JP3290662B2 - キメラ免疫原 - Google Patents
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Description
【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明は、多くの病原体の免疫原タンパクまたはタン
パクフラグメントをコード化した遺伝子からの配列を含
むマルチマーハイブリッド遺伝子の遺伝子工学および発
現（表現）に関する。
パクフラグメントをコード化した遺伝子からの配列を含
むマルチマーハイブリッド遺伝子の遺伝子工学および発
現（表現）に関する。
発明の背景 本発明におけるアプローチの長所は、広い範囲の病原
体から、防御抗体を含む単一免疫原を製造することであ
る。このようなキメラは、特に究極的に単回投与多価ワ
クチンを製造することを目的とした混合ワクチンの開発
を著しく単純化する。現在、多価ワクチンは病原体また
はその抗体を個別に生産し、それらを混合して製剤化す
ることによって製造されているため、手間がかかり、コ
ストが高く、製造工程が複雑化する。それに対して、広
い範囲の病気に対して防御効果のある単一免疫原が得ら
れると、多価ワクチンの製造に関連する多くの問題を解
決することができる。ここに提供するいくつかのキメラ
免疫原は、それらを混合することによって、多価ワクチ
ンに要求される各抗原の数を減らすことができる。
体から、防御抗体を含む単一免疫原を製造することであ
る。このようなキメラは、特に究極的に単回投与多価ワ
クチンを製造することを目的とした混合ワクチンの開発
を著しく単純化する。現在、多価ワクチンは病原体また
はその抗体を個別に生産し、それらを混合して製剤化す
ることによって製造されているため、手間がかかり、コ
ストが高く、製造工程が複雑化する。それに対して、広
い範囲の病気に対して防御効果のある単一免疫原が得ら
れると、多価ワクチンの製造に関連する多くの問題を解
決することができる。ここに提供するいくつかのキメラ
免疫原は、それらを混合することによって、多価ワクチ
ンに要求される各抗原の数を減らすことができる。
ヒトのパラインフルエンザウイルス（PIV）１、２、
３型ならびに呼吸系発疹ウイルス（RSV）ＡおよびＢ
は、乳幼児および小児における重度な呼吸器系感染を引
き起こす主要なウイルス性病原体である。米国だけで
も、１歳未満の乳幼児約160万人が毎年臨床的に顕著なR
SV感染に罹り、さらに140万人の乳幼児がPIV−３に感染
している。米国では、毎年RSVおよびPIV−３の感染によ
る重度の呼吸器系疾患の併発によって、１歳未満の乳幼
児約4000人が死亡している。WHOならびにNIALDワクチン
諮問委員会は、ワクチンの開発においてHIVについで重
要な対象にあげ、PIV−３に有効なワクチン調製物をワ
クチン開発順位のトップテンにあげている。
３型ならびに呼吸系発疹ウイルス（RSV）ＡおよびＢ
は、乳幼児および小児における重度な呼吸器系感染を引
き起こす主要なウイルス性病原体である。米国だけで
も、１歳未満の乳幼児約160万人が毎年臨床的に顕著なR
SV感染に罹り、さらに140万人の乳幼児がPIV−３に感染
している。米国では、毎年RSVおよびPIV−３の感染によ
る重度の呼吸器系疾患の併発によって、１歳未満の乳幼
児約4000人が死亡している。WHOならびにNIALDワクチン
諮問委員会は、ワクチンの開発においてHIVについで重
要な対象にあげ、PIV−３に有効なワクチン調製物をワ
クチン開発順位のトップテンにあげている。
現在のところ、乳幼児のこれらのウイルスに対する感
染に有効で、かつ安全なワクチンはなく、緊急に必要と
されている。ホルムアルデヒド処理ウイルスワクチンや
希釈生ウイルスワクチンは、これらのウイルス感染に対
する防御ワクチンとしての効果が必ずしも十分ではない
ことが臨床的に確認されている。例えば、ホルマリン処
理RSVワクチンを投与した乳幼児は、その後RSVに自然感
染すると対照群と比較して一層重度な深部呼吸器系疾患
を発症する（Am.J.Epidemiology 89,1969,405−421頁;
J.Inf.Dis.145,1982,311−319頁）。さらに、免疫アフ
ィニティ−クロマトグラフィーを用い、酸性溶媒で溶出
して精製したRSV糖タンパクは、cotton ratsにおいて
免疫増強を誘導する（Vaccine,10（７）,1992,475−484
頁）。有効で、かつワクチン投与後野生型ウイルスを注
射しても重度な呼吸器系疾患が現われないPIV−３およ
びRSVワクチンの開発は、医療上大きな意義がある。パ
ラインフルエンザウイルスおよび呼吸系発疹ウイルスの
混合感染による疾病に対して、乳幼児を同時に防護する
ことのできる遺伝子組換え単一免疫原を開発することに
よって、これらのウイルスの感染によって起こる重度の
疾病および死亡を著しく低減することができる。
染に有効で、かつ安全なワクチンはなく、緊急に必要と
されている。ホルムアルデヒド処理ウイルスワクチンや
希釈生ウイルスワクチンは、これらのウイルス感染に対
する防御ワクチンとしての効果が必ずしも十分ではない
ことが臨床的に確認されている。例えば、ホルマリン処
理RSVワクチンを投与した乳幼児は、その後RSVに自然感
染すると対照群と比較して一層重度な深部呼吸器系疾患
を発症する（Am.J.Epidemiology 89,1969,405−421頁;
J.Inf.Dis.145,1982,311−319頁）。さらに、免疫アフ
ィニティ−クロマトグラフィーを用い、酸性溶媒で溶出
して精製したRSV糖タンパクは、cotton ratsにおいて
免疫増強を誘導する（Vaccine,10（７）,1992,475−484
頁）。有効で、かつワクチン投与後野生型ウイルスを注
射しても重度な呼吸器系疾患が現われないPIV−３およ
びRSVワクチンの開発は、医療上大きな意義がある。パ
ラインフルエンザウイルスおよび呼吸系発疹ウイルスの
混合感染による疾病に対して、乳幼児を同時に防護する
ことのできる遺伝子組換え単一免疫原を開発することに
よって、これらのウイルスの感染によって起こる重度の
疾病および死亡を著しく低減することができる。
PIV−３およびRSVに対する防御反応は、主要なウイル
ス表面糖タンパクに対する中和抗体の誘導によると報告
されている。PIVの場合、これらの防護免疫原は、72kDa
の分子量を有し、血液凝固反応およびノイラミニターゼ
活性を有するHNタンパク、ならびに分子量が65kDaで、
宿主細胞膜に対するウイルスの融合およびウイルスの細
胞間伝搬に関与する溶融（Ｆ）タンパクである。RSVの
場合、この２種類の主要な免疫原タンパクは80〜90kDA
のＧ糖タンパクおよび70kDAの溶融（Ｆ）タンパクであ
る。ＧおよびＦタンパクは、それぞれPIVのHNおよびＦ
タンパクに対して機能的に相同であると考えられてい
る。PIVおよびRSVのＦ糖タンパクは不活性前駆体（FO）
として合成し、それをタンパク分解酵素によりジスルフ
ィド結合を有するＮ−末端F2およびＣ−末端F1フラグメ
ントに分解する。
ス表面糖タンパクに対する中和抗体の誘導によると報告
されている。PIVの場合、これらの防護免疫原は、72kDa
の分子量を有し、血液凝固反応およびノイラミニターゼ
活性を有するHNタンパク、ならびに分子量が65kDaで、
宿主細胞膜に対するウイルスの融合およびウイルスの細
胞間伝搬に関与する溶融（Ｆ）タンパクである。RSVの
場合、この２種類の主要な免疫原タンパクは80〜90kDA
のＧ糖タンパクおよび70kDAの溶融（Ｆ）タンパクであ
る。ＧおよびＦタンパクは、それぞれPIVのHNおよびＦ
タンパクに対して機能的に相同であると考えられてい
る。PIVおよびRSVのＦ糖タンパクは不活性前駆体（FO）
として合成し、それをタンパク分解酵素によりジスルフ
ィド結合を有するＮ−末端F2およびＣ−末端F1フラグメ
ントに分解する。
組換え株のPIVおよびRSVからの表面糖タンパクは、そ
れぞれ杆状ウイルスを用いて昆虫の細胞［Rayら（198
9）,Virus Reasearch,12:169−180;Coelinghら（198
7）,Virology,160:465−472;Wathenら（1989）,J.of I
nf.Dis.159:253−263］ならびに組換えボックスウイル
スに感染した哺乳動物細胞［Spriggsら（1987）,J.Viro
l.61:3416−3423;Stottら（1987）,J.Virol.61:3855−3
861］に表現されている。これらの系で生産された組換
え抗原は、コットンラットに免疫投与すると生ウイルス
の人工感染に対して防御効果のあることが知られてい
る。最近、ハイブリッドRSV Ｆ−Ｇ［Wathenら（198
9）,J.Gen.Virol.70;2625−2635;Wathen,国際特許公報W
O 89/05823］およびPIV−３ Ｆ−HN［Wathen,国際特
許公報WO 89/10405］組換え抗原が哺乳動物および昆虫
の細胞で製造されている。RSV Ｆ−Ｇハイブリッド抗
原は弱い抗Ｇ抗体反応しか示さない［Connorsら（199
2）,Vaccine10:475−484］が、cotton ratsにおいて防
御効果があることが知られている［Wathenら（1989）,
J.Gen.Virol.70:2637−2644］。PIV−３ Ｆ−HNタンパ
クの防御作用については、公開された出願特許で報告さ
れていない。これらの抗原は、相同ウイルス、すなわち
RSVまたはPIV−３のいずれかのみに対する防御を目的と
して遺伝子組換えが行なわれている。しかし、PIVおよ
びRSVから少なくとも１つの防御抗原を含む組換え単一
免疫原を遺伝子工学的に調製し、製造できると、各ウイ
ルス感染から乳幼児および小児を同時に防御できるため
有利であり、経済的である。このような目的でここに提
供されたキメラタンパクは、PIVおよびRSVに対する母体
抗体を刺激するために、妊婦または出産齢の婦人にも適
用することができる。さらに、当該ワクチンはその他老
人等の感受性の高い個人にも投与することができる。
れぞれ杆状ウイルスを用いて昆虫の細胞［Rayら（198
9）,Virus Reasearch,12:169−180;Coelinghら（198
7）,Virology,160:465−472;Wathenら（1989）,J.of I
nf.Dis.159:253−263］ならびに組換えボックスウイル
スに感染した哺乳動物細胞［Spriggsら（1987）,J.Viro
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え抗原は、コットンラットに免疫投与すると生ウイルス
の人工感染に対して防御効果のあることが知られてい
る。最近、ハイブリッドRSV Ｆ−Ｇ［Wathenら（198
9）,J.Gen.Virol.70;2625−2635;Wathen,国際特許公報W
O 89/05823］およびPIV−３ Ｆ−HN［Wathen,国際特
許公報WO 89/10405］組換え抗原が哺乳動物および昆虫
の細胞で製造されている。RSV Ｆ−Ｇハイブリッド抗
原は弱い抗Ｇ抗体反応しか示さない［Connorsら（199
2）,Vaccine10:475−484］が、cotton ratsにおいて防
御効果があることが知られている［Wathenら（1989）,
J.Gen.Virol.70:2637−2644］。PIV−３ Ｆ−HNタンパ
クの防御作用については、公開された出願特許で報告さ
れていない。これらの抗原は、相同ウイルス、すなわち
RSVまたはPIV−３のいずれかのみに対する防御を目的と
して遺伝子組換えが行なわれている。しかし、PIVおよ
びRSVから少なくとも１つの防御抗原を含む組換え単一
免疫原を遺伝子工学的に調製し、製造できると、各ウイ
ルス感染から乳幼児および小児を同時に防御できるため
有利であり、経済的である。このような目的でここに提
供されたキメラタンパクは、PIVおよびRSVに対する母体
抗体を刺激するために、妊婦または出産齢の婦人にも適
用することができる。さらに、当該ワクチンはその他老
人等の感受性の高い個人にも投与することができる。
発明の概要 本発明は、その広い側面において、第１の病原体から
のタンパクの抗原領域をコード化した遺伝子配列と、そ
れにリンクした第２の病原体からのタンパクの抗原領域
をコード化した遺伝子配列を有するマルチマーハイブリ
ッド遺伝子およびこれらマルチマーハイブリッド遺伝子
によりコード化されたキメラタンパクを提供するもので
ある。これらキメラタンパクは、第１の病原体からのタ
ンパクの抗原領域と、それにリンクした第２の病原体か
らのタンパクの抗原領域を有する。
のタンパクの抗原領域をコード化した遺伝子配列と、そ
れにリンクした第２の病原体からのタンパクの抗原領域
をコード化した遺伝子配列を有するマルチマーハイブリ
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によりコード化されたキメラタンパクを提供するもので
ある。これらキメラタンパクは、第１の病原体からのタ
ンパクの抗原領域と、それにリンクした第２の病原体か
らのタンパクの抗原領域を有する。
第１および第２の病原体は細菌性またはウイルス性の
病原体から選ぶが、実施例によっては両者ともウイルス
性の病原体であってもよい。
病原体から選ぶが、実施例によっては両者ともウイルス
性の病原体であってもよい。
第１および第２の病原体は異なった呼吸器疾患、すな
わち浅部および深部呼吸器系疾患を起こす病原体から選
んでもよい。好ましい実施例において、第１の病原体は
パラインフルエンザウイルスであり、第２の病原体は呼
吸系発疹ウイルスである。特にPIVタンパクはPIV−３
ＦおよびHNタンパクから選び、RSVタンパクは特にRSV
ＧおよびＦタンパクから選ぶ。
わち浅部および深部呼吸器系疾患を起こす病原体から選
んでもよい。好ましい実施例において、第１の病原体は
パラインフルエンザウイルスであり、第２の病原体は呼
吸系発疹ウイルスである。特にPIVタンパクはPIV−３
