CN114369172A - 一种新型冠状病毒多价抗原、其制备方法和应用 - Google Patents

一种新型冠状病毒多价抗原、其制备方法和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN114369172A
CN114369172A CN202210190442.1A CN202210190442A CN114369172A CN 114369172 A CN114369172 A CN 114369172A CN 202210190442 A CN202210190442 A CN 202210190442A CN 114369172 A CN114369172 A CN 114369172A
Authority
CN
China
Prior art keywords
novel coronavirus
rbd
amino acid
acid sequence
protein
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202210190442.1A
Other languages
English (en)
Inventor
高福
戴连攀
徐坤
高萍
安亚玲
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institute of Microbiology of CAS
Original Assignee
Institute of Microbiology of CAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institute of Microbiology of CAS filed Critical Institute of Microbiology of CAS
Publication of CN114369172A publication Critical patent/CN114369172A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/20011—Coronaviridae
    • C12N2770/20022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/20011—Coronaviridae
    • C12N2770/20034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

本发明涉及一种新型冠状病毒多价抗原、其制备方法和应用。该新型冠状病毒抗原，其氨基酸序列包括：按照(A‑B)‑(A‑B’)样式排列的氨基酸序列或按照(A‑B)‑C‑(A‑B’)样式排列的氨基酸序列，其中：A‑B表示新型冠状病毒的表面刺突蛋白的受体结合区的部分氨基酸序列或全长氨基酸序列，C表示连接氨基酸序列，A‑B’表示A‑B的氨基酸序列经K417N，E484K或N501Y中的一个或多个氨基酸取代获得的氨基酸序列。相对于两个原始毒株RBD蛋白串联重复二聚体，本发明新型冠状病毒多价抗原能够激活广谱保护抗体，对原始毒株以及当前的流行株都起到很好的预防效果。

