KR102039059B1 - 일본 뇌염 바이러스 피막 단백질의 돌출 도메인을 포함하는 단백질, 이의 동형이량체, 및 이의 용도 - Google Patents

일본 뇌염 바이러스 피막 단백질의 돌출 도메인을 포함하는 단백질, 이의 동형이량체, 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 일본 뇌염 바이러스 피막 단백질의 돌출 도메인을 포함하는 단백질, 이의 동형이량체, 및 이를 유효성분으로 포함하는 일본 뇌염 바이러스 감염에 의한 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 곤충세포 발현 시스템을 이용하여 본래 바이러스의 표면에 존재하는 것과 같이 구조적으로 안정한 돌출 도메인의 동형이량체 단백질 항원을 제공한다. 또한, 상기 항원은 개체에 주사할 경우 개체 내 항체 생성능이 우수하여 기존의 일본 뇌염 사백신보다 안정한 백신으로 이용될 수 있으며, 일본 뇌염의 진단에 이용될 수 있다.

Description

일본 뇌염 바이러스 피막 단백질의 돌출 도메인을 포함하는 단백질, 이의 동형이량체, 및 이의 용도 {PROTEIN COMPRISING ECTODOMAIN OF JAPANESE ENCEPHALITIS VIRUS ENVELOPE PROTEINS, HOMODIMER THEREOF, AND USE THEREOF}
본 발명은 일본 뇌염 바이러스 피막 단백질의 돌출 도메인을 포함하는 단백질, 이의 동형이량체, 및 이의 용도에 관한 것이다.
일본 뇌염 바이러스(japanese encephalitis virus, JEV)는 플라비비리데과(Flaviviridae), 플라비바이러스속(Flavivirus)에 속하는 바이러스로, 40 nm 내지 50 nm의 직경을 가진 정이십면체의 바이러스이다. 바이러스 표면은 막 단백질(membrane protein, M), 피막 단백질(envelope protein, E), 및 지질로 구성된 피막으로 구성되어 있다. 상기 바이러스 유전자는 양성 단일 가닥 RNA를 가지고 있으며 크기는 약 11 kb 이다.
일반적으로 JEV는 감염 시 뇌염(encephalitis), 무균성 수막염(aseptic meningtis), 열성 두통(febrile headache)의 증상을 보인다. 병의 증세는 나이가 증가함에 따라 증가하며 60세 이상의 고령자에서는 높은 비율로 뇌염을 일으킨다. JEV는 한국, 일본, 중국, 대만, 동남아시아, 인도, 러시아를 포함하는 아시아 전역에 널리 퍼져있으며 최근에는 구미지역에서도 출현이 보고되고 있다. 그러나, 현재까지 뚜렷한 치료방법은 알려진 것이 없다.
일본 뇌염 바이러스 백신은 쥐 뇌조직 유래 백신 및 햄스터 신장세포 유래 백신과 같은 2 종류의 불활성화 사백신 및 약독화 생백신과 같이 총 3 종류의 백신이 있다. 한편, 우리나라에서는 Nakayama주를 이용한 불활성화 쥐 뇌조직 유래 사백신과 약독화 백신이 사용되고 있다(Min Soo Park, et al., 1999). 현재, 여러 가지 새로운 일본 뇌염 백신이 개발되고 있다. 그 중에 대표적인 백신은 유전자 재조합 백신과 베로 세포(Vero cell) 유래 불활성화 사백신이다. 불활성화 사백신의 접종은 기본 3회 접종 후 각 국가마다 다른 추가접종 방식을 택하고 있다. 불활화 백신은 마우스 내에서 유래 되었기 때문에 드물게 접종자에게 쇼크를 일으킬 수 있고, 면역력이 장기간 유지되지 않기 때문에 2년마다 재접종하여야 하며, 마우스를 사용하기 때문에 경제성의 문제가 있다.
한편, 일본 뇌염 진단의 목적은 환자의 감염 진단 및 발생 감시로 구분할 수 있다. 환자의 일본 뇌염 바이러스 감염 진단을 위해, 환자 검체에서 바이러스 분리, 혈중 항체가 측정 및 유전자 검출 방법 등을 수행할 수 있다. 일본 뇌염 발생을 감시하기 위해서는, 증폭 숙주인 돼지에서 일본 뇌염 특이항체 측정 및 매개체인 모기에서 바이러스 분리 시험 등을 수행한다. 바이러스에 대한 항체검사 중, 중화항체역가측정시험법은 판정까지의 시간이 많이 걸린다는 단점이 있어 일반적인 진단법으로 사용하기는 어렵다. 또한, 혈구응집억제시험법은 신속하게 일본 뇌염 감염 여부를 확인할 수 있다는 장점이 있지만 시약 제조가 복잡하고 검사자에 따라 결과에 차이가 많이 나는 단점이 있다. 따라서, 일본 뇌염 바이러스 감염 진단을 위한 시험법의 개선이 요구되고 있는 실정이다.
Min Soo Park, et al., 1999. Immune Response to SA14-14-2 Live Attenuated Japanese Encephalitis Vaccine. Department of Pediatrics, Yonsei University College of Medicine. pp. 351-358.
이에, 본 발명자들은 일본 뇌염 바이러스 감염에 따른 혈청학적 진단을 위해 일본 뇌염 바이러스의 항원 단백질인 피막 단백질을 구조적 안정화시킨 형태로 곤충세포에 발현 및 정제를 하였다. 이를 ELISA 방법을 통하여 감염 동물의 혈청에서 높은 감도로 항체가를 측정할 수 있었다. 또한, 상기 정제된 재조합 피막 단백질을 실험동물에 면역 후 생성되는 항체가 일본 뇌염 바이러스에 대한 중화능력을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 일본 뇌염 바이러스 피막 단백질의 돌출 도메인을 구조적으로 안정화시킨 동형이량체 단백질 항원을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 항원에 대한 항체를 포함하는 일본 뇌염의 진단, 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 일본 뇌염 바이러스 피막 단백질 돌출 도메인 두 개가 결합된 동형이량체 단백질을 제공한다.
