JPH07501707A - キメラ免疫原 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 １７、細菌の細胞、哺乳動物の細胞、昆虫の細胞、酵母の細胞または糸状菌の細 胞である請求項１６に記載の細胞。 １８、第１の病原体からのタンパクの抗原領域と、それにリンクした第２の病原 体からのタンパクの抗原領域とからなるキメラタンパク。 １９、第１および第２の病原体が細菌およびウィルス性病原体から選ばれる請求 項＋８に記載のタンパク。 ２０、前記の第Ｉおよび第２の病原体がウィルス性病原体であることを特徴とす る請求項Ｉ９に記載のタンパク。 ２１、前記第１および第２の病原体が各種呼吸器系疾患の病原体から選ばれるこ とを特徴とする請求項１８に記載のタンパク。 ２２、前記の各種呼吸器系疾患の第１および第２の病原体がパラモキシビリデー 系ウィルスから選ばれることを特徴とする請求項２１に記載のタンパク。 ２３、前記第１の病原体がバラインフルエンザウィルス（Ｐ　Ｉ　Ｖ）から選ば れ、前記第２の病原体が呼吸系発疹ウィルス（Ｒ３Ｖ）から選ばれることを特徴 とする請求項１８に記載のタンパク。 ２４、少なくとも１つのバラインフルエンザウィルス（Ｐ　Ｉ　Ｖ）タンパクと 、それにリンクした少なくとも１つの呼吸系発疹ウィルス（ＲＳ　Ｖ）タンパク とからなる請求項１８に記載のタンパク。 ２５−　前ＥＰ　Ｔ　Ｖ９：ｙｔ＜りがＰＩＶ−３ＦおよびＨＮタンパクから選 ばれ、前記Ｒ５ＶタンパクがＲＳＶＧおよびＦタンパクから選ばれることを特徴 とする請求項２４に記載のタンパク。 ２６、ヒトのバラインフルエンザウィルス−３（ＰＩＶ−３）ＦまたはＨＮタン パクまたはその免疫原性エピトープを含むフラグメントと、それにリンクしたヒ トの呼吸系発疹ウィルス（Ｒ５Ｖ）ＧまたはＦタンパクまたはその免疫原性エピ トープを含むフラグメントとからなる請求項１８に記載のタンパク。 ２７、Ｆ　ＰＩＶ−３−Ｆ　Ｒ５Ｖ＋Ｆ　Ｒ５Ｖ　−ＨＮ　ＰＩＶ−３およびＦ ＰＩＶ−３−ＧＲ５Ｖキメラタンパクから選ばれる請求項２６に記載のタンパク 。 ２８、第１の病原体からのタンパクの抗原性領域をコード化している遺伝子配列 を単離し、 第２の病原体からのタンパクの抗原領域をコード化している遺伝子配列を単離し 、 前記の遺伝子配列をリンクさせてマルチマーハイブリッド遺伝子を形成させ、 細胞表現系中にマルチマーハイブリッド遺伝子を表現させることからなるキメラ タンパクの製造法。 ２９、前記マルチマーハイブリッド遺伝子がヒトのＲ５Ｖ　ＧまたはＦタンパク またはそのエピトープを含むフラグメントをコード化している遺伝子配列にリン クしたｐｔｖ−ｐまたはＩＩ　Ｎタンパクまたはその免疫原性エピトープを含む フラグメントをコード化している遺伝子配列からなることを特徴とする請求項２ ８に記載の方法。 ３０、マルチマーハイブリッド遺伝子がＦＰＩＶ−３−ＦＲ５Ｖ＋Ｆ　Ｒ５Ｖ　 −ＨＮ　ＰＩＶ−３およびＦ　ＰＩＶ−３−Ｇ　ＲＳＶハイブリッド遺伝子から 選ばれることを特徴とする請求項２９に記載の方法。 ３１、前記のマルチマーハイブリッド遺伝子がｐＡＣＱＲ７、ｐＤ２　１ミＦ− 夏ＩＮまたはｐ　Ｉ）　２　Ｆ　−Ｇプラスミツドを含む表現ベクター中に含ま れることを特徴とする請求項２９に記載の方法。 ３２、前記細胞表現系が細菌の細胞、哺乳動物の細胞、昆虫の細胞、酵母の細胞 または糸状面の細胞により提供されることを特徴とする請求項２８に記載の方法 。 ３３、前記の細胞表現系の培養培地からキメラタンパクを分離し、分離したキメ ラタンパクを精製することを含む請求項３２に記載の方法。 ３４、請求項１に記載の遺伝子を含む抗原運搬用土ベクター。 ３５、ウィルス系ベクターである請求項３４に記載の３６、前記のウィルス系ベ クターがポックスウィルス、アデノウィルスおよびレトロウィルス系ベクターか ら選ばれることを特徴とする請求項３５に記載の生ベクター。 ３７．１／ａｍベクターである請求項３４に記載の生ベクター。 ３８、前記のＳ＋＊ベクターがサルモネラおよびミーバクテリアから選ばれるこ とを特徴とする請求項３７に記載の生ベクター。 ３９、第１の病原体からのタンパクの抗原領域およびそれにリンクした第２の病 原体からのタンパクの抗原領域を含むキメラタンパクと、生理学的に許容される 担体とからなる複合感染疾病用ワクチン。 ４０、前記の第１および第２の病原体がｍ閑およびウィルス性病原体から選ばれ ることを特徴とする請求項３９に記載のワクチン。 ４１、さらに少なくとも１つの別の免疫原性および／または免疫刺激性分子を含 むことを特徴とする請求項３９に記載のワクチン。 ４２、前記の第１および第２の病原体がウィルス性病原体であることを特徴とす る請求項４ｏに記載のワクチン。 ４３、前記の第１および第２の病原体が浅部および深部の呼吸器系疾患を起こす 病原体から選ばれることを特徴とする請求項３９に記載のワクチン。 ４４、前記の第１の病原体がパラインフルエンザウィルス（Ｐ　Ｉ　Ｖ）であり 、前記第２の病原体が呼吸系発疹ウィルス（ＲＳ　Ｖ）であることを特徴とする 請求項３９に記載のワクチン。 ４５、ＰＩＶタンパクからなる少なくとも１つのセグメントまたはその免疫原性 エピトープを含むフラグメントとそれにリンクしたＲ３Ｖタンパクの少なくとも １つのセグメントまたはその免疫原性エピトープを含むフラグメントを含む組換 えマルチマータンパクと、その担体とからなるパラインフルエンザウィルス（Ｐ ＩＶ）および呼吸系発疹ウィルス（Ｒ３Ｖ）＠染に対するの請求項３９に記載の ワクチン。 ４６、前記組換えマルチマータンパクがＩ）　Ｉ　Ｖ　−３ＦまたはＨＮタンパ クを含むセグメントまたはその免疫原性エピトープを含むフラグメントとそれに リンクしたＲ３Ｖ　ＧまたはＦタンパクを含むフラグメントまたはその免疫原性 エピトープを含むフラグメントを含む組換えキメラタンパクであることを特徴と する請求項４５に記載のワクチン。 ４７、別のＰＩＶまたはＲ５Ｖまたはそのキメラタンパクを少なくとも１つ含む 請求項４６に記載のワクチン。 ４８、前記の担体がアジユバントからなることを特徴とする請求項３９に記載の ワクチン。 ４９、前記の担体がｌＳＣ０Ｍ、リポソームまたは微粒子であることを特徴とす る請求項３９に記載のワクチン。 ５０、注射、鼻腔投与、または経口投与用に製剤化された請求項４６に記載のワ クチン。 ５１、さらに前記のマルチマータンパクを特に免疫系細胞に運搬する手段を有す る請求項３９に記載のワクチン。 ５２、前記の運搬手段が毒物分子または抗体からなることを特徴とする請求項５ １に記載のワクチン。 ５３、請求項３４に記載の生ベクターと、生理学的に許容されるその担体とから なり、多くの病原体の複合感染による疾病に対するワクチン。 ５４、請求項２８または５３に記載のワクチンの有効量を宿主に投与することか らなる、複合感染による疾病に対して宿主を免疫化する方法。 ５５、前記のワクチンがバラインフルエンザウィルス（Ｐ　Ｉ　Ｖ）および呼吸 系発疹ウィルス（ＲＳ　Ｖ）により起こる疾病を防護するためのものであること を特徴とする請求項５４に記載の方法。 ５６、前記の宿主が乳幼児、小児、妊婦、出産齢の婦人および感受性の高い個人 から選ばれることを特徴とする請求項５５に記載の方法。 ５７、請求項１８に記載のキメラタンパクからなり、宿主における各種病原体に よる感染を検出する方法。 ５８、請求項１８に記載の前記のキメラタンパクを使用することからなり、宿主 における各種病原体の感染を検出する方法。 明　細　書 キメラ免疫原 技術分野 本発明は、多くの病原体の免疫原タンパクまたはタンパクフラグメントをコード 化した遺伝子からの配列を含むマルチマーハイブリッド遺伝子の遺伝子工学およ び表現に関する。 発明の背景 本発明におけるアプローチの長所は、広い範囲の病原体から、防御抗体を含む単 一免疫原を製造することである。このようなキメラは、特に究極的に単回投与多 価ワクチンを製造することを目的とした混合ワクチンの開発を著しく単純化する 。現在、多価ワクチンは病原体またはその抗体を個別に生産し、それらを混合し て製剤化することによって製造されているため、手間がかかり、＝ストが高く、 製造工程が複雑化する。 それに対して、広い範囲の病気に対して防御効果のある単一免疫原が得られると 、多価ワクチンの製造に関連する多くの問題を解決することができる。ここに提 供するいくつかのキメラ免疫原は、それらを混合することによって、多価ワクチ ンに要求される各抗原の数を減らすことができる。 ヒトのバラインフルエンザウィルス（１）ＩＶ）Ｉ、２．３型ならびに呼吸系発 疹ウィルス（Ｒ３Ｖ）ＡおよびＢは、乳幼児および小児における重度な呼吸器系 感染な引き起こす主要なウィルス性病孔体である。米国だけでも、　１歳未満の 乳幼児約１６０万人が毎年臨床的に顕著なＲ３Ｖ感染に罹り、さらに１４０万人 の乳幼児がＰＩＶ−３に感染している。米国では、毎年Ｒ３ＶおよびＰＩＶ−３ の感染による重度の呼吸器系疾患の併発によって、　１歳未満の乳幼児約４００ ０人が死亡している。ＷＨＯならびにＮＩＡＬＤワクチン諮問委員会は、ワクチ ンの開発においてＨＩＶについで重要な対象にあげ、ＰＩＶ−３に有効なワクチ ン調製物をワクチン開発順位のトップテンにあげている。 現在のところ、乳幼児のこれらのウィルスに対する感染に有効で、かつ安全なワ クチンはなく、緊急に必要とされている。ホルムアルデヒド処理ウィルスワクチ ンや希釈生ウイルスワクチンは、これらのウィルス感染に対する防御ワクチンと しての効果が必ずしも十分ではないことが臨床的に確認されている。例えば、ホ ルマリン処理Ｒ５Ｖワクチンを投与した乳幼児は、その後Ｒ３Ｖに自然感染する と対照群と比較して一層重度な深部呼吸器系疾患を発症する（Ａｍ、Ｊ、Ｅｐｉ ｄｅｍｉｏｌｏｇ）’　８９．　