Description

一种新型冠状病毒多价抗原、其制备方法和应用
交叉引用
本申请要求于2021年3月1日提交的、申请号为202110225584.2、发明名称为“一种新型冠状病毒多价抗原、其制备方法和应用”的发明专利申请的优先权益，其全部内容通过引用并入本文。
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种新型冠状病毒多价抗原、其制备方法和应用。
背景技术
新型冠状病毒肺炎(新冠肺炎，COVID-19)是由新型冠状病毒(新冠病毒，SARS-CoV-2)感染导致。新冠病毒属于冠状病毒科β-冠状病毒属，具有囊膜，是正链 RNA病毒。病毒表面的刺突(spike，S)蛋白负责与宿主细胞的受体ACE2 (Angiotensin-convertingenzyme 2)蛋白识别结合和膜融合，介导病毒入侵，其中S蛋白的受体结合区(RBD)主要负责与ACE2的结合，已有大量研究表明在新冠病毒感染过程中诱导的中和抗体大多靶向RBD，因此RBD是疫苗设计中的重要靶点。
我们前期已经设计了一款新冠肺炎亚单位蛋白疫苗，使用两个串联重复的新冠病毒 RBD形成单链二聚体，在动物实验中显示出很好的免疫原性(Cell,2020,PMID:32645327)，并于2020年6月启动1期临床实验(NCT04445194)，1期和2期临床实验结果显示疫苗可以在人体内诱导较高的中和抗体(2020,medRxiv， doi.org/10.1101/2020.12.20.20248602)，2020年12月启动了乌兹别克斯坦3期临床实验 (NCT04646590)。
当前流行的病毒株出现了一些变异，尤其是一些现有的疫苗已经证明变异株501Y.V2会逃逸其免疫产生的部分中和抗体的作用，降低疫苗的保护效果。因此研发一款具有广谱保护效果的疫苗刻不容缓。
公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
发明内容
发明目的
本发明的目的在于提供一种新型冠状病毒多价抗原、其制备方法和应用。本发明中将两段单体RBD蛋白中的部分或全长氨基酸序列串联，其中一段单体RBD蛋白的部分或全长氨基酸序列是原始毒株序列，另一段单体RBD蛋白的氨基酸序列引入了一个、两个或三个点突变，点突变分别是K417N，E484K和N501Y。相对于两个原始毒株RBD蛋白部分或全长氨基酸序列串联重复二聚体，本发明新型冠状病毒多价抗原能够激活广谱保护抗体，对原始毒株以及当前的流行株都起到很好的预防效果。
解决方案
为实现本发明目的，本发明提供了以下技术方案：
一种新型冠状病毒抗原，其氨基酸序列包括：按照(A-B)-(A-B’)样式排列的氨基酸序列或按照(A-B)-C-(A-B’)样式排列的氨基酸序列，其中：A-B表示新型冠状病毒的表面刺突蛋白的受体结合区的部分氨基酸序列或全长氨基酸序列，所述新型冠状病毒的表面刺突蛋白的受体结合区的部分氨基酸序列至少包括K417，E484或N501中的一个或多个氨基酸，C表示连接氨基酸序列，A-B’表示A-B的氨基酸序列经K417N，E484K或N501Y 中的一个或多个氨基酸取代获得的氨基酸序列。
在一种可能的实现方式中，新型冠状病毒的表面刺突蛋白的受体结合区的部分氨基酸序列至少为新型冠状病毒的表面刺突蛋白的受体结合区的全长氨基酸序列的50％以上、60％以上、70％以上、80％以上、90％以上、95％以上或99％以上。
在一种可能的实现方式中，所述新型冠状病毒的表面刺突蛋白的受体结合区的部分氨基酸序列或全长氨基酸序列为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3。
其中：SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，或SEQ ID NO：3序列均来源于新型冠状病毒的WH01株的S蛋白序列(NCBI上的GenBank：QHR63250)的一部分，分别是新型冠状病毒S蛋白的RBD的R319-S530区域、R319-K537区域、R319-F541区域。
在一种可能的实现方式中，A-B’表示A-B的氨基酸序列同时经K417N，E484K和N501Y取代获得的氨基酸序列。
在一种可能的实现方式中，新型冠状病毒抗原的氨基酸序列为SEQ ID NO:4。
在一种可能的实现方式中，所述连接氨基酸序列包括：(GGS)n连接序列，其中n表示GGS的个数，n为≥1的整数；可选地，n为选自1-10的整数；进一步可选地，n为选自 1-5的整数。GGS三个字母分别表示氨基酸G、G、S。
本发明还提供了一种上述新型冠状病毒抗原的制备方法，包括以下步骤：在编码上述新型冠状病毒抗原的核苷酸序列的5’端加入编码信号肽的序列，3’端加上组氨酸和终止密码子，进行克隆表达，筛选正确的重组子，然后转染表达系统的细胞进行表达，表达后收集细胞上清，纯化得到新型冠状病毒抗原。
在一种可能的实现方式中，所述表达系统的细胞包括为哺乳动物细胞、昆虫细胞、酵母细胞或细菌细胞，可选地；所述哺乳动物细胞包括HEK293T细胞、HEK293F细胞或 CHO细胞，所述细菌细胞包括大肠杆菌细胞。
本发明还提供了一种编码上述新型冠状病毒抗原的核苷酸序列。
在一种可能的实现方式中，所述核苷酸序列为SEQ ID NO:5。
本发明还提供了一种包括上述核苷酸序列的重组载体。
本发明还提供了一种包括上述重组载体的表达系统细胞。
本发明还提供了一种上述新型冠状病毒抗原、上述核苷酸序列、上述重组载体、上述表达系统细胞在制备新型冠状病毒疫苗中的应用。
本发明还提供了一种新型冠状病毒疫苗，包括上述新型冠状病毒抗原和佐剂。
在一种可能的实现方式中，所述佐剂选自铝佐剂、MF59佐剂或类MF59佐剂。
本发明还提供了一种新型冠状病毒DNA疫苗，包括有：包含编码上述新型冠状病毒抗原的DNA序列的重组载体。
本发明还提供了一种新型冠状病毒mRNA疫苗，包括有：包含编码上述新型冠状病毒抗原的mRNA序列的重组载体。
本发明还提供了一种新型冠状病毒病毒载体疫苗，包括有：包含编码上述新型冠状病毒抗原的核苷酸序列的重组病毒载体；可选地，病毒载体选自以下的一种或几种：腺病毒载体、痘病毒载体、流感病毒载体、腺相关病毒载体。
有益效果
(1)本发明中设计了一种新型冠状病毒RBD部分或全长氨基酸序列串联二聚体抗原，其可以不引入任何外源连接序列，其中一个单体RBD蛋白的部分或全长氨基酸序列是原始毒株序列(NCBI上的GenBank：QHR63250)，另一个单体RBD蛋白的氨基酸序列基于原始毒株序列引入了三个点突变，分别是K417N，E484K和N501Y。该新型冠状病毒抗原既可以高效诱导产生针对原始病毒株的免疫反应，也可以高效诱导产生针对变异病毒株的免疫反应。
(2)基于疫苗蛋白两个不同的RBD与B细胞交联反应，该新型冠状病毒抗原可以加强激活两个RBD蛋白保守表位的免疫反应，因此可以提供广谱保护。
附图说明
一个或多个实施例通过与之对应的附图中的图片进行示例性说明，这些示例性说明并不构成对实施例的限定。在这里专用的词“示例性”意为“用作例子、实施例或说明性”。这里作为“示例性”所说明的任何实施例不必解释为优于或好于其它实施例。
图1是本发明实施例2中，在HEK293T细胞中转染表达RBD-tr2-WTV2和RBD-tr2 的质粒，72小时后收集上清和细胞，通过Western blot实验检测目的蛋白表达。
图2是本发明实施例3中，使用HEK293F细胞表达的RBD-tr2-WTV2蛋白的上清经过镍亲和柱纯化目的蛋白，以及通过考马斯亮蓝染色检测RBD-tr2-WTV2蛋白。
图3是本发明实施例3中，将通过镍亲和柱纯化后RBD-tr2-WTV2蛋白进行分子筛层析纯化目的蛋白，以及通过考马斯亮蓝染色检测RBD-tr2-WTV2蛋白。
图4是本发明实施例4中，将纯化后的RBD-tr2-WTV2蛋白与新冠病毒受体人ACE2蛋白结合后，进行分子筛层析纯化RBD-tr2-WTV2与人ACE2蛋白的复合物，以及通过考马斯亮蓝染色进行蛋白检测。
图5是本发明实施例5中，分子筛层析纯化RBD-tr2-WTV2与CB6抗体蛋白的复合物，以及通过考马斯亮蓝染色进行蛋白检测。
图6是本发明实施例5中，将RBD-tr2-WTV2与CB6抗体的复合物继续与人ACE2 蛋白混合，形成RBD-tr2-WTV2、CB06抗体、人ACE2蛋白的复合物，分子筛层析纯化，以及通过考马斯亮蓝染色进行蛋白检测。
图7是本发明实施例6中的二聚体抗原蛋白设计示意图；其中，RBD-tr2为两个原型病毒株的RBD串联成二聚体，RBD-tr2-V2为两个Beta变异株的RBD串联成二聚体， RBD-tr2-WTV2为一个原型病毒株的RBD和一个Beta变异株的RBD串联成嵌合二聚体。
图8是本发明实施例6中，使用293F细胞表达的RBD-tr2、RBD-tr2-V2和 RBD-tr2-WTV2蛋白的上清，通过分子筛层析，以纯化目的蛋白，以及通过考马斯亮蓝染色，以检测目的蛋白。
图9是本发明实施例7中，使用新冠病毒受体蛋白hACE2和5个不同抗体表位的代表性抗体，鉴定抗原蛋白表位；其中，prototype RBD-monomer表示原型病毒株单体RBD 蛋白，Beta RBD-monomer表示Beta变异株单体RBD蛋白，RBD-tr2表示原型病毒株二聚体RBD蛋白，RBD-tr2-V2表示Beta变异株二聚体RBD蛋白，RBD-tr2-WTV2表示原型病毒株RBD与Beta变异株RBD蛋白串联嵌合二聚体蛋白，N/B为不结合。
图10是本发明实施例8中，各个新冠病毒变异株的S蛋白突变位点示意图。
图11显示本发明实施例8中，小鼠第二次免疫后14天采集的血清对新冠病毒原型毒株以及各个新冠病毒变异株的假病毒的中和结果，其中，Sham为阴性对照免疫组， RBD-tr2是原型毒株二聚体RBD蛋白免疫组，RBD-tr2-V2是Beta变异株二聚体RBD蛋白免疫组，RBD-tr2-WTV2是原型毒株RBD与Beta变异株RBD蛋白串联嵌合二聚体蛋白免疫组。
图12为本发明实施例8中，由RBD-tr2、RBD-tr2-V2和RBD-tr2-WTV2免疫小鼠血清对新冠病毒原型毒株以及各个新冠病毒变异株的假病毒的中和抗体滴度几何平均值(GMT)绘制成的雷达图，以分析广谱中和效果。
图13是本发明实施例9中，对各免疫小鼠组分别进行新冠病毒原型毒株或者Beta变异株的活病毒攻毒实验结果；其中，Sham为阴性对照免疫组，RBD-tr2是原型毒株二聚体RBD蛋白免疫组，RBD-tr2-V2是Beta变异株二聚体RBD蛋白免疫组，RBD-tr2-WTV2 是原型毒株-Beta变异株嵌合RBD二聚体蛋白免疫组；并且，其中，A-C是SARS-CoV-2 原型毒株的攻毒结果，D-F是SARS-CoV-2Beta变异株的攻毒结果，A和D是攻毒后第5 天检测小鼠肺组织的基因组RNA(gRNA)载量，B和E是攻毒后第5天检测小鼠肺组织的亚基因组RNA(sgRNA)载量，C和F是小鼠免疫后的中和抗体滴度与攻毒后的病毒 gRNA载量的相关性分析，G图是攻毒后每组小鼠的代表性肺组织HE染色病理图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
