JP2015521592A - 安定化されたｇｐ１２０ - Google Patents

Abstract

本発明は、ＣＤ４結合エピトープとＣＤ４結合部位エピトープの両方を露出する立体配座で安定化されたＨＩＶ ｇｐ１２０ポリペプチドまたは可溶性ｇｐ１４０ポリペプチドを含む単離されたポリペプチドを提供する。本発明は、ＨＩＶによる感染を処置するおよび予防する免疫原性組成物および方法も提供する。一局面において、上記ポリペプチドが、内側ドメインの層の間の層間接触によって安定化されている。別の局面において、上記ポリペプチドが、層１と層２との間の層間接触によって安定化されている。

Description

この特許出願は、２０１２年６月１８日に出願された米国仮特許出願第６１／６６１，０５０号（この完全な内容は、参考として本明細書に援用される）からの優先権を主張する。

本発明は、ＨＩＶの分野、特に、ＨＩＶワクチンの分野におけるものである。

ＨＩＶ／ＡＩＤＳの大流行は、世界中に広がっており、２００７年末までに、６０００万人を超える人々が、ＨＩＶ−１に感染した［１］。大流行と戦うのに標的にされた方策は多数あるが、ＨＩＶ−１に対して利用可能なワクチンはまだない。ヒトの身体は、最初のＨＩＶ−１感染に対して強い免疫応答を起こすが、これらの抗体の多くは、そのウイルスを中和しない［２］。１つの理由は、中和抗体からウイルスを保護する複数のレベルの防御が存在するからである。これらには、高度の配列変異性、炭水化物によるマスキング、多量体形成によるエピトープの閉塞および立体配座的マスキングが含まれる［３］。

高度の変異性にも拘わらず、そのウイルスは、細胞レセプターを認識してそれに結合し得る保存された部位を維持する必要がある。ＨＩＶ−１ ｇｐ１２０におけるこれらの保存されたレセプター結合部位は、ＣＤ４結合部位およびＣＤ４誘導（コレセプター）結合部位を含み、それらは、それぞれＣＤ４結合部位（ＣＤ４−ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ）エピトープおよびＣＤ４結合エピトープ（ＣＤ４−ｂｏｕｎｄ ｅｐｉｔｏｐｅｓ）を含むが、これらの保存されたレセプター結合部位は、抗体が媒介する中和に対する脆弱な標的であるがゆえに、ワクチンを生成するための魅力的な標的である。しかしながら、これらの保存された部位およびこれらの部位におけるエピトープは、立体配座的にマスクされており、ゆえに、中和抗体に接近しにくい。

これまでに、内側ドメインと外側ドメインとの接触を安定化させることによって、ｇｐ１２０の保存された領域を露出する立体配座でそのタンパク質を安定化させる試みが行われてきた。例えば、レセプターが結合した立体配座でｇｐ１２０を安定化させる、構造に誘導された以前の試みでは、ジスルフィド架橋および空洞充填（ｃａｖｉｔｙ ｆｉｌｌｉｎｇ）変異［４］、ならびに安定化の前のＶ１／Ｖ２およびＶ３ループなどの免疫優性領域の除去［５］を含む様々なアプローチが利用された。システイン残基による標的化された置換の後のジスルフィド架橋の形成によって、最も高い程度の安定化が達成された［６および７］。しかしながら、これらのジスルフィド結合は、ｇｐ１２０中のＣＤ４結合エピトープを露出する立体配座でｇｐ１２０の構造を安定化したが、ＣＤ４結合部位抗体の親和性によって測定されたとき、ＣＤ４結合部位エピトープを露出しなかった。このことに加えて、可変ループは、ｇｐ１２０の四次構造の制御に関わるので、可変ループの除去を含むストラテジーも不都合である［８］。

Ｊｏｈａｎｎｅｓ Ｆ．ら、Ｎａｔｕｒｅ（２００９）４５８：６３６〜６４０ Ｋｗｏｎｇ Ｄら、Ｎａｔｕｒｅ（２００２）４２０： ６７８〜６８２ Ｋｗｏｎｇ Ｄら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（２０００）８：１３２９〜１３３９

発明の開示
ＨＩＶ−１ ｇｐ１２０の内側ドメインの構造は、公開されているｇｐ１２０構造から失われている［４、９および１０］。しかしながら、その内側ドメインの層の相互作用は、ＣＤ４リガンドが結合する際にｇｐ１２０において生じる立体配座の変化において重要である。本発明は、ＨＩＶ−１ ｇｐ１２０および可溶性ＨＩＶ−１ ｇｐ１４０の内側ドメインにおける層間相互作用の安定化に関する。

ＨＩＶの構造
ｇｐ１２０の内側ドメインの新しく解明された構造は、ＣＤ４結合状態において、内側ドメインが、β−サンドイッチ構造から標的細胞膜に向かって突き出た層１、２および３からなる３つの層に組織化されることを示す（図１）［１１−１３］。内側ドメインは、ＳＦ１６２株由来のＨＩＶ ｇｐ１２０のアミノ酸１〜２４８および４５８〜４９７に対応するアミノ酸で構成される（配列番号２）。層１は、ＳＦ１６２株由来のＨＩＶ ｇｐ１２０のアミノ酸４２〜７６に対応するアミノ酸で構成される。層２は、ＳＦ１６２株由来のＨＩＶ ｇｐ１２０のアミノ酸９０〜１１７および１９２〜２２３に対応するアミノ酸で構成される。層３は、ＳＦ１６２株由来のＨＩＶ ｇｐ１２０のアミノ酸２３９〜２４９および４５９〜４７０に対応するアミノ酸で構成される。内側ドメインは、ポリペプチドがリガンド非結合（ｕｎ−ｌｉｇａｎｄｅｄ）状態からＣＤ４結合状態に移行する際に広範な立体配座変化を起こすｇｐ１２０の領域として同定された［１４，１５］。ＣＤ４結合時に起こる内側ドメインの立体配座変化は、標的細胞へのＨＩＶウイルスの融合が成功するために必要な下流の２つの事象に寄与する。これらの事象は：
１．最初の弱いＣＤ４接触の安定化、および
２．コレセプター結合のためのｇｐ１２０上への保存された部位の露出、すなわち、ＣＤ４結合エピトープの露出
である。

ＣＤ４結合状態では、ｇｐ１２０の内側ドメインの３つの層は、特定の層間相互作用によって一体となり、ＣＤ４が結合したｇｐ１２０の立体配座を安定化させる。

層１と層２との相互作用は、部位特異的変異誘発によって特定されたいくつかの残基によって媒介される［１１，１２］。これらの層１と層２との相互作用は、内側ドメインの周りに「襟」に似た独特の構造を形成し、その領域を安定化させる［８］。これらの層間相互作用が破壊されると、ＣＤ４が結合したｇｐ１２０の立体配座が不安定になり、ＣＤ４への親和性が低下する［１１］。同様に、内側ドメインの層間相互作用を減少させる変異は、高親和性相互作用のためにＣＤ４が結合したｇｐ１２０の立体配座を必要とするＮＢＤ−５５６などの小分子ＣＤ４模倣物にｇｐ１２０が結合するのも妨げる［１１，１６］。ｇｐ１２０上のＣＤ４誘導型の保存された結合部位を認識する抗体（例えば、１７ｂ、４８ｄおよび４１２ｄ［１７，１８および２７］）の結合も、内側ドメインにおける層間相互作用を妨げる変異によって劇的に減少した［１１］。一般に、層間相互作用が減少すると、保存された結合部位（すなわち、ＣＤ４結合部位およびコレセプター結合部位）の露出が減少し、ゆえに、これらの部位を認識するリガンドの結合が減少する。

上に開示されたアプローチとは対照的に、本発明者らは、内側ドメインにおける層間接触の安定化によって、ｇｐ１２０が、ＣＤ４結合エピトープ（ＣＤ４誘導エピトープまたはＣＤ４ｉエピトープとも称される）とＣＤ４結合部位エピトープの両方が露出された立体配座を取るように誘導されるのを見出した。ゆえに、本発明は：
・ＣＤ４結合エピトープとＣＤ４結合部位エピトープの両方を同時に露出する立体配座で安定化されたＨＩＶ ｇｐ１２０ポリペプチドまたは可溶性ｇｐ１４０ポリペプチドを含む単離されたポリペプチド
・ＨＩＶ ｇｐ１２０のＣＤ４結合エピトープとＣＤ４結合部位エピトープの両方を含む、安定化されたＨＩＶ ｇｐ１２０ポリペプチドまたは可溶性ｇｐ１４０ポリペプチドの免疫原性フラグメント
・３つのサブユニットを含む三量体ポリペプチドであって、各サブユニットは、独立して、ＣＤ４結合エピトープとＣＤ４結合部位エピトープの両方を同時に露出する立体配座で安定化されたＨＩＶ ｇｐ１２０ポリペプチドを含む単離されたポリペプチド、ＣＤ４結合エピトープとＣＤ４結合部位エピトープの両方を同時に露出する立体配座で安定化された可溶性ｇｐ１４０ポリペプチド、ＨＩＶ ｇｐ１２０のＣＤ４結合エピトープとＣＤ４結合部位エピトープの両方を含む安定化されたＨＩＶ ｇｐ１２０ポリペプチドの免疫原性フラグメント、およびＨＩＶ ｇｐ１２０のＣＤ４結合エピトープとＣＤ４結合部位エピトープの両方を含む可溶性ｇｐ１４０ポリペプチドからなる群より選択される、三量体ポリペプチド
・上に列挙されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
・本発明のポリペプチド、免疫原性フラグメント、融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドを含む免疫原性組成物
・被験体において免疫応答を発生させる方法
・ＨＩＶ感染を処置するかまたは予防する方法
を提供する。

安定化されたＨＩＶ ｇｐ１２０および可溶性ｇｐ１４０ポリペプチド
本発明は、ＣＤ４結合エピトープとＣＤ４結合部位エピトープの両方を同時に露出する立体配座で安定化されたＨＩＶ ｇｐ１２０または可溶性ｇｐ１４０ポリペプチドを含む単離されたポリペプチドを提供する。「ＣＤ４結合エピトープとＣＤ４結合部位エピトープの両方を同時に露出する立体配座で安定化された」とは、ＨＩＶ ｇｐ１２０または可溶性ｇｐ１４０ポリペプチドの内側ドメインが、ＣＤ４リガンドの非存在下でさえもＣＤ４が結合した立体配座を取ることを意味する。したがって、野生型ｇｐ１２０または可溶性ｇｐ１４０ではＣＤ４に結合したときだけ露出される立体配座的にマスクされたエピトープは、本発明の安定化されたｇｐ１２０または可溶性ｇｐ１４０ポリペプチドでは恒常的に露出される。さらに、本発明の安定化されたｇｐ１２０または可溶性ｇｐ１４０ポリペプチドは、ＣＤ４の非存在下においてＣＤ４が結合した立体配座を取るので、ＣＤ４結合エピトープと同時に、ＣＤ４結合部位エピトープも露出され得る。

