CN115724999B - 串联式杂合三聚体新冠疫苗 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种新型冠状病毒原型株、Delta和Omicron变异株的重组嵌合抗原、其制备方法和应用。本发明的重组嵌合抗原由来自新型冠状病毒原型株、Delta和Omicron变异株的RBD结构域的氨基酸序列(或其衍生序列)直接串联或者通过适当的连接序列串联而成；相较于新冠病毒原型株的RBD同源三聚体，本发明的重组嵌合抗原具有更高的免疫原性，能够高效地激活广谱保护性抗体，对原始毒株以及当前流行的各种变异株都能起到很好的预防或治疗效果。

Description

串联式杂合三聚体新冠疫苗
交叉引用
本申请要求于2022年5月11日提交的、申请号为202210510493.8、发明名称为“串联式杂合三聚体新冠疫苗”的中国专利申请的优先权，其全部内容通过引用并入本文。
技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及一种串联式杂合三聚体新冠疫苗，具体地，涉及一种新型冠状病毒原型株、Delta和Omicron变异株的重组嵌合抗原、其相关产品、制备方法和应用。
背景技术
新型冠状病毒(SARS-CoV-2)属于冠状病毒科β-冠状病毒属，是正链RNA囊膜病毒，能够广泛感染人和动物。目前已鉴定出能够感染人类的冠状病毒共有七种，其中，同属于β冠状病毒属的严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV)、中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)以及新型冠状病毒(SARS-CoV-2)具有高致命性，在人类历史上引发了三次严重的疾病流行。
引发COVID-19的病原体被命名为SARS-CoV-2，其刺突蛋白S与SARS-CoV的刺突蛋白S具有高度的序列同源性，且与SARS-CoV使用相同的受体血管紧张素转化酶2(ACE2)进入细胞，并引发呼吸道症状，可能发展为严重的肺炎并导致死亡。SARS-CoV-2具有更高的传染性，促进了其引发全球大流行。SARS-CoV-2主要通过呼吸道飞沫和接触传播，存在粪-口传播和气溶胶传播的风险。人群对SARS-CoV-2普遍易感。传染源主要是新冠病毒感染的患者。无症状感染者也能成为传染源，由于感染后没有明显症状，很难及时被诊断和隔离，容易造成社区中传染源的累积，增加疾病防控的难度。基于目前全球流行的发展趋势，COVID-19存在复发风险，且很有可能与人类长期共存。因此，开发COVID-19疫苗有着重要意义。
SARS-CoV-2表面刺突蛋白(S蛋白)介导病毒的附着、融合和进入宿主细胞，位于S蛋白C端的受体结合域(RBD)被认为是诱导机体产生中和抗体的最主要靶区域，是疫苗研发的靶标。RBD作为疫苗能够刺激机体产生中和抗体，强有力的抑制病毒与受体结合，从而抑制病毒感染和入侵宿主细胞。
随着SARS-CoV-2的全球大流行，逐步的演化出了多种流行变异株，主要包括阿尔法(Alpha)，贝塔(Beta)，伽马(Gamma)，德尔塔(Delta)，和2021年底在南非首次被发现的奥密克戎(Omicron)变异株。目前，在国内外，奥密克戎变异株已经成为主流流行毒株。这些新出现的流行变异株对以原型株刺突蛋白S或RBD为免疫原的新冠疫苗的保护效果出现明显或显著的降低。尤其是奥密克戎变异毒株，其S蛋白突变位点多达32处，对新冠病毒中和抗体药物和疫苗激活的体液免疫反应都有严重的免疫逃逸，对当前的疫情防控带来了严峻挑战。然而，有研究报道，以Omicron序列开发的疫苗激活的免疫反应虽然对Omicron变异株较强，但是对原型毒株以及其它变异毒株的交叉反应很弱，不适应当前多种流行变异株共存，且仍在较快变化的情况，因此，开发能够应对多种流行变异株的新型冠状病毒疫苗的需求迫在眉睫，而针对奥密克戎及其他变异毒株的中和效果则是新一代新型冠状病毒疫苗的重要指标。
公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
发明内容
发明目的
本发明的目的在于提供一种新型冠状病毒原型株、Delta和Omicron变异株的重组嵌合抗原、其相关产品及其制备方法和应用。根据本发明的重组嵌合抗原为由(1)新型冠状病毒原型株S蛋白RBD结构域或其一部分的氨基酸序列或与其具有至少90％，92％，95％，96％，97％，98％或99％同一性的氨基酸序列、(2)新型冠状病毒Delta变异株S蛋白RBD结构域或其一部分的氨基酸序列或与其具有至少90％，92％，95％，96％，97％，98％或99％同一性的氨基酸序列和(3)新型冠状病毒Omicron变异株S蛋白RBD结构域或其一部分的氨基酸序列与其具有至少90％，92％，95％，96％，97％，98％或99％同一性的氨基酸序列直接串联或者通过适当的连接序列串联而形成的三聚体，其能够高效地激活广谱保护性抗体，对原始毒株以及当前流行的各种变异株都能起到很好的预防或治疗效果。
解决方案
为实现本发明目的，本发明提供了以下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种新型冠状病毒原型株、Delta和Omicron变异株的重组嵌合抗原，所述重组嵌合抗原的氨基酸序列包括：按照(A-B)-C1-(A-B’)-C2-(A-B”)样式排列的氨基酸序列，其中：
A-B表示新型冠状病毒原型株S蛋白RBD结构域或其一部分的氨基酸序列，或与其具有至少90％，92％，95％，96％，97％，98％或99％同一性且与其具有相同或基本相同的免疫原性的氨基酸序列，
A-B’表示新型冠状病毒Delta变异株S蛋白RBD结构域或其一部分的氨基酸序列，或与其具有至少90％，92％，95％，96％，97％，98％或99％同一性且与其具有相同或基本相同的免疫原性的氨基酸序列，
A-B”表示新型冠状病毒Omicron变异株S蛋白RBD结构域或其一部分的氨基酸序列，或与其具有至少90％，92％，95％，96％，97％，98％或99％同一性且与其具有相同或基本相同的免疫原性的氨基酸序列，并且
C1和C2相同或不同，且各自独立地表示连接子(GGS)n，其中，n＝0,1,2,3,4或5。
对于上述重组嵌合抗原，在优选的实施方案中，所述新型冠状病毒原型株S蛋白RBD结构域的一部分为其全部氨基酸序列的至少70％、80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％；
和/或，所述新型冠状病毒Delta变异株S蛋白RBD结构域的一部分为其全部氨基酸序列的至少70％、80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％；
和/或，所述新型冠状病毒Omicron变异株S蛋白RBD结构域的一部分为其全部氨基酸序列的至少70％、80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％；
和/或，n＝0,1,2或3。
对于上述重组嵌合抗原，在优选的实施方案中，所述新型冠状病毒原型株S蛋白RBD结构域或其一部分的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，或者如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸获得的、与其具有相同或基本相同的免疫原性的氨基酸序列；
和/或，所述新型冠状病毒Delta变异株S蛋白RBD结构域或其一部分的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，或者如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸获得的、与其具有相同或基本相同的免疫原性的氨基酸序列；
和/或，所述新型冠状病毒Omicron变异株S蛋白RBD结构域或其一部分的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，或者如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸获得的、与其具有相同或基本相同的免疫原性的氨基酸序列；
和/或，n＝0,1或2。
在优选的具体实施方案中，A-B表示如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，A-B’表示如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，A-B”表示如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；
进一步优选地，所述重组嵌合抗原包括如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。
第二方面，本发明提供了一种如上述第一方面所述重组嵌合抗原的制备方法，其包括以下步骤：
在编码如上述第一方面所述重组嵌合抗原的核苷酸序列的5’端加上Kozak序列以及信号肽的编码序列，3’端加上组氨酸标签的编码序列和终止密码子，进行克隆表达，筛选正确的重组子，然后将其转染表达系统细胞进行表达，收集细胞培养上清，从中分离获得所述重组抗原。
在上述制备方法的一种可行的实现方式中，所述表达系统的细胞为哺乳动物细胞、昆虫细胞、酵母细胞或细菌细胞；
可选地，所述哺乳动物细胞为HEK293T细胞、293F系列细胞或CHO细胞；进一步可选地，所述293F系列细胞为HEK293F细胞、Freestyle293F细胞或Expi293F细胞；
可选地，所述昆虫细胞为sf9细胞、Hi5细胞、sf21细胞或S2细胞；
可选地，所述酵母细胞为毕赤酵母细胞或者由其改造的酵母细胞；
可选地，所述细菌细胞为大肠杆菌细胞。
第三方面，本发明提供了一种多核苷酸，其编码如上述第一方面所述的重组嵌合抗原。
所述多核苷酸为经人源密码子优化的核苷酸序列，可以为DNA或mRNA；
优选地，所述多核苷酸为如SEQ ID NO:5所示的DNA序列；
优选地，所述多核苷酸为如SEQ ID NO:6所示的mRNA序列。
第四方面，本发明提供了一种核酸构建体，其包含如上述第三方面所述的多核苷酸，以及任选地，与所述多核苷酸可操作地连接的至少一个表达调控元件。
第五方面，本发明提供了一种表达载体，其包含如上述第四方面所述的核酸构建体。
第六方面，本发明提供了一种宿主细胞，其中转化或转染有如上述第三方面所述的多核苷酸、如上述第四方面所述的核酸构建体或如上述第五方面所述的表达载体。
第七方面，本发明提供了如上述第一方面所述的重组嵌合抗原、如上述第三方面所述的多核苷酸、如上述第四方面所述的核酸构建体、如上述第五方面所述的表达载体或如上述第六方面所述的宿主细胞在制备用于预防和/或治疗新型冠状病毒感染的药物中的应用。
优选地，所述药物为疫苗；
优选地，所述新型冠状病毒为选自以下的一种或多种：SARS-CoV-2原始毒株，SARS-CoV-2变异毒株Alpha(B.1.1.7)、Beta(B.1.351)、Gamma(P.1)、Kappa(B.1.617.1)、Delta(B.1.617.2)、Omicron亚型BA.1、BA.1.1、BA.2、BA.2.12.1、BA.3、BA.4、BA.5。
