CN114207134A - 工程化的mRNA序列及其用途 - Google Patents
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Abstract
本公开涉及一系列工程化的mRNA序列及使用其来改善蛋白质表达的方法。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2019年3月25日提交的美国临时申请第62/823,215号的权益，所述美国临时申请以引用方式明确并入本文。
关于联邦政府赞助研究的声明
本发明根据国家卫生研究院(National Institutes of Health)授予的授权号R35GM119679下的政府资助产生。政府对本发明具有一定权利。
技术领域
本公开涉及一系列工程化的mRNA序列及使用其来改善蛋白质表达的方法。
背景技术
信使RNA(messenger RNA，mRNA)是使基因从DNA表达成蛋白质的重要介体和调节剂。所有活生物体内的蛋白质都是在细胞内使用mRNA作为蓝图在称为翻译的过程产生的。为了平衡各种蛋白质的生物功能，使从mRNA制造蛋白质的细胞内过程经受细致的调节。
信使RNA是长多核苷酸链，该长多核苷酸链由从5′至3′的几个主要区段，即帽、5′非翻译区(5′UTR)、编码区、3′非翻译区(3′UTR)和尾部组成。5′末端处的帽参与包括核糖体在内的翻译起始复合物的募集。编码区决定翻译后会产生什么样的蛋白质。5′UTR和3′UTR是调节从该mRNA表达所编码的蛋白的水平的关键元件。它们的作用机制在很大程度上依赖于它们独特的核苷酸序列与识别这些序列的对应RNA结合蛋白(RNA binding protein，RBP)之间的相互作用。mRNA的半衰期和表达效率通常由各种与5′UTR和3′UTR结合的RBP调节。哺乳动物细胞中的大多数mRNA在其3′末端含有聚腺苷酸(聚A)尾。聚A尾通过传递对mRNA 3′至5′衰变途径的抗性，从而延长mRNA半衰期，而有助于mRNA链的稳定性。还发现聚A尾绕回到mRNA 5′末端并在翻译起始中起作用。
许多疾病起因于细胞蛋白质合成错误，导致功能蛋白不足或突变的有害蛋白。传统的蛋白质疗法在其他生物体中制造所需的蛋白质，并直接将所述蛋白质递送至细胞中以补充或纠正缺失的细胞功能。然而，许多递送的蛋白质在低剂量下不足，并且由于其外源性而在高剂量下是免疫原性的。
一个新兴的mRNA治疗领域在实验室中通过称为体外转录的过程合成编码蛋白质的mRNA，并将该mRNA递送至细胞中。由mRNA编码的所需蛋白质可以由细胞内蛋白质合成机制产生。然而，所递送的mRNA的蛋白质表达水平差异很大。需要的是用于改善所递送的mRNA的表达效率和半衰期的方法。
发明内容
本文公开了一系列用于改善蛋白质表达的工程化的mRNA和方法。
在一些方面中，本文公开了一种工程化的mRNA，所述工程化的mRNA包含：第一核酸序列，该第一核酸序列包含RPS27A 5′非翻译区(5′UTR)序列或工程化的5′非翻译区(5′UTR)序列；第二核酸序列，该第二核酸序列包含异源核酸序列；以及第三核酸序列，该第三核酸序列包含RPS27A 3′非翻译区(3′UTR)序列。
在一些实施方案中，RPS27A 5′UTR序列选自包括以下的组：SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、或SEQ ID NO：11。
在一些实施方案中，异源核酸序列编码靶蛋白。在一些实施方案中，靶蛋白是任何感兴趣的蛋白(protein of interest，POI)。
在一些实施方案中，靶蛋白是免疫治疗蛋白。在一些实施方案中，靶蛋白是共刺激分子。在一些实施方案中，靶蛋白是基因组编辑酶或核酸酶。在一些实施方案中，靶蛋白用于蛋白质替代疗法。
在一些实施方案中，靶蛋白包括荧光蛋白。在一些实施方案中，靶蛋白与荧光蛋白融合。在一个实施方案中，荧光蛋白是mCherry(mCh)。在一些实施方案中，荧光蛋白是GFP或YFP。
在一些实施方案中，靶蛋白包括病毒蛋白。在一些实施方案中，病毒蛋白是COVID-19蛋白。
在一些实施方案中，RPS27A 3′UTR序列选自包括以下的组：SEQ ID NO：24、SEQ IDNO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：87、SEQ ID NO：89、或SEQ ID NO：91。
在一些实施方案中，任何前述方面的工程化的mRNA包括选自包括以下的组的RNA序列：SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31、SEQ IDNO：32、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ IDNO：38、SEQ ID NO：39、或SEQ ID NO：40。
在一些实施方案中，任何前述方面的工程化的mRNA包括选自包括以下的组的RNA序列：SEQ ID NO：93、SEQ ID NO：94、SEQ ID NO：95、SEQ ID NO：96、或SEQ ID NO：97。
在一些实施方案中，mRNA包含至少一个化学修饰的核苷酸。在一些实施方案中，至少一个化学修饰的核苷酸是化学修饰的核碱基。在一些实施方案中，化学修饰的核碱基是假尿苷。
在一些方面中，本文公开了一种包含任何前述方面的工程化的mRNA的载体。在一些实施方案中，细胞包含任何前述方面的载体。
在一些方面中，本文公开了一种增加蛋白质表达的方法，所述方法包括以下步骤：向细胞中引入工程化的mRNA，所述工程化的mRNA包含：第一核酸序列，所述第一核酸序列包含RPS27A 5′UTR序列；第二核酸序列，所述第二核酸序列包含异源核酸序列；以及第三核酸序列，所述第三核酸序列包含RPS27A 3′UTR序列。
在一些实施方案中，RPS27A 5′UTR序列选自包括以下的组：SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、或SEQ ID NO：11。
在一些实施方案中，异源核酸序列编码靶蛋白。在一些实施方案中，靶蛋白是任何感兴趣的蛋白(POI)。
在一些实施方案中，靶蛋白包括荧光蛋白。在一些实施方案中，靶蛋白与荧光蛋白融合。在一个实施方案中，荧光蛋白是mCherry(mCh)。在一些实施方案中，荧光蛋白是GFP或YFP。
在一些实施方案中，靶蛋白包括病毒蛋白。在一些实施方案中，病毒蛋白是COVID-19蛋白。
在一些实施方案中，RPS27A 3′UTR序列选自包括以下的组：SEQ ID NO：24、SEQ IDNO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：87、SEQ ID NO：89、或SEQ ID NO：91。
在一些实施方案中，工程化的mRNA包括选自包括以下的组的RNA序列：SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ IDNO：33、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38、SEQ IDNO：39、或SEQ ID NO：40。
在一些实施方案中，工程化的mRNA包括选自包括以下的组的RNA序列：SEQ ID NO：93、SEQ ID NO：94、SEQ ID NO：95、SEQ ID NO：96、或SEQ ID NO：97。
在一些方面中，本文公开了一种工程化的mRNA，所述工程化的mRNA包含：第一核酸序列，该第一核酸序列包含工程化的5′非翻译区(5′UTR)序列；第二核酸序列，该第二核酸序列包含异源核酸序列；以及第三核酸序列，该第三核酸序列包含RPS27A 3′非翻译区(3′UTR)序列。
在一些实施方案中，工程化的5′UTR序列选自包括以下的组：SEQ ID NO：12、SEQID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：81、SEQID NO：82、SEQ ID NO：83、SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：85、或SEQ ID NO：86。
附图说明
并入本说明书且构成其一部分的附图图解了下文所述的几个方面。
图1A至图1B示出了具有和不具有经修饰的来自小鼠核糖体蛋白S27a基因的5′UTR和3′UTR的荧光素酶mRNA在A549细胞(图1A)和Hep3B细胞(图1B)中的体外表达。AG+G、不具有3UTR的AG+G和CYBA是与其他工程化的mRNA具有相同的编码序列的对照荧光素酶mRNA。
图2A至图2C示出了具有和不具有经修饰的来自小鼠核糖体蛋白S27a基因的5′UTR和3′UTR的eGFP mRNA在A549细胞(图2A)、Hep3B细胞(图2B)和293T细胞(图2C)中的体外表达。
图3示出了用具有或不具有假尿苷修饰的5UTR-18和3UTR-1工程化的荧光素酶mRNA在A549细胞中的体外表达。
图4A至图4B示出了用5UTR-22+3UTR-1工程化和用5UTR-23+3UTR-1工程化的经假尿苷修饰的荧光素酶mRNA在Hep3B细胞(图4A)和A549细胞(图4B)中的体外表达。
图5示出了通过本文所公开的具有5′UTR和3′UTR序列的eGFP/mCherry mRNA或通过使用活Hep3B细胞的市售成像探针靶向的细胞器的活体成像。
图6A至图6B示出了测试具有5′UTR的萤火虫荧光素酶mRNA在哺乳动物细胞中的表达，所述具有5′UTR的萤火虫荧光素酶mRNA由10nt(5UTR-12)、30nt(5UTR-14)、50nt(5UTR-16)、70nt(5UTR-18)或90nt(5UTR-24)组成。分别示出了Hep3B细胞(图6A)和293T细胞(图6B)的结果。
图7A至图7B示出了位于5′UTR中的微小RNA靶位点被去除以增强mRNA表达。分别示出了Hep3B细胞(图7A)和293T细胞(图7B)的结果。
图8A至图8B示出了额外功能性RNA基序被附加至3UTR-1的3′末端以增强mRNA表达。分别示出了Hep3B细胞(图8A)和293T细胞(图8B)的结果。
具体实施方式
本文公开了一系列包含RPS27A 5′UTR和RPS27A 3′UTR的经修饰部分的工程化的mRNA，以及用于改善蛋白质表达的方法。本文还公开了一系列包含工程化的(非天然存在的)5′UTR序列的工程化的mRNA，以及用于改善蛋白质表达的方法。
现在将详细参考本发明的实施方案，附图和实施例中说明了所述实施方案的示例。然而，本发明可以以许多不同形式来体现且不应该被理解为局限于文中所阐述的实施方案。