本発明に係るＣＤ４結合エピトープとＣＤ４結合部位エピトープの両方を同時に露出する立体配座で安定化されたＨＩＶ ｇｐ１２０または可溶性ｇｐ１４０ポリペプチドを含む単離されたポリペプチドは、
（ｉ）抗ｇｐ１２０ ＣＤ４結合部位抗体、すなわち、ｇｐ１２０におけるＣＤ４結合部位に特異的な抗体、
（ｉｉ）ｇｐ１２０におけるＣＤ４誘導型の保存された結合部位に特異的な抗体、および
（ｉｉｉ）必要に応じて、さらなる抗ｇｐ１２０抗体または抗可溶性ｇｐ１４０抗体
に特異的に結合するポリペプチドである。

「特異的に結合する」とは、抗体が、ＢＳＡへの親和性よりも実質的に高い親和性で本発明のポリペプチドに結合することを意味する。好ましくは、その親和性は、ＢＳＡよりも本発明のポリペプチドに対して少なくとも１００倍、１０^３倍、１０^４倍、１０^５倍、１０^６倍などだけ高い。

代表的な抗ｇｐ１２０抗体は、当該分野で周知であり、それらとしては、例えば、Ｂ１２［１９］、Ｆ１０５［２０］、１７ｂ［１７］、４８ｄ［２７］、４１２ｄ［２１］、Ｂ１３［２２］および２Ｇ１２［２３］、ならびにＡＴＣＣから入手可能な、抗体４６−２（ＣＲＬ−２１８６）、４６−４（ＣＲＬ−２１７８）、４６−５（ＣＲＬ−２１８４）、５５−２（ＣＲＬ−２１５５）、５５−３６（ＣＲＬ−２１５３）、５５−６（ＣＲＬ−２１８５）および５５−８３（ＣＲＬ−２３９５）が挙げられる。抗ｇｐ１２０ ＣＤ４結合部位（α−ｇｐ１２０−ＣＤ４ＢＳ）抗体としては、モノクローナル抗体Ｂ１２、Ｆ１０５、ＪＬ４１３［２４］、１７９５［２５］、４４８−Ｄ（ＡＴＣＣ ＨＢ−１０８９５）、５５８−Ｄ（ＡＴＣＣ ＨＢ−１０８９４）および５５９／６４−Ｄ（ＡＴＣＣ ＨＢ−１０８９３）［２６］が挙げられる。ｇｐ１２０におけるＣＤ４誘導型の保存された結合部位に特異的な抗体（α−ｇｐ１２０ ＣＤ４ｉ）としては、参考文献２７に記載されている１７ｂ、４８ｄ、４１２ｄおよび２３ｅ（２．３Ｅ）が挙げられる。これらのα−ｇｐ１２０ ＣＤ４ｉ抗体は、ＮＩＨ ＡＩＤＳ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＆ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｐｒｏｇｒａｍｍｅ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ａｉｄｓｒｅａｇｅｎｔ．ｏｒｇ／）から入手できる。これらの抗体の配列は、公開されており［２８］、ヌクレオチド（ｎｕｃｌｅｉｔｉｄｅ）配列は、ＩＧＢＬＡＳＴ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｇｂｌａｓｔ／）またはＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ情報システム（ＩＭＧＴ）（ｈｔｔｐ：／／ｉｍｇｔ．ｃｉｎｅｓ．ｆｒ／）データベースにおいて入手可能である。

１つの実施形態において、ｇｐ１２０ポリペプチドまたは可溶性ｇｐ１４０ポリペプチドは、内側ドメインの層の間の１つ以上の層間接触によって安定化される。特定の実施形態において、安定化接触は、天然にコードされないシステイン残基対の間のジスルフィド結合によってもたらされる。

安定化接触は、層１と層２、層２と層３、または層１と層２および層２と層３の両方の間で生じ得る。

ジスルフィド架橋が２つのシステイン残基間に形成されるために、側鎖は、互いに対して正しい距離かつ正しい向きで存在しなければならない。内側ドメインの層１、２および３の界面に存在するすべての残基を調査することにより、ジスルフィド形成のための対になったシステイン残基による置換の標的になり得る残基が同定された。適切な残基の同定は、ｇｐ１２０の結晶構造に基づいた［１３］。残基対が、３．９Å〜５．８ÅのＣβ−Ｃβの距離を有すると予測された場合に、それらを好適と考えた。

これに基づいて、以下の残基対が、層間の安定化ジスルフィド架橋を形成するシステインによる置換のために特定された：Ｖ５９とＳ１０９、Ｖ９５とＷ４６５、Ｖ９５とＲ４６２、Ｖ９５とＬ４６９および／またはＨ９９とＲ４６２（残基のナンバリングはＳＦ１６２株に従う）。ＳＦ１６２株由来のｇｐ１２０ポリペプチドにおける上に列挙されたアミノ酸対と等価な他のＨＩＶ−１株由来のｇｐ１２０におけるアミノ酸の位置は、例えば、第２の株由来のｇｐ１２０ポリペプチド配列をＳＦ１６２のｇｐ１２０ポリペプチド配列とアラインメントすることによって、特定され得る。図５は、ＨＩＶ−１のＳＦ１６２株およびＨｘｂ２株由来のｇｐ１２０のアラインメントを示している。Ｈｘｂ２のｇｐ１２０における対応する残基は、灰色のナンバリングで特定される。安定化ジスルフィド架橋を形成するシステインによる置換のための対応する残基対は、Ｈｘｂ２では、Ｖ６５とＳ１１５、Ｖ１０１とＷ４７９、Ｖ１０１とＲ４７６、Ｖ１０１とＬ４８３およびＨ１０５とＲ４７６である。

同様に、可溶性ｇｐ１４０ポリペプチドにおける対応する残基は、ｇｐ１２０ポリペプチド配列をｇｐ１４０配列とアラインメントすることによって特定され得る。ＳＦ１６２可溶性ｇｐ１４０アミノ酸配列は、配列番号２３に与えられている。

したがって、本発明は、ＣＤ４結合エピトープとＣＤ４結合部位エピトープの両方を同時に露出する立体配座で安定化されたＨＩＶ ｇｐ１２０ポリペプチドまたは可溶性ｇｐ１４０ポリペプチドを含む単離されたポリペプチドを提供し、ここで、その安定化は、内側ドメインにおける層間ジスルフィド結合によって達成され、そのジスルフィド結合は、野生型ＳＦ１６２ ＨＩＶ ｇｐ１２０ポリペプチドにおける以下の対のうちの１つ以上と等価な位置のシステイン残基によって形成される：Ｖ５９とＳ１０９、Ｖ９５とＷ４６５、Ｖ９５とＲ４６２、Ｖ９５とＬ４６９および／またはＨ９９とＲ４６２。

特定の実施形態において、安定化されたＨＩＶ ｇｐ１２０ポリペプチドまたは可溶性ｇｐ１４０ポリペプチドは、配列番号２に示されるような内側ドメイン配列と少なくともａ％同一のアミノ酸配列を有する内側ドメインを含み（ここで、ａは、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超えるものから選択される値である）、そして１つ以上の天然に存在しないシステイン残基対を、配列番号２におけるＶ５９とＳ１０９、Ｖ９５とＷ４６５、Ｖ９５とＲ４６２、Ｖ９５とＬ４６９および／またはＨ９９とＲ４６２の位置と等価な位置に含む。

さらなる実施形態において、安定化されたＨＩＶ ｇｐ１２０ポリペプチドまたは可溶性ｇｐ１４０ポリペプチドは、配列番号２に示されるような配列に対して少なくともｂ％の同一性を有するアミノ酸配列を含み（ここで、ｂは、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％もしくは９９．９％またはそれを超えるものから選択される値である）、１つ以上の天然に存在しないシステイン残基対を、配列番号２におけるＶ５９とＳ１０９、Ｖ９５とＷ４６５、Ｖ９５とＲ４６２、Ｖ９５とＬ４６９および／またはＨ９９とＲ４６２の位置と等価な位置に含む。

さらなる実施形態において、安定化されたＨＩＶ ｇｐ１２０ポリペプチドは、配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０または２２に示されるようなアミノ酸配列を含む。

本発明の安定化されたＨＩＶ ｇｐ１２０ポリペプチドまたは可溶性ｇｐ１４０ポリペプチドは、当該分野で公知のさらなるドメイン間および層間の安定化も含み得る。例えば、本発明の安定化されたＨＩＶ ｇｐ１２０ポリペプチドは、参考文献４に記載されているような空洞充填変異または参考文献６および７に記載されているようなジスルフィド結合を含み得る。特に、本発明の安定化されたＨＩＶ ｇｐ１２０ポリペプチドは、配列番号２におけるＷ９０とＥ２６８、Ｉ１０３とＱ４１３に対応する位置における１つ以上の天然にコードされないシステイン対間のジスルフィド結合によってさらに安定化され得る。

本発明は、本発明のポリペプチドの免疫原性フラグメントも提供し、ここで、その免疫原性フラグメントは、ＨＩＶ ｇｐ１２０のＣＤ４結合エピトープとＣＤ４結合部位エピトープの両方を含み、それらを同時に露出する。それらの免疫原性フラグメントは、少なくとも３００、３５０、４００、４５０、４７５、４８０、４８５、４９０、４９５または４９７アミノ酸長であり得る。特定の実施形態において、それらの免疫原性フラグメントは、野生型ＳＦ１６２ ＨＩＶ ｇｐ１２０ポリペプチドにおける以下の対のうちの１つ以上と等価な位置にシステイン残基を含む：Ｖ５９とＳ１０９、Ｖ９５とＷ４６５、Ｖ９５とＲ４６２、Ｖ９５とＬ４６９および／またはＨ９９とＲ４６２。

