KR102484312B1 - 고효능 사스 코로나바이러스 2 항원 및 이를 포함하는 백신 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 면역세포 활성 LRRC24 단백질 유래 세포막 투과 도메인 펩타이드를 융합시켜서 사스 코로나바이러스 2에 대해 더 높은 면역원성을 나타내는 면역원을 발굴하였고, 실제 동물실험에서도 중화항체가 더 잘 형성되었음을 확인하였다. 재조합 면역원 접종 후 사스 코로나바이러스 2를 감염하는 면역 후 공격시험에서도 모든 마우스에서 우수한 방어면역을 유도하는 것을 확인하였다. 또한, 독성시험에서도 독성이 나타나지 않는 것을 확인하였다. 이러한 우수한 결과를 보여주는 재조합 면역원을 이용하여 치명적인 위험을 나타내는 사스 코로나바이러스 2에 대한 예방을 위한 백신으로 개발할 수 있을 것이다.
Description
본 발명은 코로나-19 바이러스 감염증 (COVID-19, novel coronavirus, 2019-nCoV)을 유발하는 사스 코로나바이러스 2 (Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2, SARS-CoV-2)를 제어하기 위한 백신 제작 기술이다. 본 기술은 고효능 백신을 제작하기 위하여, 인간 LRRC24 단백질 유래 세포막 투과 도메인 (LRRC24P)와 융합된 사스 코로나바이러스 2 (SARS-CoV-2) 수용체 결합 부위 (Receptor-binding domain, RBD)를 항원으로 하는 재조합 항원 및 이를 포함하는 백신 조성물에 관한 것이다.
사스 코로나바이러스 2 (Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2, SARS-CoV-2)는 약 3만개의 염기쌍의 positive-strand RNA의 genome을 가진 외피로 둘러 쌓여 있는 바이러스이다. 2019년 12월부터 중국 우한에서 최초로 보고된 후, 전세계적으로 감염증 환자가 폭발적으로 증가하고 있다 (비특허문헌1). 바이러스 유전자 서열을 분석한 결과 중증급성호흡기증후군 바이러스 (SARS, 사스바이러스)와 약 79%, 중동호흡기증후군 바이러스 (MERS, 메르스바이러스)와는 약 50%의 유사성을 보이는 바이러스이다 (비특허문헌1). 코로나바이러스는 바이러스 표면에 스파이크 단백질을 발현하여 리셉터와 결합 후 숙주세포에 감염을 유도한다. 이러한 스파이크단백질 안에 리셉터에 결합하는 리셉터 바인딩 도메인 (Receptor Binding domain, RBD)이 존재하며, 비특허문헌 2에서는 다양한 코로나바이러스에서 핵심 subdomain의 구조가 매우 유사하다고 보고되어 있다. 이러한 리셉터 바인딩 도메인의 유사성을 기반으로 하여 사스 코로나바이러스 2 (SARS-CoV-2)의 스파이크 단백질에 존재하는 리셉터 바인딩 도메인을 확인할 수 있다. 메르스바이러스 혹은 사스 코로나바이러스의 경우 리셉터 바인딩 도메인을 이용한 재조합 백신 연구가 진행되고 있다 (비특허문헌3). 리셉터 결합 도메인에 대한 중화항체를 유발하여 바이러스가 세포에 부착하는 과정을 억제함으로서 백신으로서 작용 가능하다. 본 발명자는 보고된 사스 코로나바이러스 리셉터 바인딩 도메인 (비특허문헌 4)을 바탕으로 사스 코로나바이러스 2 (SARS-CoV-2)의 스파이크 단백질과 단백질 서열 유사성을 비교하여 사스 코로나바이러스 2 (SARS-CoV-2)의 리셉터 바인딩 도메인을 선별하였다. 리셉터 바인딩 도메인 단백질을 진핵세포에서 발현하기 위하여 단백질을 발현하는 유전자 서열의 codon을 optimization 하여 유전자 합성하였다. 또한, 세포 밖으로 단백질을 배출하도록 하기 위하여 사스 코로나바이러스 2 (SARS-CoV-2)의 스파이크 단백질의 signal sequence를 SignalIP 라는 프로그램을 이용하여 확인하였다 (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/). 진핵세포 발현 벡터에 클로닝 한 후 진핵세포에서 항원 발현이 잘 이루어지고, 항원의 세포 밖으로의 배출이 잘 이루어짐을 확인하였다
인간 LRRC24 단백질 유래 세포막 투과 도메인 (LRRC24P)는 융합된 단백질을 세포 안으로 투과 시킬 수 있는 특징이 있다. 이를 재조합 면역원에 융합시킬 경우 기존의 중화 항체를 생성시키는 능력과 함께 면역세포 안으로 면역원을 투과시켜서 면역 세포 활성화가 가능하다. 이를 통해서 재조합 항원의 백신 능력을 향상시켜 고효능 백신 제작이 가능하다.
