JP3602448B2 - 核酸呼吸器シンシチウムウイルスワクチン - Google Patents
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Description
(発明の分野)
本発明は、呼吸器シンシチウムウイルス(RSV)ワクチンの分野に関し、とりわけRSVの融合(F)蛋白質をコードする核酸配列を含むワクチンに関する。
【0002】
(発明の背景)
パラミクソウイルス科のウイルスに属する負鎖RNAウイルスである呼吸器シンシチウムウイルス(RSV)は、幼児や低年齢児童における細気管支炎および肺炎の原因となる主要なウイルス病原体である(参考文献1−この出願明細書全体を通して、本発明に関わる技術の状況をより完全に説明するために、様々な参考文献を括弧内に引用する。各引用に対する完全な文献情報を本明細書の終わり、請求項の直前に示す。これによって、これらの参考文献の開示内容を本明細書中に参考として組込む。)。RSVが引起す急性気道感染のために、米国では年間約90000人が入院し、4500人が死亡している(参考文献2)。RSV感染による医療経費は、米国だけで年間3億4千万ドルを超えている(参考文献3)。現在のところ、RSVに対する認可されたワクチンはない。RSVワクチンを開発するための主な手法は、不活性化ウイルス、弱毒化生ウイルスおよびサブユニットワクチンを含んできた。
【0003】
RSVのF蛋白質は、このウイルスの最も重要な保護抗原のひとつとみなされている。RSVサブグループAおよびBから得たF蛋白質のアミノ酸配列には、顕著な類似性(89%の同一性)が見られ(参考文献3)、抗F抗体は両サブグループのウイルスを交差中和するだけでなく、両サブグループのウイルスによる感染に対して免疫動物を保護することができる(参考文献4)。その上、F蛋白質は、マウスおよびヒトにおけるRSV特異的細胞傷害性Tリンパ球にとっての主要ターゲットと確認されてきた(参考文献3および参考文献5)。
【0004】
RSV蛋白質をワクチンとして使用することは、傷害を伴う恐れがある。非経口的に投与したワクチン候補物質は、セロネガティブなヒトまたはチンパンジーにおける中和抗体の誘導に関して、これまでのところ免疫原性が弱いことがわかった。これらの抗原によって誘導される血清抗体反応は、大部分の低年齢幼児がもつ経胎盤獲得母性抗体のような受動獲得抗体の存在下で、更に減衰する恐れがある。RSV感染細胞培養物から得た精製した融合蛋白質から成り、イムノアフィニティまたはイオン交換クロマトグラフィーによって精製したRSVに対するサブユニットワクチン候補物質について、説明がなされてきた(参考文献6)。この製剤によるセロネガティブまたはセロポジティブなチンパンジーの非経口的免疫処置が行われ、約1:50 のRSV血清中和力価を誘導するために、50μgの投与量3回分がセロネガティブな動物において必要とされた。その後、これらの動物を野生型RSVで攻撃したとき、ウイルス暴露や臨床疾患に対する免疫処置の効果を上部気道では検出できなかった。このワクチンによる免疫処理が下部気道におけるウイルス暴露に及ぼす効果は調べられなかったが、この部分は非経口的免疫処置によって誘導される血清抗体が最大の効果を示すと予想し得る部位である。少数のセロポジティブな人々において、安全性および免疫原性の研究が行われてきた。セロポジティブな子どもおよびセロネガティブな3人の子ども(年齢は全員 2.4歳を超えている)において、そのワクチンは安全であることが判明した。免疫処置を受けた子どもが少数であったために、下部気道疾患に対する免疫処置の効果を決定することができなかった。セロポジティブな子どもにおける1回の免疫処置で、その子ども達の 40 から 60%に4倍のウイルス中和抗体力価の増加が誘導された。したがって、このワクチンのRSV誘発疾患に対する効力を評価するために、十分な情報は得られていない。サブユニットRSVワクチンが直面する他の問題は、セロネガティブな被験者に免疫原性製剤を接種すると、ホルマリン不活性化RSVワクチンに見られるものに類似した疾患増強(時々、免疫増強と云われる)が起こる可能性である。幾つかの研究において、RSV F蛋白質または合成RSV FG融合蛋白質による免疫処置に対する免疫反応が、ホルマリン不活性化RSVワクチンが誘導するものに似た疾患増強をネズミ類に引起した。非複製性抗原を用いた免疫処置が疾患増強を伴うことは、セロネガティブなヒトにそのような抗原を使用する場合、注意が必要であることを示している。
【0005】
RSVが引起す疾患に対する弱毒化生ワクチンは、主に2つの理由によって有望と思われる。第1に、弱毒化生ワクチンによる感染によって、粘膜抗体と血清抗体および細胞傷害性Tリンパ球を含む均衡のとれた免疫反応が誘導される。第2に、弱毒化生ワクチン候補物質または自然獲得野生型ウイルスによる幼児の感染は、その後の再自然感染時に疾患増強を伴わない。ウイルス中和性母性抗体を有するより低年齢の幼児に対し免疫原性を示すが、年齢6カ月以上のセロネガティブな幼児には弱毒化されている弱毒化生ワクチンを産生することは、挑戦に値する課題であろう。弱毒化生ウイルスワクチンには、残存病原性および遺伝的不安定性という危険性もある。
【0006】
幾つかの研究で、外来蛋白質をコードする配列を含有するプラスミドDNAを注入することによって、外来蛋白質の発現およびその抗原に対する抗体と細胞傷害性Tリンパ球反応の誘導が起こることが示された(例えば、参考文献7、8、9を参照されたい)。免疫処置を目的として、ウイルス蛋白質を発現させるためにプラスミドDNA接種を使用することによって、前に概説した各戦略に優る幾つもの利点が生じ得る。第1に、ウイルス自体に対する抗体の存在下、その抗体によるウイルスの中和のために効力を失うことなく、ウイルス抗原をコードするDNAを投与することができる。第2に、in vivo で発現される抗原は本来のコンフォメーションを示すはずであり、したがって、野生型ウイルス感染において存在する抗原が誘導する抗体反応に類似した反応を誘導するはずである。それとは対照的に、蛋白質の精製に使用する幾つかのプロセスは、コンフォメーションの変化を誘発することができ、その結果、保護エピトープの免疫原性と恐らく免疫増強が失われる恐れがある。第3に、注入したプラスミドDNAからの蛋白質の発現を、ウイルス感染細胞の場合よりかなり長い期間 in vivo で検出することができ、これによって細胞傷害性T細胞の誘導が延長し、抗体反応が増強するという理論的な利点が得られる。第4に、抗原の in vivo 発現によって、外来アジュバントを必要とせずに保護が得られるかもしれない。
【0007】
本発明の譲受人に譲渡され、その開示内容が参考として本明細書に組込まれている 1996年12月19日に公表された国際公開第96/04095号および米国特許第5843913号、第5880104号、第6019980号および第6022864号において、RSVに対する免疫反応を起こすために宿主に投与するための、非複製性ベクター、とりわけプラスミドベクター、およびそれらを含む免疫原性組成物の提供が記載されている。このようなベクターは、RSV F蛋白質と特異的に反応する抗体および/または細胞傷害性Tリンパ球(CTL)を発生させるRSV F蛋白質またはRSV F蛋白質断片をコードする第1のヌクレオチド配列、宿主中にRSV F蛋白質を発現させるために第1のヌクレオチド配列と動作可能に結合したプロモーター配列、およびRSV F蛋白質が宿主中でベクターから in vivo で発現したときの免疫保護能を増強するために、第1のヌクレオチド配列とプロモーター配列の間に配置された第2のヌクレオチド配列を含む。
【0008】
RSVによって発症する疾患に対して、RSV F蛋白質をコードするDNA分子の投与によって免疫処置をすることができることは、上記の国際公開第96/04095号に記載される発明までは知られていなかった。特に、分泌形態のRSV F蛋白質をコードする遺伝子を用いたRSV誘発疾患に対する免疫処置の効力は、知られていなかった。RSVによる感染は重度の疾患を起こす。RSVによって発症する疾患に対する保護のため、および診断用試薬やキットの調製のために、ワクチンを含めた免疫原性製剤に使用するために、RSV F蛋白質をコードする遺伝子を分離し、in vivo で投与するためのベクターを改良することは、有用であり、望ましいことであろう。とりわけ、セロネガティブな幼児を含むヒトにおいて免疫原性で保護性であり、疾患増強(免疫増強)を引起さない改良ワクチンを提供することは、望ましいことであろう。
【0009】
(発明の概要)
本発明は、呼吸器シンシチウムウイルスによって引起される疾患に対して宿主を免疫処置する方法、その方法で使用される核酸分子、およびその核酸分子を利用した診断手順に関する。とりわけ、本発明は、改良された核酸呼吸器シンシチウムウイルスワクチンの提供を対象としている。
【0010】