ＦおよびHNタンパクから選び、RSVタンパクは特にRSV
ＧおよびＦタンパクから選ぶ。
本発明の別の側面は、前記遺伝子によりコード化され
たキメラタンパクを表現するマルチマーハイブリッド遺
伝子を含み、複合病原体により起こる呼吸器系疾患を防
御ることのできる細胞を提供するものである。前記の細
胞は、細菌の細胞、哺乳動物の細胞、昆虫の細胞、酵母
の細胞または糸状菌の細胞であってもよい。さらに、本
発明はマルチマーハイブリッド遺伝子を含む抗原を運搬
するために生きたベクターを提供する。このベクターは
ウイルスベクターまたは細菌ベクターであってもよく、
それらの生理学的に許容される担体であってもよい。前
記の生きたベクターは、複合感染により起こる疾患に対
するワクチンの活性成分を構成することができる。前記
のワクチンは、注射、吸入または経口投与用に製剤化す
ることができる。
たキメラタンパクを表現するマルチマーハイブリッド遺
伝子を含み、複合病原体により起こる呼吸器系疾患を防
御ることのできる細胞を提供するものである。前記の細
胞は、細菌の細胞、哺乳動物の細胞、昆虫の細胞、酵母
の細胞または糸状菌の細胞であってもよい。さらに、本
発明はマルチマーハイブリッド遺伝子を含む抗原を運搬
するために生きたベクターを提供する。このベクターは
ウイルスベクターまたは細菌ベクターであってもよく、
それらの生理学的に許容される担体であってもよい。前
記の生きたベクターは、複合感染により起こる疾患に対
するワクチンの活性成分を構成することができる。前記
のワクチンは、注射、吸入または経口投与用に製剤化す
ることができる。
本発明の別の側面は、第１の病原体からのタンパクの
抗原領域をコード化した遺伝子配列の単離、第２の病原
体からのタンパクの抗原領域をコード化した遺伝子配列
の単離、前記の各遺伝子配列をリンクさせることによる
マルチマーハイブリッド遺伝子の形成、および細胞表面
系におけるマルチマーハイブリッド遺伝子の表現から成
るキメラタンパクの調製法を提供するものである。前記
の第１および第２の病原体は各種の呼吸器系疾患を起こ
す細菌性およびウイルス性病原体から選ぶことができ
る。前記の細胞表面系は、細菌の細胞、哺乳動物の細
胞、昆虫の細胞、酵母の細胞または糸状菌の細胞によっ
て提供される。遺伝子表現のキメラタンパク産物を、細
胞表現系の培地から分離し、精製する。
抗原領域をコード化した遺伝子配列の単離、第２の病原
体からのタンパクの抗原領域をコード化した遺伝子配列
の単離、前記の各遺伝子配列をリンクさせることによる
マルチマーハイブリッド遺伝子の形成、および細胞表面
系におけるマルチマーハイブリッド遺伝子の表現から成
るキメラタンパクの調製法を提供するものである。前記
の第１および第２の病原体は各種の呼吸器系疾患を起こ
す細菌性およびウイルス性病原体から選ぶことができ
る。前記の細胞表面系は、細菌の細胞、哺乳動物の細
胞、昆虫の細胞、酵母の細胞または糸状菌の細胞によっ
て提供される。遺伝子表現のキメラタンパク産物を、細
胞表現系の培地から分離し、精製する。
さらに、本発明は複合感染により起こる疾患に対する
ワクチンであって、マルチマーハイブリッド遺伝子によ
りコード化されたキメラタンパクと生理学的に許容され
るその担体とから成るワクチンを含む。前記のワクチン
は注射、吸入または経口投与用に製剤化することができ
る。
ワクチンであって、マルチマーハイブリッド遺伝子によ
りコード化されたキメラタンパクと生理学的に許容され
るその担体とから成るワクチンを含む。前記のワクチン
は注射、吸入または経口投与用に製剤化することができ
る。
本発明で提供するワクチンは、複合感染、特にパライ
ンフルエンザウイルスおよび呼吸系発疹ウイルスにより
起こる疾患に対する宿主の免疫賦与を目的として、前記
ワクチンの有効量を投与することによって使用される。
前記のように、ヒトのPIVおよびRSVの場合、宿主は乳幼
児および小児、妊婦ならびに出産齢の婦人、および老人
等の感受性の高い個人である。
ンフルエンザウイルスおよび呼吸系発疹ウイルスにより
起こる疾患に対する宿主の免疫賦与を目的として、前記
ワクチンの有効量を投与することによって使用される。
前記のように、ヒトのPIVおよびRSVの場合、宿主は乳幼
児および小児、妊婦ならびに出産齢の婦人、および老人
等の感受性の高い個人である。
本発明で提供するキメラタンパクは、適当な検定手順
を用いて、宿主における各種病原体による感染を検出す
るための診断試薬として使用することもできる。
を用いて、宿主における各種病原体による感染を検出す
るための診断試薬として使用することもできる。
本発明は主としてPIVおよびRSVの感染により起こる疾
患に対する免疫獲得に有効なキメラタンパクについて記
載するが、ここに提供する発明は単一分子中にリンクし
た各病原体からの抗原を有し、多くの病原体によって起
こる疾患に対する免疫獲得に有効なキメラタンパク、な
らびに前記キメラタンパクをコード化した遺伝子を包含
するものである。
患に対する免疫獲得に有効なキメラタンパクについて記
載するが、ここに提供する発明は単一分子中にリンクし
た各病原体からの抗原を有し、多くの病原体によって起
こる疾患に対する免疫獲得に有効なキメラタンパク、な
らびに前記キメラタンパクをコード化した遺伝子を包含
するものである。
本発明において、「マルチマーハイブリッド遺伝子」
とは各種の病原体からのタンパクの抗原領域をコード化
した遺伝子を意味し、「キメラタンパク」とは各種病原
体からのタンパクの抗原領域を有する免疫原を意味す
る。
とは各種の病原体からのタンパクの抗原領域をコード化
した遺伝子を意味し、「キメラタンパク」とは各種病原
体からのタンパクの抗原領域を有する免疫原を意味す
る。
図面の簡単な説明 図１は、それぞれPCR増幅PIV−３ Ｆ遺伝子およびＦ
タンパクのヌクレオチド配列（SEQ ID No.1）および
アミノ酸配列（SEQ ID No.2）を示す。
タンパクのヌクレオチド配列（SEQ ID No.1）および
アミノ酸配列（SEQ ID No.2）を示す。
図２は、PIV−３ Ｆ遺伝子の制限マップを示す。
図３は、それぞれPIV−３ HN遺伝子およびHNタンパ
クのヌクレオチド配列（SEQ ID No.3）およびアミノ
酸配列（SEQ ID No.4）を示す。
クのヌクレオチド配列（SEQ ID No.3）およびアミノ
酸配列（SEQ ID No.4）を示す。
図４は、PIV−３ HN遺伝子の制限マップを示す。
図５は、それぞれRSV Ｆ遺伝子およびRSV Ｆタンパ
クのヌクレオチド配列（SEQ ID No.5）およびアミノ
酸配列（SEQ ID No.6）を示す。
クのヌクレオチド配列（SEQ ID No.5）およびアミノ
酸配列（SEQ ID No.6）を示す。
図６は、RSV Ｆ遺伝子の制限マップを示す。
図７は、それぞれRSV Ｇ遺伝子およびRSV Ｇタンパ
クのヌクレオチド配列（SEQ ID No.7）およびアミノ
酸配列（SEQ ID No.8）を示す。
クのヌクレオチド配列（SEQ ID No.7）およびアミノ
酸配列（SEQ ID No.8）を示す。
図８は、RSV Ｇ遺伝子の制限マップを示す。
図９は、ＦPIV-3−ＦRSVキメラ遺伝子を含む表現ベク
ターの構築工程を示す。
ターの構築工程を示す。
図10は、5'非翻訳配列、膜内外アンカーおよび細胞質
テールコード領域を欠くＦPIV-3遺伝子を含む表現ベク
ターの構築工程を示す。
テールコード領域を欠くＦPIV-3遺伝子を含む表現ベク
ターの構築工程を示す。
図11は、トランケートRSV F1遺伝子にリンクした5'
非翻訳配列を欠くトランケートPIV−３ Ｆ遺伝子を含
むＦPIV-3−ＦRSVキメラ遺伝子を含む表現ベクターの構
築工程を示す。
非翻訳配列を欠くトランケートPIV−３ Ｆ遺伝子を含
むＦPIV-3−ＦRSVキメラ遺伝子を含む表現ベクターの構
築工程を示す。
図12は、トランケートRSV F1遺伝子にリンクした5'
非翻訳配列ならびに膜内外および細胞質テールコード領
域を欠くPIV−３ Ｆ遺伝子を含むＦPIV-3−ＦRSVキメ
ラ遺伝子を含む修飾pAC 610パクロウイルス表現ベクタ
ーの構築工程を示す。
非翻訳配列ならびに膜内外および細胞質テールコード領
域を欠くPIV−３ Ｆ遺伝子を含むＦPIV-3−ＦRSVキメ
ラ遺伝子を含む修飾pAC 610パクロウイルス表現ベクタ
ーの構築工程を示す。
図13は、組換えバクロウイルスに感染したSf9細胞か
らの細胞溶解物の免疫ブロットを示す。
らの細胞溶解物の免疫ブロットを示す。
図14は、バクロウイルス転移ベクターの構築工程を示
す。
す。
図15は、ＦRSV−HN PIV−３キメラ遺伝子の構築工程
を示す。
を示す。
図16は、精製ＦRSV−HN PIV−３キメラタンパクのSDS
−PAGEゲルおよび免疫ブロットを示す。
−PAGEゲルおよび免疫ブロットを示す。
図17は、PIV−３ Ｆ遺伝子の突然変異を説明する図
である。
である。
図18は、ＦPIV-3およびＧRSVキメラ遺伝子の構築工程
を示す。
を示す。
発明の一般的説明 本発明において、２種類の主要幼児疾患に対して防御
作用を有するキメラ分子を提供する。本発明は、特にPI
VおよびRSVの感染により起こる疾患に対して乳幼児およ
び小児ならびにその他の感受性の高い個人を防護するこ
とのできる安全で、かつ有効なワクチンを製造するため
の各種組換えパラインフルエンザウイルス（PIV）／呼
吸系発疹ウイルス免疫原の製剤に関する。しかし、前記
のように、本発明は多くの病原体からの防護抗体をコー
ド化した遺伝子を含むマルチマーハイブリッド遺伝子の
構築を包含する。前記ワクチンは、注射用ワクチン、吸
入または経口投与等必要とするあらゆる方法で投与する
ことができる。
作用を有するキメラ分子を提供する。本発明は、特にPI
VおよびRSVの感染により起こる疾患に対して乳幼児およ
び小児ならびにその他の感受性の高い個人を防護するこ
とのできる安全で、かつ有効なワクチンを製造するため
の各種組換えパラインフルエンザウイルス（PIV）／呼
吸系発疹ウイルス免疫原の製剤に関する。しかし、前記
のように、本発明は多くの病原体からの防護抗体をコー
ド化した遺伝子を含むマルチマーハイブリッド遺伝子の
構築を包含する。前記ワクチンは、注射用ワクチン、吸
入または経口投与等必要とするあらゆる方法で投与する
ことができる。
本発明において、発明者らは特にタンデムにリンクし
たPIV−３およびRSV表面糖タンパクをコード化した特定
の遺伝子からの相当する配列を含むいくつかのPIV/RSV
キメラ遺伝子モデルを遺伝子工学的に構築した。ここに
記載されたキメラ構造における遺伝子は、いずれも最近
臨床的に単離したPIV−３およびRSVから得たものであ
る。前記のキメラ遺伝子は、考えられるあらゆる相対的
方位および組合せで、RSV ＦまたはＧ遺伝子のいずれ
かにタンデムにリンクしたPIV−３ ＦまたはHN遺伝子
のいずれかからの遺伝子配列を含むことができる。
たPIV−３およびRSV表面糖タンパクをコード化した特定
の遺伝子からの相当する配列を含むいくつかのPIV/RSV
キメラ遺伝子モデルを遺伝子工学的に構築した。ここに
記載されたキメラ構造における遺伝子は、いずれも最近
臨床的に単離したPIV−３およびRSVから得たものであ
る。前記のキメラ遺伝子は、考えられるあらゆる相対的
方位および組合せで、RSV ＦまたはＧ遺伝子のいずれ
かにタンデムにリンクしたPIV−３ ＦまたはHN遺伝子
のいずれかからの遺伝子配列を含むことができる。
本発明で提供するキメラ遺伝子構造は、完全な遺伝子
配列またはその免疫原および防護エピトープをコード化
した遺伝子セグメントから成る。これら遺伝子の天然ヌ
クレオチド配列は抗原性を保持させながら突然変異によ
り修飾してもよい。このような修飾には、真核細胞にお
けるその表現を最大限発揮させることを目的とした、推
定上の前転写ターミネターの除去も含まれる。前記の遺
伝子は、パラインフルエンザウイルスおよび呼吸系発疹
ウイルスに対して防護抗原を誘導する遺伝子産物を生成
するため、単一構造にタンデムにリンクしたハイブリッ
ドPIV−RSV表面糖タンパクをコード化するように設計さ
れている。このようなマルチマーハイブリッド遺伝子
は、ヒトのRSV ＧまたはＦタンパクまたは免疫原エピ
トープを含むそのフラグメントをコード化した遺伝子配
列にリンクしたヒトのPIV−３ ＦまたはHNタンパクま
たは免疫原エピトープを含むそのフラグメントをコード
化した遺伝子配列から成る。使用できる遺伝子産物の具
体例は、ＦPIV-3−ＦRSV、ＦRSV−HN PIV−３およびＦP
IV-3−ＧRSVハイブリッド遺伝子である。
配列またはその免疫原および防護エピトープをコード化
した遺伝子セグメントから成る。これら遺伝子の天然ヌ
クレオチド配列は抗原性を保持させながら突然変異によ
り修飾してもよい。このような修飾には、真核細胞にお
けるその表現を最大限発揮させることを目的とした、推
定上の前転写ターミネターの除去も含まれる。前記の遺
伝子は、パラインフルエンザウイルスおよび呼吸系発疹
ウイルスに対して防護抗原を誘導する遺伝子産物を生成
するため、単一構造にタンデムにリンクしたハイブリッ
ドPIV−RSV表面糖タンパクをコード化するように設計さ
れている。このようなマルチマーハイブリッド遺伝子
は、ヒトのRSV ＧまたはＦタンパクまたは免疫原エピ
トープを含むそのフラグメントをコード化した遺伝子配
列にリンクしたヒトのPIV−３ ＦまたはHNタンパクま
たは免疫原エピトープを含むそのフラグメントをコード
化した遺伝子配列から成る。使用できる遺伝子産物の具
体例は、ＦPIV-3−ＦRSV、ＦRSV−HN PIV−３およびＦP
IV-3−ＧRSVハイブリッド遺伝子である。
さらに、本発明はその他のマルチマー遺伝子、例えば
考えられる全ての相対的方位にリンクしたPIVおよびRSV
遺伝子または遺伝子セググメントを含むトリマー遺伝子
の構造も包含する。例えば、 FPIV−HNPIV−ＦまたはGRSV FPIV−FRSV−GRSV HNPIV−FRSV−GRSV 本発明で提供するマルチマー遺伝子は、少なくとも１
つの免疫原性または免疫刺激性分子をコード化した少な