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科技术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。本文所用的术语“包括”及其变形与术语“包含”及其变形同义地使用并且是开放的、非限制性术语。尽管本文使用术语“包含”和“包括”来描述各种实施方案，但是可使用术语“基本上由......组成”和“由......组成”来代替“包含”和“包括”，以提供更加具体的实施方案，并且也做了公开。除非上下文另外清楚地指出，如本公开内容中和所附权利要求书中所使用，单数形式“一(a/an)”、“所述”包括复数个指示对象。
提供以下定义是为了全面理解本说明书中使用的术语。
术语
如本文所用的术语“核酸”是指由核苷酸(例如脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)构成的聚合物。
如本文所用的术语“核糖核酸”和“RNA”是指由核糖核苷酸构成的聚合物。
术语“多核苷酸”是指由核苷酸单体构成的单链聚合物或双链聚合物。
术语“多肽”是指由单链D-氨基酸或L-氨基酸构成的化合物或通过肽键接合的D-氨基酸和L-氨基酸的混合物。
术语“靶蛋白”是指由给定工程化的mRNA表达的蛋白质或多肽。靶蛋白可以是天然存在的或人造的分子。此外，它们可以以它们的未改变的状态采用，或者作为与其他物质的聚集体采用。
术语“互补”是指探针分子与其靶标的相互作用表面的拓扑相容性或匹配在一起。因此，靶标及其探针可以被描述为互补的，并且此外，接触表面特性是与彼此互补的。
术语“杂交”是指在两条或更多条互补核酸链之间建立非共价、序列特异性的相互作用以形成单个杂交体的过程，所述杂交体在两条链的情况下称为双链体。
术语“退火”是指单链核酸序列通过氢键与互补序列配对，从而形成双链核酸序列的过程，包括通过热量(热变性)分离的互补链的改造(复性)。
术语“解链”是指双链核酸序列由于高温而变性，从而导致双链通过断裂链之间的氢键而分离成两条单链。
术语“启动子”或“调节元件”是指位于转录起始上游或下游并且参与识别和结合RNA聚合酶和其他蛋白质以启动转录的区域或序列决定簇。启动子不必是细菌来源的，例如，源自病毒或其他生物体的启动子可用于本文所述的组合物、系统或方法中。术语“调节元件”旨在包括启动子、增强子、内部核糖体进入位点(internal ribosomal entry site，IRES)和其他表达控制元件(例如转录终止信号，例如聚腺苷酸化信号和聚U序列)。例如，在Goeddel，Gene Expression Technology：Methods in Enzymology 185，Academic Press，San Diego，Calif.(1990)中描述了此类调节元件。调节元件包括在许多类型的宿主细胞中指导核苷酸序列组成型表达的调节元件和仅在某些宿主细胞中指导核苷酸序列表达的调节元件(例如，组织特异性调节序列)。组织特异性启动子可以指导主要在所需的感兴趣组织，例如肌肉、神经元、骨骼、皮肤、血液、特定器官(例如肝脏、胰腺)或特定细胞类型(例如淋巴细胞)中表达。调节元件也可以以时间依赖性方式，例如以细胞周期依赖性或发育阶段依赖性方式指导表达，其也可能是或可能不是组织或细胞类型特异性的。在一些实施方案中，载体包含一个或多个pol III启动子(例如1个、2个、3个、4个、5个或更多个pol I启动子)、一个或多个pol II启动子(例如1个、2个、3个、4个、5个或更多个pol II启动子)、一个或多个pol I启动子(例如1个、2个、3个、4个、5个或更多个pol I启动子)、或它们的组合。pol III启动子的示例包括但不限于U6启动子和H1启动子。pol II启动子的示例包括但不限于逆转录病毒劳斯肉瘤病毒(Rous sarcoma virus，RSV)LTR启动子(任选地具有RSV增强子)、巨细胞病毒(cytomegalovirus，CMV)启动子(任选地具有CMV增强子)[参见例如Boshart等人，Cell，41：521-530(1985)]、SV40启动子、二氢叶酸还原酶启动子、β-肌动蛋白启动子、磷酸甘油激酶(PGK)启动子和EF1α启动子。术语“调节元件”还涵盖增强子元件，例如WPRE；CMV增强子；HTLV-I的LTR中的R-U5′区段(Mol.Cell.Biol.，第8(1)卷，第466-472页，1988)；SV40增强子；以及兔β-珠蛋白的外显子2与外显子3之间的内含子序列(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，第78(3)卷，第1527-31页，1981)。本领域技术人员将理解，表达载体的设计可取决于诸如待转化宿主细胞的选择、所需表达水平等因素。
术语“重组”是指人操纵的核酸(例如多核苷酸)或人操纵的核酸(例如多核苷酸)的拷贝或互补物，或者如果涉及蛋白质(即，“重组蛋白质”)，则是指由重组核酸(例如多核苷酸)编码的蛋白质。在实施方案中，包含与第二核酸(例如多核苷酸)可操作地连接的启动子的重组表达盒可包括作为人操纵(例如，通过在Sambrook等人，Molecular Cloning-ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.，(1989)或Current Protocols in Molecular Biology第1-3卷，John Wiley&Sons，Inc.(1994-1998)中所述的方法进行人操纵)的结果而异源于第二核酸(例如多核苷酸)的启动子。在另一示例中，重组表达盒可包含以核酸(例如多核苷酸)极不可能在自然界中发现的方式组合的核酸(例如多核苷酸)。例如，人操纵的限制性位点或质粒载体序列可以侧接于启动子或将启动子与第二核酸(例如多核苷酸)分开。本领域技术人员将认识到核酸(例如多核苷酸)可以以多种方式进行操纵并且不限于以上示例。
“编码”是指多核苷酸(诸如基因、eDNA或mRNA)中的特定核苷酸序列在生物过程中用作用于合成其他聚合物和大分子的模板的固有特性，所述其他聚合物和大分子具有确定的核苷酸序列(即，rRNA、tRNA和mRNA)或确定的氨基酸序列以及由此产生的生物特性。
术语“表达盒”或“载体”是指核酸构建体，所述核酸构建体当被引入宿主细胞时，分别导致RNA或多肽的转录和/或翻译。在实施方案中，包含与第二核酸(例如多核苷酸)可操作地连接的启动子的表达盒可包括作为人操纵(例如，通过在Sambrook等人，MolecularCloning-A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.，(1989)或Current Protocols in Molecular Biology第1-3卷，John Wiley&Sons，Inc.(1994-1998)中所述的方法进行人操纵)的结果而异源于第二核酸(例如多核苷酸)的启动子。在一些实施方案中，包含与第二核酸(例如多核苷酸)可操作地连接的终止子(或终止序列)的表达盒可包括由于人操纵的结果而与第二核酸(例如多核苷酸)异源的终止子。在一些实施方案中，作为人操纵的结果，表达盒包含与第二核酸(例如多核苷酸)可操作连接的启动子和与第二核酸(例如多核苷酸)可操作地连接的终止子。在一些实施方案中，表达盒包含内源启动子。在一些实施方案中，表达盒包含内源终止子。在一些实施方案中，表达盒包含合成(或非天然)启动子。在一些实施方案中，表达盒包含合成(或非天然)终止子。
“片段”，无论是否附接至其他序列，也都可以包括特定区域或特定氨基酸残基的插入、缺失、取代或其他选定修饰，前提条件是与未修饰的肽或蛋白质相比，片段的活性没有显著改变或受损。这些修饰可以提供一些额外的特性，诸如去除或添加能够进行二硫键键合的氨基酸、延长其生物寿命、改变其分泌特征等。
“增加”可以指导致更高水平的基因表达、蛋白质表达、症状量、疾病、组合物、状况或活性的任何变化。当基因、蛋白质、组合物或状况量的水平相对于没有某一物质时该基因、蛋白质、组合物或状况量的水平的输出更多/更高时，该物质也被理解为增加该基因、蛋白质、组合物或状况量的水平。此外，例如，增加可以是疾患的症状改变，使得症状比先前观察到的更少。增加可以是状况、症状、活性、组合物的统计上显著量的任何个别增加、中值增加、或平均增加。因此，增加可以是1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％的增加，只要该增加是统计学上显著的即可。
“降低”可以指导致较低水平的基因表达、蛋白质表达、症状量、疾病、组合物、状况或活性的任何变化。当基因、蛋白质、组合物或状况量的水平相对于没有某一物质时该基因、蛋白质、组合物或状况量的水平的输出更少/更低时，该物质也被理解为降低该基因、蛋白质、组合物或状况量的水平。降低可以是状况、症状、活性、组合物的统计上显著量的任何个别降低、中值降低、或平均降低。因此，降低可以是1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％的降低，只要该降低是统计学上显著的即可。
在两个或更多个核酸或多肽序列的上下文中，术语“同一”或“同一性”百分比是指这样的两个或更多个序列或子序列，所述两个或更多个序列或子序列是相同的或具有指定百分比的氨基酸残基或核苷酸为相同的(即，当比较和比对在比较窗口或指定区域内的最大对应时，在该指定区域内约60％同一性，优选61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的同一性)，如使用具有下述默认参数的BLAST或BLAST 2.0序列比较算法或通过手动比对和目视检查(参见例如，NCBI网站等)测量的。此类序列被称为“基本上同一”。该定义还涉及或可能适用于测试序列的补充。该定义还包括具有缺失和/或添加的序列，以及具有取代的序列。如下所述，优选的算法可考虑空位等。优选地，同一性存在于长度为至少约10个氨基酸或20个核苷酸的区域上，或更优选地存在于长度为10个至50个氨基酸或20个至50个核苷酸的区域上。如本文所用，氨基酸序列同一性百分比(％)被定义为在比对序列并引入空位(如有必要)以实现最大序列同一性百分比之后，候选序列中与参考序列中的氨基酸相同的氨基酸的百分比。为了测定序列同一性百分比的比对可以通过本领域技术范围内的多种方式实现，例如，使用公开获得的计算机软件诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2或Megalign(DNASTAR)软件。可以通过已知方法确定用于测量比对的适当参数，包括在所比较序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。
对于序列比较，通常一个序列充当参考序列，将测试序列与该参考序列进行比较。当使用序列比较算法时，将测试序列和参考序列输入计算机中，指定子序列坐标(如有必要)和序列算法程序参数。优选地，可以使用默认程序参数，或者可以指定替代参数。然后序列比较算法基于程序参数计算测试序列相对于参考序列的序列同一性百分比。
