KR100208310B1 - 키메릭 면역원들 - Google Patents
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Abstract
가장 넓은 관점에서 본 발명은 제1병원균으로부터의 단백질 항체 부분을 코딩하는 유전자와 제2병원균으로부터의 단백질 항체 부분을 코텅하는 유전자가 연결된 멀티메릭 하이브리드 유전자와 그 하이브리드 유전자에 의하여 코딩된 다수의 병원균에 감염에 의한 호흡기도 질병을 예방할 수 있는 키메릭 단백질을 제공하는 것에 관한 것이다. 그러한 키메릭 단백질은 제1병원균으로부터의 단백질의 항원부분이 제2병원균으로부터의 단백질의 항원 부분과 연결되어 있다.
제1과 제2병원균들은 일반적으로 세균성, 바이러스성 병원균으로부터 선택되어졌고, 한가지 구체적 예로 둘다 바이러스성 병원균일 수도 있다.
제1과와 제2병원균이 기도 윗 부분의 병과 기도 아랫 부분의 병과 같이 다른 병을 유발하는 병원균으로부터 선택된다. 좋은 구체적 실례로 제1병원균을 PIV로 하고 제2병원균을 RSV로 하는 것이다. 특별히 PIV 단백질은 PIV-3 단백질과 HN단백질로부터, RSV 단백질은 RSV G 와 F단백질로부터 선택되어진다. 본 발명의 또다른 점은 다수의 병원균 감염에 의한 호흡기도 질병을 예방할 수 있는 키메릭 단백질 발현을 위한 멀티메릭 하이브리드 유전자를 가지는 세포들을 제공한다는 것이다. 이러한 세포들은 세균성 세포들이거나, 포유류 세포, 곤충세포, 이스트 세포, 또는 균류 세포일 수 있다. 더우기 본 발명은 생리적으로 받아들여 질 수 있는 멀티 메릭 하이브리드 유전자를 가지는 항원 형성을 위한 살아있는 바이러스성, 또는 세균성 벡터를 제공한다. 그러한 살아있는 벡터는 다중 병원균 감염에 의한 질병에 대한 백신의 특효있는 부분을 형성한다. 그러한 백신은 비내로 또는 구강으로 투여될 수 있는 형태로 형식화 될 수 있다.
본 발명의 또다른 점은 다수의 병원균에 의한 호흡기도의 질병을 예방할 수 있는 키메릭 단백질 형성에 관한 과정을 제공한다는 점이다. 그 절차는 제1병원균으로부터의 단백질의 항원적 부분을 코딩하는 유전자 서열을 분리, 제2병원균으로부터의 단백질의 항원적 부분을 코딩하는 유전자 서열의 분리, 멀티메릭 하이브리드 유전자를 만들기 위한 유전자 서열의 연결, 세포 발현 시스템에서 멀티메릭 하이브리드 유전자의 발현으로 이루어져 있다. 제1 및 제2 병원균들은 다른 호흡기도 질병을 유발하는 박테리아성, 바이러스성 병원균들로부터 선택되어진다. 그러한 세포 발현 시스템은 세균성 세포들이거나, 포유류 세포, 곤충세포, 이이스트 세포, 또는 균류 세포에 의해 제공될 수 있다. 유전자 발현의 산물인 키메릭 단백질은 세포 발현 시스템에서 분리되어 정제될 수 있다.
본 발명은 다중 병원균 감염에 의한 질병에 대한, 멀티메릭 하이브리드 유전자에 의해 코딩된 키메릭 단백질과 생리적으로 받아들일 수 있게 하는 캐리어로 이루어진 백신을 포함한다. 그러한 백신는 비내로 또는 구강으로 투여될 수 있는 형태로 형식화 될 수 있다.
여기에 언급된 백신들은 효과있는 양의 백신을 주입함으로써 다중 병원균 감염에 의한, 특별히 PIV와 RSV, 질병에 대하여 숙주를 면역시키는데 쓰일 수 있다. 위에서 언급했다시피, 사람의 PIV와 RSV에 관하여는 숙주가 유아들이나 어린이, 임신할 나이의 여성 및 임산부나 중년과 같이 감염이 되기 쉬운 사람일 수 있다.
Description
[발명의 명칭]
키메릭 면역원들
[도면의 간단한 설명]
제1도는 PCR 증폭된 PIV-3 F 유전자의 뉴클레오타이드 서열(서열 번호 1)과 F 단백질의 아미노산 서열(서열 번호 2)이다.
제2도는 PIV-3 F 유전자의 제한효소 지도이다.
제3도는 PIV-3 HN 유전자의 뉴클레오타이드 서열(서열 번호 3)과 HN 단백질의 아미노산 서열(서열 번호 4)이다.
제4도는 PIV-3 HN 유전자의 제한효소 지도이다.
제5도는 RSV F 유전자의 뉴클레오타이드 서열(서열 번호 5)과 RSV F 단백질의 아미노산 서열(서열번호 6)이다.
제6도는 RSV F 유전자의 제한효소 지도이다.
제7도는 RSV G 유전자의 뉴클레오타이드 서열(서열 번호 7)과 RSV G 단백질의 아미노산 서열(서열번호 8)이다.
제8도는 RSV G 유전자의 제한효소 지도이다.
제9도는 키메릭 FPIV-3-FRSV유전자를 가진 발현 벡터의 형성에 관한 과정을 나타낸다.
제10도는 5'의 해석되지않는 서열이 없고 트랜스멤브레인 앵커와 세포질쪽 꼬리를 코딩하는 유전자가 없는 FPIV-3유전자를 가진 발현 벡터의 형성에 관한 과정을 나타낸다.
제11도는 절단된 RSV F1 유전자에 5'의 해석되지 않는 부분이 없는 절단된 PIV- 3 F 유전자를 가진 키메릭 FPIV-3-FRSV유전자를 가진 발현 벡터의 형성에 관한 과정을 나타낸다.
제12도는 절단된 RSV F1 유전자에 5'의 해석되지 않는 부분과 트랜스멤브레인 앵커와 세포질 쪽의 꼬리를 코딩하는 부분이 없는 PIV-3 F 유전자로 구성된 키메릭 FPIV-3-FRSV유전자를 가진 수정된 pAC 610 베큐로바이러스(baculovirus)발현 벡터의 형성에 관한 과정을 나타낸다.
제13도는 재조합 베큐로바이러스들로 감염된 Sf9세포의 세포 용해물의 이뮤노블랏(immunoblots) 을 보여주고 있다.
제14도는 베큐로바이러스 전이 벡터(pD2)의 형성에 관한 과정을 나타낸다.
제15도는 키메릭 FRSV- HNPIV-3유전자의 형성에 관한 과정을 나타낸다.
제16도는 정제된 FRSV- HNPIV-3키메릭 단백질의 이뮤노 블랏과 SDS-PAGE 젤을 나타낸다.
제17도는 PIV-3 유전자의 돌연 변이 유발을 설명해주는 것이다.
제18도는 키메릭 FPIV-3- GRSV유전자의 형성에 관한 과정을 나타낸다.
[발명의 상세한 설명]
[발명의 기술 분야]
본 발명은 면역 단백질이나 다수 병원균의 단백질 절편을 코딩하는 유전자 서열을 가지는 멀티메릭 하이브리드 유전자들의 제조와 발현에 관한 것이다.
[발명의 기술적 배경]
본 발명의 잇점은 다수 병원균으로부터의 보호적 항원을 가지는 단일 면역원을 제조하는 것이다. 이러한 키메라들은 궁극적으로는 단일 투여로 여러 효과를 나타내는 멀티메릭 백신을 만든다는 관점에서 볼 때 백신 조합 개발을 매우 단순화시킨다. 근래에 멀티메릭 백신은 병원균들의 생성, 그들에 대한 적절한 항원의 생성 그리고 그것들을 결합시키는 것을 별개로 하여 만들어지고 있다. 이는 힘들고 비용이 많이 드는 복잡한 과정이다. 반면에 여러 병으로부터 보호하는 능력을 가진 단일의 면역원은 멀티메릭 백신 제조의 많은 문제점을 해결해줄 것이다. 여기 제시된 유형의 몇가지 키메릭 면역원들은 결합하여 멀티메릭 백신 제조에 필요한 개개의 항원들의 수를 줄이게 된다.
사람의 파라인플렌쟈(parainfluenza) 바이러스 타입 1,2,3 과 호흡기 신시튬의 바이러스 타입 A,B 가 유아나 어린이에게 심한 기도 감염을 유발하는 주요한 바이러스성 병원균들이다. 미국에서만도 매년 약 백 육십만 명의 1세 미만 유아가 임상적으로 심각한 RSV 감염을 가지고 있으며, 약 백 사십만 명의 유아가 PIV-3에 감염된다고 추산되어진다. 미국에서 매년 약 사천명의 1세 미만 유아들이 RSV 와 PIV-3감염에 의한 심한 기도의 병으로부터 유발된 합병증으로 죽는다. WH0와 NIALD 백신 자문 위원회가 RSV 백신 개발을 HIV 다음으로 꼽고있는 한편, 효과있는 PIV-3 백신의 제조가 백신 제조에 있어서 우선적으로 고려되어야할 상위 열가지의 백신들에 랭크되어 있다.
