CN115124626A

CN115124626A - 串联式杂合三聚体新冠疫苗

Info

Publication number: CN115124626A
Application number: CN202210510493.8A
Authority: CN
Inventors: 高福; 戴连攀; 张艳芳; 徐坤
Original assignee: Institute of Microbiology of CAS
Current assignee: Institute of Microbiology of CAS
Priority date: 2022-05-11
Filing date: 2022-05-11
Publication date: 2022-09-30
Also published as: CN115724999B; WO2023217005A1; CN115724999A

Abstract

本发明涉及一种新型冠状病毒原型株、Delta和Omicron变异株的重组嵌合抗原、其制备方法和应用。本发明的重组嵌合抗原由来自新型冠状病毒原型株、Delta和Omicron变异株的RBD结构域的氨基酸序列(或其衍生序列)直接串联或者通过适当的连接序列串联而成；相较于新冠病毒原型株的RBD同源三聚体，本发明的重组嵌合抗原具有较高的免疫原性，能够高效地激活广谱保护性抗体，对原始毒株以及当前流行的各种变异株都能起到很好的预防或治疗效果。

Description

串联式杂合三聚体新冠疫苗

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及一种串联式杂合三聚体新冠疫苗，具体地，涉及一种新型冠状病毒原型株、Delta和Omicron变异株的重组嵌合抗原、其相关产品、制备方法和应用。

背景技术

新型冠状病毒(SARS-CoV-2)属于冠状病毒科β-冠状病毒属，是正链RNA囊膜病毒，能够广泛感染人和动物。目前已鉴定出能够感染人类的冠状病毒共有七种，其中，同属于β冠状病毒属的严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV)、中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)以及新型冠状病毒(SARS-CoV-2)具有高致命性，在人类历史上引发了三次严重的疾病流行。

引发COVID-19的病原体被命名为SARS-CoV-2，其刺突蛋白S与SARS-CoV的刺突蛋白S具有高度的序列同源性，且与SARS-CoV使用相同的受体血管紧张素转化酶2 (ACE2)进入细胞，并引发呼吸道症状，可能发展为严重的肺炎并导致死亡。SARS-CoV-2 具有更高的传染性，促进了其引发全球大流行。SARS-CoV-2主要通过呼吸道飞沫和接触传播，存在粪-口传播和气溶胶传播的风险。人群对SARS-CoV-2普遍易感。传染源主要是新冠病毒感染的患者。无症状感染者也能成为传染源，由于感染后没有明显症状，很难及时被诊断和隔离，容易造成社区中传染源的累积，增加疾病防控的难度。基于目前全球流行的发展趋势，COVID-19存在复发风险，且很有可能与人类长期共存。因此，开发COVID-19疫苗有着重要意义。

SARS-CoV-2表面刺突蛋白(S蛋白)介导病毒的附着、融合和进入宿主细胞，位于 S蛋白C端的受体结合域(RBD)被认为是诱导机体产生中和抗体的最主要靶区域，是疫苗研发的靶标。RBD作为疫苗能够刺激机体产生中和抗体，强有力的抑制病毒与受体结合，从而抑制病毒感染和入侵宿主细胞。

随着SARS-CoV-2的全球大流行，逐步的演化出了多种流行变异株，主要包括阿尔法(Alpha)，贝塔(Beta)，伽马(Gamma)，德尔塔(Delta)，和2021年底在南非首次被发现的奥密克戎(Omicron)变异株。目前，在国内外，奥密克戎变异株已经成为主流流行毒株。这些新出现的流行变异株对以原型株刺突蛋白S或RBD为免疫原的新冠疫苗的保护效果出现明显或显著的降低。尤其是奥密克戎变异毒株，其S蛋白突变位点多达32处，对新冠病毒中和抗体药物和疫苗激活的体液免疫反应都有严重的免疫逃逸，对当前的疫情防控带来了严峻挑战。然而，有研究报道，以Omicron序列开发的疫苗激活的免疫反应虽然对Omicron变异株较强，但是对原型毒株以及其它变异毒株的交叉反应很弱，不适应当前多种流行变异株共存，且仍在较快变化的情况，因此，开发能够应对多种流行变异株的新型冠状病毒疫苗的需求迫在眉睫，而针对奥密克戎及其他变异毒株的中和效果则是新一代新型冠状病毒疫苗的重要指标。

公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

发明内容

发明目的

本发明的目的在于提供一种新型冠状病毒原型株、Delta和Omicron变异株的重组嵌合抗原、其相关产品及其制备方法和应用。根据本发明的重组嵌合抗原为由(1)新型冠状病毒原型株S蛋白RBD结构域或其一部分的氨基酸序列或与其具有至少90％，92％， 95％，96％，97％，98％或99％同一性的氨基酸序列、(2)新型冠状病毒Delta变异株S 蛋白RBD结构域或其一部分的氨基酸序列或与其具有至少90％，92％，95％，96％，97％， 98％或99％同一性的氨基酸序列和(3)新型冠状病毒Omicron变异株S蛋白RBD结构域或其一部分的氨基酸序列与其具有至少90％，92％，95％，96％，97％，98％或99％同一性的氨基酸序列直接串联或者通过适当的连接序列串联而形成的三聚体，其能够高效地激活广谱保护性抗体，对原始毒株以及当前流行的各种变异株都能起到很好的预防或治疗效果。

解决方案

为实现本发明目的，本发明提供了以下技术方案：

第一方面，本发明提供了一种新型冠状病毒原型株、Delta和Omicron变异株的重组嵌合抗原，所述重组嵌合抗原的氨基酸序列包括：按照(A-B)-C1-(A-B’)-C2-(A-B”)样式排列的氨基酸序列，其中：

A-B表示新型冠状病毒原型株S蛋白RBD结构域或其一部分的氨基酸序列，或与其具有至少90％，92％，95％，96％，97％，98％或99％同一性且与其具有相同或基本相同的免疫原性的氨基酸序列，

A-B’表示新型冠状病毒Delta变异株S蛋白RBD结构域或其一部分的氨基酸序列，或与其具有至少90％，92％，95％，96％，97％，98％或99％同一性且与其具有相同或基本相同的免疫原性的氨基酸序列，

A-B”表示新型冠状病毒Omicron变异株S蛋白RBD结构域或其一部分的氨基酸序列，或与其具有至少90％，92％，95％，96％，97％，98％或99％同一性且与其具有相同或基本相同的免疫原性的氨基酸序列，并且

C1和C2相同或不同，且各自独立地表示连接子(GGS)_n，其中，n＝0,1,2,3,4或5。

对于上述重组嵌合抗原，在优选的实施方案中，所述新型冠状病毒原型株S蛋白RBD 结构域的一部分为其全部氨基酸序列的至少70％、80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％；

和/或，所述新型冠状病毒Delta变异株S蛋白RBD结构域的一部分为其全部氨基酸序列的至少70％、80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％；

和/或，所述新型冠状病毒Omicron变异株S蛋白RBD结构域的一部分为其全部氨基酸序列的至少70％、80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％；

和/或，n＝0,1,2或3。

对于上述重组嵌合抗原，在优选的实施方案中，所述新型冠状病毒原型株S蛋白RBD 结构域或其一部分的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，或者如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸获得的、与其具有相同或基本相同的免疫原性的氨基酸序列；

和/或，所述新型冠状病毒Delta变异株S蛋白RBD结构域或其一部分的氨基酸序列如 SEQ ID NO:2所示，或者如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸获得的、与其具有相同或基本相同的免疫原性的氨基酸序列；

和/或，所述新型冠状病毒Omicron变异株S蛋白RBD结构域或其一部分的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，或者如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸获得的、与其具有相同或基本相同的免疫原性的氨基酸序列；

和/或，n＝0,1或2。

在优选的具体实施方案中，A-B表示如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，A-B’表示如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，A-B”表示如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；

进一步优选地，所述重组嵌合抗原包括如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。

第二方面，本发明提供了一种如上述第一方面所述重组嵌合抗原的制备方法，其包括以下步骤：

在编码如上述第一方面所述重组嵌合抗原的核苷酸序列的5’端加上Kozak序列以及编码信号肽的序列，3’端加上组氨酸标签和终止密码子，进行克隆表达，筛选正确的重组子，然后将其转染表达系统细胞进行表达，收集细胞培养上清，从中分离获得所述重组抗原。

在上述制备方法的一种可行的实现方式中，所述表达系统的细胞为哺乳动物细胞、昆虫细胞、酵母细胞或细菌细胞；

可选地，所述哺乳动物细胞为HEK293T细胞、293F系列细胞或CHO细胞；进一步可选地，所述293F系列细胞为HEK293F细胞、Freestyle293F细胞或Expi293F细胞；

可选地，所述昆虫细胞为sf9细胞、Hi5细胞、sf21细胞或S2细胞；

可选地，所述酵母细胞为毕赤酵母细胞或者由其改造的酵母细胞；

可选地，所述细菌细胞为大肠杆菌细胞。

第三方面，本发明提供了一种多核苷酸，其编码如上述第一方面所述的重组嵌合抗原。

所述多核苷酸为经人源密码子优化的核苷酸序列，可以为DNA或mRNA；

优选地，所述多核苷酸为如SEQ ID NO:5所示的DNA序列；

优选地，所述多核苷酸为如SEQ ID NO:6所示的mRNA序列。

第四方面，本发明提供了一种核酸构建体，其包含如上述第三方面所述的多核苷酸，以及任选地，与所述多核苷酸可操作地连接的至少一个表达调控元件。

第五方面，本发明提供了一种表达载体，其包含如上述第四方面所述的核酸构建体。

第六方面，本发明提供了一种宿主细胞，其中转化或转染有如上述第三方面所述的多核苷酸、如上述第四方面所述的核酸构建体或如上述第五方面所述的表达载体。

第七方面，本发明提供了如上述第一方面所述的重组嵌合抗原、如上述第三方面所述的多核苷酸、如上述第四方面所述的核酸构建体、如上述第五方面所述的表达载体或如上述第六方面所述的宿主细胞在制备用于预防和/或治疗新型冠状病毒感染的疫苗中的应用。

