CN117050193A - 一种β冠状病毒重组嵌合抗原、其制备方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种β冠状病毒重组嵌合抗原、其制备方法和应用。所述β冠状病毒重组嵌合抗原是由SARS‑CoV‑2Omicron变异株BA.1亚型或BA.2亚型的S蛋白RBD片段与SARS‑CoV的S蛋白RBD片段串联而成的嵌合二聚体抗原，其不仅能激发机体产生针对SARS‑CoV‑2原型株及各型变异株、针对SARS‑CoV的高水平中和抗体，还能激发机体产生针对其它SARS相关冠状病毒的高水平中和抗体，因而有望成为针对β属冠状病毒的广谱疫苗的免疫原，具有极大的临床应用前景和产业价值。

Description

一种β冠状病毒重组嵌合抗原、其制备方法及应用
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种β冠状病毒重组嵌合抗原、其相关产品、制备方法和应用。
背景技术
冠状病毒属于冠状病毒科，冠状病毒科被分为四个冠状病毒属：Alpha冠状病毒、Beta冠状病毒、Gamma冠状病毒和Delta冠状病毒，其中Alpha-和Beta-冠状病毒属的冠状病毒主要感染哺乳动物。SARS-CoV和SARS-CoV-2同属Beta冠状病毒属、Sarbecovirus亚属，它们都是具有囊膜的正链RNA病毒；此外，动物源性SARS相关冠状病毒RaTG13、LYRa11、Pangolin GX、Pangolin GD、WIV1也属于Sarbecovirus亚属；这些病毒能够广泛感染人和动物，具有高致命性，因此，开发相应疫苗有着重要意义。
表面刺突蛋白(S蛋白)是冠状病毒的主要中和抗原。SARS-CoV、SARS-CoV-2的S蛋白的受体结合区(Receptor Binding Domain,RBD)被认为是诱导机体产生中和抗体的最主要的抗原靶区域。RBD作为疫苗能够将机体刺激产生的中和抗体更加聚焦在针对病毒的受体结合，可以提高疫苗的免疫原性和免疫效率。目前认为，SARS-CoV和SARS-CoV-2等Sarbecovirus亚属冠状病毒可能通过其RBD与宿主细胞受体ACE2结合而进入细胞。
公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
发明内容
发明目的
本发明的目的在于提供一种广谱且免疫原性好的β冠状病毒重组嵌合抗原、其相关疫苗产品及其制备方法和应用。
解决方案
为实现本发明目的，本发明提供了以下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种β冠状病毒重组嵌合抗原，所述β冠状病毒重组嵌合抗原的氨基酸序列按照从N端到C端的顺序包括：按照(A-B)-C-(A’-B’)样式排列的氨基酸序列，其中：
A-B表示新型冠状病毒Omicron变异株BA.1亚型或BA.2亚型S蛋白RBD结构域或其一部分的氨基酸序列，或与其具有至少90％，92％，95％，96％，97％，98％或99％同一性且与其具有相同或基本相同的免疫原性的氨基酸序列，
A’-B’表示严重呼吸综合征冠状病毒S蛋白RBD结构域或其一部分的氨基酸序列，或与其具有至少90％，92％，95％，96％，97％，98％或99％同一性且与其具有相同或基本相同的免疫原性的氨基酸序列，并且，
C表示连接子(GGS)n，其中，n为0～10之间的整数。
对于上述β冠状病毒重组嵌合抗原：
作为优选，A-B表示选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:2，或与其具有至少90％，92％，95％，96％，97％，98％或99％同一性且与其具有相同或基本相同的免疫原性的氨基酸序列；
作为优选，A’-B’表示如SEQ ID NO:4的氨基酸序列，或与其具有至少90％，92％，95％，96％，97％，98％或99％同一性且与其具有相同或基本相同的免疫原性的氨基酸序列；
作为优选，所述连接子(GGS)n中，n为0～5之间的整数，更优选为0。
进一步优选地，A-B表示如SEQ ID NO:1或如SEQ ID NO:2的氨基酸序列；和/或，A’-B’表示如SEQ ID NO:4的氨基酸序列；
更进一步优选地，所述β冠状病毒重组嵌合抗原具有选自以下的氨基酸序列：SEQID NO:5，SEQ ID NO:6。
在可行的优选实施方案中，所述β冠状病毒重组嵌合抗原的N端还包括信号肽；优选地，所述信号肽具有如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列；