유아들을 이러한 바이러스성 감염으로부터 보호하기 위한 안전하고도 효과적인 백신이 없고, 절박하게 요구되는 바이다. 임상 실험에 의하면 포름 알데히드 인액티베이티드 라이브 어테뉴에이티드(formaldehyde-inactivated and live-attenuated) 바이러스성 백신은 이러한 감염에 대한 보호 백신으로는 적당하지 않음이 밝혀졌다. 사실상, 포름알데히드 백신을 투여한 유아들은 대조 그룹보다 차후의 자연적인 RSV 감염동안 더 심각한 하부 호흡계통 질병이 발생했다.[Am. J. Epidemiology 89, 1969, p.405-421; J. Inf. Dis. 145, 1982, p.311-319] 더욱이, 산성 pH 에서의 일루션을 이용한 면역 친화도 크로마토그래피에 의하여 정제된 RSV 당단백질은 코튼 쥐들에게 면역 강화효과를 유발한다. [Vaccine, 10(7), 1992, p.475-484] 와일드 타입의 바이러스 주입 이후의 백신에 있어서 악성 폐 질환을 유발하지 않는 효과적인 PIV-3 RSV 백신의 개발은 치료학과 중요한 관련을 가진다. 유아들을 PIV와 RSV 감염에 의하여 생기는 병들로부터 동시에 보호하여 환자수와 사망율을 줄일 수 있는 재조합에 의한 단일의 면역원의 개발이 기대 되어지고 있다.
PIV-3과 RSV에 대한 보호적인 반응은 주요한 바이러스성 당단백질에 대한 중화작용 유도에 달려 있다고 보고되어져 왔다. PIV의 경우 이러한 보호적인 면역원들로는 분자량이 72 kDa의 적혈구 응집 반응(hemogglutination)과 뉴라미니다아제 액티비티(neuraminidase activity)를 가진 HN 단백질과 분자량 65 kDa의 바이러스와 숙주 세포막의 퓨젼과 바이러스의 세포에서 세포로의 퍼짐을 책임지는 퓨젼(F)단백질이 있다. RSV의 경우 두가지 주요한 면역원성 단백질은 분자량 80에서 90 kDa의 G 당단백질과 70 kDa의 퓨젼(F) 단백질이 있다. G와 F 단백질은 각각 PIV HN 과 F 단백질과 기능적으로 유사하다고 여겨진다. PIV와 RSV F 당단백질은 디설파이드 결합으로 연결된 N 말단의 F2와 C 말단의 F1 조각으로 단백질 분해적으로 쪼개어진 인액티브 프리커서(FO)로서 만들어진다.
PIV와 RSV로부터의 재조합 표면 당단백질들은 재조합된 폭스 바이러스들로 감염된 포유류 세포에서 뿐만 아니라[Spriggs et al., (1987), J. Virol.61 :3416-3423 ; Sttot et al., (1987) J. Virol.61:3855-3561] 베큐로바이러스(bacurovirus)체계를 사용하여 곤충 세포에서 개별적으로 발현되어져 왔다. [Ray et al., (1989), Virus research, 12: 169-180; Colingh et al.,(1987), Virology, 160: 465-472; Wathan et al., (1989) J.of Inf. Dis. 159: 253-263] 이러한 시스템에서 만들어진 재조합 항원들은 면역된 코튼 쥐들을 살아있는 바이러스의 도전으로부터 보호하는 것으로 알려져 있다. 최근에 재조합된 항원들인 하이브리드 RSV F-G [Wathen et al., (1989), J. Gen Virol. 70: 2625-2635; Wathen, published International Patent application WO 89/05823]과 PIV-3 F-HN [Wathen, published International Patent Application WO 89/10405]이 포유류 세포나 곤충 세포에서 유전 공학적으로 만들어져 오고 있다. RSV F-G 항원은 엔티-G 항체 반응을 유도해내지 못함에도[Connors et al., (1992) , Vaccine 10:475-484] 불구하고 코튼 쥐들에서는 보호적인 것으로 알려져 있다. [Wathan et al., (1989), J. Gen. Virol. 70:2637-2644] PIV-3 F-HN의 보호적인 능력은 출판된 특허 응용에는 보고되지 않았다. 이러한 항원들은 단지 호모로거스 바이러스, 다시 말해서 RSV 또는 PIV-3에 대한 보호목적으로 제조되었다. 그러나, 유아나 어린이들을 PIV와 RSV감염으로부터 동시에 보호할 목적으로 각 바이러스로부터 최소한 하나의 보호적인 항원을 가진 재조합 면역원을 유전 공학적으로 만드는 것은 경제적이며 잇점이 있을 것이다. 여기에 소개된 그러한 목적의 키메릭 단백질들은 또한 임신한 여성이나 임신할 나이의 여성에게 주입함으로써 모 항체를 자극시킬 수도 있다. 또한 이러한 백신은 중년의 어른들과 같이 감염되기 쉬운 사람들에게도 주입될 수 있다.
[발명의 요약]
가장 넓은 관점에서 본 발명은 제1병원균으로부터의 단백질 항체 부분을 코딩하는 유전자와 제2병원균으로부터의 단백질 항체 부분을 코딩하는 유전자가 연결된 멀티메릭 하이브리드 유전자와 그 하이브리드 유전자에 의하여 코딩된 키메릭 단백질을 제공하는 것에 관한 것이다. 그러한 키메릭 단백질은 제1병원균으로부터의 단백질의 항원부분이 제2병원균으로부터의 단백질의 항원 부분과 연결되어 있다.
첫번째와 제2병원균들은 일반적으로 세균성, 바이러스성 병원균으로부터 선택되어졌고, 한가지 구체적 예로 둘다 바이러스성 병원균일 수도 있다. 첫번째와 제2병원균이 기도 윗 부분의 병과 기도 아랫 부분의 병과 같이 다른 병을 유발하는 병원균으로부터 선택되어지면 더욱 좋다. 좋은 구체적 실례로 제1병원균을 PIV로 하고 제2병원균을 RSV로 하는 것이다.
특별히 PIV 단백질은 PIV-3 단백질과 HN단백질로부터, RSV 단백질은 RSV G 와 F단백질로부터 선택되어진다. 본 발명의 또다른 점은 키메릭 단백질 발현을 위한 멀티메릭 하이브리드 유전자를 가지는 세포들을 제공한다는 것이다. 이러한 세포들은 세균성 세포들이거나, 포유류 세포, 곤충세포, 이스트 세포, 또는 균류 세포일 수 있다. 더우기 본 발명은 생리적으로 받아들여질 수 있는 멀티메릭 하이브리드 유전자를 가지는 항원 형성을 위한 살아있는 바이러스성, 또는 세균성 벡터를 제공한다. 그러한 살아있는 벡터는 다중 병원균 감염에 의한 질병에 대한 백신의 특효있는 부분을 형성한다. 그러한 벡신은 비내로 또는 구강으로 투여될 수 있는 형태로 형식화 될 수 있다.
본 발명의 또다른 점은 키메릭 단백질 형성에 관한 과정을 제공한다는 점이다. 그 절차는 제1병원균으로부터의 단백질의 항원적 부분을 코딩하는 유전자 서열을 분리, 제2병원균으로부터의 단백질의 항원적 부분을 코딩하는 유전자 서열의 분리, 멀티메릭 하이브리드 유전자를 만들기 위한 유전자 서열의 연결, 세포 발현 시스템에서 멀티메릭 하이브리드 유전자의 발현으로 이루어져 있다. 그러한 세포 발현 시스템은 세균성 세포들이거나, 포유류 세포, 곤충세포, 이이스트 세포, 또는 균류 세포에 의해 제공될 수 있다. 유전자 발현의 산물인 키메릭 단백질은 세포 발현 시스템에서 분리되어 정제될 수 있다.
본 발명은 다중 병원균 감염에 의한 질병에 대한, 멀티메릭 하이브리드 유전자에 의해 코딩된 키메릭 단백질과 생리적으로 받아들일 수 있게 하는 캐리어로 이루어진 백신을 포함한다. 그러한 백신은 비내로 또는 구강으로 투여될 수 있는 형태로 형식화 될 수 있다.
여기에 언급된 백신들은 효과있는 양의 백신을 주입함으로써 다중 병원균 감염에 의한, 특별히 PIV와 RSV 질병에 대하여 숙주를 면역시키는데 쓰일 수 있다. 위에서 언급했다시피, 사람의 PIV와 RSV에 관하여는 숙주가 유아들이나 어린이, 임신할 나이의 여성 및 임산부나 중년과 같이 감염이 되기 쉬운 사람일 수 있다.
여기에 제시된 키메릭 단백질은 적당한 분석 과정에 의해 숙주내의 다른 병원균의 복수적인 감염을 인지하는 진단상의 시료로 쓰일 수도 있다.
후술될 본 발명의 상세한 설명에는 주로 PIV와 RSV 감염에 의한 질병에 대한 면역에 효과적인 키메릭 분자에 대해서 설명하고 있지만, 여기 제시된 발명은 각 병원균으로부터의 항체가 단일 분자안에 연결되어 있어서 복수의 병원균에 의한 질병에 효과적인 키메릭 단백질과 그러한 단백질을 코딩하는 유전자에까지 확장된다.
여기서 멀티메릭 하이브리드 유전자라 함은 다른 종류의 병원균으로부터의 단백질의 항체 부분을 코딩하는 유전자들을 말하고 키메릭 단백질이라 함은 다른 종류의 병원균으로부터의 단백질의 항체 부분을 가지는 면역원들을 의미한다.