第八方面，本发明提供了一种疫苗或免疫原性组合物，其包含如上述第一方面所述的重组嵌合抗原、如上述第三方面所述的多核苷酸、如上述第四方面所述的核酸构建体、如上述第五方面所述的表达载体或如上述第六方面所述的宿主细胞，以及生理学可接受的媒介物、佐剂、赋形剂、载体和/或稀释剂。

在一个优选的具体实施方案中，所述疫苗或免疫原性组合物为新型冠状病毒重组蛋白疫苗，其包括如上述第一方面所述的重组嵌合抗原和佐剂；

可选地，所述佐剂为选自以下佐剂中的一种或多种：铝佐剂、MF59佐剂和类MF59佐剂。

在另一个优选的具体实施方案中，所述疫苗或免疫原性组合物为新型冠状病毒DNA 疫苗，其包括：

(1)真核表达载体；和

(2)构建入所述真核表达载体中的、编码如上述第一方面所述的重组嵌合抗原的DNA序列；

可选地，所述真核表达载体选自pGX0001、pVAX1、pCAGGS和pcDNA系列载体。

在另一个优选的具体实施方案中，所述疫苗或免疫原性组合物为新型冠状病毒mRNA疫苗，所述mRNA疫苗包括：

(I)编码如上述第一方面所述的重组嵌合抗原的mRNA序列；和

(II)脂质纳米颗粒。

在另一个优选的具体实施方案中，所述疫苗或免疫原性组合物为新型冠状病毒-病毒载体疫苗，其包括：

(1)病毒骨架载体；和

(2)构建入所述病毒骨架载体中的、编码如上述第一方面所述的重组嵌合抗原的DNA序列；

可选地，所述病毒骨架载体选自以下病毒载体中的一种或几种：腺病毒载体、痘病毒载体、流感病毒载体、腺相关病毒载体。

在可行的实现方式中，所述疫苗或免疫原性组合物为鼻喷剂、口服制剂、栓剂或胃肠外制剂的形式；

优选地，所述鼻喷剂选自气雾剂、喷雾剂和粉雾剂；

优选地，所述口服制剂选自片剂、粉末剂、丸剂、散剂、颗粒剂、细粒剂、软/硬胶囊剂、薄膜包衣剂、小丸剂、舌下片和膏剂；

优选地，所述胃肠外制剂为经皮剂、软膏剂、硬膏剂、外用液剂、可注射或可推注制剂。

有益效果

本发明的发明人设计了一种新型冠状病毒原型株、Delta和Omicron变异株的重组嵌合抗原，该重组嵌合抗原由来自新型冠状病毒原型株、Delta和Omicron变异株的RBD结构域或其一部分的氨基酸序列(或其衍生序列)直接串联或者通过适当的连接序列串联而成，其具有较高的免疫原性，可以诱导产生针对原始病毒株以及一系列变异毒株的高水平的中和抗体，有望成为预防新型冠状病毒的广谱疫苗。

附图说明

一个或多个实施例通过与之对应的附图中的图片进行示例性说明，这些示例性说明并不构成对实施例的限定。在这里专用的词“示例性”意为“用作例子、实施例或说明性”。这里作为“示例性”所说明的任何实施例不必解释为优于或好于其它实施例。

图1是本发明实施例2中记载的，表达质粒pCAGGS-PPP转染Expi293F^TM细胞后五天所收集的细胞上清的蛋白免疫印迹(在非还原(non-reduced)或还原(reduced)条件下)结果图。

图2是本发明实施例2中记载的，表达质粒pCAGGS-PDO转染Expi293F^TM细胞后五天所收集的细胞上清的蛋白免疫印迹(在非还原或还原条件下)结果图。

图3是本发明实施例2中记载的，PPP三聚体蛋白的分子筛层析曲线及其洗脱峰处的洗脱液的SDS-PAGE鉴定结果图(在非还原或还原条件下)。

图4是本发明实施例2中记载的，PDO三聚体蛋白的分子筛层析曲线及其洗脱峰处的洗脱液的SDS-PAGE鉴定结果图(在非还原或还原条件下)。

图5是本发明实施例2中记载的，采用分析型超速离心法鉴定PPP三聚体蛋白的分子量的曲线图。

图6是本发明实施例2中记载的，采用分析型超速离心法鉴定PDO三聚体蛋白的分子量的曲线图。

图7是本发明实施例3中记载的，PPP蛋白与CB6 Fab蛋白的复合物的分子筛层析曲线图，以及两个洗脱峰处的洗脱液的SDS-PAGE鉴定结果图。

图8是本发明实施例3中记载的，PDO蛋白与CB6 Fab蛋白的复合物的分子筛层析曲线图，以及两个洗脱峰处的洗脱液的SDS-PAGE鉴定结果图。

图9是本发明实施例3中记载的，PPP蛋白与CB6 Fab蛋白的复合物的电镜结构示意图。

图10是本发明实施例3中记载的，PDO蛋白与CB6 Fab蛋白的复合物的电镜结构示意图。

图11是本发明实施例4中记载的，用PPP或PDO三聚体蛋白疫苗免疫小鼠的实验流程示意图。

图12是本发明实施例5中记载的，通过酶联免疫吸附试验(ELISA)检测PPP或PDO三聚体蛋白疫苗激发小鼠产生RBD特异性结合抗体滴度的结果图。

图13是本发明实施例6中记载的，PPP或PDO三聚体蛋白疫苗在对小鼠进行第二次免疫后的小鼠血清针对新冠病毒原型株、Delta和Omicron(BA.1和BA.2亚型)变异株的假病毒的中和抗体滴度检测结果图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

另外，为了更好的说明本发明，在下文的具体实施方式中给出了众多的具体细节。本领域技术人员应当理解，没有某些具体细节，本发明同样可以实施。在一些实施例中，对于本领域技术人员熟知的原料、元件、方法、手段等未作详细描述，以便于凸显本发明的主旨。

除非另有其它明确表示，否则在整个说明书和权利要求书中，术语“包括”或其变换如“包含”或“包括有”等等将被理解为包括所陈述的元件或组成部分，而并未排除其它元件或其它组成部分。

实施例1：SARS-CoV-2原型株RBD三聚体(即，PPP)以及原型株-Delta-Omicron 嵌合RBD三聚体(即，PDO)构建体的设计

本实施例中，分别设计了新冠病毒原型株RBD三聚体(简称PPP)和原型株-Delta-Omicron嵌合RBD三聚体(简称PDO)的构建体，具体方案如下：

(1)将三条新冠病毒原型株RBD结构域R319-K537区段的序列直接串联起来，在其N端连接信号肽(MIHSVFLLMFLLTPTES，SEQ ID NO.7)，在其C端加上6个组氨酸 (HHHHHH)，得到原型株RBD三聚体PPP的构建体(其氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示)；

(2)将新冠病毒原型株RBD结构域R319-L533区段的序列(SEQ ID NO:1)、Delta 变异株RBD结构域V320-L533区段的序列(SEQ ID NO:2)、Omicron变异株RBD结构域 V317-K534区段的序列(SEQ ID NO:3)直接串联起来，在其N端连接信号肽(MSSSSWLLLSLVAVTAAQS，SEQ ID NO.9)，在其C端加上6个组氨酸(HHHHHH) 标签，得到原型株-Delta-Omicron嵌合RBD三聚体PDO的构建体(其氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示)；

实施例2：SARS-CoV-2原型株RBD三聚体(即，PPP)以及原型株-Delta-Omicron 嵌合RBD三聚体(即，PDO)蛋白的表达与纯化

表达质粒的构建：

上述实施例1中所设计的两种构建体的氨基酸序列使用人源密码子优化，对应的DNA编码序列分别如SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示；在这些DNA编码序列的3’端加上终止密码子，在其5’端上游加上Kozak序列gccacc，这两个包含Kozak序列的DNA 序列由南京金斯瑞生物科技有限公司合成；所合成的两段DNA序列通过EcoRI和XhoI酶切位点克隆到pCAGGS质粒，分别获得表达原型株RBD三聚体和原型株-Delta-Omicron 嵌合RBD三聚体的表达质粒pCAGGS-PPP和pCAGGS-PDO。

蛋白表达与纯化：

使用Expi 293F细胞表达PPP和PDO单链异源三聚体。

将上述构建的表达质粒pCAGGS-PPP和pCAGGS-PDO分别转染Expi293F^TM细胞，5 天后收集上清，离心去除沉淀，再通过0.22μm的滤膜过滤，进一步除去杂质。将所得细胞上清用蛋白免疫印迹法进行鉴定，其中使用组氨酸标签特异性抗体进行检测，实验结果分别如图1、2所示；由图1、图2可以看出，用Expi239F细胞表达的PPP和PDO能够正确折叠和分泌到上清中，且由于它们是串联的三聚体，采用含二硫苏糖醇(reduced) 和不含二硫苏糖醇(Non-reduced)的上样缓冲液进行凝胶电泳，都可以检测到正确大小的目的条带，大小为75KDa左右。

此外，还将所得细胞上清通过镍亲和柱层析进行纯化；具体地，在4℃条件下，使细胞上清通过镍亲和柱(Histrap,GE Healthcare)，用缓冲液A(20mM Tris，150mM NaCl， pH8.0)洗涤，除去非特异结合蛋白；然后，用低浓度咪唑(20mM Tris，150mM NaCl， pH 8.0，20mM咪唑)洗脱杂蛋白，用缓冲液B(20mM Tris，150mM NaCl，pH 8.0， 300mM咪唑)将目的蛋白从HisTrap上洗脱下来，并用10kDa浓缩管将洗脱液浓缩换液 30倍以上至缓冲液A，终体积小于1ml；最后，通过Superdex^TM200 Increase 10/300GL柱子(GE Healthcare)进行分子筛层析，以进一步纯化目的蛋白。分子筛层析缓冲液为PBS 缓冲液(8mM Na₂HPO₄，136mMNaCl，2mM KH₂PO₄，2.6mM KCl，pH 7.4)。

