CN112538105B - 稳定的冠状病毒刺突(s)蛋白抗原和相关疫苗 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了重新设计的衍生自可溶性冠状病毒S蛋白的抗原，其通过对野生型可溶性S序列的特异性修饰而得以稳定。本发明还提供了纳米颗粒疫苗，其包含显示在自组装纳米颗粒上的重新设计的可溶性S抗原。本发明中还提供了编码重新设计的抗原和纳米颗粒疫苗的多核苷酸序列。本发明还提供了在各种治疗应用中(例如，用于预防或治疗冠状病毒感染)使用疫苗组合物的方法。

Description

稳定的冠状病毒刺突(S)蛋白抗原和相关疫苗
本申请为申请日为2020年11月07日、申请号为202011233984.X、名称为“稳定的冠状病毒刺突(S)蛋白抗原和相关疫苗”的 中国发明专利申请的分案申请。
相关申请的交叉引用
本专利申请要求美国临时专利申请US63/045,557(2020年6月29日提交)的优先权权益。优先权申请的全部公开内容出于所有 目的通过引用整体并入本文。
政府支持声明
本发明是在美国国立卫生研究院授予的编号为AI139092和AI137472的政府支持下完成的。该政府拥有本发明的某些权利。
背景技术
冠状病毒(CoV)是具有正链RNA基因组的包膜病毒。在2002年，亚洲爆发了严重的急性呼吸道综合症(SARS)。2003年， 一种新型冠状病毒被确定为SARS的病原体，其后被命名为SARS-CoV。在2002-2003年爆发期间，SARS-CoV感染了8000多人，死 亡率约为10％。在2012年，发现了另一种冠状病毒，即中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)。自2012年以来，MERS-CoV已 在27个国家感染了2000多人，致死率约为35％。2019年12月，一种命名为2019-nCoV(或SARS-CoV-2)的新型冠状病毒被发现。 在摊贩中发现了一批报告的感染者，其中有些人早在12月8日就出现症状。在2020年1月10日，基因测序确定了这种新型冠状病 毒(一种β-冠状病毒)与MERS-CoV和SARS-CoV有关。在2020年1月30日，世界卫生组织(WHO)宣布SARS-CoV-2为国际关注 的突发公共卫生事件(PHEIC)，并于2020年3月11日将这种情况描述为流行病。在2020年5月24日，WHO冠状病毒疾病 (COVID-19)仪表盘显示，在216个国家，地区或管区共确认了5,304,772例确诊病例，包括342,029例死亡病例。SARS-CoV， MERS-CoV和SARS-CoV-2属于β-冠状病毒属，是高致病性人畜共患病毒。除了这三个高致病性β-冠状病毒，四种低致病性β-冠状病 毒，HCoV-OC43，HCoVHKU1，HCoV-NL63和HCoV-229E在人类中也很流行。
迄今为止，尚未批准用于治疗或预防任何人类感染性冠状病毒的治疗剂或疫苗。在本领域中迫切需要有效的针对冠状病毒的疫苗。 本发明致力于本领域中的这种紧迫需求以及其他紧迫需求。
发明内容
一方面，本发明提供了从冠状病毒的刺突(S)糖蛋白衍生或修饰的工程抗原多肽，所述冠状病毒包括SARS-CoV，MERS-CoV 和SARS-CoV-2。相对于冠状病毒的野生型可溶性S蛋白序列，本发明的抗原多肽包含改变的具有修饰的可溶性S序列，所述修饰稳 定了融合前S结构。在各种实施方式中，所述修饰包括：(a)使S1/S2切割位点失活的突变，和(b)在七肽重复序列1(HR1)区 域和中央螺旋(CH)区域之间的转向区域中的突变(参见图1)，该突变防止HR1和CH在膜融合过程中形成直螺旋。在一些实施 方式中，除了上述稳定化突变外，本发明的抗原多肽还包含截短的七肽重复序列2区域(HR2)。
本发明的一些可溶性S抗原多肽来源于SARS-CoV-2。在这些实施方式中的一些中，使S1/S2切割位点失活的突变可以包含用 GSAG(SEQ ID NO：20)替代682RRAR685(SEQ ID NO：19)，在转向区域中的突变可以包含双重突变K986G/V987G， K986P/V987P，K986G/V987P或K986P/V987G，这使用基于cryo-EM模型PDB ID 6VSB的氨基酸编号作为参考。在一些实施方式中， 野生型可溶性S序列包含SEQ ID NO：14所示的序列，或与其基本相同的变体或保守修饰的变体。在一些实施方式中，截短的HR2 需要在野生型可溶性S序列的C端缺失SEQ IDNO：9中所示的残基。在这些实施方式的一些中，抗原多肽还可包括在C端截短的 SEQ IDNO：10所示的残基。在这些实施方式的一些中，抗原多肽包括用残基GNS替代在野生型可溶性S序列的C端的SEQ ID NO： 10所示的残基。
在一些实施方式中，本发明的源自SARS-CoV-2的抗原多肽可以包含SEQ ID NO：15所示的N端前导序列。在一些实施方式中， 抗原多肽可进一步在与HR2相互作用的HR1区域中包含：(a)一个或多个脯氨酸或甘氨酸替代物，和/或(b)插入的一个或多个氨 基酸残基。在这些实施方式的一些中，抗原多肽可具有选自A942P、S943P、A944P、A942G、S943G和A944G的一个或多个替代物。 在这些实施方式的一些中，所述插入可以是在A942-A944中的任何残基之间的G或GS插入。在一些示例性实施方式中，本发明的源 自SARS-CoV-2的抗原多肽包含SEQ ID NO：32-37中任一者所示的序列，或与其基本相同的变体或保守修饰的变体。
本发明的一些可溶性S抗原多肽来源于SARS-CoV。在这些实施方式的一些中，使S1/S2切割位点失活的突变可以是R667G替代 物，转向区域中的突变包括双重突变K968G/V969G，K968P/V969P，K968G/V969P或K968P/V969G，这使用基于UniProt ID P59594 的氨基酸编号作为参考。在一些实施方式中，野生型可溶性S序列包含SEQ ID NO：7所示的序列，或与其基本相同的变体或保守修 饰的变体。在一些实施方式中，本发明的源自SARS-CoV的抗原多肽包含在野生型可溶性S序列的C端的截短的HR2(SEQ ID NO： 9)。在这些实施方式的一些中，抗原多肽可另外包含在C端的SEQ ID NO：10所示的截短的残基。在这些实施方式的一些中，抗原 多肽包含用残基GNS替代在野生型可溶性S序列的C端的SEQ ID NO：10所示的残基。
在一些实施方式中，本发明的源自SARS-CoV的抗原多肽可包含SEQ ID NO：8所示的N端前导序列。在一些实施方式中，抗 原多肽还可在与HR2相互作用的HR1区域中包含：(a)一个或多个脯氨酸或甘氨酸替代物，和/或(b)插入的一个或多个氨基酸残 基。在这些实施方式的一些中，抗原多肽可以具有选自S924P、T925P、A926P、S924G、T925G和A926G的一个或多个替代物。在 这些实施方式的一些中，所述插入可以是在S924-A926中的任何残基之后的G或GS的插入。
本发明的一些其他可溶性S抗原多肽来源于MERS-CoV。在这些实施方式的一些中，使S1/S2切割位点失活的突变可包含 R748A/R751G双重突变，在转向区域中的突变包括双重突变V1060G/L1061G、V1060P/L1061P、V1060G/L1061P或V1060P/L1061G， 这使用基于UniProt ID R9UQ53的氨基酸编号作为参考。在一些实施方式中，野生型可溶性S序列包含SEQ ID NO：11所示的序列， 或与其基本相同的变体或保守修饰的变体。在一些实施方式中，本发明的源自MERS-CoV的抗原多肽包含在野生型可溶性S序列的 C端的截短的HR2(SEQID NO：13)。
在一些实施方式中，本发明的源自MERS-CoV的抗原多肽可包含SEQ ID NO：12所示的N端前导序列。在一些实施方式中，抗 原多肽可进一步在与HR2相互作用的HR1区域中包含：(a)在与HR2相互作用的HR1区域中的一个或多个脯氨酸或甘氨酸替代物， 和/或(b)插入的一个或多个氨基酸残基。在这些实施方式的一些中，抗原多肽可具有选自T1013P、T1014P、T1015P、T1013G、 T1014G和T1015G的一个或多个替代物。在这些实施方式的一些中，所述插入可以是在T1013-T1015中的任何残基之后的残基G或 GS的插入。
在一些实施方式中，本发明的源自冠状病毒S蛋白的抗原多肽可另外在C端包含三聚化基序。在这些实施方式的一些中，所述三 聚化基序是折叠子(foldon)或病毒衣壳蛋白SHP。在各种实施方式中，所采用的三聚化基序可以包含SEQ ID NO：26所示的折叠子 序列或SEQ ID NO：27所示的SHP序列，或与其基本相同的变体或保守修饰的变体。在一些实施方式中，本发明的衍生自冠状病毒 S蛋白的抗原多肽可另外包含自组装纳米颗粒的亚单位序列，该亚单位序列与改变的可溶性S序列是融合的。在这些实施方式的一些 中，改变的可溶性S序列的C端融合于纳米颗粒亚单位序列的N端。
另一方面，本发明提供了编码本文描述的衍生自冠状病毒S蛋白的抗原多肽的多核苷酸序列。一些多核苷酸序列编码包含抗原多 肽的融合多肽，所述抗原多肽在其C端与自组装纳米颗粒的亚单位序列的N端融合。
另一方面，本发明提供了冠状病毒疫苗组合物，其包含显示在自组装纳米颗粒表面上的本文所述的抗原多肽。在这些实施方式的 一些中，自组装纳米颗粒包含三聚体序列，抗原多肽的C端融合至纳米颗粒的亚单位序列的N端。在一些实施方式中，所采用的自组装纳米颗粒包括铁蛋白，E2p或I3-01组成。本发明的一些纳米颗粒疫苗显示了本文描述的工程化SARS-CoV-2刺突蛋白。
在一些实施方式中，纳米颗粒疫苗包含：(1)包含从N端到C端的多肽序列：(a)工程化的SARS-CoV-2刺突多肽，GS接头 序列和纳米颗粒序列I3-01v9，(b)工程化的SARS-CoV-2刺突多肽，GS接头序列和纳米颗粒序列E2p，或(c)工程化的SARS- CoV-2刺突多肽，GS接头序列和纳米颗粒序列铁蛋白；或(2)该多肽序列的保守修饰的变体。在这些实施方式的一些中，相对于野 生型刺突序列，显示的SARS-CoV-2刺突抗原多肽包含：(a)用GSAG(SEQ IDNO：20)替代S1/S2切割位点682RRAR685(SEQ ID NO：19)，(b)在转向区域转中的K986G/V987G双重突变，以及(c)在C端的截短的HR2(SEQ ID NO:9)。
在本发明的一些纳米颗粒支架式SARS-CoV-2疫苗中，显示的SARS-CoV-2刺突抗原多肽包含SEQ ID NO：33或34所示的序列 或其保守修饰的变体。在这些实施方式的一些中，支架式疫苗包括：(1)包含从N端到C端的亚单位序列：(a)SEQ ID NO：33 所示的工程化SARS-CoV-2刺突多肽，接头序列(G4S)2(SEQ ID NO：22)，SEQ ID NO：23(I3-01v9)所示的纳米颗粒序列，SEQ ID NO：29(LD7)所示的锁定结构域和SEQ ID NO：30(PADRE)所示的T细胞表位，(b)SEQ ID NO：33中所示的工程化 SARS-CoV-2刺突多肽，接头序列G4S(SEQ ID NO：21)，SEQ ID NO：24(E2p)中所示的纳米颗粒亚单位序列，SEQ ID NO：28 (LD4)中所示的锁定结构域和SEQ ID NO：30(PADRE)中所示的T细胞表位，或(c)SEQ ID NO：33中所示的工程化的SARS- CoV-2刺突多肽，接头序列G4S(SEQ ID NO：21)，如SEQ ID NO：25(铁蛋白)所示的纳米颗粒序列；或(2)亚单位序列的保 守修饰变体。在一些实施方式中，纳米颗粒支架式疫苗的亚单位包含SEQ ID NO：38-40中任一项所示的序列，或与其基本相同的变 体或保守修饰的变体。
另一方面，本发明提供了药物组合物，其包含本文所述的疫苗组合物和药学上可接受的载体。另一方面，本发明提供了用于预防 或治疗受试者中冠状病毒感染的方法。这些方法涉及向受试者施用药学有效量的本文所述的疫苗组合物或药物组合物。
通过参考说明书和权利要求书的其余部分，可以实现对本发明的本质和优点的进一步理解。
附图说明
图1示出了冠状病毒刺突(S)蛋白的不同结构基序的组织。图中所示的方案反映了本发明涵盖的不同冠状病毒(例如SARS- CoV、MERS-CoV和SARS-CoV-2)的S蛋白的结构。图中所示的S蛋白的结构域和基序包括RBD、HR1、CH1和HR2域或区域， 以及S2切割位点(又名S1/S2切割位点)和S2'切割位点。除了图中所示的各种S结构组成外，HR1和CH之间的氨基酸残基在此表 示为“转向区”。
图2是小鼠免疫方案的示意图。将每组五只小鼠的组以三周的间隔进行四次免疫。除I3-01v9之外，所有疫苗抗原(50ug/每次注 射)均使用AddaVax(一种水包油乳剂佐剂)配制，I3-01v9使用磷酸铝(AP)配制。通过腹膜内(IP)途径进行注射。每次注射后 两周采集血样。
图3显示了小鼠体内SARS-CoV-2疫苗诱导抗体响应的结果。SARS-CoV-2刺突/刺突-NP疫苗诱导的抗体结合响应。该图列出了 使用ELISA方法测定的五个基于SARS-CoV-2刺突的疫苗组(S2P-5GS-1TD0，S2GΔHR2-5GS-1TD0，S2GΔHR2-5GS-FR， S2GΔHR2-5GS-E2p-L4P和S2GΔHR2-10GS-I3-01v9-L7P)针对三种包覆抗原的ED50滴度的汇总。在GraphPadPrism 8.4.3中计算ED50值。值得注意的是，通过将OD450的下限/上限设置为0.0/3.2以获得较高的精度，得出了第二周(w2)的ED50值。
图4示出了小鼠体内SARS-CoV-2疫苗诱导的抗体响应的其他结果。该图列出了在中和实验中五个基于SARS-CoV的-2刺突的 疫苗组(S2P-5GS-1TD0，S2GΔHR2-5GS-1TD0，S2GΔHR2-5GS-FR，S2GΔHR2-5GS-E2p-L4P和S2GΔHR2-10GS-I3-01v9-L7P)针对 两种假病毒(SARS-CoV-1-pp和SARS-CoV-2-pp)的ID50滴度的汇总。在GraphPad Prism 8.4.3中计算ID50值，“％中和”的下/上限设置 为0.0/100.0。
图5示出了小鼠体内SARS-CoV-2疫苗诱导的T细胞响应的结果。(A)-(B)：疫苗诱导的CD4+ T细胞免疫。在S2PECTO刺 突(1x10-7mM)，E2p SApNP(1x10-7mM)和I3-01v9 SApNP(1x10-7mM)刺激的树突细胞(DC)的存在下，将源自第11周(wll) 小鼠的脾细胞分别培养16小时(A)和4小时(B)。(C)和(D)：疫苗诱导的CD8+ T细胞免疫。在S2PECTO刺突(1x10-7mM)，E2p SApNP(1x10-7mM)和I3-01v9 SApNP(1x10-7mM)刺激的树突细胞(DC)的存在下，将源自第11周(wll)小鼠的 脾细胞分别培养16小时(A)和4小时(B)。将来自五只幼鼠的脾细胞用作对照样品，并用PBS培养。曲线示出了细胞分数的频率。 通过单因素方差分析确定P值。*，P＜0.05；**，P＜0.01；***，P＜0.001。
具体实施方式
I.概述
对于SARS-CoV(aka SARS-CoV-1)、MERS-CoV和SARS-CoV-2，病毒基因组编码刺突(S)、包膜(E)、膜(M)和核衣 壳(N)结构蛋白，其中，S糖蛋白负责通过其S1亚单位中的受体结合结构域(RBD)结合宿主受体，以及由其S2亚单位驱动的随 后的膜融合和病毒的进入。已经提出了可能的膜融合工艺。受体结合可以帮助将RBD保持在“站立”状态，这有助于S1亚单位与S2 亚单位的解离。当S1亚单位与S2亚单位解离时，第二S2′切割可释放融合肽。连接区域、HR1区域和中央螺旋区域将形成一个非常 长的螺旋件
Figure BDA0002837439340000041
以将融合肽插入宿主细胞膜。最后，HR1和HR2区域将形成螺旋结构，并组装成六螺旋束以融合病毒膜和宿 主膜。
在所有针对SARS-CoV、MERS-CoV和SARS-CoV-2解决的融合前S结构中，病毒膜近端HR2区都是不可见的，表明HR2具有 高迁移率。RBD包含一个核心子域和一个受体结合基序(RBM)。尽管三种冠状病毒之间的核心子域高度相似，但它们的RBM明显 不同，从而导致不同的受体特异性：SARS-CoV和SARS-CoV-2识别血管紧张素转换酶2(ACE2)，而MERS-CoV结合二肽基肽酶 4(DPP4)。由于S糖蛋白是表面暴露的并介导进入宿主细胞，因此它是感染后中和抗体(NAb)的主要目标，也是疫苗设计的重点。 S三聚体广泛地用N-连接的聚糖修饰，N-连接的聚糖对于正确折叠和调节对NAb的可及性很重要。
本发明的部分依据是基于发明人的如下研究：基于两种合理的策略，设计用于三种高致病性的β-冠状病毒(SARS-CoV、MERS- CoV和SARS-CoV-2)的纳米颗粒疫苗。在第一种策略中，发明人旨在通过消除在S的各个区域(特别是HR1和HR2)中亚稳态的 原因，从而使S三聚体稳定在融合前构造中，然后将其显示在纳米颗粒上。在第二种疫苗策略中，发明人利用SpyTag/SpyCatcher蛋 白强力胶系统创建了RBD呈递纳米颗粒。基于该设计产生了衍生自许多S蛋白的抗原多肽和纳米颗粒疫苗构建体，并检查了其活性。
如本文用SARS-CoV-2(和SARS-CoV-1)刺突蛋白所举例说明的，相对于没有工程化的对照多肽，本发明的工程化的刺突抗原 多肽更稳定并且代表了更理想的疫苗设计。如本文所述的它们的有利的生化性质和结构性质表明它们适合在工业环境中快速和大规模 的疫苗生产。当在体内检查时，我们发现：无论是单独还是呈递到自组装纳米颗粒平台(SApNP)上，工程化的SARS-CoV-2刺突抗 原(例如S2GΔHR2)均比未工程化的对照蛋白更有效地引发抗SARS-CoV-2NAb响应。如本文实施例中详述的，本发明的示例性纳 米颗粒疫苗，例如S2GΔHR2呈递的I3-01v9 SApNP，也可以引起强烈的Th1响应以及保护性细胞免疫所需的其他类型的T细胞响应。 从本文关于SARS-CoV-2刺突蛋白的示例性研究中获得的结果表明：本发明的工程化刺突抗原多肽为人类试验中的评估提供了更有效 的下一代候选疫苗。