在可行的优选实施方案中，所述β冠状病毒重组嵌合抗原的C端还包括组氨酸标签。
第二方面，本发明提供了如上述第一方面所述的β冠状病毒重组嵌合抗原的制备方法，其包括以下步骤：
在编码如上述第一方面所述的β冠状病毒重组嵌合抗原的核苷酸序列的5’端加入编码信号肽的序列，3’端加上编码组氨酸标签的序列，进行克隆表达，筛选正确的重组子，然后转染表达系统的细胞进行表达，表达后收集细胞上清，纯化得到β冠状病毒重组嵌合抗原。
对于上述制备方法，作为优选，所述表达系统细胞为哺乳动物细胞、昆虫细胞、酵母细胞或细菌细胞；
可选地，所述哺乳动物细胞为HEK293T细胞、293F系列细胞或CHO细胞；进一步可选地，所述293F系列细胞为HEK293F细胞、Freestyle293F细胞或Expi293F细胞；
可选地，所述昆虫细胞为sf9细胞、Hi5细胞、sf21细胞或S2细胞；
可选地，所述酵母细胞为毕赤酵母细胞或者由其改造的酵母细胞；
可选地，所述细菌细胞为大肠杆菌细胞。
第三方面，本发明提供了一种多核苷酸，其编码如上述第一方面所述的β冠状病毒重组嵌合抗原。
在具体实施方案中，所述多核苷酸为DNA或mRNA；
优选地，所述多核苷酸为如SEQ ID NO:9或10所示的DNA序列；
优选地，所述多核苷酸为如SEQ ID NO:11或12所示的mRNA序列。
第四方面，本发明提供了一种核酸构建体，其包含如上述第三方面所述的多核苷酸，以及任选地，与所述多核苷酸可操作地连接的至少一个表达调控元件。
第五方面，本发明提供了一种表达载体，其包含如上述第四方面所述的核酸构建体。
第六方面，本发明提供了一种宿主细胞，其中转化或转染有如上述第三方面所述的多核苷酸、如上述第四方面所述的核酸构建体或如上述第五方面所述的表达载体。
第七方面，本发明提供了如上述第一方面所述的β冠状病毒重组嵌合抗原、如上述第三方面所述的多核苷酸、如上述第四方面所述的核酸构建体、如上述第五方面所述的表达载体或如上述第六方面所述的宿主细胞在制备用于预防和/或治疗β冠状病毒感染的药物中的应用。
可选地，所述药物为疫苗；
可选地，所述β冠状病毒为Sarbecovirus亚属β冠状病毒，优选选自：新型冠状病毒，严重呼吸综合征冠状病毒和其它SARS相关冠状病毒；
进一步优选地，所述新型冠状病毒包括：SARS-CoV-2原型株，SARS-CoV-2变异毒株Alpha(B.1.1.7)，Beta(B.1.351)，Gamma(P.1)，Kappa(B.1.617.1)，Delta(B.1.617.2)，Omicron亚型BA.1、BA.2、BA.2.75、BA.4/BA.5、BA.2.3.20、BQ.1.1、XBB、BF.7；
进一步优选地，所述其它SARS相关冠状病毒包括RaTG13、LYRa11、Pangolin GX、Pangolin GD、WIV1，优选为LYRa11或WIV1。
第八方面，本申请提供了一种疫苗或免疫原性组合物，其包含如上述第一方面所述的β冠状病毒重组嵌合抗原、如上述第三方面所述的多核苷酸、如上述第四方面所述的核酸构建体、如上述第五方面所述的表达载体或如上述第六方面所述的宿主细胞，以及生理学可接受的媒介物、佐剂、赋形剂、载体和/或稀释剂。
在一个优选的具体实施方案中，所述疫苗或免疫原性组合物为β冠状病毒重组蛋白疫苗，其包括如上述第一方面所述的β冠状病毒重组嵌合抗原和佐剂；
可选地，所述佐剂为选自以下佐剂中的一种或多种：铝佐剂、MF59佐剂和类MF59佐剂。
在另一个优选的具体实施方案中，所述疫苗或免疫原性组合物为β冠状病毒DNA疫苗，其包括：
(1)真核表达载体；和
(2)构建入所述真核表达载体中的、编码如上述第一方面所述的β冠状病毒重组嵌合抗原的DNA序列；
可选地，所述真核表达载体选自pGX0001、pVAX1、pCAGGS和pcDNA系列载体。
在另一个优选的具体实施方案中，所述疫苗或免疫原性组合物为β冠状病毒mRNA疫苗，所述mRNA疫苗包括：
(I)编码如上述第一方面所述的β冠状病毒重组嵌合抗原的mRNA序列；和
(II)脂质纳米颗粒。
在另一个优选的具体实施方案中，所述疫苗或免疫原性组合物为β冠状病毒-病毒载体疫苗，其包括：
(1)病毒骨架载体；和
(2)构建入所述病毒骨架载体中的、编码如上述第一方面所述的β冠状病毒重组嵌合抗原的DNA序列；
可选地，所述病毒骨架载体选自以下病毒载体中的一种或几种：腺病毒载体、痘病毒载体、流感病毒载体、腺相关病毒载体。
在可行的实现方式中，所述疫苗或免疫原性组合物为鼻喷剂、口服制剂、栓剂或胃肠外制剂的形式；
优选地，所述鼻喷剂选自气雾剂、喷雾剂和粉雾剂；