PPP和PDO三聚体蛋白的分子筛层析曲线及其洗脱峰处的洗脱液的SDS-PAGE鉴定结果分别如图3、图4所示，由图3和图4可以看出，PPP、PDO在13.5mL左右均有一个洗脱峰，将该洗脱峰处的洗脱液进行SDS-PAGE分析显示，非还原(不含二硫苏糖醇DTT的上样缓冲液)和还原(含二硫苏糖醇DTT的上样缓冲液)条件下，洗脱蛋白大小都在75KDa左右，符合上述两种三聚体蛋白的分子大小。采用分析型超速离心法鉴定 PPP和PDO的蛋白分子量分别为80.5KDa(如图5所示)和72.5KDa(如图6所示)，再结合分子筛和SDS-PAGE图片结果，说明两个蛋白均以三聚体的形式稳定存在。证明纯化得到了PPP和PDO三聚体蛋白，并且电泳条带单一，说明纯化后的蛋白具有较高的纯度，此外，PPP和PDO三聚体蛋白还具有较高的产量。

实施例3：PPP和PDO三聚体疫苗的电镜结构解析

将PPP蛋白与CB6 Fab蛋白混合，在4℃条件孵育12小时。然后通过Superdex^TM200Increase 10/300GL柱子(GE Healthcare)进行分子筛层析(pH8.0)，以纯化PPP蛋白与 CB6Fab蛋白的复合物，其分子筛层析曲线如图7所示；此外，收集两个洗脱峰处的洗脱液，并对其进行SDS-PAGE鉴定，由SDS-PAGE鉴定结果可知：图7的其中一个洗脱峰是PPP蛋白与CB6Fab的复合物，另一个峰是过量的CB6 Fab，这说明：PPP蛋白可以与CB6 Fab结合并形成了复合物。采用同样的方法，制备获得PDO同源三聚体蛋白和CB6 Fab的复合物蛋白(图8所示)。

此外，将上述收集的PPP和CB6 Fab的复合物以及PDO蛋白与CB6 Fab的复合物的洗脱液进行浓缩，浓缩后用于冷冻电镜分析，程序如下：

事先准备好制样用的Quantifoil载网(规格1.2/1.3)，进行辉光放电亲水化处理。随后将制备好的PPP同源RBD-Trimer蛋白与CB6 Fab的复合物以及PDO嵌合RBD-Trimer蛋白与CB6 Fab的复合物滴加在上述准备好的载网上，用自动制样机器Vitrobot Mark IV将载网迅速插入液态乙烷中完成制样。

数据收集是用300kV Titan Krios透射电镜(Thermo Fisher公司)搭配K3直接电子探测器相机进行的，使用Serial-EM自动收集程序收集大量照片。然后，使用MotionCor2软件对收集到的原始数据进行漂移校正，用CTFFIND4.1软件对图片进行衬度传递函数校正，使用Relion-3.1软件对图片进一步处理和最后的三维重构。

PPP同源三聚体和CB6 Fab的复合物冷冻电镜如图9所示，由图9可见：PPP同源三聚体和CB6 Fab的复合物结构中，三个Prototype的RBD从俯视角度基本每个RBD之间角度为120°左右，均匀分散开，每个RBD可以结合一个CB6 Fab，说明每个RBD都可以暴露重要的免疫表位，从而激发小鼠的特异性免疫反应。

PDO蛋白与CB6 Fab的复合物的冷冻电镜图像如图10所示，由图10可见：在PDO 异源三聚体蛋白与CB6 Fab的复合物中，Prototype RBD，Delta RBD和Omicron RBD相对对称分布；并且Prototype RBD和Delta RBD分别可以结合一个CB6 Fab，Omicron RBD不结合CB6Fab，说明PDO异源三聚体蛋白的主要表位完全暴露，有利于激活特异性免疫反应。

实施例4：实验动物免疫和样品采集

为了检测三聚体蛋白的免疫原性，我们将实施例2所得纯化的三聚体蛋白PPP或PDO作为免疫原分别免疫BALB/c小鼠，阴性对照(Sham组)采用PBS溶液进行免疫，每组6只小鼠。所使用的BALB/c小鼠从维通利华公司购买，均为雌性，6-8周龄。小鼠分组及免疫剂量情况如表1所示。

表1新型冠状病毒RBD三聚体疫苗免疫小鼠的分组及免疫剂量

具体程序如下：

将免疫原PPP或PDO分别用PBS稀释至40μg/ml，将稀释后的免疫原与SWE佐剂按照体积比1:1的比例混合、乳化，制备成疫苗。阴性对照组为PBS溶液与SWE佐剂混合。

免疫方案如图11所示。具体地，按照上述方法所得疫苗通过肌肉注射的方式对BALB/c小鼠进行免疫，所有小鼠分别在第0天、第21天进行第一次和第二次免疫，每次100μL的接种体积(含抗原蛋白2μg)。在第19天、第35天，对小鼠进行取血，离心收集血清，所得血清于-80℃冰箱保存，用于滴定抗原特异性抗体滴度和假病毒中和抗体滴度。免疫小鼠的实验流程如图5所示。

实施例5：通过酶联免疫吸附试验(ELISA)，检测三聚体蛋白疫苗PPP或PDO诱导产生的抗原特异性抗体滴度

本实施例中，通过酶联免疫吸附试验(ELISA)，检测实施例4中采用三聚体蛋白疫苗PPP、PDO所免疫的小鼠血清的抗原特异性抗体滴度，具体程序如下：

(1)分别将PPP、PDO三聚体蛋白用ELISA包被液(索莱宝，C1050)稀释至3μg/mL，向96孔ELISA板(Coring，3590)中每孔加入100μL上述稀释液，4℃放置过夜(12h 以上)，以进行包被；

(2)倒掉包被液，加入PBS，洗一遍；使用PBS配置的5％脱脂牛奶作为封闭液，加入96孔板中，每孔100μL，室温放置1h，进行封闭，之后用PBS溶液洗一遍；

(3)封闭期间，用封闭液稀释小鼠血清样品；血清样品从20倍起，按照4倍梯度依次进行稀释；具体地，第一个孔加入152μL封闭液和8μl的血清样品混匀，第二个稀释度为封闭液120μL和第一个孔的溶液40μL混匀，依次稀释；稀释完之后，在ELISA 板中每孔加入100μL，阴性对照组加入封闭液，37℃孵育2小时，之后使用PBS-T洗4 遍；

(4)向每孔中，加入用封闭液1:2000稀释的偶联HRP的羊抗鼠二抗(柏奥易杰，BE0102-100)，37℃孵育1.5小时，之后PBS-T洗5-6遍；然后，加入60μL TMB显色液显色，反应适当时间后加入60μL 2M盐酸终止反应，在酶标仪上检测OD450读值。

抗体滴度值被定义为反应值大于2.5倍阴性对照值的血清最高稀释倍数。当最低稀释倍数(检测限)的反应值仍小于2.5倍背景值时，该样品的滴度定义为最低稀释倍数的一半，即1:10。

第19天采集的血清(即，一免血清)和第35天采集的血清(即，一免血清)的免疫原性检测结果如图6所示；图6结果显示，PPP和PDO三聚体疫苗在免疫后均产生了相应的抗体。PPP三聚体疫苗一免后的血清的特异性结合抗体滴度超10³，而PDO三聚体疫苗一免后的血清的特异性结合抗体滴度超10⁴，即，PDO疫苗一免后血清中的RBD 特异性结合抗体显著高于PPP(***)；PPP三聚体疫苗二免后的血清的特异性结合抗体滴度超10⁵，而PDO三聚体疫苗的接近10⁶，即，PDO疫苗二免后血清中的RBD特异性结合抗体显著高于PPP(*)。

实验结果如图12所示，由图12可知：PDO三聚体抗原激发小鼠产生RBD特异性结合抗体的水平显著高于PPP，即，与PPP同源三聚体相比，本发明的异源三聚体抗原 PDO具有更好的免疫原性，而免疫原性直接关系着疫苗的效果，换言之，这些实验结果表明，本发明的PDO三聚体抗原设计比PPP具有明显优势。

实施例6：通过假病毒中和实验，检测三聚体蛋白疫苗PPP或PDO针对新冠病毒假病毒所产生的中和抗体滴度

使用新冠病毒假病毒，分别检测第二次免疫后的(即，第35天采集的)小鼠血清对新冠病毒原型株、Delta和Omicron(BA.1和BA.2亚型)变异株的假病毒的50％假病毒中和滴度(pVNT₅₀)。

本实施例中使用的新冠病毒假病毒为基于水疱性口炎病毒(VSV)骨架制备的展示新冠病毒S蛋白的假病毒，制备方法参见本课题组已经公开发表论文的方法部分(Effectsof a Prolonged Booster Interval on Neutralization of Omicron Variant,N Engl JMed,2022, PMID:35081296)。

检测新冠病毒假病毒(以下简称假病毒)中和抗体滴度的方法如下：

在96孔板中，将免疫小鼠血清按2倍梯度倍比稀释，初始浓度为1:20，共设置11 个浓度梯度；之后，将稀释的免疫小鼠血清与假病毒分别混合(空白培养基与假病毒混合作为阴性对照(NC)，未与假病毒混合的空白培养基作为空白对照(MOCK))，37℃孵育1小时；然后，将免疫小鼠血清-假病毒混合液转移至已铺满Vero细胞的96孔板中， 37℃孵育15小时后，通过CQ1共聚焦细胞成像仪(Yokogawa)检测并计算阳性细胞数值，然后，在GraphPadPrism软件中绘制拟合曲线，计算50％中和时对应的血清稀释度的倒数，即为50％假病毒中和滴度pVNT₅₀。