适用于确定序列同一性百分比和序列相似性的算法的一个示例是BLAST和BLAST2.0算法，所述BLAST和BLAST 2.0算法分别描述于Altschul等人(1977)Nuc.Acids Res.25：3389-3402和Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215：403-410中。用于执行BLAST分析的软件可通过国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)公开获得。该算法涉及首先通过以下方式来辨识高评分序列对(high scoring sequence pair，HSP)：辨识查询序列中长度为W的短词，所述短词当与数据库序列中相同长度的词比对时匹配或满足某个正值阈值得分T。T被称为邻域词得分阈值(Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215：403-410)。这些最初的邻域词命中充当种子以用于启动搜索来找到包含它们的更长HSP。只要累积比对得分可增加，词命中就沿着每个序列在两个方向上扩展。对于核苷酸序列，使用参数M(一对匹配残基的奖励得分；总是＞0)和N(错配残基的惩罚得分；总是＜0)计算累积得分。对于氨基酸序列，使用评分矩阵来计算累积得分。当在以下情况下时，词命中在每个方向上的扩展停止：累积比对得分从其最大实现值下降了量X；由于一个或多个负评分残基比对的累积，累积得分变为零或更低；或到达任一序列的末尾。BLAST算法参数W、T和X确定比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(用于核苷酸序列)默认使用为11的字长(wordlength，W)、为10的期望值(expectation，E)、M＝5、N＝-4以及两条链的比较。对于氨基酸序列，BLASTP程序默认使用为3的字长、为10的期望值(E)和为50的BLOSUM62评分矩阵(参见Henikoff和Henikoff(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915)比对(B)、为10的期望值(E)、M＝5、N＝-4、以及两条链的比较。
BLAST算法还对两个序列之间的相似性执行统计分析(参见例如，Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-5787)。BLAST算法提供的一种相似性度量是最小总概率(P(N))，其提供了对两个核苷酸或氨基酸序列之间偶然发生匹配的概率的指示。例如，如果测试核酸与参考核酸的比较中的最小总概率小于约0.2，更优选小于约0.01，则认为核酸与参考序列相似。
措辞“密码子优化的”当涉及用于转化各种宿主的核酸分子的基因或编码区时，是指改变多核酸分子的基因或编码区中的密码子以反映选定生物体的典型密码子使用，而不改变由该DNA编码的多肽。此类优化包括用一种或多种更频繁地用于选定生物体的基因中的密码子替换至少一种、多于一种或大量的密码子。
当核酸被置于与另一核酸序列的功能关系中时，该核酸是“可操作地连接的”。例如，如果前序列或分泌前导序列的DNA表达为参与多肽分泌的前蛋白，则所述DNA与多肽的DNA可操作地连接；如果启动子或增强子影响序列的转录，则启动子或增强子与编码序列可操作地连接；或者如果核糖体结合位点经定位以促进翻译，则所述核糖体结合位点与编码序列可操作地连接。通常，“可操作地连接”是指被连接的DNA序列彼此靠近，并且在分泌前导序列的情况下是连续的并且处于阅读阶段。然而，可操作地连接的核酸(例如增强子和编码序列)不必是连续的。连接是通过在方便的限制性位点连接完成的。如果此类位点不存在，则根据常规实践使用合成的寡核苷酸衔接子或接头。在实施方案中，当启动子能够影响(例如相对于不存在启动子的情况进行调节)来自编码序列的蛋白质的表达时，启动子与该编码序列可操作地连接(即，该编码序列处于该启动子的转录控制下)。
术语“核碱基”是指具有沃森/克里克碱基配对功能的核苷酸部分。最常见的天然存在的核碱基腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、尿嘧啶(U)、胞嘧啶(C)和胸腺嘧啶(T)具有氢键合功能，所述氢键合功能可将一条核酸链与另一条核酸链以序列特异性方式结合。
如通篇所使用的，“受试者”(或“宿主”)是指个体。因此，“受试者”可包括例如驯养动物(例如猫、狗等)、家畜(例如，牛、马、猪、绵羊、山羊等)、实验室动物(例如，小鼠、兔、大鼠、豚鼠等)哺乳动物、非人类哺乳动物、灵长类动物、非人类灵长类动物、啮齿动物、禽类、爬行动物、两栖动物、鱼和任何其他动物。受试者可以是哺乳动物，诸如灵长类动物或人。
如本文所用的术语“约”在涉及诸如量、百分比等的可测量值时，意在涵盖相对于该可测量值的±20％、±10％、±5％或±1％的变化。
如果核酸序列源自外来物种，或者如果来自同一物种，由于人类行为而从其原始形式被修饰时，则该核酸序列与第二核酸序列是“异源的”。例如，与异源编码序列可操作地连接的启动子是指编码序列来自与启动子所来源于的物种不同的物种，或者如果来自相同物种，则编码序列不同于天然存在的等位基因变体。
如本文所用的术语“治疗
”及其语法变体包括部分或完全延迟、缓解、减轻或降低疾患或病症的一种或多种伴随症状的强度，和/或缓解、减轻或阻碍疾患或病症的一种或多种病因。根据本发明的治疗可以防止性地、预防性地、减轻性地或治疗性地(remedially)应用。在发病前、发病早期期间或在癌症的确定发展后向受试者施用预防性治疗。预防性施用可以在表现出感染症状之前进行几天至几年。
如本文所用，术语“疫苗”是指含有本发明的工程化的mRNA的制剂，所述制剂为能够施用于受试者的形式，并且诱导足以诱导免疫力的保护性免疫应答以预防和/或改善感染和/或减轻感染的至少一种症状和/或增强另一剂的疫苗的功效。通常，疫苗包含本发明的组合物悬浮或溶解于的常规盐水或缓冲水溶液介质。以这种形式，本发明的组合物可以方便地用于预防、改善或以其他方式治疗感染。在引入到宿主中后，疫苗能够引发免疫应答，所述免疫应答包括但不限于产生抗体和/或细胞因子和/或激活CD8+T细胞、抗原呈递细胞、CD4+T细胞、树突细胞和/或其他细胞反应。
如本文所用，术语“佐剂”是指当与制剂中的特异性免疫原组合使用时将增强或以其他方式改变或修改所得免疫应答的化合物。免疫应答的修改包括强化或扩展抗体和细胞免疫应答中的一者或两者的特异性。免疫应答的修改也可意味减少或抑制某些抗原特异性免疫应答。
“共刺激分子”是指免疫细胞(例如T细胞)上的同源结合配偶体，该同源结合配偶体与共刺激配体特异性结合，从而由T细胞介导共刺激反应，诸如但不限于增殖。
组合物和方法
本文公开了一系列用于改善蛋白质表达的工程化的mRNA和方法。在一些方面中，本文公开了一种工程化的mRNA，所述工程化的mRNA包含：第一核酸序列，该第一核酸序列包含RPS27A 5′非翻译区(5′UTR)序列或工程化的5′非翻译区(5′UTR)序列；第二核酸序列，该第二核酸序列包含异源核酸序列；以及第三核酸序列，该第三核酸序列包含RPS27A(3′非翻译区)3′UTR序列。
在一些实施方案中，RPS27A 5′UTR序列选自包括以下的组：SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、或SEQ ID NO：11。在一些实施方案中，RPS27A 5′UTR序列是SEQ ID NO：1。在一些实施方案中，RPS27A 5′UTR序列是SEQ ID NO：2。在一些实施方案中，RPS27A 5′UTR序列是SEQ ID NO：3。在一些实施方案中，RPS27A 5′UTR序列是SEQ ID NO：4。在一些实施方案中，RPS27A 5′UTR序列是SEQ ID NO：5。在一些实施方案中，RPS27A 5′UTR序列是SEQ ID NO：6。在一些实施方案中，RPS27A 5′UTR序列是SEQ ID NO：7。在一些实施方案中，RPS27A 5′UTR序列是SEQ ID NO：8。在一些实施方案中，RPS27A 5′UTR序列是SEQ IDNO：9。在一些实施方案中，RPS27A 5′UTR序列是SEQ ID NO：10。在一些实施方案中，RPS27A5′UTR序列是SEQ ID NO：11。
在一些实施方案中，RPS27A 5′UTR序列选自包括以下的组：SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、或SEQ ID NO：11，或其片段或功能活性变体。
在一些实施方案中，RPS27A 5′UTR序列选自包括以下的组：与SEQ ID NO：1、SEQID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ IDNO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、或SEQ ID NO：11至少60％(例如，至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％)同一的核酸序列。
在一些实施方案中，RPS27A 3′UTR序列选自包括以下的组：SEQ ID NO：24、SEQ IDNO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：87、SEQ ID NO：89、或SEQ ID NO：91，或其片段或功能活性变体。在一些实施方案中，RPS27A 3′UTR序列是SEQ ID NO：24。在一些实施方案中，RPS27A 3′UTR序列是SEQ ID NO：25。在一些实施方案中，RPS27A3′UTR序列是SEQ ID NO：26。在一些实施方案中，RPS27A 3′UTR序列是SEQ ID NO：87。在一些实施方案中，RPS27A 3′UTR序列是SEQ ID NO：89。在一些实施方案中，RPS27A 3′UTR序列是SEQ ID NO：91。在一些实施方案中，任何前述方面的RPS27A 3′UTR序列包含功能基序A、基序B和/或基序C，其中功能基序A包含SEQ ID NO：88，其中功能基序B包含SEQ ID NO：90，并且其中功能基序C包含SEQ ID NO：92。
在一些实施方案中，RPS27A3′UTR序列选自包括以下的组：与SEQ ID NO：24、SEQID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：87、SEQ ID NO：89、或SEQ ID NO：91至少60％(例如，至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％)同一的核酸序列。
在一些实施方案中，异源核酸序列编码靶蛋白。异源核酸序列或靶蛋白可以是任何感兴趣的核酸序列/蛋白。
在一些实施方案中，靶蛋白是免疫治疗蛋白。在一些实施方案中，靶蛋白是共刺激分子。在一些实施方案中，靶蛋白是基因组编辑酶或核酸酶。在一些实施方案中，靶蛋白用于蛋白质替代疗法。