本発明の一態様に従えば、RSV F蛋白質に対する免疫保護反応を宿主内で起こすために、宿主に in vivo で投与される免疫原性組成物であり、かつ、投与される宿主内で非複製性であるプラスミドベクターを含むベクターであって、
自家RSV Fシグナルペプチド配列を欠くRSV F蛋白質をコードし、その代わりに、RSV F蛋白質の発現量を増強する異種シグナルペプチド配列をコードする配列を含むヌクレオチド配列と、
RSV F蛋白質の発現のために前記ヌクレオチド配列と動作可能に結合したプロモーター配列
を含むベクターを含む組成物が提供される。
【0011】
RSV F蛋白質をコードするヌクレオチド配列は、トランスメンブラン領域が欠如したRSV F蛋白質をコードするものであってよい。トランスメンブラン領域の発現が欠如すると、RSV F蛋白質の分泌形態が生成する。RSV F蛋白質をコードするヌクレオチド配列は、成熟したRSV F蛋白質をコードする部分を含んでよい。
【0012】
RSV F蛋白質の in vivo 発現量の増強に有用であることが判明したひとつの異種シグナルペプチドは、単純疱疹ウイルスI(HSV I)gDのシグナルペプチドである。既に引用した国際公開第96/04095号に記載のように、このような増強された発現量は、自家シグナルペプチド配列を有するベクターと同じ投与量でそのベクターの免疫原性の改良をもたらす。RSV F蛋白質をコードし、本発明のこの態様によって提供されるベクターは、とりわけ、図10 に見られるようなプラスミドp82M35Bであってよい。
【0013】
RSV F蛋白質が宿主内でベクターから in vivo で発現されるとき、その免疫保護能を増強するために、ベクターは第2のヌクレオチド配列を含んでよい。第2のヌクレオチド配列は、異常なmRNAスプライシングを防止することによって、実質的に全ての転写mRNAがRSV F蛋白質をコードするために、一対のスプライス部位を含んでよい。このような第2のヌクレオチド配列は、第1のヌクレオチド配列とプロモーター配列との間に配置されてよい。このような第2のヌクレオチド配列は、図8に示すようなウサギβ−グロビンイントロンIIの配列であってよい(SEQ ID番号:5)。
【0014】
ベクターの中に使用されるプロモーター配列は、宿主内でRSV F蛋白質の発現をもたらす適当な任意のプロモーターであってよい。そのプロモーター配列は、immediate early サイトメガロウイルス(CMV)プロモーターであってよい。
【0015】
本発明で提供されるベクターのいくつかは、免疫原性組成物の形でベクターを投与した後にRSV F蛋白質の in vivo 発現によってRSV感染または疾患に対して宿主を免疫処置するのに使用できる。
【0016】
本発明の他の態様に従えば、RSV F蛋白質に対する免疫保護反応を宿主内に起こすために、宿主にin vivo投与するためであって、本発明で提供される非複製性ベクターおよび薬剤として許容し得るそのための担体を含む免疫原性組成物が提供される。
【0017】
本発明の更に他の態様に従えば、呼吸器シンシチウムウイルスによる感染で発症する疾患に対して、宿主を免疫処置する方法であって、本発明にて提供される免疫原性組成物の有効量を宿主に投与することを含む方法が提供される。
【0018】
本発明は更に、RSVによる感染で発症する疾患に対して、宿主を免疫処置するための免疫原として使用するときの、本発明にて提供されるベクターにまで拡張される。その上、本発明は、RSVによる感染で発症する疾患に対して、宿主を免疫処置するための医薬の製造における、本発明にて提供されるベクターの使用にまで拡張される。
【0019】
本発明は、自家RSV Fシグナルペプチド配列を欠き、RSV F蛋白質の発現量を増強する異種シグナルペプチドを含んだRSV F蛋白質をコードするヌクレオチド配列を使用する新規な方法であって、
自家RSV Fシグナルペプチド配列を有するRSV F蛋白質をコードする遺伝子を分離すること、
自家RSV Fシグナルペプチド配列をコードするヌクレオチド配列を、RSV F蛋白質の発現量を増強する異種シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列で置換することによって、前記ヌクレオチド配列を形成すること、
前記ヌクレオチド配列を少なくとも1個の制御配列と動作可能に連結することによる非複製性ベクターの産生において、RSV F蛋白質に対する免疫反応を起こすために前記ベクターを宿主に投与するとき、前記制御配列はRSV F蛋白質の発現を指示するものであること、および
そのベクターを宿主に投与すること
を含む方法も含んでいる。
【0020】
本発明のこの態様に従って提供される手順は、
前記ヌクレオチド配列を免疫保護増強配列と動作可能に連結することによって、好ましくは免疫保護増強配列を制御配列とヌクレオチド配列の間に導入することによって、宿主内でRSV F蛋白質による免疫保護を増強する
段階を更に含み得る。
【0021】
その上、本発明は、呼吸器シンシチウムウイルスによる感染によって発症する疾患に対して、宿主を保護するワクチンを生産する方法であって、
自家RSV Fシグナルペプチド配列を有するRSV F蛋白質をコードする第1のヌクレオチド配列を分離すること、
自家RSV Fシグナルペプチド配列をコードするヌクレオチド配列を、RSV F蛋白質の発現量を増強する異種シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列で置換することによって、第2のヌクレオチド配列を形成すること、
第2のヌクレオチド配列を少なくとも1個の制御配列と動作可能に連結することによる、プラスミドベクターを含む非複製性ベクターの産生において、宿主内でそのベクターから in vivo で発現するときの、RSV F蛋白質に対する免疫反応を起こすために宿主に投与するとき、その制御配列はRSV F蛋白質の発現を指示するものであること、および
そのベクターを in vivo 投与のためのワクチンとして製剤すること
を含む方法を含んでいる。
【0022】
宿主内でベクターから in vivo で発現するときのRSV F蛋白質の免疫保護能を増強するために、第2のヌクレオチド配列を更に第3のヌクレオチド配列に動作可能に連結してもよい。そのベクターはプラスミドベクターp82M35Bであってよい。本発明は更に、本明細書で説明したベクターの免疫有効量を含む免疫原性組成物だけでなく、この方法によって生産されるヒト宿主を含む宿主に投与するためのワクチンも含む。
【0023】
前記のように、本発明で提供されるベクターは、診断用途において有用である。したがって、本発明の他の態様において、検体中のRSV F蛋白質の存在量を決定する方法であって、
(a)本発明で提供される非複製性ベクターで宿主を免疫処置することによって、RSV F蛋白質に特異的な抗体を産生する段階と、
(b)RSV F蛋白質特異抗体を分離する段階と、
(c)検体を分離抗体と接触させることによって、検体中に存在する任意のRSV F蛋白質とRSV F蛋白質特異抗体とを含む複合体を生成させる段階と、
(d)複合体の生成量を決定する段階
を含む方法が提供される。
【0024】
抗体を引出すために使用する非複製性ベクターは、プラスミドベクターp82M35Bであってよい。
【0025】
本発明は、検体中のRSV F蛋白質の存在を検出するための診断キットであって、
(a)RSV F蛋白質に特異的な抗体を産生するための、本発明で提供される非複製性ベクターと、
(b)前記RSV F蛋白質特異抗体を分離するための分離手段と、
(c)分離したRSV F特異抗体を検体と接触させることによって、検体中に存在する任意のRSV F蛋白質とRSV F蛋白質特異抗体とを含む複合体を生成させる接触手段と、
(d)複合体の生成量を決定するための同定手段
を含むキットも含む。
【0026】
本発明は更に、RSV F蛋白質特異ポリクローナル抗体を産生する方法であって、本明細書に記述した免疫処置法の使用を含み、免疫処置した動物からRSV F蛋白質特異ポリクローナル抗体を分離する段階を更に含む方法も対象とする。
【0027】
本発明は、RSVのF蛋白質に特異的なモノクローナル抗体を産生する方法であって、
(a)本発明で提供される非複製性ベクターを構築する段階、
(b)そのベクターを少なくとも1匹のマウスに投与することによって、少なくとも1匹の免疫マウスを産生する段階、
(c)少なくとも1匹のその免疫マウスからBリンパ球を除く段階、
(d)少なくとも1匹のその免疫マウスから得たBリンパ球を骨髄腫細胞と融合することによって、ハイブリドーマを産生する段階、
(e)そのハイブリドーマをクローニングする段階、
(f)抗F蛋白質抗体を産生するクローンを選択する段階、
(g)抗F蛋白質抗体産生クローンを培養する段階、および
(h)抗F蛋白質モノクローナル抗体を分離する段階
を含む方法も対象とする。
【0028】