[발명의 상세한 설명]
본 발명은 두가지 다른 어린이 질병에 대하여 보호적인 키메릭 분자에 관한 것이다. 본 발명은 PIV와 RSV에 동시에 감염되어 생기는 질병들에 대하여 특히 다른 감염이 되기 쉬운 어른들과 유아들, 어린이들을 보호할 수 있는 안전하고도 효과적인 여러 종류의 재조합 PIV/RSV 면역원들의 형성에 관한 것이다. 그러나 앞에서 언급한 바와 같이 본 발명은 많은 병원균으로부터의 보호적인 항원들을 코딩하는 유전자를 가지는 멀티메릭 하이브리드 유전자의 제조에 확장된다. 그러한 백신들은 비내나 구강으로 쉽게 주입될 수 있다.
본 발명에서 발명가는 나란히 연결되어 있는 PIV-3 과 RSV 표면 당단백질을 코딩하는 선택된 유전자로부터 관련된 서열을 가지는 몇가지의 모델 PIV/RSV 키메릭 유전자들을 특별히 제조하였다. 여기서 언급되는 키메릭 구조안에 있는 모든 유전자는 최근 임상적으로 분리된 PIV-3 와 RSV이다. 키메릭 유전자의 구조는 PIV-3 F 나 HN 가 RSV G 또는 RSV F와 모든 가능한 상대적 오리엔테이션과 조합으로 나란히 연결된 유전자 서열을 포함시킬 수 있다.
여기에 제시된 키메릭 유전자 구조는 전체 유전자 서열 또는 면역성이 있는 에피토프(epitope)를 코딩하는 유전자 조각으로 이루어질 수도 있다.
이러한 유전자의 자연적인 뉴클레오타이드 서열은 항원성은 유지한 체 돌연변이에 의하여 수정될 수 있다. 그리고 그러한 수정은 진핵세포에서의 발현을 위하여 추정되는 선-전사 종결부위의 제거를 포함하기도 한다. 단일 생성물안에 나란히 있는 하이브리드 PIV-RSV 표면 당단백질들을 코딩하기 위한 유전자의 유전 생성물은 PIV와 RSV에 둘다에 대하여 보호적인 항체를 유도할 수 있다. 그러한 멀티메릭 하이브리드 유전자는 사람의 PIV-3 F 또는 HN 단백질이나 그들의 면역원적인 에피토프를 가진 조각들을 코딩하는 유전자 서열과 사람의 RSV G나 RSV F단백질이나 그들의 면역원적인 에피토프를 가진 조각을 코딩하는 유전자 서열로 이루어져있다. 특정 유전자 구조는 FPIV-3-FRSV, FRSV- HNPIV-3, FPIV-3- GRSV하이브리드 유전자일 수 있다.
덧붙여서, 본 발명은 PIV 와 RSV 유전자들 또는 유전자 조각들이 모든 가능한 오리엔테이션으로 연결된 트리메릭(trimeric)유전자와 같은 다른 멀티메릭 유전자의 형성에까지 확장될 수 있다. 예를 들면 , FPIV-HNPIV- F 또는 GRSV, FPIV, - FRSV- GRSV, HNPIV- FRSV- GRSV와 같은 것들이 있다. 여기에 제시된 멀티메릭 유전자들은 또한 면역원적인 동시에/또는 면역 자극적인 최소한 한 분자를 코딩하는 최소한 하나의 유전자로 이루어질 수 있다.
여기에 제시된 멀티메릭 하이브리드 유전자는 세포 발현 시스템에 적합한 벡터로 서브-클론 될 수 있다. 그러한 세포 발현 시스템은 세균성 세포들이거나, 포유류 세포, 곤충세포, 이스트 세포, 또는 균류 세포들일 수 있다.
여기에 제시된 키메릭 단백질들은 재조합 폭스바이러스, 아데노바이러스, 레테로바이러스와 같은 살아있는 바이러스성 벡터와 살모넬라, 미코박테리아와 같은 살아있는 박테리아성 벡터를 이용하여 면역 시스템에 제공되기도 한다.
PIV/RSV 키메라와 같은 키메릭 단백질들은 변형되거나 감염된 세포들의 세포 용해물이나 부유물에 존재한다. 따라서 손쉽게 정제할 수 있다.
키메릭 단백질들의 면역원성과 보호적인 능력을 알아보기 위해서 PIV/RSV키메라와 같은 정제된 키메릭 단백질의 다른 주입량과 동시에 또는 별개로 위에서 언급한 살아있는 재조합 벡터를 이용하여 적당한 실험용 동물들을 면역시킨다. 그러한 키메릭 단백질들은 알루미늄 포스페이트(aluminum phosphate)와 같은 생리적으로 받아들여지는 운반물질에 의하거나, ISCOM 과 리포소옴과 같은 운반 시스템에 의하여 면역 시스템에 제공된다. 키메라들은 또한 콜레라 톡신 B 서브유닛과 같은 면역표적 운반 물질과 결합하거나 미세입자와 섞여 점막 반응을 유도해내기도 한다. 벡신은 멀티메릭 단백질을 독성 물질이나 항체와 같이 면역 시스템의 세포에 특정적으로 운반하는 수단을 가지기도 한다. 키메릭 단백질들의 면역보호적인 능력을 더욱 증대시키기 위하여 다른 면역원이나 면역 자극 물질이 보충되기도 한다. 여기서 특별히 언급하는 키메릭 PIV/RSV 단백질들은 PIV-3 와 RSV에 동시에 감염되어 생기는 질병에 대한 보호를 위한 주입되기 쉬운 벡터로 만들어지기 위하여 알루미늄 포스페이트와 같은 보조약과 함께 쓰인다.
키메릭 단백질은 비내로 또는 구강으로 주입될 수 있다. 키메릭 단백질은 PIV-3와 RSV의 감염에 대한 인지 도구로 쓰일 수 있다.
본 발명은 키메릭 PIV-3과 RSV 단백질 제조에 국한되지 않고, 최소한 두가지 병원균으로부터의 단백질의 전체 서열이나 또는 면역원성 부분으로 구성된 키메릭 면역원들의 생산에 적용될 수 있다. 키메릭 면역원들은 다른 병원균으로부터의 몇가지 단백질의 면역 우성의 에피토프를 가지도록 합성 될 수 있다. 이러한 키메릭 항원들은 벡신이나 치료적 시료로서 유용하다.
[서열표시]
몇가지의 뉴클레오타이드와 아미노산의 서열이 이 출원의 명세서에 언급되고 있다. 다음의 표는 그런 서열들과 서열들의 위치를 표시한 것이다.
[기탁 정보]
여기에서 설명되어지고 언급된 플라스미드 DNA들은 부다페스트 조약에 따라 출원일 전에 미합중국, 매릴랜드, 록빌(Rockville)에 위치한 A.T.C.C.(American Type Culture Collection)에 기탁되어졌다. 기탁된 정제된 플라스미드들은 이 미국 특허출원과 유럽 특허출원 공고중 빠른 것에 의하여 공중이 이용할 수 있다. 기탁된 구체적 실례는 단지 발명을 설명하기위한 것이므로 여기에 설명된 발명의 범위가 기탁된 플라스미드 구조에 의해 제한되지 아니한다. 다음의 정제된 플라스미드들이 1992년 12월 17일 표시된 접근 번호로 ATTC에 기탁되었다.
이 출원에서 설명된 항원과 균등한 항원을 생산하는데 쓰이는 어떠한 균등한 플라스미드들은 본 발명의 범위에 속한다.
[실시예]
상기의 명세서는 발명을 일반적으로 설명하였다. 다음의 특정 실시예를 참고하면 더 완벽하게 발명을 이해할 수 있을 것이다. 이러한 실시예는 단순히 설명을 하기 위한 목적이고 발명의 범위를 제한하기 위한 것은 아니다. 형식의 변화나 균등물의 치환은 상황에 따라 암시되는 것이거나 편법으로 여겨진다. 특정 용어가 쓰이더라도 그것은 설명을 위한 것이고 제한을 위한 것이 아니다.
PIV-3 와 RSV 유전자의 클로닝과 시퀀싱 방법과 유전자를 적당한 벡터로 서브-클로닝하고 유전자 구조를 포유류 세포나 곤충류 세포에서 발현시키는 방법은 명세서에 명백하게 설명되어 있지는 않으나 이 분야에서는 숙련된 방법의 범주에 속한다.
[실시예 1]
이 실시예는 PIV-3 F, HN 그리고 RSV F, G 유전자들(타입 A 분리물로부터)을 시퀀싱하고 클로닝하는데 사용하는 전략에 관한 윤곽을 보여주고있다. 이러한 유전자들은 실시예 2에서4, 9와 15에서 각각 상세하게 설명될 F-F, F- HN, F-G키메릭 유전자들을 형성하는데 사용된다.
두개의 PIV-3 F 유전자 클론은 처음에는 최근의 임상적인 PIV-3 분리물로부터 출출한 바이러스성 RNA로부터 얻어진 cDNA 의 PCR 증폭에 의해 얻어진다. 두개의 다른 PIV-3 F 유전자 클론과 PIV-3 HN, RSV F, RSV G 유전자들은 PIV-3나 RSV의 임상적인 분리물(타입 A 분리물)에 의해 감염된 MRC-5 세포들로부터 분리된 mRNA에 의해 마련된 cDNA 라이브러리로부터 클로닝된다. PIV-3 F(PCR 증폭된 것이나, PCR 증폭되지 않은것 둘다), PIV-3 HN, RSV F, RGV,G 유전자 클론들은 다이데옥시뉴클레오타이드 사슬 종지법의 과정에 의해 시퀀싱된다. 유전자들의 양 가닥의 시퀀싱은 수동적인 방법과 자동적인 방법이 조합이 되어 행하여졌다.