各免疫组小鼠在一免或二免后的血清的假病毒中和抗体滴度检测结果如图13所示。

由图13可见：

1)针对新冠病毒原型株的假病毒，PPP三聚体疫苗的NT₅₀是2228.6，而PDO三聚体疫苗的NT₅₀是7760.5，较PPP疫苗高3倍以上，表明：PDO三聚体疫苗对原型株的假病毒的中和效果显著优于PPP(***)；

2)针对新冠病毒Delta变异株的假病毒，PPP三聚体疫苗的NT₅₀是735.2，而PDO 三聚体疫苗的NT₅₀是4457.2，较PPP疫苗高达6倍，表明：PDO三聚体疫苗对Delta 变异株的假病毒的中和效果显著优于PPP(***)；

3)针对新冠病毒奥密克戎BA.1变异株的假病毒，PPP三聚体疫苗的NT₅₀是10.7，而PDO三聚体疫苗的NT₅₀是844.5，较PPP疫苗高将近80倍，表明：PDO对奥密克戎BA.1型变异株的假病毒的中和效果显著优于PPP(***)；

4)针对新冠病毒奥密克戎BA.2变异株的假病毒，PPP三聚体疫苗的NT₅₀是9.4，而PDO三聚体疫苗的NT₅₀是557.2，较PPP疫苗高将近60倍，表明：PDO对奥密克戎BA.2型变异株的假病毒的中和效果显著优于PPP(***)。

上述实验结果表明，与同源三聚体PPP相比较，本发明的异源三聚体抗原PDO具有以下优势：

(1)与PPP相比，PDO免疫小鼠血清针对Delta和Omicron变异株展现出了更高的中和保护活性；

尤其是，对于目前的流行毒株Omicron BA.1和BA.2亚型，PPP组小鼠血清基本已失去了针对Omicron BA.1和BA.2亚型的假病毒中和活性；而PDO组小鼠血清对 Omicron BA.1和BA.2假病毒均为100％中和阳性，PDO针对BA.1的NT₅₀为844.5，针对BA.2的NT₅₀为557.2，中和滴度值较高，具有良好的中和效果。

换言之，在针对新冠病毒Delta、Omicron BA.1和Omicron BA.2变异株的假病毒的中和效果方面，PDO三聚体疫苗均显著性地高于PPP。众所周知，在最近一年内，Delta 变异株和Omicron变异株在世界范围内大规模流行，给全球人民的生命健康造成严重威胁，而上述实验证实，本发明的PDO三聚体疫苗针对Delta和Omicron变异株均可诱导较强的免疫反应，说明其针对这两种变异株将具有很好的免疫保护效果，应用前景广阔。

(2)与PPP相比，PDO免疫小鼠血清针对原型株也展现出了更高的中和保护活性；

本发明的PDO三聚体中包含一个拷贝的原型株RBD、一个拷贝的Delta变异株RBD和一个拷贝的Omicron变异株RBD的串联，而PPP三聚体为三个原型株的RBD的串联；由免疫小鼠血清的假病毒中和抗体滴度检测结果可知，PDO免疫小鼠血清对原型株假病毒的中和抗体滴度为7760.5，远远大于PPP免疫小鼠血清对原型株假病毒的中和抗体滴度2228.6，且两者具有显著性差异(***)。

综上所述，本发明的PDO三聚体疫苗可诱导更强且更广谱的免疫反应；当前流行的新冠病毒毒株变化较快，而未来流行毒株的种类及其免疫学特点都极难预测，因此 PDO疫苗的上述特性对于预防流行毒株的变化或者多种毒株的共流行具有极大的应用价值。

最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明技术方案的精神和范围。

本文所用序列如下：

SEQ ID NO:1-原型株S蛋白RBD的R319-L533区域的氨基酸序列(215aa)

RVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFK CYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIA WNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPL QSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNL

SEQ ID NO:2-Delta变异株S蛋白RBD的V320-L533区域的氨基酸序列(214aa)

VQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFK CYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIA WNSNNLDSKVGGNYNYRYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSKPCNGVEGFNCYFPL QSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNL

SEQ ID NO:3-Omicron变异株S蛋白RBD的V317-K534区域的氨基酸序列(218aa)

VQPTESIVRFPNITNLCPFDEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNLAPFFTFK CYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGNIADYNYKLPDDFTGCVIA WNSNKLDSKVSGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGNKPCNGVAGFNCYFPL RSYSFRPTYGVGHQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNK

SEQ ID NO:4-PDO疫苗实例的全长氨基酸序列(SEQ ID NO:1+SEQ ID NO:2+SEQ ID NO:3)(647aa)

SEQ ID NO:5–编码SEQ ID NO:4的DNA序列(1941bp)

AGAGTGCAGCCAACCGAAAGCATCGTCAGATTTCCTAATATCACCAACCTGTGCCC TTTCGGCGAAGTGTTCAACGCCACCAGATTCGCCTCCGTGTACGCTTGGAACCGC AAACGGATCTCCAACTGCGTGGCCGACTACAGCGTACTGTACAATAGCGCTAGCTT CAGCACCTTCAAGTGCTACGGCGTGTCTCCTACCAAGCTGAACGACCTGTGCTTCA CCAACGTGTACGCCGACTCCTTTGTGATTAGAGGCGACGAGGTGCGGCAGATTGC TCCTGGACAGACCGGCAAGATCGCCGATTATAACTATAAGCTGCCTGACGACTTCA CCGGCTGCGTGATTGCCTGGAACAGCAACAACCTTGATAGCAAGGTGGGCGGAAA CTACAACTACCTGTACAGACTGTTCAGAAAGAGTAATCTGAAACCCTTCGAAAGA GATATCAGCACAGAGATCTACCAGGCCGGATCTACACCTTGTAACGGCGTTGAGGG CTTCAACTGCTACTTCCCTCTGCAGAGCTACGGCTTTCAGCCTACCAACGGCGTGG GATACCAGCCTTACAGGGTTGTGGTGCTGTCCTTTGAACTGCTGCACGCTCCCGCC ACAGTGTGCGGCCCCAAGAAAAGCACAAATCTGGTTCAACCCACCGAGAGCATCG TGCGGTTTCCTAACATCACGAACCTGTGTCCTTTCGGCGAGGTGTTCAACGCCACA AGATTTGCCAGCGTCTACGCCTGGAACAGAAAAAGAATCAGCAATTGCGTGGCCG ACTACAGCGTGCTCTATAACAGCGCCAGCTTTAGCACCTTTAAGTGCTACGGCGTG TCTCCTACAAAGCTGAACGACCTGTGCTTCACCAATGTGTATGCCGACAGCTTCGTGATCAGGGGCGACGAAGTCAGACAAATCGCTCCTGGCCAGACTGGCAAGATCGCC GATTACAACTACAAACTGCCTGACGACTTCACCGGATGTGTGATCGCCTGGAATAG CAACAACCTGGACAGCAAGGTGGGCGGCAACTACAACTACAGATACAGACTGTTC CGGAAGTCTAATCTGAAGCCCTTCGAAAGAGATATCAGCACCGAAATCTACCAAG CCGGCAGCAAACCTTGCAACGGCGTGGAAGGCTTCAACTGCTATTTCCCTCTGCA GTCTTACGGCTTCCAGCCAACAAATGGCGTGGGCTACCAGCCCTACCGGGTGGTC GTGCTTTCCTTCGAGCTGCTGCATGCCCCTGCTACAGTGTGCGGCCCTAAGAAGTC CACAAACCTGGTGCAGCCTACAGAGAGCATCGTGCGGTTCCCAAACATCACCAAT CTGTGCCCTTTCGACGAGGTCTTTAACGCCACCCGGTTCGCCTCTGTGTACGCCTG GAATAGAAAGCGGATCTCTAACTGCGTGGCTGATTACAGCGTGCTGTACAACCTGG CCCCTTTCTTCACCTTCAAGTGCTACGGAGTCAGCCCCACCAAGCTGAATGACCTG TGTTTTACCAACGTGTACGCTGATTCTTTCGTGATCCGGGGCGATGAGGTGAGACA GATCGCCCCCGGCCAGACAGGAAACATCGCCGACTACAATTACAAGCTGCCTGAC GATTTCACCGGCTGTGTGATCGCATGGAACAGCAACAAGCTGGACTCTAAAGTGA GCGGCAACTACAACTACCTGTATAGACTGTTTAGAAAAAGCAACCTGAAGCCCTTC GAGCGGGACATCTCTACAGAGATCTACCAGGCTGGCAACAAGCCCTGTAACGGCG TGGCTGGATTCAACTGCTACTTCCCCCTGAGAAGCTATTCTTTCCGCCCCACCTACG GCGTGGGCCACCAGCCTTACAGAGTGGTGGTGCTGTCCTTCGAGCTGCTGCACGC CCCTGCCACAGTGTGTGGACCAAAGAAGAGCACCAATCTGGTGAAGAACAAG

SEQ ID NO:6–编码SEQ ID NO:4的mRNA序列(1941bp)

