JP2001512662A - 呼吸器合胞体ウイルスのｇタンパク質をコードする核酸ワクチン - Google Patents
呼吸器合胞体ウイルスのｇタンパク質をコードする核酸ワクチンInfo
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Abstract
(57)【要約】
呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）のＧタンパク質をコードするヌクレオチド配列およびこのような配列に対するプロモーター、好ましくはサイトメガロウイルスプロモーターを含む、プラスミドベクターなどの非複製ベクターについて説明する。このようなベクターはまた、ＲＳＶ Ｇタンパク質に隣接して位置し、ｉｎ ｖｉｖｏで発現したときにＲＳＶ Ｇタンパク質の免疫防御能力を強化するための配列をコードする別のヌクレオチド配列を含むことができる。このような非複製ベクターを用い、ヒト宿主を含む宿主に投与することによって、ＲＳＶ感染に対して宿主を免疫化することができる。このような非複製ベクターを用い、試料中のＲＳＶ感染を検出するために抗体を産生することができる。
Description
（発明の分野） 本発明は、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）ワクチンの分野に関し、具体的に
は、ＲＳＶの付着（Ｇ）タンパク質をコードする核酸配列を含むワクチンに関す
る。
は、ＲＳＶの付着（Ｇ）タンパク質をコードする核酸配列を含むワクチンに関す
る。
【０００１】 （発明の背景） 呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）は、パラミクソウイルス科に属するネガティ
ブ鎖ＲＮＡウイルスであり、幼児および幼い小児における細気管支炎および肺炎
の原因である主要なウイルス病原体である（参照文献１−本出願を通して、本発
明が関係する技術分野の現状をより完全に説明する様々な参考文献を括弧内に示
す。それぞれの引用についての完全な文献情報は、明細書の最後、特許請求の範
囲の直前にある。これらの参考文献の開示を、参照により本開示に組み込む）。
ＲＳＶによる急性呼吸器感染症は、米国において１年につき約９０，０００件の
入院および４，５００人の死亡をもたらす（参照文献２）。ＲＳＶ感染症による
医療コストは、米国だけでも毎年３億４，０００万ドルを超している（参照文献
３）。ＲＳＶに対し、認可されたワクチンは今のところ存在しない。ＲＳＶワク
チンを開発するための主なアプローチには、不活化ウイルス、弱毒生ウイルスお
よびサブユニットワクチンが含まれていた。
ブ鎖ＲＮＡウイルスであり、幼児および幼い小児における細気管支炎および肺炎
の原因である主要なウイルス病原体である（参照文献１−本出願を通して、本発
明が関係する技術分野の現状をより完全に説明する様々な参考文献を括弧内に示
す。それぞれの引用についての完全な文献情報は、明細書の最後、特許請求の範
囲の直前にある。これらの参考文献の開示を、参照により本開示に組み込む）。
ＲＳＶによる急性呼吸器感染症は、米国において１年につき約９０，０００件の
入院および４，５００人の死亡をもたらす（参照文献２）。ＲＳＶ感染症による
医療コストは、米国だけでも毎年３億４，０００万ドルを超している（参照文献
３）。ＲＳＶに対し、認可されたワクチンは今のところ存在しない。ＲＳＶワク
チンを開発するための主なアプローチには、不活化ウイルス、弱毒生ウイルスお
よびサブユニットワクチンが含まれていた。
【０００２】 ＲＳＶに対する防御的免疫応答には、表面融合（Ｆ）糖タンパク質および付着
（Ｇ）糖タンパク質に対する中和抗体を誘導することが必要であると考えられて
いる（参照文献４）。さらに、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答は、ウイル
スの排除に関与している。Ｆタンパク質は、ＲＳＶのＡおよびＢサブグループの
間で保存されている。
（Ｇ）糖タンパク質に対する中和抗体を誘導することが必要であると考えられて
いる（参照文献４）。さらに、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答は、ウイル
スの排除に関与している。Ｆタンパク質は、ＲＳＶのＡおよびＢサブグループの
間で保存されている。
【０００３】 ＲＳＶのＧタンパク質（３３ｋＤａ）は、高度にＯ−グリコシル化され、見か
けの分子量９０ｋＤａの糖タンパク質を形成する（参照文献５）。ＲＳウイルス
の多種多様な２つのサブタイプは、ＡおよびＢと定義されてきた（参照文献６）
。これらのサブタイプ間の主要な免疫原性の相違は、Ｇ糖タンパク質に見い出さ
れる（参照文献３、７）。
けの分子量９０ｋＤａの糖タンパク質を形成する（参照文献５）。ＲＳウイルス
の多種多様な２つのサブタイプは、ＡおよびＢと定義されてきた（参照文献６）
。これらのサブタイプ間の主要な免疫原性の相違は、Ｇ糖タンパク質に見い出さ
れる（参照文献３、７）。
【０００４】 ＲＳＶタンパク質をワクチンとして用いることは、支障になることもある。血
清反応陰性のチンパンジーにおける中和抗体の誘導に関しては、これまでのとこ
ろ非経口的に投与されたワクチン候補は、免疫原性に乏しいことが立証されてい
る。これらの抗原によって誘導される血清抗体反応は、大部分の幼い幼児が持っ
ている胎盤経由で獲得した母性の抗体などの受動的に獲得した抗体の存在の下で
さらに減殺される可能性がある。ＲＳＶに感染した細胞培養物からイムノアフィ
ニティクロマトグラフィまたはイオン交換クロマトグラフィによって精製された
融合（Ｆ）糖タンパク質から成るサブユニットワクチン候補が記載されている（
参照文献８）。この調製物による血清反応陰性または血清反応陽性チンパンジー
の非経口的免疫化が行われ、血清反応陰性動物においては、約１：５０のＲＳＶ
血清中和力価を誘導するためには５０μｇを３回投与する必要があった。続いて
、これらの動物に野生型のＲＳＶを感染させると、上気道においてはウイルス分
断または臨床疾患に対する免疫化の効果は検出できなかった。下気道におけるウ
イルス分断に対するこのワクチンの免疫化の効果は検討されなかったが、ここは
非経口免疫化によって誘導される血清抗体が最も大きな効果を有すると考えられ
る部位である。安全性および免疫原性の試験は、少数の血清反応陽性の個体にお
いて行われた。ワクチンは、血清反応陽性の小児および３人の血清反応陰性の小
児（すべて、２．４歳以上）において安全であることが分かった。免疫化された
小児が少数であるため、下気道疾患に対する免疫化の効果は測定できなかった。
血清反応陽性の小児に１回の免疫化投与を行うと、ワクチンを受けた小児の４０
から６０％で、ウイルス中和抗体に４倍の増加が誘導された。したがって、ＲＳ
Ｖ誘発疾患に対するこのワクチンの有効性を評価するには、これらの小規模検討
からは不十分な情報しか得られない。サブユニットＲＳＶワクチンがさらに直面
する問題は、免疫原性の調製物を血清反応陰性被験者に接種することが、疾患の
進行をもたらすという可能性である。１９６０年代に、ホルマリン不活化ＲＳＶ
調製物（ＦＩ−ＲＳＶ）による幼児のワクチン接種は、続く生ウイルスの暴露に
より、免疫強化とも呼ばれる肺疾患の進行をもたらした（参照文献９、１０）。
これらのワクチンは、強力な血清学的応答を示すが、感染を防御することはなく
、それらのいくつかは、自然感染によって重篤でしばしば致命的な気道疾患を引
き起こした。正確な機構は不明のままであるが、この形の免疫亢進は、ＲＳＶ抗
原の構造変化（参照文献１１）、血清および／または細胞に残存する混入物（参
照文献１２）、ウイルスの付着（Ｇ）タンパク質の特異的性質（参照文献１３、
１４）、あるいは不均衡な細胞媒介性免疫応答（参照文献１３、１５）を反映す
るものであることが示唆されている。ＦＩ−ＲＳＶワクチンは、マウスにおいて
ＴＨ２型免疫応答を誘導し、一方、生ＲＳＶによる免疫化は免疫強化を引き起こ
さないが、ＴＨ１応答を誘発することが明らかにされている（参照文献１５）。
清反応陰性のチンパンジーにおける中和抗体の誘導に関しては、これまでのとこ
ろ非経口的に投与されたワクチン候補は、免疫原性に乏しいことが立証されてい
る。これらの抗原によって誘導される血清抗体反応は、大部分の幼い幼児が持っ
ている胎盤経由で獲得した母性の抗体などの受動的に獲得した抗体の存在の下で
さらに減殺される可能性がある。ＲＳＶに感染した細胞培養物からイムノアフィ
ニティクロマトグラフィまたはイオン交換クロマトグラフィによって精製された
融合（Ｆ）糖タンパク質から成るサブユニットワクチン候補が記載されている（
参照文献８）。この調製物による血清反応陰性または血清反応陽性チンパンジー
の非経口的免疫化が行われ、血清反応陰性動物においては、約１：５０のＲＳＶ
血清中和力価を誘導するためには５０μｇを３回投与する必要があった。続いて
、これらの動物に野生型のＲＳＶを感染させると、上気道においてはウイルス分
断または臨床疾患に対する免疫化の効果は検出できなかった。下気道におけるウ
イルス分断に対するこのワクチンの免疫化の効果は検討されなかったが、ここは
非経口免疫化によって誘導される血清抗体が最も大きな効果を有すると考えられ
る部位である。安全性および免疫原性の試験は、少数の血清反応陽性の個体にお
いて行われた。ワクチンは、血清反応陽性の小児および３人の血清反応陰性の小
児（すべて、２．４歳以上）において安全であることが分かった。免疫化された
小児が少数であるため、下気道疾患に対する免疫化の効果は測定できなかった。
血清反応陽性の小児に１回の免疫化投与を行うと、ワクチンを受けた小児の４０
から６０％で、ウイルス中和抗体に４倍の増加が誘導された。したがって、ＲＳ
Ｖ誘発疾患に対するこのワクチンの有効性を評価するには、これらの小規模検討
からは不十分な情報しか得られない。サブユニットＲＳＶワクチンがさらに直面
する問題は、免疫原性の調製物を血清反応陰性被験者に接種することが、疾患の
進行をもたらすという可能性である。１９６０年代に、ホルマリン不活化ＲＳＶ
調製物（ＦＩ−ＲＳＶ）による幼児のワクチン接種は、続く生ウイルスの暴露に
より、免疫強化とも呼ばれる肺疾患の進行をもたらした（参照文献９、１０）。
これらのワクチンは、強力な血清学的応答を示すが、感染を防御することはなく
、それらのいくつかは、自然感染によって重篤でしばしば致命的な気道疾患を引
き起こした。正確な機構は不明のままであるが、この形の免疫亢進は、ＲＳＶ抗
原の構造変化（参照文献１１）、血清および／または細胞に残存する混入物（参
照文献１２）、ウイルスの付着（Ｇ）タンパク質の特異的性質（参照文献１３、
１４）、あるいは不均衡な細胞媒介性免疫応答（参照文献１３、１５）を反映す
るものであることが示唆されている。ＦＩ−ＲＳＶワクチンは、マウスにおいて
ＴＨ２型免疫応答を誘導し、一方、生ＲＳＶによる免疫化は免疫強化を引き起こ
さないが、ＴＨ１応答を誘発することが明らかにされている（参照文献１５）。
【０００５】 いくつかの検討において、合成ＲＳＶ ＦＧ融合タンパク質による免疫化に対
する免疫応答は、ホルマリン不活化ＲＳＶワクチンによって誘発されたと同様に
疾患の進行をもたらした。ＲＳＶ Ｇタンパク質を発現する組換えワクシニアウ
イルスによるマウスの免疫化は、肺におけるＧ特異的Ｔ細胞応答をもたらし、こ
れは、もっぱらＣＤ４＋Ｔ細胞亜系から動員され、極めてＴｈ２に偏っていた。
Ｇ特異的Ｔ細胞は、肺出血、肺の好中球動員（ショック肺）、極度な肺の好酸球
増加を誘発し、養子免疫移入されたマウスレシピエントでは死を誘発することが
ある（参照文献１４）。非複製抗原を含むある種のワクチン調製物を用いる免疫
化と疾患の進行との関連性は、血清反応陰性のヒトでそれらをワクチンとして用
いる際の注意を示唆している。
する免疫応答は、ホルマリン不活化ＲＳＶワクチンによって誘発されたと同様に
疾患の進行をもたらした。ＲＳＶ Ｇタンパク質を発現する組換えワクシニアウ
イルスによるマウスの免疫化は、肺におけるＧ特異的Ｔ細胞応答をもたらし、こ
れは、もっぱらＣＤ４＋Ｔ細胞亜系から動員され、極めてＴｈ２に偏っていた。
Ｇ特異的Ｔ細胞は、肺出血、肺の好中球動員（ショック肺）、極度な肺の好酸球
増加を誘発し、養子免疫移入されたマウスレシピエントでは死を誘発することが
ある（参照文献１４）。非複製抗原を含むある種のワクチン調製物を用いる免疫
化と疾患の進行との関連性は、血清反応陰性のヒトでそれらをワクチンとして用
いる際の注意を示唆している。
【０００６】 ＲＳＶによる疾患に対する弱毒生ワクチンは、２つの主な理由から有望である
。第１に、生ワクチンウイルスによる感染は、粘膜および血清抗体および細胞傷
害性Ｔリンパ球を含む均衡のとれた免疫応答を誘導する。第２に、弱毒生ワクチ
ン候補または自然に獲得された野生型ウイルスによる幼児の感染は、続く自然の
再感染による疾患の進行とは関連しない。母性のウイルス中和抗体を持つ幼い幼
児にとっては免疫原性であるが、６カ月またはそれ以上の血清反応陰性の幼児に
とっては弱体化している弱毒生ワクチンを製造することはやりがいのあることで
あろう。弱毒生ウイルスワクチンはまた、毒力の残存および遺伝的不安定性とい
う危険性を有している。
。第１に、生ワクチンウイルスによる感染は、粘膜および血清抗体および細胞傷
害性Ｔリンパ球を含む均衡のとれた免疫応答を誘導する。第２に、弱毒生ワクチ
ン候補または自然に獲得された野生型ウイルスによる幼児の感染は、続く自然の
再感染による疾患の進行とは関連しない。母性のウイルス中和抗体を持つ幼い幼
児にとっては免疫原性であるが、６カ月またはそれ以上の血清反応陰性の幼児に
とっては弱体化している弱毒生ワクチンを製造することはやりがいのあることで
あろう。弱毒生ウイルスワクチンはまた、毒力の残存および遺伝的不安定性とい
う危険性を有している。
【０００７】 異種タンパク質をコードする配列を含むプラスミドＤＮＡの注射は、異種タン
パク質の発現および抗原に対する抗体および細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応
答の誘発をもたらすことが、多くの検討で明らかにされている（例えば、参照文
献１６、１７、１８を参照されたい）。免疫化の目的でウイルスタンパク質を発
現するためにプラスミドＤＮＡ接種を用いると、これまで概略を述べた戦略を上
回るいくつかの利点を提供することができる。第１に、ウイルス抗原をコードす
るＤＮＡは、抗体の存在下でウイルス自体に導入することが可能であり、抗体に
よるウイルスの中和に起因する効力の損失はない。第２に、ｉｎ ｖｉｖｏで発
現する抗原は、天然のコンホメーションおよび適切なグリコシル化を示すはずで
ある。したがって、抗原は、野生型ウイルス感染において存在する抗原によって
誘導されるものと同様の抗体応答を誘導するはずである。対照的に、タンパク質
の精製において用いられるいくつかの方法は、コンホメーション変化を引き起こ
し、防御的エピトープの免疫原性の損失およびおそらく免疫強化の損失をもたら
す可能性がある。第３に、注射されたプラスミドＤＮＡからのタンパク質の発現
は、ウイルス感染細胞におけるよりもずっと長期にわたってｉｎ ｖｉｖｏで検
出が可能であり、細胞傷害性Ｔ細胞誘発の延長および抗体応答の亢進という理論
的利点を有している。第４に、抗体のｉｎ ｖｉｖｏ発現は、外因性アジュバン
トを必要とせずに防御を与えることができる。
パク質の発現および抗原に対する抗体および細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応
答の誘発をもたらすことが、多くの検討で明らかにされている（例えば、参照文
献１６、１７、１８を参照されたい）。免疫化の目的でウイルスタンパク質を発
現するためにプラスミドＤＮＡ接種を用いると、これまで概略を述べた戦略を上
回るいくつかの利点を提供することができる。第１に、ウイルス抗原をコードす
るＤＮＡは、抗体の存在下でウイルス自体に導入することが可能であり、抗体に
よるウイルスの中和に起因する効力の損失はない。第２に、ｉｎ ｖｉｖｏで発
現する抗原は、天然のコンホメーションおよび適切なグリコシル化を示すはずで
ある。したがって、抗原は、野生型ウイルス感染において存在する抗原によって
誘導されるものと同様の抗体応答を誘導するはずである。対照的に、タンパク質
の精製において用いられるいくつかの方法は、コンホメーション変化を引き起こ
し、防御的エピトープの免疫原性の損失およびおそらく免疫強化の損失をもたら
す可能性がある。第３に、注射されたプラスミドＤＮＡからのタンパク質の発現
は、ウイルス感染細胞におけるよりもずっと長期にわたってｉｎ ｖｉｖｏで検
出が可能であり、細胞傷害性Ｔ細胞誘発の延長および抗体応答の亢進という理論
的利点を有している。第４に、抗体のｉｎ ｖｉｖｏ発現は、外因性アジュバン
トを必要とせずに防御を与えることができる。
【０００８】 本発明以前には、ＲＳＶ Ｇタンパク質をコードするＤＮＡ分子を投与するこ
とによりＲＳＶによる疾患に対して免疫化する能力は知られていなかった。具体
的には、分泌型のＲＳＶ Ｇタンパク質をコードする遺伝子を用いるＲＳＶ誘発
疾患に対する免疫化の有効性は、知られていなかった。ＲＳＶによる感染は、重
篤な疾患をもたらす。ＲＳＶ Ｇタンパク質およびプラスミドベクターを含む非
複製ベクターをコードする単離された遺伝子を、ｉｎ ｖｉｖｏ投与のため、お
よびＲＳＶによる疾患に対する防御および診断試薬および診断キットの作成を目
的としてワクチンを含む免疫原性の調製物中で用いるために提供することは有用
であり、望ましいであろう。具体的には、血清反応陰性の幼児を含むヒトにおい
て免疫原性でかつ防御的であり、疾患の進行（免疫強化）を引き起こさないワク
チンを提供することが望ましいであろう。
とによりＲＳＶによる疾患に対して免疫化する能力は知られていなかった。具体
的には、分泌型のＲＳＶ Ｇタンパク質をコードする遺伝子を用いるＲＳＶ誘発
疾患に対する免疫化の有効性は、知られていなかった。ＲＳＶによる感染は、重
篤な疾患をもたらす。ＲＳＶ Ｇタンパク質およびプラスミドベクターを含む非
複製ベクターをコードする単離された遺伝子を、ｉｎ ｖｉｖｏ投与のため、お
よびＲＳＶによる疾患に対する防御および診断試薬および診断キットの作成を目
的としてワクチンを含む免疫原性の調製物中で用いるために提供することは有用
であり、望ましいであろう。具体的には、血清反応陰性の幼児を含むヒトにおい
て免疫原性でかつ防御的であり、疾患の進行（免疫強化）を引き起こさないワク
チンを提供することが望ましいであろう。
【０００９】 （発明の要約） 本発明は、呼吸器合胞体ウイルスによる疾患に対し宿主を免疫化する方法、そ
のような目的で免疫原性の組成物中で用いられる核酸分子を含む非複製ベクター
、およびベクターおよび核酸分子を利用する診断手順に関する。具体的に本発明
は、呼吸器合胞体ウイルスのＧタンパク質をコードする核酸ワクチンの提供を対
象とする。
のような目的で免疫原性の組成物中で用いられる核酸分子を含む非複製ベクター
、およびベクターおよび核酸分子を利用する診断手順に関する。具体的に本発明
は、呼吸器合胞体ウイルスのＧタンパク質をコードする核酸ワクチンの提供を対
象とする。
【００１０】 本発明の一態様によれば、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）Ｇタンパク質に対
する防御抗体を宿主において産生するため、宿主にｉｎ ｖｉｖｏ投与するため
の免疫原性の組成物であって、非複製ベクターを含み、このベクターが、 ＲＳＶ Ｇタンパク質またはＲＳＶ Ｇタンパク質と特異的に反応する抗体を
産生するＲＳＶ Ｇタンパク質フラグメントをコードする第１のヌクレオチド配
列、 宿主において前記ＲＳＶ Ｇタンパク質を発現するために前記第１のヌクレオ
チド配列と動作可能に結合されるプロモーター配列、および 前記第１のヌクレオチド配列と前記プロモーター配列との間に位置し、宿主に
おいて前記ベクターからのｉｎ ｖｉｖｏにおける前記ＲＳＶ Ｇタンパク質の
発現を促進させるための第２のヌクレオチド配列、および 薬剤用に許容可能な坦体を含む組成物が提供される。
する防御抗体を宿主において産生するため、宿主にｉｎ ｖｉｖｏ投与するため
の免疫原性の組成物であって、非複製ベクターを含み、このベクターが、 ＲＳＶ Ｇタンパク質またはＲＳＶ Ｇタンパク質と特異的に反応する抗体を
産生するＲＳＶ Ｇタンパク質フラグメントをコードする第１のヌクレオチド配
列、 宿主において前記ＲＳＶ Ｇタンパク質を発現するために前記第１のヌクレオ
チド配列と動作可能に結合されるプロモーター配列、および 前記第１のヌクレオチド配列と前記プロモーター配列との間に位置し、宿主に
おいて前記ベクターからのｉｎ ｖｉｖｏにおける前記ＲＳＶ Ｇタンパク質の
発現を促進させるための第２のヌクレオチド配列、および 薬剤用に許容可能な坦体を含む組成物が提供される。
【００１１】 第１のヌクレオチド配列は、標準の長さのＲＳＶ Ｇタンパク質をコードする
配列でよい。第１のヌクレオチド配列は、図２に示されるヌクレオチド配列（Ｓ
ＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ：１）を含み、または図２に示されるアミノ酸配列（ＳＥＱ．
ＩＤ．ｎｏ：２）を有する標準の長さのＲＳＶ Ｇタンパク質をコードすること
ができる。
配列でよい。第１のヌクレオチド配列は、図２に示されるヌクレオチド配列（Ｓ
ＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ：１）を含み、または図２に示されるアミノ酸配列（ＳＥＱ．
ＩＤ．ｎｏ：２）を有する標準の長さのＲＳＶ Ｇタンパク質をコードすること
ができる。
【００１２】 あるいは、第１のヌクレオチド配列は、トランスメンブランコード配列および
その上流の配列を欠くＲＳＶ Ｇタンパク質をコードする配列であってもよい。
切断されたＲＳＶ Ｇタンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列は、図３
に示されるヌクレオチド配列（ＳＥＱ．ＩＤ．ｎｏ：３）を含むか、図３に示さ
れるアミノ酸配列（ＳＥＱ．ＩＤ．ｎｏ：４）を有する切断されたＲＳＶ Ｇタ
ンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むことができる。トランスメンブラ
ン領域の発現を欠くことにより、分泌型のＲＳＶ Ｇタンパク質がもたらされる
。
その上流の配列を欠くＲＳＶ Ｇタンパク質をコードする配列であってもよい。
切断されたＲＳＶ Ｇタンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列は、図３
に示されるヌクレオチド配列（ＳＥＱ．ＩＤ．ｎｏ：３）を含むか、図３に示さ
れるアミノ酸配列（ＳＥＱ．ＩＤ．ｎｏ：４）を有する切断されたＲＳＶ Ｇタ
ンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むことができる。トランスメンブラ
ン領域の発現を欠くことにより、分泌型のＲＳＶ Ｇタンパク質がもたらされる
。
【００１３】 さらに、非複製ベクターは、第１のヌクレオチド配列の５’末端の直ぐ上流に
あるヌクレオチド配列をコードする異種のシグナルペプチドを含むことができる
。配列をコードするシグナルペプチドは、ヒト組織のプラスミノーゲン活性化因
子のシグナルペプチドをコードできる。
あるヌクレオチド配列をコードする異種のシグナルペプチドを含むことができる
。配列をコードするシグナルペプチドは、ヒト組織のプラスミノーゲン活性化因
子のシグナルペプチドをコードできる。
【００１４】 プロモーター配列は、極初期サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターで
よい。第２のヌクレオチド配列は、ヒトサイトメガロウイルスイントロンＡを含
むことができる。
よい。第２のヌクレオチド配列は、ヒトサイトメガロウイルスイントロンＡを含
むことができる。
【００１５】 通常、非複製ベクターは、プラスミドベクターである。Ｇタンパク質をコード
し、本発明のこの態様によって提供される免疫原性の組成物に含まれるプラスミ
ドベクターは、具体的にはｐＸＬ５またはｐＸＬ６であり、それぞれ、図４また
は５に示されるように構成され、それぞれの特徴要素を有している。
し、本発明のこの態様によって提供される免疫原性の組成物に含まれるプラスミ
ドベクターは、具体的にはｐＸＬ５またはｐＸＬ６であり、それぞれ、図４また
は５に示されるように構成され、それぞれの特徴要素を有している。
【００１６】 本発明の別の態様によれば、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）に感染すること
による疾患に対し宿主を免疫化する方法であって、有効量の非複製ベクターを宿
主に投与することを含み、そのベクターが ＲＳＶ Ｇタンパク質またはＲＳＶ Ｇタンパク質と特異的に反応する抗体を
産生するＲＳＶ Ｇタンパク質フラグメントをコードする第１のヌクレオチド配
列、 宿主において前記ＲＳＶ Ｇタンパク質を発現するために前記第１のヌクレオ
チド配列と動作可能に結合されるプロモーター配列、および 前記第１のヌクレオチド配列と前記プロモーター配列との間に位置し、宿主に
おいて前記ベクターからのｉｎ ｖｉｖｏにおける前記ＲＳＶ Ｇタンパク質の
発現を促進させるための第２のヌクレオチド配列を含む方法が提供される。
による疾患に対し宿主を免疫化する方法であって、有効量の非複製ベクターを宿
主に投与することを含み、そのベクターが ＲＳＶ Ｇタンパク質またはＲＳＶ Ｇタンパク質と特異的に反応する抗体を
産生するＲＳＶ Ｇタンパク質フラグメントをコードする第１のヌクレオチド配
列、 宿主において前記ＲＳＶ Ｇタンパク質を発現するために前記第１のヌクレオ
チド配列と動作可能に結合されるプロモーター配列、および 前記第１のヌクレオチド配列と前記プロモーター配列との間に位置し、宿主に
おいて前記ベクターからのｉｎ ｖｉｖｏにおける前記ＲＳＶ Ｇタンパク質の
発現を促進させるための第２のヌクレオチド配列を含む方法が提供される。
【００１７】 この免疫方法を行って、均衡のとれたＴｈ１／Ｔｈ２免疫応答を誘導すること
ができる。
ができる。
【００１８】 本発明はまた、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）Ｇタンパク質またはＲＳＶ
Ｇタンパク質と特異的に反応する抗体を産生するＲＳＶ Ｇタンパク質フラグメ
ントをコードする遺伝子を用い、呼吸器合胞体ウイルスの感染による疾患に対し
て宿主を防御するための新規な方法であって、 遺伝子を単離するステップと、 遺伝子を、少なくとも１つのコントロール配列と動作可能に結合させ、非複製
ベクターを生成させるステップであって、前記コントロール配列が、前記ベクタ
ーが宿主に導入されたときにＲＳＶ Ｇタンパク質の発現を誘導し、ＲＳＶ Ｇ
タンパク質との免疫応答を生じるステップと、 ベクターを宿主に導入するステップとを含む方法を含む。
Ｇタンパク質と特異的に反応する抗体を産生するＲＳＶ Ｇタンパク質フラグメ
ントをコードする遺伝子を用い、呼吸器合胞体ウイルスの感染による疾患に対し
て宿主を防御するための新規な方法であって、 遺伝子を単離するステップと、 遺伝子を、少なくとも１つのコントロール配列と動作可能に結合させ、非複製
ベクターを生成させるステップであって、前記コントロール配列が、前記ベクタ
ーが宿主に導入されたときにＲＳＶ Ｇタンパク質の発現を誘導し、ＲＳＶ Ｇ
タンパク質との免疫応答を生じるステップと、 ベクターを宿主に導入するステップとを含む方法を含む。
【００１９】 本発明のこの態様に従って提供される手順は、さらに、 遺伝子を、免疫防御を亢進する配列に動作可能に結合させ、宿主におけるＲＳ
Ｖ Ｇタンパク質、好ましくは、ベクター中に免疫刺激性ＣｐＧ配列を導入する
ことを含む、コントロール配列と遺伝子との間への免疫防御を亢進する配列の導
入により、免疫防御の亢進を生み出すステップを含む。
Ｖ Ｇタンパク質、好ましくは、ベクター中に免疫刺激性ＣｐＧ配列を導入する
ことを含む、コントロール配列と遺伝子との間への免疫防御を亢進する配列の導
入により、免疫防御の亢進を生み出すステップを含む。
【００２０】 さらに、本発明は、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）の感染による疾患に対し
て宿主を防御するためのワクチンを製造する方法であって、 ＲＳＶ Ｇタンパク質またはＲＳＶ Ｇタンパク質と特異的に反応する抗体を