本発明のポリペプチドは、配列番号２または配列番号２３と比較されるとき、１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個など）の保存的アミノ酸置換を含み得、ならびに以下の対のうちの１つ以上にシステイン残基を含み得る：Ｖ５９とＳ１０９、Ｖ９５とＷ４６５、Ｖ９５とＲ４６２、Ｖ９５とＬ４６９、Ｈ９９とＲ４６２。本発明のポリペプチドは、配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０または２２と比較されるとき、１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個など）の保存的アミノ酸置換を含み得る。保存的アミノ酸置換とは、そのアミノ酸置換が、ｇｐ１２０ポリペプチドの安定化を低下させない条件、すなわち、そのポリペプチドがなおも、ＣＤ４結合エピトープとＣＤ４結合部位エピトープの両方を同時に露出する立体配座で安定化されている条件で、１つのアミノ酸が、関連する側鎖を有する別のアミノ酸に置き換えられることとして定義される。遺伝的にコードされるアミノ酸は、通常、４つのファミリーに分けられる：（１）酸性、すなわち、アスパラギン酸、グルタミン酸；（２）塩基性、すなわち、リジン、アルギニン、ヒスチジン；（３）非極性、すなわち、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン；および（４）非荷電極性、すなわち、グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、トレオニン、チロシン。フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンは、時折、芳香族アミノ酸として一緒に分類される。通常、これらのファミリー内の単一アミノ酸の置換は、生物学的活性に大きな影響を及ぼさない。さらに、本ポリペプチドは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２または２３に対して、１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個など）の単一アミノ酸欠失を有し得る。さらに、本ポリペプチドは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２または２３に対して、１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個など）の挿入（例えば、各１、２、３、４または５アミノ酸）を含み得る。ジスルフィド結合によって安定化される実施形態において、欠失、挿入および置換は、そのジスルフィド結合を干渉しない任意の位置に存在し得る。

本発明のポリペプチドは、多くの方法、例えば、化学合成（全体的または部分的）、プロテアーゼを使用してより長いポリペプチドを消化すること、ＲＮＡからの翻訳、細胞培養物（例えば、組換え発現）からの精製、生物自体から（例えば、細菌培養後に、または患者から直接）などによって、調製され得る。＜４０アミノ酸長のペプチドを生成するための好ましい方法は、インビトロ化学合成を含む［２９，３０］。ｔＢｏｃまたはＦｍｏｃ［３１］化学に基づく方法などの固相ペプチド合成が、特に好ましい。酵素的合成［３２］もまた、部分的にまたは全体において使用され得る。化学合成に対する代替法として、生物学的合成を使用してもよく、例えば、ポリペプチドは、翻訳によって生成されてもよい。これは、インビトロまたはインビボで行われ得る。生物学的方法は、通常、Ｌ−アミノ酸に基づくポリペプチドの生成に限定されるが、翻訳機構（例えば、アミノアシルｔＲＮＡ分子）の操作を用いることにより、Ｄ−アミノ酸（または他の非天然アミノ酸、例えば、ヨードチロシンまたはメチルフェニルアラニン、アジドホモアラニンなど）の導入が可能になり得る［３３］。しかしながら、Ｄ−アミノ酸が含められる場合、化学合成を使用することが好ましい。本発明のポリペプチドは、Ｃ末端および／またはＮ末端に共有結合修飾を有し得る。

本発明のポリペプチドは、好ましくは、精製されたまたは実質的に精製された形態、すなわち、他のポリペプチドを実質的に含まない（例えば、天然に存在するポリペプチドを含まない）形態、特に、他のＨＩＶまたは宿主細胞のポリペプチドを含まない形態で提供され、概して、少なくとも約５０（重量）％純粋、通常、少なくとも約９０％純粋であり、すなわち、組成物の約５０％未満、より好ましくは、約１０％未満（例えば、５％以下）が、他の発現されたポリペプチドで構成される。

本発明のポリペプチドは、固体支持体に付着され得る。本発明のポリペプチドは、検出可能な標識（例えば、放射性標識もしくは蛍光標識、またはビオチン標識）を含み得る。

用語「ポリペプチド」とは、任意の長さのアミノ酸ポリマーのことを指し、他の修飾およびバリアントの中でも糖タンパク質を含む。ＨＩＶ ｇｐ１２０およびまたは可溶性ｇｐ１４０は、糖タンパク質であり、本発明のポリペプチドは、好ましくは、グリコシル化される。アミノ酸ポリマーは、直鎖状または分枝状であり得、改変されたアミノ酸を含み得、そして非アミノ酸によって中断され得る。これらの用語は、天然に、または介入；例えば、ジスルフィド結合の形成、さらなるグリコシル化、部分的もしくは完全な脱グリコシル化（ｄｅｃｙｌｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）、脂質化、アセチル化、リン酸化、または他の任意の操作もしくは修飾（例えば、標識成分との結合体化）によって、改変されたアミノ酸ポリマーも含む。例えば、アミノ酸の１つ以上のアナログ（例えば、非天然アミノ酸などを含む）ならびに当該分野で公知の他の修飾を含むポリペプチドもまた、その定義内に含まれる。ポリペプチドは、一本鎖または会合鎖として存在し得る。本発明のポリペプチドは、天然にまたは非天然にグリコシル化され得る（すなわち、本ポリペプチドは、対応する天然に存在するポリペプチドに見られるグリコシル化パターンとは異なるグリコシル化パターンを有する）。本発明のポリペプチドは、単離され得るか、または精製され得る。

本発明は、配列−Ｘ−Ｙ−または−Ｙ−Ｘ−（ここで、−Ｘ−は、上で定義されたようなアミノ酸配列、すなわち、本発明のポリペプチドであり、−Ｙ−は、上で定義されたような配列ではない）を含むポリペプチドを提供し、すなわち、本発明は、融合タンパク質を提供する。１つの特定の実施形態において、−Ｙ−は、インフルエンザヘマグルチニン（ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｈｅｍａｇｌｕｔａｎｉｎ）ポリペプチド、または本発明のポリペプチドの機能を助ける任意の好適なタンパク質もしくは生物学的分子である。

本発明は、多量体の形態の本発明のポリペプチドも提供する。特に、本発明は、３つのサブユニットで構成される三量体を提供し、ここで、各サブユニットは、本発明に係るポリペプチド、融合タンパク質または免疫原性フラグメントである。１つの実施形態において、その三量体は、少なくとも２つの同一のサブユニットを含む。１つの特定の実施形態において、３つすべてのサブユニットが、同一である。代替の実施形態において、３つすべてのサブユニットが、異なる。

本発明は、本発明のポリペプチドを生成するためのプロセスを提供し、そのプロセスは、ポリペプチド発現を誘導する条件下で本発明の宿主細胞を培養する工程を含む。

本発明は、本発明のポリペプチドを生成するためのプロセスを提供し、ここで、そのポリペプチドは、化学的手段を用いて、部分的または全体的に合成される。

核酸
本発明は、本発明のポリペプチドをコードする核酸も提供する。本発明は、本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。そのような核酸は、同じアミノ酸をコードするために代替のコドンを使用するものを含む。

本発明は、これらの核酸にハイブリダイズし得る核酸も提供する。ハイブリダイゼーション反応は、異なる「ストリンジェンシー」の条件下で行われ得る。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーを高める条件は、広く公知であり、当該分野において公開されている。関連性のある条件の例としては、（ストリンジェンシーを高める順に）：２５℃、３７℃、５０℃、５５℃および６８℃のインキュベーション温度；１０×ＳＳＣ、６×ＳＳＣ、１×ＳＳＣ、０．１×ＳＳＣの緩衝液濃度（ここで、ＳＳＣは、０．１５Ｍ ＮａＣｌおよび１５ｍＭクエン酸緩衝液である）および他の緩衝液系を使用するそれらの等価物；０％、２５％、５０％および７５％のホルムアミド濃度；５分から２４時間までのインキュベーション時間；１回、２回またはそれより多い洗浄工程；１、２または１５分の洗浄インキュベーション時間；および６×ＳＳＣ、１×ＳＳＣ、０．１×ＳＳＣまたは脱イオン水の洗浄溶液が挙げられる。ハイブリダイゼーションの手法およびそれらの最適化は、当該分野で周知である［例えば、参考文献３４を参照のこと］。

本発明は、これらの配列に相補的な配列を含む核酸を含む（例えば、アンチセンス用もしくはプロービング用、またはプライマーとして使用するため）。

本発明に係る核酸は、様々な形態（例えば、一本鎖、二本鎖、ベクター、プライマー、プローブ、標識された形態など）を取り得る。本発明の核酸は、環状または分枝状であり得るが、一般に直鎖状であり得る。別段特定されないかまたは要求されない限り、核酸を利用する本発明の任意の実施形態は、二本鎖の形態と、二本鎖の形態を構成する２本の相補的な一本鎖の形態の各々との両方を利用し得る。プライマーおよびプローブは、一般に一本鎖であり、アンチセンス核酸も同様である。

本発明の核酸は、好ましくは、精製されたまたは実質的に精製された形態、すなわち、他の核酸を実質的に含まない（例えば、天然に存在する核酸を含まない）形態、特に、他の肺炎球菌または宿主細胞の核酸を含まない形態で提供され、概して、少なくとも約５０（重量）％純粋、通常、少なくとも約９０％純粋である。本発明の核酸は、好ましくは、肺炎球菌の核酸である。

本発明の核酸は、多くの方法、例えば、全体的または部分的な化学合成（例えば、ＤＮＡのホスホルアミダイト合成）、ヌクレアーゼ（例えば、制限酵素）を使用してより長い核酸を消化すること、ゲノムライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリー由来のより短い核酸またはヌクレオチドを（例えば、リガーゼまたはポリメラーゼを使用して）結合することなどによって、調製され得る。

本発明の核酸は、固体支持体（例えば、ビーズ、プレート、フィルター、フィルム、スライド、マイクロアレイ支持体、樹脂など）に付着され得る。本発明の核酸は、例えば、放射性標識もしくは蛍光標識またはビオチン標識で標識され得る。これは、その核酸が、検出技法において使用される場合、例えば、その核酸が、プライマーまたはプローブである場合に、特に有用である。

用語「核酸」は、一般的な意味において、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチドおよび／またはそれらのアナログを含む、任意の長さの多量体の形態のヌクレオチドを含む。それには、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドが含まれる。それには、ＤＮＡまたはＲＮＡアナログ（例えば、改変された骨格（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）またはホスホロチオエート）または改変された塩基を含むもの）も含まれる。したがって、本発明は、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、リボザイム、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、組換え核酸、分枝状の核酸、プラスミド、ベクター、プローブ、プライマーなどを含む。本発明の核酸が、ＲＮＡの形態を取る場合、それは、５’キャップを有してもよいし、有しなくてもよい。