Lancet (2020) 395(10224):565-574
Nature Communucations (2017) 8:15216
Journal of Infection (2013) 67(4): 348-350
Science (2005) 309(5742): 1864-1868
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 인간 LRRC24 (Leucine rich repeat containing 24) 단백질 유래 폴리펩티드를 포함하는 세포막 투과 도메인; 및 사스 코로나바이러스 2(SARS-CoV2) 항원 또는 그 단편;을 포함하는 재조합 항원 또는 이를 포함하는 백신 조성물에 대한 효과를 확인하여 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 인간 LRRC24 (Leucine rich repeat containing 24) 단백질 유래 서열번호 1 내지 22중 어느 하나의 폴리펩티드를 포함하는 세포막 투과 도메인; 및 사스 코로나바이러스 2(SARS-CoV2) 항원 또는 그 단편;을 포함하는 재조합 항원을 제공한다.
또한, 본 발명은 인간 LRRC24 (Leucine rich repeat containing 24) 단백질 유래 서열번호 1 내지 22중 어느 하나의 폴리펩티드를 포함하는 세포막 투과 도메인; 및 사스 코로나바이러스 2(SARS-CoV2) 항원 또는 그 단편;을 포함하는 재조합 항원을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 유전자 컨스트럭트 (gene construct)를 제공한다.
또 다른 예로, 본 발명은 인간 LRRC24 (Leucine rich repeat containing 24) 단백질 유래 서열번호 1 내지 22중 어느 하나의 폴리펩티드를 포함하는 세포막 투과 도메인; 및 사스 코로나바이러스 2(SARS-CoV2) 항원 또는 그 단편;을 포함하는 재조합 항원을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 유전자 컨스트럭트를 포함하는 재조합 벡터을 제공한다.
본 발명은 인간 LRRC24 (Leucine rich repeat containing 24) 단백질 유래 서열번호 1 내지 22중 어느 하나의 폴리펩티드를 포함하는 세포막 투과 도메인; 및 사스 코로나바이러스 2(SARS-CoV2) 항원 또는 그 단편;을 포함하는 재조합 항원을 포함하는 백신 조성물을 제공한다.
또 다른 예로, 본 발명은 사스 코로나바이러스 2(SARS-CoV2) 항원 또는 그 단편의 유전자 또는 아미노산 서열을 확인하는 단계; 인간 LRRC24 (Leucine rich repeat containing 24) 단백질 유래 서열번호 1 내지 22중 어느 하나의 폴리펩티드를 포함하는 세포막 투과 도메인을 결합시키는 단계; 인간세포에서 면역원을 과발현하는 시스템에서 항원과 세포막 투과 도메인이 융합된 재조합 항원을 제조하는 단계; 및 재조합 항원을 정제하는 단계;를 포함하는 사스 코로나바이러스 2 재조합 항원의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 인간 LRRC24 (Leucine rich repeat containing 24) 단백질 유래 서열번호 1 내지 22중 어느 하나의 폴리펩티드를 포함하는 세포막 투과 도메인; 및 사스 코로나바이러스 2(SARS-CoV2) 항원 또는 그 단편;을 포함하는 재조합 항원을 포함하는 백신 조성물 및 사용설명서를 포함하는 사스 코로나바이러스 2 감염증 예방 또는 치료용 키트를 제공한다.