优选地，所述口服制剂选自片剂、粉末剂、丸剂、散剂、颗粒剂、细粒剂、软/硬胶囊剂、薄膜包衣剂、小丸剂、舌下片和膏剂；
优选地，所述胃肠外制剂为经皮剂、软膏剂、硬膏剂、外用液剂、可注射或可推注制剂。
第九方面，本申请提供了一种试剂盒，其包括如上述第一方面所述的β冠状病毒重组嵌合抗原、如上述第三方面所述的多核苷酸、如上述第四方面所述的核酸构建体、如上述第五方面所述的表达载体、如上述第六方面所述的宿主细胞和/或如上述第八方面所述的疫苗或免疫原性组合物，以及任选地其他类型的β冠状病毒疫苗。
第十方面，本申请提供了一种预防和/或治疗β冠状病毒感染性疾病的方法，所述方法包括：
向有需要的受试者施用预防和/或治疗有效量的以下物质：如上述第一方面所述的β冠状病毒重组嵌合抗原、如上述第三方面所述的多核苷酸、如上述第四方面所述的核酸构建体、如上述第五方面所述的表达载体、如上述第六方面所述的宿主细胞和/或如上述第八方面所述的疫苗或免疫原性组合物。
所述“预防和/或治疗有效量”可根据给药对象、对象脏器、症状、给药方法等不同而存在差异，可以考虑剂型的种类、给药方法、患者的年龄和体重、患者的症状等，根据医生的判断来确定。
有益效果
本发明的β冠状病毒重组嵌合抗原是由SARS-CoV-2Omicron变异株BA.1亚型或BA.2亚型的S蛋白RBD片段与SARS-CoV的S蛋白RBD片段串联而成的嵌合二聚体抗原；当用其免疫小鼠时，不仅能激发机体产生针对SARS-CoV-2原型株及各变异株的高水平中和抗体、针对SARS-CoV的高水平中和抗体，还能激发机体产生针对其它SARS相关冠状病毒(包括RaTG13、LYRa11、Pangolin GX、Pangolin GD、WIV1等)的高水平中和抗体；特别是，其所诱导的针对SARS-CoV和其它SARS相关冠状病毒(特别是LYRa11和WIV1)的中和抗体水平明显高于SARS-CoV-2原型株与SARS-CoV的嵌合RBD二聚体抗原，实现了预料不到的技术效果，有望成为针对β属冠状病毒的广谱疫苗的免疫原。
附图说明
一个或多个实施例通过与之对应的附图中的图片进行示例性说明，这些示例性说明并不构成对实施例的限定。在这里专用的词“示例性”意为“用作例子、实施例或说明性”。这里作为“示例性”所说明的任何实施例不必解释为优于或好于其它实施例。
图1是由293F细胞所表达的五种重组蛋白(BA.1-S、BA.2-S、CS、CC、SS)的分子筛层析曲线及其洗脱峰处的洗脱液的SDS-PAGE鉴定结果图。
图2显示通过假病毒中和实验检测的五种二聚体免疫原(BA.1-S、BA.2-S、CS、CC、SS)和对照组(PBS)在三次免疫小鼠后其血清中针对新冠病毒原始毒株(Prototype)和一系列变异株(Delta，BA.1，BA.2，BA.2.75，BA.4/BA.5，BA.2.3.20，BQ.1.1，XBB，BF.7)的中和抗体水平；其中，横坐标显示的是组别(分组情况见表1)，纵坐标显示的是中和抗体滴度(pVNT50)。
图3是根据图2结果所制作的雷达图。
图4显示通过假病毒中和实验检测的五种二聚体免疫原(BA.1-S、BA.2-S、CS、CC、SS)和对照组(PBS)在三次免疫小鼠后其血清中针对SARS-CoV的中和抗体水平；其中，横坐标显示的是组别(分组情况见表1)，纵坐标显示的是中和抗体滴度(pVNT50)。
图5显示通过假病毒中和实验检测的五种二聚体免疫原(BA.1-S、BA.2-S、CS、CC、SS)和对照组(PBS)在三次免疫小鼠后其血清中针对SARS相关冠状病毒LYRa11和WIV1的中和抗体水平；其中，横坐标显示的是组别(分组情况见表1)，纵坐标显示的是中和抗体滴度(pVNT50)。
图6显示通过酶联免疫吸附试验(ELISA)检测的五种二聚体免疫原(BA.1-S、BA.2-S、CS、CC、SS)和对照组(PBS)在三次免疫小鼠后其血清中针对SARS相关冠状病毒RmYN02的的特异性结合抗体滴度结果；其中，横坐标显示的是组别(分组情况见表1)，纵坐标显示的是结合抗体滴度。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
另外，为了更好的说明本发明，在下文的具体实施方式中给出了众多的具体细节。本领域技术人员应当理解，没有某些具体细节，本发明同样可以实施。在一些实施例中，对于本领域技术人员熟知的原料、元件、方法、手段等未作详细描述，以便于凸显本发明的主旨。
除非另有其它明确表示，否则在整个说明书和权利要求书中，术语“包括”或其变换如“包含”或“包括有”等等将被理解为包括所陈述的元件或组成部分，而并未排除其它元件或其它组成部分。