在一些实施方案中，共刺激分子选自ICOS、CD28、CD27、HVEM、LIGHT、CD40L、4-1BB、OX40、DR3、GITR、CD30、SLAM、CD2、CD226、半乳凝素9、TIM1、LFA1、B7-H2、B7-1、B7-2、CD70、LIGHT、HVEM、CD40、4-1BBL、OX40L、TL1A、GITRL、CD30L、SLAM、CD48、CD58、CD155、CD112、CD80、CD86、ICOSL、TIM3、TIM4、ICAM1或LFA3。
在一些实施方案中，共刺激分子是ICOS。在一些实施方案中，共刺激分子是CD28。在一些实施方案中，共刺激分子是CD27。在一些实施方案中，共刺激分子是HVEM。在一些实施方案中，共刺激分子是LIGHT。在一些实施方案中，共刺激分子是CD40L。在一些实施方案中，共刺激分子是4-1BB。在一些实施方案中，共刺激分子是OX40。在一些实施方案中，共刺激分子是DR2。在一些实施方案中，共刺激分子是GITR。在一些实施方案中，共刺激分子是CD30。在一些实施方案中，共刺激分子是SLAM。在一些实施方案中，共刺激分子是CD2。在一些实施方案中，共刺激分子是CD226。在一些实施方案中，共刺激分子是半乳糖凝集素9。在一些实施方案中，共刺激分子是TIM1。在一些实施方案中，共刺激分子是LFA1。在一些实施方案中，共刺激分子是B7-H2。在一些实施方案中，共刺激分子是B7-1。在一些实施方案中，共刺激分子是B7-2。在一些实施方案中，共刺激分子是CD70。在一些实施方案中，共刺激分子是LIGHT。在一些实施方案中，共刺激分子是HVEM。在一些实施方案中，共刺激分子为4-1BBL。在一些实施方案中，共刺激分子是OX40L。在一些实施方案中，共刺激分子是TL1A。在一些实施方案中，共刺激分子是GITRL。在一些实施方案中，共刺激分子是CD30L。在一些实施方案中，共刺激分子是CD48。在一些实施方案中，共刺激分子是SLAM。在一些实施方案中，共刺激分子是CD58。在一些实施方案中，共刺激分子是CD155。在一些实施方案中，共刺激分子是CD112。在一些实施方案中，共刺激分子是CD80。在一些实施方案中，共刺激分子是CD86。在一些实施方案中，共刺激分子是ICOSL。在一些实施方案中，共刺激分子是TIM3。在一些实施方案中，共刺激分子是TIM4。在一些实施方案中，共刺激分子是ICAM1。在一些实施方案中，共刺激分子是LFA3。
共刺激分子的序列包括例如(对于人类序列)：ICOS(NCBI参考序列：NM_012092.3)、CD28(NCBI参考序列：NM_006139.4)、CD27(NCBI参考序列：NM_001242.4)、HVEM(NCBI参考序列：NM_003820.3)、LIGHT(NCBI参考序列：NM_003807.4)、CD40L(NCBI参考序列：NM_000074.2)、4-1BB(NCBI参考序列：NM_001561.5)、OX40(NCBI参考序列：NM_003327.4)、DR3(NCBI参考序列：NM_148965.1)、GITR(NCBI参考序列：NM_004195.3)、CD30(GenBank：M83554.1)、SLAM(NCBI参考序列：NM_003037.4)、CD2(NCBI参考序列：NM_001328609.1)、CD226(NCBI参考序列：NM_006566.3)、半乳凝素-9(GenBank：AB040130.2)、TIM1(GenBank：U02082.1)、B7-H2(NCBI参考序列：NM_015259.5)、B7-1(NCBI参考序列：NM_005191.4)、B7-2(NCBI参考序列：NM_175862.5)、CD70(NCBI参考序列：NM_001252.5)、CD40(NCBI参考序列：NM_001250.5)、4-1BBL(NCBI参考序列：NM_003811.4)、OX40L(NCBI参考序列：NM_003326.5)、TL1A(NCBI参考序列：NM_005118.4)、GITRL(GenBank：AY358868.1)、CD30L(NCBI参考序列：NM_001244.3)、SLAM(GenBank：U33017.1)、CD48(NCBI参考序列：NM_001778.4)、CD58(NCBI参考序列：NM_001779.3)、CD155(NCBI参考序列：NM_006505.5)、CD112(NCBI参考序列：NM_001042724.2)、TIM3(GenBank：AF450242.1)、TIM4(NCBI参考序列：NM_138379.3)、ICAM1(NCBI参考序列：NM_000201.3)。
因此，在一些实施方案中，共刺激分子包含与ICOS(NCBI参考序列：NM_012092.3)、CD28(NCBI参考序列：NM_006139.4)、CD27(NCBI参考序列：NM_001242.4)、HVEM(NCBI参考序列：NM_003820.3)、LIGHT(NCBI参考序列：NM_003807.4)、CD40L(NCBI参考序列：NM_000074.2)、4-1BB(NCBI参考序列：NM_001561.5)、OX40(NCBI参考序列：NM_003327.4)、DR3(NCBI参考序列：NM_148965.1)、GITR(NCBI参考序列：NM_004195.3)、CD30(GenBank：M83554.1)、SLAM(NCBI参考序列：NM_003037.4)、CD2(NCBI参考序列：NM_001328609.1)、CD226(NCBI参考序列：NM_006566.3)、半乳凝素-9(GenBank：AB040130.2)、TIM1(GenBank：U02082.1)、B7-H2(NCBI参考序列：NM_015259.5)、B7-1(NCBI参考序列：NM_005191.4)、B7-2(NCBI参考序列：NM_175862.5)、CD70(NCBI参考序列：NM_001252.5)、CD40(NCBI参考序列：NM_001250.5)、4-1BBL(NCBI参考序列：NM_003811.4)、OX40L(NCBI参考序列：NM_003326.5)、TL1A(NCBI参考序列：NM_005118.4)、GITRL(GenBank：AY358868.1)、CD30L(NCBI参考序列：NM_001244.3)、SLAM(GenBank：U33017.1)、CD48(NCBI参考序列：NM_001778.4)、CD58(NCBI参考序列：NM_001779.3)、CD155(NCBI参考序列：NM_006505.5)、CD112(NCBI参考序列：NM_001042724.2)、TIM3(GenBank：AF450242.1)、TIM4(NCBI参考序列：NM_138379.3)、ICAM1(NCBI参考序列：NM_000201.3)、或其变体或片段至少60％(例如，至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％)同一的核酸序列。
在一些实施方案中，基因组编辑酶选自锌指核酸酶(zinc finger nuclease，ZFN)、基于转录激活因子样效应物的核酸酶(transcription activator-like effector-based nuclease，TALEN)、或成簇规律间隔短回文重复序列(clustered regularlyinterspaced short palindromic repeat，CRISPR)系统核酸酶。在一些实施方案中，基因组编辑酶是Cpf1，或其变体或同源物。在一些实施方案中，基因组编辑酶是Cas9，或其变体或同源物。
在一些实施方案中，靶蛋白包括荧光蛋白。在一些实施方案中，靶蛋白与荧光蛋白融合。在一个实施方案中，荧光蛋白包括mCherry(mCh)。在一些实施方案中，荧光蛋白包括GFP。在一些实施方案中，荧光蛋白包括YFP。
在一些实施方案中，靶蛋白包括病毒蛋白。在一些实施方案中，病毒蛋白是冠状病毒蛋白。冠状病毒构成了冠状病毒科(Coronaviridae)、巢病毒目(Nidovirales)和核糖病毒域(Riboviria)中的正冠状病毒亚科(Orthocoronavirinae)。它们是包膜病毒，具有正义单链RNA基因组和螺旋对称的核衣壳。冠状病毒的基因组大小范围从约27千碱基至34千碱基。冠状病毒的结构一般由以下组成：刺突蛋白、血凝素-酯酶二聚体(hemagglutinin-esterease dimer，HE)、膜糖蛋白(M)、包膜蛋白(E)、核衣壳蛋白(N)和RNA。冠状病毒科包含包括例如以下的属：α冠状病毒(例如，人冠状病毒229E、人冠状病毒NL63、长翼蝠冠状病毒1、长翼蝠冠状病毒HKU8、猪流行性腹泻病毒、菊头蝠冠状病毒HKU2、高头蝠冠状病毒512)、β冠状病毒(例如，COVID-19、β冠状病毒1、人冠状病毒HKU1、鼠冠状病毒、伏翼蝠冠状病毒HKU5、果蝠冠状病毒HKU9、严重急性呼吸综合征相关冠状病毒、扁颅蝠冠状病毒HKU4、中东呼吸综合征相关冠状病毒(Middle East respiratory syndrome-related coronavirus，MERS)、人冠状病毒OC43、刺猬冠状病毒1(EriCoV))、γ冠状病毒(例如，白鲸冠状病毒SW1、传染性支气管炎病毒)和6冠状病毒(例如，夜莺冠状病毒HKU11、猪冠状病毒HKU15)。在一些实施方案中，病毒蛋白是严重急性呼吸综合征相关冠状病毒的蛋白。在一些实施方案中，病毒蛋白是MERS冠状病毒的蛋白。
在一些实施方案中，病毒蛋白是COVID-19蛋白，包括例如COVID-19刺突蛋白、COVID-19包膜蛋白、COVID-19膜蛋白、或COVID-19核衣壳蛋白，或它们的片段。在一些实施方案中，病毒蛋白是COVID-19刺突蛋白的受体结合结构域。
在一些实施方案中，靶蛋白是因子IX。因子IX是作为酶原产生的人类蛋白质，是一种无活性的前体(登录号：HGNC：3551；Entrez Gene：2158；Ensembl：ENSG00000101981；OMIM：300746；UniProtKB：P00740)。在一些实施方案中，靶蛋白是苯丙氨酸羟化酶(登录号：HGNC：8582；Entrez Gene：5053；Ensembl：ENSG00000171759；OMIM：612349；UniProtKB：P00439)。在一些实施方案中，靶蛋白是CFTR。其他靶蛋白可包括但不限于酶、酶辅因子、激素、凝血因子、细胞因子、生长因子等。例如，参见US10,071,114，该专利以引用方式并入本文。
在一些实施方案中，RPS27A 5′UTR序列包括SEQ ID NO：2，并且RPS27A 3′UTR序列包括SEQ ID NO：24。在一些实施方案中，RPS27A 5′UTR序列包括SEQ ID NO：3，并且RPS27A3′UTR序列包括SEQ ID NO：24。在一些实施方案中，RPS27A 5′UTR序列包括SEQ ID NO：84，并且RPS27A 3′UTR序列包括SEQ ID NO：87。
在一些实施方案中，任何前述方面的工程化的mRNA还包含120A尾。