본 발명에 따른 인간 LRRC24 단백질 유래 세포막 투과 도메인 (LRRC24P)와 융합된 사스 코로나바이러스 2 (SARS-CoV-2) 리셉터 결합 도메인 (RBD) 재조합 항원은 사스 코로나바이러스 2 (SARS-CoV-2) 감염증을 효과적으로 억제할 수 있으며, 고효능 신규 재조합 백신을 생산하는데 유용하게 사용할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 구현 예에 따른 실시예 1의 사스 코로나바이러스 2 (SARS-CoV-2) 리셉터 바인딩 도메인과 사스 코로나바이러스 리셉터 바인딩 도메인의 아미노산 서열 비교 결과 (A) 와 사스 코로나바이러스 2 (SARS-CoV-2) 시그널 펩타이드 서열 분석 결과 (B)를 나타낸 것이다. 그리고, 인간 LRRC24 단백질 유래의 세포막 투과 도메인 (LRRC24P)과 융합된 재조합 사스 코로나바이러스 2 항원 구조의 모식도 (C)를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일 구현 예에 따른 실시예 1의 2종 사스 코로나바이러스 2 (SARS-CoV-2) 항원을 동물세포를 이용하여 대량으로 정제한 후, Coomassie blue staining (A)과 사스 코로나바이러스 2 (SARS-CoV-2) spike 단백질에 특이적인 항체를 이용한 Western blot analaysis 결과 (B)를 통해 정제된 항원을 검증한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 일 구현 예에 따른 실시예 2의 재조합 사스 코로나바이러스 2 (SARS-CoV-2) 항원을 C57/BL6 마우스에 접종하고, 중화항체 생성능 평가를 위해 혈청을 얻는 과정을 나타낸 모식도 (A)와 혈청 내 생성된 사스 코로나바이러스 2 (SARS-CoV-2) 중화항체가를 Focus reduction neutralization test (FRNT)를 통해 확인한 결과 (B, C) 를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 일 구현 예에 따른 실시예 2의 재조합 사스 코로나바이러스 2 (SARS-CoV-2) 항원을 C57/BL6 마우스에 접종하고, 항원 특이적 면역글로불린 G 생성능 평가를 위해 혈청을 얻는 과정을 나타낸 모식도 (A)와 혈청 내 생성된 사스 코로나바이러스 2 (SARS-CoV-2) RBD 특이적 immunoglobulin G 생성을 ELISA assay를 통해 확인한 결과 (B) 를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일 구현 예에 따른 실시예 1의 2종 사스 코로나바이러스 2 (SARS-CoV-2) 항원을 동물세포를 이용하여 대량으로 정제한 후, Coomassie blue staining (A)과 사스 코로나바이러스 2 (SARS-CoV-2) spike 단백질에 특이적인 항체를 이용한 Western blot analaysis 결과 (B)를 통해 정제된 항원을 검증한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 일 구현 예에 따른 실시예 2의 재조합 사스 코로나바이러스 2 (SARS-CoV-2) 항원을 C57/BL6 마우스에 접종하고, 중화항체 생성능 평가를 위해 혈청을 얻는 과정을 나타낸 모식도 (A)와 혈청 내 생성된 사스 코로나바이러스 2 (SARS-CoV-2) 중화항체가를 Focus reduction neutralization test (FRNT)를 통해 확인한 결과 (B, C) 를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 일 구현 예에 따른 실시예 2의 재조합 사스 코로나바이러스 2 (SARS-CoV-2) 항원을 C57/BL6 마우스에 접종하고, 항원 특이적 면역글로불린 G 생성능 평가를 위해 혈청을 얻는 과정을 나타낸 모식도 (A)와 혈청 내 생성된 사스 코로나바이러스 2 (SARS-CoV-2) RBD 특이적 immunoglobulin G 생성을 ELISA assay를 통해 확인한 결과 (B) 를 나타낸 것이다.