本出願明細書において、「RSV F蛋白質」という用語は、(1)長さの完全な成熟RSV F蛋白質であって、様々なRSV株中に自然に発生する変異を含め、アミノ酸配列に変異を有する蛋白質、(2)トランスメンブラン領域を欠いたRSV F蛋白質の分泌形態、および(3)RSV F蛋白質の機能的類縁体、を定義するために使用される。本出願明細書において、第1の蛋白質が第2の蛋白質と免疫学的に関連し、および/または第2の蛋白質と同じ機能を有する場合、第1の蛋白質は第2の蛋白質の「機能的類縁体」である。機能的類縁体は、例えば、その蛋白質の断片、または、その置換型、付加型または欠失型の突然変異体であってよい。RSV F蛋白質と特異的に反応する抗体および/またはCTLを生じるRSV F蛋白質断片が、その中に含まれる。
【0029】
本発明はさらに、図に係る以下の概括的な説明および実施例からさらに詳しく理解されよう。
【0030】
(発明の全般的説明)
上記のように、本発明は一般に、DNAを含むポリヌクレオチド、呼吸系発疹ウイルス(RSV)による感染に対して防御を獲得する免疫、および特別のベクターを利用する診断法に関する。本発明において、RSV F蛋白をコード化するヌクレオチド配列を含ませるために幾つかの組換えベクターが構築された。ここに記載されたベクターのうちのあるものはまた、前記の国際公開第96/04095号に記載されているが、それら調製の記載以外、本発明の部分を形成しておらず、免疫化研究における使用は完全さを期するため、また比較のためにここに含まれる。
【0031】
自己由来シグナルペプチドをコード化する配列を有する完全長RSV F遺伝子のヌクレオチド配列を図2(SEQ ID番号:1)に示す。ここに用意されたある一定の構築物は、完全長RSV F(SEQ ID番号:2)蛋白をコード化するヌクレオチド配列を含むが、他のものは、末端コドンを膜内外のコード化領域(図3を参照、SEQ ID番号:3)のすぐ上流への挿入により修飾されたRSV F遺伝子を含み、蛋白の膜内外部分の発現を防止し、膜内外領域(SEQ ID番号:4)を欠如する分泌形または切頭形RSV F蛋白を産生する。さらに、本発明に従ってここに用意されたある一定の構築物は、自生のシグナルペプチド配列よりはむしろ、非相同性シグナルペプチド配列をコード化する核酸配列を含み蛋白発現の数および免疫原性の増強を提供する。具体的に、HSV IgDに関するシグナルペプチド配列は、好ましい実施形態におけるこのような目的のために使用される。しかしながら、ヒト組織のプラスミノーゲン活性化因子(TPA)などの他の非相同性シグナルペプチドを使用してもよい。
【0032】
コード化RSV F蛋白の発現のために、実際にはRSV F蛋白をコード化するヌクレオチド配列をプロモーター配列に結合させる。このプロモーター配列は直接早期のサイトメガロウイルス(CMV)プロモーターであってもよい。このプロモーターは引用文献13 に記載されている。ラウス肉腫ウイルスLTRなどの構築プロモーター類、メタロチオニンプロモーターなどの誘導プロモーター類、および組織特異的プロモーター類など任意の他の好適なプロモーターを使用してもよい。
【0033】
動物に投与する場合、投与される動物における抗体反応により示されるように、ここに提供されたベクター類はin vivo RSV F蛋白発現で働く。下記にさらに詳述するように、このような抗体類は、ここで試料中のRSV蛋白の検出に用いることが可能である。コード化されたRSV F蛋白が、プラスミドpXL1(図4)のように膜内外領域を欠いているRSV F蛋白の形態である場合、下記実施例に見られるように、ベクターの投与は、抗体および細胞介在免疫反応を中和する生RSVウイルスおよび免疫化された動物における免疫強化の欠如によるチャレンジに対して、マウスおよびコトンラットにおいて防御を提供した。
【0034】
組換えベクターはまた、ヌクレオチド配列をコード化するRSV F蛋白に隣接して位置する第2のヌクレオチド配列を含んで、宿主の in vivo で発現される際にRSV F蛋白の免疫防御能力を増強することもできる。このような増強は、in vivo 発現の増大、例えばmRNA安定性の増大、転写および/または翻訳の増大により与えることができる。この追加配列は、プロモーター配列とRSV F蛋白コード化配列との間に位置することが好ましい。
【0035】
この増強配列には、転写および翻訳中の異所mRNAスプライシングを防止する1対のスプライス部位を含んでもよく、その結果、実質的に全ての転写mRNAが、RSV F蛋白をコード化する。具体的には、図7に示されたウサギβ−グロビンイントロンII配列(SEQ ID番号:5)は、引用文献15 にも記載されているように、このようなスプライス部位を備えることができる。
【0036】
イントロンII配列、CMVプロモーター、および膜内外領域を欠く切頭形RSV F蛋白にコード化するヌクレオチド配列を含有する構築物、すなわちプラスミドpXL2(図5)は、下記の実施例に見られるように、生RSVによるチャレンジに対してマウスにおける完全防御を誘導した。さらに、イントロンII配列、CMVプロモーター、および完全長RSV F蛋白をコード化するヌクレオチド配列を含有する構築物、すなわちプラスミドpXL4(図7)は、下記の実施例に見られるように、生RSVによるチャレンジに対してマウスにおける防御を提供した。プラスミドpXL1、pXL2、pXL3およびpXL4は全て、自己由来シグナルペプチド配列を含有し、前記国際公開第96/04095号に従って構築される。
【0037】
イントロンII配列、CMVプロモーター、HSV IgDシグナルペプチドコード化配列、および膜内外領域を欠く切頭形RSV F蛋白をコード化するヌクレオチド配列を含有する構築物、すなわちプラスミドp82M35B(図10)は、本発明に従い下記の実施例に見られるように、心臓毒による前処理が完全保護を授けるpXL2にとり必要とされる条件下、心臓毒の前処理無しで完全防御を誘導した。
【0038】
ここで提供されたベクターはまた、RSVからのさらなる抗原をコード化する第3のヌクレオチド配列、少なくとも1つの他の病原体またはサイトカインなどの少なくとも1つの免疫調節剤も含んでよい。このようなベクターは、キメラ構造またはビシストロン構造における前記第3のヌクレオチド配列を含んでもよい。あるいは、第3のヌクレオチド配列を含有するベクター類を個々に構築してもよく、ここに提供された核酸分子と共に宿主に共に投与してもよい。
【0039】
本発明の種々の実施形態は、ワクチン接種、RSV感染の診断と治療の分野に多くの応用を有することは当業者にとって実に明白となる。このような利用について、さらに非限定の検討をさらに下記に示す。
【0040】
1.ワクチン調製並びに利用
ワクチンとして用いるのに好適な免疫原性組成物は、ここに開示されるようなRSV F遺伝子類およびベクター類から調製できる。このワクチンは、被験者に抗F抗体の産生などの免疫反応を誘発する。核酸を含有するワクチンなどの免疫原組成物は、ポリヌクレオチド投与のために生理学的に許容できる液体溶液または乳濁液での注射剤として調製可能である。この核酸は、核酸リポソーム(例えば、引用文献17 の国際公開第9324640号に記載されるような)として当業界に知られるレシチンリポソーム類または他のリポソーム類などのリポソーム類と関連づけられ、またはこの核酸は、さらに以下に詳細が記載されるようにアジュバントと関連づけられる。カチオン性脂質を含んで成るリポソーム類は、自発的に且つ迅速にDNAおよびRNAなどのポリアニオン類と相互作用し、ポリヌクレオチドの 100%まで捕捉するリポソーム/または核酸複合体となる。さらに、ポリカチオン性複合体は細胞膜と融合し、リソソーム区画の分解性酵素を迂回するポリヌクレオチドの細胞内送達を生じさせる。公表されたPCT出願国際公開第94/27435号には、カチオン性脂質およびポリヌクレオチドを含んで成る遺伝子免疫化に関する組成物を記載している。カルシウムイオン類、ウイルス蛋白および他のトランスフェクション促進剤などの核酸の細胞内取り込みを補助する試薬の使用が有利と成り得る。
【0041】
ポリヌクレオチド免疫原性製剤はまた、生分解性の持効性粒子を含むマイクロカプセルとして製剤化することもできる。このように米国特許第5,151,264号には、バイオベクタースプラ分子(Bio Vecteurs Supra Moleculaires)(BVSM)と呼ばれたリン脂質/糖脂質/多糖種の微粒子担体を記載している。この微粒子担体は、その層のうちの1層に生物活性を有する多様な分子を輸送するために意図される。
【0042】
米国特許第5,075,109号には、50:50 ポリ(DL−ラクチデコ−グリコリド)中、抗原のトリフェニル化キーホールリンペットヘモシニアンおよびブドウ球菌エンテロトキシンBのカプセル化を記載している。カプセル化用の他のポリマー類には、ポリ(グリコリド)、ポリ(DL−ラクチド−コ−グリコリド)、コポリオキサレート類、ポリカプロラクトン、ポリ(ラクチド−コ−カプロラクトン)、ポリ(エステルアミド類)、ポリオルトエステル類、およびポリ(8−ヒドロキシ酪酸)およびポリ無水物などが考えられる。