根据本文所述的研究和示例性设计，本发明提供了冠状病毒抗原和疫苗组合物。本发明还提供了相关的多核苷酸序列、表达载体 和药物组合物。在各种实施方式中，病毒载体携带的呈蛋白质或核酸(DNA/mRNA)形式的稳定的S三聚体和RBD蛋白可用作冠状 病毒疫苗。另外，纳米颗粒呈递的稳定的S三聚体和RBD也可以用作VLP型冠状病毒疫苗。
本发明的基于冠状病毒S蛋白的抗原和疫苗具有许多有利的特性。本文所述的S三聚体设计以其天然样构造呈现保守的中和表位， 使S三聚体可用作疫苗抗原或在纳米颗粒上多价显示。本发明的纳米颗粒疫苗允许将源自三种不同冠状病毒的S三聚体显示在公知的 纳米颗粒平台上，例如铁蛋白、E2p和I3-01，其尺寸范围为12.2至25.0nm。此外，使用高稳定性的空心纳米笼(E2p和1VLW/I3-01 变体)实现了在纳米笼中工程化锁定结构域(LD)、T细胞表位(例如PADRE)和肽佐剂，从而提供一体化疫苗解决方案。可以在 ExpiCHO细胞中高产地生产所有呈递三聚体的纳米颗粒。由于CHO是用于蛋白药物和疫苗工业生产的主要哺乳动物细胞系之一以及 ExpiCHO是该CHO细胞系的瞬时版本，因此，从ExpiCHO生产中获得的纳米颗粒预期具有与工业CHO生产中获得的那些具有相同 的特性。此外，通过抗体和SEC纯化在ExpiCHO细胞中生产的S呈递纳米颗粒的高收率将能够开发出一种简单、可靠且具有成本效 益的工业生产方法。
除非本文另有说明，否则本发明的疫苗抗原、编码的多核苷酸、表达载体和宿主细胞以及相关的治疗应用都可以根据本文举例的 方法或本领域熟知的常规方法来产生或进行。参见例如酶学方法(Methods in Enzymology)，第289卷：固相肽合成(Solid-PhasePeptide Synthesis)，JN Abelson，MI Simon，G.B.Fields(编辑)，学术出版社(AcademicPress),第一版(1997)(ISBN-13：978- 0121821906)；美国专利US4,965,343和US5,849,954；Sambrook等，分子克隆(Molecular Cloning)：实验室手册，冷泉港出版社(ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Press)，纽约，(第3版，2000)；Brent等，分子生物学的当前方案(Current Protocols in Molecular Biology)，John Wiley&Sons股份有限公司，(ringbou编辑，2003)。Davis等人，分子生物学的基本方法(Basic Methods inMolecular Biology)，爱思唯尔科学出版社(Elsevier Science Publishing)美国纽约(1986)；或酶学方法(Methods in Enzymology)：分子克隆技术指南(Guide to MolecularCloning Techniques)，152卷，SL Berger和AR Kimmerl编辑，学术出版社 (AcademicPress)，美国圣地亚哥(1987)；蛋白质科学的当前方案(Current Protocols in ProteinScience，CPPS)(John E.Coligan 等编辑，John Wiley and Sons股份有限公司),细胞生物学的当前方案(CPCB)(Juan S.Bonifacino等编辑,John Wiley and Sons股份 有限公司)以及动物细胞培养(动物细胞培养)：基本技术手册(A Manual of Basic Technique)，R.Ian Freshney，发行人Wiley-Liss； 第五版(2005年)，动物细胞培养方法(细胞生物学中的方法，第57卷，Jennie P.Mather和David Barnes编辑，学术出版社，第一 版，1998年)。以下各部分提供了实施本发明的组合物和方法的其他指导。
除非另有说明以及除非从上下文和使用中另外理解，否则本文所用的表述“至少”或“至少一个”分别包括该表述之后的每个所述对 象以及两个或多个所述对象的各种组合。除非另外从上下文中理解，否则与三个或更多所列举的对象相关的表达“和/或”应被理解为 具有相同的含义。
除非另外特别指出或从上下文中理解，术语“包含”，“包括”，“具有”，“含有”，包括其语法上的等同形式，通常应当理解为开放 式且非限制性的，例如，不排除其他未列举的要素或步骤。
在定量值之前使用术语“约”的情况下，本发明还包括特定定量值本身，除非另外特别说明。如本文所用，术语“约”是指与标称值 相差±10％，除非另外指出或推断。
除非另有说明，步骤的顺序或执行某些动作的顺序并不重要，只要本发明保持可操作性即可。而且，可以同时进行两个或更多个 步骤或动作。
除非另有说明，本文中使用的任何和所有示例，或本文所使用的示例性语言(例如“诸如”或“包括”)仅旨在更好地说明本发明， 而不对本发明的范围构成限制。说明书中的任何语言都不应解释为任何未要求保护的要素对于实施本发明是必不可少的。
II.定义
除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。以下参考文献为技 术人员提供了本发明中使用的许多术语的一般定义：科学出版社科学与技术(Academic Press Dictionary of Science andTechnology)， Morris(编辑)，学术出版社(Academic Press)(第1版，1992年)；牛津生物化学和分子生物学词典(Oxford Dictionary of Biochemistry and Molecular Biology)，Smith等(编辑)，牛津大学出版社(Oxford University Press)，2000年修订；化学百科全书字典(Encyclopaedic Dictionary of Chemistry)，Kumar(编辑)，Anmol PublicationsPvt有限公司(2002)；微生物和分子生物学词 典(Dictionary of Microbiology andMolecular Biology)，Singleton等(编辑)，John Wiley和Sons(第3版，2002)；化学词典(Dictionary of Chemistry)，Hunt(编辑),Routledge(第1版，1999)；药物医学词典(Dictionary of Pharmaceutical Medicine)， Nahler(编辑)，Springer-Verlag Telos(1994)；有机化学词典(Dictionary of Organic Chemistry)，Kumar和Anandand(编辑)，Anmol Publications Pvt.有限公司(2002)；以及生物词典(A Dictionary of Biology)(牛津平装参考，Oxford Paperback Reference)， Martin和Hine(编辑)，牛津大学出版社(Oxford University Press)(2000年第4版)。本文还对一些术语中做了进一步说明，因为它们专门适用于本发明。
如本文所用，术语“抗原”或“免疫原”可互换使用，其指能够在受试者中诱导免疫响应的物质，通常是蛋白质。该术语还指具有免 疫活性的蛋白质，即一旦向受试者给药(直接或通过向受试者给药编码该蛋白质的核苷酸序列或载体)就能够引起针对该蛋白质的体液和/或细胞类型的免疫响应。除非另有说明，术语“疫苗抗原”与“蛋白质抗原”或“抗原多肽”可互换使用。
术语“保守修饰的变体”适用于氨基酸序列和核酸序列。关于特定的核酸序列，保守修饰的变体指的是编码相同或基本相同的氨基 酸序列的那些核酸，或在核酸不编码氨基酸序列的情况下，保守修饰的变体指的是基本相同的序列。由于遗传密码的简并性，大量功 能相同的核酸编码任何给定的蛋白质。对于多肽序列，“保守修饰的变体”是指如下变体：所述变体具有保守氨基酸替代物，以及用具 有含相似电荷的侧链的其他氨基酸残基替代的氨基酸残基。具有含相似电荷的侧链的氨基酸残基的家族已经在本领域中进行定义。这 些家族包括：具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸，精氨酸，组氨酸)，具有酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸，谷氨酸)，具有不 带电荷的极性侧链的氨基酸(例如甘氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，丝氨酸，苏氨酸，酪氨酸，半胱氨酸)，具有非极性侧链的氨基酸 (例如丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，蛋氨酸，色氨酸)，具有β-支链侧链的氨基酸(例如苏氨酸，缬氨 酸，异亮氨酸)和具有芳香族侧链的氨基酸(例如酪氨酸，苯丙氨酸，色氨酸，组氨酸)。
表位是指抗原决定簇。这些是具有抗原性的分子上的特定化学基团或肽序列，以至于它们引发特异性的免疫响应，例如，表位是 B和/或T细胞响应的抗原区域。表位可以由连续氨基酸形成，或者由蛋白质的三级折叠而并列的非连续氨基酸形成。
有效量的疫苗或其他试剂，指的是足以产生所需的响应，例如减轻或消除病症或疾病(如肺炎)的体征或症状。例如，这可以是 抑制病毒复制或可测量地改变病毒感染的外在症状所必需的量。通常，该量将足以可测量地抑制病毒(例如SARS-CoV-2)的复制或 传染性。当施用于受试者时，通常将使用达到目标组织浓度的剂量，该剂量已显示出实现了体外抑制病毒复制。在一些实施方式中， “有效量”是治疗(包括预防)任何病症或疾病的一种或多种症状和/或潜在原因(例如治疗冠状病毒感染)的量。在一些实施方式中， 有效量是治疗有效量。在一些实施方式中，有效量是防止特定疾病或病症的一种或多种症状或体征(例如与冠状病毒感染相关的一种 或多种症状或体征)发展的量。
除非另有说明，融合蛋白是包含来自至少两个不相关蛋白的氨基酸序列的重组蛋白，所述至少两个不相关蛋白已经通过肽键连接 在一起以形成单个蛋白。因此，它不包括天然存在的冠状病毒表面抗原，其如本文所述被称为融合(F)蛋白。不相关的氨基酸序列可以彼此直接连接，或者可以使用接头序列连接。如本文所用，如果蛋白的氨基酸序列通常在其天然环境中(例如，在细胞内)通常 不经由肽键连接在一起，则它们是不相关的。例如，通常未发现细菌酶例如嗜热脂肪芽孢杆菌二氢硫辛酸转乙酰基酶(E2p)的氨基 酸序列和可溶性冠状病毒S糖蛋白的氨基酸序列通过肽键连接在一起。
抗原是能够在哺乳动物(例如被感染或有被病原体感染风险的哺乳动物)中诱导免疫响应的蛋白质或其一部分。抗原的施用可产 生针对目的病原体的保护性免疫和/或主动免疫。
抗原性组合物是指包含抗原性多肽的组合物，所述抗原性多肽诱导针对表达抗原性多肽的病毒的可测量的CTL响应，或诱导针 对抗原性多肽的可测量的B细胞响应(例如抗体的产生)。
两个或两个以上核酸序列，或两个或两个以上氨基酸序列之间的序列同一性或相似性以序列之间的同一性或相似性表示。序列同 一性可以用百分比同一性来衡量。百分比越高，序列越相同。当在比较窗口或指定区域使用以下序列比较算法之一进行测量，或者通过手动比对和目视检查进行比较和比对以达到最大对应性时，如果两个序列具有指定百分比的相同的氨基酸残基或核苷酸(即在指定 区域，或未指定时，在整个序列上具有60％同一性，可选地具有65％同一性，70％同一性，75％同一性，80％同一性，85％同一性， 90％同一性，95％同一性或99％同一性)，则两个序列“基本相同”。任选地，同一性存在于长度至少约50个核苷酸(或10个氨基酸) 的区域，或更优选地存在于长度为100至500或1000或更多个核苷酸(或20、50、200或更多个氨基酸)的区域。
当使用标准方法比对时，核酸或氨基酸序列的同源序列或直系同源序列具有相对较高的序列同一性/相似性。用于比较的序列比 对方法是本领域众所周知的。各种程序和比对算法描述在如下文献中：Smith&Waterman,Adv.Appl.Math.2:482,1981；Needleman&Wunsch,J.Mol.Biol.48:443,1970；Pearson&Lipman,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:2444,1988；Higgins&Sharp,Gene,73:237-44,1988； Higgins&Sharp,CABIOS 5:151-3,1989；Corpet等,Nuc.Acids Res.16:10881-90,1988；Huang等Computer Appls.in theBiosciences 8, 155-65,1992；以及Pearson等,Meth.Mol.Bio.24:307-31,1994.Altschul等人，J.Mol.Biol.215:403-10,1990详细介绍了序列比对方法和 同源性计算。
SpyCatcher-SpyTag是指基于FbaB的CnaB2结构域的内部异肽键，结合纤连蛋白的MSCRAMM和化脓性链球菌的致病因子的蛋 白质连接系统。参见，例如，Terao等人，J.Biol.Chem.2002；277:47428–47435；和Zakeri等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 2012；109:E690–E697.它利用了来自化脓性链球菌表面蛋白(SpyCatcher)的修饰结构域，该结构域识别同源的13个氨基酸的肽 (SpyTag)。识别后，两者在SpyCatcher中的赖氨酸和SpyTag中的天冬氨酸的侧链之间形成共价异肽键。除其他应用外，该技术已 用于创建共价稳定的多蛋白复合物，用于模块化的疫苗生产，以及该技术用于标记蛋白(例如，用于显微镜检查)。SpyTag系统用 途广泛，因为标签(tag)是一种短的、未折叠的肽，其可以遗传融合到靶蛋白中的暴露位置。同样，可以将SpyCatcher与报告蛋白 (例如GFP)以及表位或纯化标签融合。
术语“受试者”是指被分类为哺乳动物的任何动物，例如人类和非人类哺乳动物。非人类动物的例子包括狗，猫，牛，马，绵羊， 猪，山羊，兔子等。除非另有说明，否则术语“患者”或“受试者”在本文中可互换使用。优选地，受试者是人类。
术语“治疗”或“减轻”包括向受试者施用化合物或药剂以预防或延缓疾病(例如冠状病毒感染)的症状，并发症或生化指标的发作， 减轻症状或阻止或抑制疾病、病症或紊乱的进一步发展。需要治疗的受试者包括已经患有该疾病或病症的那些以及有风险患该病症的 那些。治疗可以是预防性的(预防或延缓疾病的发作，或预防其临床或亚临床症状的表现)，也可以是疾病表现后的治疗性抑制或症 状缓解。
疫苗是指在受试者体内引起预防性或治疗性免疫响应的药物组合物。在某些情况下，免疫响应是保护性免疫响应。通常，疫苗引 起针对病原体例如病毒病原体的抗原或与病理状况相关的细胞组成的抗原特异性免疫响应。疫苗可包括多核苷酸(例如，编码已知抗原的核酸)，肽或多肽(例如公开的抗原)，病毒，细胞或一种或多种细胞组成。在本发明的一些实施方式中，疫苗或疫苗抗原或疫 苗组合物从融合构建体表达并自组装成在表面上显示了抗原多肽或蛋白质的纳米颗粒。
病毒样颗粒(VLP)是指非复制的病毒壳，其来源于多种病毒中的任何一种。VLP通常包括一种或多种病毒蛋白，例如但不限于 被称为衣壳的蛋白，外壳蛋白，球壁蛋白，表面蛋白和/或包膜蛋白的那些蛋白，或衍生自这些蛋白的形成颗粒的多肽。在适当的表 达系统中，在重组表达蛋白质后，VLP可以自发形成。生产特定VLP的方法是本领域已知的。可以使用本领域已知的常规技术(例 如通过电子显微镜，生物物理表征等)来检测遵循重组表达病毒蛋白的VLP的存在。参见，例如，Baker等(1991)Biophys.J. 60:1445-1456以及Hagensee等(1994)J.Virol.68:4503-4505。例如，VLP可以通过密度梯度离心分离和/或通过特征密度带来识别。可 选地，可以对所讨论的VLP制品的玻璃化水样进行冷冻电子显微镜检查，并在适当的曝光条件下记录图像。
自组装纳米颗粒是指球形蛋白质壳，其直径为数十纳米并且具有明确定义的表面几何形状。该球形蛋白质壳由非病毒蛋白质的相 同复制品形成，该非病毒蛋白质能够自动组装成具有与VLP类似外观的纳米颗粒。已知的实例包括铁蛋白(FR)，其在多物种间是 保守的并形成24聚体(24-mer)。已知的实例包括嗜热脂肪芽孢杆菌二氢硫辛酸转乙酰基酶(E2P)，超嗜热菌二氧四氢喋啶合酶 (LS)和海栖热袍菌encapsulin，其中全部形成60聚体(60-mer)。自组装纳米颗粒可以在适当的表达系统中重组表达蛋白质后自发 形成。纳米颗粒的生产、检测和表征的方法可以使用开发用于VLP的相同技术。
III.重新设计的冠状病毒可溶性S抗原
本发明提供了可用于产生疫苗组合物的经重新设计或修饰的冠状病毒可溶性S序列。通过将修饰引入冠状病毒的野生型可溶性S 序列中，使重新设计的可溶性S三聚体抗原或蛋白质稳定。本文举例说明了特定SARS-CoV、MERS-CoV和SARS-CoV-2毒株或分离 物的一些特定野生型可溶性S序列，例如SE ID NO：1-3。由于给定冠状病毒的不同分离物或毒株之间的功能相似性和序列同源性， 因此也可以根据本文所述的重新设计策略来产生衍生自其他已知冠状病毒S蛋白直系同源序列的重新设计的可溶性S抗原。在文献中 已经描述了许多已知的冠状病毒S蛋白序列。参见，例如，James等,J.Mol.Biol.432:3309-25,2020；Andersen等,Nat.Med.26:450-452, 2020；Walls等,Cell 180:281–292,2020；Zhang等,J.Proteome Res.19:1351-1360,2020；Du等,Expert Opin.Ther.Targets 21:131-143.；2017； Yang等,Viral Immunol.27:543-550,2014；Wang等,Antiviral Res.133:165-177,2016；Bosch等,J.Virol.77:8801-8811,2003；Lio等, TRENDS Microbiol.12:106-111,2004；Chakraborti等,Virol.J.2:73,2005；以及Li,Ann.Rev.Virol.3:237-261,2016.