在一些实施方案中，任何前述方面的工程化的mRNA包括选自包括以下的组的RNA序列：SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31、SEQ IDNO：32、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ IDNO：38、SEQ ID NO：39、或SEQ ID NO：40。
在一些实施方案中，任何前述方面的工程化的mRNA包括选自包括以下的组的RNA序列：SEQ ID NO：93、SEQ ID NO：94、SEQ ID NO：95、SEQ ID NO：96、或SEQ ID NO：97。
在一些实施方案中，RPS27A 5′UTR序列是内源(野生型)RPS27A基因序列的片段。在一些实施方案中，RPS27A 5′UTR序列是RPS27A基因序列的经修饰版本(例如，包含核苷酸变化、插入、缺失等)。在一些实施方案中，RPS27A 3′UTR序列是内源(野生型)RPS27A基因序列的片段。在一些实施方案中，RPS27A 3′UTR序列是RPS27A基因序列的经修饰版本(例如，包含核苷酸变化、插入、缺失等)。
在一些实施方案中，工程化的mRNA包含经修饰的去除5′末端寡嘧啶束(oligopyrimidine tract，TOP)。在一些实施方案中，工程化的mRNA包含对一个或多个上游翻译起始密码子的修饰。
在一些实施方案中，工程化的mRNA包含用于靶蛋白的内质网(endoplasmicreticulum，ER)靶向的序列。在一些实施方案中，工程化的mRNA包含钙联蛋白序列(例如，如SEQ ID NO：27和SEQ ID NO：28中所公开的)。
在一些实施方案中，工程化的mRNA包含用于靶蛋白的线粒体靶向的序列。在一些实施方案中，工程化的mRNA包含TOM20序列(例如，如SEQ ID NO：29和SEQ ID NO：30中所公开的)。
在一些实施方案中，工程化的mRNA包含用于靶蛋白的溶酶体靶向的序列。在一些实施方案中，工程化的mRNA包含CaB序列(例如，如SEQ ID NO：31和SEQ ID NO：32中所公开的)。
在一些实施方案中，工程化的mRNA包含用于靶蛋白的细胞核靶向的序列。在一些实施方案中，工程化的mRNA包含核定位信号(nuclear localizaion signal，NLS)序列(例如，如SEQ ID NO：33和SEQ ID NO：40中所公开的)。
在一些方面中，本文公开了一种工程化的mRNA，所述工程化的mRNA包含：第一核酸序列，该第一核酸序列包含工程化的5′非翻译区(5′UTR)序列；第二核酸序列，该第二核酸序列包含异源核酸序列；以及第三核酸序列，该第三核酸序列包含RPS27A 3′非翻译区(3′UTR)序列。
在一些实施方案中，工程化的5′UTR序列选自包括以下的组：SEQ ID NO：12、SEQID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：81、SEQID NO：82、SEQ ID NO：83、SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：85、或SEQ ID NO：86。
在一些实施方案中，工程化的5′UTR序列是SEQ ID NO：12。在一些实施方案中，工程化的5′UTR序列是SEQ ID NO：13。在一些实施方案中，工程化的5′UTR序列是SEQ ID NO：14。在一些实施方案中，工程化的5′UTR序列是SEQ ID NO：15。在一些实施方案中，工程化的5′UTR序列是SEQ ID NO：16。在一些实施方案中，工程化的5′UTR序列是SEQ ID NO：17。在一些实施方案中，工程化的5′UTR序列是SEQ ID NO：18。在一些实施方案中，工程化的5′UTR序列是SEQ ID NO：19。在一些实施方案中，工程化的5′UTR序列是SEQ ID NO：20。在一些实施方案中，工程化的5′UTR序列是SEQ ID NO：21。在一些实施方案中，工程化的5′UTR序列是SEQ ID NO：22。在一些实施方案中，工程化的5′UTR序列是SEQ ID NO：23。
在一些实施方案中，工程化的5′UTR序列是SEQ ID NO：81。在一些实施方案中，工程化的5′UTR序列是SEQ ID NO：82。在一些实施方案中，工程化的5′UTR序列是SEQ ID NO：83。在一些实施方案中，工程化的5′UTR序列是SEQ ID NO：84。在一些实施方案中，工程化的5′UTR序列是SEQ ID NO：85。在一些实施方案中，工程化的5′UTR序列是SEQ ID NO：86。
在一些实施方案中，工程化的5′UTR序列选自包括以下的组：SEQ ID NO：12、SEQID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：81、SEQID NO：82、SEQ ID NO：83、SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：85、或SEQ ID NO：86，或其片段或功能活性变体。
在一些实施方案中，工程化的5′UTR序列选自包括以下的组：与SEQ ID NO：12、SEQID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：81、SEQID NO：82、SEQ ID NO：83、SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：85、或SEQ ID NO：86至少60％(例如，至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％)同一的核酸序列。
在一些实施方案中，工程化的5′UTR序列包括SEQ ID NO：18，并且RPS27A 3′UTR序列包括SEQ ID NO：24。在一些实施方案中，工程化的5′UTR序列包括SEQ ID NO：21，并且RPS27A 3′UTR序列包括SEQ ID NO：24。在一些实施方案中，工程化的5′UTR序列包括SEQ IDNO：22，并且RPS27A 3′UTR序列包括SEQ ID NO：24。在一些实施方案中，工程化的5′UTR序列包括SEQ ID NO：23，并且RPS27A 3′UTR序列包括SEQ ID NO：24。在一些实施方案中，工程化的5′UTR序列包括SEQ ID NO：84，并且RPS27A 3′UTR序列包括SEQ ID NO：24。在一些实施方案中，工程化的5′UTR序列包括SEQ ID NO：84，并且RPS27A 3′UTR序列包括SEQ ID NO：87。在一些实施方案中，工程化的5′UTR序列包括SEQ ID NO：82，并且RPS27A 3′UTR序列包括SEQ ID NO：24。在一些实施方案中，工程化的5′UTR序列包括SEQ ID NO：83，并且RPS27A 3′UTR序列包括SEQ ID NO：24。在一些实施方案中，工程化的5′UTR序列包括SEQ ID NO：84，并且RPS27A 3′UTR序列包括SEQ ID NO：89。在一些实施方案中，工程化的5′UTR序列包括SEQID NO：84，并且RPS27A 3′UTR序列包括SEQ ID NO：91。
在一些实施方案中，与对照相比(例如，与靶蛋白的内源性5′UTR和/或3′UTR相比，或与本领域中已知的附加5′UTR和/或3′UTR相比)，当与RPS27A 5′UTR序列和/或RPS27A 3′UTR序列可操作地连接时，靶蛋白的表达增加了大于约10％、大于约20％、大于约30％、大于约40％、大于约50％、大于约60％、大于约70％、大于约80％、大于约90％、大于约100％，以及更多)。
在一些实施方案中，与对照相比(例如，与靶蛋白的内源性5′UTR和/或3′UTR相比，或与本领域中已知的附加5′UTR和/或3′UTR相比)，当与工程化的5′UTR序列和/或RPS27A3′UTR序列可操作地连接时，靶蛋白的表达增加了大于约10％、大于约20％、大于约30％、大于约40％、大于约50％、大于约60％、大于约70％、大于约80％、大于约90％、大于约100％，以及更多)。
在一些方面中，本文公开了一种包含任何前述方面的工程化的mRNA的载体。在一些实施方案中，细胞包含任何前述方面的载体。在一些实施方案中，细胞来自包括小鼠、大鼠、人类或非人类灵长类动物的组。在一些实施方案中，细胞来自小鼠。在一些实施方案中，细胞来自大鼠。在一些实施方案中，细胞来自人类。在一些实施方案中，细胞来自非人类灵长类动物。
在一些方面中，本文公开了一种增加蛋白质表达的方法，所述方法包括以下步骤：向细胞中引入工程化的mRNA，所述工程化的mRNA包含：第一核酸序列，所述第一核酸序列包含RPS27A 5′UTR序列；第二核酸序列，所述第二核酸序列包含异源核酸序列；以及第三核酸序列，所述第三核酸序列包含RPS27A 3′UTR序列。
在一些实施方案中，RPS27A 5′UTR序列选自包括以下的组：SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、或SEQ ID NO：11。在一些实施方案中，RPS27A 5′UTR序列是SEQ ID NO：1。在一些实施方案中，RPS27A 5′UTR序列是SEQ ID NO：2。在一些实施方案中，RPS27A 5′UTR序列是SEQ ID NO：3。在一些实施方案中，RPS27A 5′UTR序列是SEQ ID NO：4。在一些实施方案中，RPS27A 5′UTR序列是SEQ ID NO：5。在一些实施方案中，RPS27A 5′UTR序列是SEQ ID NO：6。在一些实施方案中，RPS27A 5′UTR序列是SEQ ID NO：7。在一些实施方案中，RPS27A 5′UTR序列是SEQ ID NO：8。在一些实施方案中，RPS27A 5′UTR序列是SEQ IDNO：9。在一些实施方案中，RPS27A 5′UTR序列是SEQ ID NO：10。在一些实施方案中，RPS27A5′UTR序列是SEQ ID NO：11。
在一些方面中，本文公开了一种增加蛋白质表达的方法，所述方法包括以下步骤：向细胞中引入工程化的mRNA，所述工程化的mRNA包含：第一核酸序列，所述第一核酸序列包含工程化的5′UTR序列；第二核酸序列，所述第二核酸序列包含异源核酸序列；以及第三核酸序列，所述第三核酸序列包含RPS27A 3′UTR序列。
在一些实施方案中，工程化的5′UTR序列选自包括以下的组：SEQ ID NO：12、SEQID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、或SEQ ID NO：23。在一些实施方案中，工程化的5′UTR序列是SEQ ID NO：12。在一些实施方案中，工程化的5′UTR序列是SEQ IDNO：13。在一些实施方案中，工程化的5′UTR序列是SEQ ID NO：14。在一些实施方案中，工程化的5′UTR序列是SEQ ID NO：15。在一些实施方案中，工程化的5′UTR序列是SEQ ID NO：16。在一些实施方案中，工程化的5′UTR序列是SEQ ID NO：17。在一些实施方案中，工程化的5′UTR序列是SEQ ID NO：18。在一些实施方案中，工程化的5′UTR序列是SEQ ID NO：19。在一些实施方案中，工程化的5′UTR序列是SEQ ID NO：20。在一些实施方案中，工程化的5′UTR序列是SEQ ID NO：21。在一些实施方案中，工程化的5′UTR序列是SEQ ID NO：22。在一些实施方案中，工程化的5′UTR序列是SEQ ID NO：23。