くとも１つの遺伝子から成っていてもよい。
考えられる全ての相対的方位にリンクしたPIVおよびRSV
遺伝子または遺伝子セググメントを含むトリマー遺伝子
の構造も包含する。例えば、 FPIV−HNPIV−ＦまたはGRSV FPIV−FRSV−GRSV HNPIV−FRSV−GRSV 本発明で提供するマルチマー遺伝子は、少なくとも１
つの免疫原性または免疫刺激性分子をコード化した少な
くとも１つの遺伝子から成っていてもよい。
本発明で提供するマルチマーハイブリッド遺伝子は、
細胞表現系に表現するために適当なベクター中にサブク
ーロン化されていてもよい。前記の細胞表現系は細胞、
哺乳動物、昆虫、酵母等の糸状菌の細胞を包含する。
細胞表現系に表現するために適当なベクター中にサブク
ーロン化されていてもよい。前記の細胞表現系は細胞、
哺乳動物、昆虫、酵母等の糸状菌の細胞を包含する。
本発明で提供するキメラタンパクは、組換えポックス
ウイルス、アデノウイルス、レトロウイルス、セムリキ
フォレスト ウイルス等の生きたウイルスベクターお
よびサルモネラ菌およびマイコバクテリア（例えばBC
G）等の生きた細菌ベクターを含む生きたベクターを用
いて免疫系に提供することができる。
ウイルス、アデノウイルス、レトロウイルス、セムリキ
フォレスト ウイルス等の生きたウイルスベクターお
よびサルモネラ菌およびマイコバクテリア（例えばBC
G）等の生きた細菌ベクターを含む生きたベクターを用
いて免疫系に提供することができる。
PIV/RSVキメラ等のキメラタンパクは、接種細胞、転
移細胞または感染細胞の上清または細胞溶融液中に存在
し、従来の方法によって精製することができる。
移細胞または感染細胞の上清または細胞溶融液中に存在
し、従来の方法によって精製することができる。
キメラタンパクの免疫原性および防御作用を評価する
ためには、適当な実験動物にPIV/RSVキメラ等の精製キ
メラタンパクまたは前記の生きた組換えベクターを各種
の用量で免疫投与する。前記のキメラタンパクは、リン
酸アルミニウム等の生理学的に許容される担体を用いる
か、ISCOMSおよびリボソーム等の運搬手段を用いて免疫
系に到達させることができる。また、粘膜反応を発揮で
きるように、例えばコレラ毒素Ｂサブユニット等の免疫
標的担体と供役または結合させるか、または微粒子中に
混入してキメラを製剤化することもできる。また、前記
のワクチンは、毒素分子または抗体等の免疫系にマルチ
マータンパクを特異的に運搬する手段を含んでいてもよ
い。さらに、キメラタンパクの免疫防御作用を増強させ
るために、別の免疫原性または免疫刺激性分子を添加し
てもよい。特に本発明で記載するPIV/RSVキメラタンパ
クは、PIV−３およびRSVにより起こる疾患から防護する
ためのワクチン注射液を製造するために、リン酸アルミ
ニウム等のアジュバントで製剤化することもできる。ま
た、前記のキメラタンパクはPIV−３およびRSVによる感
染を診断するための試験キットに使用することもでき
る。
ためには、適当な実験動物にPIV/RSVキメラ等の精製キ
メラタンパクまたは前記の生きた組換えベクターを各種
の用量で免疫投与する。前記のキメラタンパクは、リン
酸アルミニウム等の生理学的に許容される担体を用いる
か、ISCOMSおよびリボソーム等の運搬手段を用いて免疫
系に到達させることができる。また、粘膜反応を発揮で
きるように、例えばコレラ毒素Ｂサブユニット等の免疫
標的担体と供役または結合させるか、または微粒子中に
混入してキメラを製剤化することもできる。また、前記
のワクチンは、毒素分子または抗体等の免疫系にマルチ
マータンパクを特異的に運搬する手段を含んでいてもよ
い。さらに、キメラタンパクの免疫防御作用を増強させ
るために、別の免疫原性または免疫刺激性分子を添加し
てもよい。特に本発明で記載するPIV/RSVキメラタンパ
クは、PIV−３およびRSVにより起こる疾患から防護する
ためのワクチン注射液を製造するために、リン酸アルミ
ニウム等のアジュバントで製剤化することもできる。ま
た、前記のキメラタンパクはPIV−３およびRSVによる感
染を診断するための試験キットに使用することもでき
る。
本発明はPIV−３およびRSVキメラタンパクの調製のみ
ならず、単一分子に順次リンクさせた少なくとも２種類
の病原体からの免疫原タンパクの完全な配列または領域
から成るキメラ免疫原の製造にも適用することができ
る。また、キメラ抗原は、各種病原体からの数種のタン
パクの免疫優勢エピトープを含むように合成することも
できる。これらのキメラ抗原はワクチンまたは診断薬と
して有用である。
ならず、単一分子に順次リンクさせた少なくとも２種類
の病原体からの免疫原タンパクの完全な配列または領域
から成るキメラ免疫原の製造にも適用することができ
る。また、キメラ抗原は、各種病原体からの数種のタン
パクの免疫優勢エピトープを含むように合成することも
できる。これらのキメラ抗原はワクチンまたは診断薬と
して有用である。
配列の識別 本願明細書では、いくつかのヌクレオチドおよびアミ
ノ酸の配列を引用する。その配列および配列の引用場所
を以下に示す。
ノ酸の配列を引用する。その配列および配列の引用場所
を以下に示す。
供託情報 本発明に記載または引用したある種のプラスミッドDN
Aは、ブタペスト条約に従い、本発明の出願前に米国メ
リーランド州ロックスビルにあるアメリカン タイプ
カルチャー コレクション（ATCC）に供託した。供託し
た精製プラスミッドは、本米国特許が確定するか、また
は相当するヨーロッパ特許が公開された段階で一般に開
放される。供託した実施例は本発明を説明するために過
ぎず、ここに記載または請求した発明は供託した構造の
プラスミッドDNAの範囲に限定されるものではない。以
下の精製プラスミッドを、1992年12月17日に、下記の受
け入れ番号でATCCに供託した。
Aは、ブタペスト条約に従い、本発明の出願前に米国メ
リーランド州ロックスビルにあるアメリカン タイプ
カルチャー コレクション（ATCC）に供託した。供託し
た精製プラスミッドは、本米国特許が確定するか、また
は相当するヨーロッパ特許が公開された段階で一般に開
放される。供託した実施例は本発明を説明するために過
ぎず、ここに記載または請求した発明は供託した構造の
プラスミッドDNAの範囲に限定されるものではない。以
下の精製プラスミッドを、1992年12月17日に、下記の受
け入れ番号でATCCに供託した。
プラスミッド 実施例 受け入れ番号 pAC DR7 5 75387 pD2RF−HN 9 75388 pD2F−Ｇ 16 75389 本願明細書に記載の抗原と同等な抗原を製造するため
に使用される相当するプラスミッドはいずれも本発明の
範囲に包含されるものである。
に使用される相当するプラスミッドはいずれも本発明の
範囲に包含されるものである。
実施例 上記の開示は、本発明の概要を記載したものである。
以下の実施例を引用して、本発明をさらに詳しく説明す
る。これらの実施例は本発明を説明するためのものであ
り、本発明を制限するためのものではない。状況が方策
を暗示または教示するため、形態の変更および相当物の
置換は容易に想像できるものである。ここでは特定の用
語を使用したが、このような用語は記述を目的としたも
のであり、制限を目的としたものではない。
以下の実施例を引用して、本発明をさらに詳しく説明す
る。これらの実施例は本発明を説明するためのものであ
り、本発明を制限するためのものではない。状況が方策
を暗示または教示するため、形態の変更および相当物の
置換は容易に想像できるものである。ここでは特定の用
語を使用したが、このような用語は記述を目的としたも
のであり、制限を目的としたものではない。
PIV−３およびRSV遺伝子のクローン化および配列決定
に用いた方法ならびに適当なベクター中への遺伝子のサ
ブクローン化および遺伝子構造の哺乳動物および昆虫細
胞中での表現に用いた手順は、本開示において明示的に
記載されていないが、当該技術分野の専門家にとっては
容易に理解できるものである。
に用いた方法ならびに適当なベクター中への遺伝子のサ
ブクローン化および遺伝子構造の哺乳動物および昆虫細
胞中での表現に用いた手順は、本開示において明示的に
記載されていないが、当該技術分野の専門家にとっては
容易に理解できるものである。
実施例1: この実施例ではPIV−３ Ｆ、HNおよびRSV Ｆ、Ｇ遺
伝子（Ａ型単離物からの）のクローン化および配列決定
手順を説明する。これらの遺伝子は、それぞれ実施例２
から４、９および15に記載したＦPIV-3−ＦRSV,ＦRSV−
HN PIV−３およびＦPIV-3−ＧRSVキメラ遺伝子の構築に
使用した。
伝子（Ａ型単離物からの）のクローン化および配列決定
手順を説明する。これらの遺伝子は、それぞれ実施例２
から４、９および15に記載したＦPIV-3−ＦRSV,ＦRSV−
HN PIV−３およびＦPIV-3−ＧRSVキメラ遺伝子の構築に
使用した。
まず、最近臨床的に単離したPIV−３から抽出したウ
イルスRNAに由来するcDNAのPCR増幅によって２種類のPI
V−３ Ｆ遺伝子クローンを得た。その他に臨床的に単
離したPIV−３またはRSV（Ａ型単離物）を感染させたMR
C−５細胞から単離したmRNAから調製したcDNAライブラ
リーから、２種類のPIV−３ Ｆ遺伝子クローンならび
にPIV−３ HN、RSV ＦおよびRSV Ｇ遺伝子をクロー
ン化した。前記のPIV−３ Ｆ（PCR増幅および非PCR増
幅）、PIV−３ HN、RSV ＦおよびRSV Ｇ遺伝子クロ
ーンの配列は、ジデオキシヌクレオチド鎖末端法により
決定した。遺伝子の両ストランドの配列は、マニュアル
と自動シーケンスを組合せて行なった。
イルスRNAに由来するcDNAのPCR増幅によって２種類のPI
V−３ Ｆ遺伝子クローンを得た。その他に臨床的に単
離したPIV−３またはRSV（Ａ型単離物）を感染させたMR
C−５細胞から単離したmRNAから調製したcDNAライブラ
リーから、２種類のPIV−３ Ｆ遺伝子クローンならび
にPIV−３ HN、RSV ＦおよびRSV Ｇ遺伝子をクロー
ン化した。前記のPIV−３ Ｆ（PCR増幅および非PCR増
幅）、PIV−３ HN、RSV ＦおよびRSV Ｇ遺伝子クロ
ーンの配列は、ジデオキシヌクレオチド鎖末端法により
決定した。遺伝子の両ストランドの配列は、マニュアル
と自動シーケンスを組合せて行なった。
それぞれPCR増幅PIV−３ Ｆ遺伝子およびＦタンパク
のヌクレオチド配列（SEQ ID No:1）およびアミノ酸
配列（SEQ ID No:2）を図１に示し、前記遺伝子の制
限マップを図２に示す。２種類のPCR増幅PIV−３ Ｆ遺
伝子クローンの1844ヌクレオチドの配列分析から、前記
２種類のクローンは同一であることが確認された。PCR
増幅PIV−３ Ｆ遺伝子クローンのコード化配列をすで
に公表されているPIV−３ Ｆ遺伝子と比較した結果、
２種類の遺伝子のコード化配列に2.6％の差があり、14
個のアミノ酸が置換されていることが明らかとなった。
のヌクレオチド配列（SEQ ID No:1）およびアミノ酸
配列（SEQ ID No:2）を図１に示し、前記遺伝子の制
限マップを図２に示す。２種類のPCR増幅PIV−３ Ｆ遺
伝子クローンの1844ヌクレオチドの配列分析から、前記
２種類のクローンは同一であることが確認された。PCR
増幅PIV−３ Ｆ遺伝子クローンのコード化配列をすで
に公表されているPIV−３ Ｆ遺伝子と比較した結果、
２種類の遺伝子のコード化配列に2.6％の差があり、14
個のアミノ酸が置換されていることが明らかとなった。
非PCR増幅PIV−３ Ｆ遺伝子クローンのヌクレオチド
配列は、以下の点でPCR増幅遺伝子クローンと異なって
いた。ななわち、非PCR増幅クローンは遺伝子の5'非翻
訳領域に10個余分なヌクレオチド（AGGACAAAAG）を有
し、８（PCR増幅遺伝子のＴから非PCR増幅遺伝子のＣま
で）、512（PCR増幅遺伝子のＣから非PCR増幅遺伝子の
Ｔまで）、518（PCR増幅遺伝子のＧから非PCR増幅遺伝
子のＡまで）および1376（PCR増幅遺伝子のＡから非PCR
増幅遺伝子のＧまで）の４個所で異なっていた。このよ
うな差は、非PCR増幅PIV−３ Ｆ遺伝子によってコード
化されたＦタンパクのアミノ酸配列が３個所で異なるこ
とを示している。すなわち、PCR増幅PIV−３ Ｆ遺伝子
によってコード化されたＦタンパクの一次アミノ酸配列
におけるセリン（位置110）、グリシン（位置112）およ
びアスパラギン酸（位置398）がPCR増幅クローンにより
コード化されたＦタンパクの一次アミノ酸配列では、そ
れぞれフェニルアラニン（位置110）、グルタミン酸
（位置112）およびグリシン（位置398）に変っていた。
配列は、以下の点でPCR増幅遺伝子クローンと異なって
いた。ななわち、非PCR増幅クローンは遺伝子の5'非翻
訳領域に10個余分なヌクレオチド（AGGACAAAAG）を有
し、８（PCR増幅遺伝子のＴから非PCR増幅遺伝子のＣま
で）、512（PCR増幅遺伝子のＣから非PCR増幅遺伝子の
Ｔまで）、518（PCR増幅遺伝子のＧから非PCR増幅遺伝
子のＡまで）および1376（PCR増幅遺伝子のＡから非PCR
増幅遺伝子のＧまで）の４個所で異なっていた。このよ
うな差は、非PCR増幅PIV−３ Ｆ遺伝子によってコード
化されたＦタンパクのアミノ酸配列が３個所で異なるこ
とを示している。すなわち、PCR増幅PIV−３ Ｆ遺伝子
によってコード化されたＦタンパクの一次アミノ酸配列
におけるセリン（位置110）、グリシン（位置112）およ
びアスパラギン酸（位置398）がPCR増幅クローンにより
コード化されたＦタンパクの一次アミノ酸配列では、そ
れぞれフェニルアラニン（位置110）、グルタミン酸
（位置112）およびグリシン（位置398）に変っていた。
図３は、それぞれPIV−３ HN遺伝子およびタンパク
のヌクレオチド配列（SEQ ID No:3）およびアミノ酸
配列（SEQ ID No:4）を示し、遺伝子制限マップを図
４に示す。HNクローンからの1833ヌクレオチド配列を分