１９６９．４０５−４２１頁；Ｊ、Ｉｎｆ、Ｄ ｉｓ、１４５．１９８２，３ＩＩ−３１９頁）。さらに、免疫アフィニティーク ロマトグラフィーを用い、酸性溶媒で溶出して精製したＲ３Ｖ糖タンパクは、ｃ ｏｔｌｏｎ　ｒａｔｓにおいて免疫増強を誘導する（Ｖａｃｃ　ｉｎｅ、１０　 （７）＋１９９２．４７５−４８４頁）、有効で、かつワクチン投与後針性型ウ ィルスを注射しても重度な呼吸器系疾患が現われないＰＩＶ−３およびＲ５Ｖワ クチンの開発は、医療上大きな意義がある。バラインフルエンザウィルスおよび 呼吸系発疹ウィルスの混合感染による疾病に対して、乳幼児を同時に防護するこ とのできる遺伝子組換え単一免疫原を開発することによって、これらのウィルス の感染によって起こる重度の疾病および死亡を著しく低減することができる。 ＰＩＶ−３およびＲ３Ｖに対する防御反応は、主要なウィルス表面糖タンパクに 対する中和抗体の誘導によると報告されている。ＰＩＶの場合、これらの防護免 疫原は、７２ｋＤａの分子量を有し、紐球凝集反応およびノイラミニターゼ活性 を有するＨ　Ｎタンパク、ならびに分子量が６５ｋＤａで、宿主細胞膜に対する ウィルスの融合およびウィルスの細胞間伝搬に関与する溶融（Ｆ）タンパクであ る。Ｒ３Ｖの場合、この２種類の主要な免疫原タンパクは８０〜９０ｋＤＡのＧ 糖タンパクおよび７０ｋＤＡの溶融（Ｆ）タンパクである。ＧおよびＦタンパク は、それぞれＰＩＶのＩ　ＮおよびＦタンパクに対して機能的に相同であると考 えられている。ＰＩＶおよびＲ５ＶのＦ糖タンパクは不活性前駆体（ＦＯ）とし て合成し、それをタンパク分解酵素によりジスルフィド結合を有するＮ−末端Ｆ ２およびＣ−末端ＰＩフラグメントに分解する。 組換え株のＰＩｖおよびＲ３Ｖからの表面軸タンパクは、それぞれ杆状ウィルス を用いて昆虫の細胞［Ｒａｙら（１９８９）、Ｖｉｒｕｓ　Ｒｅａｓｅａｒｃｈ 、　＋２：　１６９−１８０；Ｃｏｅ　ｌ　ｉｎｇｈら（１９８７）、Ｖｉｒｏ ｌｏｇｙ、＋６０：４６５−４７２；Ｗａｌｈｅｎら１９８９）、Ｊ、ｏｆ　ｆ ｎｆ、Ｄｉｓ、１５９：２５３−２６３］ならびに組換えポックスウィルスに感 染した哺乳動物細胞Ｃ３ｐｒｉｇｇｓら（＋９８７）、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、６１： ３４１６−３４２３；５ｔｏｔｌら（＋９８７）、Ｊ。 Ｖｉｒｏｌ、６１：３８５５　３８６１］に表現されている。これらの系で生産 された組換え抗原は、コツトンラットに免疫投与すると生ウィルスの人工感染に 対して防御効果のあることが知られている。最近、ハイブリッドＲ５Ｖ　Ｆ−Ｇ 　［Ｗａ　ｔｈｅｎら（１９８９）、Ｊ、Ｇｅｎ、Ｖｉｒｏｌ、７０；２６２５ −２６３５；Ｗａ＋ｈｅｎ、国際特許公報ＷＯ８９１０５８２３］およびＰＩＶ −３Ｆ−ＨＮ　［Ｗａｌｈｅｎ９国際特許公報Ｗ０　８９／１０４（＋５］組換 え抗原が哺乳動物および昆虫の細胞で製造されている。Ｒ３ＶＦ−Ｇハイブリッ ド抗原は弱い抗Ｇ抗体反応しか示さない［Ｃｏｎｎｏｒｓら（１９９２）、Ｖａ ｃｃｉｎｅｌｏ：４７５−４８４］　が、　ｃｏｔｔｏｎｒａｔＳにおいて防御 効果があることが知られている［Ｗａｔｈｅｎ　ら　（１９８９）、　Ｊ、　Ｇ ｅｎ、　Ｖｉｒｏｌ、７０：２６３７−２６４４１．ＰＩＶ−３Ｆ−ＨＮタンパ クの防御作用については、公開された出願特許で報告されていない、これらの抗 原は、相同ウィルス、すなわちＲ３ＶまたはＰＩＶ−３のいずれかのみに対する 防御を目的として遺伝子組換えが行なわれている。しかし、ＰＩＶおよびＲ３Ｖ から少なくとも１つの防御抗原を含む組換え単一免疫原を遺伝子工学的に調製し 、製造できると、各ウィルス感染から乳幼児および小児を同時に防御できるため 有利であり。 経済的である。このような目的でここに提供されたキメラタンパクは、ＰＩＶお よびＲ３Ｖに対する母体抗体を刺激するために、妊婦または出産齢の婦人にも適 用することができる。さらに、当該ワクチンはその他老人等の感受性の高い個人 にも投与することができる。 発明の概要 本発明は、その広い側面において、第！の病原体からのタンパクの抗原領域をコ ード化した遺伝子配列と、それにリンクした第２の病原体からのタンパクの抗原 領域をコード化した遺伝子配列を有するマルチマーハイブリッド遺伝Ｔ−および これらマルチマーハイブリッド遺伝子によりコード化されたキメラタンパクを提 供するものである。これらキメラタンパクは、第１の病原体からのタンパクの抗 原領域と、それにリンクした第２の病原体からのタンパクの抗原領域を有する。 一般に第１および第２の病原体はｍｍ性またはウィルス性の病原体から選ぶが、 実施例によっては両者ともウィルス性の病原体であってもよい。好ましくは、第 １および第２の病原体は異なった呼吸器疾患、すなわち浅部および深部呼吸音疾 患を起こす病原体から選んでもよい、好ましい実施例において、第１の病原体は パラインフルエンザウィルスであり、第２の病原体は呼吸系発疹ウィルスである 。特にＰＩＶタンパクはＰＩＶ−３ＦおよびＨＮタンパクから選び、Ｒ３Ｖタン パクは特にＲ３Ｖ　ＧおよびＦタンパクから選ぶ。 本発明の別の側面は、前記遺伝子によりコード化されたキメラタンパクを表現す るマルチマーハイブリッド遺伝子を含む細胞を提供するものである。前記の細胞 は、細菌の細胞、哺乳動物の細胞、昆虫の細胞、ＷＩ母の細胞または糸状菌の細 胞であってもよい。さらに、本発明はマルチマーハイブリッド遺伝子を含む抗原 を運搬するために生きたベクターを提供する。このベクターはウィルスベクター または細菌へクダーであってもよく、それらの生理学的に許容される担体であっ てもよい。前記の生きたヘクターは、複合感染により起こる疾患に対するワクチ ンの活性成分を構成してもよい、前記のワクチンは、注射、吸入または経口投与 用に製剤化することができる。 本発明の別の側面は、第１の病原体からのタンパクの抗原領域をニード化した遺 伝子配列の単離、第２の病原体からのタンパクの抗原領域をコード化した遺伝子 配列の１Ｍ、前記の各遺伝子配列をリンクさせることによるマルチマーハイブリ ッド遺伝子の形成、および細胞表現系におけるマルチマーハイブリッド遺伝子の 表現から成るキメラタンパクの調製法を提供するものである。前記の細胞表現系 は、ａｍの細胞、哺乳動物の細胞、昆虫の細胞、酵母の細胞または糸状菌の細胞 によって提供される。遺伝子表現のキメラタンパク産物を、細胞表現系の培地か ら分離し、精製する。 さらに、本発明は複合感染により起こる疾患に対するワクチンで季って、マルチ マーハイブリッド遺伝子によりコード化されたキメラタンパクと生理学的に許容 されるその担体とから成るワクチンを含む、前記のワクチンは注射、吸入または 経口投与用に製剤化することができる。 本発明で提供するワクチンは、複合感染、特にバラインフルエンザウィルスおよ び呼吸系発疹ウィルスにより起こる疾患に対する宿主の免疫賦午を目的として、 前記ワクチンの有効級を投手することによって使用される、前記のように、ヒト のＰＩＶおよびＲ３Ｖの場合、宿主は乳幼児および小児、妊婦ならびに出産齢の 婦人、および老人等の感受性の高い個人である。 本発明で提供するキメラタンパクは、適当な検定手順を用いて、宿主における各 種病原体による感染を検出するための診断試薬として使用することもできる。 本発明は主としてＰＩｖおよびＲ３Ｖの感染により起こる疾患に対する免疫獲得 に有効なキメラタンパクについて記載するが、ここに提供する発明は単一分子中 にリンクした各病原体からの抗原を有し、多くの病原体によって起こる疾患に対 する免疫獲得に有効なキメラタンパク、ならびに前記キメラタンパクをコード化 した遺伝子を包含するものである。 本発明において、　「マルチマーハイブリッド遺伝子Ｊとは各種の病原体からの タンパクの抗原領域をコード化した遺伝子を意味し、　［キメラタンパク」とは 各種病原体からのタンパクの抗原領域を有する免疫原を意味する。 図面の簡単な説明 図１は、それぞれＰＣＲ増幅Ｉ’１Ｖ−３１？遺伝子およびＦタンパクのヌクレ オチド配列（Ｓ　［Ｅ　Ｑ　Ｉ　ＤＮｏ、ｌ）およびアミノ酸配列（Ｓ［ＥＱ　 ＩＤ　Ｎｏ、２）を示す。 図２は、ＰＩＶ−３Ｆ遺伝子の制限マツプを示す。 図３は、それぞれＰＩＶ−３ＨＮ遺伝子および■（Ｎタンパクのヌクレオチド配 列（ＳＢｏ　１０　Ｎｏ。 ３）およびアミノ酸配列（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、４）を示す。 図４は、ＰＩＶ−３ＨＮ遺伝子の制限マツプを示す。 図５は、それぞれＲ５Ｖ　Ｆ遺伝子およびＲ３ＶＦタンパクのヌクレオチド配列 （ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ。 ５）およびアミノ酸配列（ＳＥＱ　ＴＤ　Ｎｏ、６）を示す。 図６は、Ｒ３Ｖ　Ｆ遺伝子の制限マツプな示す。 図７は、それぞれＲ３Ｖ　Ｇ遺伝子およびＲ３ＶＧタンパクのヌクレオチド配列 （ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ。 ７）およびアミノ酸配列（ＳＥＱ　１０　Ｎｏ、８）を示す。 図８は、Ｒ３Ｖ　Ｇ遺伝子の制限マツプを示す。 図９は、Ｆ　Ｐｌｖ−３−Ｆ　Ｒ５Ｖキメラ遺伝子を含む表現ベクターの構築工 程を示す。 図１０は、５゛非非翻訳列、膜内外アンカーおよび細胞質テールコード領域を欠 ＜　Ｆ　ＰＩＶ−３遺伝子を含む表現ベクターの構築工程を示す。 図１１は、　トランケートＲ５Ｖ　Ｆａｌｌ伝子にリンクした５°非非翻訳列を 欠くトランケート１）ＩＶ−３Ｆ遺伝子を含むＦ　ＰＩＶ−３−Ｆ　Ｒ５Ｖキメ ラ遺伝子を含む表現ベクターの構築り程を示す。 