另外，为了更好的说明本发明，在下文的具体实施方式中给出了众多的具体细节。本领域技术人员应当理解，没有某些具体细节，本发明同样可以实施。在一些实施例中，对于本领域技术人员熟知的原料、元件、方法、手段等未作详细描述，以便于凸显本发明的主旨。
除非另有其它明确表示，否则在整个说明书和权利要求书中，术语“包括”或其变换如“包含”或“包括有”等等将被理解为包括所陈述的元件或组成部分，而并未排除其它元件或其它组成部分。
实施例1：新冠病毒广谱保护疫苗RBD-tr2-WTV2的设计
新冠病毒变异株分析：在2020年1月和2月即出现了新冠病毒S蛋白D614G突变，2020年6月D614G突变体病毒株成为了全球的主要流行株，通过细胞和动物实验表明 D614G突变增强了病毒的感染和传播能力，与原始毒株相比，D614G新冠病毒的感染不会增强致病性。2020年12月，出现了新的变异株501Y.V1(也叫VOC-202012/01，属于B.1.1.7lineage)，与原始毒株相比具有23个突变，在S蛋白中可能影响较大的3个突变是N501Y,69-70del(删除)和P681H，其中N501Y突变使得S蛋白与受体ACE2蛋白的结合能力增强，501Y.V1具有更强的传播能力，但没有增强致病性。同样在2020年 12月，报道了新的突变株501Y.V2(B.1.351lineage)，在501Y.V2变异株很快替换其它株系称为主要流行株，研究发现501Y.V2感染会导致更高的病毒载量，这表明可能会增加传播能力。501Y.V2在S蛋白上的突变包括：D80A,L242del,A243del,L244del, R246I,K417N,E484K,N501Y,D614G,A701V。501Y.V2后也被命名为Beta变异株。
我们前期基于新冠病毒RBD设计了亚单位蛋白疫苗，新冠病毒变异株中位于RBD以外的突变位点不会影响前期疫苗的效果，因此我们主要对各变异株的RBD突变位点进行优化。经过分析发现，当前的变异株RBD突变主要集中在K417N,E484K,N501Y。
RBD-tr2为两个完全相同的新冠病毒RBD串联重复二聚体 (R319-K537-R319-K537)，我们以此为基础，将其中的一个RBD序列进行K417N,E484K, N501Y突变，另一个RBD序列维持不变，以此得到的二聚体为RBD-tr2-WTV2。 RBD-tr2-WTV2既可以高效诱导产生针对原始病毒株的免疫反应，也可以高效诱导产生针对变异病毒株的免疫反应，此外，RBD-tr2-WTV2蛋白还可以加强激活其中两个RBD 蛋白保守表位的抗体反应，因此可以提供更加广谱的保护。
实施例2：Western blot检测蛋白表达
设计的RBD-tr2-WTV2抗原的氨基酸序列为SEQ ID NO：4(序列中未给出信号肽和组氨酸序列)，表达该抗原的核苷酸序列为SEQ ID NO：5，核苷酸序列从N端至C端的元件依次是(1)Kozak序列gccacc；(2)编码MERS-S蛋白信号肽的序列： MIHSVFLLMFLLTPTES(SEQID NO：6)；(3)新冠病毒(NCBI上的GenBank： QHR63250)S蛋白RBD(R319-K537)；(4)新冠病毒(NCBI上的GenBank：QHR63250) S蛋白RBD(R319-K537)，其中含有三个点突变分别是K417N,E484K,N501Y；(5)6 个组氨酸；(6)终止密码子。将该基因序列在苏州金唯智公司进行合成，并通过EcoRI 和XhoI酶切位点克隆到pCAGGS质粒，获得pCAGGS-RBD-tr2-WTV2质粒。
将表达RBD-tr2-WTV2的pCAGGS质粒转染HEK293T细胞，同时转染表达RBD-tr2 的pCAGGS质粒作为阳性对照，将只加入转染试剂的做为阴性对照。72小时后分别收获细胞和培养上清，通过Western blot检测目的蛋白的表达。前期课题组将新冠病毒RBD蛋白免疫兔制备了兔抗新冠RBD多克隆抗体，Western blot实验中加入兔抗新冠RBD蛋白多克隆抗体作为一抗，将偶联HRP的羊抗兔抗体作为二抗(Proteintech,SA00001-2)。 Western blot检测结果如图1所示，说明蛋白已经正常表达，且可以分泌到细胞外。
实施例3：RBD-tr2-WTV2的表达纯化
使用适合做大量表达蛋白的HEK293F细胞表达RBD-tr2-WTV2抗原：将质粒pCAGGS-RBD-tr2-WTV2转染HEK293F细胞，5天后收集上清，离心去除沉淀再通过0.22 μm的滤膜过滤，进一步除去杂质。将细胞上清在4℃通过镍亲和柱(Histrap,GE Healthcare)吸附，用缓冲液A(20mM Tris,150mM NaCl,pH 8.0)洗涤，除去非特异结合蛋白。然后用缓冲液B(20mM Tris,150mM NaCl,pH 8.0,1000mM咪唑)将目的蛋白从 Histrap上梯度洗脱下来，依次将缓冲液B的比例设置为，2％、5％、10％、20％、30％、 50％、100％，结果见图2。将10％咪唑对应的洗脱蛋白溶液用10kD浓缩管浓缩，换液 30倍以上，至缓冲液A终体积小于1ml。再通过HiloadTM16/600SuperdexTM200pg柱子(GE Healthcare)进行分子筛层析进一步纯化目的蛋白。分子筛层析缓冲液为PBS缓冲液(8 mM Na2HPO4,136mM NaCl,2mM KH2PO4,2.6mMKCl,pH 7.2)。经过分子筛层析， RBD-tr2-WTV2在80ml左右均有一个洗脱峰(图3)，进行SDS-PAGE分析，显示非还原(不加DTT)和还原(加DTT)条件下蛋白都是62KD左右，为单链二聚体(单体的大小为31KD)。由此表明RBD-tr2-WTV2能够正确的折叠和分泌出来，且通过纯化能够获得高纯度的抗原蛋白。
实施例4：RBD-tr2-WTV2与受体人ACE2蛋白的结合能力检测
将RBD-tr2-WTV2蛋白与人ACE2蛋白混合，在4℃条件孵育8小时。然后通过SuperdexTM200 Increase 10/300GL柱子(GE Healthcare)进行分子筛层析，纯化 RBD-tr2-WTV2与人ACE2蛋白的复合物。由图4可见，在11ml左右对应的洗脱峰为 RBD-tr2-WTV2结合人ACE2蛋白复合物，15ml左右对应的洗脱峰为RBD-tr2-WTV2蛋白，说明RBD-tr2-WTV2可以与人ACE2蛋白结合，证明RBD-tr2-WTV2的构象是正确的。
实施例5：RBD-tr2-WTV2表位分析
我们通过CB6抗体和人ACE2受体的结合实验对RBD-tr2-WTV2的表位进行分析，CB6抗体可以结合原始分离的新冠病毒RBD(PMID:32454512)，因此我们使用 CB6抗体与RBD-tr2-WTV2进行结合实验。将0.5mg浓度为5.9mg/ml的RBD-tr2-WTV2 蛋白与1mg浓度为15.4mg/ml的CB6抗体蛋白混合，在4℃条件孵育4小时。然后通过 SuperdexTM200 Increase10/300GL柱子(GE Healthcare)进行分子筛层析(pH8.0)，纯化RBD-tr2-WTV2与CB6抗体蛋白的复合物，结果如图5所示，说明RBD-tr2-WTV2与CB6 抗体可以结合。
为进一步确定在RBD-tr2-WTV2与CB6抗体复合物中，RBD-tr2-WTV2中的突变体RBD(K417N,E484K,N501Y)是否已经与CB6抗体结合，我们将0.4mg浓度为0.7mg/ml 的RBD-tr2-WTV2和CB6抗体复合物与0.5mg浓度为15.3mg/ml的人ACE2蛋白混合,在 4℃条件孵育4小时。然后通过SuperdexTM200 Increase 10/300GL柱子(GE Healthcare) 进行分子筛层析(pH8.0)，结果如图6所示，说明RBD-tr2-WTV2与CB6抗体的复合物仍可以与人ACE2蛋白结合，这表明RBD-tr2-WTV2蛋白中的野生型RBD与CB6抗体结合在一起，突变体RBD没有与CB6结合，在加入人ACE2蛋白后，突变体RBD与人ACE2 蛋白结合在一起，形成RBD-tr2-WTV2与CB6抗体与人ACE2受体复合物，这个结果可以表明：RBD-WTV2的构象是符合预期的，其中的野生型RBD仍可以与CB6结合，突变体RBD已被正确突变，在该结合实验中显示不能与CB6抗体结合，但是突变体RBD 可以与受体人ACE2蛋白结合，表明蛋白构象是正确的。
这些结果表明RBD-WTV2可以作为疫苗使用，激活广谱免疫反应的产生。
实施例6：同型RBD二聚体蛋白和嵌合RBD二聚体蛋白的设计及制备
为了进一步在动物体内验证嵌合RBD二聚体蛋白RBD-tr2-WTV2是否比同型二聚体RBD蛋白具有更好的免疫效果，发明人设计了三种二聚体蛋白，分别是：(1)RBD-tr2，其为由两个原型病毒株的RBD串联而成的二聚体；(2)RBD-tr2-V2，其为由两个Beta变异株的RBD串联而成的二聚体；(3)RBD-tr2-WTV2，其为由一个原型病毒株的RBD和一个Beta变异株的RBD串联而成的嵌合二聚体；各二聚体蛋白的结构设计示意图如图7 所示。
将RBD-tr2蛋白、RBD-tr2-V2蛋白和RBD-tr2-WTV2蛋白均使用293F细胞进行表达。具体程序如下：采用质粒pCAGGS-RBD-tr2、质粒pCAGGS-RBD-tr2-V2和质粒 pCAGGS-RBD-tr2-WTV2分别转染293F细胞，5天后收集上清，离心，去除沉淀，再通过0.22μm的滤膜过滤，进一步除去杂质。将细胞上清在4℃、通过镍亲和柱(Histrap,GE Healthcare)吸附，用缓冲液A(20mM Tris,150mM NaCl,pH 8.0)洗涤，以除去非特异结合蛋白；然后用缓冲液B(20mMTris,150mM NaCl,pH 8.0,1000mM咪唑)洗柱，以将目的蛋白从Histrap上梯度洗脱下来，对应的洗脱蛋白溶液用10kDa浓缩管浓缩，换液30 倍以上，至缓冲液A终体积小于1ml；再通过HiloadTM16/600SuperdexTM200pg柱(GE Healthcare)进行分子筛层析，以进一步纯化目的蛋白。分子筛层析缓冲液为PBS缓冲液 (8mM Na2HPO4,136mM NaCl,2mM KH2PO4,2.6mM KCl,pH 7.2)。经过分子筛层析，收集洗脱峰对应的蛋白液，并进行SDS-PAGE分析，结果见图8；图8显示，蛋白大小在62kDa左右，证明其为单链RBD二聚体(单体RBD的大小为31kDa左右)。由此得到纯化后的RBD-tr2蛋白、RBD-tr2-V2蛋白和RBD-tr2-WTV2蛋白。
实施例7：抗原表位鉴定