産生するＲＳＶ Ｇタンパク質フラグメントをコードする第１のヌクレオチド配
列を単離するステップと、 第１のヌクレオチド配列を少なくとも１つのコントロール配列に動作可能に結
合させ、非複製ベクターを生成させるステップであって、前記コントロール配列
が宿主に導入されたときにＲＳＶ Ｇタンパク質の発現を誘導し、宿主において
ベクターからｉｎ ｖｉｖｏで発現されたときにＲＳＶ Ｇタンパク質に対する
免疫応答を生じるステップと、 第１のヌクレオチド配列を第２のヌクレオチド配列に動作可能に結合させ、宿
主においてベクターからのｉｎ ｖｉｖｏにおけるＲＳＶ Ｇタンパク質の発現
を促進させるステップと、 ベクターを、ｉｎ ｖｉｖｏ投与のためにワクチンとして製剤化するステップ
とを含む方法を含む。
て宿主を防御するためのワクチンを製造する方法であって、 ＲＳＶ Ｇタンパク質またはＲＳＶ Ｇタンパク質と特異的に反応する抗体を
産生するＲＳＶ Ｇタンパク質フラグメントをコードする第１のヌクレオチド配
列を単離するステップと、 第１のヌクレオチド配列を少なくとも１つのコントロール配列に動作可能に結
合させ、非複製ベクターを生成させるステップであって、前記コントロール配列
が宿主に導入されたときにＲＳＶ Ｇタンパク質の発現を誘導し、宿主において
ベクターからｉｎ ｖｉｖｏで発現されたときにＲＳＶ Ｇタンパク質に対する
免疫応答を生じるステップと、 第１のヌクレオチド配列を第２のヌクレオチド配列に動作可能に結合させ、宿
主においてベクターからのｉｎ ｖｉｖｏにおけるＲＳＶ Ｇタンパク質の発現
を促進させるステップと、 ベクターを、ｉｎ ｖｉｖｏ投与のためにワクチンとして製剤化するステップ
とを含む方法を含む。
【００２１】 ベクターは、ｐＸＬ５およびｐＸＬ６から選択されるプラスミドベクターでよ
い。本発明はさらに、ヒト宿主を含む、宿主に投与するための、本方法により製
造されるワクチンを含む。
い。本発明はさらに、ヒト宿主を含む、宿主に投与するための、本方法により製
造されるワクチンを含む。
【００２２】 前述のように、本明細書中で提供されるベクターは、診断的応用にも有用であ
る。したがって、本発明の別の態様において、試料中の呼吸器合胞体ウイルス（
ＲＳＶ）Ｇタンパク質の存在を測定する方法であって、 （ａ）宿主を非複製ベクターで免疫化し、ＲＳＶ Ｇタンパク質に特異的な抗
体を産生させるステップであって、非複製ベクターがＲＳＶ Ｇタンパク質また
はＲＳＶ Ｇタンパク質と特異的に反応する抗体を産生するＲＳＶ Ｇタンパク
質フラグメントをコードする第１のヌクレオチド配列、宿主におけるＲＳＶ Ｇ
タンパク質の発現のために第１のヌクレオチド配列と動作可能に結合されるプロ
モーター配列、および第１のヌクレオチド配列とプロモーター配列との間に位置
し、宿主においてベクターからのｉｎ ｖｉｖｏにおけるＲＳＶ Ｇタンパク質
の発現を促進させる第２のヌクレオチド配列を含むステップと、 （ｂ）ＲＳＶ Ｇタンパク質特異的抗体を単離するステップと、 （ｃ）試料を、単離した抗体と接触させ、試料中に存在する任意のＲＳＶ Ｇ
タンパク質およびＲＳＶ Ｇタンパク質特異的抗体を含む複合体を生成させるス
テップと、 （ｄ）複合体の生成を測定するステップとを含む方法が提供される。 抗体を誘導するために用いられる非複製ベクターは、プラスミドベクターｐＸＬ
５またはｐＸＬ６でよい。
る。したがって、本発明の別の態様において、試料中の呼吸器合胞体ウイルス（
ＲＳＶ）Ｇタンパク質の存在を測定する方法であって、 （ａ）宿主を非複製ベクターで免疫化し、ＲＳＶ Ｇタンパク質に特異的な抗
体を産生させるステップであって、非複製ベクターがＲＳＶ Ｇタンパク質また
はＲＳＶ Ｇタンパク質と特異的に反応する抗体を産生するＲＳＶ Ｇタンパク
質フラグメントをコードする第１のヌクレオチド配列、宿主におけるＲＳＶ Ｇ
タンパク質の発現のために第１のヌクレオチド配列と動作可能に結合されるプロ
モーター配列、および第１のヌクレオチド配列とプロモーター配列との間に位置
し、宿主においてベクターからのｉｎ ｖｉｖｏにおけるＲＳＶ Ｇタンパク質
の発現を促進させる第２のヌクレオチド配列を含むステップと、 （ｂ）ＲＳＶ Ｇタンパク質特異的抗体を単離するステップと、 （ｃ）試料を、単離した抗体と接触させ、試料中に存在する任意のＲＳＶ Ｇ
タンパク質およびＲＳＶ Ｇタンパク質特異的抗体を含む複合体を生成させるス
テップと、 （ｄ）複合体の生成を測定するステップとを含む方法が提供される。 抗体を誘導するために用いられる非複製ベクターは、プラスミドベクターｐＸＬ
５またはｐＸＬ６でよい。
【００２３】 本発明にはまた、試料中の呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）Ｇタンパク質の存
在を検出するための診断キットであって、 （ａ）宿主に投与されたときにＲＳＶ Ｇタンパク質に特異的な抗体を産生す
る能力を有する非複製ベクターであって、前記非複製ベクターが、ＲＳＶ Ｇタ
ンパク質またはＲＳＶ Ｇタンパク質と特異的に反応する抗体を産生するＲＳＶ
Ｇタンパク質フラグメントをコードする第１のヌクレオチド配列、宿主におけ
るＲＳＶ Ｇタンパク質の発現のために第１のヌクレオチド配列と動作可能に結
合されたプロモーター配列、および第１のヌクレオチド配列とプロモーター配列
との間に位置し、宿主においてベクターからのｉｎ ｖｉｖｏにおけるＲＳＶ
Ｇタンパク質の発現を促進させるための第２のヌクレオチド配列を含み、 （ｂ）ＲＳＶ Ｇタンパク質特異的抗体を単離するための単離手段、 （ｃ）単離したＲＳＶ Ｇタンパク質特異的抗体と試料を接触させ、試料中に
存在する任意のＲＳＶ Ｇタンパク質およびＲＳＶ Ｇタンパク質特異的抗体を
含む複合体を生成させるための接触手段、 （ｄ）複合体の生成を測定するための固定手段とを含むキットが含まれる。
在を検出するための診断キットであって、 （ａ）宿主に投与されたときにＲＳＶ Ｇタンパク質に特異的な抗体を産生す
る能力を有する非複製ベクターであって、前記非複製ベクターが、ＲＳＶ Ｇタ
ンパク質またはＲＳＶ Ｇタンパク質と特異的に反応する抗体を産生するＲＳＶ
Ｇタンパク質フラグメントをコードする第１のヌクレオチド配列、宿主におけ
るＲＳＶ Ｇタンパク質の発現のために第１のヌクレオチド配列と動作可能に結
合されたプロモーター配列、および第１のヌクレオチド配列とプロモーター配列
との間に位置し、宿主においてベクターからのｉｎ ｖｉｖｏにおけるＲＳＶ
Ｇタンパク質の発現を促進させるための第２のヌクレオチド配列を含み、 （ｂ）ＲＳＶ Ｇタンパク質特異的抗体を単離するための単離手段、 （ｃ）単離したＲＳＶ Ｇタンパク質特異的抗体と試料を接触させ、試料中に
存在する任意のＲＳＶ Ｇタンパク質およびＲＳＶ Ｇタンパク質特異的抗体を
含む複合体を生成させるための接触手段、 （ｄ）複合体の生成を測定するための固定手段とを含むキットが含まれる。
【００２４】 本発明はさらに、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）のＧタンパク質に特異的な
抗体を産生させる方法であって、 （ａ）宿主を有効量の非複製ベクターで免疫化し、ＲＳＶ Ｇ特異的抗体を産
生させるステップであって、前記非複製ベクターが、 ＲＳＶ Ｇタンパク質またはＲＳＶ Ｇタンパク質と特異的に反応する抗体を
産生するＲＳＶ Ｇタンパク質フラグメントをコードする第１のヌクレオチド配
列、 宿主において前記ＲＳＶ Ｇタンパク質を発現するために前記第１のヌクレオ
チド配列と動作可能に結合されるプロモーター配列、および 前記第１のヌクレオチド配列と前記プロモーター配列との間に位置し、宿主に
おいて前記ベクターからのｉｎ ｖｉｖｏにおける前記ＲＳＶ Ｇタンパク質の
発現を促進させるための第２のヌクレオチド配列を含み、 （ｂ）宿主からＲＳＶ Ｇ特異的抗体を単離するステップとを含む方法を対象
とする。
抗体を産生させる方法であって、 （ａ）宿主を有効量の非複製ベクターで免疫化し、ＲＳＶ Ｇ特異的抗体を産
生させるステップであって、前記非複製ベクターが、 ＲＳＶ Ｇタンパク質またはＲＳＶ Ｇタンパク質と特異的に反応する抗体を
産生するＲＳＶ Ｇタンパク質フラグメントをコードする第１のヌクレオチド配
列、 宿主において前記ＲＳＶ Ｇタンパク質を発現するために前記第１のヌクレオ
チド配列と動作可能に結合されるプロモーター配列、および 前記第１のヌクレオチド配列と前記プロモーター配列との間に位置し、宿主に
おいて前記ベクターからのｉｎ ｖｉｖｏにおける前記ＲＳＶ Ｇタンパク質の
発現を促進させるための第２のヌクレオチド配列を含み、 （ｂ）宿主からＲＳＶ Ｇ特異的抗体を単離するステップとを含む方法を対象
とする。
【００２５】 本発明はまた、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）のＧタンパク質に特異的なモ
ノクローナル抗体を産生させる方法であって、 （ａ）ＲＳＶ Ｇタンパク質またはＲＳＶ Ｇタンパク質と特異的に反応する
抗体を産生するＲＳＶ Ｇタンパク質フラグメントをコードする第１のヌクレオ
チド配列、宿主においてＲＳＶ Ｇタンパク質を発現するために第１のヌクレオ
チド配列と動作可能に結合されるプロモーター配列、および第１のヌクレオチド
配列とプロモーター配列との間に位置し、宿主においてベクターからのｉｎ ｖ
ｉｖｏにおけるＲＳＶ Ｇタンパク質の発現を促進させるための第２のヌクレオ
チド配列を含むベクターを構成するステップと、 （ｂ）少なくとも１匹のマウスにベクターを投与して、少なくとも１匹の免疫
化マウスを作るステップと、 （ｃ）少なくとも１匹の免疫化マウスからＢリンパ球を取り出すステップと、 （ｄ）少なくとも１匹の免疫化マウスから得たＢリンパ球を骨髄腫細胞と融合
させ、それによってハイブリドーマを作成するステップと、 （ｅ）ハイブリドーマをクローン化するステップと、 （ｆ）抗ＲＳＶ Ｇタンパク質抗体を産生するクローンを選択するステップと
、 （ｇ）抗ＲＳＶ Ｇタンパク質抗体産生クローンを培養するステップと、 （ｈ）抗ＲＳＶ Ｇタンパク質モノクローナル抗体を単離するステップとを含
む方法を対象とする。 このようなモノクローナル抗体を用い、ウイルスからＲＳＶ Ｇタンパク質を精
製することができる。
ノクローナル抗体を産生させる方法であって、 （ａ）ＲＳＶ Ｇタンパク質またはＲＳＶ Ｇタンパク質と特異的に反応する
抗体を産生するＲＳＶ Ｇタンパク質フラグメントをコードする第１のヌクレオ
チド配列、宿主においてＲＳＶ Ｇタンパク質を発現するために第１のヌクレオ
チド配列と動作可能に結合されるプロモーター配列、および第１のヌクレオチド
配列とプロモーター配列との間に位置し、宿主においてベクターからのｉｎ ｖ
ｉｖｏにおけるＲＳＶ Ｇタンパク質の発現を促進させるための第２のヌクレオ
チド配列を含むベクターを構成するステップと、 （ｂ）少なくとも１匹のマウスにベクターを投与して、少なくとも１匹の免疫
化マウスを作るステップと、 （ｃ）少なくとも１匹の免疫化マウスからＢリンパ球を取り出すステップと、 （ｄ）少なくとも１匹の免疫化マウスから得たＢリンパ球を骨髄腫細胞と融合
させ、それによってハイブリドーマを作成するステップと、 （ｅ）ハイブリドーマをクローン化するステップと、 （ｆ）抗ＲＳＶ Ｇタンパク質抗体を産生するクローンを選択するステップと
、 （ｇ）抗ＲＳＶ Ｇタンパク質抗体産生クローンを培養するステップと、 （ｈ）抗ＲＳＶ Ｇタンパク質モノクローナル抗体を単離するステップとを含
む方法を対象とする。 このようなモノクローナル抗体を用い、ウイルスからＲＳＶ Ｇタンパク質を精
製することができる。
【００２６】 本出願では、「ＲＳＶ Ｇタンパク質」という用語を、標準の長さのＲＳＶ
Ｇタンパク質を定義するために用いたが、このようなタンパク質は、アミノ酸配
列に変異を有し、ＲＳＶの様々な株中に天然に存在するタンパク質、トランスメ
ンブラン領域を欠く分泌型ＲＳＶ Ｇタンパク質ならびにＲＳＶ Ｇタンパク質
の機能類似体が含まれる。本出願では、第１のタンパク質が、第２のタンパク質
と免疫学的に関連し、および／または同一の機能を有している場合に、第１のタ
ンパク質を第２のタンパク質の「機能類似体」とする。例えば、機能類似体には
、そのタンパク質の免疫学的活性フラグメントまたは、免疫学的活性な置換、付
加、または欠失変異体があり得る。
Ｇタンパク質を定義するために用いたが、このようなタンパク質は、アミノ酸配
列に変異を有し、ＲＳＶの様々な株中に天然に存在するタンパク質、トランスメ
ンブラン領域を欠く分泌型ＲＳＶ Ｇタンパク質ならびにＲＳＶ Ｇタンパク質
の機能類似体が含まれる。本出願では、第１のタンパク質が、第２のタンパク質
と免疫学的に関連し、および／または同一の機能を有している場合に、第１のタ
ンパク質を第２のタンパク質の「機能類似体」とする。例えば、機能類似体には
、そのタンパク質の免疫学的活性フラグメントまたは、免疫学的活性な置換、付
加、または欠失変異体があり得る。
【００２７】 本発明は添付の図に示された各図を参照した以下の一般的記述および実施例か
ら更に理解され得るものであり、その添付の図面には以下の図が含まれる。
ら更に理解され得るものであり、その添付の図面には以下の図が含まれる。
【００２８】 図１は呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）のＧタンパク質をコードする遺伝子の
制限地図を示す図である。図２は膜付着型の呼吸器合胞体ウイルスＧタンパク質
（配列番号１）をコードする遺伝子のヌクレオチド配列並びにそれによりエンコ
ードされたＲＳＶ Ｇタンパク質のアミノ酸配列（配列番号２）を示図である。
図３は分泌型のトランスメンブランドメインを欠落したＲＳＶ Ｇタンパク質の
ヌクレオチド配列（配列番号３）並びにそれによりエンコードされたトランスメ
ンブランドメインを欠落し切断型のＲＳＶ Ｇタンパク質のアミノ酸配列（配列
番号４）を示す図である。図４は膜付着型のＲＳＶ Ｇタンパク質の全長をコー
ドする遺伝子を含んでおりＣＭＶイントロンＡ配列を含むプラスミドｐＸＬ５の
構造を示す図である。図５は分泌型のトランスメンブランドメインを欠落したＲ
ＳＶ Ｇタンパク質をコードする遺伝子を含んでおりＣＭＶイントロンＡ並びに
ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）のシグナルペプチドをコードす
るヌクレオチド配列を含むプラスミドｐＸＬ６の構造を示す図である。図６はプ
ラスミドＶＲ−１０１２のヌクレオチド配列（配列番号５）を示す図である。図
７は５’の非翻訳領域およびヒト組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）の
シグナルペプチドのヌクレオチド配列（配列番号６）を示す図である。図８はＲ
ＳＶ感染後のＤＮＡ免疫マウスにおける肺のサイトカイン発現特性を示している
図である。
制限地図を示す図である。図２は膜付着型の呼吸器合胞体ウイルスＧタンパク質
（配列番号１）をコードする遺伝子のヌクレオチド配列並びにそれによりエンコ
ードされたＲＳＶ Ｇタンパク質のアミノ酸配列（配列番号２）を示図である。
図３は分泌型のトランスメンブランドメインを欠落したＲＳＶ Ｇタンパク質の
ヌクレオチド配列（配列番号３）並びにそれによりエンコードされたトランスメ
ンブランドメインを欠落し切断型のＲＳＶ Ｇタンパク質のアミノ酸配列（配列
番号４）を示す図である。図４は膜付着型のＲＳＶ Ｇタンパク質の全長をコー
ドする遺伝子を含んでおりＣＭＶイントロンＡ配列を含むプラスミドｐＸＬ５の
構造を示す図である。図５は分泌型のトランスメンブランドメインを欠落したＲ
ＳＶ Ｇタンパク質をコードする遺伝子を含んでおりＣＭＶイントロンＡ並びに
ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）のシグナルペプチドをコードす
るヌクレオチド配列を含むプラスミドｐＸＬ６の構造を示す図である。図６はプ
ラスミドＶＲ−１０１２のヌクレオチド配列（配列番号５）を示す図である。図
７は５’の非翻訳領域およびヒト組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）の
シグナルペプチドのヌクレオチド配列（配列番号６）を示す図である。図８はＲ
ＳＶ感染後のＤＮＡ免疫マウスにおける肺のサイトカイン発現特性を示している
図である。
【００２９】 （発明の一般的な記述） 上記の通りに、本発明は一般的に、ＤＮＡを含むポリヌクレオチド、呼吸器合
胞体ウイルス（ＲＳＶ）による感染に対して防御するための免疫化、および特別
な非複製ベクターを使用した診断手順に関するものである。本発明において、い
くつかの組換えプラスミドベクターがＲＳＶ Ｇタンパク質をコードするヌクレ
オチド配列を含むように構築された。
胞体ウイルス（ＲＳＶ）による感染に対して防御するための免疫化、および特別
な非複製ベクターを使用した診断手順に関するものである。本発明において、い
くつかの組換えプラスミドベクターがＲＳＶ Ｇタンパク質をコードするヌクレ
オチド配列を含むように構築された。
【００３０】 ＲＳＶ Ｇ遺伝子の全長のヌクレオチド配列（配列番号１）は図２に示されて
いる。本明細書で提供されるいくつかの構造はＲＳＶ Ｇ（配列番号２）の全長
の蛋白質をコードするヌクレオチド配列を含むが、他のものはトランスメンブラ
ンドメインを欠落した分泌型または切断型のＲＳＶ Ｇタンパク質（配列番号４
）を作り出すためにトランスメンブランコード配列およびその上流のヌクレオチ
ドを欠落することによって変更されたＲＳＶ Ｇ遺伝子（図３参照、配列番号３
）を含む。
いる。本明細書で提供されるいくつかの構造はＲＳＶ Ｇ（配列番号２）の全長
の蛋白質をコードするヌクレオチド配列を含むが、他のものはトランスメンブラ
ンドメインを欠落した分泌型または切断型のＲＳＶ Ｇタンパク質（配列番号４
）を作り出すためにトランスメンブランコード配列およびその上流のヌクレオチ
ドを欠落することによって変更されたＲＳＶ Ｇ遺伝子（図３参照、配列番号３
）を含む。
【００３１】 ＲＳＶ Ｇタンパク質をコードするこのヌクレオチド配列は、ｉｎ ｖｉｔｒ
ｏでそのエンコードされたＲＳＶ Ｇタンパク質を発現するためにプロモータ配
列に動作可能に結合されている。このプロモータ配列はヒトの極初期サイトメガ
ロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターであることが可能である。このプロモータは
参照文献１９に記述されている。ラウス肉腫ウイルスＬＴＲｓなどの構成的プロ
モータおよびメタロチオニンプロモータなどの誘導性プロモータおよび組織特異
性プロモータを含むあらゆる便利なプロモータを使用することが可能である。
ｏでそのエンコードされたＲＳＶ Ｇタンパク質を発現するためにプロモータ配
列に動作可能に結合されている。このプロモータ配列はヒトの極初期サイトメガ
ロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターであることが可能である。このプロモータは
参照文献１９に記述されている。ラウス肉腫ウイルスＬＴＲｓなどの構成的プロ
モータおよびメタロチオニンプロモータなどの誘導性プロモータおよび組織特異
性プロモータを含むあらゆる便利なプロモータを使用することが可能である。
【００３２】 ここで提供される非複製ベクターは、薬剤用に許容される担体を伴った免疫組
成物の形態で動物に投与する場合、投与した動物の抗体応答によって示されるｉ
ｎ ｖｉｖｏ ＲＳＶ Ｇタンパク質発現をもたらす。このような抗体は、以下
でさらに詳述される通りに、本明細書の試料中のＲＳＶ蛋白質の検出に有用であ
ることが可能である。非複製ベクター、特にプラスミドｐＸＬ５およびｐＸＬ６
の投与は、以下の実施例からわかる通りに、抗Ｇ抗体、ウイルス中和抗体を産生
させて、ウイルス感染後の肺におけるＴｈ１／Ｔｈ２応答の均衡を保ち、かつマ
ウスに生ＲＳＶ感染に対する防御をもたらす。
成物の形態で動物に投与する場合、投与した動物の抗体応答によって示されるｉ
ｎ ｖｉｖｏ ＲＳＶ Ｇタンパク質発現をもたらす。このような抗体は、以下
でさらに詳述される通りに、本明細書の試料中のＲＳＶ蛋白質の検出に有用であ
ることが可能である。非複製ベクター、特にプラスミドｐＸＬ５およびｐＸＬ６
の投与は、以下の実施例からわかる通りに、抗Ｇ抗体、ウイルス中和抗体を産生
させて、ウイルス感染後の肺におけるＴｈ１／Ｔｈ２応答の均衡を保ち、かつマ
ウスに生ＲＳＶ感染に対する防御をもたらす。
【００３３】 この組換えベクターは、ＲＳＶ Ｇタンパク質をコードするヌクレオチド配列
に隣接して位置する第２のヌクレオチド配列も含むことが可能であり、宿主にお
いてｉｎ ｖｉｖｏ発現するときにそのＲＳＶ Ｇタンパク質の免疫防護活性を
高めることができる。このような増進は、たとえばｍＲＮＡの安定性の増加、転
写および／または翻訳の増進によって、ｉｎ ｖｉｖｏ発現が高まることによっ
てもたらされる。この追加的な配列は一般的にプロモータ配列とＲＳＶ Ｇタン
パク質をコードする配列との間に位置している。この増進性配列は前初期サイト
メガロウイルスのイントロンＡ配列を含むことが可能である。
に隣接して位置する第２のヌクレオチド配列も含むことが可能であり、宿主にお
いてｉｎ ｖｉｖｏ発現するときにそのＲＳＶ Ｇタンパク質の免疫防護活性を
高めることができる。このような増進は、たとえばｍＲＮＡの安定性の増加、転
写および／または翻訳の増進によって、ｉｎ ｖｉｖｏ発現が高まることによっ
てもたらされる。この追加的な配列は一般的にプロモータ配列とＲＳＶ Ｇタン
パク質をコードする配列との間に位置している。この増進性配列は前初期サイト
メガロウイルスのイントロンＡ配列を含むことが可能である。
【００３４】 本明細書で提供される非複製ベクターは、ＲＳＶからのさらなる抗原、少なく
とも１つの他の病原体またはサイトカインなどの少なくとも１つの免疫調節薬剤
の抗原をコードする追加的ヌクレオチド配列も含むことがある。このようなベク
ターはキメリック性または２シストロン性構造中に追加的なヌクレオチド配列を
含むことも可能である。別法として、追加的ヌクレオチド配列を含むベクターは
、本明細書で提供される非複製ベクターと別に構築して宿主に一緒に投与するこ
ともできる。
とも１つの他の病原体またはサイトカインなどの少なくとも１つの免疫調節薬剤
の抗原をコードする追加的ヌクレオチド配列も含むことがある。このようなベク
ターはキメリック性または２シストロン性構造中に追加的なヌクレオチド配列を
含むことも可能である。別法として、追加的ヌクレオチド配列を含むベクターは
、本明細書で提供される非複製ベクターと別に構築して宿主に一緒に投与するこ
ともできる。
【００３５】 この非複製ベクターはさらに、切断ＲＳＶ Ｇタンパク質の内在性シグナルペ
プチドの代わりに、異種ウイルスまたはヒト組織プラスミノーゲン活性化因子（
ＴＰＡ）シグナルペプチドなどの真核性シグナルペプチドをコードするヌクレオ
チド配列を含むことが可能である。このようなヌクレオチド配列はベクター内の
ＲＳＶ Ｇエンコード配列のすぐ上流に位置することが可能である。
プチドの代わりに、異種ウイルスまたはヒト組織プラスミノーゲン活性化因子（
ＴＰＡ）シグナルペプチドなどの真核性シグナルペプチドをコードするヌクレオ
チド配列を含むことが可能である。このようなヌクレオチド配列はベクター内の
ＲＳＶ Ｇエンコード配列のすぐ上流に位置することが可能である。
【００３６】 非複製ＤＮＡベクターの免疫原性はベクターに免疫刺激ＣｐＧ配列を挿入する
ことによって高めることが可能である。
ことによって高めることが可能である。
【００３７】 当業者には、本発明の種々の実施形態が予防接種、診断およびＲＳＶ感染症の
処置の分野において多くの用途を有することは明らかである。そのような用途を
以下においてさらに非制限的に検討する。 １．ワクチンの調製および使用 ワクチンとして使用するのに適した免疫原性組成物は、ＲＳＶ Ｇ遺伝子およ
び本明細書に開示するベクターから調製することが可能である。このワクチンは
、動物において抗ＲＳＶ Ｇ抗体の産生を含む免疫応答を誘発する。ワクチンを
含めて核酸を含む免疫原性組成物は、ポリヌクレオチド投与のための薬剤用に許
容される溶液またはエマルジョンという注射可能液として調製することができる
。この核酸は、レシチンリポゾームまたは当技術分野において知られている他の
リポゾームなどのリポゾームと共に（たとえば、国際特許ＷＯ９３２４６４０、
参照文献２０に記述されているように）核酸リポゾームとすることができ、また
はこの核酸は以下においてより詳細に記述する通りにアジュバントと組合わせる
ことができる。カチオン性脂質を含むリポゾームは自発的かつ迅速にＤＮＡおよ
びＲＮＡなどのポリアニオン類と相互作用して、このポリヌクレオチドを１００
％まで取り込んだリポゾーム／核酸複合体となる。さらに、このポリカチオン性
複合体は細胞膜と融合して、リソソーム区画の分解酵素をバイパスするポリヌク
レオチドの細胞内輸送を実現する。公開されたＰＣＴ出願ＷＯ９４／２７４３５
はカチオン性脂質およびポリヌクレオチドを含む遺伝子的免疫化のための組成物
を記述している。カルシウムイオン、ウイルス蛋白質および他のトランスフェク
ション促進剤などの核酸の細胞取り込みを助ける薬剤を有利に使用することが可
能である。
処置の分野において多くの用途を有することは明らかである。そのような用途を
以下においてさらに非制限的に検討する。 １．ワクチンの調製および使用 ワクチンとして使用するのに適した免疫原性組成物は、ＲＳＶ Ｇ遺伝子およ
び本明細書に開示するベクターから調製することが可能である。このワクチンは
、動物において抗ＲＳＶ Ｇ抗体の産生を含む免疫応答を誘発する。ワクチンを
含めて核酸を含む免疫原性組成物は、ポリヌクレオチド投与のための薬剤用に許
容される溶液またはエマルジョンという注射可能液として調製することができる
。この核酸は、レシチンリポゾームまたは当技術分野において知られている他の
リポゾームなどのリポゾームと共に（たとえば、国際特許ＷＯ９３２４６４０、
参照文献２０に記述されているように）核酸リポゾームとすることができ、また
はこの核酸は以下においてより詳細に記述する通りにアジュバントと組合わせる
ことができる。カチオン性脂質を含むリポゾームは自発的かつ迅速にＤＮＡおよ
びＲＮＡなどのポリアニオン類と相互作用して、このポリヌクレオチドを１００
％まで取り込んだリポゾーム／核酸複合体となる。さらに、このポリカチオン性
複合体は細胞膜と融合して、リソソーム区画の分解酵素をバイパスするポリヌク
レオチドの細胞内輸送を実現する。公開されたＰＣＴ出願ＷＯ９４／２７４３５
はカチオン性脂質およびポリヌクレオチドを含む遺伝子的免疫化のための組成物
を記述している。カルシウムイオン、ウイルス蛋白質および他のトランスフェク
ション促進剤などの核酸の細胞取り込みを助ける薬剤を有利に使用することが可
能である。
【００３８】 ポリヌクレオチド免疫原性調製物は、生物分解可能な持効性粒子を含むマイク
ロカプセルとして製剤することも可能である。たとえば米国特許第５，１５１，
２６４号はＢｉｏ Ｖｅｃｔｅｕｒｓ Ｓｕｐｒａ Ｍｏｌｅｃｕｌａｉｒｅｓ
（ＢＶＳＭ）と呼ばれているリン脂質／糖脂質／多糖類の性質の粒状担体につい
て記述している。これらの粒状担体はその層の１つに生物学的活性を有する様々
な分子を輸送しようとするものである。
ロカプセルとして製剤することも可能である。たとえば米国特許第５，１５１，
２６４号はＢｉｏ Ｖｅｃｔｅｕｒｓ Ｓｕｐｒａ Ｍｏｌｅｃｕｌａｉｒｅｓ
（ＢＶＳＭ）と呼ばれているリン脂質／糖脂質／多糖類の性質の粒状担体につい
て記述している。これらの粒状担体はその層の１つに生物学的活性を有する様々
な分子を輸送しようとするものである。
【００３９】 米国特許第５，０７５，１０９号はトリニトロフェニル化キーホールリンペッ
トヘモシアニンおよびスタフィロコッカスのエンテロトキシンＢとの５０：５０
ポリ（ＤＬ−ラクチデコ−グリコリド）の抗原のカプセル化について記述してい
る。カプセル化のための他のポリマーとしては、たとえばポリ（グリコリド）、
ポリ（ＤＬ−ラクチド−コ−グリコリド）、コポリオキサレート、ポリカプロラ
クトン、ポリ（ラクチド−コ−カプロラクトン）、ポリ（エステルアミド）、ポ
リオルソエステル類、およびポリ（８−ヒドロキシ酪酸）およびポリ無水物が挙
げられる。
トヘモシアニンおよびスタフィロコッカスのエンテロトキシンＢとの５０：５０
ポリ（ＤＬ−ラクチデコ−グリコリド）の抗原のカプセル化について記述してい