또한, 상기 동형이량체 단백질을 유효성분으로 포함하는 일본 뇌염 바이러스 감염에 의한 질환 예방 또는 치료용 백신을 제공한다.
또한, 상기 동형이량체 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 단편을 제공한다.
또한, 상기 동형이량체 단백질을 포함하는 일본 뇌염 바이러스 감염 진단용 키트을 제공한다.
또한, 상기 동형이량체 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 일본 뇌염 바이러스 감염 진단용 키트를 제공한다.
또한, 상기 일본 뇌염 바이러스 피막 단백질 돌출 도메인 단량체 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터를 제공한다.
또한, 상기 발현 벡터로 형질감염된 숙주세포를 제공한다.
또한, 상기 형질감염된 숙주세포로부터 일본 뇌염 바이러스 피막 단백질 돌출 도메인 단량체 단백질을 수득하는 단계를 포함하는 일본 뇌염 바이러스 피막 단백질 돌출 도메인 단량체 단백질의 제조방법을 제공한다.
또한, (1) 상기 동형이량체 단백질을 항원으로서 실험동물에 주입하여 면역반응을 유도하는 단계; 및 (2) 상기 실험동물로부터 항체를 회수하는 단계를 포함하는 일본 뇌염 바이러스 항체 제조 방법을 제공한다.
본 발명은 곤충세포 발현 시스템을 이용하여 본래 바이러스의 표면에 존재하는 것과 같이 구조적으로 안정한 돌출 도메인의 동형이량체 단백질 항원을 제공한다. 또한, 상기 항원은 개체에 주사할 경우 개체 내 항체 생성능이 우수하여 기존의 일본 뇌염 사백신보다 안정한 백신으로 이용될 수 있으며, 일본 뇌염의 진단에 이용될 수 있다.
도 1은 단백질 서열분석 비교 프로그램(Clustal W & ESPript 3.0)을 이용하여 플라비 바이러스의 피막 단백질 아미노산 서열을 비교 분석하여 나타낸 것이다.
도 2는 단백질 서열분석 비교 프로그램(Clustal W & ESPript 3.0)을 이용하여 일본 뇌염 바이러스의 피막 단백질 아미노산 서열을 비교 분석하여 나타낸 것이다. 이때, 일본 뇌염바이러스 피막 단백질 돌출 도메인은 1번부터 401번까지이다.
도 3은 일본 뇌염 바이러스 피막 단백질 돌출 도메인의 발현을 웨스턴 블롯을 이용하여 확인한 것이다.
도 4a는 Ni-NTA 친화성 크로마토그래피 기법을 이용하여 일본 뇌염 바이러스 피막 단백질 돌출 도메인을 정제한 후, 순도를 측정한 것이다.
도 4b는 Ni-NTA 친화성 크로마토그래피 기법을 이용하여 일본 뇌염 바이러스 피막 단백질 돌출 도메인을 정제한 후, 돌출 도메인 단백질 발현을 확인한 것이다.
도 4c는 젤 필트레이션 크로마토그래피 기법을 이용하여 일본 뇌염 바이러스 피막 단백질 돌출 도메인을 정제한 후, 순도를 측정한 것이다.
도 4d는 젤 필트레이션 크로마토그래피 기법을 이용하여 일본 뇌염 바이러스 피막 단백질 돌출 도메인을 정제한 후, 돌출 도메인 단백질 발현을 확인한 것이다.
도 4e는 정제된 일본 뇌염 바이러스 피막 단백질 돌출 도메인의 발현을 SDS-PAGE 상에서 확인한 것이다.
도 5는 일본 뇌염 바이러스 피막 단백질 돌출 도메인 항원을 면역한 4마리의 마우스로부터 최종 혈청을 분리한 후, 상기 항원에 의한 면역 항체 형성 정도를 나타낸 것이다.
도 6는 일본 뇌염 바이러스 피막 단백질 돌출 도메인 항원을 2번(JEVx2) 및 3번(JEVx3) 투여한 각 마우스의 혈액 속 항체량을 측정한 것이다.
도 7은 곤충세포 유래 일본 뇌염 바이러스 피막 단백질 돌출 도메인 항원(JEV-E)과 대장균 발현 시스템 유래 항원(LysRS-JEV-E)의 특이도 및 민감도를 측정한 것이다.
도 8a는 면역증강제와 백신의 접종 방법에 따른 항체 생성 정도를 측정한 것이다.
도 8b는 면역증강제와 백신의 접종 방법에 따라 생성된 항체량을 마우스 표준 IgG값을 기준으로 정량한 값이다.
본 발명은 일 측면으로, 일본 뇌염 바이러스 피막 단백질 돌출 도메인 두 개가 결합된 동형이량체 단백질을 제공한다.
본 명세서에서 사용된 용어, "일본 뇌염 바이러스"는 플라비비리데과 플라비바이러스 속에 속하는 바이러스이다. 상기 바이러스는 genomic RNA와 캡시드 단백질의 복합체로 구성된 뉴클레오캡시드 및 이를 둘러싼 피막 단백질로 구성되어 있다. 상기 피막 단백질은 바이러스의 혈청형을 결정하는 요소이다.
또한, 본 명세서에서 사용된 용어, "일본 뇌염 바이러스 피막 단백질"은 일본 뇌염 바이러스 감염의 중요한 역할을 하며, 상기 바이러스의 활성을 저해하는 백신이나 항체의 타겟이다. 따라서, 상기 피막 단백질은 일본 뇌염의 예방 또는 치료에 유용하게 이용될 수 있다.
상기 돌출 도메인은 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 또는 이의 단편일 수 있고, 상기 폴리펩티드는 서열번호 2의 염기서열에 의해 코딩될 수 있다.