如本文所详述，本发明的一些重新设计的可溶性S抗原多肽包含可以增强融合前S结构的稳定性的突变。这些突变包括使S1/S2 切割位点失活的突变，以及HR1内的突变，该HR1内的突变去除了HR1和CH之间的转向区域中的任何应变，即防止融合过程中形 成直螺旋。在一些实施方式中，重新设计的可溶性S抗原多肽可另外包含截短的HR2基序。截短的HR2结构域导致HR1/HR2融合 核心的破坏并稳定了融合前S结构。
一些工程化的可溶性S抗原多肽来源于引起COVID-19的SARS-CoV-2病毒。这些多肽中的一些含有修饰的S1/S2切割位点。作 为示例，用于工程化本发明的SARS-CoV-2抗原多肽的野生型可溶性S序列显示在SEQ ID NO：3中或显示在截短N端前导的可溶性 S序列(SEQ ID NO：14)中。在其他实施方式中，待使用的野生型S序列可以是SEQ ID NO：3或14的变体，例如与其基本相同的 变体或保守修饰的变体。使用基于cryo-EM模型PDB ID 6VSB或GenBank登录号MN908947.3的氨基酸编号作为参考，修饰的切割 位点包含682GSAGSV687(SEQID NO：18)。该切割位点的失活可以通过位点内或位点周围的许多序列改变(例如，缺失或替代) 来实现。如本文所例示的，使切割位点失活而不以其他方式影响蛋白质结构的一种突变是用GSAG(SEQ ID NO：20)替代切割位点 的残基682RRAR685(SEQ ID NO：19)。除了使切割位点失活外，可溶性SARS-CoV-2抗原多肽还可在HR1区域内包含双重突变， 该双重突变通过防止直螺旋的形成而消除了融合过程中转向区域(HR1和CH基序之间)的应变。在各种实施方式中，这种双重突变 可以是K986G/V987G，K986P/V987P，K986G/V987P或K986P/V987G。
除了上述稳定融合前S结构的突变以外，或替代上述稳定融合前S结构的突变，本发明的一些SARS-CoV-2抗原多肽可含有大部 分或整个HR2结构域的缺失。使用示例性的可溶性SARS-CoV-2S序列SEQ ID NO：3来说明，这种缺失可以包括氨基酸残基1150- 1208(SEQID NO：9)。在各种其他实施方式中，缺失可以是截断SEQ ID NO：3的前35、40、45、50、55或更多个C端残基。在 另一些其他实施方式中，C端截短的野生型可溶性S序列可以延伸超过HR2结构域。在这些实施方式的一些中，还可以缺失由SEQ ID NO：3的残基1139-1149(SEQ IDNO：10)组成的区域中的一个或多个残基。在这些实施方式中的一些中，C端截短的可溶性S序列可包含插入的三肽基序，GNS，例如通过用该基序替代SEQ ID NO：3的残基1139-1149。如本文所述，当抗原多肽显示在纳米 颗粒上时，该三肽基序起到增加蛋白质产量的作用。在一些其他实施方式中，可溶性S序列可包括SEQ ID NO：15所示的N端前导 序列。
在本发明的一些SARS-CoV-2抗原多肽中，可以引入野生型可溶性S序列的其他突变以使融合后的S结构不稳定。在一些实施方 式中，可以在与HR2相互作用以形成融合核心的HR1区域中工程化一个或多个脯氨酸和/或甘氨酸替代物。这些突变的功能是破坏六 螺旋束的融合核心。在各种实施方式中，突变可包括A942P，S943P，A944P，A942G，S943G和A944G。在一些实施方式中，可以 将一个或多个额外的氨基酸残基插入到与HR2相互作用以形成融合核心的HR1区域。类似地，这些插入也用于破坏融合核心的螺旋 形。在各种实施方式中，插入可包括在A942-A944中的任何残基之间插入G或GS。
如本文的实施例中详述的，相对于野生型SARS-CoV-2刺突胞外域多肽或众所周知的包含双重脯氨酸突变的SARS-CoV-2刺突多 肽(“S2P”)，几种特定的工程化的SARS-CoV-2刺突状抗原多肽表现出增强的抗原性。这些示例性的SARS-CoV-2刺突多肽之一是 SEQ IDNO：32中所示的S2GΔHR2。相对于野生型SARS-CoV-2刺突胞外域序列(SEQ ID NO：3)，S2GΔHR2包含用GSAGSV (SEQ ID NO：18)替代S1/S2切割位点序列682RRARSV687(SEQ ID NO：31)。它还在HR1中包含K986G/V987G双重突变。此外， 它已删除了HR2区域(E1150-Q1208)。如本文所述，该工程化SARS-CoV-2刺突抗原多肽产生了高纯度的三聚体，表明刺突亚稳性 显著降低。在ELISA和生物层干涉法(BLI)分析中，它还显示了专门用于刺突的代表性mAb表现出更高的亲和力。当显示在自组 装纳米颗粒支架上时，这种工程化蛋白显示令人满意的产量、纯度、生产稳定性和结构完整性，而野生型刺突和已广泛使用的带有双 重脯氨酸突变的刺突无法在任何NP支架上表达。当针对一组mAb/Nab进行测试时，NP显示出S2GΔHR2还表现出提高的抗原性。 当在体内检查时，显示出这种工程化刺突的NP疫苗还引起中和抗体响应，其响应强度比对照NP高10倍。
工程化SARS-CoV-2刺突蛋白“S2GΔHR2”(SEQ ID NO：32)的序列显示如下。在序列中，N端前导序列用斜体字标出，突变的 S1/S2切割位点用下划线标出，替代的986GG987残基用下划线和斜体字标出。
Figure BDA0002837439340000091
Figure BDA0002837439340000101
一些工程化的可溶性S抗原多肽源于SARS-CoV病毒。这些多肽中的一些含有修饰的S1/S2切割位点。作为示例，用于工程化本 发明的SARS-CoV抗原多肽的野生型可溶性S序列显示在SEQ ID NO：1或N端前导截短的可溶性S序列(SEQ ID NO：7)中。在 其他实施方式中，待使用的野生型S序列可以是SEQ ID NO：1或7的变体，例如与其基本相同的变体或保守修饰的变体。使用基于 UniProt ID P59594或GenBank登录号NP_828851的氨基酸编号作为参考，修饰的序列可以包含R667G替代物，其导致S1/S2切割位 点失活。除了使切割位点失活之外，可溶性SARS-CoV抗原多肽还可以包含在HR1区中的双重突变，该双重突变通过防止融合过程 中直螺旋的形成消除了转向区内的应变。在各种实施方式中，该双重突变可以是K968G/V969G，K968P/V969P，K968G/V969P或 K968P/V969G。
除了上述可稳定融合前S结构的突变之外或替代上述可稳定融合前S结构的突变，本发明的一些SARS-CoV抗原多肽可以包含 大部分或整个HR2结构域的缺失。使用示例性的可溶性SARS-CoV S序列SEQ ID NO：1进行说明，该缺失可以包括氨基酸残基 1132-1190(SEQ ID NO：9)。在各种其他实施方式中，缺失可以是截短的SEQ ID NO：1的前35、40、45、50、55或更多个C端残 基。在另一些其他实施方式中，野生型可溶性S序列的C端截断可以延伸超过HR2结构域。在这些实施方式的一些中，还可以缺失 由SEQ ID NO：1的残基1121-1131(SEQ ID NO：10)组成的区域中的一个或多个残基。在这些实施方式中的一些中，C端截短的 可溶性S序列可包含插入的三肽基序，GNS，例如通过用该基序替代SEQ ID NO：1的残基1121-1131。如本文所述，当抗原多肽显 示在纳米颗粒上时，该三肽基序起到增加蛋白质产量的作用。在一些其他实施方式中，可溶性S序列可以具有截断的N端前导序列。
在本发明的一些SARS-CoV抗原多肽中，可以引入野生型可溶性S序列的其他突变以使融合后的S结构不稳定。在一些实施方 式中，可以在与HR2相互作用形成融合核心的HR1区域中工程化一个或多个脯氨酸和/或甘氨酸替代物。这些突变的功能是破坏六螺 旋束的融合核心。在各种实施方式中，突变可包括S924P，T925P，A926P，S924G，T925G和A926G。在一些实施方式中，可以将 一个或多个额外的氨基酸残基插入到与HR2相互作用的HR1区域以形成融合核心。类似地，这些插入也用于破坏融合核心的螺旋形。 在各种实施方式中，插入可包括在A924-A926中的任何残基之间插入G或GS。
一些工程化的可溶性S抗原多肽源于MERS-CoV病毒。这些多肽中的一些含有修饰的S1/S2切割位点。作为示例，用于工程化 本发明的MERS-CoV抗原多肽的野生型可溶性S序列显示在SEQ ID NO：2或N端前导截断的可溶性S序列(SEQ ID NO：11)中。 在其他实施方式中，待使用的野生型S序列可以是SEQ ID NO：2或11的变体，例如与其基本相同的变体或保守修饰的变体。使用 基于UniProt ID R9UQ53或GenBank登录号JX869059.2的氨基酸编号作为参考，修饰的序列可以包含R748A/R751G双重突变，从而 导致S1/S2切割位点失活。除了使切割位点失活之外，可溶性MERS-CoV抗原多肽还可以在HR1区包含双重突变，该双重突变通过 防止融合过程中直螺旋的形成消除了转向区的应变。在各种实施方式中，该双重突变可以是V1060G/L1061G，V1060P/L1061P， V1060G/L1061P或V1060P/L1061G。
除了上述稳定融合前S结构的突变以外或替代上述稳定融合前S结构的突变，本发明的一些MERS-CoV抗原多肽可包含大部分 或整个HR2结构域的缺失。使用示例性的可溶性MERS-CoV S序列SEQ ID NO：2来说明，这种缺失可以包括氨基酸残基1229-1291 (SEQ IDNO：13)。在各种其他实施方式中，缺失可以是SEQ ID NO：2的前35、40、45、50、55、60或更多个C端残基的截断。 在一些其他实施方式中，可溶性S序列可以具有截断的N端前导序列。
在本发明的一些MERS-CoV抗原多肽中，可以引入野生型可溶性S序列的其他突变以使融合后S结构不稳定。在一些实施方式 中，可以在与HR2相互作用形成融合核心的HR1区域中工程化一个或多个脯氨酸和/或甘氨酸替代物。这些突变的功能是破坏六螺旋 束的融合核心。在各种实施方式中，突变可以包括T1013P，T1014P，T1015P，T1013G，T1014G和T1015G。在一些实施方式中， 可以将一个或多个额外的氨基酸残基插入到与HR2相互作用的HR1区域以形成融合核心。类似地，这些插入也用于破坏融合核心的 螺旋形。在各种实施方式中，插入可包括在T1013-T1015中的任何残基之间插入G或GS。
除上述各种替代和缺失外，本发明的工程化冠状病毒可溶性S抗原多肽还可在C端包含三聚化基序。用于本发明的合适的三聚化 基序包括例如T4纤维蛋白折叠子(fibritinfoldon)(PDB ID：4NCV)和病毒衣壳蛋白SHP(PDB：1TD0)。T4纤维蛋白(折叠子) 在本领域中是众所周知的，并且构成了来自噬菌体T4的三聚体蛋白纤维蛋白的C端30个氨基酸残基，并且在促进纤维蛋白的折叠和 三聚中起作用。参见，例如，Papanikolopoulou等,J.Biol.Chem.279:8991-8998,2004；以及Guthe等,J.Mol.Biol.337:905-915,2004。 类似地，SHP蛋白及其用作功能性三聚化基序的用途也是本领域众所周知的。参见例如Dreier等,Proc Natl Acad Sci USA 110:E869– E877,2013；以及Hanzelmann等,Structure 24:140–147,2016.本文例示的特定折叠子序列和SHP序列是 GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL(折叠子序列；SEQ ID NO：26)和 EVRIFAGNDPAHTATGSSGISSPTPALTPLMLDEATGKLVVWDGQKAGSAVGILVLPLEGTETALTYYKSGTFATEAIHWPESVDEHKK ANAFAGSALSHAA(1TD0；SEQ ID NO:27)。在一些实施方式中，三聚化基序通过短的GS接头与重新设计的可溶性S抗原多肽连接。 包含接头旨在稳定形成的三聚体分子。在各种实施方式中，接头可以包含GS的1-6个串联重复序列。在一些实施方式中，可以例如 通过使用镍柱，将His6-标签(His6-tag)添加至三聚化基序的C端以促进蛋白质纯化。
除上述S2GΔHR2以外，本发明的其他示例性工程化SARS-CoV-2刺突蛋白显示在SEQ ID NOs：33-37中。SEQ ID NO：33是 S2GΔHR2序列减去其N端前导序列。该序列与三聚化基序折叠子(SEQ ID NO：26)和1TD0(SEQ ID NO：27)的融合序列分别在 SEQ ID NO：35和36中显示。在这两个融合序列的每一个中，在工程化的刺突蛋白的C端引入一个限制性位点AS，然后通过G4S 接头将其连接到三聚化基序的N端。SEQ ID NO：34是包含HR1交换区的SEQID NO：33的变体。具体而言，HR1区域L922-S943 被SARS-CoV-1刺突蛋白的等效区域替代。如本文所例示的，仅当HR2茎(stalk)被去除时，含有该HR1交换的SARS-CoV-2刺突 蛋白与三聚化基序(例如1TD0)的融合体也显示出令人满意的抗原性。一种这样的融合体显示在SEQ ID NO：37中。这些示例性序 列、与其基本上相同的序列或其保守修饰的变体中的任何一个均可用于本发明中以开发SARS-CoV-2疫苗，例如纳米颗粒支架式疫苗。
工程化SARS-CoV-2刺突的序列：S2GΔHR2(减去N端前导序列)(SEQ ID NO：33)：
QCVNLTTRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLPFFSNVTWFHAIHVSGTNGTKRFDNPVLPFNDGVYFASTEKSNIIRG WIFGTTLDSKTQSLLIVNNATNVVIKVCEFQFCNDPFLGVYYHKNNKSWMESEFRVYSSANNCTFEYVSQPFLMDLEGKQGNFKNLRE FVFKNIDGYFKIYSKHTPINLVRDLPQGFSALEPLVDLPIGINITRFQTLLALHRSYLTPGDSSSGWTAGAAAYYVGYLQPRTFLLKYNE NGTITDAVDCALDPLSETKCTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNS ASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKS NLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTG TGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVSVITPGTNTSNQVAVLYQDVNCTEVPVAIHADQLTPTWRVYST GSNVFQTRAGCLIGAEHVNNSYECDIPIGAGICASYQTQTNSPGSAGSVASQSIIAYTMSLGAENSVAYSNNSIAIPTNFTISVTTEILPVS MTKTSVDCTMYICGDSTECSNLLLQYGSFCTQLNRALTGIAVEQDKNTQEVFAQVKQIYKTPPIKDFGGFNFSQILPDPSKPSKRSFIEDL LFNKVTLADAGFIKQYGDCLGDIAARDLICAQKFNGLTVLPPLLTDEMIAQYTSALLAGTITSGWTFGAGAALQIPFAMQMAYRFNGIG VTQNVLYENQKLIANQFNSAIGKIQDSLSSTASALGKLQDVVNQNAQALNTLVKQLSSNFGAISSVLNDILSRLDGGEAEVQIDRLITGR LQSLQTYVTQQLIRAAEIRASANLAATKMSECVLGQSKRVDFCGKGYHLMSFPQSAPHGVVFLHVTYVPAQEKNFTTAPAICHDGKA HFPREGVFVSNGTHWFVTQRNFYEPQIITTDNTFVSGNCDVVIGIVNNTVYDPLQPELDSFK
S2GΔHR2折叠子融合体的序列(SEQ ID NO：35)。在该序列中，将引入的限制性位点AS斜体化并加下划线，将G4S接头斜体 化，并在折叠子序列上加下划线。
Figure BDA0002837439340000121
S2GΔHR2-1TD0融合体的序列(SEQ ID NO：36)。在该序列中，引入的限制性位点AS用斜体显示并加下划线，G4S接头用斜 体显示，而1TD0序列用下划线显示。
Figure BDA0002837439340000122
HR1交换的S2G的序列S2GΔHR2(SEQ ID NO：34)：用SARs-CoV-1代替HR1区是带下划线的。
QCVNLTTRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLPFFSNVTWFHAIHVSGTNGTKRFDNPVLPFNDGVYFASTEKSNIIRG WIFGTTLDSKTQSLLIVNNATNVVIKVCEFQFCNDPFLGVYYHKNNKSWMESEFRVYSSANNCTFEYVSQPFLMDLEGKQGNFKNLRE FVFKNIDGYFKIYSKHTPINLVRDLPQGFSALEPLVDLPIGINITRFQTLLALHRSYLTPGDSSSGWTAGAAAYYVGYLQPRTFLLKYNE NGTITDAVDCALDPLSETKCTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNS ASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKS NLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTG TGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVSVITPGTNTSNQVAVLYQDVNCTEVPVAIHADQLTPTWRVYST GSNVFQTRAGCLIGAEHVNNSYECDIPIGAGICASYQTQTNSPGSAGSVASQSIIAYTMSLGAENSVAYSNNSIAIPTNFTISVTTEILPVS MTKTSVDCTMYICGDSTECSNLLLQYGSFCTQLNRALTGIAVEQDKNTQEVFAQVKQIYKTPPIKDFGGFNFSQILPDPSKPSKRSFIEDL LFNKVTLADAGFIKQYGDCLGDIAARDLICAQKFNGLTVLPPLLTDEMIAQYTSALLAGTITSGWTFGAGAALQIPFAMQMAYRFNGIG VTQNVLYENQKQIANQFNKAISQIQESLTTTSTALGKLQDVVNQNAQALNTLVKQLSSNFGAISSVLNDILSRLDGGEAEVQIDRLITGR LQSLQTYVTQQLIRAAEIRASANLAATKMSECVLGQSKRVDFCGKGYHLMSFPQSAPHGVVFLHVTYVPAQEKNFTTAPAICHDGKA HFPREGVFVSNGTHWFVTQRNFYEPQIITTDNTFVSGNCDVVIGIVNNTVYDPLQPELDSFK
HR1交换S2GΔHR2与1TD0的融合体的序列(SEQ ID NO：37)。在该序列中，引入的限制性位点AS用斜体显示并加下划线， G4S接头用斜体显示，而1TD0序列用下划线显示。
Figure BDA0002837439340000131
IV.纳米颗粒显示的冠状病毒疫苗组合物
本发明提供了包含异源支架的疫苗组合物，所述异源支架显示了至少一种源自冠状病毒S蛋白的抗原多肽或三聚体蛋白。在一些 实施方式中，所使用的冠状病毒S抗原是含有上述各种稳定突变的稳定的可溶性S多肽。在一些其他实施方式中，所采用的冠状病毒抗原包含或衍生自冠状病毒S蛋白的RBD结构域。在后面的实施方式中，使用SpyTag/SpyCatcher连接系统。如本文实施例中所详述， RBD序列可以与SpyTag基序融合，并且纳米颗粒亚单位序列可以与SpyCatcher基序融合。可选地，RBD序列可以与SpyCatcher基 序融合，并且纳米颗粒亚单位序列可以与SpyTag基序融合。在示例性的实施方式中，所采用的RBD序列可以包含SEQ ID NO：4-6 中任一个所示的序列，或与其基本上相同或保守修饰的变体。将表达SpyTag融合蛋白和SpyCatcher融合蛋白的两种构建体引入宿主 或生产细胞后，由于SpyTag/SpyCatcher介导的RBD蛋白与自组装蛋白的连接，将产生表面上显示RBD蛋白阵列的纳米颗粒疫苗。
任何异源支架可用于在本发明疫苗的构建中呈递抗原蛋白或多肽。这包括病毒样颗粒(VLP)，例如噬菌体QβVLP和纳米颗粒。 各种纳米颗粒平台可用于产生本发明的疫苗组合物。通常，用于本发明的纳米颗粒需要由单个亚单位的多个复制品形成。纳米颗粒通 常是球形的，和/或具有旋转对称性(例如，具有3重轴和5重轴)，例如具有本文示例的二十面体结构。另外地或可替代地，颗粒 亚单位的氨基末端必须暴露并紧邻3重轴，并且三个氨基末端的间隔必须紧密匹配显示的三聚体稳定的可溶性S蛋白的羧基末端的间 隔。