第八方面，本发明提供了一种疫苗或免疫原性组合物，其包含如上述第一方面所述的重组嵌合抗原、如上述第三方面所述的多核苷酸、如上述第四方面所述的核酸构建体、如上述第五方面所述的表达载体或如上述第六方面所述的宿主细胞，以及生理学可接受的媒介物、佐剂、赋形剂、载体和/或稀释剂。
在一个优选的具体实施方案中，所述疫苗或免疫原性组合物为新型冠状病毒重组蛋白疫苗，其包括如上述第一方面所述的重组嵌合抗原和佐剂；
可选地，所述佐剂为选自以下佐剂中的一种或多种：铝佐剂、MF59佐剂和类MF59佐剂。
在另一个优选的具体实施方案中，所述疫苗或免疫原性组合物为新型冠状病毒DNA疫苗，其包括：
(1)真核表达载体；和
(2)构建入所述真核表达载体中的、编码如上述第一方面所述的重组嵌合抗原的DNA序列；
可选地，所述真核表达载体选自pGX0001、pVAX1、pCAGGS和pcDNA系列载体。
在另一个优选的具体实施方案中，所述疫苗或免疫原性组合物为新型冠状病毒mRNA疫苗，所述mRNA疫苗包括：
(I)编码如上述第一方面所述的重组嵌合抗原的mRNA序列；和
(II)脂质纳米颗粒。
在另一个优选的具体实施方案中，所述疫苗或免疫原性组合物为新型冠状病毒-病毒载体疫苗，其包括：
(1)病毒骨架载体；和
(2)构建入所述病毒骨架载体中的、编码如上述第一方面所述的重组嵌合抗原的DNA序列；
可选地，所述病毒骨架载体选自以下病毒载体中的一种或几种：腺病毒载体、痘病毒载体、流感病毒载体、腺相关病毒载体。
在可行的实现方式中，所述疫苗或免疫原性组合物为鼻喷剂、口服制剂、栓剂或胃肠外制剂的形式；
优选地，所述鼻喷剂选自气雾剂、喷雾剂和粉雾剂；
优选地，所述口服制剂选自片剂、粉末剂、丸剂、散剂、颗粒剂、细粒剂、软/硬胶囊剂、薄膜包衣剂、小丸剂、舌下片和膏剂；
优选地，所述胃肠外制剂为经皮剂、软膏剂、硬膏剂、外用液剂、可注射或可推注制剂。
第九方面，本发明提供了一种试剂盒，其包括如上述第一方面所述的重组嵌合抗原、如上述第三方面所述的多核苷酸、如上述第四方面所述的核酸构建体、如上述第五方面所述的表达载体、如上述第六方面所述的宿主细胞和/或如上述第八方面所述的疫苗或免疫原性组合物，以及任选地其他类型的新型冠状病毒疫苗。
第十方面，本发明提供了一种预防和/或治疗新型冠状病毒感染性疾病的方法，所述方法包括：向有需要的受试者施用预防和/或治疗有效量的以下物质：如上述第一方面所述的重组嵌合抗原、如上述第三方面所述的多核苷酸、如上述第四方面所述的核酸构建体、如上述第五方面所述的表达载体、如上述第六方面所述的宿主细胞和/或如上述第八方面所述的疫苗或免疫原性组合物。
所述“预防和/或治疗有效量”可根据给药对象、对象脏器、症状、给药方法等不同而存在差异，可以考虑剂型的种类、给药方法、患者的年龄和体重、患者的症状等，根据医生的判断来确定。
有益效果
本发明的发明人设计了一种新型冠状病毒原型株、Delta和Omicron变异株的重组嵌合抗原，该重组嵌合抗原由来自新型冠状病毒原型株、Delta和Omicron变异株的RBD结构域或其一部分的氨基酸序列(或其衍生序列)直接串联或者通过适当的连接序列串联而成，其具有较高的免疫原性，可以诱导产生针对原始病毒株以及一系列变异毒株的高水平的中和抗体，有望成为预防新型冠状病毒的广谱疫苗。
附图说明
一个或多个实施例通过与之对应的附图中的图片进行示例性说明，这些示例性说明并不构成对实施例的限定。在这里专用的词“示例性”意为“用作例子、实施例或说明性”。这里作为“示例性”所说明的任何实施例不必解释为优于或好于其它实施例。
图1是本发明实施例2中记载的，表达质粒pCAGGS-PPP转染Expi293FTM细胞后五天所收集的细胞上清的蛋白免疫印迹(在非还原(non-reduced)或还原(reduced)条件下)结果图。
图2是本发明实施例2中记载的，表达质粒pCAGGS-PDO转染Expi293FTM细胞后五天所收集的细胞上清的蛋白免疫印迹(在非还原或还原条件下)结果图。
图3是本发明实施例2中记载的，PPP三聚体蛋白的分子筛层析曲线及其洗脱峰处的洗脱液的SDS-PAGE鉴定结果图(在非还原或还原条件下)。
图4是本发明实施例2中记载的，PDO三聚体蛋白的分子筛层析曲线及其洗脱峰处的洗脱液的SDS-PAGE鉴定结果图(在非还原或还原条件下)。
图5是本发明实施例2中记载的，采用分析型超速离心法鉴定PPP三聚体蛋白的分子量的曲线图。
图6是本发明实施例2中记载的，采用分析型超速离心法鉴定PDO三聚体蛋白的分子量的曲线图。
图7是本发明实施例3中记载的，PPP蛋白与CB6 Fab蛋白的复合物的分子筛层析曲线图，以及两个洗脱峰处的洗脱液的SDS-PAGE鉴定结果图。
图8是本发明实施例3中记载的，PDO蛋白与CB6 Fab蛋白的复合物的分子筛层析曲线图，以及两个洗脱峰处的洗脱液的SDS-PAGE鉴定结果图。
图9是本发明实施例3中记载的，PPP蛋白与CB6 Fab蛋白的复合物的电镜结构示意图。
图10是本发明实施例3中记载的，PDO蛋白与CB6 Fab蛋白的复合物的电镜结构示意图。
图11是本发明实施例4中记载的，通过表面等离子共振实验(SPR)检测PPP、PDO以及新冠病毒原型株RBD、Delta变异株RBD，Omicron BA.1变异株RBD与人类受体分子hACE2及RBD的七类表位中和抗体的亲和力检测的结果图。
图12是对图11所示亲和力检测结果的统计图表(KD值单位为nM)。
图13是本发明实施例5中记载的，用PPP或PDO三聚体蛋白疫苗免疫小鼠及样品采集的实验流程示意图。
图14是本发明实施例6中记载的，通过酶联免疫吸附试验(ELISA)检测PPP或PDO三聚体蛋白疫苗激发小鼠产生RBD结合抗体滴度的结果图。
图15是本发明实施例7中记载的，PPP或PDO三聚体蛋白疫苗在对小鼠进行第二次免疫后的小鼠血清针对新冠病毒原型株、Delta和Omicron(BA.1、BA.2、BA.2.75、BA.4/5亚型)变异株的假病毒的中和抗体滴度检测结果图。
图16显示了本发明实施例8中记载的，通过ELISpot检测疫苗两次免疫小鼠的脾细胞在RBD多肽库刺激后，三种细胞因子IL-2、IL-4、IFNγ的分泌检测结果。
图17显示了本发明实施例9中记载的，通过ELISA测定用于攻毒实验的免疫小鼠血清的抗原结合抗体效价。
图18显示了本发明实施例9中记载的，用于攻毒实验的免疫小鼠血清针对Delta、OmicronBA.1、BA.2以及BA.4/5变异株的假病毒中和效价。
图19显示了本发明实施例10中记载的，新冠病毒攻毒后采集的小鼠的肺脏和鼻甲骨组织的病毒载量。
图20为本发明实施例11中记载的免疫小鼠及样品采集的实验流程图。
图21为本发明实施例12中记载的，PPP或PDO三聚体蛋白疫苗在对小鼠进行第三次免疫后的小鼠血清针对新冠病毒原型株、Delta和Omicron(BA.1、BA.2、BA.2.75、BA.4/5亚型)变异株的假病毒的中和抗体滴度检测结果图。
图22是根据图21所制作的雷达图。
图23显示了本发明实施例13中记载的，通过ELISpot检测疫苗三次免疫小鼠的脾细胞在RBD多肽库刺激后，三种细胞因子IL-2、IL-4、IFNγ的分泌检测结果。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
另外，为了更好的说明本发明，在下文的具体实施方式中给出了众多的具体细节。本领域技术人员应当理解，没有某些具体细节，本发明同样可以实施。在一些实施例中，对于本领域技术人员熟知的原料、元件、方法、手段等未作详细描述，以便于凸显本发明的主旨。
除非另有其它明确表示，否则在整个说明书和权利要求书中，术语“包括”或其变换如“包含”或“包括有”等等将被理解为包括所陈述的元件或组成部分，而并未排除其它元件或其它组成部分。
实施例1：SARS-CoV-2原型株RBD三聚体(即，PPP)以及原型株-Delta-Omicron嵌合RBD三聚体(即，PDO)构建体的设计
本实施例中，分别设计了新冠病毒原型株RBD三聚体(简称PPP)和原型株-Delta-Omicron嵌合RBD三聚体(简称PDO)的构建体，具体方案如下：
(1)将三条新冠病毒原型株RBD结构域R319-K537区段的序列直接串联起来，在其N端连接信号肽(MIHSVFLLMFLLTPTES，SEQ ID NO.7)，在其C端加上6个组氨酸(HHHHHH)，得到原型株RBD三聚体PPP的构建体(其氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示)；
(2)将新冠病毒原型株RBD结构域R319-L533区段的序列(SEQ ID NO:1)、Delta变异株RBD结构域V320-L533区段的序列(SEQ ID NO:2)、Omicron变异株RBD结构域V317-K534区段的序列(SEQ ID NO:3)直接串联起来，在其N端连接信号肽(MSSSSWLLLSLVAVTAAQS，SEQID NO.9)，在其C端加上6个组氨酸(HHHHHH)标签，得到原型株-Delta-Omicron嵌合RBD三聚体PDO的构建体(其氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示)；
实施例2：SARS-CoV-2原型株RBD三聚体(即，PPP)以及原型株-Delta-Omicron嵌合RBD三聚体(即，PDO)蛋白的表达与纯化
表达质粒的构建：
上述实施例1中所设计的两种构建体的氨基酸序列使用人源密码子优化，对应的DNA编码序列分别如SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示；在这些DNA编码序列的3’端加上终止密码子，在其5’端上游加上Kozak序列gccacc，这两个包含Kozak序列的DNA序列由南京金斯瑞生物科技有限公司合成；所合成的两段DNA序列通过EcoRI和XhoI酶切位点克隆到pCAGGS质粒，分别获得表达原型株RBD三聚体和原型株-Delta-Omicron嵌合RBD三聚体的表达质粒pCAGGS-PPP和pCAGGS-PDO。
蛋白表达与纯化：
使用Expi293F细胞表达PPP和PDO单链异源三聚体。
将上述构建的表达质粒pCAGGS-PPP和pCAGGS-PDO分别转染Expi293FTM细胞，5天后收集上清，离心去除沉淀，再通过0.22μm的滤膜过滤，进一步除去杂质。将所得细胞上清用蛋白免疫印迹法进行鉴定，其中使用组氨酸标签特异性抗体进行检测，实验结果分别如图1、2所示；由图1、图2可以看出，用Expi239F细胞表达的PPP和PDO能够正确折叠和分泌到上清中，且由于它们是串联的三聚体，采用含二硫苏糖醇(reduced)和不含二硫苏糖醇(Non-reduced)的上样缓冲液进行凝胶电泳，都可以检测到正确大小的目的条带，大小为75KDa左右。