【0043】
公表されたPCT出願国際公開第91/06282号には、複数の生体接着ミクロスフェア類および抗原類を含んで成る送達媒体を記載している。ミクロスフェアは、デンプン、ゼラチン、デキストラン、コラーゲンまたはアルブミンである。この送達媒体は、特に鼻粘膜を通ってのワクチンの取り込み用のものである。この送達媒体は、さらに吸収増強剤を含んでよい。
【0044】
RSV F遺伝子並びにベクター類は、それと適合する製剤上許容できる賦形剤と混合することができる。このような賦形剤としては、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールおよびそれらの組み合わせを挙げることができる。この免疫原性組成物およびワクチンは、その効果を強化するために湿潤剤または乳化剤、pH緩衝剤、またはアジュバントなどの補助剤をさらに含有してもよい。この免疫原性組成物およびワクチンを、可能ならば局所麻酔による注射部位の前処理後、皮下注射、静脈注射、皮内注射または筋内注射により非経口的に投与してもよい。あるいは、本発明に従って形成された免疫原性組成物は、粘膜表面で免疫反応を誘発する様式で製剤化並びに送達されてもよい。このように免疫原性組成物は、例えば鼻または経口(胃内)経路により粘膜表面に投与できる。あるいは、坐薬および経口製剤などの他の投与態様を所望できる。坐薬に関して、結合剤および担体には、例えば、ポリアルカレングリコール類またはトリグリセリド類を含んでよい。経口製剤は、通常、例えば製薬グレードのサッカリン、セルロースおよび炭酸マグネシウムなどの初発剤を含んでよい。
【0045】
免疫原性製剤並びにワクチンは、投薬剤形に適合した様式、および治療上効果的であり、防御的および免疫原性となるような用量で投与される。投与量は、例えばRSV F蛋白およびそれに対する抗体を合成し、要すれば細胞介在の免疫反応を生じさせる個々の免疫系の能力など治療を受ける被験者に依存する。投与に必要な有効成分の正確な量は、医師の判断に依る。しかしながら、好適な投薬量の範囲は、当業者により容易に決定でき、RSV F遺伝子およびベクターの約1μgから約1mgのレベルであり得る。初発投与並びに追加抗原投与量に係る好適な用法−用量もまた変わり得るが、初発投与に引き続く投与を含んでもよい。投薬量は、投与経路にも依存し、宿主のサイズに従って変えられる。1種の病原体のみに対して防御するワクチンは単価ワクチンである。幾つかの病原体の抗原物質を含むワクチンは、組み合わせワクチンであり、また本発明に属すことができる。このような組み合わせワクチンは、例えば種々の病原体、または同一病原体の種々の株、または種々の病原体の組み合わせからの物質を含む。
【0046】
ベクター類が、リン酸緩衝生理食塩水中 0.05%から 0.1%溶液として一般に使用されるアジュバント類と共に投与されると、免疫原性は有意に改善される。アジュバント類は抗原の免疫原性を増強するが、必ずしもそれ自体が免疫原性ではない。アジュバント類は投与部位近くの局所に抗原を保持することにより作用し、免疫系の細胞に対する抗原の緩やかな放出の維持を促進する貯留効果を生じさせる。アジュバント類はまた、貯留抗原に対し免疫系の細胞を引きつけることができ、そのような細胞が免疫反応を誘発するように刺激できる。
【0047】
免疫刺激剤またはアジュバント類は、例えばワクチンに対する宿主の免疫反応を改善するために長年使用されてきた。したがって、アジュバント類は、抗原に対する免疫反応を増強することが認められてきた。しかしながら、これらのアジュバントの幾つかは毒性があり、ヒトおよび多数の動物における使用を不都合にさせる望ましくない副作用を引き起こし得る。実際、水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウム(一般に集合的にアルムと呼ばれる)のみが、通常ヒトおよび獣医用ワクチンにおけるアジュバントとして使用される。
【0048】
広範囲の外因性アジュバントおよび他の免疫調節物質は、抗原に対し効力のある免疫反応を誘発することができる。これらには、膜蛋白抗原に対して錯体を作るサポニン類が挙げられ、モノホリル脂質A、QS21 およびポリホスファゼンと同様、免疫刺激複合体(ISCOMS)、鉱油との複雑なポリマー、鉱油中の殺菌マイコバクテリア、フロイント完全アジュバント、ムラミルジペプチド(MDP)およびリポ多糖(LPS)などの細菌産生物を産生する。
【0049】
本発明の詳細な実施形態において、RSVのF蛋白をコード化する第1のヌクレオチド配列を含んで成るベクターは、免疫系の細胞など選択された細胞に対してこのベクターを標的にする標的分子と協働して送達できる。
【0050】
ポリヌクレオチドは、多様な方法、例えばウシ成長ホルモン(BGH)をコード化するDNAで被覆された金ミクロ発射物のマウスの皮膚への導入は、マウスに抗BGH抗体を産生させることを開示したTangら(引用文献10)の方法、他方、ジェットインジェクタが生きた動物の皮膚、筋肉、脂肪および哺乳動物の組織にトランスフェクションするのに使用できることを示したFurthら(引用文献11)の方法により宿主に送達可能である。
【0051】
2.イムノアッセイ
本発明のRSV F遺伝子およびベクター類は、酵素結合免疫吸着法(ELISA)、RIAsおよび他の非酵素的結合抗体結合アッセイまたは当業界に知られた方法などのイムノアッセイでの利用のために抗F抗体の生成に係る免疫原として有用である。ELISAアッセイにおいて、先ずベクターを宿主に投与し、RSV F蛋白に特異的な抗体を生成する。これらのRSV F特異的抗体を、選択された表面、例えばポリスチレン微量定量プレートのウェルなどの抗体を結合できる表面上に固定化する。不完全に吸着された抗体を除去するために洗浄後、試験試料に関して抗原的に中性であると知られているウシ血清アルブミン(BSA)の溶液などの非特異的蛋白を選択された表面に結合させ得る。これは、固定化表面上の非特異的吸着部位の遮断を可能にし、したがって抗血清の表面上への非特異的結合により生じた背景を減じることができる。
【0052】
次いで固定化表面を、臨床的または生物学的材料などの試料と接触させ、免疫複合体(抗原/抗体)形成に資した方法で試験する。この方法は、BSA、ウシガンマグロブリン(BGG)および/またはリン酸緩衝生理食塩水(PBS)/Tween の溶液などの希釈剤で試料を希釈することを含んでもよい。次に試料を、約20℃から 37℃の温度範囲などで約2時間から4時間培養させる。培養後、試料接触面を洗浄し、非免疫複合体物質を除去する。洗浄方法は、PBS/Tween またはホウ酸緩衝剤などの溶液での洗浄を含んでよい。試験試料と結合RSV F特異的抗体との間の特異的免疫複合体の形成、引き続く洗浄後、免疫複合体形成の発生率および平均量が決定できる。
【0053】
生物材料
RSV F蛋白をコード化する遺伝子を含み、ここに言及するある一定のプラスミドは、ブダペスト条約に従って本願書の出願前に、米国 20110−2209 バージニア州マナサス、10801大学通り、アメリカ型培養収集(America Type Culture Collection)(ATCC)に寄託されている。寄託プラスミドの試料は、これまたは米国特許出願に基づき特許を認可する上で公衆にとって入手できることになり、寄託物の入手に関する全ての制限はこの時点で除かれる。寄託保管所が生存試料を施行できない場合、この寄託物は交換されることになる。寄託された実施形態が発明の例証としてのみ意図されるものであることから、ここに記載され特許請求された発明は、寄託プラスミドによる範囲において限定されない。本出願に記載されるものと同様のまたは等しい抗原をコード化する任意の等しいかまたは同様のプラスミドが本発明の範囲内にある。
【0054】
実施例
上記開示は、広く本発明を説明する。より完全な理解は、以下の具体的実施例を参照することにより得ることができる。これらの実施例は、単に例証目的のために説明するものであり、本発明の範囲を限定するものではない。同等物の形体変化および代用物の変化は、状況を示唆でき、または都合よくできるように熟慮されている。特殊な用語がここでは用いられているが、このような用語は、説明上意図されているものであり、限定目的のためではない。
【0055】
分子遺伝学、蛋白生化学および免疫学の方法を用いるが、本開示において明白には説明されず、これらの実施例は、科学文献に詳細に記載されており、十分に当業者の技量内にあるものである。
【0056】
実施例1
本実施例は、RSV F遺伝子を含有するベクターの構築を説明する。
【0057】