在各种实施方式中，所采用的自组装纳米颗粒的直径为约25nm或更小(通常由12、24或60个亚单位组装而成)，并且在粒子 表面上具有3重轴。这种纳米颗粒提供了合适的颗粒平台以生产多价疫苗。在一些优选的实施方式中，冠状病毒抗原蛋白或多肽可以 呈递在自组装纳米颗粒上，例如呈递在衍生自本文举例说明的铁蛋白(FR)或E2p的自组装纳米颗粒上。适用于本发明的纳米颗粒 的其他实例包括衍生自I3-01的纳米颗粒。铁蛋白是在所有动物，细菌和植物中发现的球状蛋白，是本领域众所周知的和常规使用的。 如本领域中众所周知的，其主要作用是通过将水合的铁离子和质子运输到矿化核心或通过将水合的铁离子和质子从从矿化核心运输出 来以控制多核Fe(III)2O3形成的速率和位置。铁蛋白的球状形式由单体亚单位蛋白(也称为单体铁蛋白亚单位)组成，该单体亚单位 蛋白是分子量约为17-20kDa的多肽。E2p是来自嗜热脂肪芽孢杆菌的二氢硫辛酸转乙酰基酶的重新设计的变体，其已显示可自组装 成热稳定的60聚体的纳米颗粒。参见，例如，He等,Nat.Commun.7:12041,2016.类似地,I3-01是一种可以自组装成超稳定纳米颗粒 的工程化蛋白。参见，例如Hsia等,Nature 535,136-139,2016。这些蛋白质的亚单位的序列是本领域已知的。参见例如 WO2017/192434。在本领域中提供了关于各种纳米颗粒支架的结构和功能特性以及它们在呈递三聚体蛋白抗原中的用途的更详细的 信息。参见例如WO2017/192434，WO2019/089817和WO2019/241483。在各种实施方式中，本发明的冠状病毒疫苗组合物可以使用 任何这些已知的纳米颗粒，以及它们的保守修饰的变体或与其具有基本相同(例如，至少90％，95％或99％相同)序列的变体。
除上述纳米颗粒序列外，本领域已知的许多其他纳米颗粒或VLP也可用于实施本发明。这些包括，例如，超嗜热菌二氧四氢喋 啶合酶(LS)和海栖热袍菌encapsulin，黄色粘球菌encapsulin，噬菌体Qbeta病毒颗粒，兽棚病毒(FHV)颗粒，ORSAY病毒颗粒 和传染性法氏囊病病毒(IBDV)颗粒。
在一些示例性实施方式中，本发明的纳米颗粒疫苗包含纳米颗粒亚单位序列，其显示在如下序列中：SEQ ID NO：23(I3-01v9)、 SEQ ID NO：24(E2p)或SEQ ID NO：25(铁蛋白)、保守修饰的变体或与其基本相同的序列。通常，将工程化冠状病毒抗原多肽 的C端融合到自组装纳米颗粒(NP)的亚单位的N端。在一些实施方式中，工程化冠状病毒多肽的C端经由GS接头序列融合至自 组装纳米颗粒的纳米颗粒亚单位序列，接头序列例如为G4S(GGGGS，SEQ ID NO：21)或(G4S)(GGGGSGGGGS；SEQ ID NO:22)。
I3-01v9亚单位序列(SEQ ID NO：23)
MKMEELFKKHKIVAVLRANSVEEAKMKALAVFVGGVHLIEITFTVPDADTVIKELSFLKELGAIIGAGTVTSVEQCRKAVESGAEFIVS PHLDEEISQFCKEKGVFYMPGVMTPTELVKAMKLGHTILKLFPGEVVGPQFVKAMKGPFPNVKFVPTGGVNLDNVCEWFKAGVLAV GVGSALVKGTIAEVAAKAAAFVEKIRGCTE
E2p亚单位序列(SEQ ID NO：24)
AAAKPATTEGEFPETREKMSGIRRAIAKAMVHSKHTAPHVTLMDEADVTKLVAHRKKFKAIAAEKGIKLTFLPYVVKALVSALREYP VLNTAIDDETEEIIQKHYYNIGIAADTDRGLLVPVIKHADRKPIFALAQEINELAEKARDGKLTPGEMKGASCTITNIGSAGGQWFTPVIN HPEVAILGIGRIAEKPIVRDGEIVAAPMLALSLSFDHRMIDGATAQKALNHIKRLLSDPELLLM
铁蛋白序列(SEQ ID NO：25)
DIIKLLNEQVNKEMNSSNLYMSMSSWCYTHSLDGAGLFLFDHAAEEYEHAKKLIIFLNENNVPVQLTSISAPEHKFEGLTQIFQKAYEH EQHISESINNIVDHAIKSKDHATFNFLQWYVAEQHEEEVLFKDILDKIELIGNENHGLYLADQYVKGIAKSRK
除了显示的可溶性S抗原之外，本发明的纳米颗粒疫苗组合物可以包括另外的基序以具有更好的生物学或药学特性。这些额外的 结构组成可以有如下作用：促进抗原显示在纳米颗粒表面上，增强所显示的抗原的稳定性和/或提高自组装蛋白疫苗的产量和纯度。在这些实施方式中，一种或多种接头(接头序列，基序或部分)可用于连接构建体中的各种结构组成。
在一些实施方式中，本发明的纳米颗粒疫苗可包含蛋白质结构域的编码序列，该蛋白质结构域，例如如上所述的T4纤维蛋白 (“折叠子”)的三聚化基序，用于稳定抗原多肽；或该蛋白质结构域，例如三螺旋束(“颈部结构域”)用于从纳米颗粒抬高表面抗原 多肽；或该蛋白质结构域，例如具有已知结合抗体的蛋白质结构域，用于促进免疫亲和纯化。这些序列可以添加在抗原多肽序列和纳 米颗粒亚单位序列之间。
在这些实施方式中的一些中，可将三聚化基序例如折叠子和病毒衣壳蛋白SHP(PDB:1TD0)添加至如本文所述的稳定化的可溶 性S蛋白的C端。如上所述，可将短的GS接头插入到三聚化基序中以进一步稳定三聚体，且在总蛋白产量内增加三聚体比率。在一 些实施方式中，可以将用作化学接合的活性位点的多肽片段或基序的编码序列插入构建体中的适当位置。在一些实施方式中，还可以 将其他结构组成，例如CD4+ T辅助表位或CD8+ T细胞表位，插入到纳米颗粒构建体中的适当位置。这些包括例如本文所举例说明的 PADRE T-辅助表位(AKFVAAWTLKAAA；SEQ ID NO：30)。在一些示例性实施方式中，可以将T辅助表位插入到锁定结构域的 C端，然后将其融合至下述的NP亚单位序列的C端。
在一些实施方式中，本发明的纳米颗粒疫苗可包含稳定纳米颗粒的锁定结构域。锁定结构域编码序列可以直接或间接地融合至纳 米颗粒亚单位编码序列的C端。锁定结构域从内部稳定了纳米颗粒，以使得呈递冠状病毒抗原多肽的纳米颗粒可以在制造、疫苗配制 和免疫过程中保持完整。如此构建的纳米颗粒疫苗抗原具有显着增强的稳定性。通常，适用于本发明的锁定结构域是蛋白质亚单位， 其可以通过界面处的非共价相互作用与溶液中的另一蛋白质亚单位天然形成二聚体。在一些优选的实施方式中，两个蛋白质亚单位可 以在序列上相同并且形成同源二聚体。在一些其他实施方式中，两个蛋白质亚单位可以是不同的蛋白质，或通过工程化衍生的单个蛋 白质的两个不同的结构域，其可以通过界面处的非共价相互作用在溶液中形成异二聚体。通常，锁定结构域与抗原多肽所连接的纳米颗粒亚单位共价融合。特定锁定结构域的实例和在构建纳米颗粒显示的三聚体抗原中使用的锁定结构域的指导可以在本领域中找到， 例如，WO2019/241483。在一些示例性实施方式中，所采用的LD含有SEQ ID NO：28(LD4)或29(LD7)所示的序列，其保守修 饰的变体或与其基本相同的序列。
锁定结构域LD4(SEQ ID NO：28)：
FSEEQKKALDLAFYFDRRLTPEWRRYLSQRLGLNEEQIERWFRRKEQQIGWSHPQFEK
锁定结构域LD7(SEQ ID NO：29)：
SPAVDIGDRLDELEKALEALSAEDGHDDVGQRLESLLRRWNSRRAD
可通过将抗原多肽或多聚抗原蛋白(例如，三聚体抗原)的亚单位融合至纳米颗粒的亚单位(例如，E2p或I3-01亚单位)以及 本文所述的其他任选或替代的组分(例如，锁定结构域或三聚化基序)，来构建显示了本文所述的任何稳定的冠状病毒可溶性S蛋白 抗原(例如，稳定的SARS-CoV-2可溶性S三聚体抗原)的纳米颗粒。为了构建本发明的纳米颗粒显示的融合疫苗抗原，可以采用一 个或多个接头基序或部分来促进连接并维持不同组分的结构完整性。通常，接头基序包含短肽序列，例如富含GS的肽。在各种实施 方式中，接头或接头基序可以是连接两个蛋白质结构域或基序而不干扰其功能的任何柔性肽。例如，所采用的接头可以是如本文所示 的5-aa G4S接头(SEQ ID NO：21)或10-aa(G4S)2接头(SEQ IDNO：22)以连接：(1)刺突蛋白和纳米颗粒支架序列，(2) 刺突蛋白和三聚化基序，和/或(3)纳米颗粒支架序列和锁定结构域序列。在一些实施方式中，二肽GS接头可用于将锁定结构域连 接至如本文示例的T表位。本发明的疫苗组合物的重组生产的详细步骤可以基于本文所述的方案和/或本领域中已经描述的其他方法， 例如，He等,Nat.Comm.7,12041,2016；Kong等,Nat.Comm.7,12040,2016；He等,Sci Adv.4(11):eaau6769,2018；He等,bioRxiv,2020.2008.2022.262634,2020；WO2017/192434；WO2019/089817和WO2019/241483。
SEQ ID NO：38-40示例了本发明的几种特定的纳米颗粒显示的SARS-CoV-2刺突蛋白的序列。SEQ ID NO：38是包含无前导序 列S2GΔHR2(SEQ ID NO：33)的融合序列，其经由(G4S)2接头与纳米颗粒序列I3-01v9(SEQ ID NO：23)连接。该纳米颗粒显 示的刺突在其C端进一步包含锁定结构域LD7(SEQ ID NO：29)和PADRE T表位(SEQ ID NO：30)。SEQ ID NO：39是包含无 前导序列S2GΔHR2(SEQ ID NO：33)的融合序列，其经由G4S接头与纳米颗粒序列E2p(SEQ ID NO：24)连接。该纳米颗粒显 示的刺突在其C端进一步包含锁定结构域LD4(SEQID NO：28)和PADRE T表位(SEQ ID NO：30)。SEQ ID NO：40是包含无 前导序列S2GΔHR2(SEQ ID NO：33)的融合序列，其通过G4S接头与纳米颗粒序列铁蛋白(SEQ ID NO：25)连接。除了这些具 体例示的融合构建体之外，本发明还涵盖SARS-CoV-2纳米颗粒疫苗，该疫苗含有与任何这些例示的纳米颗粒疫苗序列中的任一个基 本相同的亚单位序列或其保守修饰的变体的亚单位序列。
3种示例性SARS-CoV-2纳米颗粒疫苗的序列显示在下面的SEQ ID NO：38-40中。在这些序列中，(1)在刺突蛋白和纳米颗粒 亚单位序列之间，(2)在纳米颗粒亚单位序列和锁定结构域之间，以及(3)在锁定结构域和T表位之间的GS接头被加粗，纳米颗 粒亚单位用下划线标出，引入的限制性位点AS用斜体标出并用下划线标出，将锁定结构域序列用斜体标出，并用T-表位序列下划线 并用粗体标出。
S2GΔHR2-10GS-I3-01v9-LD7-PADRE的序列(SEQ ID NO：38)。
Figure BDA0002837439340000161
纳米颗粒疫苗S2GΔHR2-5GS-E2p-LD4-PADRE的序列(SEQ ID NO：39)：
Figure BDA0002837439340000162
Figure BDA0002837439340000171
纳米颗粒疫苗S2GΔHR2-5GS-铁蛋白(SEQ ID NO：40)：
Figure BDA0002837439340000172
V.多核苷酸和表达构建体
本发明的稳定的冠状病毒可溶性S抗原蛋白和相关疫苗组合物通常通过首先产生的表达构建体(即表达载体)来生产，所述表达 构建体包含本文所述的各种结构成分的可操作连接的编码序列。因此，在一些相关方面，本发明提供了编码本文所述的抗原或纳米颗粒显示的抗原的基本上纯化的多核苷酸(DNA或RNA)。本发明的一些多核苷酸编码本文描述的工程化的刺突抗原多肽中的一种， 例如，SEQ ID NO：32-37中所示的稳定的SARS-COV-2可溶性S抗原。本发明的一些多核苷酸编码本文描述的纳米颗粒支架式疫苗 中的一种的亚单位序列，例如SEQ ID NO：38-40中所示的融合蛋白序列。尽管本发明表达的刺突抗原多肽通常不包含N端前导序列， 但是本发明的一些多核苷酸序列额外地编码天然刺突蛋白的前导序列。因此，例如，编码工程化的SARS-COV-2刺突抗原多肽(例 如，SEQ ID NO：33-37)或纳米颗粒支架式多肽序列(例如，SEQ ID NO：38-40)的多核苷酸可以另外编码SEQ ID NO：15所示的 天然前导序列、或与基本上相同的序列或保守修饰的变体序列。
本发明还提供了具有此类多核苷酸的表达载体(例如，本文示例的CMV载体)和用于产生疫苗抗原的宿主细胞(例如， HEK293F，ExpiCHO和CHO-S细胞系)。由多核苷酸编码或由载体表达的融合多肽也包括在本发明中。如本文所述，纳米颗粒亚单 位融合的可溶性S抗原多肽将自组装成纳米颗粒疫苗，该纳米颗粒疫苗在其表面上显示了抗原多肽或蛋白质。
多核苷酸和相关载体可以通过标准分子生物学技术或本文举例说明的方案容易地产生。例如，用于克隆，转染，瞬时基因表达和 获得稳定转染的细胞系的通用方案在本领域中已有描述，例如，Sambrook等，Molecular Cloning:A Laboratory Manual,ColdSpring Harbor Press,N.Y.,(第三版,2000年)；以及Brent等,Current Protocols inMolecular Biology,John Wiley&Sons股份有限公司.(ringbou 版,2003).。通过PCR将突变引入多核苷酸序列中可以如例如PCR Technology中所述进行：Principles andApplications for DNA Amplification,H.A.Erlich(编辑),Freeman Press,NY,NY,1992；PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications,Innis等(编辑), AcademicPress,San Diego,CA,1990；Mattila等,Nucleic Acids Res.19:967,1991；以及Eckert等,PCR Methods and Applications 1:17,1991。
具体载体的选择取决于融合多肽的预期用途。例如，无论该细胞类型是原核还是真核细胞，选择的载体必须能够驱动融合多肽在 所需细胞类型中的表达。许多载体含有允许原核载体复制和可操作地连接的基因序列的真核表达的序列。可用于本发明的载体可以自主复制，即，该载体在染色体外存在，并且其复制不必直接与宿主细胞基因组的复制相连。可选地，载体的复制可以与宿主染色 体DNA的复制相连，例如，可以将载体整合到宿主细胞的染色体中，这通过逆转录病毒载体且在稳定转染的细胞系中实现。基于病 毒的表达载体和基于非病毒的表达载体均可用于在哺乳动物宿主细胞中产生抗原。非病毒载体和系统包括质粒，附加型载体(通常具 有用于表达蛋白质或RNA的表达盒)和人类人工染色体(参见，例如，Harrington等，Nat.Genet。15：345，1997)。有用的病毒 载体包括基于慢病毒或其他逆转录病毒的载体，腺病毒，腺伴随病毒，巨细胞病毒，疱疹病毒，基于SV40的载体，乳头瘤病毒， HBP Epstein Barr病毒，牛痘病毒载体和Semliki Forest病毒(SFV)。参见，Brentsupra,supra；Smith,Annu.Rev.Microbiol.49:807, 1995；以及Rosenfeld等,Cell68:143,1992.
取决于用于表达融合多肽的特定载体，在本发明的实践中可以使用各种已知的细胞或细胞系。宿主细胞可以是可以引入携带本发 明融合体的重组载体的任何细胞，其中允许载体驱动用于本发明的融合多肽表达。它可以是原核的，例如许多细菌菌株中的任何一种， 或者可以是真核的，例如酵母或其他真菌细胞，昆虫或两栖动物细胞，或哺乳动物细胞，包括例如啮齿动物，猿猴或人细胞。表达本 发明融合多肽的细胞可以是原代培养细胞或可以是已确立的细胞系。因此，除了本文举例说明的细胞系(例如CHO细胞)外，本领 域中熟知的许多其他宿主细胞系也可以用于本发明的实践中。这些包括，例如，多种Cos细胞系，HeLa细胞，Sf9细胞，HEK293， AtT20，BV2和N18细胞，骨髓瘤细胞系，转化的B细胞和杂交瘤。
哺乳动物组织细胞培养物表达多肽的用途一般在例如Winnacker,From Genes toClones,VCH Publishers,N.Y.,N.Y.,1987中讨论。 通过本领域技术人员已知的许多合适方法中的任一种，可以将表达融合多肽的载体引入选择的宿主细胞。为了将编码融合多肽的载体 引入哺乳动物细胞，所使用的方法将取决于载体的形式。对于质粒载体，可以通过许多转染方法中的任一种引入编码融合多肽序列的 DNA，这些方法包括例如脂质体介导的转染(“脂质体转染”)，DEAE-葡聚糖介导的转染，电穿孔或磷酸钙沉淀法。这些方法例如在上文的Brent等,supra中有详细描述。脂质体转染试剂和适于瞬时转染多种转化的和未转化的或原代细胞的方法是广泛可用的，使脂 质体转染成为将构建体引入真核生物、尤其是培养的哺乳动物细胞中的有吸引力的方法。例如，可以使用LipofectAMINETM(生命技 术)或LipoTaxiTM(Stratagene)试剂盒。提供脂质体转染试剂和方法的其他公司包括Bio-Rad实验室，CLONTECH，Glen Research， Life Technologies，JBL Scientific，MBI Fermentas，PanVera，Promega，Quantum Biotechnologies，Sigma-Aldrich和Wako Chemicals USA。
为了长期高产量地生产重组融合多肽，稳定表达是优选的。代替使用包含病毒复制起点的表达载体，可以用由适当的表达控制元 件(例如启动子，增强子，序列，转录终止子，聚腺苷酸化位点等)控制的融合多肽编码序列和可选的标记转化宿主细胞。重组载体中的选择标记对选择的具有抗性，并使细胞将载体稳定整合到其染色体中。常用的选择标记包括：新霉素(neo)，其对氨基糖苷G- 418具有抗性(Colberre-Garapin等，J.Mol.Biol.,150:1,1981)，以及潮霉素(hygro)，其对潮霉素具有抗性(Santerre等,Gene,30: 147,1984)。通过适当的选择，转染的细胞可以包含融合多肽编码序列的完整复制品。
VI.药物组合物和治疗应用
在另一方面，本发明提供了使用本文所述的重新设计的冠状病毒S抗原和纳米颗粒疫苗组合物的药物组合物和相关的治疗方法。 在各种实施方式中，药物组合物可包含工程化病毒刺突蛋白或RBD多肽，纳米颗粒支架式病毒刺突抗原，以及编码本文所述的工程化病毒刺突抗原或纳米颗粒疫苗的多核苷酸序列或载体。在一些实施方式中，用于不同病毒(例如SARS-COV-2)的可溶性S三聚体 抗原可以用于预防和治疗相应的病毒感染。在各种其他实施方式中，包含本文所述的不同病毒或非病毒抗原的纳米颗粒疫苗可用于预 防或治疗相应疾病，例如各种冠状病毒引起的感染。本发明的一些实施方式涉及SARS-COV-2抗原或疫苗在预防或治疗人类受试者 的SARS-COV-2感染中的用途。本发明的一些实施方式涉及SARS-CoV抗原或疫苗在预防或治疗SARS-CoV感染中的用途。本发明 的一些实施方式涉及MERS-CoV抗原或疫苗在预防或治疗MERS-CoV感染中的用途。
在本发明的各种治疗方法的实践中，对需要预防或治疗疾病或病状(例如SARS-COV-2感染)的受试者施用相应的纳米颗粒疫 苗，抗原蛋白或多肽，或本文所述的编码多核苷酸。通常，本文公开的纳米颗粒疫苗、抗原蛋白或编码多核苷酸包含在药物组合物中。 药物组合物可以是治疗制剂或预防制剂。通常，该组合物可以另外包含一种或多种药学上可接受的载体，以及任选地其他治疗成分 (例如抗病毒药)。组合物中也可以使用各种药学上可接受的添加剂。
因此，本发明的一些药物组合物是疫苗组合物。对于疫苗组合物，可以另外包括合适的佐剂。合适的佐剂的实例包括例如氢氧化 铝、卵磷脂、弗氏佐剂，MPLTM和IL-12。在一些实施方式中，本文公开的疫苗组合物或纳米颗粒抗原(例如SARS-COV-2疫苗组合 物)可以配制为控释或定时释放制剂。这可以在包含缓释聚合物的组合物中或通过微囊递送系统或生物粘附凝胶来实现。各种药物组 合物可以根据本领域众所周知的标准程序来制备。参见，例如，Remington’s Pharmaceutical Sciences,第19版,Mack Publishing Company,Easton,Pa.,1995；Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems,J.R.Robinson编辑,Marcel Dekker,股份有限公司, New York,1978；美国专利US4,652,441和US4,917,893；美国专利US4,677,191和US4,728,721；以及美国专利US4,675,189.