상기 돌출 도메인은 서브도메인 1(FNCLGMGNRD, (서열번호 4)), 서브도메인 2(VLEGDSCLT, (서열번호 5)), 서브도메인 3(HASVTDIS, (서열번호 6)), 서브도메인 4(GWGNGCGL, (서열번호 7)), 서브도메인 5(TTTSENHGN, (서열번호 8)), 서브도메인 6(AHATKQSVVA, (서열번호 9)), 서브도메인 7(QEGGLHQALAGAIVVEYS, (서열번호 10)), 및 서브도메인 8(DTGHGTV, (서열번호 11))의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
구체적으로, 일본 뇌염 바이러스 피막 단백질 돌출 도메인을 나타내는 서열번호 3의 아미노산 서열에 있어서, 서브도메인 1은 3번 내지 12번에 위치할 수 있고; 서브도메인 2는 26번 내지 34번에 위치할 수 있으며; 서브도메인 3은 64번 내지 71번에 위치할 수 있고; 서브도메인 4는 102번 내지 109번에 위치할 수 있으며; 서브도메인 5는 148번 내지 156번에 위치할 수 있고; 서브도메인 6은 247번 내지 256번에 위치할 수 있으며; 서브도메인 7은 260번 내지 277번에 위치할 수 있고; 서브도메인 8은 318번 내지 324번에 위치할 수 있다.
상기 서브도메인 1 내지 서브도메인 8은 링커를 통해 연결될 수 있다.
이때, 서브도메인 1과 서브도메인 2를 연결하는 링커(L1)는 1개 내지 30개, 2개 내지 25개, 3개 내지 20개, 또는 5개 내지 15개의 아미노산을 포함할 수 있으며, 바람직하게는 13개의 아미노산으로 구성된 펩티드일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는, 상기 L1이 서열번호 3의 13번 내지 25번에 위치하였다.
상기 서브도메인 2와 서브도메인 3을 연결하는 링커(L2)는 1개 내지 50개, 2개 내지 45개, 3개 내지 40개, 5개 내지 35개, 또는 10개 내지 30개의 아미노산을 포함할 수 있으며, 바람직하게는 29개의 아미노산으로 구성된 펩티드일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는, 상기 L2가 서열번호 3의 35번 내지 63번에 위치하였다.
상기 서브도메인 3과 서브도메인 4를 연결하는 링커(L3)는 1개 내지 50개, 2개 내지 45개, 3개 내지 40개, 5개 내지 35개, 또는 10개 내지 30개의 아미노산을 포함할 수 있으며, 바람직하게는 30개의 아미노산으로 구성된 펩티드일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는, 상기 L3가 서열번호 3의 72번 내지 101번에 위치하였다.
상기 서브도메인 4와 서브도메인 5를 연결하는 링커(L4)는 1개 내지 60개, 2개 내지 55개, 3개 내지 50개, 5개 내지 45개, 또는 10개 내지 40개의 아미노산을 포함할 수 있으며, 바람직하게는 37의 아미노산으로 구성된 펩티드일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는, 상기 L4가 서열번호 3의 110번 내지 147번에 위치하였다.
상기 서브도메인 5와 서브도메인 6을 연결하는 링커(L5)는 1개 내지 120개, 20개 내지 110개, 40개 내지 100개, 또는 60개 내지 90개의 아미노산을 포함할 수 있으며, 바람직하게는 90개의 아미노산으로 구성된 펩티드일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는, 상기 L5가 서열번호 3의 157번 내지 246번에 위치하였다.
상기 서브도메인 6과 서브도메인 7을 연결하는 링커(L6)는 1개 내지 10개, 2개 내지 8개, 또는 3개 내지 5개의 아미노산을 포함할 수 있으며, 바람직하게는 3개의 아미노산으로 구성된 펩티드일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는, 상기 L6가 서열번호 3의 257번 내지 259번에 위치하였다.
상기 서브도메인 7과 서브도메인 8을 연결하는 링커(L7)는 1개 내지 60개, 5개 내지 55개, 10개 내지 50개, 또는 20개 내지 40개의 아미노산을 포함할 수 있으며, 바람직하게는 40개의 아미노산으로 구성된 펩티드일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는, 상기 L7이 서열번호 3의 278번 내지 317번에 위치하였다.
상기 링커를 구성하는 아미노산은 아르기닌(Arg), 히스티딘(His), 리신(Lys), 아스파르트산(Asp), 글루탐산(Glu), 세린(Ser), 트레오닌(Thr), 아스파라긴(Asn), 글루타민(Gln), 티로신(Tyr), 알라닌(Ala), 루신(Leu), 아이소루신(Ile), 발린(Val), 페닐알라닌(Phe), 메티오닌(Met), 트립토판(Trp), 글리신(Gly), 프롤린(Pro), 및 시스테인(Cys)으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
본 발명은 다른 측면으로, 상기 일본 뇌염 바이러스 피막 단백질 돌출 도메인을 포함하는 단백질 두 개가 결합된 일본 뇌염 바이러스 피막 단백질 돌출 도메인의 동형이량체 단백질을 제공한다. 상기 결합은 상기 돌출 도메인에 존재하는 서열번호 4 내지 서열번호 10의 부위에서 이루어질 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 동형이량체 단백질을 유효성분으로 포함하는 일본 뇌염 바이러스 감염에 의한 질환 예방 또는 치료용 백신을 제공한다.
상기 일본 뇌염 바이러스 감염에 의한 질환은 뇌염, 무균성수막염, 열성두통 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.
상기 약학 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 추가적으로 포함할 수 있다. 상기 담체는 본 발명의 약학 조성물 총 중량을 기준으로 약 1 중량% 내지 약 99.99 중량%, 5 중량% 내지 90 중량%, 10 중량% 내지 85 중량%, 20 중량% 내지 60중량%, 바람직하게는 약 90 중량% 내지 약 99.99 중량%로 포함될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 백신을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 일본 뇌염 바이러스 감염에 의한 질환 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 동형이량체 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 단편을 제공한다.
상기 용어 "항체"는 면역계 내에서 항원의 자극에 의하여 만들어지는 성분으로서 특정한 항원과 특이적으로 결합하여 림프와 혈액을 떠돌며 항원-항체반응을 일으키는 단백질이다. 항원-항체 반응은 각 항원에 대하여 높은 특이성을 갖는다. 이는 림프구의 B세포에서 항체가 만들어질 때 특정항원에 의해 생성된 항체는 원칙적으로 다른 항원과 반응하지 않는다. 이러한 높은 특이성은 면역, 알레르기, 각종 병 및 감염의 종류·형의 결정 등의 검사에 사용된다.