PCR 증폭된 PIV-3 F 유전자의 뉴클레오타이드 서열(서열번호 1)과 F단백질의 아미노산 서열(서열번호 2)이 제1도에 나타나있고 유전자의 제한효소 지도는 제2도에서 보여주고 있다. 두개의 PCR 증폭된 PIV-3 F 유전자 클론의 1844 개의 뉴클레오타이드들을 서열 분석한 결과 클론들이 동일하다는 확신을 갖게 했다. PCR 증폭된 PIV-3 F 유전자 클론의 코딩 시퀀스와 알려진 PIV-3 F 유전자의 그것과 비교해보니, 코딩 시퀀스에 2.6%차이가 있었고 이는 14개의 아미노산의 치환되는 결과를 낳는다.
PCR 증폭된 유전자 클론과 PCR 증폭되지 않은 PIV-3 F전자 클론의 시퀀싱은 다음과 같은 차이점이 있다. PCR증폭되지 않은 클론은 유전자의 5'쪽의 해석되지 않는 부분에 열개의 부가적인 뉴클레오타이드(AGGACAAAAG)를 가지고 있고, 8(PCR증폭 유전자에서의 T가 PCR증폭되지 않은 유전자에서는 C), 512(PCR증폭 유전자에서의 C가 PCR증폭되지 않은 유전자에서는 T), 518(PCR증폭 유전자에서의 G가 PCR증폭되지 않은 유전자에서는 A), 1376(PCR증폭 유전자에서의 A가 PCR증폭되지 않은 유전자에서는 G)등 네 부분이 다르다. 이러한 변화는 PCR증폭되지 않은 PIV-3 F유전자에 의하여 코딩된 F단백질의 아미노산 서열에 세개의 변화를 주었다. PCR증폭된 PIV-3 F유전자의 1차 아미노산 서열중 세린(110), 글리신(112), 아스파릭산(398)이 PCR증폭되지 않은 F단백질의 1차 아미노산 서열에서 페닐알라닌(110), 글루타믹산(112), 글리신(398)으로 각각 바뀌었다.
PIV-3 HN 유전자의 뉴클레오타이드 서열( 서열번호 3)과 PIV-3 HN 단백질의 아미노산 서열(서열번호 4)이 제3도에 나타나있고 유전자의 제한 효소 지도는 제4도에서 보여주고 있다. 두개의 HN 클론으로부터의 1833 개의 뉴클레오타이드를 분석한 격과, 시퀀스가 동일하다는 확신을 갖게 했다.
PIV-3 HN 유전자 클론의 코딩 시퀀스와 알려진 PIV-3 HN 유전자의 그것과 비교해보니, 코딩 시퀀스에 4.4% 차이가 있었고 이는 PIV-3 HN 유전자에 의해 코딩된 단백질의 1차 아미노산 서열에 17개의 아미노산이 치환되는 결과를 낳는다.
RSV F유전자의 뉴클레오타이드 서열(서열번호 5)과 RSV F단백질의 아미노산 서열(서열번호 6)이 제5도에 나타나있고 유전자의 제한효소 지도는 제6도에서 보여주고 있다. 두개의 RSV F클론으로부터 1887 개의 뉴클레오타이드를 분석하여 두 클론이 완전히 동일한 시퀀스라는 것이 밝혀졌다. 이 뉴클레오타이드 서열과 RSV F의 보고된 시퀀스를 비교해보면 코딩 시퀀스에서 1.8% 차이가 있고 이는 11개의 아미노산 치환의 결과로 나타난다.
RSV G 유전자의 뉴클레오타이드 서열(서열번호 7)과 RSV G 단백질의 아미노산 서열(서열번호 8)이 제7도에 나타나있고 유전자의 제한효소 지도는 제8도에서 보여주고 있다. G 유전자 클론의 920개의 뉴클레오타이드와 알려진 G 시퀀스(타입 A 분리물)을 비교해본 결과 뉴클레오타이드 서열에는 4.2% 차이가 있고 유전자에 의한 산물인 아미노산 서열에는 6.7% 차이가 있었다. 이 차이는 20개의 아미노산의 치환으로 나타난다.
PIV-3 F(PCR증폭 되지 않은)의 전 길이, PIV-3 HN, RSV F, RSV G유전자들은 블런트 엔드 연결(blunt end ligation)에 의하거나 적합한 링커를 사용하여 gtII 으로 클로닝되고, 블루스크립트 M13-SK 벡터의 다중 클로닝 부위로 서브클론된다. PCR 증폭된 PIV-3 F유전자는 블루스크립트 벡터로 직접적으로 클로닝된다. PIV-3 F(PCR증폭된), PIV-3 F(PCR 증폭되지 않은), PIV-3 HN, RSV F, RSV G 유전자들을 가지는 클로닝 벡터를 각각 pPI3F, pPI3Fc, pPIVHN, pRSVF, pRSVG 라고 부른다.
[실시예 2]
이 실시예는 키메릭 F-F유전자를 가지는 블루스크립트-베이스 발현 벡터의 형성을 설명하는 것이다. 이 키메릭 유전자의 구조는 PIV-3 F유전자의 5'의 번역되지 않는 부분을 가지나 PIV-3와 RSV F 유전자의 소수성 앵커와 세포질쪽 꼬리를 코딩하는 부분은 없다. 이러한 플라스미드 형성에 관련된 단계가 제9도에 요약되어져있다.
키메릭 유전자의 PIV-3 부분을 만들기위해(제9도의 1단계) 트랜스멤브레인 부분과 세포질쪽 꼬리를 코딩하는 부분이 없는 전 길이의 PIV-3 유전자가, 폴리링커를 BamHI으로 자르고, Klenow 폴리머라아제로 선형화된 플라스미드를 블런트-엔딩하고, 유전자를 BsrI로 자름으로써 플라스미드 pPI3R로부터 회수되어진다. PpuMI 부분과 세개의 연속적인 번역 정지 코돈을 가진 BsrI-BamHI 올리고뉴클레오타이드 카셋트(서열번호 9)가 1.6Kb의 잘리워진[BamHI]-BsrI PIV-3 F유전자 조각에 연결되고, 사람의 메탈로티오닌 프로모터와 폴리 A 그리고 SV4O 게놈의 IVS 시퀀스를 가지고 있는 블루스크립트 Ml3-SK 발현 벡터의 EcoRV-BamHI 부분으로 클로닝되면 pME1 플라스미드가 만들어진다.
키메릭 구조의 RSV F유전자 부분을 제조하기 위하여(제9도의 2단계)트랜스멤브레인 부분과 세포질쪽 꼬리를 코딩하는 부분이 없는 RSV F 유전자가, 폴리링커를 EcoRI으로, 유전자를 BspHI으로 자름으로써 플라스미드 pRSVF로부터 회수되어진다. 세개의 연속적인 번역 정지 코돈을 가지고 있는 합성된 BspHI-BamHI 올리고뉴클레오티드 카셋트(서열번호 10)가 1.6Kb의 잘리워진 RSV F유전자에 연결이 되고, 블루스크립트- 베이스 발현 벡터, pMCR20 의 EcoRI-BamHI 부분으로 클로닝 되어 플라스미드 pES13A가 만들어진다. 그런 다음 플라스미드 pES13A는 잘리워진 RSV F 유전자로부터 F2 코딩 시퀀스와 리이더 시퀀스를 없애기 위하여 EcoRI과 PpuMI으로 잘리워진다. 리이더 시퀀스는 EcoRI-PpuMI 올리고뉴클레오티드 카셋트(서열번호 11)를 사용하여 다시 만들어지고 RSV F1 조각에 연결되어 pES23A 플라스미드를 형성한다.
잘리워진 RSV F1 유전자 조각에 연결된 PIV-3 F유전자의 5'의 번역되지 않는 부분을 가진 키메릭 F-F유전자를 만들기 위하여(제9도 3단계) 먼저 1.6Kb의 잘리워진 PIV-3 F유전자를 가지고 있는 플라스미드 pMEI 을 PpuMI 와 BamHI로 자른다.
PpuMI-BamHI로 잘리워진 pMEI 벡터는 장내의 알칼린 포스파타아제에 의해 디포스포리레이트(dephosphorylate)된다. 1.1Kb의 RSV F1 유전자 조각은 플라스미드를 PpuMI 과 BamHI 으로 자름으로써 플라스미드 pES23A 로부터 회수되어진다. 1.1Kb의 PpuMI-BamHI RSV F1 유전자 조각은 디포스포리레이티드된 pMEI 벡터의 pPUMI-BamHI 부분으로 클로닝되어 플라스미드 pES29A를 형성한다. 이 키메릭 유전자 구조는 PIV-3 F유전자의 5'의 번역되지 않는 부분을 가지나 PN-3와 RSV F와 세포질쪽 꼬리와 소수성 앵커를 코딩하는 뉴클레오타이드 시퀀스는 갖고있지 않다.