本发明的药物组合物可以容易地用于多种治疗或预防应用中，例如用于治疗受试者体内的SARS-COV-2感染或用于引起对受试 者体内的SARS-COV-2的免疫响应。在各种实施方式中，疫苗组合物可用于治疗或预防由病原体引起的感染，显示在纳米颗粒疫苗 中的抗原多肽衍生自所述病原体因此，本发明的疫苗组合物可以在多种临床环境中用于治疗或预防由多种病毒引起的感染。作为示 例，可以将SARS-COV-2纳米颗粒疫苗组合物给药给受试者以诱导对SARS-COV-2的免疫响应，例如，诱导产生针对病毒的广泛中 和抗体。对于有风险感染SARS-COV-2的受试者而言，可以施用本发明的疫苗组合物以提供针对病毒感染的预防性保护。可以类似 地进行衍生自本文所述的其他抗原的疫苗的治疗性和预防性应用。取决于具体的受试者和疾病，本发明的药物组合物可以通过本领 域普通技术人员已知的多种给药方式给予受试者，例如，通过肌内途径、皮下途径、静脉内途径、动脉内途径、关节途径、腹膜内途 径或肠胃外途径。
通常，在足以预防、抑制和/或缓解所选疾病或病症或其一种或多种症状的时间和条件下，将药物组合物给予需要这种治疗的受 试者。在各种实施方式中，本发明的治疗方法涉及阻断冠状病毒(例如SARS-CoV，SARS-CoV-2或MERS-CoV)进入宿主细胞(例 如人宿主细胞)的方法，预防冠状病毒S蛋白与宿主受体结合的方法，以及治疗经常与冠状病毒感染有关的急性的呼吸道疾病的方法。 在一些实施方式中，本文所述的治疗方法和组合物可以与用于治疗或预防冠状病毒感染的其他已知治疗剂和/或方式结合使用。已知 的治疗剂和/或方式包括，例如，核酸酶类似物或蛋白酶抑制剂(例如，瑞德西韦)，针对一种或多种冠状病毒的单克隆抗体，免疫 抑制剂或抗炎药(例如，sarilumab或Tocilizumab)，ACE抑制剂，血管扩张剂或其任何组合。
对于治疗应用，组合物应包含治疗有效量的本文所述的纳米颗粒抗原。对于预防应用，组合物应包含预防有效量的本文所述的纳 米颗粒抗原。可以基于要治疗或预防的特定疾病或病症、受试者的严重程度、年龄以及特定受试者的其他个人属性(例如，受试者健康状况的总体状况和受试者的免疫系统健壮性)来确定适当的抗原量。有效剂量的确定还由动物模型研究指导，随后由人类临床试验 指导，并由可显著减少受试者的目标疾病病症或症状的发生或严重程度的给药方案指导。
对于预防性应用，在任何症状之前，例如在感染之前，提供了抗原性组合物。抗原性组合物的预防性给药用于预防或改善任何随 后的感染。因此，在一些实施方式中，待治疗的受试者是例如由于暴露或可能暴露于病毒(例如SARS-COV-2)而已经感染(例如，SARS-COV-2感染)的受试者或处于感染(例如，SARS-COV-2感染)风险中的受试者。在给予治疗有效量的所公开的治疗组合物之 后，可以监测受试者的感染(例如SARS-COV-2感染)、与感染例如(SARS-COV-2感染)相关的症状或两者。
对于治疗应用，在疾病或感染的症状发作时或之后，例如在感染(例如SARS-COV-2感染)症状发生后或诊断感染后，提供抗 原性组合物。因此，可以在预期暴露于病毒之前提供抗原性组合物，以便在暴露于或怀疑暴露于病毒之后或在实际感染初期之后，减 弱感染和/或相关疾病病症的预期严重性、持续时间或程度。本发明的药物组合物可以与本领域已知的用于治疗或预防相关病原体的 感染(例如SARS-COV-2感染)的其他试剂组合。
包含如本发明所述的新型结构组分的纳米颗粒疫苗组合物(例如SARS-COV-2疫苗)或本发明的药物组合物可以提供作为试剂 盒的组分。任选地，这种试剂盒包括另外的组成，该另外的组成包括包装、使用说明和各种其他试剂，其他试剂例如为缓冲液、底物、抗体或配体，例如对照抗体或配体以及检测试剂。试剂盒中还可以提供有可选的说明书。
实施例
提供以下实施例以举例说明，但不限制本发明。
实施例1 S抗原的稳定化、生产和纯化
本实施例描述了重新设计的稳定和可溶性冠状病毒S三聚体：
I.SARS-CoV:
SARS-CoV S蛋白的序列是从GenBank获得的，其ID为NP_828851。编号基于UniProID P59594的UniProt定义。可溶性S构建 体定义为M1-Q1190。Q1190紧邻以1191YIK1193为基序开始的预测跨膜区域的上游。截短的可溶性S构建体定义为M1-K1131，它不含 HR2。HR2缺失将破坏HR1/HR2融合核心并稳定融合前S结构。S构建体可以在Y1120处进一步截短，并在Y1120处添加3个残基 的“GNS”基序(来自MERS-CoV S)。当显示在纳米颗粒上时，这种修饰将显著提高蛋白质产量。
可通过(a)在HR1和中央螺旋区(CH)之间添加R667G突变和K968P/V969P(或K968G/V969G)双重突变，来获得未切割的、 融合前优化的(UFO)S构建体。尽管R667G突变旨在去除S1/S2切割位点，但已证明K968P/V969P双重突变可稳定融合前S结构。 代替固定化HR1-转向区-CH，K968G/V969G双重突变旨在消除转向区域内的任何应变，从而稳定融合前S结构。
通过将脯氨酸突变(S924P、T925P或A926P)、甘氨酸突变(S924G、T925G或A926G)或其组合引入与HR2相互作用形成融 合核心的区域，可以进一步稳定上述UFO S构建体。这些突变的作用是破坏六螺旋束的融合核心并破坏融合后S的稳定性。其他突 变，例如在区域S924-A926中插入一个或两个残基(例如G或GS)以破坏螺旋形，也会破坏融合后S的稳定性并防止构造变化。
三聚化基序，例如T4纤维蛋白折叠子(PDB ID：4NCV)和病毒衣壳蛋白SHP(PDB：1TD0)，可以进一步添加到上述重新设 计的S构建体的C端，三聚化基序和S构建体的C端之间具有短的GS接头以稳定三聚体。另外，可以将His6-tag添加至三聚化基序 的C端，以利于使用镍柱纯化蛋白质。
重新设计的SARS-CoV UFO S构建体的C端可以与形成纳米颗粒的亚单位(铁蛋白24聚体和两个60聚体，E2p和I3-01)的N 端融合，以使得当在合适的细胞系中表达时，融合构建体可以自组装成纳米颗粒，其中融合前S三聚体显示在纳米颗粒表面。
SARS-CoV可溶性S序列(SEQ ID NO：1)：
MFIFLLFLTLTSGSDLDRCTTFDDVQAPNYTQHTSSMRGVYYPDEIFRSDTLYLTQDLFLPFYSNVTGFHTINHTFGNPVIPFKDGIYFAA TEKSNVVRGWVFGSTMNNKSQSVIIINNSTNVVIRACNFELCDNPFFAVSKPMGTQTHTMIFDNAFNCTFEYISDAFSLDVSEKSGNFK HLREFVFKNKDGFLYVYKGYQPIDVVRDLPSGFNTLKPIFKLPLGINITNFRAILTAFSPAQDIWGTSAAAYFVGYLKPTTFMLKYDENG TITDAVDCSQNPLAELKCSVKSFEIDKGIYQTSNFRVVPSGDVVRFPNITNLCPFGEVFNATKFPSVYAWERKKISNCVADYSVLYNSTF FSTFKCYGVSATKLNDLCFSNVYADSFVVKGDDVRQIAPGQTGVIADYNYKLPDDFMGCVLAWNTRNIDATSTGNYNYKYRYLRHG KLRPFERDISNVPFSPDGKPCTPPALNCYWPLNDYGFYTTTGIGYQPYRVVVLSFELLNAPATVCGPKLSTDLIKNQCVNFNFNGLTGT GVLTPSSKRFQPFQQFGRDVSDFTDSVRDPKTSEILDISPCAFGGVSVITPGTNASSEVAVLYQDVNCTDVSTAIHADQLTPAWRIYSTG NNVFQTQAGCLIGAEHVDTSYECDIPIGAGICASYHTVSLLRSTSQKSIVAYTMSLGADSSIAYSNNTIAIPTNFSISITTEVMPVSMAKTS VDCNMYICGDSTECANLLLQYGSFCTQLNRALSGIAAEQDRNTREVFAQVKQMYKTPTLKYFGGFNFSQILPDPLKPTKRSFIEDLLFN KVTLADAGFMKQYGECLGDINARDLICAQKFNGLTVLPPLLTDDMIAAYTAALVSGTATAGWTFGAGAALQIPFAMQMAYRFNGIG VTQNVLYENQKQIANQFNKAISQIQESLTTTSTALGKLQDVVNQNAQALNTLVKQLSSNFGAISSVLNDILSRLDKVEAEVQIDRLITGR LQSLQTYVTQQLIRAAEIRASANLAATKMSECVLGQSKRVDFCGKGYHLMSFPQAAPHGVVFLHVTYVPSQERNFTTAPAICHEGKAY FPREGVFVFNGTSWFITQRNFFSPQIITTDNTFVSGNCDVVIGIINNTVYDPLQPELDSFKEELDKYFKNHTSPDVDLGDISGINASVVNIQ KEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQ
SARS-CoV可溶性S序列减去N端前导序列(SEQ ID NO：7)：SEQ ID NO：1的残基14-1190。
前导序列(SEQ ID NO：8)：MFIFLLFLTLTSG(SEQ ID NO：1的残基1-13)。
HR2序列(SEQ ID NO：9)：SEQ ID NO：1的残基1132-1190
EELDKYFKNHTSPDVDLGDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQ
进一步的截短的C端序列(SEQ ID NO：10)：
DPLQPELDSFK(SEQ ID NO：1的残基1121-1131)。
II.MERS-CoV:
MERS-CoV S蛋白的序列获自GenBank，其ID为JX869059.2。氨基酸编号基于具有UniPro ID R9UQ53的UniProt定义。
可溶性S构建体定义为M1-Y1291。Y1291紧邻以1292YNK1294为基序开始的预测跨膜区域的上游。截短的可溶性S构建体定义为 M1-S1226，它不含HR2。HR2缺失将破坏HR1/HR2融合核心并稳定融合前S结构。
可以通过添加R748A/R751G双重突变和V1060P/L1061P(或V1060G/L1061G)双重突变来获得未切割、融合前优化的(UFO) S构建体。尽管R748A/R751G双重突变旨在去除S1/S2切割位点，但已证明V1060P/L1061P双重突变可稳定融合前S结构。代替固 定化HR1-转向区-CH，V1060G/L1061G双重突变旨在消除转向区域内的任何应变，从而稳定融合前S结构。
通过将脯氨酸突变(T1013P、T1014P或T1015P)，甘氨酸突变(T1013G、T1014G或T1015G)或其组合引入与HR2相互作用 形成融合核心的HR1区域，可以进一步稳定UFO S构建体。这些突变将破坏六螺旋束融合核心并破坏融合后S的稳定性。其他突变， 例如在区域T1013-T1015中插入一个或两个残基(例如G或GS)以破坏螺旋形，也会破坏融合后S的稳定性并防止构造变化。
三聚化基序，例如T4纤维蛋白折叠子(PDB ID：4NCV)和病毒衣壳蛋白SHP(PDB：1TD0)，可以添加到上述重新设计的 UFO S构建体的C端，三聚化基序和UFO S构建体的C端之间有一个短GS接头以稳定三聚体。可以将His6-tag添加到三聚化基序的 C端，以利于通过镍柱纯化蛋白质。
可以将重新设计的MERS-CoV UFO S构建体的C端与形成纳米颗粒的亚单位的N端融合，以使得当在适当的细胞系中表达时， 融合构建体可以自组装成纳米颗粒，其中融合前S三聚体显示在纳米颗粒表面上。
MERS-CoV可溶性S(SEQ ID NO：2)：
MIHSVFLLMFLLTPTESYVDVGPDSVKSACIEVDIQQTFFDKTWPRPIDVSKADGIIYPQGRTYSNITITYQGLFPYQGDHGDMYVYSAG HATGTTPQKLFVANYSQDVKQFANGFVVRIGAAANSTGTVIISPSTSATIRKIYPAFMLGSSVGNFSDGKMGRFFNHTLVLLPDGCGTL LRAFYCILEPRSGNHCPAGNSYTSFATYHTPATDCSDGNYNRNASLNSFKEYFNLRNCTFMYTYNITEDEILEWFGITQTAQGVHLFSSR YVDLYGGNMFQFATLPVYDTIKYYSIIPHSIRSIQSDRKAWAAFYVYKLQPLTFLLDFSVDGYIRRAIDCGFNDLSQLHCSYESFDVESG VYSVSSFEAKPSGSVVEQAEGVECDFSPLLSGTPPQVYNFKRLVFTNCNYNLTKLLSLFSVNDFTCSQISPAAIASNCYSSLILDYFSYPL SMKSDLSVSSAGPISQFNYKQSFSNPTCLILATVPHNLTTITKPLKYSYINKCSRLLSDDRTEVPQLVNANQYSPCVSIVPSTVWEDGDY YRKQLSPLEGGGWLVASGSTVAMTEQLQMGFGITVQYGTDTNSVCPKLEFANDTKIASQLGNCVEYSLYGVSGRGVFQNCTAVGVR QQRFVYDAYQNLVGYYSDDGNYYCLRACVSVPVSVIYDKETKTHATLFGSVACEHISSTMSQYSRSTRSMLKRRDSTYGPLQTPVGC VLGLVNSSLFVEDCKLPLGQSLCALPDTPSTLTPRSVRSVPGEMRLASIAFNHPIQVDQLNSSYFKLSIPTNFSFGVTQEYIQTTIQKVTVD CKQYVCNGFQKCEQLLREYGQFCSKINQALHGANLRQDDSVRNLFASVKSSQSSPIIPGFGGDFNLTLLEPVSISTGSRSARSAIEDLLFDKVTIADPGYMQGYDDCMQQGPASARDLICAQYVAGYKVLPPLMDVNMEAAYTSSLLGSIAGVGWTAGLSSFAAIPFAQSIFYRLNGV GITQQVLSENQKLIANKFNQALGAMQTGFTTTNEAFQKVQDAVNNNAQALSKLASELSNTFGAISASIGDIIQRLDVLEQDAQIDRLIN GRLTTLNAFVAQQLVRSESAALSAQLAKDKVNECVKAQSKRSGFCGQGTHIVSFVVNAPNGLYFMHVGYYPSNHIEVVSAYGLCDAA NPTNCIAPVNGYFIKTNNTRIVDEWSYTGSSFYAPEPITSLNTKYVAPQVTYQNISTNLPPPLLGNSTGIDFQDELDEFFKNVSTSIPNFGS LTQINTTLLDLTYEMLSLQQVVKALNESYIDLKELGNYTY
MERS-CoV可溶性S序列减去N端前导序列(SEQ ID NO：11)：SEQ ID NO：2的残基18-1291。
前导序列(SEQ ID NO：12)：MIHSVFLLMFLLTPTES(SEQ ID NO：2的残基1-17)。
HR2序列(SEQ ID NO：13)：SEQ ID NO：2的残基1227-1291
TGIDFQDELDEFFKNVSTSIPNFGSLTQINTTLLDLTYEMLSLQQVVKALNESYIDLKELGNYTY
III.SARS-CoV-2:
SARS-CoV-2 S蛋白的序列获自GenBank，ID为MN908947.3。氨基酸编号基于具有PDB ID 6VSB的cryo-EM模型。
可溶性S构建体定义为M1-Q1208。Q1208紧邻以1209YIK1211基序开始的预测跨膜区域的上游。截短的可溶性S构建体定义为 M1-K1149，它不含HR2。HR2缺失将破坏HR1/HR2融合核心并稳定融合前S结构。S构建体可以在Y1138处进一步截短，并在 Y1138上添加3个残基的“GNS”基序(来自MERS-CoV S)。当显示在纳米颗粒上时，这种修饰将显著提高蛋白质产量。
未切割的、融合前优化的(UFO)可溶性S构建体定义为M1-Q1208，其具有修饰的S1/S2切割位点682GSAGSV687(SEQ ID NO： 18)和K986P/V987P(或K986G/V987G)双重突变。SARS-CoV-2在S1/S2切割位点681PRRA684之前具有4-aa插入，这将提高切割 效率。682GSAGSV687(SEQID NO：18)修饰旨在去除S1/S2切割位点，并且已经显示出K986P/V987P双重突变稳定了融合前的S结 构。代替固定化HR1-转向区-CH，K986G/V987G双重突变旨在消除转向区域内的任何应变，从而稳定融合前S结构。
通过将脯氨酸突变(A942P、S943P和A944P)，甘氨酸突变(A942G、S943G和A944G)或其组合引入与HR2相互作用以形成 融合核心的HR1区，可以进一步稳定(b)中的SARS-CoV-2UFO S构建体。这些突变将破坏六螺旋束融合核心并破坏融合后S的稳 定性。其他突变，例如在A942-A944区域插入一个或两个残基(例如G或GS)以破坏螺旋形，也会破坏融合后S的稳定性并防止构 造变化。
三聚化基序，例如T4纤维蛋白折叠子(PDB ID：4NCV)和病毒衣壳蛋白SHP(PDB：1TD0)，可以添加到(b)和(c)中重 新设计的S结构的C端，三聚化基序和重新设计的S结构的C端之间具有短GS接头以稳定三聚体。可以将His6-tag添加到三聚化基 序的C端，以利于通过镍柱纯化蛋白质。
可以将上述重新设计的SARS-CoV-2 UFO S构建体的C端融合到形成纳米颗粒的亚单位的N端，以使得当在适当的细胞系中表 达时，该融合构建体可以自组装成纳米颗粒，其中融合前S三聚体显示在纳米颗粒表面上。
SARS-CoV-2可溶性S(SEQ ID NO：3)：
MFVFLVLLPLVSSQCVNLTTRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLPFFSNVTWFHAIHVSGTNGTKRFDNPVLPFNDG VYFASTEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQSLLIVNNATNVVIKVCEFQFCNDPFLGVYYHKNNKSWMESEFRVYSSANNCTFEYVSQPFLMD LEGKQGNFKNLREFVFKNIDGYFKIYSKHTPINLVRDLPQGFSALEPLVDLPIGINITRFQTLLALHRSYLTPGDSSSGWTAGAAAYYVG YLQPRTFLLKYNENGTITDAVDCALDPLSETKCTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRIS NCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGG NYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKN KCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVSVITPGTNTSNQVAVLYQDVNCTEVPVAIHA DQLTPTWRVYSTGSNVFQTRAGCLIGAEHVNNSYECDIPIGAGICASYQTQTNSPRRARSVASQSIIAYTMSLGAENSVAYSNNSIAIPT NFTISVTTEILPVSMTKTSVDCTMYICGDSTECSNLLLQYGSFCTQLNRALTGIAVEQDKNTQEVFAQVKQIYKTPPIKDFGGFNFSQILP DPSKPSKRSFIEDLLFNKVTLADAGFIKQYGDCLGDIAARDLICAQKFNGLTVLPPLLTDEMIAQYTSALLAGTITSGWTFGAGAALQIP FAMQMAYRFNGIGVTQNVLYENQKLIANQFNSAIGKIQDSLSSTASALGKLQDVVNQNAQALNTLVKQLSSNFGAISSVLNDILSRLD KVEAEVQIDRLITGRLQSLQTYVTQQLIRAAEIRASANLAATKMSECVLGQSKRVDFCGKGYHLMSFPQSAPHGVVFLHVTYVPAQEK NFTTAPAICHDGKAHFPREGVFVSNGTHWFVTQRNFYEPQIITTDNTFVSGNCDVVIGIVNNTVYDPLQPELDSFKEELDKYFKNHTSP DVDLGDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQ
SARS-CoV-2可溶性S序列减去N端前导序列(SEQ ID NO：14)：SEQ ID NO：3的残基14-1208。
前导序列(SEQ ID NO：15)：MFVFLVLLPLVSS(SEQ ID NO：3的残基1-13)。
HR2序列(SEQ ID NO：9)：SEQ ID NO：3的残基1150-1208
EELDKYFKNHTSPDVDLGDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQ
进一步的截短的C端序列(SEQ ID NO：10)：
DPLQPELDSFK(SEQ ID NO：3的残基1121-1131)
实施例2：设计的冠状病毒的RBD结构域
I.基于SARS-CoV RBD的疫苗：
上面指出了SARS-CoV S蛋白的序列和氨基酸编号。在基于RBD的疫苗设计中使用的SARS-CoV RBD定义为P317-D518(请参 见SEQ ID NO：4)。具体地，三聚化基序，病毒衣壳蛋白SHP(PDB：1TD0)可以添加到SARS-CoV RBD的C端，其之间具有短 5GS接头以使RBD稳定在三聚体构造中。可以使用1GS接头将His6-tag添加到三聚化基序的C端，以利于纯化。
SpyTag和SpyCatcher能够以不同组合连接至SARS-CoV RBD和纳米颗粒亚单位，以促进RBD在纳米颗粒上的多价显示。例如， 如果使用5GS接头将RBD的C端融合到SpyTag的N端，则可以使用5GS接头将SpyCatcher的C端融合到纳米颗粒亚单位的N端 以创建一对。可以在这两个构建体中切换SpyTag和SpyCatcher来创建不同的对。SpyTag或SpyCatcher也可以通过5GS接头与RBD 的N端融合。当将两种构建体引入宿主细胞并在宿主细胞中表达时，重组疫苗蛋白将通过SpyTag和SpyCatcher基序之间的结合而形 成。