상기 용어 "항원"은 바이러스의 구성성분 중 면역기능을 일으킬 수 있는 성분으로서 바이러스가 발현하는 단백질이다. 본 발명의 일 실시예에서는, 일본 뇌염 바이러스 피막 단백질 돌출 도메인의 동형이량체 단백질이 개체에 투여되었을 때 면역 항체 형성을 유도하는 항원으로 작용하였다.
또한, 본 발명은 상기 동형이량체 단백질을 포함하는 일본 뇌염 바이러스 감염 진단용 키트를 제공하며, 상기 동형이량체 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 일본 뇌염 바이러스 감염 진단용 키트를 제공한다.
일 구체예로, 일본 뇌염 바이러스 피막 단백질 돌출 도메인의 동형이량체 단백질은 일본 뇌염 바이러스에 대한 항체와 특이적으로 결합할 수 있어, 일본 뇌염 바이러스 감염 진단 키트에 적용될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 일본 뇌염 바이러스 감염 진단용 키트에 진단 대상에서 분리된 시료를 첨가하는 단계를 포함하는 일본 뇌염 바이러스 감염 정보제공 방법을 제공한다.
상기 용어 "일본 뇌염 바이러스 감염 진단용 키트"는 일본 뇌염 바이러스 감염 및 이에 의한 질병을 신속하게 진단할 수 있는 키트이다. 이러한 키트를 이용한 검사들은 10분 내지 15분 이내에 검사 결과를 알 수 있으며, 전문가 또는 진단을 위한 장비가 필요하지 않아 누구나 쉽게 일본 뇌염 바이러스 감염에 의한 질병을 진단할 수 있다는 장점이 있다.
본 발명은 또 다른 측면으로, 일본 뇌염 바이러스 피막 단백질 돌출 도메인 단량체 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터를 제공한다. 이때, 상기 벡터는 pAcGP67A-JEVE401일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는, 서열번호 3으로 표시되는 일본 뇌염 바이러스 피막 단백질의 둘출 도메인을 pAcGP67A 벡터의 BamHI과 ECoRI 부위에 서브클론하고 대장균 균주를 이용하여 과발현하였다. 이후, DNA midi-prep (Qiagen, 독일)을 이용하여 발현 벡터인 pAcGP67A-JEVE401를 정제하였다.
또한, 본 발명은 상기 발현 벡터로 형질감염된 숙주세포를 제공한다. 상기 숙주세포는 진핵세포일 수 있고, 상기 진핵세포는 곤충세포일 수 있다. 이때, 상기 숙주세포는 바큘로바이러스에 의해 추가로 형질감염될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는, 형질감염 시약인 10% 프로펙틴(profectin)(AB vector 사)을 이용하여 상기 pAcGP67A-JEVE401 벡터와 바큘로 바이러스 DNA를 곤충세포인 sf9 세포에 형질감염시켰다.
또한, 본 발명은 상기 형질감염된 숙주세포로부터 일본 뇌염 바이러스 피막 단백질 돌출 도메인 단량체 단백질을 수득하는 단계를 포함하는 일본 뇌염 바이러스 피막 단백질 돌출 도메인 단량체 단백질의 제조방법을 제공한다.
상기 수득된 일본 뇌염 바이러스 피막 단백질 돌출 도메인 단량체 단백질을 정제하는 단계를 포함할 수 있다. 이때, 상기 정제는 친화성 크로마토그래피 또는 젤 필트레이션 크로마토그래피 기법으로 수행될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는, 상기 pAcGP67A-JEVE401 벡터와 바큘로 바이러스 DNA로 형질감염된 곤충세포를 배양함으로써 일본 뇌염 바이러스 피막 단백질 돌출 도메인 단량체 단백질을 수득하였다.
본 발명은 또 다른 측면으로, (1) 상기 동형이량체 단백질을 항원으로서 실험동물에 주입하여 면역반응을 유도하는 단계; 및 (2) 상기 실험동물로부터 항체를 회수하는 단계를 포함하는 일본 뇌염 바이러스 항체 제조 방법을 제공한다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 플라비 바이러스 및 일본 뇌염 바이러스의 피막 단백질 서열 비교분석
단백질 서열분석 비교 프로그램(Clustal W & ESPript 3.0)을 이용하여 플라비 바이러스 및 일본 뇌염 바이러스의 피막 단백질 아미노산 서열을 비교 분석하였다. 그 결과를 도 1 및 도 2에 나타내었다.
도 1 및 도 2에 나타난 바와 같이, 플라비 바이러스 및 일본 뇌염 바이러스의 서열을 비교 분석하여 단백질 간의 보존된 서열을 확인하였고, 단백질의 구조를 기반으로 안정한 돌출도메인을 설계하였다.
실시예 2. 일본 뇌염 바이러스 피막 단백질 돌출도메인의 발현 벡터 제작 및 발현 확인
일본 뇌염 바이러스는 Nakayama strain(연세대학교)을 사용하였다. 상기 Nakayama strain의 피막 단백질은 바이러스에서 직접 유전자를 증폭하여 수득하였으며, 상기 피막 단백질의 염기 서열은 서열번호 1에 나타내었다.
일본 뇌염 바이러스 피막 단백질의 둘출 도메인을 pAcGP67A 벡터의 BamHI과 ECoRI 부위에 서브클로닝하고(subcloning)하고 대장균(Escherichia coli) DH10β 균주(strain)를 사용하여 벡터를 증폭하였다. 이후, DNA midi-prep (Qiagen, 독일)을 통하여 순수하게 발현 벡터(pAcGP67A-JEVE401)를 정제하였다. 형질감염 시약(10% profectin, AB vector 사)을 이용하여 정제한 pAcGP67A-JEVE401 벡터와 바큘로 바이러스 DNA를 곤충세포인 sf9 세포에 형질감염시켰다. 50시간 후, pAcGP67A-JEVE401을 포함한 바이러스 상층액을 수득하였다. 이 상층액을 1:20의 비율로 다시 감염시키는 방식으로 5회 계대 배양한 후, 배양 상층액으로 분비된 피막 단백질의 돌출 도메인 발현을 웨스턴 블롯을 이용하여 확인하였다. 그 결과를 도 3에 나타내었다.