发明人通过表面等离子共振技术(Surface Plasmon Resonance，SPR)鉴定抗原蛋白的RBD结合基序(RBM)以及主要的中和抗体表位的暴露，并检测抗原蛋白对新冠病毒的人受体——人血管紧张素转换酶(hACE2)的亲和力，以及对具有代表性的、靶向 SARS-CoV-2RBD中的5个不同表位的单克隆抗体CB6(该抗体的具体信息请参见A human neutralizingantibody targets the receptor-binding site of SARS-CoV-2.Nature,2020, PMID:32454512)、CV07-270(该抗体的具体信息请参见A Therapeutic Non-self-reactiveSARS-CoV-2Antibody Protects from Lung Pathology in a COVID-19HamsterModel.Cell, 2020,PMID:33058755)、C110(该抗体的具体信息请参见SARS-CoV-2neutralizing antibody structures inform therapeutic strategies.Nature,2020,PMID:33045718)、S309(该抗体的具体信息请参见Cross-neutralization of SARS-CoV-2by a human monoclonal SARS-CoV antibody.Nature,2020,PMID:32422645)和CR3022(该抗体的具体信息请参见A highly conserved cryptic epitope in the receptorbinding domains of SARS-CoV-2and SARS-CoV.Science,2020,PMID:32245784)的Fab蛋白的亲和力，hACE2受体和5个单克隆抗体结合RBD的表位见图9。
亲和力测试实验中，除了测试二聚体蛋白RBD-tr2、RBD-tr2-V2、RBD-tr2-WTV2 的亲和力外，还测试了原型株单体RBD蛋白和Beta变异株单体RBD蛋白的亲和力，以作为对照。
亲和力测试方法：本测试是使用BIAcore8000(GE Healthcare)仪器进行操作的。测试前，将目的抗原蛋白换液到PBS-T缓冲液(10mM Na2HPO4，2mM KH2PO4,pH 7.4，137mMNaCl，2.7mM KCl，0.005％Tween 20)中。首先，利用氨基偶联的方法将抗原蛋白固定到CM5芯片上，目标响应值约为1000RU；然后，倍比稀释抗体Fab蛋白，稀释液作为流动相，以30mL/min的速度依次流过固定的抗原蛋白，得到不同的实时结合响应信号，收集的数据使用BIAevaluation Version 4.1(GE Healthcare)软件、按照1:1结合模型进行计算，最终得到抗原蛋白与抗体结合的亲和力。
结果显示：所有的抗原蛋白都与hACE2具有相似的亲和力，KD值在1.13-2.66nM 范围(见图9下图)。在与单抗的亲和力方面，单体和二聚体形式的Beta RBD丧失了结合CB6抗体的结合活性；相比原型株单体RBD蛋白对CV07-270和C110的亲和力，单体和二聚体形式的Beta RBD对CV07-270和C110的亲和力降低了100倍以上，这证实：Beta 变异株会逃逸一些原型毒株感染或者以原型毒株序列设计的疫苗诱导所产生的抗体反应。作为对比，嵌合RBD二聚体抗原RBD-tr2-WTV2维持了对所有检测单抗的亲和力(见图9下图)，表明：嵌合抗原的设计可以很好地暴露受体结合位点以及展示了主要的中和抗体表位构象。
实施例8：检测RBD-tr2-WTV2疫苗诱导的体液免疫反应
为了检测RBD-tr2-WTV2疫苗所诱导的抗体反应，发明人使用上述各二聚体RBD抗原疫苗免疫BALB/c小鼠，实验分组如下：(1)原型株RBD二聚体RBD-tr2免疫组；(2) BetaRBD二聚体RBD-tr2-V2免疫组；(3)原型株+Beta株嵌合RBD二聚体RBD-tr2-WTV2 免疫组；(4)Sham组，为PBS溶液。
对于各实验组，将各二聚体抗原蛋白与Addavax佐剂混合，以制备疫苗；Sham组为PBS溶液与Addavax佐剂混合，以制备疫苗对照。实验小鼠共免疫2次，两次免疫间隔 21天进行，每剂含0.5μg抗原蛋白，后腿肌肉注射。第二次免疫后第14天采集小鼠血液，使用新冠病毒假病毒，分别检测小鼠血清对新冠病毒原型毒株和变异株的假病毒的 50％假病毒中和滴度(pVNT50)，其中变异株包括Alpha(B.1.1.7)、Beta(B.1.351)、Gamma (P.1)、Delta(B.1.617.2)、Delta plus(S蛋白突变位点同B.1.617.2，加上K417N)、Kappa (B.1.617.1)、Lambda(C.37)和Omicron(B.1.1.529)变异株，各变异株相对于原型毒株的突变位点见图10。
本实施例中使用的新冠病毒假病毒为基于水疱性口炎病毒(VSV)骨架制备的展示新冠病毒S蛋白的假病毒，制备方法参见本课题组已经公开发表论文的方法部分(Effectsof a Prolonged Booster Interval on Neutralization of Omicron Variant,N Engl JMed,2022, PMID:35081296)。
检测新冠病毒假病毒(以下简称假病毒)中和抗体滴度的方法如下：在96孔板中，将免疫小鼠血清按2倍梯度倍比稀释，然后与假病毒分别混合，空白培养基也与假病毒混合作为对照，37℃孵育1小时。将免疫血清-假病毒混合液转移至已铺满Vero细胞的 96孔板中。15小时后，通过CQ1共聚焦细胞成像仪(Yokogawa)计算阳性细胞数值，然后在GraphPadPrism软件中绘制拟合曲线，计算50％中和时对应的血清稀释度的倒数，即为50％假病毒中和滴度pVNT50。假病毒中和抗体滴度检测结果如图11所示。
由图11可见：
1)对于原型株RBD二聚体疫苗RBD-tr2，其对展示原型毒株S蛋白假病毒的中和抗体滴度的几何平均值(GMT)是1779，但是对部分变异株的中和效果有所下降，包括Beta(GMT，487)，Gamma(GMT，699)等，对当前流行的Delta和Omicron变异株GMT 是1100和122，对Omicron变异株下降倍数较高。
2)对于Beta RBD二聚体疫苗RBD-tr2-V2，其对Beta和Gamma变异株S蛋白假病毒的中和抗体滴度较高，分别是809和1650，但是对原型毒株和其它变异株的中和活性不高，GMT范围在104-385，其中对当前流行的Delta和Omicron变异株GMT是104和136。
3)对于原型株+Beta株嵌合RBD二聚体疫苗RBD-tr2-WTV2，其诱导了较为平衡的抗体反应，其中对当前流行的Delta和Omicron变异株GMT是1140和434，均优于RBD-tr2 和RBD-tr2-V2，对原型毒株和其它变异株也都维持了较高的中和滴度。
使用图11的中和抗体滴度GMT值做成雷达图，结果如图12所示；通过比较三种抗原蛋白疫苗对各个假病毒的中和抗体滴度GMT发现，RBD-tr2-WTV2对原型毒株、Beta 变异株、Gamma变异株、Delta变异株、Delta+变异株、Kappa变异株、Lambda变异株和 Omicron变异株的中和能力是最高的，尤其是在当前流行的Delta和Omicron变异株， RBD-tr2-WTV2显示出更好的效果。
综上，可得出：与同型的RBD二聚体蛋白疫苗(RBD-tr2和RBD-tr2-V2)相比，嵌合RBD二聚体疫苗RBD-tr2-WTV2诱导的抗体反应对各个变异株的假病毒中和活性更加均衡，均维持较高滴度，具有较好的广谱性。
实施例9：新冠病毒活病毒攻毒实验以验证RBD-tr2-WTV2疫苗效果
为了进一步探索嵌合RBD二聚体疫苗——RBD-tr2-WTV2的保护效果，对上述每个实验组中的8只小鼠分别进行了SARS-CoV-2攻毒实验。
由于BALB/c小鼠ACE2与原型株新冠病毒S蛋白结合的亲和力低，因此BALB/c 小鼠对原型新冠病毒不易感，但S蛋白的N501Y突变可提高S蛋白与小鼠ACE2的亲和力，鉴于Beta变异株含有N501Y突变，因此BALB/c小鼠对Beta变异株易感。
对每个实验组中的四只小鼠进行新冠病毒原型毒株的攻毒实验，同时对每个实验组中的另外四只小鼠进行新冠病毒Beta变异株的攻毒实验。原型毒株新冠病毒的攻毒实验方法如下：采用滴鼻转导8×109vp腺病毒Ad5-hACE2，瞬时表达hACE2的模型，在转导Ad5-hACE2五天后，经滴鼻感染5×105TCID50原型毒株新冠病毒 (hCoV-19/China/CAS-B001/2020毒株)。Beta变异株(GDPCC-nCoV84株)的攻毒实验方法如下：小鼠直接通过滴鼻感染1×106TCID50新冠病毒Beta变异株 (GDPCC-nCoV84株)。
在新冠病毒原型毒株或Beta变异株感染后第5天，对小鼠实施安乐死并进行解剖；每只小鼠取出肺，分成2份：一份加入DMEM培养基后进行匀浆研磨，提取病毒核酸，使用qRT-PCR方法对病毒的病毒基因组gRNA和亚基因组sgRNA进行定量，gRNA代表了全部病毒核酸，sgRNA代表的正在复制过程的病毒核酸，是病毒复制水平的指标；另一份经多聚甲醛固定后，进行苏木精和伊红(H&E)染色染色，观察组织病理。
检测病毒gRNA和sgRNA的方法是：小鼠肺组织匀浆后，取140μL的组织匀浆上清液使用病毒RNA提取试剂盒QIAamp Viral RNA Mini Kit(GIAGEN公司，cat.no. 52906)提取病毒RNA。在CFX96 Touch real-time PCR检测系统(Bio-Rad,USA)上使用 FastKing一步探针RT-qPCR试剂盒(天根生物，中国)，按照试剂盒说明的步骤进行 SARS-CoV-2特异性定量逆转录PCR(qRT-PCR)检测。采用两组引物和探针分别检测 SARS-CoV-2病毒基因组gRNA和sgRNA。
检测SARS-CoV-2病毒gRNA的引物探针序列如下：
F,GACCCCAAAATCAGCGAAAT(SEQ ID NO：7)；
R,TCTGGTTACTGCCAGTTGAATCTG(SEQ ID NO：8)；
probe,FAM-ACCCCGCATTACGTTTGGTGGACC(SEQ ID NO：9)-TAMRA。
检测SARS-CoV-2病毒sgRNA的引物探针序列如下：
sgRNA-F,CGATCTCTTGTAGATCTGTTCTC(SEQ ID NO：10)；
sgRNA-R,ATATTGCAGCAGTACGCACACA(SEQ ID NO：11)；
sgRNA-probe,FAM-ACACTAGCCATCCTTACTGCGCTTCG(SEQ ID NO：12) -TAMRA。
攻毒实验的检测结果如图13所示；由图13可见，对于用新冠病毒原型毒株攻毒的小鼠，对照组小鼠检测到高水平的gRNA(均值：1.72×109拷贝/g)和sgRNA(均值： 1.9×108拷贝/g)(图13A和13B)，相比之下，在疫苗免疫后的小鼠中检测到的病毒载量(包括gRNA和sgRNA)均显著降低，其中RBD-tr2、RBD-tr2-V2和RBD-tr2-WTV2 免疫组的肺组织gRNA平均值分别为4.61×105拷贝/g、2.58×106拷贝/g和2.66×105拷贝/g，显示：这三种疫苗中，抑制新冠病毒原型毒株效果最好的是RBD-tr2-WTV2，其与RBD-tr2-V2组具有显著性差异。此外，所有疫苗组均未检测到肺组织病毒sgRNA，表明它们完全抑制了病毒复制(图13B)。将每只小鼠的对新冠病毒原型毒株的假病毒的中和抗体滴度与攻毒后对应的肺组织病毒gRNA基于线性模型进行相关性分析，可以看到中和抗体滴度与攻毒后肺组织中新冠病毒原型毒株gRNA的相关性较高(r＝ -0.8967，P<0.0001)，表明：中和抗体滴度越高，抑制病毒的效果越明显(图13C)。