此外，还将所得细胞上清通过镍亲和柱层析进行纯化；具体地，在4℃条件下，使细胞上清通过镍亲和柱(Histrap,GE Healthcare)，用缓冲液A(20mM Tris，150mM NaCl，pH8.0)洗涤，除去非特异结合蛋白；然后，用低浓度咪唑(20mM Tris，150mM NaCl，pH 8.0，20mM咪唑)洗脱杂蛋白，用缓冲液B(20mM Tris，150mM NaCl，pH 8.0，300mM咪唑)将目的蛋白从HisTrap上洗脱下来，并用10kDa浓缩管将洗脱液浓缩换液30倍以上至缓冲液A，终体积小于1ml；最后，通过SuperdexTM200 Increase 10/300GL柱子(GE Healthcare)进行分子筛层析，以进一步纯化目的蛋白。分子筛层析缓冲液为PBS缓冲液(8mM Na2HPO4，136mM NaCl，2mM KH2PO4，2.6mM KCl，pH 7.4)。
PPP和PDO三聚体蛋白的分子筛层析曲线及其洗脱峰处的洗脱液的SDS-PAGE鉴定结果分别如图3、图4所示，由图3和图4可以看出，PPP、PDO在13.5mL左右均有一个洗脱峰，将该洗脱峰处的洗脱液进行SDS-PAGE分析显示，非还原(不含二硫苏糖醇DTT的上样缓冲液)和还原(含二硫苏糖醇DTT的上样缓冲液)条件下，洗脱蛋白大小都在75KDa左右，符合上述两种三聚体蛋白的分子大小。采用分析型超速离心法鉴定PPP和PDO的蛋白分子量分别为80.5KDa(如图5所示)和72.5KDa(如图6所示)，再结合分子筛和SDS-PAGE图片结果，说明两个蛋白均以三聚体的形式稳定存在。证明纯化得到了PPP和PDO三聚体蛋白，并且电泳条带单一，说明纯化后的蛋白具有较高的纯度，此外，PPP和PDO三聚体蛋白还具有较高的产量。
实施例3：PPP和PDO三聚体疫苗的电镜结构解析
将PPP蛋白与CB6 Fab蛋白(其制备方法参见以下实施例4)混合，在4℃条件孵育12小时。然后通过SuperdexTM200 Increase 10/300GL柱子(GE Healthcare)进行分子筛层析(pH8.0)，以纯化PPP蛋白与CB6 Fab蛋白的复合物，其分子筛层析曲线如图7所示；此外，收集两个洗脱峰处的洗脱液，并对其进行SDS-PAGE鉴定，由SDS-PAGE鉴定结果可知：图7的其中一个洗脱峰是PPP蛋白与CB6 Fab的复合物，另一个峰是过量的CB6Fab，这说明：PPP蛋白可以与CB6 Fab结合并形成了复合物。采用同样的方法，制备获得PDO同源三聚体蛋白和CB6Fab的复合物蛋白(图8所示)。
此外，将上述收集的PPP和CB6 Fab的复合物以及PDO蛋白与CB6 Fab的复合物的洗脱液进行浓缩，浓缩后用于冷冻电镜分析，程序如下：
事先准备好制样用的Quantifoil载网(规格1.2/1.3)，进行辉光放电亲水化处理。随后将制备好的PPP同源RBD-Trimer蛋白与CB6 Fab的复合物以及PDO嵌合RBD-Trimer蛋白与CB6 Fab的复合物滴加在上述准备好的载网上，用自动制样机器Vitrobot Mark IV将载网迅速插入液态乙烷中完成制样。
数据收集是用300kV Titan Krios透射电镜(Thermo Fisher公司)搭配K3直接电子探测器相机进行的，使用Serial-EM自动收集程序收集大量照片。然后，使用MotionCor2软件对收集到的原始数据进行漂移校正，用CTFFIND4.1软件对图片进行衬度传递函数校正，使用Relion-3.1软件对图片进一步处理和最后的三维重构。
PPP同源三聚体和CB6 Fab的复合物冷冻电镜如图9所示，由图9可见：PPP同源三聚体和CB6 Fab的复合物结构中，三个Prototype的RBD从俯视角度基本每个RBD之间角度为120°左右，均匀分散开，每个RBD可以结合一个CB6 Fab，说明每个RBD都可以暴露重要的免疫表位，从而激发小鼠的特异性免疫反应。
PDO蛋白与CB6 Fab的复合物的冷冻电镜图像如图10所示，由图10可见：在PDO异源三聚体蛋白与CB6 Fab的复合物中，Prototype RBD，Delta RBD和Omicron RBD相对对称分布；并且Prototype RBD和Delta RBD分别可以结合一个CB6 Fab，Omicron RBD不结合CB6Fab，说明PDO异源三聚体蛋白的主要表位完全暴露，有利于激活特异性免疫反应。
实施例4：通过表面等离子共振实验(SPR)检测三聚体蛋白疫苗PPP或PDO的多种抗原表位
本实施例中，采用BIAcore 8k进行表面等离子共振的结合特性测定实验；具体地，使用CM5芯片，采用氨基偶联的方法，将293F细胞表达的PPP和PDO三聚体蛋白固定于CM5芯片表面，测定其与人类受体分子hACE2以及RBD的多类表位抗体分子的Fab的亲和力，与单体RBD蛋白进行比较。
根据文献报道(Huang,M.,et al.,Atlas of currently available humanneutralizing antibodies against SARS-CoV-2and escape by Omicron sub-variantsBA.1/BA.1.1/BA.2/BA.3.Immunity,2022.55(8):p.1501-1514e3)，新型冠状病毒刺突蛋白RBD区域的抗原表位可以分为7类，本实施例在7类抗体中每类选择一种抗体，包括第1类的CB6抗体(其重、轻链可变区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:13、14所示)，第2类的REGN10933(其重、轻链可变区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:15、16所示)，第3类的ADI-56046(其重、轻链可变区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:17、18所示)，第4类的CV07-270(其重、轻链可变区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:19、20所示)，第5类的S309(其重、轻链可变区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:21、22所示)，第6类的C022(其重、轻链可变区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:23、24所示)，第7类的CR3022(其重、轻链可变区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:25、26所示)。本实验所用抗体均为真核系统293F细胞表达纯化而来。由于抗体均为二价分子，而流动相必须为单体状态，因此，我们将这几种抗体全抗用木瓜蛋白酶进行酶切，然后用ProteinA亲和柱进行纯化，获得酶切后的抗体的Fab分子从而作为流动相流经CM5芯片表面，来测定PPP和PDO与抗体的亲和力。用10mM pH 1.5的甘氨酸缓冲液作为再生液处理芯片，以方便后续抗体亲和力的测定。每次测定包括三次独立测定结果，从而算出其平均值±标准误。
PPP、PDO以及新冠病毒原型株RBD、Delta变异株RBD，Omicron BA.1变异株RBD与人类受体分子hACE2及各类抗体的结合情况如图11所示。
然后，对所测定的亲和力进行小结，结果如图12所示。
由图11和图12可知，PPP和PDO可以高亲和力结合人类受体分子hACE2和七种针对不同表位的抗体分子，说明：本发明的三聚体免疫原PDO可以将各类多种的有效抗原表位充分暴露，因此，有激发机体产生针对多位点的中和抗体的潜能。
实施例5：实验动物免疫和样品采集
为了检测三聚体蛋白的免疫原性，我们将实施例2所得纯化的三聚体蛋白PPP或PDO作为免疫原分别免疫BALB/c小鼠，阴性对照(Sham组)采用PBS溶液进行免疫，每组6只小鼠。所使用的BALB/c小鼠从维通利华公司购买，均为雌性，6-8周龄。小鼠分组及免疫剂量情况如表1所示。
表1新型冠状病毒RBD三聚体疫苗免疫小鼠的分组及免疫剂量
具体程序如下：
将免疫原PPP或PDO分别用PBS稀释至40μg/ml，将稀释后的免疫原与SWE佐剂按照体积比1:1的比例混合、乳化，制备成疫苗。阴性对照组为PBS溶液与SWE佐剂混合。
免疫方案如图13所示。具体地，按照上述方法所得疫苗通过肌肉注射的方式对BALB/c小鼠进行免疫，所有小鼠分别在第0天、第21天进行第一次和第二次免疫，每次100μL的接种体积(含抗原蛋白2μg)。在第19天、第35天，对小鼠进行取血，离心收集血清，所得血清于-80℃冰箱保存，用于滴定抗原特异性抗体滴度和假病毒中和抗体滴度。免疫小鼠以及样品采集的实验流程如图13所示。
实施例6：通过酶联免疫吸附试验(ELISA)，检测三聚体蛋白疫苗PPP或PDO诱导产生的抗原特异性结合抗体滴度
本实施例中，通过酶联免疫吸附试验(ELISA)，检测实施例5中采用三聚体蛋白疫苗PPP、PDO所免疫的小鼠血清的抗原特异性抗体滴度，具体程序如下：
(1)分别将PPP、PDO三聚体蛋白用ELISA包被液(索莱宝，C1050)稀释至3μg/mL，向96孔ELISA板(Coring，3590)中每孔加入100μL上述稀释液，4℃放置过夜(12h以上)，以进行包被；
(2)倒掉包被液，加入PBS，洗一遍；使用PBS配置的5％脱脂牛奶作为封闭液，加入96孔板中，每孔100μL，室温放置1h，进行封闭，之后用PBS溶液洗一遍；
(3)封闭期间，用封闭液稀释小鼠血清样品；血清样品从20倍起，按照4倍梯度依次进行稀释；具体地，第一个孔加入152μL封闭液和8μl的血清样品混匀，第二个稀释度为封闭液120μL和第一个孔的溶液40μL混匀，依次稀释；稀释完之后，在ELISA板中每孔加入100μL，阴性对照组加入封闭液，37℃孵育2小时，之后使用PBS-T洗4遍；
(4)向每孔中，加入用封闭液1:2000稀释的偶联HRP的羊抗鼠二抗(柏奥易杰，BE0102-100)，37℃孵育1.5小时，之后PBS-T洗5-6遍；然后，加入60μL TMB显色液显色，反应适当时间后加入60μL 2M盐酸终止反应，在酶标仪上检测OD450读值。
抗体滴度值被定义为反应值大于2.5倍阴性对照值的血清最高稀释倍数。当最低稀释倍数(检测限)的反应值仍小于2.5倍背景值时，该样品的滴度定义为最低稀释倍数的一半，即1:10。
第19天采集的血清(即，一免血清)和第35天采集的血清(即，二免血清)的免疫原性检测结果如图14所示；图14结果显示，PPP和PDO三聚体疫苗在免疫后均产生了相应的抗体。PPP三聚体疫苗一免后的血清的特异性结合抗体滴度超103，而PDO三聚体疫苗一免后的血清的特异性结合抗体滴度超104，即，PDO疫苗一免后血清中的RBD特异性结合抗体显著高于PPP(***)；PPP三聚体疫苗二免后的血清的特异性结合抗体滴度超105，而PDO三聚体疫苗的接近106，即，PDO疫苗二免后血清中的RBD特异性结合抗体显著高于PPP(*)。
由图14可知：PDO三聚体抗原激发小鼠产生RBD特异性结合抗体的水平显著高于PPP，即，与PPP同源三聚体相比，本发明的异源三聚体抗原PDO具有更好的免疫原性，而免疫原性直接关系着疫苗的效果，换言之，这些实验结果表明，本发明的PDO三聚体抗原设计比PPP具有明显优势。
实施例7：通过假病毒中和实验，检测三聚体蛋白疫苗PPP或PDO二免后产生的针对新冠病毒假病毒的中和抗体滴度
使用新冠病毒假病毒，分别检测第二次免疫后的(即，第35天采集的)小鼠血清对新冠病毒原型株、Delta和Omicron(BA.1、BA.2、BA.2.75、BA.4/5亚型)变异株的假病毒的假病毒中和滴度(pVNT50)。