이하, 본 발명의 바람직한 구현예에 대하여 상세히 설명한다. 또한, 하기의 설명에서는 구체적인 구성요소 등과 같은 많은 특정 사항들이 도시되어 있는데, 이는 본 발명의 보다 전반적인 이해를 돕기 위해서 제공된 것일 뿐 이러한 특정 사항들 없이도 본 발명이 실시될 수 있음은 이 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게는 자명하다 할 것이다. 그리고, 본 발명을 설명함에 있어서, 관련된 공지 기능 혹은 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.
본 발명은 인간 LRRC24 (Leucine rich repeat containing 24) 단백질 유래 서열번호 1 내지 22중 어느 하나의 폴리펩티드를 포함하는 세포막 투과 도메인; 및 사스 코로나바이러스 2(SARS-CoV2) 항원 또는 그 단편;을 포함하는 재조합 항원을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 따른 인간 LRRC24 (Leucine rich repeat containing 24) 단백질 유래 서열번호 1 내지 22중 어느 하나의 폴리펩티드를 포함하는 세포막 투과 도메인 국내 출원번호 제10-2019-0144779호와 동일한 방법으로 수득한 것이다
본 발명의 일 구현예에 따른 사스 코로나바이러스 2 항원은 사스 코로나바이러스 2에 포함되는 모든 항원성 성분을 의미하는 것으로, 바람직하게는 불활성화된 전체 사스 코로나바이러스 2 항원, 스파이크 단백질, 뉴클레오단백질(nucleoprotein), 엔벨로프(envelope), S1 도메인, S2 도메인, 수용체 결합 도메인(RBD), N 말단, C 말단 및 그 단편으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 포함하는 재조합 항원일 수 있고, 더욱 바람직하게는 수용체 결합 도메인(RBD)일 수 있으며, 더더욱 바람직하게는 서열번호 24 또는 그 단편일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현예에 따른 재조합 항원은 인간 LRRC24 (Leucine rich repeat containing 24) 단백질 유래 서열번호 1 내지 22중 어느 하나의 폴리펩티드를 포함하는 세포막 투과 도메인; 및 사스 코로나바이러스 2(SARS-CoV2) 항원 또는 그 단편이 조합된 모든 경우의 수를 포함할 수 있고, 바람직하게는 서열번호 26 내지 47으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 재조합 항원일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 인간 LRRC24 (Leucine rich repeat containing 24) 단백질 유래 서열번호 1 내지 22중 어느 하나의 폴리펩티드를 포함하는 세포막 투과 도메인; 및 사스 코로나바이러스 2(SARS-CoV2) 항원 또는 그 단편;을 포함하는 재조합 항원을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 유전자 컨스트럭트 (gene construct)를 제공한다.
본 발명의 유전자 컨스트럭트에서 뉴클레오타이드 서열은 적합한 발현 컨스트럭트(expression construct) 내에 존재하는 것이 바람직하다. 상기 발현 컨스트럭트에서, 뉴클레오타이드 서열은 프로모터에 작동적으로 연결되는 것이 바람직하다. 본 명세서에서, 용어 "작동적으로 연결된"은 핵산 발현 조절 서열(예: 프로모터, 시그널 서열, 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 해독을 조절하게 된다.
또 다른 예로, 본 발명은 인간 LRRC24 (Leucine rich repeat containing 24) 단백질 유래 서열번호 1 내지 22중 어느 하나의 폴리펩티드를 포함하는 세포막 투과 도메인; 및 사스 코로나바이러스 2(SARS-CoV2) 항원 또는 그 단편;을 포함하는 재조합 항원을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 유전자 컨스트럭트를 포함하는 재조합 벡터을 제공한다.
본 발명은 인간 LRRC24 (Leucine rich repeat containing 24) 단백질 유래 서열번호 1 내지 22중 어느 하나의 폴리펩티드를 포함하는 세포막 투과 도메인; 및 사스 코로나바이러스 2(SARS-CoV2) 항원 또는 그 단편;을 포함하는 재조합 항원을 포함하는 백신 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 백신 조성물은 사스 코로나바이러스 2 특이적 중화능력을 갖는 것을 특징으로 하고, 사스 코로나바이러스 2 감염증 예방 또는 치료용인 것을 특징으로 하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 백신 조성물은 유효성분 이외에 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본 발명의 백신 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 백신 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
또한, 본 발명의 백신 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 백신 조성물은 포유동물에 투여시, 활성 성분의 신속한 방출, 또는 지속 또는 지연된 방출이 가능하도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있다. 제형은 분말, 과립, 정제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀, 멸균 주사용액, 멸균 분말 형태를 포함한다. 그러나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 백신 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 한편, 본 발명의 약제학적 조성물의 투여량은 바람직하게는 1일 당 0.001-1000 mg/kg(체중)이나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 백신 조성물은 인간 또는 인간을 제외한 동물에 주입되어 항원에 대한 항체 생성률을 높일 수 있으며, 상기 주입은 피하주사, 근육내 주사, 피하내 주사, 복막내 주사, 비강투여, 구강투여, 경피투여 및 경구 투여로 구성된 군에서 선택된 어느 하나의 방법으로 수행될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따른 백신 조성물은 효능의 증가를 위해 면역보조제, 면역증강제 또는 어쥬번트를 추가적으로 포함할 수 있다. 백신 면역보조제는 작용기전에 따라 크게 항원의 전달체, 면역증강제, 면역반응을 자극하는 동시에 항원에 대한 매트릭스로서 작용하는 것 등의 세 가지 종류로 구별된다. 백신 면역보조제를 효과적으로 사용하면 (1) 재조합 항원의 면역원성을 증가시키고, (2) 항원 투여량을 줄이거나 면역화 횟수를 줄일 수 있으며, (3) 면역력이 약한 유아와 노인에게서 면역원성을 향상시키는 등의 다양한 효과를 얻을 수 있다. 백신 면역보조제로는 이 분야에 알려진 면역보조제 성분을 사용할 수 있고, 바람직하게는 알루미늄염, MF59, AS03, AS04등을 단독 또는 조합하여 사용할 수 있고, 더욱 바람직하게는 알럼(Alum)을 사용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또 다른 예로, 본 발명은 사스 코로나바이러스 2(SARS-CoV2) 항원 또는 그 단편의 유전자 또는 아미노산 서열을 확인하는 단계; 인간 LRRC24 (Leucine rich repeat containing 24) 단백질 유래 서열번호 1 내지 22중 어느 하나의 폴리펩티드를 포함하는 세포막 투과 도메인을 결합시키는 단계; 인간세포에서 면역원을 과발현하는 시스템에서 항원과 세포막 투과 도메인이 융합된 재조합 항원을 제조하는 단계; 및 재조합 항원을 정제하는 단계;를 포함하는 사스 코로나바이러스 2 재조합 항원의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 인간 LRRC24 (Leucine rich repeat containing 24) 단백질 유래 서열번호 1 내지 22중 어느 하나의 폴리펩티드를 포함하는 세포막 투과 도메인; 및 사스 코로나바이러스 2(SARS-CoV2) 항원 또는 그 단편;을 포함하는 재조합 항원을 포함하는 백신 조성물 및 사용설명서를 포함하는 사스 코로나바이러스 2 감염증 예방 또는 치료용 키트를 제공한다.
본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 상세하게 후술되어있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하고, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.
<실시예 1> 인간 LRRC24 단백질 유래 세포막 투과 도메인 (LRRC24P)와 융합된 사스 코로나바이러스 2 (SARS-CoV-2) 리셉터 결합 도메인 (RBD) 재조합 항원 생산 및 정제
공개된 사스 코로나바이러스 2 (SARS-CoV-2) 유전자 서열을 (GeneBank ID: MN908974.3) 이용하여 Spike 단백질을 발현하는 염기서열을 얻었다. 이에 해당하는 아미노산 서열을 기존에 알려진 사스 코로나바이러스 2 (SARS-CoV-2) 리셉터 바인딩 도메인과 Snalgene 프로그램상의 아미노산 서열 얼라인 (align) 도구를 이용하여 상동성 비교를 진행하였다 (도 1A). 이를 통해서 신종코로나바이러스 리셉터 바인딩 도메인의 아미노산 서열을 얻을 수 있었다. 리셉터 바인딩 도메인은 신종코로나바이러스 스파이크 단백질의 319번 아미노산부터 541번 아미노산까지 해당한다. 해당 유전자 서열을 진핵세포에서 발현하기 위해서 코돈 최적화 (codon optimization)을 진행한 후 IDT 회사에서 유전자 합성을 진행하였다. 또한 세포 밖으로 단백질을 배출시키면 단백질 발현과 정제에 도움이 되기 때문에 신종코로나바이러스 스파이크 단백질의 배출을 담당하는 signal peptide를 밝혔다 (도 1B). Signal IP라는 분석 프로그램을 통하여 스파이크 단백질의 1에서 16 아미노산이 이러한 역할을 할 수 있음을 확인하였고, 이를 면역원 발현에 사용하였다.