本発明の核酸は、ベクターの一部、すなわち、１つ以上の細胞型の形質導入／トランスフェクションのためにデザインされた核酸構築物の一部であり得る。ベクターは、例えば、挿入されたヌクレオチドの単離、増殖および複製のためにデザインされた「クローニングベクター」、宿主細胞においてヌクレオチド配列を発現させるためにデザインされた「発現ベクター」、組換えウイルスもしくはウイルス様粒子を生成させるためにデザインされた「ウイルスベクター」、または２つ以上のタイプのベクターの特質を備える「シャトルベクター」であり得る。好ましいベクターは、プラスミドである。「宿主細胞」は、外因性核酸のレシピエントであり得るか、または外因性核酸のレシピエントである、個々の細胞または細胞培養物を含む。宿主細胞は、単一の宿主細胞の子孫を含むが、その子孫は、天然の、偶然のまたは故意の変異および／または変更に起因して、元の親細胞と必ずしも完全に同一でない可能性がある（形態学的に、または全体のＤＮＡ含量（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）において）。宿主細胞は、インビボまたはインビトロにおいて本発明の核酸でトランスフェクトされたまたは感染された細胞を含む。

核酸がＤＮＡである場合、ＲＮＡ配列中の「Ｕ」は、そのＤＮＡでは「Ｔ」によって置き換えられることが理解されるだろう。同様に、核酸がＲＮＡである場合、ＤＮＡ配列中の「Ｔ」は、そのＲＮＡでは「Ｕ」によって置き換えられることが理解されるだろう。

用語「相補体」または「相補的な」は、核酸に関して使用されるとき、ワトソン−クリック塩基対のことを指す。したがって、Ｃの相補体は、Ｇであり、Ｇの相補体は、Ｃであり、Ａの相補体は、Ｔ（またはＵ）であり、Ｔ（またはＵ）の相補体は、Ａである。例えば、ピリミジン（ＣまたはＴ）の相補するために、Ｉ（プリンイノシン）などの塩基を使用することも可能である。

本発明の核酸は、例えば、インビトロもしくはインビボでポリペプチドを生成するため；生物学的サンプル中の核酸を検出するためのハイブリダイゼーションプローブとして；核酸のさらなるコピーを生成するため；リボザイムもしくはアンチセンスオリゴヌクレオチドを生成するため；一本鎖ＤＮＡプライマーもしくはプローブとして；または三重鎖を形成するオリゴヌクレオチドとして、使用され得る。

本発明は、本発明の核酸を生成するためのプロセスを提供し、ここで、その核酸は、化学的手段を用いて、部分的または全体的に合成される。

本発明は、本発明のヌクレオチド配列を含むベクター（例えば、クローニングベクターまたは発現ベクター）およびそのようなベクターで形質転換された宿主細胞を提供する。

免疫原性組成物
本発明は、免疫原性組成物も提供する。本発明の免疫原性組成物は、本発明のポリペプチド、その免疫原性フラグメント、本発明の融合タンパク質、本発明の三量体ポリペプチド、本発明のポリヌクレオチドおよび／またはそれらの組み合わせを含み、それらは、本明細書中で抗原と称され得る。そのような免疫原性組成物は、ワクチンとして有用であり得る。これらのワクチンは、予防的（すなわち、感染を予防する）または治療的（すなわち、感染を処置する）であり得るが、代表的には、予防的であり得る。

代表的には、免疫原性組成物は、それらを薬学的に許容され得るようにするために、さらなる成分を含む。免疫原性組成物は、通常、抗原のほかに成分を含み、例えば、代表的には、１つ以上の薬学的キャリアおよび／または賦形剤を含む。そのような成分の詳細な考察は、参考文献３５において入手可能である。

免疫原性組成物は、一般に、水性の形態で哺乳動物に投与される。しかしながら、その組成物は、投与前は非水性の形態で存在してもよい。例えば、いくつかのワクチンは、水性の形態で製造され、次いで、水性の形態で充填され、配布され、投与されるが、他のワクチンは、製造中に凍結乾燥され、使用時に水性の形態に再構成される。したがって、本発明の組成物は、凍結乾燥された製剤のように乾燥されていてもよい。

免疫原性組成物は、チオメルサールまたは２−フェノキシエタノールなどの保存剤を含み得る。しかしながら、ワクチンは、水銀材料を実質的に含むべきでなく（すなわち、５μｇ／ｍｌ未満）、例えば、チオメルサール非含有であることが好ましい。水銀を含まないワクチンが、より好ましい。保存剤を含まないワクチンが、特に好ましい。

張度を制御するために、ナトリウム塩などの生理学的な塩を含むことが好ましい。塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）が好ましく、それは、１〜２０ｍｇ／ｍｌ、例えば、約１０±２ｍｇ／ｍｌ ＮａＣｌで存在し得る。存在してもよい他の塩としては、塩化カリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸二ナトリウム二水和物（ｄｅｈｙｄｒａｔｅ）、塩化マグネシウム、塩化カルシウムなどが挙げられる。

免疫原性組成物は、一般に、２００ｍＯｓｍ／ｋｇ〜４００ｍＯｓｍ／ｋｇ、好ましくは、２４０〜３６０ｍＯｓｍ／ｋｇの質量オスモル濃度を有し得、より好ましくは、２９０〜３１０ｍＯｓｍ／ｋｇの範囲に入り得る。

免疫原性組成物は、１つ以上の緩衝液を含み得る。代表的な緩衝液としては：リン酸緩衝液；Ｔｒｉｓ緩衝液；ホウ酸緩衝液；コハク酸緩衝液；ヒスチジン緩衝液（特に、水酸化アルミニウムアジュバントとともに）；またはクエン酸緩衝液が挙げられる。緩衝液は、代表的には、５〜２０ｍＭの範囲内で含められ得る。

組成物のｐＨは、一般に、５．０〜８．１、より代表的には、６．０〜８．０、例えば、６．５〜７．５または７．０〜７．８であり得る。

本組成物は、好ましくは、無菌である。本組成物は、好ましくは、非発熱性であり、例えば、１用量あたり＜１ＥＵ（標準的な尺度であるエンドトキシン単位）、好ましくは、１用量あたり＜０．１ＥＵを含む。本組成物は、好ましくは、グルテンを含まない。

本組成物は、単回の免疫化のための材料を含み得るか、または複数回の免疫化のための材料を含み得る（すなわち、「複数回用量（ｍｕｌｔｉｄｏｓｅ）」キット）。複数回用量の構成において、保存剤を含むことが好ましい。複数回用量の免疫原性組成物に保存剤を含めることの代替法として（またはそれに加えて）、その免疫原性組成物は、材料を取り出すための無菌のアダプターを有する容器に含められ得る。

本発明の免疫原性組成物は、１つ以上の免疫調節剤（ｉｍｍｕｎｏｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ａｇｅｎｔｓ）も含み得る。好ましくは、免疫調節剤の１つ以上は、１つ以上のアジュバント、例えば、２、３、４種またはそれより多くのアジュバント、例えば、参考文献３６および３７に開示されているようなアジュバント（例えば、１種以上のアルミニウム塩を含むかまたはサブミクロン水中油型エマルジョンを含むアジュバント）を含む。

免疫原性組成物は、注入可能医薬品として、液体の溶液または懸濁物のいずれかとして、調製され得る。注射前に液体ビヒクルに溶解されるまたは懸濁されるのに適した固体の形態もまた、調製され得る（例えば、凍結乾燥された組成物または噴霧凍結乾燥された組成物）。免疫原性組成物は、経口投与用に、例えば、錠剤もしくはカプセル剤、スプレーまたはシロップ剤（必要に応じて風味づけられたもの）として、調製され得る。免疫原性組成物は、鼻または眼への投与のために、例えば、滴剤として、調製され得る。免疫原性組成物は、組み合わされた組成物が、患者に投与する直前に再構成されるようにデザインされたキットの形態であり得る。そのようなキットは、液体の形態の１つ以上の抗原および１つ以上の凍結乾燥された抗原を含み得る。

組成物が、使用前に即席で調製され（例えば、ある成分が凍結乾燥された形態で提供される場合）、かつキットとして提供される場合、そのキットは、２本のバイアルを備え得るか、または１本の充填済みの注射器および１本のバイアルを備え得、ここで、その注射器の内容物は、注射の前にバイアルの内容物を再活性化させるために使用される。

ワクチンとして使用される免疫原性組成物は、免疫学的に有効な量の抗原、ならびに必要に応じ、他の任意の成分を含む。「免疫学的に有効な量」とは、個体に単回用量または一連の用量の一部としてその量を投与することが、処置または予防にとって有効であることを意味する。この量は、処置される個体の健康状態および身体的状態、処置される個体の年齢、分類群（例えば、非ヒト霊長類、霊長類など）、その個体の免疫系が抗体を合成する能力、所望の防御の程度、ワクチンの製剤、処置している医師によるその医学的状況の評価、ならびに他の関連する要因に応じて変動する。その量は、慣例的な治験によって決定され得る比較的広い範囲内に入ることが予想される。

処置方法
本発明の単離されたポリペプチド、その免疫原性フラグメント、本発明の融合タンパク質、本発明の三量体ポリペプチド、本発明のポリヌクレオチド、本発明の免疫原性組成物および／またはそれらの組み合わせは、被験体において免疫応答を発生させる方法、ならびに被験体におけるＨＩＶによる感染および／またはＡＩＤＳを処置するおよび予防する方法において使用され得る。好ましい実施形態において、被験体は、ヒトである。

被験体において免疫応答を発生させるための方法は、本発明の単離されたポリペプチド、その免疫原性フラグメント、本発明の融合タンパク質、本発明の三量体ポリペプチド、本発明のポリヌクレオチド、本発明の免疫原性組成物および／またはそれらの組み合わせをその被験体に投与する工程を含む。

本発明の方法および使用によって生じる免疫応答は、通常、抗体応答、好ましくは、防御抗体応答を含む。ＨＩＶワクチン接種の後の抗体応答、中和能力および防御を評価するための方法は、当該分野で周知であり、例えば、参考文献３８、３９、４０、４１および４２に記載されているとおりである。

本発明は、被験体におけるＨＩＶによる感染および／またはＡＩＤＳを処置するかまたは予防する方法も提供し、その方法は、本発明の単離されたポリペプチド、その免疫原性フラグメント、本発明の融合タンパク質、本発明の三量体ポリペプチド、本発明のポリヌクレオチド、本発明の免疫原性組成物および／またはそれらの組み合わせをその被験体に投与する工程を含む。

