がＳ１－ＲＢＤ－Ｆｃ（配列番号３５５）である、（５または６）のいずれか１項に記載の組成物。
（１０）組成物であって、
ａ）Ｓ１－ＲＢＤ－ｓＦＣ融合タンパク質、
ｂ）配列番号３４５、３４６、３４７、３４８及び３６１を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ペプチドの混合物、ならびに
ｃ）ＵＢＩＴｈ（登録商標）１ａペプチド（配列番号６６）
を含む、前記組成物。
（１１）（１）に記載の融合タンパク質、ならびに薬学的に許容される担体及び／またはアジュバントを含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチン組成物。
（１２）配列番号３４５、３４６、３４７、３４８、３６１及びその任意の組合せからなる群から選択されるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ペプチドをさらに含む、（１１）に記載のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチン組成物。
（１３）ＵＢＩＴｈ（登録商標）１ａペプチド（配列番号６６）をさらに含む、（１１または１２）のいずれか１項に記載のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチン組成物。
（１４）
ａ）配列番号３４５、３４６、３４７、３４８、３６１及びその任意の組合せからなる群から選択されるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ペプチド、ならびに
ｂ）ＵＢＩＴｈ（登録商標）１ａペプチド（配列番号６６）
をさらに含む、（１１）に記載のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチン組成物。
（１５）前記薬学的に許容される担体及び／またはアジュバントがＣｐＧ１（配列番号１０４）である、（１１～１４）のいずれか１項に記載のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチン組成物。
（１６）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチン組成物であって、
ａ）（１）に記載の融合タンパク質、
ｂ）配列番号３４５、３４６、３４７、３４８及び３６１を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ペプチドの混合物、
ｃ）ＵＢＩＴｈ（登録商標）１ａペプチド（配列番号６６）、ならびに
ｄ）薬学的に許容される担体及び／またはアジュバント
を含む、前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチン組成物。
（１７）前記融合タンパク質がＳ１－ＲＢＤ－ｓＦｃ（配列番号２３５）である、（１１～１６）のいずれか１項に記載のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチン組成物。
（１８）前記融合タンパク質がＳ１－ＲＢＤａ－ｓＦｃ（配列番号２３６）である、（１１～１６）のいずれか１項に記載のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチン組成物。
（１９）前記融合タンパク質がＳ１－ＲＢＤ－Ｆｃ（配列番号３５５）である、（１１～１６）のいずれか１項に記載のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチン組成物。
（２０）前記薬学的に許容される担体及び／またはアジュバントがＣｐＧ１（配列番号１０４）である、（１１～１４または１６～１９）のいずれか１項に記載のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチン組成物。
（２１）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチン組成物であって、
ａ）Ｓ１－ＲＢＤ－ｓＦＣ融合タンパク質、
ｂ）配列番号３４５、３４６、３４７、３４８及び３６１を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ペプチドの混合物、
ｃ）ＵＢＩＴｈ（登録商標）１ａペプチド（配列番号６６）、ならびに
ｄ）ＣｐＧ１オリゴヌクレオチド（配列番号１０４）
を含む、前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチン組成物。
（２２）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対して対象を免疫化する方法であって、薬学的有効量の（１１～２１）のいずれか１項に記載のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチン組成物を前記対象に投与することを含む、前記方法。
（２３）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対して対象を免疫化する方法であって、薬学的有効量の（２１）に記載のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチン組成物を前記対象に投与することを含む、前記方法。
（２４）（１）に記載の融合タンパク質をコードするｃＤＮＡ配列をトランスフェクトされた、細胞株。
（２５）チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株である、請求項２４に記載の細胞株。
（２６）前記融合タンパク質がＳ１－ＲＢＤ－ｓＦｃ（配列番号２３５）である、（２４または２５）のいずれか１項に記載の細胞株。
（２７）前記融合タンパク質がＳ１－ＲＢＤａ－ｓＦｃ（配列番号２３６）である、（２４または２５）のいずれか１項に記載の細胞株。
（２８）前記融合タンパク質がＳ１－ＲＢＤ－Ｆｃ（配列番号３５５）である、（２４または２５）のいずれか１項に記載の細胞株。
（２９）前記ｃＤＮＡ配列が、Ｓ１－ＲＢＤ－ｓＦｃ（配列番号２４６）、Ｓ１－ＲＢＤａ－ｓＦｃ（配列番号２４７）及びＳ１－ＲＢＤ－Ｆｃ（配列番号３５７）からなる群から選択される、（２４または２５）に記載の細胞株。
（３０）前記ｃＤＮＡ配列が、Ｓ１－ＲＢＤ－ｓＦｃをコードする配列番号２４６である、（２４または２５）に記載の細胞株。
（３１）前記ｃＤＮＡ配列が、Ｓ１－ＲＢＤａ－ｓＦｃをコードする配列番号２４７である、（２４または２５）に記載の細胞株。
（３２）前記ｃＤＮＡ配列が、Ｓ１－ＲＢＤ－Ｆｃをコードする配列番号３５７である、（２４または２５）に記載の細胞株。
実施例１
Ｓ－ＲＢＤ関連ペプチドの合成及びその製剤の調製
ａ．Ｓ－ＲＢＤ関連ペプチドの合成
Ｓ－ＲＢＤペプチド免疫原構築物の開発に含まれるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原性ペプチド、内因性Ｔｈ及びＣＴＬ、ならびにＳ－ＲＢＤ関連ペプチドを合成する方法について記載する。ペプチドは、血清学的アッセイ、検査施設予備試験及び実地調査に有用な小規模な量で、ならびに医薬組成物の工業的／商業的生産に大規模（キログラム）量で合成され得る。長さがおよそ６～８０アミノ酸である配列を有する広いレパートリーのＳ－ＲＢＤ Ｂ細胞エピトープペプチドを同定及び選択して、有効なＳ－ＲＢＤ指向性治療ワクチンに使用するためのペプチド免疫原構築物に最適な配列とした。
表１～３は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｍ、Ｎ及びＳタンパク質の完全長配列（それぞれ配列番号１、６及び２０）を示す。表１、３、１１及び１３はまた、抗体検出のための診断アッセイに使用するための固相／免疫吸着剤ペプチドとして使用するための、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｍ、Ｎ、Ｅ、ＯＲＦ９ｂ及びＳタンパク質に由来する抗原性ペプチドの配列（配列番号４～５、１７～１８、３７～３８、４～５、１７～１８、３７～３８、２２６、２２７、２５０～２５２、２５９、２６１、２６３、２６５、２６６、２７０、２８１、３０８、３２１、３２２、３２３、３２４及び３２８～３３４）も示す。加えて、表３、１１及び１３は、完全長Ｓ－ＲＢＤ、その断片または改変形態の配列（配列番号２２６、２２７、２３～２４、２６～２７、２９～３４及び３１５～３１９）を示す。
選択されたＳ－ＲＢＤ Ｂ細胞エピトープペプチドは、表６において特定される麻疹ウイルス融合タンパク質（ＭＶＦ）、Ｂ型肝炎表面抗原タンパク質（ＨＢｓＡｇ）、インフルエンザ、破傷風菌（Clostridum Tetani）及びエプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）を含めた病原体タンパク質に由来する入念に設計されたヘルパーＴ細胞（Ｔｈ）エピトープペプチド（例えば配列番号４９～１００）に合成的に連結することによって、Ｓ－ＲＢＤペプチド免疫原構築物にされ得る。Ｔｈエピトープペプチドは、単一の配列（例えば、ＭＶＦの場合は配列番号４９～５２、５４～５７、５９～６０、６２～６３、６５～６６、また、ＨＢｓＡｇの場合は配列番号６７～７１、７３～７４、７６～７８）か、コンビナトリアルライブラリー配列（例えば、ＭｖＦの場合は配列番号５３、５８、６１、６４、また、ＨＢｓＡｇの場合は配列番号７２及び７５）かのどちらかにおいてそれらの各々のＳ－ＲＢＤペプチド免疫原構築物の免疫原性を増強するために使用され得る。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２に対するワクチン接種宿主のＢ細胞またはＣＴＬ応答のリコールを容易にするであろうメモリーＴ細胞を生み出すために、既知のＭＨＣ結合活性を有する表２、３、４、５及び８に示すＳＡＲＳ－ＣｏＶ２由来内因性Ｔｈ及びＣＴＬエピトープ（配列番号９～１９、３５～４８、３４５～３５１）も合成免疫原として設計し（例えば配列番号３４５～３５１）、最終的なＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ワクチン製剤の中への組入れのために合成する。
数百個のペプチド構築物から選出された代表的なＳ－ＲＢＤペプチド免疫原構築物が表８に特定される（配列番号１０７～１４４）。抗Ｓ－ＲＢＤ抗体の検出及び／または測定のための免疫原性試験または関係する血清学的検査のために使用され得る全てのペプチドは、Ａｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓモデル４３０Ａ、４３１及び／または４３３のペプチド合成装置によるＦ－ｍｏｃ化学を用いて小規模に合成され得る。各ペプチドは、Ｎ末端におけるＦ－ｍｏｃで保護及び三官能性アミノ酸の側鎖保護基を伴って固相担体上での独立した合成によって生産され得る。合成後、ペプチドは固体担体から切断され得、側鎖保護基が９０％のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）によって除去され得る。合成ペプチド調製物はマトリックス支援レーザー脱イオン化－飛行時間（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ）質量分析によって評価されて正確なアミノ酸含有量が確保され得る。各合成ペプチドはまた、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ－ＨＰＬＣ）によっても評価されて調製物の合成プロファイル及び濃度が確認され得る。合成プロセス（カップリング効率の段階的追跡評価を含む）の厳密な制御にもかかわらず、伸張サイクル中の意図しない事象、例えば、アミノ酸挿入、欠失、置換及び早すぎる終止によってペプチド類縁体も生成することがある。かくして、合成された調製物は、目標とするペプチドと一緒に複数のペプチド類縁体を含むのが典型的である。
そのような意図しないペプチド類縁体が含まれているにもかかわらず、得られた合成ペプチド調製物はなおも、免疫診断（抗体捕捉抗原として）及び医薬組成物（ペプチド免疫原として）を含めた免疫学的用途における使用に適したものとなる。典型的には、そのようなペプチド類縁体は、意図的に設計されたものであれ、合成プロセスによって副生成物の混合物として生成したものであれ、これらのペプチドを採用する最終生成物の再現性及び有効性を保証すべく製造プロセス及び生成物評価プロセスの両方を監視するための鑑識的ＱＣ手順が開発される限りにおいて所望のペプチドの精製調製物と同様に有効であることが多い。数百～数キログラム量の大規模なペプチド合成は、独自に作られた自動化ペプチド合成装置（ＵＢＩ２００３）などにおいて１５～１５０ミリモルまたはそれより大きな規模で行われ得る。
臨床試験用の最終医薬組成物に使用される有効成分のためには、Ｓ－ＲＢＤペプチド免疫原構築物は浅い溶離勾配の下で分取ＲＰ－ＨＰＬＣによって精製され得、純度及び同一性についてＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析、アミノ酸分析及びＲＰ－ＨＰＬＣによって特性評価され得る。
ｂ．Ｓ－ＲＢＤペプチド免疫原構築物を含有する組成物の調製
油中水型エマルジョン、及び無機塩を使用した懸濁液を採用する製剤が調製され得る。大きな集団によって使用されることを企図した医薬組成物のためには、安全性がもう１つの重要な考慮因子である。多くの臨床試験において医薬組成物としてヒトに油中水型エマルジョンが使用されているという事実にもかかわらず、ミョウバンはその安全性ゆえに、医薬組成物に使用するための主要なアジュバントであり続けている。それゆえ、ミョウバンまたはその無機塩であるＡＤＪＵＰＨＯＳ（リン酸アルミニウム）は、臨床用途のための調製物においてアジュバントとして頻繁に使用される。
試験群において製剤は全種類のデザイナーＳ－ＲＢＤペプチド免疫原構築物を含有し得る。多数のデザイナーＳ－ＲＢＤペプチド免疫原構築物は、Ｂ細胞エピトープペプチドまたは完全長ＲＢＤポリペプチド（配列番号２２６、２３５、２３６及び２５５）として使用される対応するＳ－ＲＢＤペプチドに対するそれらの相対的免疫原性についてモルモットにおいて慎重に評価され得る。評価ペプチド（例えば配列番号２３～２４、２６～２７、２９～３４、３１５～３１９及び３３５～３４４）で被覆したプレートを使用してＥＬＩＳＡアッセイによって、様々な相同ペプチドの中でのエピトープマッピング及び血清学的交差反応性が分析され得る。
様々な量のＳ－ＲＢＤペプチド免疫原構築物は、ヒト用の承認された油としてのＳｅｐｐｉｃ ＭＯＮＴＡＮＩＤＥ（商標）ＩＳＡ５１を使用する油中水型エマルジョンに調製され得るか、または無機塩ＡＤＪＵＰＨＯＳ（リン酸アルミニウム）またはＡＬＨＹＤＲＯＧＥＬ（ミョウバン）と混合され得る。組成物は、Ｓ－ＲＢＤペプチド免疫原構築物を水に約２０～２，０００でμｇ／ｍＬ溶解させることによって調製され得、ＭＯＮＴＡＮＩＤＥ（商標）ＩＳＡ５１を使用して油中水型エマルジョン（体積比１：１）に製剤化され得るか、または無機塩ＡＤＪＵＰＨＯＳもしくはＡＬＨＹＤＲＯＧＥＬ（ミョウバン）を使用して製剤化され得る（体積比１：１）。免疫化に先立って、組成物を約３０分間にわたって室温に保つこと及び約１０～１５秒間にわたってボルテックス処理によって混合することを行わなければならない。動物は、２～３用量の特定の組成物を時間０（初回刺激）、及び初回免疫化後（ｗｐｉ）３週間目（追加免疫）、任意選択的には２回目の追加免疫のために５または６ｗｐｉに投与することによって免疫化され得る。その後、免疫化動物からの血清が、製剤中に存在する様々なＳ－ＲＢＤペプチド免疫原構築物の免疫原性を評価するために、及び配列番号２６のＳ－ＲＢＤ部位または完全長Ｓ－ＲＢＤ配列（配列番号２２６）との対応する血清の交差反応性について、選択されたＢ細胞エピトープペプチド（複数可）によって検査され得る。モルモットにおける最初のスクリーニングで見つかった強力な免疫原性を有するＳ－ＲＢＤペプチド免疫原構築物は、試験管内アッセイでそれらの対応する血清の機能的特性についてさらに検査され得る。その後、選出された候補Ｓ－ＲＢＤペプチド免疫原構築物は、免疫化プロトコールによって規定された指定期間にわたる投薬計画のための油中水型エマルジョン系、無機塩系及びミョウバン系製剤に調製され得る。
最も有望なＳ－ＲＢＤペプチド免疫原構築物のみが、幅広くさらに評価されることになり、その後、新医薬品適用の申請に備えたＧＬＰ指導下の前臨床試験及びこれに続くＣＯＶＩＤ－１９患者における臨床試験における免疫原性、持続期間、毒性及び有効性試験のために、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ Ｔｈ／ＣＴＬペプチド構築物と組み合わされるかまたは組み合わされない最終製剤に組み込まれることになる。
実施例２
血清学的アッセイ及び試薬
Ｓ－ＲＢＤペプチド免疫原構築物及びその製剤の機能的免疫原性を評価するための血清学的アッセイ及び試薬について以下に詳しく記載する。
ａ．免疫原性及び抗体特異性分析のためのＳ－ＲＢＤまたはＳ－ＲＢＤ Ｂ細胞エピトープペプチドに基づくＥＬＩＳＡ検査
ＣＯＶＩＤ－１９の検出のための免疫血清試料及び／または個体からの試料を評価するために用いられ得るＥＬＩＳＡアッセイについて以下に記載する。
９６ウェルプレートのウェルを個々に、１時間にわたって３７℃で、（特に記されない限り）ｐＨ９．５の１０ｍＭのＮａＨＣＯ３緩衝液の中に含まれた（特に記されない限り）２μｇ／ｍＬの１００μＬのＳ－ＲＢＤ（配列番号２２６）またはＳ－ＲＢＤ Ｂ細胞エピトープペプチド（例えば配列番号２３～２４、２６～２７及び／または２９～３４）で被覆する。
Ｓ－ＲＢＤまたはＳ－ＲＢＤ Ｂ細胞エピトープペプチドで被覆されたウェルを３７℃で１時間にわたってＰＢＳ中３重量％のゼラチン２５０μＬとインキュベートして非特異的なタンパク質結合部位を遮断し、その後、０．０５体積％のＴＷＥＥＮ（登録商標）２０を含有するＰＢＳで３回洗浄し、乾燥させる。分析する血清を、２０体積％の正常ヤギ血清、１体積％のゼラチン及び０．０５体積％のＴＷＥＥＮ（登録商標）２０を含有するＰＢＳで（特に記されない限り）１：２０に希釈する。１００マイクロリットル（１００μＬ）の希釈検体（例えば、血清、血漿）を各ウェルに加え、３７℃で６０分間反応させる。その後、未結合抗体を除去するために０．０５体積％のＴＷＥＥＮ（登録商標）２０を含むＰＢＳでウェルを６回洗浄する。西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）にコンジュゲートされた種（例えばモルモットまたはラット）特異的ヤギポリクローナル抗ＩｇＧ抗体またはプロテインＡ／Ｇを、陽性ウェルにおいて形成される抗体／ペプチド抗原複合体と結合する標識付けされたトレーサーとして使用する。１体積％の正常ヤギ血清と共に０．０５体積％のＴＷＥＥＮ（登録商標）２０を含んだＰＢＳの中にＨＲＰ標識検出試薬を予め力価決定された最適な希釈度で含んだもの１００マイクロリットル（１００μＬ）を各ウェルに加え、３７℃でもう３０分間インキュベートする。０．０５体積％のＴＷＥＥＮ（登録商標）２０を含んだＰＢＳでウェルを６回洗浄して未結合抗体を除去し、クエン酸ナトリウム緩衝液中に０．０４重量％の３’，３’，５’，５’－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）及び０．１２体積％の過酸化水素を含有する基質混合物１００μＬともう１５分間反応させる。この基質混合物を、ペルオキシダーゼ標識を呈色生成物の形成によって検出するために使用する。１００μＬの１．０ＭのＨ２ＳＯ４の添加によって反応を停止し、４５０ｎｍでの吸光度（Ａ４５０）を決定する。様々なペプチドワクチン製剤を与えたワクチン接種動物、またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２による感染を検査される個体の抗体価を決定するために、血清の１：１００～１：１０，０００の１０倍段階希釈液、または血清の１：１００～１：４．１９×１０８の４倍段階希釈液を検査し、Ｌｏｇ１０として表される検査血清の力価を、カットオフＡ４５０を０．５に定めたＡ４５０の線形回帰解析によって算出する。
ｂ．Ｔｈペプチドに基づくＥＬＩＳＡ検査によるＴｈペプチドに対する抗体反応性の評価
上記のように実施される同様のＥＬＩＳＡ法において、９６ウェルＥＬＩＳＡプレートのウェルを個々に、１時間にわたって３７℃で、（特に記されない限り）ｐＨ９．５の１０ｍＭのＮａＨＣＯ３緩衝液の中に含まれた（特に記されない限り）２μｇ／ｍＬの１００μＬのＴｈペプチドで被覆する。Ｓ－ＲＢＤペプチド免疫原構築物を含有する様々な製剤を与えたワクチン接種動物の抗体価を決定するために、血清の１：１００～１：１０，０００の１０倍段階希釈液を検査し、Ｌｏｇ１０として表される検査血清の力価を、カットオフＡ４５０を０．５に定めたＡ４５０の線形回帰解析によって算出する。
ｃ．免疫原性評価
動物対象からの免疫化前及び免疫血清試料を実験的ワクチン接種プロトコールに従って採取し、５６℃で３０分間加熱して血清補体因子を不活化する。Ｓ－ＲＢＤペプチド免疫原構築物を含有する製剤の投与後、プロトコールに従って血液試料が得られ得、特定の標的部位（複数可）に対するその免疫原性が、対応するＳ－ＲＢＤ Ｂ細胞エピトープペプチドに基づくＥＬＩＳＡ検査を用いて評価され得る。段階希釈血清が検査され得、陽性力価は希釈度の逆数のＬｏｇ１０として表され得る。特定の製剤の免疫原性を、所望のＢ細胞応答の増強をもたらすために採用されたヘルパーＴ細胞エピトープに対する低い～無視できるほどの抗体反応性を維持しながら標的抗原中の所望のエピトープ特異性に対して指向される高力価抗体応答及びＳ－ＲＢＤポリペプチドとの高い交差反応性を誘発するその能力について評価する。
実施例３
アッセイ用製剤中に抗原性ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ペプチドの混合物を有するペプチド組成物は感度を増強する
ＣＯＶＩＤ－１９の早期検出は、検査施設判定基準、例えば、分子プローブを使用するＲＴ－ＰＣＲアッセイによって、及び臨床判定基準、例えば、体温上昇、乾性咳嗽などによって行われるが、血清学的監視のためには感度が高くかつ特異的な抗体検出アッセイが望ましい。
血清監視及び診断のための本開示のＣＯＶＩＤ－１９抗体検出アッセイの開発において、アッセイ特異性が最優先事項とみなされる。患者を誤診して不必要に隔離することがないように、及び大流行を食い止めるための緊急公衆衛生措置を不必要に講じることを回避するために、高い特異性が許容可能なＣＯＶＩＤ－１９抗体検出検査の必須条件である。
血清監視及び診断のための許容可能な免疫アッセイはまた、高い感度も有していなければならない。それゆえ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ血清学の従前の知識に基づいて、ペプチド相同体（例えば配列番号４、１７及び３７）としての、ならびに大々的な血清学的検証によって設計及び同定されたもの（例えば配列番号４、１７、３７、２６２、２６５、２８１、３２２、３５４）としてのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｍ、Ｎ及びＳタンパク質に由来する対応する抗原性ペプチドの混合物を、抗体検出の補完する感度のための抗原として評価する。選択されたペプチドのＥＬＩＳＡプレートに対する結合能を増強するために、選択されたペプチド類縁体（例えば配列番号５、１８及び３８）の各々のＮ末端にＫＫＫ－リジン尾部を付加する。さらに、広範な検査に際してペプチド混合物の使用は正常血清に対するペプチド混合物の特異性の喪失を招いてはならない。したがって、配列番号５、１８及び３８のアミノ酸配列を有するペプチドを含む抗原性ペプチドの混合物が固相抗原吸着剤としてのアッセイ用製剤のために保持され得る。同様に、配列番号５、１８、３８、２６１、２６６、２８１及び３２２のアミノ酸配列を有する抗原性ペプチドを含む混合物が、増強された分析感度を有するための固相抗原吸着剤としてのアッセイ用製剤のために使用され得る（図２８）。配列番号５、１８、３８、２６１、２６６、２８１、３２２のアミノ酸配列を有するこれらの抗原性ペプチドはまた、各々高い特異性を有する対応する成分ＥＬＩＳＡのための固相抗原吸着剤として個別にも製剤化され得、それらは一緒になって、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染が陽性であることが示された個体の抗原性プロファイルを提供する検証的アッセイを形成する。
実施例４
大規模分析での、感染集団、無作為血液ドナー集団及び他の非ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染集団におけるＣＯＶＩＤ－１９酵素免疫吸着の評価
ａ．他のウイルスに感染した患者からの血清及び正常血清