SARS-CoV RBD(SEQ ID NO：4)
PNITNLCPFGEVFNATKFPSVYAWERKKISNCVADYSVLYNSTFFSTFKCYGVSATKLNDLCFSNVYADSFVVKGDDVRQIAPGQTGVI ADYNYKLPDDFMGCVLAWNTRNIDATSTGNYNYKYRYLRHGKLRPFERDISNVPFSPDGKPCTPPALNCYWPLNDYGFYTTTGIGYQ PYRVVVLSFELLNAPATVCGPKLSTD
SpyTag：VPTIVMVDAYKRYK(SEQ ID NO：16)。
SpyCatcher：SEQ ID NO：17
AMVTTLSGLSGEQGPSGDMTTEEDSATHIKFSKRDEDGRELAGATMELRDSSGKTISTWISDGHVKDFYLYPGKYTFVETAAPDGYEV ATAITFTVNEQGQVTVNGEATKGDAHTAS
II.基于MERS-CoV RBD的疫苗：
上面指出了MERS-CoV S蛋白的序列和氨基酸编号。在基于RBD的疫苗设计中使用的MERS-CoV RBD定义为E382-K587(参 见SEQ ID NO：5)。三聚化基序，病毒衣壳蛋白SHP(PDB：1TD0)可以添加到MERS-CoV RBD的C端，其之间具有短5GS接头 以使RBD稳定在三聚体构造中。可以使用1GS接头将His6-tag添加到三聚化基序的C端，以利于纯化。
SpyTag和SpyCatcher能够以不同组合连接至MERS-CoV RBD和纳米颗粒亚单位，以促进RBD在纳米颗粒上的多价显示。例如， 如果使用5GS接头将RBD的C端融合到SpyTag的N端，则可以使用5GS接头将SpyCatcher的C端融合到纳米颗粒亚单位的N端 以创建一对。可以在这两个构建体中切换SpyTag和SpyCatcher来创建不同的对。SpyTag或SpyCatcher也可以通过5GS接头与RBD 的N端融合。当将两种构建体引入宿主细胞并在宿主细胞中表达时，重组疫苗蛋白将通过SpyTag和SpyCatcher基序之间的结合而形 成。
MERS-CoV RBD(SEQ ID NO：5)
ECDFSPLLSGTPPQVYNFKRLVFTNCNYNLTKLLSLFSVNDFTCSQISPAAIASNCYSSLILDYFSYPLSMKSDLSVSSAGPISQFNYKQSF SNPTCLILATVPHNLTTITKPLKYSYINKCSRLLSDDRTEVPQLVNANQYSPCVSIVPSTVWEDGDYYRKQLSPLEGGGWLVASGSTVA MTEQLQMGFGITVQYGTDTNSVCPK
SpyTag：VPTIVMVDAYKRYK(SEQ ID NO：16)。
SpyCatcher：SEQ ID NO：17：
AMVTTLSGLSGEQGPSGDMTTEEDSATHIKFSKRDEDGRELAGATMELRDSSGKTISTWISDGHVKDFYLYPGKYTFVETAAPDGYEV ATAITFTVNEQGQVTVNGEATKGDAHTAS
III.基于SARS-CoV-2 RBD的疫苗：
上面指出了SARS-CoV-2 S蛋白的序列和氨基酸编号。在基于RBD的疫苗设计中使用的SARS-CoV-2 RBD定义为P330-N532 (请参见SEQ ID NO：6)。三聚化基序，病毒衣壳蛋白SHP(PDB：1TD0)可以添加到SARS-CoV-2 RBD的C端，其之间具有短 5GS接头，以使RBD稳定在三聚体构造中。可以使用1GS接头将His6-tag添加到三聚化基序的C端，以利于纯化。
SpyTag和SpyCatcher能够以不同组合连接至SARS-CoV-2 RBD和纳米颗粒亚单位，以促进RBD在纳米颗粒上的多价显示。例 如，如果使用5GS接头将RBD的C端融合到SpyTag的N端，则可以使用5GS接头将SpyCatcher的C端融合到纳米颗粒亚单位的N 端以创建一对。可以在这两个构建体中切换SpyTag和SpyCatcher来创建不同的对。SpyTag或SpyCatcher也可以通过5GS接头与 RBD的N端融合。当将两种构建体引入宿主细胞并在宿主细胞中表达时，重组疫苗蛋白将通过SpyTag和SpyCatcher基序之间的结合 而形成。
SARS-CoV-2 RBD(SEQ ID NO：6)：
PNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKI ADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQ PYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTN
SpyTag:VPTIVMVDAYKRYK(SEQ ID NO：16)。
SpyCatcher：SEQ ID NO：17：
AMVTTLSGLSGEQGPSGDMTTEEDSATHIKFSKRDEDGRELAGATMELRDSSGKTISTWISDGHVKDFYLYPGKYTFVETAAPDGYEV ATAITFTVNEQGQVTVNGEATKGDAHTAS
实施例3：S三聚体和RBD结构域的生产和纯化
细胞系：所有构建体均在HEK293F细胞和ExpiCHO细胞中表达，ExpiCHO显示出明显更高的产量。
纯化：瞬时表达后，使用包括His6-tag/镍柱和抗原特异性抗体柱在内的三种方法从上清液中纯化S抗原。S230和CR3022抗体 柱可用于纯化SARS-CoV S和RBD抗原以及纳米颗粒。MCA1抗体柱可用于纯化MERS-CoV S和RBD抗原以及纳米颗粒。CR3022 抗体柱可用于纯化SARS-CoV-2 S和RBD抗原以及纳米颗粒。
实施例4：支架式RBD三聚体和呈递RBD的SapNP的合理设计
我们假设，连接至三聚体支架的RBD可以模拟“RBD-up”刺突构造，并诱导NAb阻断ACE2结合。为了检测这种可能性，我们设 计了一种融合构建体，其包含SARS-CoV-1/2 RBD，短的5-aa G4S接头(具有2-aa限制性位点)和三聚体病毒衣壳蛋白SHP (PDB:1TD0)。结构建模表明：三个束缚的RBD形成了一个
Figure BDA0002837439340000251
的三角形(针对L492测量)，分别比SARS-CoV-1“两个RBD-up” 刺突(PDB:6CRX，针对L478进行测量)和MERS-CoV“全RBD-up”刺突(PDB：5X59，针对L506测量)宽14和
Figure BDA0002837439340000252
以允许 NAb进入每个RBD。然后，我们开发了一种免疫亲和色谱(IAC)柱，以促进无标签疫苗的纯化。以前，源于NAb的IAC色谱柱已 用于纯化HIV-1 Env三聚体/NP，丙型肝炎病毒(HCV)E2核心/NP，和埃博拉病毒(EBOV)GP三聚体/NP。据报道，SARS-CoV-1NAb，CR3022可以结合SARS-CoV-2 RBD(Tian等,Emerg.Microbes Infect.9,382-385,2020)。SARS-CoV-2 RBD/CR3022结构揭示 了两个SARS-CoV共有的表位，并暗示了使CR3022与RBD结合的刺突的呼吸运动。在这里，我们检查了IAC列中CR3022的实用 性。SARS-CoV-1/2 RBD-5GS-1TD0构建体在100ml ExpiCHO细胞中瞬时表达，并在CR3022抗体柱上纯化，然后使用Superdex 200 10/300GL柱进行尺寸排阻色谱(SEC)。尽管SARS-CoV-1 RBD构建体在SEC曲线中同时显示了聚集峰(8.6ml)和三聚体峰 (12.7ml)，但SARS-CoV-2 RBD构建体在12.8ml处产生了一个单独的三聚体峰。在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)中，在还原和非还原条件下分别观察到～37kD的单体带和～100kD的三聚体带。在CR3022/SEC纯化后，在酶联免疫吸附 测定(ELISA)中评估了两个支架式RBD三聚体的抗原性。在ELISA中测试了针对SARS-CoV-1(CR3022，m396、80R和S230) 和SARS-CoV-2(B38，CB6，来自SARS幸存者的S309，和P2B-2F6)的RBD特异性NAb。总体而言，对于结合到他们各自的NAb的两个RBD三聚体，观察到了相似的半最大效应浓度(EC50)值。SARS-CoV-1 RBD三聚体比其SARS-CoV-2对应物对 CR3002具有更大的结合亲和力，EC50值相差1.3倍。在SARS-CoV-2NAb中，B38产生了与CR3022相似的EC50值。使用生物层干 涉技术(BLI)测量抗体结合的动力学。总体而言，所有测试的抗体均显示出快速的结合速率，但其解离速率存在明显差异。例如， B38显示出比其他SARS-CoV-2 NAb更快的解离速率，而用于纯化SARS-CoV-1/2 RBD蛋白的抗体CR3022则具有相当的动力学曲线。
然后，我们假设SpyTag/SpyCatcher(或简称SPY)系统可用于将RBD与SApNP偶联，以产生能够引起更有效的NAb响应的多 价RBD疫苗。13-aa SpyTag自发地与SpyCatcher蛋白反应以形成不可逆的异肽键。SPY系统已用于将抗原连接到SApNP和VLP。在 这里，SpyTag与RBD的C端融合，而SpyCatcher与SApNP亚单位的N端融合，两者均使用5-aa G4S接头。此设计首先针对FR进 行测试。我们比较了两种生产策略–RBD-5GS-SpyTag和SpyCatcher-5GS-FR的共表达对(VS)单独表达后的上清液混合物–并在 CR3022色谱柱上进行纯化。在Superose 6 10/300GL柱上通过SEC来分析从50ml ExpiCHO细胞中瞬时转染获得的蛋白质。两种生产 策略均产生对应于SApNP的峰(12ml)。尽管SARS-CoV-2构建体的颗粒产量明显优于其SARS-CoV-1对应物(CR3022/SEC后， 0.6-1.0mg对0.3-0.5mg)，但上清液混合物似乎优于共表达。但是，结果表明：两种策略均可用于在符合良好生产规范(GMP)的中 国仓鼠卵巢(CHO)细胞中产生RBD偶联的SApNP。评估了SEC纯化的RBD-5GS-SPY-5GS-FR SApNP的抗原性。在ELISA中， 呈递RBD的SApNP表现出略微改善的mAb结合性，如较低的EC50值所示。在BLI中，观察到多价显示对抗原性的更明显的影响， 表明显著增加的结合信号和平稳的解离。
通过阴性染色EM对各种RBD SApNP的结构完整性进行了分析。对于SARS-CoV-1，RBD-10GS-FR构建体被包含在内以用于比 较，该构建体产生的SApNP很少。相比而言，RBD-5GS-SPY-5GS-FR构建体产生了具有可见表面修饰的SApNP。对于SARS-CoV-2， 无论哪种生产策略，纯化的RBD-5GS-SPY-5GS-FR SApNP都表现出与形成良好的纳米颗粒相对应的形态。遵循类似的策略，SARS- CoV-1/2RBD也连接至多层的I3-01v9 SApNP(He等,bioRxiv,2020.2008.2022.262634,2020)。尽管产量适中，但在EM中观察到较大 的SApNP。
总之，我们证明了SPY系统在基于RBD的SApNP疫苗的快速开发中的实用性。与两组分RBD SApNP相比，此处介绍的SPY 连接的RBD SApNP在稳定性和可制造性方面可能更具优势。
实施例5：通过最小化亚稳态来合理设计融合前刺突
必须理解SARS-CoV-2刺突亚稳性，并在此基础上设计最优的刺突作为疫苗抗原。我们首先为SARS-CoV-1/2创建了His标记的、 未切割的刺突胞外域(SECTO)构建体，这两者均包含2P突变和与G4S接头的C端融合的三聚化基序(1TD0)。两种构建体在50ml ExpiCHO细胞中瞬时表达，然后在镍柱或CR3022柱上纯化。在Superose 6 10/300GL柱上通过SEC对S2PECTO-5GS-1TD0-His6蛋白 进行了表征。在镍柱纯化之后，两个S2PECTO构建体均显示三聚体峰(～12ml)，左右肩部分别显示了聚集体和二聚体/单体种类。 CR3022纯化产生了一致的三聚体峰和较少的二聚体/单体种类。然后，我们测试了一对含有双重甘氨酸突变的SECTO构建体 (V1060G/L1061G，称为2G)。2G突变对SARS-CoV-1刺突几乎没有影响，但产生了异常的SEC曲线，并且分别通过镍柱和CR3022柱纯化后，均显示没有产出SARS-CoV-2刺突。最后，我们测试了一对不含HR2茎(E1150-Q1208)的S2G变体，称为 S2GΔHR2。HR2茎的缺失恢复了SARS-CoV-2三聚体峰并减少了两个SARS-CoV的聚集体，如CR3022纯化后的SEC曲线所示。
我们假设HR2可能是SARS-CoV峰值亚稳态的关键决定因素。除了ACE2结合和S1分离外，两个相邻刺突的HR1和HR2之间 的相互作用可能还有助于融合前到融合后的过渡。鉴于与SARS-CoV-1相比HR1发生了广泛的突变(总共9个)，我们试图通过两 个HR1交换的刺突构建物检查HR1在SARS-CoV-2刺突亚稳中的作用。有趣的是，虽然HR1交换证明是无效的，但HR2茎的缺失 再次恢复了三聚体峰。因此，S2GΔHR2为SARS-CoV-1/2和其他CoV提供了通用的刺突设计。在300ml的ExpiCHO细胞中的SARS- CoV-2 S2GΔHR2-5GS-1TD0进行的四次独立生产运行产生了几乎相同的SEC曲线，其中，三聚体产量为0.8-1.0mg。蓝原生聚丙烯酰胺凝胶电泳分析(BN-PAGE)证实了S2GΔHR2刺突在所有SEC段中的纯度。评估了新鲜生产的SARS-CoV-2 S2PECTO和S2GΔHR2 刺突的抗原性。在ELISA中，与S2PECTO刺突相比，S2GΔHR2刺突显示出了对五个代表性mAb的较高的亲和力。当针对三个新发现 的NAb，C105和CC12.1/CC12.3进行测试时，两个刺突产生了相似的EC50值。在BLI中，S2GΔHR2刺突在最高浓度下显示出比 S2PECTO刺突更高的结合信号，同时表现出相似的结合动力学。使用NAb P2B-2F6进行刺突纯化产生了更高的三聚体产率，以及在所 有SEC片段中与CR3022柱相似的纯度。
总之，我们证明了HR2茎的缺失可以改善刺突性能，以及S2GΔHR2可提供改善2P突变的更好的刺突抗原。
实施例6：单组分和多层SApNP的合理设计
尽管已证明可以使用SPY系统将三聚体SARS-CoV-2刺突偶联到SApNP，但随机且不可逆的化学连接将导致表面上的不规则显 示，该不规则显示具有未被占据但空间受限的锚固位点。SPY系统可能更适合单个抗原，例如RBD。因此，我们着手使用基因融合 方法来获得单组分、多层、自组装刺突状纳米颗粒的合理设计。
天然SARS-CoV-2病毒粒子在表面上呈递融合前和融合后刺突。我们的疫苗策略旨在开发单组分、多层的SApNP，每个SApNP 向免疫系统呈递8或20个稳定的S2GΔHR2刺突。为了探索这种可能性，我们对S2GΔHR2刺突进行了建模：使用5-aa G4S接头在 FR上对S2GΔHR2刺突进行建模，使用5-aa G4S接头在E2p上对S2GΔHR2刺突进行建模，以及使用10-aa(G4S)2接头在I3-01v9上对 S2GΔHR2刺突进行建模，从而得到直径分别为47.9nm，55.9nm和59.3nm的大SApNP。在400ml ExpiCHO细胞中瞬时表达三个 S2GΔHR2 SApNP构建体，随后在Superose 6 10/300GL柱上通过CR3022和SEC进行纯化。尽管对于FR和E2p SApNP观察到了低 分子量杂质的变化，但对全部三个构建体而言，三个独立的生产运行产生了高度一致的SEC曲线。在CR3022/SEC纯化后，对于 S2GΔHR2-5GS-FR,S2GΔHR2-5GS-E2p-LD4-PADRE(或E2p-L4P),和S2GΔHR2-10GS-I3-01v9-LD7-PADRE(或I3-01v9-L7P)，我们获 得了平均为0.3-0.4mg，0.15-0.25mg和0.3-0.35mg的SApNP。总体而言，就产量、纯度和生产稳定性而言，S2GΔHR2-10GS-I3- 01v9-L7P似乎表现得最好。
CR3022/SEC纯化的SApNP的结构完整性由阴性染色EM表征，其显示了在40-60nm范围内形成良好的颗粒，这与建模是一致 的。刺突可以很容易在SApNP表面被识别。使用同一组mAb/NAb对呈递S2GΔHR2的SApNP的抗原性进行评估。在ELISA中，与 单个刺突相比，三种SApNP表现出与某些但不是全部抗体的略有改善的结合。在BLI中，我们观察到峰结合信号与抗原结合价之间 存在明显的相关性，排名为E2p/I3-01v9>FR>刺突。与24聚体FR相比，在两个60聚体上显示了明显改善的抗体结合。
总之，这些大的VLP大小的SApNP表面具有8或20个刺突，为体内评估提供了有希望的候选疫苗。
实施例7：SARS-CoV-1/2疫苗诱导的结合抗体响应
在BALB/c小鼠中评估了选定的基于SARS-CoV-1/2RBD和基于SARS-CoV-1/2刺突的抗原，以评估疫苗诱导的抗体响应(图 2)。将每组五只小鼠的组以三周的间隔进行四次免疫。除I3-01v9 SApNP用磷酸铝(AP)配制外，所有疫苗抗原均使用水包油乳剂 佐剂AddaVax配制。我们首先在两个SARS-CoV-2 RBD疫苗组中通过半数最大有效稀释度(half maximaleffective dilution，ED50)进 行了所测量的结合抗体响应的纵向分析。该研究的结果如图3所示。不考虑包覆抗原，RBD SApNP(RBD-5GS-SPY-5GS-FR)在第2 周和第5周都比支架式RBD三聚体(RBD-5GS-1TD0)产生了更高的ED50滴度，当RBD被包覆时，RBD SApNP(RBD-5GS-SPY- 5GS-FR)在第8周显示的P值为0.0009。相比于稳定的刺突(S2GΔHR2-5GS-1TD0)，RBDSApNP在第2周，第5周和第8周针对 RBD产生了明显更高的ED50滴度，这证明了强大的“表位聚焦”效应。小鼠血清结合SARS-CoV-1刺突，其中，结合SARS-CoV-1刺 突的ED50滴度低于SARS-CoV-2刺突，但模式相似。然后，我们对由两个SARS-CoV-2刺突、S2PECTO-5GS-1TD0和S2GΔHR2-5GS- 1TD0，以及三个SApNP诱导的结合抗体响应进行了纵向分析，其中，每个SApNP显示8个或20个S2GΔHR2刺突。不考虑包覆抗 原，S2GΔHR2刺突产生的平均ED50滴度比S2PECTO刺突高2-3倍，这表现出更高的抗原性(值得注意的是，为了便于公平比较，针 对各自的刺突来测试来自两个刺突组的小鼠血清)。
取决于包被抗原，三种SApNP表现出不同的时间模式。当使用刺突作为包覆抗原时，I3-01v9组显示出平均ED50滴度随时间稳 定增加。该SApNP在第2周和第8周两个时间点均产生最高的ED50平均滴度，并且在所有时间点均明显优于S2PECTO刺突。较小的 FR表现出相似的时间模式但较低的平均ED50滴度，但这较低的平均ED50滴度仍显着高于S2PECTO组的平均ED50滴度。在这三个 SApNP中，E2p在第2周时记录了最低的平均ED50滴度，在第5周时达到最高的平均ED50滴度，在平均ED50滴度第8周有下降。就 RBD特异性响应而言，根据其平均ED50滴度，这五个组显示出清晰的排名，该排名在各个时间点保持一致。在第2周，I3-01v9引起 的平均ED50滴度为175，而所有其他基于刺突的疫苗组则几乎没有RBD特异性响应。在第5周和第8周，S2GΔHR2引起的ED50滴 度比S2PECTO高(平均高2倍)，而三个SApNP均胜过单个S2GΔHR2刺突，并且ED50滴度的排名与它们的大小相关(FR<E2p<I3- 01v9).尽管水平较低，但是血清仍然与SARS-CoV-1刺突反应。
最后，我们比较了三种SARS-CoV-1疫苗诱导的结合抗体响应，这三种疫苗为S2PECTO刺突(S2PECTO-5GS-1TD0)、支架式 RBD三聚体(RBD-5GS-1TD0)和RBD SApNP(RBD-5GS-SPY-5GS-FR)。基于ED50滴度，SARS-CoV-1 S2PECTO刺突似乎比 SARS-CoV-2 S2GΔHR2刺突更具免疫原性，而SARS-COV-1 RBD SApNP的优势不及SARS-COV-2对应物。在所有三个SARS-CoV- 1疫苗组中均观察到与SARS-CoV-2 S2PECTO刺突的血清反应性。
因此，我们的结果表明：与刺突相比，RBD SApNP可以引发类似或更高水平的RBD特异性抗体滴度。此外，除了具有优异的体 外特性外，S2GΔHR2刺突还比广泛使用的S2PECTO刺突具有更强的抗原性。大的多层E2p和I3-01v9 SApNP在所有基于刺突的疫苗 中表现最好，这与我们先前的HIV-1、HCV和埃博拉疫苗研究中的发现是一致的。
实施例8：SARS-CoV-1/2疫苗诱导的NAb响应
COVID-19疫苗开发的一个主要目标是产生可以抵抗SARS-CoV-2感染的有效的NAb响应。伪颗粒(SARS-CoV-1/2-pp)中和实 验用于评估由不同疫苗候选物引起的血清NAb响应。如图4所示，我们首先对两个SARS-CoV-2 RBD疫苗组中半数最大抑制稀释度 (halfmaximal inhibitory dilution,ID50)进行了所测量的NAb响应的纵向分析。RBD SApNP最早在第2周针对自体同源的SARS- CoV-2引起了低滴度NAb响应，并在随后的两个时间点保留了其优势，这表明接种这种RBD SApNP疫苗后可引起快速的NAb响应。 支架式RBD三聚体组在第5周时显示出最低的平均ID50滴度，但在第8周显示出的NAb响应与稳定的S2GΔHR2刺突诱导的NAb响 应是相当的。在SARS-CoV-1-pp实验中观察到了一些不同的模式。在第一个时间点，第2周，没有疫苗组显示出任何可检测到的异 源NAb响应。在第5周和第8周，与两种基于RBD的疫苗相比，S2GΔHR2刺突引起的SARS-CoV-1 NAb响应更为有效，表明非 RBD表位可能有助于交叉中和。