る。カプセル化のための他のポリマーとしては、たとえばポリ（グリコリド）、
ポリ（ＤＬ−ラクチド−コ−グリコリド）、コポリオキサレート、ポリカプロラ
クトン、ポリ（ラクチド−コ−カプロラクトン）、ポリ（エステルアミド）、ポ
リオルソエステル類、およびポリ（８−ヒドロキシ酪酸）およびポリ無水物が挙
げられる。
【００４０】 公開されたＰＣＴ出願ＷＯ９１／０６２８２は複数個の生体接着性ミクロスフ
ェアおよび抗原類を含む輸送媒体を記述している。このミクロスフェアは澱粉、
ゼラチン、デキストラン、コラーゲンまたはアルブミンからなる。この輸送用媒
体は特に鼻腔粘膜を介してワクチンを吸収させるためのものである。この輸送媒
体は追加的に吸収促進剤を含むことが可能である。
ェアおよび抗原類を含む輸送媒体を記述している。このミクロスフェアは澱粉、
ゼラチン、デキストラン、コラーゲンまたはアルブミンからなる。この輸送用媒
体は特に鼻腔粘膜を介してワクチンを吸収させるためのものである。この輸送媒
体は追加的に吸収促進剤を含むことが可能である。
【００４１】 非複製ベクターを含むＲＳＶ Ｇ遺伝子はそれらと相容性のある薬剤用に許容
される医薬品添加物と混合することが可能である。このような医薬品添加物は水
、食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール、およびそれらの混合物
を含むことができる。それらの免疫原性組成物およびワクチンはさらに、湿潤剤
または乳化剤、ｐＨ緩衝剤、またはそれらの有効性を高めるアジュバント類など
の補助物質を含むことが可能である。免疫原生組成物およびワクチンは非経口的
に、皮下注射、静脈内注射、皮内注射または筋肉内注射によって、場合によって
注射部位の局部麻酔による予備処置の後で投与してもよい。別法として、本発明
に従い形成された免疫原性組成物は粘膜表面において免疫応答を誘発する方法で
処方して投与してもよい。したがってこの免疫原性組成物は、たとえば鼻腔内ま
たは経口（胃内）の経路によって粘膜表面に投与することが可能である。別法と
して、座薬および経口用製剤を含む他の形態の投与が望ましいこともある。座薬
は、たとえばポリアルキレングリコールまたはトリグリセリドなどの結合剤およ
び担体を含むことができる。経口用製剤は、たとえば薬剤等級のサッカリン、セ
ルロースおよび炭酸マグネシウムなどの通常使用される補助剤（ｉｎｃｉｐｉｅ
ｎｔ）を含むことが可能である。
される医薬品添加物と混合することが可能である。このような医薬品添加物は水
、食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール、およびそれらの混合物
を含むことができる。それらの免疫原性組成物およびワクチンはさらに、湿潤剤
または乳化剤、ｐＨ緩衝剤、またはそれらの有効性を高めるアジュバント類など
の補助物質を含むことが可能である。免疫原生組成物およびワクチンは非経口的
に、皮下注射、静脈内注射、皮内注射または筋肉内注射によって、場合によって
注射部位の局部麻酔による予備処置の後で投与してもよい。別法として、本発明
に従い形成された免疫原性組成物は粘膜表面において免疫応答を誘発する方法で
処方して投与してもよい。したがってこの免疫原性組成物は、たとえば鼻腔内ま
たは経口（胃内）の経路によって粘膜表面に投与することが可能である。別法と
して、座薬および経口用製剤を含む他の形態の投与が望ましいこともある。座薬
は、たとえばポリアルキレングリコールまたはトリグリセリドなどの結合剤およ
び担体を含むことができる。経口用製剤は、たとえば薬剤等級のサッカリン、セ
ルロースおよび炭酸マグネシウムなどの通常使用される補助剤（ｉｎｃｉｐｉｅ
ｎｔ）を含むことが可能である。
【００４２】 それらの免疫原性調製物およびワクチンは投与用調合物と相容性のある方法で
、かつ治療に有効で、防御的および免疫原生的な量で投与することができる。投
与する量は、たとえばＲＳＶ Ｇタンパク質およびそれに対する抗体を生成し、
必要ならば細胞性免疫応答を引き起こす個体の免疫系の能力を含む治療対象に依
存する。投与するために必要な活性成分の正確な量は医師の判断に依存する。し
かし、適切な投与量範囲は当技術者によって容易に決定することができ、ＲＳＶ
Ｇ遺伝子を含むベクターの約１μｇから約２ｍｇ程度であることが可能である
。初期投与および追加免疫投与の適切な処方も可変であるが、初期投与引き続い
て次の投与を含むことが可能である。この投与量も投与経路に依存することが可
能で、宿主の大きさによって変化する。１つだけの病原体に対して防護するワク
チンは１価ワクチンである。いくつかの病原体の抗原物質を含むワクチンも本発
明に従属する。このような混合ワクチンは、たとえば様々な病原体からの物質、
または同じ病原体の異なった株からの物質、または様々な病原体の組合せからの
物質を含む。
、かつ治療に有効で、防御的および免疫原生的な量で投与することができる。投
与する量は、たとえばＲＳＶ Ｇタンパク質およびそれに対する抗体を生成し、
必要ならば細胞性免疫応答を引き起こす個体の免疫系の能力を含む治療対象に依
存する。投与するために必要な活性成分の正確な量は医師の判断に依存する。し
かし、適切な投与量範囲は当技術者によって容易に決定することができ、ＲＳＶ
Ｇ遺伝子を含むベクターの約１μｇから約２ｍｇ程度であることが可能である
。初期投与および追加免疫投与の適切な処方も可変であるが、初期投与引き続い
て次の投与を含むことが可能である。この投与量も投与経路に依存することが可
能で、宿主の大きさによって変化する。１つだけの病原体に対して防護するワク
チンは１価ワクチンである。いくつかの病原体の抗原物質を含むワクチンも本発
明に従属する。このような混合ワクチンは、たとえば様々な病原体からの物質、
または同じ病原体の異なった株からの物質、または様々な病原体の組合せからの
物質を含む。
【００４３】 免疫原性はそれらのベクターがアジュバントと一緒に、通常リン酸緩衝液中に
おいて０．０５から０．１パーセント溶液として投与された場合に顕著に増強さ
れることができる。アジュバントは抗原の免疫原性を高めるが、それ自身免疫原
性である必要はない。アジュバントは抗原を投与部位の近傍に局部的に保持する
ことによって作用して、免疫系細胞に抗原をゆっくり持続的に放出することを助
ける貯蔵所効果をもたらすことが可能である。アジュバントはまた、免疫系の細
胞を抗原集積部へ引き寄せてそのような細胞を刺激して免疫応答を誘発すること
もできる。
おいて０．０５から０．１パーセント溶液として投与された場合に顕著に増強さ
れることができる。アジュバントは抗原の免疫原性を高めるが、それ自身免疫原
性である必要はない。アジュバントは抗原を投与部位の近傍に局部的に保持する
ことによって作用して、免疫系細胞に抗原をゆっくり持続的に放出することを助
ける貯蔵所効果をもたらすことが可能である。アジュバントはまた、免疫系の細
胞を抗原集積部へ引き寄せてそのような細胞を刺激して免疫応答を誘発すること
もできる。
【００４４】 免疫刺激剤またはアジュバントは多年にわたり宿主の、たとえばワクチンに対
する免疫応答を高めるために使用されてきた。したがって、アジュバントが抗原
への免疫応答を高めることが明らかになっている。しかし、これらのアジュバン
トのいくつかは毒性があり、望ましくない副作用を引き起こす可能性があり、ヒ
トや多くの動物に使用するのが不適切となっている。実際に、水酸化アルミニウ
ムおよびリン酸アルミニウム（合わせて通常明礬と呼ぶ）のみが慣習的にヒトお
よび獣医用ワクチンにおいてアジュバントとして使用されている。
する免疫応答を高めるために使用されてきた。したがって、アジュバントが抗原
への免疫応答を高めることが明らかになっている。しかし、これらのアジュバン
トのいくつかは毒性があり、望ましくない副作用を引き起こす可能性があり、ヒ
トや多くの動物に使用するのが不適切となっている。実際に、水酸化アルミニウ
ムおよびリン酸アルミニウム（合わせて通常明礬と呼ぶ）のみが慣習的にヒトお
よび獣医用ワクチンにおいてアジュバントとして使用されている。
【００４５】 広範囲の外的アジュバントおよび他の免疫調節物質は抗原に対して強い免疫反
応を引き起こすことができる。これらには、膜蛋白質抗原と複合させて免疫刺激
複合体（ＩＳＣＯＭＳ）を作り出すサポニン、鉱油を含むプルロニック（ｐｌｕ
ｒｏｎｉｃ）ポリマー、鉱油中の死菌ミコバクテリアフロイントの完全アジュバ
ント、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）およびリポポリサッカライド（ＬＰＳ）な
どの細菌産生物並びにモノホリルリピドＡ、ＱＳ２１およびポリホスファゼンが
含まれる。
応を引き起こすことができる。これらには、膜蛋白質抗原と複合させて免疫刺激
複合体（ＩＳＣＯＭＳ）を作り出すサポニン、鉱油を含むプルロニック（ｐｌｕ
ｒｏｎｉｃ）ポリマー、鉱油中の死菌ミコバクテリアフロイントの完全アジュバ
ント、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）およびリポポリサッカライド（ＬＰＳ）な
どの細菌産生物並びにモノホリルリピドＡ、ＱＳ２１およびポリホスファゼンが
含まれる。
【００４６】 本発明の特別な実施形態において、ＲＳＶのＧタンパク質をコードする第１ヌ
クレオチド配列を含む非複製ベクターは、そのベクターを免疫系細胞を含む選択
された細胞に指向させるために標的指向分子と組合わせて投与することができる
。
クレオチド配列を含む非複製ベクターは、そのベクターを免疫系細胞を含む選択
された細胞に指向させるために標的指向分子と組合わせて投与することができる
。
【００４７】 この非複製ベクターの免疫原性は、サイトカインまたはケモカインを発現する
プラスミドＤＮＡベクターと共に投与することによって、またはビスシストロン
構造または融合構造内のこのような分子を共に発現することによって高めること
が可能である。
プラスミドＤＮＡベクターと共に投与することによって、またはビスシストロン
構造または融合構造内のこのような分子を共に発現することによって高めること
が可能である。
【００４８】 この非複製ベクターは宿主に種々の方法で投与することができ、たとえばＴａ
ｎｇ等（参照文献２１）は牛成長ホルモン（ＢＧＨ）をコードするＤＮＡで被覆
された金のマイクロ発射物（ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ）をマウスの皮膚
の中に導入してマウスに抗ＢＧＨ抗体を産生をもたらしたことを記述している一
方、Ｆｕｒｔｈ等（参照文献２２）はジェット注入器を生きた動物の皮膚、筋肉
、脂肪および乳腺組織を形質転換させるために使用することができることを示し
た。 ２．イムノアッセイ ＲＳＶ Ｇ遺伝子および本発明のベクターは、酵素結合免疫吸着アッセイ（Ｅ
ＬＩＳＡ）、ＲＩＡおよび他の非酵素結合型抗体結合アッセイまたは当技術にお
いて知られている方法を含むイムノアッセイにおいて使用するための抗Ｇ抗体の
産生のための免疫原として有用である。ＥＬＩＳＡアッセイにおいて、非複製ベ
クターはまず宿主に投与されてＲＳＶ Ｇタンパク質に対する特異的な抗体を産
生させる。これらのＲＳＶ Ｇ特異的抗体はたとえばポリスチレンマイクロタイ
タープレートの穴などのそれらの抗体を結合することのできる選択された表面上
に固定される。洗浄によって非吸着抗体を除去した後、被検試料に関して抗原的
に中性であることが知られている牛ガンマアルブミン（ＢＳＡ）などの非特異的
蛋白質を選択された表面に結合することができる。これが固定化された表面上の
非特異的吸着部位を遮蔽することを可能にして、それによって表面上に非特異的
な抗血清の結合によって起こるバックグラウンドを低下させる。
ｎｇ等（参照文献２１）は牛成長ホルモン（ＢＧＨ）をコードするＤＮＡで被覆
された金のマイクロ発射物（ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ）をマウスの皮膚
の中に導入してマウスに抗ＢＧＨ抗体を産生をもたらしたことを記述している一
方、Ｆｕｒｔｈ等（参照文献２２）はジェット注入器を生きた動物の皮膚、筋肉
、脂肪および乳腺組織を形質転換させるために使用することができることを示し
た。 ２．イムノアッセイ ＲＳＶ Ｇ遺伝子および本発明のベクターは、酵素結合免疫吸着アッセイ（Ｅ
ＬＩＳＡ）、ＲＩＡおよび他の非酵素結合型抗体結合アッセイまたは当技術にお
いて知られている方法を含むイムノアッセイにおいて使用するための抗Ｇ抗体の
産生のための免疫原として有用である。ＥＬＩＳＡアッセイにおいて、非複製ベ
クターはまず宿主に投与されてＲＳＶ Ｇタンパク質に対する特異的な抗体を産
生させる。これらのＲＳＶ Ｇ特異的抗体はたとえばポリスチレンマイクロタイ
タープレートの穴などのそれらの抗体を結合することのできる選択された表面上
に固定される。洗浄によって非吸着抗体を除去した後、被検試料に関して抗原的
に中性であることが知られている牛ガンマアルブミン（ＢＳＡ）などの非特異的
蛋白質を選択された表面に結合することができる。これが固定化された表面上の
非特異的吸着部位を遮蔽することを可能にして、それによって表面上に非特異的
な抗血清の結合によって起こるバックグラウンドを低下させる。
【００４９】 次にこの固定化した表面に、臨床または生物学的物質などの試験する試料を、
免疫複合体（抗原／抗体）を形成するのを促進する方法で接触させる。この方法
はＢＳＡ溶液、牛ガンマグロブリン（ＢＧＧ）および／またはリン酸緩衝食塩水
（ＰＢＳ）／Ｔｗｅｅｎの溶液などの希釈剤で試料を希釈することを含むことが
可能である。次にこの試料を約２０から３７℃程度の温度において約２から４時
間インキュベートする。インキュベーション後、試料と接触させた表面を洗浄し
て免疫複合化しなかった物質を除去する。この洗浄操作はＰＢＳ／トゥイーンま
たはホウ酸塩緩衝液などの溶液による洗浄を含むことが可能である。被検試料と
結合ＲＳＶ Ｇ特異的抗体との間の特異的免疫複合体の形成、およびその後の洗
浄で、免疫複合体形成の発生、およびその量をも決定することができる。
免疫複合体（抗原／抗体）を形成するのを促進する方法で接触させる。この方法
はＢＳＡ溶液、牛ガンマグロブリン（ＢＧＧ）および／またはリン酸緩衝食塩水
（ＰＢＳ）／Ｔｗｅｅｎの溶液などの希釈剤で試料を希釈することを含むことが
可能である。次にこの試料を約２０から３７℃程度の温度において約２から４時
間インキュベートする。インキュベーション後、試料と接触させた表面を洗浄し
て免疫複合化しなかった物質を除去する。この洗浄操作はＰＢＳ／トゥイーンま
たはホウ酸塩緩衝液などの溶液による洗浄を含むことが可能である。被検試料と
結合ＲＳＶ Ｇ特異的抗体との間の特異的免疫複合体の形成、およびその後の洗
浄で、免疫複合体形成の発生、およびその量をも決定することができる。
【００５０】 （生物学的物質） ＲＳＶ Ｇタンパク質をコードする遺伝子を含んでおり、本明細書で言及した
ある種のプラスミド類は、本願の出願に先立ってブタペスト条約に従って、米国
２０８５２、メリーランド、ロックヴィル、Ｐａｒｋｌａｗｎ Ｄｒｉｖｅ １
２３０１に所在するＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅ
ｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に寄託された。
ある種のプラスミド類は、本願の出願に先立ってブタペスト条約に従って、米国
２０８５２、メリーランド、ロックヴィル、Ｐａｒｋｌａｗｎ Ｄｒｉｖｅ １
２３０１に所在するＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅ
ｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に寄託された。
【００５１】 この寄託されたプラスミド試料は、この米国特許出願に基づいて特許が与えら
れた時に公衆に入手可能となり、この寄託物へのアクセスの全ての制限がそのと
き除かれることになる。寄託されたプラスミド試料は、寄託先が生きた試料を調
製することができない場合は返却されるであろう。寄託された実施例は本発明を
例示することのみを目的としているので、本明細書で記述され特許請求される発
明は、寄託されたプラスミドによってその範囲を限定されるものではない。この
明細書で記述されたものと類似または等価な抗原をコードする等価または類似の
全てのプラスミド類は本発明の範囲に含まれる。 プラスミド ＡＴＣＣ表示 寄託日付 ｐＸＬ５ ２０９１４３ １９９７年７月１６日 ｐＸＬ６ ２０９１４４ １９９７年７月１６日 （実施例） 上記の開示は一般的に本発明を記述するものである。以下の特定の実施例を参
照することによってより完全な理解が得られる。これらの実施例は例示の目的の
ためにのみ記述するものであって、発明の範囲を制限しようとするものではない
。形態の変化および等価物の置換は条件が示唆し、または好都合になる時に考え
られる。本明細書では特定の用語を使用しているが、このような用語は記述的な
意味で用いるものであって限定を目的としたものではない。
れた時に公衆に入手可能となり、この寄託物へのアクセスの全ての制限がそのと
き除かれることになる。寄託されたプラスミド試料は、寄託先が生きた試料を調
製することができない場合は返却されるであろう。寄託された実施例は本発明を
例示することのみを目的としているので、本明細書で記述され特許請求される発
明は、寄託されたプラスミドによってその範囲を限定されるものではない。この
明細書で記述されたものと類似または等価な抗原をコードする等価または類似の
全てのプラスミド類は本発明の範囲に含まれる。 プラスミド ＡＴＣＣ表示 寄託日付 ｐＸＬ５ ２０９１４３ １９９７年７月１６日 ｐＸＬ６ ２０９１４４ １９９７年７月１６日 （実施例） 上記の開示は一般的に本発明を記述するものである。以下の特定の実施例を参
照することによってより完全な理解が得られる。これらの実施例は例示の目的の
ためにのみ記述するものであって、発明の範囲を制限しようとするものではない
。形態の変化および等価物の置換は条件が示唆し、または好都合になる時に考え
られる。本明細書では特定の用語を使用しているが、このような用語は記述的な
意味で用いるものであって限定を目的としたものではない。
【００５２】 分子遺伝学、蛋白質化学および免疫学の方法が使用されているが、この開示に
おいては明確に記述しておらず、これらの実施例は化学文献で十分に報告されて
おり、かつ十分に当技術者の能力の範囲内である。 実施例１ この実施例はＲＳＶ Ｇ遺伝子を含むベクターの構造を記述する。
おいては明確に記述しておらず、これらの実施例は化学文献で十分に報告されて
おり、かつ十分に当技術者の能力の範囲内である。 実施例１ この実施例はＲＳＶ Ｇ遺伝子を含むベクターの構造を記述する。
【００５３】 図１は呼吸器合胞体ウイルスのＧタンパク質をコードする遺伝子の制限地図を
示しており、図２はＲＳＶ Ｇタンパク質の全長をコードする遺伝子のヌクレオ
チド配列（配列番号１）および推論されたアミノ酸配列（配列番号２）を示す。
図３は分泌型ＲＳＶ Ｇタンパク質をコードする遺伝子（配列番号３）および推
論されたアミノ酸配列（配列番号４）を示す。
示しており、図２はＲＳＶ Ｇタンパク質の全長をコードする遺伝子のヌクレオ
チド配列（配列番号１）および推論されたアミノ酸配列（配列番号２）を示す。
図３は分泌型ＲＳＶ Ｇタンパク質をコードする遺伝子（配列番号３）および推
論されたアミノ酸配列（配列番号４）を示す。
【００５４】 プラスミドｐＸＬ５（図４）は以下の通りにＲＳＶ Ｇタンパク質全長の発現
のために調製した。
のために調製した。
【００５５】 臨床的なＲＳＶ単離物（サブグループＡ）の全長Ｇタンパク質をコードするｃ
ＤＮＡを含む組換えＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔプラスミド（ＲＳＶ Ｇ１２）がＲＳ
Ｖ ＤＮＡ−Ｇ免疫のためのベクターの構築に使用された。ＲＳＶ Ｇ１２をＡ
ｆｌＩＩＩおよびＥｃｏＲＩで消化してＤＮＡポリメラーゼのクレノウサブユニ
ットを挿入した。得られた全長Ｇタンパク質のコード配列を含む１．２３ｋｂフ
ラグメントは、ゲルで精製してＥｃｏＲＶで前もって直鎖にしたＶＲ−１０１２
（Ｖｉｃａｌ）（図６）に繋いだ。この方法によってＲＳＶ ＧのｃＤＮＡは前
初期サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターおよびヒトサイトメガロウイ
ルス（ＣＭＶ）のイントロンＡ配列の下流かつ牛成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリ−
Ａ−部位の上流に置かれた。プラスミド構築中のｃＤＮＡフラグメントの連結は
配列分析によって確認する。得られたプラスミドはｐＸＬ５と称した。
ＤＮＡを含む組換えＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔプラスミド（ＲＳＶ Ｇ１２）がＲＳ
Ｖ ＤＮＡ−Ｇ免疫のためのベクターの構築に使用された。ＲＳＶ Ｇ１２をＡ
ｆｌＩＩＩおよびＥｃｏＲＩで消化してＤＮＡポリメラーゼのクレノウサブユニ
ットを挿入した。得られた全長Ｇタンパク質のコード配列を含む１．２３ｋｂフ
ラグメントは、ゲルで精製してＥｃｏＲＶで前もって直鎖にしたＶＲ−１０１２
（Ｖｉｃａｌ）（図６）に繋いだ。この方法によってＲＳＶ ＧのｃＤＮＡは前
初期サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターおよびヒトサイトメガロウイ
ルス（ＣＭＶ）のイントロンＡ配列の下流かつ牛成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリ−
Ａ−部位の上流に置かれた。プラスミド構築中のｃＤＮＡフラグメントの連結は
配列分析によって確認する。得られたプラスミドはｐＸＬ５と称した。
【００５６】 プラスミドｐＸＬ６（図５）は以下の通りに分泌型ＲＳＶ Ｇタンパク質の発
現のために調製された。
現のために調製された。
【００５７】 ＲＳＶ Ｇ１２はＥｃｏＲＩで消化してクレノウを挿入し再びＢａｍＨＩで消
化した。ＢａｍＨＩ切断によってＮ末端を有するＲＳＶ Ｇタンパク質をコード
するｃＤＮＡフラグメントが生成された。このＤＮＡセグメントをゲルによって
精製されて、１１対の部分オリゴデオキシヌクレオチド （５’ＧＡＴＣＣＡＣＴＣＡＧ３’）（配列番号７） ３’ＧＴＧＡＧＴＣＣＴＡＧ５’（配列番号８） の存在下で、前もってＢｇｌＩＩで消化してクレノウを挿入して、再びＢａｍＨ
Ｉで消化してゲルで精製したＶＲ−１０２０（Ｖｉｃａｌ）に繋いだ。この方法
によって切断されたＲＳＶ ＧｃＤＮＡ（トランスメンブランドメインを含むＮ
末端の９１アミノ酸残基のコーディング領域を欠失している）は前初期ＣＭＶプ
ロモーターおよびヒトＣＭＶのイントロンＡ配列の下流かつＢＧＨポリＡ部位の
上流に置かれた。さらに、約１００ｂｐの５’非翻訳領域およびヒトプラスミノ
ーゲン活性化因子蛋白質（図７）のシグナルペプチドのコード配列をＣＭＶプロ
モータ／イントロンＡ配列の下流のＲＳＶ Ｇタンパク質コード配列のＮ末端に
融合するように導入された。このプラスミド構造におけるｃＤＮＡフラグメント
の連結は配列分析によって確かめられた。得られたプラスミドはｐＸＬ６と称し
た。 実施例２ この実施例ではマウスの免疫について記述する。マウスは参照文献２４で記述
された通りにＲＳＶによって感染に感受性である。
化した。ＢａｍＨＩ切断によってＮ末端を有するＲＳＶ Ｇタンパク質をコード
するｃＤＮＡフラグメントが生成された。このＤＮＡセグメントをゲルによって
精製されて、１１対の部分オリゴデオキシヌクレオチド （５’ＧＡＴＣＣＡＣＴＣＡＧ３’）（配列番号７） ３’ＧＴＧＡＧＴＣＣＴＡＧ５’（配列番号８） の存在下で、前もってＢｇｌＩＩで消化してクレノウを挿入して、再びＢａｍＨ
Ｉで消化してゲルで精製したＶＲ−１０２０（Ｖｉｃａｌ）に繋いだ。この方法
によって切断されたＲＳＶ ＧｃＤＮＡ（トランスメンブランドメインを含むＮ
末端の９１アミノ酸残基のコーディング領域を欠失している）は前初期ＣＭＶプ
ロモーターおよびヒトＣＭＶのイントロンＡ配列の下流かつＢＧＨポリＡ部位の
上流に置かれた。さらに、約１００ｂｐの５’非翻訳領域およびヒトプラスミノ
ーゲン活性化因子蛋白質（図７）のシグナルペプチドのコード配列をＣＭＶプロ
モータ／イントロンＡ配列の下流のＲＳＶ Ｇタンパク質コード配列のＮ末端に
融合するように導入された。このプラスミド構造におけるｃＤＮＡフラグメント
の連結は配列分析によって確かめられた。得られたプラスミドはｐＸＬ６と称し
た。 実施例２ この実施例ではマウスの免疫について記述する。マウスは参照文献２４で記述
された通りにＲＳＶによって感染に感受性である。
【００５８】 プラスミドＤＮＡは２重セシウム遠心法によって精製された。筋肉内（ｉ．ｍ
．）免疫のために、ＢＡＬＢ／ｃマウス（６から８週齡の雄）（米国メイン州、
Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂ．）の前脛骨筋の両側から、２
×５０μｇ（ＰＢＳ中１μｇ／μＬ）のｐＸＬ５、ｐＸＬ６またはＶ−１０１２
のいずれかを注射した。Ｄａｖｉｓ他（参照文献２３）によって報告された通り
に、ＤＮＡの取り込みを増加させ免疫応答を高めるために、ＤＮＡ注射の５日前
にその筋肉をカルジオトキシン（フランス、Ｌａｔｏｘａｎ）の２×５０μＬ（
ＰＢＳ中１０μＭ）で処理した。これらの動物に６週目および１３週目に、それ
ぞれ同用量のプラスミドＤＮＡを追加投与した。皮内（ｉ．ｄ．）免疫化のため
には、プラスミドＤＮＡ１００μｇ（ＰＢＳ中２μｇ／μＬ）を尾の付け根に注
射して６週および１３週間後にそれぞれ追加免疫した。陽性対照群のマウスは、
ドクターＢ．Ｇｒａｈａｍから恵与されたＨｅｐ２細胞内で増殖させた臨床ＲＳ
Ｖ株のＡ２サブタイプを１０6プラーク形成ユニット（ｐｆｕ）で鼻腔内免疫化 した（参照文献２４）。
．）免疫のために、ＢＡＬＢ／ｃマウス（６から８週齡の雄）（米国メイン州、
Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂ．）の前脛骨筋の両側から、２
×５０μｇ（ＰＢＳ中１μｇ／μＬ）のｐＸＬ５、ｐＸＬ６またはＶ−１０１２
のいずれかを注射した。Ｄａｖｉｓ他（参照文献２３）によって報告された通り
に、ＤＮＡの取り込みを増加させ免疫応答を高めるために、ＤＮＡ注射の５日前
にその筋肉をカルジオトキシン（フランス、Ｌａｔｏｘａｎ）の２×５０μＬ（
ＰＢＳ中１０μＭ）で処理した。これらの動物に６週目および１３週目に、それ
ぞれ同用量のプラスミドＤＮＡを追加投与した。皮内（ｉ．ｄ．）免疫化のため
には、プラスミドＤＮＡ１００μｇ（ＰＢＳ中２μｇ／μＬ）を尾の付け根に注
射して６週および１３週間後にそれぞれ追加免疫した。陽性対照群のマウスは、
ドクターＢ．Ｇｒａｈａｍから恵与されたＨｅｐ２細胞内で増殖させた臨床ＲＳ
Ｖ株のＡ２サブタイプを１０6プラーク形成ユニット（ｐｆｕ）で鼻腔内免疫化 した（参照文献２４）。
【００５９】 ３回目の免疫後４週目に、マウスにＲＳＶ Ａ２株の１０6ｐｆｕを鼻腔内に 試験感染させた。４日後に肺を滅菌的に取り出し、完全培養培地２ｍＬに均質化
させた（参照番号２５）。肺のホモジェネート中のｐｆｕ数をワクチン品質のｖ
ｅｒｏ細胞を用いて以前に記述した通りに（参照文献２６）２連で測定した。 実施例３ この実施例はポリヌクレオチド免疫による免疫原性および防御について記述す
る。
させた（参照番号２５）。肺のホモジェネート中のｐｆｕ数をワクチン品質のｖ
ｅｒｏ細胞を用いて以前に記述した通りに（参照文献２６）２連で測定した。 実施例３ この実施例はポリヌクレオチド免疫による免疫原性および防御について記述す
る。
【００６０】 免役したマウスから得られた抗血清について、特異的酵素結合免疫吸着アッセ
イ（ＥＬＩＳＡ）を使用した抗ＲＳＶ Ｇ ＩｇＧ抗体力価およびＲＳＶ特異的
プラーク減少力価を分析した。ＥＬＩＳＡはイムノアフィニティークロマトグラ
フィーで精製したＲＳＶ Ｇタンパク質（５０ｎｇ／ｍＬ）で被覆された９６穴
プレートを使用して免疫血清の２倍系列希釈を用いて実施した。アルカリホスフ
ァターゼ結合山羊抗マウスＩｇＧ抗体（カナダ国オンタリオ州、Ｍｉｓｓｉｓｓ
ａｕｇａのＪａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓ．）を２次抗体として使用した