本発明の免疫原性組成物は、様々な方法で投与され得る。最も好ましい免疫化の経路は、筋肉内注射（例えば、腕または脚への）であるが、他の利用可能な経路としては、皮下注射、鼻腔内［４３−４５］、皮内［４６，４７］、経口［４８］、経皮的（ｔｒａｎｓｃｕｔａｎｅｏｕｓ）、経皮的（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）［４９］などが挙げられる。皮内および鼻腔内経路が、魅力的である。皮内投与は、例えば、約１．５ｍｍ長の針を備えた、マイクロインジェクションデバイスを必要とし得る。

処置は、単回投与スケジュールまたは複数回用量スケジュールによって行われ得る。複数回用量は、一次免疫スケジュールおよび／または追加免疫スケジュールにおいて使用され得る。複数回用量スケジュールでは、様々な用量が、例えば、非経口初回刺激（ｐｒｉｍｅ）および粘膜追加免疫（ｂｏｏｓｔ）、粘膜初回刺激および非経口追加免疫など、同じ経路または異なる経路によって与えられ得る。１回より多い用量（代表的には、２用量）の投与が、免疫学的にナイーブな患者、例えば、以前にＨＩＶワクチンを受容したことがない人々において、特に有用である。複数回用量は、代表的には、少なくとも１週間空けて（例えば、約２週間、約３週間、約４週間、約６週間、約８週間、約１２週間、約１６週間など）投与される。

本発明の免疫原性組成物は、抗レトロウイルス化合物、特に、ＨＩＶに対して活性な抗レトロウイルス化合物と実質的に同時に（例えば、同じ診察時または医療専門家への訪問時に）患者に投与され得る。

一般
用語「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、「〜を含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」ならびに「〜からなる」を包含し、例えば、Ｘ「を含む」組成物は、もっぱらＸからなり得るか、またはさらなる何かを含み得る（例えば、Ｘ＋Ｙ）。

単語「実質的に」は、「完全に」を排除せず、例えば、Ｙを「実質的に含まない」組成物は、Ｙを完全に含まない可能性がある。必要であれば、単語「実質的に」は、本発明の定義から省略され得る。

数値ｘに関する用語「約」は、任意選択であり、例えば、ｘ±１０％を意味する。

ポリペプチド配列間の同一性は、好ましくは、ＭＰＳＲＣＨプログラム（Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ）に実装されているようなＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムによって、ギャップオープンペナルティ＝１２およびギャップ伸長ペナルティ＝１というパラメータでアフィンギャップ検索を使用して、決定される。

図１ Ａ：ＨＸＢｃ２株由来のＨＩＶ ｇｐ１２０の内側ドメインの構造およびその層１、２および３への組織化。Ｂ：関連する層およびドメインを示している、ＳＦ１６２株由来のＨＩＶ−１ ｇｐ１２０の配列（配列番号２）。内側ドメインは、黒色の文字であり、外側ドメインは、灰色の文字である。層１に寄与するアミノ酸には、一重下線が引かれており、層２に寄与するアミノ酸には、二重下線が引かれており、層３に寄与するアミノ酸には、破線の下線が引かれている。 図２ システイン置換されたｇｐ１２０構造と天然のｇｐ１２０構造との比較。 図３ ＨＸＢｃ２株由来のｇｐ１２０構造に基づく層１および２のジスルフィド架橋のための標的。 図４ ＨＸＢｃ２株由来のｇｐ１２０構造に基づく層２および３のジスルフィド架橋のための標的。 図５ Ｈｘｂ２−ｇｐ１２０（ここから構造情報を得た）およびＳＦ１６２（参照配列）のアラインメントで示されるシステイン置換の部位。システイン置換およびジスルフィド架橋のために標的にされる部位を、配列番号とともに四角の中に示す。 図６ 哺乳動物細胞における野生型ｇｐ１２０およびシステイン置換ｇｐ１２０の発現の比較。ＳＦ１６２ ｇｐ１２０をコードする野生型、単一変異および二重変異プラスミドを２９３Ｔ細胞にトランスフェクトし、４８時間培養した後、細胞を回収し、溶解した。等量の細胞溶解産物を還元または非還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥで泳動し、その溶解産物中のＨＩＶ−ｇｐ１２０を、抗ｇｐ１２０抗体（２Ｇ１２）を用いるウエスタンブロッティングによって検出した。 図６ 哺乳動物細胞における野生型ｇｐ１２０およびシステイン置換ｇｐ１２０の発現の比較。ＳＦ１６２ ｇｐ１２０をコードする野生型、単一変異および二重変異プラスミドを２９３Ｔ細胞にトランスフェクトし、４８時間培養した後、細胞を回収し、溶解した。等量の細胞溶解産物を還元または非還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥで泳動し、その溶解産物中のＨＩＶ−ｇｐ１２０を、抗ｇｐ１２０抗体（２Ｇ１２）を用いるウエスタンブロッティングによって検出した。 図７ Ａ：精製されたＳＦ１６２ ｇｐ１２０およびジスルフィド安定化されたＳＦ１６２ Ｌ１−ＳＳ−Ｌ２ ｇｐ１２０（配列番号４）を示しており、それらのタンパク質が＞９０％の純度であることを示している、代表的なクマシー染色ＰＡＧＥゲル。Ｂ：精製されたＳＦ１６２ ｇｐ１４０およびジスルフィド安定化されたＳＦ１６２ Ｌ１−ＳＳ−Ｌ２ ｇｐ１４０（Ｖ５９ＣおよびＳ１０９Ｃ）を示しており、それらのタンパク質が＞９０％の純度であることを示している、代表的なクマシー染色ＰＡＧＥゲル。 レセプター（可溶性ＣＤ４，ｓＣＤ４）、ｍＡｂ ｂ１２（ＣＤ４結合部位に結合する抗体）およびｍＡｂ １７ｂ（ＣＤ４誘導型の様式でＣＤ４結合後に結合する抗体）に対するｇｐ１２０およびｇｐ１２０ Ｌ１−ＳＳ−Ｌ２の結合親和性を測定する表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）解析。各リガンドの上に注入された様々な濃度のｇｐ１２０タンパク質に対する実験データならびに１：１当てはめ曲線が示されている。 Ａ：１回目の免疫化の２週間後（２ｗｐ１）、２回目の免疫化の２週間後（２ｗｐ２）、３回目の免疫化の２週間後（２ｗｐ３）、３回目の免疫化の４週間後（４ｗｐ３）および３回目の免疫化の８週間後（８ｗｐ３）の時点における抗体結合研究。Ｂ：４つすべての免疫原のアビディティー指数（ａｖｉｄｉｔｙ ｉｎｄｅｘ）。 ＴＺＭ−ｂｌアッセイにおける偽ウイルス（交差サブタイプ）の中和。Ａ−ｇｐ１２０；Ｂ−ｇｐ１２０ Ｌ１−ＳＳ−Ｌ２；Ｃ−ｇｐ１４０；Ｄ−ｇｐ１４０ Ｌ１−ＳＳ−Ｌ２。 Ａ−ｇｐ１２０；Ｂ−ｇｐ１２０ Ｌ１−ＳＳ−Ｌ２；Ｃ−ｇｐ１４０；Ｄ−ｇｐ１４０ Ｌ１−ＳＳ−Ｌ２によって産生される抗体のエピトープ特異性。

層間接触を安定化させるためのストラテジー
システイン変異およびジスルフィド架橋のための部位の特定
ジスルフィド架橋が２つのシステイン残基間に形成されるために、側鎖は、互いに対して適切な距離かつ正しい向きで存在しなければならない。本発明者らは、層１、２および３の界面に存在するすべての残基を調査し、ジスルフィド形成のためのシステインによる置換の標的になり得る残基を同定しようと試みた。本発明者らは、ｇｐ１２０の結晶構造［１３］を使用し、この選択のために以下の基準を使用した：
ａ．以前に解明されたｇｐ１２０構造においてジスルフィド架橋を形成したシステインのＣβ（炭素−ベータ）原子間の平均距離は、約４．２２Åであり、範囲は３．９Å〜４．７Åである。ゆえに、本発明者らは、この範囲内に入るＣβ−Ｃβ距離を有する相互作用層における残基についてスクリーニングした
ｂ．本発明者らは、システイン残基による置換によって人工的なジスルフィド架橋が導入されたｇｐ１２０の結晶構造も調査した［６］。この構造では、２対の残基（Ｗ９０−Ｅ２６８）および（Ｉ１０３−Ｑ４１３）を、システイン（Ｗ９０Ｃ−Ｅ２６８Ｃ）および（Ｉ１０３Ｃ−Ｑ４１３Ｃ）に置換した。天然の残基およびシステイン置換された残基のＣβ距離は、それぞれ４．１Åおよび４．３Åだった。さらに、システインで置換された残基におけるジスルフィド架橋は、適切に形成され、これらのジスルフィド架橋されたｇｐ１２０のＣＤ４が結合した構造は、天然のｇｐ１２０にＣＤ４が結合した構造と識別できなかった（図２）。

これらの基準に基づいて、本発明者らは、システインに置換された場合、層間にジスルフィド架橋を形成する複数の残基対を同定した（図３、４および５）。

システイン置換および標的化されたジスルフィド結合挿入のための部位の選択
上に記載されたように、層の界面において近距離（およそ（ａｐｐｒｏｘａｉｍａｔｅｌｙ）４〜５オングストローム）で存在し、システインで置換された場合にジスルフィド結合を形成することができるであろう残基を、入手可能な構造情報［１３］を用いて視覚的に選択した。本発明者らはまた、Ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ−ｂｙ−Ｄｅｓｉｇｎソフトウェアを使用して、システインによって置換された場合にジスルフィド結合を形成することができるのに十分近いと推定される残基をさらに推測した。

システイン（ｃｙｔｅｉｎｅ）置換のための部位特異的変異誘発
本発明者らは、システイン置換のための残基を決定したら、Ｑｕｉｃｋ Ｃｈａｎｇｅ部位特異的変異誘発（Ｓｔｒａｔａｇｅｎ）に従って、相補的なプライマーをデザインした。野生型ＳＦ１６２ ｇｐ１２０をコードするプラスミドを鋳型として使用し、変異誘発の各回の後に、クローンを選択し、配列決定して、確実に正しい変異が存在し、意図されない変異が存在しないようにした。それらの正しいクローンをラージスケールのプラスミドＤＮＡ調製のためにさらに増幅させた。