図1は、呼吸系発疹ウイルスのF蛋白をコード化する遺伝子の制限マップを示し、図2は、完全長のRSV F蛋白(SEQ ID番号:1)および推測されたアミノ酸配列(SEQ ID番号:2)をコード化する遺伝子のヌクレオチド配列を示す。図3は、分泌されるRSV F蛋白をコード化する遺伝子(SEQ ID番号:3)および推測されたアミノ酸配列(SEQ ID番号:4)を示す。
【0058】
RSV Fをコード化するcDNAが、直接早期のプロモーター、エンハンサーおよびヒトサイトメガロウイルス(CMV)のイントロンA配列の下流域、およびウシ成長ホルモン(BGH)Poly−A部位の上流域にサブクローン化した、4種のプラスミドDNA構築物のセットが作製された(図4から図7に図式的に示されるように)。プロモーターを含有する 1.6KbSspl−PstIフラグメント、エンハンサーおよびCMVタウン株のイントロンA配列は、ジョンズホプキンス大学のG.S.Hayward博士から恵与されたプラスミドpRL43a(引用文献20)から最初に誘導され、EcoRVとpBluescript11SK+/−のPstI部位(層遺伝子)との間でサブクローン化した。F蛋白の分泌体を発現するプラスミド(図4および図5のpXL1およびpXL2)の構築に関しては、サブグループAに属する臨床単離体から独自にクローン化されたFcDNAの切頭形体を含有する 1.6KbEcoRI−BamHIフラグメントが、pRSVFから切除され(引用文献18および国際公開第93/14207号)、EcoRIとpSG5のBamHI部位(層遺伝子、引用文献14)との間でサブクローン化した。次に 1.6KbEcoRI−BamHIフラグメントまたは 2.2KbClaI−BamHIフラグメントのいずれかをpSG5構築物から切除し、クレノウで充填し、プロモーターとイントロンA配列を含有するpBluescriptIISK+/−構築物のSmaI部位にサブクローン化した。pSG5から誘導された 0.6KbClaI−EcoRIフラグメントは、ウサギβ−グロビンからのイントロンII配列を含んでいた。引き続きプラスミドは、HindIIIで消化され、クレノウで充填され、XbaIで消化され、3.2Kbまたは 3.8Kbのいずれかのフラグメントを生成した。これらのフラグメントは、pRc/CMV(インビトロゲン)にCMVプロモーターを含有する 0.8KbNruI−XbaIフラグメントの代わりに使用され、それぞれ最終のpXL1およびpXL2構築体となる。
【0059】
完全長F蛋白(pXL3およびpXL4−図6および図7)を発現するプラスミドの構築に関して、完全長RSV FcDNAは、挿入体(引用文献18および国際公開第93/14207号)を含有する組換えpBluescript M13−SK(層遺伝子)から 1.9KbEcoRIフラグメントとして切除し、pSG5(層遺伝子)のEcoRI部位にサブクローン化した。次いで 1.9KbEcoRIフラグメントまたは2.5KbClaI−BamHIフラグメントのいずれかをpSG5構成物から切除し、クレノウで充填し、プロモーターとイントロンA配列を含有するpBluescriptIISK+/−構成物のSmaI部位にサブクローン化した。残りのpXL3およびpXL4に関する構築は、上記のpXL1およびpXL2の構築と同じであった。したがって、CMVプロモーターとイントロンA配列以外のpXL1〜4における残りのベクター成分は、プラスミドpRc/CMVから誘導された。プラスミドpXL1およびpXL2は、停止コドンを輸送するF蛋白の切頭形/分泌形を発現するのに作製され、不活性分子と比較して、膜内外(TM)およびC末端サイトソール尾部を含む48個のアミノ酸のC−末端欠失となった。これに対してpXL3およびpXL4は、TMおよびサイトソールC末端尾部を含むRSV F分子の不活性膜付着体を発現するために作製された。pXL2およびpXL4中のイントロンII配列の存在根拠は、このイントロンがRNAの正確なスプライシングを仲介すると報告されたことであった。RSV−Fに関するmRNAが、異所スプライシングの傾向があると思われたことから、イントロンII配列の存在は、これを克服する助けとなると思われる。4種の全てのプラスミド構築体は、DNA塩基配列決定分析により確認された。プラスミドpXL1、pXL2、pXL3およびpXL4は全て、自己由来シグナルペップチド配列を含有し、前記の国際公開第96/04095号に従って構築される。
【0060】
プラスミドDNAは、製造元の使用説明書に従ってQiagen社(米国カリフォルニア州チャッツワース)からのプラスミドメガキットを用いて精製された。
【0061】
実施例2
本実施例では、マウスの免疫化を説明する。マウスは引用文献16に記載されるようにRSVによる感染に鋭敏である。
【0062】
筋内(i.m.)免疫化について、9匹のBALB/cマウス群(オス、6〜8週齢)(米国メイン州バーハーバー、Jackson Lab.)の前脛骨筋に、pXL1〜4のそれぞれ2×50μg(PBS中1μg/μL)を両側に注射した。DNA注射5日前に、筋肉を2×50μL(PBS中10μM)の心臓毒剤(Latoxan、仏国)で処理した。心臓毒剤による筋肉の前処理は、DNA取り込みを増加し、それに続く筋内経路による免疫反応を増強すると報告されている(引用文献24)。これらのマウスは、1カ月後同様に抗原追加された。対照群のマウスを、同一のスケジュールに従ってRSV F遺伝子の無い同一のベクター要素配列を含有するプラセボプラスミドで免疫化した。皮内(i.d.)免疫化に関しては、100μgのpXL2(PBS中2μg/μL)を背基部から1〜2cm遠位の皮膚に注射した。これらのマウスは、1カ月後同様に抗原追加された。
【0063】
第2の免疫化後 75日目に、マウスは、105.4プラーク形成単位(pfu)のマウス適合RSVのA2サブタイプ(米国テキサス州ヒューストン、ベイラー医科大学P.Wyde博士より恵与された)によりチャレンジされた。肺は4日後無菌的に除去され、重量計測し、2mLの完全培地中均質化した。肺ホモジネートにおけるpfu数は、ワクチン品質のベロ細胞を用いて前記(引用文献19)のように2回で決定された。これらのデータは、SigmaStat(カナダ国オンタリオ州ゲルフ、Jandel Scientific Software)を用いて統計解析に供された。
【0064】
免疫化マウスから得られた血清を、酵素結合免疫吸着法(ELISA)による抗RSV F抗体力価(それぞれIgG、IgG1およびIgG2a)およびRSV特異的プラーク減少力価に関して分析した。ELISAは、免疫親和性精製RSV F蛋白(50ng/mL)で被覆された 96ウェルプレートおよび2倍連続希釈の免疫血清を用いて実施された。アルカリホスファターゼ(カナダ国オンタリオ州 Mississauga、Jackson ImmunoRes.)抱合ヤギ抗マウスIgG抗体を、二次抗体として用いられた。IgG1およびIgG2a抗体力価の測定のために、使用される二次抗体は、それぞれ単一特異性のアルカリホスファターゼ抱合ヒツジ抗マウスIgG1抗体(カナダ国オンタリオ州トロント、Serotic)およびラット抗マウスIgG2a抗体(米国カリフォルニア州サンフランシスコ、Zymed)であった。プラーク減少力価は、ワクチン品質のベロ細胞を用いてPrinceら(引用文献19)に従って決定された。4倍連続希釈の免疫血清は、培地中 50pfuのRSV長株(ATCC)と共に5%CO2存在下、37℃1時間培養した。次にベロ細胞をこの混合に感染させた。プラークを 80%メタノールで固定し、5日後ペルオキシダーゼ(カナダ国オンタリオ州 Mississauga、Jackson ImmunoRes.)抱合マウス抗RSV FモノクローナルIgG1抗体およびロバ抗マウスIgG抗体を用いて展開した。RSV特異的プラーク減少力価は、プラーク数の60%減少を生じる血清試料の希釈として定義された。ELISAおよびプラーク減少アッセイの双方は、2重に実施され、データは2つの測定平均として表される。これらのデータはSigmaStat(カナダ国オンタリオ州ゲルフ、Jandel Scientific Software)を用いて統計解析に供された。
【0065】