本实施例中使用的新冠病毒假病毒为基于水疱性口炎病毒(VSV)骨架制备的展示新冠病毒S蛋白的假病毒，制备方法参见本课题组已经公开发表论文的方法部分(Zhao,X.,et al.,Effects of a Prolonged Booster Interval on Neutralization of OmicronVariant.N EnglJ Med,2022.386(9):p.894-896)。
检测新冠病毒假病毒(以下简称假病毒)中和抗体滴度的方法如下：
在96孔板中，将免疫小鼠血清按2倍梯度倍比稀释，初始浓度为1:20，共设置11个浓度梯度；之后，将稀释的免疫小鼠血清与假病毒分别混合(空白培养基与假病毒混合作为阴性对照(NC)，未与假病毒混合的空白培养基作为空白对照(MOCK)，37℃孵育1小时；然后，将免疫小鼠血清-假病毒混合液转移至已铺满Vero细胞的96孔板中，37℃孵育15小时后，通过CQ1共聚焦细胞成像仪(Yokogawa)检测并计算阳性细胞数值，然后，在GraphPad Prism软件中绘制拟合曲线，计算50％中和时对应的血清稀释度的倒数，即为中和滴度pVNT50。
各免疫组小鼠-二免后血清的假病毒中和抗体滴度检测结果如图15所示。
由图15可见：
1)针对新冠病毒原型株的假病毒，二免后，PPP三聚体疫苗的pVNT50是2228.6，而PDO三聚体疫苗的pVNT50是7760.5，较PPP疫苗高3倍以上，表明：二免后，PDO三聚体疫苗对原型株的假病毒的中和效果显著优于PPP(***)；
2)针对新冠病毒Delta变异株的假病毒，二免后，PPP三聚体疫苗的pVNT50是735.2，而PDO三聚体疫苗的pVNT50是4457.2，较PPP疫苗高达6倍，表明：二免后，PDO三聚体疫苗对Delta变异株的假病毒的中和效果显著优于PPP(***)；
3)针对新冠病毒奥密克戎BA.1变异株的假病毒，二免后，PPP三聚体疫苗的pVNT50是10.7，而PDO三聚体疫苗的pVNT50是844.5，较PPP疫苗高将近80倍，表明：二免后，PDO对奥密克戎BA.1型变异株的假病毒的中和效果显著优于PPP(***)；
4)针对新冠病毒奥密克戎BA.2变异株的假病毒，二免后，PPP三聚体疫苗的pVNT50是9.4，而PDO三聚体疫苗的pVNT50是557.2，较PPP疫苗高将近60倍，表明：二免后，PDO对奥密克戎BA.2型变异株的假病毒的中和效果显著优于PPP(***)。
5)针对新冠病毒奥密克戎BA.2.75变异株的假病毒，二免后，PPP三聚体疫苗的pVNT50是219.5，而PDO三聚体疫苗的pVNT50是2319.7，较PPP疫苗高10倍，差异显著(**)，表明：二免后，PDO对奥密克戎BA.2.75型变异株的假病毒的中和效果显著优于PPP。
6)针对新冠病毒奥密克戎BA.4/5变异株的假病毒，二免后，PPP三聚体疫苗的pVNT50是18.4，而PDO三聚体疫苗的pVNT50是312.8，是PPP疫苗的17倍，差异显著(**)，表明：二免后，PDO对奥密克戎BA.4/5型变异株的假病毒的中和效果显著优于PPP。
实施例8：通过ELISpot测定，检测PDO二免后小鼠脾细胞在RBD多肽库刺激后IL-2、IL-4和IFNγ的分泌
本实施例中，采用实施例5中的PDO免疫后小鼠，在二免后2周，取小鼠脾研磨处理成脾细胞；将脾细胞与RBD多肽库(北京中科亚光生物技术有限公司)于37℃孵育36h，以刺激细胞因子分泌；然后，对三种细胞因子IL-2、IL-4、IFNγ进行ELISpot检测，以测定其表达水平。同时，以PBS免疫小鼠的脾细胞作为阴性对照；并且，以PBS免疫小鼠的脾细胞与PMA(佛波酯，购自深圳达科为生物技术股份有限公司，可以激发小鼠脾细胞产生免疫反应)孵育，作为阳性对照。
具体实验方法如下：
1.先将培养皿中加入20mL 1640培养基备用；
2.取小鼠脾脏，并转移至培养皿中；
3.用研磨棒缓慢研磨脾细胞，同时用1640培养基进行冲洗；
4.将研磨液转移到50mL离心管中，500g离心5分钟；
5.加入4mL红细胞裂解液裂解5分钟后，加入20mL1640培养基稀释，并以500g离心5分钟；
6.倒掉培养基后，先加入1mL的1640培养基，将团状的组织细胞取出，只留分散均匀的细胞；
7.再次加入20mL培养基，500g，离心5min后弃上清；
8.用10mL完全培养基(1640培养基+10％ FBS)重悬细胞；
9.用细胞计数仪进行细胞计数；
10.在已封闭好的ELISpot 96孔板(MSIPS4510，Mabtech)中加入用培养基稀释的RBD多肽库，然后加入小鼠脾细胞(5×105个细胞/孔)；
11.将96孔ELISpot板子小心转移到培养箱培养36h，期间尽量不要挪动，之后把板子从培养箱拿出进行后续步骤；
12.裂解细胞：倾倒孔内的细胞及培养基，200μL/孔加入冰冷的去离子水，4℃冰浴10分钟；
13.洗涤：每孔加入200μL的PBST，洗涤5次；最后一次，在吸水纸上扣干；
14.加检测抗体(针对IL-2、IL-4、IFNγ的抗体分别购自Mabtech，SWEDEN)：每孔加入100μL稀释好的生物素标记检测抗体，室温孵育2h；
15.洗涤：每孔加入200μL的PBST，洗涤5次；最后一次，在吸水纸上扣干；
16.加酶标亲和素：每孔加入100μL稀释好的酶标亲和素，室温孵育1小时；
17.洗涤：每孔加入200μL的PBST，洗涤5次；最后一次，在吸水纸上扣干；
18.显色：每孔加入100μL的显色液，室温静置5-15min，期间注意避光；
19.洗涤晾干：待斑点生长到适合大小之后，用去离子水洗涤2遍，终止显色过程；将板倒扣在吸水纸上，拍干细小的水珠，之后取下保护层，放在通风的地方，室温静置30min，让膜自然晾干；注意不要将板放到烤箱内，防止膜发脆、破裂；
20.结果分析：斑点计数(MabtechASTORELISpot Reader,SWEDEN)。
三聚体蛋白PDO二免后的ELISpot检测结果如图16所示。
图16显示，对于检测的这三种细胞因子IL-2、IL-4和IFNγ，其分泌水平在PDO免疫组与PBS对照组之间均具有显著性差异，说明：与PBS阴性对照组比较，PDO免疫组诱导了平衡的多功能的细胞免疫反应。
上述结果表明，SWE佐剂可以辅助PDO三聚体蛋白疫苗产生较好的细胞免疫反应，这补充了重组亚单位疫苗T细胞反应差的短板。
换句话说，SWE佐剂辅助的PDO三聚体免疫原不仅能够激发B细胞反应，还可以刺激机体产生细胞免疫反应，增强疫苗的保护效应。
实施例9：活病毒攻毒实验
实验方法:
为了评估候选疫苗PDO的保护效力，SARS-CoV-2攻毒保护实验用四种VOC进行，分别是Delta，Omicron BA.1，Omicron BA.2和Omicron BA.4。实验分组如以下表2所示；具体实施方案如下：PBS和PDO分别免疫四组BALB/c小鼠(6-8周雌性，购自维通利华)，按照实施例5中的时间节点进行两剂2μgPDO疫苗(采用SWE佐剂)接种(间隔21天)，在二免后2周采集血清以进行结合抗体和中和抗体效价的评估。结果显示：与PBS对照组相比较，PDO免疫的小鼠血清可检测到较高效价的抗原结合IgG(图17)，以及针对Delta、OmicronBA.1、BA.2和BA.4假病毒的中和抗体(图18)。
由于Delta毒株的刺突蛋白S不含有N501Y突变，从而对于普通的BALB/c小鼠不易感，因此，在攻毒前(5天)需用表达hACE2的人5型重组腺病毒(Ad5-hACE2)通过滴鼻的方法转导小鼠表达受体蛋白hACE2，剂量为8×109vp每只，使小鼠对于Delta病毒易感，然后，通过滴鼻进行Delta毒株攻击。而毒株Omicron BA1、Omicron BA.2和Omicron BA.4的刺突蛋白S均含有N501Y突变，对普通的BALB/c小鼠是易感的，因此，可直接通过滴鼻进行新冠病毒攻毒，所有的攻毒相关实验均在ABSL-3实验室完成。
攻毒毒株信息和剂量：Delta(NPRC 2.192100004)，攻毒剂量为1.6×104TCID50；Omicron BA.1(NPRC 2.192100009)，攻毒剂量为8×103TCID50；Omicron BA.2(NPRC2.192100010)，攻毒剂量为7×103TCID50；Omicron BA.4(NPRC2.192100012)，攻毒剂量为3×103TCID50。
表2.实验小鼠的分组和对应攻毒种类
编号 免疫分组 免疫剂量 佐剂 攻毒种类
1 PBS 100μL SWE Delta
2 PDO 2μg SWE Delta
3 PBS 100μL SWE OmicronBA.1
4 PDO 2μg SWE OmicronBA.1
5 PBS 100μL SWE OmicronBA.2
6 PDO 2μg SWE OmicronBA.2
7 PBS 100μL SWE OmicronBA.4
8 PDO 2μg SWE OmicronBA.4
攻毒后第3天，对小鼠实施安乐死，然后采集攻毒感染后小鼠的鼻甲骨和肺脏组织，将样品保存于-80℃冰箱，用于后期RNA提取及病毒载量的测定。
实施例10：攻毒后组织(肺脏和鼻甲骨)的病毒滴度测定
本实施例中，通过提取实施例9中新冠病毒活病毒攻毒后的PDO免疫组小鼠和PBS组小鼠的肺脏和鼻甲骨组织的RNA，使用RT-qPCR试剂盒(Tiangen Biotech，China，货号：FP314)，在CFX96 Touch实时PCR检测系统(Bio-Rad，USA)上进行SARS-CoV-2特异性定量PCR(qRT-PCR)测定，具体地，检测病毒基因组N基因的一段特定区域(参见Chandrashekar,A.,et al.,SARS-CoV-2 infection protects against rechallenge in rhesusmacaques.Science,2020.369(6505):p.812-817)。
(1)RNA的提取(ABSL-3实验室)：
将鼻甲骨和部分肺脏样品研磨，取140μL研磨后的上清加入RNA提取试剂盒的AVL溶液(560μL)中混匀，放置10分钟，然后加入560μL的100％乙醇溶液，混匀，病毒即被灭活。
然后按照QIAGEN病毒RNA提取试剂盒的说明书，进行RNA提取；将提取的RNA保存在-80℃冰箱备用。
(2)qPCR实验：
以下引物和探针用于检测Delta VOC的病毒基因组，序列参考文献Xu,K.,et al.,Protective prototype-Beta and Delta-Omicron chimeric RBD-dimer vaccinesagainst SARS-CoV-2.Cell,2022.185(13):p.2265-2278e14，具体如下：
RNA-F，GACCCCAAAATCAGCGAAAT(SEQ ID NO:27)；
RNA-R，TCTGGTTACTGCCAGTTGAATCTG(SEQ ID NO:28)；
RNA探针-Delta，ACCCCGCATTACGTTTGGTGGACC(SEQ ID NO:29)。
在对于Omicron变异株(BA.1，BA.2和BA.4)病毒基因组的qRT-PCR分析中，使用的引物序列与上述Delta VOC的相同，而所用探针序列不同，针对Omicron变异株(BA.1，BA.2和BA.4)的探针序列为：