실시예 3. 일본 뇌염 바이러스 피막 단백질 돌출도메인의 대량 발현
상기 실시예 2에서 확인한 일본 뇌염 바이러스 피막 단백질 돌출 도메인의 대량 발현을 위하여 2.5% FBS와 함께 배양한 곤충세포 Hi5 세포의 배양액을 1.5 X 106 cell/ml 내지 2.0 X 106 cell/ml까지 배양하였다. 이후, 상기 배양액을 1:20의 비율로 바이러스 감염시키고 27℃에서 4일 동안 배양하였다. 배양 후, 상기 배양액의 상층액을 원심분리하여 일본 뇌염 바이러스 피막 단백질의 돌출 도메인을 수득하였다.
실시예 4. 일본 뇌염 바이러스 피막 단백질 돌출 도메인의 정제
6개의 히스티딘이 표지된 일본 뇌염 바이러스 피막 단백질 돌출 도메인의 Ni-NTA를 이용한 친화 크로마토그래피법 정제를 위하여, 컬럼 평형화 완충 용액인 pH 7.5의 20 mM Tris-HCl 용액과 0.2 M NaCl 용액으로 3일 동안 투석(dialysis) 과정을 수행하였다. 투석 후, 상기 피막 단백질 돌출 도메인이 포함된 상층액을 Ni-NTA(nickel nitrilotriacetic acid) 아가로오스(agarose) 컬럼에 천천히 결합시켰다. 이후, 상기와 동일한 완충 용액으로 컬럼을 세척하고, 0.5 M 이미다졸(imidazole)이 포함된 완충 용액을 이용하여 선형농도구배법으로 단백질을 용출하면서 분획을 모았다. 이후, SDS-PAGE를 통하여 용출된 단백질을 확인하였다. 그 결과를 도 4a 및 도 4b에 나타내었다.
상기 확인된 단백질은 농축기(Vivaspin, MWCO 30KDa)를 통하여 5 ml까지 농축한 후, 2배 농도의 PBS (Phosphate buffered saline) 완충 용액으로 평형화시킨 Superdex 200 (GE Healthcare, 16X600) 젤 필트레이션(Gel Filtration) 크로마토그래피법을 이용하여 최종 정제하였다. 상기 정제된 단백질은 Bradford assay (Bio-rad사)법으로 농도를 정량한 후 1 mg/ml로 농축하여 표준 단백질인 1 mg/ml의 소혈청 알부민과 SDS-PAGE 상에서 비교하였다. 그 결과를 도 4c 내지 도 4d에 나타내었다. 또한, 상기 정제된 일본 뇌염 바이러스 피막 단백질 돌출도메인의 발현을 SDS 상에서 확인한 것을 도 4e에 나타내었다. 이후, 상기 정제된 단백질을 분주하여 -80℃에서 실험 전까지 보관하였다.
도 4a 내지 도 4e에 나타난 바와 같이, 상기 실시예 1에서 제작한 일본 뇌염 바이러스 피막 단백질 돌출 도메인은 Ni-NTA 친화성 크로마토그래피 및 젤 필트레이션 크로마토그래피 기법에 의한 정제 과정을 통해 순도 98% 이상 정제되었다.
실시예 5. 항체 생성 실험
상기 실시예 4의 정제 과정을 통해 수득된 일본 뇌염 바이러스 피막 단백질의 돌출 도메인의 동형이량체 단백질 항원에 대한 항체 생성 실험을 진행하였다. 먼저, 상기 동형이량체 단백질 항원을 마우스에 주사하기 전, pre-immune serum을 채취하여 음성 대조군으로 사용하였다. 1차 면역(primary immunization)은 항원 200 ㎍과 혼합하여 복강(intraperitoneal, IP) 주사하였고, 2주 후 불완전한 프로이드 어주번트(incomplete freund's adjuvant, IFA)(sigma)와 혼합하여 1차 부스팅(boosting)을 진행하였다. 1주 후, 1차 혈액을 채취하여 ELISA 테스트를 진행하였다. 1주 간격으로 부스팅과 블리딩을 진행하였다. 3차 부스팅을 진행하고 1주 후, 마우스의 심장으로부터 혈액을 채취하고 최종 혈청을 분리하여 최종 ELISA 테스트를 진행하였다. ELISA 테스트 시 항원은 100 ng/well로 코팅하여 사용하였다. 또한, 각 부스팅 시기별로 채혈하여 보관한 혈청은 0.2% skim milk를 포함한 0.05% tween PBS용액(이하 0.2% skim milk)을 이용하여 일정 비율 희석하여 사용하였으며, 1:10,000으로 희석한 Anti-mouse IgG-HRP(ABC5001)를 이용하여 항원특이적 항체를 검출하였다.
실험예 1. 일본 뇌염 바이러스 피막 단백질의 돌출 도메인의 동형이량체 단백질 항원의 면역 항체 형성 실험
1.1. 항체 형성 실험
일본 뇌염 바이러스 피막 단백질의 돌출 도메인의 동형이량체 단백질 항원의 면역 항체 형성을 확인하기 위하여, 상기 실시예 4에서 정제된 일본 뇌염 바이러스 피막 단백질의 돌출 도메인의 동형이량체 단백질 항원(JEP401)을 4마리의 마우스에 면역하였다. 4주 후, 각 마우스로부터 최종 혈청을 분리하여 ELISA 테스트를 진행하였다. ELISA 테스트 시, 상기 항원은 웰 당 100 ng을 사용하였으며, 상기 분리한 면역 혈청은 1X PBS로 1:100 내지 1:100,000 비율로 희석하였다. 또한, 2차 확인을 위하여 항-마우스 IgG-HRP (ABC5001)을 사용하였으며, 405 nm의 흡광도(Optical Density, OD)에서 발색을 검출하여 비교하였다. 이를 표 1 및 도 5에 나타내었다.