ＣＯＶＩＤ－１９に無関係な他のウイルス感染症を有する患者から２０００年よりも前に得られた血清は血清学的マーカーによって体系的記録が十分になされている。正常血液ドナーから血清の大パネルをフロリダ州血液バンクから得た。これらの血清パネルにおいて、いかなる分かっているＣＯＶＩＤ－１９症例の報告よりも少なくとも３年前に採取された、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する反応性に関する血清陽性率を用いてＣＯＶＩＤ－１９ ＥＬＩＳＡの特異性を評価した。
ｂ．ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出のための、混合ペプチドに基づくＣＯＶＩＤ－１９ ＥＬＩＳＡによる分析
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｍ、Ｎ及びＳタンパク質の混合物による被覆がなされた９６ウェルマイクロタイタープレートにおいて、ならびに１：２０に希釈された血清で、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出のためのＥＬＩＳＡアッセイを以下に記載される方法によって行った。９６ウェルプレートのウェルを個別に、１時間にわたって３７℃で、特に記されない限りｐＨ９．５の１０ｍＭのＮａＨＣＯ３緩衝液の中に含まれた２μｇ／ｍＬのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｍ、Ｎ及びＳタンパク質由来ペプチド混合物によってウェル１つあたり１００μＬを使用して被覆した。ペプチド被覆ウェルを３７℃で１時間にわたってＰＢＳ中３重量％のゼラチン２５０μＬとインキュベートして非特異的なタンパク質結合部位を遮断し、その後、０．０５体積％のＴＷＥＥＮ２０を含有するＰＢＳで３回洗浄し、乾燥させた。ＩＦＡによってＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２反応性抗体が陽性である患者血清、及び対照血清を、２０体積％の正常ヤギ血清、１重量％のゼラチン及び０．０５体積％のＴＷＥＥＮ２０を含有するＰＢＳによる特に記されない限り１：２０の希釈度で、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ペプチド被覆ウェルとの交差反応性による陽性対照として使用した。１００マイクロリットル（１００μＬ）の希釈検体を各ウェルに加え、３７℃で６０分間反応させた。その後、未結合抗体を除去するために０．０５体積％のＴＷＥＥＮ２０を含むＰＢＳでウェルを６回洗浄した。西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲートヤギ抗ヒトＩｇＧを、陽性ウェルにおいて形成されるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体／ペプチド抗原と結合する標識付けされたトレーサーとして使用した。１体積％の正常ヤギ血清、０．０５体積％のＴＷＥＥＮ２０を含んだＰＢＳの中にペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧを予め滴定された最適な希釈度で含んだもの１００マイクロリットル（１００μＬ）を各ウェルに加え、３７℃でもう３０分間インキュベートした。０．０５体積％のＴＷＥＥＮ２０を含んだＰＢＳでウェルを６回洗浄して未結合抗体を除去し、クエン酸ナトリウム緩衝液中に０．０４重量％の３’，３’，５’，５’－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）及び０．１２体積％の過酸化水素を含有する基質混合物１００μＬともう１５分間反応させた。この基質混合物が、ペルオキシダーゼ標識を呈色生成物の形成によって検出するために使用された。１００μＬの１．０ＭのＨ２ＳＯ４の添加によって反応を停止させ、４５０ｎｍでの吸光度（Ａ４５０）を決定した。
ｃ．解釈のための判断基準
ＥＬＩＳＡ様式での有意な反応性、すなわちカットオフ値は、平均Ａ４５０に正常集団からの血清の分布の６標準偏差を加えたものよりも大きいＡ４５０吸光度をもって与えられた。
ｄ．結果
血清陽性率がゼロと推測される５００超の正常な血漿及び血清試料のパネルからの試料を、１：２０の希釈度で検査して混合ペプチドＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＥＬＩＳＡにおけるそれらの各々の反応性を評価した。正常ドナー試料は、０．０７４±０．０３４２（標準偏差）の平均Ａ４５０を与え、０．２７４のカットオフ値が確立された。正常血清の信号対カットオフ（Ｓ／Ｃ）比率の分布はピークＳ／Ｃ比率が０．３の値を有し、どの試料も陽性反応性を示さなかった。したがって、正常試料におけるこのＥＬＩＳＡの特異性は設定カットオフ値において１００％であった。
対応するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来配列を有するペプチド相同体を使用したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＥＬＩＳＡは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に無関係な感染症、例えばＨＩＶ－１、ＨＩＶ２、ＨＣＶ、ＨＴＬＶ １／ＩＩ及び梅毒を有する患者からの試料、ならびに干渉物質でスパイクされた正常血清試料の大パネルで検査することによって特異性がさらに評価される。
台湾、上海、北京及び武漢からの感染ＣＯＶＩＤ－１９患者から得られた血清を使用するさらなる血清学的分析が、混合ペプチドＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＥＬＩＳＡの有効性を再確認するために検査されることになる。ＣＯＶＩＤ－１９が確認された患者から得られた全ての血清、及びＩＦＡによって検出したときＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する抗体価を有することが示された試料は、０日目から３０日目まで及びさらに長い期間にわたる段階的採血日と併せて検査されて抗体陽転プロセス及びそのような抗体の持続性が評価されることになる。信頼できる所出を有するこれらの抗体陽転パネルからの結果は、感染後、及びそのような抗体が持続する期間全体にわたって、最も早い段階での検出可能なレベルの抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｍ、Ｎ及びＳ抗体を示す情報を提供するであろう。病院の医療従事者、タクシー運転手、空港のスチュワーデス、及び他の定常的に一般人と接触する者を含めたリスクに曝されている個体の大規模な血清学的スクリーニングを行って、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染しており高いウイルス負荷を有するがなおも無症候のままである稀な（この出願日時点で、２％未満で見つかっている）スーパースプレッダー個体を特定し、意図せずして一般人を危険に曝す不明の感染を最小限に抑えることは、特に重要である。
まとめると、ＣＯＶＩＤ－１９の血清監視を大規模に適用するための、簡単で高速で簡便なＥＬＩＳＡ様式での高い感度及び特異性を有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体検出検査が開発された。検査は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｍ、Ｎ及びＳタンパク質及びその免疫学的機能性類縁体のセグメントに対応する抗原性合成ペプチド、分岐型及び直鎖型、コンジュゲート、ならびにポリマーを含む、固相免疫吸着剤に基づく。免疫アッセイは、分子プローブなどに基づくウイルス検出システムと組み合わせて用いるのに適している。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原性ペプチドの選出に課された高い厳密性によってもたらされたこのペプチド系ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２免疫アッセイシステムの高い特異性、補完的な部位特異的エピトープを有するペプチドの混合物によってもたらされた及び高い感度は、国家の疫学的調査に適した検査をもたらす。そのような検査は、ＣＯＶＩＤ－１９の大流行を被っているかまたはＣＯＶＩＤ－１９の存在が疑われる国々によって遡及疫学研究のために用いられ得る。また、高度に特異的な免疫アッセイが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症を、無関係な呼吸器系ウイルス及び細菌によって引き起こされる疾患と見分けるために用いられ得る。本発明の免疫アッセイは、ＣＯＶＩＤ－１９の不適切な過剰報告を排除し得、隔離される患者の数を減らし得、疾患伝染を食い止めるための緊急措置に関連する他のコストを減らし得る。
実施例５
安全性、免疫原性、毒性及び有効性試験に使用される動物
ａ．モルモット：
免疫原性試験が、成熟した未感作の雄性及び雌性成体Ｄｕｎｃａｎ－Ｈａｒｔｌｅｙモルモット（３００～３５０ｇ／体重）において行われ得る。実験は、群１つあたり少なくとも３頭のモルモットを使用する。
Ｄｕｎｃａｎ－Ｈａｒｔｌｅｙモルモット（８～１２週齢、Ｃｏｖａｎｃｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｄｅｎｖｅｒ，ＰＡ，ＵＳＡ）が関与するプロトコールは、ＵＢＩをスポンサーとする契約動物施設において、承認されたＩＡＣＵＣ適用の下に実施される。
ｂ．カニクイザル：
雄性及び雌性成体サル（Macaca fascicularis、およそ３～４歳、Ｊｏｉｎｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｓｕｚｈｏｕ，Ｃｈｉｎａ）における免疫原性及び反復用量毒性試験が、ＵＢＩをスポンサーとする契約動物施設において、承認されたＩＡＣＵＣ適用の下に実施される。
実施例６
Ｓ－ＲＢＤペプチド免疫原構築物及びその製剤によって誘発された抗体の機能的特性の評価
モルモットにおいて産生された免疫血清または精製抗Ｓ－ＲＢＤ抗体は、（１）配列番号２６、２２６及び２２７の配列を有するＳ－ＲＢＤペプチド及びポリペプチドに結合する、（２）ＥＬＩＳＡアッセイ及び免疫蛍光ＡＣＥ２表面発現結合アッセイにおいてＳ－ＲＢＤタンパク質によるＡＣＥ２受容体との結合を阻害する、ならびに（３）試験管内での標的細胞ウイルス複製を中和するそれらの能力について、さらに検査され得る。
ａ．抗体結合アッセイ
このアッセイの目的は、免疫化モルモットに由来する免疫血清がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク（Ｓ）タンパク質を認識できることを実証することである。具体的には、０．１Ｍの炭酸塩緩衝液（ｐＨ９．６）中に含まれた１μｇ／ｍｌの組換えＳタンパク質を使用して９６ウェルマイクロタイタープレート（ＭａｘｉＳｏｒｐ ＮＵＮＣ）を４℃で一晩被覆する。２％のＢＳＡで遮断した後、段階希釈された抗血清を添加し、振盪しながら３７℃で１時間インキュベートし、その後、０．１％のＴＷＥＥＮ２０を含有するＰＢＳで４回洗浄する。結合した抗血清を、ヤギ抗モルモットＩｇＧ Ｈ＆Ｌ（ＨＲＰ）（ＡＢｃａｍ、ａｂ６９０８）によって３７℃で１時間検出し、その後４回洗浄する。基質３，３，５，５－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を各ウェルに加え、３７℃で２０分間インキュベートする。４５０ｎｍでの吸光度をＥＬＩＳＡプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ）によって測定する。
ｂ．抗体中和アッセイ
このアッセイの目的は、Ｓ－ＲＢＤペプチド免疫原構築物（配列番号１０７～１４４）またはＳ－ＲＢＤ融合タンパク質（配列番号２３５及び２３６のそれぞれＳ－ＲＢＤ－ｓＦｃ及びＳ－ＲＢＤａ－ｓＦｃ）を投与した動物からの免疫血清中の抗体がＡＣＥ２受容体の存在下で中和特性または受容体結合阻害特性を有するかを実証することである。具体的には、０．１Ｍの炭酸塩緩衝液（ｐＨ９．６）中に含まれた１μｇ／ｍｌの組換えＳタンパク質（配列番号２０）またはＳ－ＲＢＤタンパク質（配列番号２２６、２２７）を使用して９６ウェルマイクロタイタープレート（ＭａｘｉＳｏｒｐ ＮＵＮＣ）を４℃で一晩被覆する。２％のＢＳＡで遮断した後、段階希釈された免疫血清を、Ｓタンパク質またはＳ－ＲＢＤポリペプチドで被覆された９６ウェルプレートにおいて１時間にわたって３７℃でｈＡＣＥ２と共インキュベートし、その後、０．１％のＴＷＥＥＮ２０を含有するＰＢＳで４回洗浄する。結合したＡＣＥ２ＥＣＤまたはＡＣＥ２ＮＥＣＤペプチド（配列番号２２９～２３０）を、ヤギ抗ＨｕＡＣＥ２ Ａｂ（ＨＲＰ）（Ｒ＆Ｂ Ｓｙｓｔｅｍ）によって３７℃で１時間検出し、その後４回洗浄する。基質３，３，５，５－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を各ウェルに加え、３７℃で２０分間インキュベートする。４５０ｎｍでの吸光度をＥＬＩＳＡプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ）によって測定する。信号は中和抗体濃度に反比例する。中和力価は血清希釈倍率の逆数として表されよう。
ｃ．細胞に基づく中和アッセイ（フローサイトメトリー）
Ｓ－ＲＢＤ（Ｓ－ＲＢＤペプチド免疫原構築物、Ｓ－ＲＢＤ－ｓＦｃ融合タンパク質、またはＳ－ＲＢＤａ－ｓＦｃ融合タンパク質）に指向される免疫血清による、ＡＣＥ２発現細胞に対するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質の結合の中和アッセイを、フローサイトメトリーによって測定する。手短に述べると、１０６個のＨＥＫ２９３／ＡＣＥ２細胞を剥がし、回収し、ＨＢＳＳ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）で洗浄する。段階希釈された免疫血清の存在下または非存在下でＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２からのＳタンパク質を１μｇ／ｍＬの終濃度となるように細胞に添加し、その後、室温で３０分間インキュベートする。細胞をＨＢＳＳで洗浄し、１／５０の希釈度の抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質抗体（ＨＲＰ）と室温でもう３０分間インキュベートする。洗浄後、細胞をＰＢＳ中１％のホルムアルデヒドで固定し、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメータ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）においてＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェアを使用して解析する。
ｄ．ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染の中和
Ｓ－ＲＢＤペプチド免疫原構築物、Ｓ－ＲＢＤ－ｓＦｃ融合タンパク質、またはＳ－ＲＢＤａ－ｓＦｃ融合タンパク質で免疫化されたモルモットに由来する免疫血清が試験管内でのアッセイにおいてｈＡＣＥ２を中和する有効性を示した後に、免疫血清をＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２中和アッセイで検査することになる。
手短に述べると、Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞を５×１０４細胞／ウェルで９６ウェル組織培養プレートに播種し、一晩成長させる。１００マイクロリットル（１００μＬ）の５０％組織培養物感染用量のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を等体積の希釈モルモット免疫血清と混合し、３７℃で１時間インキュベートする。混合物をＶｅｒｏ Ｅ６細胞の単層に添加する。感染後３日目に細胞変性効果（ＣＰＥ）を記録する。ウェルの５０％においてＣＰＥを完全に防止したＧＰ免疫血清の希釈度を表す中和力価を、Ｒｅｅｄ－Ｍｕｅｎｃｈ法によって算出する。
実施例７
抗ウイルス療法としてのＡＣＥ２－ＳＦＣ融合タンパク質の開発において採用されたアッセイ
１．ｈＡＣＥ２タンパク質創薬のためのアッセイ
ａ．結合アッセイ
以下のアッセイは、ｈＡＣＥ２融合タンパク質（配列番号２３７～２３８のＡＣＥ２－ＥＣＤ－ｓＦｃ、ＡＣＥ２Ｎ－ＥＣＤ－ｓＦｃ）がその天然のリガンド（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質）によって認識され得ることをＡＣＥ２－ＥＣＤ－Ｆｃと対比して実証するように設計されている。具体的には、０．１Ｍの炭酸塩緩衝液（ｐＨ９．６）中に含まれた１μｇ／ｍｌの組換えＳタンパク質（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）を使用して９６ウェルマイクロタイタープレート（ＭａｘｉＳｏｒｐ ＮＵＮＣ）を４℃で一晩被覆する。２％のＢＳＡで遮断した後、０．５μｇ／ｍＬの濃度のＡＣＥ２タンパク質を添加し、振盪しながら３７℃で１時間インキュベートし、その後、０．１％のＴＷＥＥＮ２０を含有するＰＢＳで４回洗浄する。結合したＡＣＥ２タンパク質を、ウサギ抗ヒトＡＣＥ２ポリクローナル抗体：ＨＲＰ（Ｍｙ Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ、ＣＮ：ＭＢＳ７０４４７２７）によって３７℃で１時間検出し、その後４回洗浄する。基質３，３，５，５－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を各ウェルに加え、３７℃で２０分間インキュベートする。４５０ｎｍでの吸光度をＥＬＩＳＡプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ）によって測定する。
ｂ．遮断アッセイ
このアッセイの目的は、Ｓタンパク質とＡＣＥ２との結合がＡＣＥ２融合タンパク質（配列番号２３７及び２３８のそれぞれＡＣＥ２－ＥＣＤ－ｓＦｃ及びＡＣＥ２Ｎ－ＥＣＤ－ｓＦｃ）によって遮断され得るかをＡＣＥ２－ＥＣＤ－Ｆｃと対比して実証することである。具体的には、０．１Ｍの炭酸塩緩衝液（ｐＨ９．６）中に含まれた１μｇ／ｍｌのＡＣＥ２を使用して９６ウェルマイクロタイタープレート（ＭａｘｉＳｏｒｐ ＮＵＮＣ）を４℃で一晩被覆する。２％のＢＳＡで遮断した後、段階希釈された組換えＡＣＥ２タンパク質を１時間にわたって３７℃でＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質と共インキュベートし、その後、０．１％のＴＷＥＥＮ２０を含有するＰＢＳで４回洗浄する。結合したＳタンパク質を抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ抗体（ＨＲＰ）によって３７℃で１時間検出し、その後４回洗浄する。基質３，３，５，５－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を各ウェルに加え、３７℃で２０分間インキュベートする。４５０ｎｍでの吸光度をＥＬＩＳＡプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ）によって測定する。信号はタンパク質の希釈倍率の逆数に比例する。
ｃ．細胞に基づく中和アッセイ（フローサイトメトリー）
ＡＣＥ２融合タンパク質（配列番号２３７及び２３８のそれぞれＡＣＥ２－ＥＣＤ－ｓＦｃ及びＡＣＥ２Ｎ－ＥＣＤ－ｓＦｃ）による、ＡＣＥ２発現細胞に対するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質の結合の中和を、フローサイトメトリーによって測定する。手短に述べると、１０６個のＨＥＫ２９３／ＡＣＥ２細胞を剥がし、回収し、ＨＢＳＳ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）で洗浄する。段階希釈されたＡＣＥ２組換えタンパク質の存在下または非存在下でＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質を１μｇ／ｍＬの終濃度となるように細胞に添加し、その後、室温で３０分間インキュベートする。細胞をＨＢＳＳで洗浄し、１／５０の希釈度の抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ Ａｂ（ＨＲＰ）と室温でもう３０分間インキュベートする。洗浄後、細胞をＰＢＳ中１％のホルムアルデヒドで固定し、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメータ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）においてＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェアを使用して解析する。
ｄ．ＳＰＲアッセイによる親和性決定
ＳＰＲ装置（ＧＥ、ＢｉａｃｏｒｅＸ１００）を使用してＳ－ＲＢＤ－ＦｃをＣＭ５センサーチップ上に、捕捉キット（ＧＥ、ＢＲ１００８３９）の取扱説明書に示されているとおりに固定化する。反応サイクルのために一定レベルの組換えタンパク質を最初にセンサーチップ上に捕捉する。続いて、各周期において試料（ＡＣＥ２－ＥＣＤ－ｓＦｃまたはＡＣＥ２Ｎ－ＥＣＤ－ｓＦｃ）を様々な濃度で会合のためにチップに流し、その後、解離のための流動用緩衝液を流す。最後にチップを次の反応サイクルのために再生用緩衝液で再生する。データ解析では、少なくとも５回の反応周期からの結合パターン（またはセンサーグラム）をＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアによって解析して親和性パラメータ、例えば、ＫＤ、Ｋａ及びｋｄを得る。
実施例８
ＣＨＯ細胞内のＳ－ＲＢＤ融合タンパク質の設計、プラスミド構築及びタンパク質発現
１．ｃＤＮＡ配列の設計
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２からのＳタンパク質のｃＤＮＡ配列（配列番号２３９）をＣＨＯ細胞発現のために最適化する。この核酸は、配列番号２０として示されるＳタンパク質をコードする。Ｓタンパク質の受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶのＳタンパク質配列（配列番号２１）をＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２からの対応する配列（配列番号２０）と整列させることによって同定された。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２からのＳ－ＲＢＤポリペプチド（ａａ３３１～５３０）（ペプチド配列番号２２６、ＤＮＡ配列番号２４０）は、ｈＡＣＥ２に高い親和性で結合する結合ドメインであることが証明されたＳＡＲＳ－ＣｏＶのＳ－ＲＢＤ配列に対応する。
ＣＯＶＩＤ－１９感染症から個体を保護する医薬組成物を開発するために、Ｓタンパク質のＲＢＤは、免疫化後に抗体を誘導してＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を中和するための重要な標的である。Ｓ－ＲＢＤ－Ｆｃ融合タンパク質（ＤＮＡ配列番号２４６）を生成するためには、図６のＡ、及び図７に示すプラスミドマップに示されるように、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（配列番号２４０）のＳ－ＲＢＤ（ａａ３３１～５３０）をコードする核酸配列を免疫グロブリンＦｃの一本鎖（ＤＮＡ配列番号２４５）のＮ末端に融合させる。ＣＨＯ発現システムにおいてＳ－ＲＢＤ融合タンパク質における重要でないジスルフィド結合形成の不整合を回避するために、Ｓ－ＲＢＤポリペプチド（アミノ酸配列番号２２７、ＤＮＡ配列番号２４１）においてＣｙｓ３９１をＡｌａ３９１に置き換え、Ｃｙｓ５２５をＡｌａ５２５に置き換えて、Ｓ－ＲＢＤａ－ｓＦｃ融合タンパク質（アミノ酸配列番号２３６、ＤＮＡ配列番号２４７）を生成する。