析したところ、配列は同一であることが確認された。そ
の配列を公表されているPIV−３ HNコード化配列と比
較したところ、PIV−３ HN遺伝子のコード化配列に4.4
％の差が認められた。この差は、PIV−３ HN遺伝子に
よりコード化されたタンパクのアミノ酸配列に17個のア
ミノ酸置換があることを示している。
のヌクレオチド配列（SEQ ID No:3）およびアミノ酸
配列（SEQ ID No:4）を示し、遺伝子制限マップを図
４に示す。HNクローンからの1833ヌクレオチド配列を分
析したところ、配列は同一であることが確認された。そ
の配列を公表されているPIV−３ HNコード化配列と比
較したところ、PIV−３ HN遺伝子のコード化配列に4.4
％の差が認められた。この差は、PIV−３ HN遺伝子に
よりコード化されたタンパクのアミノ酸配列に17個のア
ミノ酸置換があることを示している。
それぞれRSV Ｆ遺伝子およびRSV Ｆタンパクのヌク
レオチド配列（SEQ ID No:5）およびアミノ酸配列（S
EQ ID No:6）を図５に示し、遺伝子制限マップを図６
に示す。２種類のRSV Ｆクローンからの1887ヌクレオ
チド配列を分析したところ、配列は２種類のクローン間
で完全に相同であることが確認された。このヌクレオチ
ド配列で報告されているRSV Ｆ遺伝子のヌクレオチド
配列と比較すると、コード化配列に1.8％の差があり、1
1個のアミノ酸置換に相当した。
レオチド配列（SEQ ID No:5）およびアミノ酸配列（S
EQ ID No:6）を図５に示し、遺伝子制限マップを図６
に示す。２種類のRSV Ｆクローンからの1887ヌクレオ
チド配列を分析したところ、配列は２種類のクローン間
で完全に相同であることが確認された。このヌクレオチ
ド配列で報告されているRSV Ｆ遺伝子のヌクレオチド
配列と比較すると、コード化配列に1.8％の差があり、1
1個のアミノ酸置換に相当した。
RSV Ｇ遺伝子およびRSV Ｇタンパクのヌクレオチド
配列（SEQ ID No:7）およびアミノ酸配列（SEQ ID
No:8）をそれぞれ図７に示し、遺伝子制限マップを図８
に示す。Ｇ遺伝子の920ヌクレオチド配列を報告されて
いるＧ配列（Ａ型単離物）と比較すると、遺伝子産物の
アミノ酸配列に6.7％の差があり、この差は20個のアミ
ノ酸置換に相当した。
配列（SEQ ID No:7）およびアミノ酸配列（SEQ ID
No:8）をそれぞれ図７に示し、遺伝子制限マップを図８
に示す。Ｇ遺伝子の920ヌクレオチド配列を報告されて
いるＧ配列（Ａ型単離物）と比較すると、遺伝子産物の
アミノ酸配列に6.7％の差があり、この差は20個のアミ
ノ酸置換に相当した。
鈍端結紮または適当なリンカーを用いて、完全長PIV
−３ Ｆ（非PCR増幅）、PIV−３ HN、RSV ＦおよびR
SVG遺伝子をλgt11にクローン化し、ブルースクリプトM
13−SKベクターの多重クローン化部位にサブクローン化
した。PCR増幅PIV−３ Ｆ遺伝子は、ブルースクリプト
ベクター中に直接クローン化した。PIV−３ Ｆ−PCR増
幅、PIV−３ Ｆ−PCR非増幅、PIV−３ HN、RSV Ｆお
よびRSV Ｇ遺伝子を含むクローン化ベクターは、それ
ぞれpPI3F、pPI3Fc、pPIVHN、pRSVFおよびpRSVGと命名
した。
−３ Ｆ（非PCR増幅）、PIV−３ HN、RSV ＦおよびR
SVG遺伝子をλgt11にクローン化し、ブルースクリプトM
13−SKベクターの多重クローン化部位にサブクローン化
した。PCR増幅PIV−３ Ｆ遺伝子は、ブルースクリプト
ベクター中に直接クローン化した。PIV−３ Ｆ−PCR増
幅、PIV−３ Ｆ−PCR非増幅、PIV−３ HN、RSV Ｆお
よびRSV Ｇ遺伝子を含むクローン化ベクターは、それ
ぞれpPI3F、pPI3Fc、pPIVHN、pRSVFおよびpRSVGと命名
した。
実施例２ 本実施例は、FPIV-3−FRSVキメラ遺伝子を含み、ブル
ースクリプトを利用した表現ベクター（pMCR20）の構築
について説明するものである。このキメラ遺伝子構造
は、PIV−３ Ｆ遺伝子の5'非翻訳領域を含むが、PIV−
３およびRSV Ｆ遺伝子の疎水性アンカーおよび細胞質
尾部コード化領域を欠いている。このプラスミッドの構
築工程を図９に要約する。
ースクリプトを利用した表現ベクター（pMCR20）の構築
について説明するものである。このキメラ遺伝子構造
は、PIV−３ Ｆ遺伝子の5'非翻訳領域を含むが、PIV−
３およびRSV Ｆ遺伝子の疎水性アンカーおよび細胞質
尾部コード化領域を欠いている。このプラスミッドの構
築工程を図９に要約する。
キメラ遺伝子のPIV−３部分を調製するために（図
９、工程１）、ポリリンカーをBamH Iで切断し、クレノ
ーポリメラーゼにより直線化プラスミッドを鈍端結紮を
行い、Bsr Iで遺伝子を切断して、膜間領域および細胞
質尾部コード化領域を欠く完全長PIV−３遺伝子をpPI3F
プラスミッドから取り出した。PpuM I部位および３つの
連続した翻訳終了コドンを含むBsr I−BamH I糖ヌクレ
オチドカセット（SEQ ID No:9）をトランケート状の
1.6Kb［BamH I］−Bsr I PIV−３遺伝子フラグメント
に結紮し、ヒトメタロチオネンプロモーター、SV40ゲノ
ム（pMCR20と表示）のポリＡよびIVS配列を含むブルー
スクリプトM13−SK表現ベクターのEcoR V−BamH I部位
にクローン化して、pME1プラスミッドを生成させた。
９、工程１）、ポリリンカーをBamH Iで切断し、クレノ
ーポリメラーゼにより直線化プラスミッドを鈍端結紮を
行い、Bsr Iで遺伝子を切断して、膜間領域および細胞
質尾部コード化領域を欠く完全長PIV−３遺伝子をpPI3F
プラスミッドから取り出した。PpuM I部位および３つの
連続した翻訳終了コドンを含むBsr I−BamH I糖ヌクレ
オチドカセット（SEQ ID No:9）をトランケート状の
1.6Kb［BamH I］−Bsr I PIV−３遺伝子フラグメント
に結紮し、ヒトメタロチオネンプロモーター、SV40ゲノ
ム（pMCR20と表示）のポリＡよびIVS配列を含むブルー
スクリプトM13−SK表現ベクターのEcoR V−BamH I部位
にクローン化して、pME1プラスミッドを生成させた。
キメラ構造のRSV Ｆ遺伝子成分を遺伝子工学的に構
築するために（図９、工程２）、EcoR Iでポリリンカー
を切断し、遺伝子をBspH Iで切断して膜間領域および細
胞質尾部コード化領域を欠くRSV Ｆ遺伝子をpRSVFプラ
スミッドから取り出した。３つの連続した翻訳終了コド
ンを含む合成BspH I−BamH I糖ヌクレオチドカセット
（SEQ ID No:10）を1.6KbトランケートRSV Ｆ遺伝子
に結紮し、ブルースクリプト表現ベクターpMCR20のEcoR
I−BamH I部位にクローン化してpES13Aプラスミッドを
生成させた。ついで、プラスミッドpES13AをEcoR Iおよ
びPpuM Iで切断して、トランケートRSV Ｆ遺伝子から
リーダーおよびF2コード化配列を除去した。EcoR I−Pp
uM I糖カッセト（SEQ ID No:11）を用いてリーダー配
列を再構築し、RSV F1遺伝子セグメントに結紮してpES
23Aプラスミッドを生成させた。
築するために（図９、工程２）、EcoR Iでポリリンカー
を切断し、遺伝子をBspH Iで切断して膜間領域および細
胞質尾部コード化領域を欠くRSV Ｆ遺伝子をpRSVFプラ
スミッドから取り出した。３つの連続した翻訳終了コド
ンを含む合成BspH I−BamH I糖ヌクレオチドカセット
（SEQ ID No:10）を1.6KbトランケートRSV Ｆ遺伝子
に結紮し、ブルースクリプト表現ベクターpMCR20のEcoR
I−BamH I部位にクローン化してpES13Aプラスミッドを
生成させた。ついで、プラスミッドpES13AをEcoR Iおよ
びPpuM Iで切断して、トランケートRSV Ｆ遺伝子から
リーダーおよびF2コード化配列を除去した。EcoR I−Pp
uM I糖カッセト（SEQ ID No:11）を用いてリーダー配
列を再構築し、RSV F1遺伝子セグメントに結紮してpES
23Aプラスミッドを生成させた。
トランケートRSV F1遺伝子フラグメントにリンクし
たPIV−３ Ｆ遺伝子の5'非翻訳領域を含むＦPIV-3−Ｆ
RSVキメラ遺伝子（図９、工程３）を調製するため、ま
ずpME1プラスミッド（1.6KbトランケートPIV−３ Ｆ遺
伝子を含む）をPpuM IおよびBamH Iで切断した。PpuM I
−BamH I制限pME1ベクターを腸アルカリホスファターゼ
で脱リン酸化した。1.1KbのPpuM I−BamH I RSV F1遺
伝子フラグメントを脱リン酸化したpME1ベクターのPpuM
I−BamH I部位にクローン化してpES29Aプラスミッドを
生成させた。このキメラ遺伝子はPIV−３ Ｆ遺伝子の
5'非翻訳領域を含むが、PIV−３およびRSV Ｆタンパク
の疎水性アンカードメインおよび細胞質尾部コード化ヌ
クレオチド配列を欠く。
たPIV−３ Ｆ遺伝子の5'非翻訳領域を含むＦPIV-3−Ｆ
RSVキメラ遺伝子（図９、工程３）を調製するため、ま
ずpME1プラスミッド（1.6KbトランケートPIV−３ Ｆ遺
伝子を含む）をPpuM IおよびBamH Iで切断した。PpuM I
−BamH I制限pME1ベクターを腸アルカリホスファターゼ
で脱リン酸化した。1.1KbのPpuM I−BamH I RSV F1遺
伝子フラグメントを脱リン酸化したpME1ベクターのPpuM
I−BamH I部位にクローン化してpES29Aプラスミッドを
生成させた。このキメラ遺伝子はPIV−３ Ｆ遺伝子の
5'非翻訳領域を含むが、PIV−３およびRSV Ｆタンパク
の疎水性アンカードメインおよび細胞質尾部コード化ヌ
クレオチド配列を欠く。
実施例３ 本実施例は、5'非翻訳および膜間アンカーおよび細胞
質尾部コード化領域を欠くPIV−３ Ｆ遺伝子を含むブ
ルースクリプト表現ベクターの構築を説明するものであ
る。このプラスミッドの構築工程を図10に示す。
質尾部コード化領域を欠くPIV−３ Ｆ遺伝子を含むブ
ルースクリプト表現ベクターの構築を説明するものであ
る。このプラスミッドの構築工程を図10に示す。
完全長PIV−３ Ｆ遺伝子を含むpPI3Fプラスミッドを
BamH Iで切断し、クレノーポリメラーゼで鈍端化し、Bs
r Iで切断して膜間および細胞質尾部コード化領域を除
去した。ブルースクリプト表現ベクターpMCR20は、Sma
IおよびBamH Iで切断した。翻訳終了コドンを含む合成B
sr I−BamH I糖ヌクレオチドカセット（SEQ ID No:1
2）を1.6Kbの鈍端化Bsr I PIV−３ Ｆ遺伝子フラグメ
ントでSma I−BamH I制限化pMCR20ベクターに結紮し、p
MpFBプラスミッドを生成させた。この構造のPIV−３
Ｆ遺伝子は膜間および細胞質アンカードメインを欠く
が、5'非翻訳領域を有している。5'非翻訳領域および疎
水性アンカードメインコード化DNAフラグメントを欠くP
IV−３ Ｆ遺伝子を含むプラスミッド遺伝子工学的に構
築するために、pMpFBプラスミッドをEcoR IおよびBstB
Iで切断した。EcrR I−BstB I切断で除去されたシグナ
ルペプチドおよびコード化配列を再構築するための配列
を含むEcrR I−BstB I糖カセット（SEQ ID No:13）Ec
oR I−BstB I制限化pMpFBベクターに結紮してpMpFAプラ
スミッドを構築した。
BamH Iで切断し、クレノーポリメラーゼで鈍端化し、Bs
r Iで切断して膜間および細胞質尾部コード化領域を除
去した。ブルースクリプト表現ベクターpMCR20は、Sma
IおよびBamH Iで切断した。翻訳終了コドンを含む合成B
sr I−BamH I糖ヌクレオチドカセット（SEQ ID No:1
2）を1.6Kbの鈍端化Bsr I PIV−３ Ｆ遺伝子フラグメ
ントでSma I−BamH I制限化pMCR20ベクターに結紮し、p
MpFBプラスミッドを生成させた。この構造のPIV−３
Ｆ遺伝子は膜間および細胞質アンカードメインを欠く
が、5'非翻訳領域を有している。5'非翻訳領域および疎
水性アンカードメインコード化DNAフラグメントを欠くP
IV−３ Ｆ遺伝子を含むプラスミッド遺伝子工学的に構
築するために、pMpFBプラスミッドをEcoR IおよびBstB
Iで切断した。EcrR I−BstB I切断で除去されたシグナ
ルペプチドおよびコード化配列を再構築するための配列
を含むEcrR I−BstB I糖カセット（SEQ ID No:13）Ec
oR I−BstB I制限化pMpFBベクターに結紮してpMpFAプラ
スミッドを構築した。
実施例4: 本実施例は、トランケートRSV F1遺伝子にリンクし
た5'非翻訳領域を欠くトランケートPIV−３ Ｆ遺伝子
からなるFPIV-3−FRSVキメラ遺伝子の構築を説明するも
のである。このプラスミッドの構築工程を図11に示す。
た5'非翻訳領域を欠くトランケートPIV−３ Ｆ遺伝子
からなるFPIV-3−FRSVキメラ遺伝子の構築を説明するも
のである。このプラスミッドの構築工程を図11に示す。
このキメラ遺伝子構造を調製するため、pES29Aプラス
ミッド（実施例２）をBstB IおよびBamH Iで切断して2.
5KbのBstB I−BamH I PI3−３ Ｆ−RSV F1キメラ遺
伝子フラグメントを遊離させた。このBstB I−BamH Iフ
ラグメントを低融点アガロースゲルから単離し、脱リン
酸化ベクターpMpFAのBstB I−BamH I部位にクローン化
してpES60Aプラスミッドを構築した。5'非翻訳領域およ
びトランケートRSV Ｆ遺伝子のF1コード化領域にリン
クした疎水性アンカーおよび細胞質尾部コード化配列を
欠くPIV−３ Ｆ遺伝子を含んでいる。ついで、このキ
メラ遺伝子をバクロウイルス運搬ベクターにサブクロー
ン化する（実施例５を参照）。
ミッド（実施例２）をBstB IおよびBamH Iで切断して2.