[실시예 3]
이 예는 5'의 번역되지 않는 부분과 트랜스멤브레인 앵커와 세포질쪽 꼬리를 코딩하는 부분이 없는 PIV-3 F유전자를 가지고 있는 블루스크립트-베이스 발현 벡터의 형성을 설명하는 것이다. 이 플라스미드의 형성에 관계되는 단계들이 제10도에 요약되어 있다.
전 길이의 PIV-3 F유전자를 가진 플라스미드 pPI3F 는 BamHI로 잘리고, Klenow 폴리머라아제에 의해 블런트 엔딩된후에 트랜스 멤브레인 부분과 세포질 쪽 꼬리를 코딩하는 부분을 제거하기 위해서 BsrI으로 잘린다.
블루스크립트-베이스 발현 벡터, pMCR20은 SamI와 BamHI로 잘린다. 번역 중지 코돈을 가진 합성된 BsrI-BamHN 올리고뉴클레오티드 카셋트(서열번호 12)는 플라스미드 pMpFB를 생산하기 위하여 1.6Kb의 블런트-엔딩 BsrI PIV-3 F유전자 조각과 결합하여 SamI-BamHI로 잘린 pMCR20 벡터를 만든다. 이 구조의 PIV-3 F유전자는 트랜스멤브레인과 세포질 앵커 부분을 코딩하는 DNA 조각은 가지고 있지 않지만, 5'의 번역되지 않는 부분은 가지고 있다. 5'의 번역되지 않는 부분과 소수성 앵커 부분을 코딩하는 DNA 조각 둘 다를 가지고 있지 않는 PIV-3 F유전자를 제조하려면 플라스미드 pMpFB가 EcoRI 과 BstBI로 잘린다. EcoRI-BstBI에 의해 제거된 시그날 펩티드와 코딩 시퀀스를 재구성하는 시퀀스를 가진 EcoRI-BstBI 올리고카셋트(서열번호 13) 가 EcoRI-BstBI에 의한 pMpFB 벡터와 연결되어 플라스미드 pMpFA를 생성한다.
[실시예 4]
이 예는 5'의 번역되지않는 부분이 없는 잘리워진 PIV-3 F유전자가 잘리워진 RSV F1 유전자에 연결된 키메릭 F-F유전자희 형성을 설명한다. 이러한 플라스미드를 형성하는데 관계되는 단계들이 제11도에 요약되어 있다. 이 키메릭 유전자 구조를 만들기 위해 플라스미드 pES29A(실시예 2)가 BstBI 와 BamHI 로 잘려져 2.5 Kb의 BstBI-BamHI PIV-3 F-RSV F1 키메릭 유전자 조각을 내놓게된다. 이 BstBI-BamHI 조각은 녹는점이 낮은 아가로스 젤로부터 분리되어 디포스포리레이티드 벡터 pMpFA 의 BsBI-BamHI 부분으로 클로닝되어 플라스미드 pES60을 생산한다. 이러한 구조에는 5'의 번역되지 않는 부분과 소수성 앵커, 세포질 쪽 꼬리를 코딩하는 시퀀스를 다 갖지 않는 PIV-3 F유전자가 잘리워진 RSV F유전자의 F1 코딩 부분에 연결되어있다. 이 키메릭 유전자는 서브 클론되어 베큐로바이러스 전이 벡터가 된다(실시예 5).
[실시예 5]
이 예는 잘리워진 RSV F유전자의 F1 코딩 부분에 연결된 5'의 번역되지 않는 부분과 소수성 앵커, 세포질 쪽 꼬리를 코딩하는 시퀀스를 다갖지 않는 PIV-3 F유전자로 이루어진 키메릭 F-F유전자와 선천적인 폴리히드린 프로모터를 가진 수정된 pAC 610 베큐로바이러스 전이벡터의 형성을 설명하는 것이다. 이러한 플라스미드를 형성하는데 관계되는 단계들이 제12도에 요약되어 있다.
pAC 610 베큐로바이러스 발현 벡터는 다음과 같은 방법으로 선천적인 폴리히드린 프로모터를 가지도록 수정될 수 있다. pAC 610 벡터가 EcoRV 와 BamHI로 잘린다. EcoRV-BamHI DNA 시퀀스가 없는 9.4Kb의 베큐로바이러스 전이 벡터는 낮은 녹는점의 아가로스 젤로부터 분리되며 장의 알칼린 포스파타아제로 처리된다. 3 가지의 결합 방식으로 선천적인 폴리히드린 프로모터를 재생하는데 필요한 뉴클레오타이드를 가진 EcoRV-EcoRI 올리고뉴클레오티드 카셋트(서열번호 14)가 pES13A(실시예 2, 2단계)구조로부터 분리된 잘린 RSV F유전자 조각과 EcoRV-BamHI에 의한 pAC 610 포스파타아스드 벡터와 결합하여 플라스미드 pES47A를 만들어낸다. 키메릭 F-F유전자를 가지는 pAC 610 블루스크립트-베이스 발현 벡터를 만들기 위하여 먼저 플라스미드 pES47A가 EcoRI 과 BamHI에 의해 잘려져서 1.6Kb의 잘리워진 RSV F유전자를 제거한다. 2.8Kb의 F-F키메릭 유전자는 플라스미드 pES60A(실시예 4)를 EcoRl 과 BamHI로 자름으로써 회수될 수 있다. 2.8Kb의 EcoRI-BamHI 키메릭 유전자는 EcoRI-BamHI 에 의한 pES47A 벡터에 결합하여 플라스미드 pAC DR7(ATCC 75387)을 생성한다.
[실시예 6]
이 예는 키메릭 F- F유전자를 가지고 있는 재조합 베큐로바이러스의 플라크 정제에 관한 설명이다.
Sf9 세포들이 와일드 타입 AcMNPV DNA 1.0 ug 과 F- F플라스미드 DNA(플라스미드 pAC DR7-실시예 5) 2.5 ug에 동시에 감염되었다. F-F키메릭 유전자를 가지는 추정의 재조합 베큐로바이러스들은 도트-브랏(dot-blot) 하이브리다이제이션으로 인지된다. 추정의 재조합 베큐로바이러스들로 감염된 곤충류 세포의 용해물은 p로 레이블된 F- F키메릭 유전자로 조사된다. 발현 연구에 쓰이기전에 재조합 베큐로바이러스들은 두 차례 플라크 정제하였다. 모든 절차는 베큐로바이러스 벡터들과 곤충 세포 배양 절차들의 메뉴얼 에서 M.D.Summer와 G.E.Smith 가 개설한 원안에 따라 행하여졌다.
[실시예 7]
이 예는 감염된 Sf9 세포의 세포 용해물과 부유물에 키메릭 F-F단백질이 존재함을 설명하는 것이다.
곤충류 세포는 8의 m.o.i.에서 실시예 4에서 설명한대로 마련된 플라크-정제된 재조합 베큐로바이러스들로 감염되었다. 재조합 바이러스들로 감염된 세포들로부터의 농축된 부유물은 PIV-3 특정 ELISA에 대하여 양성이었다. 뿐만아니라, S-메티오닌 레이블된 감염 세포들을 SDS-폴리아크릴 아마이드 젤 전기영동을 시키고, 젤을 오토래디오그래피로 분석하면 와일드 타입 감염 세포의 용해물에는 없는 약 90 kDa의 분자량을 가진 강한 밴드가 재조합 바이러스들로 감염된 세포의 용해물에서 존재한다. 재조합된 베큐로바이러스로 감염된 세포의 용해물에 키메릭 F-F단백질이 존재한다는 것은 모노스페시픽 항-PIV-3 F와 항-RSV F의 항혈청, 또는 모노크로날 항체(Mabs) 들을 이용한 웨스턴 브랏 분석에 의해 확인된다. 재조합 베큐로바이러스로 감염된 세포들의 용해물은 이뮤노블랏에서 항-PIV-3 항혈청과 항-RSV 항혈청과 둘다와 반응을 한다. 제13도의 이뮤노블랏에서 보여주듯이 RSV F또는 F-F재조합 베큐로바이러스로 감염된 세포의 용해물은 항-F RSV Mab 과 양성적으로 반응을 한다. 기대했던대로 와일드 타입 바이러스에 감염된 세포들로부터의 용해물은 이 Mab과 반응하지 않는다. 뿐만아니라, 오직 키메릭 F-F재조합 베큐로바이러스들로 감염된 세포들의 용해물만이 항-PIV-3 F항혈청과 반응한다.
[실시예 8]
이 예는 베큐로바이러스 전이 벡터 pVL1392(생체외에서 얻어진)에 대한 수정을 설명하는 것이다. pVL1392안에는 폴리히드린 ATG시작 코돈이 ATT로 바꾸어져 있고 폴리히드린 유전자 아랫쪽의 +4,5,6위치에 CCG 시퀀스가 존재한다. ATT 코돈으로부터 아랫 쪽에 몇 염기쌍의 구조 유전자를 삽입하면 해독이 증대되는 것이 알려져 있다. 이러한 수정된 배큐로바이러스 전이 벡터를 형성하는 과정이 제14도에 요약되어있다.
배큐로바이러스 발현 벡터 pVL1392 는 EcoRV와 BamHI로 잘라졌다. 9.5 Kb의 잘려진 pVL1392 벡터는 EcoRV-BamHI 올리고뉴클레오타이드 카셋트(서열 번호 15)에 연결되어 pD2 벡터를 생성한다.