受動免疫化としてのウイルス阻害による中和介入を開発するためには、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の受容体として作用してウイルス侵入を媒介するヒトアンジオテンシン変換酵素ＩＩ（ＡＣＥ２ 受託ＮＰ＿００１３５８３４４、アミノ酸配列番号２２８、ＤＮＡ配列番号２４２）が、Ｓタンパク質を遮断するための肝要な標的である。以前の試験（Sui J., et al., 2004）において結合親和性は、中和のための強力なｍＡｂに相当する１．７０Ｅ－９である。高用量のＡＣＥ２の投与は、コロナウイルス感染患者を治療するのに十分に安全であるはずである、というのも、高血圧治療のためのＡＣＥ２臨床試験のいくつかは非常に高い用量の投与で安全性プロファイルを示したからである（Arendse, L. B. et al., 2009）。
図６Ｃ、及び図８に示すプラスミドマップに示すように、ＡＣＥ２の細胞外ドメイン（アミノ酸配列２２９、ＤＮＡ配列番号２４３）を一本鎖免疫グロブリンＦｃ（アミノ酸配列番号２３２、ＤＮＡ配列番号２４５）と融合させてＳ－ＡＣＥ２ＥＣＤ－Ｆｃ融合タンパク質（ＤＮＡ配列番号２４８）を生成する。安全性の不確実性を低減するために、ＡＣＥ２ＥＣＤ融合タンパク質におけるペプチダーゼ活性を消失させる融合タンパク質がＣＨＯ発現システムにおいて産生され得る。具体的には、ＡＣＥ２の亜鉛結合ドメイン（アミノ酸配列番号２３０、ＤＮＡ配列番号２４４）においてＨｉｓ３７４をＡｓｎ３７４に置き換え、Ｈｉｓ３７８をＡｓｎ３７８に置き換えて、ＡＣＥ２ＮＥＣＤ融合タンパク質（アミノ酸配列番号２３８、ＤＮＡ配列番号２４９）を生成する。ヒンジ領域ではジスルフィド結合が全く形成されないため、ｓＦｃとの大型タンパク質融合体はＳタンパク質に対する結合を制限せずに最も強力な中和効果を実現するであろう。一本鎖Ｆｃの構造は、精製プロセスにおいてプロテインＡ結合及び溶離によって精製されるという利点も有する。Ｃｙｓ３４５－Ｃｙｓ３７０、Ｃｙｓ３８８－Ｃｙｓ４４１及びＣｙｓ４８９－Ｃｙｓ４９７によって形成される他のジスルフィド結合は依然として配列中に保たれて、ＡＣＥ２に結合する立体配座を維持する。
２．プラスミド構築及びタンパク質発現
ａ．プラスミド構築
Ｓ－ＲＢＤ－Ｆｃ及びＳ－ＲＢＤａ－Ｆｃ融合タンパク質を発現させるためには、これらのタンパク質をコードするｃＤＮＡ配列が適切な細胞株において産生され得る。ｃＤＮＡ断片のＮ末端にはタンパク質分泌のためのリーダーシグナル配列が付加され得、Ｃ末端は、一本鎖Ｆｃ（ｓＦｃ）、またはトロンビン切断配列に続くＨｉｓタグに連結され得る。ｃＤＮＡ断片は、選択のためのネオマイシン耐性遺伝子及び遺伝子増幅のためのｄｈｆｒ遺伝子を含有するものであるｐＮＤ発現ベクターに挿入され得る。ベクター及びｃＤＮＡ断片はＰａｃＩ／ＥｃｏＲＶ制限酵素によって消化され、その後、ライゲートされて４つの発現ベクターｐＳ－ＲＢＤ、ｐＳ－ＲＢＤ－ｓＦｃ、ｐＳ－ＲＢＤａ及びｐＳ－ＲＢＤａ－ｓＦｃが生成する。
ＡＣＥ２ＥＣＤ及びＡＣＥ２ＮＥＣＤ融合タンパク質を発現させるためには、これらのタンパク質をコードするｃＤＮＡ配列が適切な細胞株において産生され得る。ｃＤＮＡ断片のＣ末端は、一本鎖Ｆｃ、またはトロンビン切断配列に続くＨｉｓタグに連結され得る。ｃＤＮＡ断片は、ｐＮＤ発現ベクターに挿入されて４つの発現ベクターｐＡＣＥ２－ＥＣＤ、ｐＡＣＥ２－ＥＣＤ－ｓＦｃ、ｐＡＣＥ２Ｎ－ＥＣＤ、ｐＡＣＥ２Ｎ－ＥＣＤ－ｓＦｃが生成する。
ｂ．宿主細胞株
ＣＨＯ－Ｓ（商標）細胞株（Ｇｉｂｃｏ、Ａ１１３４６０１）は、成体チャイニーズハムスターの卵巣から樹立された安定した異数性細胞株である。宿主細胞株ＣＨＯ－Ｓ（商標）は、無血清懸濁液での成長に適合しており、高いトランスフェクション効率のためのＦＲＥＥＳＴＹＬＥ（商標）ＭＡＸ試薬との適合性を有する。８ｍＭのグルタミン補充剤（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｔ．２５０３００８１）及び抗凝集剤（Ｇｉｂｃｏ、Ｃａｔ．００１００５７ＤＧ）が補充されたＤＹＮＡＭＩＳ（商標）培地（Ｇｉｂｃｏ、Ｃａｔ．Ａ２６１７５－０１）の中でＣＨＯ－Ｓ細胞を培養する。
ＥｘｐｉＣＨＯ－Ｓ（商標）細胞株（Ｇｉｂｃｏ、Ｃａｔ．Ａ２９１２７）は、ＣＨＯ－Ｓ細胞株のクローン派生物である。ＥｘｐｉＣＨＯ－Ｓ（商標）細胞は、補充が何らなされていないＥｘｐｉＣＨＯ（商標）発現培地（Ｇｉｂｃｏ、Ｃａｔ．Ａ２９１００）における高密度懸濁培養に適合している。細胞は８％ＣＯ２の加湿雰囲気を有する３７℃のインキュベータ内に維持される。
ｃ．一過的発現
一過的発現のために、ＥＸＰＩＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）ＣＨＯキット（Ｇｉｂｃｏ、Ｃａｔ．Ａ２９１２９）を用いて発現ベクターを個々にＥｘｐｉＣＨＯ－Ｓ細胞にトランスフェクトする。トランスフェクト後１日目にＥＸＰＩＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）ＣＨＯエンハンサー及び最初の給送物を添加し、細胞を、８％ＣＯ２の加湿雰囲気を有する３７℃のインキュベータから５％ＣＯ２の加湿雰囲気を有する３２℃のインキュベータに移す。その後、２回目の給送物をトランスフェクト後５日目に添加し、トランスフェクト後１２～１４日目に細胞培養物を採集する。細胞培養物を採集した後、遠心分離及び０．２２μｍ濾過によって上清を清澄化する。一本鎖Ｆｃ及びＨｉｓタグを含有する組換えタンパク質をそれぞれプロテインＡクロマトグラフィー（Ｇｉｂｃｏ、Ｃａｔ．１０１００６）及びＮｉ－ＮＴＡクロマトグラフィー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｔ．Ｒ９０１０１）によって精製する。
ｄ．安定的トランスフェクション及び細胞選択
ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ＭＡＸ試薬（Ｇｉｂｃｏ、Ｃａｔ．１６４４７５００）を使用して発現ベクターをＣＨＯ－Ｓ細胞にトランスフェクトし、その後、８ｍＭのＬ－グルタミン、１：１００の希釈度の抗凝集剤、ピューロマイシン（ＩｎｖｏｖｏＧｅｎ、Ｃａｔ．ａｎｔ－ｐｒ－１）及びＭＴＸ（Ｓｉｇｍａ、Ｃａｔ．Ｍ８４０７）を含有する選択ＤＹＮＡＭＩＳ（商標）培地とインキュベートする。２回の選択期間の後、４つの安定したプール（１Ａ、１Ｂ、２Ａ、２Ｂ）が得られる。さらに、細胞クローンを半固形ＣｌｏｎｅＭｅｄｉａ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｃａｔ．Ｋ８７００）に播種すると同時に、高処理量システムＣｌｏｎｅＰｉｘＴＭ２（ＣＰ２）によるクローンスクリーニング及び単一細胞単離のための検出抗体を添加する。ＣＰ２によって取り出されたクローンを、８ｍＭのグルタミン及び抗凝集剤を含むＤＹＮＡＭＩＳ（商標）培地の中で、選択を伴わない１４日間のグルコース単純流加培養を用いてスクリーニングする。スクリーニング後、高収率でのクローンの単一細胞単離を限界希釈によって実施し、ＣｌｏｎｅＳｅｌｅｃｔ Ｉｍａｇｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用した撮像によってモノクローナル性を確認する。
ｅ．単純流加培養
単純流加培養を用いて、組換えタンパク質を発現させるＣＨＯ－Ｓ細胞の生産性を決定する。１２５ｍＬ容振盪フラスコにおいて、３０ｍＬのＤＹＮＡＭＩＳ培地を補充し、グルタミンを８ｍＭとし、抗凝集剤を１：１００の希釈度として、ＣＨＯ－Ｓ細胞を３×１０５細胞／ｍＬで播種する。細胞を、８％ＣＯ２の加湿雰囲気を有する３７℃のインキュベータ内でインキュベートする。４ｇ／Ｌのグルコースを３日目及び５日目に添加し、６ｇ／Ｌのグルコースを７日目に添加する。培養物を毎日採取して、細胞生存能が５０％未満に落ち込むかまたは培養１４日目に達するまで細胞密度、生存能及び生産性の決定を行う。
ｆ．遺伝子転写産物の精度
ＣＨＯ－Ｓ発現細胞による遺伝子転写の精度をＲＴ－ＰＣＲによって確認し、ＰＵＲＥＬＩＮＫ（商標）ＲＮＡ Ｍｉｎｉキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃａｔ．１２１８３０１８Ａ）を使用して細胞の全ＲＮＡを単離する。その後、Ｍａｘｉｍａ Ｈ Ｍｉｎｕｓ第一鎖ｃＤＮＡ合成キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｃａｔ．Ｋ１６５２）を使用して全ＲＮＡから第一鎖ｃＤＮＡを逆転写する。組換えタンパク質のｃＤＮＡを精製し、ｙＴ＆Ａベクター（Ｙｅａｓｔｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｃｏ．，Ｌｔｄ Ｃａｔ．ＹＣ２０３）にライゲートする。最後に、ｃＤＮＡ配列をＤＮＡシーケンシングによって確認する。
ｇ．発現細胞の安定性
細胞を１～２×１０５細胞／ｍＬで播種し、選択試薬を含まない培地の中で６０世代にわたって培養する。この期間中に培養物の細胞密度が１．０×１０６細胞／ｍＬ以上に達した時点で培養物を１～２×１０５細胞／ｍＬの細胞密度で再び継代する。６０世代にわたる培養の後、グルコース単純流加培養を用いて細胞性能及び生産性を、ＬＭＣＢから解凍したての細胞と比較する。細胞における生成物生産性の安定性の判定基準は、６０世代にわたる培養の後の７０％を上回る力価である。
実施例９
ｓＦｃ融合タンパク質及びＨｉｓタグ付きタンパク質の精製及び生化学的特性評価
１．ｓＦｃ融合タンパク質の精製
採集された細胞培養物の馴化培地からプロテインＡ－セファロースクロマトグラフィーによって全てのｓＦｃ融合タンパク質を精製した。ｓＦｃ融合タンパク質をプロテインＡ親和性カラムによって捕捉した。洗浄及び溶離を行った後、タンパク質溶液のｐＨを３．５に調整した。その後、１Ｍのトリス塩基緩衝液、ｐＨ１０．８の添加によってタンパク質溶液をｐＨ６．０に中和した。融合タンパク質の純度をポリアクリルアミドゲル電気泳動によって決定した。タンパク質濃度を波長２８０ｎｍでのＵＶ吸光度によって測定した。
２．Ｈｉｓタグ付きタンパク質
馴化培地をＮｉ－ＮＴＡ樹脂と混合して製造業者のマニュアルに従って融合タンパク質を精製した。５０ｍｍｏｌ・Ｌ－１のＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍｍｏｌ・Ｌ－１のＮａＣｌ、及び２５０ｍｍｏｌ・Ｌ－１のイミダゾールを含有するｐＨ８．０の溶離液でＨｉｓタグ付きタンパク質を溶離した。溶離された溶液を、Ａｍｉｃｏｎ ＹＭ－５を使用して濃縮し、その後、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－７５カラムに通して不純物を除去し、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－２５カラムに通して塩を除去し、その後、回収されたタンパク質溶液を凍結乾燥した。Ｈｉｓタグ付きタンパク質の純度をポリアクリルアミドゲル電気泳動によって決定した。タンパク質濃度を波長２８０ｎｍでのＵＶ吸光度によって測定した。
３．（１）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染、回復またはワクチン接種個体において中和抗体を測定するための高精度ＥＬＩＳＡのために使用される、（２）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を予防するための免疫原としての、及び（３）ＣＯＶＩＤ－１９の治療のための長時間作用性抗ウイルスタンパク質としての、ｓＦｃ融合タンパク質及びＨｉｓタグ付きタンパク質の生化学的特性評価。
（１）感染、回復ＣＯＶＩＤ－１９患者またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチン接種個体において中和抗体を測定するための高精度ＥＬＩＳＡの試薬として、（２）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染の予防のための高精度デザイナーワクチン製剤での代表的な免疫原として、及び（３）ＣＯＶＩＤ－１９の治療のための長時間作用性抗ウイルスタンパク質として使用するために、上記方法に従ってＳ１－ＲＢＤ－Ｈｉｓ（配列番号３３５）、Ｓ１－ＲＢＤ－ｓＦｃ（配列番号２３５）及びＡＣＥ２－ＥＣＤ－ｓＦｃ（配列番号２３７）を調製し、精製した。
ｓＦｃ融合タンパク質及びＨｉｓタグ付きタンパク質を精製した後、タンパク質の純度を、非還元及び還元条件下でクーマシーブルー染色を用いるＳＤＳ－ＰＡＧＥによって決定した（図９～１１）。図９は、非還元条件下（レーン２）及び還元条件下（レーン３）で高度に精製されたＳ１－ＲＢＤ－ｓＦｃタンパク質の調製物を示す画像である。図１０は、非還元条件下（レーン２）及び還元条件下（レーン３）で高度に精製されたＳ１－ＲＢＤ－Ｈｉｓタンパク質の調製物を示す画像である。図１１は、非還元条件下（レーン２）及び還元条件下（レーン３）で高度に精製されたＡＣＥ２－ＥＣＤ－ｓＦｃタンパク質の調製物を示す画像である。
精製タンパク質のさらなる特性評価を質量分析及びグリコシル化分析によって行った。
ａ．Ｓ１－ＲＢＤ－Ｈｉｓ － ＬＣ質量分析
精製Ｓ１－ＲＢＤ－Ｈｉｓタンパク質のさらなる特性評価をＬＣ質量分析によって行った。Ｓ１－ＲＢＤ－Ｈｉｓタンパク質の理論分子量は、そのアミノ酸配列に基づくと、グリコシル化を含めた翻訳後修飾を全く考慮しない状態で２４，１００．９６Ｄａである。図１２は、２６，７８３Ｄａから２８，９３２Ｄａまでにわたる分子量を有する分子種の群が検出され、主要ピークが２７，３９０．８９Ｄａにあることを示しており、タンパク質がグリコシル化されていることを示唆している。
ｂ．Ｓ－ＲＢＤ－ｓＦｃ － ＬＣ質量分析及びグリコシル化分析
ｉ．グリコシル化
糖タンパク質は、Ｎ結合型グリコシル化及びＯ結合型グリコシル化という、２種類のグリコシル化リンケージを有し得る。Ｎ結合型グリコシル化は通常、ＸａａをＰｒｏ以外の任意のアミノ酸残基とする配列：Ａｓｎ－Ｘａａ－Ｓｅｒ／Ｔｈｒの中のアスパラギン（Ａｓｎ）残基において起こり、炭水化物部分はアスパラギンの側鎖上のＮＨ２によってタンパク質に結合する。Ｏ結合型グリコシル化は、セリンまたはスレオニン残基の側鎖ＯＨ基を利用する。
Ｓ－ＲＢＤ－ｓＦｃのグリコシル化部位をトリプシン消化及びそれに続くＬＣ－ＭＳ及びＭＳ／ＭＳ（図１３及び図１４）によって調べた。図１３は、Ｓ－ＲＢＤ－ｓＦｃが、アミノ酸位置１３のアルギニン残基（Ｎ１３）にある１つのＮ結合型グリコシル化部位、及びアミノ酸位置２１１（Ｓ２１１）及び位置２２４（Ｓ２２４）のセリン残基にあるＯ－グリコシル化部位を有することを示している。
ｉｉ．Ｎ－グリコシル化
Ｓ－ＲＢＤ－ｓＦｃのＮ結合型グリカン構造を質量分析（ＭＳ）スペクトル技術によって分析した。手短に述べると、ＰＮＧアーゼＦを使用してＮ－オリゴ糖を精製タンパク質から遊離させた。その後、Ｎ結合型グリカンの部分を２－アミノベンズアミド（２－ＡＢ）でさらに標識付けして質量分析におけるグリカン信号を増強した。最後に、コンジュゲートされたオリゴ糖を、マッピングのための蛍光検出器を使用する順相ＨＰＬＣによって、及び構造同定のための質量分析によって調べた。図１３は、Ｓ－ＲＢＤ－ｓＦｃタンパク質上に１０個のＮ結合型グリカンが同定され、主要なＮ－グリカンがＧ０Ｆ及びＧ０Ｆ＋Ｎであったことを示している。Ｓ－ＲＢＤ－ｓＦｃのＮ結合型グリカンの炭水化物構造を表１４にまとめる。
ｉｉｉ．Ｏ－グリコシル化
Ｓ－ＲＢＤ－ｓＦｃのＯ結合型グリカンをトリプシン消化及びそれに続く質量分析スペクトル技術によって調べた。トリプシン消化後、Ｏ結合型グリカンを含有するピークを集め、それらの分子量を質量分析によって決定した。図１３は、Ｓ－ＲＢＤ－ｓＦｃタンパク質上に６つのＯ結合型グリカンが同定されたことを示している。Ｓ－ＲＢＤ－ｓＦｃのＯ結合型グリカンの炭水化物構造を表１５にまとめる。
ｉｖ．ＬＣ質量分析
精製Ｓ１－ＲＢＤ－ｓＦｃタンパク質の特性評価をＬＣ質量分析によって行った。Ｓ１－ＲＢＤ－ｓＦｃタンパク質の理論分子量は、そのアミノ酸配列に基づくと、４８，３４７．０４Ｄａである。図１４は、４９，９８４．５１Ｄａに主要ピークを有するＳ１－ＲＢＤ－ｓＦｃタンパク質の質量分析プロファイルを示す。理論分子量とＬＣ質量分析によって実測された質量との差は１，６３７．４７Ｄａであり、これは、図中に示されるように精製Ｓ－ＲＢＤ－ｓＦｃタンパク質がＮ－及び／またはＯ－グリカンを含有することを示唆している。
ｃ．ＡＣＥ２－ＥＣＤ－ｓＦｃ － ＬＣ質量分析及びグリコシル化分析
ｉ．グリコシル化
ＡＣＥ２－ＥＣＤ－ｓＦｃのグリコシル化部位をトリプシン消化及びそれに続くＬＣ－ＭＳ及びＭＳ／ＭＳによって調べた。図１５は、ＡＣＥ２－ＥＣＤ－ｓＦｃタンパク質が７つのＮ結合型グリコシル化部位（Ｎ５３、Ｎ９０、Ｎ１０３、Ｎ３２２、Ｎ４３２、Ｎ５４６、Ｎ６９０）及び７つのＯ結合型グリコシル化部位（Ｓ７２１、Ｔ７３０、Ｓ７４０、Ｓ７４４、Ｔ７４８、Ｓ７５１、Ｓ７６４）を有することを示している。
ｉｉ．Ｎグリコシル化
ＡＣＥ２－ＥＣＤ－ｓＦｃのＮ結合型グリカン構造を質量分析（ＭＳ）スペクトル技術によって分析した。手短に述べると、ＰＮＧアーゼＦを使用してＮ－オリゴ糖をタンパク質から遊離させた。その後、Ｎ結合型グリカンの部分を２－アミノベンズアミド（２－ＡＢ）でさらに標識付けして質量分析におけるグリカン信号を増強した。最後に、コンジュゲートされたオリゴ糖を、マッピングのための蛍光検出器を使用する順相ＨＰＬＣによって、及び構造同定のための質量分析によって調べた。図１５は、ＡＣＥ２－ＥＣＤ－ｓＦｃタンパク質上に１７個のＮ結合型グリカンが同定され、主要なＮ－グリカンがＧ０Ｆ及びＧ０Ｆ＋Ｎであったことを示している。ＡＣＥ２－ＥＣＤ－ｓＦｃのＮ結合型グリカンの炭水化物構造を表１６にまとめる。
ｉｉｉ．Ｏ－グリコシル化
ＡＣＥ２－ＥＣＤ－ｓＦｃのＯ結合型グリカンをトリプシン消化及びそれに続く質量分析スペクトル技術によって調べた。トリプシン消化後、Ｏ結合型グリカンを含有するピークを集め、それらの分子量を質量分析によって決定した。図１５は、８つのＯ結合型グリカンが同定されたことを示している。ＡＣＥ２－ＥＣＤ－ｓＦｃのＯ結合型グリカンの炭水化物構造を表１７にまとめる。
ｉｖ．ＬＣ質量分析
精製ＡＣＥ２－ＥＣＤ－ｓＦｃタンパク質の特性評価をＬＣ質量分析によって行った。ＡＣＥ２－ＥＣＤ－ｓＦｃタンパク質の理論分子量は、そのアミノ酸配列に基づくと、１１１，２３４．７０Ｄａである。図１６は、１１７，７４８．５３４Ｄａに主要ピークを有するＡＣＥ２－ＥＣＤ－ｓＦｃタンパク質の質量分析プロファイルを示す。理論分子量とＬＣ質量分析によって実測された質量との差は１，６３７．４７Ｄａであり、これは、精製ＡＣＥ２－ＥＣＤ－ｓＦｃタンパク質がＮ－及び／またはＯ－グリカンを含有することを示唆している。
ｄ．Ｓ１－ＲＢＤ－ｓＦｃの配列及び構造
Ｓ１－ＲＢＤ－ｓＦｃタンパク質（配列番号２３５）の配列及び構造を図５２Ａに示す。Ｓ１－ＲＢＤ－ｓＦｃタンパク質は、１つのＮ結合型グリカン（Ａｓｎ１３）及び２つのＯ結合型グリカン（Ｓｅｒ２１１及びＳｅｒ２２４）からなる糖タンパク質である。影付き部分（ａａ１～ａａ２００）は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳ１－ＲＢＤ部分（配列番号２２６）を表し、四角で囲われた部分（ａａ２０１～ａａ２１５）は変異型ヒンジ領域（配列番号１８８）を表し、影なし／四角囲みなしの部分（ａａ２１６～ａａ４３１）はＩｇＧ１のｓＦｃ断片を表す。ＩｇＧ１の一本鎖におけるＨｉｓ２９７によるＡｓｎ２９７の置換（ＥＵインデックス付番）（すなわち、図５２Ａに示される配列番号２３５中のＨｉｓ２８２）を下線で示す。Ｓ１－ＲＢＤ－ｓＦｃタンパク質の分子量は約５０ｋＤａであり、６対のジスルフィド結合（Ｃｙｓ６－Ｃｙｓ３１、Ｃｙｓ４９－Ｃｙｓ１０２、Ｃｙｓ６１－Ｃｙｓ１９５、Ｃｙｓ１５０－Ｃｙｓ１５８、Ｃｙｓ２４６－Ｃｙｓ３０６及びＣｙｓ３５２－Ｃｙｓ４１０）を形成している１２個のシステイン残基（Ｃｙｓ６、Ｃｙｓ３１、Ｃｙｓ４９、Ｃｙｓ６１、Ｃｙｓ１０２、Ｃｙｓ１５０、Ｃｙｓ１５８、Ｃｙｓ１９５、Ｃｙｓ２４６、Ｃｙｓ３０６、Ｃｙｓ３５２及びＣｙｓ４１０）を含めた４３１個のアミノ酸残基を含有し、これらは図５２Ａ中に連結線として示される。Ｓ１－ＲＢＤ－ｓＦｃのジスルフィド結合の概要を図５２Ｂに示す。
ＲＢＤドメイン上には１つのＮ－グリコシル化部位Ａｓｎ１３が存在し、ｓＦｃ断片上には２つのＯ－グリコシル化部位Ｓｅｒ２１１及びＳｅｒ２２４が存在する。図５２Ａに示される残基の上に、Ｎ－グリコシル化部位は星印（＊）で示され、２つのＯ－グリコシル化部位は十字（＋）で示される。保存されたアスパラギン残基Ａｓｎ２９７（ＥＵインデックス付番）におけるＩｇＧ Ｆｃ断片のグリコシル化は、Ｆｃ媒介エフェクター機能、例えば補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）及び抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）の必須因子である。Ｓ１－ＲＢＤ－ｓＦｃ中のＦｃ断片は、プロテインＡ親和性クロマトグラフィーによる精製のために設計される。加えて、Ｆｃ媒介エフェクター機能による標的ｈＡＣＥ２の除去を防止するために、重鎖のＡｓｎ２９７にあるグリコシル化部位をＨｉｓへの変異（ＥＵ付番でＮ２９７Ｈ、Ｓ１－ＲＢＤ－ｓＦｃタンパク質においてＮ２８２Ｈ）によって除去した。
ｅ．ｈＡＣＥ２に対するＳ１－ＲＢＤ－ｓＦｃの結合活性
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＢＤはｈＡＣＥ２に結合するので、ｈＡＣＥ２に対する結合の測定は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質のそれを代表する構造をＳ１－ＲＢＤ－Ｆｃがとっていることを実証するための妥当な方法である。ワクチンの結合活性をｈＡＣＥ２ ＥＬＩＳＡにおいて試験し、８．４７７ｎｇ／ｍＬのＥＣ５０でｈＡＣＥ２に結合することが実証され、高い親和性が示された（図５２Ｃ）。
実施例１０
免疫アッセイにおいて免疫吸着剤として使用するためのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシド（Ｎ）、スパイク（Ｓ）、膜（Ｍ）、エンベロープ（Ｅ）及びオープンリーディングフレーム９ｂ（ＯＲＦ９ｂ）タンパク質からの抗原性ペプチドのデザイン及び同定
１．Ｎ、Ｓ、Ｍ、Ｆ及びＯＲＦ９ｂタンパク質からのペプチド抗原
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシド（Ｎ）タンパク質（配列番号６、表２）に由来する２５個超の入念に設計されたペプチドを、感染個体の抗体の検出のための様々な免疫アッセイの免疫吸着剤としてのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原混合物の調製に使用するのに適する抗原性ペプチドの同定のために合成した。抗原性ペプチドのアミノ酸配列を表１３（配列番号２５３～２７８）に示し、完全長Ｎタンパク質中でのペプチドの相対位置を図１７に示す。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク（Ｓ）タンパク質（配列番号２０、表３）に由来する配列を有する５０個超の入念に設計されたペプチドを、感染個体の抗体の検出のための様々な免疫アッセイの免疫吸着剤としてのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原混合物の調製に使用するのに適する抗原性ペプチドの同定のために合成した。抗原性ペプチドのアミノ酸配列を表１３（配列番号２７９～３２７）に示し、完全長Ｓタンパク質中でのペプチドの相対位置を図１８に示す。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２膜（Ｍ）タンパク質（配列番号１、表１）の露出領域に由来する配列を有する３個の入念に設計されたペプチドを、感染個体の抗体の検出のための様々な免疫アッセイの免疫吸着剤としてのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原混合物の調製に使用するのに適する抗原性ペプチドの同定のために合成した。抗原性ペプチドのアミノ酸配列を表１及び表１３（配列番号４、５、２５０及び２５１）に示し、完全長Ｍタンパク質中でのペプチドの相対位置を図１９に示す。
エンベロープ（Ｅ）及びＯＲＦ９ｂである２つの小さなＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質に由来する配列を有する８個の入念に設計されたペプチドを、感染個体の抗体の検出のための様々な免疫アッセイの免疫吸着剤としてのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原混合物の調製に使用するのに適する抗原性ペプチドの同定のために合成した。抗原性ペプチドのアミノ酸配列を表１３（Ｅタンパク質については配列番号２５２、ＯＲＦ９ｂタンパク質については配列番号３２８～３３４）に示す。完全長Ｅタンパク質中及びＯＲＦ９ｂタンパク質中でのペプチドの相対位置をそれぞれ図２０及び図２１に示す。