RNA探针-Omicron，ACTCCGCATTACGTTTGGTGGACC(SEQ ID NO:30)。
按照表3和表4，进行qPCR体系的配置和qPCR程序的设定
表3.qPCR体系配置
试剂 体系(单位：μL)
2*qPCR 10
25 FastKing Enzyme Mix 0.8
N-gene-F 0.5
N-gene-R 0.5
N-gene-probe 0.4
ddH2O 2.8
模板RNA 5
体系体积 20
表4 qPCR程序
小鼠肺脏和鼻甲骨样品的qPCR检测结果如图19所示。
图19显示，对于检测的4个病毒，PDO免疫小鼠组的肺脏病毒gRNA水平相对于PBS组均显著降低，具有显著性差异：Delta(**)，OmicronBA.1(**)，OmicronBA.2(**)，OmicronBA.4(**)。PDO免疫小鼠组鼻甲骨样品相对于PBS组，Delta病毒降低了1383倍(**)，OmicronBA.1病毒降低145倍(*)，OmicronBA.2病毒降低44倍(*)，OmicronBA.4病毒降低了16倍。这说明：PDO疫苗免疫大幅度地降低了Delta、OmicronBA.1、Omicron BA.2和OmicronBA.4毒株攻毒后小鼠肺脏和鼻甲骨中的病毒载量。
综合以上实验结果，可以得出：PDO作为免疫原免疫后的小鼠在活病毒攻毒实验中可以有效降低小鼠的上呼吸道-鼻甲骨和下呼吸道-肺脏的病毒载量，对于流行的多种新冠病毒变异株均显示出了较好的保护效果。
实施例11：新一批实验动物免疫和样品采集
免疫程序：
除了在第42天进行第三次免疫(免疫剂量与前两次的相同)外，其余程序与实施例5相同。
样品采集程序：
在第56天(即，第三次免疫后第14天)，对小鼠进行眼眶静脉丛取血，离心收集血清，所得血清于-80℃冰箱保存，用于滴定抗原结合抗体滴度和假病毒中和抗体滴度。
免疫小鼠及样品采集的实验流程如图20所示。
实施例12：通过假病毒中和实验，检测第三次免疫后、三聚体蛋白疫苗PPP或PDO针对新冠病毒假病毒所产生的中和抗体滴度
采用实施例7所记载的检测方式，检测实施例11所采集的三免后的免疫小鼠血清对新冠病毒原型株、Delta和Omicron(BA.1、BA.2、BA.2.75、BA.4/5亚型)变异株的假病毒中和抗体滴度(pVNT50)。
结果如图21所示，由图21可见：
1)针对新冠病毒原型株的假病毒，三免后，PPP三聚体疫苗的pVNT50是14902.9，而PDO三聚体疫苗的pVNT50是26913.4，高于PPP疫苗，表明：三免后，PDO三聚体疫苗对原型株的假病毒的中和效果优于PPP；
2)针对新冠病毒Delta变异株的假病毒，三免后，PPP三聚体疫苗的pVNT50是14085.1，而PDO三聚体疫苗的pVNT50是46142.1，高于PPP疫苗，表明：三免后，PDO三聚体疫苗对Delta变异株的假病毒的中和效果优于PPP；
3)针对新冠病毒奥密克戎BA.1变异株的假病毒，三免后，PPP三聚体疫苗的pVNT50是427.6，而PDO三聚体疫苗的pVNT50是12896.0，显著高于PPP疫苗，表明：三免后，PDO三聚体疫苗对奥密克戎BA.1变异株的假病毒的中和效果显著优于PPP(**)；
4)针对新冠病毒奥密克戎BA.2变异株的假病毒，三免后，PPP三聚体疫苗的pVNT50是393.4，而PDO三聚体疫苗的pVNT50是14712.7，为PPP疫苗的37倍，差异显著(**)，表明：三免后，PDO对奥密克戎BA.2型变异株的假病毒的中和效果显著优于PPP；
5)针对新冠病毒奥密克戎BA.2.75变异株的假病毒，三免后，PPP三聚体疫苗的pVNT50是534.8，而PDO三聚体疫苗的pVNT50是11756.8，为PPP疫苗的20倍，表明：三免后，PDO对奥密克戎BA.2.75型变异株的假病毒的中和效果显著优于PPP,差异显著(**)。
6)针对新冠病毒奥密克戎BA.4/5变异株的假病毒，三免后，PPP三聚体疫苗的pVNT50是89.5，而PDO三聚体疫苗的pVNT50是6043.2，为PPP疫苗的67倍。表明：三免后，PDO对奥密克戎BA.4/5型变异株的假病毒的中和效果显著优于PPP，差异显著(**)。
基于上述三免后的假病毒中和效价制作了雷达图，如图22所示。
图22清晰地显示，与PPP同源三聚体相比较，本发明的PDO三聚体免疫原对于多种SARS-CoV-2流行变异株的假病毒均具有明显更好的中和效果，特别是，针对奥密克戎BA.4/5假病毒的中和效价具有明显的提升，展示了PDO作为新型免疫原可产生针对多种流行毒株的较为广谱且均衡的假病毒中和效果，具有成为新一代SARS-CoV-2疫苗的候选免疫原的强大潜力。
实施例13.通过ELISpot测定，检测PPP和PDO三免后小鼠脾细胞在RBD多肽库刺激后IL-2、IL-4和IFNγ的分泌
对于实施例11中的小鼠，在三免后第14天采血之后，取小鼠脾脏研磨，将脾细胞与RBD多肽库(北京中科亚光生物技术有限公司)于37℃孵育36h，以刺激细胞因子分泌；然后，对三种细胞因子IL-2、IL-4、IFNγ进行ELISpot检测，以测定其表达水平。同时，以PBS免疫小鼠的脾细胞与PBS孵育，作为阴性对照；并且，以PBS免疫小鼠的脾细胞与PMA孵育，作为阳性对照。具体实验方法参照实施例8。
三聚体蛋白PDO三免后的ELISpot检测结果如图23所示。
图23显示，这三种细胞因子(IL-2、IL-4和IFNγ)的分泌水平在PDO免疫组与PBS对照组之间均具有显著性差异，说明：与PBS阴性对照组比较，PDO疫苗激活了平衡的多功能的细胞免疫反应。
上述结果表明，SWE佐剂可以辅助PDO三聚体蛋白疫苗产生较好的细胞免疫反应。即SWE佐剂辅助的PDO三聚体免疫原不仅能够激发B细胞反应，还可以有效地刺激机体产生细胞免疫反应，增强疫苗的保护效应。
综合上述实验结果可以得出，与同源三聚体PPP相比较，本发明的异源三聚体抗原PDO具有以下优势：
(1)与PPP相比，PDO免疫小鼠血清针对新冠病毒原型株、德尔塔、奥密克戎BA.1、BA.2、BA.2.75、BA.4/5变异株展现出了效价更高、更广谱的中和保护活性。
尤其是，对于目前流行的毒株Omicron BA.1，BA.2，BA.2.75以及BA.4/5亚型，PPP组小鼠血清已基本失去了针对奥密克戎多种亚型的的假病毒中和活性；而PDO组小鼠血清对Omicron BA.1和BA.2，BA.2.75假病毒均展示出较高的中和活性；具体地，PDO二免后小鼠血清针对BA.4/5的pVNT50为312.8，PDO三免后小鼠血清针对BA.4/5的pVNT50为6043，三免后血清的中和滴度得到了很大的提升，因此，PDO三免后血清对BA.4/5也具有良好的中和效果。
(2)PDO辅以SWE佐剂可以激发小鼠的多功能的细胞免疫反应。
根据SWE佐剂辅以真核293F细胞表达的三聚体疫苗PDO二免和三免后的ELISpot实验结果，与PBS对照组比较，PDO免疫组可显著的刺激IL-2，IL-4以及IFNγ三种细胞因子的产生，说明：SWE佐剂可以辅助PDO三聚体蛋白苗产生较好的T细胞反应。
(3)活病毒攻毒保护的实验结果显示，与PBS对照组相比，PDO免疫后小鼠的肺脏和鼻甲骨的病毒gRNA载量出现了显著的下降。
具体地，PDO免疫组小鼠在新冠病毒流行变异毒株德尔塔、奥密克戎BA.1、奥密克戎BA.2和奥密克戎BA.4活病毒攻毒后，其肺脏和鼻甲骨的病毒gRNA的载量相较于PBS对照组均大幅度降低。特别是，对于奥密克戎BA.4的活病毒攻毒，PDO免疫组小鼠的鼻甲骨的病毒载量比PBS对照组降低了15.6倍之多，预示着具有防感染和防传播的效果。
在针对新冠病毒德尔塔、奥密克戎BA.1、奥密克戎BA.2和奥密克戎BA.4/5变异株的假病毒的中和效果方面，PDO三聚体疫苗均显著性地高于PPP。尤其是三免后，从如图20所示的雷达图来看，PDO免疫后的小鼠血清对于原型株、德尔塔、奥密克戎BA.1、奥密克戎BA.2、奥密克戎BA,2.75以及奥密克戎BA.4/5展现了较为均一且广谱的假病毒中和保护效果。众所周知，在最近一年内，Delta变异株和Omicron变异株在世界范围内大规模流行，给全球人民的生命健康造成严重威胁，而上述实验证实，本发明的PDO三聚体疫苗针对Delta和Omicron变异株均可诱导较强的免疫反应，说明其针对这两种变异株将具有很好的免疫保护效果，应用前景广阔。
综上所述，本发明的PDO三聚体疫苗可诱导更强且更广谱的免疫反应；当前流行的新冠病毒毒株变化较快，而未来流行毒株的种类及其免疫学特点都极难预测，因此PDO疫苗的上述特性对于预防流行毒株的变化或者多种毒株的共流行具有极大的应用价值。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明技术方案的精神和范围。
本文所用序列如下：
SEQ ID NO:1-原型株S蛋白RBD的R319-L533区域的氨基酸序列(215 aa)
RVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNL
SEQ ID NO:2-Delta变异株S蛋白RBD的V320-L533区域的氨基酸序列(214aa)
VQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYRYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSKPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNL
SEQ ID NO:3-Omicron变异株S蛋白RBD的V317-K534区域的氨基酸序列(218 aa)
VQPTESIVRFPNITNLCPFDEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNLAPFFTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGNIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNKLDSKVSGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGNKPCNGVAGFNCYFPLRSYSFRPTYGVGHQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNK
SEQ ID NO:4-PDO疫苗实例的全长氨基酸序列(SEQ ID NO:1+SEQ ID NO:2+SEQ ID NO:3)(647aa)
RVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKL NDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPF ERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYRYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSKPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVQPTESIVRFPNITNLCPFDEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNLAPFFTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGNIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNKLDSKVSGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGNKPCNGVAGFNCYFPLRSYSFRPTYGVGHQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNK
SEQ ID NO:5–编码SEQ ID NO:4的DNA序列(1941bp)
AGAGTGCAGCCAACCGAAAGCATCGTCAGATTTCCTAATATCACCAACCTGTGCCCTTTCGGCGAAGTGTTCAACGCCACCAGATTCGCCTCCGTGTACGCTTGGAACCGCAAACGGATCTCCAACTGCGTGGCCGACTACAGCGTACTGTACAATAGCGCTAGCTTCAGCACCTTCAAGTGCTACGGCGTGTCTCCTACCAAGCTGAACGACCTGTGCTTCACCAACGTGTACGCCGACTCCTTTGTGATTAGAGGCGACGAGGTGCGGCAGATTGCTCCTGGACAGACCGGCAAGATCGCCGATTATAACTATAAGCTGCCTGACGACTTCACCGGCTGCGTGATTGCCTGGAACAGCAACAACCTTGATAGCAAGGTGGGCGGAAACTACAACTACCTGTACAGACTGTTCAGAAAGAGTAATCTGAAACCCTTCGAAAGAGATATCAGCACAGAGATCTACCAGGCCGGATCTACACCTTGTAACGGCGTTGAGGGCTTCAACTGCTACTTCCCTCTGCAGAGCTACGGCTTTCAGCCTACCAACGGCGTGGGATACCAGCCTTACAGGGTTGTGGTGCTGTCCTTTGAACTGCTGCACGCTCCCGCCACAGTGTGCGGCCCCAAGAAAAGCACAAATCTGGTTCAACCCACCGAGAGCATCGTGCGGTTTCCTAACATCACGAACCTGTGTCCTTTCGGCGAGGTGTTCAACGCCACAAGATTTGCCAGCGTCTACGCCTGGAACAGAAAAAGAATCAGCAATTGCGTGGCCGACTACAGCGTGCTCTATAACAGCGCCAGCTTTAGCACCTTTAAGTGCTACGGCGTGTCTCCTACAAAGCTGAACGACCTGTGCTTCACCAATGTGTATGCCGACAGCTTCGTGATCAGGGGCGACGAAGTCAGACAAATCGCTCCTGGCCAGACTGGCAAGATCGCCGATTACAACTACAAACTGCCTGACGACTTCACCGGATGTGTGATCGCCTGGAATAGCAACAACCTGGACAGCAAGGTGGGCGGCAACTACAACTACAGATACAGACTGTTCCGGAAGTCTAATCTGAAGCCCTTCGAAAGAGATATCAGCACCGAAATCTACCAAGCCGGCAGCAAACCTTGCAACGGCGTGGAAGGCTTCAACTGCTATTTCCCTCTGCAGTCTTACGGCTTCCAGCCAACAAATGGCGTGGGCTACCAGCCCTACCGGGTGGTCGTGCTTTCCTTCGAGCTGCTGCATGCCCCTGCTACAGTGTGCGGCCCTAAGAAGTCCACAAACCTGGTGCAGCCTACAGAGAGCATCGTGCGGTTCCCAAACATCACCAATCTGTGCCCTTTCGACGAGGTCTTTAACGCCACCCGGTTCGCCTCTGTGTACGCCTGGAATAGAAAGCGGATCTCTAACTGCGTGGCTGATTACAGCGTGCTGTACAACCTGGCCCCTTTCTTCACCTTCAAGTGCTACGGAGTCAGCCCCACCAAGCTGAATGACCTGTGTTTTACCAACGTGTACGCTGATTCTTTCGTGATCCGGGGCGATGAGGTGAGACAGATCGCCCCCGGCCAGACAGGAAACATCGCCGACTACAATTACAAGCTGCCTGACGATTTCACCGGCTGTGTGATCGCATGGAACAGCAACAAGCTGGACTCTAAAGTGAGCGGCAACTACAACTACCTGTATAGACTGTTTAGAAAAAGCAACCTGAAGCCCTTCGAGCGGGACATCTCTACAGAGATCTACCAGGCTGGCAACAAGCCCTGTAACGGCGTGGCTGGATTCAACTGCTACTTCCCCCTGAGAAGCTATTCTTTCCGCCCCACCTACGGCGTGGGCCACCAGCCTTACAGAGTGGTGGTGCTGTCCTTCGAGCTGCTGCACGCCCCTGCCACAGTGTGTGGACCAAAGAAGAGCACCAATCTGGTGAAGAACAAG
SEQ ID NO:6–编码SEQ ID NO:4的mRNA序列(1941bp)
AGAGUGCAGCCAACCGAAAGCAUCGUCAGAUUUCCUAAUAUCACCAACCUGUGCCCUUUCGGCGAAGUGUUCAACGCCACCAGAUUCGCCUCCGUGUACGCUUGGAACCGCAAACGGAUCUCCAACUGCGUGGCCGACUACAGCGUACUGUACAAUAGCGCUAGCUUCAGCACCUUCAAGUGCUACGGCGUGUCUCCUACCAAGCUGAACGACCUGUGCUUCACCAACGUGUACGCCGACUCCUUUGUGAUUAGAGGCGACGAGGUGCGGCAGAUUGCUCCUGGACAGACCGGCAAGAUCGCCGAUUAUAACUAUAAGCUGCCUGACGACUUCACCGGCUGCGUGAUUGCCUGGAACAGCAACAACCUUGAUAGCAAGGUGGGCGGAAACUACAACUACCUGUACAGACUGUUCAGAAAGAGUAAUCUGAAACCCUUCGAAAGAGAUAUCAGCACAGAGAUCUACCAGGCCGGAUCUACACCUUGUAACGGCGUUGAGGGCUUCAACUGCUACUUCCCUCUGCAGAGCUACGGCUUUCAGCCUACCAACGGCGUGGGAUACCAGCCUUACAGGGUUGUGGUGCUGUCCUUUGAACUGCUGCACGCUCCCGCCACAGUGUGCGGCCCCAAGAAAAGCACAAAUCUGGUUCAACCCACCGAGAGCAUCGUGCGGUUUCCUAACAUCACGAACCUGUGUCCUUUCGGCGAGGUGUUCAACGCCACAAGAUUUGCCAGCGUCUACGCCUGGAACAGAAAAAGAAUCAGCAAUUGCGUGGCCGACUACAGCGUGCUCUAUAACAGCGCCAGCUUUAGCACCUUUAAGUGCUACGGCGUGUCUCCUACAAAGCUGAACGACCUGUGCUUCACCAAUGUGUAUGCCGACAGCUUCGUGAUCAGGGGCGACGAAGUCAGACAAAUCGCUCCUGGCCAGACUGGCAAGAUCGCCGAUUACAACUACAAACUGCCUGACGACUUCACCGGAUGUGUGAUCGCCUGGAAUAGCAACAACCUGGACAGCAAGGUGGGCGGCAACUACAACUACAGAUACAGACUGUUCCGGAAGUCUAAUCUGAAGCCCUUCGAAAGAGAUAUCAGCACCGAAAUCUACCAAGCCGGCAGCAAACCUUGCAACGGCGUGGAAGGCUUCAACUGCUAUUUCCCUCUGCAGUCUUACGGCUUCCAGCCAACAAAUGGCGUGGGCUACCAGCCCUACCGGGUGGUCGUGCUUUCCUUCGAGCUGCUGCAUGCCCCUGCUACAGUGUGCGGCCCUAAGAAGUCCACAAACCUGGUGCAGCCUACAGAGAGCAUCGUGCGGUUCCCAAACAUCACCAAUCUGUGCCCUUUCGACGAGGUCUUUAACGCCACCCGGUUCGCCUCUGUGUACGCCUGGAAUAGAAAGCGGAUCUCUAACUGCGUGGCUGAUUACAGCGUGCUGUACAACCUGGCCCCUUUCUUCACCUUCAAGUGCUACGGAGUCAGCCCCACCAAGCUGAAUGACCUGUGUUUUACCAACGUGUACGCUGAUUCUUUCGUGAUCCGGGGCGAUGAGGUGAGACAGAUCGCCCCCGGCCAGACAGGAAACAUCGCCGACUACAAUUACAAGCUGCCUGACGAUUUCACCGGCUGUGUGAUCGCAUGGAACAGCAACAAGCUGGACUCUAAAGUGAGCGGCAACUACAACUACCUGUAUAGACUGUUUAGAAAAAGCAACCUGAAGCCCUUCGAGCGGGACAUCUCUACAGAGAUCUACCAGGCUGGCAACAAGCCCUGUAACGGCGUGGCUGGAUUCAACUGCUACUUCCCCCUGAGAAGCUAUUCUUUCCGCCCCACCUACGGCGUGGGCCACCAGCCUUACAGAGUGGUGGUGCUGUCCUUCGAGCUGCUGCACGCCCCUGCCACAGUGUGUGGACCAAAGAAGAGCACCAAUCUGGUGAAGAACAAG
SEQ ID NO:7–信号肽序列
MIHSVFLLMFLLTPTES
SEQ ID NO:8–原型株RBD三聚体PPP的构建体(680aa)
MIHSVFLLMFLLTPTESRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKHHHHHH*
SEQ ID NO:9–信号肽序列
MSSSSWLLLSLVAVTAAQS
SEQ ID NO:10–原型株-Delta-Omicron嵌合RBD三聚体PDO的构建体(672 aa)
MSSSSWLLLSLVAVTAAQSRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYRYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSKPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVQPTESIVRFPNITNLCPFDEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNLAPFFTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGNIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNKLDSKVSGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGNKPCNGVAGFNCYFPLRSYSFRPTYGVGHQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKHHHHHH*