AGAGUGCAGCCAACCGAAAGCAUCGUCAGAUUUCCUAAUAUCACCAACCUGUG CCCUUUCGGCGAAGUGUUCAACGCCACCAGAUUCGCCUCCGUGUACGCUUGGA ACCGCAAACGGAUCUCCAACUGCGUGGCCGACUACAGCGUACUGUACAAUAGC GCUAGCUUCAGCACCUUCAAGUGCUACGGCGUGUCUCCUACCAAGCUGAACGA CCUGUGCUUCACCAACGUGUACGCCGACUCCUUUGUGAUUAGAGGCGACGAGG UGCGGCAGAUUGCUCCUGGACAGACCGGCAAGAUCGCCGAUUAUAACUAUAAG CUGCCUGACGACUUCACCGGCUGCGUGAUUGCCUGGAACAGCAACAACCUUGA UAGCAAGGUGGGCGGAAACUACAACUACCUGUACAGACUGUUCAGAAAGAGUA AUCUGAAACCCUUCGAAAGAGAUAUCAGCACAGAGAUCUACCAGGCCGGAUCU ACACCUUGUAACGGCGUUGAGGGCUUCAACUGCUACUUCCCUCUGCAGAGCUA CGGCUUUCAGCCUACCAACGGCGUGGGAUACCAGCCUUACAGGGUUGUGGUGC UGUCCUUUGAACUGCUGCACGCUCCCGCCACAGUGUGCGGCCCCAAGAAAAGC ACAAAUCUGGUUCAACCCACCGAGAGCAUCGUGCGGUUUCCUAACAUCACGAA CCUGUGUCCUUUCGGCGAGGUGUUCAACGCCACAAGAUUUGCCAGCGUCUACG CCUGGAACAGAAAAAGAAUCAGCAAUUGCGUGGCCGACUACAGCGUGCUCUAU AACAGCGCCAGCUUUAGCACCUUUAAGUGCUACGGCGUGUCUCCUACAAAGCU GAACGACCUGUGCUUCACCAAUGUGUAUGCCGACAGCUUCGUGAUCAGGGGCG ACGAAGUCAGACAAAUCGCUCCUGGCCAGACUGGCAAGAUCGCCGAUUACAAC UACAAACUGCCUGACGACUUCACCGGAUGUGUGAUCGCCUGGAAUAGCAACAA CCUGGACAGCAAGGUGGGCGGCAACUACAACUACAGAUACAGACUGUUCCGGA AGUCUAAUCUGAAGCCCUUCGAAAGAGAUAUCAGCACCGAAAUCUACCAAGCCGGCAGCAAACCUUGCAACGGCGUGGAAGGCUUCAACUGCUAUUUCCCUCUGCA GUCUUACGGCUUCCAGCCAACAAAUGGCGUGGGCUACCAGCCCUACCGGGUGG UCGUGCUUUCCUUCGAGCUGCUGCAUGCCCCUGCUACAGUGUGCGGCCCUAAG AAGUCCACAAACCUGGUGCAGCCUACAGAGAGCAUCGUGCGGUUCCCAAACAU CACCAAUCUGUGCCCUUUCGACGAGGUCUUUAACGCCACCCGGUUCGCCUCUG UGUACGCCUGGAAUAGAAAGCGGAUCUCUAACUGCGUGGCUGAUUACAGCGUG CUGUACAACCUGGCCCCUUUCUUCACCUUCAAGUGCUACGGAGUCAGCCCCACC AAGCUGAAUGACCUGUGUUUUACCAACGUGUACGCUGAUUCUUUCGUGAUCCG GGGCGAUGAGGUGAGACAGAUCGCCCCCGGCCAGACAGGAAACAUCGCCGACU ACAAUUACAAGCUGCCUGACGAUUUCACCGGCUGUGUGAUCGCAUGGAACAGC AACAAGCUGGACUCUAAAGUGAGCGGCAACUACAACUACCUGUAUAGACUGUU UAGAAAAAGCAACCUGAAGCCCUUCGAGCGGGACAUCUCUACAGAGAUCUACC AGGCUGGCAACAAGCCCUGUAACGGCGUGGCUGGAUUCAACUGCUACUUCCCC CUGAGAAGCUAUUCUUUCCGCCCCACCUACGGCGUGGGCCACCAGCCUUACAG AGUGGUGGUGCUGUCCUUCGAGCUGCUGCACGCCCCUGCCACAGUGUGUGGAC CAAAGAAGAGCACCAAUCUGGUGAAGAACAAG

SEQ ID NO:7–信号肽序列

MIHSVFLLMFLLTPTES

SEQ ID NO:8–原型株RBD三聚体PPP的构建体(680aa)

SEQ ID NO:9–信号肽序列

MSSSSWLLLSLVAVTAAQS

SEQ ID NO:10–原型株-Delta-Omicron嵌合RBD三聚体PDO的构建体(672aa)

SEQ ID NO:11–编码原型株RBD三聚体PPP的构建体(即，SEQ ID NO:8)的DNA序列 (2040bp)

ATGATCCACAGCGTGTTTCTACTGATGTTCCTGCTTACCCCAACCGAAAGCCGTGT TCAGCCAACCGAGTCGATCGTAAGGTTCCCTAACATTACCAACTTATGCCCCTTCG GTGAGGTTTTCAACGCCACGAGATTCGCATCCGTGTATGCCTGGAATCGTAAGCGT ATCTCAAACTGCGTTGCGGACTACTCCGTGCTCTACAATAGTGCCAGCTTTAGCAC CTTCAAATGCTACGGTGTCAGCCCCACGAAGCTGAACGATTTATGTTTTACAAATG TCTATGCCGATAGCTTTGTTATTCGCGGCGATGAGGTTAGACAAATAGCGCCAGGA CAAACTGGAAAGATAGCCGACTACAATTACAAACTTCCCGATGACTTTACGGGTTG CGTCATAGCCTGGAACAGCAATAACTTGGACTCCAAGGTTGGGGGAAATTACAATT ATCTCTACCGGCTATTCAGAAAGTCAAATCTGAAGCCGTTTGAGAGAGACATCAGT ACAGAAATATACCAGGCCGGTAGCACTCCATGTAACGGGGTGGAAGGGTTCAATT GTTACTTCCCCCTCCAGAGTTATGGTTTCCAACCCACGAACGGAGTGGGCTACCAA CCTTACAGAGTAGTAGTACTGAGCTTCGAGTTATTGCATGCTCCGGCGACAGTCTG TGGCCCAAAGAAGAGCACAAACCTGGTAAAGAACAAAAGAGTTCAACCCACTGA GAGTATTGTAAGATTCCCCAATATTACCAACTTGTGTCCTTTCGGGGAGGTATTTAA TGCCACCAGATTTGCCTCTGTGTACGCATGGAATCGCAAAAGAATCAGCAATTGTG TGGCCGACTATAGCGTCCTGTATAACAGCGCCTCTTTCTCAACCTTCAAGTGTTACG GGGTAAGCCCCACTAAGCTCAACGATCTATGCTTCACCAATGTCTACGCCGATTCTT TTGTGATCCGCGGCGATGAAGTTAGACAGATCGCCCCTGGGCAAACCGGAAAGAT CGCCGACTATAACTACAAACTGCCGGACGACTTCACTGGCTGCGTTATCGCCTGGA ACTCGAACAATCTTGACAGCAAGGTGGGAGGCAACTACAATTATCTGTATCGGCTG TTCAGGAAATCTAACCTCAAGCCCTTCGAAAGAGATATCTCTACCGAAATCTATCA AGCGGGTAGCACGCCGTGCAATGGCGTCGAGGGTTTTAACTGCTATTTTCCCCTGC AGAGCTACGGGTTTCAACCCACTAATGGTGTGGGATATCAGCCCTACCGCGTTGTG GTGTTGAGCTTCGAACTGCTGCACGCGCCAGCGACAGTATGCGGTCCCAAGAAGT CCACGAATTTGGTTAAAAACAAGAGAGTACAGCCCACAGAGAGCATAGTGCGGTT CCCCAACATTACGAACCTGTGTCCGTTCGGCGAGGTGTTCAACGCCACTAGATTTG CAAGTGTATATGCTTGGAACCGCAAGAGAATCTCGAACTGCGTTGCTGACTACAGC GTACTCTATAACTCGGCCTCATTTTCGACATTCAAGTGCTACGGCGTGAGCCCCACC AAGCTGAACGACCTGTGTTTCACCAACGTCTACGCTGACTCGTTTGTGATTAGAGG CGATGAAGTGCGGCAGATCGCACCCGGGCAAACAGGCAAAATCGCAGACTACAA CTACAAGTTGCCAGACGACTTCACGGGCTGCGTGATCGCTTGGAACTCTAACAAC CTGGATTCAAAGGTGGGGGGCAACTATAATTACCTGTACCGACTGTTCCGTAAGAG CAACTTGAAGCCCTTTGAGAGGGACATTAGCACCGAAATCTACCAGGCCGGCAGC ACACCCTGTAATGGCGTCGAAGGTTTCAATTGCTACTTTCCTCTCCAAAGCTACGG CTTTCAGCCCACCAACGGGGTGGGCTACCAGCCTTACCGCGTGGTGGTGCTATCGT TCGAGCTGCTGCATGCCCCCGCTACCGTGTGTGGGCCCAAGAAGAGCACTAATCTGGTGAAGAACAAACATCATCACCACCACCAC

SEQ ID NO:12–编码原型株-Delta-Omicron嵌合RBD三聚体PDO的构建体(即，SEQ ID NO:10)的DNA序列(2016bp)