在一些实施方案中，本文所公开的核酸序列是分离的。在一些实施方案中，本文所公开的核酸序列是重组的。
在一些实施方案中，异源核酸序列编码靶蛋白。异源核酸序列或靶蛋白可以是任何感兴趣的核酸序列/蛋白。
在一些实施方案中，靶蛋白包括荧光蛋白。在一些实施方案中，靶蛋白与荧光蛋白融合。在一个实施方案中，荧光蛋白包括mCherry(mCh)。在一些实施方案中，荧光蛋白包括GFP。在一些实施方案中，荧光蛋白包括YFP。
在一些实施方案中，RPS27A 3′UTR序列选自包括以下的组：SEQ ID NO：24、SEQ IDNO：25、或SEQ ID NO：26。在一些实施方案中，RPS27A 3′UTR序列是SEQ ID NO：24。在一些实施方案中，RPS27A 3′UTR序列是SEQ ID NO：25。在一些实施方案中，RPS27A 3′UTR序列是SEQ ID NO：26。
在一些方面中，本文公开了一种工程化的mRNA，所述工程化的mRNA包含：第一核酸序列，所述第一核酸序列包含RPS27A 5′UTR序列；和第二核酸序列，所述第二核酸序列包含异源核酸序列。在一些方面中，本文公开了一种工程化的mRNA，所述工程化的mRNA包含：第一核酸序列，所述第一核酸序列包含工程化的5′UTR序列；和第二核酸序列，所述第二核酸序列包含异源核酸序列。在一些方面中，本文公开了一种工程化的mRNA，所述工程化的mRNA包含：包含RPS27A 3′UTR序列的核酸序列；和第二核酸序列，所述第二核酸序列包含异源核酸序列。这些工程化的mRNA可在本文所述的载体、细胞或方法中的任一者中使用。
在本文的实施方案中，RPS27A 5′UTR序列可操作地连接至异源核酸序列。在本文的实施方案中，工程化的5′UTR序列可操作地连接至异源核酸序列。在本文的实施方案中，RPS27A 3′UTR序列可操作地连接至异源核酸序列。
在一些实施方案中，本文所公开的核酸(工程化的mRNA)包含至少一种化学修饰的核苷酸。在一些实施方案中，至少一种化学修饰的核苷酸包含化学修饰的核碱基、化学修饰的核糖、化学修饰的磷酸二酯键、或它们的组合。
在一个实施方案中，至少一种化学修饰的核苷酸是化学修饰的核碱基。
在一个实施方案中，化学修饰的核碱基选自5-甲酰胞苷(5fC)、5-甲基胞苷(5meC)、5-甲氧基胞苷(5moC)、5-羟基胞苷(5hoC)、5-羟基甲基胞苷(5hmC)、5-甲酰尿苷(5fU)、5-甲基尿苷(5-meU)、5-甲氧基尿苷(5moU)、5-羧甲基酯尿苷(5camU)、假尿苷(Ψ)、N1-甲基假尿苷(me1Ψ)、N6-甲基腺苷(me6A)、或噻吩鸟苷(thG)。
在一些实施方案中，化学修饰的核碱基是5-甲氧基尿苷(5moU)。在一些实施方案中，化学修饰的核碱基是假尿苷(Ψ)。在一些实施方案中，化学修饰的核碱基是N1-甲基假尿苷(me1Ψ)。
这些修饰的核碱基的结构如下所示：
在一个实施方案中，至少一种化学修饰的核苷酸是化学修饰的核糖。
在一个实施方案中，化学修饰的核糖选自2′-O-甲基(2′-O-Me)、2′-氟(2′-F)、2′-脱氧-2′-氟-β-D-阿拉伯-核酸(2′F-ANA)、4′-S、4′-SFANA、2′-叠氮基、UNA、2′-O-甲氧基-乙基(2′-O-ME)、2′-O-烯丙基、2′-O-乙胺、2′-O-氰乙基、锁核酸(LAN)、亚甲基-cLAN、N-MeO-氨基BNA、或N-MeO-氨基氧基BNA。在一个实施方案中，化学修饰的核糖是2′-O-甲基(2′-O-Me)。在一个实施方案中，化学修饰的核糖是2′-氟(2′-F)。
这些修饰的核糖的结构如下所示：
在一个实施方案中，至少一种化学修饰的核苷酸是化学修饰的磷酸二酯键。
在一个实施方案中，化学修饰的磷酸二酯键选自硫代磷酸酯(phosphorothioate，PS)、硼代磷酸酯、二硫代磷酸酯(phosphodithioate，PS2)、3′，5′-酰胺、N3′-氨基磷酸酯(NP)、磷酸二酯(PO)、或2′，5′-磷酸二酯(2′，5′-PO)。在一个实施方案中，化学修饰的磷酸二酯键是硫代磷酸酯。
这些修饰的磷酸二酯键的结构如下所示：
在一些实施方案中，异源核酸序列相对于5′UTR序列是异源的。在一些实施方案中，异源核酸序列相对于3′UTR序列是异源的。在一些实施方案中，异源核酸序列相对于5′UTR序列和3′UTR序列都是异源的。在一些方面中，本文公开了一种包含编码任何前述方面的工程化的RNA的核酸的载体。在一些实施方案中，载体包含选自包括以下的组的核酸序列：SEQ ID NO：41至SEQ ID NO：66。
在一些方面中，本文公开了一种包含任何前述方面的工程化的RNA或载体的细胞。
在一些方面中，本文公开了一种增加蛋白质表达的方法，所述方法包括以下步骤：
将工程化的mRNA导入细胞中，所述工程化的mRNA包含：
第一核酸序列，所述第一核酸序列包含RPS27A 5′UTR序列或工程化的5′非翻译区(5′UTR)序列；
第二核酸序列，所述第二核酸序列包含异源核酸序列；和
第三核酸序列，所述第三核酸序列包含RPS27A 3′UTR序列。
在一些方面中，本文公开了一种用于治疗、预防、减少和/或抑制病毒感染的疫苗，所述疫苗包含工程化的mRNA，所述工程化的mRNA包含：
第一核酸序列，所述第一核酸序列包含RPS27A 5′非翻译区(5′UTR)序列或工程化的5′非翻译区(5′UTR)序列；
第二核酸序列，所述第二核酸序列包含异源核酸序列；和
第三核酸序列，所述第三核酸序列包含RPS27A 3′非翻译区(3′UTR)序列，其中所述异源核酸序列编码病毒蛋白。
在一些实施方案中，病毒蛋白是COVID-19蛋白，包括例如COVID-19刺突蛋白、COVID-19包膜蛋白、COVID-19膜蛋白、或COVID-19核衣壳蛋白，或它们的片段。在一些实施方案中，病毒蛋白是COVID-19刺突蛋白的受体结合结构域。
因此，在一些实施方案中，任何前述方面的疫苗包含与SEQ ID NO：93、SEQ ID NO：94、SEQ ID NO：95、SEQ ID NO：96、或SEQ ID NO：97或其功能片段至少60％(例如，至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％)同一的RNA序列。在一些实施方案中，任何前述方面的疫苗包含选自包括以下的组的RNA序列：SEQ ID NO：93、SEQ ID NO：94、SEQ ID NO：95、SEQ IDNO：96、或SEQ ID NO：97。
在一些实施方案中，疫苗还包含佐剂。在一些实施方案中，疫苗还包含药学上可接受的载体。
在一些方面中，本文公开了一种治疗、预防、减少和/或抑制受试者中的病毒感染的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的任何前述方面的疫苗。
实施例
下面叙述了以下实施例以说明根据所公开主题的化合物、系统、方法和结果。这些实施例并不旨在包括本文所公开的主题的所有方面，而是为了说明代表性方法和结果。这些实施例并不旨在排除对本领域技术人员显而易见的本发明的等同物和变体。
实施例1
在A549细胞和Hep3B细胞中，具有经修饰的来自小鼠核糖体蛋白S27a基因的5′UTR和3′UTR的荧光素酶mRNA的表现优于文献中公布的那些具有UTR的mRNA。AG、AG+G、不具有3UTR的AG+G和CYBA是与其他工程化的mRNA具有相同的编码序列的对照荧光素酶mRNA。AG的5′UTR和3′UTR来自人类α珠蛋白基因(基因符号：HBA1)。AG+G是经修饰的AG，其具有在5′UTR的末端插入的一个额外G以创建完整的Kozak序列(GCCACC)。不具有3UTR的AG+G具有与AG+G相同的5′UTR并且去除了3′UTR。CYBA具有来自人类细胞色素b-245α多肽基因(基因符号：CYBA)的5′UTR和3′UTR。所有的mRNA都是由脂质转染胺3000递送的。
实施例2
具有非天然5′UTR的eGFP mRNA进一步增强了A549细胞、Hep3B细胞和293T细胞中的蛋白表达(n＝2)。如实施例1所述，不具有3UTR的AG+G和CYBA是对照荧光素酶mRNA。所有的mRNA都是由脂质转染胺3000递送的。
实施例3
与未修饰的mRNA相比，在A549细胞中具有5UTR-18和3UTR-1的荧光素酶mRNA显示出增加的具有假尿苷修饰(pU)的蛋白质表达(n＝3)。所有的mRNA都是由脂质转染胺3000递送的。
实施例4
与肺肿瘤细胞系(A549)中相比，具有5UTR-22+3UTR-1和5UTR-23+3UTR-1的经假尿苷修饰的荧光素酶mRNA在肝脏肿瘤细胞系(Hep3B)中显示出选择性的基因表达。所有的mRNA都是由脂质转染胺3000递送的(n＝3)。
实施例5
在此公开的具有5′UTR和3′UTR序列的靶向细胞器的eGFP/mCherry mRNA可应用于活Hep3B细胞中的细胞器成像。通过与市售细胞器成像探针共定位，验证了这些靶向细胞器的eGFP/mCherry mRNA的细胞器成像能力。所有的mRNA都是由脂质转染胺3000递送的。
实施例6
图6A和图6B中的结果分别是在Hep3B细胞和293T细胞中获得的。所有mRNA都利用相同的3′UTR：3UTR1。所有的mRNA都是使用假尿苷合成的，以在体外转录中完全取代UTP。70nt的具有5′UTR的mRNA显示出最高的表达。AG+G和CYBA是具有先前公布的UTR的对照荧光素mRNA。AG+G的5′UTR和3′UTR来自人类α珠蛋白基因(基因符号：HBA1)，其具有在5′UTR的末端插入的一个额外G以创建完整的Kozak序列(GCCACC)。CYBA具有来自人类细胞色素b-245α多肽基因(基因符号：CYBA)的5′UTR和3′UTR。所有的mRNA都是由脂质转染胺3000递送的。
实施例7
图7A和图7B中的结果分别是在Hep3B细胞和293T细胞中获得的。所有mRNA都利用相同的3′UTR：3UTR-1。所有的mRNA都是使用假尿苷合成的，以在体外转录中完全取代UTP。5UTR-18中的微小RNA靶位点的去除产生了5UTR-28。5UTR-25中微小RNA靶位点的去除产生了5UTR-27。5UTR-26中微小RNA靶位点的去除产生了5UTR-29。具有5UTR-27的mRNA显示出最高的表达。AG+G和CYBA是具有先前公布的UTR的对照荧光素mRNA。AG+G的5′UTR和3′UTR来自人类α珠蛋白基因(基因符号：HBA1)，其具有在5′UTR的末端插入的一个额外G以创建完整的Kozak序列(GCCACC)。CYBA具有来自人类细胞色素b-245α多肽基因(基因符号：CYBA)的5′UTR和3′UTR。所有的mRNA都是由脂质转染胺3000递送的。