図１２は、　トランケートＲ５Ｖ　Ｆｌ遺伝子にリンクした５゛非非翻訳列なら びに膜内外および細胞質テールコード領域を欠＜ＰＩＶ−３Ｆ遺伝子を含むＦＰ ＩＶ−３−Ｆ　Ｒ５Ｖキメラ遺伝子を含む修飾ｏＡＣ６ＩＯバクロウィルス表現 ベクターの構築工程を示す。 図１３は、組換えバクロウィルスに感染したＳ（９細胞からの細胞溶解物の免疫 プロットを示す。 図１４は、バクロウィルス転移ベクターの構築工程を示す。 図１５は、　Ｆ　Ｒ５ｖ−ＨＮ　ＰＩＶ−３キメラ遺伝子の構築工程を示す。 図１６は、梢ＨＦ　Ｒ５Ｖ　−ＨＮ　ＰＩＶ−３キメラタンパクの５ＤＳ−ＰＡ ＧＥゲルおよび免疫プロットを示す。 図１７は、ＰＩＶ−３Ｆ遺伝子の突然変異を説明する図である６ 図１８は、Ｆ　ＰＩＶ−３およびＧＲ５Ｖキメラ遺伝ｆ遺伝溝築工程を示す。 発明の詳細な説明 本発明において、２種類の主要幼児疾患に対して防御作用を有するキメラ分りを 提供する。本発明は、特にＰＩＶおよびＩ？　Ｓ　Ｖの感染により起こる疾患に 対して乳幼児および小児ならびにその他の感受性の高い個人を防護することので きる安全で、かつ有効なワタチンを製造するための各種組換えバラインフルエン ザウィルス（Ｐ　Ｉ　Ｖ）　／呼吸系発疹ウィルス免疫原の製剤に関する。しか し、前記のように、本発明は多くの病原体からの防護抗体をコード化した遺伝子 を含むマルチマーハイブリッド遺伝子の構築を包含する。前記ワクチンは、注射 用ワクチン、吸入または経口投与等必要とするあらゆる方法で投与することがで きる。 本発明において、発明者らは特にタンデムにリンクしたＰＩＶ−３およびＲ５Ｖ 表面糖タンパクをブード化した特定の遺伝子からの相当する配列を含むいくつか のＰＩＶ／Ｒ３Ｖキメラ遺伝子モデルを遺伝子工学的に構築した。ここに記載さ れたキメラ構造における遺伝子は、いずれも最近臨床的に単離したＰＩＶ−３お よびＲ３Ｖから得たものである。前記のキメラ遺伝子は、考えられるあらゆる相 対的方位および組合せで、Ｒ３Ｖ　ＦまたはＧ遺伝子−のいずれかにタンデムに リンクしたＰＩＶ−３ＦまたはＩ　Ｎ遺伝子のいずれかからの遺伝子配列を含む ことができる。 本発明で提供するキメラ遺伝子構造は、完全な遺伝子配列またはその免疫原およ び防護エピトープをコード化した遺伝Ｌセグメントから成る。これら遺伝子の天 然ヌクレオチド配列は抗原性を保持させながら突然変異により修飾してもよい。 このような修飾には、真核細胞におけるその表現を最大限発揮させることを目的 とした、推定上の前転写ターミネターの除去も含まれる。前記の遺伝子は、バラ インフルエンザウィルスる遺伝子産物を生成するため、単一構造にタンデムにリ ンクしたハイブリッドＰＩＶ−Ｒ３Ｖ表面糖タンパクをコード化するように設計 されている。このようなマルチマーハイブリッド遺伝子は、ヒトのＲ３Ｖ　Ｇま たはＦタンパクまたは免疫原エピトープを含むそのフラグメントをコード化した 遺伝子配列にリンクしたヒトのＰＩＶ−３ＦまたはＨＮタンパクまたは免疫原エ ピトープを含むそのフラグメントをコード化した遺伝子配列から成る。使用でき る遺伝子産物の具体例は、Ｆ　ＰＩＶ−３−Ｆ　Ｒ５Ｖ、Ｆ　Ｒ５Ｖ　−ＨＮ　 ＰＩＶ−３およびＰＰＩＶ−３−Ｇ　Ｒ３Ｖハイブリッド遺伝子である。 さらに、本発明はその他のマルチマー遺伝子、例えば考えられる全ての相対的方 位にリンクしたＰＩＶおよびＲ５Ｖｉ伝子または遺伝子セググメントを含むトリ マー遺伝子の構造も包含する０例えば、Ｆｐ＋ｖ　１ＩＮｐ＋ｖ　ＦまたはＧ＊ ｓｖＦ　ＰＩＶ　Ｆ　＊ａｖ　−Ｇ　ｌ１ＩＩＩＶＨＮ　ＦＩＶ　Ｆ　Ｒ８１１ １Ｇ　＊ｓｖ本発明で提供するマルチマー遺伝子は、少なくとも１つの免疫原性 または免疫刺激性分子をコード化した少なくとも１つの遺伝子−から成っていて もよい。 本発明で提供するマルチマーハイブリッド遺伝子は、細胞表現系に表現するため に適当なベクター中にサブクーロン化されていてもよい、前記の細胞表現系は細 菌、哺乳動物、昆虫、酵母等の糸状菌の細胞を包含する。 本発明で提供するキメラタンパクは、組換えポックスウィルス、アデノウィルス 、レトロウィルス、セムリキ　フォレスト　ウィルス等の生きたウィルスベクタ ーおよびサルモネラ繭およびマイコバクテリア（例えばＢＣＧ）等の生きたａｍ ベクターを含む生きたベクターを用いて免疫系に提供することができる。 ＰＴＶ／Ｒ３Ｖキメラ等のキメラタンパクは、接種細胞、転移細胞または感染細 胞の上清または細胞溶融液中に存在し、従来の方法によって精製することかでき 　る。 キメラタンパクの免疫原性および防御作用を評価するためには、適当な実験動物 にＰＩＶ／Ｒ３Ｖキメラ等の精製キメラタンパクまたは前記の生きた組換えベク ターを各種の重量で免疫投与する。１Ｍ＋記のキメラタンパクは、リン酸アルミ ニウム等の生理学的に許容される担体を用いるか、　ｌＳＣ０Ｍ５およびリポソ ーム等の運搬手段を用いて免疫系に到達させる二とができる。また、粘膜反応を 発揮できるように、例えばコレラ毒素Ｂサブユニット等の免疫標的神体と供役ま たは結合させるか、または微粒子中に混入してキメラを製剤化することもできる 。また、前記のワクチンは、毒素分子または抗体等の免疫系にマルチマータンパ クを特異的に運搬する手段を含んでいてもよい。さらに、キメラタンパクの免疫 防御作用を増強させるために、別の免疫原性または免疫刺激性分子を添加しても よい。 特に本発明で記載するＰＩＶ／Ｒ３Ｖキメラタンノ（りは、ＰＩＶ−３およびＲ ３Ｖにより起こる疾患から防護するためのワクチン注射液を製造するために、リ ン酸アルミニウム等のアジュバントで製剤化することもできる。また、前記のキ メラタンパクはＩ）　Ｉ　Ｖ　−３およびＲ３Ｖによる感染を診断するための試 験キットに使用することもできる。 本発明はＰＩＶ−３およびＲ３Ｖキメラタン！（りの調製のみならず、単一分子 に順次リンクさせた少なくとも２種類の病原体からの免疫原タンノ（りの完全な 配列または領域から成るキメラ免疫原の製造にも適用することができる。また、 キメラ抗原は、各種病原体からの数種のタンパクの免疫優勢エピトープを含むよ うに合成することもできる。これらのキメラ抗原はワクチンまたは診断薬として 有用である。 配列の識別 本願明ｍｓでは、いくつかのヌクレオチドおよびアミノ酸の配列を引用する。そ の配列および配列の引用場所を以下に示す。 ＥＱ ＩＤＮｏ、　配　列　引用場所 ！　ＰＣＩ増幅ＰＩＶ−３Ｆ　実施例１．２　ＰＣＲ増幅ＰＩＶ−Ｆ　実施例１ ゜タンパクのアミノ酸配列　図１ ３ＰＩＶ−３８Ｎ遺伝子の　実施例１゜ヌクレオチド配列　図３ ４ＰＩＶ−３ＨＮタンパクツ　実施例１、アミノ酸配列　図３ ５　Ｒ３Ｖ　Ｆ遺伝子の　実施例１、 ヌクレオチド配列　＠５ ６　Ｒ５Ｖ　Ｆタンパクの　実施例１、アミノ酸配列　図５ ７　Ｒ５Ｖ　Ｇ遺伝子のヌクレオ　実施例１、チド配列　図７ ８　Ｒ５Ｖ　Ｇタンパクの　実施例１．１６　８ＳＤＨＩ−ＢＳＤＨＩ糖　実施 例９、限定されるものではない。以下の精製プラスミツドを、おいて明示的に記 載されていないが、当該技術分野のタンパクのヌクレオチド配列（ＳＢｏ　１０ 　Ｎｏ：ｌ）およびアミノ酸配列Ｃ３ＢＱ　ＩＤ　Ｎｏ：２）を図１に示し、１ 記遺伝子の制限マツプを図２に示す。 ２種類のＰＣＲ増幅ＰＩＶ−３Ｆ遺伝子クローンの１８４４ヌクレオチドの配列 分析から、前記２種類のクローンは同一であることが確認された。ＰＣＲ増幅Ｐ ＩＶ−３ＦＭ伝子クローンの＝−ド化配列をすでに公表されているＰＩＶ−３Ｆ 遺伝子と比較した結果、２種類の遺伝子のコード化配列に２．６％の差があり、 　１４個のアミノ酸が置換されていることが明らかとなった。 非ＰＣＲ増幅ｒ’１Ｖ−３Ｆ遺伝子クローンのヌクレオチド配列は、以下の点で ＰＣＲ増幅遺伝子クローンと異なっていた。すなわち、非ＰＣＲ増幅クローンは 遺伝子の５゛非翻訳領域に１０個余分なヌクレオチド（ＡＧＧＡＣＡＡＡＡＧ） を有し、８　（ＰＣＲ増幅遺伝子のＴから非ＰＣＲ増幅遺伝子のＣまで）、５１ ２　（ＰＣＲ増幅遺伝子のＣから非ＰＣＲ増幅遺伝了・のＴまで）、５１８（Ｐ ＣＲ増幅遺伝子の６から非ｐｃＲ増幅遺伝その八まで）および＋３７６（ＰＣＲ 増幅遺伝子のＡから非ＰＣＩ増幅遺伝子のＧまで）の４個所で異なっていた。こ のような差は、非Ｐ　ＣＲＩｌｌ　Ｍ　Ｉ）ＩＶ−３Ｆ遺伝子によってコード化 された＋７タンパクのアミノ酸配列が３個所で異なることを示している。 すなわち、ＰＣＲ増幅ｐｔ’ｖ−ａｐｍ伝子によって＝−ド化されたＰタンパク の一次アミノ酸配列におけるセリン（位置１１Ｏ）、グリシン（位置１１２）お よびアスパラギン酸（位置３９８）がＰＣＩ増幅クローンによりコード化された Ｆタンパクの一次アミノ酸配列では、それぞれフェニルアラニン（位置目０）、 グルタミン酸（位置１１２）およびグリシン（位置３９８）に変っていた。 図３は、それぞれＰＩＶ−３ＨＮＩＩ伝子およびタンパクのヌクレオチド配列（ ＳＥｏ　１０　Ｎｏ＝３）およびアミノ酸配列（ＳＥｏ　１０　Ｎｏ：４）を示 し、遺伝子制限マツプを図４に示す、ＨＮクローンからの１８３３ヌクレオチド 配列を分析したところ、配列は同一であることが確認された。その配列を公表さ れているＰＩＶ−３ＨＮコ一ド化配列と比較したところ、Ｐｌ、Ｖ−３ＨＮ遺伝 Ｉ−のコード化配列に４゜４％の差が認められた。この差は、ＰＩ・Ｖ−３ＩＮ 遺伝子によりコード化されたタンパクのアミノ酸配列に１７９１のアミノ酸置換 があることを示している。 それぞれＲ３Ｖ　Ｆ遺伝子およびＲ３Ｖ　Ｐタンパクのヌクレオチド配列（ＳＦ ｏ　１０　Ｎｏ：５）およびアミノ酸配列（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：６）を図５に 示し、遺伝子制限マツプを図６に示す、２種類のＲ３Ｖ　Ｆクローンからの１８ ８７ヌクレオチド配列を分析したところ、配列は２種類のクリーン間で完全に相 同であることが確認された。