SEQ ID NO:11–编码原型株RBD三聚体PPP的构建体(即，SEQ ID NO:8)的DNA序列 (2040bp)
ATGATCCACAGCGTGTTTCTACTGATGTTCCTGCTTACCCCAACCGAAAGCCGTGTTCAGCCAACCGAGTCGATCGTAAGGTTCCCTAACATTACCAACTTATGCCCCTTCGGTGAGGTTTTCAACGCCACGAGATTCGCATCCGTGTATGCCTGGAATCGTAAGCGTATCTCAAACTGCGTTGCGGACTACTCCGTGCTCTACAATAGTGCCAGCTTTAGCACCTTCAAATGCTACGGTGTCAGCCCCACGAAGCTGAACGATTTATGTTTTACAAATGTCTATGCCGATAGCTTTGTTATTCGCGGCGATGAGGTTAGACAAATAGCGCCAGGACAAACTGGAAAGATAGCCGACTACAATTACAAACTTCCCGATGACTTTACGGGTTGCGTCATAGCCTGGAACAGCAATAACTTGGACTCCAAGGTTGGGGGAAATTACAATTATCTCTACCGGCTATTCAGAAAGTCAAATCTGAAGCCGTTTGAGAGAGACATCAGTACAGAAATATACCAGGCCGGTAGCACTCCATGTAACGGGGTGGAAGGGTTCAATTGTTACTTCCCCCTCCAGAGTTATGGTTTCCAACCCACGAACGGAGTGGGCTACCAACCTTACAGAGTAGTAGTACTGAGCTTCGAGTTATTGCATGCTCCGGCGACAGTCTGTGGCCCAAAGAAGAGCACAAACCTGGTAAAGAACAAAAGAGTTCAACCCACTGAGAGTATTGTAAGATTCCCCAATATTACCAACTTGTGTCCTTTCGGGGAGGTATTTAATGCCACCAGATTTGCCTCTGTGTACGCATGGAATCGCAAAAGAATCAGCAATTGTGTGGCCGACTATAGCGTCCTGTATAACAGCGCCTCTTTCTCAACCTTCAAGTGTTACGGGGTAAGCCCCACTAAGCTCAACGATCTATGCTTCACCAATGTCTACGCCGATTCTTTTGTGATCCGCGGCGATGAAGTTAGACAGATCGCCCCTGGGCAAACCGGAAAGATCGCCGACTATAACTACAAACTGCCGGACGACTTCACTGGCTGCGTTATCGCCTGGAACTCGAACAATCTTGACAGCAAGGTGGGAGGCAACTACAATTATCTGTATCGGCTGTTCAGGAAATCTAACCTCAAGCCCTTCGAAAGAGATATCTCTACCGAAATCTATCAAGCGGGTAGCACGCCGTGCAATGGCGTCGAGGGTTTTAACTGCTATTTTCCCCTGCAGAGCTACGGGTTTCAACCCACTAATGGTGTGGGATATCAGCCCTACCGCGTTGTGGTGTTGAGCTTCGAACTGCTGCACGCGCCAGCGACAGTATGCGGTCCCAAGAAGTCCACGAATTTGGTTAAAAACAAGAGAGTACAGCCCACAGAGAGCATAGTGCGGTTCCCCAACATTACGAACCTGTGTCCGTTCGGCGAGGTGTTCAACGCCACTAGATTTGCAAGTGTATATGCTTGGAACCGCAAGAGAATCTCGAACTGCGTTGCTGACTACAGCGTACTCTATAACTCGGCCTCATTTTCGACATTCAAGTGCTACGGCGTGAGCCCCACCAAGCTGAACGACCTGTGTTTCACCAACGTCTACGCTGACTCGTTTGTGATTAGAGGCGATGAAGTGCGGCAGATCGCACCCGGGCAAACAGGCAAAATCGCAGACTACAACTACAAGTTGCCAGACGACTTCACGGGCTGCGTGATCGCTTGGAACTCTAACAACCTGGATTCAAAGGTGGGGGGCAACTATAATTACCTGTACCGACTGTTCCGTAAGAGCAACTTGAAGCCCTTTGAGAGGGACATTAGCACCGAAATCTACCAGGCCGGCAGCACACCCTGTAATGGCGTCGAAGGTTTCAATTGCTACTTTCCTCTCCAAAGCTACGGCTTTCAGCCCACCAACGGGGTGGGCTACCAGCCTTACCGCGTGGTGGTGCTATCGTTCGAGCTGCTGCATGCCCCCGCTACCGTGTGTGGGCCCAAGAAGAGCACTAATCTGGTGAAGAACAAACATCATCACCACCACCACSEQ ID NO:12–编码原型株-Delta-Omicron嵌合RBD三聚体PDO的构建体(即，SEQ ID NO:10)的 DNA序列(2016 bp)
ATGTCCAGCAGCAGTTGGCTGTTGCTGAGCCTGGTGGCCGTGACCGCCGCCCAGAGCAGAGTGCAGCCAACCGAAAGCATCGTCAGATTTCCTAATATCACCAACCTGTGCCCTTTCGGCGAAGTGTTCAACGCCACCAGATTCGCCTCCGTGTACGCTTGGAACCGCAAACGGATCTCCAACTGCGTGGCCGACTACAGCGTACTGTACAATAGCGCTAGCTTCAGCACCTTCAAGTGCTACGGCGTGTCTCCTACCAAGCTGAACGACCTGTGCTTCACCAACGTGTACGCCGACTCCTTTGTGATTAGAGGCGACGAGGTGCGGCAGATTGCTCCTGGACAGACCGGCAAGATCGCCGATTATAACTATAAGCTGCCTGACGACTTCACCGGCTGCGTGATTGCCTGGAACAGCAACAACCTTGATAGCAAGGTGGGCGGAAACTACAACTACCTGTACAGACTGTTCAGAAAGAGTAATCTGAAACCCTTCGAAAGAGATATCAGCACAGAGATCTACCAGGCCGGATCTACACCTTGTAACGGCGTTGAGGGCTTCAACTGCTACTTCCCTCTGCAGAGCTACGGCTTTCAGCCTACCAACGGCGTGGGATACCAGCCTTACAGGGTTGTGGTGCTGTCCTTTGAACTGCTGCACGCTCCCGCCACAGTGTGCGGCCCCAAGAAAAGCACAAATCTGGTTCAACCCACCGAGAGCATCGTGCGGTTTCCTAACATCACGAACCTGTGTCCTTTCGGCGAGGTGTTCAACGCCACAAGATTTGCCAGCGTCTACGCCTGGAACAGAAAAAGAATCAGCAATTGCGTGGCCGACTACAGCGTGCTCTATAACAGCGCCAGCTTTAGCACCTTTAAGTGCTACGGCGTGTCTCCTACAAAGCTGAACGACCTGTGCTTCACCAATGTGTATGCCGACAGCTTCGTGATCAGGGGCGACGAAGTCAGACAAATCGCTCCTGGCCAGACTGGCAAGATCGCCGATTACAACTACAAACTGCCTGACGACTTCACCGGATGTGTGATCGCCTGGAATAGCAACAACCTGGACAGCAAGGTGGGCGGCAACTACAACTACAGATACAGACTGTTCCGGAAGTCTAATCTGAAGCCCTTCGAAAGAGATATCAGCACCGAAATCTACCAAGCCGGCAGCAAACCTTGCAACGGCGTGGAAGGCTTCAACTGCTATTTCCCTCTGCAGTCTTACGGCTTCCAGCCAACAAATGGCGTGGGCTACCAGCCCTACCGGGTGGTCGTGCTTTCCTTCGAGCTGCTGCATGCCCCTGCTACAGTGTGCGGCCCTAAGAAGTCCACAAACCTGGTGCAGCCTACAGAGAGCATCGTGCGGTTCCCAAACATCACCAATCTGTGCCCTTTCGACGAGGTCTTTAACGCCACCCGGTTCGCCTCTGTGTACGCCTGGAATAGAAAGCGGATCTCTAACTGCGTGGCTGATTACAGCGTGCTGTACAACCTGGCCCCTTTCTTCACCTTCAAGTGCTACGGAGTCAGCCCCACCAAGCTGAATGACCTGTGTTTTACCAACGTGTACGCTGATTCTTTCGTGATCCGGGGCGATGAGGTGAGACAGATCGCCCCCGGCCAGACAGGAAACATCGCCGACTACAATTACAAGCTGCCTGACGATTTCACCGGCTGTGTGATCGCATGGAACAGCAACAAGCTGGACTCTAAAGTGAGCGGCAACTACAACTACCTGTATAGACTGTTTAGAAAAAGCAACCTGAAGCCCTTCGAGCGGGACATCTCTACAGAGATCTACCAGGCTGGCAACAAGCCCTGTAACGGCGTGGCTGGATTCAACTGCTACTTCCCCCTGAGAAGCTATTCTTTCCGCCCCACCTACGGCGTGGGCCACCAGCCTTACAGAGTGGTGGTGCTGTCCTTCGAGCTGCTGCACGCCCCTGCCACAGTGTGTGGACCAAAGAAGAGCACCAATCTGGTGAAGAACAAGCACCACCACCACCACCAC
SEQ ID NO:13-CB6抗体重链可变区氨基酸序列(115aa)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTVSSNYMSWVRQAPGKGLEWVSVIYSGGSTFYADSVKGRFTISRDNSMNTLFLQMNSLRAEDTAVYYCARVLPMYGDYLDYWGQGTLV
SEQ ID NO:14-CB6抗体轻链可变区氨基酸序列(109aa)
DIVMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISRYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPPEYTFGQGTKLEIK
SEQ ID NO:15-REGN10933抗体重链可变区氨基酸序列(116aa)