然后，我们对由五种基于刺突的疫苗诱导的NAb响应进行了纵向分析。在自体同源中和方面，首次注射后第2周，没有基于刺 突的疫苗引起任何SARS-CoV-2-pp NAb响应。但是在第5周和第8周观察到了血清中和的一致模式：目前在人体试验中几乎所有候 选疫苗中使用的S2PECTO刺突在第5周和第8周显示最低的平均ID50滴度，分别为879和2481。新设计的S2GΔHR2刺突比S2PECTO刺突诱导的NAb响应更强，平均ID50滴度高2.8-6.7倍，这证实了2P到2G替代和HR2茎缺失的有益作用；在三个SApNP中，E2p 在第5周表现最佳，显示的ID50平均滴度为8493，比S2PECTO高9.7倍，比S2GΔHR2高1.4倍，而I3-01v9在第8周表现出最有效的NAb响应，ID50滴度平均为17351，比S2PECTO高7倍，比S2GΔHR2高2.5倍。在异源SARS-CoV-1-pp实验中观察到了相似的NAb 响应时间模式。值得注意的是，I3-01v9 SApNP在第2周引发的SARS-CoV-1 NAb响应的平均ID50滴度为351，而所有其他组均未检 测到中和作用。尽管如此，我们的结果表明，基于SARS-CoV-2 S2GΔHR2的疫苗，尤其是SApNP，可以提供针对SARS-CoV-1/2的 保护。最后，我们对三种SARS-CoV-1疫苗诱导的NAb响应进行了纵向分析。在自体同源SARS-CoV-1-pp实验中，与支架式RBD 三聚体相比，S2PECTO刺突和RBD SApNP在第2周和第5周诱导了明显更有效的NAb响应，并且所有三个疫苗组在第8周均显示相 似的ID50滴度。但是，在第2周，第5周和第8周，三种SARS-CoV-1疫苗的异源SARS-CoV-2中和均低于或处于基线水平。
因此，我们的结果证明了S2GΔHR2刺突和S2GΔHR2呈递的SApNP相对于S2PECTO刺突在NAb诱导方面的优势。虽然呈递 SARS-CoV-2 RBD和呈递SARS-CoV-2 S2GΔHR2的SApNP在引发SARS-CoV-2特异性NAb响应方面是相当的，但是呈递SARS- CoV-2 S2GΔHR2的SApNP可针对SARS相关的CoV提供更广泛的保护。
实施例9：T细胞响应和疫苗安全性
虽然需要体液免疫来阻止宿主病毒相互作用并防止病毒感染，但细胞免疫对于消除感染的宿主细胞以控制病毒感染至必需的。新 兴证据表明：早期的T细胞响应以及T细胞记忆，对于防止SARS-CoV-2至关重要。但是，COVID-19疫苗必须诱导CD4+ Th1辅助 细胞(Th1)，但不能诱导Th2型T细胞响应，因为Th2型T细胞已与呼吸道疾病的疫苗相关增强(VAERD)相关联。此外，滤泡 辅助T细胞(Tfh)在NAb的成熟和生产中也起着重要作用。因此，了解T细胞响应对于开发有效且安全的COVID-19疫苗至关重要。
生产干扰素(IFN)-γ的Th1细胞对于产生最佳抗体响应和诱导细胞免疫以清除病毒很重要。当脾脏中已经形成记忆T细胞时， 在第11周至第四次免疫后两周，我们首先检测了各种SARS-CoV-2疫苗制剂对诱导针对刺突蛋白的特异性的CD4+ Th1响应的影响。 使用纯
Figure BDA0002837439340000291
样品作为阴性对照，通过流式细胞术(FC)分析了S2P组和两个SApNP组(E2p和I3-01v9)的小鼠脾细胞。研究 结果如图5所示。在诱导生产IFN-γ的CD4+ Th1细胞的频率方面，I3-01v9分别比S2P和E2p高出约1.5和2.3倍。值得注意的是，在 用各自的抗原再刺激短短4小时后，E2p和I3-01v9组产生的生产CD107a的溶解的CD4+ T细胞的频率是S2P和空白对照组的2倍。 IFN-γ/IL-4(白介素-4)双阳性细胞是记忆CD4+ T细胞，其已获得产生IL-4的能力并同时保留在Th1条件下产生IFN-γ的能力。看起 来I3-01v9诱导的IFN-γ/IL-4双阳性记忆CD4+ T细胞分别比S2P和E2p多3倍和5倍。这些结果表明I3-01v9可以诱导有效的CD4+Th1细胞和IFN-γ/IL-4双阳性记忆CD4+ T细胞。
此外，I3-01v9诱导的IFN-γ/GM-CSF(粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子)双阳性CD8+效应T细胞比S2P和E2p更多，如图5所示。 这些数据表明，在用I3-01v9 SApNP免疫的小鼠中也产生了保护性CD8+ T细胞响应。值得注意的是，源自受I3-01v9免疫的小鼠而非 受S2P和E2p免疫的小鼠的CD8+ T细胞，在受到抗原重新刺激后，具有快速产生IFN-γ的能力，这表明产生了I3-01v9响应性效应子 /记忆T细胞。总之，我们的发现表明S2GΔHR2 I3-01v9SApNP可以在由CD4+ Th1细胞、IFN-γ/IL-4双阳性记忆CD4+ T细胞和CD8+ T细胞组成的小鼠中诱导有效的T细胞响应，因此可提供针对SARS-CoV-2的有效疫苗所需的保护性细胞免疫。
实施例10：一些示例方法
SARS-CoV-2 RBD和刺突抗原的设计、表达和纯化：在优化密码子后，SARS-CoV-1分离株Tor2的刺突(S)基因(GenBank登 录号：NC_004718)和SARS-CoV-2分离株Wuhan-Hu-1的刺突(S)基因(GenBank登录号：MN908947)用于设计所有RBD和刺突 构建体以在哺乳动物细胞中表达。对于SARS-CoV-1和2，RBD序列分别定义为P317-D518和P330-N532。对于SARS-CoV-1和2， SECTO序列分别定义为M1-Q1190和M1-Q1208。为了除去S1/S2切割位点，分别在SARS-CoV-1和2个刺突中引入了R667G突变和 682GSAGSV687(SEQ ID NO：18)修饰。在SARS-CoV-1和2个刺突中分别对K968/V969和K986/V987进行了2P(或2G)突变。从 S2GECTO中移除了包含HR2茎的SARS-CoV-2 C端区域(E1150-Q1208)，从而产生了称为S2GΔHR2的缺失HR2刺突构建体。病毒 衣壳蛋白SHP(PDB：1TD0)用作用于免疫的刺突构建体中的三聚化基序，而来自噬菌体T4纤维蛋白(PDB：1RFO)的折叠子结 构域用于包覆ELISA的刺突抗原以掩盖1TD0衍生的抗体响应。所有构建体均在ExpiCHO细胞(Thermo Fisher)中瞬时表达。简而 言之，将ExpiCHO细胞解冻，并用ExpiCHOTM表达培养基(Thermo Fisher)在摇床培养箱中于37℃，135rpm和8％CO2培养。当 细胞达到10×106ml-1的密度时，添加ExpiCHO TM表达培养基以将细胞密度降低至6×106ml-1以进行转染。按照制造商的说明，准备 将ExpiFectamineTMCHO/质粒DNA复合物在ExpiCHO细胞中进行100ml转染。对于给定的构建体，将100μg质粒和320lExpiFectamineTMCHO试剂在7.7ml冷的OptiPROTM培养基(Thermo Fisher)中混合。在第一天第一次给料后，按照Max Titer规 程在第5天进行额外给料(Thermo Fisher)在33℃、115rpm和8％CO2的摇床培养箱中培养ExpiCHO细胞。转染后13到14天收获 培养上清液，以4000rpm离心25分钟进行澄清，然后使用0.45μm过滤器进行过滤(Thermo Fisher)。CR3022抗体柱用于从上清液 中提取SARS-CoV-1/2抗原，然后在Superdex 200 10/300GL柱(用于支架式RBD三聚体)或Superose 6 10/300GL柱(用于RBD- SPY-NP、刺突和呈递刺突的NP)进行提取。为了进行比较，使用固定化的Ni SepharoseTM Excel柱(GE Healthcare)从上清液中提 取带有His标记的SECTO-5GS-1TD0刺突蛋白，并在SEC前用500mM咪唑洗脱。使用具有理论消光系数的UV280吸光度测定蛋白质浓 度。
蓝原生聚丙烯酰胺凝胶电泳分析：通过蓝原生聚丙烯酰胺凝胶电泳分析(BN-PAGE)来分析SARS-CoV-2刺突和呈递刺突的NP， 并用考马斯亮兰染色。将蛋白质与样品缓冲液和G250负载染料混合，然后添加到4-12％Bis-Tris NativePAGETM凝胶(LifeTechnologies)中。根据制造商的说明，使用NativePAGETM运行缓冲液(Life Technologies)在150V下将BN-PAGE凝胶运行2至 2.5小时。
酶联免疫吸附测定：首先用50μl含0.2g的适当的抗原来涂覆PBSCostarTM 96孔测定板(Corning)的每个孔。将板在4℃下培 养过夜，然后用含有PBS和0.05％(v/v)Tween 20的洗涤缓冲液洗涤五次。然后用150μl封闭缓冲液涂覆每个孔，其中，该150μl 封闭缓冲液由PBS，40mg ml-1印迹级封闭剂(Bio-Rad)和5％(v/v)FBS组成。将板与封闭缓冲液在室温下培养1小时，然后用洗 涤缓冲液洗涤五次。对于抗原结合，将抗体在封闭缓冲液中稀释至最大浓度为5g ml-1，然后进行10倍稀释系列。对于每种抗体稀释 液，总共将50l体积加到适当的孔中。对于小鼠样品分析，将血清或血浆在封闭缓冲液中稀释20倍，然后进行10倍稀释系列。对 于每个样品稀释液，总计将50μl体积加到孔(well)中。每个板在室温下培养1小时，然后用含有0.05％Tween 20的PBS洗涤5次。 然后，对于抗体结合，在洗涤缓冲液(含0.05％Tween 20的PBS)制备1：5000稀释的山羊抗人IgG抗体(Jackson ImmunoResearchLaboratories，Inc)，或对于小鼠样品分析，在洗涤缓冲液(含0.05％Tween 20的PBS)制备1：3000稀释的辣根过氧化物酶(HRP) -标记的山羊抗小鼠IgG抗体，其中，将50μl这种稀释的二级抗体添加到每个孔中。采用二级抗体将板在室温下培养1小时，然后用 含0.05％Tween 20的PBS洗涤5次。最后，用50μl的TMB(Life Sciences)对孔进行显色3-5分钟，然后停止与以50μl的2N硫酸。 在450nm的波长下测量所得的板读数。值得注意的是，第2周血清结合未达到准确测定ED50滴度的稳定水平(或饱和度)。尽管如 此，通过将OD450的下限/上限设置为0.0/3.2可以得出在第2周时的ED50值，以便于在第一时间点比较不同的疫苗组。
生物层干涉法：使用Octet RED96仪器(FortéBio，Pall Life Sciences)测量SARS-CoV-1/2疫苗抗原，RBD对(VS)RBD呈递 NP以及刺突对(VS)刺突呈递NP与一组已知抗体结合的动力学。所有实验均在FortéBio 1x动力学缓冲液中进行，搅拌设置为 1000rpm。所有溶液的最终体积为每孔200μl。在实心黑色96孔板(Geiger Bio-One)中于30℃进行实验。对于除了S2GΔHR2-NP之 外的所有抗原，1x动力学缓冲液中的5μgml-1抗体上样至抗人Fc Capture Biosensors表面(AHC)持续300s。对于S2GΔHR2-NP，使 用抗人Fc定量生物传感器(AHQ)。先应用60s生物传感器基线步骤，然后进行分析生物传感器上的抗体与溶液中抗原的关联分析 持续200s。以如下浓度为起始点：对于支架式RBD三聚体为950nM，对于RBD-5GS-SPY-5GS-FR NP为37nM，对于刺突三聚体为 150nM，对于呈递在FR/E2p/I3-01v9NP上的S2GΔHR2为9/3.5/3.5nM，将抗原的两倍浓度梯度用于六个滴定系列。相互作用的解离被追踪300秒。通过减去记录有抗体但未与抗原一起培养的传感器和没有抗体但已与抗原一起培养的传感器的位移平均值，进行基线 漂移的校正。八位组数据由FortéBio的数据采集软件v.8.1处理。用描述2：1相互作用的结合方程式拟合实验数据，以实现最佳拟合。 值得注意的是，使用AHQ测量S2GΔHR2三聚体结合，以便与呈递S2GΔHR2的NP抗体结合进行比较。
纳米颗粒构建体的电子显微镜(EM)评估：在美国斯克里普斯研究所的核心显微镜实验室进行RBD和呈递S2GΔHR2的NP的 初始EM分析。简而言之，以0.01mg/ml的浓度制备NP样品。将碳涂层的铜网格(400目)辉光放电，将8μL的每个样品吸附2分 钟。多余的样品被芯吸走，并用2％的甲酸铀酰对网格进行2分钟的负染。多余的污渍被芯吸走，并让网格干燥。使用Talos L120C 透射电子显微镜(Thermo Fisher)在80kV下分析样品，并使用CETA 16MCMOS相机采集图像。
动物免疫和样品采集：在我们之前的NP疫苗研究中已经报道了类似的免疫方案。简而言之，在免疫研究中对动物受试者进行了 试验，这遵循了机构动物护理和使用委员会(IACUC)的指南。八周大的BALB/c小鼠购自杰克逊实验室(Jackson Laboratory)，并 按照批准的IACUC协议和AAALAC(实验室动物护理评估和认证协会)的规定，放在斯克里普斯研究所(Scripps Research Institute) 环境受控的房间内的通风笼中国际准则。在第0、3、6和9周，通过腹膜注射路线(ip)用包含50μg疫苗抗原和100μl佐剂， AddaVax或Adju-Phos(InvivoGen)的200μl抗原/佐剂混合物免疫小鼠。每次免疫后两周采血。所有出血均使用肝素化毛细管经眼眶 后窦进入涂有EDTA的管中进行。用等体积的PBS稀释样品，然后将其放在15ml SepMateTM管(STEMCELL Technologies)中的4.5 ml Ficoll上，并在20℃下以1200RPM旋转10分钟以分离血浆和细胞。将血浆在56℃下热灭活30分钟，以1200RPM旋转10分钟， 然后无菌过滤。将细胞在PBS中洗涤一次，然后重悬于1ml的ACK红细胞切割缓冲液(Lonza)中。用PBS洗涤后，将外周血单核 细胞(PBMC)重悬于2ml的Bambanker冷冻培养基(Lymphotec)中。还收获脾脏并用70-μm细胞过滤器(BD Falcon)研磨以将脾 细胞释放到细胞悬液中。将脾细胞离心，在PBS中洗涤，用5ml ACK切割缓冲液(Lonza)处理，并用3mlBambanker冷冻培养基冷 冻。将血清热灭活以用于ELISA结合和假病毒中和实验。
SARS-CoV-1/2伪病毒中和实验：伪颗粒(SARS-CoV-1/2-pp)中和实验用于评估以前报道的抗体的中和活性和疫苗诱导的鼠抗 体响应。SARS-CoV-1/2-pp是通过将HEK293T细胞与HIV-1 pNL4-3.lucR-E-质粒(NIH AIDS试剂程序)以及表达质粒共转染而产生 的，表达质粒用于编码通过脂质体3000(Thermo Fisher Scientific)以4：1的比例混合的SARS-CoV-1分离株Tor2的S基因 (GenBank登录号：NC_004718)和SARS-CoV-2分离株Wuhan-Hu-1的S基因(GenBank登录号：MN908947)。48至72小时后， 通过以4000rpm离心10分钟从上清液中收集SARS-CoV-1/2-pp，分装并在使用前在-80℃保存。起始浓度为0.1-10g/ml的的mAb， 或起始稀释度为100倍的小鼠血清与含有SARS-CoV-1/2-pp的上清液混合，并在白色固体底部96孔板中于37℃培养1小时(康宁)。 在实验中使用3倍稀释系列。HEK293T-hACE2细胞系(目录号：NR-52511)和含有SARS-CoV-2刺突基因的载体pcDNA3.1(-) (目录编号：NR52420)获自BEI RESOURCES，并用于伪病毒中和实验。简而言之，将1x104个HEK293T-hACE2细胞加到每个孔 中，并将板在37℃下培养48小时。培养后，除去上面的培养基，并溶解细胞。根据制造商的说明，使用Bright-Glo荧光素酶测定系 统(Promega)确定来自受感染细胞的萤火虫荧光素酶信号。从具有第5代软件的BioTek酶标仪读取数据，从每个孔中减去一系列未 感染孔的平均背景发光，并使用GraphPad Prism 8.4.3生成中和曲线，其中将孔中的值与以及仅包含SARS-CoV-1/2-pp的孔比较。在 HEK293T细胞中产生了用鼠白血病病毒(MLV)Env基因假型化的相同HIV-1载体，称为MLV-pp，并将其包括在中和试验中作为阴性对照。
树突状细胞(DC)生产：在含有10％胎牛血清和重组小鼠Flt3L(50ng/mL)和SCF(10ng/ml)的RPMI 1640培养基中培养小 鼠骨髓(BM)9天。为了诱导DC活化，将未成熟的DC与脂多糖(LPS，100ng/mL)，R848(Resiquimod，100ng/mL)或CpG (ODN 1585，1μM)培养过夜，从而分别激活Toll样受体(TLR)4，TLR7/8或TLR9信令。收获细胞用于实验。使用FACS细胞分选仪和磁珠(Miltenyi-Biotech，CA)对pDC进行分选，以分离CD11c+B220+细胞。
抗体(Ab)和流式细胞仪分析：用于免疫荧光染色的所有抗体均购自eBioscience(加利福尼亚州圣地亚哥)，BioLegend(加利 福尼亚州圣地亚哥)或BD Biosciences(加利福尼亚州圣何塞)。磁性微珠结合的Ab和抗生蛋白链菌素购自Miltenyi-Biotech(加利 福尼亚州奥本)。重组人IL-2蛋白购自R&D Systems(明尼阿波利斯)。重组小鼠Flt3配体(Flt3L)和小鼠SCF购自Shenandoah Biotech(Warwick,PA)。细胞用适当浓度的mAb染色。使用来自eBioscience(San Diego,CA)的Fixable Viability Dye排除死细胞。 流式细胞仪分析使用LSRII(BD Bioscience，CA)和Canto细胞仪(Becton Dickinson，NJ)进行。在BDFACSAria II(BD Bioscience，CA)上分选细胞。
T细胞培养与活化：将来自免疫小鼠的脾单核细胞在使用或不使用S2P、E2P和I3-01的刺激的树突细胞的存在下，在含有IL-2 (5.0ng/ml)的完全IMDM培养基中培养。16小时后收集细胞用于细胞内细胞因子染色和流式细胞仪分析。
统计：在抗体滴度分析中，使用两尾未配对的学生t检验在GraphPad Prism 8.4.3中进行了不同疫苗组的比较。在T细胞分析中， 均值比较是使用两尾不配对的学生t检验、方差分析和事后t检验进行的。P值小于或等于0.05被认为是显著的。
因此，已经参考上述代表性实施例对本发明进行了广泛的公开和说明。应当理解，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以 对本发明进行各种修改。
还要注意的是，本文引用的所有出版物、序列登录号、专利和专利申请整体地并出于所有目的通过引用明确地并入本文，就好像 每个文献都这样单独表示。在与本公开中的定义相抵触的程度上，排除了包含在通过引用并入的文本中的定义。
序列表
<110> 斯克里普斯研究院
<120> 稳定的冠状病毒刺突S蛋白抗原和相关疫苗
<130> FP200545US-1
<141> 2020-12-15
<150> 63/045,557
<151> 2020-06-29
<160> 40
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1190
<212> PRT
<213> Synthetic sequence
<400> 1
Met Phe Ile Phe Leu Leu Phe Leu Thr Leu Thr Ser Gly Ser Asp Leu
1 5 10 15
Asp Arg Cys Thr Thr Phe Asp Asp Val Gln Ala Pro Asn Tyr Thr Gln
20 25 30
His Thr Ser Ser Met Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Glu Ile Phe Arg
35 40 45
Ser Asp Thr Leu Tyr Leu Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Tyr Ser
50 55 60
Asn Val Thr Gly Phe His Thr Ile Asn His Thr Phe Gly Asn Pro Val
65 70 75 80
Ile Pro Phe Lys Asp Gly Ile Tyr Phe Ala Ala Thr Glu Lys Ser Asn
85 90 95
Val Val Arg Gly Trp Val Phe Gly Ser Thr Met Asn Asn Lys Ser Gln
100 105 110
Ser Val Ile Ile Ile Asn Asn Ser Thr Asn Val Val Ile Arg Ala Cys
115 120 125
Asn Phe Glu Leu Cys Asp Asn Pro Phe Phe Ala Val Ser Lys Pro Met
130 135 140
Gly Thr Gln Thr His Thr Met Ile Phe Asp Asn Ala Phe Asn Cys Thr
145 150 155 160
Phe Glu Tyr Ile Ser Asp Ala Phe Ser Leu Asp Val Ser Glu Lys Ser
165 170 175
Gly Asn Phe Lys His Leu Arg Glu Phe Val Phe Lys Asn Lys Asp Gly
180 185 190
Phe Leu Tyr Val Tyr Lys Gly Tyr Gln Pro Ile Asp Val Val Arg Asp
195 200 205
Leu Pro Ser Gly Phe Asn Thr Leu Lys Pro Ile Phe Lys Leu Pro Leu