。プラーク減少力価はワクチン品質のＶｅｒｏ細胞を使用してＰｒｉｎｃｅ他（
参照文献２６）に従って測定した。４倍系列希釈した免疫血清を５０ｐｆｕのＲ
ＳＶ、Ｌｏｎｇ株（ＡＴＣＣ）と共に５％ＣＯ2の存在下で３７℃で１時間培地 中でインキュベートして、この混合液をＶｅｒｏ細胞の感染に使用した。プラー
クは８０％メタノールで固定して、５日後にマウス抗ＲＳＶ−Ｆモノクローナル
ＩｇＧ１抗体およびペルオキシダーゼを結合したロバ抗マウスＩｇＧ抗体（カナ
ダ国オンタリオ州、ＭｉｓｓｉｓｓａｕｇａのＪａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲ
ｅｓ．）を使用して確認した。このＲＳＶ特異的プラーク減少力価はプラーク数
の６０％減少をもたらす血清試料の希釈度として定義した。ＥＬＩＳＡおよびプ
ラーク減少アッセイの両方とも２連で実施してデータは２つの測定値の平均とし
て表した。
イ（ＥＬＩＳＡ）を使用した抗ＲＳＶ Ｇ ＩｇＧ抗体力価およびＲＳＶ特異的
プラーク減少力価を分析した。ＥＬＩＳＡはイムノアフィニティークロマトグラ
フィーで精製したＲＳＶ Ｇタンパク質（５０ｎｇ／ｍＬ）で被覆された９６穴
プレートを使用して免疫血清の２倍系列希釈を用いて実施した。アルカリホスフ
ァターゼ結合山羊抗マウスＩｇＧ抗体（カナダ国オンタリオ州、Ｍｉｓｓｉｓｓ
ａｕｇａのＪａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓ．）を２次抗体として使用した
。プラーク減少力価はワクチン品質のＶｅｒｏ細胞を使用してＰｒｉｎｃｅ他（
参照文献２６）に従って測定した。４倍系列希釈した免疫血清を５０ｐｆｕのＲ
ＳＶ、Ｌｏｎｇ株（ＡＴＣＣ）と共に５％ＣＯ2の存在下で３７℃で１時間培地 中でインキュベートして、この混合液をＶｅｒｏ細胞の感染に使用した。プラー
クは８０％メタノールで固定して、５日後にマウス抗ＲＳＶ−Ｆモノクローナル
ＩｇＧ１抗体およびペルオキシダーゼを結合したロバ抗マウスＩｇＧ抗体（カナ
ダ国オンタリオ州、ＭｉｓｓｉｓｓａｕｇａのＪａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲ
ｅｓ．）を使用して確認した。このＲＳＶ特異的プラーク減少力価はプラーク数
の６０％減少をもたらす血清試料の希釈度として定義した。ＥＬＩＳＡおよびプ
ラーク減少アッセイの両方とも２連で実施してデータは２つの測定値の平均とし
て表した。
【００６１】 得られた結果は以下の表１および表２に再掲した。
【００６２】
【表１】
【００６３】
【表２】
【００６４】 表１に認められる通りに、プラスミドｐＸＬ５およびｐＸＬ６は１．ｍ．また
はｉ．ｄ．のいずれによる免疫後も抗Ｇ抗体およびウイルス中和抗体を生産して
免疫原性を有していることが発見された。さらに、表２に示される通りに、プラ
スミドｐＸＬ５およびｐＸＬ６は下気道の１次ＲＳＶ感染に対して免疫マウスを
防護した。対照ベクターは免疫応答を引き起こさず、防護も与えなかった。 実施例４ この実施例はＲＳＶ感染後ｐＸＬ５およびｐＸＬ６で免役したマウスにおける
局部の肺サイトカイン発現特性の測定について記述する。
はｉ．ｄ．のいずれによる免疫後も抗Ｇ抗体およびウイルス中和抗体を生産して
免疫原性を有していることが発見された。さらに、表２に示される通りに、プラ
スミドｐＸＬ５およびｐＸＬ６は下気道の１次ＲＳＶ感染に対して免疫マウスを
防護した。対照ベクターは免疫応答を引き起こさず、防護も与えなかった。 実施例４ この実施例はＲＳＶ感染後ｐＸＬ５およびｐＸＬ６で免役したマウスにおける
局部の肺サイトカイン発現特性の測定について記述する。
【００６５】 ＢＡＬＢ／ｃマウスを実施例１で記述した通りに調製したｐＸＬ５および６の
１００μｇで０および６週目に免役して、１０週目にｉ．ｎ．でＲＳＶ感染させ
た。対照動物はプラシーボＰＩ−ＲＳＶおよび生ＲＳＶで免役して同方法に従っ
てＲＳＶ感染させた。さらに、動物は１９９５年７月７日出願の米国特許出願第
０８／４７６，３９７号（ＷＯ９６／４０９４５）に記述されたとおりにｐＸＬ
２で免役して、また同方法に従ってＲＳＶで感染させた。ウイルス感染後４日目
に、免役したマウスの肺を取り出し、すぐに液体窒素で凍結した。全ＲＮＡはＴ
ＲＩｚｏｌ／β−メルカプトエタノール中で均質化した肺からクロロホルム抽出
およびイソプロパノール沈殿によって調製した。その後ＣｌｏｎｅＴｅｃｈから
のＩＬ−４、ＩＬ−５またはＩＦＮ−γ特異的プライマーのいずれかを使用して
逆転写酵素−複製連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）をＲＮＡ試料について実施した。そ
の後増幅された生成物はＣｌｏｎｅＴｅｃｈのサイトカイン特異的Ｐ32標識プロ
ーブに液体ハイブリダイズして、５％ポリアクリルアミドゲル上で溶解して、ゲ
ル中の放射活性シグナルのスキャニングによって定量した。３つのマウス肺を各
処理群から取り出して、最小２回肺サイトカイン発現を分析した。このデータは
図８にあり、これらの測定値の平均および標準偏差を表した。
１００μｇで０および６週目に免役して、１０週目にｉ．ｎ．でＲＳＶ感染させ
た。対照動物はプラシーボＰＩ−ＲＳＶおよび生ＲＳＶで免役して同方法に従っ
てＲＳＶ感染させた。さらに、動物は１９９５年７月７日出願の米国特許出願第
０８／４７６，３９７号（ＷＯ９６／４０９４５）に記述されたとおりにｐＸＬ
２で免役して、また同方法に従ってＲＳＶで感染させた。ウイルス感染後４日目
に、免役したマウスの肺を取り出し、すぐに液体窒素で凍結した。全ＲＮＡはＴ
ＲＩｚｏｌ／β−メルカプトエタノール中で均質化した肺からクロロホルム抽出
およびイソプロパノール沈殿によって調製した。その後ＣｌｏｎｅＴｅｃｈから
のＩＬ−４、ＩＬ−５またはＩＦＮ−γ特異的プライマーのいずれかを使用して
逆転写酵素−複製連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）をＲＮＡ試料について実施した。そ
の後増幅された生成物はＣｌｏｎｅＴｅｃｈのサイトカイン特異的Ｐ32標識プロ
ーブに液体ハイブリダイズして、５％ポリアクリルアミドゲル上で溶解して、ゲ
ル中の放射活性シグナルのスキャニングによって定量した。３つのマウス肺を各
処理群から取り出して、最小２回肺サイトカイン発現を分析した。このデータは
図８にあり、これらの測定値の平均および標準偏差を表した。
【００６６】 図８に示されたデータからわかる通りに、 １．生ＲＳＶ鼻腔内（ｉ．ｎ．）免疫によって均衡のとれたサイトカイン特性（
ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４およびＩＬ−５）が生じて、一方ＦＩ−ＲＳＶの筋肉内（
ｉ．ｍ．）免疫によってはＴｈ２の優勢（ＩＬ−４およびＩＬ−５の上昇）が生
じた。これらの結果は文献で報告されたものと同様である。 ２．ｉ．ｍ．または皮内（ｉ．ｄ．）経路のいずれかを介するｐＸＬ５またはｐ
ＸＬ６の免疫は、生ＲＳＶ免疫と同様に均衡のとれたサイトカインプロフィルを
もたらした。 ３．分泌型蛋白質（ＳＥＣ）を発現する構築物を使用した場合、ｉ．ｍ．のｐＸ
Ｌ６（ＲＳＶ Ｇ）およびｐＸＬ２（ＲＳＶ−Ｆ）免疫に伴うサイトカイン応答
の程度は、生ＲＳＶ免疫の場合よりも顕著に高かった。 ４．膜結合ＲＳＶ Ｇタンパク質（ＭＡ）の全長の構造発現を使用した場合のｐ
ＸＬ５およびｉ．ｄ．ｐＸＬ６免疫に伴うサイトカイン応答の程度は生ＲＳＶ免
疫よりもいくらか高かった。 ５．Ｏｐｅｎｓｈａｗ他（参照文献１３）によって報告されたものと対照的にＤ
ＮＡ−Ｇ免疫に伴って均衡のとれた局部サイトカイン応答が観察された。Ｇタン
パク質を発現する組換えワクチンウイルスを使用して、これらの研究者は気管支
肺胞洗浄の分析によって局部のＴｈ２応答を報告した。本明細書での結果は単一
遺伝子によって得られたものであり、Ｔｈ２応答は必ずしもＧタンパク質固有の
性質ではないことを示唆している。
ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４およびＩＬ−５）が生じて、一方ＦＩ−ＲＳＶの筋肉内（
ｉ．ｍ．）免疫によってはＴｈ２の優勢（ＩＬ−４およびＩＬ−５の上昇）が生
じた。これらの結果は文献で報告されたものと同様である。 ２．ｉ．ｍ．または皮内（ｉ．ｄ．）経路のいずれかを介するｐＸＬ５またはｐ
ＸＬ６の免疫は、生ＲＳＶ免疫と同様に均衡のとれたサイトカインプロフィルを
もたらした。 ３．分泌型蛋白質（ＳＥＣ）を発現する構築物を使用した場合、ｉ．ｍ．のｐＸ
Ｌ６（ＲＳＶ Ｇ）およびｐＸＬ２（ＲＳＶ−Ｆ）免疫に伴うサイトカイン応答
の程度は、生ＲＳＶ免疫の場合よりも顕著に高かった。 ４．膜結合ＲＳＶ Ｇタンパク質（ＭＡ）の全長の構造発現を使用した場合のｐ
ＸＬ５およびｉ．ｄ．ｐＸＬ６免疫に伴うサイトカイン応答の程度は生ＲＳＶ免
疫よりもいくらか高かった。 ５．Ｏｐｅｎｓｈａｗ他（参照文献１３）によって報告されたものと対照的にＤ
ＮＡ−Ｇ免疫に伴って均衡のとれた局部サイトカイン応答が観察された。Ｇタン
パク質を発現する組換えワクチンウイルスを使用して、これらの研究者は気管支
肺胞洗浄の分析によって局部のＴｈ２応答を報告した。本明細書での結果は単一
遺伝子によって得られたものであり、Ｔｈ２応答は必ずしもＧタンパク質固有の
性質ではないことを示唆している。
【００６７】 （開示の要約） この開示の要約において、本発明はＲＳＶ Ｇタンパク質をコードする遺伝子
を含むある種の新規の非複製ベクター、このようなベクターを使用した免疫方法
およびこのようなベクターを使用した診断方法を提供する。変更は本発明の範囲
内である。
を含むある種の新規の非複製ベクター、このようなベクターを使用した免疫方法
およびこのようなベクターを使用した診断方法を提供する。変更は本発明の範囲
内である。
【００６８】 文献リスト 1. McIntosh K., Conock, R. M. In: Fields B.N, Knipe, DM, editors. Virol
ogy. New York: Raven Press: 1990: 1045-1072 2. Heilman, C. A., J. Infect. Dis. 1990, 161: 402 to 406. 3. Wertz GW, Sullender WM., Biotechnology 1992: 20: 151-176 4. Murphy, B. R. et al, 1994, Virus Res. 32: 13-36 5. Levine, S., Keiber-France, R., and Paradiso, P. R. (1987) J. Gen. Vi
rol. 69, 2521-2524 6. Anderson, L. J., Hierholzer, J. C., Tsou, C., Hendry, R. M., Fernie,
B. F., Stone, Y. and McIntosh, K. (1985) J. Infect. Dis. 151, 626-633 7. Johnson et al., J. Virol 1987, 61: 3163-3166 8. Crowe, J. E., Vaccine 1995, 13: 415-421 9. Kapikian, A. Z. et al 1969, Am. J. Epidemiol. 89: 405-421 10. Kim, H. W., et al 1969 Am. J. Epidemiol. 89: 422-434 11. Murphy, B. R. et al 1986 J. Clin. Microbiol. 24: 197-202 12. Vaux-Peretz, F. et al 1992 Vaccine 10: 113-118 13. Openshaw, P. J. 1995 Springer-Semin Immunopathol. 17: 187-201 14. Alwan et al 1994 J. Exp. Med. 179: 81-89 15. Graham, B. S. 1995 Am. J. Respir. Crit. Care Med. 152: 563-566 16. WO 90/11092 17. WO 94/21797 18. Ulmer, Current Opinion, Invest Drugs, 1993, 2: 983-989 19. Chapman, B. S.; Thayer, R. M.; Vincent, K. A. and Haigwood, N. L., N
ucl. Acids. Res. 1991, 19: 3979-3986 20. Nabel, G. J. 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 11307-11311 21. Tang et al., Nature 1992, 356: 152-154 22. Furth et al. Analytical Biochemistry, 1992, 205: 365-368 23. Davis et al., Vaccine 1994, 12: 1503-1509 24. Graham, B. S.; Perkins M. D.; Wright, P. F. and Karzon, D. T. J. Med
. Virol. 1988 26: 153-162 25. Du, R. P. et al. 1994., Bio Technology 12: 813-818 26. Prince, G. A. et al, 1978. Ame. J. Pathol. 93: 771-790
ogy. New York: Raven Press: 1990: 1045-1072 2. Heilman, C. A., J. Infect. Dis. 1990, 161: 402 to 406. 3. Wertz GW, Sullender WM., Biotechnology 1992: 20: 151-176 4. Murphy, B. R. et al, 1994, Virus Res. 32: 13-36 5. Levine, S., Keiber-France, R., and Paradiso, P. R. (1987) J. Gen. Vi
rol. 69, 2521-2524 6. Anderson, L. J., Hierholzer, J. C., Tsou, C., Hendry, R. M., Fernie,
B. F., Stone, Y. and McIntosh, K. (1985) J. Infect. Dis. 151, 626-633 7. Johnson et al., J. Virol 1987, 61: 3163-3166 8. Crowe, J. E., Vaccine 1995, 13: 415-421 9. Kapikian, A. Z. et al 1969, Am. J. Epidemiol. 89: 405-421 10. Kim, H. W., et al 1969 Am. J. Epidemiol. 89: 422-434 11. Murphy, B. R. et al 1986 J. Clin. Microbiol. 24: 197-202 12. Vaux-Peretz, F. et al 1992 Vaccine 10: 113-118 13. Openshaw, P. J. 1995 Springer-Semin Immunopathol. 17: 187-201 14. Alwan et al 1994 J. Exp. Med. 179: 81-89 15. Graham, B. S. 1995 Am. J. Respir. Crit. Care Med. 152: 563-566 16. WO 90/11092 17. WO 94/21797 18. Ulmer, Current Opinion, Invest Drugs, 1993, 2: 983-989 19. Chapman, B. S.; Thayer, R. M.; Vincent, K. A. and Haigwood, N. L., N
ucl. Acids. Res. 1991, 19: 3979-3986 20. Nabel, G. J. 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 11307-11311 21. Tang et al., Nature 1992, 356: 152-154 22. Furth et al. Analytical Biochemistry, 1992, 205: 365-368 23. Davis et al., Vaccine 1994, 12: 1503-1509 24. Graham, B. S.; Perkins M. D.; Wright, P. F. and Karzon, D. T. J. Med
. Virol. 1988 26: 153-162 25. Du, R. P. et al. 1994., Bio Technology 12: 813-818 26. Prince, G. A. et al, 1978. Ame. J. Pathol. 93: 771-790
【図面の簡単な説明】
【図１】 呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）のＧタンパク質をコードする遺伝子の制限地
図を示す図である。
図を示す図である。
【図２】 膜付着型の呼吸器合胞体ウイルスＧタンパク質（配列番号１）をコードする遺
伝子のヌクレオチド配列並びにそれによりエンコードされたＲＳＶ Ｇタンパク
質のアミノ酸配列（配列番号２）を示図である。
伝子のヌクレオチド配列並びにそれによりエンコードされたＲＳＶ Ｇタンパク
質のアミノ酸配列（配列番号２）を示図である。
【図３】 分泌型のトランスメンブランドメインを欠落したＲＳＶ Ｇタンパク質のヌク
レオチド配列（配列番号３）並びにそれによりエンコードされたトランスメンブ
ランドメインを欠落し切断型のＲＳＶ Ｇタンパク質のアミノ酸配列（配列番号
４）を示す図である。
レオチド配列（配列番号３）並びにそれによりエンコードされたトランスメンブ
ランドメインを欠落し切断型のＲＳＶ Ｇタンパク質のアミノ酸配列（配列番号
４）を示す図である。
【図４】 膜付着型のＲＳＶ Ｇタンパク質の全長をコードする遺伝子を含んでおりＣＭ
ＶイントロンＡ配列を含むプラスミドｐＸＬ５の構造を示す図である。
ＶイントロンＡ配列を含むプラスミドｐＸＬ５の構造を示す図である。
【図５】 分泌型のトランスメンブランドメインを欠落したＲＳＶ Ｇタンパク質をコー
ドする遺伝子を含んでおりＣＭＶイントロンＡ並びにヒト組織プラスミノーゲン
活性化因子（ＴＰＡ）のシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む
プラスミドｐＸＬ６の構造を示す図である。
ドする遺伝子を含んでおりＣＭＶイントロンＡ並びにヒト組織プラスミノーゲン
活性化因子（ＴＰＡ）のシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む
プラスミドｐＸＬ６の構造を示す図である。
【図６】 プラスミドＶＲ−１０１２のヌクレオチド配列（配列番号５）を示す図である
。
。
【図７】 ５’の非翻訳領域およびヒト組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）のシ
グナルペプチドのヌクレオチド配列（配列番号６）を示す図である。
グナルペプチドのヌクレオチド配列（配列番号６）を示す図である。
【図８】 ＲＳＶ感染後のＤＮＡ免疫マウスにおける肺のサイトカイン発現特性を示す図
である。
である。
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１２年１月１８日（２０００．１．１８）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
【請求項４８】 呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）のＧタンパク質に特異的
なモノクローナル抗体を産生させる方法であって、 （ａ）ＲＳＶ Ｇタンパク質またはＲＳＶ Ｇタンパク質と特異的に反応する
抗体を産生するＲＳＶ Ｇタンパク質フラグメントをコードする第１のヌクレオ
チド配列、 宿主において前記ＲＳＶ Ｇタンパク質を発現するために前記第１のヌクレオ
チド配列と動作可能に結合されるプロモーター配列、および 前記第１のヌクレオチド配列と前記プロモーター配列との間に位置し、宿主に
おいて前記ベクターからのｉｎ ｖｉｖｏにおける前記ＲＳＶ Ｇタンパク質の
発現を促進させるための第２のヌクレオチド配列を含む、防御すべき宿主に導入
されたときに複製しないベクターを構成するステップと、 （ｂ）少なくとも１匹のマウスにベクターを投与して、少なくとも１匹の免疫
化マウスを作るステップと、 （ｃ）少なくとも１匹の免疫化マウスからＢリンパ球を取り出すステップと、
（ｄ）少なくとも１匹の免疫化マウスから得たＢリンパ球を骨髄腫細胞と融合
させ、それによってハイブリドーマを作るステップと、 （ｅ）ハイブリドーマをクローン化するステップと、 （ｆ）抗ＲＳＶ Ｇタンパク質抗体を産生するクローンを選択するステップと
、 （ｇ）抗ＲＳＶ Ｇタンパク質抗体産生クローンを培養するステップと、 （ｈ）抗ＲＳＶ Ｇタンパク質モノクローナル抗体を単離するステップとを含
む方法。
なモノクローナル抗体を産生させる方法であって、 （ａ）ＲＳＶ Ｇタンパク質またはＲＳＶ Ｇタンパク質と特異的に反応する
抗体を産生するＲＳＶ Ｇタンパク質フラグメントをコードする第１のヌクレオ
チド配列、 宿主において前記ＲＳＶ Ｇタンパク質を発現するために前記第１のヌクレオ
チド配列と動作可能に結合されるプロモーター配列、および 前記第１のヌクレオチド配列と前記プロモーター配列との間に位置し、宿主に
おいて前記ベクターからのｉｎ ｖｉｖｏにおける前記ＲＳＶ Ｇタンパク質の
発現を促進させるための第２のヌクレオチド配列を含む、防御すべき宿主に導入
されたときに複製しないベクターを構成するステップと、 （ｂ）少なくとも１匹のマウスにベクターを投与して、少なくとも１匹の免疫
化マウスを作るステップと、 （ｃ）少なくとも１匹の免疫化マウスからＢリンパ球を取り出すステップと、
（ｄ）少なくとも１匹の免疫化マウスから得たＢリンパ球を骨髄腫細胞と融合
させ、それによってハイブリドーマを作るステップと、 （ｅ）ハイブリドーマをクローン化するステップと、 （ｆ）抗ＲＳＶ Ｇタンパク質抗体を産生するクローンを選択するステップと
、 （ｇ）抗ＲＳＶ Ｇタンパク質抗体産生クローンを培養するステップと、 （ｈ）抗ＲＳＶ Ｇタンパク質モノクローナル抗体を単離するステップとを含
む方法。
【手続補正書】
【提出日】平成１２年４月４日（２０００．４．４）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正内容】
【発明の名称】 呼吸器合胞体ウイルスのＧタンパク質をコードする核酸ワクチ
ン
ン
【特許請求の範囲】
【化１】
を有するｐＸＬ５または下記構造：
【化２】 を有するｐＸＬ６である請求項９に記載の免疫原性の組成物。
【化３】
を有するｐＸＬ５または下記構造：
【化４】
を有するｐＸＬ６である請求項２０に記載のベクター。
【化５】
ｐＸＬ５および下記構造：
【化６】
ｐＸＬ６からなる群から選択される請求項２２に記載のワクチンの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】 （発明の分野） 本発明は、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）ワクチンの分野に関し、具体的に
は、ＲＳＶの付着（Ｇ）タンパク質をコードする核酸配列を含むワクチンに関す
る。
は、ＲＳＶの付着（Ｇ）タンパク質をコードする核酸配列を含むワクチンに関す
る。
【０００２】 （発明の背景） 呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）は、パラミクソウイルス科に属するネガティ
ブ鎖ＲＮＡウイルスであり、幼児および幼い小児における細気管支炎および肺炎
の原因である主要なウイルス病原体である（参照文献１−本出願を通して、本発
明が関係する技術分野の現状をより完全に説明する様々な参考文献を括弧内に示
す。それぞれの引用についての完全な文献情報は、発明の詳細な説明の最後にあ
る。これらの参考文献の開示を、参照により本開示に組み込む）。ＲＳＶによる
急性呼吸器感染症は、米国において１年につき約９０，０００件の入院および４
，５００人の死亡をもたらす（参照文献２）。ＲＳＶ感染症による医療コストは
、米国だけでも毎年３億４，０００万ドルを超している（参照文献３）。ＲＳＶ
に対し、認可されたワクチンは今のところ存在しない。ＲＳＶワクチンを開発す
るための主なアプローチには、不活化ウイルス、弱毒生ウイルスおよびサブユニ
ットワクチンが含まれていた。
ブ鎖ＲＮＡウイルスであり、幼児および幼い小児における細気管支炎および肺炎
の原因である主要なウイルス病原体である（参照文献１−本出願を通して、本発
明が関係する技術分野の現状をより完全に説明する様々な参考文献を括弧内に示
す。それぞれの引用についての完全な文献情報は、発明の詳細な説明の最後にあ
る。これらの参考文献の開示を、参照により本開示に組み込む）。ＲＳＶによる
急性呼吸器感染症は、米国において１年につき約９０，０００件の入院および４
，５００人の死亡をもたらす（参照文献２）。ＲＳＶ感染症による医療コストは
、米国だけでも毎年３億４，０００万ドルを超している（参照文献３）。ＲＳＶ
に対し、認可されたワクチンは今のところ存在しない。ＲＳＶワクチンを開発す
るための主なアプローチには、不活化ウイルス、弱毒生ウイルスおよびサブユニ
ットワクチンが含まれていた。
【０００３】 ＲＳＶに対する防御的免疫応答には、表面融合（Ｆ）糖タンパク質および付着
（Ｇ）糖タンパク質に対する中和抗体を誘導することが必要であると考えられて
いる（参照文献４）。さらに、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答は、ウイル
スの排除に関与している。Ｆタンパク質は、ＲＳＶのＡおよびＢサブグループの
間で保存されている。
（Ｇ）糖タンパク質に対する中和抗体を誘導することが必要であると考えられて
いる（参照文献４）。さらに、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答は、ウイル
スの排除に関与している。Ｆタンパク質は、ＲＳＶのＡおよびＢサブグループの
間で保存されている。
【０００４】 ＲＳＶのＧタンパク質（３３ｋＤａ）は、高度にＯ−グリコシル化され、見か
けの分子量９０ｋＤａの糖タンパク質を形成する（参照文献５）。ＲＳウイルス
の多種多様な２つのサブタイプは、ＡおよびＢと定義されてきた（参照文献６）
。これらのサブタイプ間の主要な免疫原性の相違は、Ｇ糖タンパク質に見い出さ
れる（参照文献３、７）。
けの分子量９０ｋＤａの糖タンパク質を形成する（参照文献５）。ＲＳウイルス
の多種多様な２つのサブタイプは、ＡおよびＢと定義されてきた（参照文献６）
。これらのサブタイプ間の主要な免疫原性の相違は、Ｇ糖タンパク質に見い出さ
れる（参照文献３、７）。
【０００５】 ＲＳＶタンパク質をワクチンとして用いることは、支障になることもある。血
清反応陰性のチンパンジーにおける中和抗体の誘導に関しては、これまでのとこ
ろ非経口的に投与されたワクチン候補は、免疫原性に乏しいことが立証されてい
る。これらの抗原によって誘導される血清抗体反応は、大部分の幼い幼児が持っ
ている胎盤経由で獲得した母性の抗体などの受動的に獲得した抗体の存在の下で
さらに減殺される可能性がある。ＲＳＶに感染した細胞培養物からイムノアフィ
ニティクロマトグラフィまたはイオン交換クロマトグラフィによって精製された
融合（Ｆ）糖タンパク質から成るサブユニットワクチン候補が記載されている（
参照文献８）。この調製物による血清反応陰性または血清反応陽性チンパンジー
の非経口的免疫化が行われ、血清反応陰性動物においては、約１：５０のＲＳＶ
血清中和力価を誘導するためには５０μｇを３回投与する必要があった。続いて
、これらの動物に野生型のＲＳＶを感染させると、上気道においてはウイルス分
断または臨床疾患に対する免疫化の効果は検出できなかった。下気道におけるウ
イルス分断に対するこのワクチンの免疫化の効果は検討されなかったが、ここは