DNA免疫化後RSV特異的CTLの誘導を検討するために、2匹の免疫化マウスから脾臓を除去し、集められた単細胞懸濁液を調製した。脾細胞は、1TCID50/細胞RSV(長株)に2時間感染させてガンマ放射された(3,000ラド)同系脾細胞(2.5×106個の細胞/mL)を用いて 10U/mLマウスインターロイキン2(IL−2)を含有する完全RPMI培地中で 2.5×106個の細胞/mLにて培養した。マウスIL−2源は、バーゼル免疫研究所のH.Karasuyama博士(引用文献20)から恵与された高濃度のIL−2を構成的に分泌するマウス細胞系の上澄液であった。CTL活性は、標準的な4時間のクロム放出アッセイにおいて in vitro の再刺激5日後に試験した。標的細胞は、それぞれ5種の51Cr標識未感染BALB/c線維芽細胞(BC細胞)および永続的RSV感染BCH14線維芽細胞であった。洗浄された応答細胞は、96ウェルV字底組織培養プレートにて37℃4時間、200μL中目標比率に対してエフェクターを変えて2×103個の標的細胞を用いて培養した。自発的且つ総クロム放出は、応答リンパ球の不在下、培地または 2.5%トリトン−X100 のいずれかを用いて標的細胞を培養することにより決定された。特異的なクロム放出パーセントは、(カウント−自発的カウント)/(総カウント−自発的カウント)×100 として算出された。試験は3回実施され、データは3回の測定平均として表される。CTLアッセイにおける抗体遮断試験に関して、クロム標識BCまたはBCH4細胞を添加する前に、エフェクター細胞は、CD4(GK1.5)(引用文献21)に対する精製mAbまたはマウスCD8(53−6.7)(引用文献22)に対する精製mAbの最終10μg/mLにより1時間培養した。殺CTLにおける抗クラスIMHC抗体の効果を決定するために、クロム標識標的細胞BCまたはBCH4を、エフェクター細胞の添加前にクラスIMHC(34−1−2S)(引用文献23)のKdおよびDdを認識するmAbを分泌するハイブリドーマの培養上澄の 20μLで培養した。
【0066】
実施例3
本実施例では、筋内経路によるポリヌクレオチド免疫化による免疫原性および防御を説明する。
【0067】
筋内DNA投与後抗体応答を特性化するために、免疫血清を、ELISAによる抗RSV FIgG抗体力価に関してまたRSV特異的プラーク減少力価に関してそれぞれ分析した。4種のプラスミド構築物はすべて免疫原性であることが判った。pXL1〜4で免疫化されたマウスから得た血清は、プラセボ群と比較して、有意な抗RSV FIgG力価またRSV特異的プラーク減少力価を示した(下記の表1)(それぞれP<0.0061および<0.0001、マン‐ホイットニー検定)。しかしながら、pXL1、pXL2、pXL3、pXL4のいずれで免疫化したマウス間でも抗RSV FIgG力価またRSV特異的プラーク減少力価のいずれにおいても有意差はない。
【0068】
下気道の初回抗原刺激のRSV感染に対してpXL1〜4の防御能力を評価するために、免疫化マウスをマウス適合RSVで鼻腔内にチャレンジし、およびチャレンジ後のウイルス肺力価を評価した。4種のプラスミド構成体すべてが、RSV感染に対してマウスを防御することが判った。プラセボ群と比較して、ウイルス肺力価における有意な減少が、pXL1〜4で免疫化されたマウスに観察された(P<0.0001、マン‐ホイットニー検定)。しかしながら、防御程度の変化がプラスミドに依存して観察された。特に、pXL1は、pXL3よりも防御性があり(P=0.00109、マン‐ホイットニー検定)、およびpXL4はpXL3よりも防御性あったが(P=0.00125)、一方、pXL2のみが完全防御を誘導した。この結論は、エンドポイントとして多くの完全防御マウスでの他の解析により確認された(フィッシャーの完全検定)。構築体pXL1、pXL2またはpXL4は、プラセボ以上の効果が無かったpXL3よりも高程度の防御を与えた(P<0.004、フィッシャーの完全検定)。pXL2のみが全ての免疫化マウスの中で完全防御を与えた。
【0069】
上記の統計解析は、pXL1がpXL3よりも有意な防御を提供することを明らかにした。前者は切頭形および分泌形を発現し、後者はRSV F蛋白の不活性膜固定形を発現する。さらに、pXL4はpXL3よりも防御性があることが示された。これら2つの構築体間の相違は、pXL4におけるイントロンII配列の存在である。イントロンII配列と関連してRSV−Fの分泌形を発現する構築体pXL2は、実施例2のプロトコルにて免疫化された全マウスにおいて完全防御を提供するのは唯一のプラスミドであった。
【0070】
実施例4
本実施例では、免疫原性および防御能力におけるpXL2の投与経路の影響を説明する。
【0071】
DNA投与の筋内および皮内経路を、抗RSV F抗体力価およびRSV特異的プラーク減少力価の観点で免疫原性に関して比較した。免疫血清の解析により(下記の表2)、DNA投与の皮内投与を抗RSV FIgGおよびIgG1抗体応答により判定すると、筋内経路と同じく免疫原性であり、RSV特異的プラーク減少力価も同様であることが明らかとなった。しかしながら、筋内経路のみが有意な抗RSV FIgG2a抗体応答を誘導したが、一方、皮内経路が使用された場合、IgG2aイソタイプ力価は無視してよいものであった。筋内および皮内経路はまた、RSV特異的CTLの誘導に関して比較した。有意なRSV特異的CTL活性が、筋内免疫化マウスにおいて検出された。対照的に、細胞応答は皮内接種されたマウスにおいて有意により低かった(下記の表3)。これらの相違にもかかわらず、下気道の初回抗原刺激のRSV感染に対する防御は、いずれかの経路を経て免疫化された両群のマウスにおいても観察された(下記の表4)。RSV−FDNAにより誘導されたCTLは、古典的なCD8+クラスI制限CTLである。標的細胞のBCH4線維芽細胞は、クラスIMHCのみを発現し、クラスIIMHCを発現しない。さらに、抗クラスIMHC抗体を有するBCH4標的細胞の前培養は、RSV−F DNA誘導CTL系列の溶菌活性を有意に遮断した。抗CD8抗体は、BCH4細胞の溶菌を部分的に遮断できたが、CD4分子の抗体は全く効果が無かった(下記の表5)。mAbからCD8による全遮断の欠如は、CD8に影響を受けないCTL(たとえそれらがCD8+CTLであっても、それらのTCRがクラスIMHC+ペプチドに十分な親和性を有し、クラスIMHCのアルファ3とCD8との相互作用を必要としないことを意味する)によるか、またはこれらの実験に用いられた抗体量が制限されていたことによると考えられる。YAC−1(NK感受性標的)細胞の溶菌は検出できなかった(データは示さず)。
【0072】
実施例5
本実施例では、pXL2を用いたコトンラットにおける免疫化試験を説明する。
【0073】
DNA免疫化に対するコトンラットの免疫反応は、下記の表6に示されたプロトコルにより分析された。5日目に、40匹のコトンラットを無作為に選び、各5匹の8グループに分けた。グループ1からグループ7のコトンラットは、心臓毒剤(1.0μM)を前脛骨(TA)の両側筋肉に筋内接種された。1日目に、グループ8のコトンラットはブピバカイン(0.25%)をTA筋肉内に接種された。0日目に、各グループの数匹の動物を採血し、ワクチン投与前の試験動物の血清中のRSV特異的抗体濃度を決定した。次いで全ての動物に、200μgのプラスミドDNA、プラセボ(RSV非特異的DNA)、RSVの 100 中央値のコトンラット感染量(CRID50;ポジティブコントロール)またはHep−2組織培養細胞で調製したホルマリン不活化RSVを接種し、アルムにて抗原増強された。44日後グループ1および7のコトンラットのTA筋にカルジオトキシンを接種した。4日後(ワクチンによる初回抗原刺激の 48日後)、グループ8の動物は、右肢のTA筋にブピバカインを再接種した。翌日(ワクチンによる初回抗原刺激の7週後)、全ての動物を採血し、生存RSVを投与したグループの動物を除く全ての動物を0日目に用いた同一物質の同一用量で抗原追加を行った。29日後、各コトンラットを採血し、次いでHep−2組織培養細胞で増殖した 100 CRID50 RSV A2により鼻孔内(i.n.)チャレンジした。このウイルスチャレンジの4日後(+88日目)、全てのコトンラットを殺し、肺を除去した。各肺のセットから1葉をホルマリンで固定し、肺組織病理学の組織評価が施された。残りの肺葉は、RSVの存在と濃度について評価された。0日目、49日目および 78日目に採取された各血清を、RSV中和活性、抗RSV融合活性およびRSV特異的ELISA抗体について試験した。
【0074】
+49日目および+78日目のRSV中和活性は、それぞれ下記の表7(a)および表7(b)に示す。表7(a)に示された結果から理解できるように、+49日目の生RSVおよび免疫DNAで免疫化された動物は、重要なRSV結成中和力価を有していた。ホルマリン不活化RSVで免疫化された動物は、+49日目のプラセボグループと等しい中和力価を有したが、+78日目までの抗原追加後は、5.8(log10/0.05)に到達した。追加抗原では、生RSVまたは筋内プラスミド免疫化により免疫化された動物においては有意な効果は無かった。
【0075】
+82日目の鼻(上気道)洗浄におけるRSV力価を下記の表8に示す。+82日目の肺(下気道)のRSV力価を下記の表9に示す。全てのワクチンは、肺感染に対して防御を呈したが、これらの条件下で、生菌ウイルスのみが上気道感染に対して全体防御を呈した。
【0076】