層１と層２の架橋のための標的
システイン置換が層１と層２とを架橋するために選択される標的は、層１のバリン５９および層２のセリン１０９である（図３および５）。この架橋は、本明細書中でＬ１−ＳＳ−Ｌ２と称される。ＣＤ４が結合した新しいｇｐ１２０構造におけるこれらの残基間のＣβ原子間距離は、３．７Åであり、これは、ジスルフィド架橋にとって理想的な距離である。これらの２つの残基を、Ｓｔｒａｔａｇｅｎ（登録商標）Ｑｕｉｃｋ Ｃｈａｎｇｅプロトコルを使用する部位特異的変異誘発によってシステインに変異させ、ＤＮＡ配列決定によって確かめた（表１）。これらの残基をシステインに変異させることに関連して、ｇｐ１２０の発現またはプロセシングに悪影響がないことを、小規模なトランスフェクションおよびウエスタンブロッティングによって確かめた（図６）。

層２と層３の架橋のための標的
上に記載された類似の基準に基づいて、本発明者らは、ジスルフィド結合によって架橋され得る層２および層３に存在するいくつかの残基を同定した。これらの残基およびＣβ原子間の距離を以下に列挙する；Ｖ９５−Ｗ４６５：４．５Å、Ｖ９５−Ｒ４６２：５．３Å、Ｖ９５−Ｌ４６９：５．６ÅおよびＨ９９−Ｒ４６２：５．８Å。残基Ｖ９５およびＷ４６５は、システイン変異および層２と層３とのジスルフィド架橋に対する主要な標的である（図４および５）。これらの選択された残基を変異させ、変異が存在することおよび変異による悪影響が存在しないことを、上に記載されたように確かめた（表１および図６）。

組み合わせ変異誘発および複数のジスルフィド結合の挿入
さらなる安定化を達成するために、本発明者らは、表１に示されるようなおよび下記に記載されるような組み合わせ変異誘発を進めた。これらは、
ａ．Ｖ５９ＣとＳ１０９Ｃとの間およびＶ９５ＣとＷ４６５Ｃとの間のジスルフィド結合を用いる、層１−２および層２−３の二重架橋の組み合わせ
ｂ．Ｖ５９ＣとＳ１０９Ｃとの間のジスルフィド結合を使用する、以前に公開されたジスルフィド架橋されたｇｐ１２０構造［６］（Ｗ９０ＣとＥ２６８Ｃ；Ｉ１０３ＣとＱ４１３Ｃ）との、層１−２架橋の組み合わせ
ｃ．Ｖ９５ＣとＷ４６５Ｃ；Ｗ９０ＣとＥ２６８Ｃ；またはＩ１０３ＣとＱ４１３Ｃにおけるジスルフィド結合と組み合わせた、以前に公開されたジスルフィド架橋されたｇｐ１２０構造（Ｗ９０ＣとＥ２６８Ｃ；Ｉ１０３ＣとＱ４１３Ｃ）［６］との、層２−３架橋の組み合わせ
を含む。

タンパク質の発現および精製：
組換えＨＩＶ−１エンベロープ（Ｅｎｖ）糖タンパク質であるｇｐ１２０およびｇｐ１４０は、サブタイプＢ ＣＣＲ５向性株ＨＩＶ−１ ＳＦ１６２に由来し、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞のトランスフェクションによって生成された。ループ１および２がジスルフィド安定化されたｇｐ１２０（ｇｐ１２０ Ｌ１−ＳＳ−Ｌ２）およびｇｐ１４０（ｇｐ１４０ Ｌ１−ＳＳ−Ｌ２）もまた、ＳＦ１６２に由来し、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞において生成された。４つすべての糖タンパク質を、Ｓｒｉｖａｓｔａｖａら［５２］が記載しているように、Ｇａｌａｎｔｈｕｓ Ｎｉｖａｌｉｓ−Ａｇａｒｏｓｅ（ＧＮＡ）アフィニティーカラム、陽イオン交換ＤＥＡＥカラムおよび最後のセラミックヒドロキシアパタイト（ＣＨＡＰ）カラムを含む３工程精製プロセスを用いて精製した。次いで、精製された糖タンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって（純度レベルについて）解析し、免疫ブロット（抗ＳＦ１６２ ｇｐ１４０ポリクローナルウサギ血清に対する）によって特異的反応性について解析した。精製された糖タンパク質は、＞９８％の純度で均質だった（ｇｐ１２０については＞９５％モノマー；ｇｐ１４０については＞８０％三量体）。糖タンパク質中のエンドトキシンレベルを、Ｅｎｄｏｓａｆｅ（登録商標）カートリッジおよびＥｎｄｏｓａｆｅ（登録商標）−ＰＴＳＴＭ分光光度計（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）を用いて測定したところ、≦０．０５ＥＵ／免疫化用量であることが見出された。

エピトープマッピングの目的で使用されたＳＦ１６２ ｇｐ１２０の他のバリアント（例えば、ｇｐ１２０ΔＶ３、ｇｐ１２０ΔＶ１Ｖ２、ｇｐ１２０ Ｄ３６８Ｒ（ＣＤ４結合部位変異体）、ｇｐ１２０ Ｉ４２０Ｒ（ＣＤ４ｉ部位変異体））もまた、上におよび以前［５０］に記載されたように、生成し、精製した。タンパク質のクマシー染色ＳＤＳ ＰＡＧＥおよびウエスタンブロットから、タンパク質の純度を推定する。

図７Ａは、精製されたＳＦ１６２ ｇｐ１２０（レーン１）およびジスルフィド安定化されたＳＦ１６２ Ｌ１−ＳＳ−Ｌ２ ｇｐ１２０（配列番号４）（レーン２）のクマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥを示しており、これにより、それらのタンパク質が＞９０％の純度であることが示される。矢印は、２つの１２０ｋＤａタンパク質を示している。図７Ｂは、精製されたＳＦ１６２ ｇｐ１４０（レーン３）およびジスルフィド安定化されたＳＦ１６２ Ｌ１−ＳＳ−Ｌ２ ｇｐ１４０（Ｖ５９ＣおよびＳ１０９Ｃ）（レーン４）のクマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥを示しており、これにより、それらのタンパク質が＞９０％の純度であることが示される（パネルＢ）。矢印は、２つの１４０ｋＤａタンパク質を示している。

ＭＷは、分子量マーカーのことを指し；そのマーカーにおける各バンドの分子量（単位はｋＤａ）が示されている。

表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）アッセイによるタンパク質の特徴付け：
各変異体からの精製されたタンパク質の構造の変化および立体配座の固定を、特異的リガンドへの結合の動態を計測するＳＰＲによってアッセイした。野生型ｇｐ１２０およびジスルフィド安定化されたｇｐ１２０であるｇｐ１２０ Ｌ１−ＳＳ−Ｌ２の結合親和性を測定するために、本発明者らは、ＳＰＲベースのＢＩＡｃｏｒｅ３０００を使用した。２００ＲＵのｓＣＤ４またはｍＡｂであるｂ１２もしくは１７ｂを、アミンカップリングによってＣＭ５センサーチップ上に直接固定化した。次いで、様々な濃度の、野生型または（ｏｆ）ジスルフィド安定化型のいずれかのｇｐ１２０を８０μｌ／分で注入した。ランニング緩衝液としてＨＢＳ−ＥＰ緩衝液を使用し、２５℃において結合解析を行った。次いで、実験曲線を、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア３．２（ＢＩＡｃｏｒｅ Ｉｎｃ）を使用して１：１Ｌａｎｇｍｕｉｒ結合モデルに当てはめた。１：１の当てはめの後に得られる会合速度Ｋｏｎ、解離速度Ｋｏｆｆおよび解離定数Ｋｄを表２に示す。

結果
ｇｐ１２０の構造上の立体配座に対する、ジスルフィド結合によって層間可動性を固定する影響を特徴付けるために、野生型（変化なし）および層１−２ジスルフィド連結変異体（Ｖ５９ＣとＳ１０９Ｃ；Ｌ１−ＳＳ−Ｌ２）由来のタンパク質を精製し、表面プラズモン共鳴（Ｓｕｒｆａｃｅ Ｐｌａｍｓｏｎ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）（ＳＰＲ）アッセイによって特徴付けた。このアッセイでは、異なる立体配座のｇｐ１２０に結合するリガンドをＣＭ５チップ上に捕捉し（方法を参照のこと）、野生型または変異体の可溶性ｇｐ１２０への結合を比較した。ＣＤ４が結合したｇｐ１２０の立体配座に選択的に結合するＣＤ４誘導型抗体である１７ｂ抗体と変異体ｇｐ１２０との結合は、野生型への結合と比べて有意な量だけ増大した。ジスルフィド結合によって層１と層２との相互作用が安定化されると、１７ｂへの結合の親和性が５倍超増大した。興味深いことに、この親和性の増大のほとんどすべては、会合速度の増大に由来し（表２を参照のこと）、これは、ＣＤ４が結合した立体配座でのｇｐ１２０の固定を裏付ける。しかしながら、層１と層２とのジスルフィド結合のみによって安定化されたｇｐ１２０では、なおも相当量の可撓性が残っており、これは、可溶性ＣＤ４への結合において特に明らかである。

表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）解析を使用することにより、レセプター（可溶性ＣＤ４；ｓＣＤ４）、ｍＡｂ ｂ１２（ＣＤ４結合部位に結合する抗体）ならびにｍＡｂ １７ｂへのｇｐ１２０およびｇｐ１２０ Ｌ１−ＳＳ−Ｌ２の結合親和性も測定した（図８）。これらの線は、各リガンドの上に注入された様々な濃度のｇｐ１２０タンパク質に対する実験データを示しており；これらの曲線は、１：１に当てはめられた曲線を示している。２つの曲線がほぼ完全に重なることは、１：１結合モデルへの適合度（Ｃｈｉ２，表２）の正当性を立証する。