非経口免疫化によって誘導される血清抗体が最も大きな効果を有すると考えられ
る部位である。安全性および免疫原性の試験は、少数の血清反応陽性の個体にお
いて行われた。ワクチンは、血清反応陽性の小児および３人の血清反応陰性の小
児（すべて、２．４歳以上）において安全であることが分かった。免疫化された
小児が少数であるため、下気道疾患に対する免疫化の効果は測定できなかった。
血清反応陽性の小児に１回の免疫化投与を行うと、ワクチンを受けた小児の４０
から６０％で、ウイルス中和抗体に４倍の増加が誘導された。したがって、ＲＳ
Ｖ誘発疾患に対するこのワクチンの有効性を評価するには、これらの小規模検討
からは不十分な情報しか得られない。サブユニットＲＳＶワクチンがさらに直面
する問題は、免疫原性の調製物を血清反応陰性被験者に接種することが、疾患の
進行をもたらすという可能性である。１９６０年代に、ホルマリン不活化ＲＳＶ
調製物（ＦＩ−ＲＳＶ）による幼児のワクチン接種は、続く生ウイルスの暴露に
より、免疫強化とも呼ばれる肺疾患の進行をもたらした（参照文献９、１０）。
これらのワクチンは、強力な血清学的応答を示すが、感染を防御することはなく
、それらのいくつかは、自然感染によって重篤でしばしば致命的な気道疾患を引
き起こした。正確な機構は不明のままであるが、この形の免疫亢進は、ＲＳＶ抗
原の構造変化（参照文献１１）、血清および／または細胞に残存する混入物（参
照文献１２）、ウイルスの付着（Ｇ）タンパク質の特異的性質（参照文献１３、
１４）、あるいは不均衡な細胞媒介性免疫応答（参照文献１３、１５）を反映す
るものであることが示唆されている。ＦＩ−ＲＳＶワクチンは、マウスにおいて
ＴＨ２型免疫応答を誘導し、一方、生ＲＳＶによる免疫化は免疫強化を引き起こ
さないが、ＴＨ１応答を誘発することが明らかにされている（参照文献１５）。
清反応陰性のチンパンジーにおける中和抗体の誘導に関しては、これまでのとこ
ろ非経口的に投与されたワクチン候補は、免疫原性に乏しいことが立証されてい
る。これらの抗原によって誘導される血清抗体反応は、大部分の幼い幼児が持っ
ている胎盤経由で獲得した母性の抗体などの受動的に獲得した抗体の存在の下で
さらに減殺される可能性がある。ＲＳＶに感染した細胞培養物からイムノアフィ
ニティクロマトグラフィまたはイオン交換クロマトグラフィによって精製された
融合（Ｆ）糖タンパク質から成るサブユニットワクチン候補が記載されている（
参照文献８）。この調製物による血清反応陰性または血清反応陽性チンパンジー
の非経口的免疫化が行われ、血清反応陰性動物においては、約１：５０のＲＳＶ
血清中和力価を誘導するためには５０μｇを３回投与する必要があった。続いて
、これらの動物に野生型のＲＳＶを感染させると、上気道においてはウイルス分
断または臨床疾患に対する免疫化の効果は検出できなかった。下気道におけるウ
イルス分断に対するこのワクチンの免疫化の効果は検討されなかったが、ここは
非経口免疫化によって誘導される血清抗体が最も大きな効果を有すると考えられ
る部位である。安全性および免疫原性の試験は、少数の血清反応陽性の個体にお
いて行われた。ワクチンは、血清反応陽性の小児および３人の血清反応陰性の小
児（すべて、２．４歳以上）において安全であることが分かった。免疫化された
小児が少数であるため、下気道疾患に対する免疫化の効果は測定できなかった。
血清反応陽性の小児に１回の免疫化投与を行うと、ワクチンを受けた小児の４０
から６０％で、ウイルス中和抗体に４倍の増加が誘導された。したがって、ＲＳ
Ｖ誘発疾患に対するこのワクチンの有効性を評価するには、これらの小規模検討
からは不十分な情報しか得られない。サブユニットＲＳＶワクチンがさらに直面
する問題は、免疫原性の調製物を血清反応陰性被験者に接種することが、疾患の
進行をもたらすという可能性である。１９６０年代に、ホルマリン不活化ＲＳＶ
調製物（ＦＩ−ＲＳＶ）による幼児のワクチン接種は、続く生ウイルスの暴露に
より、免疫強化とも呼ばれる肺疾患の進行をもたらした（参照文献９、１０）。
これらのワクチンは、強力な血清学的応答を示すが、感染を防御することはなく
、それらのいくつかは、自然感染によって重篤でしばしば致命的な気道疾患を引
き起こした。正確な機構は不明のままであるが、この形の免疫亢進は、ＲＳＶ抗
原の構造変化（参照文献１１）、血清および／または細胞に残存する混入物（参
照文献１２）、ウイルスの付着（Ｇ）タンパク質の特異的性質（参照文献１３、
１４）、あるいは不均衡な細胞媒介性免疫応答（参照文献１３、１５）を反映す
るものであることが示唆されている。ＦＩ−ＲＳＶワクチンは、マウスにおいて
ＴＨ２型免疫応答を誘導し、一方、生ＲＳＶによる免疫化は免疫強化を引き起こ
さないが、ＴＨ１応答を誘発することが明らかにされている（参照文献１５）。
【０００６】 いくつかの検討において、合成ＲＳＶ ＦＧ融合タンパク質による免疫化に対
する免疫応答は、ホルマリン不活化ＲＳＶワクチンによって誘発されたと同様に
疾患の進行をもたらした。ＲＳＶ Ｇタンパク質を発現する組換えワクシニアウ
イルスによるマウスの免疫化は、肺におけるＧ特異的Ｔ細胞応答をもたらし、こ
れは、もっぱらＣＤ４＋Ｔ細胞亜系から動員され、極めてＴｈ２に偏っていた。
Ｇ特異的Ｔ細胞は、肺出血、肺の好中球動員（ショック肺）、極度な肺の好酸球
増加を誘発し、養子免疫移入されたマウスレシピエントでは死を誘発することが
ある（参照文献１４）。非複製抗原を含むある種のワクチン調製物を用いる免疫
化と疾患の進行との関連性は、血清反応陰性のヒトでそれらをワクチンとして用
いる際の注意を示唆している。
する免疫応答は、ホルマリン不活化ＲＳＶワクチンによって誘発されたと同様に
疾患の進行をもたらした。ＲＳＶ Ｇタンパク質を発現する組換えワクシニアウ
イルスによるマウスの免疫化は、肺におけるＧ特異的Ｔ細胞応答をもたらし、こ
れは、もっぱらＣＤ４＋Ｔ細胞亜系から動員され、極めてＴｈ２に偏っていた。
Ｇ特異的Ｔ細胞は、肺出血、肺の好中球動員（ショック肺）、極度な肺の好酸球
増加を誘発し、養子免疫移入されたマウスレシピエントでは死を誘発することが
ある（参照文献１４）。非複製抗原を含むある種のワクチン調製物を用いる免疫
化と疾患の進行との関連性は、血清反応陰性のヒトでそれらをワクチンとして用
いる際の注意を示唆している。
【０００７】 ＲＳＶによる疾患に対する弱毒生ワクチンは、２つの主な理由から有望である
。第１に、生ワクチンウイルスによる感染は、粘膜および血清抗体および細胞傷
害性Ｔリンパ球を含む均衡のとれた免疫応答を誘導する。第２に、弱毒生ワクチ
ン候補または自然に獲得された野生型ウイルスによる幼児の感染は、続く自然の
再感染による疾患の進行とは関連しない。母性のウイルス中和抗体を持つ幼い幼
児にとっては免疫原性であるが、６カ月またはそれ以上の血清反応陰性の幼児に
とっては弱体化している弱毒生ワクチンを製造することはやりがいのあることで
あろう。弱毒生ウイルスワクチンはまた、毒力の残存および遺伝的不安定性とい
う危険性を有している。
。第１に、生ワクチンウイルスによる感染は、粘膜および血清抗体および細胞傷
害性Ｔリンパ球を含む均衡のとれた免疫応答を誘導する。第２に、弱毒生ワクチ
ン候補または自然に獲得された野生型ウイルスによる幼児の感染は、続く自然の
再感染による疾患の進行とは関連しない。母性のウイルス中和抗体を持つ幼い幼
児にとっては免疫原性であるが、６カ月またはそれ以上の血清反応陰性の幼児に
とっては弱体化している弱毒生ワクチンを製造することはやりがいのあることで
あろう。弱毒生ウイルスワクチンはまた、毒力の残存および遺伝的不安定性とい
う危険性を有している。
【０００８】 異種タンパク質をコードする配列を含むプラスミドＤＮＡの注射は、異種タン
パク質の発現および抗原に対する抗体および細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応
答の誘発をもたらすことが、多くの検討で明らかにされている（例えば、参照文
献１６、１７、１８を参照されたい）。免疫化の目的でウイルスタンパク質を発
現するためにプラスミドＤＮＡ接種を用いると、これまで概略を述べた戦略を上
回るいくつかの利点を提供することができる。第１に、ウイルス抗原をコードす
るＤＮＡは、抗体の存在下でウイルス自体に導入することが可能であり、抗体に
よるウイルスの中和に起因する効力の損失はない。第２に、ｉｎ ｖｉｖｏで発
現する抗原は、天然のコンホメーションおよび適切なグリコシル化を示すはずで
ある。したがって、抗原は、野生型ウイルス感染において存在する抗原によって
誘導されるものと同様の抗体応答を誘導するはずである。対照的に、タンパク質
の精製において用いられるいくつかの方法は、コンホメーション変化を引き起こ
し、防御的エピトープの免疫原性の損失およびおそらく免疫強化の損失をもたら
す可能性がある。第３に、注射されたプラスミドＤＮＡからのタンパク質の発現
は、ウイルス感染細胞におけるよりもずっと長期にわたってｉｎ ｖｉｖｏで検
出が可能であり、細胞傷害性Ｔ細胞誘発の延長および抗体応答の亢進という理論
的利点を有している。第４に、抗体のｉｎ ｖｉｖｏ発現は、外因性アジュバン
トを必要とせずに防御を与えることができる。
パク質の発現および抗原に対する抗体および細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応
答の誘発をもたらすことが、多くの検討で明らかにされている（例えば、参照文
献１６、１７、１８を参照されたい）。免疫化の目的でウイルスタンパク質を発
現するためにプラスミドＤＮＡ接種を用いると、これまで概略を述べた戦略を上
回るいくつかの利点を提供することができる。第１に、ウイルス抗原をコードす
るＤＮＡは、抗体の存在下でウイルス自体に導入することが可能であり、抗体に
よるウイルスの中和に起因する効力の損失はない。第２に、ｉｎ ｖｉｖｏで発
現する抗原は、天然のコンホメーションおよび適切なグリコシル化を示すはずで
ある。したがって、抗原は、野生型ウイルス感染において存在する抗原によって
誘導されるものと同様の抗体応答を誘導するはずである。対照的に、タンパク質
の精製において用いられるいくつかの方法は、コンホメーション変化を引き起こ
し、防御的エピトープの免疫原性の損失およびおそらく免疫強化の損失をもたら
す可能性がある。第３に、注射されたプラスミドＤＮＡからのタンパク質の発現
は、ウイルス感染細胞におけるよりもずっと長期にわたってｉｎ ｖｉｖｏで検
出が可能であり、細胞傷害性Ｔ細胞誘発の延長および抗体応答の亢進という理論
的利点を有している。第４に、抗体のｉｎ ｖｉｖｏ発現は、外因性アジュバン
トを必要とせずに防御を与えることができる。
【０００９】 本発明以前には、ＲＳＶ Ｇタンパク質をコードするＤＮＡ分子を投与するこ
とによりＲＳＶによる疾患に対して免疫化する能力は知られていなかった。具体
的には、分泌型のＲＳＶ Ｇタンパク質をコードする遺伝子を用いるＲＳＶ誘発
疾患に対する免疫化の有効性は、知られていなかった。ＲＳＶによる感染は、重
篤な疾患をもたらす。ＲＳＶ Ｇタンパク質およびプラスミドベクターを含む非
複製ベクターをコードする単離された遺伝子を、ｉｎ ｖｉｖｏ投与のため、お
よびＲＳＶによる疾患に対する防御および診断試薬および診断キットの作成を目
的としてワクチンを含む免疫原性の調製物中で用いるために提供することは有用
であり、望ましいであろう。具体的には、血清反応陰性の幼児を含むヒトにおい
て免疫原性でかつ防御的であり、疾患の進行（免疫強化）を引き起こさないワク
チンを提供することが望ましいであろう。
とによりＲＳＶによる疾患に対して免疫化する能力は知られていなかった。具体
的には、分泌型のＲＳＶ Ｇタンパク質をコードする遺伝子を用いるＲＳＶ誘発
疾患に対する免疫化の有効性は、知られていなかった。ＲＳＶによる感染は、重
篤な疾患をもたらす。ＲＳＶ Ｇタンパク質およびプラスミドベクターを含む非
複製ベクターをコードする単離された遺伝子を、ｉｎ ｖｉｖｏ投与のため、お
よびＲＳＶによる疾患に対する防御および診断試薬および診断キットの作成を目
的としてワクチンを含む免疫原性の調製物中で用いるために提供することは有用
であり、望ましいであろう。具体的には、血清反応陰性の幼児を含むヒトにおい
て免疫原性でかつ防御的であり、疾患の進行（免疫強化）を引き起こさないワク
チンを提供することが望ましいであろう。
【００１０】 （発明の要約） 本発明は、呼吸器合胞体ウイルスによる疾患に対し宿主を免疫化する方法、そ
のような目的で免疫原性の組成物中で用いられる核酸分子を含む非複製ベクター
、およびベクターおよび核酸分子を利用する診断手順に関する。具体的に本発明
は、呼吸器合胞体ウイルスのＧタンパク質をコードする核酸ワクチンの提供を対
象とする。
のような目的で免疫原性の組成物中で用いられる核酸分子を含む非複製ベクター
、およびベクターおよび核酸分子を利用する診断手順に関する。具体的に本発明
は、呼吸器合胞体ウイルスのＧタンパク質をコードする核酸ワクチンの提供を対
象とする。
【００１１】 本発明の一態様によれば、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）Ｇタンパク質に対
する防御抗体を宿主において産生するため、宿主にｉｎ ｖｉｖｏ投与するため
の免疫原性の組成物であって、非複製ベクターを含み、このベクターが、 ＲＳＶ Ｇタンパク質またはＲＳＶ Ｇタンパク質と特異的に反応する抗体を
産生するＲＳＶ Ｇタンパク質フラグメントをコードする第１のヌクレオチド配
列、 宿主において前記ＲＳＶ Ｇタンパク質を発現するために前記第１のヌクレオ
チド配列と動作可能に結合されるプロモーター配列、および 前記第１のヌクレオチド配列と前記プロモーター配列との間に位置し、宿主に
おいて前記ベクターからのｉｎ ｖｉｖｏにおける前記ＲＳＶ Ｇタンパク質の
発現を促進させるための第２のヌクレオチド配列、および 薬剤用に許容可能な坦体を含む組成物が提供される。
する防御抗体を宿主において産生するため、宿主にｉｎ ｖｉｖｏ投与するため
の免疫原性の組成物であって、非複製ベクターを含み、このベクターが、 ＲＳＶ Ｇタンパク質またはＲＳＶ Ｇタンパク質と特異的に反応する抗体を
産生するＲＳＶ Ｇタンパク質フラグメントをコードする第１のヌクレオチド配
列、 宿主において前記ＲＳＶ Ｇタンパク質を発現するために前記第１のヌクレオ
チド配列と動作可能に結合されるプロモーター配列、および 前記第１のヌクレオチド配列と前記プロモーター配列との間に位置し、宿主に
おいて前記ベクターからのｉｎ ｖｉｖｏにおける前記ＲＳＶ Ｇタンパク質の
発現を促進させるための第２のヌクレオチド配列、および 薬剤用に許容可能な坦体を含む組成物が提供される。
【００１２】 第１のヌクレオチド配列は、標準の長さのＲＳＶ Ｇタンパク質をコードする
配列でよい。第１のヌクレオチド配列は、図２に示されるヌクレオチド配列（配 列番号：１； ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ：１）を含み、または図２に示されるアミノ酸
配列（配列番号：２）を有する標準の長さのＲＳＶ Ｇタンパク質をコードする
ことができる。
配列でよい。第１のヌクレオチド配列は、図２に示されるヌクレオチド配列（配 列番号：１； ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ：１）を含み、または図２に示されるアミノ酸
配列（配列番号：２）を有する標準の長さのＲＳＶ Ｇタンパク質をコードする
ことができる。
【００１３】 あるいは、第１のヌクレオチド配列は、トランスメンブランコード配列および
その上流の配列を欠くＲＳＶ Ｇタンパク質をコードする配列であってもよい。
切断されたＲＳＶ Ｇタンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列は、図３
に示されるヌクレオチド配列（配列番号：３）を含むか、図３に示されるアミノ
酸配列（配列番号：４）を有する切断されたＲＳＶ Ｇタンパク質をコードする
ヌクレオチド配列を含むことができる。トランスメンブラン領域の発現を欠くこ
とにより、分泌型のＲＳＶ Ｇタンパク質がもたらされる。
その上流の配列を欠くＲＳＶ Ｇタンパク質をコードする配列であってもよい。
切断されたＲＳＶ Ｇタンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列は、図３
に示されるヌクレオチド配列（配列番号：３）を含むか、図３に示されるアミノ
酸配列（配列番号：４）を有する切断されたＲＳＶ Ｇタンパク質をコードする
ヌクレオチド配列を含むことができる。トランスメンブラン領域の発現を欠くこ
とにより、分泌型のＲＳＶ Ｇタンパク質がもたらされる。
【００１４】 さらに、非複製ベクターは、第１のヌクレオチド配列の５’末端の直ぐ上流に
あるヌクレオチド配列をコードする異種のシグナルペプチドを含むことができる
。配列をコードするシグナルペプチドは、ヒト組織のプラスミノーゲン活性化因
子のシグナルペプチドをコードできる。
あるヌクレオチド配列をコードする異種のシグナルペプチドを含むことができる
。配列をコードするシグナルペプチドは、ヒト組織のプラスミノーゲン活性化因
子のシグナルペプチドをコードできる。
【００１５】 プロモーター配列は、極初期サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターで
よい。第２のヌクレオチド配列は、ヒトサイトメガロウイルスイントロンＡを含
むことができる。
よい。第２のヌクレオチド配列は、ヒトサイトメガロウイルスイントロンＡを含
むことができる。
【００１６】 通常、非複製ベクターは、プラスミドベクターである。Ｇタンパク質をコード
し、本発明のこの態様によって提供される免疫原性の組成物に含まれるプラスミ
ドベクターは、具体的にはｐＸＬ５またはｐＸＬ６であり、それぞれ、図４また
は５に示されるように構成され、それぞれの特徴要素を有している。
し、本発明のこの態様によって提供される免疫原性の組成物に含まれるプラスミ
ドベクターは、具体的にはｐＸＬ５またはｐＸＬ６であり、それぞれ、図４また
は５に示されるように構成され、それぞれの特徴要素を有している。
【００１７】 本発明の別の態様によれば、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）に感染すること
による疾患に対し宿主を免疫化する方法であって、有効量の非複製ベクターを宿
主に投与することを含み、そのベクターが ＲＳＶ Ｇタンパク質またはＲＳＶ Ｇタンパク質と特異的に反応する抗体を
産生するＲＳＶ Ｇタンパク質フラグメントをコードする第１のヌクレオチド配
列、 宿主において前記ＲＳＶ Ｇタンパク質を発現するために前記第１のヌクレオ
チド配列と動作可能に結合されるプロモーター配列、および 前記第１のヌクレオチド配列と前記プロモーター配列との間に位置し、宿主に
おいて前記ベクターからのｉｎ ｖｉｖｏにおける前記ＲＳＶ Ｇタンパク質の
発現を促進させるための第２のヌクレオチド配列を含む方法が提供される。
による疾患に対し宿主を免疫化する方法であって、有効量の非複製ベクターを宿
主に投与することを含み、そのベクターが ＲＳＶ Ｇタンパク質またはＲＳＶ Ｇタンパク質と特異的に反応する抗体を
産生するＲＳＶ Ｇタンパク質フラグメントをコードする第１のヌクレオチド配
列、 宿主において前記ＲＳＶ Ｇタンパク質を発現するために前記第１のヌクレオ
チド配列と動作可能に結合されるプロモーター配列、および 前記第１のヌクレオチド配列と前記プロモーター配列との間に位置し、宿主に
おいて前記ベクターからのｉｎ ｖｉｖｏにおける前記ＲＳＶ Ｇタンパク質の
発現を促進させるための第２のヌクレオチド配列を含む方法が提供される。
【００１８】 この免疫方法を行って、均衡のとれたＴｈ１／Ｔｈ２免疫応答を誘導すること
ができる。
ができる。
【００１９】 本発明はまた、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）Ｇタンパク質またはＲＳＶ
Ｇタンパク質と特異的に反応する抗体を産生するＲＳＶ Ｇタンパク質フラグメ
ントをコードする遺伝子を用い、呼吸器合胞体ウイルスの感染による疾患に対し
て宿主を防御するための新規な方法であって、 遺伝子を単離するステップと、 遺伝子を、少なくとも１つのコントロール配列と動作可能に結合させ、非複製
ベクターを生成させるステップであって、前記コントロール配列が、前記ベクタ
ーが宿主に導入されたときにＲＳＶ Ｇタンパク質の発現を誘導し、ＲＳＶ Ｇ
タンパク質との免疫応答を生じるステップと、 ベクターを宿主に導入するステップとを含む方法を含む。
Ｇタンパク質と特異的に反応する抗体を産生するＲＳＶ Ｇタンパク質フラグメ
ントをコードする遺伝子を用い、呼吸器合胞体ウイルスの感染による疾患に対し
て宿主を防御するための新規な方法であって、 遺伝子を単離するステップと、 遺伝子を、少なくとも１つのコントロール配列と動作可能に結合させ、非複製
ベクターを生成させるステップであって、前記コントロール配列が、前記ベクタ
ーが宿主に導入されたときにＲＳＶ Ｇタンパク質の発現を誘導し、ＲＳＶ Ｇ
タンパク質との免疫応答を生じるステップと、 ベクターを宿主に導入するステップとを含む方法を含む。
【００２０】 本発明のこの態様に従って提供される手順は、さらに、 遺伝子を、免疫防御を亢進する配列に動作可能に結合させ、宿主におけるＲＳ
Ｖ Ｇタンパク質、好ましくは、ベクター中に免疫刺激性ＣｐＧ配列を導入する
ことを含む、コントロール配列と遺伝子との間への免疫防御を亢進する配列の導
入により、免疫防御の亢進を生み出すステップを含む。
Ｖ Ｇタンパク質、好ましくは、ベクター中に免疫刺激性ＣｐＧ配列を導入する
ことを含む、コントロール配列と遺伝子との間への免疫防御を亢進する配列の導
入により、免疫防御の亢進を生み出すステップを含む。
【００２１】 さらに、本発明は、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）の感染による疾患に対し
て宿主を防御するためのワクチンを製造する方法であって、 ＲＳＶ Ｇタンパク質と特異的に反応する抗体を生成させるＲＳＶ Ｇタンパ ク質またはＲＳＶ Ｇタンパク質フラグメントをコードする第１のヌクレオチド 配列を単離する工程と、 前記第１のヌクレオチド配列を少なくとも１つの制御配列（コントロール配列 ） に結合させ、防御すべき宿主に導入された時に複製しなくなるベクターを製造 し、該制御配列が、前記ＲＳＶ Ｇタンパク質に対する免疫応答を生じさせるた めに宿主に導入されたときに該ＲＳＶ Ｇタンパク質またはそのフラグメントの 発現を誘導するものである工程と、 前記第１のヌクレオチド配列を第２のヌクレオチド配列に動作可能に結合させ
、宿主においてベクターからｉｎ ｖｉｖｏにおける前記ＲＳＶ Ｇタンパク質 またはそフラグメントの発現を増強する工程と、 前記ベクターを、宿主にｉｎ ｖｉｖｏ投与するためのワクチンとして製剤化
する工程と を含むことを特徴とするワクチンの製造方法に関する。
て宿主を防御するためのワクチンを製造する方法であって、 ＲＳＶ Ｇタンパク質と特異的に反応する抗体を生成させるＲＳＶ Ｇタンパ ク質またはＲＳＶ Ｇタンパク質フラグメントをコードする第１のヌクレオチド 配列を単離する工程と、 前記第１のヌクレオチド配列を少なくとも１つの制御配列（コントロール配列 ） に結合させ、防御すべき宿主に導入された時に複製しなくなるベクターを製造 し、該制御配列が、前記ＲＳＶ Ｇタンパク質に対する免疫応答を生じさせるた めに宿主に導入されたときに該ＲＳＶ Ｇタンパク質またはそのフラグメントの 発現を誘導するものである工程と、 前記第１のヌクレオチド配列を第２のヌクレオチド配列に動作可能に結合させ
、宿主においてベクターからｉｎ ｖｉｖｏにおける前記ＲＳＶ Ｇタンパク質 またはそフラグメントの発現を増強する工程と、 前記ベクターを、宿主にｉｎ ｖｉｖｏ投与するためのワクチンとして製剤化
する工程と を含むことを特徴とするワクチンの製造方法に関する。
【００２２】 ベクターは、ｐＸＬ５およびｐＸＬ６から選択されるプラスミドベクターでよ
い。本発明はさらに、ヒト宿主を含む、宿主に投与するための、本方法により製
造されるワクチンを含む。
い。本発明はさらに、ヒト宿主を含む、宿主に投与するための、本方法により製
造されるワクチンを含む。
【００２３】 前述のように、本明細書中で提供されるベクターは、診断的応用にも有用であ
る。したがって、本発明の別の態様において、試料中の呼吸器合胞体ウイルス（
ＲＳＶ）Ｇタンパク質の存在を測定する方法であって、 （ａ）宿主を非複製ベクターで免疫化し、ＲＳＶ Ｇタンパク質に特異的な抗
体を産生させるステップであって、非複製ベクターがＲＳＶ Ｇタンパク質また
はＲＳＶ Ｇタンパク質と特異的に反応する抗体を産生するＲＳＶ Ｇタンパク
質フラグメントをコードする第１のヌクレオチド配列、宿主におけるＲＳＶ Ｇ
タンパク質の発現のために第１のヌクレオチド配列と動作可能に結合されるプロ
モーター配列、および第１のヌクレオチド配列とプロモーター配列との間に位置
し、宿主においてベクターからのｉｎ ｖｉｖｏにおけるＲＳＶ Ｇタンパク質
の発現を促進させる第２のヌクレオチド配列を含むステップと、 （ｂ）ＲＳＶ Ｇタンパク質特異的抗体を単離するステップと、 （ｃ）試料を、単離した抗体と接触させ、試料中に存在する任意のＲＳＶ Ｇ
タンパク質およびＲＳＶ Ｇタンパク質特異的抗体を含む複合体を生成させるス
テップと、 （ｄ）複合体の生成を測定するステップとを含む方法が提供される。 抗体を誘導するために用いられる非複製ベクターは、プラスミドベクターｐＸＬ
５またはｐＸＬ６でよい。
る。したがって、本発明の別の態様において、試料中の呼吸器合胞体ウイルス（
ＲＳＶ）Ｇタンパク質の存在を測定する方法であって、 （ａ）宿主を非複製ベクターで免疫化し、ＲＳＶ Ｇタンパク質に特異的な抗
体を産生させるステップであって、非複製ベクターがＲＳＶ Ｇタンパク質また
はＲＳＶ Ｇタンパク質と特異的に反応する抗体を産生するＲＳＶ Ｇタンパク
質フラグメントをコードする第１のヌクレオチド配列、宿主におけるＲＳＶ Ｇ
タンパク質の発現のために第１のヌクレオチド配列と動作可能に結合されるプロ
モーター配列、および第１のヌクレオチド配列とプロモーター配列との間に位置
し、宿主においてベクターからのｉｎ ｖｉｖｏにおけるＲＳＶ Ｇタンパク質
の発現を促進させる第２のヌクレオチド配列を含むステップと、 （ｂ）ＲＳＶ Ｇタンパク質特異的抗体を単離するステップと、 （ｃ）試料を、単離した抗体と接触させ、試料中に存在する任意のＲＳＶ Ｇ
タンパク質およびＲＳＶ Ｇタンパク質特異的抗体を含む複合体を生成させるス
テップと、 （ｄ）複合体の生成を測定するステップとを含む方法が提供される。 抗体を誘導するために用いられる非複製ベクターは、プラスミドベクターｐＸＬ
５またはｐＸＬ６でよい。
【００２４】 本発明にはまた、試料中の呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）Ｇタンパク質の存
在を検出するための診断キットであって、 （ａ）宿主に投与されたときにＲＳＶ Ｇタンパク質に特異的な抗体を産生す
る能力を有する非複製ベクターであって、前記非複製ベクターが、ＲＳＶ Ｇタ
ンパク質またはＲＳＶ Ｇタンパク質と特異的に反応する抗体を産生するＲＳＶ
Ｇタンパク質フラグメントをコードする第１のヌクレオチド配列、宿主におけ
るＲＳＶ Ｇタンパク質の発現のために第１のヌクレオチド配列と動作可能に結
合されたプロモーター配列、および第１のヌクレオチド配列とプロモーター配列
との間に位置し、宿主においてベクターからのｉｎ ｖｉｖｏにおけるＲＳＶ
Ｇタンパク質の発現を促進させるための第２のヌクレオチド配列を含み、 （ｂ）ＲＳＶ Ｇタンパク質特異的抗体を単離するための単離手段、 （ｃ）単離したＲＳＶ Ｇタンパク質特異的抗体と試料を接触させ、試料中に
存在する任意のＲＳＶ Ｇタンパク質およびＲＳＶ Ｇタンパク質特異的抗体を
含む複合体を生成させるための接触手段、 （ｄ）複合体の生成を測定するための固定手段とを含むキットが含まれる。
在を検出するための診断キットであって、 （ａ）宿主に投与されたときにＲＳＶ Ｇタンパク質に特異的な抗体を産生す
る能力を有する非複製ベクターであって、前記非複製ベクターが、ＲＳＶ Ｇタ
ンパク質またはＲＳＶ Ｇタンパク質と特異的に反応する抗体を産生するＲＳＶ
Ｇタンパク質フラグメントをコードする第１のヌクレオチド配列、宿主におけ
るＲＳＶ Ｇタンパク質の発現のために第１のヌクレオチド配列と動作可能に結