コトンラットからの肺を、肺組織病理学に関して組織学的に調査し、この結果を下記の表10 に示す。実質的に感染細胞の無いまたは感染徴候の無いグループ9、および本試験で見られた最大の肺病理を示したグループ3から得られた肺切片を除いて、他のグループから得られた全ての肺切片は、よく知られたものが観察され、すなわち、散乱した感染細胞が大抵の領域存在し、幾らかの隔膜厚みがあった。これらには軽度の感染症の徴候がある。大多数の感染細胞および他の感染徴候がグループ3(すなわち、ウイルスチャレンジ前にホルマリン不活化[FI]RSVワクチンが投与された)からの肺切片に存在する。この結果は、RSV F蛋白を発現するプラスミドDNAでの免疫化は、プラセボと異なり肺組織病理とならないが、FI−RSVはより重篤な病理を生じた。
【0077】
実施例6
本実施例では、RSVチャレンジ後のpXL2により免疫化したマウスにおける局所サイトカイン発現プロフィルの測定を説明する。
【0078】
Balb/Cマウスを実施例1に記載した通り調製したpXL2 100μgにより、0週目および6週目に免疫化し、10週目に鼻腔内RSVチャレンジを行った。対照マウスを同一プロトコルに従って、FI−RSVおよび生RSVで免疫化し、RSVでチャレンジさせた。ウイルスチャレンジの4日後、免疫化マウスから肺を除去し、直ちに液体窒素中で凍らせた。総RNAは、クロロホルム抽出とイソプロパノール沈殿により、TRIzol/β−メルカプトエタノール中ホモジナイズした肺から調製した。次に、クローン法からのIL4、IL5またはIFN−γ特異的プライマーを用いて、RNA試料において逆転写ポリメラーゼチェイン反応(RT−PCR)を実施した。次に増殖産生物をクローン法からのサイトカイン特異的32P標識プローブと液体ハイブリッド形成を行い、5%ポリアクリルアミドゲル上で分析し、ゲル中の放射性シグナルの走査により定量化した。各処理群から3つのマウス肺を除去し、最低2回肺サイトカイン発現の分析を行った。データは図9に示し、これらの測定平均値と標準偏差を示している。
【0079】
図9に示されたデータから判るように、
1.生RSVによる鼻腔内(i.n.)免疫化は、平均したサイトカインプロフィル(IFN−γ、IL−4およびIL−5)となり、他方、FI−RSVによる筋内(i.m.)免疫化は、Th2優位(IL−4およびIL−5の上昇)となった。これらの結果は、文献で報告された結果と同様である。
【0080】
2.FIの分泌(sec.)体を含むpXL2によるi.m.または皮内(i.d.)経路を介しての免疫化により、生RSV免疫化によるものと同様の平均したサイトカインプロフィルが増大した。
【0081】
3.分泌形蛋白を発現するpXL2を用いてのi.m.およびi.d.免疫化によるサイトカイン反応の大きさは、生RSV免疫化によるものよりも有意に高い。
【0082】
実施例7
本実施例では、本発明に従って、RSV F蛋白をコード化し、5’UTRおよび単純ヘルペスウイルスI(HSVI)gDのシグナルペプチドを含むプラスミドベクターの構築を説明する。
【0083】
プラスミドp82M35Bは、図10 に示された計画に従って調製された。CMVプロモーター、イントロンAおよびBGHポリA配列を含むプラスミドpVR1012(Vical)(図11:SEQ ID番号:6)は、制限酵素PstIにより線状化し、T4DNAポリメラーゼにより末端鈍化させた。ウサギβグロビンイントロンII配列をClaIおよびEcoRI消化によりプラスミドpSG5(層遺伝子:引用文献14)より回収し、0.6Kbフラグメントを単離し、クレノウフラグメントポリメラーゼを用いた処理によって末端鈍化させた。次に、ウサギβ−グロビンイントロンIIフラグメントをPst I/末端鈍化VR1012 プラスミドと結合させた(図10)。このベクターを次にEcoRVによって制限化し、脱リン酸した。
【0084】
RSV Fの分泌体をSalIを用いた消化によってプラスミドpXL2より単離し(実施例1;図5)、クレノウフラグメントポリメラーゼを用いた処理により末端鈍化し、次いでKpnIにより制限化し、5’KpnI,3’末端鈍化フラグメントを産生した。HSVIgD配列は図12に示されるように、DNA(SEQ ID番号:7)、および誘導アミノ酸(SEQ ID番号:8)配列を有する合成オリゴペプチドとして合成した。
【0085】
gDオリゴヌクレオチドは5’鈍化末端と3’KpnI認識配列を有する。単離したRSV Fフラグメント、gDオリゴおよびVR1012 プラスミドを用いて、3方向結合を実施しプラスミドp82M35Bを産生した(図10)。
【0086】
実施例8
本実施例では、in vitro におけるRSV F蛋白の発現および分泌を示す。
【0087】
BHK細胞は、実施例7に記載した通り調製され、p82M35Bによって取り込まれ、その対の一方が実施例6に記載した通りに調製された自己由来のRSV Fシグナルペプチド(pXL2)を含むか、またはリポフェクチン(Gtibco/BRL)を用いてベクター要素のみ(プラセボ)によって取り込まれるかのいずれかである。取り込み48時間後に上澄液分画を回収し、F特異的酵素結合免疫吸着法(ELISA)を用いて、RSV F蛋白の定量化に供した。3つの独立した取り込みアッセイを各々のベクターについて行った。
【0088】
捕捉剤として、1つのアフィニティー精製したマウスモノクロ−ナル抗RSV F抗体(2μg/mL)を、また、検出剤としてもう1つのビオチン化モノクローナル抗RSV F抗体(0.1μg/mL)を用いてELISAを行った。続いて、セイヨウワサビペルオキシダーゼ標識アビジン(Pierce)を用いた。用いたRSV F標準蛋白は、免疫アフィニティークロマトグラフィーにより、培養ウイルスの界面活性剤溶菌液から精製した。
【0089】
表11(下記)に得られた結果を示す。表11に見られるように、プラセボに比べて、p82M35BとpXL2は双方とも取り込み 48時間後にBHKからのF蛋白の有意な発現/分泌を媒介した。さらにp82M35B取り込みBHK細胞の上澄液分画においては、pXL2取り込み細胞の上澄液分画よりも顕著に高濃度のF蛋白が一貫して検出され、後者の 5.4倍の改善を示した。これらの結果は、自己由来のRSV Fシグナルペプチドのコード配列を5’UTRのコード化配列およびHSVIgDのシグナルペプチドに置き換えることにより、in vitro でのF蛋白の発現/分泌が有意に増大することを示している。
【0090】
実施例9
本実施例では、p82M35Bを用いて実施された免疫原性試験を示す。
【0091】
BALB/cマウス(オス、6〜8週齢)(米国メイン州バーハーバー、Jackson Lab.)の前脛骨筋の両側に、2×50μg(PBS中1μg/μL)のp82M35B、pXL2またはベクター要素のみ(プラセボ)を注射した。幾つかの群では、DNA注射5日前に、該筋肉を2×50μL(PBS中 10μM)の心臓毒剤(Latoxan、仏国)で処理したが、その他の群ではこの前処理は行わなかった。これらのマウスに6週間後、同じ投与量のプラスミドDNAで抗原追加した。ポジティブコントロール群のマウスに、Hep2細胞(引用文献16)で増殖したA2サブタイプの臨床RSV株の 106プラーク形成単位(pfu)で鼻腔内(i.n.)免疫化を行った。
【0092】
免疫化マウスから得られた抗血清を、特異的ELISAを用いて抗RSV FIgG抗体力価の分析およびRSV特異的プラーク減少力価の分析を行った。免疫アフィニティー精製したRSV F蛋白(50ng/mL)を塗布した 96ウェルプレートおよび免疫血清の2倍連続血清希釈液を用いてELISAを行った。アルカリホスファターゼ抱合ヤギ抗マウスIgG抗体(カナダ国オンタリオ州 Mississauga、Jackson ImmunoRes.)を二次抗体として使用した。プラーク減少力価は、ワクチン品質のベロ細胞を用いてPrinceら(引用文献19)に従って決定した。免疫血清の4倍連続希釈液を 50pfuのRSV長株(ATCC)と共に5%のCO2存在下、培養温度 37℃で1時間培養し、混合物を用いてベロ細胞に感染させた。プラークを 80%メタノールで固定し、5日後にマウス抗RSV FモノクローナルIgG1抗体およびペルオキシダーゼ抱合ロバ抗マウスIgG抗体(カナダ国オンタリオ州 Mississauga、Jackson ImmunoRes.)を用いて展開した。RSV特異的プラーク減少力価は、プラーク数において 60%減少となる血清試料の希釈として定義した。ELISAおよびプラーク減少アッセイは双方とも2回実施し、データは2回の測定平均を表した。
【0093】
これらの試験結果を下記の表12 に示す。血清抗体反応の誘導(表12)に関しては、p82M35Bは、使用されたDNA投与量および免疫化法の下で、心臓毒剤前処理の必要性無しで効果的であり、2回免疫化後 7.2±1.1(log2力価/100)の抗F IgG力価および 11.8±0.9(log2)のRSV特異的プラーク減少力価となった。それに対し、心臓毒剤前処理無しでpXL2によって誘発された抗体力価はそれより有意に低かった(2.9±2.3 のIgG力価および 8.2±1.9 のプラーク減少力価)。しかし、pXL2により誘発された血清抗体反応は、心臓毒剤前処理工程によって有意に改善した(7.4±1.1 のIgG力価および 10.5±0.8 のプラーク減少力価)。プラセボは、心臓毒剤前処理工程の有無にかかわらず検出し得る血清抗体反応を誘発することはできなかった。