（ｗｔ／未改変）ｇｐ１２０およびジスルフィド安定化されたｇｐ１２０ Ｌ１−ＳＳ−Ｌ２の結合の比較動態解析は、以下のことを示す：
１．ＣＤ４への結合：ｇｐ１２０は、２４．５ｎＭ（２．４８ｅ^−８Ｍ）のＫ_ｄ（解離定数）で可溶性ＣＤ４（ｓＣＤ４）に結合したが、安定化されたｇｐ１２０（ｇｐ１２０ Ｌ１−ＳＳ−Ｌ２）は、４分の１の親和性（Ｋ_ｄ＝９３．１ｎＭ／９．３１ｅ^−８Ｍ）で結合した。この４倍の差異は、ＣＤ４が結合した立体配座でそのタンパク質を「ロック」したことが原因の、ｓＣＤ４へのジスルフィド安定化されたｇｐ１２０のより低い会合速度（Ｋ_ｏｎ）にもっぱら起因した［行２および３を比較のこと］
２．ｂ１２への結合：本発明者らは、同様の傾向を観察したが、ｇｐ１２０とｇｐ１２０ Ｌ１−ＳＳ−Ｌ２との間に≦７倍のＫ_ｄのより大きな差異があった［行４と５とを比較のこと］
３．１７ｂ（＋／−ｓＣＤ４）への結合：本発明者らは、ｇｐ１２０がｓＣＤ４の非存在下ではｍＡｂ １７ｂに効率的に結合しないことを承知している。しかしながら、ｓＣＤ４の存在下において［行６］、ｇｐ１２０は、０．２６ｎＭ（２．６２ｅ^−１０Ｍ）というナノモル濃度未満の親和性で結合した。重要かつ決定的なことに、ジスルフィド安定化されたｇｐ１２０（ｇｐ１２０ Ｌ１−ＳＳ−Ｌ２）は、０．４４ｎＭ（４．４２ｅ^−１０Ｍ）という、ＣＤ４結合状態のｇｐ１２０（ｇｐ１２０＋ＣＤ４）と類似の親和性でｓＣＤ４の非存在下においてｍＡｂ １７ｂに結合した［行７］。安定化されたｇｐ１２０にｓＣＤ４が加えられると、親和性は、２０倍改善し、９６ｐＭ［９．６２ｅ^−１１Ｍ，行７］という解離定数を示す。

ＣＤ４が結合した立体配座でのｇｐ１２０の完全な安定化を達成するために、層２と層３との間のさらなる安定化変異が探索されている。

候補免疫原の解析
さらに安定化された各ポリペプチドが生成されたら、その各ポリペプチドは、タンパク質発現のレベル、適切な折り畳みおよびリガンド結合について評価され得る。これらは、以前に安定化された構造および保存された結合部位の露出を増強するために開発された他の改変されたｇｐ１２０と比較され得る。ｇｐ１２０上の保存された結合部位の安定した露出を達成したそれらのタンパク質は、候補免疫原として、小規模の動物治験においてさらに解析される。

アジュバント−Ｃａｒｂｏｐｏｌ９７１Ｐ ＮＦ＋ＭＦ５９［５１］
Ｃａｒｂｏｐｏｌ（登録商標）９７１Ｐ ＮＦ（この研究ではＣａｒｂｏｐｏｌ ９７１Ｐと称される）を粉末としてＬｕｂｒｉｚｏｌから購入し、次いで、滅菌条件下において水に再懸濁することにより、０．５％の均質な（ｈｏｍｏｇｅｎｏｕｓ）低粘度の懸濁物を生成した。その懸濁物を、さらに使用するまで４℃で保存した。ｇｐ１４０タンパク質と０．５％（ｗ／ｖ）Ｃａｒｂｏｐｏｌ９７１Ｐとの１：１（ｖ／ｖ）混合物（ｐＨ≧３．０）をすべてのインビトロ評価のために生成した。動物に投与するために、まず、ｇｐ１４０と０．５％（ｗ／ｖ）Ｃａｒｂｏｐｏｌ９７１Ｐとの１：１（ｖ／ｖ）混合物を生成し、ｇｐ１４０タンパク質−Ｃａｒｂｏｐｏｌ９７１Ｐ複合体を３０分間インキュベートした後、等体積のＭＦ５９を加えることにより、０．１２５％（ｗ／ｖ）で投与されるＣａｒｂｏｐｏｌ９７１Ｐ懸濁物の最終濃度を維持した。インビボ研究用のすべてのＣａｒｂｏｐｏｌ９７１Ｐ懸濁物に対して、エンドトキシンレベルを、Ｅｎｄｏｓａｆｅ（登録商標）カートリッジおよびＥｎｄｏｓａｆｅ（登録商標）−ＰＴＳＴＭ分光光度計（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）を用いて計測した。

ウサギの免疫化
免疫化研究を、ＵＳＤＡから許諾を得た（Ｎｏ．９３−Ｒ−０２６０）およびＮＩＨからのＰｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ（ＰＨＳ）Ａｓｓｕｒａｎｃｅを有する（Ｎｏ．Ａ３４０４−０１）研究施設であるＪｏｓｍａｎ ＬＬＣ（Ｎａｐａ，ＣＡ）において行った。３つの群のニュージーランドシロウサギ（１群あたり５匹の若年成体の雌）をこの研究では使用した。ＭＦ５９単独、Ｃａｒｂｏｐｏｌ９７１Ｐ単独またはＣａｒｂｏｐｏｌ９７１Ｐ＋ＭＦ５９のいずれかでアジュバント化した（ａｄｊｕｖａｎｔｅｄ）ＳＦ１６２ ｇｐ１４０タンパク質をウサギに免疫化した。４回の免疫化を、０、４、１２および２４週目に殿筋（１つの免疫化あたり２つの部位）の筋肉内に行った。各免疫化におけるタンパク質投与量は、５０μｇだった。最初の免疫化の前（事前採血）および各免疫化の後の様々な時点（２ｗｐ２、２ｗｐ３、２ｗｐ４、４ｗｐ４および１５ｗｐ４）において回収された血液から血清サンプルを調製し、結合および中和について解析した。

０．１２５％（ｗ／ｖ）Ｃａｒｂｏｐｏｌ９７１Ｐの注射に関連する局所的な反応源性を評価するために、注射部位における浮腫および紅斑についての皮膚の視覚的な観察を、投与前、免疫化の直後、ならびに免疫化の２４時間後および４８時間後に行った。任意の明らかな臨床的徴候についての全般的な観察を、免疫化の直後、ならびに免疫化の２４および４８時間後に行った。研究を始める前、各免疫化の前、ならびに各免疫化の２４および４８時間後に、体重も記録した。

この研究は、Ａｎｉｍａｌ Ｗｅｌｆａｒｅ Ａｃｔ、ＩＬＡＲのＧｕｉｄｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓ、ならびにすべての該当する地域、州および連邦の法律および規制に示されているような動物の人道的管理と使用についての要件に従って、ＮｏｖａｒｔｉｓのＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（承認番号０９ＮＶＤ０４４．３．３．０９）によって十分に認められたものである。

結果
本発明者らは、ＣａｒｂｏｐｏｌおよびＭＦ５９をアジュバントとして用いる、タンパク質のみ（２５μｇ）の免疫化のウサギ研究を行った。野生型ｇｐ１２０およびｇｐ１４０を、それぞれｇｐ１２０ Ｌ１−ＳＳ−Ｌ２（配列番号４）およびｇｐ１４０ Ｌ１−ＳＳ−Ｌ２（Ｖ５９ＣおよびＳ１０９Ｃ）と比較した。下記の表３に示されるような免疫化を行った。

０、４週間および１２週間の時点において、示されている免疫原およびアジュバントでウサギを免疫化した。

免疫化の際、本発明者らは、１回目の免疫化の２週間後（２ｗｐ１）、２回目の免疫化の２週間後（２ｗｐ２）、３回目の免疫化の２週間後（２ｗｐ３）、４ｗｐ３および８ｗｐ３の時点において抗体の結合を評価した。本発明者らは、４つすべての免疫原が、＞１０ｅ＋５−６ ＧＭＴ ２ｗｐ２／２ｗｐ３免疫化を誘発することを観察した。結果（Ｒｅｓｕｌｓ）は、図９Ａに示されている。

本発明者らは、２ｗｐ３（最後の免疫化の２週間後）において有意に高いアビディティー抗体をもたらしたｇｐ１４０ Ｌ１−ＳＳ−Ｌ２を除いて、４つすべての免疫原が、解析された５つの時点において、同様のレベルのアビディティーをもたらすことも観察した。結果は、図９Ｂに示されている。

ＨＩＶ−１ウイルスの中和
本発明者らは、ＴＺＭ−ｂｌアッセイにおいて偽ウイルス（交差サブタイプ）の中和に対する２ｗｐ３血清も解析した。以前に記載されているように［４６、４７］、ＴＺＭ−ｂｌ細胞［Ｄｒ．Ｊｏｈｎ Ｃ．Ｋａｐｐｅｓ，Ｄｒ．Ｘｉａｏｙｕｎ Ｗｕ ａｎｄ Ｔｒａｎｚｙｍｅ，Ｉｎｃ．（Ｄｕｒｈａｍ，ＮＣ）］において、偽ウイルスを使用する十分に標準化されたアッセイおよびルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイを使用して、ウイルス中和力価を計測した。簡潔には、合計２００ ＴＣＩＤ５０偽ウイルス／ウェルを、希釈された血清サンプルに加え、３７℃で１時間インキュベートした。インキュベーションの後、ＤＥＡＥ−デキストラン含有培地中の１０，０００細胞／ウェルを加え、３７℃で４８時間インキュベートした。ＤＥＡＥ−デキストランの最終濃度は、１０μｇ／ｍｌだった。４８時間のインキュベーションの後、供給業者（Ｐｒｏｍｅｇａ）が説明するようにＢｒｉｇｈｔ Ｇｌｏ基質溶液を使用するルミネセンスの測定のために、１００μｌの細胞を９６ウェル黒色固体プレート（Ｃｏｓｔａｒ）に移した。中和力価は、バックグラウンドＲＬＵを減算した後、ウイルスコントロールウェルと比べて相対ルミネセンス単位（ＲＬＵ）を５０％減少させた希釈度である。以前に報告されたように［Ｍｏｎｔｅｆｉｏｒｉ，Ｄ．Ｃ．，Ｍｅａｓｕｒｉｎｇ ＨＩＶ ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ ｉｎ ａ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ｒｅｐｏｒｔｅｒ ｇｅｎｅ ａｓｓａｙ．．ＨＩＶ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ ｅｄ．Ｇ．Ｖ．Ｋ．Ｖｉｎａｙａｋａ Ｒ．Ｐｒａｓａｄ，ｅｄｓ．Ｖｏｌ．４８５．２００９：Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ．３９５−４０５］、ＦｕＧＥＮＥ−６ ＨＤ（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を使用して、ｅｎｖ欠損ＨＩＶ−１骨格ベクター（ｐＳＧ３Δｅｎｖ）と組み合わせて、ＨＩＶ−１分離株のパネル由来の分子的にクローニングされた完全長ｇｐ１６０ｅｎｖ遺伝子を含む発現プラスミドで２９３Ｔ細胞をコトランスフェクションすることによって、ＨＩＶ−１ Ｅｎｖ偽ウイルスを調製した。４８時間後、偽ウイルスを含む細胞培養上清を０．４５μｍフィルターで濾過し、使用するまで−８０℃で保管した。