5KbのBstB I−BamH I PI3−３ Ｆ−RSV F1キメラ遺
伝子フラグメントを遊離させた。このBstB I−BamH Iフ
ラグメントを低融点アガロースゲルから単離し、脱リン
酸化ベクターpMpFAのBstB I−BamH I部位にクローン化
してpES60Aプラスミッドを構築した。5'非翻訳領域およ
びトランケートRSV Ｆ遺伝子のF1コード化領域にリン
クした疎水性アンカーおよび細胞質尾部コード化配列を
欠くPIV−３ Ｆ遺伝子を含んでいる。ついで、このキ
メラ遺伝子をバクロウイルス運搬ベクターにサブクロー
ン化する（実施例５を参照）。
実施例5: 本実施例は、在来ポリヘドリンプロモーターおよび、
5'非翻訳配列およびトランケートRSV F1遺伝子にリン
クした疎水性アンカードメインおよび細胞質尾部をコー
ド化したヌクレオチド配列を欠くPIV−３ Ｆ遺伝子か
らなるFPIV-3−FRSVキメラ遺伝子を含む修飾pAC 610バ
クロウイルス運搬ベクターの構築を説明するものであ
る。
5'非翻訳配列およびトランケートRSV F1遺伝子にリン
クした疎水性アンカードメインおよび細胞質尾部をコー
ド化したヌクレオチド配列を欠くPIV−３ Ｆ遺伝子か
らなるFPIV-3−FRSVキメラ遺伝子を含む修飾pAC 610バ
クロウイルス運搬ベクターの構築を説明するものであ
る。
このプラスミッドの構築を図12に示す。
pAC 610バクロウイルス表現ベクターを以下のように
修飾して、在来ポリヘドリンプロモーターを含ませる。
ベクターpAC 610をEcrR VおよびBamH Iで切断した。Ec
rR V−BamH I DNA配列を欠く9.4Kbのバクロウイルス運
搬ベクターを低融点アガロースゲルから単離し、腸アル
カリホスファターゼで処理した。三方向結紮において、
在来ポリヘドリンプロモーターを修復するために必要な
ヌクレオチドを含むEcrR V−EcrR I糖ヌクレオチドカセ
ット（SEQ ID No:14）を、pES13A構造（実施例１、工
程２）から単離した1.6KbのEcrR I−BamH Iトランケー
トRSV Ｆ遺伝子フラグメントおよびEcrR V−BamH I制
限化pAC 610ホファターゼ処理ベクターで結紮し、pES4
7Aプラスミッドを生成させた。FPIV-3−FRSVキメラ遺伝
子を含むpAC 610表現ベクターを調製するために、まず
pES47AプラスミッドをEcrR IおよびBamH Iで切断して、
挿入した1.6KbのトランケートRSV Ｆ遺伝子を除去し
た。BcoR IおよびBamH IでpES60Aプラスミッドを切断し
て（実施例４）、2.8KbのFPIV-3−FRSVキメラ遺伝子を
取り出した。2.8KbのEcrR I−BamH Iキメラ遺伝子をEcr
R I−BamH I制限化pES47Aベクターに結紮し、pAC DR7
プラスミッド（ATCC75387）を構築した。
修飾して、在来ポリヘドリンプロモーターを含ませる。
ベクターpAC 610をEcrR VおよびBamH Iで切断した。Ec
rR V−BamH I DNA配列を欠く9.4Kbのバクロウイルス運
搬ベクターを低融点アガロースゲルから単離し、腸アル
カリホスファターゼで処理した。三方向結紮において、
在来ポリヘドリンプロモーターを修復するために必要な
ヌクレオチドを含むEcrR V−EcrR I糖ヌクレオチドカセ
ット（SEQ ID No:14）を、pES13A構造（実施例１、工
程２）から単離した1.6KbのEcrR I−BamH Iトランケー
トRSV Ｆ遺伝子フラグメントおよびEcrR V−BamH I制
限化pAC 610ホファターゼ処理ベクターで結紮し、pES4
7Aプラスミッドを生成させた。FPIV-3−FRSVキメラ遺伝
子を含むpAC 610表現ベクターを調製するために、まず
pES47AプラスミッドをEcrR IおよびBamH Iで切断して、
挿入した1.6KbのトランケートRSV Ｆ遺伝子を除去し
た。BcoR IおよびBamH IでpES60Aプラスミッドを切断し
て（実施例４）、2.8KbのFPIV-3−FRSVキメラ遺伝子を
取り出した。2.8KbのEcrR I−BamH Iキメラ遺伝子をEcr
R I−BamH I制限化pES47Aベクターに結紮し、pAC DR7
プラスミッド（ATCC75387）を構築した。
実施例6: 本実施例は、FPIV-3−FRSVキメラ遺伝子を含む無菌精
製組換えバクロウイルスの調製を説明するものである。
製組換えバクロウイルスの調製を説明するものである。
Spdoptera frugiperda（ヨトウムシの１種）（Sf9）
の細胞に1.0μｇの野生型AcMNPV DNAと2.5μｇのF
PIV-3−FRSVプラスミッドDNA（pACプラスミッド、実施
例５）を同時に感染させた。FPIV-3−FRSVキメラ遺伝子
を含む予想される組換えバクロウイルス（連続希釈によ
りあらかじめ精製したもの）を点ブロットハイブリッド
化により同定した。予想組換えバクロウイルスを感染さ
せた昆虫細胞の溶融液に32P−標識FPIV-3−FRSVキメラ
遺伝子挿入でプローブした。組換えバクロウイルスは、
表現実験に使用する前に、２回無菌精製精製した。全て
の手順は、M.D.SummersおよびG.E.Smithの“Ａ Manual
of Methods for Baculovirus Vectors and Ins
ect Cell Culture Procedures"、Texas Agricultur
al Experiment Station,Bulletin 1555,1987に記載
されているプロトコールに準じて行った。
の細胞に1.0μｇの野生型AcMNPV DNAと2.5μｇのF
PIV-3−FRSVプラスミッドDNA（pACプラスミッド、実施
例５）を同時に感染させた。FPIV-3−FRSVキメラ遺伝子
を含む予想される組換えバクロウイルス（連続希釈によ
りあらかじめ精製したもの）を点ブロットハイブリッド
化により同定した。予想組換えバクロウイルスを感染さ
せた昆虫細胞の溶融液に32P−標識FPIV-3−FRSVキメラ
遺伝子挿入でプローブした。組換えバクロウイルスは、
表現実験に使用する前に、２回無菌精製精製した。全て
の手順は、M.D.SummersおよびG.E.Smithの“Ａ Manual
of Methods for Baculovirus Vectors and Ins
ect Cell Culture Procedures"、Texas Agricultur
al Experiment Station,Bulletin 1555,1987に記載
されているプロトコールに準じて行った。
実施例７ 本実施例は、感染させたSf9細胞の溶融液およびその
上清中におけるFPIV-3−FRSVキメラタンパクの存在を説
明するものである。
上清中におけるFPIV-3−FRSVキメラタンパクの存在を説
明するものである。
昆虫細胞は、実施例６の記載にしたがってm.o.i.8と
なるように調製した無菌精製精製した組換えバクロウイ
ルスを感染させた。組換えウイルスを感染させた細胞か
らの濃縮上清はPIV−３ Ｆ特異性ELISAで陽性であっ
た。さらに、35S−メチオニン標識感染細胞の溶融液をS
DS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、ゲルをオ
ートラジオグラフィーで分析したところ、組換えウイル
スを感染させた細胞の溶融液中には見掛け分子量約90KD
aの強いバンドが存在していたが、野生型を感染させた
細胞の溶融液には存在していなかった。組換えバクロウ
イルスを感染させた細胞の溶融液におけるFPIV-3−FRSV
キメラタンパクの存在は、さらにモノ特異性抗PIV−３
Ｆおよび抗RSV Ｆ抗血清およびモノクロナル抗体（M
abs）を用いたウエスターンブロット分析によっても確
認された。組換えバクロウイルスを感染させた細胞の溶
融液は、免疫ブロット中の抗PIV−３および抗RSV抗血清
と反応させた。図13の免疫ブロットに示すように、RSV
ＦまたはFPIV-3−FRSV組換えバクロウイルスを感染さ
せた細胞の溶融液は、抗Ｆ RSV Mabで陽性反応を示し
た。期待したように、野生型ウイルスを感染させた細胞
の溶融液は、このMabと反応しなかった。さらに、F
PIV-3−FRSVキメラ組換えウイルスのみが抗PIV−３ F1
抗血清と反応した。
なるように調製した無菌精製精製した組換えバクロウイ
ルスを感染させた。組換えウイルスを感染させた細胞か
らの濃縮上清はPIV−３ Ｆ特異性ELISAで陽性であっ
た。さらに、35S−メチオニン標識感染細胞の溶融液をS
DS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、ゲルをオ
ートラジオグラフィーで分析したところ、組換えウイル
スを感染させた細胞の溶融液中には見掛け分子量約90KD
aの強いバンドが存在していたが、野生型を感染させた
細胞の溶融液には存在していなかった。組換えバクロウ
イルスを感染させた細胞の溶融液におけるFPIV-3−FRSV
キメラタンパクの存在は、さらにモノ特異性抗PIV−３
Ｆおよび抗RSV Ｆ抗血清およびモノクロナル抗体（M
abs）を用いたウエスターンブロット分析によっても確
認された。組換えバクロウイルスを感染させた細胞の溶
融液は、免疫ブロット中の抗PIV−３および抗RSV抗血清
と反応させた。図13の免疫ブロットに示すように、RSV
ＦまたはFPIV-3−FRSV組換えバクロウイルスを感染さ
せた細胞の溶融液は、抗Ｆ RSV Mabで陽性反応を示し
た。期待したように、野生型ウイルスを感染させた細胞
の溶融液は、このMabと反応しなかった。さらに、F
PIV-3−FRSVキメラ組換えウイルスのみが抗PIV−３ F1
抗血清と反応した。
実施例８ 本実施例は、ポリヘドリンATG出発コドンをATTに変換
し、CCG配列がポリヘドリン遺伝子の下流の＋４、５、
６位に存在するバクロウイルス運搬ベクターpVL1392
（インビトロゲンより得たもの）における修飾を説明す
るものである。ATTコドン下流のいくつかの塩基対に構
造遺伝子を挿入すると、翻訳が促進されることが知られ
ている。この修飾バクロウイルスベクターの構築工程を
図14に示す。
し、CCG配列がポリヘドリン遺伝子の下流の＋４、５、
６位に存在するバクロウイルス運搬ベクターpVL1392
（インビトロゲンより得たもの）における修飾を説明す
るものである。ATTコドン下流のいくつかの塩基対に構
造遺伝子を挿入すると、翻訳が促進されることが知られ
ている。この修飾バクロウイルスベクターの構築工程を
図14に示す。
バクロウイルス表現ベクターpVL1392をEcoR VおよびB
amH Iで切断した。9.5Kbの制限pVL1392ベクターをEcrR
V−BamH I糖ヌクレオチドカセット（SEQ ID No:15）
に結紮してpD2ベクターを構築した。
amH Iで切断した。9.5Kbの制限pVL1392ベクターをEcrR
V−BamH I糖ヌクレオチドカセット（SEQ ID No:15）
に結紮してpD2ベクターを構築した。
実施例9: 本実施例は、タンデムにリンクしたトランケートRSV
ＦおよびPIV−3HN遺伝子からなるFRSV−HNPIV-3キメ
ラ遺伝子を有するpD2バクロウイルス表現ベクターの構
築を説明するものである。このプラスミッドの構築工程
は図15に示す。
ＦおよびPIV−3HN遺伝子からなるFRSV−HNPIV-3キメ
ラ遺伝子を有するpD2バクロウイルス表現ベクターの構
築を説明するものである。このプラスミッドの構築工程
は図15に示す。
FRSV−HNPIV-3遺伝子を遺伝子工学的に構築するた
め、ポリリンカーをEcrR Iによって切断し、遺伝子をBs
pH Iによって切断して、RSV Ｆ糖タンパクの膜間ドメ
インおよび細胞質尾部をコーソ化したヌクレオチド配列
を欠くRSV Ｆ遺伝子をpRSVFプラスミッド（実施例１）
から取り出した。遺伝子をBspH Iで切断し、ポリリンカ
ーをBamH Iで切断して、疎水性アンカードメインをコー
ド化したDNAフラグメントを欠くPIV−３ HN遺伝子をpP
IVHNプラスミッド（実施例１）から取り出した。1.6Kb
のEcrR I−BspH I RSV Ｆ遺伝子フラグメントおよび
1.7KbのBspH I−BamH I PIV−３ HN遺伝子フラグメン
トを低融点アガロースゲルから単離した。クローン化を
目的として、ブルースクリプト哺乳動物細胞表現ベクタ
ー中の２箇所のBapH I部位の突然変異を起こさせた。表
現ベクターをBspH Iで切断し、BspH I制限ベクターおよ
びクレノーポリメラーゼ切断BspH Iにより遊離した1.1K
bフラグメントを処理し、鈍端化ブルースクリプト表現
ベクターに鈍端化1.1Kbフラグメントを結紮してpMCR20
のBapH I部位に突然変異を誘導して、pM'プラスミッド
を構築した。1.1Kb鈍端フラグメントを哺乳動物の細胞
表現ベクター中に不適当な方位で挿入すると、ブルース
クリプト表現ベクターのAmp遺伝子が変化するので、1.1
2Kb鈍端化フラグメントを有するpM'プラスミッドDNAで
適切な方位に変換されたHB101細胞のみがアンピシリン
存在下で生存することができる。塩化セシウム−臭化エ
チジウムグラジエント中で平衡遠心分離を行い、PM'プ
ラスミッドで変換させたアンピシリン耐性HB101細胞コ
ロニーからプラスミッドDNAを精製した。1.6KbEcrR I−
BspH I RSV Ｆおよび1.7KbBspH I−BamH I PIV−３ H
N遺伝子フラグメントを三方向結紮でpM'ベクターおfEcr
R I−BamH I部位にクローン化し、pM' RF−HNプラスミ
ッドを構築した。
め、ポリリンカーをEcrR Iによって切断し、遺伝子をBs
pH Iによって切断して、RSV Ｆ糖タンパクの膜間ドメ
インおよび細胞質尾部をコーソ化したヌクレオチド配列
を欠くRSV Ｆ遺伝子をpRSVFプラスミッド（実施例１）
から取り出した。遺伝子をBspH Iで切断し、ポリリンカ
ーをBamH Iで切断して、疎水性アンカードメインをコー
ド化したDNAフラグメントを欠くPIV−３ HN遺伝子をpP
IVHNプラスミッド（実施例１）から取り出した。1.6Kb
のEcrR I−BspH I RSV Ｆ遺伝子フラグメントおよび
1.7KbのBspH I−BamH I PIV−３ HN遺伝子フラグメン
トを低融点アガロースゲルから単離した。クローン化を
目的として、ブルースクリプト哺乳動物細胞表現ベクタ
ー中の２箇所のBapH I部位の突然変異を起こさせた。表
現ベクターをBspH Iで切断し、BspH I制限ベクターおよ
びクレノーポリメラーゼ切断BspH Iにより遊離した1.1K
bフラグメントを処理し、鈍端化ブルースクリプト表現
ベクターに鈍端化1.1Kbフラグメントを結紮してpMCR20
のBapH I部位に突然変異を誘導して、pM'プラスミッド
を構築した。1.1Kb鈍端フラグメントを哺乳動物の細胞
表現ベクター中に不適当な方位で挿入すると、ブルース
クリプト表現ベクターのAmp遺伝子が変化するので、1.1
2Kb鈍端化フラグメントを有するpM'プラスミッドDNAで
適切な方位に変換されたHB101細胞のみがアンピシリン
存在下で生存することができる。塩化セシウム−臭化エ
チジウムグラジエント中で平衡遠心分離を行い、PM'プ
ラスミッドで変換させたアンピシリン耐性HB101細胞コ
ロニーからプラスミッドDNAを精製した。1.6KbEcrR I−
BspH I RSV Ｆおよび1.7KbBspH I−BamH I PIV−３ H
N遺伝子フラグメントを三方向結紮でpM'ベクターおfEcr
R I−BamH I部位にクローン化し、pM' RF−HNプラスミ
ッドを構築した。
BspH I切断で除去されたRSV ＦおよびPIV−３ HN遺
伝子の特定のコード化配列を修復するために、適切なRS
V ＦおよびPIV−３ HN遺伝子配列を含むBspH I−BspH
I糖ヌクレオチドカセット（SEQ ID No:16）を、BspH
I経由でBspH I制限プラスミッドpM' RF−HNに結紮
し、pM RF−HNプラスミッドを構築した。適切な方位で
BspH I−BspH I糖ヌクレオチドカセットを含むクローン
を糖ヌクレオチドリンカーおよびそのフランキング領域
の配列分析により同定した。
伝子の特定のコード化配列を修復するために、適切なRS
V ＦおよびPIV−３ HN遺伝子配列を含むBspH I−BspH
I糖ヌクレオチドカセット（SEQ ID No:16）を、BspH
I経由でBspH I制限プラスミッドpM' RF−HNに結紮
し、pM RF−HNプラスミッドを構築した。適切な方位で
BspH I−BspH I糖ヌクレオチドカセットを含むクローン
を糖ヌクレオチドリンカーおよびそのフランキング領域
の配列分析により同定した。
FRSV−HNPIV-3キメラ遺伝子をバクロウイルス表現ベ
クターpD2（実施例８）にクローン化するため、まずプ
ラスミッドをEcrR Iで切断して、pM RF−HNプラスミッ
ドからFRSV−HNPIV-3トランケート遺伝子を取り出し
た。次に、3.3Kb FRSV−HNPIV-3遺伝子をバクロウイル
ス運搬ベクタープラスミッドpD2のEcrR I部位にクロー
ン化して、pD2 RF−HNプラスミッドを構築した（ATCC
7588）。配列分析により、3.3Kb EcrR I FRSV−HN
PIV-3キメラ遺伝子がpD2 RF−HNプラスミッド中に適切
な方位で挿入されていることを確認した。
クターpD2（実施例８）にクローン化するため、まずプ
ラスミッドをEcrR Iで切断して、pM RF−HNプラスミッ
ドからFRSV−HNPIV-3トランケート遺伝子を取り出し
た。次に、3.3Kb FRSV−HNPIV-3遺伝子をバクロウイル
ス運搬ベクタープラスミッドpD2のEcrR I部位にクロー
ン化して、pD2 RF−HNプラスミッドを構築した（ATCC
7588）。配列分析により、3.3Kb EcrR I FRSV−HN
PIV-3キメラ遺伝子がpD2 RF−HNプラスミッド中に適切
な方位で挿入されていることを確認した。
実施例10:本実施例は、FRSV−HNPIV-3キメラ遺伝子を含
む無菌精製組換えバクロウイルスの調製を説明するもの
である。
む無菌精製組換えバクロウイルスの調製を説明するもの
である。
Spodoptera frugiperda（Sf9）細胞に野生型AcNPV
DNAを１μｇとFRSV−HNPIV-3プラスミッドDNA（pD2 RF
−HNプラスミッド、実施例９）を２μｇ混合接種した。
FRSV−HNPIV-3キメラ遺伝子を含む予想組換えバクロウ
イルス（連続希釈により１回精製）をドットブロットハ
イブリッド化により同定した。予想組換えバクロウイル
スに感染した昆虫の細胞の細胞溶融液を、32p標識RSV
ＦまたはPTV−３ HN遺伝子糖ヌクレオチドプリーブで
プローブした。表現試験に使用する前に、組換えバクロ
ウイルスを３回無菌精製した。これらの手順は、Summer
sおよびSmithのプロトコール（実施例６）に従って行っ
た。
DNAを１μｇとFRSV−HNPIV-3プラスミッドDNA（pD2 RF
−HNプラスミッド、実施例９）を２μｇ混合接種した。
FRSV−HNPIV-3キメラ遺伝子を含む予想組換えバクロウ
イルス（連続希釈により１回精製）をドットブロットハ
イブリッド化により同定した。予想組換えバクロウイル
スに感染した昆虫の細胞の細胞溶融液を、32p標識RSV
ＦまたはPTV−３ HN遺伝子糖ヌクレオチドプリーブで
プローブした。表現試験に使用する前に、組換えバクロ
ウイルスを３回無菌精製した。これらの手順は、Summer
sおよびSmithのプロトコール（実施例６）に従って行っ
た。
実施例11: 本実施例は、感染Sf9およびHigh ５細胞の上清中にF
RSV−HNPIV-3キメラタンパクが存在することを説明する
ものである。
RSV−HNPIV-3キメラタンパクが存在することを説明する
ものである。
昆虫の細胞（Sf9およびHigh ５）を血清を含まないE
X401培地に保ち、実施例10の無菌精製組換えバクロウイ
ルスを５〜10pfu/細胞のm.o.i.で接種した。組換えバク
ロウイルス感染細胞の上清は、RSV−ＦおよびPIV−３
HN特異性ELISAS試験で陽性を示した。さらに、感染細胞
からの上清は、免疫ブロット上で、抗Ｆ RSVモノクロ
ナール抗体および抗HNペプチド抗血清と陽性反応を示し
た。免疫ブロット中には約105kDaの明瞭なバンドが認め
られた。この結果から、組換えバクロウイルスに感染し
たSf9およびHigh ５細胞の上清中にFRSV−HNPIV-3キメ
ラタンパクが分泌されることが確認された。
X401培地に保ち、実施例10の無菌精製組換えバクロウイ
ルスを５〜10pfu/細胞のm.o.i.で接種した。組換えバク
ロウイルス感染細胞の上清は、RSV−ＦおよびPIV−３
HN特異性ELISAS試験で陽性を示した。さらに、感染細胞
からの上清は、免疫ブロット上で、抗Ｆ RSVモノクロ
ナール抗体および抗HNペプチド抗血清と陽性反応を示し
た。免疫ブロット中には約105kDaの明瞭なバンドが認め
られた。この結果から、組換えバクロウイルスに感染し
たSf9およびHigh ５細胞の上清中にFRSV−HNPIV-3キメ
ラタンパクが分泌されることが確認された。
実施例12: 本実施例は、感染high ５細胞の上清からのFRSV−HN
PIV-3キメラタンパクの精製を説明するものである。
PIV-3キメラタンパクの精製を説明するものである。
High ５細胞を血清を含まない培地に保ち、実施例10
の無菌精製組換えバクロウイルスを5pfu/細胞のm.o.i.