【0094】
この傾向は、防御試験の結果(表12)に拡張させることができた。ベクターp82M35Bは心臓毒剤前処理無しで肺のRSV感染に対し完全防御を与えた。それに対し、pXL2は同一条件で部分的な防御を与えるのみであった。しかし、免疫化法に心臓毒剤前処理工程を含めた場合はpXL2ベクターにより完全防御が達成された。プラセボでは、心臓毒剤前処理工程の有無にかかわらず防御は見られなかった。
【0095】
これらの結果は、自己由来RSV Fシグナルペプチドのコード化配列を5’UTRおよびHSVIgDのシグナルペプチドのコード化配列に置き換えることにより、in vitro で評価されたF蛋白の発現/分泌(実施例8)における有意な増大のみならず、F蛋白に対する免疫原性、またマウスモデルで評価されたRSV感染に対する防御能力も増大することを示している。
【0096】
(開示の概要)
本開示を要約すると、本発明は、RSV F蛋白をコード化する遺伝子を含むある一定の新規のベクター、このようなベクターを用いる免疫化法およびこのようなベクターを用いる診断法を提供する。本発明の範囲内での変更は可能である。
【0097】
【表1】
【0098】
【表2】
【0099】
【表3】
【0100】
【表4】
【0101】
【表5】
【0102】
【表6】
【0103】
【表7(a)】
【0104】
【表7(b)】
【0105】
【表8】
【0106】
【表9】
【0107】
【表10】
【0108】
【表11】
【0109】
【表12】
【0110】
参考文献
【0111】
【表13】
【0112】
【表14】
【図面の簡単な説明】
【図1】呼吸系発疹ウイルスのF蛋白をコード化する遺伝子の制限マップを示す図である。
【図2A、図2B、図2C、図2D、図2E】自己由来のシグナルペプチド(SP)を有する呼吸系発疹ウイルスのF蛋白の膜付着形をコード化する遺伝子のヌクレオチド配列(SEQ ID番号:1)、およびそれによりコード化されたRSV F蛋白のアミノ酸配列(SEQ ID番号:2)を示す図である。
【図3A、図3B、図3C、図3D】自己由来のシグナルペプチド配列(SP)を有し、膜内外領域を欠如するRSV F蛋白の分泌形をコード化する遺伝子のヌクレオチド配列(SEQ ID番号:3)、およびそれによりコード化された膜内外領域を欠如する切頭形RSV F蛋白のアミノ酸配列(SEQ ID番号:4)を示す図である。
【図4A、図4B、図4C、図4D】膜内外領域を欠如するRSV F蛋白の分泌形をコード化する遺伝子を含有するプラスミドpXL1の構築を示す図である。
【図5A、図5B、図5C、図5D】膜内外領域を欠如するRSV F蛋白の分泌形をコード化する遺伝子を含有し、ウサギβ−グロビンイントロンII配列を含有するプラスミドpXL2の構築を示す図である。
【図6A、図6B、図6C、図6D】RSV F蛋白の完全長の膜付着形をコード化する遺伝子を含有するプラスミドpXL3の構築を示す図である。
【図7】RSV F蛋白の膜付着形をコード化する遺伝子を含有し、ウサギβ−グロビンイントロンII配列を含有するプラスミドpXL4の構築を示す図である。
【図8】ウサギβ−グロビンイントロンII配列(SEQ ID番号:5)に関するヌクレオチド配列を示す図である。
【図9】RSVチャレンジ後のDNA免疫化マウスにおける肺サイトカイン発現プロフィルを示す図である。
【図10】膜内外領域を欠如するRSV F蛋白の分泌形をコード化する遺伝子を含有し、ウサギβ−グロビンイントロンII配列およびシグナルペプチド配列HSV IgDを含有するプラスミドp82M35Bの組み立てを示す図である。
【図11】プラスミドVR−1012 のヌクレオチド配列(SEQ ID番号:6)を示す図である。
【図12】DNA(SEQ ID番号:7)および合成オリゴペプチドとして合成されたHSV IgDシグナルペプチド配列の誘導アミノ酸(SEQ ID番号:8)配列を示す図である。
Claims (18)
- 宿主に in vivo 投与するためのベクターであって、
自家RSV Fシグナルペプチド配列を欠くRSV F蛋白質をコードし、宿主内でのRSV F蛋白質の発現量を増強する異種シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第1のヌクレオチド配列、および
宿主内で前記RSV F蛋白質を発現するために前記ヌクレオチド配列と動作可能に結合したプロモーター配列
を含み、更に、
前記異種シグナルペプチドが、単純疱疹ウイルスI(HSV I)gDのシグナルペプチドである
ことを特徴とするベクター。 - 前記第1のヌクレオチド配列が、トランスメンブランコード領域を欠くRSV F蛋白質断片をコードすることを特徴とする請求項1に記載のベクター。
- 前記プロモーター配列が immediate early サイトメガロウイルスプロモーターであることを特徴とする請求項1または2に記載のベクター。
- 宿主内で前記ベクターから in vivo で発現されるときの前記RSV F蛋白質の免疫保護能を増強するために、更に第2のヌクレオチド配列を含むことをさらに特徴とする請求項1〜3のいずれかに記載のベクター。
- 前記第2のヌクレオチド配列が、異常なmRNAスプライシングを防止するために、一対のスプライス部位を含むことを特徴とする請求項4に記載のベクター。
- 前記第2のヌクレオチド配列が、前記第1のヌクレオチド配列と前記プロモーター配列との間に配置されたことを特徴とする請求項4または5に記載のベクター。
- 前記第2のヌクレオチド配列が、ウサギβ-グロビンイントロンIIのヌクレオチド配列であることを特徴とする請求項4〜6のいずれかに記載のベクター。
- プラスミドベクターであることを特徴とする請求項1〜7のいずれかに記載のベクター。
- プラスミドp82M35B(ATCC 203790)であることを特徴とする請求項1〜8のいずれかに記載のベクター。
- RSV F蛋白質に対する免疫保護反応を宿主内に起こすために、宿主に in vivo 投与するための免疫原性組成物であって、請求項1〜9のいずれかに記載のベクターおよび薬剤として許容し得るそのための担体を含むことを特徴とする組成物。
- 呼吸器シンシチウムウイルス(RSV)による感染によって発症する疾患に対して、宿主を保護するワクチンを生産する方法であって、
自家RSV Fシグナルペプチド配列を有するRSV F蛋白質をコードする第1のヌクレオチド配列を分離すること、
自家RSV Fシグナルペプチド配列をコードするヌクレオチド配列を、RSV F蛋白質の発現量を増強する異種シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列で置換することによって、第2のヌクレオチド配列を形成すること、
前記第2のヌクレオチド配列を少なくとも1個の制御配列と動作可能に連結することによる非複製性ベクターの産生において、前記RSV F蛋白質に対する免疫反応を起こすために宿主に投与するとき、前記制御配列は前記RSV F蛋白質の発現を指示するものであること、
前記ベクターを in vivo 投与のためのワクチンとして製剤すること、および
前記異種シグナルペプチドが、単純疱疹ウイルスI(HSV I)gDのシグナルペプチドである
ことを特徴とする方法。 - RSV F蛋白質をコードする前記ヌクレオチド配列が、トランスメンブラン領域を欠くRSV F蛋白質をコードすることを特徴とする請求項11に記載の方法。
- 前記少なくとも1個の制御配列が、immediate early サイトメガロウイルスプロモーターを含むことを特徴とする請求項11または12に記載の方法。
- 前記宿主内で前記RSV F蛋白質に対する免疫保護を増強するために、前記ヌクレオチド配列を免疫保護増強配列と動作可能に連結する段階を含むことを特徴とする請求項11〜13のいずれかに記載の方法。
- 前記免疫保護増強配列を、前記制御配列と前記ヌクレオチド配列の間で前記ベクター中に導入することを特徴とする請求項14に記載の方法。
- 前記免疫保護増強配列が、異常なmRNAスプライシングを防止するために、一対のスプライス部位を含むことを特徴とする請求項14または15に記載の方法。
- 前記免疫保護増強配列が、ウサギβ-グロビンイントロンIIであることを特徴とする請求項14〜16のいずれかに記載の方法。
- 前記非複製性ベクターがプラスミドベクターp82M35B(ATCC 203790)であることを特徴とする請求項11〜17のいずれかに記載の方法。
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