Sample Dilution JEP401
Factor #1 #2 #3 #4
Pre-serum 1:100 0.090 0.082 0.089 0.094


Test serum
1:100 2.603 2.570 2.666 2.676
1:1,000 2.475 2.371 2.231 2.384
1:5,000 1.730 1.532 0.949 1.165
1:10,000 1.256 1.047 0.605 0.903
1:50,000 0.422 0.344 0.188 0.310
1:100,000 0.289 0.250 0.149 0.249
표 1 및 도 5에 나타난 바와 같이, 일본 뇌염 바이러스 피막 단백질의 돌출 도메인의 동형이량체 단백질 항원을 주입한 마우스에서 항체 농도가 증가하였다. 이를 통해, 일본 뇌염 바이러스 피막 단백질의 돌출 도메인의 동형이량체 단백질 항원을 개체에 주입할 경우, 이에 대한 면역 항체가 잘 생성되어 백신으로써 효능이 있음을 알 수 있었다.
1.2. 일본 뇌염 바이러스 피막 단백질의 돌출 도메인의 동형이량체 단백질 항원의 면역 횟수에 따른 항체 형성 차이 확인
일본 뇌염 바이러스 피막 단백질의 돌출 도메인의 동형이량체 단백질 항원의 면역 횟수에 따른 항체 형성 차이를 확인하기 위하여, 상기 실시예 4에서 정제된 일본 뇌염 바이러스 피막 단백질의 돌출 도메인의 동형이량체 단백질 항원을 2마리의 마우스에게 각각 2번 및 3번 면역하였다. 이후, ELISA 기법을 이용하여 상기 각 마우스의 혈청에 존재하는 일본 뇌염 바이러스의 항체를 측정하였다. 그 결과를 도 6에 나타내었다.
도 6에 나타난 바와 같이, 상기 항원을 3번 면역한 마우스(JEVx3)의 혈액 속 항체의 농도는 상기 항원을 2번 면역한 마우스(JEVx2)에 비해 높게 나타났다. 이는 상기 돌출 도메인 항원의 투여 횟수가 증가할수록, 이의 항체 형성이 증가함을 의미한다.
1.3. 항체 형성 클론 세포 확인
일본 뇌염 바이러스 피막 단백질의 돌출 도메인의 동형이량체 단백질 항원의 항체를 형성하는 클론 세포를 확인하기 위해, 상기 실험예 1.1의 방법에 따라 일본 뇌염 바이러스 피막 단백질의 돌출 도메인의 동형이량체 단백질 항원의 단클론 항체를 제작하여 ELISA 테스트 및 아이소타이핑 스크리닝(isotyping screening)을 진행하였다. 이를 표 2 및 표 3에 나타내었다.
Clone No. OD
1A8 2.011
1G1 1.836
1H4 2.015
4E12 1.825
5D8 1.754
1A8 1G1 1H4 4E12 5D8
IgG1 0.060 0.048 0.047 0.047 1.807
IgG2a 2.095 0.041 0.064 0.041 0.048
IgG2b 0.067 1.564 1.652 1.302 0.082
IgG3 0.046 0.041 0.041 0.041 0.041
IgA 0.041 0.040 0.041 0.039 0.040
IgM 0.040 0.041 0.040 0.040 0.041
Kappa 0.673 0.386 0.579 0.354 0.694
Lambda 0.044 0.043 0.044 0.041 0.043
실험예 2. 곤충세포 유래 일본 뇌염 바이러스 피막 단백질의 돌출 도메인의 동형이량체 단백질 항원의 특이도 확인
본 발명에 따른 곤충세포 유래 일본 뇌염 바이러스 피막 단백질의 돌출 도메인의 동형이량체 단백질 항원과 대장균 발현 시스템 유래 항원의 특이도를 비교하기 위하여, 고농도의 혈청(1:25)과 항원(200, 400, 800 ng/well)을 사용하여 ELISA 테스트를 실시하였다. 그 결과를 도 7에 나타내었다.
도 7에 나타난 바와 같이, 대장균 발현 시스템 유래 항원(LysRS-JEV-E)에서는 항원-항체 반응이 거의 검출되지 않았다. 반면, 곤충세포 유래 일본 뇌염 바이러스 피막 단백질의 돌출 도메인의 동형이량체 단백질 항원(JEV-E)에서는 항원-항체 반응이 높게 나타났다. 이는, 본 발명의 곤충세포 유래 항원이 대장균 시스템 유래 항원보다 민감도 및 특이도가 월등히 우수함을 의미한다.
실험예 3: 일본 뇌염 바이러스 피막 단백질의 돌출 도메인의 동형이량체 백신 효능 평가
본 발명에 따른 동형이량체 단백질이 실제 혈청 내 항체가 측정에 적용될 수 있는지 여부를 확인하기 위해, 일본 뇌염 양성 마우스 혈청을 제작하여 확보하였다. ELISA 기법에 대한 정제 단백의 효용성 및 실험기법의 민감도 및 정확도를 비교하기 위하여, 지금까지 일본 뇌염 면역원성 평가의 최적 표준으로 이용되어온 PRNT(plaque reduction neutralization test) 기법의 SOP (Shirley H.L et al., Journal of Virological Methods, 2001)를 구축하였다. 마우스 유래 일본 뇌염 양성 항혈청을 이용하여, 새로이 개발된 ELISA 기법과 PRNT 검증법과의 비교분석을 수행하였다. 그 결과를 표 4, 도 8a, 및 도 8b에 나타내었다.