[실시예 9]
이 발명은 잘리워진 RSV F와 PIV-3 HN 유전자가 나란히 연결된 키메릭 F-HN유전자를 가지고 있는 pD2 배큐로바이러스 발현 벡터의 형성에 관한 설명이다. 이 플라스미드의 형성에 관련된 단계들이 제15도에 요약되어져 있다.
F- HN유전자를 만들기 위하여 RSV F 당단백질의 세포질쪽 꼬리와 트랜스멤브레인 부분을 코딩하는 뉴클레오타이드 시퀀스가 없는 RSV F 유전자는 폴리 링커를 EcoRI으로, 유전자를 BspHI으로 자름으로써 플라스미드 pRSVF(실시예 1)으로부터 회수될 수 있다. 소수성 앵커 부분을 코딩하는 DNA 조각이 없는 PIV-3 HN 유전자는 유전자를 BspHI로 자르고 폴리 링커를 BamHI로 자름으로써 플라스미드 pPIVHN(실시예 1)로부터 회수될 수 있다. 1.6Kb의 EcoRl-BspHl RSV F유전자 조각과 1.7Kb의 BspHI-BamHI PIV-3 HN 유전자 조각은 아가로스 젤의 낮은 녹는 점으로부터 분기되었다. 클로닝을 위하여 블루스크립-베이스 포유류 세포 발현 벡터, pMCR20안의 두 BspHI 자리를 돌연변이시켰다. pMCR20의 BspHI 위치에 돌연변이는 발현 벡터를 BspHI로 자름에 의해 생기고, BspHI 제한 벡터와 BspHI에 의한 1,1KB의 조각을 Klenow 폴리머라아제로 처리하고, 블런트-엔드 블루스크립트-베이스 발현 벡터에 블런트-앤드 1.1Kb의 조각을 연결함으로써 플라스미드 PM'를 만든다. 포유류 세포 발현 벡터에 1.1Kb의 조각이 부적합한 오리엔테이션으로 삽입되면 블루스크립-베이스 발현 벡터의 증폭 유전자를 변하게 하므로, 단지, 잘 삽입된 1.1Kb의 조각을 가진 PM' 플라스미드 DNA로 변형된 HB101 세포의 클론만이 암피실린 존재하에 살아남는다. 플라스미드 DNA 는 플라스미드 PM'으로 변형된 암피실린-저항의 HB101 세포로부터 평형 원심분리를 이용하여 정제할 수 있다. 1.6Kb의 EcoRI-BspHl RSV F와 1,7 Kb BspHI-BamHI PIV-3 HN의 유전자 조각은 직접적으로 pM' 벡터의 EcoRl-BamHI 위치로 3가지 방법의 결합으로 클로닝되어서 플라스미드 pM'RF-HN 를 만든다.
BspHI에 의하여 제거된 RSV F와 PIV-3 F의 특정 코딩 시퀀스를 재생하기 위하여 적절한 RSV F와 PIV-9 HN 유전자 시퀀스를 가진 BspHI-BspHI 올리고뉴클레오타이드 카셋트(서열 번호 16)을 BspHI위치를 통해 BspHI에 의해 잘린 플라스미드 pM'RF-HN 에 연결하면 플라스미드 pM RF-HN이 생성된다. 적절한 위치의 BspHI-BspHI 올리고뉴클레오타이드 카셋트를 가진 클론은 올리고뉴클레오타이드 연결자와 측면 부위의 서열 분석으로 인지되었다.
키메릭 F-HN유전자를 베큐로바이러스 발현벡터 pD2(실시예 8) 안으로 클로닝하기 위해서 먼저 플라스미드 pM RF-HN 을 EcoRI로 자름으로써 잘려진 F-HN유전자를 회수하였다. 그런 다음 HN유전자를 베큐로바이러스 전이 플라스미드 pD2의 EcoRI위치에 클론시켜서 프라스미드 pD2 RF-HN을 얻는다. 플라스미드 pD2 RF-HN 에 삽입된 3.3Kb EcoRI F-HN키메릭 유전자의 적당한 오리엔테이션은 서열분석으로 확인한다.
[실시예 10]
이 예는 키메릭 F-HN유전자를 가지는 플라크-정제 재조합 베큐로바이러스의 제조에 관한 것이다.
Sf9 세포들이 1ug의 와일드 타입 AcNPV DNA와 2ug의 F-HN플라스미드 DNA(플라스미드 pD2 RF-HN 실시예 9)으로 감염되었다. F-HN키메릭 유전자를 가지는 추정의 재조합 베큐로바이러스들은 도트-블랏 하이브리다이제이션에 의해 인지된다. 추정의 재조합 베큐로바이러스에 감염된 곤충류 세포의 용해물들은 P-레이블된 RSV F나 PIV-3 HN 유전자 올리고뉴클레오타이드 프로브에 의해 검침된다. 발현 연구에 쓰이기 전에 재조합 베큐로바이러스들은 세 차례 플라크-정제되었다. 모든 절차는 Summers와 Smith에 의해 요약된 원안(실시예 6)에 의거하여 행하여졌다.
[실시예 11]
이 예는 감염된 Sf9 과 High5 세포의 부유물에 키메릭 F-HN단백질이 존재함을 설명하는 것이다.
혈청이 없는 매개체 Ex4 에서 유지된 곤충세포(Sf9 High5) 5-10 pfu/cell m.o.i.에서 실시예 10의 재조합 베큐로바이러스에 의해 감염되었다.
재조합 바이러스들로 감염된 세포들의 부유물들은 두 RSV-F와 PIV-3 HN 특정 ELISAS에서 발현된 단백질의 양성 반응을 보였다. 감염된 세포들로부터의 부유물들은 이뮤노블랏에서 두가지 항-F RSV 모노크로날 항체와 항-HN 펩티드 항혈청과 양성적으로 반응하였다. 이뮤노 블랏에서 약 105kDa의 구별되는 띠가 존재하였다. 이러한 결과는 재조합 베큐로바이러스들로 감염된 Sf9 과 High5 세포들의 부유물에 키메릭 F-HN이 분비되었음을 확인시켜준다.
[실시예 12]
이 예는 감염된 High5 세포들의 부유물로부터의 키메릭 F-HN의 정제에 관한 것이다.
혈청이 없는 매개체에서 유지된 High5 세포들은 5 pfu/cell m.o.i.에서 실시예 10의 플라크-정제된 재도합 베큐로바이러스로 감염되었다. 용해성 F-HN키메릭 단백질은 항-HN PIV-3 모노크로날 항체를 사용한 면역친화도 크로마토그래피에 의해 감염된 세포들로부터 정제되었다. 항-HN모노크로날 항체는 통용되는 방식에 의해 CNBR-액티베이티드 세파로스 4B와 짝지어진다. 면역 친화 칼럼을 사용하기전에 10베드 부피의 세척버퍼(10mM Tris-HCL pH 7.5, 150mM Nacl, 0.2% v/v Triton-X1OO)로 씻어졌다. 시료를 로딩한후, 칼럼은 10베드 부피의 세척 버퍼로 씻어진후 3베드 부피의 고염 버퍼(10mm Tris-HCL pH 7.5, 500mM Nacl, 0.02% v/v Triton-X 100)로 씻어진다. 키메릭 F-HN단백질은 0.02% Triton X-100의 존재하에 100MM 글리신 pH 2.5을 사용하여 면역친화 칼럼으로 부터 용출된다. 용출된 단백질은 1M Tris-HCL, pH 10.7로 즉시 중화되었다.
면역친화-정제 F-HN단백질의 폴리아크릴아마이드 젤 전기영동분석(제16도 panelA)는 분자량이 105kDa인 하나의 주요한 단백질 밴드가 존재함을 밝혀주었다. 정제된 단백질의 이뮤노 블랏에서 항-RSV F모노크로날 항체와 항-HN 펩티드 항혈청과 둘다 반응하였다.
[실시예 13]
이 예는 기니어 피그에서 F-HN의 면역원성을 설명하는 것이다.
4그룹의 기니어 피그들이 실시예 12에서 설명된 1.0또는 10.0ug의 정제된 F-HN단백질을 근육내에 주입되고 알루미늄포스페이트로 면역 보강되었다. 대조군의 동물들은 플라시보(placebo) 또는 살아있는 PIV-3나 RSV로 면역되었다. 기니어 피그들은 제1주입후 2, 4주 키워지고 4주에서 같은 양의 항원을 주입하여 더 강화시켰다. 제2 주입이후 2,4주후에 혈청 샘플을 얻는다. 키메릭 단백질의 PIV-3, RSV 특정 항체 반응들을 유도해 내는 능력을 알아보기 위해서 혈청 샘플들의 PIV-3 특정 혈구응집반응방해와 RSV항체 중화를 분석해보았다. 아래 표 1에 요약되어 있다시피, 두 10ug 복용량의 키메릭 단백질로 면역된 동물의 혈청들의 6, 8 주에서의 PIV-3 특정 혈구응집반응(HAI)과 PIV-3/RSV 중화 항체의 값이 살아있는 PIV-3나 RSV로 비내에 예방 접종하여 얻어진 수준위 값과 동일하다. 뿐만아니라, 단지 두 1ug 복용량의 키메릭 단백질로 면역된 동물들은 강한 PIV-3와 RSV 특정 중화 항체들을 유도했다. 이러한 결과는 키메릭 단백질 성분의 두 RSV와 PIV-3의 면역원성을 확인시켜주고, 단일의 재조합 면역원이 RSV와 PIV-3 모두의 항체를 중화시킬 수 있다는 확실한 증거를 제공한다.