210 215 220
Gly Ile Asn Ile Thr Asn Phe Arg Ala Ile Leu Thr Ala Phe Ser Pro
225 230 235 240
Ala Gln Asp Ile Trp Gly Thr Ser Ala Ala Ala Tyr Phe Val Gly Tyr
245 250 255
Leu Lys Pro Thr Thr Phe Met Leu Lys Tyr Asp Glu Asn Gly Thr Ile
260 265 270
Thr Asp Ala Val Asp Cys Ser Gln Asn Pro Leu Ala Glu Leu Lys Cys
275 280 285
Ser Val Lys Ser Phe Glu Ile Asp Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn
290 295 300
Phe Arg Val Val Pro Ser Gly Asp Val Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr
305 310 315 320
Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Lys Phe Pro Ser
325 330 335
Val Tyr Ala Trp Glu Arg Lys Lys Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr
340 345 350
Ser Val Leu Tyr Asn Ser Thr Phe Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly
355 360 365
Val Ser Ala Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Ser Asn Val Tyr Ala
370 375 380
Asp Ser Phe Val Val Lys Gly Asp Asp Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly
385 390 395 400
Gln Thr Gly Val Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe
405 410 415
Met Gly Cys Val Leu Ala Trp Asn Thr Arg Asn Ile Asp Ala Thr Ser
420 425 430
Thr Gly Asn Tyr Asn Tyr Lys Tyr Arg Tyr Leu Arg His Gly Lys Leu
435 440 445
Arg Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Asn Val Pro Phe Ser Pro Asp Gly
450 455 460
Lys Pro Cys Thr Pro Pro Ala Leu Asn Cys Tyr Trp Pro Leu Asn Asp
465 470 475 480
Tyr Gly Phe Tyr Thr Thr Thr Gly Ile Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val
485 490 495
Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu Asn Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly
500 505 510
Pro Lys Leu Ser Thr Asp Leu Ile Lys Asn Gln Cys Val Asn Phe Asn
515 520 525
Phe Asn Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Pro Ser Ser Lys Arg
530 535 540
Phe Gln Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Val Ser Asp Phe Thr Asp
545 550 555 560
Ser Val Arg Asp Pro Lys Thr Ser Glu Ile Leu Asp Ile Ser Pro Cys
565 570 575
Ala Phe Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Ala Ser Ser
580 585 590
Glu Val Ala Val Leu Tyr Gln Asp Val Asn Cys Thr Asp Val Ser Thr
595 600 605
Ala Ile His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Ala Trp Arg Ile Tyr Ser Thr
610 615 620
Gly Asn Asn Val Phe Gln Thr Gln Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala Glu
625 630 635 640
His Val Asp Thr Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile
645 650 655
Cys Ala Ser Tyr His Thr Val Ser Leu Leu Arg Ser Thr Ser Gln Lys
660 665 670
Ser Ile Val Ala Tyr Thr Met Ser Leu Gly Ala Asp Ser Ser Ile Ala
675 680 685
Tyr Ser Asn Asn Thr Ile Ala Ile Pro Thr Asn Phe Ser Ile Ser Ile
690 695 700
Thr Thr Glu Val Met Pro Val Ser Met Ala Lys Thr Ser Val Asp Cys
705 710 715 720
Asn Met Tyr Ile Cys Gly Asp Ser Thr Glu Cys Ala Asn Leu Leu Leu
725 730 735
Gln Tyr Gly Ser Phe Cys Thr Gln Leu Asn Arg Ala Leu Ser Gly Ile
740 745 750
Ala Ala Glu Gln Asp Arg Asn Thr Arg Glu Val Phe Ala Gln Val Lys
755 760 765
Gln Met Tyr Lys Thr Pro Thr Leu Lys Tyr Phe Gly Gly Phe Asn Phe
770 775 780
Ser Gln Ile Leu Pro Asp Pro Leu Lys Pro Thr Lys Arg Ser Phe Ile
785 790 795 800
Glu Asp Leu Leu Phe Asn Lys Val Thr Leu Ala Asp Ala Gly Phe Met
805 810 815
Lys Gln Tyr Gly Glu Cys Leu Gly Asp Ile Asn Ala Arg Asp Leu Ile
820 825 830
Cys Ala Gln Lys Phe Asn Gly Leu Thr Val Leu Pro Pro Leu Leu Thr
835 840 845
Asp Asp Met Ile Ala Ala Tyr Thr Ala Ala Leu Val Ser Gly Thr Ala
850 855 860
Thr Ala Gly Trp Thr Phe Gly Ala Gly Ala Ala Leu Gln Ile Pro Phe
865 870 875 880
Ala Met Gln Met Ala Tyr Arg Phe Asn Gly Ile Gly Val Thr Gln Asn
885 890 895
Val Leu Tyr Glu Asn Gln Lys Gln Ile Ala Asn Gln Phe Asn Lys Ala
900 905 910
Ile Ser Gln Ile Gln Glu Ser Leu Thr Thr Thr Ser Thr Ala Leu Gly
915 920 925
Lys Leu Gln Asp Val Val Asn Gln Asn Ala Gln Ala Leu Asn Thr Leu
930 935 940
Val Lys Gln Leu Ser Ser Asn Phe Gly Ala Ile Ser Ser Val Leu Asn
945 950 955 960
Asp Ile Leu Ser Arg Leu Asp Lys Val Glu Ala Glu Val Gln Ile Asp
965 970 975
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100 105 110
Thr Pro Thr Glu Leu Val Lys Ala Met Lys Leu Gly His Thr Ile Leu
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Lys Leu Phe Pro Gly Glu Val Val Gly Pro Gln Phe Val Lys Ala Met
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Lys Gly Pro Phe Pro Asn Val Lys Phe Val Pro Thr Gly Gly Val Asn
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Leu Asp Asn Val Cys Glu Trp Phe Lys Ala Gly Val Leu Ala Val Gly
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Val Gly Ser Ala Leu Val Lys Gly Thr Ile Ala Glu Val Ala Ala Lys
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Ala Ala Ala Phe Val Glu Lys Ile Arg Gly Cys Thr Glu
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Ser Lys His Thr Ala Pro His Val Thr Leu Met Asp Glu Ala Asp Val
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Thr Lys Leu Val Ala His Arg Lys Lys Phe Lys Ala Ile Ala Ala Glu
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115 120 125
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130 135 140
Ala Arg Asp Gly Lys Leu Thr Pro Gly Glu Met Lys Gly Ala Ser Cys
145 150 155 160
Thr Ile Thr Asn Ile Gly Ser Ala Gly Gly Gln Trp Phe Thr Pro Val
165 170 175
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Lys Pro Ile Val Arg Asp Gly Glu Ile Val Ala Ala Pro Met Leu Ala
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Thr Ser Val Asp Cys Thr Met Tyr Ile Cys Gly Asp Ser Thr Glu Cys
725 730 735
Ser Asn Leu Leu Leu Gln Tyr Gly Ser Phe Cys Thr Gln Leu Asn Arg
740 745 750
Ala Leu Thr Gly Ile Ala Val Glu Gln Asp Lys Asn Thr Gln Glu Val
755 760 765
Phe Ala Gln Val Lys Gln Ile Tyr Lys Thr Pro Pro Ile Lys Asp Phe
770 775 780
Gly Gly Phe Asn Phe Ser Gln Ile Leu Pro Asp Pro Ser Lys Pro Ser
785 790 795 800
Lys Arg Ser Phe Ile Glu Asp Leu Leu Phe Asn Lys Val Thr Leu Ala
805 810 815
Asp Ala Gly Phe Ile Lys Gln Tyr Gly Asp Cys Leu Gly Asp Ile Ala
820 825 830
Ala Arg Asp Leu Ile Cys Ala Gln Lys Phe Asn Gly Leu Thr Val Leu
835 840 845
Pro Pro Leu Leu Thr Asp Glu Met Ile Ala Gln Tyr Thr Ser Ala Leu
850 855 860
Leu Ala Gly Thr Ile Thr Ser Gly Trp Thr Phe Gly Ala Gly Ala Ala
865 870 875 880
Leu Gln Ile Pro Phe Ala Met Gln Met Ala Tyr Arg Phe Asn Gly Ile
885 890 895
Gly Val Thr Gln Asn Val Leu Tyr Glu Asn Gln Lys Leu Ile Ala Asn
900 905 910
Gln Phe Asn Ser Ala Ile Gly Lys Ile Gln Asp Ser Leu Ser Ser Thr
915 920 925
Ala Ser Ala Leu Gly Lys Leu Gln Asp Val Val Asn Gln Asn Ala Gln
930 935 940
Ala Leu Asn Thr Leu Val Lys Gln Leu Ser Ser Asn Phe Gly Ala Ile
945 950 955 960
Ser Ser Val Leu Asn Asp Ile Leu Ser Arg Leu Asp Gly Gly Glu Ala
965 970 975
Glu Val Gln Ile Asp Arg Leu Ile Thr Gly Arg Leu Gln Ser Leu Gln
980 985 990
Thr Tyr Val Thr Gln Gln Leu Ile Arg Ala Ala Glu Ile Arg Ala Ser
995 1000 1005
Ala Asn Leu Ala Ala Thr Lys Met Ser Glu Cys Val Leu Gly Gln Ser
1010 1015 1020
Lys Arg Val Asp Phe Cys Gly Lys Gly Tyr His Leu Met Ser Phe Pro
1025 1030 1035 1040
Gln Ser Ala Pro His Gly Val Val Phe Leu His Val Thr Tyr Val Pro
1045 1050 1055
Ala Gln Glu Lys Asn Phe Thr Thr Ala Pro Ala Ile Cys His Asp Gly
1060 1065 1070
Lys Ala His Phe Pro Arg Glu Gly Val Phe Val Ser Asn Gly Thr His
1075 1080 1085
Trp Phe Val Thr Gln Arg Asn Phe Tyr Glu Pro Gln Ile Ile Thr Thr
1090 1095 1100
Asp Asn Thr Phe Val Ser Gly Asn Cys Asp Val Val Ile Gly Ile Val
1105 1110 1115 1120
Asn Asn Thr Val Tyr Asp Pro Leu Gln Pro Glu Leu Asp Ser Phe Lys
1125 1130 1135
Ala Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Ile Lys Leu Leu Asn Glu Gln
1140 1145 1150
Val Asn Lys Glu Met Gln Ser Ser Asn Leu Tyr Met Ser Met Ser Ser
1155 1160 1165
Trp Cys Tyr Thr His Ser Leu Asp Gly Ala Gly Leu Phe Leu Phe Asp
1170 1175 1180
His Ala Ala Glu Glu Tyr Glu His Ala Lys Lys Leu Ile Ile Phe Leu
1185 1190 1195 1200
Asn Glu Asn Asn Val Pro Val Gln Leu Thr Ser Ile Ser Ala Pro Glu
1205 1210 1215
His Lys Phe Glu Gly Leu Thr Gln Ile Phe Gln Lys Ala Tyr Glu His
1220 1225 1230
Glu Gln His Ile Ser Glu Ser Ile Asn Asn Ile Val Asp His Ala Ile
1235 1240 1245
Lys Ser Lys Asp His Ala Thr Phe Asn Phe Leu Gln Trp Tyr Val Ala
1250 1255 1260
Glu Gln His Glu Glu Glu Val Leu Phe Lys Asp Ile Leu Asp Lys Ile
1265 1270 1275 1280
Glu Leu Ile Gly Asn Glu Asn His Gly Leu Tyr Leu Ala Asp Gln Tyr
1285 1290 1295
Val Lys Gly Ile Ala Lys Ser Arg Lys Ser
1300 1305

Claims (6)

1.一种衍生自SARS-CoV-2的刺突(S)蛋白的工程化抗原多肽，其包含与SEQ ID NO：33中所示的序列具有至少99％同一性的序列；
其中，所述多肽不包含对应于SEQ ID NO:3的氨基酸1150-1208的SARS-CoV-2S蛋白HR2区域；
其中，与SEQ ID NO:3的氨基酸682-687(RRARSV)相对应的S1/S2切割位点序列被SEQID NO:18(GSAGSV)替代；
其中，HR1区域包含与SEQ ID NO:3的K986G和V987G相对应的位置处的双重甘氨酸突变。
2.根据权利要求1所述的抗原多肽，其包含SEQ ID NO：33中所示的序列。
3.一种SARS-CoV-2抗原性组合物，其包含：含有从N端到C端的工程化SARS-CoV-2刺突多肽的多肽序列，其中所述工程化SARS-CoV-2刺突多肽从N端到C端依次包含有：与SEQ IDNO：33中所示的序列具有至少99％同一性的序列、接头序列(G4S)2(SEQ ID NO：22)、SEQ IDNO:23中所示的纳米颗粒序列、SEQ ID NO：29中所示的锁定结构域以及SEQ ID NO：30中所示的T细胞表位；
其中，所述工程化SARS-CoV-2刺突多肽不包含对应于SEQ ID NO:3的氨基酸1150-1208的SARS-CoV-2S蛋白HR2区域；
其中，与SEQ ID NO:3的氨基酸682-687(RRARSV)相对应的S1/S2切割位点序列被SEQID NO:18(GSAGSV)替代；以及
其中，HR1区域包含与SEQ ID NO:3的K986G和V987G相对应的位置处的双重甘氨酸突变。
4.根据权利要求3所述的抗原性组合物，其包含SEQ ID NO：38中所示的序列。
5.一种SARS-CoV-2抗原性组合物，其包含：含有从N端至C端的工程化SARS-CoV-2刺突多肽的多肽序列，其中所述工程化SARS-CoV-2刺突多肽从N端到C端依次包含有：与SEQ IDNO：33中所示的序列具有至少99％同一性的序列、接头序列G4S(SEQ ID NO：21)、SEQ IDNO：24中所示的纳米颗粒亚单位序列、SEQ ID NO：28中所示的锁定结构域以及SEQ ID NO：30中所示的T细胞表位；
其中，所述工程化SARS-CoV-2刺突多肽不包含对应于SEQ ID NO:3的氨基酸1150-1208的SARS-CoV-2S蛋白HR2区域；
其中，与SEQ ID NO:3的氨基酸682-687(RRARSV)相对应的S1/S2切割位点序列被SEQID NO:18(GSAGSV)替代；以及
其中，HR1区域包含与SEQ ID NO:3的K986G和V987G相对应的位置处的双重甘氨酸突变。
6.根据权利要求5所述的抗原性组合物，其包含SEQ ID NO：39中所示的序列。
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