ATGTCCAGCAGCAGTTGGCTGTTGCTGAGCCTGGTGGCCGTGACCGCCGCCCAGA GCAGAGTGCAGCCAACCGAAAGCATCGTCAGATTTCCTAATATCACCAACCTGTGC CCTTTCGGCGAAGTGTTCAACGCCACCAGATTCGCCTCCGTGTACGCTTGGAACCG CAAACGGATCTCCAACTGCGTGGCCGACTACAGCGTACTGTACAATAGCGCTAGCT TCAGCACCTTCAAGTGCTACGGCGTGTCTCCTACCAAGCTGAACGACCTGTGCTTC ACCAACGTGTACGCCGACTCCTTTGTGATTAGAGGCGACGAGGTGCGGCAGATTG CTCCTGGACAGACCGGCAAGATCGCCGATTATAACTATAAGCTGCCTGACGACTTC ACCGGCTGCGTGATTGCCTGGAACAGCAACAACCTTGATAGCAAGGTGGGCGGAA ACTACAACTACCTGTACAGACTGTTCAGAAAGAGTAATCTGAAACCCTTCGAAAG AGATATCAGCACAGAGATCTACCAGGCCGGATCTACACCTTGTAACGGCGTTGAGG GCTTCAACTGCTACTTCCCTCTGCAGAGCTACGGCTTTCAGCCTACCAACGGCGTG GGATACCAGCCTTACAGGGTTGTGGTGCTGTCCTTTGAACTGCTGCACGCTCCCGC CACAGTGTGCGGCCCCAAGAAAAGCACAAATCTGGTTCAACCCACCGAGAGCATC GTGCGGTTTCCTAACATCACGAACCTGTGTCCTTTCGGCGAGGTGTTCAACGCCAC AAGATTTGCCAGCGTCTACGCCTGGAACAGAAAAAGAATCAGCAATTGCGTGGCC GACTACAGCGTGCTCTATAACAGCGCCAGCTTTAGCACCTTTAAGTGCTACGGCGTGTCTCCTACAAAGCTGAACGACCTGTGCTTCACCAATGTGTATGCCGACAGCTTCG TGATCAGGGGCGACGAAGTCAGACAAATCGCTCCTGGCCAGACTGGCAAGATCGC CGATTACAACTACAAACTGCCTGACGACTTCACCGGATGTGTGATCGCCTGGAATA GCAACAACCTGGACAGCAAGGTGGGCGGCAACTACAACTACAGATACAGACTGTT CCGGAAGTCTAATCTGAAGCCCTTCGAAAGAGATATCAGCACCGAAATCTACCAA GCCGGCAGCAAACCTTGCAACGGCGTGGAAGGCTTCAACTGCTATTTCCCTCTGC AGTCTTACGGCTTCCAGCCAACAAATGGCGTGGGCTACCAGCCCTACCGGGTGGT CGTGCTTTCCTTCGAGCTGCTGCATGCCCCTGCTACAGTGTGCGGCCCTAAGAAGT CCACAAACCTGGTGCAGCCTACAGAGAGCATCGTGCGGTTCCCAAACATCACCAA TCTGTGCCCTTTCGACGAGGTCTTTAACGCCACCCGGTTCGCCTCTGTGTACGCCT GGAATAGAAAGCGGATCTCTAACTGCGTGGCTGATTACAGCGTGCTGTACAACCTG GCCCCTTTCTTCACCTTCAAGTGCTACGGAGTCAGCCCCACCAAGCTGAATGACCT GTGTTTTACCAACGTGTACGCTGATTCTTTCGTGATCCGGGGCGATGAGGTGAGAC AGATCGCCCCCGGCCAGACAGGAAACATCGCCGACTACAATTACAAGCTGCCTGA CGATTTCACCGGCTGTGTGATCGCATGGAACAGCAACAAGCTGGACTCTAAAGTG AGCGGCAACTACAACTACCTGTATAGACTGTTTAGAAAAAGCAACCTGAAGCCCT TCGAGCGGGACATCTCTACAGAGATCTACCAGGCTGGCAACAAGCCCTGTAACGG CGTGGCTGGATTCAACTGCTACTTCCCCCTGAGAAGCTATTCTTTCCGCCCCACCTA CGGCGTGGGCCACCAGCCTTACAGAGTGGTGGTGCTGTCCTTCGAGCTGCTGCAC GCCCCTGCCACAGTGTGTGGACCAAAGAAGAGCACCAATCTGGTGAAGAACAAGCACCACCACCACCACCAC

SEQUENCE LISTING

<110> 中国科学院微生物研究所

<120> 串联式杂合三聚体新冠疫苗

<130> 1087-220158F

<160> 12

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 215

<212> PRT

<213> SARS-CoV-2原型株

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(215)

<223> SARS-CoV-2 原型株S蛋白RBD的R319-L533区域

<400> 1

Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn

1 5 10 15

Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val

20 25 30

Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser

35 40 45

Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val

50 55 60

Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp

65 70 75 80

Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln

85 90 95

Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr

100 105 110

Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly

115 120 125

Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys

130 135 140

Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr

145 150 155 160

Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser

165 170 175

Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val

180 185 190

Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly

195 200 205

Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu

210 215

<210> 2

<211> 214

<212> PRT

<213> SARS-CoV-2 Delta变异株

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(214)

<223> SARS-CoV-2 Delta变异株S蛋白RBD的V320-L533区域

<400> 2

Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu

1 5 10 15

Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr

20 25 30

Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val

35 40 45

Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser

50 55 60

Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser

65 70 75 80

Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr

85 90 95

Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly

100 105 110

Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly

115 120 125

Asn Tyr Asn Tyr Arg Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro

130 135 140

Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Lys Pro

145 150 155 160

Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr

165 170 175

Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val

180 185 190

Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro

195 200 205

Lys Lys Ser Thr Asn Leu

210

<210> 3

<211> 218

<212> PRT

<213> SARS-CoV-2 Omicron变异株

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(218)

<223> SARS-CoV-2 Omicron变异株S蛋白RBD的V317-K534区域

<400> 3

Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu

1 5 10 15

Cys Pro Phe Asp Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr

20 25 30

Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val

35 40 45

Leu Tyr Asn Leu Ala Pro Phe Phe Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser

50 55 60

Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser

65 70 75 80

Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr

85 90 95

Gly Asn Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly

100 105 110

Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Lys Leu Asp Ser Lys Val Ser Gly

115 120 125

Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro

130 135 140

Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Asn Lys Pro

145 150 155 160

Cys Asn Gly Val Ala Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Arg Ser Tyr

165 170 175

Ser Phe Arg Pro Thr Tyr Gly Val Gly His Gln Pro Tyr Arg Val Val

180 185 190

Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro

195 200 205

Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys

210 215

<210> 4

<211> 647

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 合成多肽

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(647)

<223> 本发明PDO疫苗实例的全长氨基酸序列

<400> 4

Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn

1 5 10 15

Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val

20 25 30

Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser

35 40 45

Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val

50 55 60

Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp

65 70 75 80

Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln

85 90 95

Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr

100 105 110

Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly

115 120 125

Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys

130 135 140

Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr

145 150 155 160

Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser

165 170 175

Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val

180 185 190

Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly

195 200 205

Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg

210 215 220

Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala

225 230 235 240

Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn

245 250 255

Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr

260 265 270

Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe

275 280 285

Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg

290 295 300

Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys

305 310 315 320

Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn

325 330 335

Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Arg Tyr Arg Leu Phe

340 345 350

Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile

355 360 365

Tyr Gln Ala Gly Ser Lys Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys

370 375 380

Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly

385 390 395 400

Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala

405 410 415

Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Gln Pro

420 425 430

Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe

435 440 445

Asp Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn

450 455 460

Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn

465 470 475 480

Leu Ala Pro Phe Phe Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys

485 490 495

Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Ile

500 505 510

Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Asn Ile

515 520 525

Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val Ile

530 535 540

Ala Trp Asn Ser Asn Lys Leu Asp Ser Lys Val Ser Gly Asn Tyr Asn

545 550 555 560

Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg

565 570 575

Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Asn Lys Pro Cys Asn Gly

580 585 590

Val Ala Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Arg Ser Tyr Ser Phe Arg

595 600 605

Pro Thr Tyr Gly Val Gly His Gln Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser

610 615 620

Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys Lys Ser

625 630 635 640

Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys

645

<210> 5

<211> 1941

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 合成的多核苷酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1941)

<223> 本发明PDO疫苗实例的DNA编码序列

<400> 5

agagtgcagc caaccgaaag catcgtcaga tttcctaata tcaccaacct gtgccctttc 60

ggcgaagtgt tcaacgccac cagattcgcc tccgtgtacg cttggaaccg caaacggatc 120

tccaactgcg tggccgacta cagcgtactg tacaatagcg ctagcttcag caccttcaag 180

tgctacggcg tgtctcctac caagctgaac gacctgtgct tcaccaacgt gtacgccgac 240

tcctttgtga ttagaggcga cgaggtgcgg cagattgctc ctggacagac cggcaagatc 300

gccgattata actataagct gcctgacgac ttcaccggct gcgtgattgc ctggaacagc 360

aacaaccttg atagcaaggt gggcggaaac tacaactacc tgtacagact gttcagaaag 420

agtaatctga aacccttcga aagagatatc agcacagaga tctaccaggc cggatctaca 480

ccttgtaacg gcgttgaggg cttcaactgc tacttccctc tgcagagcta cggctttcag 540

cctaccaacg gcgtgggata ccagccttac agggttgtgg tgctgtcctt tgaactgctg 600

cacgctcccg ccacagtgtg cggccccaag aaaagcacaa atctggttca acccaccgag 660

agcatcgtgc ggtttcctaa catcacgaac ctgtgtcctt tcggcgaggt gttcaacgcc 720

acaagatttg ccagcgtcta cgcctggaac agaaaaagaa tcagcaattg cgtggccgac 780

tacagcgtgc tctataacag cgccagcttt agcaccttta agtgctacgg cgtgtctcct 840

acaaagctga acgacctgtg cttcaccaat gtgtatgccg acagcttcgt gatcaggggc 900

gacgaagtca gacaaatcgc tcctggccag actggcaaga tcgccgatta caactacaaa 960

ctgcctgacg acttcaccgg atgtgtgatc gcctggaata gcaacaacct ggacagcaag 1020

gtgggcggca actacaacta cagatacaga ctgttccgga agtctaatct gaagcccttc 1080

gaaagagata tcagcaccga aatctaccaa gccggcagca aaccttgcaa cggcgtggaa 1140

ggcttcaact gctatttccc tctgcagtct tacggcttcc agccaacaaa tggcgtgggc 1200

taccagccct accgggtggt cgtgctttcc ttcgagctgc tgcatgcccc tgctacagtg 1260

tgcggcccta agaagtccac aaacctggtg cagcctacag agagcatcgt gcggttccca 1320

aacatcacca atctgtgccc tttcgacgag gtctttaacg ccacccggtt cgcctctgtg 1380

tacgcctgga atagaaagcg gatctctaac tgcgtggctg attacagcgt gctgtacaac 1440

ctggcccctt tcttcacctt caagtgctac ggagtcagcc ccaccaagct gaatgacctg 1500

tgttttacca acgtgtacgc tgattctttc gtgatccggg gcgatgaggt gagacagatc 1560

gcccccggcc agacaggaaa catcgccgac tacaattaca agctgcctga cgatttcacc 1620

ggctgtgtga tcgcatggaa cagcaacaag ctggactcta aagtgagcgg caactacaac 1680

tacctgtata gactgtttag aaaaagcaac ctgaagccct tcgagcggga catctctaca 1740

gagatctacc aggctggcaa caagccctgt aacggcgtgg ctggattcaa ctgctacttc 1800

cccctgagaa gctattcttt ccgccccacc tacggcgtgg gccaccagcc ttacagagtg 1860

gtggtgctgt ccttcgagct gctgcacgcc cctgccacag tgtgtggacc aaagaagagc 1920

accaatctgg tgaagaacaa g 1941

<210> 6

<211> 1941

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 合成的多核苷酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1941)