[실시예 14]
이 예는 코튼 쥐에서 F-HN의 면역원성과 보호적인 기능을 설명하는 것이다.
8마리의 코튼 쥐 그룹이 1.0 또는 10.0ug 의 키메릭 F-HN단백질(실시예 12에서 만들어짐)을 근육내에 주입되고 알루미늄포스페이트로 면역 강화되었다. 대조군의 동물들은 플라시보(PBS+알루미늄포스페이트)또는 살아있는 PIV-3, RSV로 면역화되었다. 코튼 쥐가 제1주입이후 4주동안 키워지고 4주째 같은 복용량의 항원의 주입으로 더 강화되었다. 혈청 샘플은 재주입후 1주째에서 얻어졌다. 아래의 표 2에서와 같이 4주후의 자료가 1,10ug의 키메릭 단백질의 주입이 강한 주요 반응을 유도해낼 수 있다는 것을 보여준다. logPIV-3 특정 HAI와 PIV-3/RSV 중화적정값의 평균의 역수는 살아있는 PIV-3과 RSV에 의해 얻어진 적정값과 동일하다. 따라서 키메릭 단백질의 단일 접종이 PIV-3과 RSV둘다에 대한 항체 중화를 유도해내는데 충분하다. 강한 PIV-3와 RSV 중화 적정값이 후의 재차 주입(5주 기름)에서 관찰되었다. 이러한 결과들은 키메릭 단백질의 두 RSV와 PIV-3의 성분이 좋은 면역원이다라는 또다른 증거를 제공한다.
키메릭 면역원들의 RSV와 PIV-3 모두에 대하여 동물을 보호할 능력이 있는지를 알아보기 위해서 각 그룹의 4마리 코튼 쥐가 PIV-3 RSV의 100 TCID단위들로 근육내로 도전되어진다. 아래의 표 3에서 보다시피 키메릭 F-HN단백질 1 또는 10 ug으로 면역된 동물들은 PIV-3나 RSV의 도전으로부터 완벽하게 보호되었다. 이러한 결과들은 키메릭 단백질들이 강한 면역원성이 있을뿐만 아니라, 두 PIV-3와 RSV감염에 의한 질병으로부터 코튼 쥐를 보호할 수 있다는 증거를 제공한다.
[실시예 15]
이 예는 키메릭 F-HN유전자를 가지는 블루스크립트 Ml3-SK 벡터 형성에 관한 것이다.
이 키메릭 유전자 구조는 돌연변이된 PIV-3 F유전자의 5'의 해독되지 않는 부분을 가지지만, 돌연변이된 PIV-3 F유전자와 본래의 RSV G유전자들의 소수성 앵커와 세포질쪽 꼬리부분을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 없다. 이 플라스미드를 형성하는데 관계되는 단계가 제17도, 제18도에 요약되어져 있다.
키메릭 F-HN유전자 구조의 PIV-3 F성분을 만드는 제1단계는 PCR 증폭되지 않은 PIV-3 F유전자의 857, 874 위치사이와 PCR 증폭된 PIV-3 F유전자(제1도)의 18 뉴클레오타이드 길이의 847, 864 위치 사이에 있는 5'CAAGAAAGGAATAAAA 3'(서열 번호 17)내의 추정된 선종결부위(pretermination site)를 제거하는 것이다. 이를 위해, PCR 증폭되지 않은 PIV-3 F유전자의 PIV-F cDNA가 BsaAI와 EcoRI 자리에서 잘려진다. BsaAI-EcoRI PIV F유전자 조각은 EcoRI-BsaAI 연결자를 사용하여 블루스크립 Ml3-SK 벡터의 EcoRI 부위로 클론된다. 그 후 PCR 증폭되지 않은 PIV-3 F유전자의 857-874 표적 부위가 Morinaga등의 방법[1984,Biotechnology 2: 636-639]을 사용한 올리고뉴클레오타이드-중재 돌연변이 유발로 돌연변이된다. 플라스미드 pPI3Fc(실시예 1)는 Amp 유전자 내의 ScaI로 잘리워지고 알칼린 포스파타아제로 디포스포릴레이트됐다.(플라스미드#1) 플라스미드 pPICFc의 제2샘플은 BstEII과 NsiI로 잘리워져 PIV-3 F유전자(플라스미드 #2)의 0.9Kb BstEII-NsiI 조각이 없는 3.9Kb의 제한된 플라스미드를 만든다. 5' CAGGAGAAGGGTATCAAG 3'(서열번호 19) 돌연변이된 78가 합성 올리고뉴클레오티드(제17도에서 #2721, 서열번호 18)가 특별히 F단백질 서열을 바꾸지 아니하고 857-874 DNA 조각을 돌연변이시키기 위해 합성되었다. 이 올리고뉴클레오티드가 플라스미드 DNAs #1과 #2에 첨가되어 100℃에서 3분간 변성되고 점차 식혀가면서 재생된다. 이 혼합물이 DNA 폴리머라아제, dNTPs,T4 리가아제 존재하에 배양되어 HB101 세포들로 바뀐다. 1.8Kb 돌연변이된 PIV-3 F 유전자를 가진 박테리아가 100ug/ml 암피실린을 가진 YT 아가 판에서 분리된다. 올리고뉴클레오타이드 프로브 5'AGGAGAAGGGTATCAAG 3'(서열번호 20)과의 혼성으로 돌연변이된 PIV-3 F유전자의 존재를 확신할 수 있다. 돌연변이된 유전자 서열은 DNA 시퀀싱으로 확인되었다. 돌연변이된 PIV-3 유전자를 가진 플라스미드를 pPI3Fm으로 표시하였다.
키메릭 유전자 구조를 제조하는데 있어서 제2단계(제18도)는 트랜스멤브레인 앵커 부분과 PIV-3 F단백질의 세포질쪽 꼬리를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열이 없는 잘리워진 PIV-3 Fm유전자가 5'리이더 시퀀스와 G 당단백질의 트랜스멤브레인 앵커부분과 세포질쪽 코딩하는 뉴클레오타이드 서열이 없는 RSV G 유전자와 나란히 연결하여 블루스크립-베이스 벡터를 만드는 것이다.
이 키메릭 유전자를 만들기 위해서, 플라스미드 pPI3Fm에서의 돌연변이된 PIV-3 F 유전자의 오리엔테이션이 처음에 EcoRI 소화에 의해 바뀌어지고, 다시 연결되어 플라스미드 pPI3Fmr를 만든다. 키메릭 유전자의 PIV-3 F유전자 부분을 만들기 위해서 플라스미드 pPI3FmrDL NotIRHK BsrI으로 잘리워져 1.7Kb의 잘리워진 PIV-3 F유전자를 주게된다. RSV G부분을 만들기 위해서, G 단백질의 앵커 부분과 세포질쪽 꼬리를 코딩하는 DNA조각과 5'리이더 시퀀스가 없는 0.95kb의 RSV-G유전자가 폴리앵커를 EcoRI으로, 유전자를 BamHI로 자름으로써 플라스미드 pRSVG(실시예1) 로부터 얻어진다. 0.95kb의 EcoRI-BamHI RSV G 유전자 조각은 제한된 블루스크립 벡터 pM 13-SK의 EcoRI-BamHI부분으로 서브 클론되어 플라스미드 pRSVGt를 만든다. 0.95kb EcoRI-BamHI G 유전자 조각과 1.5Kb의 NotI-BsrI으로 잘리워진 PIV-3 유전자가 BsrI-BamHI 올리고뉴클레오티드 카셋트(서열번호 9)를 통해 연결되어서 F G 유전자의 코딩 시퀀스를 재생하고, 이로 BamHI와 NotI로 제한된 pRSVGt 벡터로 클론된다.
[실시예 16]
이 예는 소수성 앵커와 세포질쪽 꼬리를 코딩하는 부분이 없는 돌연변이된 PIV-3 F유전자가 5'리이더 서열과 G 단백질의 트랜스멤브레인 앵커부분과 세포질 쪽 꼬리부분을 코딩하는 뉴클레오타이드가 없는 RSV G 유전자에 연결된 키메릭 F-G유전자를 가진 pD2 베큐로바이러스 전이벡터(실시예 8에서 설명됨)의 제조에 관한 것이다.
이 구조를 만들기 위해 EcoRI으로 플라스미드 pFG(실시예 15)가 잘리워져 2.6Kb의 F-G키메릭 유전자를 주게 된다. 그런 다음, 2.6Kb의 EcoRI으로 잘린 키메릭 유전자 조각은 디포스폴리레이리드된 pD2 벡터의 EcoRI 부위로 서브-클론되어 12.1Kb의 pD2F-G 플라스미드를 만든다(ATCC 75389).
[실시예 17]
이 예는 키메릭 F-G유전자를 가진 플라크-정제된 재조합 베큐로바이러스의 제조에 관한 것이다. Sf9 세포들이 2ug의 pD2F-G 플라스미드 DNA(실시예 16)와 1ug의 선형 와일드-타입 AcNPV DNA(생체외부에서 얻어진)으로 감염되었다.
F-G를 가진 재조합 베큐로바이러스들은 실시예 10에 언급된 절차에 따라 두차례 플라크-정제되었다.