で接種した。接種２日後に、ウイルス感染細胞の上清を
採取した。抗HN PIV−３モノクロナール抗体を用いた
イミュノアフィニティークロマトグラフィーで、可溶性
FRSV−HNPIV-3キメラタンパクを精製した。抗HNモノク
ローナル抗体は、常法によりCNBr活性化セファロース4B
に共役させた。イミュノアフィニティーカラムは、使用
前に10倍量の洗浄用緩衝液（10mMトリスHCl pH7.5、15
0mMNaCl、0.02％v/vTriton X−100）で洗浄した。試料
を載せ、10倍量の洗浄用緩衝液、ついで３倍量の高塩濃
度緩衝液（10mMトリス−HCl pH7.5、500mMNaCl、0.02％
v/v Triton X−100）で洗浄した。FRSV−HNPIV-3キメラ
タンパクは、0.02％triton Ｘ−100含有100mMグリシ
ン、pH 2.5でイミュノアフィニティーカラムから溶出
させた。溶出したタンパクは、1Mトリス−HCl、pH10.7
で直ちに中和した。
の無菌精製組換えバクロウイルスを5pfu/細胞のm.o.i.
で接種した。接種２日後に、ウイルス感染細胞の上清を
採取した。抗HN PIV−３モノクロナール抗体を用いた
イミュノアフィニティークロマトグラフィーで、可溶性
FRSV−HNPIV-3キメラタンパクを精製した。抗HNモノク
ローナル抗体は、常法によりCNBr活性化セファロース4B
に共役させた。イミュノアフィニティーカラムは、使用
前に10倍量の洗浄用緩衝液（10mMトリスHCl pH7.5、15
0mMNaCl、0.02％v/vTriton X−100）で洗浄した。試料
を載せ、10倍量の洗浄用緩衝液、ついで３倍量の高塩濃
度緩衝液（10mMトリス−HCl pH7.5、500mMNaCl、0.02％
v/v Triton X−100）で洗浄した。FRSV−HNPIV-3キメラ
タンパクは、0.02％triton Ｘ−100含有100mMグリシ
ン、pH 2.5でイミュノアフィニティーカラムから溶出
させた。溶出したタンパクは、1Mトリス−HCl、pH10.7
で直ちに中和した。
イミュノアフィニティー精製FRSV−HNPIV-3タンパク
のポリアクリルアミド ゲル電気泳動分析（図16、パネ
ルＡ）から、見かけ分子量105kDaを有する一つの主要タ
ンパクのバンドが認められた。精製したタンパクは、免
疫ブロット上で、抗RSV Ｆモノクロナール抗体および
抗HNペプチド抗血清と反応した（図16、パネルＢ、それ
ぞれレーン１および２）。
のポリアクリルアミド ゲル電気泳動分析（図16、パネ
ルＡ）から、見かけ分子量105kDaを有する一つの主要タ
ンパクのバンドが認められた。精製したタンパクは、免
疫ブロット上で、抗RSV Ｆモノクロナール抗体および
抗HNペプチド抗血清と反応した（図16、パネルＢ、それ
ぞれレーン１および２）。
実施例13: 本実施例は、モルモットにおけるFRSV−HNPIV-3タン
パク免疫原性を説明するものである。
パク免疫原性を説明するものである。
前記実施例12に記載した精製FRSV−HNPIV-3キメラタ
ンパクを、リン酸アルミニウムアジュバントとともに1.
0または10.0μｇの用量で、１群４匹のモルモットに筋
肉内注射した。対照群の動物には、パルセボ、生きたPI
V−３またはRSVを免疫投与した（鼻腔内投与）。第１回
注射２および４週間後に採血し、さらに４週時に同用量
の抗体製剤で追加免疫を行った。追加免疫後２および４
週間で、血清試料を採取した。キメラタンパクのPIV−
３およびRSV特異抗体反応を評価するため、血清試料に
ついてPIV−３特異的血球凝集阻害抗体および中和抗体
ならびにRSV中和抗体の有無を分析した。下表（本開示
の最後に示す）に要約するように、キメラタンパクを10
μｇの用量で２回免疫投与した動物の血清は６および８
週時に、PIV−３またはRSVの鼻腔内投与後と同等レベル
のPIV−３特異性血球凝集阻害（HAI）およびPIV−3/RSV
中和抗体価を示した。さらに、キメラタンパクのわずか
１μｇを２回免疫投与した動物でも、高いPIV−３およ
びRSV特異性中和抗体が誘導された。これらの結果か
ら、RSVおよびPIV−３成分の免疫原性が確認され、単一
組換え免疫原がRSVおよびPIV−３に対して中和抗体を誘
導することが確認された。
ンパクを、リン酸アルミニウムアジュバントとともに1.
0または10.0μｇの用量で、１群４匹のモルモットに筋
肉内注射した。対照群の動物には、パルセボ、生きたPI
V−３またはRSVを免疫投与した（鼻腔内投与）。第１回
注射２および４週間後に採血し、さらに４週時に同用量
の抗体製剤で追加免疫を行った。追加免疫後２および４
週間で、血清試料を採取した。キメラタンパクのPIV−
３およびRSV特異抗体反応を評価するため、血清試料に
ついてPIV−３特異的血球凝集阻害抗体および中和抗体
ならびにRSV中和抗体の有無を分析した。下表（本開示
の最後に示す）に要約するように、キメラタンパクを10
μｇの用量で２回免疫投与した動物の血清は６および８
週時に、PIV−３またはRSVの鼻腔内投与後と同等レベル
のPIV−３特異性血球凝集阻害（HAI）およびPIV−3/RSV
中和抗体価を示した。さらに、キメラタンパクのわずか
１μｇを２回免疫投与した動物でも、高いPIV−３およ
びRSV特異性中和抗体が誘導された。これらの結果か
ら、RSVおよびPIV−３成分の免疫原性が確認され、単一
組換え免疫原がRSVおよびPIV−３に対して中和抗体を誘
導することが確認された。
実施例14: 本実施例は、コットンラットにおけるFRSV−HNPIV-3
タンパクの免疫原性および防護効果を説明するものであ
る。
タンパクの免疫原性および防護効果を説明するものであ
る。
リン酸アルミニウムアジュバントを添加したFRSV−HN
PIV-3キメラタンパク（実施例12に記載したように調
製）を１群８匹のコットンラットに1.0または10.0μｇ
の用量で筋肉内注射した。対照群の動物には、パルセボ
（PBS ＋ リン酸アルミニウム）、生きたPIV−３また
はRSVを免疫投与した（鼻腔内投与）。第１回注射４週
間後に採血し、さらに４週時に同用量の抗体製剤で追加
免疫を行った。追加免疫後１週時に、血清試料を採取し
た。下表２に示したように、４週に採血したデータか
ら、キメラタンパクは１および10μｇの用量で強い一次
反応を誘発することが認められた。PIV−３特異性HAIお
よびPIV−３およびRSVで得られた力価と同等であった。
このように、キメラタンパクの単回接種はPIV−３およ
びRSVに対する中和抗体を誘導するに十分であった。追
加免疫後（５週間後採血）でも、強いPIV−３およびRSV
中和力価が認められた。これらの結果は、さらにキメラ
タンパクのRSVおよびPIV−３成分の免疫原性が高いこと
を実証するものである。
PIV-3キメラタンパク（実施例12に記載したように調
製）を１群８匹のコットンラットに1.0または10.0μｇ
の用量で筋肉内注射した。対照群の動物には、パルセボ
（PBS ＋ リン酸アルミニウム）、生きたPIV−３また
はRSVを免疫投与した（鼻腔内投与）。第１回注射４週
間後に採血し、さらに４週時に同用量の抗体製剤で追加
免疫を行った。追加免疫後１週時に、血清試料を採取し
た。下表２に示したように、４週に採血したデータか
ら、キメラタンパクは１および10μｇの用量で強い一次
反応を誘発することが認められた。PIV−３特異性HAIお
よびPIV−３およびRSVで得られた力価と同等であった。
このように、キメラタンパクの単回接種はPIV−３およ
びRSVに対する中和抗体を誘導するに十分であった。追
加免疫後（５週間後採血）でも、強いPIV−３およびRSV
中和力価が認められた。これらの結果は、さらにキメラ
タンパクのRSVおよびPIV−３成分の免疫原性が高いこと
を実証するものである。
キメラタンパクがRSVおよびPIV−３に対して同時に動
物を防護できるか否か評価するために、各群４匹のコッ
トンラットに100TCID50単位のPIV−３またはRSVを鼻腔
内に抗原投与した。ウイルスを抗原投与してから４日後
に動物を屠殺した。肺ホモジネートについてウイルス価
を測定した。下表３に示すように、FRSV−HNPIV-3キメ
ラタンパクを１または10μｇ免疫投与した動物では、PI
V−３またはRSVの抗原投与に対して完全な防護が認めら
れた。これらの結果は、キメラタンパクが高い免疫原性
を有するのみならず、PIV−3/RSV中和の平均逆数log2力
価は、生きたPIV−３およびRSV感染により起こる疾病に
対してコットンラットを同時に防護できることを実証す
るものである。
物を防護できるか否か評価するために、各群４匹のコッ
トンラットに100TCID50単位のPIV−３またはRSVを鼻腔
内に抗原投与した。ウイルスを抗原投与してから４日後
に動物を屠殺した。肺ホモジネートについてウイルス価
を測定した。下表３に示すように、FRSV−HNPIV-3キメ
ラタンパクを１または10μｇ免疫投与した動物では、PI
V−３またはRSVの抗原投与に対して完全な防護が認めら
れた。これらの結果は、キメラタンパクが高い免疫原性
を有するのみならず、PIV−3/RSV中和の平均逆数log2力
価は、生きたPIV−３およびRSV感染により起こる疾病に
対してコットンラットを同時に防護できることを実証す
るものである。
実施例15: 本実施例は、FPIV-3−GRSVキメラ遺伝子を含むブルー
スクリプトM13−SKベクターの構築を説明するものであ
る。このキメラ遺伝子構造は、突然変異PIV−３ Ｆ遺
伝子の5'非翻訳領域を含むが、突然変異PIV−３ Ｆお
よび在来RSV Ｇ遺伝子の疎水性アンカー及び細胞質尾
部ドメインをコード化したヌクレオチド配列を欠く。こ
のプラスミッドの構築工程は、図17および18に示す。
スクリプトM13−SKベクターの構築を説明するものであ
る。このキメラ遺伝子構造は、突然変異PIV−３ Ｆ遺
伝子の5'非翻訳領域を含むが、突然変異PIV−３ Ｆお
よび在来RSV Ｇ遺伝子の疎水性アンカー及び細胞質尾
部ドメインをコード化したヌクレオチド配列を欠く。こ
のプラスミッドの構築工程は、図17および18に示す。
第１段階のFPIV-3−GRSVキメラ遺伝子構造のPIV−３
Ｆ成分調製工程（図17）は非PCR増幅PIV−３ Ｆ遺伝
子の857と874の位置およびPCR増幅PIV−３ Ｆ遺伝子の
847と864の位置に存在する18ペプチド長の配列5'CAAGAA
AAAGGAATAAAA 3'（SEQ ID No:17）内の予想前終了部
位の除去である（図１参照）。この工程の最後に、非PC
R増幅PIV−3 F遺伝子のPIV−３ cDNAをBsaA IおよびEc
rR I部位で切断した。EcrR I−BsaA Iリンカーを用い、
BsaA I−EcrR I PIV Ｆ遺伝子フラグメントをブルース
クリプトM13−SKベクターのEcrR I部位にクローン化し
た。次に、Morinagaらの方法［1984,Biotechnology 2:
636−639］を用い、糖ヌクレオチド介在突然変異により
PIV−３ Ｆ遺伝子（非PCR増幅）の857−874標的領域に
突然変異を起こさせた。pPI3Fcプラスミッド（実施例
１）をAmp遺伝子中のSca Iで切断し、アルキルホスファ
ターゼで脱リン酸化した（プラスミッド＃１）。pPI3Fc
プラスミッドの別の試料をBstE IIおよびNsi Iで切断
し、PIV−３ 遺伝子の0.9KbBstE II−Nsi Iフラグメン
トを欠く3.9Kb制限プラスミッドを構築した（プラスミ
ッド＃２）。Ｆタンパク配列を変化させることなく857
−874DNAセグメントに特異的突然変異を起こさせるため
に、5'CAGGAGAAGGGTATCAAG 3'配列（SEQ ID No:19）
を含む突然変異原性78−mer合成糖ヌクレオチド（図17
に示した＃2721、SEQ ID No:18）を合成した。100℃
で３分間変性させ、徐々に冷却することによって復元さ
せたDNAプラスミッド＃１および＃２に、この糖ヌクレ
オチドを添加した。次に、混合物をDNAポリメラーゼ、d
TNPsおよびT4リガーゼの存在下でインキュベーション
し、HB101細胞に転換した。100μg/mlのアンピシリン含
有YT寒天プレートから、1.8Kb突然変異PIV−３ Ｆ遺伝