Immunizing virus Route of immunization Immunizing dose(TCID 50 ) Neutralizing antibody
NC - - -

SA14-14-2
s.l.(+cholera toxin) 2.5 x 105 < 160
i.m. 2.5 x 105 < 640

MVA(Vjh6)
s.l.(+cholera toxin) 1.0 x 106 < 160
i.m. 1.0 x 106 < 320
이때, 표 4는 항원과 면역증강제를 설하투여와 근육주사방법으로 투여하여 얻은 혈청을 이용하여 TCID50값과 항체의 중화능력을 titer로 나타난 값이다.
도 8a는 상기 실험에서 얻은 혈청을 이용하여 ELISA를 통해 각 샘플의 항JEV혈청의 양을 측정한 값으로서, 혈청을 1:100에서 1:10,000까지 순차적으로 희석하여 혈청속에 있는 항체의 정도를 측정한 것이다.
도 8b는 도 8a와 같은 혈청 샘플을 이용하여 그 속에 있는 JEV항체의 농도를 마우스 표준 IgG를 이용하여 정량화 한 값이다. 두 가지 면역 증강제 SA-14-2와 MAV를 비교하였을 때 MAV가 더 좋은 효과를 보이는 것은 알 수 있었고 설하(sublingual, s.l.) 백신보다 근육(intramuscular, i.m.)으로 백신을 투여한 경우가 더 효과가 좋으나 MAV의 경우 설하백신도 충분히 좋은 백신의 효과를 나타내도록 면역증강제로서의 역할을 한다는 것을 정량적으로 알 수 있었다. 이 실험은 혈액 속의 JEV항체가를 측정할 수 있을 뿐만 아니라 백신개발이나 치료제 개발과정에서도 진단기법으로 쉽게 사용할 수 있을 것으로 보인다.
표 4, 도 8a, 및 도 8b에 나타난 바와 같이, JEV 백신 후보물질을 투여한 마우스의 혈청샘플에서 유의미한 값의 anti-JEV IgG가 측정되었고, 이 값은 TCID50 및 PRNT 분석을 통해 도출된 neutralizing antibody 측정값과 같은 양상을 나타내었다. 이는 새로이 확립된 ELISA 기반 항체가 측정 기법이 일본 뇌염 표준 항체가 측정법으로 사용 가능한 수준의 신뢰도를 가짐을 의미한다. 특히, 본 실험에서 수행한 ELISA 기법은 기존의 PRNT 기법에 비해 실험과정이 단순하고 살아있는 바이러스를 사용하지 않아 안전할 뿐 아니라 특별한 실험시설을 갖춘 곳에서 진행하지 않아도 일본뇌염 바이러스의 항체의 정량적 값을 도출할 수 있어, 연구 및 임상에서 활용성이 매우 높을 것으로 기대된다.
<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology Industry-Academic Cooperation Foundation, Yonsei University <120> PROTEIN COMPRISING ECTODOMAIN OF JAPANESE ENCEPHALITIS VIRUS ENVELOPE PROTEINS, HOMODIMER THEREOF, AND USE THEREOF <130> FPD/201708-0036 <160> 11 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1500 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid sequence for Japanese encephalitis virus envelop protein (strain: Nakayama) <400> 1 ttcaactgtc tgggaatggg caatcgtgac ttcatagaag gagccagtgg agccacttgg 60 gtggacttgg tgctagaagg agacagctgc ttgacaatta tggcaaacga caaaccaaca 120 ttggacgtcc gcatgatcaa catcgaagct gtccaacttg ctgaggtcag aagttactgc 180 tatcatgctt cagtcactga catttcgacg gtggctcggt gccccacgac tggagaagct 240 cacaacaaga agcgagctga tagtagctat gtgtgcaaac aaggcttcac tgatcgtggg 300 tggggcaacg gatgtggact tttcgggaag ggaagcattg acacatgtgc aaaattctcc 360 tgcaccagta aggcgattgg gagaacaatc cagccagaaa acatcaaata cgaagttggc 420 atttttgtgc atggaaccac cacttcggaa aaccatggga 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tacagtaaca cccaatgctc cttcgataac cctcaaactt 540 ggtgactacg gagaagtcac actggactgt gagccaagga gtggactaaa cactgaagcg 600 ttttacgtca tgaccgtggg gtcaaagtca tttttggtcc acagggaatg gtttcatgat 660 ctcgctctcc cttggacgcc cccttcgagc acagcgtgga gaaacagaga actcctcatg 720 gaatttgaag aggcgcacgc cacaaaacag tccgttgttg ctcttgggtc acaggaagga 780 ggcctccatc aggcgttggc aggagccatc gtggtggagt actcaaactc agtgaagtta 840 acatcaggcc acctaaaatg caggctgaga atggacaaac tggctctgaa aggcacaacc 900 tatggcatgt gcacagaaaa attctcgttc gcgaaaaatc cggcggacac tggtcacgga 960 acagttgtca ttgaactttc ctactctggg agtgatggcc cttgcaaaat tccgattgtc 1020 tccgttgcga gcctcaatga catgaccccc gtcgggcggc tggtgacagt gaaccccttc 1080 gtcgcgactt ccagcgccaa ctcaaaggtg ctagtcgaga tggaaccccc cttcggagac 1140 tcctacatcg tagttggaag gggagacaag cagattaacc accattggca caaggctgga 1200 agc 1203 <210> 3 <211> 411 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence for ectodomain of Japanese encephalitis virus envelop protein (strain: Nakayama) <400> 3 Gly Ser Phe Asn Cys Leu Gly Met Gly Asn Arg Asp Phe Ile Glu Gly 1 5 10 15 Ala Ser Gly Ala Thr Trp Val Asp Leu Val Leu Glu Gly Asp Ser Cys 20 25 30 Leu Thr Ile Met Ala Asn Asp Lys Pro Thr Leu Asp Val Arg Met Ile 35 40 45 Asn Ile Glu Ala Val Gln Leu Ala Glu Val Arg Ser Tyr Cys Tyr His 50 55 60 Ala Ser Val Thr Asp Ile Ser Thr Val Ala Arg Cys Pro Thr Thr Gly 65 70 75 80 Glu Ala His Asn Lys Lys Arg Ala Asp Ser Ser Tyr Val Cys Lys Gln 85 90 95 Gly Phe Thr Asp Arg Gly Trp Gly Asn Gly Cys Gly Leu Phe Gly Lys 100 105 110 Gly Ser Ile Asp Thr Cys Ala Lys Phe Ser Cys Thr Ser Lys Ala Ile 115 120 125 Gly Arg Thr Ile Gln Pro Glu Asn Ile Lys Tyr Glu Val Gly Ile Phe 130 135 140 Val His Gly Thr Thr Thr Ser Glu Asn His Gly Asn Tyr Ser Ala Gln 145 150 155 160 Val Gly