本発明者らは、４つすべての免疫原が、Ｔｉｅｒ １ａウイルス［ＳＨＩＶ−Ｂａｌ−Ｐ４（キメラ、サブタイプＢ）、ＭＮ．３（サブタイプＢ）、ＳＦ１６２．ＬＳ（サブタイプＢ）およびＭＷ９６５．２６（サブタイプＣ）］に対するＥｎｖ特異的中和抗体を誘発することを観察した。重要なことには、ジスルフィド安定化されたｇｐ１２０とｇｐ１４０の両方が、＞０．５ｌｏｇ高い相同な中和力価をもたらした（すなわち、ＳＦ１６２ウイルスに対する）。結果は、図１０に示されている。

エピトープ特異性
本発明者らは、２ｗｐ３血清を使用して、上記４つの免疫原によって免疫化されたときに産生された抗体のエピトープ特異性を評価した。本発明者らが検討した４つのエピトープは、Ｖ３ループ、Ｖ１Ｖ２ループ、ＣＤ４結合部位（ＣＤ４ＢＳ）およびＣＤ４誘導性／誘導型（ＣＤ４ｉ；ＣＤ４結合）部位だった。ＭＦ５９でアジュバント化したｇｐ１４０タンパク質、Ｃａｒｂｏｐｏｌ９７１Ｐでアジュバント化したｇｐ１４０タンパク質またはＣａｒｂｏｐｏｌ９７１Ｐ＋ＭＦ５９でアジュバント化したｇｐ１４０タンパク質を免疫化された動物由来の血清中のエンベロープ特異的な総抗体価を、先に記載されたように［５２］、ＳＦ１６２ ｇｐ１４０タンパク質を使用する標準的なＥＬＩＳＡアッセイによって定量した。抗体アビディティー指数の測定を、他で［５２］説明されているようなチオシアン酸アンモニウム（ＮＨ_４ＳＣＮ）置換ＥＬＩＳＡを使用して行った。

解析の際、本発明者らは、４つの免疫原によって産生される抗体の質に有意差をみとめた。ｇｐ１２０は、Ｖ３（約５０〜５５％）およびＶ１Ｖ２エピトープに対して高レベルの抗体を誘発したが、より保存されたＣＤ４ＢＳおよびＣＤ４ｉ部位に対する抗体は、より少なかった（１０〜２０％）（図１１Ａ）。しかしながら、ジスルフィド安定化されたｇｐ１２０は、Ｖ３（＜４０％）領域およびＶ１Ｖ２（１５〜２０％）領域に対して有意に低いレベルの抗体、ならびにＣＤ４ＢＳ（≧３０％；ｇｐ１２０免疫化アームにおいて約２０％より上）およびＣＤ４部位（＞３０％；ｇｐ１２０免疫化アームにおいて１０％より上）に対して比較的高いレベルの抗体（図１１Ｂ）を産生させた。

ｇｐ１４０を使用する免疫化は、＜４０％のＶ３反応性抗体および≦２０％のＶ１Ｖ２反応性抗体を誘発した。保存されたＣＤ４ＢＳに対する抗体は、≧２０％であり、ＣＤ４ｉ部位に対する抗体は、約１０％だった（図１１Ｃ）。しかしながら、ジスルフィド安定化されたｇｐ１４０で免疫化されたとき、２ｗｐ３は、同様の抗Ｖ３抗体レベルを示した（＜４０％）が、Ｖ１Ｖ２（３０〜３５％）、ＣＤ４ＢＳ（３０〜３５％）およびＣＤ４ｉ部位（≦４０％）に対して有意に高い抗体レベルを示した（図１１Ｄ）。

結論として、ジスルフィド安定化されたｇｐ１２０およびｇｐ１４０が、有意により高いＣＤ４ｉ部位特異的抗体を産生させ、中でも、ジスルフィド安定化されたｇｐ１４０は、すべてのエピトープに対して最も「バランスのとれた」応答を誘発した。

初回刺激−追加免疫レジメンまたはより強力なアジュバントを使用することにより、応答の幅または全体的な質を高めることが補助され得る。

本発明が単に例として記載されてきたこと、ならびに本発明の範囲内および精神内に残ったままで改変が行われ得ることが理解されるだろう。

Claims (23)

1. ＣＤ４結合エピトープとＣＤ４結合部位エピトープの両方を同時に露出する立体配座で安定化されたＨＩＶ ｇｐ１２０ポリペプチドまたは可溶性ｇｐ１４０ポリペプチドを含む単離されたポリペプチド。
2. 前記ポリペプチドが、内側ドメインの層の間の層間接触によって安定化されている、請求項１に記載の単離されたポリペプチド。
3. 前記ポリペプチドが、層１と層２との間の層間接触によって安定化されている、請求項１または請求項２に記載の単離されたポリペプチド。
4. 前記ポリペプチドが、層２と層３との間の層間接触によって安定化されている、前述のいずれかの請求項に記載の単離されたポリペプチド。
5. 前記層間接触が、ジスルフィド結合によってもたらされる、前述のいずれかの請求項に記載の単離されたポリペプチド。
6. 前記ジスルフィド結合が、配列番号２における１つ以上のアミノ酸対：Ｖ５９ＣとＳ１０９Ｃ、Ｖ９５ＣとＷ４６５Ｃ、Ｖ９５ＣとＲ４６２Ｃ、Ｖ９５ＣとＬ４６９Ｃおよび／またはＨ９９ＣとＲ４６２Ｃと等価な位置のシステイン残基間に形成される、請求項５に記載の単離されたポリペプチド。
7. 前記安定化されたＨＩＶ ｇｐ１２０ポリペプチドまたは可溶性ｇｐ１４０ポリペプチドが、配列番号２に示されるような内側ドメイン配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、そして配列番号２のＶ５９とＳ１０９、Ｖ９５とＷ４６５、Ｖ９５とＲ４６２、Ｖ９５とＬ４６９および／またはＨ９９とＲ４６２と等価な位置に１つ以上の天然に存在しないシステイン残基対を含む、前述のいずれかの請求項に記載の単離されたポリペプチド。
8. 前記安定化されたＨＩＶ ｇｐ１２０ポリペプチドまたは可溶性ｇｐ１４０ポリペプチドが、配列番号２に示されるような配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、そして配列番号２のＶ５９とＳ１０９、Ｖ９５とＷ４６５、Ｖ９５とＲ４６２、Ｖ９５とＬ４６９および／またはＨ９９とＲ４６２と等価な位置に１つ以上の天然に存在しないシステイン残基対を含む、前述のいずれかの請求項に記載の単離されたポリペプチド。
9. 前記安定化されたＨＩＶ ｇｐ１２０ポリペプチドまたは可溶性ｇｐ１４０ポリペプチドが、配列番号２におけるＷ９０とＥ２６８、Ｉ１０３とＱ４１３に対応する位置に１つ以上の天然にコードされないシステイン対を含む、前述のいずれかの請求項に記載の単離されたポリペプチド。
10. 前記安定化されたＨＩＶ ｇｐ１２０ポリペプチドが、配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０または２２に示されるようなアミノ酸配列を含む、請求項７または請求項８に記載の単離されたポリペプチド。
11. 前述のいずれかの請求項に記載の単離されたポリペプチドの免疫原性フラグメントであって、ここで、該免疫原性フラグメントは、ＨＩＶ ｇｐ１２０のＣＤ４結合エピトープおよびＣＤ４結合部位エピトープの両方を含み、かつそれらを露出する、免疫原性フラグメント。
12. 請求項１〜１０のいずれか１項に記載の単離されたポリペプチドまたは請求項１１に記載の免疫原性フラグメントおよびさらなるポリペプチドを含む融合タンパク質。
13. 前記さらなるポリペプチドが、インフルエンザ由来のＨＡポリペプチドである、請求項１２に記載の融合タンパク質。
14. ３つのサブユニットを含む三量体ポリペプチドであって、ここで、各サブユニットは、独立して、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の単離されたポリペプチド、請求項１１に記載の免疫原性フラグメントおよび請求項１２または請求項１３に記載の融合タンパク質からなる群より選択される、三量体ポリペプチド。
15. 請求項１〜１０のいずれか１項に記載の単離されたポリペプチド、請求項１１に記載の免疫原性フラグメントまたは請求項１２もしくは請求項１３に記載の融合タンパク質をコードする単離されたポリヌクレオチド。
16. 前記ポリヌクレオチドが、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９または２１に示されるような配列と少なくとも９０％の同一性を有する核酸配列を含む、請求項１５に記載のポリヌクレオチド。
17. 請求項１〜１０のいずれか１項に記載の単離されたポリペプチド、請求項１１に記載の免疫原性フラグメント、請求項１２もしくは請求項１３に記載の融合タンパク質、請求項１４に記載の三量体および／または請求項１５もしくは請求項１６に記載のポリヌクレオチドを含む免疫原性組成物。
18. アジュバントをさらに含む、請求項１７に記載の免疫原性組成物。
19. ＨＩＶによる感染および／またはＡＩＤＳを処置するためまたは予防するためのワクチンとして使用するための、請求項１７または請求項１８に記載の免疫原性組成物。
20. 被験体において免疫応答を発生させるための方法であって、該方法は、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の単離されたポリペプチド、請求項１１に記載の免疫原性フラグメント、請求項１２もしくは請求項１３に記載の融合タンパク質、請求項１４に記載の三量体、請求項１５もしくは請求項１６に記載のポリヌクレオチドまたは請求項１７もしくは請求項１８に記載の免疫原性組成物を該被験体に投与する工程を含む、方法。
21. 被験体におけるＨＩＶによる感染および／またはＡＩＤＳの処置または予防において使用するための、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の単離されたポリペプチド、請求項１１に記載の免疫原性フラグメント、請求項１２もしくは請求項１３に記載の融合タンパク質、請求項１４に記載の三量体、請求項１５もしくは請求項１６に記載のポリヌクレオチドおよび／または請求項１７もしくは請求項１８に免疫原性組成物。
22. 被験体におけるＨＩＶによる感染および／またはＡＩＤＳを処置するかまたは予防する方法であって、該方法は、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の単離されたポリペプチド、請求項１１に記載の免疫原性フラグメント、請求項１２もしくは請求項１３に記載の融合タンパク質、請求項１４に記載の三量体、請求項１５もしくは請求項１６に記載のポリヌクレオチドおよび／または請求項１７もしくは請求項１８に記載の免疫原性組成物を該被験体に投与する工程を含む、方法。
23. 前記被験体が、ヒトである、請求項２１に記載の単離されたポリペプチド、免疫原性フラグメント、融合タンパク質、三量体、ポリヌクレオチドもしくは免疫原性組成物、または請求項２０もしくは２２に記載の方法。