实施例1：本发明二聚体抗原BA.1-SARS、BA.2-SARS和对照二聚体抗原PT-SARS、PT-PT、SARS-SARS的设计
本实施例中，分别设计了作为本发明代表的二聚体抗原构建体BA.1-SARS(简称BA.1-S)、BA.2-SARS(简称BA.2-S)，和作为对照的二聚体抗原构建体PT-SARS(简称CS)、PT-PT(简称CC)、SARS-SARS(简称SS)，具体方案如下：
(1)二聚体抗原BA.1-S
将SARS-CoV-2Omicron变异株BA.1亚型RBD结构域R319-K537区段的序列(SEQ IDNO:1)与SARS-CoV RBD结构域R306-Q523区段的序列(SEQ ID NO:4)直接串联起来，在其N端连接信号肽(MIHSVFLLMFLLTPTES，SEQ ID NO.7)，在其C端加上6个组氨酸(HHHHHH)，得到二聚体抗原BA.1-S的构建体，其氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示；
(2)二聚体抗原BA.2-S
将SARS-CoV-2Omicron变异株BA.2亚型RBD结构域R319-K537区段的序列(SEQ IDNO:2)与SARS-CoV RBD结构域R306-Q523区段的序列(SEQ ID NO:4)直接串联起来，在其N端连接信号肽(MIHSVFLLMFLLTPTES，SEQ ID NO.7)，在其C端加上6个组氨酸(HHHHHH)，得到二聚体抗原BA.2-S的构建体，其氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示；
(3)二聚体抗原CS
将SARS-CoV-2原型株RBD结构域R319-K537区段的序列(SEQ ID NO:3)与SARS-CoVRBD结构域R306-Q523区段的序列(SEQ ID NO:4)直接串联起来，在其N端连接信号肽(MIHSVFLLMFLLTPTES，SEQ ID NO.7)，在其C端加上6个组氨酸(HHHHHH)，得到二聚体抗原CS的构建体，其氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示；
(4)二聚体抗原CC
将两段SARS-CoV-2原型株RBD结构域R319-K537区段的序列(SEQ ID NO:3)直接串联起来，在其N端连接信号肽(MIHSVFLLMFLLTPTES，SEQ ID NO.7)，在其C端加上6个组氨酸(HHHHHH)，得到二聚体抗原CC的构建体，其氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示；
(5)二聚体抗原SS
将两段SARS-CoV RBD结构域R306-Q523区段的序列(SEQ ID NO:4)直接串联起来，在其N端连接信号肽(MFIFLLFLTLTSG，SEQ ID NO.8)，在其C端加上6个组氨酸(HHHHHH)，得到二聚体抗原SS的构建体，其氨基酸序列如SEQ ID NO:17所示。
实施例2：BA.1-S、BA.2-S、CS、CC、SS二聚体抗原蛋白的表达与纯化
表达质粒的构建：
上述实施例1中所设计的五种构建体的氨基酸序列使用人源密码子优化，对应的DNA编码序列分别如SEQ ID NO:18、19、20、21、22所示；在这些DNA编码序列的3’端加上终止密码子，在其5’端上游加上Kozak序列gccacc，所得DNA序列由安升达公司合成；所合成的五个DNA序列通过EcoRI和Xhol双酶切克隆到pCAGGS质粒(商购获得)，分别获得表达上述五种二聚体抗原蛋白的表达质粒pCAGGS-BA.1-S、pCAGGS-BA.2-S、pCAGGS-CS、pCAGGS-CC、pCAGGS-SS。
蛋白表达与纯化：
1)将上述构建的表达质粒pCAGGS-BA.1-S、pCAGGS-BA.2-S、pCAGGS-CS、pCAGGS-CC、pCAGGS-SS分别转染293F细胞，5天后收集上清，离心去除沉淀，再通过0.22μm的滤膜过滤，进一步除去杂质。
2)将所得细胞上清，通过镍亲和柱层析进行纯化；
镍亲和柱层析的条件及程序如下：采用HisTrap excel(cytiva)层析柱，柱体积CV为5ml，流速为1～2ml/min；预处理：先用双蒸水冲洗5-10个CV：平衡：用Binding缓冲液(1×PBS缓冲液，pH7.4)冲洗5～10个CV；上样：取0.22μm滤膜过滤后的293F悬浮细胞培养物上样至平衡好的层析柱；洗杂：上样完成后，先用Binding缓冲液淋洗至少4个CV至UV基线走平，随后用不同浓度洗脱缓冲液(1×PBS+1M imidazole,pH7.4)洗脱，洗脱至UV基线平，分管收集各洗脱组分，并将其分别进行镍亲和柱层析，根据SDS-PAGE凝胶电泳图的分析结果，合并收集管内目的蛋白进行浓缩，进行下一步的凝胶过滤层析。