对于用新冠病毒Beta变异株攻毒的小鼠，对照组小鼠检测到高水平的gRNA(均值：4.01×108拷贝/g)和sgRNA(均值：3.03×107拷贝/g)(图13D和13E)，相比之下，在疫苗免疫后的小鼠中检测到的病毒载量(包括gRNA和sgRNA)均显著降低，其中RBD-tr2、RBD-tr2-V2和RBD-tr2-WTV2免疫组的肺组织gRNA平均值分别为6.34×106拷贝/g、5.46×105copies/g拷贝/g和9.81×104拷贝/g，表明：这三种疫苗中抑制新冠病毒Beta变异株效果最好的是RBD-tr2-WTV2，其与RBD-tr2组具有显著性差异； RBD-tr2-V2和RBD-tr2-WTV2疫苗组均未检测到肺组织病毒sgRNA，表明它们完全抑制了病毒复制；RBD-tr2组仍有小鼠检测到sgRNA，RBD-tr2组的肺组织病毒sgRNA均值是4.51×105拷贝/g(图13E)。将每只小鼠的对新冠病毒Beta变异株的假病毒的中和抗体滴度与新冠病毒Beta变异株攻毒后对应的肺组织病毒gRNA基于线性模型进行相关性分析，可以看到中和抗体滴度与攻毒后肺组织原型株新冠病毒gRNA的相关性较高 (r＝-0.8039，P＝0.0002)，表明：中和抗体滴度越高，抑制病毒的效果越明显(图13F)。
各实验组小鼠在用新冠病毒原型毒株或Beta变异株攻毒后的肺组织病理学结果如图13G所示。通过分析各实验组小鼠的肺组织病理学看出，对照组小鼠(Sham)在感染新冠病毒原型毒株或新冠病毒Beta变异株后，其肺部病理变化呈现出中度至重度的病变，包括肺泡腔消失、肺血管充血和弥漫性炎症细胞浸润；相比之下，接种RBD-tr2、 RBD-tr2-V2或RBD-tr2-WTV2疫苗的小鼠只表现出轻微的肺损伤(图13G)。此外，Beta 变异株攻毒的小鼠的肺组织病理学结果显示：与RBD-tr2相比，RBD-tr2-V2和 RBD-tr2-WTV2的保护效果更好(图13G)。这些肺组织病理学结果与上述肺组织病毒 gRNA测定的趋势一致，证明了RBD-tr2-WTV2确实可以为新冠病毒不同毒株提供较为平衡且高效的保护作用。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国科学院微生物研究所
<120> 一种新型冠状病毒多价抗原、其制备方法和应用
<130> 1087-210056F-1
<160> 12
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 212
<212> PRT
<213> SARS-CoV-2
<220>
<221> DOMAIN
<222> (1)..(212)
<223> SARS-CoV-2的WH01株的S蛋白序列（NCBI上的GenBank：
QHR63250）的RBD中R319-S530氨基酸序列
<400> 1
Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn
1 5 10 15
Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val
20 25 30
Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser
35 40 45
Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val
50 55 60
Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp
65 70 75 80
Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln
85 90 95
Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr
100 105 110
Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly
115 120 125
Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys
130 135 140
Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr
145 150 155 160
Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser
165 170 175
Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val
180 185 190
Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly
195 200 205
Pro Lys Lys Ser
210
<210> 2
<211> 219
<212> PRT
<213> SARS-CoV-2
<220>
<221> DOMAIN
<222> (1)..(219)
<223> SARS-CoV-2的WH01株的S蛋白序列（NCBI上的GenBank：
QHR63250）的RBD中R319-K537氨基酸序列
<400> 2
Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn
1 5 10 15
Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val
20 25 30
Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser
35 40 45
Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val
50 55 60
Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp
65 70 75 80
Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln
85 90 95
Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr
100 105 110
Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly
115 120 125
Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys
130 135 140
Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr
145 150 155 160
Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser
165 170 175
Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val
180 185 190
Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly
195 200 205
Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys
210 215
<210> 3
<211> 223
<212> PRT
<213> SARS-CoV-2
<220>
<221> DOMAIN
<222> (1)..(223)
<223> SARS-CoV-2的WH01株的S蛋白序列（NCBI上的GenBank：
QHR63250）的RBD中R319-F541氨基酸序列
<400> 3
Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn
1 5 10 15
Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val
20 25 30
Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser
35 40 45
Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val
50 55 60
Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp
65 70 75 80
Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln
85 90 95
Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr
100 105 110
Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly
115 120 125
Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys
130 135 140
Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr
145 150 155 160
Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser
165 170 175
Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val
180 185 190
Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly
195 200 205
Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe
210 215 220
<210> 4
<211> 438
<212> PRT
<213> SARS-CoV-2
<400> 4
Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn
1 5 10 15
Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val
20 25 30
Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser
35 40 45
Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val
50 55 60
Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp
65 70 75 80
Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln
85 90 95
Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr
100 105 110
Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly
115 120 125
Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys
130 135 140
Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr
145 150 155 160
Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser
165 170 175
Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val
180 185 190
Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly
195 200 205
Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Arg Val Gln Pro Thr
210 215 220
Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly
225 230 235 240
Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg
245 250 255
Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser
260 265 270
Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu
275 280 285
Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Ile Arg
290 295 300
Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Asn Ile Ala
305 310 315 320
Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala
325 330 335
Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr
340 345 350
Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp
355 360 365
Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val
370 375 380
Lys Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro
385 390 395 400
Thr Tyr Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe
405 410 415
Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys Lys Ser Thr
420 425 430
Asn Leu Val Lys Asn Lys
435
<210> 5
<211> 1392
<212> DNA
<213> SARS-CoV-2
<400> 5
gccaccatga tccactccgt gtttctgctg atgttcctgc tgacccctac cgagagcaga 60
gtgcagccta ccgagtccat cgtgcggttc cccaacatca ccaatctgtg ccctttcggc 120
gaggtgttca acgccaccag attcgcctct gtgtacgcct ggaaccggaa gcggatcagc 180
aattgcgtgg ccgactacag cgtgctgtac aacagcgcca gcttcagcac cttcaagtgc 240
tacggcgtgt cccctaccaa gctgaacgac ctgtgcttca ccaacgtgta cgccgacagc 300
ttcgtgatca gaggcgacga agtgcggcag attgcccctg gacagacagg caagatcgcc 360
gattacaact acaagctgcc cgacgacttc accggctgtg tgattgcctg gaacagcaac 420
aacctggaca gcaaagtcgg cggcaactac aactacctgt accggctgtt ccggaagtcc 480
aacctgaagc ctttcgagcg ggacatcagc accgagatct atcaggccgg cagcacccct 540
tgcaatggcg tggaaggctt caactgctac ttcccactgc agtcctacgg cttccagcct 600
acaaacggcg tgggctacca gccttacaga gtggtggtgc tgagcttcga gctgctgcat 660
gctcctgcca cagtgtgcgg ccctaagaaa agcaccaacc tggtcaagaa caagcgggtg 720
cagcccactg agagcattgt gcgctttcca aatatcacga atctctgccc ctttggggaa 780
gtctttaatg ccacacgctt cgccagcgtc tacgcttgga ataggaagag aatctccaac 840
tgcgtggcag attactccgt cctgtacaat tccgccagct tttccacgtt taagtgttat 900
ggcgtcagcc ccacaaagct caatgatctc tgctttacca atgtctatgc cgactccttt 960
gtgattcgcg gagatgaagt ccgccagatc gctccaggac agaccggaaa cattgccgac 1020
tataattaca agctcccgga tgatttcacg ggatgcgtga tcgcttggaa ctccaacaat 1080
ctggattcca aagttggcgg gaattacaat tatctctatc gcctcttccg caagagcaat 1140
ctgaagccct ttgagagaga catctctaca gaaatctacc aggctggctc taccccatgt 1200
aacggcgtga agggctttaa ttgctatttt cccctgcaat cttacgggtt tcagcccacc 1260
tatggcgtgg gatatcaacc ctatcgcgtg gtggtcctgt cttttgaact gctgcacgcc 1320
ccagctaccg tgtgtggccc aaaaaagtcc accaatctcg tgaagaacaa acaccaccac 1380
catcaccact ga 1392
<210> 6
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MERS-S蛋白信号肽
<220>
<221> SIGNAL
<222> (1)..(17)
<400> 6
Met Ile His Ser Val Phe Leu Leu Met Phe Leu Leu Thr Pro Thr Glu
1 5 10 15
Ser
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 用于检测SARS-CoV-2病毒gRNA的引物F
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<400> 7
gaccccaaaa tcagcgaaat 20
<210> 8
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 用于检测SARS-CoV-2病毒gRNA的引物R
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(24)
<400> 8
tctggttact gccagttgaa tctg 24
<210> 9
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 用于检测SARS-CoV-2病毒gRNA的探针
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(24)
<400> 9
accccgcatt acgtttggtg gacc 24
<210> 10
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 用于检测SARS-CoV-2病毒sgRNA的引物F
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(23)
<400> 10
cgatctcttg tagatctgtt ctc 23
<210> 11
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 用于检测SARS-CoV-2病毒sgRNA的引物R
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(22)
<400> 11
atattgcagc agtacgcaca ca 22
<210> 12
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 用于检测SARS-CoV-2病毒sgRNA的探针
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(26)
<400> 12
acactagcca tccttactgc gcttcg 26