このヌクレオチド配列を報告されているＲ３Ｖ　Ｆ 遺伝子のヌクレオチド配列と比較すると、コード化配列に１．８％の差があり、 １１ｍのアミノ酸置換に相当した。 Ｒ３Ｖ　Ｇｌｌ伝子およびＲ３ＶＧタンパクのヌクレオチド配列（ＳｒシＱ　Ｉ Ｉ）　Ｎｏニア）およびアミノ酸配列（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：８）をそれぞれ図 ７に示し、遺伝子制限マツプな図８に示す。Ｇ遺伝子の９２０ヌクレオチド配列 を報告されているＧ配列（Ａ型単離物）と比較すると、遺伝子産物のアミノ酸配 列に６．７％の差があり、この差は２０個のアミノ酸置換に相当した。 鈍端結紮または適当なリンカ−を用いて、完全長ＰＩＶ−３Ｆ（非ＰＣＲ増幅） 、ＰＩＶ−３ＨＮ。 Ｒ５Ｖ　ＦおよびＲ３ＶＧ遺伝子をλｇ＋＋目こクローン化し、ブルースクリプ トＭＩ３−５Ｋベクターの多重クローン化部位にサブクローン化した。ＰＣＲ増 幅ＰＩＶ−３Ｆ遺伝子・は、ブルースクリプトベクター中に直接クローン化した 。　ＰＩＶ−３Ｆ−ＰＣＢ増幅、Ｐ　Ｉ　Ｖ　−３Ｆ　−Ｐ　ＣＲ非増幅、Ｉ） 　Ｉ　Ｖ　−３ＵＮ、Ｒ３Ｖ　ＦおよびｌシＳＶ　ＧＭ伝ｆ・を含むクローン化 ベクターは、それぞれＤ　Ｉ３　ｌ　３　Ｆ、ｐｐ　Ｉ　３Ｐｃ、ＤＰＩＶＨＮ 、ｐＲ３ＶＦおよびｏ　ｒＩ　Ｓ　Ｖ　Ｇ　ト命名した。 実施例２ 本実施例は、Ｐ　ｐｔｖ−ｓ−Ｆ　＊ｓｖキメラ遺伝子を含み、ブルースクリプ トを利用した表現ベクター（ｏ　Ｍ　ＣＲ２０）の構築について説明するもので ある。このキメラ遺伝子構造は、ＰＩＶ−３Ｆ遺伝子の５゛非翻訳領域を含むが 、ＰＩＶ−３およびＲ３ＶＦ遺伝子の疎水性アンカーおよび細胞質尾部コード化 領域を欠いている。このプラスミツドの構築ゴニ程を図９に要約する。 キメラ遺伝子のＰＩＶ−３部分を調製するために（図９、工程ｌ）、ポリリンカ ーをＢａｍＨＩで切断し、タレノーポリメラーゼにより直線化プラスミツドを鈍 端結紮を行い、Ｂｓｒｌで遺伝子を切断して、膜間領域および細胞質尾部コード 化領域を欠く完全長ＰＩＶ−３Ｍ伝子をＤＰＩ３Ｆプラスミツドから取り出した 。ＰｐｕＭ１部位および３つの連続した翻訳終了コドンを含むＢｓｒｌ−Ｂａｍ ＨＩ糖ヌクレオチドカセット（ＳＥＱ　ｒＤ　Ｎｏ　：　９）をトランケート状 の１．６Ｋｂ［ＢａｍＨＩ］−Ｂｓｒｌ　ＰＩＶ−３遺伝子フラグメントに結紮 し、ヒトメタロチオネンプｏ　％　−９−１Ｓｖ４０ゲノム（ｐ　Ｍ　ＣＲ２（ ｌと表示）のポリＡおよびＩＶＳ配列を含むブルースクリプト間１３−５Ｋ表現 ベクターのＲｃｏＲＶ−１１ａｍ）（ｌｆｉ位にクローン化して、　ｏ　Ｍ　Ｅ 　ｌプラスミツドを生成させた。 キメラ構造のＲ３Ｖ　Ｆ遺伝子成分を遺伝子工学的に構築するために（図９、工 程２）、ＥｃｏＲＩでポリリンカーを切断し、遺伝子をＢｓｐＨ１で切断して膜 閏慴域および細胞質尾部＝−ド化領域を欠＜Ｒ３ＶＦ遺伝子をｐＲ３ＶＦプラス ミツドがら取り出した。 ３つの連続した翻訳終了コドンを含む合成ＩＩｓ　ｏ　ＨＥ−Ｂ　ａ　ｍ　ＨＩ 糖ヌクレオチドカセット（ＳＥＱ　１ＯＮｏ：１０）を１．６Ｋｂ）ランケート Ｒ３Ｖ　Ｐ遺伝子に結紮し、ブルースクリプト表現ベクターｏＭＣＲ２０のＥｃ ｏＲＩ−Ｂａｍ８１部位にクローン化してｐＥＳ　１３Ａプラスミツドを生成さ せた。ついで、プラスミツドｐＢｓ　Ｉ　３ＡをＥｃ　ｏＲＩおよびＰｐｕＭｌ で切断して、トランケー）Ｒ３Ｖ　Ｆ遺伝子からリーダーおよびＦ２ブード化配 列を除去したｍ　Ｅｃ。 ＲＩ　−Ｐ　ｐ　ｕ　Ｍ　Ｉ糖カッセト　（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：１１）を用い てリーダー配列を再構築し、Ｒ３Ｖ　Ｆ１遺伝子セグメントに結紮してＤＥＳ２ ３Ａプラスミツドを生成させた。 トランケートＲ３Ｖ　Ｐｌｊｌ伝了・フラグメントにリンクしたＰＩＶ−３Ｆ遺 伝子の５°非翻訳領域を含むＦ　ＰＩＶ−３−Ｆ　Ｒ５Ｖキメラ遺伝子（図９、 １−稈３）を調製するため、まずｏ　Ｍ　Ｅ　ｌプラスミツド（１，６Ｋｂトラ ンケートｐｉｖ−ａｐ遺伝子を含む）をＰＤｕＭｌおよびＢａｍＨＩで切断した 。ＰｐｕＭＩ−ＢａｍＨＩ制限Ｅ）ＭＥ１ベクターを腸アルカリホスファターゼ で脱リン酸化した。　１．　ＩＫｂのＰ　ｐ　ｕ　Ｍ　Ｉ　−ＢａｍＨＩ　Ｒ３ Ｖ　Ｆｌ遺伝子フラグメントを脱リン酸化したＤＭＥＩベクターのＰ　ｏ　ｕ　 Ｍ　Ｉ　−Ｂ　ａ　ｍ　Ｈ１部位にクローン化してｐＥｓ２９Ａプラスミツドを 生成させた。このキメラ遺伝子はＰＩＶ−３Ｆ遺伝子の５′非翻訳領域を含むが 、ＰＩＶ−３およびＲ３ＶＦタンパクの疎水性アンカードメインおよび細胞質尾 部コード化ヌクレオチド配列を欠く。 実施例３ 本実施例は、５′非翻訳および膜間アンカーおよび細胞質尾部コード化領域を欠 ＜ＰＩＶ−３Ｆ遺伝子を含むブルースクリプト表現ベクターの構築を説明するも のである。このプラスミツドの構築ｆ、稈を図Ｉ。 に示す。 完全長ＰＩＶ−３’Ｆ遺伝子を含むｏ　Ｐ　Ｉ　３　ＦプラスミツドをＢ　ａ　 ｍ　ＨＩで切断し、クレノーポリメラーゼで鈍端化し、Ｌ（ｓｒｌで切断して膜 間および細胞質尾部コード化領域を除去１−だ。ブルースクリプト表現ベクター ｐ　Ｍ　ＣＲ２０は、Ｓｍａ　ｌおよび１１　ａ　ｍ　Ｈｒで切断した。翻訳終 了コドンを含む合成Ｉｔ　ｓ　ｒ　ｒ　−１３ａ　ｍ　Ｈ［糖ヌクレオチドカセ ット　（３ＩうＱ　ＩＤ　Ｎｏ：Ｉ２）を１．６Ｋｂの鈍端化Ｂｓｒｌ　ＰＩＶ −３Ｆ遺伝子フラグメントでＳ　ｍ　ａ　Ｉ　−Ｂ　ａ　ｒｎ　ＨＩ制限化ｐＭ ｃＲ２０ベクターに結紮し、ｐＭｐｐｏプラスミツドを生成させた。この構造の ＰＩＶ−３１２遺伝子は膜間および細胞質アンカードメインを欠くが、５°非翻 訳領域を有している。５°非翻訳領域および疎水性アンカードメインコード化Ｄ ＮＡフラグメントを欠＜ＰＩＶ−３Ｆ遺伝子を含むプラスミツドを遺伝子工学的 に構築するために、ｐＭＤ　Ｆ　［３プラスミツドをＥ（ｒＲＴおよびＢｓｌＢ Ｉで切断した。ＥＣｒＲＩ　−Ｂ　ｓ　ｔ　Ｂ　Ｉ切断で除去されたシグナルペ プチドおよびコード化配列を再構築するための配列を含むｒ＝ｃ　ｒ　ＲＩ　− Ｂ　ｓ　ｔ　Ｂ　＋糖カセット（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：　１３）ＥｃｏＲＩ−Ｂ ｓｔＢｌ制限化ＯＭ　ｐ　Ｆ　Ｂベクターに結紮してｏ　Ｍ　ｐ　Ｐ　Ａプラス ミツドを構築した。 実施例４： 本実施例は、　トランケートＲ３ＶＰＩ遺伝イにリンクした５゛非翻訳領域を欠 くトランケートＰ　Ｉ　Ｖ　−３Ｆ遺伝子からなるＦ　ＰＩＶ−３−Ｆ　ＲＩＩ Ｖキメラ遺伝子の構築を説明するものである。このプラスミツドの構築り程を図 １１に示す。 このキメラ遺伝Ｉ！−搭造を調製するため、ｐ　ＩＥ　３２９Ａプラスミツド（ 実施例２）をＢ　ｓ　＋　＋（ｌおよびＢ　ａｍｌ−１ｆで切断して２．５Ｋｂ のＢｓｌＢＩ−ＢａｍＨＩ　Ｐ＋３−３　Ｆ−Ｒ３Ｖ　ＰＩキメラ遺伝子フラグ メントを遊離させた。このＢｓｌＢＩ−ＢａｍＨＩフラグメントを低融点アガロ ースゲルから単離し、脱リン酸化ベクターｏ　Ｍ　ｏ　Ｆ　ＡのＢｓｌＢＩ−Ｂ ａｍｆ（１部位にクローン化してＤＥＳ６０Ａプラスミツドを構築した。５°非 翻訳領域およびトランケートＲ５ＶＦ遺伝子のＦＩ＝Ｉ−ド化領域にリンクした 疎水性アンカーおよび細胞質尾部コード化配列を欠＜　Ｐ　Ｉ　Ｖ　−３Ｆ遺伝 子を含んでいる。ついで、このキメラ遺伝子をバクロウィルス運搬ベクタ′−に サブクローン化する（実施例５を参１！！り。 実施例５： 本実施例は、在来ポリへドリンプロモーターおよび、５′非非翻訳列およびトラ ンヶー）Ｒ５Ｖ　Ｆｌ遺伝子にリンクした疎水性アンカードメインおよび細胞質 尾部をコード化したヌクレオチド配列を欠＜　Ｐ　Ｉ　Ｖ　−３Ｆ遺伝子からな るＦＰＩシー３　ＰＲＩＩＶキメラ遺伝Ｔを含む修飾ＤＡＣ６１０バクロウイル ス運搬ベクターの構築を説明するものである。 二のプラスミツドの構築を図１２に示す。 ＤＡＣ６１（ｌバクロウィルス表現ヘクターを以下のように修飾して、６−来ポ リへドリンプロモーターを含ませる。ベクターｐＡＣ６１０をＥ　ｃ　ｒ　ＲＶ およびＢ　ａ　ｍ　Ｈｌ　′ｃ切断した。　ＩＫ　ｃ　ｒ　ＲＶ　−Ｂ　ａ　ｍ 　Ｉｔ　Ｉ　ＬＮＡ配列を欠＜９．４Ｋｂのバクロウィルス運搬ベクネスファタ ーゼで処理した。三方向結紮において、在来ポリへドリンプロモーターを修復す るために必要なヌクレオチドを含むＥｃｒＲＶ−ＢｃｒＲ１１１１ヌクレオチド カセット（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：Ｉ４）を、ｐＥＳ　Ｉ　３Ａ病造（実施例１、 工程２）から単離したＩ。 ６Ｋｂのεｃ　ｒ　ＲＪ　−Ｂ　ａ　ｍ　１４１　）ランケートＲ５ＶＦ遺伝子 フラグメントおよびＥ　ｃ　ｒ　ＲＶ　−Ｂ　ａ　ｍ　Ｈ１１１ｍ化ｐＡＣ６１ ０ホスフアターゼ処理ベクターで結紮し、ＤＥＳ４７Ａプラスミツドを生成させ た。 Ｐ　ｐｌｖ−ｓ　Ｆ　ＩＩＪＩＶキメラ遺伝子を含むｏＡｃ　６１０表現ベクタ ーを調製するために、まず０ＥＳ４７ＡプラスミツドをＥｃｒＲＩおよびＲａ　 ｍ　ＨＩで切断して、挿入した１、６にｂのトランケートＲ３ＶＦＩＩ伝Ｔを除 去した。　ＢｃｏＲＩおよび［３ａ　ｍ　ＨＩでＤＥＳ６０Δプラスミツドを切 断して（実施例４）、２．８ＫｂのＰ　ｒｒｖ−ｖ　Ｆ　＊＃ｖキメラ遭伝ｆ− を取り出した。２゜８ＫｂのＥ　ｃ　ｒ　Ｒｌ　−ｎ　ａ　ｍ　＋４１キメラ遺 伝子をＥｃｒ　ＲＩ　［３ａ　ｍ　ＨＩ　Ｉｆ限化ＤＣ５４７Ａベクターに結紮 し、　ｏＡＣＤＲ７プラスミツド（八’ｒＣＣ７５３８７）を構築した。 実施例６゜ Ｄ　本Ｘ施例は、Ｐ　ｐｌｖ−３−Ｐ　＠＠ｙキメラ履伝子を含ｔｒｌ１１精製 組換えバクロウィルスのｊＩＩ製を説明するものでトウムシの１稽）（ＳＦ３） の細胞に１．　Ｑμｇの野□９プラスミツドＤＮＡ　（ｐＡｃプラスミツド、実 施例５）を同時に感染させたａ　Ｆｐ＋ｖ−Ｉ　Ｐ□９キメラ遺伝子を含む予想 される紹換えバクロウィルス（連続希釈によりあらかじめ精製したもの）を点プ ロットハイブリッド化により同定した。予勿組換えバクロウィルスを感染させた 昆虫頼胞のｔｌＩ酎岐耐”Ｐ　−４１ａ　Ｆ　ｐｌｖ−ｓ−ｐｓｓｖキメラ遺伝 子挿入でプローブした。Ｈ換えバクロウィルスは、表現実験に使用する曲に、２ 回ｔｐｉｍＩＲ製稍袈した。全ての手順は％　Ｍ、Ｄ、ＳｕｍｍｅｒｓおよびＧ 、Ｅ、Ｓｍ１ｔｈ（Ｆ）”Ａ　ＭａｎｕａｌＣｕｌｔｕｒｅ　Ｐｒｏｃｅｄｕｒ ｅｓ″、Ｔｅｘａ８７に記載されているプロトゴールに中じて行った。 本実施例は、感染させたＳｆ９１１ｍ胞の溶１Ｍ液およびその上清中におけるＰ 　ｐｌｖ−Ｉ　Ｆ　汽ａｖキメラタンパクの存在を説明するものである。 昆虫細胞は、実施例６の記載にしたがってｍ、ｏ。 ｉ、８となるようにｗＩ４製したｐＭ１１ｉ精製精製した組換えバクロウィルス を５！Ｉ染させた１組換えウィルスを感染させた細胞からの濃縮上清はＰＩＶ− ３Ｆ特異性Ｅ　ＬＩＳＡで陽性であった。さらに、３５５−メチオニン標識感染 細胞のｍ融液をＳＤＳ〜ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、ゲルをオート ラジオグラフィーで分析したところ、組換えウィルスを感染させた細胞の溶融液 中にはＲ，掛は分子象約９０８Ｄａの強いバンドが存在していたが、野生型を感 染させた細胞の溶＠液には存在していなかった６組換えバクロウィルスを感染さ せた細胞のｍ耐液におけるＦＰＴ％・−３Ｆｍｓ・ｔキメラタンパクの存在は、 さらにモノ特異性抗ＰＩＶ−３Ｆおよび抗１１ｓＶＦ抗血消およびモノクロナル 抗体（Ｍａｂｓ）を用いたウェスターンプロット分析によっても確認された０組 換えバクロウィルスを感染させた細胞の溶ＭＦＩ！は、免疫プロット中の抗１’ 　ｌ’　Ｖ　−３およびｖＬＲ５Ｖ抗血消と反応させた。図１３の免疫プロット に示すように、＋ｔｓｖｐまたはＦ　ｐｌｖ−ｚ−１：＊ａｖｕ　換えバクロウ ィルスを感染させた細胞の溶！　液は、抗ＦＲ５ＶＭａｂでＶＡ杓反応を示した 。１ＩＩＩ待したように、野生型ウィルスを感染させた細胞のｒｉＳｅ破は、こ のＭ　ａ　ｂと反応しなかった。さらに、ｌ’　ｐｒｖ−ｉ　１’　ｓａｖキメ ラ組換＾ウィルスのみが抗ＰＩＶ−３ＰＩ抗血渭と反応した。 実施例８ 本実施例は、ポリへドリンＡＴＧ出発コドンをＡＴＴに変換し、ＣＣＧ配列がポ リへドリン道伝子の下流の＋４．５．６位に存在するバクロウィルス運搬ベクタ ーＤＶＬ１３９２　（インビトロゲンより得たもの）における修飾を説明１°る ものである。ＡＴＴコドン下流のいくつかの塩基対に構造遺伝子を挿入すると、 翻訳が促進されることが知られている。この修飾バクロウィルスベクターの構築 １程を図１４に示す。 バクロウィルス表現ベクターｐ　Ｖ　Ｌ　＋　３９２　ｋ　Ｅ　ｃｒＲＶおよび Ｂａｍ１ｌ＋で切断した。９．５Ｋｂの制限ｐＶＬ１３９２ベクターをＥ　ｃ　 ｏ　ＲＶ　−Ｂ　ａ　ｍ　Ｈ１糖ヌクレオチドカセット（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ＋ Ｉ５）に結紮してｐＤ２ベクターを構築した。 実施例９： 本実施例は、タンデムにリンクしたトランケートＲｓｖ　ｐおよびｌ）　Ｉ　Ｖ 　−３ＩＩ　Ｎ遺伝子からなるＦ　＊６Ｖ−ＨＮＰＩＶ−３キメラ這伝ｆ・を有 するｐ【）２バクロウィルス表現ベクターの構築を説明するものである。このプ ラスミツドの構築［程は図１５に示す。 Ｆ□ｖ−１１ＮｐＩｖ〜、遺伝ｆ−を遺伝ｆ］−学的に構築するため、ポリリン カーをＥｃｒＲｌによって切断し、遺伝子をＢｓｐＨｒによって切断して、Ｒ３ Ｖ　ＰＩＮタンパクの膜間ドメインおよび細胞質尾部をコーソ化したヌクレオチ ド配列を欠＜Ｒ３Ｖ　Ｆ遺伝ＴをＤＲ３ＶＦプラスミツド（実施例１）から取り 出した。＋１伝子を１３ｓｐＨ１で切断し、ポリリンカーをＢ　ａ　ｍ　Ｈ［で 切断して、疎水性アンカードメインをフード化したＤＮＡフラグメントを欠＜Ｐ ＩＶ−３８Ｎ遺伝子をｐＰ　Ｉ　ＶＨＮプラスミツド（実施例１）から取り出し た。 １．６ＫｂのＥｃｒＲＩ−ＢｓｐＨＩ　Ｒ５Ｖ　Ｆ遺伝子フラグメントおよび１ ．７ＫｂのＢ　ｓ　ｏ　ＨＩ　−Ｂ　ａｍＨＩ　ＰＩＶ−３ＨＮ遺伝子フラグメ ントを低融点アガロースゲルから単離した。クローン化を目的として、ブルース クリプト哺乳動物細胞表現ベクター中の２１所のＢａｃ＋ＨＩｉ位の突然変異を 起こさせた０表現ベクターをＢｓｐＨＩで切断し、ＢｓｐＨ１制限ベクターおよ びタレノーポリメラーゼ切断ＢｓｐＨＩにより遊離した１、ＩＫｂフラグメント を処理し、鈍端化ブルースクリプト表現ベクターに鈍端化１．ｌＫｂフラグメン トを結紮して０ＭＣＲ２０の１３　ａ　ｐ　Ｈ１部位に突然変異を誘導して、ｐ Ｍ’　プラスミツドを構築した。　１．ＩＫｂ鈍端フラグメントを哺乳動物の細 胞表現ベクター中に不適当な方位で挿入すると、ブルースクリプト表現ベクター のＡｍｏ遺伝ｆが変化するので、　１．１２Ｋｂ鈍端化フラグメントを有するｐ 　Ｍ　’プラスミツドＤＮＡで適切な方位に変換されたＨＢＩＯ！細胞のみがア ンピシリン存在下で生存することができる。塩化セシウム−臭化エチジウムグラ ジェント中で平衡遠心分離を行い、ＰＭ’　プラスミツドで変換させたアンピシ リン耐性ＨＢ　１０１１１１１１胞コロニーがらプラスミツドＤＮＡを精製した 。　１．６ＫｂＥｃｒＲ１−ＢＳＤＨＴ　Ｒ３Ｖ　Ｐおよび１．　フＫｂＢｓｏ Ｈ夏−ＢａｍＨＩ　ＰＩＶ−３）ＩＮＩＩ伝Ｌフラグメントを三方向結紮でｐＭ 　’ベクターお（Ｅ　ｃ　ｒ　ＲＩ　−Ｂ　ａｍＨｒ部位にクローン化し、　ｏ 　Ｍ　’　ＲＦ　−ＨＮプラスミツドを構築した。 ＢｓｐＨＩ切断で除去されたＲ３Ｖ　ＦおよびｐｔＶ−３ＨＮ遺伝子の特定のコ ード化配列を修復するために、適切なＲ３Ｖ　ＦおよびＰＩＶ−３ＨＮＩＩ伝子 配利子配列Ｂ　ｓ　ｏ　Ｈｌ　−Ｂ　Ｓ　Ｄ　ＨＩ糖ヌクレオチドカセット　（ ＳＥｏ　１０　Ｎｏ：１６）　を、　ＢｓｐＨ１経由でＲｓｐＨＴ制限プラスミ ツドｏＭ’　ＲＰ−ＨＮに結紮し、　ｏ　Ｍ　ＲＦ　−Ｉ　Ｎプラスミツドを構 築した。適切な方位でＢｓｐＨＩ−Ｂｓｐｌ（＋糖ヌクレオチドカセットを含む クローンを糖ヌクレオチドリンカーおよびそのフランキング領域の配列分析によ り同定した。 Ｆ　＊ｓｖ　ＨＮ　ＰＩＶ−３キメラ遺伝子をバクロウィルス表現ベクターＤＤ ２　（実施例８）にクローン化１゛るため、まずプラスミツドをＥｃｒＲＩで切 ′断して、ｐＭＲＦ　−ＩＩ　ＮプラスミツドからＰ　、Ｉｇｖ　ＨＮ　ＰＩＶ −３）ランケート遺伝子を取り出した６次に、　３．　３Ｋｂ　ＦＲＢＶ−ＨＮ 　ｐｒｖ−ｓ遺伝子をバクロウィルス運搬ベクタープラスミツドｐＤ２のＥｃｒ Ｒ１部位にクローン化して、　ｐＤ２ＲＦ−ＨＮプラスミツドを構築した（ＡＴ ＣＣ７５８８）、配列分析により、３．３Ｋｂ　ＥＣｒＲＴ　ＦＲＩＩＶ　ＨＮ ＰＩｖ−ａキメラ遺伝子−がＤＤ２　ＲＦ−ＨＮプラスミツド中に適切な方位で 挿入されていることを確認した。 実施例１０：本実施例は、Ｆ　Ｆ１８Ｖ　ＩＩ　Ｎ　ｐｒｖ−ｉキメラ遺伝子を 含む＠菌精製組換えバクロウィルスの調製を説明するものである。 ５ｐｏｄｏｐｔｅｒａ　ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ　（Ｓ１９）細胞に野生型ＡｃＮ ＰＶ　ＤＮＡをｊｕｇとＦＲ♂〜−−ＨＮρＩＶ−３プラスミツドＤＮＡ　（ｐ Ｄ２　ＲＦ−ＨＮプラスミツド、実施例９）を２μｇ混合接種した。 Ｆ　＊ａｖ　ＨＮ　ｐｒｖ−ｉキメラ遺伝子を含むＴ・想組換えバクロウィルス （連続希釈により１回精製）をトンドブロットハイブリノド化により同定した。 　Ｔ・想組換えバクロウィルスに感染した昆虫の細胞の細胞溶融液を、３２Ｐ標 ａＲ３Ｖ　Ｉ’また＋１　Ｐ　’ｒ　Ｖ　−３１１Ｎ遺伝子糖ヌクレオチドプリ ーブでプローブした。表現試験に使用する前に、組換えバクロウィルスを３回！ ！＃菌精製した。 これらの手順は、ＳｕｍｍｅｒｓおよびＳ　ｍ　ｉ　ｔ　ｈのプロトコール（実 施例６）に従って行った。 実施例１１： 本実施例は、感染Ｓｆ９およびＨｉｇｈ　５＃ｌ胞の上清中にＦ　Ｆ１６Ｖ　Ｈ Ｎ　ｐｒｖ−３キメラタンパクが存在することを説明するものである。 昆虫の細胞（ＳＣ２およびＨｉｇｈ　５）を血清な含まないＥＸ４０１培地に保 ち、実施例１０のｔＡ菌精製組換えバクロウィルスを５〜ｌ０ｐｆｕ／Ｉ／ａ胞 のｍ。 ｏ、ｉ、で接種した０組換えバクロウィルス感染細胞の上清は、Ｒ３Ｖ−Ｆおよ びＰ　Ｉ　Ｖ　−３１１Ｎ特異性ＥＬ　Ｉ　ＳＡＳ試験で陽性を示した。さらに 、感染細胞からの上清は、免疫プロット上で、抗Ｆ　Ｒ３Ｖモノクロナール抗体 および抗ＨＮペプチド抗鉦清と陽性反応を示した。免疫プロット中には約１０５ ｋＤａの明瞭なバンドが認められた。この結果から、組換えバクロウィルスに感 染したＳＣ２およびＨｉｇｈ５Ｎｌ胞の上清中にＩ’Ｒ８シーＨＮ　ＰＩＶ−３ キメラタンパクが分泌されることが確認された。 実施例１２： 本実施例は、感染ｈｉｇｈ　５細胞の上清からのＩ？ｐＢｖ　ＨＮ　ｐト−３キ メラタンパクの精製を説明するものである。 Ｈｉｇｈ　５ｍ胞を麹漬を含まない培地に保ち、実施例１０の無菌精製組換えバ クロウィルスを５ｐｆｕ／Ｉｌｌ胞のｔｏ、ｏ、ｉ、で接種した。ｍ種２日後に 、ウィルス感染細胞の上清を採取した。抗ＨＮＰＩＶ−３モノクロナール抗体な 用いたイミエノアフィニティークロマトグラフィーで、可溶性Ｐ　＊ａｖ　ＨＮ 　ＰＩＶ−３キメラタンパクを精製した。抗Ｉ　Ｎモノクロナール抗体は、常法 によりＣＮＢ　ｒ活性化セファロース４Ｂに共役させた。イミュノアフィニティ ーカラムは、使用曲に１０倍量の洗浄用緩衝液（Ｉ　Ｏｍ　Ｍ　トリスＨＣｌｐ Ｈ７，５、＋　５０　ｍ　Ｍ　Ｎ　ａ　Ｃ＋、０．０２％ｖ　／　ｖ　Ｔｒ　ｉ 　（ｏｎ　ＸＩ　００）で洗浄した。試料を載せ、　１０倍量の洗浄用緩衝液、 ついで３倍量の高塩濃度緩衝液（ＩＯｍＭ）リス−１（ＣＩｐＨ７，５，５００ ｍＭ　Ｎ　ａ　Ｃｌ、０．０２％ｖ／ｖ　Ｔｒ　ｉ　ｔｏｎ　Ｘ−１００）で洗 浄した。Ｆ　＊ｓｖ　Ｉ（Ｎ　ＦＩＶ−３キメラタンパクは、０．０２％ｔｒｉ ＋ｏｎ　Ｘ−１００含有１００ｍＭグリシン、　ＤＨ２，５でイミュノアフィニ ティーカラムから溶出させた。′ｆｓ出したタンパクは、　ＩＭ）リス−ＩＣ１ ，ＤＨＩｏ、７で直ちに中和した。 イミュノアフィニティー精製Ｆ　＊ｓｖ　ＩＩ　Ｎ　ＰＩＶ−３タンパクのポリ アクリルアミド　ゲルな気詠動分析（図１６、パネルＡ）から、見かけ分子Ｉｔ 　Ｉ　ｆｌ　５　ｋ　ｌ）　ａを有する一つのｔｔタンパクのバンドが認められ た。精製したタンパクは、免疫プロット上で、抗Ｒ５Ｖ　Ｆモノクロナール抗体 および抗ＨＮペプチド抗麹漬と反応した（図１６、パネルＢ、それぞれレーンｌ および２）。 実施例１３： 本実施例は、モルモットにおけるＦ□ｖ−ＨＮｐ、ｖ−ｓタンパク免疫原性を説 明するものである。 前記実施例１２に記載した精製Ｆ　＊ａｖ−ＨＮ　ｐｒｖ−ｓキメラタンパクを 、リン酸アルミニウムアジュバントとともに１．０または１０．０μｇの用量で 、１群４匹のモルモットに筋肉内注射した。対照群の動物には、パルセボ、生き たＰＩＶ−３またはＲＳＶを免疫投与した（鼻腔内投午）、第１回注射２および ４週間後に採此し、さらに４週時に同用量の抗体製剤で追加免疫を行った。追加 免疫後２および４週間で、直情試料を採取した。キメラタンパクのＰＩＶ−３お よびＲ３Ｖ特異抗体反応を評価するため、血清試料についてＰＩＶ−３特異的血 球凝集ｌｌｌ１ｗ抗体および中和抗体ならびにＲ３Ｖ中和抗体の有無を分析した 。下表（本開示の最後に示す）に要約するように、キメラタンパクをｌＯμｇの 重量で２回免疫投与した動物の血ｔｎは６および８週時に、ＰＩＶ−３またはＲ ＳＶの鼻腔内投与後と同等レベルのｌ）　Ｉ　Ｖ　−３特異性血球凝集阻１１Ｆ （ＩＩＡｌ）および１１　夏Ｖ　−３／　ＲＳ　Ｖ中和抗体価を示した。 さらに、キメラタンパクのわずかＩＭｇを２回免疫投与した動物でも、高いＰＩ Ｖ−３およびＲＳ　Ｖ特異性中和抗体が誘導された。これらの結果から、ＲＳ　 ＶおよびＰＩＶ−３成分の免疫原性が確認され、単一組換え免疫原がＲＳＶおよ びＰＩＶ−３に対して中和抗体を誘導することが確認された。 実施例１４： 本実施例は、コツトンラットにおける１２Ｐ５シー１１　ＮＰＩＶ−３タンパク の免疫原性および防護効果を説明するものである。 リン酸アルミニウムアジュバントを添加したＦ　＊ａｖ−ＨＮｐ、シー３キメラ タンパク（実施例１２に記載したように調製）を１群８匹のコツトンラットに１ ．　Ｏまたはｌ帆　０μｇの用量で筋肉内注射した。対照群の動物には、パルセ ボ（ＰＢＳ　＋　リン酸アルミニウム）、生きたＰＩＶ−３またはＲＳ　Ｖを免 疫投与した（鼻腔内投与）。第１回注射４週間後に採姦し、さらに４週時に同用 量の抗体製剤で追加免疫を行った。追加免疫後１週時に、龜清試料を採取した。 下表２に示したように、４週に裸面したデータから、キメラタンパクはＩおよび ｌ　＋＋μにの用量で強い一次反応を誘発することが認められた。　Ｐ　Ｉ　Ｖ 　−３特異性ＩＡＩおよびＰ　１ｖ　−３／　ＲＳ　Ｖ中和（＋）　ｌ’均逆数 １０ｇ２カイｉｉ　ハ、生きたＰ　Ｉ　Ｖ　−３およびＩ＜　Ｓ　Ｖで得られた 力価と同等であった。このように、キメラタンパクの囃回接挿はＰ　Ｉ　Ｖ−３ およびＲＳＶに対する中和抗体を誘導するに十分であった。追加免疫後（５週間 後採龜）でも、強いＰＩＶ−３およびＲ３Ｖ中和力価が認められた。これらの結 果は、さらにキメラタンパクのＲＳＶおよびＰＩＶ−３成分の免疫原性が高いこ とを実証するものである。 キメラタンパクがＲＳ　ＶおよびＰ　Ｉ　Ｖ−３に対して同時に動物を防護でき るか否か評価するために、各群４匹のコツトンラットにｌ００ＴＣＩＤ５ｏ単位 のＰＩＶ−３またはＲＳＶを鼻腔内に抗原投与した。ウィルスを抗原投与してか ら４８後に動物を屠殺した。肺ホモジネートについてウィルス価を測定した。　 Ｆ表３に示すように、ＦＲ８シーＨＮ　ＰＩＶ−３キメラタンパクを１またはｌ Ｏμｇ免疫投与した動物では、ＰＩＶ−３またはＲＳＶの抗原投与に対して完全 な防護が認められた。 これらの結果は、キメラタンパクが高い免疫原性を有するのみならず、ＰＩＶ− ３およびＲ３Ｖ感染により起こる疾病に対してコツトンラットを同時に防護でき ることを実証するものである。 実施例１５： 本実施例は、Ｆ　ｒ＋ｙ−３Ｇ　Ｆ１６シキメラ遺伝子を含むブルースクリプト Ｍｌ：１−５Ｋベクターの構築を説明するものである。このキメラ遺伝子構造は 、突然変異Ｉ）ＩＶ−３Ｆ遺伝子の５゛非翻訳領域を含むが、突然変異ＰＩＶ− ３Ｆおよび在来Ｒ３Ｖ　Ｇ遺伝子の疎水性アンカー及び細胞質尾部ドメインをコ ード化したヌクレオチド配列を欠く、このプラスミツドの構築工程は、図１７お よび＋８に示す。 第１段階のＦ　ｐｒｖ−ｓ　Ｇ　ＲＰＶキメラ遺伝子構造のｐｔＶ−３Ｆ成分調 製工程（図１７）は非ＰＣＲ増幅ＰＩＶ−３ｒ’遺伝子の８５７と８７４の位置 およびＰＣＲ増幅ＰＩＶ−３Ｆ遺伝子の８４７と８６４の位置に存在する１８ペ プチド長の配列５°ＣＡＡＧＡＡＡ　Ａ　Ａ　Ｇ　Ｇ　Ａ　Ａ　Ｔ　Ａ　Ａ　Ａ 　Ａ　３　’　（Ｓ　Ｅ　Ｑ　Ｉ　Ｄ　Ｎ　。 ：１７）内の予想前終７８位の除去である（図！参照）。 この工程の最後に、非ＰＣＲ増幅ＰＩＶ−３Ｆ遺伝子のＰＩＶ−Ｆ　ｃＤＮＡを ＢｓａＡＩおよびＥｃｒＲ１部位で切断した。Ｅ　ｃ　ｒ　ＲＩ−Ｂ　ｓ　ａ　 Ａ　Ｉリンカ−を用い、ＢｓａＡｌ−ＵｃｒＲＩ　ＰＩＶ　Ｐ遺伝子フラグメン トをブルースクリプトＭＩ３−５ＫベクターのＥｃｒＲ１部位にクローン化した ０次に、Ｍ　ｏ　ｒ　ｉｎａｇａらの方法［１９８４，８ｉｏｌｅｃｈｎｏｌｏ ｇｙ　２°６３６−６３９］を用い、糖ヌクレオチド介在突然変異によりＰＩＶ −３Ｆ遺伝子（非１）　ＣＲ増幅）の８５７−８７４標的領域に突然変異を起こ させた。ｃ＋ＰＩ：１１７ｃプラスミツド（実施例１）をＡｍｐ遺伝遺伝中のＳ ｅａ　＋で切断し、アルキルホスファターゼで脱リン酸化した（プラスミツド＃ １）。　ｐｌ）ｒ　３Ｆｃプラスミツドの別の試料ｔ−Ｂｓ１ＥＩＩおよびＮ５ ｊ１で切断し、ｐ［Ｖ−３Ｆ遺伝子１７）０．９ＫｂＢｓ　ｔＥＴ　ｌ−＋５　 ｉ　ｆフラグメントを欠く３゜９Ｋｂ制限プラスミツドを構築した（プラスミツ ド＃２）、Ｆタンパク配列を変化させることなく８５７−８７４ＤＮＡセグメン トに特異的突然変異を起こさせるために、５　’　ＣＡ　Ｇ　Ｇ　Ａ　Ｇ　Ａ　 Ａ　Ｇ　Ｇ　Ｇ　Ｔ　Ａ　Ｔ　ＣＡ　ＡＧ　３゛配列（ＳＥｏ　１０　Ｎｏ：＋ ９）を含む突然変異原性７８−ｍａｒ合成糖ヌクレオチド（図１７に示した＃２ ７２１．ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：＋８）を合成した。　１００℃で３分間変性させ 、徐々に冷却することによって復元させたＤＮＡプラスミツド＃１および＃２に 、この糖ヌクレオチドを添加した０次に、混合物をＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴ ＰｓおよびＴ４リガーゼの存在下でインキュベーションし、ＨＢＩＯ＋細胞に転 換した。　１００μｚ／ｍ１のアンピシリン含有ＹＴ寒天プレートから、　１． ８Ｋｂ突然変異ＰＩＶ−３Ｆ遺伝子を含む細菌を分離した。糖ヌクレオチドプロ ーブ５’　ＡＧＧＡＧＡＡＧＧＧＴＡＴＣＡＡＧ５°　（ＳＥＱ　１０　Ｎｏ： ２０）ハイブリッド化を用いて、突然変異ＰＩＶ−３Ｆ遺伝子の存在を確認した 。突然変異遺伝子−配列は、Ｄ　Ｎ　Ａ配列解析により確認した。突然変異ＰＩ Ｖ−３遺伝ｆを含むプラスミツドはｏ　Ｐ　Ｉ　３　Ｆ　ｍと命名した。 キメラ遺伝子構造の遺伝Ｆ工学的構築における第２工程（図１８）は、　トラン ケートＰＩＶ−３Ｇ糖ヌクレオチドの膜間アンカードメインおよび細胞質尾部を コード化したヌクレオチドおよび５°　リーダー配列を欠＜Ｒ３Ｖ　Ｇ遺伝子に タンデムにリンクしたＰＩＶ−３Ｆタンパクの膜間アンカードメインおよび細胞 質尾部コード化ヌクレオチド配列な欠（Ｆｍ遺伝子を組み込むための、ブルース クリプトベクターの構築に関するものである。 このキメラ遺伝子を調製するために、まずｐＰ１３Ｆｍプラスミツドにおける突 然変異ＰＩＶ−Ｆｌｌ伝子の方向をＥｃｒＲＩ消化および再結紮によって逆転さ せて、　ｏ　Ｐ　Ｉ　３　Ｆ　ｍ　ｒプラスミツドを構築した。キメラ遺伝子の ＰＩＶ−３Ｆ遺遺伝子分を調製するため、ｐＰＩ３ＦｍｒプラスミツドＮｏ＋＋ およびＢｓｒ＋で切断して１．　７ｋｂ）うＪ’７−４１’ｌＶ−：ｌ　Ｆ遺伝 子を遊離させた。Ｒ５Ｖ　Ｇ成分を調製するため、ポリリンカーをＥｃｒＲｌで 、遺伝子をＢ　ａ　ｍ　ＨＩで切断して、Ｇタンパクアンカードメインおよび細 胞質尾部をブード化したＤＮＡセグメント５°　リーダー配列を欠＜０．９５Ｋ ｂｌセ５Ｖ−Ｇ遺伝子をＤ　ＩＺＳ　Ｖ　−Ｇプラスミツド（実施例ｉ）から遊 離させた。０．９５ＫｂのＩＥ　ｃ　ｒ　ＲＩ　−１１ａ　ｍ　ＩＩ　Ｉ　ＩＩ 　Ｓ　Ｖ　Ｇ　Ｍ伝ｆ−フラグメントを制限ブルースクリプトベクターｐＭＩ３ −３ＫのＥ　ｃ　ｒ　ＲＩ　−Ｂ　ａ　ｍ　Ｉ−１１ｗＳ位にサブクローン化し 、　ｐＲ５ＶＧＩプラスミツドを構築した。　ＦおよびＧ遺伝子コード配列を修 復するＢ　ｓ　ｒ　Ｉ　−Ｂ　ａ　ｍ　Ｈ（糖ヌクレオチドカセット（ＳＥＱ　 Ｉ　Ｄ　Ｎｏ　：　９）を介して、０．　９５ＫｂＥｃｒＲＴ−ＢａｍＨＩ　Ｇ 遺伝子フラグメントおよび１．５Ｋｂ　Ｎｏ１ｌ−ＢｓｒｌトランケートケーＶ −３Ｆ遺伝子をリンクさせ、三方向結紮でＢ　ａ　ｍ　ＨＩおよびＮｏ１ｌ制限 ｐＲ３ＶＧ【ベクターにりローン化した。このようにして構築したプラスミツド はｐＦＧと命名した。 実施例１６： 本実施例は、突然変異ｐ＋ｖ−３Ｆ遺伝子を含み、５゛　リーダー配列およびＧ タンパクの膜間アンカードメインおよび細胞質尾部コード化ヌクレオチド配列を 欠＜Ｒ３Ｖ　Ｇ遺伝子にリンカラした疎水性アンカーおよび細胞質コード化部位 を欠＜　Ｆ　ＰＩＶ−３Ｇ　ＲＰＶキメラ遺伝子ｐＤ２バクロウィルス運搬ベク ター（実施例８に記載）の構築を説明するものである。 この構造を構築するため、ｐＦＧＦラスミツド（実施例１５）をＥｃ　ｒＲＩで 切断して２．６ＫｂのＦｐ＋ｖ−３Ｃ；ｐ８ｖキメラ遺伝子を遊離させた。次に 、２．６ｋｂのＥｃｒＲ１制限キメラ遺伝子フラグメントを脱リン酸化ｐＤ２ベ クターの［Ｅ　ｃ　ｒ　Ｒ１部位にサブクローン化して、　＋２．ＩＫｂのｏ　 Ｄ　２　Ｆ　−Ｇプラスミッド（ＡＴＣＣ７５３８９）を構築した。 実施例１７： 本実施例は、Ｆ　ＰＩＶ−３Ｇ　ｓａｖキメラ遺伝子を含む無菌精製組換えバク ロウィルスの調製を説明するものである。 ２μｇのｏ　Ｄ　２　Ｐ　−ＧプラスミツドＤＮＡ　（実施例！６）とＩｌｊｇ の直線野生型ＡｃＮＰＶ　ＤＮＡ　（１ｎｖ　Ｉｔ　ｒｏｇｅｎより人手）を同 時に５ｏｏｄｏｐｔｅｒａ　ｒｒｕｇｉｏｅｒｄａ　（Ｓｒ９）Ｉｔ胞に接種し た。実施例１０に記載した手順にしたがって、Ｆｐ＋ｖ−ｓ　ＧＩＩ１８Ｖ遺伝 子を含む組換えバクロウィルスを２回！！＃菌精製した。 実施例１８： 本実施例は、組換えバクロウィルス感染Ｓｒ９およびＨｉｇｈ　５ａｌｌＢ胞に おけるＦ　ＰＩＶ−３Ｇ　＊ａｖキメラタンパクの存在を説明するものである。 Ｆ　ＰＩＶ−３Ｇ　＊ａｖキメラ遺伝子を含む組換えバクロウィルス（実施ｆｌ ｌ　１６　）をＳｒ９およびｌｌｉＫｈ５ｍ胞に５〜ｌ０ｐｒｕ／ｍ胞のｍ、ｏ 、ｉ、で感染させた。組換えウィルスに感染した細胞の上清はＰＩＶ−３Ｆ特異 的Ｅ　Ｌ　Ｉ　Ｓ　Ａで表現タンパクが陽性であった。感染細胞のＥ清は、免疫 プロントで、抗ＰＩ）１ｖ−７３および抗Ｇ　Ｒ３Ｖモノクロナール抗体に反応 した。これらの結果から、感染Ｓｆ９およびＨｉ　ｇ　ｈ５１ｍ胞の上清中にお けるＦ　ｐＩｖ−２−Ｇ　Ｆ１８Ｖキメラタンパクの存在が確認された。 実施例１９： 本実施例は、Ｆ　ｐＩｖ−ｓ−Ｆ　＊ｓｖおよびＦ　宍ａｖ　−ＨＮ　ＰＩＶづ 遺伝子を表現する組換えワクチンウィルスの調製を説明するものである。 Ｆ　ｐＩｖ−ｓ　Ｆ　ＲＩＩＶ遺伝子（ｖＰ１１９２と表示）およびＦ　ＲＰＶ 　ＨＮ　ｐＩｖ−ｉ遺伝子（ｖｐＨ９５と表示）を表現する組換えワクチンウィ ルスは、Ｃ０ＰＡＫｉｌ主域選択システムを用い、ＶｉｒｏｇｅｎｅｔｉｃｓＣ ｏｒｏｏｒａ　ｔ　ｉｏｎ　（Ｔｒｏｙ、　ＮＹ）（本特許被譲渡人の関連会社 ）で製造した。Ｃ０ＰＡＫ宿主域選択システムに使用した挿入プラスミツドはワ クチニアＫＩＬ宿を域遺伝子［Ｐｅｒｋｕｓら、　（１９９０）Ｖｉｒｏｌｏｇ ｙ　１７９：２７６−２８６１および修飾ワクチニアＨ６プロモーター［Ｐｅｒ ｋｕｓら（１９８９）、Ｊ、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　６３：３８２９−３８３６１を 含んでいた。これら挿入プラスミツドにおいて、ＫＩＬ遺伝子、Ｈ６プロモータ ーおよびポリリンカー領域はＡＴＬ＠域を置換するプベンハーゲン系ワタチニア フランキングアームの間に位置させる［オープンリーディングフレーム（０１目 ’５）Ａ２５１、、Ａ２６１．；Ｇａｔｅｂｅ　Ｉら（＋９９０）、Ｖｉｒｏｌ ｎｇｙ　１７９：２４７−２６６；５１７−５６３］。Ｃ０ＰＡＫ挿入プラスミ ツドはレスキエーウイルスＮＹＶＡＣ（ｖＰ８６６）を用い、　ｉｎ　ｖｉｔｒ ｏにおける組換えに使用するように設計されている（Ｔａｒｔａｇｌｉａら（１ ９９２）、Ｖｉｒｏｌ。 ｇｙ　Ｉ　８８　：　２１７−２３２）。組換えウィルスの選択は、ウサギの腎 ｉｉａｍ胞を用いて行った。 組換えウィルスｖＰＩＩ９２およびｖＰＩ　１９５は、それぞれ挿入プラスミツ ドｐＥｓ２２９Ａ−６およびＰＳＤ、ＲＮを用いて構築したｍ　Ｆ　ｐＩｖ−３ −Ｆ　＊ｓｖ遺伝子を含むｐＥｓ２２９Ａ−６プラスミツドを調製するために、 Ｃ０ＰＡＫ−Ｈ６挿入プラスミツドｏｓＤ６５５をＳ　ｍ　ａ　Ｉで切断し、腸 アルカリホスファターゼで脱リン酸化した。プラスミツドをＥｃｒＲＩおよびＢ 　ａ　ｍ　ＨＩで切断して、　ＤＥＳ６０Ａプラスミツド（実施例４）から２． ６ＫｂのＦ　ＰＩＶ−３Ｆ　＊ｓｖ遺伝子を取り出した。　２．　６ＫｂＥｃｒ ＲＩ−ＨａｍＨＩＦ　ＰＩＶ−３Ｆ　ＲＩＩＶ遺伝子をタレノーポリメラーゼで 鈍端化し、低融点アガフォースゲルから単頭し、ＣＯＩ３　ＡＫ　−Ｉｔ　６挿 入プラスミツドｐＳＤ５５５のＳ　ｍ　ａ　１部位にクローン化して、　ｐＥ　 Ｓ　２２９　Ａ　−Ｉｔ　６ブラスミソドを構築した。これによってＦ　ｐＩｖ −３Ｆ　ＲＩＩＶ　ＯＲ１；は５′末端が１１６プロモーターに最も近い所にあ るように位置する。 ＰＳＤ、ＲＮプラスミツドを調製するため、まずｐＳＤ５５５ベクターをＳｍａ 　ＩおよびＢａｍＨＩで切断した。　Ｆ　Ｒ５Ｖ　−ＨＮ　ＰＩＶ−３１−ラン ケート遺伝子を含むｏＭＲＦ−ＨＮプラスミツド（実施例９）をＣ１ａ！で切断 し、タレノーポリメラーゼで鈍端化し、さらにＢａｍＨｌで切断した。３．３Ｋ ｂのＦＲＳＶ−ＨＮＰ！ｖ−３遺伝子をｐＳＤ５５５ベクターのＳｍａｌ−Ｂａ ｍＨ１部位にクローン化してＰＳＤ、ＲＮベクターを構築した。このようにして 、Ｈ６の５′末端がＨ６プロモーターの最も近くにあるようにＦ　Ｒ５Ｖ　−Ｈ Ｎ　ＰＩＶ−３０ＲＦを配置した。 レスキエーウイルスとしてＮＹＶＡＣ（νＰ８６６）を月い、　Ｄ　Ｅ　Ｓ　２ ２９　’Ａ　−６およびＰＳＤ、ＲＮプラスミツドを用いて、ベロ細胞における ｉｎ　ｖｉｔｒｏ組換え実験を行なった０組換えブロゲニーウイルスをウサギ腎 （ＲＫ）−１３ａｌｌ胞（ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ３７）上で選抜した。いくつかのプ ラクをＲＫ−１３１１胞上で２回通過させた。キメラ遺伝子を含むウィルスは、 ＰＩＶおよびＲ３Ｖ挿入ＤＮＡ配列に特異的な標鳳プローブを用いた標準的ｉｎ 　５ｉｔｕプラクハイブリツド化［Ｐｉｃｃｉｎｉら（１９８７）、Ｍ　ｅ’　 ｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、＋５３：５４５−５６３１によって 確認した。　Ｆ　ＰＩＶ−３−Ｐ　Ｒ５ＶおよびＦ　Ｒ５Ｖ　−ＨＮ　ＰＩＶ− ３キメラ遺伝子を含むプラク精製ウィルスは、それぞれνＰ１１９２およびｖＰ ＩＩ９５と命名した。 ｖＰＩ　１９２およびｖｐＨ９５感染綱胞におけるキメラ遺伝子の表現を確認す るために、ラジオイミエノ沈殿検定を行なった。この検定は、ベロウィルス感染 細胞から調製した綱胞簿融液について、モルモットのモノ特異性Ｐ［Ｖ−３抗− ＨＮおよび抗−Ｐ抗血清およびウサギの抗Ｒ３Ｖ　Ｆ抗血清を用いて行なった口 ’１ｙｌｏｒら（１９９０）Ｊ、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ６４；　１４４１−１４５０ １．　抗ｐｔｖ　ｐおよび抗Ｒ３Ｖ　Ｆ抗血清はｖＰ＋１９２１１ｋ染ベロ細胞 から見かけ分子量約９０ｋＤａのタンパクを沈殿させた。 抗Ｒ３Ｖ　Ｆおよびモルモットの抗ＰＩＶ　ＨＮ抗血清は、ｖＰｌ　１９５感染 ベロ細胞から見かけ分子量約１００ｋＤａのタンパクを沈殿させた。これらの結 果から、組換えポックスウィルス感染ベロ細胞において、Ｆ　ＰＩＶ−３−Ｆ　 Ｒ５ｖオ、Ｊ：びＦ　Ｒ５Ｖ　−ＨＮ　ＰＩＶ−３キメラタンパクの生産が確認 された。 開示の要約 本開示を要約すると、本発明は多くの病原体、特にＰＫｖおよびＲ５Ｖによる感 染に対する防護を誘導することのできるキメラタンパクを生産するマルチマーハ イブリッド遺伝子を提供するものである。本発明の範囲内で改良が可能である。 １７Ａ、Ｉ、ｌ　Ｒ５Ｖ　ａ遺伝子のヌクレオチド配列ＦＩＧ、７日。 業７０．口 Ｘ　ＩＯＢ、図 ＥｃｏＲｌ−ＢｓＬＢｌ制限ベクター取り出しＥｃｏＲＩ　ＰｐｕＭＩ ＡＣＣＡＧＴＴＧＴＣＡＧ　Ｇ　［；ＴＴＴＣＣＣＴＡＣＴＴＣＴＡＴＡ　Ｇ　 ＴＧ　ＴＴＴＴＧ　ＡＡＧ　ＣＴＴ苓１３邑 組換えバクロウィルス感染Ｓｆ９細胞溶融液の免疫プロット１　２　３　１　・ 　２３ Ａ　Ｂ 茗１５Ｂ、呂 ＴＧＡＴＴＡＡＧＧＴＡＧＴＴＴＴＣＡＣＴＴＴＴＣＣ６ＡにＴＡＣ茗１６畠 Ａ　Ｂ ￥１７．い　Ｐ　Ｉ　Ｖ−３ＦＩＥヶ、。突然変異茗１６．畠Ｗｆ’１Ｖ−１− Ｇ□５Ｖ−５ｉｌケ□。構築補正書の写しく翻訳文）提出書（特許法第１８４条 の８）平成６年７月　６日

Claims (58)

【特許請求の範囲】
1. １．第１の病原体からのタンパクの抗原領域をコード化した遺伝子配列と、それ にリンクした第２の病原体からのタンパクの抗原領域をコード化した遺伝子配列 とからなるマルチマーハイブリッド遺伝子。
2. ２．前記の第１および第２の病原体が細菌性およびウイルス性の病原体から選ば れることを特徴とする請求項１に記載のハイブリッド遺伝子。
3. ３．前記の第１および第２の病原体がウイルス性の病原体であことを特徴とする 請求項２に記載のハイブリッド遺伝子。
4. ４．前記の第１および第２の病原体が各種の呼吸器系疾患の病因となる病原体か ら選ぼれることを特徴とする請求項１に記載のハイブリッド遺伝子。
5. ５．前記の第１および第２の各種呼吸器系疾患の病因となる病原体がパラモキシ ビリデー系のウイルスから選ばれることを特徴とする請求項４に記載のハイブリ ッド遺伝子。
6. ６．前記遺伝子配列の少なくとも１つが抗原性を保持しながら突然変異を起こし たものであることを特徴とする請求項１に記載のハイブリッド遺伝子。
7. ７．前記の突然変異が予想前終了部位において起こっていることを特徴とする請 求項６に記載のハイブリッド遺伝子。
8. ８．前記の第１の病原体がパラインフルエンザウイルス（ＰＩＶ）であり、前記 の第２の病原体が呼吸系発疹ウイルス（ＲＳＶ）であることを特徴とする請求項 １に記載のハイブリッド遺伝子。
9. ９．呼吸系発疹ウイルス（ＲＳＶ）タンパクをコード化した少なくとも１つの遺 伝子配列にリンクしたパラインフルエンザウイルス（ＰＩＶ）タンパクをコード 化した少なくとも１つの遺伝子配列からなることを特徴とする請求項１に記載の ハイブリッド遺伝子。
10. １０．前記のパラインフルエンザウイルスタンパクがＰＩＶ−３ＦおよびＨＮタ ンパクから選ばれ、前記の呼吸系発疹ウイルスタンパクがＲＳＶＧおよびＦタン パクから選ばれることを特徴とする請求項９に記載のハイブリッド遺伝子。
11. １１．ヒトのＲＳＶＧまたはＦタンパクまたはその免疫原性エビトープを含むフ ラグメントをコード化した遺伝子配列にリンクしたヒトのＰＩＶ−３ＦまたはＨ Ｎタンパクまたはその免疫原性エピトープを含むフラグメントをコード化した遺 伝子配列からなる請求項１に記載のハイブリッド遺伝子。
12. １２．ＦＰＩＶ−３−ＦＲＳＶ、ＦＲＳＶ−ＨＮＰＩＶ−３およびＦＰＩＶ−３ −ＧＲＳＶハイブリッド遺伝子から選ばれる請求項１１に記載のハイブリッド遺 伝子。
13. １３．表現ベクター中に含まれる請求項１３に記載のハイブリッド遺伝子。
14. １４．ブラスミッドｐＡＣＤＲ７、ｐＤ２ＲＦ−ＨＮまたはｐＤ２Ｆ−Ｇを形成 している請求項１３に記載のハイブリッド遺伝子。
15. １５．さらに少なくとも１つの免疫原性かつ／または免疫刺激性分子をコード化 した少なくとも１つの遺伝子を含む請求項１に記載のハイブリッド遺伝子。
16. １６．前記遺伝子によりコード化されたキメラタンパクの表現のための請求項１ に記載のハイブリッド遺伝子を含む細胞。
17. １７．細歯の細胞、哺乳動物の細胞、昆虫の細胞、酵母の細胞または糸状菌の細 胞である請求項１６に記載の細胞．
18. １８．第１の病原体からのタンパクの抗原領域と、それにリンクした第２の病原 体からのタンパクの抗原領域とからなるキメラタンパク。
19. １９．第１および第２の病原体が細菌およびウイルス性病原体から選ばれる請求 項１８に記載のタンパク。
20. ２０．前記の第１および第２の病原体がウイルス性病原体であることを特徴とす る請求項１９に記載のタンパク。
21. ２１．前記第１および第２の病原体が各種呼吸器系疾患の病原体から選ばれるこ とを特徴とする請求項１８に記載のタンパク。
22. ２２．前記の各種呼吸器系疾患の第１および第２の病原体がパラモキシビリデー 系ウイルスから選ばれることを特赦とする請求項２１に記載のタンパク。
23. ２３．前記第１の病原体がパラインフルエンザウイルス（ＰＩＶ）から選ばれ、 前記第２の病原体が呼吸系発疹ウイルス（ＲＳＶ）から選ばれることを特徴とす る請求項１８に記載のタンパク。
24. ２４．少なくとも１つのパラインフルエンザウイルス（ＰＩＶ）タンパクと、そ れにリンクした少なくとも１つの呼吸系発疹ウイルス（ＲＳＶ）タンパクとから なる請求項１８に記載のタンパク。
25. ２５．前記ＰＩＶタンパクがＰＩＶ−３ＦおよびＨＮタンパクから選ばれ、前記 ＲＳＶタンパクがＲＳＶＧおよびＦタンパクから選ばれることを特徴とする請求 項２４に記載のタンパク。
26. ２６．ヒトのパラインフルエンザウイルスー３（ＰＩＶ−３）ＦまたはＨＮタン パクまたはその免疫原性エピトープを含むフラグメントと、それにリンクしたヒ トの呼吸系発疹ウイルス（ＲＳＶ）ＧまたはＦタンパクまたはその免疫原性エピ トープを含むフラグメントとからなる請求項１８に記載のタンパク。
27. ２７．ＦＰＩＶ−３−ＦＲＳＶ、ＦＲＳＶ−ＨＮＰＩＶ−３およびＦＰＩＶ−３ −ＧＲＳＶキメラタンパクから選ばれる請求項２６に記載のタンパク。
28. ２８．第１の病原体からのタンパクの抗原性領域をコード化している遺伝子配列 を単離し、 第２の病原体からのタンパクの抗原領域をコード化している遺伝子配列を単離し 、 前記の遺伝子配列をリンクさせてマルチマーハイブリッド遺伝子を形成させ、 細砲表現系中にマルチマーハイブリッド遺伝子を表現させることからなるキメラ タンパクの製造法。
29. ２９．前記マルチマーハイブリッド遺伝子がヒトのＲＳＶＧまたはＦタンパクま たはそのエビトープを含むフラグメントをコード化している遺伝子配列にリンク したＰＩＶ−ＦまたはＨＮタンパクまたはその免疫原性エビトープを含むフラグ メントをコード化している遺伝子配列からなることを特徴とする請求項２８に記 載の方法。
30. ３０．マルチマーハイブリッド遺伝子がＦＰ１Ｖ−３−ＦＲＳＶ、ＦＲＳＶ−Ｈ ＮＰＩＶ−３およびＰＰＩＶ−３−ＧＲＳＶハイブリッド遺伝子から選ばれるこ とを特徴とする請求項２９に記載の方法。
31. ３１．前記のマルチマーハイブリッド遺伝子がｐＡＣＱＲ７、ｐＤ２ＲＦ−ＨＮ またはｐＤ２Ｆ−Ｇブラスミッドを含む表現ベクター中に含まれることを特徴と する請求項２９に記載の方法。
32. ３２．前記細胞表現系が細菌の細胞、哺乳動物の細胞、昆虫の細胞、酵母の細胞 または糸状菌の細胞により提供されることを特徴とする請求項２８に記載の方法 。
33. ３３．前記の細胞表現系の培養培地からキメラタンパクを分離し、分離したキメ ラタンパクを精製することを含む請求項３２に記載の方法。
34. ３４．請求項１に記載の遺伝子を含む抗原運搬用生ベクター。
35. ３５．ウイルス系ベクターである請求項３４に記載の生ベクター。
36. ３６．前記のウイルス系ベクターがボックスウイルス、アデノウイルスおよびレ トロウイルス系ベクターから選ばれることを特徴とする請求項３５に記載の生ベ クター。
37. ３７．細菌ベクターである請求項３４に記載の生ベクター。
38. ３８．前記の細菌ベクターがサルモネラおよびミコバクテリアから選ばれること を特徴とする請求項３７に記載の生ベクター。
39. ３９．第１の病原体からのタンパクの抗原領域およびそれにリンクした第２の病 原体からのタンパクの抗原領域を含むキメラタンパクと、生理学的に許容される 担体とからなる複合感染疾病用ワクチン。
40. ４０．前記の第１および第２の病原体が細菌およびウイルス性病原体から選ばれ ることを特徴とする請求項３９に記載のワクチン。
41. ４１．さらに少なくとも１つの別の免疫原性および／または免疫刺激性分子を含 むことを特徴とする請求項３９に記載のワクチン。
42. ４２．前記の第１および第２の病原体がウイルス性病原体であることを特徴とす る請求項４０に記載のワクチン。
43. ４３．前記の第１および第２の病原体が浅部および深部の呼吸器系疾患を起こす 病原体から選ばれることを特徴とする請求項３９に記載のワクチン。
44. ４４．前記の第１の病原体がパラインフルエンザウイルス（ＰＩＶ）であり、前 記第２の病原体が呼吸系発疹ウイルス（ＲＳＶ）であることを特徴とする請求項 ３９に記載のワクチン。
45. ４５．ＰＩＶタンパクからなる少なくとも１つのセグメントまたはその免疫原性 エビトープを含むフラグメントとそれにリンクしたＲＳＶタンパクの少なくとも １つのセグメントまたはその免疫原性エビトープを含むフラグメントを含む組換 えマルチマータンパクと、その担体とからなるパラインフルエンザウイルス（Ｐ ＩＶ）および呼吸系発疹ウイルス（ＲＳＶ）感染に対するの請求項３９に記載の ワクチン。
46. ４６．前記組換えマルチマータンパクがＰＩＶ−３ＦまたはＨＮタンパクを含む セグメントまたはその免疫原性エビトープを含むフラグメントとそれにリンクし たＲＳＶＧまたはＦタンパクを含むフラグメントまたはその免疫原性エビトープ を含むフラグメントを含む組換えキメラタンパクであることを特徴とする請求項 ４５に記載のワクチン。
47. ４７．別のＰＩＶまたはＲＳＶまたはそのキメラタンパクを少なくとも１つ含む 請求項４６に記載のワクチン。
48. ４８．前記の担体がアジユバントからなることを特徴とする請求項３９に記載の ワクチン。
49. ４９．前記の担体がＩＳＣＯＭ、リポソームまたは徴粒子であることを特徴とす る請求項３９に記載のワクチン。
50. ５０．注射、鼻腔投与、または経口投与用に製剤化された請求項４６に記載のワ クチン。
51. ５１．さらに前記のマルチマータンパクを特に免疫系細胞に運搬する手段を有す る請求項３９に記載のワクチン。
52. ５２．前記の運搬手段が毒物分子または抗体からなることを特徴とする請求項５ １に記載のワクチン。
53. ５３．請求項３４に記載の生ベクターと、生理学的に許容されるその担体とから なり、多くの病原体の複合感染による疾病に対するワクチン。
54. ５４．請求項２８または５３に記載のワクチンの有効量を宿主に投与することか らなる、複合感染による疾病に対して宿主を免疫化する方法。
55. ５５．前記のワクチンがパラインフルエンザウイルス（ＰＩＶ）および呼吸系発 疹ウイルス（ＲＳＶ）により起こる疾病を防護するためのものであることを特徴 とする請求項５４に記載の方法。
56. ５６．前記の宿主が乳幼児、小児、妊婦、出産齢の婦人および感受性の高い個人 から選ばれることを特徴とする請求項５５に記載の方法。
57. ５７．請求項１８に記載のキメラタンパクからなり、宿主における各種病原体に よる感染を検出する方法。
58. ５８．請求項１８に記載の前記のキメラタンパクを使用することからなり、宿主 における各種病原体の感染を検出する方法。