3)将上述浓缩后的蛋白，通过凝胶过滤层析(即，分子筛层析)进一步纯化；
凝胶过滤层析的条件及程序如下：
采用SuperdexTM 200Increase 10/300GL(cytiva)凝胶过滤层析柱，柱体积CV为24ml，流速为0.4ml/min；预处理：用双蒸水冲洗1个CV；平衡：用Binding缓冲液(1×PBS缓冲液，pH7.4)平衡1个CV；上样：将浓缩后的蛋白通过loop环上样至凝胶柱中；收集：对目标蛋白进行收集，可将目的蛋白合并浓缩，获得二聚体抗原蛋白BA.1-S、BA.2-S、CC和SS。
采用HiLoadTM 16/600SuperdexTM 200pg(cytiva)凝胶过滤层析柱，柱体积CV为120ml，流速为1.0ml/min；预处理：用双蒸水冲洗1个CV；平衡：用Binding缓冲液(1×PBS缓冲液，pH7.4)平衡1个CV；上样：将浓缩后的蛋白通过loop环上样至凝胶柱中；收集：对目标蛋白进行收集，可将目的蛋白合并浓缩，获得二聚体蛋白CS。
五种二聚体抗原蛋白BA.1-S、BA.2-S、CS、CC、SS的分子筛层析曲线如图1所示，图1显示：BA.1-S、BA.2-S、CC、SS均在洗脱体积为约14mL时有一个主洗脱峰，CS在洗脱体积为约76mL时有一个主洗脱峰；分别收集上述主洗脱峰处的洗脱液进行SDS-PAGE分析，结果显示：主洗脱峰处的洗脱蛋白大小都在60KDa左右，符合上述五种二聚体蛋白的分子大小，这说明：五种重组蛋白均以二聚体的形式稳定存在，证明纯化得到了BA.1-S、BA.2-S、CS、CC、SS二聚体蛋白；并且电泳条带单一，说明纯化后的蛋白具有较高的纯度。
按照上述方法，获得了经纯化的五种二聚体抗原蛋白BA.1-S、BA.2-S、CS、CC、SS。
实施例3：实验动物免疫和样品采集
为了检测二聚体抗原蛋白的免疫原性，我们将实施例2所得纯化的五种二聚体抗原蛋白分别作为免疫原免疫BALB/c小鼠。
疫苗制备
将二聚体蛋白BA.1-S、BA.2-S、CS、CC、SS分别用PBS稀释至10μg/ml，分别将稀释后的免疫原与类MF59佐剂——AddaVaxTM佐剂按照体积比1:1的比例充分混合、彻底乳化，制备成疫苗；同时，将PBS溶液与AddaVaxTM佐剂混合，作为阴性对照组。
免疫方案
将按照上述方法所得疫苗通过肌肉注射的方式对BALB/c小鼠(购自维通利华公司，雌性，6-8周龄)进行免疫，实验共分6组，每组8只小鼠；对于所有小鼠，分别在第0天进行第一次免疫，在第19天进行一免后采血；在第21天进行第二次免疫，在第35天进行二免后采血；在第42天进行第三次免疫，在第56天进行三免后采血；每次免疫的接种体积为100μL(含抗原蛋白1μg)。
上述实验分组及免疫方案如表1所示。
表1、各免疫原免疫小鼠的分组及免疫方案
将上述各次免疫后所采集的血液通过12000rpm、10min离心，收集血清，将所得血清于56℃作用30min以灭活补体，然后保存于-80℃，用于后续实验。
实施例4：通过假病毒中和实验，检测免疫小鼠血清中的中和抗体滴度
本实施例中，分别检测第三次免疫后的(即，第56天采集的)小鼠血清对新冠病毒原型株、Delta变异株、Omicron变异株BA.1、BA.2、BA.2.75、BA.4/5、BA.2.3.20、BQ.1、BQ.1.1、XBB、BF.7亚型，SARS-CoV，以及SARS相关冠状病毒LYRa11和WIV1的假病毒的中和抗体滴度(pVNT50)。
本实施例中使用的新冠病毒原型株及其各型变异株、SARS-CoV、LYRa11和WIV1的假病毒的包装均是在二级生物安全实验室，通过在水泡口炎病毒(VSV)骨架上分别携带相应病毒的刺突蛋白获得的，制备方法参见Zhao X,Zheng A,Li D,Zhang R,Sun H,Wang Q,Gao GF,Han P,Dai L.Neutralisation of ZF2001-elicited antisera to SARS-CoV-2variants.Lancet Microbe.2021Oct；2(10):e494.doi:10.1016/S2666-5247(21)00217-2.Epub2021Aug 20.PMID:34458880；PMCID:PMC8378832。
检测SARS-CoV和SARS-CoV-2原型株和各型变异株的假病毒中和抗体滴度的方法如下：