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SEQ ID NO:16-REGN10933抗体轻链可变区氨基酸序列(107aa)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDITNYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTFTISGLQPEDIATYYCQQYDNLPLTFGGGTKVEIK
SEQ ID NO:17-ADI-56046抗体重链可变区氨基酸序列(120aa)
EVQLVESGGGLIQPGGSLRLSCAASGFPFSGTYMTWVRQAPGKGLEWVSIIYSGGDTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLFLQMNSLRVEDTAMYYCARDREMAIITERSYGLDVWGQGTMV
SEQ ID NO:18-ADI-56046抗体轻链可变区氨基酸序列(112aa)
QPVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGGSSNIGSNSVNWYQQLPGTAPKLLIYSNSQRPSGVPDRFSGSKSGT SASLAISGLQ SEDEADYYCA AWDDSLNTFR YVFGTGTKVTVL
SEQ ID NO:19-CV07-270抗体重链可变区氨基酸序列(125aa)
QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMTWIRQAPGKGLEWVSYISSSGSTIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARARGSSGWYRIGTRWGNWFDPWGQGTLV
SEQ ID NO:20-CV07-270抗体轻链可变区氨基酸序列(112aa)
QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYEVSNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSSNVVFGGGTMLTVLGQ
SEQ ID NO:21-S309抗体重链可变区氨基酸序列(123aa)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYPFTSYGISWVRQAPGQGLEWMGWISTYNGNTNYAQKFQGRVTMTTDTSTTTGYMELRRLRSDDTAVYYCARDYTRGAWFGESLIGGFDNWGQGTLV
SEQ ID NO:22-S309抗体轻链可变区氨基酸序列(107aa)
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQTVSSTSLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQHDTSLTFGGGTKVEIK
SEQ ID NO:23-C022抗体重链可变区氨基酸序列(125aa)
QVQLQESGPGLVKPSETLSVTCTVSGGSISSSRYYWGWIRQPPGKGLEWIGSIYYSGSTYYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARHAAAYYDRSGYYFIEYFQHWGQGTLV
SEQ ID NO:24-C022抗体轻链可变区氨基酸序列(107aa)
DIQMTQSPSTLSASVGDSVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASSLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYNNYRYTFGQGTKLEIK
SEQ ID NO:25-CR022抗体重链可变区氨基酸序列(115aa)
QMQLVQSGTEVKKPGESLKISCKGSGYGFITYWIGWVRQMPGKGLEWMGIIYPGDSETRYSPSFQGQVTISADKSINTAYLQWSSLKASDTAIYYCAGGSGISTPMDVWGQGTTV
SEQ ID NO:26-CR022抗体轻链可变区氨基酸序列(113aa)
DIQLTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLYSSINKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYSTPYTFGQGTKVEIK
SEQ ID NO:27-qPCR的上游引物(20bp)
GACCCCAAAATCAGCGAAAT
SEQ ID NO:28-qPCR的下游引物(24bp)
TCTGGTTACTGCCAGTTGAATCTG
SEQ ID NO:29-qPCRDelta探针(24bp)
ACCCCGCATTACGTTTGGTGGACC
SEQ ID NO:30-qPCROmicron探针(24bp)
ACTCCGCATTACGTTTGGTGGACC

Claims (27)

1. 一种新型冠状病毒原型株、Delta和Omicron变异株的重组嵌合抗原，其特征在于：所述重组嵌合抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。
2.根据权利要求1所述的重组嵌合抗原，其特征在于，在所述重组嵌合抗原的N端连接有信号肽；
和/或，在所述重组嵌合抗原的C端连接有组氨酸标签。
3. 根据权利要求2所述的重组嵌合抗原，其特征在于，N端信号肽的氨基酸序列如SEQID NO.9所示；
和/或，C端的组氨酸标签为6个组氨酸的标签。
4.一种如权利要求1所述重组嵌合抗原的制备方法，其包括以下步骤：在编码如权利要求1所述重组嵌合抗原的核苷酸序列的5’端加上Kozak序列以及信号肽的编码序列，3’端加上组氨酸标签的编码序列和终止密码子，进行克隆表达，筛选正确的重组子，然后将其转染表达系统细胞进行表达，收集细胞培养上清，从中分离获得所述重组嵌合抗原。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述表达系统细胞为哺乳动物细胞、昆虫细胞、酵母细胞或细菌细胞。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：所述哺乳动物细胞为HEK293T细胞、293F系列细胞或CHO细胞；
和/或，所述昆虫细胞为sf9细胞、Hi5细胞、sf21细胞或S2细胞；
和/或，所述酵母细胞为毕赤酵母细胞或者由其改造的酵母细胞；
和/或，所述细菌细胞为大肠杆菌细胞。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于：所述293F系列细胞为HEK293F细胞、Freestyle293F细胞或Expi293F细胞。
8.一种多核苷酸，其编码如权利要求1-3任一项所述的重组嵌合抗原。
9.根据权利要求8所述的多核苷酸，其特征在于：所述多核苷酸为DNA或mRNA。
10. 根据权利要求9所述的多核苷酸，其特征在于：所述多核苷酸为如SEQ ID NO:5所示的DNA序列，或者为如SEQ ID NO:6所示的mRNA序列。
11.一种核酸构建体，其包含如权利要求9或10所述的多核苷酸，以及任选地，与所述多核苷酸可操作地连接的至少一个表达调控元件。
12.一种表达载体，其包含如权利要求11所述的核酸构建体。
13.一种宿主细胞，其中转化或转染有如权利要求9或10所述的多核苷酸、如权利要求11所述的核酸构建体或如权利要求12所述的表达载体。
14. 如权利要求1-3任一项所述的重组嵌合抗原、如权利要求9或10所述的多核苷酸、如权利要求11所述的核酸构建体、如权利要求12所述的表达载体或如权利要求13所述的宿主细胞在制备用于预防新型冠状病毒感染的药物中的应用；其中，所述新型冠状病毒为选自以下的一种或多种：SARS-CoV-2原始毒株，SARS-CoV-2变异毒株Delta (B.1.617.2)、Omicron亚型BA.1、BA.1.1、BA.2、BA.2.12.1、BA.3、BA.4、BA.5。
15.根据权利要求14所述的应用，其特征在于：所述药物为疫苗。
16.一种疫苗或免疫原性组合物，其包含如权利要求1-3任一项所述的重组嵌合抗原、如权利要求9或10所述的多核苷酸、如权利要求11所述的核酸构建体、如权利要求12所述的表达载体或如权利要求13所述的宿主细胞，以及生理学可接受的媒介物、佐剂、赋形剂、载体和/或稀释剂。
17.根据权利要求16所述的疫苗或免疫原性组合物，其为新型冠状病毒重组蛋白疫苗，其包括如权利要求1-3任一项所述的重组嵌合抗原和佐剂。
18.根据权利要求17所述的疫苗或免疫原性组合物，其特征在于：所述佐剂为选自以下佐剂中的一种或多种：铝佐剂、MF59佐剂和类MF59佐剂。
19. 根据权利要求16所述的疫苗或免疫原性组合物，其为新型冠状病毒DNA疫苗，所述DNA疫苗包括：
（1）真核表达载体；和
（2）构建入所述真核表达载体中的、编码如权利要求1-3任一项所述的重组嵌合抗原的DNA序列。
20.根据权利要求19所述的疫苗或免疫原性组合物，其特征在于：所述真核表达载体选自pGX0001、pVAX1、pCAGGS和pcDNA系列载体。
21. 根据权利要求16所述的疫苗或免疫原性组合物，其为新型冠状病毒mRNA疫苗，所述mRNA疫苗包括：
(I)编码如权利要求1-3任一项所述的重组嵌合抗原的mRNA序列；和
(II)脂质纳米颗粒。
22. 根据权利要求16所述的疫苗或免疫原性组合物，其为新型冠状病毒-病毒载体疫苗，其包括：
（1）病毒骨架载体；和
（2）构建入所述病毒骨架载体中的、编码如权利要求1-3任一项所述的重组嵌合抗原的DNA序列。
23.根据权利要求22所述的疫苗或免疫原性组合物，其特征在于：所述病毒骨架载体选自以下病毒载体中的一种或几种：腺病毒载体、痘病毒载体、流感病毒载体、腺相关病毒载体。
24.根据权利要求16-23任一项所述的疫苗或免疫原性组合物，其特征在于，所述疫苗或免疫原性组合物为鼻喷剂、口服制剂、栓剂或胃肠外制剂的形式。
25.根据权利要求24所述的疫苗或免疫原性组合物，其特征在于，所述鼻喷剂选自气雾剂、喷雾剂和粉雾剂；
和/或，所述口服制剂选自片剂、粉剂、丸剂、散剂、颗粒剂、软/硬胶囊剂、薄膜包衣剂和膏剂；
和/或，所述胃肠外制剂为经皮剂、软膏剂、硬膏剂、外用液剂、可注射或可推注制剂。
26.根据权利要求25所述的疫苗或免疫原性组合物，其特征在于，所述片剂为舌下片；
和/或，所述丸剂为小丸剂；
和/或，所述颗粒剂为细粒剂。
27.一种试剂盒，其包括如权利要求1-3任一项所述的重组嵌合抗原、如权利要求9或10所述的多核苷酸、如权利要求11所述的核酸构建体、如权利要求12所述的表达载体、如权利要求13所述的宿主细胞和/或如权利要求16-26任一项所述的疫苗或免疫原性组合物，以及任选地其他类型的新型冠状病毒疫苗。
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