合されたプロモーター配列、および第１のヌクレオチド配列とプロモーター配列
との間に位置し、宿主においてベクターからのｉｎ ｖｉｖｏにおけるＲＳＶ
Ｇタンパク質の発現を促進させるための第２のヌクレオチド配列を含み、 （ｂ）ＲＳＶ Ｇタンパク質特異的抗体を単離するための単離手段、 （ｃ）単離したＲＳＶ Ｇタンパク質特異的抗体と試料を接触させ、試料中に
存在する任意のＲＳＶ Ｇタンパク質およびＲＳＶ Ｇタンパク質特異的抗体を
含む複合体を生成させるための接触手段、 （ｄ）複合体の生成を測定するための固定手段とを含むキットが含まれる。
【００２５】 本発明はさらに、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）のＧタンパク質に特異的な
抗体を産生させる方法であって、 （ａ）宿主を有効量の非複製ベクターで免疫化し、ＲＳＶ Ｇ特異的抗体を産
生させるステップであって、前記非複製ベクターが、 ＲＳＶ Ｇタンパク質またはＲＳＶ Ｇタンパク質と特異的に反応する抗体を
産生するＲＳＶ Ｇタンパク質フラグメントをコードする第１のヌクレオチド配
列、 宿主において前記ＲＳＶ Ｇタンパク質を発現するために前記第１のヌクレオ
チド配列と動作可能に結合されるプロモーター配列、および 前記第１のヌクレオチド配列と前記プロモーター配列との間に位置し、宿主に
おいて前記ベクターからのｉｎ ｖｉｖｏにおける前記ＲＳＶ Ｇタンパク質の
発現を促進させるための第２のヌクレオチド配列を含み、 （ｂ）宿主からＲＳＶ Ｇ特異的抗体を単離するステップとを含む方法を対象
とする。
抗体を産生させる方法であって、 （ａ）宿主を有効量の非複製ベクターで免疫化し、ＲＳＶ Ｇ特異的抗体を産
生させるステップであって、前記非複製ベクターが、 ＲＳＶ Ｇタンパク質またはＲＳＶ Ｇタンパク質と特異的に反応する抗体を
産生するＲＳＶ Ｇタンパク質フラグメントをコードする第１のヌクレオチド配
列、 宿主において前記ＲＳＶ Ｇタンパク質を発現するために前記第１のヌクレオ
チド配列と動作可能に結合されるプロモーター配列、および 前記第１のヌクレオチド配列と前記プロモーター配列との間に位置し、宿主に
おいて前記ベクターからのｉｎ ｖｉｖｏにおける前記ＲＳＶ Ｇタンパク質の
発現を促進させるための第２のヌクレオチド配列を含み、 （ｂ）宿主からＲＳＶ Ｇ特異的抗体を単離するステップとを含む方法を対象
とする。
【００２６】 本発明はまた、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）のＧタンパク質に特異的なモ
ノクローナル抗体を産生させる方法であって、 （ａ）ＲＳＶ Ｇタンパク質またはＲＳＶ Ｇタンパク質と特異的に反応する
抗体を産生するＲＳＶ Ｇタンパク質フラグメントをコードする第１のヌクレオ
チド配列、宿主においてＲＳＶ Ｇタンパク質を発現するために第１のヌクレオ
チド配列と動作可能に結合されるプロモーター配列、および第１のヌクレオチド
配列とプロモーター配列との間に位置し、宿主においてベクターからのｉｎ ｖ
ｉｖｏにおけるＲＳＶ Ｇタンパク質の発現を促進させるための第２のヌクレオ
チド配列を含むベクターを構成するステップと、 （ｂ）少なくとも１匹のマウスにベクターを投与して、少なくとも１匹の免疫
化マウスを作るステップと、 （ｃ）少なくとも１匹の免疫化マウスからＢリンパ球を取り出すステップと、
（ｄ）少なくとも１匹の免疫化マウスから得たＢリンパ球を骨髄腫細胞と融合
させ、それによってハイブリドーマを作成するステップと、 （ｅ）ハイブリドーマをクローン化するステップと、 （ｆ）抗ＲＳＶ Ｇタンパク質抗体を産生するクローンを選択するステップと
、 （ｇ）抗ＲＳＶ Ｇタンパク質抗体産生クローンを培養するステップと、 （ｈ）抗ＲＳＶ Ｇタンパク質モノクローナル抗体を単離するステップとを含
む方法を対象とする。 このようなモノクローナル抗体を用い、ウイルスからＲＳＶ Ｇタンパク質を精
製することができる。
ノクローナル抗体を産生させる方法であって、 （ａ）ＲＳＶ Ｇタンパク質またはＲＳＶ Ｇタンパク質と特異的に反応する
抗体を産生するＲＳＶ Ｇタンパク質フラグメントをコードする第１のヌクレオ
チド配列、宿主においてＲＳＶ Ｇタンパク質を発現するために第１のヌクレオ
チド配列と動作可能に結合されるプロモーター配列、および第１のヌクレオチド
配列とプロモーター配列との間に位置し、宿主においてベクターからのｉｎ ｖ
ｉｖｏにおけるＲＳＶ Ｇタンパク質の発現を促進させるための第２のヌクレオ
チド配列を含むベクターを構成するステップと、 （ｂ）少なくとも１匹のマウスにベクターを投与して、少なくとも１匹の免疫
化マウスを作るステップと、 （ｃ）少なくとも１匹の免疫化マウスからＢリンパ球を取り出すステップと、
（ｄ）少なくとも１匹の免疫化マウスから得たＢリンパ球を骨髄腫細胞と融合
させ、それによってハイブリドーマを作成するステップと、 （ｅ）ハイブリドーマをクローン化するステップと、 （ｆ）抗ＲＳＶ Ｇタンパク質抗体を産生するクローンを選択するステップと
、 （ｇ）抗ＲＳＶ Ｇタンパク質抗体産生クローンを培養するステップと、 （ｈ）抗ＲＳＶ Ｇタンパク質モノクローナル抗体を単離するステップとを含
む方法を対象とする。 このようなモノクローナル抗体を用い、ウイルスからＲＳＶ Ｇタンパク質を精
製することができる。
【００２７】 本出願では、「ＲＳＶ Ｇタンパク質」という用語を、標準の長さのＲＳＶ
Ｇタンパク質を定義するために用いたが、このようなタンパク質は、アミノ酸配
列に変異を有し、ＲＳＶの様々な株中に天然に存在するタンパク質、トランスメ
ンブラン領域を欠く分泌型ＲＳＶ Ｇタンパク質ならびにＲＳＶ Ｇタンパク質
の機能類似体が含まれる。本出願では、第１のタンパク質が、第２のタンパク質
と免疫学的に関連し、および／または同一の機能を有している場合に、第１のタ
ンパク質を第２のタンパク質の「機能類似体」とする。例えば、機能類似体には
、そのタンパク質の免疫学的活性フラグメントまたは、免疫学的活性な置換、付
加、または欠失変異体があり得る。
Ｇタンパク質を定義するために用いたが、このようなタンパク質は、アミノ酸配
列に変異を有し、ＲＳＶの様々な株中に天然に存在するタンパク質、トランスメ
ンブラン領域を欠く分泌型ＲＳＶ Ｇタンパク質ならびにＲＳＶ Ｇタンパク質
の機能類似体が含まれる。本出願では、第１のタンパク質が、第２のタンパク質
と免疫学的に関連し、および／または同一の機能を有している場合に、第１のタ
ンパク質を第２のタンパク質の「機能類似体」とする。例えば、機能類似体には
、そのタンパク質の免疫学的活性フラグメントまたは、免疫学的活性な置換、付
加、または欠失変異体があり得る。
【００２８】 本発明は添付の図に示された各図を参照した以下の一般的記述および実施例か
ら更に理解され得るものであり、その添付の図面には以下の図が含まれる。
ら更に理解され得るものであり、その添付の図面には以下の図が含まれる。
【００２９】 図１は呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）のＧタンパク質をコードする遺伝子の
制限地図を示す図である。図２は膜付着型の呼吸器合胞体ウイルスＧタンパク質
（配列番号：１）をコードする遺伝子のヌクレオチド配列並びにそれによりエン
コードされたＲＳＶ Ｇタンパク質のアミノ酸配列（配列番号：２）を示す図で
ある。図３は分泌型のトランスメンブランドメインを欠落したＲＳＶ Ｇタンパ
ク質のヌクレオチド配列（配列番号：３）並びにそれによりエンコードされたト
ランスメンブランドメインを欠落し切断型のＲＳＶ Ｇタンパク質のアミノ酸配
列（配列番号：４）を示す図である。図４は膜付着型のＲＳＶ Ｇタンパク質の
全長をコードする遺伝子を含んでおりＣＭＶイントロンＡ配列を含むプラスミド
ｐＸＬ５の構造を示す図である。図５は分泌型のトランスメンブランドメインを
欠落したＲＳＶ Ｇタンパク質をコードする遺伝子を含んでおりＣＭＶイントロ
ンＡ並びにヒト組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）のシグナルペプチド
をコードするヌクレオチド配列を含むプラスミドｐＸＬ６の構造を示す図である
。図６はプラスミドＶＲ−１０１２のヌクレオチド配列（配列番号：５）を示す
図である。図７は５’の非翻訳領域およびヒト組織プラスミノーゲン活性化因子
（ＴＰＡ）のシグナルペプチドのヌクレオチド配列（配列番号：６）を示す図で
ある。図８はＲＳＶ感染後のＤＮＡ免疫マウスにおける肺のサイトカイン発現特
性を示している図である。
制限地図を示す図である。図２は膜付着型の呼吸器合胞体ウイルスＧタンパク質
（配列番号：１）をコードする遺伝子のヌクレオチド配列並びにそれによりエン
コードされたＲＳＶ Ｇタンパク質のアミノ酸配列（配列番号：２）を示す図で
ある。図３は分泌型のトランスメンブランドメインを欠落したＲＳＶ Ｇタンパ
ク質のヌクレオチド配列（配列番号：３）並びにそれによりエンコードされたト
ランスメンブランドメインを欠落し切断型のＲＳＶ Ｇタンパク質のアミノ酸配
列（配列番号：４）を示す図である。図４は膜付着型のＲＳＶ Ｇタンパク質の
全長をコードする遺伝子を含んでおりＣＭＶイントロンＡ配列を含むプラスミド
ｐＸＬ５の構造を示す図である。図５は分泌型のトランスメンブランドメインを
欠落したＲＳＶ Ｇタンパク質をコードする遺伝子を含んでおりＣＭＶイントロ
ンＡ並びにヒト組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）のシグナルペプチド
をコードするヌクレオチド配列を含むプラスミドｐＸＬ６の構造を示す図である
。図６はプラスミドＶＲ−１０１２のヌクレオチド配列（配列番号：５）を示す
図である。図７は５’の非翻訳領域およびヒト組織プラスミノーゲン活性化因子
（ＴＰＡ）のシグナルペプチドのヌクレオチド配列（配列番号：６）を示す図で
ある。図８はＲＳＶ感染後のＤＮＡ免疫マウスにおける肺のサイトカイン発現特
性を示している図である。
【００３０】 （発明の一般的な記述） 上記の通りに、本発明は一般的に、ＤＮＡを含むポリヌクレオチド、呼吸器合
胞体ウイルス（ＲＳＶ）による感染に対して防御するための免疫化、および特別
な非複製ベクターを使用した診断手順に関するものである。本発明において、い
くつかの組換えプラスミドベクターがＲＳＶ Ｇタンパク質をコードするヌクレ
オチド配列を含むように構築された。
胞体ウイルス（ＲＳＶ）による感染に対して防御するための免疫化、および特別
な非複製ベクターを使用した診断手順に関するものである。本発明において、い
くつかの組換えプラスミドベクターがＲＳＶ Ｇタンパク質をコードするヌクレ
オチド配列を含むように構築された。
【００３１】 ＲＳＶ Ｇ遺伝子の全長のヌクレオチド配列（配列番号：１）は図２に示され
ている。本明細書で提供されるいくつかの構造はＲＳＶ Ｇ（配列番号：２）の
全長の蛋白質をコードするヌクレオチド配列を含むが、他のものはトランスメン
ブランドメインを欠落した分泌型または切断型（末端領域削除型）のＲＳＶ Ｇ
タンパク質（配列番号：４）を作り出すためにトランスメンブランコード配列お
よびその上流のヌクレオチドを欠落することによって変更された末端側領域削除 型の ＲＳＶ Ｇ遺伝子（図３参照、配列番号：３）を含む。
ている。本明細書で提供されるいくつかの構造はＲＳＶ Ｇ（配列番号：２）の
全長の蛋白質をコードするヌクレオチド配列を含むが、他のものはトランスメン
ブランドメインを欠落した分泌型または切断型（末端領域削除型）のＲＳＶ Ｇ
タンパク質（配列番号：４）を作り出すためにトランスメンブランコード配列お
よびその上流のヌクレオチドを欠落することによって変更された末端側領域削除 型の ＲＳＶ Ｇ遺伝子（図３参照、配列番号：３）を含む。
【００３２】 ＲＳＶ Ｇタンパク質をコードするこのヌクレオチド配列は、ｉｎ ｖｉｔｒ
ｏでそのエンコードされたＲＳＶ Ｇタンパク質を発現するためにプロモータ配
列に動作可能に結合されている。このプロモータ配列はヒトの極初期サイトメガ
ロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターであることが可能である。このプロモータは
参照文献１９に記述されている。ラウス肉腫ウイルスＬＴＲｓなどの構成的プロ
モータおよびメタロチオニンプロモータなどの誘導性プロモータおよび組織特異
性プロモータを含むあらゆる便利なプロモータを使用することが可能である。
ｏでそのエンコードされたＲＳＶ Ｇタンパク質を発現するためにプロモータ配
列に動作可能に結合されている。このプロモータ配列はヒトの極初期サイトメガ
ロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターであることが可能である。このプロモータは
参照文献１９に記述されている。ラウス肉腫ウイルスＬＴＲｓなどの構成的プロ
モータおよびメタロチオニンプロモータなどの誘導性プロモータおよび組織特異
性プロモータを含むあらゆる便利なプロモータを使用することが可能である。
【００３３】 ここで提供される非複製ベクターは、薬剤用に許容される担体を伴った免疫組
成物の形態で動物に投与する場合、投与した動物の抗体応答によって示されるｉ
ｎ ｖｉｖｏ ＲＳＶ Ｇタンパク質発現をもたらす。このような抗体は、以下
でさらに詳述される通りに、本明細書の試料中のＲＳＶ蛋白質の検出に有用であ
ることが可能である。非複製ベクター、特にプラスミドｐＸＬ５およびｐＸＬ６
の投与は、以下の実施例からわかる通りに、抗Ｇ抗体、ウイルス中和抗体を産生
させて、ウイルス感染後の肺におけるＴｈ１／Ｔｈ２応答の均衡を保ち、かつマ
ウスに生ＲＳＶ感染に対する防御をもたらす。
成物の形態で動物に投与する場合、投与した動物の抗体応答によって示されるｉ
ｎ ｖｉｖｏ ＲＳＶ Ｇタンパク質発現をもたらす。このような抗体は、以下
でさらに詳述される通りに、本明細書の試料中のＲＳＶ蛋白質の検出に有用であ
ることが可能である。非複製ベクター、特にプラスミドｐＸＬ５およびｐＸＬ６
の投与は、以下の実施例からわかる通りに、抗Ｇ抗体、ウイルス中和抗体を産生
させて、ウイルス感染後の肺におけるＴｈ１／Ｔｈ２応答の均衡を保ち、かつマ
ウスに生ＲＳＶ感染に対する防御をもたらす。
【００３４】 この組換えベクターは、ＲＳＶ Ｇタンパク質をコードするヌクレオチド配列
に隣接して位置する第２のヌクレオチド配列も含むことが可能であり、宿主にお
いてｉｎ ｖｉｖｏ発現するときにそのＲＳＶ Ｇタンパク質の免疫防護活性を
高めることができる。このような増進は、たとえばｍＲＮＡの安定性の増加、転
写および／または翻訳の増進によって、ｉｎ ｖｉｖｏ発現が高まることによっ
てもたらされる。この追加的な配列は一般的にプロモータ配列とＲＳＶ Ｇタン
パク質をコードする配列との間に位置している。この増進性配列は前初期サイト
メガロウイルスのイントロンＡ配列を含むことが可能である。
に隣接して位置する第２のヌクレオチド配列も含むことが可能であり、宿主にお
いてｉｎ ｖｉｖｏ発現するときにそのＲＳＶ Ｇタンパク質の免疫防護活性を
高めることができる。このような増進は、たとえばｍＲＮＡの安定性の増加、転
写および／または翻訳の増進によって、ｉｎ ｖｉｖｏ発現が高まることによっ
てもたらされる。この追加的な配列は一般的にプロモータ配列とＲＳＶ Ｇタン
パク質をコードする配列との間に位置している。この増進性配列は前初期サイト
メガロウイルスのイントロンＡ配列を含むことが可能である。
【００３５】 本明細書で提供される非複製ベクターは、ＲＳＶからのさらなる抗原、少なく
とも１つの他の病原体またはサイトカインなどの少なくとも１つの免疫調節薬剤
の抗原をコードする追加的ヌクレオチド配列も含むことがある。このようなベク
ターはキメリック性または２シストロン性構造中に追加的なヌクレオチド配列を
含むことも可能である。別法として、追加的ヌクレオチド配列を含むベクターは
、本明細書で提供される非複製ベクターと別に構築して宿主に一緒に投与するこ
ともできる。
とも１つの他の病原体またはサイトカインなどの少なくとも１つの免疫調節薬剤
の抗原をコードする追加的ヌクレオチド配列も含むことがある。このようなベク
ターはキメリック性または２シストロン性構造中に追加的なヌクレオチド配列を
含むことも可能である。別法として、追加的ヌクレオチド配列を含むベクターは
、本明細書で提供される非複製ベクターと別に構築して宿主に一緒に投与するこ
ともできる。
【００３６】 この非複製ベクターはさらに、切断ＲＳＶ Ｇタンパク質の内在性シグナルペ
プチドの代わりに、異種ウイルスまたはヒト組織プラスミノーゲン活性化因子（
ＴＰＡ）シグナルペプチドなどの真核性シグナルペプチドをコードするヌクレオ
チド配列を含むことが可能である。このようなヌクレオチド配列はベクター内の
ＲＳＶ Ｇエンコード配列のすぐ上流に位置することが可能である。
プチドの代わりに、異種ウイルスまたはヒト組織プラスミノーゲン活性化因子（
ＴＰＡ）シグナルペプチドなどの真核性シグナルペプチドをコードするヌクレオ
チド配列を含むことが可能である。このようなヌクレオチド配列はベクター内の
ＲＳＶ Ｇエンコード配列のすぐ上流に位置することが可能である。
【００３７】 非複製ＤＮＡベクターの免疫原性はベクターに免疫刺激ＣｐＧ配列を挿入する
ことによって高めることが可能である。
ことによって高めることが可能である。
【００３８】 当業者には、本発明の種々の実施形態が予防接種、診断およびＲＳＶ感染症の
処置の分野において多くの用途を有することは明らかである。そのような用途を
以下においてさらに非制限的に検討する。 １．ワクチンの調製および使用 ワクチンとして使用するのに適した免疫原性組成物は、ＲＳＶ Ｇ遺伝子およ
び本明細書に開示するベクターから調製することが可能である。このワクチンは
、動物において抗ＲＳＶ Ｇ抗体の産生を含む免疫応答を誘発する。ワクチンを
含めて核酸を含む免疫原性組成物は、ポリヌクレオチド投与のための薬剤用に許
容される溶液またはエマルジョンという注射可能液として調製することができる
。この核酸は、レシチンリポゾームまたは当技術分野において知られている他の
リポゾームなどのリポゾームと共に（たとえば、国際特許ＷＯ９３２４６４０、
参照文献２０に記述されているように）核酸リポゾームとすることができ、また
はこの核酸は以下においてより詳細に記述する通りにアジュバントと組合わせる
ことができる。カチオン性脂質を含むリポゾームは自発的かつ迅速にＤＮＡおよ
びＲＮＡなどのポリアニオン類と相互作用して、このポリヌクレオチドを１００
％まで取り込んだリポゾーム／核酸複合体となる。さらに、このポリカチオン性
複合体は細胞膜と融合して、リソソーム区画の分解酵素をバイパスするポリヌク
レオチドの細胞内輸送を実現する。公開されたＰＣＴ出願ＷＯ９４／２７４３５
はカチオン性脂質およびポリヌクレオチドを含む遺伝子的免疫化のための組成物
を記述している。カルシウムイオン、ウイルス蛋白質および他のトランスフェク
ション促進剤などの核酸の細胞取り込みを助ける薬剤を有利に使用することが可
能である。
処置の分野において多くの用途を有することは明らかである。そのような用途を
以下においてさらに非制限的に検討する。 １．ワクチンの調製および使用 ワクチンとして使用するのに適した免疫原性組成物は、ＲＳＶ Ｇ遺伝子およ
び本明細書に開示するベクターから調製することが可能である。このワクチンは
、動物において抗ＲＳＶ Ｇ抗体の産生を含む免疫応答を誘発する。ワクチンを
含めて核酸を含む免疫原性組成物は、ポリヌクレオチド投与のための薬剤用に許
容される溶液またはエマルジョンという注射可能液として調製することができる
。この核酸は、レシチンリポゾームまたは当技術分野において知られている他の
リポゾームなどのリポゾームと共に（たとえば、国際特許ＷＯ９３２４６４０、
参照文献２０に記述されているように）核酸リポゾームとすることができ、また
はこの核酸は以下においてより詳細に記述する通りにアジュバントと組合わせる
ことができる。カチオン性脂質を含むリポゾームは自発的かつ迅速にＤＮＡおよ
びＲＮＡなどのポリアニオン類と相互作用して、このポリヌクレオチドを１００
％まで取り込んだリポゾーム／核酸複合体となる。さらに、このポリカチオン性
複合体は細胞膜と融合して、リソソーム区画の分解酵素をバイパスするポリヌク
レオチドの細胞内輸送を実現する。公開されたＰＣＴ出願ＷＯ９４／２７４３５
はカチオン性脂質およびポリヌクレオチドを含む遺伝子的免疫化のための組成物
を記述している。カルシウムイオン、ウイルス蛋白質および他のトランスフェク
ション促進剤などの核酸の細胞取り込みを助ける薬剤を有利に使用することが可
能である。
【００３９】 ポリヌクレオチド免疫原性調製物は、生物分解可能な持効性粒子を含むマイク
ロカプセルとして製剤することも可能である。たとえば米国特許第５，１５１，
２６４号はＢｉｏ Ｖｅｃｔｅｕｒｓ Ｓｕｐｒａ Ｍｏｌｅｃｕｌａｉｒｅｓ
（ＢＶＳＭ）と呼ばれているリン脂質／糖脂質／多糖類の性質の粒状担体につい
て記述している。これらの粒状担体はその層の１つに生物学的活性を有する様々
な分子を輸送しようとするものである。
ロカプセルとして製剤することも可能である。たとえば米国特許第５，１５１，
２６４号はＢｉｏ Ｖｅｃｔｅｕｒｓ Ｓｕｐｒａ Ｍｏｌｅｃｕｌａｉｒｅｓ
（ＢＶＳＭ）と呼ばれているリン脂質／糖脂質／多糖類の性質の粒状担体につい
て記述している。これらの粒状担体はその層の１つに生物学的活性を有する様々
な分子を輸送しようとするものである。
【００４０】 米国特許第５，０７５，１０９号はトリニトロフェニル化キーホールリンペッ
トヘモシアニンおよびスタフィロコッカスのエンテロトキシンＢとの５０：５０
ポリ（ＤＬ−ラクチデコ−グリコリド）の抗原のカプセル化について記述してい
る。カプセル化のための他のポリマーとしては、たとえばポリ（グリコリド）、
ポリ（ＤＬ−ラクチド−コ−グリコリド）、コポリオキサレート、ポリカプロラ
クトン、ポリ（ラクチド−コ−カプロラクトン）、ポリ（エステルアミド）、ポ
リオルソエステル類、およびポリ（８−ヒドロキシ酪酸）およびポリ無水物が挙
げられる。
トヘモシアニンおよびスタフィロコッカスのエンテロトキシンＢとの５０：５０
ポリ（ＤＬ−ラクチデコ−グリコリド）の抗原のカプセル化について記述してい
る。カプセル化のための他のポリマーとしては、たとえばポリ（グリコリド）、
ポリ（ＤＬ−ラクチド−コ−グリコリド）、コポリオキサレート、ポリカプロラ
クトン、ポリ（ラクチド−コ−カプロラクトン）、ポリ（エステルアミド）、ポ
リオルソエステル類、およびポリ（８−ヒドロキシ酪酸）およびポリ無水物が挙
げられる。
【００４１】 公開されたＰＣＴ出願ＷＯ９１／０６２８２は複数個の生体接着性ミクロスフ
ェアおよび抗原類を含む輸送媒体を記述している。このミクロスフェアは澱粉、
ゼラチン、デキストラン、コラーゲンまたはアルブミンからなる。この輸送用媒
体は特に鼻腔粘膜を介してワクチンを吸収させるためのものである。この輸送媒
体は追加的に吸収促進剤を含むことが可能である。
ェアおよび抗原類を含む輸送媒体を記述している。このミクロスフェアは澱粉、
ゼラチン、デキストラン、コラーゲンまたはアルブミンからなる。この輸送用媒
体は特に鼻腔粘膜を介してワクチンを吸収させるためのものである。この輸送媒
体は追加的に吸収促進剤を含むことが可能である。
【００４２】 非複製ベクターを含むＲＳＶ Ｇ遺伝子はそれらと相容性のある薬剤用に許容
される医薬品添加物と混合することが可能である。このような医薬品添加物は水
、食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール、およびそれらの混合物
を含むことができる。それらの免疫原性組成物およびワクチンはさらに、湿潤剤
または乳化剤、ｐＨ緩衝剤、またはそれらの有効性を高めるアジュバント類など
の補助物質を含むことが可能である。免疫原生組成物およびワクチンは非経口的
に、皮下注射、静脈内注射、皮内注射または筋肉内注射によって、場合によって
注射部位の局部麻酔による予備処置の後で投与してもよい。別法として、本発明
に従い形成された免疫原性組成物は粘膜表面において免疫応答を誘発する方法で
処方して投与してもよい。したがってこの免疫原性組成物は、たとえば鼻腔内ま
たは経口（胃内）の経路によって粘膜表面に投与することが可能である。別法と
して、座薬および経口用製剤を含む他の形態の投与が望ましいこともある。座薬
は、たとえばポリアルキレングリコールまたはトリグリセリドなどの結合剤およ
び担体を含むことができる。経口用製剤は、たとえば薬剤等級のサッカリン、セ
ルロースおよび炭酸マグネシウムなどの通常使用される補助剤（ｉｎｃｉｐｉｅ
ｎｔ）を含むことが可能である。
される医薬品添加物と混合することが可能である。このような医薬品添加物は水
、食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール、およびそれらの混合物
を含むことができる。それらの免疫原性組成物およびワクチンはさらに、湿潤剤
または乳化剤、ｐＨ緩衝剤、またはそれらの有効性を高めるアジュバント類など
の補助物質を含むことが可能である。免疫原生組成物およびワクチンは非経口的
に、皮下注射、静脈内注射、皮内注射または筋肉内注射によって、場合によって
注射部位の局部麻酔による予備処置の後で投与してもよい。別法として、本発明
に従い形成された免疫原性組成物は粘膜表面において免疫応答を誘発する方法で
処方して投与してもよい。したがってこの免疫原性組成物は、たとえば鼻腔内ま
たは経口（胃内）の経路によって粘膜表面に投与することが可能である。別法と
して、座薬および経口用製剤を含む他の形態の投与が望ましいこともある。座薬
は、たとえばポリアルキレングリコールまたはトリグリセリドなどの結合剤およ
び担体を含むことができる。経口用製剤は、たとえば薬剤等級のサッカリン、セ
ルロースおよび炭酸マグネシウムなどの通常使用される補助剤（ｉｎｃｉｐｉｅ
ｎｔ）を含むことが可能である。
【００４３】 それらの免疫原性調製物およびワクチンは投与用調合物と相容性のある方法で
、かつ治療に有効で、防御的および免疫原生的な量で投与することができる。投
与する量は、たとえばＲＳＶ Ｇタンパク質およびそれに対する抗体を生成し、
必要ならば細胞性免疫応答を引き起こす個体の免疫系の能力を含む治療対象に依
存する。投与するために必要な活性成分の正確な量は医師の判断に依存する。し
かし、適切な投与量範囲は当技術者によって容易に決定することができ、ＲＳＶ
Ｇ遺伝子を含むベクターの約１μｇから約２ｍｇ程度であることが可能である
。初期投与および追加免疫投与の適切な処方も可変であるが、初期投与引き続い
て次の投与を含むことが可能である。この投与量も投与経路に依存することが可
能で、宿主の大きさによって変化する。１つだけの病原体に対して防護するワク
チンは１価ワクチンである。いくつかの病原体の抗原物質を含むワクチンも本発
明に従属する。このような混合ワクチンは、たとえば様々な病原体からの物質、
または同じ病原体の異なった株からの物質、または様々な病原体の組合せからの
物質を含む。
、かつ治療に有効で、防御的および免疫原生的な量で投与することができる。投
与する量は、たとえばＲＳＶ Ｇタンパク質およびそれに対する抗体を生成し、
必要ならば細胞性免疫応答を引き起こす個体の免疫系の能力を含む治療対象に依
存する。投与するために必要な活性成分の正確な量は医師の判断に依存する。し
かし、適切な投与量範囲は当技術者によって容易に決定することができ、ＲＳＶ
Ｇ遺伝子を含むベクターの約１μｇから約２ｍｇ程度であることが可能である
。初期投与および追加免疫投与の適切な処方も可変であるが、初期投与引き続い
て次の投与を含むことが可能である。この投与量も投与経路に依存することが可
能で、宿主の大きさによって変化する。１つだけの病原体に対して防護するワク
チンは１価ワクチンである。いくつかの病原体の抗原物質を含むワクチンも本発
明に従属する。このような混合ワクチンは、たとえば様々な病原体からの物質、
または同じ病原体の異なった株からの物質、または様々な病原体の組合せからの
物質を含む。
【００４４】 免疫原性はそれらのベクターがアジュバントと一緒に、通常リン酸緩衝液中に
おいて０．０５から０．１パーセント溶液として投与された場合に顕著に増強さ
れることができる。アジュバントは抗原の免疫原性を高めるが、それ自身免疫原
性である必要はない。アジュバントは抗原を投与部位の近傍に局部的に保持する
ことによって作用して、免疫系細胞に抗原をゆっくり持続的に放出することを助