２．ＥＬＩＳＡの免疫吸着剤としてのペプチド抗原の評価
臨床診断及びＰＣＲ検査の両方によって確認されたＣＯＶＩＤ－１９患者からの１０個の代表的な血清のパネルを、ペプチド抗原の相対抗原性の評価のために使用した。
図２２は、Ｎタンパク質中で、（ａ）Ｎ末端側ドメイン（ＮＴＤ）の部分を含み、ＳＲに富むモチーフを有するリンカー領域まで延在するアミノ酸１０９～１９５（配列番号２５９、２６１、２６３及び２６５）、（ｂ）アミノ酸２１３～２６６（配列番号２６９及び２７０）、及び（ｃ）ＮＬＳ及びＩＤＲ領域を含むＣ末端に位置するアミノ酸３５５～４１９（配列番号１８）を含む高抗原性領域が同定されたことを示す。
図２３は、Ｓタンパク質中で、（ａ）ＲＢＤのすぐ隣にある領域を含むアミノ酸５３４～５８８（配列番号２８１）、（ｂ）Ｓ２サブユニットのＦＰ領域を含むアミノ酸７８５～８３９（配列番号３７及び３８）、（ｃ）Ｓ２サブユニットのＨＲ１領域を含むアミノ酸９２８～１０１５（配列番号３０８）、及び（ｄ）Ｓ２サブユニットのＨＲ２領域の部分を含むアミノ酸１１０４～１１８３（配列番号３２１～３２４）を含む高抗原性領域が同定されたことを示す。図２４は、Ｓタンパク質の３Ｄ構造において４つの抗原部位（配列番号３８、２８１、３０８及び３２２）が局在していることを示す。左パネルに示されるように、２つの抗原性ペプチド（配列番号２８８及び３８）は球状ドメインとしてＳタンパク質の表面上に露出している。右パネルに示されるように、１つの抗原性部位（配列番号３０８）は、長いヘリカルループ内にある。４つ目の抗原性ペプチド（配列番号３２２）は、Ｃ末端ドメインの周辺に位置しており、左及び右パネルに示される。
図２５～２７は、Ｅタンパク質（配列番号２５１）、Ｍタンパク質（配列番号５）及びＯＲＦ９ｂタンパク質（配列番号２７）の各々から弱抗原性領域が同定されたことを示す。
Ｎ、Ｓ及びＭ領域からの抗原性ペプチドの混合物は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染した個体からの抗体による最適な結合性を有する固相免疫吸着剤として製剤化され得る。Ｎ、Ｓ及びＭタンパク質からの抗原性ペプチドの混合物は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する抗体の検出及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染の血清監視のための高感度で特異的な免疫アッセイのために使用され得る。
図２８は、４つの代表的なＰＣＲ陽性ＣＯＶＩＤ－１９患者血清（ＬＤＢ、ＳＲ２５、ＤＢ２０及びＡ２９）から得られた試料についてのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＥＬＩＳＡの分析感度を示す。図は分析感度を示し、Ｍ、Ｎ及びＳタンパク質に由来する配列番号５、１８、３８、２６１、２６６、２８１及び３２２を有する抗原性ペプチドの混合物で製剤化された代表的なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＥＬＩＳＡによる１：６４０もの高い希釈度から１：２５６０を上回る高い希釈度までに対する陽性信号を実証している。
図２９及び図３０に示されるように、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染後の個体の特徴的な抗体を決定するためにＥＬＩＳＡにおいて免疫吸着剤として個々のペプチド抗原を使用して各患者についての特異的な血清反応性パターンを得てもよい。各個の患者によって生み出された抗体についてのこの詳細な評価は、宿主細胞抗原を表すタンパク質との抗体交差反応性または他の干渉因子によって引き起こされる偽陽性を示すことが頻繁にある血清陽性に確証を与えるさらなる検証的プロファイルを有しておらず単純な陽性または陰性の判定を与えることしかできない従来のアッセイとは実に対照的であろう。
実施例１１
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＥＬＩＳＡはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２エピトープに由来する合成ペプチド抗原をヒト血清または血漿におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する抗体の検出のために採用する
ＣＯＶＩＤ－１９の世界的汎流行に応えて、新型コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する抗体の検出のための、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２抗原性ペプチドを採用した血液スクリーニング検査キットが開発された。
カットオフ値以上の吸光度値を有する検体は「初期反応性」と定義される。初期反応性検体は、２反復で再検査されるべきである。２反復の反復検査のどちらにおいても反応しない検体はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する抗体について「非反応性」とみなされる。反復検査の片方または両方において反応性である初期反応性検体は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する抗体について「反復的反応性」とみなされる。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＥＬＩＳＡは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイク（Ｓ）、膜（Ｍ）及びヌクレオカプシド（Ｎ）タンパク質の高抗原性セグメントに対する特異性を有する抗体を捕捉する合成ペプチドからなる、反応マイクロプレートのウェルに結合した免疫吸着剤を採用する。アッセイの過程において、希釈された陰性対照及び検体を反応マイクロプレートウェルに加え、インキュベートする。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異抗体は、存在する場合、免疫吸着剤に結合することになる。反応マイクロプレートウェルを十分に洗浄して未結合の抗体及び他の血清成分を除去した後、ヒトＩｇＧのＦｃ部分に対して特異的である西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲートヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体の標準化調製物を各ウェルに加える。その後、このコンジュゲート調製物を、捕捉された抗体と反応させる。ウェルをもう１回十分に洗浄して未結合の西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート抗体を除去した後、過酸化水素及び３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を含有する基質溶液を添加する。大抵の場合、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異抗体が存在するときはその量に比例して青色に呈色するが、さらなる免疫アッセイ、例えばＩＦＡによって、及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の固有の遺伝子産物のための抗原を同定できるより特異的な検査、例えばＰＣＲによって反応性検体を繰り返し調べることは適切である。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２汎流行時の数年前に採取された血清及び血漿試料からの米国血液ドナーの中で検出可能な反応性がないことは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を他のヒトコロナウイルスによる感染と見分けるアッセイの特異性を示唆していた。他の検査と比較して本開示の合成抗原は、高度に標準化されており、バイオハザード試薬が不要であり、スケールアップ生産が簡単であるという利点を提供する。さらに、ＥＬＩＳＡ様式による検査は、大規模スクリーニングのための自動化が容易であり得る。高特異性ペプチドに基づくＳＡＲＳ－ＣｏＶ２抗体検査は、広範囲に遡及的監視を行うための簡便な手段である。ＰＣＲ確認済みＣＯＶＩＤ－１９患者（ＮＴＵＨ、Ｔａｉｗａｎ）からの３、８及び１０日目の一連の３つの抗体陽転採取血液を検査した。症候開始後１０日目が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＥＬＩＳＡによる陽性信号が得られた最も早い時間点であった。いくつかのさらなる抗体陽転採取血液を検査したが、症候開始からの早い感染時期の感度を以下の試験１及び２に報告する。
１．アッセイ特異性及び感度の評価
試験１では、（１）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２とは無関係な他のウイルス感染を有することが分かっている者（台湾及び米国）から採取された、及び（２）２００７年採取の正常ヒト血漿（ＮＨＰ）からの、定期的に健康診断を受けている従業員のコホートから採取された血清試料／血漿試料を、まずＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＥＬＩＳＡで検査した。これらの試料は、多数の非ＣＯＶＩＤ－１９試料（ｎ＝９２２）を使用してアッセイ特異性を評価してアッセイに適するカットオフ値の決定のための論理的根拠を確立するために検査された。図３１に示すように、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染とは無関係な９２２個の検体は全て、アッセイによるＯＤ読み値が非常に低かった。
ａ．試験１：性能特徴：他のウイルス感染との交差反応性のなさ：
ＨＩＶ（５１個の試料）、ＨＢＶ（３６０個の試料）、ＨＣＶ（９２個の試料）が陽性である患者、ならびに以前にＮＬ６３株（２個の試料）及びＨＫＵ１株（１個の試料）のコロナウイルス感染を有する患者を含めて他のウイルス感染を有することが分かっている患者からの血清試料を使用して得られたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＥＬＩＳＡの検査結果を表１８に示す。全ての試料においてＯＤ読み値がブランクのものに近かったことから、これらの試料のどれにおいても非交差反応性は認められなかった。２００７年採取の正常ヒト血漿（ＮＨＰ）からの、定期的に健康診断を受けている従業員のコホートからの全ての試料についても同様のブランクに近いＯＤ読み値が得られた。
ｂ．ＮＲＣ＋０．２を基準とするＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＥＬＩＳＡのカットオフ値の決定
本開示のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＥＬＩＳＡのカットオフ値を、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＥＬＩＳＡによって検査された９２２個の試料からのＯＤ読み値に基づいてＮＲＣ＋０．２（すなわち、免疫アッセイの各実施のためのキットと共に含まれる非反応性対照（ＮＲＣ）の３つのＯＤ４５０ｎｍ読み値の平均に０．２単位を加えたもの）に定め、理論的根拠を以下に論述する。ＮＲＣ＋０．２のカットオフ値は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＥＬＩＳＡが、ＰＣＲ陽性確認ＣＯＶＩＤ－１９患者の検出のための最大限の感度、及び母集団における１００％の特異性を有するという、最適な結果を可能にする。表１９は、正常ヒト血漿、正常ヒト血清、ならびに他の（つまり非ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）ウイルス感染を有する個体からの血清もしくは血漿試料の検査のために収集された全ての検査実施からのＮＲＣの平均ＯＤ４５０ｎｍ読み値を報告する。プレート実施によるＮＲＣの平均値は、図３１に示されるように一貫して正常ヒト血漿の平均に近かった。正常ヒト血漿／血清、及び他の（つまり非ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）ウイルス感染を有する個体からの血清／血漿試料の標準偏差（ＳＤ）を検査場所にわたって調べると標準偏差（ＳＤ）は０．００６から０．０２０にまで及んでいた（表１９）。カットオフ値をＮＲＣ＋０．２単位となるように定めることによって、ＮＲＣ＋４ＳＤの平均（０．０２０×４＝０．０８０）よりも高いバーが得られるが、これは陰性的中率の９９．９９％の信頼レベル（ｚ値＝３．９８１）を可能にする。また、ＮＲＣ＋２単位のカットオフ値は、抗体陽転から陽性への過程にある可能性がより高い、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染のリスクが高い個体（例えば病院の医療労働者及び公共サービス提供者など）のための、「平均ＮＲＣ＋０．１２」から「平均ＮＲＣ＋０．２」までのグレーゾーンを確立する余地を提供する。
ｃ．試験１：性能特徴：全てのＣＯＶＩＤ－１９入院患者において抗体陽転を検出する１００％の感度
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＥＬＩＳＡ（血清／血漿）からの検査結果を、表２０及び図３２に示されるように（１）患者を入院登録した時に採取される試料が大部分である、症候開始後１０日目よりも前のもの、（２）病院で治療中の患者について症候開始後１０日目よりも後のもの、（３）退院日のもの、及び（４）退院後１４日目の病院再訪問時のものを基準として評価した。
試験１の結果は、（１）入院登録時に採取された試料（ｎ＝１０）の感度が０％であったこと、（２）入院中に全て（２３例中２３例）が陽性に抗体陽転して１００％の検査感度をもたらしたこと、（３）退院日に全て（５例中５例）が陽性の反応性を示して１００％の感度をもたらしたこと、及び（４）退院後１４日目の病院再訪問時に全てが陽性の反応性を示して１００％の感度をもたらしたことを示している。試験１の検査の全体的感度は７８．２％（３６／４６）（または、１つの試料について１名の患者から異なる時間点で２回行って３７／４７＝７８．７％）であった。
まとめると、図３３に示されるように、試験１で検査した全ての試料についてＮＲＣ＋０．２カットオフ値に基づいて算出されたＳ／Ｃ比率の分布をプロットした。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染に無関係な個体から採取された９２２個の試料のうち、このＥＬＩＳＡによって陽性の反応性を示したものはなかった。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染に無関係な者、及び症候開始後１０日目に試料が採取された４６名のＣＯＶＩＤ－１９確認患者からの試料全てについての要約結果を表２１に示した。
本開示のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＥＬＩＳＡは１００％の全体的感度を示し、症候開始後１０日目の入院ＣＯＶＩＤ－１９患者についての感度が１００％であった。症候開始後間もない者から採取された試料を含む４６名全てのＣＯＶＩＤ－１９確認患者を計算に加えた場合には７８．２％の全体的感度が得られた。これらの陽性試料は、関連する実施例に記載されるような陽性の確認のための他の血清学的アッセイ、及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対して中和活性を向けることができる抗体の量を含めた免疫状態のさらなる評価によって、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２反応性抗体の抗原性プロファイルについてのさらなる特性評価がなされ得る。
ｄ．試験２：性能特徴：ＣＯＶＩＤ－１９患者の抗体陽転についての感度
１７名のＰＣＲ確認及び入院ＣＯＶＩＤ－１９患者からの計３７個の試料を、本開示のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＥＬＩＳＡを用いて検査した。表２２に示すように、症候開始に関連付けた治療中の血清採取日に関する詳細な情報が得られた。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＥＬＩＳＡ（血清／血漿）からの検査結果を、表２３に示されるように（１）入院後７日目よりも前、（２）入院後７～１４日目、及び（３）入院後１４日目よりも後を基準として評価した。結果は、試料の相対特異性が、症候開始後７日目よりも前では２５％であり、症候開始後７～１４日目では６３．６％であり、入院後１４日目よりも後では１００％であったことを示している。３７個の試料全ての全体的感度は８１．１％（３０／３７）であり、このコホートにおいて症候開始後１４日目よりも後での陽性的中率の精度は１００％であった。
ｅ．結論
本開示のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＥＬＩＳＡスクリーニングアッセイは、ヒト血清または血漿の中の低レベルの抗体を検出できる高い感度及び特異性を有する検査である。アッセイの特徴は以下のとおりである。
・早くも症候開始後２日目（試験２からの１名のＩＤ番号１１の患者、表２２）において、及び通例は症候開始後７～１０日目において、ヒト抗体陽転試料中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体を検出することができ、試験１及び試験２においてそれぞれ症候開始後１０日目及び１４日目の陽性的中率が１００％であること。試験１及び２の全体的感度率はそれぞれ７８．２％及び８１．１％であった。
・正常血漿ドナーからの、及び２０２０年以前に採取された健康診断を受けている従業員のコホートからの血清／血漿試料からのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対して特異性が１００％であること。
・２０２０年以前に採取された、他のコロナウイルスＮ－６３、ＨＫＵを含めた他のウイルス感染、例えば、ＨＣＶ、ＨＢＶ、ＨＩＶを有する個体からの試料に対する交差反応性がみられなかったこと。
２．特に注意すべきこと
本開示の（上記の）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＥＬＩＳＡ手順、及び結果の解釈の節は、個々の対象からの血漿または血清の中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する抗体の存在を検査する場合には厳密に遵守されなければならない。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＥＬＩＳＡは、個体単位で血清または血漿を検査するために設計されたため、その解釈に関するデータは、個々の試料を検査することで得られた。他の体液に対して実施された検査を解釈するために利用できるデータは現時点では不十分であり、これらの検体の検査は推奨されない。
本開示のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＥＬＩＳＡを用いて血清または血漿が陽性であると判明した人は、ウイルスに感染していると推定される。本開示のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＥＬＩＳＡの検査結果が陽性である個体は、他者に伝染することができる活動性感染を個体が有しているか否かを判定するために他の分子的検査（例えばＲＴ－ＰＣＲ）を用いて検査されるべきである。適切なカウンセリング及び医学的評価も提供されるべきである。そのような評価は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体検査の重要な部分であると考えられ、新しく採取された試料からの検査結果検証を含むべきである。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２によって引き起こされるＣＯＶＩＤ－１９は臨床的症候群であり、その診断は臨床的にのみ確立され得る。たとえ反応性検体の推奨される研究によってＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体の存在が裏付けられているとしても、本開示のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＥＬＩＳＡ検査を活動性ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染の診断のために単独で用いることはできない。血清学的研究のいかなる時点での陰性検査結果も、将来ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に曝露されるかまたは感染する可能性を排除するものではない。
３．ＵＢＩ（登録商標）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＥＬＩＳＡの性能評価
ａ．交差反応性
ＵＢＩ（登録商標）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＥＬＩＳＡを（以下に記載される）臨床的一致試験において評価し、１００％（１５４／１５４）の陰性一致パーセントを実証した。加えて、非ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異抗体の交差反応性を、呼吸器合胞体ウイルス（１０）及びＡＮＡ（６）に対する既知の抗体を有する血清を使用して調べた。干渉は何ら認められなかった。
ｂ．臨床的一致試験
ＵＢＩ（登録商標）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＥＬＩＳＡアッセイの臨床的性能を決定する試験を実施した。
ＵＢＩ（登録商標）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＥＬＩＳＡとＰＣＲ対照との間の陽性一致パーセント（ＰＰＡ）を推算するために、１００個の血清及び５個のＥＤＴＡ血漿検体を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法によってＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の試験結果が陽性でありさらにＣＯＶＩＤ－１９症候も呈している９５名の対象から採取した。各検体を、ＵＢＩ（登録商標）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＥＬＩＳＡを用いて検査した。
陰性一致パーセント（ＮＰＡ）を推算するために、６２個の血清及び９２個のＥＤＴＡ血漿検体を、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２が陰性であると推定された１５４名の対象から採取した。１５４個の検体は全て、ＣＯＶＩＤ大流行の前に採取された。各検体を、ＵＢＩ（登録商標）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＥＬＩＳＡを用いて検査した。両群の結果を表２４及び表２５に示す。
ｃ．独立臨床的一致検証試験
２０２０年の６月１７日及び９月１日に、国立がん研究所（ＮＣＩ）をスポンサーとするフレデリック国立がん研究所（ＦＮＬＣＲ）において、ＵＢＩ（登録商標）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＥＬＩＳＡによる検査を行った。検査の検証は、以前に冷凍された、５８個のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体陽性血清試料、ならびに９７個の抗体陰性血清及び血漿試料からなる試料のパネルに対して行った。５８個の抗体陽性試料を核酸増幅検査（ＮＡＡＴ）によって確認し、５８個の試料の全てにＩｇＭ及びＩｇＧ抗体が存在することが確認された。試料における抗体の存在は、関連性がないいくつかの方法によってＵＢＩＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＥＬＩＳＡの前に確認された。具体的にはＩｇＭ及びＩｇＧ抗体の存在を１つ以上の対照方法によって確認した。異なる力価の抗体陽性試料を選択した。