[실시예 18]
이 예는 재조합 베큐로바이러스들로 감염된 High 5세포와 Sf9세포의 부유물에 키메릭 F-G단백질의 존재를 설명하는 것이다. Sf9와 High 5 세포들이 F-G유전자를 가진 재조합 베큐로바이러스들(실시예 16)로 5~10 pfu/cell의 m.o.i에서 감염되었다. 재조합 바이러스들로 감염된 세포들의 부유물은 PIV-3 F특정 ELISA에서 표현된 단백질에 대하여 양성반응을 나타내었다. 감염된 세포들의 부유물들은 이뮤노블랏에서 항-F PIV-3와 항-GRSV 오도크리날 항체들과 모두 반응한다. 이 결과들은 감염된 Sf9와 High 5 세포들의 부유물에 키메릭 F-G단백질이 존재함을 확신시켜 준다.
[실시예 19]
이 예는 F-F와 F-HN을 발현하는 재조합 백시니어 바이러스들의 제조에 관한 것이다. F-F(VP1192로 표시됨)와 F-HN(VP1195)을 발현하는 재조합 백시니어 바이러스들은 바이로제네틱 회사(Virogenetic, Corporation)에서 COPAK 숙주-범위 선택시스템에 사용된 삽입플라스이드들은 백시니어 KIL 숙주-범위 유전자[Perkuse등 (1990). Virology 179:276∼286]과 수정된 백시니어 H6 프로모터[Perkus 등(1989), J. Virology 63: 3829∼3836]을 가지고 있다.
이러한 삽입플라스미들들내에 KIL 유전자와 H6 프로모터와 플리링커 부분이 코펜하겐 균종 백시니어의 ATI부분을 대신하는 측면 팔들사이에 위치하고 있다[ORFS A25L, A26L; COPAK 삽입 플라스미드들은 구조바이러스 NYNAC를 사용하여 생체내재조합이 사용될 목적으로 고안되었다. 재조합 바이러스들의 선택은 토기콩팥세포들에서 행해졌다. 재조합 바이러스들, VP1192와 VP1195는 삽입플라스미드들 pES229A-6과 PSD. RIV를 각각 사용하여 만들어졌다. F-F유전자를 지닌 플라스미드 pES229A-6를 만들려면, COPAK-16 삽입플라스미드 pSD555가 SmaI로 잘리고 장내 알칼린 포스파타아제로 디포스포릴레이트되었다. 2.6Kb의 F-F유전자는 플라스미드를 EcoRI과 BamHI로 자름으로써 플라스미드 pES60A(실시예 4)로부터 회수된다. 2.6Kb의 EcoRI-BamHI F-F유전자는 Klenow 폴리머라아제로 블런트 엔딩되고 낮은 녹는 점의 아가로스젤에서 분리되고, COPAK-H6 삽입플라스미드 pSD555의 SmI부위로 클론되어 플라스미드 pES229A-6를 만든다. 이는 5 '플이 H6 프로모터에 가장 가깝게 F-FORF에 위치했다. 플라스미드 PSD. RN를 만들기 위해서 먼저 pSD555 벡터가 SmaI와 BamHI로 잘려진다. 잘리워진 플라스미드 pM RF-HN(실시예 9)이 C1aI로 잘려지고 F-HN유전자를 가진 Klenow 폴리머라아제로 블런트 엔딩된후 BamHI로 잘려진다. 3.3Kb의 F-HN유전자는 pSD555벡터의 SmaI-BamHI 위치에 클론되어 플라스미드 PSD. RN.을 만든다. 이것은 H6의 5' 끝이 H6 프로모터에 가장 가깝도록 F-HN에 위치한다. 플라스미드 pSE229A-6과 PSD. RN은 베로세포내에서 NYVAC를 구제바이러스로 사용하여 생체의 재조합 실험에 쓰인다. 재조합 자손 바이러스는 토끼 신장(RK)-13 세포에서 선택되어진다(ATCC # CCL37). 몇개의 플라크들을 RK-13세포에서 두번 통과시켰다.
키메릭 유전자들을 가진 바이러스들은 PIV와 RSV 삽입된 DNA시퀀스에 특이한 라디오레이블된 프로브를 사용한 표준 원위치 플라크 혼성화의 방법으로 확인했다[Piccini등(1987) Methods in Enzymology, 153;545∼563] F-F와 F-HN키메릭 유전자들을 가진 플라크-정제된 바이러스들은 VP1192와 VP1195로 각각 표시되었다. 방사능 면역침전은 VP1192와 VP1195감염된 세포에서 키메릭 유전자들의 발현을 확인하기 위해 행해졌다. 이러한 분석은 기니어 피그 특정 PIV-3항-HN과 항-F항혈청과 토끼 항-RSV F항혈청을 사용하여 감염된 베로세포들로부터의 용해물을 이용하여 행해졌다. 항-PIN F와 항-RSV F항혈청은 VP1192 감염된 베로세포들로부터 분자량이 약 90KD와의 단백질을 침전시켰다. 항-RSV F와 기니어피그 항-PIV HN 항혈청은 VP1195 감염세포로부터 분자량이 약 100Ka인 단백질을 침전시켰다. 이러한 결과는 재조합 폭스바이러스들로 감염된 베로세포에서 F-F와 F-HN키메릭 단백질들의 형성을 확인시켜 준다.
[발명의 개시 요약]
본 발명은 복수의 병원균 특히 PIV와 RSV의 감염에 대해 보호를 유도할 수 있는 키메릭 단백질을 생성할 수 있는 멀티메릭 하이브리드 유전자들을 제공한다. 본 발명의 범위내에서 수정들이 가능하다.
Claims (14)
- 파라인플렌쟈 바이러스(PIV)와 호흡기 신시륨바이러스(RSV)에 의해 유발되는 다중 호흡기 질병들에 대한 보호를 부여하는 키메릭단백질에 있어서, 파라인플렌쟈 바이러스-3(PIV-3) F또는 HN단백질 또는 이들의 면역원적 에피토프-함유 단편이, 호흡기 신시륨바이러스(RSV) G 또는 F단백질 또는 이들의 면역원적 에피토프-함유 단편에 연결되어 있는 것을 특징으로 하는 키메릭단백질.
- 제1항에 있어서, 상기 유전자가 FPIV-3-FRSV, FRSV-HNPIV-3및 FPIV-3-GRSV하이브리드유전자들로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 키메릭 단백질.
- 제1항 또는 제2항의 키메릭단백질을 코딩하는 멀티메릭 하이브리드유전자.
- 제3항에 있어서, 상기 유전자가 FPIV-3-FRSV, FRSV-HNPIV-3및 FPIV-3-GRSV하이브리드유전자들로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 하이브리드유전자.
- 제3항 또는 제4항에 있어서, 상기 하이브리드유전자가 발현벡터내에 함유되어 있는 것을 특징으로 하는 하이브리드유전자.
- 제5항에 있어서, 상기 하이브리드유전자가 플라스미드 pACDR7(ATCC 75387), pD2 RF-HN(ATCC 75388) 또는 pD2 F-G(ATCC 75389)의 형태인 것을 특징으로 하는 하이브리드유전자.
- 제 3,4 및 6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하이브리드 유전자가, 적어도 하나의 면역원적 및/또는 면역자극적인 분자를 코딩하는 적어도 하나의 유전자를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 하이브리드유전자.
- 제3항 내지 제7항 중 어느 한 항의 멀티메릭 하이브리드유전자에 의해 코딩된 상기 키메릭단백질의 발현을 위한 상기 유전자들을 함유하는 세포들.
- 제3항 내지 제7항에 있어서, 어느 한 항의 하이브리드유전자를 함유하는 항원전달을 위한 라이브벡터.
- 파라인플렌쟈 바이러스(PIV)와 호홉기 신시륨바이러스(RSV)에 의해 유발되는 다중 호홉기 질병들에 대한 보호를 부여하는 키메릭단백질의 제조공정에 있어서, PIV-3 F또는 HN단백질 또는 이들의 면역원적 에피토프-함유 단편을 코딩하는 유전자서열을 분리하는 단계, RSV G또는 F단백질 또는 이들의 면역원적 에피토프-함유 단편을 코딩하는 유전자서열을 분리하는 단계, 상기 유전자서열들을 연결하여 멀티메릭 하이브리드유전자를 형성하는 단계 및, 세포발현시스템에서 상기 멀티메릭 하이브리드유전자를 발현하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 키메릭단백질의 제조공정.
- 제10항에 있어서, 상기 멀티메릭 하이브리드유전자가 FPIV-3-FRSV, FRSV-HNPIV-3및 FPIV-3-GRSV하이브리드유전자들로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 키메릭단백질의 제조공정.
- 제11항에 있어서, 상기 멀티메릭 하이브리드유전자가 플라스미드 pAC DR7(ATCC 75387), pDF RF-HN(ATCC 75388) 또는 pD2 F-G(ATCC 75389)를 포함하는 발현벡터에 함유된 것임을 특징으로 하는 키메릭단백질의 제조공정.
- 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 키메릭 단백질이 상기 세포발현시스템의 배지로부터 분리되고, 상기 분리된 키메릭단백질이 정제된 것임을 특징으로 하는 키메릭단백질의 제조공정.
- 파라인플렌자 바이러스와 호흡기 신시륨바이러스에 의한 병원균적 감염들에 의해 유발된 질병에 대한 백신에 있어서, 제1항 및 제2항의 키메릭단백질 또는 제9항의 라이브벡터와 이들을 생리적으로 수용할 수 있는 캐리어에 의해 특징지어지는 백신.
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