ける貯蔵所効果をもたらすことが可能である。アジュバントはまた、免疫系の細
胞を抗原集積部へ引き寄せてそのような細胞を刺激して免疫応答を誘発すること
もできる。
おいて０．０５から０．１パーセント溶液として投与された場合に顕著に増強さ
れることができる。アジュバントは抗原の免疫原性を高めるが、それ自身免疫原
性である必要はない。アジュバントは抗原を投与部位の近傍に局部的に保持する
ことによって作用して、免疫系細胞に抗原をゆっくり持続的に放出することを助
ける貯蔵所効果をもたらすことが可能である。アジュバントはまた、免疫系の細
胞を抗原集積部へ引き寄せてそのような細胞を刺激して免疫応答を誘発すること
もできる。
【００４５】 免疫刺激剤またはアジュバントは多年にわたり宿主の、たとえばワクチンに対
する免疫応答を高めるために使用されてきた。したがって、アジュバントが抗原
への免疫応答を高めることが明らかになっている。しかし、これらのアジュバン
トのいくつかは毒性があり、望ましくない副作用を引き起こす可能性があり、ヒ
トや多くの動物に使用するのが不適切となっている。実際に、水酸化アルミニウ
ムおよびリン酸アルミニウム（合わせて通常明礬と呼ぶ）のみが慣習的にヒトお
よび獣医用ワクチンにおいてアジュバントとして使用されている。
する免疫応答を高めるために使用されてきた。したがって、アジュバントが抗原
への免疫応答を高めることが明らかになっている。しかし、これらのアジュバン
トのいくつかは毒性があり、望ましくない副作用を引き起こす可能性があり、ヒ
トや多くの動物に使用するのが不適切となっている。実際に、水酸化アルミニウ
ムおよびリン酸アルミニウム（合わせて通常明礬と呼ぶ）のみが慣習的にヒトお
よび獣医用ワクチンにおいてアジュバントとして使用されている。
【００４６】 広範囲の外的アジュバントおよび他の免疫調節物質は抗原に対して強い免疫反
応を引き起こすことができる。これらには、膜蛋白質抗原と複合させて免疫刺激
複合体（ＩＳＣＯＭＳ）を作り出すサポニン、鉱油を含むプルロニック（ｐｌｕ
ｒｏｎｉｃ）ポリマー、鉱油中の死菌ミコバクテリアフロイントの完全アジュバ
ント、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）およびリポポリサッカライド（ＬＰＳ）な
どの細菌産生物並びにモノホリルリピドＡ、ＱＳ２１およびポリホスファゼンが
含まれる。
応を引き起こすことができる。これらには、膜蛋白質抗原と複合させて免疫刺激
複合体（ＩＳＣＯＭＳ）を作り出すサポニン、鉱油を含むプルロニック（ｐｌｕ
ｒｏｎｉｃ）ポリマー、鉱油中の死菌ミコバクテリアフロイントの完全アジュバ
ント、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）およびリポポリサッカライド（ＬＰＳ）な
どの細菌産生物並びにモノホリルリピドＡ、ＱＳ２１およびポリホスファゼンが
含まれる。
【００４７】 本発明の特別な実施形態において、ＲＳＶのＧタンパク質をコードする第１ヌ
クレオチド配列を含む非複製ベクターは、そのベクターを免疫系細胞を含む選択
された細胞に指向させるために標的指向分子と組合わせて投与することができる
。
クレオチド配列を含む非複製ベクターは、そのベクターを免疫系細胞を含む選択
された細胞に指向させるために標的指向分子と組合わせて投与することができる
。
【００４８】 この非複製ベクターの免疫原性は、サイトカインまたはケモカインを発現する
プラスミドＤＮＡベクターと共に投与することによって、またはビスシストロン
構造または融合構造内のこのような分子を共に発現することによって高めること
が可能である。
プラスミドＤＮＡベクターと共に投与することによって、またはビスシストロン
構造または融合構造内のこのような分子を共に発現することによって高めること
が可能である。
【００４９】 この非複製ベクターは宿主に種々の方法で投与することができ、たとえばＴａ
ｎｇ等（参照文献２１）は牛成長ホルモン（ＢＧＨ）をコードするＤＮＡで被覆
された金のマイクロ発射物（ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ）をマウスの皮膚
の中に導入してマウスに抗ＢＧＨ抗体を産生をもたらしたことを記述している一
方、Ｆｕｒｔｈ等（参照文献２２）はジェット注入器を生きた動物の皮膚、筋肉
、脂肪および乳腺組織を形質転換させるために使用することができることを示し
た。 ２．イムノアッセイ ＲＳＶ Ｇ遺伝子および本発明のベクターは、酵素結合免疫吸着アッセイ（Ｅ
ＬＩＳＡ）、ＲＩＡおよび他の非酵素結合型抗体結合アッセイまたは当技術にお
いて知られている方法を含むイムノアッセイにおいて使用するための抗Ｇ抗体の
産生のための免疫原として有用である。ＥＬＩＳＡアッセイにおいて、非複製ベ
クターはまず宿主に投与されてＲＳＶ Ｇタンパク質に対する特異的な抗体を産
生させる。これらのＲＳＶ Ｇ特異的抗体はたとえばポリスチレンマイクロタイ
タープレートの穴などのそれらの抗体を結合することのできる選択された表面上
に固定される。洗浄によって非吸着抗体を除去した後、被検試料に関して抗原的
に中性であることが知られている牛ガンマアルブミン（ＢＳＡ）などの非特異的
蛋白質を選択された表面に結合することができる。これが固定化された表面上の
非特異的吸着部位を遮蔽することを可能にして、それによって表面上に非特異的
な抗血清の結合によって起こるバックグラウンドを低下させる。
ｎｇ等（参照文献２１）は牛成長ホルモン（ＢＧＨ）をコードするＤＮＡで被覆
された金のマイクロ発射物（ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ）をマウスの皮膚
の中に導入してマウスに抗ＢＧＨ抗体を産生をもたらしたことを記述している一
方、Ｆｕｒｔｈ等（参照文献２２）はジェット注入器を生きた動物の皮膚、筋肉
、脂肪および乳腺組織を形質転換させるために使用することができることを示し
た。 ２．イムノアッセイ ＲＳＶ Ｇ遺伝子および本発明のベクターは、酵素結合免疫吸着アッセイ（Ｅ
ＬＩＳＡ）、ＲＩＡおよび他の非酵素結合型抗体結合アッセイまたは当技術にお
いて知られている方法を含むイムノアッセイにおいて使用するための抗Ｇ抗体の
産生のための免疫原として有用である。ＥＬＩＳＡアッセイにおいて、非複製ベ
クターはまず宿主に投与されてＲＳＶ Ｇタンパク質に対する特異的な抗体を産
生させる。これらのＲＳＶ Ｇ特異的抗体はたとえばポリスチレンマイクロタイ
タープレートの穴などのそれらの抗体を結合することのできる選択された表面上
に固定される。洗浄によって非吸着抗体を除去した後、被検試料に関して抗原的
に中性であることが知られている牛ガンマアルブミン（ＢＳＡ）などの非特異的
蛋白質を選択された表面に結合することができる。これが固定化された表面上の
非特異的吸着部位を遮蔽することを可能にして、それによって表面上に非特異的
な抗血清の結合によって起こるバックグラウンドを低下させる。
【００５０】 次にこの固定化した表面に、臨床または生物学的物質などの試験する試料を、
免疫複合体（抗原／抗体）を形成するのを促進する方法で接触させる。この方法
はＢＳＡ溶液、牛ガンマグロブリン（ＢＧＧ）および／またはリン酸緩衝食塩水
（ＰＢＳ）／Ｔｗｅｅｎの溶液などの希釈剤で試料を希釈することを含むことが
可能である。次にこの試料を約２０から３７℃程度の温度において約２から４時
間インキュベートする。インキュベーション後、試料と接触させた表面を洗浄し
て免疫複合化しなかった物質を除去する。この洗浄操作はＰＢＳ／トゥイーンま
たはホウ酸塩緩衝液などの溶液による洗浄を含むことが可能である。被検試料と
結合ＲＳＶ Ｇ特異的抗体との間の特異的免疫複合体の形成、およびその後の洗
浄で、免疫複合体形成の発生、およびその量をも決定することができる。
免疫複合体（抗原／抗体）を形成するのを促進する方法で接触させる。この方法
はＢＳＡ溶液、牛ガンマグロブリン（ＢＧＧ）および／またはリン酸緩衝食塩水
（ＰＢＳ）／Ｔｗｅｅｎの溶液などの希釈剤で試料を希釈することを含むことが
可能である。次にこの試料を約２０から３７℃程度の温度において約２から４時
間インキュベートする。インキュベーション後、試料と接触させた表面を洗浄し
て免疫複合化しなかった物質を除去する。この洗浄操作はＰＢＳ／トゥイーンま
たはホウ酸塩緩衝液などの溶液による洗浄を含むことが可能である。被検試料と
結合ＲＳＶ Ｇ特異的抗体との間の特異的免疫複合体の形成、およびその後の洗
浄で、免疫複合体形成の発生、およびその量をも決定することができる。
【００５１】 （生物学的物質） ＲＳＶ Ｇタンパク質をコードする遺伝子を含んでおり、本明細書で言及した
ある種のプラスミド類は、本願の出願に先立ってブタペスト条約に従って、米国
２０８５２、メリーランド、ロックヴィル、Ｐａｒｋｌａｗｎ Ｄｒｉｖｅ １
２３０１に所在するＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅ
ｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に寄託された。
ある種のプラスミド類は、本願の出願に先立ってブタペスト条約に従って、米国
２０８５２、メリーランド、ロックヴィル、Ｐａｒｋｌａｗｎ Ｄｒｉｖｅ １
２３０１に所在するＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅ
ｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に寄託された。
【００５２】 この寄託されたプラスミド試料は、この米国特許出願に基づいて特許が与えら
れた時に公衆に入手可能となり、この寄託物へのアクセスの全ての制限がそのと
き除かれることになる。寄託されたプラスミド試料は、寄託先が生きた試料を調
製することができない場合は返却されるであろう。寄託された実施例は本発明を
例示することのみを目的としているので、本明細書で記述され特許請求される発
明は、寄託されたプラスミドによってその範囲を限定されるものではない。この
明細書で記述されたものと類似または等価な抗原をコードする等価または類似の
全てのプラスミド類は本発明の範囲に含まれる。 プラスミド ＡＴＣＣ表示 寄託日付 ｐＸＬ５ ２０９１４３ １９９７年７月１６日 ｐＸＬ６ ２０９１４４ １９９７年７月１６日
れた時に公衆に入手可能となり、この寄託物へのアクセスの全ての制限がそのと
き除かれることになる。寄託されたプラスミド試料は、寄託先が生きた試料を調
製することができない場合は返却されるであろう。寄託された実施例は本発明を
例示することのみを目的としているので、本明細書で記述され特許請求される発
明は、寄託されたプラスミドによってその範囲を限定されるものではない。この
明細書で記述されたものと類似または等価な抗原をコードする等価または類似の
全てのプラスミド類は本発明の範囲に含まれる。 プラスミド ＡＴＣＣ表示 寄託日付 ｐＸＬ５ ２０９１４３ １９９７年７月１６日 ｐＸＬ６ ２０９１４４ １９９７年７月１６日
【００５３】 （実施例） 上記の開示は一般的に本発明を記述するものである。以下の特定の実施例を参
照することによってより完全な理解が得られる。これらの実施例は例示の目的の
ためにのみ記述するものであって、発明の範囲を制限しようとするものではない
。形態の変化および等価物の置換は条件が示唆し、または好都合になる時に考え
られる。本明細書では特定の用語を使用しているが、このような用語は記述的な
意味で用いるものであって限定を目的としたものではない。
照することによってより完全な理解が得られる。これらの実施例は例示の目的の
ためにのみ記述するものであって、発明の範囲を制限しようとするものではない
。形態の変化および等価物の置換は条件が示唆し、または好都合になる時に考え
られる。本明細書では特定の用語を使用しているが、このような用語は記述的な
意味で用いるものであって限定を目的としたものではない。
【００５４】 分子遺伝学、蛋白質化学および免疫学の方法が使用されているが、この開示に
おいては明確に記述しておらず、これらの実施例は化学文献で十分に報告されて
おり、かつ十分に当技術者の能力の範囲内である。
おいては明確に記述しておらず、これらの実施例は化学文献で十分に報告されて
おり、かつ十分に当技術者の能力の範囲内である。
【００５５】 実施例１ この実施例はＲＳＶ Ｇ遺伝子を含むベクターの構造を記述する。
【００５６】 図１は呼吸器合胞体ウイルスのＧタンパク質をコードする遺伝子の制限地図を
示しており、図２はＲＳＶ Ｇタンパク質の全長をコードする遺伝子のヌクレオ
チド配列（配列番号：１）および推論されたアミノ酸配列（配列番号：２）を示
す。図３は分泌型ＲＳＶ Ｇタンパク質をコードする遺伝子（配列番号：３）お
よび推論されたアミノ酸配列（配列番号：４）を示す。
示しており、図２はＲＳＶ Ｇタンパク質の全長をコードする遺伝子のヌクレオ
チド配列（配列番号：１）および推論されたアミノ酸配列（配列番号：２）を示
す。図３は分泌型ＲＳＶ Ｇタンパク質をコードする遺伝子（配列番号：３）お
よび推論されたアミノ酸配列（配列番号：４）を示す。
【００５７】 プラスミドｐＸＬ５（図４）は以下の通りにＲＳＶ Ｇタンパク質全長の発現
のために調製した。
のために調製した。
【００５８】 臨床的なＲＳＶ単離物（サブグループＡ）の全長Ｇタンパク質をコードするｃ
ＤＮＡを含む組換えＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔプラスミド（ＲＳＶ Ｇ１２）がＲＳ
Ｖ ＤＮＡ−Ｇ免疫のためのベクターの構築に使用された。ＲＳＶ Ｇ１２をＡ
ｆｌＩＩＩおよびＥｃｏＲＩで消化してＤＮＡポリメラーゼのクレノウサブユニ
ットを挿入した。得られた全長Ｇタンパク質のコード配列を含む１．２３ｋｂフ
ラグメントは、ゲルで精製してＥｃｏＲＶで前もって直鎖にしたＶＲ−１０１２
（Ｖｉｃａｌ）（図６）に繋いだ。この方法によってＲＳＶ ＧのｃＤＮＡは前
初期サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターおよびヒトサイトメガロウイ
ルス（ＣＭＶ）のイントロンＡ配列の下流かつ牛成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリ−
Ａ−部位の上流に置かれた。プラスミド構築中のｃＤＮＡフラグメントの連結は
配列分析によって確認する。得られたプラスミドはｐＸＬ５と称した。
ＤＮＡを含む組換えＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔプラスミド（ＲＳＶ Ｇ１２）がＲＳ
Ｖ ＤＮＡ−Ｇ免疫のためのベクターの構築に使用された。ＲＳＶ Ｇ１２をＡ
ｆｌＩＩＩおよびＥｃｏＲＩで消化してＤＮＡポリメラーゼのクレノウサブユニ
ットを挿入した。得られた全長Ｇタンパク質のコード配列を含む１．２３ｋｂフ
ラグメントは、ゲルで精製してＥｃｏＲＶで前もって直鎖にしたＶＲ−１０１２
（Ｖｉｃａｌ）（図６）に繋いだ。この方法によってＲＳＶ ＧのｃＤＮＡは前
初期サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターおよびヒトサイトメガロウイ
ルス（ＣＭＶ）のイントロンＡ配列の下流かつ牛成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリ−
Ａ−部位の上流に置かれた。プラスミド構築中のｃＤＮＡフラグメントの連結は
配列分析によって確認する。得られたプラスミドはｐＸＬ５と称した。
【００５９】 プラスミドｐＸＬ６（図５）は以下の通りに分泌型ＲＳＶ Ｇタンパク質の発
現のために調製された。
現のために調製された。
【００６０】 ＲＳＶ Ｇ１２はＥｃｏＲＩで消化してクレノウを挿入し再びＢａｍＨＩで消
化した。ＢａｍＨＩ切断によってＮ末端を有するＲＳＶ Ｇタンパク質をコード
するｃＤＮＡフラグメントが生成された。このＤＮＡセグメントをゲルによって
精製されて、１１対の部分オリゴデオキシヌクレオチド （５’ＧＡＴＣＣＡＣＴＣＡＧ３’）（配列番号：７） ３’ＧＴＧＡＧＴＣＣＴＡＧ５’（配列番号：８） の存在下で、前もってＢｇｌＩＩで消化してクレノウを挿入して、再びＢａｍＨ
Ｉで消化してゲルで精製したＶＲ−１０２０（Ｖｉｃａｌ）に繋いだ。この方法
によって切断されたＲＳＶ ＧｃＤＮＡ（トランスメンブランドメインを含むＮ
末端の９１アミノ酸残基のコーディング領域を欠失している）は前初期ＣＭＶプ
ロモーターおよびヒトＣＭＶのイントロンＡ配列の下流かつＢＧＨポリＡ部位の
上流に置かれた。さらに、約１００ｂｐの５’非翻訳領域およびヒトプラスミノ
ーゲン活性化因子蛋白質（図７）のシグナルペプチドのコード配列をＣＭＶプロ
モータ／イントロンＡ配列の下流のＲＳＶ Ｇタンパク質コード配列のＮ末端に
融合するように導入された。このプラスミド構造におけるｃＤＮＡフラグメント
の連結は配列分析によって確かめられた。得られたプラスミドはｐＸＬ６と称し
た。
化した。ＢａｍＨＩ切断によってＮ末端を有するＲＳＶ Ｇタンパク質をコード
するｃＤＮＡフラグメントが生成された。このＤＮＡセグメントをゲルによって
精製されて、１１対の部分オリゴデオキシヌクレオチド （５’ＧＡＴＣＣＡＣＴＣＡＧ３’）（配列番号：７） ３’ＧＴＧＡＧＴＣＣＴＡＧ５’（配列番号：８） の存在下で、前もってＢｇｌＩＩで消化してクレノウを挿入して、再びＢａｍＨ
Ｉで消化してゲルで精製したＶＲ−１０２０（Ｖｉｃａｌ）に繋いだ。この方法
によって切断されたＲＳＶ ＧｃＤＮＡ（トランスメンブランドメインを含むＮ
末端の９１アミノ酸残基のコーディング領域を欠失している）は前初期ＣＭＶプ
ロモーターおよびヒトＣＭＶのイントロンＡ配列の下流かつＢＧＨポリＡ部位の
上流に置かれた。さらに、約１００ｂｐの５’非翻訳領域およびヒトプラスミノ
ーゲン活性化因子蛋白質（図７）のシグナルペプチドのコード配列をＣＭＶプロ
モータ／イントロンＡ配列の下流のＲＳＶ Ｇタンパク質コード配列のＮ末端に
融合するように導入された。このプラスミド構造におけるｃＤＮＡフラグメント
の連結は配列分析によって確かめられた。得られたプラスミドはｐＸＬ６と称し
た。
【００６１】 実施例２ この実施例ではマウスの免疫について記述する。マウスは参照文献２４で記述
された通りにＲＳＶによって感染に感受性である。
された通りにＲＳＶによって感染に感受性である。
【００６２】 プラスミドＤＮＡは２重セシウム遠心法によって精製された。筋肉内（ｉ．ｍ
．）免疫のために、ＢＡＬＢ／ｃマウス（６から８週齡の雄）（米国メイン州、
Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂ．）の前脛骨筋の両側から、２
×５０μｇ（ＰＢＳ中１μｇ／μＬ）のｐＸＬ５、ｐＸＬ６またはＶ−１０１２
のいずれかを注射した。Ｄａｖｉｓ他（参照文献２３）によって報告された通り
に、ＤＮＡの取り込みを増加させ免疫応答を高めるために、ＤＮＡ注射の５日前
にその筋肉をカルジオトキシン（フランス、Ｌａｔｏｘａｎ）の２×５０μＬ（
ＰＢＳ中１０μＭ）で処理した。これらの動物に６週目および１３週目に、それ
ぞれ同用量のプラスミドＤＮＡを追加投与した。皮内（ｉ．ｄ．）免疫化のため
には、プラスミドＤＮＡ１００μｇ（ＰＢＳ中２μｇ／μＬ）を尾の付け根に注
射して６週および１３週間後にそれぞれ追加免疫した。陽性対照群のマウスは、
ドクターＢ．Ｇｒａｈａｍから恵与されたＨｅｐ２細胞内で増殖させた臨床ＲＳ
Ｖ株のＡ２サブタイプを１０6プラーク形成ユニット（ｐｆｕ）で鼻腔内免疫化 した（参照文献２４）。
．）免疫のために、ＢＡＬＢ／ｃマウス（６から８週齡の雄）（米国メイン州、
Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂ．）の前脛骨筋の両側から、２
×５０μｇ（ＰＢＳ中１μｇ／μＬ）のｐＸＬ５、ｐＸＬ６またはＶ−１０１２
のいずれかを注射した。Ｄａｖｉｓ他（参照文献２３）によって報告された通り
に、ＤＮＡの取り込みを増加させ免疫応答を高めるために、ＤＮＡ注射の５日前
にその筋肉をカルジオトキシン（フランス、Ｌａｔｏｘａｎ）の２×５０μＬ（
ＰＢＳ中１０μＭ）で処理した。これらの動物に６週目および１３週目に、それ
ぞれ同用量のプラスミドＤＮＡを追加投与した。皮内（ｉ．ｄ．）免疫化のため
には、プラスミドＤＮＡ１００μｇ（ＰＢＳ中２μｇ／μＬ）を尾の付け根に注
射して６週および１３週間後にそれぞれ追加免疫した。陽性対照群のマウスは、
ドクターＢ．Ｇｒａｈａｍから恵与されたＨｅｐ２細胞内で増殖させた臨床ＲＳ
Ｖ株のＡ２サブタイプを１０6プラーク形成ユニット（ｐｆｕ）で鼻腔内免疫化 した（参照文献２４）。
【００６３】 ３回目の免疫後４週目に、マウスにＲＳＶ Ａ２株の１０6ｐｆｕを鼻腔内に 試験感染させた。４日後に肺を滅菌的に取り出し、完全培養培地２ｍＬに均質化
させた（参照番号２５）。肺のホモジェネート中のｐｆｕ数をワクチン品質のｖ
ｅｒｏ細胞を用いて以前に記述した通りに（参照文献２６）２連で測定した。
させた（参照番号２５）。肺のホモジェネート中のｐｆｕ数をワクチン品質のｖ
ｅｒｏ細胞を用いて以前に記述した通りに（参照文献２６）２連で測定した。
【００６４】 実施例３ この実施例はポリヌクレオチド免疫による免疫原性および防御について記述す
る。
る。
【００６５】 免役したマウスから得られた抗血清について、特異的酵素結合免疫吸着アッセ
イ（ＥＬＩＳＡ）を使用した抗ＲＳＶ Ｇ ＩｇＧ抗体力価およびＲＳＶ特異的
プラーク減少力価を分析した。ＥＬＩＳＡはイムノアフィニティークロマトグラ
フィーで精製したＲＳＶ Ｇタンパク質（５０ｎｇ／ｍＬ）で被覆された９６穴
プレートを使用して免疫血清の２倍系列希釈を用いて実施した。アルカリホスフ
ァターゼ結合山羊抗マウスＩｇＧ抗体（カナダ国オンタリオ州、Ｍｉｓｓｉｓｓ
ａｕｇａのＪａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓ．）を２次抗体として使用した
。プラーク減少力価はワクチン品質のＶｅｒｏ細胞を使用してＰｒｉｎｃｅ他（
参照文献２６）に従って測定した。４倍系列希釈した免疫血清を５０ｐｆｕのＲ
ＳＶ、Ｌｏｎｇ株（ＡＴＣＣ）と共に５％ＣＯ2の存在下で３７℃で１時間培地 中でインキュベートして、この混合液をＶｅｒｏ細胞の感染に使用した。プラー
クは８０％メタノールで固定して、５日後にマウス抗ＲＳＶ−Ｆモノクローナル
ＩｇＧ１抗体およびペルオキシダーゼを結合したロバ抗マウスＩｇＧ抗体（カナ
ダ国オンタリオ州、ＭｉｓｓｉｓｓａｕｇａのＪａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲ
ｅｓ．）を使用して確認した。このＲＳＶ特異的プラーク減少力価はプラーク数
の６０％減少をもたらす血清試料の希釈度として定義した。ＥＬＩＳＡおよびプ
ラーク減少アッセイの両方とも２連で実施してデータは２つの測定値の平均とし
て表した。
イ（ＥＬＩＳＡ）を使用した抗ＲＳＶ Ｇ ＩｇＧ抗体力価およびＲＳＶ特異的
プラーク減少力価を分析した。ＥＬＩＳＡはイムノアフィニティークロマトグラ
フィーで精製したＲＳＶ Ｇタンパク質（５０ｎｇ／ｍＬ）で被覆された９６穴
プレートを使用して免疫血清の２倍系列希釈を用いて実施した。アルカリホスフ
ァターゼ結合山羊抗マウスＩｇＧ抗体（カナダ国オンタリオ州、Ｍｉｓｓｉｓｓ
ａｕｇａのＪａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓ．）を２次抗体として使用した
。プラーク減少力価はワクチン品質のＶｅｒｏ細胞を使用してＰｒｉｎｃｅ他（
参照文献２６）に従って測定した。４倍系列希釈した免疫血清を５０ｐｆｕのＲ
ＳＶ、Ｌｏｎｇ株（ＡＴＣＣ）と共に５％ＣＯ2の存在下で３７℃で１時間培地 中でインキュベートして、この混合液をＶｅｒｏ細胞の感染に使用した。プラー
クは８０％メタノールで固定して、５日後にマウス抗ＲＳＶ−Ｆモノクローナル
ＩｇＧ１抗体およびペルオキシダーゼを結合したロバ抗マウスＩｇＧ抗体（カナ
ダ国オンタリオ州、ＭｉｓｓｉｓｓａｕｇａのＪａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲ
ｅｓ．）を使用して確認した。このＲＳＶ特異的プラーク減少力価はプラーク数
の６０％減少をもたらす血清試料の希釈度として定義した。ＥＬＩＳＡおよびプ
ラーク減少アッセイの両方とも２連で実施してデータは２つの測定値の平均とし
て表した。
【００６６】 得られた結果は以下の表１および表２に再掲した。
【００６７】
【表１】
【００６８】
【表２】
【００６９】 表１に認められる通りに、プラスミドｐＸＬ５およびｐＸＬ６は１．ｍ．また
はｉ．ｄ．のいずれによる免疫後も抗Ｇ抗体およびウイルス中和抗体を生産して
免疫原性を有していることが発見された。さらに、表２に示される通りに、プラ
スミドｐＸＬ５およびｐＸＬ６は下気道の１次ＲＳＶ感染に対して免疫マウスを
防護した。対照ベクターは免疫応答を引き起こさず、防護も与えなかった。
はｉ．ｄ．のいずれによる免疫後も抗Ｇ抗体およびウイルス中和抗体を生産して
免疫原性を有していることが発見された。さらに、表２に示される通りに、プラ
スミドｐＸＬ５およびｐＸＬ６は下気道の１次ＲＳＶ感染に対して免疫マウスを
防護した。対照ベクターは免疫応答を引き起こさず、防護も与えなかった。
【００７０】 実施例４ この実施例はＲＳＶ感染後ｐＸＬ５およびｐＸＬ６で免役したマウスにおける
局部の肺サイトカイン発現特性の測定について記述する。
局部の肺サイトカイン発現特性の測定について記述する。
【００７１】 ＢＡＬＢ／ｃマウスを実施例１で記述した通りに調製したｐＸＬ５および６の
１００μｇで０および６週目に免役して、１０週目にｉ．ｎ．でＲＳＶ感染させ
た。対照動物はプラシーボＰＩ−ＲＳＶおよび生ＲＳＶで免役して同方法に従っ
てＲＳＶ感染させた。さらに、動物は１９９５年７月７日出願の米国特許出願第
０８／４７６，３９７号（ＷＯ９６／４０９４５）に記述されたとおりにｐＸＬ
２で免役して、また同方法に従ってＲＳＶで感染させた。ウイルス感染後４日目
に、免役したマウスの肺を取り出し、すぐに液体窒素で凍結した。全ＲＮＡはＴ
ＲＩｚｏｌ／β−メルカプトエタノール中で均質化した肺からクロロホルム抽出
およびイソプロパノール沈殿によって調製した。その後ＣｌｏｎｅＴｅｃｈから
のＩＬ−４、ＩＬ−５またはＩＦＮ−γ特異的プライマーのいずれかを使用して
逆転写酵素−複製連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）をＲＮＡ試料について実施した。そ
の後増幅された生成物はＣｌｏｎｅＴｅｃｈのサイトカイン特異的Ｐ32標識プロ
ーブに液体ハイブリダイズして、５％ポリアクリルアミドゲル上で溶解して、ゲ
ル中の放射活性シグナルのスキャニングによって定量した。３つのマウス肺を各
処理群から取り出して、最小２回肺サイトカイン発現を分析した。このデータは
図８にあり、これらの測定値の平均および標準偏差を表した。
１００μｇで０および６週目に免役して、１０週目にｉ．ｎ．でＲＳＶ感染させ
た。対照動物はプラシーボＰＩ−ＲＳＶおよび生ＲＳＶで免役して同方法に従っ
てＲＳＶ感染させた。さらに、動物は１９９５年７月７日出願の米国特許出願第
０８／４７６，３９７号（ＷＯ９６／４０９４５）に記述されたとおりにｐＸＬ
２で免役して、また同方法に従ってＲＳＶで感染させた。ウイルス感染後４日目
に、免役したマウスの肺を取り出し、すぐに液体窒素で凍結した。全ＲＮＡはＴ
ＲＩｚｏｌ／β−メルカプトエタノール中で均質化した肺からクロロホルム抽出
およびイソプロパノール沈殿によって調製した。その後ＣｌｏｎｅＴｅｃｈから
のＩＬ−４、ＩＬ−５またはＩＦＮ−γ特異的プライマーのいずれかを使用して
逆転写酵素−複製連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）をＲＮＡ試料について実施した。そ
の後増幅された生成物はＣｌｏｎｅＴｅｃｈのサイトカイン特異的Ｐ32標識プロ
ーブに液体ハイブリダイズして、５％ポリアクリルアミドゲル上で溶解して、ゲ
ル中の放射活性シグナルのスキャニングによって定量した。３つのマウス肺を各
処理群から取り出して、最小２回肺サイトカイン発現を分析した。このデータは
図８にあり、これらの測定値の平均および標準偏差を表した。
【００７２】 図８に示されたデータからわかる通りに、 １．生ＲＳＶ鼻腔内（ｉ．ｎ．）免疫によって均衡のとれたサイトカイン特性（
ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４およびＩＬ−５）が生じて、一方ＦＩ−ＲＳＶの筋肉内（