实施例8
图8A和图8B中的结果分别是在Hep3B细胞和293T细胞中获得的。所有mRNA都利用相同的5′UTR：5UTR-27。将功能基序A添加到3UTR-1产生了3UTR-4。将功能基序B添加到3UTR-1产生了3UTR-5。将功能基序C添加到3UTR-1产生了3UTR-6。具有3UTR-4的mRNA显示出最高的表达。所有的mRNA都是使用假尿苷合成的，以在体外转录中完全取代UTP。AG+G和CYBA是具有先前公布的UTR的对照荧光素mRNA。AG+G的5′UTR和3′UTR来自人类α珠蛋白基因(基因符号：HBA1)，其具有在5′UTR的末端插入的一个额外G以创建完整的Kozak序列(GCCACC)。CYBA具有来自人类细胞色素b-245α多肽基因(基因符号：CYBA)的5′UTR和3′UTR。所有的mRNA都是由脂质转染胺3000递送的。
序列
5UTR-1(T44)
来自小鼠核糖体蛋白S27a基因(基因符号：RPS27A)的转录物ENSMUST00000102844的5′UTR
5UTR-2(T44-top)
去除了5′末端寡嘧啶束(5′TOP)的对5UTR-1的修饰
5UTR-3(T44-top-uAUG)
5UTR-2的修饰：两个上游翻译起始密码子AUG被修饰为UAG
5UTR-4(截断的-T44-top-uAUG)
在GGG截断后具有前83个核苷酸的5UTR-3的修饰
5UTR-5(截断的-T44-top-uAUG-2AUG)
在编码区中的AUG前添加一个额外的AUG，从而得到两个串联的AUG翻译起始密码子而进行的对5UTR-4的修饰
5UTR-6(T45)
来自小鼠核糖体蛋白S27a基因(基因符号：RPS27A)的转录物ENSMUST00000102845的5′UTR
5UTR-7(T45-top)
去除了5′末端寡嘧啶束(5′TOP)的对5UTR-6的修饰
5UTR-8(T17)
来自人类核糖体蛋白S27a基因(基因符号：RPS27A)的转录物ENST00000272317的5′UTR
5UTR-9(T 17-TOP)
去除了5′末端寡嘧啶束(5′TOP)的对5UTR-8的修饰
5UTR-10(T35)
来自人类核糖体蛋白S27a基因(基因符号：RPS27A)的转录物ENST00000404735的5′UTR
5UTR-11(T35-TOP)
去除了5′末端寡嘧啶束(5′TOP)的对5UTR-10的修饰
5UTR-12(10nt)
具有GGG、kozak序列(GCCACC)和最小二级结构的10nt非天然5′UTR
5UTR-13(20nt)
具有GGG、kozak序列(GCCACC)和最小二级结构的20nt非天然5′UTR
5UTR-14(30nt)
具有GGG、kozak序列(GCCACC)和最小二级结构的30nt非天然5′UTR
5UTR-15(40nt)
具有GGG、kozak序列(GCCACC)和最小二级结构的40nt非天然5′UTR
5UTR-16(50nt)
具有GGG、kozak序列(GCCACC)和最小二级结构的50nt非天然5′UTR
5UTR-17(60nt)
具有GGG、kozak序列(GCCACC)和最小二级结构的60nt非天然5′UTR
5UTR-18(70nt＝0305K)
具有GGG、kozak序列(GCCACC)和最小二级结构的70nt非天然5′UTR
5UTR-19(100nt)
具有GGG、kozak序列(GCCACC)和最小二级结构的100nt非天然5′UTR
5UTR-20(50nt＝0301K-1)
具有GGG、kozak序列(GCCACC)和最小二级结构的替代50nt非天然5′UTR
5UTR-21(50nt＝0301K-2)
具有GGG、kozak序列(GCCACC)和最小二级结构的替代50nt非天然5′UTR
5UTR-22(70nt＝1015K-A)
具有G、kozak序列(GCCACC)、最小二级结构和经修饰的ACGU含量(25％的GC、27％的A、37％的U)的70nt非天然5′UTR
5UTR-23(70nt＝1015K-B)
具有G、kozak序列(GCCACC)、最小二级结构和经修饰的ACGU含量(25％的GC、17％的A、48％的U)的70nt非天然5′UTR
3UTR-1(T44/45)
来自小鼠核糖体蛋白S27a基因(基因符号：RPS27A)的转录物ENSMUST00000102844和ENSMUST00000102845的3′UTR
3UTR-2(T35)
来自人类核糖体蛋白S27a基因(基因符号：RPS27A)的转录物ENST00000404735的3′UTR
3UTR-3(T17)
来自人类核糖体蛋白S27a基因(基因符号：RPS27A)的转录物ENST00000272317的3′UTR
T44-TOP-uAUG-钙联蛋白-EGFP(靶向ER的eGFP mRNA)
T44-TOP-uAUG-钙联蛋白-mCherry(靶向ER的mCherry mRNA)
T44-TOP-uAUG-TOM20-EGFP(靶向线粒体的eGFP mRNA)
T44-TOP-uAUG-TOM20-mCherry(靶向线粒体的mCherry mRNA)
T44-TOP-uAUG-CatB-EGFP(靶向溶酶体的eGFP mRNA)
T44-TOP-uAUG-CatB-mCherry(靶向溶酶体的mCherry mRNA)
T44-top-uAUG-NLS-eGFP-NLS(靶向细胞核的eGFP mRNA)
T44-top-uAUG-NLS-mCherry-NLS(靶向细胞核的mCherry mRNA)
T44-TOP-uAUG-TOM20-mCherry-P2A-钙联蛋白-eGFP
T44-TOP-uAUG-TOM20-mCherry-P2A-CatB-eGFP
T44-TOP-uAUG-TOM20-mCherry-P2A-NLS-eGFP-NLS
T44-TOP-uAUG-TOM20-mCherry-GGGGS4-钙联蛋白-eGFP
T44-TOP-uAUG-TOM20-mCherry-GGGGS4-CatB-eGFP
T44-TOP-uAUG-TOM20-mCherry-GGGGS4-NLS-eGFP-NLS
本文还公开了针对上述RNA序列的DNA序列：
5UTR-1(T44)
来自小鼠核糖体蛋白S27a基因(基因符号：RPS27A)的转录物ENSMUST00000102844的5′UTR
5UTR-2(T44-top)
去除了5′末端寡嘧啶束(5′TOP)的对5UTR-1的修饰
5UTR-3(T44-top-uATG)
5UTR-2的修饰：两个上游翻译起始密码子ATG被修饰为TAG
5UTR-4(截断的-T44-top-uATG)
在GGG截断后具有前83个核苷酸的5UTR-3的修饰
5UTR-5(截断的-T44-top-uATG-2ATG)
在编码区中的ATG前添加一个额外的ATG，从而得到两个串联的ATG翻译起始密码子而进行的对5UTR-4的修饰
5UTR-6(T45)
来自小鼠核糖体蛋白S27a基因(基因符号：RPS27A)的转录物ENSMUST00000102845的5′UTR
5UTR-7(T45-top)
去除了5′末端寡嘧啶束(5′TOP)的对5UTR-6的修饰
5UTR-8(T17)
来自人类核糖体蛋白S27a基因(基因符号：RPS27A)的转录物ENST00000272317的5′UTR
5UTR-9(T17-TOP)
去除了5′末端寡嘧啶束(5′TOP)的对5UTR-8的修饰
5UTR-10(T35)
来自人类核糖体蛋白S27a基因(基因符号：RPS27A)的转录物ENST00000404735的5′UTR
5UTR-11(T35-TOP)
去除了5′末端寡嘧啶束(5′TOP)的对5UTR-10的修饰
5UTR-12(10nt)
具有GGG、kozak序列(GCCACC)和最小二级结构的10nt非天然5′UTR
5UTR-13(20nt)
具有GGG、kozak序列(GCCACC)和最小二级结构的20nt非天然5′UTR
5UTR-14(30nt)
具有GGG、kozak序列(GCCACC)和最小二级结构的30nt非天然5′UTR
GGGAAAGAAACAGGACAGAAAACAGCCACC(SEQ ID NO：54)
5UTR-15(40nt)
具有GGG、kozak序列(GCCACC)和最小二级结构的40nt非天然5′UTR
5UTR-16(50nt)
具有GGG、kozak序列(GCCACC)和最小二级结构的50nt非天然5′UTR
5UTR-17(60nt)
具有GGG、kozak序列(GCCACC)和最小二级结构的60nt非天然5′UTR
5UTR-18(70nt＝0305K)
具有GGG、kozak序列(GCCACC)和最小二级结构的70nt非天然5′UTR
5UTR-19(100nt)
具有GGG、kozak序列(GCCACC)和最小二级结构的100nt非天然5′UTR
5UTR-20(50nt＝0301K-1)
具有GGG、kozak序列(GCCACC)和最小二级结构的替代50nt非天然5′UTR
5UTR-21(50nt＝0301K-2)
具有GGG、kozak序列(GCCACC)和最小二级结构的替代50nt非天然5′UTR
5UTR-22(70nt＝1015K-A)
具有G、kozak序列(GCCACC)、最小二级结构和经修饰的ACGU含量(25％的GC、27％的A、37％的U)的70nt非天然5′UTR
5UTR-23(70nt＝1O 15K-B)
具有G、kozak序列(GCCACC)、最小二级结构和经修饰的ACGU含量(25％的GC、17％的A、48％的U)的70nt非天然5′UTR
3UTR-1(T44/45)
来自小鼠核糖体蛋白S27a基因(基因符号：RPS27A)的转录物ENSMUST00000102844和ENSMUST00000102845的3′UTR
3UTR-2(T35)
来自人类核糖体蛋白S27a基因(基因符号：RPS27A)的转录物ENST00000404735的3′UTR
3UTR-3(T17)
来自人类核糖体蛋白S27a基因(基因符号：RPS27A)的转录物ENST00000272317的3′UTR
T44-TOP-uATG-钙联蛋白-EGFP(靶向ER的eGFP mRNA)
T44-TOP-uATG-钙联蛋白-mCherry(靶向ER的mCherry mRNA)
T44-TOP-uATG-TOM20-EGFP(靶向线粒体的eGFP mRNA)
T44-TOP-uATG-TOM20-mCherry(靶向线粒体的mCherry mRNA)
T44-TOP-uATG-CatB-EGFP(靶向溶酶体的eGFP mRNA)
T44-TOP-uATG-CatB-mCherry(靶向溶酶体的mCherry mRNA)
T44-top-uATG-NLS-eGFP-NLS(靶向细胞核的eGFP mRNA)
T44-top-uATG-NLS-mCherry-NLS(靶向细胞核的mCherry mRNA)