Claims (18)

1.一种新型冠状病毒抗原，其特征在于：氨基酸序列包括：按照(A-B)-(A-B’)样式排列的氨基酸序列或按照(A-B)-C-(A-B’)样式排列的氨基酸序列，其中：A-B表示新型冠状病毒的表面刺突蛋白的受体结合区的部分氨基酸序列或全长氨基酸序列，所述新型冠状病毒的表面刺突蛋白的受体结合区的部分氨基酸序列至少包括K417，E484或N501中的一个或多个氨基酸，C表示连接氨基酸序列，A-B’表示A-B的氨基酸序列经K417N，E484K或N501Y中的一个或多个氨基酸取代获得的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的新型冠状病毒抗原，其特征在于：新型冠状病毒的表面刺突蛋白的受体结合区的部分氨基酸序列至少为新型冠状病毒的表面刺突蛋白的受体结合区的全长氨基酸序列的50％以上、60％以上、70％以上、80％以上、90％以上、95％以上或99％以上。
3.根据权利要求1所述的新型冠状病毒抗原，其特征在于：所述新型冠状病毒的表面刺突蛋白的受体结合区的部分氨基酸序列或全长氨基酸序列为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3。
4.根据权利要求3所述的新型冠状病毒抗原，其特征在于：A-B’表示A-B的氨基酸序列同时经K417N，E484K和N501Y取代获得的氨基酸序列。
5.根据权利要求4所述的新型冠状病毒抗原，其特征在于：新型冠状病毒抗原的氨基酸序列为SEQ ID NO:4。
6.根据权利要求1所述的新型冠状病毒抗原，其特征在于：所述连接氨基酸序列包括：(GGS)n连接序列，其中n表示GGS的个数，n为≥1的整数；可选地，n为选自1-10的整数；进一步可选地，n为选自1-5的整数。
7.一种权利要求1-6之一所述新型冠状病毒抗原的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：在编码权利要求1-6之一所述新型冠状病毒抗原的核苷酸序列的5’端加入编码信号肽的序列，3’端加上组氨酸和终止密码子，进行克隆表达，筛选正确的重组子，然后转染表达系统的细胞进行表达，表达后收集细胞上清，纯化得到新型冠状病毒抗原。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于：所述表达系统的细胞包括为哺乳动物细胞、昆虫细胞、酵母细胞或细菌细胞，可选地；所述哺乳动物细胞包括HEK293T细胞、HEK293F细胞或CHO细胞，所述细菌细胞包括大肠杆菌细胞。
9.一种编码权利要求1-6之一所述新型冠状病毒抗原的核苷酸序列。
10.根据权利要求9所述的新型冠状病毒抗原，其特征在于：所述核苷酸序列为SEQ IDNO:5。
11.一种包括权利要求9-10之一所述核苷酸序列的重组载体。
12.一种包括权利要求11所述的重组载体的表达系统细胞。
13.一种权利要求1-6之一所述的新型冠状病毒抗原、权利要求9-10之一所述的核苷酸序列、权利要求11所述的重组载体、权利要求12所述的表达系统细胞在制备新型冠状病毒疫苗中的应用。
14.一种新型冠状病毒疫苗，包括权利要求1-6之一所述的新型冠状病毒抗原和佐剂。
15.根据权利要求1所述的新型冠状病毒抗原，其特征在于：所述佐剂选自铝佐剂、MF59佐剂或类MF59佐剂。
16.一种新型冠状病毒DNA疫苗，包括有：包含编码权利要求1-6之一所述的新型冠状病毒抗原的DNA序列的重组载体。
17.一种新型冠状病毒mRNA疫苗，包括有：包含编码权利要求1-6之一所述的新型冠状病毒抗原的mRNA序列的重组载体。
18.一种新型冠状病毒病毒载体疫苗，包括有：包含编码权利要求1-6之一所述的新型冠状病毒抗原的核苷酸序列的重组病毒载体；可选地，病毒载体选自以下的一种或几种：腺病毒载体、痘病毒载体、流感病毒载体、腺相关病毒载体。
CN202210190442.1A 2021-03-01 2022-02-28 一种新型冠状病毒多价抗原、其制备方法和应用 Pending CN114369172A (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110225584 2021-03-01
CN2021102255842 2021-03-01