子を含む細菌を分離した。糖ヌクレオチドプローブ5'AG
GAGAAGGGTATCAAG 5'（SEQ ID No:20）ハイブリッド化
を用いて、突然変異PIV−３ Ｆ遺伝子の存在を確認し
た。突然変異遺伝子配列は、DNA配列解析により確認し
た。突然変異PIV−３遺伝子を含むプラスミッドはpPI3F
mと命名した。
Ｆ成分調製工程（図17）は非PCR増幅PIV−３ Ｆ遺伝
子の857と874の位置およびPCR増幅PIV−３ Ｆ遺伝子の
847と864の位置に存在する18ペプチド長の配列5'CAAGAA
AAAGGAATAAAA 3'（SEQ ID No:17）内の予想前終了部
位の除去である（図１参照）。この工程の最後に、非PC
R増幅PIV−3 F遺伝子のPIV−３ cDNAをBsaA IおよびEc
rR I部位で切断した。EcrR I−BsaA Iリンカーを用い、
BsaA I−EcrR I PIV Ｆ遺伝子フラグメントをブルース
クリプトM13−SKベクターのEcrR I部位にクローン化し
た。次に、Morinagaらの方法［1984,Biotechnology 2:
636−639］を用い、糖ヌクレオチド介在突然変異により
PIV−３ Ｆ遺伝子（非PCR増幅）の857−874標的領域に
突然変異を起こさせた。pPI3Fcプラスミッド（実施例
１）をAmp遺伝子中のSca Iで切断し、アルキルホスファ
ターゼで脱リン酸化した（プラスミッド＃１）。pPI3Fc
プラスミッドの別の試料をBstE IIおよびNsi Iで切断
し、PIV−３ 遺伝子の0.9KbBstE II−Nsi Iフラグメン
トを欠く3.9Kb制限プラスミッドを構築した（プラスミ
ッド＃２）。Ｆタンパク配列を変化させることなく857
−874DNAセグメントに特異的突然変異を起こさせるため
に、5'CAGGAGAAGGGTATCAAG 3'配列（SEQ ID No:19）
を含む突然変異原性78−mer合成糖ヌクレオチド（図17
に示した＃2721、SEQ ID No:18）を合成した。100℃
で３分間変性させ、徐々に冷却することによって復元さ
せたDNAプラスミッド＃１および＃２に、この糖ヌクレ
オチドを添加した。次に、混合物をDNAポリメラーゼ、d
TNPsおよびT4リガーゼの存在下でインキュベーション
し、HB101細胞に転換した。100μg/mlのアンピシリン含
有YT寒天プレートから、1.8Kb突然変異PIV−３ Ｆ遺伝
子を含む細菌を分離した。糖ヌクレオチドプローブ5'AG
GAGAAGGGTATCAAG 5'（SEQ ID No:20）ハイブリッド化
を用いて、突然変異PIV−３ Ｆ遺伝子の存在を確認し
た。突然変異遺伝子配列は、DNA配列解析により確認し
た。突然変異PIV−３遺伝子を含むプラスミッドはpPI3F
mと命名した。
キメラ遺伝子構造の遺伝子工学的構築における第２工
程（図18）は、トランケートPIV−３ Ｇ糖ヌクレオチ
ドの膜間アンカードメインおよび細胞質尾部をコード化
したヌクレオチドおよび5'リーダー配列を欠くRSV Ｇ
遺伝子にタンデムにリンクしたPIV−３ Ｆタンパクの
膜間アンカードメインおよび細胞質尾部コード化ヌクレ
オチド配列を欠くFm遺伝子を組み込むための、ブルース
クリプトベクターの構築に関するものである。
程（図18）は、トランケートPIV−３ Ｇ糖ヌクレオチ
ドの膜間アンカードメインおよび細胞質尾部をコード化
したヌクレオチドおよび5'リーダー配列を欠くRSV Ｇ
遺伝子にタンデムにリンクしたPIV−３ Ｆタンパクの
膜間アンカードメインおよび細胞質尾部コード化ヌクレ
オチド配列を欠くFm遺伝子を組み込むための、ブルース
クリプトベクターの構築に関するものである。
このキメラ遺伝子を調製するために、まずpPI3Fmプラ
スミッドにおける突然変異PIV−Ｆ遺伝子の方向をEcrR
I消化および再結紮によって逆転させて、pPI3Fmrプラス
ミッドを構築した。キメラ遺伝子のPIV−３ Ｆ遺伝子
成分を調製するため、pPI3FmrプラスミッドNot Iおよび
Bsr Iで切断して1.7kbトランケートPIV−３ Ｆ遺伝子
を遊離させた。RSV Ｇ成分を調製するため、ポリリン
カーをEcrR Iで、遺伝子をBamH Iで切断して、Ｇタンパ
クアンカードメインおよび細胞質尾部をコード化したDN
Aセグメント5'リーダー配列を欠く0.95KbRSV−Ｇ遺伝子
をpRSV−Ｇプラスミッド（実施例１）から遊離させた。
0.95KbのEcrR I−BamH I RSV Ｇ遺伝子フラグメントを
制限ブルースクリプトベクターpM13−SKのEcrR I−BamH
I部位にサブクローン化し、pRSVGtプラスミッドを構築
した。ＦおよびＧ遺伝子コード配列を修復するBsr I−B
amH I糖ヌクレオチドカセット（SEQ ID No:9）を介し
て、0.95KbEcrR I−BamH I G遺伝子フラグメントおよび
1.5Kb Not I−Bsr IトランケートPIV−３ Ｆ遺伝子を
リンクさせ、三方向結紮でBamH IおよびNot I制限pRSVG
tベクターにクローン化した。このようにして構築した
プラスミッドはpFGと命名した。
スミッドにおける突然変異PIV−Ｆ遺伝子の方向をEcrR
I消化および再結紮によって逆転させて、pPI3Fmrプラス
ミッドを構築した。キメラ遺伝子のPIV−３ Ｆ遺伝子
成分を調製するため、pPI3FmrプラスミッドNot Iおよび
Bsr Iで切断して1.7kbトランケートPIV−３ Ｆ遺伝子
を遊離させた。RSV Ｇ成分を調製するため、ポリリン
カーをEcrR Iで、遺伝子をBamH Iで切断して、Ｇタンパ
クアンカードメインおよび細胞質尾部をコード化したDN
Aセグメント5'リーダー配列を欠く0.95KbRSV−Ｇ遺伝子
をpRSV−Ｇプラスミッド（実施例１）から遊離させた。
0.95KbのEcrR I−BamH I RSV Ｇ遺伝子フラグメントを
制限ブルースクリプトベクターpM13−SKのEcrR I−BamH
I部位にサブクローン化し、pRSVGtプラスミッドを構築
した。ＦおよびＧ遺伝子コード配列を修復するBsr I−B
amH I糖ヌクレオチドカセット（SEQ ID No:9）を介し
て、0.95KbEcrR I−BamH I G遺伝子フラグメントおよび
1.5Kb Not I−Bsr IトランケートPIV−３ Ｆ遺伝子を
リンクさせ、三方向結紮でBamH IおよびNot I制限pRSVG
tベクターにクローン化した。このようにして構築した
プラスミッドはpFGと命名した。
実施例16: 本実施例は、突然変異PIV−３ Ｆ遺伝子を含み、5'
リーダー配列およびＧタンパクの膜間アンカードメイン
および細胞質尾部コード化ヌクレオチド配列を欠くRSV
G遺伝子にリンカウした疎水性アンカーおよび細胞質コ
ード化部位を欠くFPIV-3−GRSVキメラ遺伝子pD2バクロ
ウイルス運搬ベクター（実施例８に記載）の構築を説明
するものである。
リーダー配列およびＧタンパクの膜間アンカードメイン
および細胞質尾部コード化ヌクレオチド配列を欠くRSV
G遺伝子にリンカウした疎水性アンカーおよび細胞質コ
ード化部位を欠くFPIV-3−GRSVキメラ遺伝子pD2バクロ
ウイルス運搬ベクター（実施例８に記載）の構築を説明
するものである。
この構造を構築するため、pFGプラスミッド（実施例1
5）をEcrR Iで切断して2.6KbのFPIV-3−GRSVキメラ遺伝
子を遊離させた。次に、2.6kbのEcrR I制限キメラ遺伝
子フラグメントを脱リン酸化pD2ベクターのEcrR I部位
にサブクローン化して、12.1KbのpD2F−Ｇプラスミッド
（ATCC 75389）を構築した。
5）をEcrR Iで切断して2.6KbのFPIV-3−GRSVキメラ遺伝
子を遊離させた。次に、2.6kbのEcrR I制限キメラ遺伝
子フラグメントを脱リン酸化pD2ベクターのEcrR I部位
にサブクローン化して、12.1KbのpD2F−Ｇプラスミッド
（ATCC 75389）を構築した。
実施例17: 本実施例は、FPIV-3−GRSVキメラ遺伝子を含む無菌精
製組換えバクロウイルスの調製を説明するものである。
製組換えバクロウイルスの調製を説明するものである。
２μｇのpD2F−ＧプラスミッドDNA（実施例16）と１
μｇの直線野生型AcNPV DNA（Invitrogenより入手）を
同時にSpodoptera frugiperda（Sf9）細胞に接種し
た。実施例10に記載した手順にしたがって、FPIV-3−G
RSV遺伝子を含む組換えバクロウイルスを２回無菌精製
した。
μｇの直線野生型AcNPV DNA（Invitrogenより入手）を
同時にSpodoptera frugiperda（Sf9）細胞に接種し
た。実施例10に記載した手順にしたがって、FPIV-3−G
RSV遺伝子を含む組換えバクロウイルスを２回無菌精製
した。
実施例18: 本実施例は、組換えバクロウイルス感染Sf9およびHig
h ５細胞におけるFPIV-3−GRSVキメラタンパクの存在
を説明するものである。
h ５細胞におけるFPIV-3−GRSVキメラタンパクの存在
を説明するものである。
FPIV-3−GRSVキメラ遺伝子を含む組換えバクロウイル
ス（実施例16）をSf9およびHigh ５細胞に５〜10pfu/
細胞のm.o.i.で感染させた。組換えウイルスに感染した
細胞の上清はPIV−３ Ｆ特異的ELISAで表現タンパクが
陽性であった。感染細胞の上清は、免疫ブロットで、抗
Ｆ PIV−３および抗Ｇ RSVモノクロナール抗体に反応
した。これらの結果から、感染Sf9およびHigh ５細胞
の上清中におけFPIV-3−GRSVキメラタンパクの存在が確
認された。
ス（実施例16）をSf9およびHigh ５細胞に５〜10pfu/
細胞のm.o.i.で感染させた。組換えウイルスに感染した
細胞の上清はPIV−３ Ｆ特異的ELISAで表現タンパクが
陽性であった。感染細胞の上清は、免疫ブロットで、抗
Ｆ PIV−３および抗Ｇ RSVモノクロナール抗体に反応
した。これらの結果から、感染Sf9およびHigh ５細胞
の上清中におけFPIV-3−GRSVキメラタンパクの存在が確
認された。
実施例19: 本実施例は、FPIV-3−FRSVおよびFRSV−HNPIV-3遺伝
子を表現する組換えワクチンウイルスの調製を説明する
ものである。
子を表現する組換えワクチンウイルスの調製を説明する
ものである。
FPIV-3−FRSV遺伝子（vP1192と表示）およびFRSV−HN
PIV-3遺伝子（vP1195と表示）を表現する組換えワクチ
ンウイルスは、COPAK宿主域選択システムを用い、Virog
enetics Corporation（Troy,NY）（本特許被譲渡人の
関連会社）で製造した。COPAK宿主域選択システムに使
用した挿入プラスミッドはワクチニアK1L宿主域遺伝子
［Perkusら、（1990）Virology 179:276−286］および
修飾ワクチニアH6プロモーター［Perkusら（1989）、J.
Virology 63:3829−3836］を含んでいた。これら挿入プ
ラスミッドにおいて、K1L遺伝子、H6プロモーターおよ
びポリリンカー領域はATI領域を置換するコペンハーゲ
ン系ワクチニアフランキングアームの間に位置させる
［オープンリーディングフレーム（ORFs）A25L,A26L;Go
ebelら（1990）、Virology 179:247−266;517−56
3］。COPAK挿入プラスミッドはレスキューウイルスNYVA
C（vP866）を用い、in vitroにおける組換えに使用す
るように設計されている（Tartagliaら（1992）、Virol
ogy 188:217−232）。組換えウイルスの選択は、ウサ
ギの腎臓細胞を用いて行った。
PIV-3遺伝子（vP1195と表示）を表現する組換えワクチ
ンウイルスは、COPAK宿主域選択システムを用い、Virog
enetics Corporation（Troy,NY）（本特許被譲渡人の
関連会社）で製造した。COPAK宿主域選択システムに使
用した挿入プラスミッドはワクチニアK1L宿主域遺伝子
［Perkusら、（1990）Virology 179:276−286］および
修飾ワクチニアH6プロモーター［Perkusら（1989）、J.
Virology 63:3829−3836］を含んでいた。これら挿入プ
ラスミッドにおいて、K1L遺伝子、H6プロモーターおよ
びポリリンカー領域はATI領域を置換するコペンハーゲ
ン系ワクチニアフランキングアームの間に位置させる
［オープンリーディングフレーム（ORFs）A25L,A26L;Go
ebelら（1990）、Virology 179:247−266;517−56
3］。COPAK挿入プラスミッドはレスキューウイルスNYVA
C（vP866）を用い、in vitroにおける組換えに使用す
るように設計されている（Tartagliaら（1992）、Virol
ogy 188:217−232）。組換えウイルスの選択は、ウサ
ギの腎臓細胞を用いて行った。
組換えウイルスvP1192およびvP1195は、それぞれ挿入
プラスミッドpES229A−６およびPSD.RNを用いて構築し
た。FPIV-3−FRSV遺伝子を含むpES229A−６プラスミッ
ドを調製するために、COPAK−H6挿入プラスミッドpSD55
5をSma Iで切断し、腸アルカリホスファターゼで脱リン
酸化した。プラスミッドをEcrR IおよびBamH Iで切断し
て、pES60Aプラスミッド（実施例４）から2.6KbのF
PIV-3−FRSV遺伝子を取り出した。2.6KbEcrR I−BamH I
FPIV-3−FRSV遺伝子をクレノーポリメラーゼで鈍端化
し、低融点アガフォースゲルから単離し、COPAK−H6挿
入プラスミッドpSD555のSma I部位にクローン化して、p
ES229A−H6プラスミッドを構築した。これによってF
PIV-3−FRSVORFは5'末端がH6プロモーターに最も近い所
にあるように位置する。
プラスミッドpES229A−６およびPSD.RNを用いて構築し
た。FPIV-3−FRSV遺伝子を含むpES229A−６プラスミッ
ドを調製するために、COPAK−H6挿入プラスミッドpSD55
5をSma Iで切断し、腸アルカリホスファターゼで脱リン
酸化した。プラスミッドをEcrR IおよびBamH Iで切断し
て、pES60Aプラスミッド（実施例４）から2.6KbのF
PIV-3−FRSV遺伝子を取り出した。2.6KbEcrR I−BamH I
FPIV-3−FRSV遺伝子をクレノーポリメラーゼで鈍端化
し、低融点アガフォースゲルから単離し、COPAK−H6挿
入プラスミッドpSD555のSma I部位にクローン化して、p
ES229A−H6プラスミッドを構築した。これによってF
PIV-3−FRSVORFは5'末端がH6プロモーターに最も近い所
にあるように位置する。
PSD.RNプラスミッドを調製するため、まずpSD555ベク
ターをSma IおよびBamH Iで切断した。ＦRSV−HN PIV−
３トランケート遺伝子を含むpM RF−HNプラスミッド
（実施例９）をCla Iで切断し、クレノーポリメラーゼ
で鈍端化し、さらにBamH Iで切断した。3.3KbのＦRSV−
HN PIV−３遺伝子をpSD555ベクターのSma I−BamH I部
位にクローン化してPSD.RNベクターを構築した。このよ
うにして、H6の5'末端がH6プロモーターの最も近くにあ
るようにＦRSV−HN PIV−３ ORFを配置した。
ターをSma IおよびBamH Iで切断した。ＦRSV−HN PIV−
３トランケート遺伝子を含むpM RF−HNプラスミッド
（実施例９）をCla Iで切断し、クレノーポリメラーゼ
で鈍端化し、さらにBamH Iで切断した。3.3KbのＦRSV−
HN PIV−３遺伝子をpSD555ベクターのSma I−BamH I部
位にクローン化してPSD.RNベクターを構築した。このよ
うにして、H6の5'末端がH6プロモーターの最も近くにあ
るようにＦRSV−HN PIV−３ ORFを配置した。
レスキューウイルスとしてNYVAC（vP866）を用い、pE
S229A−６およびPSD.RNプラスミッドを用いて、ベロ細
胞におけるin vitro組換え実験を行なった。組換えプ
ロゲニーウイルスをウサギ腎（RK）−13細胞（ATCC＃CC
L37）上で選抜した。いくつかのプラクをRK−13細胞上
で２回通過させた。キメラ遺伝子を含むウイルスは、PI
VおよびRSV挿入DNA配列に特異的な標識プローブを用い
た標準的in situプラクハイブリッド化［Picciniら（1
987）、Methods in Enzymology,153:545−563］によ
って確認した。ＦPIV-3−ＦRSVおよびＦRSV−HN PIV−
３キメラ遺伝子を含むプラク精製ウイルスは、それぞれ
vP1192およびvP1195と命名した。
S229A−６およびPSD.RNプラスミッドを用いて、ベロ細
胞におけるin vitro組換え実験を行なった。組換えプ
ロゲニーウイルスをウサギ腎（RK）−13細胞（ATCC＃CC
L37）上で選抜した。いくつかのプラクをRK−13細胞上
で２回通過させた。キメラ遺伝子を含むウイルスは、PI
VおよびRSV挿入DNA配列に特異的な標識プローブを用い
た標準的in situプラクハイブリッド化［Picciniら（1
987）、Methods in Enzymology,153:545−563］によ
って確認した。ＦPIV-3−ＦRSVおよびＦRSV−HN PIV−
３キメラ遺伝子を含むプラク精製ウイルスは、それぞれ
vP1192およびvP1195と命名した。
vP1192およびvP1195感染細胞におけるキメラ遺伝子の
表現を確認するために、ラジオイミュノ沈殿検定を行な
った。この検定は、ベロウイルス感染細胞から調製した
細胞溶融液について、モルモットのモノ特異性PIV−３
抗−HNおよび抗−Ｆ抗血清およびウサギの抗RSV Ｆ抗
血清を用いて行なった［Taylorら（1990）J.Virology
64;1441−1450］。抗PIV Ｆおよび抗RSV Ｆ抗血清はv
P1192感染ベロ細胞から見かけ分子量約90kDaのタンパク
を沈殿させた。抗RSV Ｆおよびモルモットの抗PIV HN
抗血清は、vP1195感染ベロ細胞から見かけ分子量約100k
Daのタンパクを沈殿させた。これらの結果から、組換え
ポックスウイルス感染ベロ細胞において、ＦPIV-3−ＦR
SVおよびＦRSV−HN PIV−３キメラタンパクの生産が確
認された。
表現を確認するために、ラジオイミュノ沈殿検定を行な
った。この検定は、ベロウイルス感染細胞から調製した
細胞溶融液について、モルモットのモノ特異性PIV−３
抗−HNおよび抗−Ｆ抗血清およびウサギの抗RSV Ｆ抗
血清を用いて行なった［Taylorら（1990）J.Virology
64;1441−1450］。抗PIV Ｆおよび抗RSV Ｆ抗血清はv
P1192感染ベロ細胞から見かけ分子量約90kDaのタンパク
を沈殿させた。抗RSV Ｆおよびモルモットの抗PIV HN
抗血清は、vP1195感染ベロ細胞から見かけ分子量約100k
Daのタンパクを沈殿させた。これらの結果から、組換え
ポックスウイルス感染ベロ細胞において、ＦPIV-3−ＦR
SVおよびＦRSV−HN PIV−３キメラタンパクの生産が確
認された。
開示の要約 本開示を要約すると、本発明は多くの病原体、特にPI
VおよびRSVによる感染に対する防護を誘導することので
きるキメラタンパクを生産するマルチマーハイブリッド
遺伝子を提供するものである。本発明の範囲内で改良が
可能である。
VおよびRSVによる感染に対する防護を誘導することので
きるキメラタンパクを生産するマルチマーハイブリッド
遺伝子を提供するものである。本発明の範囲内で改良が
可能である。
フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ａ６１Ｐ 37/04 Ｃ０７Ｋ 14/115 Ｃ０７Ｋ 14/115 14/19 14/19 19/00 19/00 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｎ 5/10 5/00 Ａ (72)発明者 エワシシン、メアリー、イー. カナダ国、エム２アール ３エヌ７、オ ンタリオ州、ウィロウダール、アパート メント 1506、トレスダール 120 (56)参考文献 特開 昭61−129135（ＪＰ，Ａ) 特開 平１−160998（ＪＰ，Ａ) 特表 平３−503760（ＪＰ，Ａ) 特表 平３−501723（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/09 A61K 39/00 A61K 39/155 A61P 11/00 A61P 31/16 A61P 37/04 C07K 14/005 C07K 14/11 C07K 14/19 C07K 19/00 C12N 5/10 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＣＡ（ＳＴＮ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ) ＥＭＢＡＳＥ（ＳＴＮ)
Claims (11)
- 【請求項１】パラインフルエンザウイルス−３（PIV−
３）のＦタンパク（FPIV-3）またはHNタンパク（HN
PIV-3）の免疫原性エピトープが、呼吸器系発疹ウイル
ス（RSV）のＧタンパク（GRSV）またはＦタンパク（F
RSV）の免疫原性エピトープにリンクしている構造を有
するパラインフルエンザウイルス（PIV）および呼吸器
系発疹ウイルス（RSV）により引き起こされる複合呼吸
器系疾患に対して防護効果のあるキメラタンパクであっ
て、 FPIV-3−FRSVキメラタンパク、FRSV−HNPIV-3キメラタ
ンパクおよびFPIV-3−GRSVキメラタンパクから選ばれた
ものである ことを特徴とするキメラタンパク。 - 【請求項２】請求項１に記載のキメラタンパクをコード
することを特徴とするマルチマーハイブリッド遺伝子。 - 【請求項３】発現ベクター中に含まれている請求項２に
記載のマルチマーハイブリッド遺伝子。 - 【請求項４】プラスミドpAC DR7（ATCC 75387）、pD2
RF−HN（ATCC 75388）、またはpD2 Ｆ−Ｇ（ATCC
75389）を形成している請求項３に記載のマルチマーハ
イブリッド遺伝子。 - 【請求項５】さらに少なくとも１つの免疫原性およびま
たは免疫刺激性分子をコードする少なくとも１つの遺伝
子を含む請求項２〜４のいずれかに記載のマルチマーハ
イブリッド遺伝子。 - 【請求項６】前記キメラタンパクの発現のための請求項
２ないし５のいずれかに記載のマルチマーハイブリッド
遺伝子を含むことを特徴とする細胞。 - 【請求項７】請求項２ないし５のいずれかに記載のマル
チマーハイブリッド遺伝子を含む抗原運搬用ベクター。 - 【請求項８】パラインフルエンザウイルス−３（PIV−
３）のＦタンパク（FPIV-3）またはHNタンパク（HN
PIV-3）をコードする遺伝子配列を分離し、呼吸器系発
疹ウイルス（RSV）のＧタンパク（GRSV）またはＦタン
パク（FRSV）をコードする遺伝子配列を分離し、それら
の遺伝子配列をリンクさせてマルチマーハイブリッド遺
伝子を形成させ、細胞発現系中でマルチマーハイブリッ
ド遺伝子を発現させることによるパラインフルエンザウ
イルス（PIV）および呼吸器系発疹ウイルス（RSV）によ
り引き起こされる複合呼吸器系疾患に対して防護効果の
あるキメラタンパクを調製する方法であって、 前記マルチマーハイブリッド遺伝子が、FPIV-3−FRSVハ
イブリッド遺伝子、FRSV−HNPIV-3ハイブリッド遺伝子
またはFPIV-3−GRSVハイブリッド遺伝子である ことを特徴とするキメラタンパクを調製する方法。 - 【請求項９】該マルチマーハイブリッド遺伝子がプラス
ミドpAC DR7（ATCC75387）、pD2 RF−HN（ATCC 7538
8）、またはpD2 Ｆ−Ｇ（ATCC 75389）を含む発現ベ
クター中に含まれる請求項８に記載の方法。 - 【請求項１０】該キメラタンパクは、細胞発現系の培養
培地から分離され、分離されたキメラタンパクは精製さ
れていることを特徴とする請求項８または９に記載の方
法。 - 【請求項１１】請求項１に記載のキメラタンパクと、そ
の生理学的に許容される担体と、を含むことを特徴とす
るパラインフルエンザウイルス（PIV）および呼吸器系
発疹ウイルス（RSV）により引き起こされる複合呼吸器
系疾患に対するワクチン。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB9200117.1 | 1992-01-06 | ||
| GB929200117A GB9200117D0 (en) | 1992-01-06 | 1992-01-06 | Production of recombinant chimeric proteins for vaccine use |
| PCT/CA1993/000001 WO1993014207A1 (en) | 1992-01-06 | 1993-01-05 | Chimeric immunogens |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07501707A JPH07501707A (ja) | 1995-02-23 |
| JP3290662B2 true JP3290662B2 (ja) | 2002-06-10 |
Family
ID=10708117
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP51203593A Expired - Lifetime JP3290662B2 (ja) | 1992-01-06 | 1993-01-05 | キメラ免疫原 |
Country Status (16)
| Country | Link |
|---|---|
| US (13) | US6225091B1 (ja) |
| EP (1) | EP0621898B1 (ja) |
| JP (1) | JP3290662B2 (ja) |
| KR (1) | KR100208310B1 (ja) |
| AT (1) | ATE205535T1 (ja) |
| AU (1) | AU667502B2 (ja) |
| CA (1) | CA2126863C (ja) |
| DE (1) | DE69330745T2 (ja) |
| DK (1) | DK0621898T3 (ja) |
| ES (1) | ES2164070T3 (ja) |
| FI (1) | FI117514B (ja) |
| GB (1) | GB9200117D0 (ja) |
| NO (1) | NO316622B1 (ja) |
| PT (1) | PT621898E (ja) |
| RU (1) | RU2123047C1 (ja) |
| WO (1) | WO1993014207A1 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2013031827A1 (ja) | 2011-08-29 | 2013-03-07 | 国立大学法人徳島大学 | Rsv粘膜ワクチン |
Families Citing this family (47)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB9200117D0 (en) * | 1992-01-06 | 1992-02-26 | Connaught Lab | Production of recombinant chimeric proteins for vaccine use |
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| FR2718452B1 (fr) | 1994-04-06 | 1996-06-28 | Pf Medicament | Elément d'immunogène, agent immunogène, composition pharmaceutique et procédé de préparation. |
| US6300090B1 (en) | 1994-07-29 | 2001-10-09 | The Rockefeller University | Methods of use of viral vectors to deliver antigen to dendritic cells |
| US20030054505A1 (en) * | 1997-09-26 | 2003-03-20 | Hong Jin | Recombinant rsv expression systems and vaccines |
| FR2726472B1 (fr) | 1994-11-07 | 1997-01-31 | Pf Medicament | Proteine porteuse a effet adjuvant, complexe immunogene la contenant, leur procede de preparation, sequence nucleotidique et vaccin |
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| US6699476B1 (en) | 1996-07-15 | 2004-03-02 | Peter L. Collins | Production of recombinant respiratory syncytial viruses expressing immune modulatory molecules |
| FR2751229B1 (fr) | 1996-07-19 | 1998-11-27 | Rhone Merieux | Formule de vaccin polynucleotidique notamment contre la pathologie respiratoire des bovins |
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| US7951383B2 (en) | 1997-05-23 | 2011-05-31 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Attenuated parainfluenza virus (PIV) vaccines |
| US7314631B1 (en) | 1997-05-23 | 2008-01-01 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Use of recombinant live-attenuated parainfluenza virus (PIV) as a vector to protect against disease caused by PIV and respiratory syncytial virus (RSV) |
| US7201907B1 (en) | 1997-05-23 | 2007-04-10 | The United States Of America, Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Attenuated human-bovine chimeric parainfluenza virus(PIV) vaccines |
| US20030082209A1 (en) | 2000-07-05 | 2003-05-01 | Skiadopoulos Mario H. | Attenuated human-bovine chimeric parainfluenza virus (PIV) vaccines |
| US6410023B1 (en) | 1997-05-23 | 2002-06-25 | United States Of America | Recombinant parainfluenza virus vaccines attenuated by deletion or ablation of a non-essential gene |
| US7192593B2 (en) * | 1997-05-23 | 2007-03-20 | The United States Of America, Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Use of recombinant parainfluenza viruses (PIVs) as vectors to protect against infection and disease caused by PIV and other human pathogens |
| US7250171B1 (en) | 1997-05-23 | 2007-07-31 | United States Of America As Represented By The Dept. Of Health & Human Services | Construction and use of recombinant parainfluenza viruses expressing a chimeric glycoprotein |
| US6656906B1 (en) | 1998-05-20 | 2003-12-02 | Trimeris, Inc. | Hybrid polypeptides with enhanced pharmacokinetic properties |
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