全ての抗体陰性試料は、２０２０年よりも前に採取されたものであり、ｉ）臨床状態に関係なく選択された８７個の試料「陰性」、及びｉｉ）ＨＩＶ＋患者からの預託血清から選択された１０個の試料「ＨＩＶ＋」を含む。検査は、ＵＢＩ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＥＬＩＳＡの１つのロットを使用して１人の作業者によって実施された。感度及び特異性の信頼区間を、ＣＬＳＩ ＥＰ１２－Ａ２（２００８）に記載される採点方法に従って算出した。
ＨＩＶ＋との交差反応性の評価のために、ＨＩＶを有する抗体陰性試料の中での偽陽性率の上昇が、ＨＩＶを有さない抗体陰性試料の中での偽陽性率よりも統計的に高いか否かを評価した（このために偽陽性率の違いの信頼区間を、Ａｌｔｍａｎによって記述された採点方法に従って算出した）。試験結果及び要約統計量を表２６及び表２７に示す。
この試験については以下の制限に留意されたい。
・試料を無作為に選択しなかったので、感度及び特異性の推算は装置の現実の性能を示していない可能性がある。
・これらの結果は血清及び血漿試料のみに基づいているので、他の試料種、例えばフィンガースティック全血を含めた全血に関する性能を表していない可能性がある。
・パネル内の試料の数は、検査性能の妥当な推算及び信頼区間がなおも得られる実施可能な最小限の試料サイズであり、使用された試料は、患者集団に認められる抗体プロファイルを表していない可能性がある。
ｄ．マトリックス等価性
５名の健常ドナーからの患者一致血清及び血漿試料を使用してマトリックス等価性試験を行った。血漿試料を、抗凝固剤としてのヘパリンナトリウムまたはＫ２ ＥＤＴＡが入ったバイアルに採取した。一致試料は、ＵＢＩ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＥＬＩＳＡで検査したとき陰性であった。その後、試料対に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＩｇＧが陽性である試料をスパイクして３つの濃度を得、２反復で検査した。結果は各マトリックスの陽性及び陰性信号の１００％の一致を示し、ＵＢＩ（登録商標）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ ＥＬＩＳＡによる血清または血漿試料におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＩｇＧ検出においてマトリックス反応性の作用がないことを示していた。
試験は、ＵＢＩ（登録商標）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＥＬＩＳＡの性能が、血清、ヘパリンナトリウム血漿、及びＫ２ ＥＤＴＡ血漿試料について等価であることを示している。
ｅ．クラス特異性
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対するＩｇＧ及びＩｇＭ抗体が陽性である８つの血清試料をＵＢＩ（登録商標）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＥＬＩＳＡで検査した。その後、試料をＤＴＴで処理してＩｇＭ抗体を破壊し、ＵＢＩ（登録商標）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＥＬＩＳＡで再検査した。８つ全ての試料の結果はＤＴＴ処理の前及び後のどちらにおいても陽性となり、ヒトＩｇＧアイソタイプに対するクラス特異的反応性が実証された。ＵＢＩ（登録商標）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＥＬＩＳＡアッセイは、ヒトＩｇＧアイソタイプに対してのみクラス特異的反応性を示す。ヒトＩｇＭに対する結合相互作用は認められなかった。
実施例１２
ＡＣＥ２に対するＳ１結合の阻害による中和抗体の測定のためのＥＬＩＳＡの開発
ＥＬＩＳＡに基づくＳ１－ＲＢＤとＡＣＥ２との結合アッセイの詳細な手順を図３４の下部に示す。詳しくは、ＥＬＩＳＡプレートをＡＣＥ２ ＥＣＤ－ｓＦｃで被覆し、トレーサーとして様々なＳ１－ＲＢＤタンパク質を使用し、対照トレーサーとしてＨＲＰ単独を使用した。この試験では、Ｓ１－ＲＢＤ－Ｈｉｓ、Ｓ１－ＲＢＤ－Ｈｉｓ－ＨＲＰ、Ｓ１－ＲＢＤ－ｓＦｃ－ＨＲＰ、及びＨＲＰ単独を、ＥＬＩＳＡプレート上を被覆しているＡＣＥ２ ＥＣＤ－ｓＦｃに対するそれらの結合能力について評価した。図３４は、ＥＬＩＳＡプレート上を被覆しているＡＣＥ２ ＥＣＤ－ｓＦｃにＳ１－ＲＢＤ－Ｈｉｓ、Ｓ１－ＲＢＤ－Ｈｉｓ－ＨＲＰ及びＳ１－ＲＢＤ－ｓＦｃ－ＨＲＰがそれぞれ０．４０μｇ／ｍＬ、０．１９μｇ／ｍＬ及び０．２７μｇ／ｍＬのＥＣ５０値で結合することができたことを示す。ＨＲＰ単独ではＡＣＥ２ ＥＣＤ－ｓＦｃに結合することができなかった。
次に、図３４に描かれる結合アッセイを、図３５の下部に示されるように結合ステップの前のステップで改変した。具体的には、ＡＣＥ２ ＥＣＤ－ｓＦｃで被覆されたＥＬＩＳＡプレートにＳ１－ＲＢＤ－Ｈｉｓ－ＨＲＰタンパク質を加える前に、Ｓ１－ＲＢＤ－ｓＦｃに指向される抗体を含有する希釈免疫血清（５ｗｐｉ）とＳ１－ＲＢＤ－Ｈｉｓ－ＨＲＰタンパク質とを混合及びインキュベートした。この追加ステップを加えたのは、Ｓ１－ＲＢＤ－ｓＦｃに対して惹起された抗体がＡＣＥ２ ＥＣＤ－ｓＦｃに対するＳ１－ＲＢＤ－Ｈｉｓ－ＨＲＰタンパク質の結合を阻害し得るかを判定するためであった。
図３５は、Ｓ１－ＲＢＤ－ｓＦｃで免疫化されたモルモットからの免疫血清によってＡＣＥ２ ＥＣＤ－ｓＦｃに対するＳ１－ＲＢＤ－Ｈｉｓ－ＨＲＰの結合の阻害が１：１０の希釈度での９５％超から約１０％未満までにわたって希釈度依存的に減少し、ＥＣ５０が約３．５Ｌｏｇ１０であることを示す。結合の全体的信号は、ＡＣＥ２受容体に対するＳ１－ＲＢＤ結合に干渉すること、したがってそれを阻害することができる抗体の量の高感度検出を可能にするように調整され得る。ＣＯＶＩＤ－１９患者、感染及び回復個体、またはＳ１－ＲＢＤを含むワクチンを受けている個体に存在する血清中和抗体の程度を測定するＥＬＩＳＡのこの単純化形態について、標準化されたアッセイが確立され得る。
抗体検出アッセイによってＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する抗体が陽性であると分かった任意の患者試料は、ＡＣＥ２に対するＳ１－ＲＢＤ結合を阻害することができる抗体を患者が発達させたかを判定するためにこの「中和」ＥＬＩＳＡを用いてさらに検査され得る。そのような中和ＥＬＩＳＡは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２による再感染を防止する患者の能力についての予測判断材料として用いられ得る。
実施例１３
Ｓ１－ＲＢＤ融合タンパク質を含有する、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染に対する高精度デザイナーワクチン
１．全体的デザイン
ウイルス感染に対する効果的な免疫応答は体液性及び細胞性免疫の両方によって決まる。より具体的には、高精度デザイナー予防ワクチンの潜在能力は、（１）ウイルスのその標的細胞上の受容体に対する結合に関与するウイルスタンパク質上のＢ細胞エピトープの採用による、中和抗体の誘導、（２）内因性Ｔｈ及びＣＴＬエピトープの採用による、侵襲してくるウイルス抗原に対する一次及びメモリーＢ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞応答を含む細胞応答の誘導のために、医薬品原薬としてのペプチドかタンパク質かのどちらかのデザイナー免疫原を活用したものとなるであろう。そのようなワクチンは、アジュバント、例えばＡＤＪＵＰＨＯＳ、ＭＯＮＴＡＮＩＤＥ ＩＳＡ、ＣｐＧなど、及び高精度デザイナー免疫原の免疫原性を増強する他の賦形剤と共に製剤化され得る。
代表的なデザイナーＣＯＶＩＤ－１９ワクチンは、ＣＨＯ細胞発現Ｓ－ＲＢＤ－ｓＦｃタンパク質（配列番号２３５のアミノ酸配列及び配列番号２４６の核酸配列）を採用する。このタンパク質は、ＲＢＤ内に極めて炭化水素性の構造を有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク（Ｓ）タンパク質上の受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）を免疫化時に提示して高親和性中和抗体を誘導するように設計及び調製された。ワクチンはまた、宿主特異的なＴｈ細胞媒介免疫性を促進してＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対するウイルス特異的な一次及びメモリーＢ細胞及びＣＴＬ応答を容易にすることができる内因性ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｔｈ及びＣＴＬエピトープを組み込んだ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染予防のためのデザイナーペプチドの混合物も採用し得る。ウイルス感染／攻撃時に速やかなリコールを可能にするためには有効なワクチンがメモリーＴ細胞及びＢ細胞を初回刺激する必要がある。
本開示のデザイナー免疫原の有効性を向上させるために、最適な抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２免疫応答の誘導のための２つの代表的なアジュバント製剤（ＡＤＪＵ－ＰＨＯＳ（登録商標）／ＣｐＧ、及びＭＯＮＴＡＮＩＤＥ（商標）ＩＳＡ／ＣｐＧ）が採用される。
ＡＤＪＵＰＨＯＳはヒトワクチンのためのアジュバントとして一般的に許容されている。このアジュバントは、抗原提示細胞（ＡＰＣ）によるデザイナー免疫原の引寄せ及び取込みを改善することによってＴｈ２応答を誘導する。ＭＯＮＴＡＮＩＤＥ（商標）ＩＳＡ５１は、水相のデザイナーペプチド／タンパク質免疫原と混合したときにエマルジョンを形成してＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する強力な免疫応答を誘発する油である。ＣｐＧｓオリゴヌクレオチドは、抗原提示、ならびにワクチン特異的な細胞性及び体液性応答の誘導を改善するＴＬＲ９アゴニストである。通常は、免疫応答をさらに増強すべく抗原提示を受けやすい免疫刺激複合体を形成するために、負に帯電したＣｐＧ分子を正に帯電したデザイナー免疫原と組み合わせる。
本開示の高精度デザイナーワクチンは、不活化ウイルス溶解物または他のあまり特性評価されていない免疫原を採用したより複雑な免疫原内容物によるワクチンの弱いかまたは不適切な抗体提示と比較して、高度に特異的な免疫応答を生じさせる利点を有する。加えて、ＣＯＶＩＤ－１９ワクチン開発には、抗体依存性感染増強（ＡＤＥ）と呼称される機序に関係する潜在的な落とし穴がある。具体的には、ＡＤＥは、非中和抗体に対するウイルスの結合が、宿主細胞へのその侵入、時にはさらにその複製を増強する現象である。この機序は、増大した感染力及び病毒性を招くものであり、蚊媒介性フラビウイルス、ＨＩＶ及びコロナウイルスについて認められている。本開示の高精度ワクチンは、機能的転帰を決定付けるであろう抗体応答の質及び量を追跡評価することによってワクチン起因性疾患増強を回避するように設計されている。
以下に論述される代表的な試験は、（１）ＣＨＯによって発現されたＳ１－ＲＢＤ－ｓＦｃタンパク質に結合すること、（２）マイクロウェル表面上に固定化されたかまたはＡＣＥ２受容体タンパク質が過剰発現している細胞表面上にあるＡＣＥ２受容体に対するＳ１タンパク質の結合を阻害すること、及び（３）細胞媒介中和アッセイにおいてウイルス媒介細胞変性効果を中和することができる抗体の誘発を容易にし得る本開示の高精度ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチンを設計するときの取り組み方を示す。
Ｓタンパク質抗体結合アッセイによってＳタンパク質に対する抗体を評価するための、モルモットにおける様々な形態のＳ１－ＲＢＤ－ｓＦｃデザイナータンパク質（配列番号２３５、２３６及び３５５）の免疫化計画を表２８に示す。
２．Ｓ１タンパク質抗体結合アッセイ（免疫原性）
群ごとに１００μｇの量でＳ１－ＲＢＤ－ｓＦｃ、Ｓ１－ＲＢＤａ－ｓＦｃ及びＳ１－ＲＢＤ－Ｆｃを含めた様々な形態のＳ１－ＲＢＤタンパク質をＩＳＡ５１と混合してｗ／ｏエマルジョンを調製した。表２８に示される免疫化計画を用いてこれらの製剤でモルモット（群１つあたりｎ＝５）の免疫化を筋肉内に行った。手短に述べると、モルモットに１用量あたり１００μｇの一次免疫化を与え、続いて３週間目に１用量あたり５０μｇの追加免疫を行い、初回免疫化後（ＷＰＩ）０、３及び５日目に個々の血清を採取した。採取された血清試料を、図３６に詳しい手順が示されるＳ１被覆ＥＬＩＳＡによって免疫原性について検査した。
図３７Ａは、たった１回の投与（３ＷＰＩ）の後に高力価のＳ結合抗体が生み出され、Ｓ１－ＲＢＤ－ｓＦｃ、Ｓ１－ＲＢＤａ－ｓＦｃ及びＳ１－ＲＢＤ－Ｆｃについて力価の幾何平均がそれぞれ９４，１０１、４０，９６０及び３１，０４２であったことを示す。力価は、カットオフ値を上回る陽性をなおも示すことができる最大希釈倍率の逆数として決定し、カットオフは０．０５０ＯＤ４５０読み値（平均＋３×標準偏差）と定めた。これらの力価は、一本鎖Ｆｃ融合タンパク質Ｓ１－ＲＢＤ－ｓＦｃタンパク質（配列番号２３５）が最も免疫原性であり、この後に続くのが、Ｃｙｓジスルフィド結合を減らすようにＲＢＤドメインを改変してドメインのより良好な折りたたみを可能にしたものであるＳ－ＲＢＤａ－ｓＦｃ（配列番号２３６）であり、そして、二本鎖Ｆｃ融合タンパク質Ｓ－ＲＢＤが最も低い免疫原性を有していたことを示している。３ＷＰＩでのＳ１－ＲＢＤ－ｓＦｃとＳ１－ＲＢＤａ－ｓＦｃとの差は統計的に有意であり（ｐ≦０．０５）、Ｓ１－ＲＢＤ－ｓＦｃが見掛け上は結合抗体応答の点においてわずかな利点を保持していながら、全ての構築物が極めて免疫原性であったことを示している。しかしながら、５ＷＰＩでは、Ｓ１－ＲＢＤａ－ｓＦｃ対Ｓ１－ＲＢＤ－Ｆｃ（ｐ＞０．９９）、及びＳ１－ＲＢＤ－ｓＦｃ対Ｓ１－ＲＢＤ－Ｆｃ（ｐ＝２０）において目立った有意差がなかった。
図３７Ｂは、５ＷＰＩのモルモット免疫血清によるＥＬＩＳＡでのＡＣＥ２に対するＳ１タンパク質結合についての中和阻害的希釈度ＩＤ５０（幾何平均力価、ＧＭＴ）を示す。群内の各ワクチン接種動物からの５ＷＰＩの血清試料を段階希釈し、ＥＬＩＳＡに基づく方法によって阻害活性について検査した。血清の阻害活性は、以下の式を用いることによって決定された：阻害活性＝｛１－（ＯＤ４５０ｅｘｐ－ＯＤ４５０バックグラウンド）／（ＯＤ４５０ｍａｘ－ＯＤ４５０バックグラウンド）｝×１００％。得られた阻害曲線（左パネル）を平均±標準偏差として表した。５０％阻害する各動物の抗体価（右パネル）を、４パラメータロジスティック回帰によって生成した阻害曲線に基づいて決定した。
図３８は、３ＷＰＩでの１用量あたり５０μｇによる少なめの追加免疫がタンパク質免疫原１つにつき４～１０倍の抗体価の増強をもたらしたことを示す。３つのデザイナー融合タンパク質を比較すると、Ｓ－ＲＢＤ－ｓＦｃ融合タンパク質は追加免疫後に幾何平均Ｓ１結合力価増大が１０６であり、初回免疫化から１０倍に増大した。
これら３つのタンパク質免疫原によって誘発された抗体の機能的特性を、Ｓ１－ＲＢＤのその表面受容体ＡＣＥ－２に対する結合を阻害して標的細胞内へのウイルスの侵入を防止するそれらの能力について評価した。（１）そのようなＳ１結合抗体によるＡＣＥ－２ ＥＣＤ－ｓＦｃ被覆プレートに対するＳ１－ＲＢＤ結合の直接阻害を評価するためのＥＬＩＳＡ、及び（２）細胞に基づくＳ１－ＲＢＤ－ＡＣＥ２結合阻害アッセイを含む２つの機能アッセイを確立した。これらの機能アッセイについて以下にさらに説明する。
３．ＡＣＥ２に対するＳ１－ＲＢＤ結合の阻害を判定するためのＥＬＩＳＡに基づくアッセイ
２つの別個のＥＬＩＳＡに基づくＳ１－ＲＢＤ／ＡＣＥ２結合阻害アッセイの詳細な手順を図３９に示す。
方法Ａでは、ＥＬＩＳＡプレートをＡＣＥ２（例えば、ＡＣＥ２ ＥＣＤ－ｓＦｃ）で被覆し、Ｓ－ＲＢＤａ－ｓＦｃで免疫化された動物からの１００μＬの抗血清をＳ１－ＲＢＤ－Ｈｉｓと混合及びインキュベートし、その後、混合物をＥＬＩＳＡプレートに加えた。Ｓ１－ＲＢＤ－Ｈｉｓ結合／阻害の量は、ＨＲＰコンジュゲート抗Ｈｉｓ抗体を使用して検出され得る。
方法Ｂでは、ＥＬＩＳＡプレートをＡＣＥ２（例えば、ＡＣＥ２ ＥＣＤ－ｓＦｃ）で被覆し、Ｓ－ＲＢＤａ－ｓＦｃで免疫化された動物からの１００μＬの抗血清をＳ１－ＲＢＤ－Ｈｉｓ－ＨＲＰと混合及びインキュベートし、その後、混合物をＥＬＩＳＡプレートに加えた。Ｓ１－ＲＢＤ－Ｈｉｓ－ＨＲＰ結合／阻害の量は直接検出され得る。
４．ＡＣＥ２に対するＳ１－ＲＢＤ結合の阻害を判定するためのＥＬＩＳＡに基づくアッセイからの結果
上記方法Ａ及びＢのＳ１－ＲＢＤ／ＡＣＥ２結合阻害アッセイを利用して、ＡＣＥ２ ＥＣＤ－ｓＦｃに対するＳ１－ＲＢＤ－Ｈｉｓ結合を阻害するＳ１－ＲＢＤ－ｓＦｃ、Ｓ１－ＲＢＤａ－ｓＦｃ及びＳ１－ＲＢＤ－Ｆｃに対する抗体の能力をＥＬＩＳＡによって判定した。
図４０は、方法Ａの阻害アッセイを用いて得られた結果を示す。具体的には、図４０は、ＥＬＩＳＡプレートに結合したＡＣＥ２ ＥＣＤ－ｓＦｃに結合する前にＳ１－ＲＢＤ－Ｈｉｓタンパク質と混合及びインキュベートされたｓＦｃまたはＦｃ融合タンパク質で免疫化されたモルモットに対する初回刺激用量の後に３ｗｐｉにおいて採取された全ての免疫血清について、血清の希釈度を１：１０として検査した場合、このアッセイで９５％を上回る結合阻害が認められたことを示す。１：１０の血清希釈度での９５％超から１：１００の血清希釈度での約６０％の阻害、及び１：１，０００の血清希釈度での約２０％の阻害まで、ＡＣＥ２ ＥＣＤ－ｓＦｃに対するＳ１－ＲＢＤ－Ｈｉｓの結合の阻害には希釈度依存的な減少がみられた。
図４１は、方法Ｂの阻害アッセイを用いて得られた結果を示す。具体的には、図４１は、ＥＬＩＳＡプレートに結合したＡＣＥ２ ＥＣＤ－ｓＦｃに結合する前にＳ１－ＲＢＤ－Ｈｉｓ－ＨＲＰタンパク質と混合及びインキュベートされたｓＦｃまたはＦｃ融合タンパク質で免疫化されたモルモットに対する初回刺激及び追加免疫用量の後に５ｗｐｉにおいて採取された全ての免疫血清について、血清の希釈度を１：２５０として検査した場合、このアッセイで９５％を上回る結合阻害が認められたことを示す。１：２５０の希釈度から１：３２，０００の希釈度まで、ＡＣＥ２ ＥＣＤ－ｓＦｃに対するＳ１－ＲＢＤ－Ｈｉｓ－ＨＲＰの結合の阻害には希釈度依存的な減少がみられた。
方法Ａ（図４０）及び方法Ｂ（図４１）からの結果において認められる差異は、結合阻害の検出において方法Ｂは方法Ａに比べてより感度が高いことを実証している。
５．ＡＣＥ２に対するＳ１－ＲＢＤ結合の阻害を判定するための細胞に基づくアッセイ
細胞に基づくＳ１－ＲＢＤとＡＣＥ２との結合の阻害アッセイの詳細な手順を図４２に詳しく示す。具体的には、ＡＣＥ－２が過剰発現しているＨＥＫ２９３細胞をそのような結合のための標的細胞として使用した。Ｓ１－ＲＢＤの様々な形態の融合タンパク質（Ｓ１－ＲＢＤ－ｓＦｃ、Ｓ１－ＲＢＤａ－ｓＦｃ及びＳ－ＲＢＤ－Ｆｃ）で免疫化されたモルモットから得られた免疫血清をＳ１－ＲＢＤ－Ｈｉｓタンパク質と、及びこれに続いて抗Ｈｉｓ－ＦＩＴＣであるＦＩＴＣコンジュゲート検出抗体と、混合及びインキュベートした。このＦＩＴＣで追跡するＡＣＥ２／Ｓ１－ＲＢＤ結合システムにおいて、様々な形態のＳ－ＲＢＤ－ｓＦｃ、Ｓ－ＲＢＤａ－ｓＦｃまたはＳ－ＲＢＤ－Ｆｃで免疫化されたモルモットから採取された免疫血清の存在を、それらの各々の結合阻害能力について検査した。図４３に示すように、初回刺激及び追加免疫の免疫化後に５ｗｐｉで採取された免疫血清の系列ごとに、各々のデザイナータンパク質免疫原について約１００％阻害から約１０％阻害の範囲まで下がる用量依存曲線が確立され、Ｓ－ＲＢＤ－ｓＦｃ、Ｓ－ＲＢＤａ－Ｆｃ及びＳ－ＲＢＤ－Ｆｃのデザイナータンパク質免疫原について特徴的なＩＣ５０値がそれぞれ１：１０２４、１：１８０、及び１：３００であった。惹起された抗体の幾何平均力価（ＧＭＴ）ＩＣ５０値は、Ｓ－ＲＢＤ－ｓＦｃ、Ｓ－ＲＢＤａ－Ｆｃ及びＳ－ＲＢＤ－Ｆｃのデザイナータンパク質免疫原についてそれぞれ２０２、６９．２及び１０８であった。図４４に示されるように、この細胞に基づく遮断アッセイによって生じた相対的Ｓ１－ＡＣＥ２結合阻害を評価するために希釈度が１：６２５に固定して、０、３及び５週目に採取された血清についての３つ全てのデザイナータンパク質免疫原の阻害プロファイルの代表的なグラフを示した。この比較結合阻害試験は、Ｓ－ＲＢＤａ－ｓＦｃ（約２１％）及びＳ－ＲＢＤ－Ｆｃ（約３３％）について２１及び３３％であったのと比較してＳ－ＲＢＤ－ｓＦｃがその高い結合阻害（約７５％）によって示される最良の機能的免疫原性を生んだことを示している。
全ての結合阻害結果から考えて、Ｓ－ＲＢＤ－ｓＦｃタンパク質は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス侵入の決定的経路であるＳ１とＡＣＥ２との結合を阻害することができる機能性抗体の誘発のためのＢ細胞成分を代表する最も有効な高精度デザイナー免疫原であると見受けられる。
６．試験管内中和アッセイ
Ｓ－ＲＢＤ－ｓＦｃ、Ｓ－ＲＢＤａ－Ｆｃ及びＳ－ＲＢＤ－Ｆｃで免疫化された動物から採取した血清試料を５６℃で０．５時間にわたって不活化し、細胞培養培地にて２段階で段階希釈した。９６ウェルプレートにおいて希釈血清を、北京のＫｅＸｉｎ検査施設で実施されたＣＮＩ株ウイルスか、独立して台北市で実施された台湾株ウイルスかのどちらかとの１００ＴＣＩＤ５０の懸濁液として１：１の比で混合し、その後、３６．５℃で２時間、５％ＣＯ２のインキュベータの中でインキュベートした。その後、Ｖｅｒｏ細胞（１～２×１０４細胞）を血清－ウイルス混合物に添加し、プレートを３６．５℃で５日間、５％ＣＯ２のインキュベータの中でインキュベートした。各ウェルの細胞変性効果（ＣＰＥ）を顕微鏡下で記録し、中和力価を５０％保護的条件の希釈数によって算出した。
表２９に示すように、単回免疫化後のモルモットからの免疫血清を３ｗｐｉで採取し、この試験管内中和検査のために北京のＫｅＸｉｎ検査施設による検査に供した。予備採取血液（０ｗｐｉ）及び他の対照血清は、力価が８未満であると分かった。デザイナータンパク質Ｓ－ＲＢＤ－ｓＦｃによる免疫原からの免疫血清は最良の力価（１：＞２５６）を示した一方、Ｓ１－ＲＢＤａ－ｓＦｃ及びＳ１－ＲＢＤ－Ｆｃからの免疫血清はそれぞれ１２８及び１９２の範囲にあった。ウイルス起因性ＣＰＥを阻害する能力を検出するこの試験管内中和アッセイは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を予防する検査免疫血清の機能的有効性をさらに示した。
表２９に示すように、これらの免疫血清についての別の独立した検査が台北市南港区で行われた。初回刺激及び追加免疫注射後のモルモットから０、３及び５ｗｐｉでの血液採取によって採取された免疫血清に対してこのＣＰＥに基づく試験管内中和アッセイが実施された。この第２の場所での検査では、０及び３ｗｐｉの免疫血清について再現性が極めて良好な結果が得られ、測定された中和力価が１２８～２５６であった一方、これらのタンパク質からの免疫血清の力価は単回投与によっておおよそ４，０９６及び８，１９２となって免疫血清よりも約１５～３０倍高かった。予備採取血液及び他の対照血清はそれぞれの検査施設の採点方式に応じて８未満または４未満であることが分かった。デザイナータンパク質Ｓ１－ＲＢＤ－ｓＦｃによる構築物からの免疫血清は最良の力価（１：＞２５６）を示した一方、その他の免疫血清は、北京の検査施設でみられたように１２８及び１９２の範囲にあった。かくして、Ｓ１－ＲＢＤ－ｓＦｃをデザイナー免疫原として使用した場合、他の２つのデザイナータンパク質Ｓ１－ＲＢＤ－ＦｃまたはＳ１－ＲＢＤａ－ｓＦｃに比べて少なくとも２倍を上回る中和力価がみられた。ウイルス起因性ＣＰＥを阻害するこれらのデザイナータンパク質誘導抗体の能力についての、２つの独立した検査施設でのこの試験管内中和アッセイの検証は、これらの免疫血清の機能的有効性、したがって、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を予防するためのワクチン製剤における免疫原としてのこれらの高精度デザイナータンパク質の有用性をさらに示した。
Ｓ１－ＲＢＤ－ｓＦｃで免疫化されたモルモットからの血清の中和力価を、ＣＯＶＩＤ－１９患者の回復期血清のそれと比較した。Ｓ１－ＲＢＤ：ＡＣＥ２結合阻害ＥＬＩＳＡ（ｑＮｅｕ ＥＬＩＳＡとも呼ぶ）を用いてモルモットにおける応答を、退院後の台湾人ＣＯＶＩＤ－１９患者からの回復期血清のそれと比較した。結果は、図５３に示されるが、１，０００倍（３ＷＰＩ）または８，０００倍（５ＷＰＩ）に希釈したモルモット免疫血清が呈したＳ１－ＲＢＤ：ＡＣＥ２結合の阻害が、２０倍希釈の１０名の患者の回復期血清による場合と同程度またはそれよりも高いことを示し、モルモットの血清がヒト回復期血清よりも５０倍以上高い抗体価を含んでいたことを示していた。
抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｎタンパク質抗体に関する別個のＣＰＥ試験、及び免疫蛍光可視化法によって、抗体の中和力価のさらなる確認が得られた。５ＷＰＩにおいてＳ１－ＲＢＤ－ｓＦｃ融合タンパク質で免疫化された動物からの試料において、動物血清の１：３２，７６８倍希釈で、またしてもＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の完全な中和（ＶＮＴ１００）が認められた（図５４）。０及び３ＷＰＩにＳ１－ＲＢＤ－ｓＦｃ、Ｓ１－ＲＢＤａ－ｓＦｃ及びＳ１－ＲＢＤ－ＦｃでＭＯＮＴＡＮＩＤＥ（商標）ＩＳＡ ５０Ｖ２と共にワクチン接種したモルモットから５ＷＰＩにおいて採取された免疫血清を分析した。ウイルス－血清混合物によって感染したＶｅｒｏ－Ｅ６細胞の単層を免疫蛍光法（ＩＦＡ）によって評価した。細胞をヒト抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｎタンパク質で染色し、抗ヒトＩｇＧ－４８８（明色）で検出した。核をＤＡＰＩ（４’、６－ジアミジノ－２－フェニルインドール）（暗色）で対比染色した。
ＣＰＥアッセイ及びＩＦＡによって得られた中和力価をさらに確かめるために、１０個の試料（陽性及び陰性）を、情報が分からないように暗号化し、テキサス州ガルベストンにあるテキサス大学医学部（ＵＴＭＢ））のＡｌｅｘａｎｄｅｒ Ｂｕｋｒｅｙｅｖ博士の研究所に送った。これらは複製ウイルス中和アッセイにおいて検査され、各試料のＶＮＴ５０が算出された。結果は、ＵＴＭＢ及びＡｃａｄｅｍｉａ Ｓｉｎｉｃａにおいて実施された２つのアッセイの間に強い相関関係（ｒ＝０．９４００）を示した（図５５）。
まとめると、免疫原性検査の結果は、３つ全てのワクチン製剤が免疫原性であり、Ｓ１－ＲＢＤ－ｓＦｃが、Ｓ１－ＲＢＤ結合抗体価、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ１－ＲＢＤタンパク質によるＡＣＥ２との結合の阻害、及び生ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の中和に関して明らかな利点を有していることを示していた。
実施例１４
ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２による感染の予防のためのマルチトープタンパク質／ペプチドワクチン組成物の製造
ワクチン組成物の異なる製剤を調製し、ワクチン投与のためのそれらの安定性を検査する製剤化前特性評価試験において評価した。強制分解試験において、Ｓ－ＲＢＤ－ｓＦｃは、熱、光曝露及び撹拌に弱いが凍結解凍サイクルには弱くないことが示された。Ｓ－ＲＢＤ－ｓＦｃが感受性を有すると考えられる条件を、適切なｐＨ及びワクチン投与に適する賦形剤の選択のために用いた。
１．ｐＨ－熱及びＵＶ曝露
Ｓ－ＲＢＤ－ｓＦｃの等電点（ｐＩ）値は７．３～８．４であるため、５．７～７．０の範囲のｐＨで製剤を調製した。総じて、製剤ｐＨが等電点（ｐＩ）から離れるにつれて溶液は透明になる、というのも、それに従ってタンパク質溶解性が高くなるからである。
サイズ排除クロマトグラフィーを用いて、製剤のｐＨが熱に起因するタンパク質凝集かＵＶに起因する不純物かのどちらかに影響を及ぼすか否かを判定した。この試験では、ヒスチジン緩衝液を使用してｐＨが５．７～７．０の範囲であるＳ－ＲＢＤ－ｓＦｃを含有する溶液を調製し、３５℃で２４時間インキュベートしたかあるいはＵＶ光に２４時間曝露した。サイズ排除クロマトグラフィーを用いて、存在するＳ－ＲＢＤ－ｓＦｃ及びいくつかの高分子量（ＨＭＷ）不純物の量を決定した。この試験からの結果を表３０に示す。具体的には、結果は、熱に起因するタンパク質凝集にｐＨが明らかな影響を及ぼさないことを示した。結果はまた、ｐＨが低下するにつれて、特にｐＨ５．７から６．４に低下するにつれて、２４時間にわたるＵＶ曝露の後にＳ－ＲＢＤ－ｓＦｃが形成する高分子量不純物が少なくなったことも示した。
この試験に基づいて、１０ｍＭのヒスチジンを使用した５．９の目標ｐＨでの負荷条件で、及び製剤化ｐＨ規格限界をｐＨ５．４及びｐＨ６．４として試作製剤を評価した後に最終製剤を選択した。
２．界面活性剤－撹拌
強制分解試験に基づいてＳ－ＲＢＤ－ｓＦｃは、撹拌ストレスに弱く、撹拌中に視認可能粒子を形成しがちであることが分かった。タンパク質不安定化を招く可能性がある固液及び液気界面におけるタンパク質吸着を軽減するために界面活性剤がしばしば使用される。このため、ポリソルベート８０が撹拌後のＳ－ＲＢＤ－ｓＦｃの析出を軽減または防止できるか否かを判定する試験を実施した。
この試験では、およそ２ｍｇ／ｍＬのＳ－ＲＢＤ－ｓＦｃが入った３つの別個の溶液を１，２００ＲＰＭで６７時間、２５℃で撹拌した。第１溶液は０．０３％（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０を含有し、第２溶液は０．０６％（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０を含有し、第３溶液は、ポリソルベート８０を含んでいない対照であった。この試験において、結果は、０．０６％（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０が撹拌後のＳ－ＲＢＤ－ｓＦｃの析出を効率的に緩和することを示した（データ示さず）。したがって、０．０６％（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０の存在は、製剤中のＳ－ＲＢＤ－ｓＦｃの安定性を向上させ、析出を軽減すると判定された。
３．タンパク質緩衝剤
添加剤、例えば、アルギニン－ＨＣｌ、スクロース及びグリセロールが、タンパク質の製剤開発において保護剤として頻繁に使用されている。
この試験では、Ｓ－ＲＢＤ－ｓＦｃを様々な量のアルギニン－ＨＣｌ（２５～１００ｍＭ）、スクロース（２５～１００ｍＭ）またはグリセロール（５～１５％）を含有する溶液と一緒に５０℃で１時間インキュベートした。サイズ排除クロマトグラフィーを用いて、存在するＳ－ＲＢＤ－ｓＦｃ及びいくつかの高分子量（ＨＭＷ）不純物の量を決定した。この試験からの結果を表３０に示す。具体的には、結果は、アルギニン－ＨＣｌ、スクロースまたはグリセロールの添加が、熱に起因する凝集を軽減できたことを示した。これらの結果を、４０℃で４５分間インキュベートされた試料の濁度（ＯＤ６００）の測定によってさらに確認した。サイズ排除クロマトグラフィー結果と一致して、アルギニン－ＨＣｌ、スクロースまたはグリセロールの添加は試料の濁度を効率的に低減した（データ示さず）。
ＵＶストレス下でのｐＨ５．９のＳ－ＲＢＤ－ｓＦｃ溶液に対するアルギニン－ＨＣｌ、スクロースまたはグリセロールの効果も評価した。サイズ排除クロマトグラフィー結果は、アルギニン－ＨＣｌの添加は光に起因する凝集をわずかに増加させたがスクロース及びグリセロールは凝集に対してあまり影響を与えなかったことを示した。
４．要約
製剤スクリーニング試験で得られた結果の要約を表３１に示す。
実施例１５
ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２による感染の予防のためのマルチトープタンパク質／ペプチドワクチン組成物に使用するためのＳ１－ＲＢＤ－ｓＦｃタンパク質の生産
試験的小規模バッチ（１５Ｌ）及び大規模バッチ（１００Ｌ）のための流加式生産開発を以下に記載のとおりに行った。
１．試験的バッチ（１５Ｌ）
ａ．流加式細胞培養上流プロセス
試験的規模での流加式生産開発を、１５Ｌ容Ｆｉｎｅｓｓｅバイオリアクターにおいて初期運転体積９Ｌで行った。ＨＹＰＥＲＦＯＲＭＡ（商標）１５Ｌ容バイオリアクターは、ＨＹＰＥＲＦＯＲＭＡ（商標）Ｇ３Ｌａｂコントローラ及びＴｒｕＦｌｏｗガス質量流コントローラ（ＭＦＣ）を備えたガラス製容器のバイオリアクターである。装備されたインペラは傾斜翼型インペラであり、スパージャーは曝気のための直径０．８ｍｍの穴を有する穿孔パイプ型スパージャーである。１５Ｌ容バイオリアクターのパラメータは以下のとおりであった：
ａ．培地：ＤＹＮＡＭＩＳ＋１ｇ／ｋｇの硫酸デキストラン＋１．１７ｇ／ｋｇのグルタミン
ｂ．初期細胞密度：０．３Ｅ６ｖｃ／ｍＬ
ｃ．温度：３７℃、Ｄ５に３２℃までのＴＳ
ｄ．ｐＨ：ｐＨ７．０±０．３、塩基：１ＭのＮａ２ＣＯ３、酸：ＣＯ２
ｅ．溶存酸素：設定点５０％
ｆ．供給方策：５０ｇ／ｋｇのグルコース及び２０ｇ／ｋｇの酵母抽出物が補充された、８３％のＥＸ－ＣＥＬＬ（登録商標）ＡＣＦ ＣＨＯ培地＋１７％のＥＸ－ＣＥＬＬ（登録商標）３２５ ＰＦ ＣＨＯ培地。
Ｄ３～Ｄ７：毎日３％、Ｄ８～Ｄ１２：毎日４％（合計供給率：３５％ｗ／ｗ）
ｇ．グルコース管理：Ｄ３～Ｄ１３：［Ｇｌｕｃ］≦２ｇ／Ｌの時に２ｇ／ｋｇのグルコースを添加する（原液３００ｇ／ｋｇ）
ｈ．採集基準：細胞生存能≦６０％またはＤ１４
手短に述べると、Ｌ－グルタミン及び硫酸デキストランを補充したＤＹＮＡＭＩＳ（商標）ＡＧＴ（商標）培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ａ２６１７５０２）を種系列増殖及び生産プロセスの両方のために使用した。バイオリアクターへのボーラス栄養補給を実施３日目（Ｄ３）から開始した。栄養補給剤は、８３％のＥＸ－ＣＥＬＬ（登録商標）ＡＣＦ ＣＨＯ培地（Ｍｅｒｃｋ、Ｃ９０９８）を１７％のＥＸ－ＣＥＬＬ（登録商標）３２５ ＰＦ ＣＨＯ培地（Ｍｅｒｃｋ、２４３４０Ｃ）と混和することによって製剤化された。細胞数、細胞生存能、代謝産物（グルコース、ラクテート、グルタミン、グルタメート及びアンモニア）の濃度、浸透圧、ｐＨ、ｐＣＯ２及びｐＯ２の計測監視をＢｉｏＰｒｏｆｉｌｅ ＦＬＥＸ分析装置（Ｎｏｖａ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ）で毎日実施した。採集基準は、６０％未満の細部生存能、または生産１４日目（Ｄ１４）とした。
採集日に細胞培養液を、Ｃ０ＨＣデプスフィルター（Ｍｅｒｃｋ、ＭＣ０ＨＣ０５ＦＳ１）によって、及びこれに続けて０．２２μｍのカプセル濾過によって清澄化した。採集された細胞培養液（ＨＣＣＦ）を、下流での即時処理のためのタンパク質精製ラボに移した。
このプロセスでは、ピークＶＣＤは７日目のおよそ１４Ｅ＋０６ｖｃ／ｍＬであり、細胞生存能は、生産の最後に至るまで９０％以上を維持することができた。Ｓ１－ＲＢＤ－ｓＦｃの生産力は１４日目に１．６ｇ／Ｌであった。
ｂ．採集
Ｍｉｌｌｉｓｔａｋ＋ＰＯＤ Ｃ０ＨＣ ０．５５ｍ２、及びＯｐｔｉｃａｐ ＸＬ ５ Ｃａｐｓｕｌｅを採集材料に適用した。フィルターに１００Ｌ／ｍ２の精製水を６００ＬＭＨの流動速度で流した。洗浄速度は５Ｌ／分であり、洗浄時間は少なくとも１０分であった。濾液を流す前に、ＰＯＤフィルターから精製水を排出するための圧抜きを実施した（１０ｐｓｉで少なくとも１０分間）。採集細胞培養液（ＨＣＣＦ）を５４．５ＬＭＨに等しい５００Ｌ／分で流した。最初の１．４Ｌの保持液を捨て、残りの保持液を回収した。操作全体の間、圧力を計測監視したが、これは３０ｐｓｉを超えてはならない。清澄化前及び清澄化後の濁度はそれぞれ１３４３ＮＴＵ及び１２．９ＮＴＵであり、清澄化前及び清澄化後の力価はそれぞれ１．６６ｇ／Ｌ及び１．５０ｇ／Ｌであった。上流では生成物収率が高かった（１．５ｇ／Ｌ）。
ｃ．下流精製プロセス開発
手短に述べると、採集細胞培養液（ＨＣＣＦ）をまず、１％のＴＷＥＥＮ８０（Ｍｅｒｃｋ、８．１７０６１）及び０．３％のＴＮＢＰ（Ｍｅｒｃｋ、１．００００２）で処理し、溶媒／界面活性剤によるウイルス不活化のために常温（２３±４℃）で１時間、撹拌せずに保持した。溶媒／界面活性剤で処理されたＨＣＣＦを、プロテインＡ親和性クロマトグラフィーカラム（ＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕＲｅ ＬＸ樹脂、Ｃｙｔｉｖａ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１７－５４７４－０３）を使用して精製した。プロテインＡカラムからの溶離液をすぐさま１Ｍのトリス塩基溶液（Ｍｅｒｃｋ、１．０８３８６）でｐＨ６．０に中和した。中和されたタンパク質溶液を２種類のデプスフィルターＣ０ＨＣ（２３ｃｍ２、Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＭＣ０ＨＣ２３ＣＬ３）及びＸ０ＳＰ（２３ｃｍ２、Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＭＸ０ＳＰ２３ＣＬ３）で濾過して析出物及び不純物を除去した。清澄化されたタンパク質溶液をカチオン交換クロマトグラフィーカラム（ＮＵＶＩＡ（商標）ＨＲ－Ｓ培地、Ｂｉｏ－Ｒａｄ、１５６－０５１５）によってさらに精製した。タンパク質濃度を５ｍｇ／ｍｌに調整し、タンパク質溶液をウイルス濾過（ＰＬＡＮＯＶＡＴＭ ２０Ｎ ナノフィルター、Ａｓａｈｉ Ｋａｓｅｉ、２０ＮＺ－００１）に供した。ナノ濾過からの濾液を、タンジェンシャルフロー濾過（ＴＡＮＧＥＮＸ（商標）ＳＩＵＳ（商標）ＰＤｎ ＴＦＦカセット、Ｒｅｐｌｉｇｅｎ、ＰＰ０３０ＭＰ１Ｌ）を用いて製剤用緩衝液で緩衝液交換した。緩衝液交換後、次にＴＷＥＥＮ８０を製剤化タンパク質溶液に添加して０．０６％（ｗ／ｖ）の終濃度とし、続いて０．２２μｍの濾過を行い、製剤化された製品を２～８℃で保存し、光曝露から保護した。
ｄ．プロセス収率、１５Ｌ試験ロット
各工程の収率は以下のとおりであった：
ａ．溶媒界面活性剤ウイルス不活化、プロテインＡクロマトグラフィー、中和及びデプス濾過：１１．３０ｇ（収率８３．１％）。
ｂ．カチオン交換クロマトグラフ：１０．９６ｇ（収率９６．７％）。
ｃ．ナノ濾過、透析濾過による製剤化、及び０．２μｇの濾過：１０．５０ｇ（収率９９．７％）。
全体的な回収は８０．３％の収率であった。
２．大型バッチ（１００Ｌ）
Ｓ－ＲＢＤ－ｓＦｃの臨床用バッチ（１００Ｌ）は、ｃｌｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｌｌ Ｂａｎｋから製造された。最終組成は変更せずに薬物レベルでのみ変更を行った。原材料及びプロセスパラメータは変更せず、バッチサイズのみを大きくした。両ロット間に大差は認められない。
試験的バッチと大型バッチとの間でのＳ－ＲＢＤ－ｓＦｃ薬物のための製造プロセスにおける変更の影響を適合性試験によって評価した。
１５Ｌ規模のプロセスからの薬物バッチと１００Ｌ規模のプロセスからの薬物との間での適合性を評価するために、特性評価によって生成された公開データの分析データと強制分解試験のデータとを比較及び評価した。
１５Ｌ規模及び１００Ｌ規模の製造プロセスによって生産されたＳ－ＲＢＤ－ｓＦｃロットは全て、各々の規格で定めた公開規格を満たしていた。検査した全てのロットは、ロット間での整合性を示し、サイズバリアント及び不純物のレベルが類似し、電荷バリアントが類似し、力価が同程度であった。
特性評価試験の結果は、１５Ｌ規模または１００Ｌ規模の製造プロセスで生産されたＳ－ＲＢＤ－ｓＦｃロットのタンパク質及び炭水化物構造、翻訳後修飾、純度／不純物、不均一性及び生物活性が同程度であり整合していることを示した。加えて、強制分解試験は、分解経路、及び特定の分解条件に対する感受性が、異なるプロセスによって製造された検査ロットにおいて類似し、同程度であったことを示した。
全体として、結果は、１５Ｌ規模及び１００Ｌ規模で生産されたものの間でＳ－ＲＢＤ－ｓＦｃロットが、公開検査、強制分解試験及び追加の特性評価から得られた結果に関して同程度であることを実証した。
実施例１６
ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２による感染の予防のためのマルチトープタンパク質／ペプチドワクチン組成物
モルモットにおける最初の免疫原性評価は、本発明者らのＲＢＤ系タンパク質の体液性免疫原性を確立し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対するワクチンのための主要免疫原性Ｂ細胞成分としてのＳ１－ＲＢＤ－ｓＦｃ（配列番号２３５）の選択を可能にした。
Ｔ細胞エピトープの存在は、ウイルス抗原に対するＢ細胞メモリー応答を誘導する上で重要である。ＭＨＣ結合及びＴ細胞機能アッセイによって検証された、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１（２００３年）ウイルス間で保存されているＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＣＴＬ及びＴｈエピトープを、ＣＯＶＩＤ－１９に対する高精度ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチンの設計において採用した。ＭＨＣ結合アッセイを用いて決定されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１（２００３年）上のＴ細胞エピトープの同定を用いて、配列アライメントによってＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（２０１９年）中の対応するＴ細胞エピトープを決定した（図３、図４及び図５Ａ～５Ｃ、ならびに表３２参照）。同様の方法で、本開示の高精度デザイナーＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチンのデザインに組み込まれるＣＴＬエピトープを同定した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチンデザインに組み込まれるＴｈ及びＣＴＬエピトープは、表３２に示されるようにＭＨＣクラスＩＩ結合及びＴ細胞刺激によって検証された。２０μｇ／ｍＬ、６０μｇ／ｍＬ、２００μｇ／ｍＬ（Ｓ１－ＲＢＤ－ｓＦｃ融合タンパク質及びＴｈ／ＣＴＬペプチドの合計重量）を含有する、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２による感染を予防するための特定のマルチトープタンパク質／ペプチドワクチン組成物を表３３～３５に示す。
１．ラットにおける免疫原性試験
ラットで行われた一組の実験において、最適な配合組成及びアジュバントのさらなる評価、ならびにワクチンの細胞性免疫成分の確立のために、Ｔｈ／ＣＴＬペプチド（配列番号３４５、３４６、３４８、３４８、３６１及び６６）の専売混合物をＳ１－ＲＢＳ－ｓＦｃ（配列番号２３５）Ｂ細胞成分に添加した（例えば図５６）。このワクチン組成物を以下の試験に使用した。
ａ．ラットにおける体液性免疫原性検査
実施例１３に記載されるモルモット実験は、アジュバントとしてＩＳＡ５０を使用して初回刺激（１００μｇまたは２００μｇ）及び追加免疫（５０μｇまたは１００）による単回投薬計画で３つのタンパク質候補を使用して検査され、各々の候補構築物を厳密に比較することができた。ラットにおいて行われる本実験組では、Ｓ１－ＲＢＤ結合抗体価及び均衡のとれたＴｈ１／Ｔｈ２応答に基づく最適なアジュバントの選択を可能にすべく様々な用量の免疫原及びアジュバントを評価した。
Ｓ１－ＲＢＤ－ｓＦｃタンパク質をＴｈ／ＣＴＬペプチドと共に含有するワクチン組成物を２つの異なるアジュバント系（ａ）ＣｐＧ３（配列番号１０６）と組み合わせたＩＳＡ５１、及び（ｂ）ＣｐＧ１（配列番号１０４）と組み合わせたＡＤＪＵ－ＰＨＯＳ（登録商標）と組み合わせた。これらのワクチン－アジュバント合剤を、注射１回あたり１０～３００μｇの広い用量範囲で０ＷＰＩ（初回刺激）及び２ＷＰＩ（追加免疫）においてラットにＩＭ投与した。抗体価分析のために、０、２（すなわち１回目の用量の後）、３及び４ＷＰＩ（すなわち、２回目の用量の１及び２週間後）において動物から採血した。
全ての時間点における結合抗体（ＢＡｂ）検査の結果は、両アジュバント系と共に製剤化されたワクチンが１０～３００μｇの範囲の全ての用量にわたって同程度のレベルの抗Ｓ１－ＲＢＤ ＥＬＩＳＡ力価を誘発したことを実証し、主要タンパク質免疫原の量が少ないときでさえワクチン製剤の免疫原性が優れていることを示していた（図５７Ａ）。加えて、合成ペプチド成分を含まないときの１００μｇ用量のＳ１－ＲＢＤ－ｓＦｃは、先のモルモット試験に類似する高いＳ１－ＲＢＤ結合活性を刺激した（データ示さず）。
Ｓ１－ＲＢＤ：ＡＣＥ２結合阻害ＥＬＩＳＡ検査では、１０及び３０μｇは、４ＷＰＩにおいて１００及び３００μｇの高用量と同じくらい強い阻害活性を示した（図５７Ｂ、左パネル）。最も強力な阻害活性は、合理的に設計されたペプチド及びＡＤＪＵ－ＰＨＯＳ（登録商標）／ＣｐＧ１アジュバントと共に製剤化されたＳ１－ＲＢＤ－ｓＦｃタンパク質の最低用量（１０μｇ）でみられた。（モルモット試験において上に述べた）台湾人ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２単離物に対する複製ウイルス中和アッセイでは、ワクチン組成物によって誘導された４ＷＰＩの免疫血清は有意な用量依存的効果を示さなかった。しかしながら、アジュバントを伴う１０及び３０μｇの低用量のタンパク質は、１０，２４０を上回るＶＴＮ５０の希釈倍率でウイルス感染を中和することができた（図５７Ｂ、右パネル）。各ワクチン接種用量群からの６ＷＰＩのラット免疫血清を（ａ）Ｓ１－ＲＢＤ：ＡＣＥ２結合阻害ＥＬＩＳＡにおけるμｇ／ｍＬの遮断レベルで表される力価をＣＯＶＩＤ－１９患者の一組の回復期血清と比較して（図５７Ｃ、左パネル）、及び（ｂ）ＶＮＴ５０として表されるＶｅｒｏ－Ｅ６細胞におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＣＰＥアッセイによって（図５７Ｃ、右パネル）検査した。図５７Ｃに示すように、ラットにおいて全ての用量のワクチン製剤は、回復期患者と比較して、Ｓ１－ＲＢＤ：ＡＣＥ２結合ＥＬＩＳＡプレートによれば有意により高く、ＶＮＴ５０によれば（患者データの広がり及び少ない動物数のために統計的有意性は得られなかったが）より高い中和力価を誘発した。
ｂ．ラットにおける細胞免疫原性検査
Ｔｈ１／Ｔｈ２応答の均衡に関する問題に対処するために、ＥＬＩＳｐｏｔを用いてワクチン接種ラットにおける細胞応答を評価した。
ｉ．ラットＴｈ１／Ｔｈ２均衡試験のための手順
合計１２頭の８～１０週齢の雄性Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラット（３００～３５０グラム／体重）をＢｉｏＬＡＳＣＯ Ｔａｉｗａｎ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．から購入した。３日間順応させた後、動物を４つの群に無作為に割り振った。動物に対する全ての処置は、ＵＢＩＡｓｉａにおいて動物実験委員会（ＩＡＣＵＣ）によって査読及び承認された規制及びガイドラインに従って実施した。ＩＡＣＵＣ番号はＡＴ－２０２８である。Ｓ１－ＲＢＤ－ｓＦｃ（配列番号２３５）を、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳ、Ｍ及びＮタンパク質から選択される５つのＴｈ／ＣＴＬペプチド（配列番号３４５、３４６、３４８、３４８及び３６１）、ならびに専売汎用ＴｈエピトープＵＢＩＴｈ（商標）１ａ（配列番号６６）と共に含有し、ＡＤＪＵ－ＰＨＯＳ（登録商標）／ＣｐＧ１アジュバントで製剤化された、１～１００μｇの範囲の様々な用量のワクチン組成物を使用して、０週目（初回刺激）及び２週目（追加免疫）にラットに筋肉内へのワクチン接種を行った。抗原活性の評価のためにラット（群１つごとにｎ＝３）からの免疫血清を０、２、３及び４週目に採取した。脾細胞を４ＷＰＩにおいて採取し、２μｇ／ウェルで、Ｔｈ／ＣＴＬペプチドプールとＳ１－ＲＢＤか、Ｔｈ／ＣＴＬペプチドプール単独かのどちらかによって試験管内で再刺激した。ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２及びＩＬ－４を分泌している脾細胞をＥＬＩＳｐｏｔ分析によって決定した。細胞１００万個あたりのサイトカイン分泌細胞（ＳＣ）は、陰性対照ウェルを差し引くことによって算定された。
ｉｉ．細胞応答の測定のためのＥＬＩＳｐｏｔ