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN114369172A true CN114369172A (zh) 2022-04-19

Family

ID=81146201

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210190442.1A Pending CN114369172A (zh) 2021-03-01 2022-02-28 一种新型冠状病毒多价抗原、其制备方法和应用

Country Status (2)

Country Link
CN (1) CN114369172A (zh)
WO (1) WO2022184027A1 (zh)

Cited By (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113150085A (zh) * 2021-04-27 2021-07-23 成都威斯克生物医药有限公司 抗SARS-CoV-2感染的组合物
CN114573667A (zh) * 2022-05-06 2022-06-03 艾棣维欣(苏州)生物制药有限公司 SARS-CoV-2病毒B.1.1.529突变株DNA疫苗及应用
CN114751992A (zh) * 2022-05-25 2022-07-15 中国科学院微生物研究所 一种冠状病毒的通用疫苗及其应用
CN114989308A (zh) * 2022-05-12 2022-09-02 中国科学院微生物研究所 新冠病毒嵌合核酸疫苗及其用途
CN115057938A (zh) * 2022-06-24 2022-09-16 广东菲鹏制药股份有限公司 抗新型冠状病毒人源化多价结合蛋白及其应用
CN115678906A (zh) * 2022-05-12 2023-02-03 中国科学院微生物研究所 经优化的新冠病毒嵌合核酸疫苗及其用途
CN115724999A (zh) * 2022-05-11 2023-03-03 中国科学院微生物研究所 串联式杂合三聚体新冠疫苗
CN117051019A (zh) * 2022-05-11 2023-11-14 江苏瑞科生物技术股份有限公司 新型冠状病毒疫苗及其制备方法和应用
WO2023226988A1 (zh) * 2022-05-25 2023-11-30 中山大学 一种增强新冠病毒变异株免疫原性的方法及其应用
WO2024002129A1 (zh) * 2022-06-28 2024-01-04 中国科学院微生物研究所 新冠病毒三聚体嵌合疫苗及其用途

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111592602A (zh) * 2020-02-10 2020-08-28 中国科学院微生物研究所 一种β冠状病毒抗原、其制备方法和应用

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114207134A (zh) * 2019-03-25 2022-03-18 俄亥俄州国家创新基金会 工程化的mRNA序列及其用途
US10906944B2 (en) * 2020-06-29 2021-02-02 The Scripps Research Institute Stabilized coronavirus spike (S) protein immunogens and related vaccines
CN112048005B (zh) * 2020-09-04 2022-09-09 江苏省中国科学院植物研究所 新型冠状病毒s蛋白片段多倍体及其制备方法、检测试剂盒、疫苗及药物

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111592602A (zh) * 2020-02-10 2020-08-28 中国科学院微生物研究所 一种β冠状病毒抗原、其制备方法和应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JULIAN W. TANG,等: "Introduction of the South African SARS-CoV-2 variant 501Y.V2 into the UK", 《J INFECT》 *

Cited By (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113150085A (zh) * 2021-04-27 2021-07-23 成都威斯克生物医药有限公司 抗SARS-CoV-2感染的组合物
CN114573667A (zh) * 2022-05-06 2022-06-03 艾棣维欣(苏州)生物制药有限公司 SARS-CoV-2病毒B.1.1.529突变株DNA疫苗及应用
CN115724999A (zh) * 2022-05-11 2023-03-03 中国科学院微生物研究所 串联式杂合三聚体新冠疫苗
WO2023217005A1 (zh) * 2022-05-11 2023-11-16 中国科学院微生物研究所 串联式杂合三聚体新冠疫苗
CN117051019A (zh) * 2022-05-11 2023-11-14 江苏瑞科生物技术股份有限公司 新型冠状病毒疫苗及其制备方法和应用
CN115724999B (zh) * 2022-05-11 2023-09-19 中国科学院微生物研究所 串联式杂合三聚体新冠疫苗
WO2023217206A1 (zh) * 2022-05-12 2023-11-16 中国科学院微生物研究所 新冠病毒嵌合核酸疫苗及其用途
CN115678906A (zh) * 2022-05-12 2023-02-03 中国科学院微生物研究所 经优化的新冠病毒嵌合核酸疫苗及其用途
CN115678906B (zh) * 2022-05-12 2023-09-19 中国科学院微生物研究所 经优化的新冠病毒嵌合核酸疫苗及其用途
CN114989308A (zh) * 2022-05-12 2022-09-02 中国科学院微生物研究所 新冠病毒嵌合核酸疫苗及其用途
CN114751992A (zh) * 2022-05-25 2022-07-15 中国科学院微生物研究所 一种冠状病毒的通用疫苗及其应用
WO2023226988A1 (zh) * 2022-05-25 2023-11-30 中山大学 一种增强新冠病毒变异株免疫原性的方法及其应用
CN114751992B (zh) * 2022-05-25 2024-05-31 中国科学院微生物研究所 一种冠状病毒的通用疫苗及其应用
CN115057938B (zh) * 2022-06-24 2023-01-06 广东菲鹏制药股份有限公司 抗新型冠状病毒人源化多价结合蛋白及其应用
CN115057938A (zh) * 2022-06-24 2022-09-16 广东菲鹏制药股份有限公司 抗新型冠状病毒人源化多价结合蛋白及其应用
WO2024002129A1 (zh) * 2022-06-28 2024-01-04 中国科学院微生物研究所 新冠病毒三聚体嵌合疫苗及其用途

Also Published As

Publication number Publication date
WO2022184027A1 (zh) 2022-09-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN114369172A (zh) 一种新型冠状病毒多价抗原、其制备方法和应用
CN113230395B (zh) 一种β冠状病毒抗原、β冠状病毒二联疫苗及其制备方法和应用
CN113292640B (zh) 一种产生广谱交叉中和活性的重组新型冠状病毒rbd三聚体蛋白疫苗、其制备方法和应用
CN113185613B (zh) 新型冠状病毒s蛋白及其亚单位疫苗
CN114634556B (zh) 一种新冠病毒Delta和Omicron变异株嵌合抗原、其制备方法和应用
CN111592602B (zh) 一种β冠状病毒抗原、其制备方法和应用
KR102236497B1 (ko) 안정화된 가용성 예비융합 ｒｓｖ ｆ 폴리펩타이드
CN113943373B (zh) 一种β冠状病毒多聚体抗原、其制备方法和应用
CN113912710B (zh) 抗新型冠状病毒n蛋白的单克隆抗体及其应用
CN103483447A (zh) 抗hpv l1 蛋白的广谱单克隆抗体或其抗原结合片段及它们的用途
CN109311946A (zh) 稳定化的融合前rsv f蛋白
CN114315989A (zh) 一种重组新型冠状病毒蛋白疫苗、其制备方法和应用
CN114478718A (zh) 一种重组新型冠状病毒蛋白疫苗、其制备方法和应用
CN114702556A (zh) 一种冠状病毒rbd变异体及其应用
CN115724999B (zh) 串联式杂合三聚体新冠疫苗
JPH08325291A (ja) ハンタウィルス抗原蛋白質およびモノクローナル抗体
CN113603786B (zh) 特异性结合SARS-CoV-2 S蛋白和N蛋白的双特异性抗体
CN115043915B (zh) 一种增强新冠病毒变异株免疫原性的方法及其应用
CN114717205A (zh) 一种冠状病毒RBDdm变异体及其应用
CN114478717A (zh) 一种重组新型冠状病毒蛋白疫苗、其制备方法和应用
KR20230030653A (ko) 하나 이상의 면역원성 단편 및 항체 Fc 영역을 함유하는 재조합 폴리펩티드 및 이의 용도
CA2393644A1 (en) Hepatitis virus sentinel virus i (svi)
JP2002020399A (ja) ノルウォークウイルス（ｎｖ）を認識するモノクローナル抗体
CN113493494B (zh) Eb病毒balf3蛋白的抗原表位
CN114751964B (zh) β属冠状病毒通用疫苗蛋白片段及其筛选方法和应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination