CN114369144A - 一种酵母表达的抗新型冠状病毒基因工程疫苗 - Google Patents

一种酵母表达的抗新型冠状病毒基因工程疫苗 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种酵母表达的抗新型冠状病毒基因工程疫苗。具体地，本发明提供了抗原肽和新型冠状病毒的疫苗多肽，本发明还提供含有所述抗原肽或疫苗多肽的疫苗组合物及其应用。实验表明，本发明的疫苗多肽可产生阻断RBD与ACE2结合的较高滴度的中和抗体，因而本发明在新型冠状病毒肺炎的预防或治疗有潜在的应用前景。

Description

一种酵母表达的抗新型冠状病毒基因工程疫苗
技术领域
本发明涉及基因工程和疫苗学领域，具体地，本发明涉及一种酵母表达的抗新型冠状病毒基因工程疫苗。
背景技术
与其他冠状病毒一样，新型冠状病毒(SARS-CoV-2)是一种包膜病毒，拥有约30kb的单链正义RNA基因组。该病毒基因组编码4种结构蛋白，包括刺突(S)、包膜(E)、膜(M)和核衣壳(N)蛋白，16种非结构蛋白和少量辅助蛋白。S蛋白由胞外域、跨膜结构域和胞内结构域组成。胞外域可以进一步划分为两个功能不同的亚单位，S1和S2，分别负责受体结合和膜融合。与与之密切相关的SARS-CoV病毒一样，SARS-CoV-2也以人血管紧张素转换酶2(ACE2)为关键受体，促进其进入宿主细胞。S蛋白通过位于S1亚基内的受体结合域(RBD)与人类ACE2蛋白结合。
然而，目前的新型冠状病毒疫苗生产流程复杂、成本高、副作用明显等缺点。
因此，本领域迫切需要开发一种高效、简便、低成本地制备新型冠状病毒疫苗的新方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种高效、简便、低成本地制备新型冠状病毒疫苗的新方法。
在本发明的第一方面，提供了一种抗原肽，所述抗原肽衍生自新型冠状病毒S蛋白的受体结合域(RBD)，并且选自下组：
(1)SEQ ID NO.1所示的第320－550位的氨基酸序列；
(2)将SEQ ID NO.1所示的第320－550位的氨基酸序列经过一个或多个(≤20个，如2-10个，优选为2-5个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的衍生多肽，且所述衍生多肽具有诱发针对新型冠状病毒的免疫反应的功能。
在另一优选例中，所述的抗原肽与新型冠状病毒的S蛋白竞争性结合人ACE2蛋白。
在另一优选例中，所述的“竞争性结合”指所述的抗原肽与新型冠状病毒的S蛋白结合于相同或基本相同的人ACE2蛋白的结合域(或氨基酸区段)。
在另一优选例中，所述的抗原肽与新型冠状病毒的S蛋白结合于人ACE2蛋白上的相同的结合区段。
在另一优选例中，所述的竞争性结合包括阻断性或非阻断性的竞争性结合。
在另一优选例中，所述的抗原肽为人工合成的或重组的抗原肽。
在另一优选例中，所述抗原肽为酵母细胞表达的重组蛋白。
在另一优选例中，所述酵母包括毕赤酵母。
在另一优选例中，所述的抗原肽选自下组：
(a)具有SEQ ID No:2所示的氨基酸序列的多肽；
(b)对(a)中多肽的氨基酸序列进行一个或多个氨基酸添加、一个或多个氨基酸的取代或1-3个氨基酸缺失所形成的衍生多肽，所述衍生多肽与衍生前的原始多肽具有基本相同的功能。
在另一优选例中，所述的“基本相同的功能”指所述的衍生多肽具有基本相同的激发免疫反应的免疫原性，与新型冠状病毒的S蛋白竞争性结合人ACE2蛋白的活性。
本发明第二方面提供了一种疫苗多肽，所述疫苗多肽包括本发明第一方面所述的抗原肽。
在另一优选例中，所述的疫苗多肽可激发灵长动物和啮齿动物产生阻断RBD与ACE2结合的中和抗体。
在另一优选例中，所述的疫苗多肽可激发灵长动物产生细胞免疫和体液免疫。
在另一优选例中，所述的灵长动物包括人、非人灵长类动物。
本发明第三方面提供了一种分离的多核苷酸，所述的多核苷酸编码本发明第一方面所述的抗原肽或本发明第二方面所述的疫苗多肽。
本发明第四方面提供了一种表达载体，所述表达载体含有本发明第三方面所述的多核苷酸。
本发明第五方面提供了一种宿主细胞，所述的宿主细胞含有本发明第四方面所述的表达载体，或者在基因组中整合有本发明第三方面所述的多核苷酸。
在另一优选例中，所述的宿主细胞包括原核细胞和真核细胞。
在另一优选例中，所述的宿主细胞包括酵母、果蝇S2细胞、大肠杆菌、CHO细胞、DC细胞等。
本发明第六方面提供了一种药物组合物，所述的组合物含有本发明第一方面所述的抗原肽、本发明第二方面所述的新型冠状病毒的疫苗多肽或本发明第三方面所述的多核苷酸或者本发明第四方面所述的表达载体或者本发明第五方面所述的宿主细胞，以及药学上可接受的载体和/或辅料。
在另一优选例中，所述的药物组合物为疫苗组合物。
在另一优选例中，所述疫苗组合物为单价或多价。
在另一优选例中，所述的药物组合物还含有佐剂，首选各种铝佐剂。
在另一优选例中，所述药物组合物中抗原肽或免疫多肽、和佐剂(如铝)的摩尔数或重量比在1:100之间，优选为1:40到1:60之间。
在另一优选例中，所述的药物组合物包括单方药物、复方药物、或协同药物。
在另一优选例中，所述的药物组合物的剂型为液态、固体、或凝胶态。
在另一优选例中，所述的药物组合物用选自下组的方式施用：皮下注射、皮内注射、肌肉注射、静脉注射、腹腔注射、微针注射、口服、或口鼻腔喷入和雾化吸入。
本发明第七方面提供了一种疫苗组合物，所述的组合物含有本发明第一方面所述的抗原肽、本发明第二方面所述的新型冠状病毒的疫苗多肽或本发明第三方面所述的多核苷酸或者本发明第四方面所述的表达载体或者本发明第五方面所述的宿主细胞，以及免疫学上可接受的载体和/或辅料。
在另一优选例中，所述的疫苗组合物还含有佐剂。
在另一优选例中，所述的佐剂包括氧化铝、皂苷、quil A、胞壁酰二肽、矿物油或植物油、基于囊泡的佐剂、非离子嵌段共聚物或DEAE葡聚糖、细胞因子(包括IL-1、IL-2、IFN-r、GM-CSF、IL-6、IL-12、和CpG)。
本发明第八方面提供了如本发明第一方面所述的抗原肽或本发明第二方面所述的新型冠状病毒的疫苗多肽或本发明第六方面所述的药物组合物或本发明第七方面所述的疫苗组合物的用途，其特征在于，(a)用于制备针对新型冠状病毒的抗体；和/或(b)用于制备预防冠状病毒SARS-CoV-2感染或其相关疾病的药物。
在另一优选例中，所述的冠状病毒SARS-CoV-2相关疾病选自下组：呼吸道感染、肺炎及其并发症、或其组合。
在另一优选例中，所述的冠状病毒SARS-CoV-2相关疾病为新型冠状病毒肺炎(COVID-19)。
本发明第九方面提供了一种制备本发明第一方面所述的抗原肽的方法，包括步骤：
(i)在适宜条件下培养本发明第五方面所述的宿主细胞，从而表达本发明第一方面所述的抗原肽；
(ii)纯化所述抗原肽。
在另一优选例中，所述方法步骤(i)中将转化的酵母单菌落分别接种到BMGY培养基中，培养后离心去除上清，用BMMY培养基重悬菌体，28－30℃(优选为29.5℃)，诱导培养36－48小时(优选为48小时)。
本发明第十方面提供了一种产生针对冠状病毒SARS-CoV-2的免疫反应的方法，包括步骤：给需要的对象施用本发明第一方面所述的抗原肽、本发明第二方面所述的新型冠状病毒的疫苗多肽、或本发明第六方面所述的药物组合物或本发明第七方面所述的疫苗组合物。
在另一优选例中，所述的对象包括人或非人哺乳动物。
在另一优选例中，所述的非人哺乳动物包括非人灵长动物(如猴)。
在另一优选例中，所述方法在所述对象中诱导产生针对冠状病毒SARS-CoV-2的中和抗体。
在另一优选例中，所述中和抗体阻断冠状病毒SARS-CoV-2与人ACE2蛋白的结合。
本发明第十一方面提供了一种治疗方法，给需要的对象施用本发明第一方面所述的抗原肽、本发明第二方面所述的疫苗多肽、本发明第三方面所述的多核苷酸或者本发明第四方面所述的表达载体或者本发明第五方面所述的宿主细胞或本发明第六方面所述的药物组合物或本发明第七方面所述的疫苗组合物。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了pPinkα-HC-SARS2-RBD(320V-550G)质粒图谱；其中，PAOX1，醇氧化酶启动子；α，α-factor分泌信号肽；CYC1 TT，CYC1转录终止区；ADE2，磷酸核糖酰氨基咪唑羧化酶，用作筛选标记。
图2显示了小量筛选毕赤酵母高表达株；其中，(A)不同克隆的培养基部分取5ul样品Western-blot检测目的蛋白，目的蛋白(RBD与His-tag融合)大小40-55KDa。(B)纯化的RBDD蛋白经去糖基化酶PNGase F和Endo H处理后SDS-PAGE和WB分析。
图3显示了RBD与ACE2蛋白的亲和力；其中，BLI测定RBD与ACE2的结合亲和力。稳态时的结合亲和力表示为平衡解离常数(KD)。
图4显示了RBD免疫后抗体滴度测定及中和活性测定；其中，(A)小鼠在免疫后能够产生针对SARS-2-RBD的特异性抗体，并且三免后的抗体滴度高于二免后的抗体滴度。(B)将假病毒与四倍系列稀释的血清温育1小时，然后加到293T/ACE2-mcherry细胞上。感染后约48小时测定细胞内荧光素酶活力，并使用GraphPad Prism软件计算每种抗体的半数抑制浓度(IC50)。数据表示为平均值±平均数标准误差。
图5显示了不同长度和不同剂量RBD免疫后抗体滴度测定及假病毒中和试验；其中，(A)不同免疫策略的疫苗平行免疫BALB/c小鼠，二免后两周和三免后两周采血检测血清滴度。三免后血清滴度高于二免后血清滴度，并且免疫剂量越高，更快的产生的抗体。(B)将假病毒与四倍系列稀释的血清温育1小时，然后加到293T/ACE2-mcherry细胞上。感染后约48小时测定细胞内荧光素酶活力，并使用GraphPad Prism软件计算每种抗体的半数抑制浓度(IC50)。数据表示为平均值±平均数标准误差。
具体实施方式
本发明人通过广泛而深入的研究，意外地发现利用酵母细胞开发的新型冠状病毒疫苗具有产量高、纯度高、稳定性好、易于纯化的优点。而且，本发明的实验结果表明，本发明的疫苗多肽可产生阻断RBD与ACE2结合的较高滴度的中和抗体，因而本发明在新型冠状病毒肺炎的预防或治疗有潜在的应用前景。
冠状病毒SARS-CoV-2
冠状病毒(Coronavirus，CoV)属于套式病毒目(Nidovirales)冠状病毒科(Coronaviridae)，是一种有包膜的正链RNA病毒，其亚科包含α、β、δ及γ四属。
目前已知的感染人的冠状病毒中，HCoV-229E和HCoV-NL63属于α属冠状病毒，HCoV-OC43、SARS-CoV、HCoV-HKU1、MERS-CoV和SARS-CoV-2均为β属冠状病毒。
2019年年底爆发的新型冠状病毒(SARS-CoV-2)与SARS-CoV有约80％相似性、与MERS-CoV有40％的相似性，也属于β属冠状病毒。
该类病毒的基因组是一条单股正链RNA，是基因组最大的RNA病毒之一，编码包括复制酶、刺突蛋白、囊膜蛋白、包膜蛋白和核壳蛋白等。在病毒复制的初始阶段，基因组被翻译成两条长达几千个氨基酸的肽链即前体多聚蛋白(Polyprotein)，随后前体蛋白被蛋白酶切割生成非结构蛋白(如RNA聚合酶和解旋酶)和结构蛋白(如刺突蛋白)及辅助蛋白。
S蛋白是冠状病毒SARS-CoV-2的一种主要的结构蛋白，其中，RBD负责与人ACE2受体结合。
冠状病毒SARS-CoV-2的RBD区域位于S蛋白的第319-534位。
在本发明中，一种代表性的抗原肽的氨基酸序列如SEQ ID No:1中第320-550位所示，另一种代表性的抗原肽的氨基酸序列如SEQ ID No:1中第319-534位所示。
>RBD(320-550)
VQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTG(SEQ ID NO.:2)(SEQ ID No:1中第320-550位)
>RBD(319-534)
RVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLV(SEQID NO.:3)(SEQ ID No:1中第319-534位)
>Spike蛋白(S蛋白)
MFVFLVLLPLVSSQCVNLTTRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLPFFSNVTWFHAIHVSGTNGTKRFDNPVLPFNDGVYFASTEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQSLLIVNNATNVVIKVCEFQFCNDPFLGVYYHKNNKSWMESEFRVYSSANNCTFEYVSQPFLMDLEGKQGNFKNLREFVFKNIDGYFKIYSKHTPINLVRDLPQGFSALEPLVDLPIGINITRFQTLLALHRSYLTPGDSSSGWTAGAAAYYVGYLQPRTFLLKYNENGTITDAVDCALDPLSETKCTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVSVITPGTNTSNQVAVLYQDVNCTEVPVAIHADQLTPTWRVYSTGSNVFQTRAGCLIGAEHVNNSYECDIPIGAGICASYQTQTNSPRRARSVASQSIIAYTMSLGAENSVAYSNNSIAIPTNFTISVTTEILPVSMTKTSVDCTMYICGDSTECSNLLLQYGSFCTQLNRALTGIAVEQDKNTQEVFAQVKQIYKTPPIKDFGGFNFSQILPDPSKPSKRSFIEDLLFNKVTLADAGFIKQYGDCLGDIAARDLICAQKFNGLTVLPPLLTDEMIAQYTSALLAGTITSGWTFGAGAALQIPFAMQMAYRFNGIGVTQNVLYENQKLIANQFNSAIGKIQDSLSSTASALGKLQDVVNQNAQALNTLVKQLSSNFGAISSVLNDILSRLDKVEAEVQIDRLITGRLQSLQTYVTQQLIRAAEIRASANLAATKMSECVLGQSKRVDFCGKGYHLMSFPQSAPHGVVFLHVTYVPAQEKNFTTAPAICHDGKAHFPREGVFVSNGTHWFVTQRNFYEPQIITTDNTFVSGNCDVVIGIVNNTVYDPLQPELDSFKEELDKYFKNHTSPDVDLGDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQ(SEQ ID NO.1)
应理解，在本发明中，S蛋白、RBD区域均包括野生型和突变型。
本发明主要目标是研发出一种能诱导机体产生靶向冠状病毒SARS-CoV-2的RBD区域中和抗体的疫苗，用于预防新型冠状病毒的感染。
本发明提供了一种衍生自新型冠状病毒S蛋白的受体结合域(RBD)的抗原肽，优选地，本发明的抗原肽选自下组：
(1)SEQ ID NO.1所示的第320－550位的氨基酸序列；
(2)将SEQ ID NO.1所示的第320－550位的氨基酸序列经过一个或多个(≤20个，如2-10个，优选为2-5个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的衍生多肽，且所述衍生多肽具有诱发针对新型冠状病毒的免疫反应的功能。
在一优选实施方式中，抗原肽的氨基酸序列如下所示：VQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTG(SEQ ID NO.:2)。
疫苗多肽
在本发明中，“本发明表位肽”、“本发明疫苗多肽”、“本发明多肽”可互换使用，指符合本发明第二方面中所述的疫苗多肽。
在本发明中，疫苗多肽还包括其他形式，例如药学上可接受的盐、偶联物、或融合蛋白。
在本发明中，疫苗多肽包括对SEQ ID No:2的序列进行一个或多个(如1-5个，优选地1-3个)氨基酸添加、一个或多个(如1-5个，优选地1-3个)氨基酸的取代和/或1-3个氨基酸缺失所形成的衍生多肽，所述衍生多肽与衍生前的原始多肽具有基本相同的功能。
优选地，疫苗多肽包括对SEQ ID No:2的序列经过1-3个氨基酸添加(优选添加在N端或C端)、和/或1-2个氨基酸的取代(优选保守性氨基酸替换)并仍具有与衍生前的原始多肽具有基本相同的功能。
优选地，所述的保守性氨基酸替换根据表C进行氨基酸替换。
表C
最初的残基 代表性的取代 优选的取代
Ala(A) Val；Leu；Ile Val
Arg(R) Lys；Gln；Asn Lys
Asn(N) Gln；His；Lys；Arg Gln
Asp(D) Glu Glu
Cys(C) Ser Ser
Gln(Q) Asn Asn
Glu(E) Asp Asp
Gly(G) Pro；Ala Ala
His(H) Asn；Gln；Lys；Arg Arg
Ile(I) Leu；Val；Met；Ala；Phe Leu
Leu(L) Ile；Val；Met；Ala；Phe Ile
Lys(K) Arg；Gln；Asn Arg
Met(M) Leu；Phe；Ile Leu
Phe(F) Leu；Val；Ile；Ala；Tyr Leu
Pro(P) Ala Ala
Ser(S) Thr Thr
Thr(T) Ser Ser
Trp(W) Tyr；Phe Tyr
Tyr(Y) Trp；Phe；Thr；Ser Phe
Val(V) Ile；Leu；Met；Phe；Ala Leu
如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多肽是没有分离纯化的，但同样的多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。
如本文所用，“分离的肽”是指本发明多肽基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化本发明多肽。基本上纯化的多肽(融合蛋白)在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。
本发明的多肽可以是重组多肽、或合成多肽，优选合成多肽。
在本发明中，当疫苗多肽的序列较短(如≤70aa，更佳地≤60aa时)，可用化学方法直接合成相关肽序列。
当疫苗多肽的序列较长或以融合蛋白形式提供疫苗多肽时，也可以用重组法来大批量地获得相关肽序列。这通常是将编码所述抗原多肽或其融合蛋白的编码序列克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到相关的抗原肽或融合蛋白。
载体和宿主细胞
本发明还提供了一种包含本发明的抗原肽编码序列的载体，以及含所述载体的宿主细胞。
在本发明的一个优选例中，所述载体具有表达所述抗原肽基因的表达盒，所述表达盒从5’-3’依次具有下述元件：启动子，抗原肽基因，和终止子。
本领域的普通技术人员可以使用的常规方法获得所述抗原肽的上述优化基因序列，例如全人工合成或PCR法合成。一种优选的合成法为不对称PCR法。用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。
本发明的多核苷酸序列可以通过常规的重组DNA技术，表达或生产目的蛋白(抗原肽)，包括步骤：
(1)用编码本发明蛋白的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞，较佳地为酵母或果蝇S2细胞；
(2)在合适的培养基中培养宿主细胞；
(3)从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。
本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含本发明蛋白的编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体，优选市售的载体如pPinkαHC或pMT/BiP/V5-HisA。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。此外，表达载体优选包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状。
包含上述DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，表达目的蛋白。能够表达本发明抗原肽的宿主细胞可以是原核细胞，如大肠杆菌；或是低等真核细胞，如酵母细胞(毕赤酵母、酿酒酵母)；或是高等真核细胞，如昆虫细胞；优选为酵母细胞。用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。工程细胞可以是快速利用甲醇型(Mut+)或慢速利用甲醇型(Muts)。
工程细胞的培养和目的蛋白发酵生产
在获得工程细胞后，便可在适合的条件下培养工程细胞，表达本发明的基因序列所编码的蛋白。根据宿主细胞的不同，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基，在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。
在本发明中，可采用常规的发酵条件。代表性的条件包括(但并不限于)：
(a)就温度而言，本发明的抗原肽的发酵及诱导温度保持在28-30℃；
(b)就诱导期的pH值而言，诱导期pH控制在3-9；
(c)就溶氧(DO)而言，DO控制在20-90％，溶氧的维持可以用氧气/空气混合气体的通入来解决；
(d)就补料而言，补料种类宜包括甘油、甲醇、葡萄糖等碳源，可单独补料或混合补料。
工程细胞表达目的蛋白可以采用层析技术进行纯化。层析技术包括阳离子交换层析、阴离子交换层析、凝胶过滤层析、疏水层析、亲和层析等技术。常用的层析方法包括：
1.阴离子交换层析
阴离子交换层析介质包括(但不限于)：Q-Sepharose、DEAE-Sepharose。如果发酵样品的盐浓度较高，影响与离子交换介质的结合，则在进行离子交换层析前需降低盐浓度。样品可以用稀释、超滤、透析、凝胶过滤层析等手段进行平衡缓冲液的更换，直至与对应的离子交换柱平衡液系统相似，然后上样，进行盐浓度或pH的梯度洗脱。
2.疏水层析
疏水层析介质包括(但不限于)：Phenyl-Sepharose、Butyl-Sepharose、Octyle-Sepharose。样品通过添加NaCl、(NH4)2SO4等方式提高盐浓度，然后上样，通过降低盐浓度方法洗脱。通过疏水层析除去疏水性有较大差异的杂蛋白。
3.凝胶过滤层析
疏水层析介质包括(但不限于)：Sephacryl、Superdex、Sephadex类。通过凝胶过滤层析更换缓冲体系，或进一步精纯。
4.亲和层析
亲和层析介质包括(但不限于)：HiTrapTM Heparin HP Columns。
制备疫苗组合物
本发明还提供了一种制备疫苗组合物的方法，具体地，包括步骤：
将本发明制备的抗原肽与药学上可接受的疫苗佐剂混合，从而形成疫苗组合物。
在另一优选例中，所述的佐剂为铝佐剂、GLA佐剂，较佳的GLA佐剂。
组合物和施用方法
本发明还提供了一种组合物，所述组合物含有：(i)用本发明方法制备的重组抗原肽或疫苗多肽，以及(ii)药学上或免疫学上可接受的赋形剂或佐剂。本发明中，术语“含有”表示各种成分可一起应用于或存在于本发明的组合物中。因此，术语“主要由...组成”和“由...组成”包含在术语“含有”中。
本发明的组合物包括药物组合物和疫苗组合物。本发明的组合物可以是单价的，也可以是多价的。
本发明的药物组合物或疫苗组合物可制备成各种常规剂型，其中包括(但并不限于)：注射剂、粒剂、片剂、丸剂、栓剂、胶囊、悬浮液、喷雾剂等。
(i)药物组合物
本发明的药物组合物包括有效量的用本发明方法制备的抗原肽或疫苗多肽，所述抗原肽或疫苗多肽可以是单价的，也可以是多价的。
本文所用的术语“有效量”指治疗剂治疗、缓解或预防目标疾病或状况的量，或是表现出可检测的治疗或预防效果的量。该效果可通过例如抗原水平来检测。治疗效果也包括生理性症状的减少。对于某一对象的精确有效量取决于该对象的体型和健康状况、病症的性质和程度、以及选择给予的治疗剂和/或治疗剂的组合。因此，预先指定准确的有效量是没用的。然而，对于某给定的状况而言，可以用常规实验来确定该有效量。
为了本发明的目的，有效的剂量为给予个体约0.2微克/千克至2微克/千克。
药物组合物还可含有药学上可接受的载体。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂(例如抗原肽或其它治疗剂)给药的载体。该术语指这样一些药剂载体：它们本身不诱导产生对接受该组合物的个体有害的抗体，且给药后没有过分的毒性。合适的载体可以是大的、代谢缓慢的大分子，如蛋白质、多糖、聚乳酸(polylactic acid)、聚乙醇酸等。这些载体是本领域普通技术人员所熟知的。在Remington’s Pharmaceutical Sciences(MackPub.Co.，N.J.1991)中可找到关于药学上可接受的载体或赋形剂的充分讨论。
组合物中药学上可接受的载体可包括液体，如水、盐水、甘油和乙醇。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。通常，可将组合物制成可注射剂，例如液体溶液或悬液；还可制成在注射前适合配入溶液或悬液、液体赋形剂的的固体形式。脂质体也包括在药学上可接受的载体的定义中。
(ii)疫苗组合物
本发明的疫苗组合物可以是预防性的(即预防感染)，也可以是治疗性的。所述的疫苗组合物包含免疫性抗原(包括本发明蛋白或自组装的病毒样颗粒)，并且通常与“药学上可接受的载体”组合，这些载体包括本身不诱导产生对接受该组合物的个体有害的抗体的任何载体。合适的载体通常是大的、代谢缓慢的大分子，如蛋白质、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、氨基酸聚合物、氨基酸共聚物、脂质凝集物(如油滴或脂质体)等。这些载体是本领域普通技术人员所熟知的。另外，这些载体可起免疫刺激剂(“佐剂”)作用。另外，抗原也可以和细菌类毒素(如白喉、破伤风、霍乱、幽门螺杆菌等病原体的类毒素)偶联。
增强免疫组合物效果的优选佐剂包括但不限于：(1)铝盐(alum)，如氢氧化铝、磷酸铝、硫酸铝等；(2)水包油型乳剂配方，例如，(a)MF59(参见WO90/14837)，(b)SAF，和(c)RibiTM佐剂系统(RAS)(Ribi Immunochem，Hamilton，MT)，(3)皂素佐剂；(4)Freund完全佐剂(CFA)和Freund不完全佐剂(IFA)；(5)细胞因子，如白介素(如IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12等)、干扰素(如γ干扰素)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CFS)、肿瘤坏死因子(TNF)等；(6)细菌ADP-核糖基化毒素(如霍乱毒素CT，百日咳毒素PT或大肠杆菌热不稳定毒素LT)的脱毒变异体，参见例如WO93/13302和WO92/19265；以及(7)作为免疫刺激剂来增强组合物效果的其它物质。
包括免疫原性组合物在内的疫苗组合物(例如，可包括抗原、药学上可接受的载体以及佐剂)，通常含有稀释剂，如水，盐水，甘油，乙醇等。另外，辅助性物质，如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等可存在于这类运载体中。
更具体地，包括免疫原性组合物在内的疫苗，包含免疫学有效量的免疫原性多肽，以及上述其它所需的组分。“免疫学有效量”指以单剂或连续剂一部分给予个体的量对治疗或预防是有效的。该用量可根据所治疗个体的健康状况和生理状况、所治疗个体的类别(如人)、个体免疫系统合成抗体的能力、所需的保护程度、疫苗的配制、治疗医师对医疗状况的评估、及其它的相关因素而定。预计该用量将在相对较宽的范围内，可通过常规实验来确定。
通常，可将疫苗组合物或免疫原性组合物制成可注射剂，例如液体溶液或悬液；还可制成在注射前适合配入溶液或悬液、液体赋形剂的固体形式。该制剂还可乳化或包封在脂质体中，以增强佐剂效果。
(iii)给药途径和剂量
所述组合物可以直接给予对象。对象可以是人或非人哺乳动物，较佳地为人。当用作疫苗时，可用已知的方法将本发明的病毒样颗粒直接施用于个体。通常采用与常规疫苗相同的施用途径和/或模拟病原体感染路径施用这些疫苗。
给予本发明药物组合物或疫苗组合物的途径包括(但并不限于)：肌内、皮下、皮内、肺内、静脉内、经鼻、阴道内、经口服或其它肠胃外给药途径。如果需要，可以组合给药途径，或根据疾病情况进行调节。疫苗组合物可以单剂量或多剂量给予，且可以包括给予加强剂量以引发和/或维持免疫力。
应以“有效量”给予病毒样颗粒疫苗，即病毒样颗粒的量在所选用的给药路径中足以引发免疫应答，能有效促使保护宿主抵抗新型冠状病毒感染。
在各疫苗剂份中所选用的病毒样颗粒的量，是按可引发免疫保护性应答而无明显的副作用的量而定。通常，在感染宿主细胞后，各剂的疫苗足以含有约1μg-1000μg，较佳地为1μg-100μg，更佳地10μg-50μg蛋白质或VLP。可用包括观察对象中的抗体滴定度和其它反应的标准研究方法来确定具体疫苗的最佳用量。可通过监控疫苗提供的免疫力水平来确定是否需要增强剂量。在评估了血清中的抗体滴定度后，可能需要选用增强剂量免疫接种。施用佐剂和/或免疫刺激剂就可提高对本发明的蛋白质的免疫应答。优选方法是从肠胃外(皮下或肌内)途径通过注射给予免疫原性组合物。
本发明的主要优点包括：
(1)本发明首次发现，特定区段的新型冠状病毒的RBD蛋白的衍生物(即新型冠状病毒S蛋白的320－550位的氨基酸序列)可产生阻断RBD与ACE2结合的较高滴度的中和抗体。
(2)本发明所采用的疫苗多肽能够在小鼠等哺乳动物的机体内产生抗新型冠状病毒S蛋白RBD(受体结合区域)的中和抗体，所述中和抗体可阻断RBD与ACE2结合。
(3)本发明特定的SARS2-RBD蛋白在毕赤酵母中高效表达，酵母表达RBD蛋白具有功能性构象，能够与受体ACE2结合，本发明特定的RBD蛋白免疫动物产生高效价血清中和抗体。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆实验指南(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)；或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。
1.材料和方法
1.1细胞
Vero细胞、293T细胞用含10％牛血清的DMEM培养基进行培养。用表达ACE2-mCherry融合蛋白的质粒构建慢病毒，感染293T细胞后进行流式筛选，获得过表达ACE2-mCherry的细胞系，命名为293T/ACE2-mcherry。PichiaPinkTM酵母菌株购于美国Invitrogen公司，并按照厂家说明书进行培养。
1.2抗体
抗His tag的抗体为Proteintech的HRP标记的单克隆抗体。抗新冠病毒RBD蛋白鼠多抗为本课题组制备，用大肠杆菌表达的新型冠状病毒RBD蛋白免疫BALB/c小鼠三次后，采集血液分离血清而获得鼠多抗。
1.3质粒构建
根据新型冠状病毒2019年SARS-CoV-2strain Wuhan-Hu-1(GenBank ID:MN908947.3)S1蛋白编码序列，进行密码子优化及基因合成，并进一步克隆到载体上，获得质粒p-SARS2-S1。
利用引物(optRBD-XhoI-F(a-HC):TCCGctcgagaaaaggtccgttcaaccaactgagtct及optRBD-KpnI-his-R(a-HC):CAACGGTACCttaatgatgatgatgatgatgaccagtaccagtcaaacc)从基因优化的质粒p-SARS2-S1上PCR扩增RBD基因，所获得PCR产物用XhoI和KpnI酶切后产生的片段，克隆到XhoI和KpnⅠ双酶切的pPinkα-HC(Invitrogen)载体上，得到质粒pPinkα-HC-yRBD(320V-550G)。
类似地，我们还构建了表达yRBD(319-534)的质粒pPinkα-HC-yRBD(319-534)。
1.4毕赤酵母转化和菌株表达量检测
为了转化毕赤酵母，质粒p-pink-α-HC-yRBD(320V-550G)用EcoNⅠ线性化，然后电转入PichiaPinkTM Strain 1(Invitrogen)。毕赤酵母的转化和随后的转化子的筛选根据厂家说明书进行操作。根据说明书进行了小量培养表达筛选实验。简单来说，转化的酵母单菌落分别接种到5ml BMGY培养基中，30℃ 250rpm培养24hr，然后离心去除上清，用1ml BMMY(含有1％甲醇)培养基重悬菌体，30℃ 250rpm诱导培养48hr。诱导结束后，离心收集培养基上清，取上清适量进行Western blotting检测，具体方法如之前文章描述的[11]。
1.5SARS2-RBD蛋白的制备
为了制备SARS2-RBD抗原，对选定的菌株进行培养和诱导。离心收集培养基上清，首先使用0.45uM的滤膜过滤，然后使用3KDa的超滤管进行超滤浓缩，浓缩后的样品用Binding buffer从超滤管中洗下来，使用镍柱进行纯化。最后对纯化的蛋白进行去糖基化处理，然后考马斯亮蓝染色和Western-blot检测。
1.6生物膜干涉测量(BLI)测定
为了测定蛋白与受体的结合亲和力，根据制造商的说明，在Octet RED96机器(PallFortéBio，美国)上进行BLI测定。简言之，将带有生物素标记的ACE-2-Fc受体蛋白，透析到0.01M PBS中，然后用动力学溶液(补充有0.1％牛血清白蛋白和0.02％吐温20的0.01MPBS)稀释到30ng/μL，然后固定在有亲和素的生物传感器(PallFortéBio)上直至饱和。将结合上受体的生物传感器置于含有一系列稀释的RBD蛋白样品的孔中作用500s以允许抗原受体结合，然后浸入动力学溶液中作用500s来解离。使用Octet数据分析软件(PallFortéBio)计算平衡解离常数(KD)。
1.7小鼠免疫及疫苗特异性抗体检测
将纯化的SARS2-RBD蛋白与
Figure BDA0002725702760000151
(Invivogen，美国)佐剂相混合，做成试验性疫苗，每个剂量含有50μg抗原(SARS2-RBD)和500μg的氢氧化铝佐剂。将PBS与佐剂混合作为阴性对照。Balb/c小鼠(每组六只，6-8周龄)购买自维通利华公司，在第0周、2周和4周腹腔注射试验性疫苗或PBS阴性对照，然后在第4周和第6周采血，用于抗体检测。
SARS2-RBD特异性抗体的测定方法如下：用293F表达的的SARS2-RBD包被ELISA板(25ng/孔)，之后的每步操作后都需要用PBST洗板三次以除去非特异性结合，用5％milk封闭后，每孔加50ul的10倍比稀释的血清，然后加HRP偶联的羊抗鼠IgG(sigma)作为二抗，TMB显色液显色，1N磷酸溶液终止，测定0D450。
1.8假病毒的制备和中和试验
基于鼠白血病病毒(MLV)的SARS-CoV-2假病毒制备简述如下：将S蛋白编码质粒、MLV Gag-Pol包装质粒和和编码荧光素酶报告基因的MLV转移质粒与Lipofectamine 2000(Life Technologies)混合后，共转染到HEK 293T细胞中。将细胞与转染培养基在37℃孵育18小时。然后去掉转染培养基，加入含有10％FBS的DMEM，37℃再孵育30小时。然后收集上清液，并用0.45μm膜过滤。
假病毒中和试验如下：培养293T/ACE-2-mcherry细胞，接种到48孔板中。150μL 4倍梯度稀释的抗体样品与150μL假病毒，37℃温育1小时后，加入到细胞上，37℃孵育12小时。去掉培养基后，加入新鲜培养基，37℃再孵育48小时。然后利用Luciferase AssaySystem(Promega)试剂盒检测胞内荧光素酶信号，方法依据制造商的说明书。根据如下公式计算中和百分比：100×(给定样品的荧光-单纯细胞对照样品的荧光)/(单纯假病毒对照样品的荧光-单纯细胞对照样品的荧光)。使用GraphPad Prism软件，通过非线性回归方法计算每种单抗的半数抑制浓度(IC50)。IC50定义为与单纯假病毒对照样品的感染相比，抑制50％病毒感染所需的抗体稀释倍数。
1.9统计
所有的统计分析均使用GraghPad Prism版本5来进行。Kaplan–Meier生存曲线使用log-rank检验进行比较，其他实验数据均是使用two-tailed student’s t-test方法来分析。统计的显著性差异定义如下：ns，P≥0.05；*0.01≤P<0.05；**P<0.01；***P<0.001。
实施例1 SARS2-RBD在毕赤酵母中的表达及鉴定
为了探究新型冠状病毒在毕赤酵母中重组表达，构建了质粒pPinkα-HC-SARS2-RBD(320V-550G)，质粒结构如图1所示。质粒pPinkα-HC-SARS2-RBD(320V-550G)用于分泌表达RBD蛋白，其N-端融合α-factor分泌信号肽而C-端融合His tag。
将质粒pPinkα-HC-SARS2-RBD(320V-550G)转化酵母细胞，得到的各重组酵母克隆用western-blot方法来检测RBD的表达量，空载体pPinkα-HC转化的酵母细胞作为阴性对照。结果显示，pPinkα-HC-SARS2-RBD(320V-550G)转化酵母克隆有非常强的抗His tag单抗检测信号(图2A)，提示RBD在酵母中表达量很高。
挑选pPinkα-HC-SARS2-RBD(320V-550G)的8号菌株作为高表达株进行大量表达纯化，所获得纯化产物用SDS-PAGE考马斯亮蓝染色和Western blotting进行分析鉴定。从pPinkα-HC-SARS2-RBD(320V-550G)转化8号菌中纯化的蛋白在SDS-PAGE中呈现为约40-55KDa的条带(图2B)，大于RBD序列计算所得蛋白分子量，可能是糖基化造成分子量偏大，所以用去糖基化酶PNFase F和Endo H处理后SDS和WB检测蛋白大小；用鼠抗RBD抗体在考马斯亮蓝染色蛋白条带处检测到阳性信号(图2B)，表明所纯化蛋白确实是RBD。
以上结果表明RBD在酵母中正确、高效表达，具有极大的疫苗开发潜力。
实施例2 RBD蛋白与受体ACE2结合亲和力测定
为了定量测定的纯化的RBD蛋白与受体ACE2的结合亲和力，进行生物膜干涉实验(BLI)测定。在该实验中，将生物素化的ACE2固定到传感器上，然后使其与不同浓度的RBD蛋白相互作用。RBD蛋白的平衡解离常数(KD)为24nM(图3)。这些结果表明RBD抗原对受体ACE2蛋白具有很高的亲和力。
实施例3 SARS2-RBD免疫小鼠产生高效价的特异性结合抗体并能有效中和SARS-Cov-2假病毒
为了研究yRBD(320-550)的免疫原性，2组(每组6只)Balb/c小鼠在第0周、第2周和第4周分别免疫yRBD(320-550)或PBS，PBS为阴性对照组。血清样品在第4周和第6周收集，用293F表达的SARS2-RBD包被抗原，进行ELISA试验来检测特异性抗体反应。如图4A所示，PBS组小鼠血清的抗原抗体反应为背景水平，而RBD组小鼠的免疫血清均有明显的抗体反应，且三免后两周血清比二免后两周血清的抗体滴度要高。ELISA结果表明，RBD免疫小鼠产生特异性抗体。
通过假病毒中和试验来评估免疫血清在体外抑制SARS-Cov-2假病毒进入的能力。如图4B所示，三免后两周的PBS组抗血清的中和效价与RBD组抗血清中和效价有显著性差异；RBD组抗血清的几何均值中和效价为2994。以上结果表明，RBD疫苗的免疫原性良好，能够强烈诱发具有保护潜力的中和抗体。
实施例4 SARS2-RBD不同免疫策略效果评估
为了比较不同长度的RBD的免疫原性，在酵母中表达了包含319到534位氨基酸的RBD，简称为yRBD(319-534)。同时，比较不同抗原剂量、佐剂对yRBD(320-550)免疫原性的影响。开展了小鼠免疫实验，共有5组(每组6只)Balb/c小鼠，分别用不同抗原/佐剂组合进行免疫，具体如图5，其中1组注射PBS及铝佐剂作为阴性对照。各组小鼠在第0周、第2周和第4周进行免疫。血清样品在第4周和第6周收集，用293F表达的SARS2-RBD包被抗原，进行ELISA试验来检测特异性抗体反应。如图5A所示，PBS组小鼠血清的抗原抗体反应为背景水平，而不同策略免疫RBD组小鼠的免疫血清均有明显的抗体反应，且三免后两周血清比二免后两周血清的抗体滴度要高。ELISA结果表明，RBD免疫小鼠产生特异性抗体。而且，对于yRBD(320-550)来说，高剂量(40μg)诱导产生的抗体滴度要明显高于低剂量(10μg)。
我们通过假病毒中和试验来评估不同免疫策略得到的抗体抑制SARS-CoV-2假病毒进入的能力。如图5B所示，PBS组抗血清的中和效价与RBD组抗血清中和效价有显著性差异；对于同一抗原来说，免疫剂量越大，产生的特异性抗体的中和效价越高；对于不同抗原来说，在同样剂量下，yRBD(320-550)诱导的中和抗体效价要高于yRBD(319-534)，即RBD蛋白越大，其潜在保护力越强。
结论
SARS2-RBD蛋白在毕赤酵母中高效分泌表达，酵母表达RBD蛋白具有功能性构象，能够与受体ACE2结合，RBD蛋白免疫动物产生高效价血清中和抗体。
综上，酵母表达RBD蛋白是一种优秀的抗新型冠状病毒基因工程疫苗候选者。
序列表
<110> 中国科学院上海巴斯德研究所
<120> 一种酵母表达的抗新型冠状病毒基因工程疫苗
<130> P2020-1696
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1208
<212> PRT
<213> SARS-CoV-2
<400> 1
Met Phe Val Phe Leu Val Leu Leu Pro Leu Val Ser Ser Gln Cys Val
1 5 10 15
Asn Leu Thr Thr Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala Tyr Thr Asn Ser Phe
20 25 30
Thr Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Lys Val Phe Arg Ser Ser Val Leu
35 40 45
His Ser Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Phe Ser Asn Val Thr Trp
50 55 60
Phe His Ala Ile His Val Ser Gly Thr Asn Gly Thr Lys Arg Phe Asp
65 70 75 80
Asn Pro Val Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val Tyr Phe Ala Ser Thr Glu
85 90 95
Lys Ser Asn Ile Ile Arg Gly Trp Ile Phe Gly Thr Thr Leu Asp Ser
100 105 110
Lys Thr Gln Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr Asn Val Val Ile
115 120 125
Lys Val Cys Glu Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro Phe Leu Gly Val Tyr
130 135 140
Tyr His Lys Asn Asn Lys Ser Trp Met Glu Ser Glu Phe Arg Val Tyr
145 150 155 160
Ser Ser Ala Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser Gln Pro Phe Leu
165 170 175
Met Asp Leu Glu Gly Lys Gln Gly Asn Phe Lys Asn Leu Arg Glu Phe
180 185 190
Val Phe Lys Asn Ile Asp Gly Tyr Phe Lys Ile Tyr Ser Lys His Thr
195 200 205
Pro Ile Asn Leu Val Arg Asp Leu Pro Gln Gly Phe Ser Ala Leu Glu
210 215 220
Pro Leu Val Asp Leu Pro Ile Gly Ile Asn Ile Thr Arg Phe Gln Thr
225 230 235 240
Leu Leu Ala Leu His Arg Ser Tyr Leu Thr Pro Gly Asp Ser Ser Ser
245 250 255
Gly Trp Thr Ala Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr Val Gly Tyr Leu Gln Pro
260 265 270
Arg Thr Phe Leu Leu Lys Tyr Asn Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp Ala
275 280 285
Val Asp Cys Ala Leu Asp Pro Leu Ser Glu Thr Lys Cys Thr Leu Lys
290 295 300
Ser Phe Thr Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val
305 310 315 320
Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys
325 330 335
Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala
340 345 350
Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu
355 360 365
Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro
370 375 380
Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe
385 390 395 400
Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly
405 410 415
Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys
420 425 430
Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn
435 440 445
Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe
450 455 460
Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys
465 470 475 480
Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly
485 490 495
Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val
500 505 510
Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys
515 520 525
Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn Phe Asn
530 535 540
Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn Lys Lys Phe Leu
545 550 555 560
Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr Thr Asp Ala Val
565 570 575
Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr Pro Cys Ser Phe
580 585 590
Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Thr Ser Asn Gln Val
595 600 605
Ala Val Leu Tyr Gln Asp Val Asn Cys Thr Glu Val Pro Val Ala Ile
610 615 620
His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Thr Trp Arg Val Tyr Ser Thr Gly Ser
625 630 635 640
Asn Val Phe Gln Thr Arg Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala Glu His Val
645 650 655
Asn Asn Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile Cys Ala
660 665 670
Ser Tyr Gln Thr Gln Thr Asn Ser Pro Arg Arg Ala Arg Ser Val Ala
675 680 685
Ser Gln Ser Ile Ile Ala Tyr Thr Met Ser Leu Gly Ala Glu Asn Ser
690 695 700
Val Ala Tyr Ser Asn Asn Ser Ile Ala Ile Pro Thr Asn Phe Thr Ile
705 710 715 720
Ser Val Thr Thr Glu Ile Leu Pro Val Ser Met Thr Lys Thr Ser Val
725 730 735
Asp Cys Thr Met Tyr Ile Cys Gly Asp Ser Thr Glu Cys Ser Asn Leu
740 745 750
Leu Leu Gln Tyr Gly Ser Phe Cys Thr Gln Leu Asn Arg Ala Leu Thr
755 760 765
Gly Ile Ala Val Glu Gln Asp Lys Asn Thr Gln Glu Val Phe Ala Gln
770 775 780
Val Lys Gln Ile Tyr Lys Thr Pro Pro Ile Lys Asp Phe Gly Gly Phe
785 790 795 800
Asn Phe Ser Gln Ile Leu Pro Asp Pro Ser Lys Pro Ser Lys Arg Ser
805 810 815
Phe Ile Glu Asp Leu Leu Phe Asn Lys Val Thr Leu Ala Asp Ala Gly
820 825 830
Phe Ile Lys Gln Tyr Gly Asp Cys Leu Gly Asp Ile Ala Ala Arg Asp
835 840 845
Leu Ile Cys Ala Gln Lys Phe Asn Gly Leu Thr Val Leu Pro Pro Leu
850 855 860
Leu Thr Asp Glu Met Ile Ala Gln Tyr Thr Ser Ala Leu Leu Ala Gly
865 870 875 880
Thr Ile Thr Ser Gly Trp Thr Phe Gly Ala Gly Ala Ala Leu Gln Ile
885 890 895
Pro Phe Ala Met Gln Met Ala Tyr Arg Phe Asn Gly Ile Gly Val Thr
900 905 910
Gln Asn Val Leu Tyr Glu Asn Gln Lys Leu Ile Ala Asn Gln Phe Asn
915 920 925
Ser Ala Ile Gly Lys Ile Gln Asp Ser Leu Ser Ser Thr Ala Ser Ala
930 935 940
Leu Gly Lys Leu Gln Asp Val Val Asn Gln Asn Ala Gln Ala Leu Asn
945 950 955 960
Thr Leu Val Lys Gln Leu Ser Ser Asn Phe Gly Ala Ile Ser Ser Val
965 970 975
Leu Asn Asp Ile Leu Ser Arg Leu Asp Lys Val Glu Ala Glu Val Gln
980 985 990
Ile Asp Arg Leu Ile Thr Gly Arg Leu Gln Ser Leu Gln Thr Tyr Val
995 1000 1005
Thr Gln Gln Leu Ile Arg Ala Ala Glu Ile Arg Ala Ser Ala Asn Leu
1010 1015 1020
Ala Ala Thr Lys Met Ser Glu Cys Val Leu Gly Gln Ser Lys Arg Val
1025 1030 1035 1040
Asp Phe Cys Gly Lys Gly Tyr His Leu Met Ser Phe Pro Gln Ser Ala
1045 1050 1055
Pro His Gly Val Val Phe Leu His Val Thr Tyr Val Pro Ala Gln Glu
1060 1065 1070
Lys Asn Phe Thr Thr Ala Pro Ala Ile Cys His Asp Gly Lys Ala His
1075 1080 1085
Phe Pro Arg Glu Gly Val Phe Val Ser Asn Gly Thr His Trp Phe Val
1090 1095 1100
Thr Gln Arg Asn Phe Tyr Glu Pro Gln Ile Ile Thr Thr Asp Asn Thr
1105 1110 1115 1120
Phe Val Ser Gly Asn Cys Asp Val Val Ile Gly Ile Val Asn Asn Thr
1125 1130 1135
Val Tyr Asp Pro Leu Gln Pro Glu Leu Asp Ser Phe Lys Glu Glu Leu
1140 1145 1150
Asp Lys Tyr Phe Lys Asn His Thr Ser Pro Asp Val Asp Leu Gly Asp
1155 1160 1165
Ile Ser Gly Ile Asn Ala Ser Val Val Asn Ile Gln Lys Glu Ile Asp
1170 1175 1180
Arg Leu Asn Glu Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp Leu
1185 1190 1195 1200
Gln Glu Leu Gly Lys Tyr Glu Gln
1205
<210> 2
<211> 231
<212> PRT
<213> SARS-CoV-2
<400> 2
Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu
1 5 10 15
Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr
20 25 30
Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val
35 40 45
Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser
50 55 60
Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser
65 70 75 80
Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr
85 90 95
Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly
100 105 110
Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly
115 120 125
Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro
130 135 140
Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro
145 150 155 160
Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr
165 170 175
Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val
180 185 190
Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro
195 200 205
Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn Phe
210 215 220
Asn Gly Leu Thr Gly Thr Gly
225 230
<210> 3
<211> 216
<212> PRT
<213> SARS-CoV-2
<400> 3
Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn
1 5 10 15
Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val
20 25 30
Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser
35 40 45
Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val
50 55 60
Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp
65 70 75 80
Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln
85 90 95
Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr
100 105 110
Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly
115 120 125
Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys
130 135 140
Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr
145 150 155 160
Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser
165 170 175
Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val
180 185 190
Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly
195 200 205
Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val
210 215

Claims (10)

1.一种抗原肽，其特征在于，所述抗原肽衍生自新型冠状病毒S蛋白的受体结合域(RBD)，并且选自下组：
(1)SEQ ID NO.1所示的第320－550位的氨基酸序列；
(2)将SEQ ID NO.1所示的第320－550位的氨基酸序列经过一个或多个(≤20个，如2-10个，优选为2-5个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的衍生多肽，且所述衍生多肽具有诱发针对新型冠状病毒的免疫反应的功能。
2.一种疫苗多肽，其特征在于，所述疫苗多肽包括权利要求1所述的抗原肽。
3.一种分离的多核苷酸，其特征在于，所述的多核苷酸编码权利要求1所述的抗原肽或权利要求2所述的疫苗多肽。
4.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体含有权利要求3所述的多核苷酸。
5.一种宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞含有权利要求4所述的表达载体，或者在基因组中整合有权利要求3所述的多核苷酸。
6.一种药物组合物，其特征在于，所述的组合物含有权利要求1所述的抗原肽、权利要求2所述的新型冠状病毒的疫苗多肽或权利要求3所述的多核苷酸或者权利要求4所述的表达载体或者权利要求5所述的宿主细胞，以及药学上可接受的载体和/或辅料。
7.一种疫苗组合物，其特征在于，所述的组合物含有权利要求1所述的抗原肽、权利要求2所述的新型冠状病毒的疫苗多肽或权利要求3所述的多核苷酸或者权利要求4所述的表达载体或者权利要求5所述的宿主细胞，以及免疫学上可接受的载体和/或辅料。
8.如权利要求1所述的抗原肽或权利要求2所述的新型冠状病毒的疫苗多肽或权利要求6所述的药物组合物或权利要求7所述的疫苗组合物的用途，其特征在于，(a)用于制备针对新型冠状病毒的抗体；和/或(b)用于制备预防冠状病毒SARS-CoV-2感染或其相关疾病的药物。
9.一种制备权利要求1所述的抗原肽的方法，其特征在于，包括步骤：
(i)在适宜条件下培养权利要求5所述的宿主细胞，从而表达权利要求1所述的抗原肽；
(ii)纯化所述抗原肽。
10.一种产生针对冠状病毒SARS-CoV-2的免疫反应的方法，其特征在于，包括步骤：给需要的对象施用权利要求1所述的抗原肽、权利要求2所述的新型冠状病毒的疫苗多肽、或权利要求6所述的药物组合物或权利要求7所述的疫苗组合物。
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