４ＷＰＩのワクチン接種ラットからの脾臓をリンパ球調整培地（ＬＣＭ、１０％のＦＢＳ及びペニシリン／ストレプトマイシンが補充されたＲＰＭＩ－１６４０培地）中に採取し、単細胞懸濁液に処理した。細胞ペレットを５ｍＬのＲＢＣ溶解用緩衝液中に室温（ＲＴ）で３分間再懸濁させ、その後、ペニシリン／ストレプトマイシンを含有するＲＰＭＩ－１６４０培地を添加して反応を止めた。遠心分離後、ＬＣＭ中に再懸濁させた細胞ペレットをＥＬＩＳｐｏｔアッセイに使用した。ＥＬＩＳｐｏｔアッセイは、ラット用ＩＦＮ－γ ＥＬＩＳｐｏｔＰＬＵＳキット（ＭＡＢＴＥＣＨ、カタログ番号３２２０－４ＡＰＷ）、ラット用ＩＬ－４ Ｔ細胞ＥＬＩＳｐｏｔキット（Ｕ－ＣｙＴｅｃｈ、カタログ番号ＣＴ０８１）、及びラット用ＩＬ－２ ＥＬＩＳｐｏｔキット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号ＸＥＬ５０２）を使用して実施された。捕捉抗体で予め被覆されたＥＬＩＳｐｏｔプレートをＬＣＭで少なくとも３０分間にわたってＲＴで遮断した。２５０，０００個のラット脾細胞を各ウェルに播種し、Ｓ１－ＲＢＤ－Ｈｉｓタンパク質とＴｈ／ＣＴＬペプチドプール、Ｓ１－ＲＢＤ－Ｈｉｓタンパク質、Ｔｈ／ＣＴＬペプチドプール、または各単一のＴｈ／ＣＴＬペプチドで１８～２４時間、３７℃で刺激した。細胞の刺激を、ウェル１つあたりＬＣＭ中に１μｇの各タンパク質／ペプチドを含む終濃度で行った。製造業者の使用説明書に従ってスポットを呈色させた。ＬＣＭ及びＣｏｎＡをそれぞれ陰性及び陽性対照のために使用した。スポットをＡＩＤ ｉＳｐｏｔリーダーで読み取り、定量した。細胞１００万個あたりのスポット形成単位（ＳＦＵ）は、陰性対照ウェルを差し引くことによって算定された。
ＩＦＮ－γ分泌における用量依存的傾向が脾細胞において認められた一方、ＩＬ－４の分泌はほとんどみられなかった（図５８Ａ）。結果は、ワクチン組成物が極めて免疫原性であり、ＩＦＮ－γ／ＩＬ－４、またはＩＬ－２／ＩＬ－４の高い比率によって示されるようにＴｈ１寄りの細胞性免疫応答を誘導したことを示した。Ｔｈ／ＣＴＬペプチドプールの存在下において（図５８Ｂ）、及びＩＬ－４分泌をほとんど誘導しなかった個々のペプチドによる刺激において（図５８Ｃ）、ＩＬ－２／ＩＬ－４の高い比率も認められた。バーは平均標準偏差（ｎ＝３）を表す。３０及び１００μｇ群においてＩＦＮ－γまたはＩＬ－２の分泌はＩＬ－４のそれよりも有意に高いことが認められたが（最小二乗平均及びペアワイズ比較を用いて＊＊＊ｐ＜０．００５）、１または３μｇ用量群ではそれらに統計的有意差がなかった。
２．遺伝子導入マウスでの攻撃試験
台湾のＡｃａｄｅｍｉａ ＳｉｎｉｃａでＴａｕ，Ｍｉ－Ｈｕａ博士によって樹立され、他の研究者によって適合形態も報告されている、ＡＡＶ／ｈＡＣＥ２形質導入ＢＡＬＢ／ｃマウスモデルにおいて、ワクチン組成物の初回攻撃試験を実施した。
ａ．ＢＡＬＢ／Ｃ攻撃試験のための動物処置
合計１２頭の８～１０週齢の雄性ＢＡＬＢ／ＣラットをＢｉｏＬＡＳＣＯ Ｔａｉｗａｎ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．から購入した。３日間順応させた後、動物を４つの群に無作為に割り振った。動物に対する全ての処置は、ＵＢＩ Ａｓｉａにおいて動物実験委員会（ＩＡＣＵＣ）によって査読及び承認された規制及びガイドラインに従って実施した。ＩＡＣＵＣ番号はＡＴ２０３２及びＡＴ２０３３である。
Ｓ１－ＲＢＤ－ｓＦｃ（配列番号２３５）を、Ｔｈ／ＣＴＬペプチド（配列番号３４５、３４６、３４８、３４８、３６１及び６６）と共に含有し、ＡＤＪＵ－ＰＨＯＳ（登録商標）／ＣｐＧ１アジュバントで製剤化された、３、９または３０μｇのワクチン組成物を使用して、０週目（初回刺激）及び２週目（追加免疫）にマウスにＩＭ経路によるワクチン接種を行った。以下に記載されるアッセイ方法による抗原活性及び機能活性の評価のためにマウスからの免疫血清を０、３及び４週目に採取した。
ＡＡＶ６／ＣＢ－ｈＡＣＥ２及びＡＡＶ９／ＣＢ－ｈＡＣＥ２はＡｃａｄｅｍｉａ ＳｉｎｉｃａのＡＡＶ中核施設によって生産された。ＢＡＬＢ／Ｃマウス（８～１０週齢）にアトロピン（０．４ｍｇ／ｍｌ）／ケタミン（２０ｍｇ／ｍｌ）／キシラジン（０．４％）の混合物の腹腔内注射によって麻酔をかけた。その後、３×１０１１ｖｇのＡＡＶ６／ｈＡＣＥ２を含んだ１００μＬの生理食塩水をマウスの気管内（ＩＴ）に注射した。肺外臓器に形質導入するために、１×１０１２ｖｇのＡＡＶ９／ｈＡＣＥ２を含んだ１００μＬの生理食塩水をマウスの腹腔内に注射した。
ＡＡＶ６／ＣＢ－ｈＡＣＥ２及びＡＡＶ９／ＣＢ－ｈＡＣＥ２形質導入の２週間後にマウスに麻酔をかけ、体積１００μＬ中の１×１０４ＰＦＵのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス（台湾の台北市の国立台湾大学から得たｈＣｏＶ－１９／Ｔａｉｗａｎ／４／２０２０ ＴＣＤＣ＃４）で攻撃した。マウス攻撃実験は、Ａｃａｄｅｍｉａ ＳｉｎｉｃａのＩＡＣＵＣによって評価及び承認された。実験からの生存マウスを、ＩＳＣＩＩＩ ＩＡＣＵＣガイドラインに従って二酸化炭素を使用して屠殺した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２攻撃後は全ての動物の体重を１日１回測定した。
ｂ．ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡ定量のためのＲＴ－ＰＣＲ
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＮＡレベルを測定するために、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムのエンベロープ（Ｅ）遺伝子中の２６，１４１～２６，２５３領域を標的とする特異的プライマーを、以前の研究で記述がなされたＴａｑｍａｎリアルタイムＲＴ－ＰＣＲ法（Corman, et al., 2020）によって使用した。プローブＥ－Ｓａｒｂｅｃｏ－Ｐ１（５’－ＦＡＭ－ＡＣＡＣＴＡＧＣＣＡＴＣＣＴＴＡＣＴＧＣＧＣＴＴＣＧ－ＢＢＱ－３’、配列番号３７０）に加えて、順方向プライマーＥ－Ｓａｒｂｅｃｏ－Ｆ１（５’－ＡＣＡＧＧＴＡＣＧＴＴＡＡＴＡＧＴＴＡＡＴＡＧＣＧＴ－３’、配列番号３６８）及び逆方向プライマーＥ－Ｓａｒｂｅｃｏ－Ｒ２（５’－ＡＴＡＴＴＧＣＡＧＣＡＧＴＡＣＧＣＡＣＡＣＡ－３’、配列番号３６９）を使用した。ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ、ドイツ）を製造業者の使用説明書に従って使用して各試料から合計３０μＬのＲＮＡ溶液を採取した。Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩ １ステップＲＴ－ＰＣＲシステムをＰｌａｔｉｎｕｍ Ｔａｑポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＳＡ）と共に使用して５μＬのＲＮＡ試料を加えて合計２５μＬの混合物とした。最終反応混合物は、４００ｎＭの順方向及び逆方向プライマー、２００ｎＭのプローブ、１．６ｍＭのデオキシリボヌクレオシドトリホスフェート（ｄＮＴＰ）、４ｍＭの硫酸マグネシウム、５０ｎＭのＲＯＸ標準色素、及びキットからの１μＬの酵素混合物を含有していた。サイクリング条件は、１ステップＰＣＲプロトコールによって実施した：ｃＤＮＡ合成のために５５℃で１０分間、続いて９４℃で３分間、ならびに９４℃で１５秒間と５８℃で３０秒間の増幅サイクルを４５回。データはＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７５００ リアルタイムＰＣＲシステム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＳＡ）によって収集及び算出された。合成１１３－ｂｐオリゴヌクレオチド断片をｑＰＣＲ標準として使用してウイルスゲノムのコピー数を推算した。オリゴヌクレオチドはＧｅｎｏｍｉｃｓ ＢｉｏＳｃｉ ａｎｄ Ｔｅｃｈ Ｃｏ．Ｌｔｄ．（Ｔａｉｐｅｉ，Ｔａｉｗａｎ）によって合成された。
ｃ．攻撃試験
試験の０及び２ＷＰＩにおいてマウス３頭の群に、３、９または３０μｇのタンパク質を含有しＡＤＪＵ－ＰＨＯＳ（登録商標）／ＣｐＧ１で製剤化されたワクチン組成物によるワクチン接種を行った。４ＷＰＩにおいてマウスを、ｈＡＣＥ２が発現しているアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）に感染させ、２週間後に１０６のＴＣＩＤ５０のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２で鼻腔内（ＩＮ）経路によって攻撃した（図５９Ａ）。肺ウイルス負荷及び体重測定を用いてワクチンの有効性を測定した。図５９Ｂに示すように、３０μｇのワクチン組成物によるワクチン接種は、生理食塩水群と比較して肺ウイルス負荷を有意に減少させた（約３．５ｌｏｇ１０ウイルスゲノムコピー／μｇのＲＮＡ、または約５倍のＴＣＩＤ５０／ｍＬの感染性ウイルス）（対応ありｔ検定によって測定してｐ＜０．０５）。図５９Ｃに示すように、中程度及び高い用量でのワクチン接種は肺病態の明瞭な軽減をもたらした。３または９μｇのワクチン組成物によるワクチン接種は、細胞培養法（ＴＣＩＤ５０）による生ウイルス検出を検出レベル未満（ＬＯＤ、図５９Ｂ、右パネル）に低減したが、ＲＴ－ＰＣＲ（図５９Ｂ、左パネル）によって測定したとき、それはウイルス負荷を有意に低減したようには見受けられなかった。同様に、体重測定は、高用量群と対照群との間の有意差を示した（データ示さず）。まとめると、この試験では統計力が欠けている（Ｎ＝３マウス）とはいえ、生ウイルス検出がないこと、及び炎症性細胞浸潤がないこと、ならびに肺において免疫病態がないことを考え合わせれば１用量あたり３０μｇの最高用量は最大の保護的有効性を有していた可能性があった。
３．アカゲザルにおける免疫原性及び攻撃試験
アカゲザル（ＲＭ）を使用して確立されたモデルに基づいて、Ｓ１－ＲＢＤ－ｓＦｃ（配列番号２３５）をＴｈ／ＣＴＬペプチド（配列番頭３４５、３４６、３４８、３４８、３６１及び６６）と一緒に含有するワクチン組成物の免疫化試験を以下に記載のとおりに実施した。
ａ．非ヒト霊長類における免疫原性試験
ＪＯＩＮＮ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（北京）において、およそ３～６歳のアカゲザルで試験を行った。動物をステンレス鋼製の檻に個別に収容し、環境を監視し、１８～２６℃の温度及び４０～７０％の相対湿度で十分に換気された部屋（従来の等級）を維持した。動物を隔離し、少なくとも１４日間順応させた。到着後３日以内に獣医師によって動物の全身の健康状態が評価及び記録された。詳細な臨床所見、体重、体温、心電図（ＥＣＧ）、血液学、凝固及び臨床化学をサルに対して実施した。データは、収容場所から移される前に獣医師によって査読された。－１日目に得られた実験前体重に基づいて全ての動物を、コンピュータ生成無作為化手法を用いて各々の用量群に無作為に割り振った。群１～４の全ての動物に対照か試験品かのどちらかを筋肉内（ＩＭ）注射によって与えた。用量は片方の後肢の大腿四頭筋への注射によって投与した。試験期間中は、死亡、瀕死状態、糞、嘔吐、ならびに水及び食餌摂取の変化を含むがこれらに限定されない臨床兆候があるかについてサルを少なくとも１日２回（午前及び午後）観察した。以下に記載される免疫原性試験のために定期的な間隔で動物の採血を行った。
アカゲザル（３～６歳）を４つの群に分け、それぞれ高用量（１００μｇ／用量）、中用量（３０μｇ／用量）、低用量（１０μｇ／用量）のワクチン及び生理食塩水を筋肉内に注射した。群分けされた全ての動物を、（８２日目に実施される）気管内経路による１０６ＴＣＩＤ５０／ｍｌのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスによる攻撃の前に、３回（０、２８及び７０日目）免疫化した。サルを安楽死させ、肺組織を攻撃後７日目に採取した。ｄｐｉ３、５、７日目に喉スワブを採取した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の中和抗体検査のために、免疫化後０、１４、２８、３５、４２、７０及び７６日目、ならびに攻撃後０、３、５、７日目に血液試料を採取した。攻撃後７日目に肺組織を採取し、ＲＴ－ＰＣＲアッセイ及び組織学的アッセイのために使用した。攻撃後０及び３日目に採取された血液試料においてそれぞれリンパ球サブセットパーセント（ＣＤ３＋、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋）及び肝要なサイトカイン（ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－６）の分析も実施した。
ｂ．アカゲザルにおける免疫原性及び攻撃試験
アカゲザル（ＲＭ）を使用して確立されたモデルに基づいてＩＭ注射によるワクチン組成物の免疫化試験を、０及び４ＷＰＩにおいて０、１０、３０または１００μｇの組成物を受けているＲＭ（Ｎ＝４／群）を使用して開始した。免疫原性測定は、全ての動物においてＳ１－ＲＢＤに結合する血清ＩｇＧがベースラインを上回って増加し、５及び７ＷＰＩにおいて結合力価がおおよそ３対数にまで達したことを示した（図６０Ａ）。強い中和抗体応答が誘導され、３０μｇ用量が最も強力であった（図６０Ｂ）。ＥＬＩＳｐｏｔ分析は、ワクチン組成物が用量依存的に抗原特異的ＩＦＮ－γ－分泌Ｔ細胞を活性化させたことを示し（図６０Ｃ）、Ｔ細胞応答は１００μｇの用量レベルで最も高かった。
４．臨床試験に備えた毒性試験
臨床試験を可能にするために、Ｓ１－ＲＢＤ－ｓＦｃ（配列番号２３５）をＴｈ／ＣＴＬペプチド（配列番号３４５、３４６、３４８、３４８、３６１及び６６）と一緒に含有するワクチン組成物を、Ｓｐｒａｇｕｅ－ＤａｗｌｅｙラットにおいてＧＬＰに準拠した反復用量毒性試験で以下に記載されるとおりに検査した。
ａ．毒性試験のためのプロトコール
合計１６０頭のラット（８０頭／性別）を、－１日目（最初の投薬の１日前。最初の投薬日を１日目として定義する）に得た体重に基づいて８つの群に無作為に割り振り、そのうちの１２０頭のラットを毒性試験のために群１、２、３及び４に割り振り（１５頭／性別／群）、４０頭のラットをサテライト試験のために群５、６、７及び８（５頭／性別／群）に割り振った。ラットを群１及び５では陰性対照としての生理食塩水で処置し、群２及び６ではアジュバント対照としてのワクチン組成物プラセボで処置し、群３及び７、ならびに群４及び８ではそれぞれ１００、３００μｇ／動物の用量のワクチン組成物で処置した。ラットを片側の後肢筋（大腿四頭筋及び腓腹筋。１回目の用量は左側、２回目の用量は右側）への筋肉内注射によって複数部位において２週連続で２週間に１回、合計２回の用量（１日目及び１５日目）で処置した。用量体積は０．５ｍＬ／動物であった。試験の間に臨床所見（注射部位観察を含む）、体重、食餌摂取、体温、検眼鏡検査、血液学、凝固、臨床化学、検尿、Ｔリンパ球亜集団、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）によってＩＦＮ－γを分泌しているＴリンパ球スポットの数、サイトカイン、及び免疫原性、中和抗体価、及びＩｇＧ２ｂ／ＩｇＧ１比率分析を実施した。群１～４の最初の１０頭の動物／性別／群を２週間の投薬の後（１８日目）の終末剖検に指定し、残りの５頭の動物／性別／群を最後の投薬の後（４４日目）の４週間の回復剖検に指定した。群１～４の全ての動物に完全な剖検検査を行い、その後、臓器重量、巨視的及び微視的検査を評価した。
ｂ．臨床試験に備えた毒性試験
臨床試験を可能にするために、ワクチン組成物を、Ｓｐｒａｇｕｅ－ＤａｗｌｅｙラットにおいてＧＬＰに準拠した反復用量毒性試験で検査した。試験は臨床用途のために意図する最高用量よりも３倍高い３００ｕｇの用量を含んでいた。２回の注射の計画は、臨床用途を意図したものを超えていなかったが、これはＷＨＯガイドライン４６によれば許容可能なものである。試験は、ワクチン組成物の免疫原性を評価することを企図したものでもあった。１６０頭のラットを８つの群に無作為に分割し（８０頭の雄及び８０頭の雌）、そのうちの４０頭をサテライト免疫原性試験に含めた。低及び高用量群にはそれぞれ１００μｇ／動物（０．５ｍＬ）及び３００μｇ／動物（０．５ｍＬ）のワクチン組成物を接種し、対照群には生理食塩水（０．９％生理食塩水）かアジュバント（ワクチン組成物プラセボ）かのどちらかを同じ用量体積で注射した。最初の１０頭の動物／性別／群を２週間の投薬の後の２ＷＰＩ（１８日目）における終末剖検に指定し、残りの２０頭の動物／性別／群を４ＷＰＩ（４４日目）の最後の投薬の後の４週間の回復剖検に指定した。実験条件下において、ラットの片方の後肢筋（大腿四頭筋及び腓腹筋。１回目の用量は左側、２回目の用量は右側）へのＩＭ注射を、複数部位において２週連続で２週間に１回、０及び２ＷＰＩ（１日目及び１５日目）での合計２回の用量で行った。
１週目及び３週目における３００μｇ／動物以下の用量レベルのワクチン組成物による処置は、全身毒性の兆候がなく良好に忍容された。試験全体を通して、試験品に関係する死亡も瀕死状態も認められなかった。臨床所見（注射部位観察を含む）において、ワクチンに関係する異常な知見は認められなかった。注射部位には紅斑も浮腫も認められず、全ての観察時間点においてドレイズスコアは０であった。同様に、体重、食餌摂取、体温、血液学、化学（ＡＧ比以外）、検眼鏡検査または検尿におけるワクチンに関係する変化は認められず、ＣＤ３＋、ＣＤ３＋ＣＤ４＋、ＣＤ３＋ＣＤ８＋、及びＣＤ３＋ＣＤ４＋／ＣＤ３＋ＣＤ８の比率には統計的に有意な変化が認められなかった。統計的に有意な増加がフィブリノーゲン、ＩＦＮ－γ及びＩＬ－６においてみられた一方、アルブミン／グロブリン比率には低下が認められ、これらの結果は、ワクチンに対する急性期応答と整合しており、回復期間の最後までに全て消散した。副睾丸、皮膚、肝臓、前立腺及び乳腺の組織病理学的検査は、視認可能な病変または異常がなく炎症性細胞浸潤が最小限に抑えられたことを明らかにした。
サテライト群において測定されたワクチン組成物の免疫原性は、１００μｇ／動物または３００μｇ／動物の２回の用量を２及び４ＷＰＩ（１４日間隔）で受けている動物において、ワクチンが相当なレベルの抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ１－ＲＢＤ ＩｇＧを誘導できたことを示した（データ示さず）。Ｓ１－ＲＢＤ結合ＩｇＧ力価は２ＷＰＩ（１５日目）での追加免疫の後に経時的にやや上昇したが、これは、６ＷＰＩ（４４日目）に１００μｇ／動物及び３００μｇ／動物のワクチン組成物で免疫化されたラットにおいて２．６ｌｏｇ１０及び３．３ｌｏｇ１０にまで到達した。この試験で認められた知見は、免疫応答を刺激して高力価の抗体の産生をもたらすことを企図したワクチンについて予想したとおりである。ＥＬＩＳＡによる抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ１－ＲＢＤ ＩｇＧ力価、サブタイプＩｇＧ及び血清サイトカイン産生を実施してＴｈ１／Ｔｈ２応答を決定した。Ｓ１－ＲＢＤ特異ＩｇＧサブクラスの分析において、Ｔｈ２に関係するサブクラスＩｇＧ抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ１－ＲＢＤのパターン及び誘導レベルは、全ＩｇＧ抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ１－ＲＢＤにおいて認められたのと同程度であった。Ｔｈ１に関係するサブクラスＩｇＧ２ｂ抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ１－ＲＢＤの誘導が、６ＷＰＩ（４３日目）にワクチン組成物でワクチン接種したラットにおいてごくわずかだけ検出された。しかしながら、ＥＬＩＳＡによって測定された血清サイトカインパターンは、Ｔｈ１／Ｔｈ２の均衡のとれた応答を示していた（データ示さず）。
ワクチン組成物の臨床試験が台湾で始められた。「健常成人ボランティアにおいてＵＢ－６１２ワクチンの安全性、忍容性及び免疫原性を評価するための第１相非盲検試験」と題する最初の試験は、台湾において２０２０年９月に開始された。この試験は、１日目及び２９日目（２回用量計画）に与えられるＵＢ－６１２の３つ（１０、３０または１００μｇ）の用量群（群１つあたりＮ＝２０）を含む。主要評価項目はワクチン接種の７日以内の有害事象の発生であり、副次評価項目は、６ヶ月の経過観察期間中の有害事象、標準的検査施設安全措置、抗原特異抗体価、抗体陽転率、Ｔ細胞応答、及び中和抗体価の上昇を含む。
実施例１７
健常成人ボランティアにおける高精度デザイナーワクチンの安全性、忍容性及び免疫原性を評価するための第Ｉ相非盲検試験
１．目的
主目的は、健常成人ボランティアにおいて本開示の高精度デザイナーワクチンの安全性、忍容性及び免疫原性を評価することであった。
２．方法
０日目及び４週目における低及び高用量の本開示の高精度デザイナーワクチンの非盲検２回用量筋肉内投与。
３．被験者の数
合計４０名の参加者。
ａ．試験アーム、介入、主要及び副次評価項目を図４５に詳しく記載するとともに、組入れ及び除外基準を図４６に詳しく記載する。
ｂ．健常成人においてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対するデザイナーワクチンの安全性、忍容性及び免疫原性を評価する第Ｉ相非盲検試験のための臨床デザインが、図４７に示されているとおりに表される。
ｃ．健常成人ボランティアにおいてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対するデザイナーワクチンの安全性、忍容性及び免疫原性を評価する第Ｉ相非盲検試験に関連する臨床活動性が、図４８に示されているとおりに詳しく表される。
ｄ．４つのコホートを用いて２段階で健常成人ボランティアにおいてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対するデザイナーワクチンの安全性、忍容性及び免疫原性を評価する第Ｉ相非盲検試験のための臨床デザインが、図４９に示されているとおりに詳しく表される。
実施例１８
デザイナー長時間作用性タンパク質薬ＡＣＥ２－ＥＣＤ－ｓＦｃはＶＥＲＯ細胞におけるＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２起因性ＣＰＥの阻害のための中和アッセイで測定される高い抗ウイルス効果を生み出した
コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１（２００３年）及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（２０１９年）は、ウイルスエンベロープに係留されたスパイク（Ｓ）タンパク質が受容体アンジオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ２）に結合することによって宿主細胞に侵入する。Ｓタンパク質の数ある独特な特徴の中でも、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１に比べてより高い（最大で２０倍の）親和性でＡＣＥ２に結合するが、これは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２において認められる新型感染症のヒトからヒトへの急速な伝染性に対応している。ＡＣＥ２はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の蔓延において必須な役割を果たすため、操作型可溶性ＡＣＥ２様タンパク質は潜在的に、膜結合型ＡＣＥ２の正常な生理的機能をさらなる減少及び損傷から保護すると同時に、ウイルス侵入を阻止する効果的な妨害物質として働いてそれによって治療目的を達成する可能性がある。
専売技術プラットフォームを用いてＧＭＰグレードの独特なＡＣＥ受容体系長時間作用性融合タンパク質製品が、症候性及び無症候性患者の両方のＣＯＶＩＤ－１９を治療するために使用され得る。この技術プラットフォームは、一本鎖免疫グロブリンＦｃ断片（ｓＦｃ）に連結されるＡＣＥ２の細胞外ドメイン（ＡＣＥ２－ＥＣＤ）のプラスミド構築、ＣＨＯ－Ｓ細胞におけるＡＣＥ２－ｓＦｃ融合タンパク質の発現及び産生、ならびにタンパク質種の精製及び生物学的特性評価を統合する。本ＡＣＥ２－ｓＦｃ製品は、前臨床検査中であり、臨床診断及びＰＣＲ検証によって軽度～重度のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を有することが確認された患者での加速並行第Ｉ相安全性試験が予定されている。
融合タンパク質ＡＣＥ２－ｓＦｃが機能的に活性であることを実証する多種多様な試験管内生物学的アッセイが実施された。これらのアッセイには、ＳＰＲに基づく結合親和性アッセイ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク（Ｓ）タンパク質による分子認識及び細胞認識、ならびにＳタンパク質－ＡＣＥ相互作用のＡＣＥ２－ｓＦｃによる中和が含まれる。概念実証となるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染の阻害は、細胞レベルで確認された。ＡＣＥ２－ｓＦｃは、単独であろうと、抗ＩＬ６Ｒ ｍＡｂもしくは現在承認されているレムデシビルとの相乗的組合せであろうと、ＣＯＶＩＤ－１９の治療のための顕著な臨床的実用性を有する可能性がある。