在96孔板中，用DMEM培养基(含10％胎牛血清)，将免疫小鼠血清按2倍梯度倍比稀释，初始稀释度为1:40，共设置10个梯度；同样地，用DMEM培养基(含10％胎牛血清)将假病毒稀释至2000TU/100μl；之后，将稀释的免疫小鼠血清与稀释的假病毒按体积比1：1分别混合，空白培养基与假病毒混合作为阴性对照(NC)，未与假病毒混合的空白培养基作为空白对照(MOCK)，37℃孵育1小时；然后，将免疫小鼠血清-假病毒混合液转移至已铺满Vero细胞的96孔板中，37℃孵育15小时后，通过CQ1共聚焦细胞成像仪(Yokogawa)检测并计算阳性细胞数值，然后，在GraphPad Prism软件中绘制拟合曲线，计算50％中和时对应的血清稀释度的倒数，即为中和滴度pVNT50。
检测SARS相关冠状病毒LYRa11和WIV1的假病毒中和抗体滴度的方法如下：
在96孔板中，用DMEM培养基(含10％胎牛血清)，将免疫小鼠血清按2倍梯度倍比稀释，初始稀释度为1:40，共设置10个梯度；同样地，用DMEM培养基(含10％胎牛血清)将假病毒稀释至1000TU/100μl；之后，将稀释的免疫小鼠血清与稀释的假病毒按体积比1：1分别混合，空白培养基与假病毒混合作为阴性对照(NC)，未与假病毒混合的空白培养基作为空白对照(MOCK)，37℃孵育1小时；然后，将免疫小鼠血清-假病毒混合液转移至已铺满293T-ACE2细胞的96孔板中，37℃孵育15小时后，通过CQ1共聚焦细胞成像仪(Yokogawa)检测并计算阳性细胞数值，然后，在GraphPad Prism软件中绘制拟合曲线，计算50％中和时对应的血清稀释度的倒数，即为中和滴度pVNT50。
各免疫小鼠血清针对新冠病毒原型株及其变异株的假病毒的中和抗体滴度检测结果如图2所示，其相应的雷达图如图3所示；各免疫小鼠血清针对SARS-CoV的假病毒的中和抗体滴度检测结果如图4所示；各免疫小鼠血清针对SARS相关冠状病毒LYRa11和WIV1的假病毒的中和抗体滴度检测结果如图5所示。
图2、3显示：本发明的二聚体抗原BA.1-S、BA.2-S作为免疫原对BALB/c小鼠进行免疫后，可以引发高水平的、针对新冠病毒原型株及其各型变异株假病毒的中和抗体滴度；特别是，BA.1-S、BA.2-S所引起的针对新冠病毒Omicron变异株各亚型假病毒的中和抗体滴度水平明显高于对照二聚体CS。
图4显示：本发明的二聚体抗原BA.1-S、BA.2-S作为免疫原对BALB/c小鼠进行免疫后，可以引发非常高水平的、针对SARS-CoV假病毒的中和抗体滴度，其所引发的针对SARS-CoV假病毒的中和抗体水平远远高于对照二聚体CS，并与纯合二聚体SS的水平相当；要注意，在相同的免疫剂量下，与纯合二聚体抗原SS相比，BA.1-S、BA.2-S二聚体抗原的SARS-CoV抗原成分的实际含量减半，然而，其所激发的针对SARS-CoV假病毒的中和抗体水平却与SS的相当；而相较于SARS-CoV-2原型株与SARS-CoV的嵌合二聚体抗原CS，BA.1-S、BA.2-S二聚体抗原的SARS-CoV抗原成分的实际含量相当，然而其所激发的针对SARS-CoV假病毒的中和抗体水平却远远高于CS(***，p<0.001)。这些结果均表明：本发明的二聚体抗原BA.1-S、BA.2-S在引发针对SARS-CoV假病毒的中和抗体方面实现了预料不到的技术效果。
图5显示：本发明的二聚体抗原BA.1-S、BA.2-S作为免疫原对BALB/c小鼠进行免疫后，可以引发非常高水平的、针对LYRa11和WIV1的假病毒的中和抗体滴度，其所引发的针对LYRa11和WIV1的假病毒的中和抗体水平显著高于对照二聚体CS(针对LYRa11假病毒，***，p<0.001；针对WIV1假病毒，*，p<0.05)。这些结果表明：本发明的二聚体抗原BA.1-S、BA.2-S在引发针对SARS相关冠状病毒LYRa11和WIV1假病毒的中和抗体方面实现了预料不到的技术效果。
实施例5：通过酶联免疫吸附试验(ELISA)，免疫小鼠血清中针对相关冠状病毒RmYN02的特异性结合抗体滴度