Ala Ser Gln Ala Ala Lys Phe Thr Val Thr Pro Asn Ala Pro 165 170 175 Ser Ile Thr Leu Lys Leu Gly Asp Tyr Gly Glu Val Thr Leu Asp Cys 180 185 190 Glu Pro Arg Ser Gly Leu Asn Thr Glu Ala Phe Tyr Val Met Thr Val 195 200 205 Gly Ser Lys Ser Phe Leu Val His Arg Glu Trp Phe His Asp Leu Ala 210 215 220 Leu Pro Trp Thr Pro Pro Ser Ser Thr Ala Trp Arg Asn Arg Glu Leu 225 230 235 240 Leu Met Glu Phe Glu Glu Ala His Ala Thr Lys Gln Ser Val Val Ala 245 250 255 Leu Gly Ser Gln Glu Gly Gly Leu His Gln Ala Leu Ala Gly Ala Ile 260 265 270 Val Val Glu Tyr Ser Asn Ser Val Lys Leu Thr Ser Gly His Leu Lys 275 280 285 Cys Arg Leu Arg Met Asp Lys Leu Ala Leu Lys Gly Thr Thr Tyr Gly 290 295 300 Met Cys Thr Glu Lys Phe Ser Phe Ala Lys Asn Pro Ala Asp Thr Gly 305 310 315 320 His Gly Thr Val Val Ile Glu Leu Ser Tyr Ser Gly Ser Asp Gly Pro 325 330 335 Cys Lys Ile Pro Ile Val Ser Val Ala Ser Leu Asn Asp Met Thr Pro 340 345 350 Val Gly Arg Leu Val Thr Val Asn Pro Phe Val Ala Thr Ser Ser Ala 355 360 365 Asn Ser Lys Val Leu Val Glu Met Glu Pro Pro Phe Gly Asp Ser Tyr 370 375 380 Ile Val Val Gly Arg Gly Asp Lys Gln Ile Asn His His Trp His Lys 385 390 395 400 Ala Gly Ser Leu Glu His His His His His His 405 410 <210> 4 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Binding site on ectodomain of Japanese encephalitis virus envelop protein <400> 4 Phe Asn Cys Leu Gly Met Gly Asn Arg Asp 1 5 10 <210> 5 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Binding site on ectodomain of Japanese encephalitis virus envelop protein <400> 5 Val Leu Glu Gly Asp Ser Cys Leu Thr 1 5 <210> 6 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Binding site on ectodomain of Japanese encephalitis virus envelop protein <400> 6 His Ala Ser Val Thr Asp Ile Ser 1 5 <210> 7 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Binding site on ectodomain of Japanese encephalitis virus envelop protein <400> 7 Gly Trp Gly Asn Gly Cys Gly Leu 1 5 <210> 8 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Binding site on ectodomain of Japanese encephalitis virus envelop protein <400> 8 Thr Thr Thr Ser Glu Asn His Gly Asn 1 5 <210> 9 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Binding site on ectodomain of Japanese encephalitis virus envelop protein <400> 9 Ala His Ala Thr Lys Gln Ser Val Val Ala 1 5 10 <210> 10 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Binding site on ectodomain of Japanese encephalitis virus envelop protein <400> 10 Gln Glu Gly Gly Leu His Gln Ala Leu Ala Gly Ala Ile Val Val Glu 1 5 10 15 Tyr Ser <210> 11 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Binding site on ectodomain of Japanese encephalitis virus envelop <400> 11 Asp Thr Gly His Gly Thr Val 1 5

Claims (16)

  1. 곤충세포에서 제조된, 일본 뇌염 바이러스(japanese encephalitis virus, JEV) 피막 단백질 돌출 도메인으로 이루어진 단백질로서, 상기 돌출 도메인은 서열번호 3의 3~403번 위치의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는, 단백질.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 돌출 도메인이 FNCLGMGNRD(서열번호 4), VLEGDSCLT(서열번호 5), HASVTDIS(서열번호 6), GWGNGCGL(서열번호 7), TTTSENHGN(서열번호 8), AHATKQSVVA(서열번호 9), QEGGLHQALAGAIVVEYS(서열번호 10), 및 DTGHGTV(서열번호 11)의 아미노산 서열을 포함하는 것인, 단백질.
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서,
    상기 서열번호 3의 3~403번 위치의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드는 서열번호 2의 염기서열에 의해 코딩되는 것을 특징으로 하는, 단백질.
  5. 제1항의 단백질을 유효성분으로 포함하는 일본 뇌염 바이러스 감염에 의한 질환 예방 또는 치료용 백신.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 질환은 뇌염, 무균성수막염, 열성두통 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 백신.
  7. 제1항의 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 단편.
  8. 제1항의 단백질을 포함하는 일본 뇌염 바이러스 감염 진단용 키트.
  9. 제7항의 항체를 포함하는 일본 뇌염 바이러스 감염 진단용 키트.
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 삭제
  13. 삭제
  14. 삭제
  15. 삭제
  16. (1) 제1항의 단백질을 항원으로서 실험동물에 주입하여 면역반응을 유도하는 단계; 및
    (2) 상기 실험동물로부터 항체를 회수하는 단계를 포함하는 일본 뇌염 바이러스 항체 제조 방법.
KR1020170157475A 2017-11-23 2017-11-23 일본 뇌염 바이러스 피막 단백질의 돌출 도메인을 포함하는 단백질, 이의 동형이량체, 및 이의 용도 KR102039059B1 (ko)

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