T44-TOP-uATG-TOM20-mCherry-P2A-钙联蛋白-eGFP
T44-TOP-uATG-TOM20-mCherry-P2A-CatB-eGFP
T44-TOP-uATG-TOM20-mCherry-P2A-NLS-eGFP-NLS
T44-TOP-uATG-TOM20-mCherry-GGGGS4-钙联蛋白-eGFP
T44-TOP-uATG-TOM20-mCherry-GGGGS4-CatB-eGFP
T44-TOP-uATG-TOM20-mCherry-GGGGS4-NLS-eGFP-NLS
5UTR-24
具有GGG、kozak序列(GCCACC)和最小二级结构的90nt非天然5′UTR
5UTR-25
具有GG、kozak序列(GCCACC)、最小二级结构和经修饰的核苷酸组成的70nt非天然5′UTR。
5UTR-26
具有GG、kozak序列(GCCACC)、最小二级结构和经修饰的核苷酸组成的70nt非天然5′UTR。
5UTR-27
与在5UTR-25中没有微小RNA靶位点的5UTR-25具有相同的长度和核苷酸组成的非天然5′UTR。
5UTR-28
与在5UTR-18中没有微小RNA靶位点的5UTR-18具有相同的长度和核苷酸组成的非天然5′UTR。
5UTR-29
与在5UTR-26中没有微小RNA靶位点的5UTR-26具有相同的长度和核苷酸组成的非天然5′UTR。
3UTR-4
具有附加至3′端的功能基序A(加下划线)的经修饰的3UTR-1。
基序A
3UTR-5
具有附加至3′端的功能基序B(加下划线)的经修饰的3UTR-1。
基序B
3UTR-6
具有附加至3′端的功能基序C(加下划线)的经修饰的3UTR-1。
基序C
COVID-19 mRNA疫苗1
利用5UTR-27、3UTR-4和120A尾来表达冠状病毒(COVID-19)刺突蛋白作为抗原的mRNA的全长序列(SEQ ID NO：93)
COVID-19 mRNA疫苗2
利用5UTR-27、3UTR-4和120A尾来表达刺突蛋白的冠状病毒(COVID-19)受体结合结构域(RBD)作为抗原的mRNA的全长序列(SEQ ID NO：94)
COVID-19 mRNA疫苗3
利用5UTR-27、3UTR-4和120A尾来表达冠状病毒(COVID-19)包膜蛋白作为抗原的mRNA的全长序列(SEQ ID NO：95)
COVID-19 mRNA疫苗4
利用5UTR-27、3UTR-4和120A尾来表达冠状病毒(COVID-19)膜蛋白作为抗原的mRNA的全长序列(SEQ ID NO：96)
COVID-19 mRNA疫苗5
利用5UTR-27、3UTR-4和120A尾来表达冠状病毒(COVID-19)核衣壳蛋白作为抗原的mRNA的全长序列(SEQ ID NO：97)
除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语均具有与公开的发明所属领域的技术人员通常所理解的含义相同的含义。本文所引用的出版物以及引用所述出版物所涉及到的材料明确地以引用的方式并入。
本领域的一般技术人员将会理解，可以对本发明的优选实施方案做出各种变化和修改，并且可以在不脱离本发明的精神的情况下做出这些变化和修改。因此，随附权利要求书意欲涵盖在本发明的真实精神和范围内的所有这些等同变化。
Claims (32)
1.一种工程化的mRNA，所述工程化的mRNA包含：
第一核酸序列，所述第一核酸序列包含RPS27A 5′非翻译区(5′UTR)序列或工程化的5′非翻译区(5′UTR)序列；
第二核酸序列，所述第二核酸序列包含异源核酸序列；和
第三核酸序列，所述第三核酸序列包含RPS27A 3′非翻译区(3′UTR)序列。
2.如权利要求1所述的工程化的mRNA，其中所述RPS27A 5′UTR序列或所述工程化的5′UTR序列选自包括以下的组：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ IDNO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ IDNO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ IDNO：23、SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：82、SEQ ID NO：83、SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：85、或SEQID NO：86。
3.如权利要求1或2所述的工程化的mRNA，其中所述异源核酸序列编码靶蛋白。
4.如权利要求3所述的工程化的mRNA，其中所述靶蛋白包括荧光蛋白。
5.如权利要求4所述的工程化的mRNA，其中所述荧光蛋白包括GFP或mCherry。
6.如权利要求3所述的工程化的mRNA，其中所述靶蛋白包括病毒蛋白。
7.如权利要求6所述的工程化的mRNA，其中所述病毒蛋白是COVID-19蛋白。
8.如权利要求3所述的工程化的mRNA，其中所述靶蛋白包含共刺激分子。
9.如权利要求8所述的工程化的mRNA，其中所述共刺激分子选自ICOS、CD28、CD27、HVEM、LIGHT、CD40L、4-1BB、OX40、DR3、GITR、CD30、SLAM、CD2、CD226、半乳凝素9、TIM1、LFA1、B7-H2、B7-1、B7-2、CD70、LIGHT、HVEM、CD40、4-1BBL、OX40L、TL1A、GITRL、CD30L、SLAM、CD48、CD58、CD155、CD112、CD80、CD86、ICOSL、TIM3、TIM4、ICAM1或LFA3。
10.如权利要求1至9中任一项所述的工程化的mRNA，其中所述RPS27A 3′UTR序列选自包括以下的组：SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：87、SEQ ID NO：89、或SEQ ID NO：91。
11.如权利要求1至10中任一项所述的工程化的mRNA，所述工程化的mRNA包括选自包括以下的组的RNA序列：SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ IDNO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36、SEQ IDNO：37、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39、或SEQ ID NO：40。
12.如权利要求1至10中任一项所述的工程化的mRNA，所述工程化的mRNA包括选自包括以下的组的RNA序列：SEQ ID NO：93、SEQ ID NO：94、SEQ ID NO：95、SEQ ID NO：96、或SEQID NO：97。
13.如权利要求1至12中任一项所述的工程化的mRNA，其中所述工程化的mRNA包含至少一种经化学修饰的核苷酸。
14.如权利要求13所述的工程化的mRNA，其中所述至少一种经化学修饰的核苷酸是经化学修饰的核碱基。
15.如权利要求14所述的工程化的mRNA，其中所述经化学修饰的核碱基是假尿苷。
16.一种载体，所述载体包含编码如权利要求1至15中任一项所述的工程化的mRNA的核酸。
17.一种细胞，所述细胞包含如权利要求16所述的载体。
18.一种增加蛋白质表达的方法，所述方法包括以下步骤：
将工程化的mRNA导入细胞中，所述工程化的mRNA包含：
第一核酸序列，所述第一核酸序列包含RPS27A 5′UTR序列或工程化的5′非翻译区(5′UTR)序列；
第二核酸序列，所述第二核酸序列包含异源核酸序列；和
第三核酸序列，所述第三核酸序列包含RPS27A 3′UTR序列。
19.如权利要求18所述的方法，其中所述RPS27A 5′UTR序列或所述工程化的5′UTR序列选自包括以下的组：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQID NO：81、SEQ ID NO：82、SEQ ID NO：83、SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：85、或SEQ ID NO：86。
20.如权利要求18或19所述的方法，其中所述异源核酸序列编码靶蛋白。
21.如权利要求20所述的方法，其中所述靶蛋白包括荧光蛋白。
22.如权利要求21所述的方法，其中所述荧光蛋白包括GFP或mCherry。
23.如权利要求20所述的方法，其中所述靶蛋白包括病毒蛋白。
24.如权利要求23所述的方法，其中所述病毒蛋白是COVID-19蛋白。
25.如权利要求20所述的方法，其中所述靶蛋白包含共刺激分子。
26.如权利要求25所述的方法，其中所述共刺激分子选自ICOS、CD28、CD27、HVEM、LIGHT、CD40L、4-1BB、OX40、DR3、GITR、CD30、SLAM、CD2、CD226、半乳凝素9、TIM1、LFA1、B7-H2、B7-1、B7-2、CD70、LIGHT、HVEM、CD40、4-1BBL、OX40L、TL1A、GITRL、CD30L、SLAM、CD48、CD58、CD155、CD112、CD80、CD86、ICOSL、TIM3、TIM4、ICAM1或LFA3。
27.如权利要求18至26中任一项所述的方法，其中所述RPS27A 3′UTR序列选自包括以下的组：SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：87、SEQ ID NO：89、或SEQID NO：91。
28.如权利要求18至27中任一项所述的方法，其中所述工程化的mRNA包括选自包括以下的组的RNA序列：SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ IDNO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36、SEQ IDNO：37、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39、或SEQ ID NO：40。
29.如权利要求18至27中任一项所述的方法，其中所述工程化的mRNA包括选自包括以下的组的RNA序列：SEQ ID NO：93、SEQ ID NO：94、SEQ ID NO：95、SEQ ID NO：96、或SEQ IDNO：97。
30.如权利要求18至29中任一项所述的方法，其中所述工程化的mRNA包含至少一种经化学修饰的核苷酸。
31.如权利要求30所述的方法，其中所述至少一种经化学修饰的核苷酸是经化学修饰的核碱基。
32.如权利要求31所述的方法，其中所述经化学修饰的核碱基是假尿苷。
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