将病毒RmYN02的RBD单体蛋白(按照GenBank数据库中展示的相应序列，通过人工表达、纯化获得)用ELISA包被液(索莱宝，C1050)稀释至3ug/ml，在ELISA包被板(康宁，3590)中按照100ul/孔的体积加入稀释的RmYN02 RBD单体蛋白溶液，于4℃包被过夜。待包被过夜完成后，去掉含有抗原蛋白的包被液，加入PBS配置的5％脱脂乳，添加体积为100ul/孔，室温封闭1小时。在封闭的间歇，将不同免疫组的小鼠血清，用5％脱脂乳按照1:40起始的稀释梯度进行4倍比梯度稀释。具体地，第一孔为把3.2ul小鼠血清加入124.8ul脱脂乳中，混匀，完成1:40稀释；在第一孔中取其中32ul液体，将其与96ul脱脂乳混匀，完成第二孔的稀释；在第二孔中取32ul液体，将其与96ul脱脂乳混匀，完成第三孔的稀释；以此类推，在第十二孔的稀释中，弃掉32ul液体。待封闭完成后，去掉脱脂乳，用PBST洗两次，沥干水分，加入梯度稀释的免疫小鼠血清，每孔90ul，37℃孵育1.5小时。孵育完成后，用PBST洗4次板子，沥干水分。同时，用5％脱脂乳按照1:3000稀释HRP耦联的二抗山羊抗鼠(Gene-ProteinLink，P03S01M)，每孔添加90ul，37℃，孵育1.5小时。待孵育完成后，用PBST冲洗4次，沥干板子，加入TMB显色液(碧云天，P0209-500ml)，每孔60ul。反应适当时间，待显色结束后，用2MHCl终止显色。使用酶标仪检测OD450的读数。大于空白对照值的2.5倍值作为阳性，抗体滴度为此时对应的稀释倍数；小于最低检测值1:40的结果，记做1:20，即20。其结果如图6所示。
图6显示：本发明的二聚体抗原BA.1-S、BA.2-S作为免疫原对BALB/c小鼠进行免疫后，可以引发非常高水平的、针对RmYN02假病毒的特异性IgG的抗体滴度，其所引发的针对RmYN02假病毒的特异性IgG抗体水平显著高于对照二聚体CS(*,p<0.05)。该结果表明：本发明的二聚体抗原BA.1-S、BA.2-S在引发针对SARS相关冠状病毒RmYN02假病毒的特异性结合抗体方面实现了预料不到的技术效果。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (19)

1.一种β冠状病毒重组嵌合抗原，其特征在于：所述β冠状病毒重组嵌合抗原的氨基酸序列按照从N端到C端的顺序包括：按照(A-B)-C-(A’-B’)样式排列的氨基酸序列，其中：
A-B表示新型冠状病毒Omicron变异株BA.1亚型或BA.2亚型S蛋白RBD结构域或其一部分的氨基酸序列，或与其具有至少90％，92％，95％，96％，97％，98％或99％同一性且与其具有相同或基本相同的免疫原性的氨基酸序列，
A’-B’表示严重呼吸综合征冠状病毒S蛋白RBD结构域或其一部分的氨基酸序列，或与其具有至少90％，92％，95％，96％，97％，98％或99％同一性且与其具有相同或基本相同的免疫原性的氨基酸序列，并且，
C表示连接子(GGS)n，其中，n为0～10之间的整数。
2.根据权利要求1所述的β冠状病毒重组嵌合抗原，其特征在于：A-B表示选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:2，或与其具有至少90％，92％，95％，96％，97％，98％或99％同一性且与其具有相同或基本相同的免疫原性的氨基酸序列；
和/或，A’-B’表示如SEQ ID NO:4的氨基酸序列，或与其具有至少90％，92％，95％，96％，97％，98％或99％同一性且与其具有相同或基本相同的免疫原性的氨基酸序列；
和/或，所述连接子(GGS)n中，n为0～5之间的整数。
3.根据权利要求2所述的β冠状病毒重组嵌合抗原，其特征在于：A-B表示如SEQ ID NO:1或如SEQ ID NO:2的氨基酸序列；和/或，A’-B’表示如SEQ ID NO:4的氨基酸序列；
优选地，所述β冠状病毒重组嵌合抗原具有选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:5，SEQID NO:6。
4.根据权利要求1-3任一项所述的β冠状病毒重组嵌合抗原，其特征在于：所述β冠状病毒抗原的N端还包括信号肽；优选地，所述信号肽具有如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列；
和/或，所述β冠状病毒抗原的C端还包括组氨酸标签。
5.一种如权利要求1-3之一所述的β冠状病毒重组嵌合抗原的制备方法，其包括以下步骤：在编码权利要求1-3之一所述的β冠状病毒重组嵌合抗原的核苷酸序列的5’端加入编码信号肽的序列，3’端加上编码组氨酸标签的序列，进行克隆表达，筛选正确的重组子，然后转染表达系统的细胞进行表达，表达后收集细胞上清，纯化得到β冠状病毒重组嵌合抗原。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：所述表达系统细胞为哺乳动物细胞、昆虫细胞、酵母细胞或细菌细胞；
可选地，所述哺乳动物细胞为HEK293T细胞、293F系列细胞或CHO细胞；进一步可选地，所述293F系列细胞为HEK293F细胞、Freestyle293F细胞或Expi293F细胞；
可选地，所述昆虫细胞为sf9细胞、Hi5细胞、sf21细胞或S2细胞；
可选地，所述酵母细胞为毕赤酵母细胞或者由其改造的酵母细胞；
可选地，所述细菌细胞为大肠杆菌细胞。
7.一种多核苷酸，其编码如权利要求1-4之一所述的β冠状病毒重组嵌合抗原。
8.根据权利要求7所述的多核苷酸，其特征在于：所述多核苷酸为DNA或mRNA；
优选地，所述多核苷酸为如SEQ ID NO:9或10所示的DNA序列；
优选地，所述多核苷酸为如SEQ ID NO:11或12所示的mRNA序列。
9.一种核酸构建体，其包含如权利要求7或8所述的多核苷酸，以及任选地，与所述多核苷酸可操作地连接的至少一个表达调控元件。
10.一种表达载体，其包含如权利要求9所述的核酸构建体。
11.一种宿主细胞，其中转化或转染有如权利要求7或8所述的多核苷酸、如权利要求9所述的核酸构建体或如权利要求10所述的表达载体。
12.如权利要求1-4任一项所述的β冠状病毒重组嵌合抗原、如权利要求7或8所述的多核苷酸、如权利要求9所述的核酸构建体、如权利要求10所述的表达载体或如权利要求11所述的宿主细胞在制备用于预防和/或治疗β冠状病毒感染的药物中的应用；
可选地，所述药物为疫苗；
可选地，所述β冠状病毒为Sarbecovirus亚属β冠状病毒，优选选自：新型冠状病毒，严重呼吸综合征冠状病毒和其它SARS相关冠状病毒；
进一步优选地，所述新型冠状病毒包括：SARS-CoV-2原型株，SARS-CoV-2变异毒株Alpha(B.1.1.7)，Beta(B.1.351)，Gamma(P.1)，Kappa(B.1.617.1)，Delta(B.1.617.2)，Omicron亚型BA.1、BA.2、BA.2.75、BA.4/BA.5、BA.2.3.20、BQ.1.1、XBB、BF.7；
进一步优选地，所述其它SARS相关冠状病毒包括RaTG13、LYRa11、Pangolin GX、Pangolin GD、WIV1，优选为LYRa11或WIV1。
13.一种疫苗或免疫原性组合物，其包含如权利要求1-4任一项所述的β冠状病毒重组嵌合抗原、如权利要求7或8所述的多核苷酸、如权利要求9所述的核酸构建体、如权利要求10所述的表达载体或如权利要求11所述的宿主细胞，以及生理学可接受的媒介物、佐剂、赋形剂、载体和/或稀释剂。
14.根据权利要求13所述的疫苗或免疫原性组合物，其为β冠状病毒重组蛋白疫苗，其包括如权利要求1-4任一项所述的β冠状病毒重组嵌合抗原和佐剂；
可选地，所述佐剂为选自以下佐剂中的一种或多种：铝佐剂、MF59佐剂和类MF59佐剂。
15.根据权利要求13所述的疫苗或免疫原性组合物，其为β冠状病毒DNA疫苗，所述DNA疫苗包括：
(1)真核表达载体；和
(2)构建入所述真核表达载体中的、编码如权利要求1-4任一项所述的β冠状病毒重组嵌合抗原的DNA序列；
可选地，所述真核表达载体选自pGX0001、pVAX1、pCAGGS和pcDNA系列载体。
16.根据权利要求13所述的疫苗或免疫原性组合物，其为β冠状病毒mRNA疫苗，所述mRNA疫苗包括：
(I)编码如权利要求1-4任一项所述的β冠状病毒重组嵌合抗原的mRNA序列；和
(II)脂质纳米颗粒。
17.根据权利要求13所述的疫苗或免疫原性组合物，其为β冠状病毒-病毒载体疫苗，其包括：
(1)病毒骨架载体；和
(2)构建入所述病毒骨架载体中的、编码如权利要求1-4任一项所述的β冠状病毒重组嵌合抗原的DNA序列；
可选地，所述病毒骨架载体选自以下病毒载体中的一种或几种：腺病毒载体、痘病毒载体、流感病毒载体、腺相关病毒载体。
18.根据权利要求13-17任一项所述的疫苗或免疫原性组合物，其特征在于，所述疫苗或免疫原性组合物为鼻喷剂、口服制剂、栓剂或胃肠外制剂的形式；
优选地，所述鼻喷剂选自气雾剂、喷雾剂和粉雾剂；
优选地，所述口服制剂选自片剂、粉末剂、丸剂、散剂、颗粒剂、细粒剂、软/硬胶囊剂、薄膜包衣剂、小丸剂、舌下片和膏剂；
优选地，所述胃肠外制剂为经皮剂、软膏剂、硬膏剂、外用液剂、可注射或可推注制剂。
19.一种试剂盒，其包括如权利要求1-4任一项所述的β冠状病毒重组嵌合抗原、如权利要求7或8所述的多核苷酸、如权利要求9所述的核酸构建体、如权利要求10所述的表达载体、如权利要求11所述的宿主细胞和/或如权利要求13-18任一项所述的疫苗或免疫原性组合物，以及任选地其他类型的β冠状病毒疫苗。
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