ｉ．ｍ．）免疫によってはＴｈ２の優勢（ＩＬ−４およびＩＬ−５の上昇）が生
じた。これらの結果は文献で報告されたものと同様である。 ２．ｉ．ｍ．または皮内（ｉ．ｄ．）経路のいずれかを介するｐＸＬ５またはｐ
ＸＬ６の免疫は、生ＲＳＶ免疫と同様に均衡のとれたサイトカインプロフィルを
もたらした。 ３．分泌型蛋白質（ＳＥＣ）を発現する構築物を使用した場合、ｉ．ｍ．のｐＸ
Ｌ６（ＲＳＶ Ｇ）およびｐＸＬ２（ＲＳＶ−Ｆ）免疫に伴うサイトカイン応答
の程度は、生ＲＳＶ免疫の場合よりも顕著に高かった。 ４．膜結合ＲＳＶ Ｇタンパク質（ＭＡ）の全長の構造発現を使用した場合のｐ
ＸＬ５およびｉ．ｄ．ｐＸＬ６免疫に伴うサイトカイン応答の程度は生ＲＳＶ免
疫よりもいくらか高かった。 ５．Ｏｐｅｎｓｈａｗ他（参照文献１３）によって報告されたものと対照的にＤ
ＮＡ−Ｇ免疫に伴って均衡のとれた局部サイトカイン応答が観察された。Ｇタン
パク質を発現する組換えワクチンウイルスを使用して、これらの研究者は気管支
肺胞洗浄の分析によって局部のＴｈ２応答を報告した。本明細書での結果は単一
遺伝子によって得られたものであり、Ｔｈ２応答は必ずしもＧタンパク質固有の
性質ではないことを示唆している。
ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４およびＩＬ−５）が生じて、一方ＦＩ−ＲＳＶの筋肉内（
ｉ．ｍ．）免疫によってはＴｈ２の優勢（ＩＬ−４およびＩＬ−５の上昇）が生
じた。これらの結果は文献で報告されたものと同様である。 ２．ｉ．ｍ．または皮内（ｉ．ｄ．）経路のいずれかを介するｐＸＬ５またはｐ
ＸＬ６の免疫は、生ＲＳＶ免疫と同様に均衡のとれたサイトカインプロフィルを
もたらした。 ３．分泌型蛋白質（ＳＥＣ）を発現する構築物を使用した場合、ｉ．ｍ．のｐＸ
Ｌ６（ＲＳＶ Ｇ）およびｐＸＬ２（ＲＳＶ−Ｆ）免疫に伴うサイトカイン応答
の程度は、生ＲＳＶ免疫の場合よりも顕著に高かった。 ４．膜結合ＲＳＶ Ｇタンパク質（ＭＡ）の全長の構造発現を使用した場合のｐ
ＸＬ５およびｉ．ｄ．ｐＸＬ６免疫に伴うサイトカイン応答の程度は生ＲＳＶ免
疫よりもいくらか高かった。 ５．Ｏｐｅｎｓｈａｗ他（参照文献１３）によって報告されたものと対照的にＤ
ＮＡ−Ｇ免疫に伴って均衡のとれた局部サイトカイン応答が観察された。Ｇタン
パク質を発現する組換えワクチンウイルスを使用して、これらの研究者は気管支
肺胞洗浄の分析によって局部のＴｈ２応答を報告した。本明細書での結果は単一
遺伝子によって得られたものであり、Ｔｈ２応答は必ずしもＧタンパク質固有の
性質ではないことを示唆している。
【００７３】 （開示の要約） この開示の要約において、本発明はＲＳＶ Ｇタンパク質をコードする遺伝子
を含むある種の新規の非複製ベクター、このようなベクターを使用した免疫方法
およびこのようなベクターを使用した診断方法を提供する。変更は本発明の範囲
内である。
を含むある種の新規の非複製ベクター、このようなベクターを使用した免疫方法
およびこのようなベクターを使用した診断方法を提供する。変更は本発明の範囲
内である。
【００７４】 文献リスト 1. McIntosh K., Conock, R. M. In: Fields B.N, Knipe, DM, editors. Virolo
gy. New York: Raven Press: 1990: 1045-1072 2. Heilman, C. A., J. Infect. Dis. 1990, 161: 402 to 406. 3. Wertz GW, Sullender WM., Biotechnology 1992: 20: 151-176 4. Murphy, B. R. et al, 1994, Virus Res. 32: 13-36 5. Levine, S., Keiber-France, R., and Paradiso, P. R. (1987) J. Gen. Vir
ol. 69, 2521-2524 6. Anderson, L. J., Hierholzer, J. C., Tsou, C., Hendry, R. M., Fernie, B. F., Stone, Y. and McIntosh, K. (1985) J. Infect. Dis. 151, 626-633 7. Johnson et al., J. Virol 1987, 61: 3163-3166 8. Crowe, J. E., Vaccine 1995, 13: 415-421 9. Kapikian, A. Z. et al 1969, Am. J. Epidemiol. 89: 405-421 10. Kim, H. W., et al 1969 Am. J. Epidemiol. 89: 422-434 11. Murphy, B. R. et al 1986 J. Clin. Microbiol. 24: 197-202 12. Vaux-Peretz, F. et al 1992 Vaccine 10: 113-118 13. Openshaw, P. J. 1995 Springer-Semin Immunopathol. 17: 187-201 14. Alwan et al 1994 J. Exp. Med. 179: 81-89 15. Graham, B. S. 1995 Am. J. Respir. Crit. Care Med. 152: 563-566 16. WO 90/11092 17. WO 94/21797 18. Ulmer, Current Opinion, Invest Drugs, 1993, 2: 983-989 19. Chapman, B. S.; Thayer, R. M.; Vincent, K. A. and Haigwood, N. L., N
ucl. Acids. Res. 1991, 19: 3979-3986 20. Nabel, G. J. 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 11307-11311 21. Tang et al., Nature 1992, 356: 152-154 22. Furth et al. Analytical Biochemistry, 1992, 205: 365-368 23. Davis et al., Vaccine 1994, 12: 1503-1509 24. Graham, B. S.; Perkins M. D.; Wright, P. F. and Karzon, D. T. J. Med
. Virol. 1988 26: 153-162 25. Du, R. P. et al. 1994., Bio Technology 12: 813-818 26. Prince, G. A. et al, 1978. Ame. J. Pathol. 93: 771-790
gy. New York: Raven Press: 1990: 1045-1072 2. Heilman, C. A., J. Infect. Dis. 1990, 161: 402 to 406. 3. Wertz GW, Sullender WM., Biotechnology 1992: 20: 151-176 4. Murphy, B. R. et al, 1994, Virus Res. 32: 13-36 5. Levine, S., Keiber-France, R., and Paradiso, P. R. (1987) J. Gen. Vir
ol. 69, 2521-2524 6. Anderson, L. J., Hierholzer, J. C., Tsou, C., Hendry, R. M., Fernie, B. F., Stone, Y. and McIntosh, K. (1985) J. Infect. Dis. 151, 626-633 7. Johnson et al., J. Virol 1987, 61: 3163-3166 8. Crowe, J. E., Vaccine 1995, 13: 415-421 9. Kapikian, A. Z. et al 1969, Am. J. Epidemiol. 89: 405-421 10. Kim, H. W., et al 1969 Am. J. Epidemiol. 89: 422-434 11. Murphy, B. R. et al 1986 J. Clin. Microbiol. 24: 197-202 12. Vaux-Peretz, F. et al 1992 Vaccine 10: 113-118 13. Openshaw, P. J. 1995 Springer-Semin Immunopathol. 17: 187-201 14. Alwan et al 1994 J. Exp. Med. 179: 81-89 15. Graham, B. S. 1995 Am. J. Respir. Crit. Care Med. 152: 563-566 16. WO 90/11092 17. WO 94/21797 18. Ulmer, Current Opinion, Invest Drugs, 1993, 2: 983-989 19. Chapman, B. S.; Thayer, R. M.; Vincent, K. A. and Haigwood, N. L., N
ucl. Acids. Res. 1991, 19: 3979-3986 20. Nabel, G. J. 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 11307-11311 21. Tang et al., Nature 1992, 356: 152-154 22. Furth et al. Analytical Biochemistry, 1992, 205: 365-368 23. Davis et al., Vaccine 1994, 12: 1503-1509 24. Graham, B. S.; Perkins M. D.; Wright, P. F. and Karzon, D. T. J. Med
. Virol. 1988 26: 153-162 25. Du, R. P. et al. 1994., Bio Technology 12: 813-818 26. Prince, G. A. et al, 1978. Ame. J. Pathol. 93: 771-790
【図面の簡単な説明】
【図１】 呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）のＧタンパク質をコードする遺伝子の制限地
図を示す図である。
図を示す図である。
【図２】 膜付着型の呼吸器合胞体ウイルスＧタンパク質（配列番号：１）をコードする
遺伝子のヌクレオチド配列並びにそれによりエンコードされたＲＳＶ Ｇタンパ
ク質のアミノ酸配列（配列番号：２）を示図である。
遺伝子のヌクレオチド配列並びにそれによりエンコードされたＲＳＶ Ｇタンパ
ク質のアミノ酸配列（配列番号：２）を示図である。
【図３】 分泌型のトランスメンブランドメインを欠落したＲＳＶ Ｇタンパク質のヌク
レオチド配列（配列番号：３）並びにそれによりエンコードされたトランスメン
ブランドメインを欠落し切断型のＲＳＶ Ｇタンパク質のアミノ酸配列（配列番
号：４）を示す図である。
レオチド配列（配列番号：３）並びにそれによりエンコードされたトランスメン
ブランドメインを欠落し切断型のＲＳＶ Ｇタンパク質のアミノ酸配列（配列番
号：４）を示す図である。
【図４】 膜付着型のＲＳＶ Ｇタンパク質の全長をコードする遺伝子を含んでおりＣＭ
ＶイントロンＡ配列を含むプラスミドｐＸＬ５の構造を示す図である。
ＶイントロンＡ配列を含むプラスミドｐＸＬ５の構造を示す図である。
【図５】 分泌型のトランスメンブランドメインを欠落したＲＳＶ Ｇタンパク質をコー
ドする遺伝子を含んでおりＣＭＶイントロンＡ並びにヒト組織プラスミノーゲン
活性化因子（ＴＰＡ）のシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む
プラスミドｐＸＬ６の構造を示す図である。
ドする遺伝子を含んでおりＣＭＶイントロンＡ並びにヒト組織プラスミノーゲン
活性化因子（ＴＰＡ）のシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む
プラスミドｐＸＬ６の構造を示す図である。
【図６】 プラスミドＶＲ−１０１２のヌクレオチド配列（配列番号：５）を示す図であ
る。
る。
【図７】 ５’の非翻訳領域およびヒト組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）のシ
グナルペプチドのヌクレオチド配列（配列番号：６）を示す図である。
グナルペプチドのヌクレオチド配列（配列番号：６）を示す図である。
【図８】 ＲＳＶ感染後のＤＮＡ免疫マウスにおける肺のサイトカイン発現特性を示す図
である。
である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ， ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，Ｌ Ｖ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ， ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，Ｕ Ｓ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 サンバーラ、 サーヤプラケッシュ カナダ国 エル３エス １ワイ１ オンタ リオ州 マークハム ハーネス サークル 50 (72)発明者 クレイン、 ミッシェル、 エイチ カナダ国 エム２ピー １ビー９ オンタ リオ州 ウィロウダール ムンロ ブール ヴァード 16
Claims (48)
- 【請求項１】 呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）Ｇタンパク質に対する防御
抗体を宿主において産生するため、宿主にｉｎ ｖｉｖｏ投与する免疫原性の組
成物であって、非複製ベクターを含み、 ＲＳＶ Ｇタンパク質またはＲＳＶ Ｇタンパク質と特異的に反応する抗体を
産生するＲＳＶ Ｇタンパク質フラグメントをコードする第１のヌクレオチド配
列、 宿主において前記ＲＳＶ Ｇタンパク質を発現するために前記第１のヌクレオ
チド配列と動作可能に結合されるプロモーター配列、および 前記第１のヌクレオチド配列と前記プロモーター配列との間に位置し、宿主に
おいて前記ベクターからのｉｎ ｖｉｖｏにおける前記ＲＳＶ Ｇタンパク質の
発現を促進させるための第２のヌクレオチド配列、および 薬剤用に許容可能な坦体を含む組成物。 - 【請求項２】 前記第１のヌクレオチド配列が標準の長さのＲＳＶ Ｇタン
パク質をコードする請求項１に記載の組成物。 - 【請求項３】 前記ヌクレオチド配列が図２に示されるヌクレオチド配列（
配列番号１）を含む請求項２に記載の組成物。 - 【請求項４】 前記第１のヌクレオチド配列が図２に示されるアミノ酸配列
（配列番号２）を有する標準の長さのＲＳＶ Ｇタンパク質をコードするヌクレ
オチド配列を含む請求項２に記載の組成物。 - 【請求項５】 前記第１のヌクレオチド配列が、トランスメンブランコード
配列およびその上流の配列を欠くＲＳＶ Ｇタンパク質をコードする請求項１に
記載の組成物。 - 【請求項６】 前記非複製ベクターがさらに、前記第１のヌクレオチド配列
の５’末端の直ぐ上流のヌクレオチド配列をコードする異種のシグナルペプチド
を含む請求項５に記載の組成物。 - 【請求項７】 配列をコードする前記シグナルペプチドがヒト組織プラスミ
ノーゲン活性化因子をコードする請求項６に記載の組成物。 - 【請求項８】 前記第１のヌクレオチド配列が図３に示されるヌクレオチド
配列（配列番号３）を含む請求項５に記載の組成物。 - 【請求項９】 前記第１のヌクレオチド配列が図３に示されるアミノ酸配列
（配列番号４）を有する切断されたＲＳＶ Ｇタンパク質をコードするヌクレオ
チド配列を含む請求項５に記載の組成物。 - 【請求項１０】 前記プロモーター配列が極初期サイトメガロウイルスプロ
モーターである請求項１に記載の組成物。 - 【請求項１１】 前記第２のヌクレオチド配列がヒトサイトメガロウイルス
イントロンＡである請求項１に記載の組成物。 - 【請求項１２】 非複製ベクターがプラスミドベクターである請求項１に記
載の組成物。 - 【請求項１３】 プラスミドベクターが図４に示されるｐＸＬ５である請求
項１２に記載の組成物。 - 【請求項１４】 プラスミドベクターが図５に示されるｐＸＬ６である請求
項１２に記載の組成物。 - 【請求項１５】 呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）に感染することによる疾
患に対し宿主を免疫化するための方法であって、有効量の非複製ベクターを宿主
に投与することを含み、非複製ベクターが、 ＲＳＶ Ｇタンパク質またはＲＳＶ Ｇタンパク質と特異的に反応する抗体を
産生するＲＳＶ Ｇタンパク質フラグメントをコードする第１のヌクレオチド配
列、 宿主において前記ＲＳＶ Ｇタンパク質を発現するために前記第１のヌクレオ
チド配列と動作可能に結合されるプロモーター配列、および 前記第１のヌクレオチド配列と前記プロモーター配列との間に位置し、宿主に
おいて前記ベクターからのｉｎ ｖｉｖｏにおける前記ＲＳＶ Ｇタンパク質の
発現を促進させるための第２のヌクレオチド配列を含む方法。 - 【請求項１６】 前記第１のヌクレオチド配列が標準の長さのＲＳＶ Ｇタ
ンパク質をコードする請求項１５に記載の方法。 - 【請求項１７】 前記ヌクレオチド配列が図２に示されるヌクレオチド配列
（配列番号１）を含む請求項１６に記載の方法。 - 【請求項１８】 前記第１のヌクレオチド配列が図２に示される標準の長さ
のＲＳＶ Ｇタンパク質（配列番号２）をコードするヌクレオチド配列を含む請
求項１６に記載の方法。 - 【請求項１９】 前記第１のヌクレオチド配列が、トランスメンブランコー
ド配列およびその上流の配列を欠くＲＳＶ Ｇタンパク質をコードする請求項１
４に記載の方法。 - 【請求項２０】 前記非複製ベクターがさらに、前記第１のヌクレオチド配
列の５’末端の直ぐ上流のヌクレオチド配列をコードする異種のシグナルペプチ
ドを含む請求項１９に記載の方法。 - 【請求項２１】 配列をコードする前記シグナルペプチドがヒト組織プラス
ミノーゲン活性化因子に対するシグナルペプチドをコードする請求項２０に記載
の方法。 - 【請求項２２】 前記第１のヌクレオチド配列が図３に示されるヌクレオチ
ド配列（配列番号３）を含む請求項１９に記載の方法。 - 【請求項２３】 前記第１のヌクレオチド配列が図３に示される横断ＲＳＶ
Ｇタンパク質（配列番号４）をコードするヌクレオチド配列を含む請求項１９
に記載の方法。 - 【請求項２４】 前記プロモーター配列が極初期サイトメガロウイルスプロ
モーターである請求項１５に記載の方法。 - 【請求項２５】 前記第２のヌクレオチド配列がヒトサイトメガロウイルス
イントロンＡである請求項１５に記載の方法。 - 【請求項２６】 非複製ベクターがプラスミドベクターである請求項１に記
載の方法。 - 【請求項２７】 前記プラスミドベクターが図４に示されるｐＸＬ５である
請求項２６に記載の組成物。 - 【請求項２８】 前記ベクターが図５に示されるｐＸＬ６である請求項２６
に記載の組成物。 - 【請求項２９】 均衡のとれたＴｈ１／Ｔｈ２免疫応答が誘発される請求項
１５に記載の方法。 - 【請求項３０】 呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）Ｇタンパク質またはＲＳ
Ｖ Ｇタンパク質と特異的に反応する抗体を産生するＲＳＶ Ｇタンパク質フラ
グメントをコードする遺伝子を用い、宿主において免疫応答を生じさせる方法で
あって、 前記遺伝子を単離するステップと、 前記遺伝子を、少なくとも１つのコントロール配列に動作可能に結合させ、非
複製ベクターを生成させるステップであって、前記コントロール配列が、宿主に
導入されたときに前記ＲＳＶ Ｇタンパク質の発現を誘導し、前記ＲＳＶ Ｇタ
ンパク質に対する免疫応答を生じさせるステップと、 前記ベクターを宿主に導入するステップとを含む方法。 - 【請求項３１】 ＲＳＶ Ｇタンパク質をコードする前記遺伝子が標準の長
さのＲＳＶ Ｇタンパク質をコードする請求項３０に記載の方法。 - 【請求項３２】 ＲＳＶ Ｇタンパク質をコードする前記遺伝子が、トラン
スメンブランドメインおよびその上流の配列を欠くＲＳＶ Ｇタンパク質をコー
ドする請求項３０に記載の方法。 - 【請求項３３】 前記ベクターがさらに、前記第１のヌクレオチド配列の５
’末端の直ぐ上流のヌクレオチド配列をコードするシグナルペプチドを含む請求
項３２に記載の方法。 - 【請求項３４】 配列をコードする前記シグナルペプチドがヒト組織プラス
ミノーゲン活性化因子に対するシグナルペプチドをコードする請求項３３に記載
の方法。 - 【請求項３５】 前記の少なくとも１つのコントロール配列が極初期サイト
メガロウイルスプロモーターである請求項３０に記載の方法。 - 【請求項３６】 前記遺伝子を、免疫防御を亢進する配列に動作可能に結合
させ、前記宿主において前記ＲＳＶ Ｇタンパク質に対する免疫防御の亢進を生
み出すステップを含む請求項３５に記載の方法。 - 【請求項３７】 免疫防御を亢進する前記配列が、前記コントロール配列と
前記遺伝子の間の前記ベクターに導入される請求項３６に記載の方法。 - 【請求項３８】 免疫防御を亢進する前記配列が、ヒトサイトメガロウイル
スイントロンＡである請求項３７に記載の方法。 - 【請求項３９】 前記遺伝子がｐＸＬ５およびｐＸＬ６からなる群から選択
されるプラスミド内に含まれる請求項３０に記載の方法。 - 【請求項４０】 呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）の感染による疾患に対し
宿主を防御するためのワクチンを製造する方法であって、 ＲＳＶ Ｇタンパク質またはＲＳＶ Ｇタンパク質と特異的に反応する抗体を
産生するＲＳＶ Ｇタンパク質フラグメントをコードする第１のヌクレオチド配
列を単離するステップと、 前記第１のヌクレオチド配列を少なくとも１つのコントロール配列に動作可能
に結合させ、非複製ベクターを生成させるステップであって、コントロール配列
が宿主に導入されたときに前記ＲＳＶ Ｇタンパク質の発現を誘導し、前記ＲＳ
Ｖ Ｇタンパク質に対する免疫応答を生じさせるステップと、 前記第１のヌクレオチド配列を第２のヌクレオチド配列に動作可能に結合させ
、宿主においてベクターからｉｎ ｖｉｖｏにおける前記ＲＳＶ Ｇタンパク質
の発現を促進させるステップと、 前記ベクターを、宿主にｉｎ ｖｉｖｏ投与するためのワクチンとして製剤化
するステップとを含む方法。 - 【請求項４１】 前記ベクターがｐＸＬ５およびｐＸＬ６からなる群から選
択される請求項４０に記載の方法。 - 【請求項４２】 請求項４０に記載の方法によって製造されるワクチン。
- 【請求項４３】 試料中の呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）Ｇタンパク質の
存在を測定する方法であって、 （ａ）宿主を非複製ベクターで免疫し、ＲＳＶ Ｇタンパク質に特異的な抗体
を産生させるステップであって、前記非複製ベクターが、 ＲＳＶ Ｇタンパク質またはＲＳＶ Ｇタンパク質と特異的に反応する抗体を
産生するＲＳＶ Ｇタンパク質フラグメントをコードする第１のヌクレオチド配
列、 宿主における前記ＲＳＶ Ｇタンパク質の発現のために前記第１のヌクレオチ
ド配列と動作可能に結合されたプロモーター配列、および 前記第１のヌクレオチド配列と前記プロモーター配列との間に位置し、宿主に
おいて前記ベクターからのｉｎ ｖｉｖｏにおける前記ＲＳＶ Ｇタンパク質の
発現を促進させる第２のヌクレオチド配列を含むステップと、 （ｂ）ＲＳＶ Ｇタンパク質特異的抗体を単離するステップと、 （ｃ）試料を、単離された抗体と接触させ、試料中に存在する任意のＲＳＶ
Ｇタンパク質および前記単離されたＲＳＶ Ｇタンパク質特異的抗体を含む複合
体を生成させるステップと、 （ｄ）複合体の生成を測定するステップとを含む方法。 - 【請求項４４】 前記ベクターがｐＸＬ５およびｐＸＬ６からなる群から選
択される請求項４３に記載の方法。 - 【請求項４５】 試料中の呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）Ｇタンパク質の
存在を検出するための診断キットであって、 （ａ）宿主に投与されたときにＲＳＶ Ｇタンパク質に特異的な抗体を産生す
る能力を有する非複製ベクターであって、非複製ベクターが、 ＲＳＶ Ｇタンパク質またはＲＳＶ Ｇタンパク質と特異的に反応する抗体を
産生するＲＳＶ Ｇタンパク質フラグメントをコードする第１のヌクレオチド配
列、 宿主における前記ＲＳＶ Ｇタンパク質の発現のために前記第１のヌクレオチ
ド配列と動作可能に結合されたプロモーター配列、および 前記第１のヌクレオチド配列と前記プロモーター配列との間に位置し、宿主に
おいて前記ベクターからのｉｎ ｖｉｖｏにおける前記ＲＳＶ Ｇタンパク質の
発現を促進させるための第２のヌクレオチド配列を含み、 （ｂ）前記ＲＳＶ Ｇタンパク質特異的抗体を単離するための単離手段、 （ｃ）単離したＲＳＶ Ｇタンパク質特異的抗体と試料を接触させ、試料中に
存在する任意のＲＳＶ Ｇタンパク質およびＲＳＶ Ｇタンパク質特異的抗体を
含む複合体を生成させるための接触手段、および （ｄ）複合体の生成を測定するための確認手段とを含むキット。 - 【請求項４６】 前記ベクターがｐＸＬ５およびｐＸＬ６からなる群から選
択される請求項４５に記載の診断キット。 - 【請求項４７】 呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）のＧタンパク質に特異的
な抗体を産生させるための方法であって、 （ａ）宿主を有効量の非複製ベクターで免疫し、ＲＳＶ Ｇ特異的抗体を産生
させるステップであって、前記非複製ベクターが、 ＲＳＶ Ｇタンパク質またはＲＳＶ Ｇタンパク質と特異的に反応する抗体を
産生するＲＳＶ Ｇタンパク質フラグメントをコードする第１のヌクレオチド配
列、 宿主において前記ＲＳＶ Ｇタンパク質を発現するために前記第１のヌクレオ
チド配列と動作可能に結合されるプロモーター配列、および 前記第１のヌクレオチド配列と前記プロモーター配列との間に位置し、宿主に
おいて前記ベクターからのｉｎ ｖｉｖｏにおける前記ＲＳＶ Ｇタンパク質の
発現を促進させるための第２のヌクレオチド配列を含むステップと、 （ｂ）宿主からＲＳＶ Ｇ特異的抗体を単離するステップとを含む方法。 - 【請求項４８】 呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）のＧタンパク質に特異的
なモノクローナル抗体を産生させる方法であって、 （ａ）ＲＳＶ Ｇタンパク質またはＲＳＶ Ｇタンパク質と特異的に反応する
抗体を産生するＲＳＶ Ｇタンパク質フラグメントをコードする第１のヌクレオ
チド配列、 宿主において前記ＲＳＶ Ｇタンパク質を発現するために前記第１のヌクレオ
チド配列と動作可能に結合されるプロモーター配列、および 前記第１のヌクレオチド配列と前記プロモーター配列との間に位置し、宿主に
おいて前記ベクターからのｉｎ ｖｉｖｏにおける前記ＲＳＶ Ｇタンパク質の
発現を促進させるための第２のヌクレオチド配列を含むベクターを構成するステ
ップと、 （ｂ）少なくとも１匹のマウスにベクターを投与して、少なくとも１匹の免疫
化マウスを作るステップと、 （ｃ）少なくとも１匹の免疫化マウスからＢリンパ球を取り出すステップと、 （ｄ）少なくとも１匹の免疫化マウスから得たＢリンパ球を骨髄腫細胞と融合
させ、それによってハイブリドーマを作るステップと、 （ｅ）ハイブリドーマをクローン化するステップと、 （ｆ）抗ＲＳＶ Ｇタンパク質抗体を産生するクローンを選択するステップと
、 （ｇ）抗ＲＳＶ Ｇタンパク質抗体産生クローンを培養するステップと、 （ｈ）抗ＲＳＶ Ｇタンパク質抗体を培地から単離するステップとを含む方法
。
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