<223> 本发明PDO疫苗实例的mRNA编码序列

<400> 6

agagugcagc caaccgaaag caucgucaga uuuccuaaua ucaccaaccu gugcccuuuc 60

ggcgaagugu ucaacgccac cagauucgcc uccguguacg cuuggaaccg caaacggauc 120

uccaacugcg uggccgacua cagcguacug uacaauagcg cuagcuucag caccuucaag 180

ugcuacggcg ugucuccuac caagcugaac gaccugugcu ucaccaacgu guacgccgac 240

uccuuuguga uuagaggcga cgaggugcgg cagauugcuc cuggacagac cggcaagauc 300

gccgauuaua acuauaagcu gccugacgac uucaccggcu gcgugauugc cuggaacagc 360

aacaaccuug auagcaaggu gggcggaaac uacaacuacc uguacagacu guucagaaag 420

aguaaucuga aacccuucga aagagauauc agcacagaga ucuaccaggc cggaucuaca 480

ccuuguaacg gcguugaggg cuucaacugc uacuucccuc ugcagagcua cggcuuucag 540

ccuaccaacg gcgugggaua ccagccuuac aggguugugg ugcuguccuu ugaacugcug 600

cacgcucccg ccacagugug cggccccaag aaaagcacaa aucugguuca acccaccgag 660

agcaucgugc gguuuccuaa caucacgaac cuguguccuu ucggcgaggu guucaacgcc 720

acaagauuug ccagcgucua cgccuggaac agaaaaagaa ucagcaauug cguggccgac 780

uacagcgugc ucuauaacag cgccagcuuu agcaccuuua agugcuacgg cgugucuccu 840

acaaagcuga acgaccugug cuucaccaau guguaugccg acagcuucgu gaucaggggc 900

gacgaaguca gacaaaucgc uccuggccag acuggcaaga ucgccgauua caacuacaaa 960

cugccugacg acuucaccgg augugugauc gccuggaaua gcaacaaccu ggacagcaag 1020

gugggcggca acuacaacua cagauacaga cuguuccgga agucuaaucu gaagcccuuc 1080

gaaagagaua ucagcaccga aaucuaccaa gccggcagca aaccuugcaa cggcguggaa 1140

ggcuucaacu gcuauuuccc ucugcagucu uacggcuucc agccaacaaa uggcgugggc 1200

uaccagcccu accggguggu cgugcuuucc uucgagcugc ugcaugcccc ugcuacagug 1260

ugcggcccua agaaguccac aaaccuggug cagccuacag agagcaucgu gcgguuccca 1320

aacaucacca aucugugccc uuucgacgag gucuuuaacg ccacccgguu cgccucugug 1380

uacgccugga auagaaagcg gaucucuaac ugcguggcug auuacagcgu gcuguacaac 1440

cuggccccuu ucuucaccuu caagugcuac ggagucagcc ccaccaagcu gaaugaccug 1500

uguuuuacca acguguacgc ugauucuuuc gugauccggg gcgaugaggu gagacagauc 1560

gcccccggcc agacaggaaa caucgccgac uacaauuaca agcugccuga cgauuucacc 1620

ggcuguguga ucgcauggaa cagcaacaag cuggacucua aagugagcgg caacuacaac 1680

uaccuguaua gacuguuuag aaaaagcaac cugaagcccu ucgagcggga caucucuaca 1740

gagaucuacc aggcuggcaa caagcccugu aacggcgugg cuggauucaa cugcuacuuc 1800

ccccugagaa gcuauucuuu ccgccccacc uacggcgugg gccaccagcc uuacagagug 1860

guggugcugu ccuucgagcu gcugcacgcc ccugccacag uguguggacc aaagaagagc 1920

accaaucugg ugaagaacaa g 1941

<210> 7

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 合成多肽

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(17)

<223> 信号肽序列

<400> 7

Met Ile His Ser Val Phe Leu Leu Met Phe Leu Leu Thr Pro Thr Glu

1 5 10 15

Ser

<210> 8

<211> 680

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 合成多肽

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(680)

<223> 原型株RBD三聚体PPP的构建体

<400> 8

Met Ile His Ser Val Phe Leu Leu Met Phe Leu Leu Thr Pro Thr Glu

1 5 10 15

Ser Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr

20 25 30

Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser

35 40 45

Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr

50 55 60

Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly

65 70 75 80

Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala

85 90 95

Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly

100 105 110

Gln Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe

115 120 125

Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val

130 135 140

Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu

145 150 155 160

Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser

165 170 175

Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln

180 185 190

Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg

195 200 205

Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys

210 215 220

Gly Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Arg Val Gln Pro

225 230 235 240

Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe

245 250 255

Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn

260 265 270

Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn

275 280 285

Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys

290 295 300

Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Ile

305 310 315 320

Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Lys Ile

325 330 335

Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val Ile

340 345 350

Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn

355 360 365

Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg

370 375 380

Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly

385 390 395 400

Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln

405 410 415

Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser

420 425 430

Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys Lys Ser

435 440 445

Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val

450 455 460

Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn

465 470 475 480

Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser

485 490 495

Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser

500 505 510

Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys

515 520 525

Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val

530 535 540

Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr

545 550 555 560

Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn

565 570 575

Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu

580 585 590

Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu

595 600 605

Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn

610 615 620

Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val

625 630 635 640

Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His

645 650 655

Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys

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Asn Lys His His His His His His

675 680

<210> 9

<211> 19

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 合成多肽

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(19)

<223> 信号肽序列

<400> 9

Met Ser Ser Ser Ser Trp Leu Leu Leu Ser Leu Val Ala Val Thr Ala

1 5 10 15

Ala Gln Ser

<210> 10

<211> 672

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 合成多肽

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(672)

<223> 原型株-Delta-Omicron嵌合RBD三聚体PDO的构建体

<400> 10

Met Ser Ser Ser Ser Trp Leu Leu Leu Ser Leu Val Ala Val Thr Ala

1 5 10 15

Ala Gln Ser Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn

20 25 30

Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe

35 40 45

Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala

50 55 60

Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys

65 70 75 80

Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val

85 90 95

Tyr Ala Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala

100 105 110

Pro Gly Gln Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp

115 120 125

Asp Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser

130 135 140

Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser

145 150 155 160

Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala

165 170 175

Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro

180 185 190

Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro

195 200 205

Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr

210 215 220

Val Cys Gly Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Gln Pro Thr Glu Ser

225 230 235 240

Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val

245 250 255

Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg

260 265 270

Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser

275 280 285

Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp

290 295 300

Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp

305 310 315 320

Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr

325 330 335

Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn

340 345 350

Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Arg Tyr

355 360 365

Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser

370 375 380

Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Lys Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly

385 390 395 400

Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn

405 410 415

Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu

420 425 430

Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu

435 440 445

Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu

450 455 460

Cys Pro Phe Asp Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr

465 470 475 480

Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val

485 490 495

Leu Tyr Asn Leu Ala Pro Phe Phe Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser

500 505 510

Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser

515 520 525

Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr

530 535 540

Gly Asn Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly

545 550 555 560

Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Lys Leu Asp Ser Lys Val Ser Gly

565 570 575

Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro

580 585 590

Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Asn Lys Pro

595 600 605

Cys Asn Gly Val Ala Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Arg Ser Tyr

610 615 620

Ser Phe Arg Pro Thr Tyr Gly Val Gly His Gln Pro Tyr Arg Val Val

625 630 635 640

Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro

645 650 655

Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys His His His His His His

660 665 670

<210> 11

<211> 2040

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 合成的多核苷酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(2040)

<223> 编码原型株RBD三聚体PPP的构建体的DNA序列

<400> 11

atgatccaca gcgtgtttct actgatgttc ctgcttaccc caaccgaaag ccgtgttcag 60

ccaaccgagt cgatcgtaag gttccctaac attaccaact tatgcccctt cggtgaggtt 120

ttcaacgcca cgagattcgc atccgtgtat gcctggaatc gtaagcgtat ctcaaactgc 180

gttgcggact actccgtgct ctacaatagt gccagcttta gcaccttcaa atgctacggt 240

gtcagcccca cgaagctgaa cgatttatgt tttacaaatg tctatgccga tagctttgtt 300

attcgcggcg atgaggttag acaaatagcg ccaggacaaa ctggaaagat agccgactac 360

aattacaaac ttcccgatga ctttacgggt tgcgtcatag cctggaacag caataacttg 420

gactccaagg ttgggggaaa ttacaattat ctctaccggc tattcagaaa gtcaaatctg 480

aagccgtttg agagagacat cagtacagaa atataccagg ccggtagcac tccatgtaac 540

ggggtggaag ggttcaattg ttacttcccc ctccagagtt atggtttcca acccacgaac 600

ggagtgggct accaacctta cagagtagta gtactgagct tcgagttatt gcatgctccg 660

gcgacagtct gtggcccaaa gaagagcaca aacctggtaa agaacaaaag agttcaaccc 720

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aatgccacca gatttgcctc tgtgtacgca tggaatcgca aaagaatcag caattgtgtg 840