인간세포에서 면역원을 과발현하는 시스템을 이용하여 인간 LRRC24 단백질 유래 세포막 투과 도메인 (LRRC24P)와 융합된 사스 코로나바이러스 2 (SARS-CoV-2) 리셉터 결합 도메인 (RBD) 재조합 항원을 제작하였다 (도 1C). 단백질 정제를 효율적으로 진행하기 위하여 6개의 Histidine 아미노산 tag을 SARS-CoV-2 RBD의 C-말단에 융합시킨 면역원 (SARS-CoV-2 RBD)을 제작하였다. 인간 LRRC24 단백질 유래 세포막 투과 도메인 (LRRC24P)의 백신효능 향상 기능을 연구하기 위하여 이와 융합된 SARS-CoV-2 RBD-LRRC24P 항원을 제작하였다. 두 항원 모두 His-tag을 가지고 있어서 Ni-NTA agarose column (QIAGEN 사)을 이용하여 정제하였다. 대량 정제된 재조합 항원을 Coomassie blue staining (도 2A)과 Western blot analysis (도 2B)로 확인하였다. 순도가 높은 면역원을 생산하여 백신 효능 평가에 사용하였다.
<실시예 2> 인간 LRRC24 단백질 유래 세포막 투과 도메인 (LRRC24P)와 융합된 사스 코로나바이러스 2 (SARS-CoV-2) 리셉터 결합 도메인 (RBD) 재조합 항원의 야생형 마우스에서의 면역화 및 중화 항체 역가 측정
상기 실시예 1에서 얻어진 인간 LRRC24 단백질 유래 세포막 투과 도메인 (LRRC24P)와 융합된 사스 코로나바이러스 2 (SARS-CoV-2) 리셉터 결합 도메인 (RBD) 재조합 항원을 도 3A에 제시된 연구 일정에 따라서 면역화를 수행하였다. 재조합 면역원을 생쥐 한마리당 10 마이크로그램을 이용하여 접종하였다. 각 항원 별로 그룹당 6 마리의 생쥐를 이용하여 실험하였다. 어쥬번트는 Thermo Fisher Scientific 회사의 Alum을 이용하였다. 마우스의 근육 내로 주사를 하여 면역원을 주입하여 0일에 1차 면역화 (프라이밍)를 진행하였다. 상기 면역화를 14일(2차)과 28일(3차)에 반복 진행하여 면역 부스팅을 진행하였다. 3회 백신 접종 후 도 3A에 제시된 일정에 따라서 마우스 혈청을 확보하여 중화항체가를 측정하였다. 사스 코로나바이러스 2 (SARS-CoV-2)에 대한 중화항체가를 측정하기 위하여 마우스 혈청을 최소 필수 배지에서 40배씩 희석시켰고, 섭씨 37도에서 사스 코로나바이러스 2 (SARS-CoV-2)와 함께 반응시켰다. 바이러스 혈청 혼합물을 96-well 플라스크에서 배양된 단일층의 세포에 첨가하고 나서 8시간 동안 섭씨 37도 5% 이산화탄소 인큐베이터에서 배양하였다. 중화항체가 없는 대조군에서는 사스 코로나바이러스 2 (SARS-CoV-2)에 의한 특이적 항체 반응 효과가 잘 일어난다. 중화항체가 존재하면 사스 코로나바이러스 2 (SARS-CoV-2)에 특이적인 항체 반응 효과가 잘 일어나지 않는다. 이를 Focus reduction neutralization test (FRNT) 어세이를 통해서 정량적으로 측정하여 세포so 사스 코로나바이러스 2 (SARS-CoV-2) 특이적 항체 수준의 50%를 나타내는 희석배율을 산출하여 중화항체가 수준을 정량화 하였다.