「一本鎖Ｆｃプラットフォーム」を採用して強力な長時間作用性中和タンパク質製品ＡＣＥ２－ＥＣＤ－ｓＦｃ（配列番号２３７）が生み出された。受容体の結合を阻害する性質ゆえにＡＣＥ２－ＥＣＤ－ｓＦｃタンパク質は、コロナウイルスが変異した場合に薬剤耐性に直面することがほとんどないと予期される。図５０に示すように、二価Ｆｃ融合体の性質である嵩高い立体配座のためにＡＣＥ－ＥＣＤ－Ｆｃは、Ｓ１タンパク質に結合するとき、一本鎖（ＡＣＥ ＥＣＤ－ｓＦｃタンパク質）に比べてより速い（約１０倍の）離脱速度を有するが、これは、Ｆｃタンパク質が一本鎖（ｓＦｃ）融合タンパク質に比べて１０倍低い結合親和性を有することを示している。図５１に示されるように、３種類全てのＡＣＥ－ＥＣＤ融合タンパク質（ＡＣＥ２ ＥＣＤ－ｓＦｃ、ＡＣＥ２ ＥＣＤ－Ｆｃ、及びＡＣＥ２ ＥＣＤ－ｓＦｃ）は全て、ＥＬＩＳＡプレート上に被覆されたＡＣＥ－２に対するＳ１結合を遮断する顕著な能力を有しているが、ＡＣＥ２－ＥＣＤ－ｓＦｃは、他の２つの種類と比較したとき、より高い遮断阻害％を有している。この結果は、おおよそ５０の範囲の血清力価の中和抗体を使用する霊長類攻撃試験において十分な保護が得られ得るという観察結果に基づけば、表３６に示されるように２つの別個の検査施設（北京のＫｅＸｉｎ Ｌａｂ、及び台北市のＳｉｎｉｃａ Ｌａｂ）で検査したときアッセイにおいて２．４ｍｇ／ｍＬのＡＣＥ２－ＥＣＤ－ｓＦｃによって８，１９２に相当する力価を実現したＶｅｒｏ細胞に対するウイルス起因性細胞変性効果（ＣＰＥ）の相対的阻害が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染による急性攻撃に遭遇している患者のための極めて効果的な治療を提供するであろうということを示している。第Ｉ／ＩＩ相試験が、そのような長時間作用性タンパク質薬の安全性及び有効性を観察するために軽度～重度のＣＯＶＩＤ－１９患者において行われよう。
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Claims (73)

  1. 融合タンパク質であって、
    ａ）配列番号２２５及び配列番号２２６からなる群から選択されるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２からのスパイク（Ｓ）タンパク質の受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）に由来するアミノ酸配列、
    ｂ）配列番号１６６～２２５からなる群から選択されるＩｇＧ分子からの任意選択のヒンジ領域、ならびに
    ｃ）配列番号２３１～２３４からなる群から選択されるＩｇＧ分子のＦｃ断片
    を含み、
    （ａ）の前記アミノ酸配列が直接、または（ｂ）の前記任意選択のヒンジ領域を介して（ｃ）の前記Ｆｃ断片に共有結合で連結されている、
    前記融合タンパク質。
  2. （ｃ）の前記Ｆｃ断片が配列番号２３２のアミノ酸配列を有し、前記任意選択のヒンジ領域が配列番号１６６または配列番号１８８のアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の融合タンパク質。
  3. 前記融合タンパク質が、配列番号２３５のＳ１－ＲＢＤ－ｓＦｃ、配列番号２３６のＳ１－ＲＢＤａ－ｓＦｃ、及び配列番号３５５のＳ１－ＲＢＤ－Ｆｃからなる群から選択される、請求項１に記載の融合タンパク質。
  4. ＣＯＶＩＤ－１９ワクチン組成物であって、
    ａ）請求項３に記載の融合タンパク質、及び
    ｂ）薬学的に許容される賦形剤
    を含む、前記ＣＯＶＩＤ－１９ワクチン組成物。
  5. 前記融合タンパク質が配列番号２３５のＳ１－ＲＢＤ－ｓＦｃである、請求項４に記載のＣＯＶＩＤ－１９ワクチン組成物。
  6. Ｔｈ／ＣＴＬペプチドをさらに含む、請求項４に記載のＣＯＶＩＤ－１９ワクチン組成物。
  7. 前記Ｔｈ／ＣＴＬペプチドが、配列番号１のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｍタンパク質、配列番号６のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｎタンパク質、配列番号２０のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質、病原体タンパク質またはその任意の組合せに由来するものである、請求項６に記載のＣＯＶＩＤ－１９ワクチン組成物。
  8. ａ．前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｍタンパク質に由来する前記Ｔｈ／ＣＴＬペプチドが配列番号３６１であり、
    ｂ．前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｎタンパク質に由来する前記Ｔｈ／ＣＴＬペプチドが、配列番号９～１６、１９、１５３～１６０、１６５、３４７、３５０、３５１及び３６３からなる群から選択され、
    ｃ．前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質に由来する前記Ｔｈ／ＣＴＬペプチドが、配列番号３５～３６、３９～４８、１４５～１５２、１６１～１６４、３４５～３４６、３４８、３６２、３６４及び３６５からなる群から選択され、
    ｄ．前記病原体タンパク質に由来する前記Ｔｈ／ＣＴＬペプチドが、配列番号４９～１００からなる群から選択される、
    請求項７に記載のＣＯＶＩＤ－１９ワクチン組成物。
  9. 配列番号３４５、３４６、３４７、３４８、３６１及び６６のＴｈ／ＣＴＬペプチドの混合物をさらに含む、請求項４に記載のＣＯＶＩＤ－１９ワクチン組成物。
  10. 前記Ｔｈ／ＣＴＬペプチドの各々が等重量で前記混合物中に存在する、請求項９に記載のＣＯＶＩＤ－１９ワクチン組成物。
  11. 前記Ｓ１－ＲＢＤ－ｓＦｃタンパク質の前記Ｔｈ／ＣＴＬペプチドの混合物の総重量に対する比（ｗ：ｗ）が８８：１２である、請求項１０に記載のＣＯＶＩＤ－１９ワクチン組成物。
  12. 前記薬学的に許容される賦形剤が、アジュバント、緩衝剤、界面活性剤、乳化剤、ｐＨ調整剤、生理食塩水、保存剤、溶剤またはその任意の組合せである、請求項４に記載のＣＯＶＩＤ－１９ワクチン組成物。
  13. 前記薬学的に許容される賦形剤が、ＣｐＧオリゴヌクレオチド、リン酸アルミニウム、ヒスチジン、ヒスチジンＨＣｌ・Ｈ２Ｏ、アルギニンＨＣｌ、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレエート、塩酸、塩化ナトリウム、２－フェノキシエタノール、水及びその任意の組合せからなる群から選択される、請求項４に記載のＣＯＶＩＤ－１９ワクチン組成物。
  14. ＣＯＶＩＤ－１９ワクチン組成物であって、
    ａ．配列番号２３５のＳ１－ＲＢＤ－ｓＦｃタンパク質、
    ｂ．配列番号９～１６、１９、３５～３６、３９～１００、１４５～１６５、３４５～３４８、３５０、３５１、３６２～３６５及びその任意の組合せからなる群から選択される、Ｔｈ／ＣＴＬペプチド、
    ｃ．薬学的に許容される賦形剤
    を含む、前記ＣＯＶＩＤ－１９ワクチン組成物。
  15. （ｂ）の前記Ｔｈ／ＣＴＬペプチドが配列番号３４５、３４６、３４７、３４８、３６１及び６６の混合物である、請求項１４に記載のＣＯＶＩＤ－１９ワクチン組成物。
  16. 前記Ｔｈ／ＣＴＬペプチドの各々が等重量で前記混合物中に存在する、請求項１５に記載のＣＯＶＩＤ－１９ワクチン組成物。
  17. 前記Ｓ１－ＲＢＤ－ｓＦｃタンパク質の前記Ｔｈ／ＣＴＬペプチドの混合物の総重量に対する比（ｗ：ｗ）が８８：１２である、請求項１６に記載のＣＯＶＩＤ－１９ワクチン組成物。
  18. 前記薬学的に許容される賦形剤が、アジュバント、緩衝剤、界面活性剤、乳化剤、ｐＨ調整剤、生理食塩水、保存剤、溶剤またはその任意の組合せである、請求項１４に記載のＣＯＶＩＤ－１９ワクチン組成物。
  19. 前記薬学的に許容される賦形剤が、ＣｐＧオリゴヌクレオチド、リン酸アルミニウム、ヒスチジン、ヒスチジンＨＣｌ・Ｈ２Ｏ、アルギニンＨＣｌ、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレエート、塩酸、塩化ナトリウム、２－フェノキシエタノール、水及びその任意の組合せからなる群から選択される、請求項１４に記載のＣＯＶＩＤ－１９ワクチン組成物。
  20. 前記Ｔｈ／ＣＴＬペプチドが配列番号３４５、３４６、３４７、３４８、３６１及び６６の混合物であり、各ペプチドが等重量で前記混合物中に存在しており、
    前記薬学的に許容される賦形剤が、ＣｐＧ１オリゴヌクレオチド、リン酸アルミニウム、ヒスチジン、ヒスチジンＨＣｌ・Ｈ２Ｏ、アルギニンＨＣｌ、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレエート、塩酸、塩化ナトリウム及び２－フェノキシエタノールを組み合わせて水中に含むものである、
    請求項１４に記載のＣＯＶＩＤ－１９ワクチン組成物。
  21. 配列番号２３５の前記Ｓ１－ＲＢＤ－ｓＦｃタンパク質の総量が約１０μｇ～約２００μｇであり、
    前記Ｔｈ／ＣＴＬペプチドの総量が約２μｇ～約２５μｇである、
    請求項２０に記載のＣＯＶＩＤ－１９ワクチン組成物。
  22. 配列番号２３５の前記Ｓ１－ＲＢＤ－ｓＦｃタンパク質の総量が約１７．６μｇであり、
    前記Ｔｈ／ＣＴＬペプチドの総量が約約２．４μｇである、
    請求項２０に記載のＣＯＶＩＤ－１９ワクチン組成物。
  23. 配列番号２３５のＳ１－ＲＢＤ－ｓＦｃタンパク質の総量が約５２．８μｇであり、
    前記Ｔｈ／ＣＴＬペプチドの総量が約７．２μｇである、
    請求項２０に記載のＣＯＶＩＤ－１９ワクチン組成物。
  24. 配列番号２３５の前記Ｓ１－ＲＢＤ－ｓＦｃタンパク質の総量が約１７６μｇであり、
    前記Ｔｈ／ＣＴＬペプチドの総量が約２４μｇである、
    請求項２０に記載のＣＯＶＩＤ－１９ワクチン組成物。
  25. 対象におけるＣＯＶＩＤ－１９を予防する方法であって、薬学的有効量の請求項１２に記載のワクチン組成物を前記対象に投与することを含む、前記方法。
  26. 前記ワクチン組成物の前記薬学的有効量が２回用量で前記対象に投与される、請求項２５に記載の方法。
  27. 前記ワクチン組成物の第１用量が前記対象に投与され、前記第１用量の約４週間後に前記ワクチン組成物の第２用量が前記対象に投与される、請求項２６に記載の方法。
  28. ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する抗体を生み出す方法であって、薬学的有効量の請求項１４に記載のワクチン組成物を対象に投与することを含む、前記方法。
  29. ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質のＳ１－ＲＢＤ部分（配列番号２２６）に特異的に結合する、単離された抗体またはそのエピトープ結合性断片。
  30. 請求項２９に記載の単離された抗体またはそのエピトープ結合性断片を含む、組成物。
  31. 請求項１に記載の融合タンパク質をコードするｃＤＮＡ配列をトランスフェクトされた、細胞株。
  32. チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株である、請求項３１に記載の細胞株。
  33. 前記ｃＤＮＡ配列が、Ｓ１－ＲＢＤ－ｓＦｃをコードする配列番号２４６、Ｓ１－ＲＢＤａ－ｓＦｃをコードする配列番号２４７、及びＳ１－ＲＢＤ－Ｆｃをコードする配列番号３５７
    からなる群から選択される、請求項３１に記載の細胞株。
  34. 前記ｃＤＮＡ配列が、Ｓ１－ＲＢＤ－ｓＦｃをコードする配列番号２４６である、請求項３１に記載の細胞株。
  35. 前記ｃＤＮＡ配列が、Ｓ１－ＲＢＤａ－ｓＦｃをコードする配列番号２４７である、請求項３１に記載の細胞株。
  36. 前記ｃＤＮＡ配列が、Ｓ１－ＲＢＤ－Ｆｃをコードする配列番号３５７である、請求項３１に記載の細胞株。
  37. ＣＯＶＩＤ－１９についてのウイルス感染の検出及び疫学的監視のための血清学的診断アッセイであって、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＭタンパク質（配列番号１）、Ｎタンパク質（配列番号６）及びＳタンパク質（配列番号２０）からの抗原性ペプチド
    を含む、前記血清学的診断アッセイ。
  38. 前記抗原性ペプチドが、配列番号４～５、１７～１８、３７～３８、２５９、２６１、２６３、２６５、２６６、２７０、２８１、３０８、３２１、３２２、３２３、３２４及びその任意の組合せからなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項３７に記載の血清学的診断アッセイ。
  39. 前記抗原性ペプチドが、配列番号５、１８、３８、２６１、２６６、２８１、３２２及びその任意の組合せからなる群から選択される、請求項３７に記載の血清学的診断アッセイ。
  40. ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２による感染を検出する方法であって、
    ａ）配列番号４～５、１７～１８、２３～２４、２６、２９～３４、３７～３８、２５９、２６１、２６３、２６５、２６６、２７０、２８１、３０８、３２１、３２２、３２３及び３２４、ならびにその任意の組合せからなる群から選択される抗原性ペプチドを、固体担体に結合させること、
    ｂ）（ａ）において前記固体担体に結合した前記抗原性ペプチドを、患者からの抗体を含有する生体試料に、前記抗体が前記ペプチドに結合するよう導く条件の下で曝露すること、ならびに
    ｃ）（ｂ）において前記固体担体に結合した前記ペプチドに結合した前記抗体の存在を検出すること
    を含む、前記方法。
  41. （ａ）の前記抗原性ペプチドが、配列番号５、１８、３８、２６１、２６６、２８１、３２２及びその任意の組合せからなる群から選択される、請求項４０に記載の方法。
  42. 前記固体担体に結合させた前記ペプチドに結合している前記抗体の存在が、ＥＬＩＳＡによって評価される、請求項４１に記載の方法。
  43. 約２０個以上のアミノ酸を有するＳ－ＲＢＤペプチド免疫原構築物であって、式：
    （Ｔｈ）ｍ－（Ａ）ｎ－（Ｓ１－ＲＢＤ Ｂ細胞エピトープペプチド）－Ｘ
    または
    （Ｓ１－ＲＢＤ Ｂ細胞エピトープペプチド）－（Ａ）ｎ－（Ｔｈ）ｍ－Ｘ
    または
    （Ｔｈ）ｍ－（Ａ）ｎ－（Ｓ１－ＲＢＤ Ｂ細胞エピトープペプチド）－（Ａ）ｎ－（Ｔｈ）ｍ－Ｘ
    よって表され、
    式中、
    Ｔｈは異種Ｔヘルパーエピトープであり、
    Ａは異種スペーサーであり、
    （Ｓ１－ＲＢＤ Ｂ細胞エピトープペプチド）は、Ｓ１－ＲＢＤ（配列番号２２６）またはそのバリアントからの６～約３５アミノ酸残基を有するＢ細胞エピトープペプチドであり、
    Ｘは、アミノ酸のα－ＣＯＯＨまたはα－ＣＯＮＨ２であり、
    ｍは１～約４であり、
    ｎは０～約１０である、
    前記Ｓ－ＲＢＤペプチド免疫原構築物。
  44. 前記Ｓ１－ＲＢＤ Ｂ細胞エピトープペプチドが、配列番号２３～２４、２６～２７及び２９～３４からなる群から選択されるエピトープの局所的束縛を可能にする鎖内ジスルフィド結合を形成している、請求項４３に記載のＳ１－ＲＢＤペプチド免疫原構築物。
  45. 前記異種Ｔヘルパーが、配列番号４９～１００からなる群から選択される、請求項４３に記載のＳ１－ＲＢＤペプチド免疫原構築物。
  46. 前記Ｓ１－ＲＢＤ Ｂ細胞エピトープペプチドが、配列番号２３～２４、２６～２７、２９～３４及び３１５～３１９からなる群から選択され、
    前記Ｔｈエピトープが、配列番号４９～１００からなる群から選択される、
    ４３に記載のＳ１－ＲＢＤペプチド免疫原構築物。
  47. 前記ペプチド免疫原構築物が、配列番号１０７～１４４からなる群から選択される、４３に記載のＳ１－ＲＢＤペプチド免疫原構築物。
  48. Ｓ１－ＲＢＤペプチド免疫原構築物であって、
    ａ．配列番号２２６のＳ１－ＲＢＤ配列からの約６～約３５アミノ酸残基を含むＢ細胞エピトープ、
    ｂ．配列番号４９～１００及びその任意の組合せからなる群から選択されるアミノ酸配列を含む異種Ｔヘルパーエピトープ、ならびに
    ｃ．アミノ酸、Ｌｙｓ－、Ｇｌｙ－、Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－、（α、ε－Ｎ）Ｌｙｓ、ε－Ｎ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ（配列番号１０１）、Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－ε－Ｎ－Ｌｙｓ（配列番号１０２）及びＰｒｏ－Ｐｒｏ－Ｘａａ－Ｐｒｏ－Ｘａａ－Ｐｒｏ（配列番号１０３）ならびにその任意の組合せからなる群から選択される、任意選択の異種スペーサー
    を含み、前記Ｂ細胞エピトープが直接、または任意選択の異種スペーサーを介して前記Ｔヘルパーエピトープに共有結合で連結されている、
    前記Ｓ１－ＲＢＤペプチド免疫原構築物。
  49. 前記Ｂ細胞エピトープが、配列番号２３～２４、２６～２７、２９～３４及び３１５～３１９からなる群から選択される、請求項４８に記載のＳ１－ＲＢＤペプチド免疫原構築物。
  50. 前記任意選択の異種スペーサーが、
    （α、ε－Ｎ）Ｌｙｓ、ε－Ｎ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ（配列番号１０１）、Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－ε－Ｎ－Ｌｙｓ（配列番号１０２）、またはＰｒｏ－Ｐｒｏ－Ｘａａ－Ｐｒｏ－Ｘａａ－Ｐｒｏ（配列番号１０３）であり、式中、Ｘａａは任意のアミノ酸である、請求項４８に記載のＳ１－ＲＢＤペプチド免疫原構築物。
  51. 前記Ｔヘルパーエピトープが前記Ｂ細胞エピトープのアミノまたはカルボキシル末端に共有結合で連結されている、請求項４８に記載のＳ１－ＲＢＤペプチド免疫原構築物。
  52. 前記Ｔヘルパーエピトープが前記任意選択の異種スペーサーを介して前記Ｂ細胞エピトープのアミノまたはカルボキシルに共有結合で連結されている、請求項４８に記載のＳ１－ＲＢＤペプチド免疫原構築物。
  53. 請求項４３に記載のＳ１－ＲＢＤペプチド免疫原構築物を含む組成物。
  54. 医薬組成物であって、
    ａ．請求項４３に記載のペプチド免疫原構築物、及び
    ｂ．薬学的に許容される送達ビヒクル及び／またはアジュバント
    を含む、前記医薬組成物。
  55. ａ．前記Ｓ１－ＲＢＤ Ｂ細胞エピトープペプチドが、配列番号２３～２４、２６～２７、２９～３４及び３１５～３１９からなる群から選択され、
    ｂ．前記異種Ｔヘルパーエピトープが、配列番号４９～１００からなる群から選択され、
    ｃ．前記異種スペーサーが、アミノ酸、Ｌｙｓ－、Ｇｌｙ－、Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－、（α、ε－Ｎ）Ｌｙｓ、ε－Ｎ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ（配列番号１０１）、Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－ε－Ｎ－Ｌｙｓ（配列番号１０２）及びＰｒｏ－Ｐｒｏ－Ｘａａ－Ｐｒｏ－Ｘａａ－Ｐｒｏ（配列番号１０３）、ならびにその任意の組合せからなる群から選択され、
    前記Ｓ１－ＲＢＤペプチド免疫原構築物が、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）と混合されて安定化免疫刺激複合体を形成する、
    請求項５４に記載の医薬組成物。
  56. ａ．前記Ｓ１－ＲＢＤペプチド免疫原構築物が、配列番号１０７～１４４からなる群から選択され、
    前記Ｓ１－ＲＢＤペプチド免疫原構築物が、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）と混合されて安定化免疫刺激複合体を形成する、
    請求項５４に記載の医薬組成物。
  57. 前記医薬組成物が、配列番号１３、３９～４１、４４、１６１～１６５またはその任意の組合せの内因性ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｔｈエピトープ配列を含有する別個のペプチドをさらに含有する、請求項５６に記載の医薬組成物。
  58. 前記医薬組成物が、配列番号９～１２、１４～１６、１９、３５～３６、４２～４３、４５～４８、１４５～１６０またはその任意の組合せの内因性ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＣＴＬエピトープ配列を含有する別個のペプチドをさらに含有する、５６に記載の医薬組成物。
  59. 前記医薬組成物が、
    ａ．配列番号１３、３９～４１、４４、１６１～１６５またはその任意の組合せの内因性ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｔｈエピトープ配列を含有する別個のペプチド、及び
    ｂ．配列番号９～１２、１４～１６、１９、３５～３６、４２～４３、４５～４８、１４５～１６０またはその任意の組合せの内因性ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＣＴＬエピトープ配列を含有する別個のペプチド
    をさらに含有する、請求項５６に記載の医薬組成物。
  60. 動物においてＳ１－ＲＢＤに対する抗体を生み出す方法であって、請求項５４に記載の医薬組成物を前記動物に投与することを含む、前記方法。
  61. 動物においてＳ１－ＲＢＤに対する抗体を生み出す方法であって、請求項５７に記載の医薬組成物を前記動物に投与することを含む、前記方法。
  62. 動物においてＳ１－ＲＢＤに対する抗体を生み出す方法であって、請求項５８に記載の医薬組成物を前記動物に投与することを含む、前記方法。
  63. 動物においてＳ１－ＲＢＤに対する抗体を生み出す方法であって、請求項５９に記載の医薬組成物を前記動物に投与することを含む、前記方法。
  64. 配列番号２３～２４、２６～２７、２９～３４または２２６のアミノ酸配列に特異的に結合する、単離された抗体またはそのエピトープ結合性断片。
  65. 前記Ｓ１－ＲＢＤペプチド免疫原構築物に結合している、請求項６４に記載の単離された抗体またはそのエピトープ結合性断片。
  66. 請求項６４に記載の単離された抗体またはそのエピトープ結合性断片を含む、組成物。
  67. 動物におけるＣＯＶＩＤ－１９を予防及び／または治療する方法であって、請求項５４に記載の医薬組成物を前記動物に投与することを含む、前記方法。
  68. 動物におけるＣＯＶＩＤ－１９を予防及び／または治療する方法であって、請求項５７に記載の医薬組成物を前記動物に投与することを含む、前記方法。
  69. 動物におけるＣＯＶＩＤ－１９を予防及び／または治療する方法であって、請求項５８に記載の医薬組成物を前記動物に投与することを含む、前記方法。
  70. 動物におけるＣＯＶＩＤ－１９を予防及び／または治療する方法であって、請求項５９に記載の医薬組成物を前記動物に投与することを含む、前記方法。
  71. 融合タンパク質であって、
    ａ）配列番号２２８及び配列番号２２９からなる群から選択されるヒト受容体ＡＣＥ２の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）（ＥＣＤ－ｈＡＣＥ２）に由来するアミノ酸配列、
    ｂ）配列番号１６６～２２５からなる群から選択されるＩｇＧ分子からの任意選択のヒンジ領域、ならびに
    ｃ）配列番号２３１～２３４からなる群から選択されるＩｇＧ分子のＦｃ断片
    を含み、（ａ）の前記アミノ酸配列が直接、または（ｂ）の前記任意選択のヒンジ領域を介して（ｃ）の前記Ｆｃ断片に共有結合で連結されている、前記融合タンパク質。
  72. （ｃ）の前記Ｆｃ断片が配列番号２３２のアミノ酸配列を有し、前記任意選択のヒンジ領域が配列番号１６６または配列番号１８８のアミノ酸配列を有する、請求項７１に記載の融合タンパク質。
  73. 前記融合タンパク質が、配列番号２３７のＡＣＥ２－ＥＣＤ－ｓＦｃ、配列番号２３８のＡＣＥ２－ＥＣＤＮ－ｓＦｃ、及び配列番号３５６のＡＣＥ２－ＥＣＤ－Ｆｃからなる群から選択される、請求項７１に記載の融合タンパク質。
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