gccgactata gcgtcctgta taacagcgcc tctttctcaa ccttcaagtg ttacggggta 900

agccccacta agctcaacga tctatgcttc accaatgtct acgccgattc ttttgtgatc 960

cgcggcgatg aagttagaca gatcgcccct gggcaaaccg gaaagatcgc cgactataac 1020

tacaaactgc cggacgactt cactggctgc gttatcgcct ggaactcgaa caatcttgac 1080

agcaaggtgg gaggcaacta caattatctg tatcggctgt tcaggaaatc taacctcaag 1140

cccttcgaaa gagatatctc taccgaaatc tatcaagcgg gtagcacgcc gtgcaatggc 1200

gtcgagggtt ttaactgcta ttttcccctg cagagctacg ggtttcaacc cactaatggt 1260

gtgggatatc agccctaccg cgttgtggtg ttgagcttcg aactgctgca cgcgccagcg 1320

acagtatgcg gtcccaagaa gtccacgaat ttggttaaaa acaagagagt acagcccaca 1380

gagagcatag tgcggttccc caacattacg aacctgtgtc cgttcggcga ggtgttcaac 1440

gccactagat ttgcaagtgt atatgcttgg aaccgcaaga gaatctcgaa ctgcgttgct 1500

gactacagcg tactctataa ctcggcctca ttttcgacat tcaagtgcta cggcgtgagc 1560

cccaccaagc tgaacgacct gtgtttcacc aacgtctacg ctgactcgtt tgtgattaga 1620

ggcgatgaag tgcggcagat cgcacccggg caaacaggca aaatcgcaga ctacaactac 1680

aagttgccag acgacttcac gggctgcgtg atcgcttgga actctaacaa cctggattca 1740

aaggtggggg gcaactataa ttacctgtac cgactgttcc gtaagagcaa cttgaagccc 1800

tttgagaggg acattagcac cgaaatctac caggccggca gcacaccctg taatggcgtc 1860

gaaggtttca attgctactt tcctctccaa agctacggct ttcagcccac caacggggtg 1920

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<210> 12

<211> 2016

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 合成的多核苷酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(2016)

<223> 编码原型株-Delta-Omicron嵌合RBD三聚体PDO的构建体的DNA序列

<400> 12

atgtccagca gcagttggct gttgctgagc ctggtggccg tgaccgccgc ccagagcaga 60

gtgcagccaa ccgaaagcat cgtcagattt cctaatatca ccaacctgtg ccctttcggc 120

gaagtgttca acgccaccag attcgcctcc gtgtacgctt ggaaccgcaa acggatctcc 180

aactgcgtgg ccgactacag cgtactgtac aatagcgcta gcttcagcac cttcaagtgc 240

tacggcgtgt ctcctaccaa gctgaacgac ctgtgcttca ccaacgtgta cgccgactcc 300

tttgtgatta gaggcgacga ggtgcggcag attgctcctg gacagaccgg caagatcgcc 360

gattataact ataagctgcc tgacgacttc accggctgcg tgattgcctg gaacagcaac 420

aaccttgata gcaaggtggg cggaaactac aactacctgt acagactgtt cagaaagagt 480

aatctgaaac ccttcgaaag agatatcagc acagagatct accaggccgg atctacacct 540

tgtaacggcg ttgagggctt caactgctac ttccctctgc agagctacgg ctttcagcct 600

accaacggcg tgggatacca gccttacagg gttgtggtgc tgtcctttga actgctgcac 660

gctcccgcca cagtgtgcgg ccccaagaaa agcacaaatc tggttcaacc caccgagagc 720

atcgtgcggt ttcctaacat cacgaacctg tgtcctttcg gcgaggtgtt caacgccaca 780

agatttgcca gcgtctacgc ctggaacaga aaaagaatca gcaattgcgt ggccgactac 840

agcgtgctct ataacagcgc cagctttagc acctttaagt gctacggcgt gtctcctaca 900

aagctgaacg acctgtgctt caccaatgtg tatgccgaca gcttcgtgat caggggcgac 960

gaagtcagac aaatcgctcc tggccagact ggcaagatcg ccgattacaa ctacaaactg 1020

cctgacgact tcaccggatg tgtgatcgcc tggaatagca acaacctgga cagcaaggtg 1080

ggcggcaact acaactacag atacagactg ttccggaagt ctaatctgaa gcccttcgaa 1140

agagatatca gcaccgaaat ctaccaagcc ggcagcaaac cttgcaacgg cgtggaaggc 1200

ttcaactgct atttccctct gcagtcttac ggcttccagc caacaaatgg cgtgggctac 1260

cagccctacc gggtggtcgt gctttccttc gagctgctgc atgcccctgc tacagtgtgc 1320

ggccctaaga agtccacaaa cctggtgcag cctacagaga gcatcgtgcg gttcccaaac 1380

atcaccaatc tgtgcccttt cgacgaggtc tttaacgcca cccggttcgc ctctgtgtac 1440

gcctggaata gaaagcggat ctctaactgc gtggctgatt acagcgtgct gtacaacctg 1500

gcccctttct tcaccttcaa gtgctacgga gtcagcccca ccaagctgaa tgacctgtgt 1560

tttaccaacg tgtacgctga ttctttcgtg atccggggcg atgaggtgag acagatcgcc 1620

cccggccaga caggaaacat cgccgactac aattacaagc tgcctgacga tttcaccggc 1680

tgtgtgatcg catggaacag caacaagctg gactctaaag tgagcggcaa ctacaactac 1740

ctgtatagac tgtttagaaa aagcaacctg aagcccttcg agcgggacat ctctacagag 1800

atctaccagg ctggcaacaa gccctgtaac ggcgtggctg gattcaactg ctacttcccc 1860

ctgagaagct attctttccg ccccacctac ggcgtgggcc accagcctta cagagtggtg 1920

gtgctgtcct tcgagctgct gcacgcccct gccacagtgt gtggaccaaa gaagagcacc 1980

aatctggtga agaacaagca ccaccaccac caccac 2016

Claims

1.一种新型冠状病毒原型株、Delta和Omicron变异株的重组嵌合抗原，其特征在于：所述重组嵌合抗原的氨基酸序列包括：按照(A-B)-C1-(A-B’)-C2-(A-B”)样式排列的氨基酸序列，其中：

2.根据权利要求1所述的重组嵌合抗原，其特征在于：所述新型冠状病毒原型株S蛋白RBD结构域的一部分为其全部氨基酸序列的至少70％、80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％；

和/或，n＝0,1,2或3。

3.根据权利要求1或2所述的重组嵌合抗原，其特征在于：所述新型冠状病毒原型株S蛋白RBD结构域或其一部分的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，或者如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸获得的、与其具有相同或基本相同的免疫原性的氨基酸序列；

和/或，所述新型冠状病毒Delta变异株S蛋白RBD结构域或其一部分的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，或者如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸获得的、与其具有相同或基本相同的免疫原性的氨基酸序列；

和/或，n＝0,1或2。

4.根据权利要求1-3任一项所述的重组嵌合抗原，其特征在于：A-B表示如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，A-B’表示如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，A-B”表示如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；

优选地，所述重组嵌合抗原包括如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。

5.一种如权利要求1-4任一项所述重组嵌合抗原的制备方法，其包括以下步骤：在编码如权利要求1-4任一项所述重组嵌合抗原的核苷酸序列的5’端加上Kozak序列以及编码信号肽的序列，3’端加上组氨酸标签和终止密码子，进行克隆表达，筛选正确的重组子，然后将其转染表达系统细胞进行表达，收集细胞培养上清，从中分离获得所述重组抗原。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：所述表达系统细胞为哺乳动物细胞、昆虫细胞、酵母细胞或细菌细胞；

可选地，所述细菌细胞为大肠杆菌细胞。

7.一种多核苷酸，其编码如权利要求1-4任一项所述的重组嵌合抗原。

8.根据权利要求7所述的多核苷酸，其特征在于：所述多核苷酸为DNA或mRNA；

优选地，所述多核苷酸为如SEQ ID NO:5所示的DNA序列；

优选地，所述多核苷酸为如SEQ ID NO:6所示的mRNA序列。

9.一种核酸构建体，其包含如权利要求7或8所述的多核苷酸，以及任选地，与所述多核苷酸可操作地连接的至少一个表达调控元件。

10.一种表达载体，其包含如权利要求9所述的核酸构建体。

11.一种宿主细胞，其中转化或转染有如权利要求7或8所述的多核苷酸、如权利要求9所述的核酸构建体或如权利要求10所述的表达载体。

12.如权利要求1-4任一项所述的重组嵌合抗原、如权利要求7或8所述的多核苷酸、如权利要求9所述的核酸构建体、如权利要求10所述的表达载体或如权利要求11所述的宿主细胞在制备用于预防和/或治疗新型冠状病毒感染的疫苗中的应用。

13.一种疫苗或免疫原性组合物，其包含如权利要求1-4任一项所述的重组嵌合抗原、如权利要求7或8所述的多核苷酸、如权利要求9所述的核酸构建体、如权利要求10所述的表达载体或如权利要求11所述的宿主细胞，以及生理学可接受的媒介物、佐剂、赋形剂、载体和/或稀释剂。

14.根据权利要求13所述的疫苗或免疫原性组合物，其为新型冠状病毒重组蛋白疫苗，其包括如权利要求1-4任一项所述的重组嵌合抗原和佐剂；

15.根据权利要求13所述的疫苗或免疫原性组合物，其为新型冠状病毒DNA疫苗，所述DNA疫苗包括：

(1)真核表达载体；和

(2)构建入所述真核表达载体中的、编码如权利要求1-4任一项所述的重组嵌合抗原的DNA序列；

16.根据权利要求13所述的疫苗或免疫原性组合物，其为新型冠状病毒mRNA疫苗，所述mRNA疫苗包括：

(I)编码如权利要求1-4任一项所述的重组嵌合抗原的mRNA序列；和

(II)脂质纳米颗粒。

17.根据权利要求13所述的疫苗或免疫原性组合物，其为新型冠状病毒-病毒载体疫苗，其包括：

(1)病毒骨架载体；和

(2)构建入所述病毒骨架载体中的、编码如权利要求1-4任一项所述的重组嵌合抗原的DNA序列；

18.根据权利要求13-17任一项所述的疫苗或免疫原性组合物，其特征在于，所述疫苗或免疫原性组合物为鼻喷剂、口服制剂、栓剂或胃肠外制剂的形式；

优选地，所述鼻喷剂选自气雾剂、喷雾剂和粉雾剂；