도 4에 보여진 결과처럼, 인간 LRRC24 단백질 유래 세포막 투과 도메인 (LRRC24P)와 융합된 사스 코로나바이러스 2 (SARS-CoV-2) 리셉터 결합 도메인 (RBD) 재조합 항원에 의해 면역된 생쥐에서 생산된 중화항체는 사스 코로나바이러스 2 (SARS-CoV-2) 리셉터 결합 도메인 (RBD)에 특이적인 면역글로불린 G의 생성이 이루어 졌음이 확인되었다 (도 4A와 4B).
<110> KRICT
<120> High potency severe acute respiratory syndrome coronavirus 2
(SARS-CoV2) antigen and vaccine composition comprising the same
<130> M20-0000
<160> 47
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> LRRC24P
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Arg Arg Arg Arg Arg Arg Lys Lys Ala Arg
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<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
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Arg Arg Arg Arg Arg Arg Lys Lys Val Arg
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<213> Artificial Sequence
<220>
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Arg Arg Arg Arg Arg Arg Lys Lys Lys Arg
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<211> 741
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SARS-CoV-2 RBD nucleotide
<400> 23
atgtttgtct tcctcgttct gctcccactt gtaagctctc aatgcgtccg ggtacaaccc 60
acagaatcaa ttgtcagatt tcccaatatc actaacctgt gtccctttgg cgaagtgttt 120
aatgccaccc gctttgcatc cgtctatgcg tggaacagga aaaggatatc caactgtgtg 180
gcagactatt ccgtccttta caattcagct tcctttagta cttttaagtg ttacggggtt 240
tcaccaacaa aactgaacga tctctgtttc actaatgtat atgctgactc ttttgtcata 300
cgcggtgatg aggttaggca aatagcgccc ggccagacag gcaaaatagc ggattacaac 360
tataaacttc ctgatgactt cacgggatgc gttatagcat ggaacagtaa caacctcgat 420
tcaaaggttg ggggaaacta caattacctc tatcgattgt tccgaaagag taacctcaag 480
ccctttgagc gcgacatctc aacggagata tatcaagctg gatctacgcc ctgcaatggg 540
gtagaggggt ttaattgtta cttcccactg caaagttatg gctttcagcc aacgaacggc 600
gttgggtatc aaccatatcg ggtggtagtg ctttcattcg aactgcttca tgcacccgca 660
acggtctgcg gtccgaaaaa gagcactaac ctggtcaaga ataaatgcgt taatttcact 720
agtcatcacc atcaccatca c 741
<210> 24
<211> 247
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SARS-CoV-2 RBD amino acid
<400> 24
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Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val
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Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser
50 55 60
Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val
65 70 75 80
Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp
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Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr
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Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly
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Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys
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Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr
165 170 175
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Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly
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Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Thr
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245
<210> 25
<211> 771
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SARS-CoV-2 RBD-LRRC24P nucleotides
<400> 25
atgtttgtct tcctcgttct gctcccactt gtaagctctc aatgcgtccg ggtacaaccc 60
acagaatcaa ttgtcagatt tcccaatatc actaacctgt gtccctttgg cgaagtgttt 120
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acggtctgcg gtccgaaaaa gagcactaac ctggtcaaga ataaatgcgt taatttcact 720
agtcgaagaa gacgaaggag aaagaaagct aggcatcacc atcaccatca c 771
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<211> 257
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SARS-CoV-2 RBD-LRRC24P amino acid
<400> 26
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<220>
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20 25 30
Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val
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Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser
50 55 60
Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val
65 70 75 80
Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp
85 90 95
Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln
100 105 110
Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr
115 120 125
Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly
130 135 140
Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys
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165 170 175
Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser
180 185 190
Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val
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Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly
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Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Thr
225 230 235 240
Ser Arg Arg Arg Arg Arg Arg Lys Lys Ser Arg His His His His His
245 250 255
His
<210> 28
<211> 257
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SARS-CoV-2 RBD-LRRC24P-M2
<400> 28
Met Phe Val Phe Leu Val Leu Leu Pro Leu Val Ser Ser Gln Cys Val
1 5 10 15
Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn
20 25 30
Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val
35 40 45
Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser
50 55 60
Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val
65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr
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Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly
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Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys
145 150 155 160
Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr
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Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser
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Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val
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Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly
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His
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SARS-CoV-2 RBD-LRRC24P-M3
<400> 29
Met Phe Val Phe Leu Val Leu Leu Pro Leu Val Ser Ser Gln Cys Val
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Claims (12)
- 인간 LRRC24 (Leucine rich repeat containing 24) 단백질 유래 서열번호 1 내지 7, 21 및 22중 어느 하나의 폴리펩티드를 포함하는 세포막 투과 도메인; 및 서열번호 24를 포함하는 사스 코로나바이러스 2(SARS-CoV2) 항원;을 포함하는 재조합 항원
- 삭제
- 삭제
- 제1항에 있어서, 재조합 항원은 서열번호 26 내지 32, 46 및 47로 이루어진 군에서 선택된 하나를 포함하는 재조합 항원
- 인간 LRRC24 (Leucine rich repeat containing 24) 단백질 유래 서열번호 1 내지 7, 21 및 22중 어느 하나의 폴리펩티드를 포함하는 세포막 투과 도메인; 및 서열번호 24를 포함하는 사스 코로나바이러스 2(SARS-CoV2) 항원;을 포함하는 재조합 항원을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 유전자 컨스트럭트
- 인간 LRRC24 (Leucine rich repeat containing 24) 단백질 유래 서열번호 1 내지 7, 21 및 22중 어느 하나의 폴리펩티드를 포함하는 세포막 투과 도메인; 및 서열번호 24를 포함하는 사스 코로나바이러스 2(SARS-CoV2) 항원;을 포함하는 재조합 항원을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 유전자 컨스트럭트를 포함하는 재조합 벡터
- 인간 LRRC24 (Leucine rich repeat containing 24) 단백질 유래 서열번호 1 내지 7, 21 및 22중 어느 하나의 폴리펩티드를 포함하는 세포막 투과 도메인; 및 서열번호 24를 포함하는 사스 코로나바이러스 2(SARS-CoV2) 항원;을 포함하는 재조합 항원을 포함하는 백신 조성물
- 제7항에 있어서, 백신 조성물은 사스 코로나바이러스 2 특이적 중화능력을 갖는 것을 특징으로 하는 백신 조성물
- 제7항에 있어서, 백신 조성물은 사스 코로나바이러스 2 감염증 예방 또는 치료용인 것을 특징으로 하는 백신 조성물
- 서열번호 24를 포함하는 사스 코로나바이러스 2(SARS-CoV2) 항원의 유전자 또는 아미노산 서열을 확인하는 단계;
인간 LRRC24 (Leucine rich repeat containing 24) 단백질 유래 서열번호 1 내지 7, 21 및 22중 어느 하나의 폴리펩티드를 포함하는 세포막 투과 도메인을 결합시키는 단계;
인간세포에서 면역원을 과발현하는 시스템에서 항원과 세포막 투과 도메인이 융합된 재조합 항원을 제조하는 단계; 및
재조합 항원을 정제하는 단계;를 포함하는 사스 코로나바이러스 2 재조합 항원의 제조방법
- 인간 LRRC24 (Leucine rich repeat containing 24) 단백질 유래 서열번호 1 내지 7, 21 및 22중 어느 하나의 폴리펩티드를 포함하는 세포막 투과 도메인; 및 서열번호 24를 포함하는 사스 코로나바이러스 2(SARS-CoV2) 항원;을 포함하는 재조합 항원을 포함하는 백신 조성물; 및
사용설명서;를 포함하는 사스 코로나바이러스 2 감염증 예방 또는 치료용 키트
- 삭제
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Patent Citations (2)
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